BRPI0612720A2

BRPI0612720A2 - método de preparação de uma matriz de separação, matriz de separação de polissacarìdeo reticulado, coluna de cromatografia, e, uso de uma matriz de separação

Info

Publication number: BRPI0612720A2
Application number: BRPI0612720-7A
Authority: BR
Inventors: Hans Berg; David Buckley; Maria Birgitta Holm; Philippe Busson; Anders Hagvall; Eva Holmgren; Henrik Ihre; Anders Larsson; Lindstroem Dag
Original assignee: Ge Healthcare Bio Sciences Ab
Priority date: 2005-07-06
Filing date: 2006-06-28
Publication date: 2011-02-15
Also published as: KR101326438B1; CN101218023B; ES2608638T3; JP2008544847A; RU2411081C2; US20080154031A1; US8309709B2; AU2006266529B2; CA2609093A1; EP1904226A4; EP1904226A1; KR20080027326A; RU2007146247A; WO2007004947A1; AU2006266529A1; CA2609093C; EP1904226B1; JP5058159B2; BRPI0612720B1; CN101218023A

Abstract

METODO DE PREPARAçãO DE UMA MATRIZ DE SEPARAçãO, MATRIZ DE SEPARAçãO DE POLISSACARIDEO RETICULADO, COLUNA DE CROMATOGRAFIA, E, USO DE UMA MATRIZ DE SEPARAçAO A presente invenção diz respeito a um método de preparação de uma matriz de separação insolúvel, cujo método compreende tratamento de sal de um gel de polissacarídeo seguido pela reticulação dos polímeros de polissacarídeo. Em uma forma de realização, o método compreende fornecer uma solução aquosa de um polissacarídeo nativo gelificável; diminuir a temperatura da solução de polissacarídeo para um valor abaixo de seu ponto de gelação; tratamento de sal mediante a adição de pelo menos um sal ao polissacarídeo resultante; e reticular o polissacarídeo tratado com sal. O polissacarídeo pode ser preparado, por exemplo, em partículas, membranas ou monolitos.

Description

"MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA MATRIZ DE SEPARAÇÃO,MATRIZ DE SEPARAÇÃO DE POLISSACARÍDEO RETICULADO,COLUNA DE CROMATOGRAFIA, E, USO DE UMA MATRIZ DESEPARAÇÃO"

Campo Técnico

A presente invenção diz respeito à separação e purificação demoléculas alvos, tais como biomoléculas, e mais especificamente a umamatriz de cromatografia e um novo método para a sua preparação. A invençãotambém abrange o uso de uma tal matriz na cromatografia líquida, e umacoluna de cromatografia que compreende a matriz.

Fundamentos

Os recentes avanços no campo da biotecnologia têm requeridotécnicas mais seguras e mais precisas para recuperação, purificação e análisede substâncias biológicas e bioquímicas, tais como proteínas. A cromatografiaé uma técnica de purificação comumente usada no campo. Na cromatografia,duas fases mutuamente imiscíveis são colocadas em contato. Maisespecificamente, a molécula alvo é introduzida em uma fase móvel, que écolocada em contato com uma fase estacionária. A molécula alvo depoispassará por uma série de interações entre as fases estacionárias e móveiscomo se estivesse sendo carregada através do sistema pela fase móvel. Asinterações exploram as diferenças nas propriedades físicas ou químicas doscomponentes na amostra. Na cromatografia líquida, uma amostra líquida,opcionalmente combinada com um tampão adequado constitui a fase móvel,que é colocada em contato com uma fase estacionária, conhecida como umamatriz de separação. Geralmente, a matriz compreende um suporte para queos ligandos, que são grupos capazes de interações com o alvo, fossemacoplados.

As matrizes de separação comumente se baseiam nos suportesproduzidos a partir de materiais inorgânicos, tais como sílica, ou materiaisorgânicos, tais como polímeros sintéticos ou naturais. Os polímeros sintéticos,tais como estireno e divinilbenzeno, são freqüentemente usados para suportesque apresentam alguma hidrofobicidade, tais como cromatografia de exclusãode tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia defase reversa (RPC). Além disso, os polímeros sintéticos são às vezespreferidos sobre os polímeros naturais, porque eles são facilmente produzidosmais rígidos e resistentes a pressão, resultando em suportes que fornecempropriedades de fluxo mais vantajosas.

Os polímeros naturais, que são comumente polissacarídeos taiscomo agarose, têm sido utilizados como suportes de matrizes de separaçãodurante décadas. Devido à presença de grupos de hidroxila, as superfícies dospolímeros naturais são geralmente hidrófilos, não fornecendo essencialmentenenhuma interação não específica com as proteínas. Uma outra vantagem dospolímeros naturais, que é de importância específica na purificação demedicamentos ou moléculas de diagnóstico para uso humano interno, é suaspropriedades não tóxicas. Agarose pode ser dissolvida na água emtemperatura aumentada, e depois formará um gel poroso após esfriamentopara uma certa temperatura (o ponto de gelação). Durante o aquecimento, ogel fundirá novamente em uma temperatura (o ponto de fusão), que égeralmente muito mais elevada do que o ponto de gelificação. A gelificaçãoenvolve a agregação hélice-hélice dos polímeros de polissacarídeo, e éalgumas vezes referida como uma reticulação física.

Como mencionado acima, os polímeros naturais são menosrígidos e resistentes a pressão do que os polímeros sintéticos, econsequentemente métodos têm sido desenvolvidos para a sua melhorar. Porexemplo, mediante a variação da concentração de polissacarídeo, aporosidade do suporte pode ser aumentada, resultando em transporte de massadirecionado melhorado e aumento da área com o qual o alvo interage durantea cromatografia. Um outro parâmetro essencial a considerar é as propriedadesde fluxo do suporte, por exemplo, em um leito condensado de matriz deseparação particulada. Quando a fase móvel for forçada através do leito, apressão de retorno principalmente será controlada pelas canais intersticiaisentre as partículas. Em vazões baixas, as partículas podem ser consideradascomo incompressíveis e depois a pressão de retorno aumenta linearmente coma vazão, com a inclinação dependente do tamanho de partícula. Quando avazão aumenta, as partículas podem começar a deformar sob pressãohidrostática, resultando na diminuição dos diâmetros dos canais intersticiais euma pressão de retorno rapidamente crescente. Em uma certa vazão,dependendo da rigidez da matriz, o leito cairá em colapso e a pressão deretorno se aproximará do infinito.

O meio mais comumente usado para melhorar a rigidez econsequentemente as propriedades de fluxo de agarose é a sua reticulaçãoquímica. Tal reticulação ocorre entre os grupos de hidroxila disponíveis, epode ser obtida por métodos comumente conhecidos usando, por exemplo,epicloroidrina.

A US 4.973.683 (Lindgren) diz respeito à reticulação de géisde polissacarídeo porosos, e mais especificamente a um método de melhorar arigidez enquanto minimiza a interação não específica de um gel depolissacarídeo poroso. O método envolve fornecer um gel de agarose e umreagente designado "monofuncional", que compreende um grupo reativo, talcomo um grupo de halogênio ou um grupo de epóxido, e uma ligação dupla.

O reagente é ligado ao gel através de seu grupo reativo; e a ligação dupla édepois ativada em um epóxido ou haloidrina, que é finalmente reagida comgrupos de hidroxila na agarose para fornecer reticulação.

A US 5.135.650 (Hjertén et al) diz respeito às partículas defase estacionária cromatográficas altamente compressíveis, tais comoglóbulos de agarose, que são mencionadas de ser suficientemente rígidas paraHPLC e não porosas na medida em que elas são impenetráveis por solutos.Mais especificamente, os glóbulos de Hjertén são produzidos de glóbulos deagarose porosos, que são colocados em contato com um solvente orgânicopara a porosidade cair em colapso, após o que as superfícies do glóbulo dentrodos poros desfalecidos são reticulados para fixar os poros em seu estadodesfalecido. Alternativamente, os glóbulos são produzidos mediante oenchimento dos poros com uma substância polimerizável, que enxerta nassuperfícies do poro, e execução da polimerização de enxertia. Uma vantagemmencionada da invenção divulgada é que uma fase estacionária única é eficazem pressões elevadas e ainda pode ser usada em pressões baixas. No entanto,o uso de solventes, especialmente tais solventes como usados nesta patente, éem geral evitada por razões de saúde e segurança.

A US 6.602.990 (Berg) se refere a um processo para aprodução de um gel de polissacarídeo reticulado poroso, em que um agente dereticulação bifuncional é adicionado a uma solução de polissacarídeo edeixado se ligar através de seu sítio ativo aos grupos de hidroxila dopolissacarídeo. Um gel de polissacarídeo é depois formado a partir dasolução, após o que o sítio inativo do agente de reticulação é ativado e areticulação do gel executada. Assim, o agente de reticulação é introduzido nasolução de polissacarídeo, ao contrário dos métodos debatidos acima em que éadicionado a um gel de polissacarídeo. O agente de reticulação bifuncionalcompreende um sítio ativo, isto é, um sítio capaz de reação com os grupos dehidroxila do polissacarídeo, tais como haletos e epóxidos, e um sítio inativo,isto é, um grupo que não reage sob as condições onde o sítio ativo reage, talcomo grupos de alila. Assim, o agente de reticulação bifuncional presentecorresponde aos "reagentes monofuncionais" usados de acordo com a US4.973.683 (Lindgren) examinada acima. As partículas compreendidas do gelresultante foram mostradas de apresentar uma capacidade melhorada desuportar vazões e pressões de retorno elevadas. Uma desvantagem com ométodo da US 6.602.990 é que bromo é requerido para a ativação do agentede reticulação.

A US 5.998.606 (Grandics) diz respeito a um método desintetização das matrizes de cromatografia, em que a reticulação e afuncionalização de uma matriz ocorrem simultaneamente. Maisespecificamente, as ligações duplas fornecidas na superfície de uma matriz decarboidrato polimérica são ativadas na presença de um catalisador metálicopara reticular a matriz e funcionalizá-la com grupos de haloidrina, carboxilaou sulfonato. As ligações duplas são fornecidas na superfície da matrizmediante o contato com um reagente de ativação, que contém um átomo dehalogênio ou epóxido e uma ligação dupla. Assim, o reagente de ativação daUS 5.998.606 corresponde ao reagente monofuncional da US 4.973.683 e oagente de reticulação bifuncional da US 6.602.990.

Qi et al (Journal of Functional Polymers, Vol. 13, March 2000:"Preparation of Two Types of Immobilized Metal-Chelated Complex AffinityMembrane Chromatography Media") descreve como as membranas deafinidade de celulose macro-porosas são produzidas usando papel de filtro decelulose como a matriz, em atividade através do tratamento alcalino, ativaçãoda epoxidação, acoplamento com iminodiacetato de dissódio, e imobilizaçãode Cu. Além disso, a agarose foi covalentemente reticulada nas membranasde pós-ativação para produzir as membranas que possuem uma estruturasemelhante a sanduíche.

A US 2005/0220982 (Moya et al) diz respeito a um método deformação de estruturas de polissacarídeo tais como glóbulos, películas de gele revestimentos porosos sobre substratos porosos mediante a formação deuma solução inibida por gel em temperatura ambiente de um polissacarídeo,um ou mais agente(s) de inibição de gel e um solvente tal como água,aquecimento da mistura até que todos os componentes sejam dissolvidos,esfriamento da mistura como uma solução ao redor da temperatura ambiente,formação de uma estrutura tridimensional com a solução e adição da estruturaa um agente de gelação para formar um gel de polissacarídeo. O agente deinibição do gel, por exemplo, baseia-se em sais de zinco, lítio ou sódio. Orevestimento de polissacarídeo é determinado de ser espesso o bastante parapermitir o fluxo difusivo ocorrer dentro da própria camada de polissacarídeo.

Uma vantagem mencionada do método descrito é que as estruturas sãoformadas em temperatura ambiente e com gelação controlada do polímerocom os polímeros de polissacarídeo que normalmente formam gel bem acimada temperatura ambiente. E também mencionado que o revestimento dassuperfícies é obtido sem substancialmente bloquear os poros com opolissacarídeo. Entretanto, tal operação em temperatura ambiente exigirácontrole cuidadoso da solução de agarose, que torna o processo totalrelativamente demorado.

Desta maneira, mesmo embora técnicas estejam disponíveispara a produção de matrizes de separação de polissacarídeo reticuladas,diferentes aplicações futuras proporão diferentes requisitos sobre a matriz,resultando em uma necessidade contínua de métodos alternativos.

Breve descrição da invenção

Um aspecto da presente invenção é fornecer um método para apreparação de uma matriz de separação de polissacarídeo, em que a matrizapresenta propriedades de fluxo adequadas para o processamento em grandeescala. Isto pode ser obtido mediante a preparação de uma matriz deseparação como definido nas reivindicações anexas.

Um aspecto específico da presente invenção é fornecer ummétodo para a preparação de uma matriz de separação de polissacarídeoparticulada, que permite a reticulação com risco reduzido de agregação. Istopode ser alcançado por uma matriz de separação preparada como definido nasreivindicações anexas, que podem ser reticuladas em temperaturas maiselevadas do que convencionalmente usadas.

Um aspecto específico da presente invenção é fornecer ummétodo que permite a fabricação de uma matriz de separação porosa derigidez melhorada sem cair em colapso a estrutura de poro. Isto pode serobtido usando o método definido nas reivindicações anexas para preparar umamatriz de separação, o tamanho de poro da qual permite as moléculas alvosentrar nos poros. Este aspecto é vantajoso para a purificação e/ou isolamentode moléculas alvos relativamente pequenas, tais como proteínas, em vazõesaumentadas.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção surgirão apartir da descrição detalhada que se segue.

Definições

O termo matriz de separação "particulada" significa aqui umamatriz de separação compreendida de partículas, tais como partículasessencialmente esféricas ou partículas menos regularmente moldadas.

O "ponto de gelação", às vezes aqui indicado como"temperatura de gelação" significa a temperatura em que os polímeros de umasolução interagem fisicamente para formar um gel sólido.

O termo "gelificável" significa aqui capaz de formar um gelfísico.

O termo polissacarídeo "nativo" se refere a um polissacarídeoem um estado não modificado, isto é, um polissacarídeo que não foisubstituído ou derivado.

O termo "matriz" de separação aqui contido significa ummaterial compreendido de um suporte sólido poroso ou não poroso, a qual osligandos foram ligados. No campo de cromatografia, a matriz de separação éàs vezes significada resina ou meio.

O termo "ligandos" é aqui usado em seu significadoconvencional, isto é, para entidades químicas que são capazes de interagircom uma molécula alvo, tais como grupos carregados capazes de interagircom uma molécula alvo opostamente carregada em um processo de troca deίοη. Kav é um parâmetro de filtração de gel (cromatografia de exclusão detamanho) definido como (Ve-Vo)/(Vt-Vo), onde Ve é o volume de eluição dopico de molécula de teste, Vo é o volume vazio da coluna e Vt é o volume deleito total. Kav é uma medida da fração do volume de fase estacionáriaacessível à molécula de teste particular.

Kav dx é Kav para moléculas de dextrano. Nos exemplos,dextranos de peso molecular 110 kD, 500 kD e 1000 kD, respectivamente,foram usados.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção se refere a um método de preparação deuma matriz de separação insolúvel, tal como partículas, um monolito ou umamembrana, mediante o tratamento de sal de um gel de polissacarídeo seguidopor reticulação dos polímeros de polissacarídeo. O método pode incluir umaetapa precedente de fornecer o gel de polissacarídeo de uma solução desta,preferivelmente mediante a diminuição de sua temperatura. O gel pode serfornecido como um portador de membrana; como partículas depolissacarídeo; ou como um revestimento sobre as partículas produzidas apartir de um material diferente. O gel é vantajosamente poroso.

Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção se referea um método de preparação de uma matriz de separação, cujo métodocompreende as etapas de

(a) fornecimento de uma suspensão aquosa de partículascompreendidas de polissacarídeo nativo em forma de gel;

(b) tratamento de sal das partículas colocadas em suspensão mediante aadição de pelo menos um sal; e

(c) reticulação das partículas tratadas com sal.

O polissacarídeo pode ser qualquer polissacarídeo capaz deforma um gel, preferivelmente mediante uma mudança de temperatura, e podeser selecionado do grupo consistindo de agarose, ágar, celulose, dextrano,amido, quitosana, konjac, curdlan, carragenano, pectina, gellan e alginato.

Como a pessoa versada compreenderá, tais partículas de polissacarídeo emforma de gel são vantajosamente compreendidas de um polissacarídeo, mas apresente invenção também abrange o uso de partículas compreendidas de umamistura de dois ou mais polissacarídeos. Em uma forma de realizaçãovantajosa do presente método, o polissacarídeo é agarose. Em um métodoespecífico, um núcleo ou portador de partícula é revestido com umpolissacarídeo como descrito acima. O portador pode ser como debatidoabaixo no contexto do portador de membrana.

Como se mostra do acima, de acordo com a presente invenção,as partículas de polissacarídeo fornecidas na etapa (a) são compreendidas depolissacarídeo nativo, isto é, um polissacarídeo cujos polímeros não foramsubmetidos a qualquer modificação ou substituição tais como derivação oureticulação. Assim, a presente invenção adiciona sais ao polissacarídeo nãomodificado.

Em uma forma de realização vantajosa, as partículas depolissacarídeo são essencialmente partículas esféricas (contas). No campo decromatografia, o tamanho de partícula é comumente dado como o tamanho departícula mediano da distribuição de volume cumulativa. No presente método,o tamanho médio dos glóbulos pode estar em uma faixa de 10 a 300 μιη,preferivelmente de 30 a 200 μιη ou mais preferivelmente de 45 a 165 μιη, talcomo cerca de 45 μηι, de diâmetro.

Tais contas de polissacarídeo são facilmente preparadas pelapessoa versada neste campo de acordo com os métodos padrão, tais comogelificação de suspensão inversa (S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2),393-398 (1964). Por exemplo, quando se prepara agarose, gotícuias deagarose são obtidas pela dissolução ou dispersão da agarose em um solventeaquoso, tal como água, ou qualquer outro solvente comumente usado, em umatemperatura acima de seu ponto de fusão. A agarose dissolvida é depoisemulsificada em um solvente orgânico comumente usado tal como tolueno ouheptano com agitação, após o que a temperatura é reduzida para baixo doponto de gelação da agarose, convenientemente para a temperatura ambiente.No presente método, os glóbulos assim produzidos são vantajosamentelavados para remover qualquer traço de solvente, por exemplo, com etanol ouágua, e colocados em suspensão em água ou uma solução aquosa adequada.Assim, em uma forma de realização vantajosa, as partículas são lavadas antesda etapa de reticulação.

Como entendido pela pessoa versada neste campo, existemoutros métodos de preparação da suspensão aquosa de partículas depolissacarídeo do que a emulsão. Assim, em uma forma de realizaçãoalternativa, as partículas de polissacarídeo são obtidas mediante apulverização de uma composição, que é compreendida de um polissacarídeotermicamente gelificável em um meio aquoso, em ar ambiente e deixando acomposição atomizada formar gel no ar, como divulgado, por exemplo, na US6.248.268 (FMC Corporation), que é por meio desta aqui incorporado atravésde referência.

Em uma forma de realização alternativa, as partículas depolissacarídeo são irregularmente moldadas, tais como obteníveis, porexemplo, simplesmente pela preparação de um segmento grande depolissacarídeo e triturando em tamanho de partícula médio adequado. Emmais uma forma de realização alternativa, as partículas de polissacarídeo sãoalongadas tais como partículas ovais ou semelhantes a fibra.

O sal adicionado na etapa (b) no presente método pode serqualquer sal capaz de fornecer a rigidez desejada em temperatura econcentração de sal selecionadas, mas é preferivelmente composto de doisíons que igualmente são taxados na extremidade mais elevada da sérieHofmeister.

Em uma forma de realização, o ânion do sal adicionado naetapa (b) é um sulfato ou fosfato, preferivelmente sulfato. Em uma outraforma de realização, o cátion do sal é selecionado do grupo consistindo deMg; Li; Na; K; e NH4. Em uma forma de realização vantajosa, o cátion do salé selecionado do grupo consistindo de Mg e Na. Desta maneira, o saladicionado na etapa (b) pode, por exemplo, ser MgSO4 ou Na2SO4. Em umaforma de realização vantajosa, o sal é MgSO4.

O(s) sal(is) na etapa (b) pode(m) ser adicionado(s) em soluçãoaquosa ou forma sólida. Em uma forma de realização, a quantidade de sal(is)adicionado(s) na etapa (b) é suficiente para fornecer uma concentração finalna suspensão que está na faixa de 0,5 a 1,3 M. Em uma forma de realizaçãoespecífica, a concentração de sal na suspensão está abaixo de 1,0 M, tal comona faixa de 0,5 a 1,0 M, e preferivelmente de 0,5 a 0,8 ou de 0,8 a 1,0 M. Emuma forma de realização alternativa, a concentração de sal na suspensão estáacima de 1,0 M, tal como na faixa de 1,0 a 1,3 M, e preferivelmente de 1,0 a1,2, por exemplo, cerca de 1,1 M ou de 1,2 a 1,3 M.

A suspensão a qual o sal foi adicionado é mantida em umatemperatura aumentada durante um tempo suficiente para as propriedades depolissacarídeo mudarem em direção às propriedades de fluxo melhoradas erigidez melhorada observadas pelos presentes inventores, preferivelmentecom agitação. A duração do tratamento de sal é facilmente determinada pelapessoa versada neste campo, e pode, por exemplo, durar por até uma hora, talcomo de 20 a 40 minutos, e vantajosamente durante cerca de 30 minutos.

Assim, a temperatura durante o tratamento de sal pode ser mantida qualqueruma na faixa de 94 a 98 0C, e é adaptada dependendo das propriedadesdesejadas da matriz. Em uma forma de realização, a temperatura está na faixade 94 a 96 0C, tal como de 94 a 95 0C ou de 95 a 96 0C, tal como cerca de 94,cerca de 95 ou cerca de 96 0C. Em outra forma de realização, a temperaturaestá na faixa de 96 a 98 0C, tal como de 96 a 97 0C ou de 97 a 98 0C, tal comocerca de 97 ou cerca de 98 0C.Em uma forma de realização vantajosa, o presente métodocompreende tratamento de sal, preferivelmente mediante a adição de sulfato,tal como Na2SO4 ou MgS04, em uma temperatura de cerca de 96 0C. Em umaforma de realização mais vantajosa, o método compreende o tratamento de salmediante a adição de Na2SO4 ou MgSO4 até uma concentração de sal nasuspensão acima de 1,0 Μ, o tratamento ocorrendo em uma temperatura decerca de 96 a 97 0C.

Como se torna óbvio do acima, as partículas de polissacarídeosão reticuladas em uma etapa subseqüente à adição de sal. Em uma forma derealização vantajosa, na etapa (c), a etapa de reticulação compreende a adiçãode um agente de reticulação. O agente de reticulação pode ser qualquermonômero adequado ou reagente bifuncional conhecido de polimerizar ospolissacarídeos, tais como epicloroidrina, divinilsulfona, diepóxidos,diisocianatos etc. A reticulação de polissacarídeos é bem conhecida nestecampo, ver, por exemplo, as US 4.973.683 e US 6.602.990 acima debatidas.Uma vantagem do presente método é que ele permite a fabricação departículas de polissacarídeo altamente rígidas mediante a reticulação em umatemperatura mais elevada do que as técnicas comumente usadas, que por suavez reduz ou mesmo elimina a formação de agregado. Sem desejar serlimitado por qualquer teoria específica, pode ser adotado que este aspecto estáconectado com a adição de sal antes da reticulação.

Em uma forma de realização, o presente método compreendeuma etapa subseqüente de ligação de ligandos de cromatografia aos grupos dehidroxila da matriz de polissacarídeo reticulada. A ligação de ligandos decromatografia, também conhecida como funcionalização ou às vezesderivação, a uma matriz insolúvel pode ser fornecida pela ligação de gruposcarregados ou carregáveis para se preparar uma matriz de troca de íon; pelaligação de grupos de ligação que apresentam afinidade biológica para prepararuma matriz de afinidade; pela ligação de grupos de quelação para produziruma matriz de cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC); oupela ligação de grupos hidrofóbicos para produzir uma matriz decromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Alternativamente, os gruposconhecidos como multimodais, isto é, grupos que contêm mais do que umgrupo, tais como grupos de troca de íon além dos grupos hidrofóbicos, sãoligados na matriz preparada de acordo com a invenção. Em uma forma derealização específica, os grupos funcionais são ligandos de troca de íonselecionados do grupo consistindo de grupos de amônio quaternário (Q),dietilaminoetila (DEAE), dietilaminopropila, sulfopropila (SP) ecarboximetila (CM). Os métodos para ligação de grupos funcionais a umsuporte insolúvel tal como uma matriz de separação são bem conhecidos dapessoa versada neste campo e pode envolver uma etapa precedente de alilaçãodo substituinte e uso de reagentes padrão e condições (Ver, por exemplo,Immobilized Affinity Ligand Technoques, Hermanson et al, Greg T.Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC,1992). Em uma forma de realização específica, a matriz de separaçãoreticulada é fornecida com prolongadores, também conhecidas como ramosflexíveis, tentáculos ou felpa, antes da funcionalização. Um prolongador bemconhecido é dextrano; ver, por exemplo, a US 6.537.793 em que a adição deprolongadores a uma matriz de polissacarídeo é descrita com maioresdetalhes.

A presente invenção também abrange a esterilização de umamatriz de separação reticulada tratada de acordo com a invenção. Em umaoutra forma de realização, o método diz respeito ao recheio ou simplesmentefornecer um recipiente com uma matriz de separação e subseqüentementeesterilizar o recipiente com seus conteúdos. Assim, uma forma de realizaçãoespecífica do método compreende fornecer a matriz de separação reticuladaem uma coluna de cromatografia antes da esterilização. A esterilização podeser realizada mediante o tratamento térmico e/ou vapor, tal como aautoclavação; radiação; microondas; pressão elevada; reagentes químicos; ouqualquer outro método de esterilização bem conhecido.

Um outro aspecto da presente invenção é uma matriz deseparação reticulada preparada como descrito acima. Em uma forma derealização vantajosa, a matriz de separação de polissacarídeo de acordo com ainvenção é compreendida de partículas porosas essencialmente esféricas. Emuma forma de realização, as partículas apresentam um valor de Kav para umdextrano de 110 kDa de pelo menos cerca de 0,4, preferivelmente >0,5. Emuma forma, de realização vantajosa, as partículas foram fornecidas comligandos de cromatografia. Nesta forma de realização, os poros são de umtamanho suficiente para permitir a entrada de moléculas alvos para seremseparadas, em conseqüência melhorar a capacidade de ligação das partículas.Além disso, o método de preparação descrito acima fornece uma matrizsuficientemente rígida para o processamento em grande escala. Esta forma derealização é útil para qualquer uma das moléculas alvos exemplificadasabaixo no contexto do aspecto de uso, mas é particularmente vantajosa paramoléculas alvos relativamente pequenas tais como proteínas.

Mesmo embora uma matriz de separação na forma departículas tenha sido debatida acima, como compreendido pela pessoa versadaneste campo, o presente método é igualmente útil para produção de matrizesde separação de outros formatos. Assim, a matriz de separação de acordo coma presente invenção pode ser preparada em qualquer forma comumente usada,tal como monolitos; filtros ou membranas; lascas; superfícies; capilares;fibras etc.

Em uma forma de realização vantajosa, o presente método depreparação de uma matriz de separação compreende o método de preparaçãode uma matriz de separação, cujo método compreende as etapas de

(i) fornecer uma solução aquosa de um polissacarídeo nativogelificável;(ii) diminuir a temperatura da solução de polissacarídeo para um valorabaixo de seu ponto de gelação;

(iii) tratamento de sal mediante a adição de pelo menos um sal aopolissacarídeo resultante de (ii); e

(iv) reticular o polissacarídeo tratado com sal.

Em uma forma de realização, o polissacarídeo é umpolissacarídeo nativo, isto é, um polissacarídeo cujos polímeros não foramsubmetidos a qualquer modificação ou substituição tal como derivação oureticulação. Em uma forma de realização vantajosa, o(s) sal(is) é/sãoadicionado(s) até uma concentração na solução na faixa de 0,5 M a 1,3 M.

Qualquer um dos detalhes acima no contexto do primeiroaspecto tal como o polissacarídeo, natureza do sal, temperatura econcentrações de sal etc. pode ser aplicável ao método acima para apreparação de outros formatos da matriz de separação.

Como se torna óbvio do acima, o polissacarídeo pode serpreparado em partículas. Em uma forma de realização, a matriz de separaçãoé uma membrana, ou um filtro. A parte dos detalhes acima que resulta namatriz rígida da invenção, a preparação das membranas é bem conhecida efacilmente realizada pela pessoa versada neste campo.

Em uma forma de realização alternativa, a matriz de separaçãoé um monolito. Nesta forma de realização, um porogen é vantajosamenteadicionado para garantir a porosidade desejada do produto monolítico. Osporogens adequados são bem conhecidos neste campo, e podem, porexemplo, ser polietileno glicol. Outros detalhes com respeito à fabricação demonolitos são bem conhecidos neste campo.

Um outro aspecto da invenção é uma coluna de cromatografiaque compreende uma matriz de separação como descrito acima. A colunapode ser produzida de qualquer material convencional, tal como um plásticobiocompatível, por exemplo, polipropileno, vidro ou aço inoxidável. A colunapode ser de um tamanho adequado para purificação em escala de laboratórioou em grande escala. Em uma forma de realização específica, a coluna deacordo com a invenção é fornecida com adaptadores luer, conectores detubulação e porcas que têm forma de cúpula.

Em uma forma de realização vantajosa, a etapa (i) acimacompreende também fornecer um portador de membrana porosa e colocar emcontato dito portador com a solução de polissacarídeo. O contato pode, porexemplo, ser por imersão do portador de membrana em uma solução quentede polissacarídeo, em cujo caso a membrana encharcada de polissacarídeo épreferivelmente removida da solução antes o esfriamento da etapa (ii). Oportador de membrana pode ser feito de qualquer material que sejacompatível com a solução de polissacarídeo, e é consequentemente de formavantajosa essencialmente hidrófila. Desta maneira, em uma forma derealização, o portador de membrana é produzido de um polímero hidrófilo, talcomo um polímero selecionado do grupo consistindo de agarose, ágar,celulose, dextrano, amido, quitosana, konjac, curdlan, carragenano, pectina,gellan, alginato e qualquer mistura de dois ou mais de ditos polímeros. Emuma forma de realização vantajosa do presente método, o portador demembrana é produzido de celulose. Na forma de realização mais vantajosa, oportador de membrana de celulose é colocado em contato com uma soluçãode agarose para fornecer uma membrana de celulose-agarose híbrida. Em umaforma de realização alternativa, o portador de membrana é produzido de umpolímero sintético, ou um material cerâmico, que foi tratado para apresentaruma superfície substancialmente hidrófila, tal como pela modificação químicada superfície. Assim, em uma forma de realização, o portador de membranaapresenta uma superfície hidrófila.

O portador de membrana usado no presente método pode seruma membrana comercialmente disponível. Alternativamente, é preparadoseguindo os métodos bem conhecidos no campo. O tamanho de poro médiodo portador de membrana dependerá de seu uso pretendido, e pode serqualquer um na faixa de 0,1 a 10 μιη, tal como de 0,2 a 5 μηι. Em uma formade realização específica, a membrana é fornecida como um cartucho. Emoutra forma de realização, a membrana é uma membrana empilhada. Em umaforma de realização específica, a membrana de acordo com a invenção éfornecida em um rolo. Como compreendido pela pessoa versada, o tamanho egeometria do portador de membrana também dependerá do uso.

O tratamento de sal da etapa (iii) é vantajosamente realizadomediante a saturação do portador de membrana em uma solução de sal aquosaaquecida durante um período de tempo adequado para obter as propriedadesde fluxo desejadas do produto final. Em uma forma de realização, a duraçãodo tratamento de sal é de 0,5 a 4 h, tal como de 1 a 3 h, por exemplo, 1 ou 2horas. A pessoa versada neste campo pode usar o teste simples para encontraro período de tempo mais adequado para uma dada combinação de portador -polissacarídeo da membrana. Como mostrado na parte Experimental abaixo,os presentes inventores têm inesperadamente mostrado que mediante otratamento de um portador de membrana revestido com polissacarídeo comsal de acordo com a invenção, a porosidade do portador de membrana, que foisubstancialmente reduzida após a etapa de revestimento, pode ser criadanovamente.

O revestimento de polissacarídeo da membrana tratada com salé depois reticulado de acordo com qualquer método bem conhecido nestecampo. Em uma forma de realização, o método para a preparação de umamembrana compreende uma etapa subseqüente de ligação de ligandos decromatografia aos grupos de hidroxila do revestimento de polissacarídeo. Talfuncionalização pela ligação de ligandos pode ser fornecida como descritoacima. Em uma forma de realização específica, a reticulação efuncionalização ocorrem substancialmente de forma simultânea.

Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a umamembrana preparada por fornecer um portador de membrana poroso e contatode dito portador com uma solução aquosa de um polissacarídeo gelificável;em que um revestimento de polissacarídeo que apresente propriedades defluxo melhoradas é obtido por um método como descrito na US 6.602.990(Berg) ou SE 0402322-2 (Berg et ai.)· Igualmente ditos métodos envolvemuma modificação do polissacarídeo tal como por alilação ou outra derivaçãodos polímeros de polissacarídeo antes de sua gelação, que intensificará arigidez do revestimento obtido após a reticulação. O portador de membranapode, por exemplo, ser celulose ou qualquer outro material hidrófilo; e opolissacarídeo de revestimento é vantajosamente agarose.

Em uma forma de realização vantajosa, o presente métodocompreende uma etapa de esterilização da matriz de separação reticuladaassim obtida. A esterilização pode ser realizada como debatido acima. Emuma forma de realização específica, a membrana de acordo com a invenção épreparada para uso único, também conhecida como um produto descartável. Ouso único é vantajoso, por exemplo, em casos onde a membrana é utilizadapara adsorver contaminantes, tais como contaminantes que por razões desegurança ou saúde são tratados com restrições. O uso único é tambémvantajoso em casos onde a pureza é de extrema importância, tal como naindústria farmacêutica. Uma outra vantagem de produtos de uso único é que anecessidade para validação de limpeza é eliminada.

Em uma forma de realização alternativa, a matriz de separaçãoé um monolito. Nesta forma de realização, um porogen é vantajosamenteadicionado para garantir a porosidade desejada do produto. Os porogensadequados são bem conhecidos neste campo, e podem, por exemplo, serpolietileno glicol. Outros detalhes a respeito da fabricação de monolitos sãobem conhecidos neste campo.

Finalmente, a presente invenção se refere ao uso de umamatriz de separação preparada como descrito acima para virtualmentequalquer espécie de moléculas alvos. Assim, em uma forma de realização dopresente uso, uma biomolécula ou uma molécula orgânica é isolada,purificada e/ou removida de um líquido. Desta maneira, este aspecto é ummétodo de cromatografia líquida, como debatido acima, e envolve a adsorçãode uma molécula alvo na matriz e opcionalmente uma etapa subseqüente dedessorção seletiva do alvo, comumente conhecida como eluição gradiente. Serequerido, uma ou mais etapas de lavagem são fornecida entre a adsorção eeluição. Alternativamente, o presente uso é para o retardo de uma moléculaalvo, em cujo caso o alvo é seletivamente retardado na coluna, quandocomparado com outros componentes. Neste caso, não existe nenhumanecessidade de uma etapa de eluição.

Em uma forma de realização, a presente coluna compreende departículas porosas essencialmente esféricas. A coluna de cromatografia podeser recheada com a matriz de separação de acordo com a invenção para usoem HPLC. Alternativamente, a matriz de separação de acordo com a invençãoé meramente enchida na coluna para permitir o uso em modo de leitofluidificado, também conhecido como adsorção de leito expandido (EBA).Em mais uma outra alternativa, a separação de acordo com a invenção é ummonolito que é polimerizado na coluna. Em uma forma de realizaçãovantajosa da invenção, a coluna compreendendo uma matriz de separação deacordo com a invenção foi esterilizada para permitir o uso único. Uma talcoluna de uso único ou descartável é especialmente vantajosa na indústriafarmacêutica, e às vezes também no campo de diagnóstico, quando aesterilidade é um problema.

A presente invenção também abrange um kit que compreende,em compartimentos separados, uma coluna de cromatografia compreendendouma matriz de separação como descrito acima; pelo menos um tampão; einstruções escritas relacionadas com a purificação de moléculas alvos.

Finalmente, a presente invenção diz respeito ao uso de umamatriz de separação preparada como descrito acima para qualquer espécie demolécula alvo. Assim, em uma forma de realização do presente uso, umabiomolécula ou uma molécula orgânica é isolada, purificada e/ou removida deum líquido. Assim, este aspecto é um método de cromatografia líquida, comodebatido acima, e envolve a adsorção de uma molécula alvo na matriz eopcionalmente uma etapa subseqüente de dessorção seletiva do alvo,comumente conhecida como eluição gradiente. Se requerido, uma ou maisetapas de lavagem são fornecidas entre a adsorção e eluição.Alternativamente, o presente uso é para o retardo de uma molécula alvo, emcujo caso o alvo é seletivamente retardado na coluna, quando comparado comoutros componentes. Neste caso, não existe nenhuma necessidade de umaetapa de eluição.

Em uma forma de realização do presente uso, um fluxo líquidode pelo menos cerca de 300 cm/h, tal como pelo menos 400, preferivelmentepelo menos 500 e mais preferivelmente pelo menos 700 cm/h, é aplicado auma matriz compreendida de partículas essencialmente esféricas queapresentam uma Kav de pelo menos cerca de 0,4 para dextrano de pesomolecular 110 kD.

Como se torna óbvio do acima, as moléculas alvos podem serquaisquer moléculas biológicas, tais como peptídeos, proteínas, tais comoreceptores e anticorpos monoclonais ou policlonais, ácidos nucléicos, taiscomo DNA, RNA e oligonucleotídeos, por exemplo, plasmídeos, vírus ecélulas procarióticas ou eucarióticas; ou moléculas orgânicas, tais comocandidatos de medicamento etc. Em uma forma de realização, o candidato demedicamento pode ser usado na medicina personalizada. A matriz deseparação preparada de acordo com a presente invenção é também útil paraseparar as moléculas alvos úteis na indústria de alimento e bebida, tal como apurificação de gêneros alimentícios funcionais e/ou a purificação de umabebida da contaminação de moléculas alvos. As moléculas alvos bemconhecidas da indústria de alimentos são produtos de soro de leite, tais comovárias proteínas de leite.

Um último aspecto da presente invenção é o uso da matriz deseparação preparada de acordo com a presente invenção como um portadorpara o crescimento de células aderentes em cultura. Tais células podem, porexemplo, ser células troncos embriônicas ou adultas. Um outro uso da matrizé para a imobilização de enzimas para produzir um biocatalisador.

PARTE EXPERIMENTAL

Os presentes exemplos são fornecidos para propósitosilustrativos apenas, e não devem ser interpretados como limitativos dapresente invenção como definido pelas reivindicações anexas. Todas asreferências dadas abaixo e em outras partes no presente relatório descritivosão por meio desta aqui incluídas por referência.

Materiais e Métodos

Propriedades da partícula

Dextranos para a avaliação Kd de protótipos

Dextrano puro 5 mg/ml

M= 1963OO 10 mg/ml

M= 123600 10 mg/ml

M=66700 10 mg/ml

M=43500 10 mg/ml

M=4440 10 mg/ml

M= 1080 10 mg/ml

Todos os dextranos diluídos com solução de NaCl 0,2 M, coma exceção de dextrano puro que foi diluído em NaCl 0,25 M.

Teste de efetividade

O teste de efetividade foi executado usando umÀKTA™explorer (ID 494) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) mediante ainjeção de solução de acetona a 1 %. Este teste fornece um valor da qualidadedo recheio da coluna. A assimetria aprovada está na faixa de 0,75 a 1,25 e umnúmero de placa >1000 Nm.

Seletividade

A avaliação Kd foi realizada usando um ÀKTA™explorer (ID494) equipado com um classificador automático A-900. Um Shimadzu RI-detector (RJD-IOA) foi conectado ao sistema ÀKTA™ para detecção dasamostras de dextrano. As seguintes condições foram usadas:

Fluxo: 0,2 ml/min

Fase Móvel: 0,2 M NaCl

Circuito de injeção: 100 μΐ

Avaliação

Os picos de dextrano foram avaliados de acordo com osmétodos bem conhecidos neste campo. Os valores Kd foram depois calculadoscomo uma medida de superfície de poro disponível como se segue:

Kd = (Ve-V0)/(Vc-Vo-matriz de gel) = (Ve-V0)/(Vt-V0)

Ve = volume de retenção de dextrano eluído (ml)

V0 — volume de vazio (retenção de dextrano puro) (ml)

Vc = volume de coluna calculado (altura do leito (cm) χ áreasuperficial da coluna (cm )) (ml)

Vt - volume líquido total (volume de retenção de NaCl) (ml)

Exemplo 1: Síntese geral de partículas de polissacarídeo

Tratamento de sal: Aproximadamente 1,5 g de Sepharose™HP não reticulada (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) foi lavado com10 volumes de leito de água deionizada para fornecer uma suspensão aquosade partículas de gel de 75 %. Os sais como especificados abaixo para cadaprotótipo foram depois adicionados na suspensão. A mistura de reação foiaquecida para a temperatura especificada abaixo para cada protótipo durante30 minutos com agitação antes do esfriamento para baixo de 30 0C com banhode gelo. Os sais na suspensão foram depois removidos mediante a lavagem dogel com 10 volumes de leito de água em um funil de vidro de sintetização.

Reticulação: A reticulação foi executada com epicloroidrinacomo o agente de reticulação e de acordo com Porath (Gel product forseparation, 1982, EP 81850244) com 4 vezes a epicloroidrina mencionada eNaOH.

Funcionalização: Para fornecer um trocador de ânion, gruposde amônio quaternário (grupos Q) foram ligados às partículas reticuladas deacordo com os métodos bem conhecidos. Titulação de Cl" com 0,1 M AgNO3foi executada após a ligação para medir a quantidade de grupos Q funcionais.

Recheio da coluna: As partículas preparadas como descritoacima foram recheadas em colunas HR 5/20 (GE Heathcare, Uppsala,Sweden) com água deionizada como o líquido de recheio. As colunas foramprimeiro recheadas em uma vazão de 306 cm/h durante aproximadamente 15minutos e depois em uma vazão de 764 cm/h durante aproximadamente 15minutos. O recheio da coluna foi testado pela medição da assimetria máximaapós a injeção de 25 μΐ de acetona a 0,4 % em uma vazão de 76 cm/h. Ascolunas com assimetria máxima entre 0,8 e 1,8 foram consideradas aceitáveisneste estudo.

Exemplos de 2 a 4: Protótipos de partícula

Partindo das matrizes de Sepharose comercialmentedisponíveis, os protótipos foram preparados como descrito acima com sais,tempos de tratamento e durações variáveis. Os resultados são relatados nasTabelas abaixo.

Exemplos de 5 a 6: Exemplos de partícula comparativos

Dois exemplos comparativos foram executados, testando asduas matrizes de Sepharose™ usadas como materiais de partida nos Exemplosde 2 a 4 acima, mas omitindo a etapa de tratamento de sal.

ResultadosTabela 1: Vazões

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Tabela 2: Teste da eficácia

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* Assimetria aceitável para o presente propósito

** Mesmo após repetir este recheio 4 vezes, ainda não cumpriu os critérios estabelecidosno presente teste.

Tabela 3: Superfície de poro disponível

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Exemplos de 7 a 10: Tratamento de sal das Membranas

Exemplo 7: Impregnação da membrana com solução deagarose - Membrana A

Uma solução de agarose a 1 % foi preparada por dissolver 0,3g de agarose em 30 ml de água a 95 0C durante 3 h. Uma membrana decelulose regenerada (Sartorius, 0,45 μηι, produto no. 3S18406-047N) foidepois imersa na solução de agarose durante 1 h a 95 0C. A membrana foidepois removida da solução de agarose e deixada esfriar para a temperaturaambiente de modo que a agarose pode formar gel dentro da estrutura demembrana.

Exemplo 8: Tratamento da membrana em solução de sal

Membrana B

A membrana A híbrida preparada como descrito no Exemplo 7foi imersa em sulfato de amônio ((NlrLO2SCU (solução 1 M) (50 ml) em 96 0Cdurante lhe depois removida da solução e deixada esfriar. A membrana foilavada extensivamente com água.

Exemplo 9: Medição da capacidade de fluxo da membrana

Um pedaço da membrana preparada e tratada como descritoacima foi colocado em um funil de filtro de 15 mm de diâmetro e 0,7 bar devácuo foi aplicado. 50 ml de água foram despejados no funil e um cronômetrofoi iniciado. O tempo até que toda a água tenha passado na membrana foiregistrado. Análise em triplicata foi executada.

O fluxo em ml por centímetro quadrado e min foi calculado.

Exemplo 10: Resultados sobre a capacidade de fluxo damembrana

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Claims

1. Método de preparação de uma matriz de separaçãoinsolúvel, caracterizado pelo fato de que o método compreende tratamento desal de um gel de polissacarídeo seguido pela reticulação dos polímeros depolissacarídeo.

2. Método de preparação de uma matriz de separação,caracterizado pelo fato de que o método compreende(a) fornecimento de uma suspensão aquosa de partículascompreendidas de polissacarídeo nativo em forma de gel;(b) tratamento de sal das partículas colocadas em suspensão mediante aadição de pelo menos um sal; e(c) reticulação das partículas tratadas com sal.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que o polissacarídeo é agarose.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o(s) sal(is) é/são adicionado(s) atéuma concentração de sal na suspensão na faixa de 0,5 a 1,3 M.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o ânion do sal adicionado na etapa(b) é um sulfato.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o cátion do sal é selecionado dogrupos que consiste de Mg; Na; K; Li e Cu.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o cátion do sal é selecionado do grupo que consiste de Mg e Na.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o sal é MgSC>4.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a temperatura durante otratamento de sal está na faixa de 94 a 98 0C.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a temperatura durante o tratamento de sal é de cerca de 96oC.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que as partículas de polissacarídeo daetapa (a) foram preparadas mediante a emulsificação em um solventeorgânico.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que as partículas são lavadas após aemulsificação.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que na etapa (c), a etapa de reticulaçãocompreende a adição de um agente de reticulação.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapasubseqüente de ligação de ligandos de cromatografia aos grupos de hidroxilado polissacarídeo em forma de gel.

15. Matriz de separação de polissacarídeo reticulado,caracterizada pelo fato de ser produzida como definido em qualquer uma dasreivindicações precedentes.

16. Matriz de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o volume de poro disponível corresponde a um valor Kav paraum dextrano de 110 kD de pelo menos 0,5.

17. Coluna de cromatografia, caracterizada pelo fato de quecompreende uma matriz de separação como definido em qualquer uma dasreivindicações de 15 a 16.

18. Método de preparação de uma matriz de separação,caracterizado pelo fato de que o método compreende(i) fornecer uma solução aquosa de um polissacarídeo nativogelificável;(ii) diminuir a temperatura da solução de polissacarídeo para um valorabaixo de seu ponto de gelação;(iii) tratamento de sal mediante a adição de pelo menos um sal aopolissacarídeo resultante de (ii); e(iv) reticular o polissacarídeo tratado com sal.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o(s) sal(is) é/são adicionado(s) até uma concentração de salna faixa de 0,5 a 1,3 M.

20. Matriz de separação de polissacarídeo reticulado,caracterizada pelo fato de ser produzida de como definida em qualquer umadas reivindicações de 18 a 19.

21. Matriz de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo fato de que é uma membrana ou um monolito.

22. Método de preparação de uma matriz de separação,caracterizado pelo fato de que o método compreende(i) fornecer um portador de membrana porosa e colocar em contatodito portador com uma solução aquosa de um polissacarídeogelificável;(ii) diminuir a temperatura da solução de polissacarídeo para um valorabaixo de seu ponto de gelação;(iii) tratamento de sal mediante a adição de pelo menos um sal; e(iv) reticular o polissacarídeo tratado com sal.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o portador de membrana apresenta uma superfície hidrófila.

24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 23,caracterizado pelo fato de que o portador de membrana é produzido decelulose.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é um polissacarídeonativo.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 22 a 25, caracterizado pelo fato de que o(s) sal(is) é/são adicionados em umaconcentração de sal na solução na faixa de 0,5 a 1,3 M.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 22 a 26, caracterizado pelo fato de que a temperatura durante o tratamento desal está na faixa de 94 a 98 0C.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 22 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa subseqüente deligação de ligandos de cromatografia aos grupos de hidroxila do revestimentode polissacarídeo gelificados.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 22 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de esterilizaçãoda matriz de separação reticulada assim obtida.

30. Uso de uma matriz de separação como definido emqualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de serpara purificar, isolar e/ou remover uma biomolécula ou uma moléculaorgânica de um líquido.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que o fluxo da fase móvel aplicado na matriz de separação é pelomenos cerca de 300 cm/h.