ES2608638T3 - Método para preparar una matriz de separación - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un matriz de separación, cuyo método comprende: (a) proporcionar una suspensión acuosa de partículas comprendida por un polisacárido nativo gelificado; (b) tratamiento de sal de las partículas suspendidas por adición de al menos una sal; y (c) retrocruzamiento de las partículas tratadas con sal, En la que la sal(es) se añade hasta una concentración de sal en la suspensión en el intervalo de 0,5 a 1,3 M y en el que la temperatura durante el tratamiento de sal está en el intervalo de 94-98ºC.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para preparar una matriz de separacion Campo tecnico

La presente invencion se refiere a la separacion y purificacion de moleculas objetivo, tales como biomoleculas, y mas especfficamente a un metodo nuevo para preparar una matriz de separacion.

Antecedentes

Los avances recientes en el campo de la biotecnologfa han requerido tecnicas mas rapidas y mas precisas para recuperacion, purificacion y analisis de sustancias biologicas y bioqufmicas, tales como protefnas. La cromatograffa es una tecnica de purificacion comunmente usada en este campo. En cromatograffa, se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Mas especfficamente, la molecula objetivo se introduce en una fase movil, que se pone en contacto con una fase estacionaria. La molecula objetivo despues se somete a series de interacciones entre las fases estacionaria y movil a medida que avanza hacia el sistema mediante la fase movil. Las interacciones se valen de las diferencias en las propiedades ffsicas o qufmicas de los componentes de la muestra. En cromatograffa lfquida, una muestra lfquida, opcionalmente combinada con un tampon adecuado, constituye la fase movil, que se pone en contacto con una fase estacionaria, conocida como una matriz de separacion. Normalmente, la matriz comprende un soporte al que los ligandos, que son grupos capaces de reaccionar con el objetivo, se han emparejado.

Las matrices de separacion normalmente estan basadas en soportes hechos a partir de materiales inorganicos, tales como silicio, o materiales organicos, tales como polfmeros sinteticos o naturales. Los polfmeros sinteticos, tales como estireno y divinilbenceno, a menudo se usan para soportes que muestran algo de hidrofobicidad, tales como cromatograffa de exclusion de tamano, cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) y cromatograffa de fase inversa (RPC). Ademas, algunas veces son preferentes los polfmeros sinteticos sobre los polfmeros naturales, ya que facilmente se hacen mas rfgidos y resistentes a presion, dando como resultado soportes que proporcionan propiedades de fluidez mas ventajosas.

Los polfmeros naturales, que comunmente son polisacaridos tal como agarosa, se han utilizado como soportes de matrices de separacion durante decadas. Debido a la presencia de grupos hidroxilo, las superficies de los polfmeros naturales normalmente son hidrofilos, dando interacciones esencialmente no especfficas con protefnas. Otra ventaja de los polfmeros naturales, que tiene importancia especffica en la purificacion de medicamentos o moleculas de diagnostico para uso interno humano, son sus propiedades no toxicas. La agarosa se puede disolver en agua a temperatura creciente, y entonces formara un gel poroso al enfriarse hasta cierta temperatura (el punto de gelificacion). Al calentar, el gel se fundira de nuevo a una temperatura (el punto de fusion), que normalmente es considerablemente mas alta que el punto de gelificacion. La gelificacion implica agregacion helice-helice de los polfmeros de polisacarido, y algunas veces es referida como un retrocruzamiento ffsico.

Como se menciono anteriormente, los polfmeros naturales son menos rfgidos y resistentes a presion que los polfmeros sinteticos, y en consecuencia se han desarrollado metodos para mejorarlos. Por ejemplo, mediante la variacion de la concentracion de polisacaridos, se puede incrementar la porosidad, dando como resultado mejora del transporte de masa objetivo e incremento del area con la que el objetivo interactua durante la cromatograffa. Otro parametro esencial a considerar es las propiedades de fluidez del soporte, por ejemplo en un lecho compacto de matriz de separacion en partfculas. Cuando la fase movil se fuerza a traves del lecho, la presion posterior se controla principalmente mediante los canales intersticiales entre las partfculas. A velocidad de fluido lenta, las partfculas se pueden considerar como incompresibles y despues la presion posterior incrementa linealmente con la velocidad de flujo, con la pendiente dependiente del tamano de partfcula. A medida que la velocidad de flujo aumenta, las partfculas pueden empezar a deformarse bajo la presion hidrostatica, dando como resultado diametros en disminucion de los canales intersticiales y un rapido incremento de la presion posterior. A cierta velocidad de flujo, dependiendo de la rigidez de la matriz, el lecho colapsa y la presion posterior se aproxima a infinito.

La manera mas comun de mejorar la rigidez y por tanto las propiedades de fluidez de agarosa es su retrocruzamiento qufmico. Tal retrocruzamiento se da entre grupos hidroxilo disponibles, y se puede obtener mediante metodos comunmente conocidos usando por ejemplo epiclorhidrina.

La patente de EEUU 4.973.683 (Lindgren) se refiere al retrocruzamiento de geles porosos de polisacaridos, y mas especfficamente a un metodo para mejorar la rigidez mientras se minimiza la interaccion no especffica de un gel poroso de polisacarido. El metodo implica proporcionar un gel de agarosa y un reactivo denominado “monofuncional”, que comprende un grupo de reaccion tal como un grupo halogeno o un grupo epoxi, y un doble enlace. El reactivo se une al gel por medio de su grupo de reaccion; y despues el doble enlace se activa en epoxido o halohidrina, que finalmente reacciona con los grupos hidroxilo de la agarosa para proporcionar retrocruzamiento.

La patente de EEUU 5.135.650 (Hjerten et al) se refiere a partfculas en fase estacionaria altamente comprensibles por cromatograffa, tales como gotas de agarosa, que se ha constatado que son suficientemente rfgidas para HPLC y no porosas hasta el punto de que son impenetrables por solutos. Mas especfficamente, las gotas Hjerten se

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producen a partir de gotas de agarosa porosas, que se ponen en contacto con un disolvente organico para disminuir la porosidad, despues de lo que la superficie de las gotas dentro de los poros disminuidos es retrocruzan para fijar los poros en su estado disminuido. Alternativamente, las gotas se producen rellenando los poros con una sustancia polimerizable, que se injerta a la superficie de los poros, y realiza polimerizacion injertada. Un estado avanzado de la invencion descrita es que una fase estacionaria sencilla es eficaz a altas presiones y aun se puede usar a bajas presiones. Sin embargo, el uso de disolventes, especialmente los disolventes que se usan en la presente patente, se evita en general por razones de salud y seguridad.

La patente de EEUU 6.602.990 (Berg) se refiere a un proceso para la produccion de un gel de polisacarido retrocruzado poroso, en el que se anade una gente retrocruzado funcional a una disolucion de polisacarido y se deja que se una mediante su sitio activo a los grupos hidroxilo del polisacarido. Despues se forma un gel de polisacarido a partir de la disolucion, despues de lo que el sitio inactivo del agente retrocruzado se activa y se realiza el retrocruzamiento del gel. Por tanto, el agente retrocruzado se introduce en la disolucion de polisacarido, al contrario de los metodos discutidos anteriormente en los que se anade a un gel de polisacarido. El agente retrocruzado bifuncional comprende un sitio activo, es decir un grupo capaz de reaccionar con grupos hidroxilo del polisacarido, tales como haluros y epoxidos, y un sitio inactivo, es decir un grupo que no reacciona bajo las condiciones que reacciona el sitio activo, tales como grupos alilo. Por tanto, el presente agente retrocruzado bifuncional corresponde a los “reactivos monofuncionales” usados segun la patente de EEUU 4.973.683 (Lindgren) discutida anteriormente. Las partfculas que comprenden el gel que resulta han mostrado presentar una capacidad mejorada de resistencia a alta velocidad de flujo y presion posterior. Una desventaja con el metodo de la patente de EEUU 6.602.990 es que se requiere bromo para la activacion del agente retrocruzado.

La patente de EEUU 5.998.606 (Grandics) se refiere a un metodo para sintetizar matrices de cromatograffa, en el que el retrocruzamiento y funcionalizacion de una matriz tiene lugar simultaneamente. Mas especfficamente, los dobles enlaces que se proporcionan en la superficie de una matriz de hidrato de carbono polimerica se activan en presencia de un catalizador metalico para retrocruzar la matriz y funcionalizarla con grupos halohidrina, carboxilo o sulfonato. Los dobles enlaces se proporcionan en la superficie de la matriz por contacto con un reactivo activador, que contiene un atomo halogeno o epoxido y un doble enlace. Por tanto, el reactivo activador de la patente de EEUU 5.998.606 corresponde al reactivo monofuncional de la patente de EEUU 4.973.683 y al agente retrocruzado bifuncional de la patente de EEUU 6.602.990.

Qi et al (Journal of Functional Polymers, Vol. 13, March 2000: “Preparation of Two Types of Immobilized Metal - Chelated Complex Affinity membrane Chromatography Media”) describe como se producen membranas con afinidad a celulosa macroporosa usando papel de filtro de celulosa como la matriz, sometiendo a tratamiento alcalino, activacion por epoxidacion, emparejamiento con iminodiacetato disodio, e inmovilizacion de Cu2+. Ademas, la agarosa se retrocruzo covalentemente sobre las membranas de postactivacion para producir membranas que poseen una estructura tipo sandwich.

La patente de EEUU 2005/0220982 (Moya et al) se refiere a un metodo para formar estructuras de polisacaridos tales como gotas, pelfculas de gel y recubrimientos porosos sobre sustratos porosos formando una disolucion inhibidora de gel a temperatura ambiente, uno o mas agente(s) inhibidor de gel y un disolvente tal como agua, calentar la mezcla hasta que todos los componentes esten disueltos, enfriar la mezcla como una disolucion hasta aproximadamente temperatura ambiente, formar una estructura tridimensional con la disolucion y anadir la estructura a un agente gelificante para formar un gel polisacarido. El agente que inhibe el gel se basa por ejemplo en sales de zinc, litio o sodio. El recubrimiento del polisacarido se considera que es suficientemente grueso para permitir que se de flujo difusor en la misma capa de polisacarido. Una ventaja declarada del metodo descrito es que las estructuras se forman a temperatura ambiente y con gelificacion controlada del polfmero con polfmeros de polisacarido que normalmente gelifican bien a temperatura superior a ambiente. Tambien se declara que el recubrimiento de superficies se logra sin bloquear significativamente los poros con el polisacarido. Sin embargo, tales operaciones a temperatura ambiente requeriran control cuidadoso de la disolucion de agarosa, que hace al proceso global relativamente consumidor de tiempo.

El documento WO03091315 describe la preparacion de matrices de separacion basados en gotas de polisacarido con estructura de poro adecuada para cromatograffa de protefna. Este documento menciona que el retrocruzamiento puede incrementar la estabilidad mecanica de las matrices.

Por tanto, incluso aunque estan disponibles tecnicas para producir matrices de separacion de polisacaridos retrocruzados, diferentes aplicaciones futuras pondran diferentes requerimientos sobre la matriz, dando como resultado una necesidad permanente de metodos alternativos.

Breve descripcion de la invencion

Un aspecto de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar una matriz de separacion de polisacarido, cuya matriz presenta propiedades de flujo adecuadas para procesado a gran escala. Esto se puede lograr preparando una matriz de separacion segun se define en las reivindicaciones adjuntas.

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Un aspecto especffico de la presente invencion es proporcionar un metodo para preparar una matriz de separacion de polisacarido en partfculas, que permite retrocruzamiento con riesgo reducido de agregacion. Esto se puede lograr mediante una matriz de separacion preparada segun se define en las reivindicaciones adjuntas, que se puede retrocruzar a temperaturas mas altas que las que se usan convencionalmente.

Un aspecto especffico de la presente invencion es proporcionar un metodo que permita fabricar una matriz de separacion porosa de rigidez mejorada sin disminuir la estructura porosa. Esto se puede lograr usando el metodo definido en las reivindicaciones adjuntas para preparar una matriz de separacion, el tamano de poro que permite a las moleculas objetivo entrar por los poros. Este aspecto es ventajoso para la purificacion y/o aislamiento de moleculas objetivo relativamente pequenas, tales como protefnas, a velocidad de flujo incrementada.

Otros aspectos y ventajas de la presente invencion se haran aparentes a partir de la siguiente descripcion detallada.

Definiciones

El termino matriz de separacion “en partfculas” significa en la presente memoria una matriz de separacion que comprende partfculas, tales como esencialmente partfculas esfericas o partfculas de formas menos regulares.

El “punto de gelificacion”, algunas veces en la presente memoria llamada “temperatura de gelificacion” significa la temperatura a la que los polfmeros de una disolucion interactuan ffsicamente para formar un gel solido.

El termino “gelificable” significa en la presente memoria capaz de formar un gel tfsico.

El termino polisacarido “nativo” se refiere a un polisacarido en un estado no modificado, es decir, un polisacarido que no se ha sustituido o derivado.

El termino “matriz” de separacion significa en la presente memoria un material que comprende un soporte solido poroso o no poroso, al que se han unido los ligandos. En el campo de la cromatograffa, a la matriz de separacion a veces se la llama resina o medio.

El termino “ligandos” se usa en la presente memoria en su significado convencional, es decir para entidades qufmicas que son capaces de interactuar con una molecula objetivo, tales como grupos cargados capaces de interactuar con una molecula objetivo con carga opuesta en un proceso de intercambio de iones.

Kav es un parametro de filtracion de gel (cromatograffa de exclusion de tamano) definido como (Ve-Vo)/(Vt-Vo), donde Ve es el volumen de elucion del pico de molecula de prueba, Vo es el volumen vacfo de la columna y Vt es el volumen de lecho total. Kav es una medida de la fraccion del volumen de fase estacionaria accesible a la molecula de prueba particular.

KavDx es Kav para moleculas de dextrano. En los ejemplos, se ha usado dextrano de peso molecular de 110 kD, 500 kD y 1000 kD, respectivamente.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar una matriz de separacion insoluble, tal como partfculas, un monolito o una membrana, mediante tratamiento con sal de un gel de polisacarido seguido de retrocruzamiento de los polfmeros de polisacarido. El metodo puede incluir una etapa precedente de proporcionar el gel de polisacarido a partir de una disolucion, preferentemente mediante la disminucion de su temperatura. El gel se puede proporcionar como un recubrimiento de un vehfculo de membrana; como partfculas de polisacarido; o como un recubrimiento sobre partfculas hecho de un material diferente. El gel ventajosamente es poroso.

Por tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para preparar una matriz de separacion, segun la reivindicacion 1.

El polisacarido puede ser cualquier polisacarido capaz de formar un gel, preferentemente mediante un cambio de temperatura, y se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en agarosa, agar, celulosa, dextrano, almidon, quitosano, konjac, curdlan, carragenano, pectina, gellan, y alginato. Como entendera el experto en la tecnica, tales partfculas de polisacarido gelificadas ventajosamente estan comprendidas por un polisacarido, pero la presente invencion tambien implica el uso de partfculas que comprenden una mezcla de uno o mas polisacaridos. En una realizacion ventajosa del presente metodo, el polisacarido es agarosa. En un metodo especffico, un nucleo de partfcula o vehfculo se recubre con un polisacarido segun se describio anteriormente. El vehfculo puede estar segun se describe a continuacion en el contexto del vehfculo de membrana. Como se ve de lo anterior, segun la presente invencion, las partfculas de polisacaridos proporcionadas en la etapa (a) comprenden un polisacarido nativo, es decir, un polisacarido cuyos polfmeros no se han sometido a ninguna modificacion o sustitucion tal como derivacion o retrocruzamiento. Por tanto, la presente invencion anade sal a polisacarido no modificado.

En una realizacion ventajosa, las partfculas de polisacarido esencialmente son partfculas esfericas (gotas). En el campo de la cromatograffa, el tamano de partfcula comunmente se da como el tamano medio de partfcula de la distribucion de volumen acumulativo. En el presente metodo, el tamano medio de las gotas puede estar en el

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intervalo de 10-300 pm, preferentemente 30-200 pm o mas preferentemente 45-165 pm, tal como aproximadamente 45 pm, en diametro.

Tales gotas de polisacarido se preparan facilmente por el experto en la tecnica en este campo segun los metodos estandar, tal como gelificacion por suspension inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Por ejemplo, cuando se prepara agarosa, se obtienen gotas de agarosa mediante disolucion o dispersion de la agarosa en un disolvente acuoso, tal como agua, o cualquier otro disolvente usado comunmente, a una temperatura por encima de su punto de fusion. La agarosa disuelta despues se emulsiona en un disolvente organico comunmente usado tal como tolueno o heptano agitando, despues de lo cual la temperatura se reduce por debajo del punto de gelificacion de la agarosa, convenientemente a temperatura ambiente. En el presente metodo, las gotas asf producidas se lavan ventajosamente para eliminar cualquier resto de disolvente, p. ej. con etanol o agua, y se suspenden en agua o en una disolucion acuosa adecuada. Por tanto, en una realizacion ventajosa, las partfculas se lavan antes de la etapa de retrocruzamiento.

Como comprende la persona experta en este campo, hay otros metodos de preparar la disolucion acuosa de partfculas de polisacarido aparte de emulsion. Por tanto, en una realizacion alternativa, las partfculas de polisacarido se obtienen por pulverizado de una composicion, que esta comprendida por un polisacarido gelificable termalmente en un medio acuoso, en el aire ambiente y permitiendo a la composicion atomizada gelificar en el aire, segun se describe p. ej. en la patente de EEUU 6.248.268 (FMC Corporation), que se incorpora en la presente memoria mediante referencia.

En una realizacion alternativa, las partfculas de polisacarido tienen forma irregular, tal como la que se obtiene por ejemplo simplemente preparando un segmento grande de polisacarido y triturandolo en partfculas de tamano medio adecuado. Aun en otra realizacion alternativa, las partfculas de polisacarido se alargan tal como partfculas ovales o como fibras.

La sal anadida en la etapa (b) del presente metodo puede ser cualquier sal capaz de proporcionar la rigidez deseada a temperatura seleccionada y concentracion de sal, pero preferentemente esta compuesta de dos iones que ambos estan en el orden mas alto de la serie de Hofmeister.

En una realizacion, el anion de la sal que se anade en la etapa (b) es un sulfato o un fosfato, preferentemente sulfato. En otra realizacion, el cation del a sal se selecciona a partir del grupo que consiste en Mg; Li; Na; K, y NH4. En una realizacion ventajosa, el cation de la sal se selecciona a partir del grupo que consiste en Mg y Na. Por tanto, la sal anadida en la etapa (b) puede ser p. ej. MgSO4 o Na2SO4. En una realizacion ventajosa, la sal es MgSO4.

La sal(es) anadida en la etapa (b) se puede anadir en disolucion acuosa o forma solida. En una realizacion, la cantidad de sal(es) anadida en la etapa (b) es suficiente para proporcionar una concentracion final de la disolucion que esta en el intervalo de 0,5-1,3 M. En una realizacion especffica, la concentracion de sal en la disolucion esta por debajo de 1,0 M, tal como en el intervalo 0,5-1,0 M, y preferentemente 0,5-0,8 o 0,8-1,0 M. En una realizacion alternativa, la concentracion de sal en la disolucion esta por encima de 1,0 M, tal como en el intervalo 1,0-1,3 M, y preferentemente 1,0-1,2, p. ej. aproximadamente 1,1 M o 1,2-1,3 M.

La disolucion a la que se ha anadido la sal se mantiene a una temperatura incrementada durante un tiempo suficiente para que las propiedades de los polisacaridos cambien hacia las propiedades de flujo mejoradas y rigidez mejorada observado por los presentes inventores, preferentemente con agitado. La duracion del tratamiento de sal se determina facilmente por la persona experta en este campo, y puede p. ej. durar hasta una hora, tal como 20-40 minutos, y ventajosamente durante aproximadamente 30 minutos. Por tanto, la temperatura durante el tratamiento de sal se mantiene en cualquier punto en el intervalo 94-98°C, y se adapta dependiendo de las propiedades deseadas de la matriz. En una realizacion, la temperatura esta en el intervalo de 94-96°C, tal como 94-95°C o 95- 96°C, tal como 94, 95 o 96°C. En otra realizacion, la temperatura esta en el intervalo de 96-98°C, tal como 96-97°C o 97-98°C, tal como 97 o 98°C.

En una realizacion ventajosa, el presente metodo comprende tratamiento de sal, preferentemente mediante adicion de sulfato, tal como Na2SO4 o MgSO4, a una temperatura de 96°C.

En una realizacion mas ventajosa, el metodo comprende tratamiento de sal mediante adicion de Na2SO4 o MgSO4 hasta una concentracion de sal en la disolucion de 1,0 M, dandose el tratamiento a una temperatura de 96-97°C.

Como se muestra a partir de lo anterior, las partfculas de polisacarido se retrocruzan en la etapa posterior a la adicion de sal. En una realizacion preferente, en la etapa (c), la etapa de retrocruzamiento comprende la adicion de un agente de retrocruzamiento. El agente de retrocruzamiento puede ser cualquier monomero adecuado o reactivo funcional conocido por polimerizar polisacaridos, tales como epiclorhidrina, divinilsulfona, diepoxidos, diisocianatos, etc. El retrocruzamiento de polisacaridos se conoce bien en este campo, vease p. ej. la patente de EEUU 4.973.683 y EEUU 6.602.990 discutidas anteriormente. Una ventaja del presente metodo es que permite la fabricacion de partfculas de polisacarido muy rfgidas mediante retrocruzamiento a una temperatura mas alta que las tecnicas comunmente usadas, que a cambio reduce o incluso elimina la formacion de agregados. Sin desear ser limitante de cualquier teorfa especffica, se puede asumir que esta caracterfstica esta relacionada con la adicion de sal antes del retrocruzamiento.

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En una realizacion, el presente metodo comprende una etapa posterior de anadir ligandos de cromatograffa a grupos hidroxilo de la matriz de polisacarido retrocruzada. Anadir ligandos por cromatograffa, tambien conocido como funcionalizacion o a veces derivacion, a una matriz insoluble se puede proporcionar por adicion de grupos cargados o cargables para preparar una matriz de intercambio de iones; por adicion de grupos que muestran afinidad biologica para preparar una matriz de afinidad; por adicion de grupos quelantes para hacer una matriz por cromatograffa de afinidad por metales inmovilizados (IMAC); o por adicion de grupos hidrofobos para hacer una matriz por cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC). Alternativamente, grupos conocidos como multimodales, es decir, grupos que contienen mas de un grupo, tales como grupos de intercambio de iones ademas de grupos hidrofobos, se adicionan a la matriz preparada segun la invencion. En una realizacion especffica, los grupos funcionales son ligandos de intercambio de iones seleccionados a partir del grupo que consiste en amonio cuaternario (Q), dietilaminoetil (DEAE), dietilaminopropil, sulfopropil (SP), y grupos carboximetil (CM). Los metodos para la adicion de grupos funcionales a un soporte insoluble tal como una matriz de separacion son muy conocidos por la persona experta en este campo y pueden implicar una etapa precedente de alilacion del sustituyente y uso de reactivos y condiciones estandar. (Vease p. ej. Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K, Smith, Academic Press , INC, 1992). En una realizacion preferente, la matriz de separacion retrocruzada se proporciona con extensores, tambien conocidos como brazos flexibles, tentaculos, o hueco, antes de la funcionalizacion. Un extensor muy conocido es dextrano; vease p. ej. la patente de EEUU 6.537.793 donde se describe en mas detalle la adicion de extensores a una matriz de polisacarido.

La matriz de separacion de polisacarido preparada segun la invencion esta comprendida por partfculas porosas, esencialmente esfericas. En una realizacion, las partfculas muestran un valor Kav para un dextrano de 110 kDa de al menos aproximadamente 0,4, preferentemente >0,5. En una realizacion ventajosa, las partfculas se han proporcionado con ligandos de cromatograffa. En esta realizacion, los poros son de un tamano suficiente para permitir la entrada de las moleculas objetivo que hay que separar, por lo tanto mejora la capacidad de union de las partfculas. Ademas, el metodo de preparacion descrito anteriormente proporciona una matriz suficientemente rfgida para procesado a gran escala. Esta realizacion es util para cualquiera de las moleculas objetivo del ejemplo siguiente en el contexto del aspecto de uso, pero es particularmente ventajoso para moleculas objetivo relativamente pequenas tales como protefnas.

Incluso aunque anteriormente se ha discutido una matriz de separacion en la forma de partfculas, como comprende la persona experta en este campo, el presente metodo es igualmente util para hacer matrices de separacion de otros formatos. Por tanto, la matriz de separacion segun la presente invencion se puede preparar de cualquier forma comunmente usada, tales como monolitos; filtros o membranas; laminas; superficies; capilares; fibras, etc.

Como se ve de lo anterior, el polisacarido se prepara en partfculas.

Finalmente, la matriz de separacion preparada segun se describe anteriormente se puede emplear para cualquier tipo de molecula objetivo tal como una biomolecula o una molecula organica aislada, purificada y/o eliminada de un lfquido. Por tanto, este aspecto es un metodo de cromatograffa lfquida, como se discutio anteriormente, e implica adsorber una molecula objetivo a la matriz y opcionalmente una etapa posterior de desadsorcion selectiva del objetivo, comunmente conocido como elucion en gradiente. Si se requiere, se proporcionan una o mas etapas de lavado entre adsorcion y elucion. Alternativamente, el presente uso es para retardar una molecula objetivo, en cuyo caso el objetivo se retarda selectivamente en la columna, comparado con otros componentes. En este caso, no hay necesidad de una etapa de elucion.

En una realizacion del presente uso, un lfquido que fluye a al menos aproximadamente 300 cm/h, tal como al menos 400, preferentemente al menos 500 y mas preferentemente al menos 700 cm/h, se aplica a una matriz que comprende esencialmente partfculas esfericas que muestran un Kav de al menos aproximadamente 0,4 para dextrano de peso molecular de 110 kD.

Como se ve de lo anterior, las moleculas objetivo pueden ser moleculas biologicas, tales como peptidos, protefnas, tales como receptores y anticuerpos monoclonales o policlonales, acidos nucleicos, tales como ADN, ARN y oligonucleotidos, p. ej. plasmidos, virus, y celulas procariotas o eucariotas; o moleculas organicas, tales como candidatos para medicamentos. En una realizacion, el candidato para medicamento se puede usar en medicina personalizada. La matriz de separacion preparada segun la presente invencion tambien es util para separar moleculas objetivo utiles en la industria alimentaria y de bebidas, tal como purificacion de productos alimentarios funcionales y/o la purificacion de una bebida a partir de moleculas objetivo contaminantes. Moleculas objetivos muy conocidas en la industria alimentaria son productos de suero, tal como varias protefnas de leche.

Parte experimental

Los presentes ejemplos se proporcionan solo con propositos ilustrativos, y no pretenden ser limitantes de la presente invencion segun se define en las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias que se dan a continuacion y en cualquier sitio de la presente especificacion se incluyen en la presente memoria como referencia.

Materiales y metodos. Propiedades de partfcula.

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Dextranos para evaluacion Kd de prototipos.

Dextrano original

5 mg/ml 10 mg/ml 10 mg/ml 10 mg/ml 10 mg/ml

M =196300

M =123600

M = 66700

M = 43500

M = 4440

10 mg/ml 10 mg/ml

M = 1080

Todos los dextranos diluidos con disolucion 0,2 M de NaCl, con excepcion del dextrano original que se diluyo en 0,25 M de NaCl.

Prueba de eficacia.

Se llevo a cabo la prueba de eficacia usando un explorador AKTA™ (ID 494) (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) mediante inyeccion de disolucion de acetona al 1%. Esta prueba da un valor de la calidad del envase de columna. La asimetrfa aprobada esta en el intervalo de 0,75-1,25 y un numero de placa >1.000 Nm.

Selectividad.

Se llevo a cabo la evaluacion Kd usando un explorador AKTAtm (ID 494) equipado con un automuestra A-900. Se conecto un detector RI Shimadzu (RID-10A) al sistema AKTAtm para deteccion de las muestras de dextrano. Se usaron las siguientes condiciones:

Flujo: 0,2 ml/min

Fase movil: 0,2 M NaCl

Bucle de inyeccion: 100 pm

Evaluacion.

Se evaluaron los picos de dextrano segun los metodos muy conocidos en este campo. Despues se calcularon los valores Kd como una medida de la superficie de poro disponible como sigue:

Kd = (Ve-Vo)/(Vc-Vo-matriz gel) = (Ve-Vo)/(VrVo)

Ve = volumen de retencion de dextrano eluido (ml)

Vo = volumen vacfo (retencion dextrano original) (ml)

Vc = volumen de columna calculado (altura lecho (cm) X superficie area columna (cm2)) (ml)

Vt = volumen total lfquido (volumen retencion NaCl) (ml)

Ejemplo 1: sfntesis general de partfculas de polisacaridos.

Tratamiento de sal: se lavo aproximadamente 1,5 g de Sepharose™ sin retrocruzar (Amersham BIosciences, Uppsala, Suecia) con 10 volumenes de lecho de agua desionizada para proporcionar una suspension acuosa de partfculas de gel de 75%. Despues se anadieron las sales segun se especifica a continuacion para cada prototipo a la suspension. La mezcla de reaccion se calento a la temperatura especificada a continuacion para cada prototipo durante 30 minutos agitando antes de enfriar por debajo de 30°C con bano de hielo. Despues se eliminaron las sales en la suspension mediante lavado del gel con 10 volumenes de lecho de agua sobre un embudo de vidrio sinterizado.

Retrocruzamiento: se llevo a cabo retrocruzamiento con epiclorhidrina como agente de retrocruzamiento y segun Porath (Gel product for separation, 1982, EP 81850244) con 4 veces la epiclorhidrina establecida y NaOH.

Funcionalizacion: para proporcionar un intercambiador de iones, se anadieron grupos de amonio cuaternario (grupos Q) a las partfculas retrocruzadas segun metodos muy conocidos. Se llevo a cabo titulacion de Cl- con AgNO3 0,1 M despues de la adicion para medir la cantidad de grupos Q funcionales.

Envase columna: las partfculas envasadas segun se describio anteriormente se envasaron en columnas HR 5/20 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) con agua desionizada como lfquido de envasado. Las columnas primero se

llenaron a una velocidad de flujo de 306 cm/h durante aproximadamente 15 minutos y despues a una velocidad de flujo de 764 cm/h durante aproximadamente 15 minutos. El envase de columna se ensayo por medicion de la asimetrfa punta despues de inyectar 25 pl de acetona al 0,4% a una velocidad de flujo de 76 cm/h. Las columnas con asimetrfa punta entre 0,8 y 1,8 se consideraron aceptables en este estudio.

5 Ejemplos 2-4: prototipos de partfculas.

Comenzando con matrices de Sepharose comercialmente disponibles, se prepararon prototipos segun se describio anteriormente con variacion de sales, tiempos de tratamiento y duraciones. Los resultados se senalan en las siguientes tablas.

Ejemplos 5-6: ejemplos comparativos de partfculas.

10 Se realizaron dos ejemplos comparativos, ensayando las dos matrices de Sepharose™ usadas como materiales de inicia en los ejemplos 2-4 anteriores pero omitiendo la etapa de tratamiento de sal.

Resultados.

Tabla 1: velocidad de flujo.

Prototipo

Matriz base Tratamiento de sal M(mol/litro partfculas en suspension) Temp. Maxima (°C) Diametro de partfculas (Malvern, d50v) (pm) Velocidad de flujo (max) (ml/min)

Ej. 2 U1262069

Sepharose1™ 4B MgSO4 0,35 M + Na2SO4 0,5 M 96,8 58 34,5

Ej. 3 U1262073

SepharoseIM 6B Na2SO4 1,3 M 96,7 76 32,5

Ej. 4 U1262074

Sepharose1™ 6B MgSO4 0,5 M + Na2SO4 0,5 M 96,9 55 85

Ej. 5 comparativo U1262066

Sepharose1™ 4B 83 6

Ej. 6 comparativo U1262067

Sepharose1™ 6B 89 10

15 Tabla 2: prueba de eficacia.

Prototipo

Asimetrfa Numero de placa (Nm)

Ej. 2 U1262069

1,00 1609

Ej. 3 U1262073

0,77 2520

Ej. 4 U1262074

1,26 1489

Ej. 5 comparativo U1262066

0,75 2281

Ej. 6 comparativo U1262067

0,49** 886**

*asimetrfa aceptable para el proposito presente

**incluso despues de repetir este envasado 4 veces, todavfa no cumplfa los criterios establecidos en la presente prueba.

Tabla 3: superficie de poro disponible.

Prototipo

Matriz base Velocidad de flujo (max) (ml/min) Diametro de particulas (Malvern, d50v) (pm) 110000)

Ej. 2 U1262069

SepharoseIM 4B 34,5 0,67

Ej. 3 U1262073

SepharoseIM 6B 32,5 0,59

Ej. 4 U1262074

SepharoseIM 6B 85 0,10

Ej. 5 comparativo U1262066

SepharoseIM 4B 6 0,65

Ej. 6 comparativo U1262067

SepharoseIM 6B 10 0,46

Ejemplos 7-10: tratamiento de sal de membranas.

5 Ejemplo 7: impregnacion de membrana en disolucion de agarosa - Membrana A.

Se preparo una disolucion de agarosa al 1% disolviendo 0,3 g de agarosa en 30 ml de agua a 95°C durante 3 h. Despues una membrana de celulosa regenerada (Sartorius, 0,45 pm, producto n° 3S18406-047N) se sumergio en la disolucion de agarosa durante 1 h a 95°C. Despues la membrana se elimino de la disolucion de agarosa y se dejo enfriar a temperatura ambiente de modo que la agarosa podia gelificar en la estructura de membrana.

10 Ejemplo 8: tratamiento de membrana en la disolucion de sal - Membrana B.

La membrana hibrida A preparada segun se describe en el ejemplo 7 se sumergio en sulfato de amonio ((NH4)2SO4) (disolucion 1M) (50 ml) a 96°C durante 1 h y despues se elimino de la disolucion y se dejo enfriar. La membrana se lavo extensamente con agua.

Ejemplo 9: medicion de la capacidad de flujo de membrana.

15 Se puso un trozo de membrana preparada y tratada segun se describio anteriormente en un embudo de filtro de diametro 15 mm y se aplico vacio de 0,7 bar. Se vertio 50 ml de agua en el embudo y se inicio un cronometro. Se registro el tiempo hasta que todo el agua paso por la membrana. Se realizo el analisis por triplicado.

Se calculo el flujo en ml por centimetro cuadrado y minutos.

Ejemplo 10: resultados de la capacidad de flujo de membrana.

Membrana

Disolucion de agarosa (%) Iratamiento de sal Flujo (ml/min/cm2)

Referencia

- - 21,8

Membrana A

1 No 2,1

Membrana B

1 Si 18,7

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   10

   15

   20

   1. Un metodo para preparar un matriz de separacion, cuyo metodo comprende:

   (a) proporcionar una suspension acuosa de partfculas comprendida por un polisacarido nativo gelificado;

   (b) tratamiento de sal de las partfculas suspendidas por adicion de al menos una sal; y

   (c) retrocruzamiento de las partfculas tratadas con sal,

   En la que la sal(es) se anade hasta una concentracion de sal en la suspension en el intervalo de 0,5 a 1,3 M y en el que la temperatura durante el tratamiento de sal esta en el intervalo de 94-98°C.
2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el polisacarido es agarosa.
3. 3. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anion de la sal anadida en la etapa (b) es un sulfato.
4. 4. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cation de la sal se selecciona del grupo que consiste en Mg; Na; K; Li; y Cu.
5. 5. Un metodo segun la reivindicacion 4, en el que el cation de la sal se selecciona a partir del grupo que consiste en Mg y Na.
6. 6. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la sal es MgSO4.
7. 7. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que la temperatura durante el tratamiento de sal es 96°C.
8. 8. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las partfculas de polisacarido de la etapa (a) se han preparado por emulsion en un disolvente organico.
9. 9. Un metodo segun la reivindicacion 8, en el que las partfculas se lavan despues de la emulsion.
10. 10. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa (c), la etapa de retrocruzamiento comprende la adicion de un agente de retrocruzamiento.
11. 11. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa posterior de adicionar ligandos de cromatograffa a grupos hidroxilo del polisacarido gelificado.