BRPI0612925A2 - uso de um composto, composição farmacêutica e kit - Google Patents

Abstract

USO DE UM COMPOSTO, COMPOSIçAO FARMACêUTICA E KIT. A invençào caracteriza composições e métodos que sào úteis para o tratamento ou a prevenção de uma doença de conformação de proteína em um indivíduo mediante a intensificação da degradação de proteínas incorretamente desdobradas in vivo.

Description

USO DE UM COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E KIT

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As proteínas devem se desdobrar em sua conformaçãotridimensional correta para realizar a sua função biológica.

A conformação nativa de um polipeptídeo é codificada dentrode sua seqüência de aminoácido primária e até mesmo uma únicamutação em uma seqüência de aminoácido pode prejudicar acapacidade de uma proteína de atingir a sua conformaçãoapropriada. Quando as proteínas não conseguem se desdobrarcorretamente, os efeitos biológicos e clínicos podem serdevastadores. A agregação de proteínas e o desdobramentoincorreto são os principais contribuintes de muitas doençashumanas, tais como a rétinite pigmentosa dominanteautossomal, o mal de Alzheimer, deficiência de al-antitripsina, a fibrose cística, o diabetes insipidusnefrogênico e as infecções mediadas por príons. Em outrosdistúrbios de desdobramento de proteína, tais como a retinitepigmentosa dominante autossomal, a degeneração macularrelacionada à idade, o mal de Alzheimer, o mal de Parkinson eo mal de Huntington, a patologia resulta dos efeitoscitotóxicos da proteína incorretamente desdobrada.

As proteínas incorretamente desdobradas sãoreconhecidas pelo sistema de controle de qualidade RE e sãovisadas para a degradação pelo proteassomo. Além da passagemproteassomal, a autofagia é um outro mecanismo celularpreponderante para a degradação da proteína. Embora aautofagia possa ser estimulada por uma variedade de tensõesintracelulares e extracelulares, incluindo a carência deaminoácido, a agregação de proteínas incorretamentedesdobradas e a acumulação de organelas danificadas, aautofagia parece ser um processo amplamente não-seletivo. Asproteínas expandidas de poliglutamina e polialanina propensasà agregação associadas com o mal de Huntington são degradadaspor autofagia e a inibição da autofagia reduziu a toxicidadedas proteínas mutantes de Huntington em modelos de mosca e decamundongo do mal de Huntington. Também foi demonstrado que aautofagia contribui para a eliminação das proteínasacumuladas no RE. Se os métodos para aumentar a autofagiaestivessem disponíveis, eles poderiam intensificar aeliminação de proteínas incorretamente desdobradas e eliminaros efeitos citotóxicos associados com a sua acumulação. Osmétodos atuais para eliminar os efeitos citotóxicos dasproteínas incorretamente desdobradas e preservar a funçãoneuronal são urgentemente requeridos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

A invenção caracteriza composições e métodos quesão úteis para o tratamento ou a prevenção de uma Doença deConformação de Proteína (PCD) mediante a intensificação dadegradação de proteínas incorretamente desdobradas.

Em um aspecto, a invenção apresenta de maneirageral um método para o tratamento ou a prevenção de umDistúrbio de Conformação de Proteína (PCD) em um indivíduo,em que o método envolve a administração de uma quantidadeeficaz de um composto que intensifica a degradação deproteína autofágica ao indivíduo (por exemplo, um pacientehumano). Em uma realização, o composto (por exemplo,rapamicina, inibidor de farnesil transferase, FTI-277 ouanálogos dos mesmos) inibe o mamífero alvo da rapamicina(mTOR) ou inibe o homólogo de Ras enriquecido no cérebro(Rheb). Em uma outra realização, o PCD é qualquer um ou maisdo grupo que consiste em deficiência de al-antitripsina,fibrose cística, mal de Huntington, mal de Parkinson, mal deAlzheimer, diabetes insipidus nefrogênico, câncer e mal deJacob-Creutzfeld. Contudo, em uma outra realização, o PCD éum PCD ocular selecionado de qualquer um ou mais dentre aretinite pigmentosa, a degeneração macular relacionada àidade (por exemplo, úmida ou seca), glaucoma, distrofiascorneais, retinosquise, mal de Stargardt, gânglio dominanteautossomal e distrofia macular de Best. Ainda em outrasrealizações, o método envolve adicionalmente a administraçãode 11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou um isômero travado desete anéis de 11-cis-retinal ao indivíduo (por exemplo, umpaciente humano).

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um métodopara o tratamento ou a prevenção de um Distúrbio deConformação de Proteína (PCD) ocular em um indivíduo (porexemplo, um paciente humano), em que o método envolve aadministração de uma quantidade eficaz de um composto queintensifica a degradação de proteína autofágica ao indivíduo.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um métodopara o tratamento ou a prevenção da retinite pigmentosa ou dadegeneração macular em um indivíduo (por exemplo, um pacientehumano), em que o método envolve a administração ao indivíduode um composto que intensifica a degradação de proteínaautofágica; e a administração de 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal, onde 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e o compostosão administrados simultaneamente ou dentro de um intervalode quatorze dias entre si em quantidades suficientes para otratamento ou a prevenção da retinite pigmentosa ou dadegeneração macular no indivíduo.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um métodopara o tratamento ou a prevenção de um Distúrbio deConformação de Proteína (PCD) , onde o PCD é qualquer um oumais dentre a deficiência de αΐ-antitripsina, fibrosecística, mal de Huntington, mal de Parkinson, mal deAlzheimer, diabetes insipidus nefrogênico, câncer, e mal deJacob-Creutzfeld, em um indivíduo (por exemplo, um pacientehumano) , em que o método envolve a administração de umcomposto que intensifica a autofagia em uma quantidadesuficiente para o tratamento ou a prevenção do PCD noindivíduo. Era uma realização, a invenção envolveadicionalmente a etapa de identificação do paciente que estápadecendo de um PCD. Contudo7 em uma outra realização, ainvenção envolve adicionalmente a etapa de medição do nívelou da expressão da proteína incorretamente desdobrada, de ummarcador autofágico ou de vacúolos autofágicos em uma célula.

Em uma realização, o PCD é a fibrose cística e o métodoenvolve adicionalmente a administração de um agenteselecionado de qualquer um ou mais dentre antibióticos,suplementos das vitaminas A, D, EeK, broncodilatação dealbuterol, dornase e ibuprofeno. Contudo, em uma outrarealização, o PCD é o mal de Huntington e o método envolveadicionalmente a administração de um agente selecionado dequalquer um ou mais dentre haloperidol, fenotiazina,reserpina, tetrabenazina, amantadina e co-enzima Q 10.Contudo, em uma outra realização, o PCD é o mal de Parkinsone o método envolve adicionalmente a administração de umagente selecionado de qualquer um ou mais dentre levodopa,amantadina, bromocriptina, pergolida, apomorfina,benserazida, lisurida, mesulergina, lisurida, lergotrila,memantina, metergolina, piribedila, tiramina, tirosina,fenilalanina, mesilato de bromocriptina, mesilato depergolida, anti-histamínicos, antidepressivos e inibidores deoxidase de monoamina. Contudo, em uma outra realização, o PCDé o mal de Alzheimer e o método envolve adicionalmente aadministração de um agente selecionado de qualquer um ou maisdentre donepezila, rivastigmina, galantamina e tacrina.Contudo, em uma outra realização, o PCD é diabetes insipidusnefrogênico e o método envolve adicionalmente a administraçãode um agente selecionado de qualquer um ou mais dentreclorotiazida/cloridretotiazida, amilorida e indometacina.Contudo, em uma outra realização, o método envolveadicionalmente a administração de um agente selecionado dequalquer um ou mais dentre acetato de abiratenona,altretamina, anidrovinblastina, auristatina, bexaroteno,bicalutamida, BMS184476, 2,3,4,5,6-pentafIuoro-N-(3-fluoro-4-metoxifenil)benzeno sulfonamida, bleomicina, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-proli-l-L-prolina-t-butilamida, caquectina, cemadotina, clorambucil,ciclofosfamida, 3',41-dideidro-41-deóxi-8'-norvin-caleucoblastina, docetaxol, doxetaxel, ciclofosfamida,carboplatina, carmustina (BCNU), cisplatina, criptoficina,citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, daunorubicina,dolastatina, doxorubicina (adriamicina), etoposide, 5-fluorouracil, finasterida, flutamida, hidróxi uréia e hidróxiuréia taxanos, ifosfamida, liarozol, lonidamina, lomustina(CCNU), mecloretamina (mostarda de nitrogênio), melfalan,isetionato de mivobulina, rizoxina, sertenef, estreptozocina,mitomicina, metotrexate, nilutamida, onapristona, paclitaxel,prednimustina, procarbazina, RPR109881, fosfato deestramustina, tamoxifen, tasonermina, taxol, tretinoina,vinblastina, vincristina, sulfato de vindesina e vinflunina.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um métodopara a intensificação da degradação de uma proteínaincorretamente desdobrada em uma célula (por exemplo, umacélula ocular, um neurônio, uma célula epitelial), sendo queo método envolve a colocação de uma célula em contato com umaquantidade eficaz de um composto que intensifica a autofagia.Em uma realização, o método envolve adicionalmente a etapa demedição do nível ou da expressão da proteína incorretamentedesdobrada, de um marcador autofágico ou de vacúolosautofágicos em uma célula (por exemplo, uma célula de ummamífero, tal como uma célula humana, in vitro ou in vivo) .Contudo, em uma outra realização, o método envolveadicionalmente a colocação da célula ocular em contato com11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou um isômero travado de seteanéis de 11-cis-retinal. Contudo, em uma outra realização, acélula contém uma proteína mutante (por exemplo, opsina,miocilina, lipofuscina, proteína B-H3) que forma um agregadoou uma fibrila.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o tratamento de um PCD quecompreende um inibidor de mTOR ou um análogo do mesmo em umexcipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o tratamento de um PCD ocularque compreende uma quantidade eficaz de um composto queintensifica a autofagia em um excipiente farmaceuticamenteaceitável.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o tratamento da retinitepigmentosa ou da degeneração macular relacionada à idade quecompreende uma quantidade eficaz de 11-cis-retinal ou de 9-cis-retinal e uma quantidade eficaz de um inibidor deautofagia em um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta umkit para o tratamento de um PCD ocular, em que o kitcompreende uma quantidade eficaz de 11-cis-retinal ou de 9-cis-retinal e uma quantidade eficaz de rapamicina ou umanálogo da mesma.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta umkit para o tratamento da retinite pigmentosa ou dadegeneração macular relacionada à idade, em que o kitcompreende uma quantidade eficaz de 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal; e uma quantidade eficaz de rapamicina ou um análogoda mesma.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo de identificação de um composto útil para o tratamentode um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) que tem umPCD, em que o método envolve a colocação de uma célula invitro que expressa uma proteína incorretamente desdobrada emcontato com um composto candidato; e a determinação de umaumento na autofagia na célula em relação a uma célula decontrole, onde um aumento na autofagia na célula contatadaidentifica um composto útil para o tratamento de um indivíduoque tem um PCD.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo de identificação de um composto útil para o tratamentode um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) que temretinite pigmentosa ou degeneração macular relacionada àidade, em que o método envolve a colocação de uma célula queexpressa uma proteína incorretamente desdobrada in vitro emcontato com 11-cis-retinal (por exemplo, um isômero travadode sete anéis de 11-cis-retinal) ou 9-cis-retinal e umcomposto candidato; e a determinação de um aumento naautofagia na célula em relação a uma célula de controle, ondeum aumento na autofagia na célula contatada identifica umcomposto útil para o tratamento de um indivíduo que temretinite pigmentosa.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo de identificação de um composto útil para o tratamentode um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) que temfibrose cística, em que o método envolve a colocação de umacélula in vitro que expressa uma proteína incorretamentedesdobrada em contato com um composto candidato; e adeterminação de um aumento na autofagia na célula em relaçãoa uma célula de controle, onde um aumento na autofagia nacélula contatada identifica um composto útil para otratamento de um indivíduo que está com fibrose cística. Emuma realização, a proteína incorretamente desdobrada contémuma mutação. Em uma outra realização, a proteínaincorretamente desdobrada é uma opsina, tal como uma opsinaque contém uma mutação de P23H. Contudo, em uma outrarealização, um aumento na autofagia é determinado aomonitorar o nível de uma proteína; ao monitorar a expressãode um marcador autofágico; ou ao monitorar o número devacúolos autofágicos.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo para o tratamento ou a prevenção de um Distúrbio deConformação de Proteína (PCD) em um indivíduo (por exemplo,um paciente humano) , em que o método envolve a administraçãode uma quantidade eficaz de um composto que intensifica umaatividade biológica de rapamicina ou de FTI-277. Em umarealização, o composto é administrado em combinação com arapamicina ou um análogo da mesma, ou administrado emcombinação com FTI-277 ou um análogo do mesmo. Contudo, emuma outra realização, o PCD é selecionado de qualquer um oumais dentre a deficiência de αΐ-antitripsina, a fibrosecística, o mal de Huntington, o mal de Parkinson, o mal deAlzheimer, diabetes insipidus nefrogênico, câncer e o mal deJacob-Creutzfeld. Em uma outra realização, o PCD é um PCDocular selecionado de qualquer um ou mais dentre a retinitepigmentosa, a degeneração macular relacionada à idade,glaucoma, distrofias corneais, retinosquise, mal deStargardt, gânglio dominante autossomal e distrofia macularde Best. Em uma outra realização, o método envolveadicionalmente a administração de 11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou um isômero de 7 anéis travado de 11-cis-retinal aoindivíduo.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um métodopara o tratamento ou a prevenção da retinite pigmentosa em umindivíduo (por exemplo, um paciente humano), em que o métodoenvolve a administração de rapamicina ou de FTI-2 77 aoindivíduo e um composto que intensifica uma atividadebiológica de rapamicina ou de FTI-277. Em uma realização, ométodo envolve adicionalmente a administração de 11-eis-retinal ou 9-cis-retinal, onde 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e o composto são administrados simultaneamente oudentro de um intervalo de quatorze dias entre si emquantidades suficientes para o tratamento ou a prevenção daretinite pigmentosa no indivíduo.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo para o tratamento ou a prevenção de um Distúrbio deConformação de Proteína (PCD) em um indivíduo (por exemplo,paciente humano), sendo que o método envolve a administraçãode rapamicina, FTI-277 ou de um análogo do mesmo emcombinação com um composto que intensifica uma atividadebiológica de rapamicina ou de FTI-277, onde cada um dentre arapamicina ou FTI-277 e o composto é administrado em umaquantidade suficiente para o tratamento ou a prevenção do PCDno indivíduo.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo para a intensificação da degradação de uma proteínaincorretamente desdobrada em uma célula, em que o métodoenvolve a colocação de uma célula (por exemplo, uma célulaocular, uma célula neuronal, uma célula epitelial) em contatocom uma quantidade eficaz de rapamicina, FTI-277 ou em umanálogo dos mesmos, e um composto que intensifica umaatividade biológica de rapamicina ou de FTI-277, onde cada umdentre a rapamicina ou FTI-277 e o composto é administrado emuma quantidade suficiente para intensificar a degradação daproteína. Em uma realização, o método envolve adicionalmentea colocação da célula em contato com 11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou um isômero travado de sete anéis de 11-cis-retinal.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta umacomposição farmacêutica para o tratamento de um PCD ocularque compreende a rapamicina, o FTI-277 ou um análogo dosmesmos e um composto que intensifica uma atividade biológicade rapamicina ou de FTI-277 em um excipientefarmaceuticamente aceitável, onde a rapamicina ou o FTI-277 eo composto estão presentes em uma quantidade suficiente parao tratamento ou a prevenção do PCD no indivíduo (por exemplo,um paciente humano).

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo de identificação de um composto útil para o tratamentode um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) que tem umPCD, em que o método envolve a colocação de uma célula invitro que expressa uma proteína incorretamente desdobrada emcontato com um composto candidato na presença ou ausência deum intensificador de autofagia; e a determinação de umaumento na autofagia na célula em relação a uma célula decontrole, onde um aumento na autofagia na célula contatadaidentifica um composto útil para o tratamento de um indivíduoque tem um PCD.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo de identificação de um composto útil para o tratamentode um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) que temretinite pigmentosa, em que o método envolve a colocação deuma célula que expressa uma proteína de opsina incorretamentedesdobrada in vitro em contato com 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e rapamicina ou FTI-277 e um composto candidato; e adeterminação de um aumento na autofagia na célula em relaçãoa uma célula de controle, onde um aumento na autofagia nacélula contatada identifica um composto útil para otratamento de um indivíduo que tem retinite pigmentosa.

Em um outro aspecto ainda, a invenção apresenta ummétodo de identificação de um composto útil para o tratamentode um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) que temfibrose cística, em que o método envolve a colocação de umacélula in vitro que expressa uma proteína de CFTRincorretamente desdobrada em contato com um compostocandidato e rapamicina ou FTI-277; e a determinação de umaumento na autofagia na célula em relação a uma célula decontrole, onde um aumento na autofagia na célula contatadaidentifica um composto útil para o tratamento de um indivíduoque está com fibrose cística.

Em várias realizações de qualquer um dos aspectosacima, o PCD é selecionado de qualquer um ou mais dentre adeficiência de αΐ-antitripsina, a fibrose cística, o mal deHuntington, o mal de Parkinson, o mal de Alzheimer, diabetesinsipidus nefrogênico, câncer e o mal de Jacob-Creutzfeld.Contudo, em outras realizações de qualquer um dos aspectosacima, o PCD é um PCD ocular selecionado de qualquer um oumais dentre a retinite pigmentosa, a degeneração macularrelacionada à idade (por exemplo, na forma úmida ou seca),glaucoma, distrofias corneais, retinosquise, o mal deStargardt, gânglio dominante autossomal e distrofia macularde Best. Ainda em outras realizações de qualquer um dosaspectos acima, o composto inibe o mamífero alvo darapamicina (mTOR) ou inibe o homólogo de Ras enriquecido nocérebro (Rheb). Em uma realização preferida de qualquer umdos aspectos acima, o PCD ocular é a retinite pigmentosa ou adegeneração macular, tal como a degeneração macularrelacionada à idade (por exemplo, a forma seca ou úmida) .Ainda em outras realizações de qualquer um dos aspectosacima, o método compreende adicionalmente a administração de11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou de um isômero travado desete anéis de 11-cis-retinal ao indivíduo (por exemplo, ummamífero, tal como um ser humano). Nas realizações preferidasde qualquer um dos aspectos acima, o indivíduo compreende umamutação que afeta o desdobramento da proteína (por exemplo,uma mutação ocorre em uma opsina, tal como uma mutação deΡ23Η ou uma mutação em CFTR, tal como AF508) . Em outrasrealizações dos aspectos acima, a degradação é seletiva paraa proteína incorretamente desdobrada. Ainda em outrasrealizações de qualquer um dos aspectos acima, um compostoútil em um método da invenção é a rapamicina, um inibidor defarnesil transferase, FTI-277 ou um análogo de tal composto.Ainda em outras realizações, o método envolve adicionalmentea administração de 11-cis-retinal, 9-cis-retinal ou umisômero travado de sete anéis de 11-cis-retinal ao indivíduo.Contudo, em uma outra realização, o composto inibe o mamíferoalvo da rapamicina (mTOR) ou inibe o homólogo de Rasenriquecido no cérebro (Rheb). Em várias realizações dequalquer um dos aspectos acima, o indivíduo (por exemplo, umpaciente humano ou veterinário) contém uma mutação que afetao desdobramento da proteína, tal como uma mutação na opsina(por exemplo, uma mutação de P23H). Ainda em outrasrealizações, a degradação é seletiva para a proteínaincorretamente desdobrada. Ainda em outras realizações, 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e o composto são administradosdentro de um intervalo de vinte e quatro horas, de três diasou de cinco dias entre si. Em uma outra realização dequalquer um dos aspectos acima, 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e o composto são administrados simultaneamente. Aindaem outras realizações, 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e ocomposto são administrados ao olho; por exemplo, aadministração é intra-ocular. Contudo, em uma outrarealização, cada um dentre 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal eo composto é incorporado em uma composição que propicialiberação a longo prazo (por exemplo, uma microesfera, umananoesfera ou uma nanoemulsão) . Contudo, em uma outrarealização, a liberação a longo prazo é através de umdispositivo de aplicação de droga. Contudo, em uma outrarealização, o método envolve adicionalmente a administraçãode um suplemento de vitamina A. Ainda em outras realizaçõesde qualquer um dos aspectos acima, um aumento na autofagia édeterminado ao monitorar o nível de uma proteína; aomonitorar a expressão de um marcador autofágico; ou aomonitorar o número de vacúolos autofágicos.

Definições

Por "mamífero alvo de rapamicina (mTOR)" entenda-seuma seqüência de polipeptídeo que tem pelo menos 85% ou 95%de identidade com o Acesso no GenBank N°. P42345.

Por "inibe mTOR" entenda-se que reduz em pelo menos10% pelo menos uma atividade biológica associada com mTOR. As"atividades biológicas de mTOR" exemplificadoras incluem aatividade de quinase de mTOR, a indução de autofagia nascélulas, a regulação da progressão do ciclo da célula, arecombinação do DNA e a detecção dos danos ao DNA. Oscompostos que inibem a fosforilação de mTOR e a quinase S6também inibem a atividade biológica de mTOR.

Por "homólogo de Ras enriquecido no cérebro (Rheb)"entenda-se uma seqüência de polipeptídeo que tem pelo menos85% ou 95% de identidade com o Número de Acesso no GenBankNP-005605.

Por "inibe Rheb" entenda-se que reduz em pelo menos10% pelo menos uma atividade biológica associada com mTOR. As"atividades biológicas de Rheb" exemplificadoras incluem aindução de autofagia, a fosforilação de mTOR, a atividade deligação de nucleotídeo de guanina e a atividade de GTPase.

Por "doença conformacional de proteína" entenda-seuma doença ou um distúrbio cuja patologia está relacionada àpresença da proteína incorretamente desdobrada. Em umarealização, uma doença conformacional de proteína é causadaquando a proteína incorretamente desdobrada interfere naatividade biológica normal de uma célula, de um tecido ou deum órgão.Por "atividade biológica de rapamicina" entenda-sea intensificação da autofagia, a inibição de mTOR, a inibiçãoda proliferação de linfócitos T, a inibição da secreção delinfoquina, a inibição da proliferação de células delevedura, a intensificação da degradação de proteínas ouqualquer outro efeito associado com a administração darapamicina a uma célula ou organismo.

Por "degradação de proteína autofágica" entenda-sea degradação que ocorre substancialmente por autofagia.

Por "análogo" entenda-se um composto que estárelacionado estruturalmente a um composto de referência ecompartilha essencialmente a mesma função que o composto dereferência. Por análogo também entende-se um derivado ou ummetabólito de um composto de referência.

Por "intensifica" entenda-se uma alteração positivade pelo menos 10%, 15%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

Por "proteína incorretamente desdobrada" entenda-seuma proteína que tem uma alteração que afeta a sua estruturaterciária em relação a uma proteína de referência. Asproteínas incorretamente desdobradas exemplificadoras incluemformas de opsina (por exemplo, opsina de P23H), isto é,formas que têm uma alteração da seqüência em relação a umaseqüência de referência de opsina (por exemplo, Números deAcesso no GenBank NM-000539 e NP 000530) e formas mutantes deCFTR humano (por exemplo, que têm uma mutação AF508), isto é,formas que têm uma alteração da seqüência em relação a umaseqüência de referência de CFTR (por exemplo, Números deAcesso no GenBank AAA35680, NP-000483, P13569) .

O termo "microesferas" refere-se às estruturascoloidais substancialmente esféricas que têm uma substânciabioativa incorporada nas mesmas. As microesferas têmgeralmente uma distribuição de tamanho dentro da faixa deaproximadamente 0,5 μΜ a aproximadamente 500 μΜ. Se osconstrutos forem menores do que um mícron de diâmetro, entãoo termo correspondente, "nanoesfera", pode ser utilizado.

Por "nanoemulsão" entenda-se as dispersões do tipoõleo-em-água que compreendem pequenas estruturas de lipidio.

Em um exemplo, uma nanoemulsão compreende uma fase de óleoque tem gotas com um tamanho médio de partícula deaproximadamente 0,5 a 5 micra.

Por "reduz" entenda-se uma alteração negativa depelo menos 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

Por "degradação seletiva" entenda-se a degradaçãoque afeta preferencialmente as proteínas incorretamentedesdobradas, de modo que as proteínas corretamentedesdobradas permaneçam substancialmente não-afetadas. Emvárias realizações, menos de 45%, 35%, 25%, 15%, 10% ou 5% deproteínas corretamente desdobradas são degradados.

Tal como empregado na presente invenção, os termos"tratar", tratando, "tratamento" e outros ainda referem-se àredução ou à melhora de um distúrbio e/ou dos sintomasassociados com o mesmo. Deverá ser apreciado que, embora nãoseja excluído, o tratamento de um distúrbio ou condição nãorequer que o distúrbio, a condição ou os sintomas associadoscom o mesmo sejam completamente eliminados.

Tal como empregado na presente invenção, os termos"impedir", "impedindo", "prevenção", "tratamento profilático"e outros ainda referem-se à redução da probabilidade de sedesenvolver um distúrbio ou uma condição em um indivíduo, quenão tenha, mas esteja correndo o risco de ou suscetível dedesenvolver um distúrbio ou uma condição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA-H mostram que a autofagia causa adegradação seletiva de opsina de P23H incorretamentedesdobrada em relação à opsina do tipo selvagem (WT) . AsFiguras IA, IC e IE são imunotransferências que mostram aexpressão da proteína de opsina nas células HEK-293transfectadas estavelmente cora a opsina do tipo selvagem(Figura IA) ou a opsina de P23H (Figura 1C) e tratadas com oesgotamento da rapamicina ou do aminoácido para induzir aautofagia. Na Figura IE, a opsina de P23H que expressa ascélulas é tratada adicionalmente com 11-cis-retinal. Émostrado um período de tempo de indução da autofagia. AsFiguras IB, ID e IE são gráficos que mostram o perfil dedegradação da opsina do tipo selvagem (Figura 1B) , a opsinade P23H (Figura 1D) e a opsina de P23H resgatada com 11-cis-retinal (Figura 1F) em relação ao tempo. As seguintescondições são denotadas pelos símbolos respectivos: os meiosde cultura com aminoácidos (losango), com carência deaminoácido (quadrado), rapamicina (triângulo) e carência deaminoácido com rapamicina (círculo) . As Figuras 1 G, IH e IIsão imunotransferências. A Figura IG mostra a desfosforilaçãode mTOR durante a indução da autofagia no tipo selvagem e nascélulas que expressam P23H. As Figuras IH e II mostram aexpressão da proteína dos acompanhantes Bip, calnexina eHsp7 0 sob condições autofágicas nas células que expressamP23H (Figura 1H) ou nas células que expressam P23H, as quaistambém foram tratadas com 11-cis-retinal (Figura II).

As Figuras 2A-2F mostram que a autofagia causa adegradação preferencial de OF508 em relação ao tipo selvagem.

As Figuras 2A e 2C são imunotransf erências que mostram aexpressão de CFTR etiquetada por HA nas células de BHK queexpressam estavelmente o CFTR de tipo selvagem (Figura 2A) ouOF508 (Figura 2C) depois do esgotamento do aminoácido (pistas4-6) ou o tratamento com 5 0 mM de rapamicina (pistas 7-9), ouambos (pistas 10-12) . As Figuras 2B e 2D são gráficos quemostram o perfil de degradação do CFTR de tipo selvagem(Figura 2B) e AF5 08 (Figura 2D) em relação ao tempo. Cada umadas seguintes condições é denotada pelos símbolosrespectivos: os meios de cultura com (losango), com carênciade aminoácido (triângulo) , rapamicina (quadrado) e carênciade aminoácido com rapamicina (círculo) . A Figura 2E é umaimunotransferência que mostra a desfosforilação de mTORseguindo a indução da autofagia no CFTR de tipo selvagem e nacélula que expressa AF508. A Figura 2F mostra a regulação dosacompanhantes Bip, calnexina, calreticulina e Hsp70 sobcondições autofágicas nas células que expressam o CFTR detipo selvagem ou AF508.

As Figuras 3A-3B são micrografias que mostram otingimento imunofluorescente para marcadores autofágicos nascélulas HEK-293 que expressam a opsina de tipo selvagem(Figura 3A) ou a opsina de P23H (Figura 3B) . 0 tingimentomostra que os marcadores autofágicos estão colocalizados comos agregados incorretamente desdobrados da opsina de P23H. Acolocalização da opsina (painel central) com os marcadores deautofagia (painel à esquerda) Atg7, LC3 e LAMP-I é mostradasob condições normais ou esgotadas de aminoácidos.

As Figuras 4A-B são micrografias que mostram otingimento imunofluorescente para os marcadores de autofagiae CFTR nas células de BFK que expressam o CFTR de tiposelvagem (Figura 4A) ou AF508 (Figura 4B) . Os marcadoresautofágicos estão colocalizados com a proteína de CFTR AF508retida no RE. A colocalização de CFTR etiquetado por HA(painel central) com os marcadores de autofagia (painel àesquerda) Atg7, LC3 e LAMP-I é mostrada sob condições normaisou esgotadas de aminoácidos.

As Figuras 5A-5c mostram três micrografias deelétrons das células. A Figura 5A mostra os agregados de P23Hnas células tingidas para a rodopsina e etiquetadas porimuno-ouro. As Figuras 5B e C mostram lisossomos e vacúolosautofágicos em células autofágicas.A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra que otratamento com rapamicina intensifica a função retinal em ummodelo de camundongo de P23H da retinite pigmentosa. OsP23141 e P23H2 de controle são camundongos transgênicos queexpressam uma cópia da opsina de P23H. Rap-P23HA e B sãocamundongos transgênicos que expressam uma cópia da opsina deP23H e tratados com rapamicina. WT-1, 2 e 3 são oscamundongos do controle do tipo selvagem. Rap-WTA e B são oscamundongos do controle do tipo selvagem que receberam arapamicina. Cada barra representa um ensaio de ERG de umúnico c amundongo.

A Figura 7 é um gráfico de barras que mostra que otratamento com rapamicina intensifica a função retinal em ummodelo de camundongo de degeneração macular. Cada barrarepresenta um ensaio de ERG de um único camundongo.

A Figura 8 é uma transferência Western que mostra adegradação da proteína de P23H em células que expressam P23Htratadas com o inibidor de proteína de farnesil transferaseFTI277. Uma transferência Western para uma tubulina émostrada abaixo como um controle de carga. 0 termo"alimentado" denota a condição da cultura com o meio quecontém aminoácido e soro; o termo 'F+ R1 denota alimentados etratados com rapamicina; o termo "F+FTI277" denotaalimentados e tratados com 10 μΜ ou 50 μΜ de FTI277. Umatransferência Western sondado com tubulina é mostrada abaixocomo um controle para a carga de proteína.

As Figuras 9A-9B mostram que o tratamento com FTI-277 resulta na degradação da opsina de P23H. A Figura 9A éuma imunotransferência que mostra os níveis de opsinae P23Hdepois da inibição de Rheb com FTI-277 durante um período detempo de doze horas. As células que expressam a opsina deP23H foram tratadas com 10 μΜ (pistas 8-10) ou 50 μΜ de FTI-277 (pistas 11-13). 0 tratamento com rapamicina (pistas 5-7)foi utilizado como um controle positivo. Os controlesalimentados com aminoácido e soro também foram utilizados(pistas 2-4) . A tubulina serve como um controle de carga. AFigura 9B é um gráfico que mostra os perfis de degradação combase nas intensidades de pixel das faixas naimunotransferência que compara o tratamento com rapamicina ecom o FTI-277 (50 μΜ) nas células que expressam a opsina deP23H em duas horas (h), em seis horas e em doze horas.

A Figura 10 é um conjunto de imunotransferênciasque mostram os acompanhantes dos níveis de calnexina,calreticulina, Hsp70 e Hsp90. Este trabalho analisa o efeitodo tratamento com FTI-277 em resposta à proteína não-desdobrada e a resposta ao choque de calor de uma maneiradependente do tempo e mostra que a autofagia é exclusiva deUPR e HSR.

As Figuras IlA-IlC são um conjunto deimunotransferências que mostram que FTI-277 bloqueia afosforilação de S6K e mTOR. A Figura IlA mostra que o estadoda fosforilação de S6K foi determinado após o tratamento comrapamicina e FTI-277 dentro de duas horas. A Figura IlBmostra que o estado de fosforilação de mTOR foi determinadoutilizando rapamicina, FTI-277 e FTI-277 em combinação com acarência de aminoácido e de soro durante um período de tempode doze horas.

As Figuras 12A-12C são uma série de micrografiasque mostram a imunocolocalização de marcadores deautofagossomo após o tratamento com FTI-277. A Figura 12Amostra o tingimento de Atg7 e a Figura 12B mostra otingimento de Atg8. Estes marcadores foram utilizados paraobservar a colocalização com agregados de opsina de P23H apóso tratamento com FTI-277. 0 aminoácido alimentado e ascélulas tratadas com rapamicina foram utilizados comocontroles. A Figura 12C mostra uma geração de imagensconfocal das células tratadas com FTI-277. A geração deimagens confocais indica claramente a localizaçãointracelular entre os marcadores de autofagossomo dosagregados da opsina de P23H de Atg7 e Atg8. Os anticorpos deautofagossomo são etiquetados por TRITC (à esquerda) e aopsina é etiquetada por FITC (à direita).

As Figuras 13A-13C mostram a resposta autofágica dacélula ao tratamento com FTI-277. A Figura 13A mostra que uminstrumento lysotracker foi utilizado como um marcador paraobservar a regulação para cima da passagem lisossomal nascélulas após o tratamento com FTI-277. A Figura 13B mostrauma análise de ultra-estrutura da micrografia eletrônica, quefoi executada após o tratamento das células com FTI-277 porseis horas. As células foram processadas pela citoquímica deMPASE para visualizar os lisossomos bem como osautolisossomos. A Figura 13C é um gráfico que mostra osresultados de uma análise morfométrica executada duas horas eseis horas após o tratamento com FTI-277. Isto compara aindução autofágica quando do tratamento com FTI-277 comaquele dos controles alimentados com aminoácidos e soro.

A Figura 14 é uma análise confocal que mostra asuperexpressão de GFP-LC3 nas células HuH7 após o tratamentocom FTI-277.

As Figuras 15A e 15B mostram a autofagia induzidapor FTI-277. A Figura 15A mostra duas imunotransferênciasexecutadas após o tratamento das células com o inibidor deautofagia 3MA. 0 3MA inibiu a degradação da opsina de P23Hinduzida por FTI-277. As células com carência de aminoácido ede soro (pista superior) foram utilizadas como um controlepara observar a acumulação de opsina de P23H em vinte equatro horas. Similarmente, o tratamento com FTI-277 napresença de 3MA (barras cinza-claro) impediu a degradação daopsina de P23H. A acumulação máxima de opsina foi observadaem doze horas nas células tratadas com 3MA em comparação aotratamento com FTI-277 sozinho (barras cinza-escuro). AFigure 15B mostra as células que expressam a opsina de P23Htratadas com o inibidor de proteassomo, MG132, sob condiçõesalimentadas (barras cinza-claro) e tratadas com FTI-277(barras cinza-escuro) por doze horas mostraram que o MG132não interferiu na degradação da opsina de P23H incorretamentedesdobrada durante a inanição.

A Figura 16 é um diagrama esquemático da passagemde insulina/T0R/S6K que mostra os sítios de inibição por FTI-277 e rapamicina. A ativação de quinases de PI3 conduz àfosforilação de Akt. 0 TSC1/2 age como uma ABERTURA paraativar Rheb que, por sua vez, fosforila mTOR. A inibição demTOR conduz à indução de autofagia nas células. A inibiçãopotencial de Rheb por FTI-277 induz a autofagia similar àinibição de mTOR pela rapamicina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção caracteriza composições e os métodos quesão úteis para intensificar a degradação proteínaserroneamente desdobradas in vivo. Geralmente, a invenção ébaseada na descoberta que os compostos da invenção (porexemplo, rapamicina, FTI-277, análogos e variantes dosmesmos) intensificam a degradação de proteínas mutantes.Vantajosamente, as proteínas mutantes são degradadasespecificamente, ao passo que os níveis das respectivasformas do tipo selvagem permanecem principalmenteinalterados. As proteínas erroneamente desdobradas podeminterferir na função normal da célula, e podem causarcitotoxicidade, resultando em uma Doença Conformacional deProteína (PCD) humana. As PCDs incluem : a deficiência de al-antitripsina, a fibrose cística, o mal de Huntington, o malde Parkinson, o mal de Alzheimer, o diabetes insipidusnefrogênico, o câncer, e distúrbios relacionados com príons(por exemplo, o mal de Jacob-Creutzfeld) . As composições e osmétodos da invenção são particularmente úteis para aprevenção ou o tratamento de PCDs oculares, incluindoretinite pigmentosa, degeneração macular relacionada com aidade (formas úmida e seca), glaucoma, distrofias corneais,retinosquises, mal de Stargardt, gânglio dominanteautossomal, distrofia macular, e distrofias corneais. Ascomposições da invenção podem ser utilizadas no tratamento dePCD, para retardar a morte das células afetadas, para aliviaros sintomas causados pela PCD, ou para impedir que um PCDseja iniciada em primeiro lugar.

Intensificadores de Autofagia

A autofagia é um mecanismo evolucionariamenteconservado para a degradação de componentes celulares nocitoplasma, e serve como um mecanismo de sobrevivência dacélula em células famintas. Durante a autofagia, pedaços docitoplasma ficam encapsulados pelas membranas celulares,formando vacúolos autofágicos que se fundem eventualmente comlisossomos para terem o seu conteúdo degradado. Osintensificadores de autofagia podem ser utilizadosindependentemente ou em combinação com 11-cis-retinal, 9-cis-retinal, ou um isômero travado no anel 7 de 11-cis-retinalpara o tratamento de uma PCD. O intensificador de autofagiarapamicina é particularmente útil para o tratamento daretinite pigmentosa e outras doenças oculares, bem como parao tratamento de fibrose cística e outros distúrbiosrelacionados a proteínas erroneamente desdobradas ou àagregação de proteínas. Os intensificadores de autofagiaúteis nos métodos da invenção incluem, mas sem ficar a eleslimitados, a rapamicina, FTI-277, e sais ou análogos dosmesmos.Rapamicina

A rapamicina (Rapamune®, sirolimus, Wyeth) é umalactona cíclico produzida por Steptomyces hygroscopicus. Arapamicina é uma droga imunosupressora que inibe a ativação ea proliferação de linfócitos Τ. A rapamicina se liga e inibeo alvo mamífero da rapamicina (mTOR), uma quinase que érequerido para a progressão do ciclo da célula. A inibição daatividade da quinase mTOR bloqueia a proliferação delinfócitos Tea secreção de linfocina.

Os análogos estruturais e funcionais da rapamicinaincluem derivados mono- e diacilados da rapamicina (PatenteU.S. n° . 4.316.885); pró-medicamentos de rapamicina solúveisem água (Patente U.S. n° . 4.650.803); ésteres de ácidoscarboxílicos (publicação PCT n° . WO 92/05179); carbamatos(Patente U.S. n°. 5.118.678); ésteres de amida (Patente U.S.n°. 5.118.678); ésteres de biotina (Patente U.S. n° .5.504.091); ésteres fluoretados (Patente U.S. n°. 5.100.883);acetais (Patente U.S. n° . 5.151.413); éteres de silila(Patente U.S. n°. 5.120.842); derivados bicíclicos (PatenteU.S. n° . 5.120.725); dímeros de rapamicina (Patente U.S. n° .5.120.727); derivados de 0-arila, 0-alquila, O-alquenila e O-alquinila (Patente U.S. n° . 5.258.389); e rapamicinadeuterada (Patente U.S. n° . 6.503.921). Outros análogos derapamicina incluem CCI-779, (Wyeth Ayerst), tacrolimus,pimecrolimus, AP20840 (Ariad Pharmaceutics), AP23841 (AriadPharmaceutics), e ABT-578 (Abbott Laboratories), SAR943 (32-deoxorapamicina, Eynott et al. , Immunology. 109(3):461-7,2003), e everolimus (SDZ RAD) . 0 Everolimus (40-0-(2-hidroxietil)rapamicina (CERTICAN, Novartis) é um macrolídeoimunosupressor que é relacionado estruturalmente àrapamicina. Análogos adicionais de rapamicina são descritosnas Patentes U.S. n°. 5.202.332 e 5.169.851.

A rapamicina está atualmente disponível para aadministração oral em formulações líquidas e em comprimidos.

O líquido RAPAMUNE.TM. contém 1 mg/ml de rapamicina que édiluído em água ou em suco de laranja antes da administração.Comprimidos que contêm 1 ou 2 mg de rapamicina também sãodisponíveis. A rapamicina é de preferência administrada umavez ao dia. Ela é absorvida de forma rápida e completamenteapós a administração oral. Tipicamente, a dosagem derapamicina para o paciente varia de acordo com a condição dopaciente, mas algumas dosagens recomendadas padrão sãofornecidas abaixo. A dose de carga inicial para a rapamicinaé de 6 mg. As doses subseqüentes de manutenção de 2 mg/diasão típicas. Alternativamente, uma dose de carga de 3 mg, 5mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, ou 25 mg pode ser utilizada com um 1mg, 3 mg, 5 mg, 7 mg, ou 10 mg por dose de manutenção ao dia.

Nos pacientes que pesam menos de 4 0 quilogramas, as dosagensde rapamicina são ajustados tipicamente com base na área desuperfície do corpo; geralmente uma dose de carga de 3mg/m2/dia e uma dose de manutenção de 1 mg/m2/dia sãoutilizadas.

Inibidores de Farnesil Transferase

Os inibidores de farnesil transferase inibem afarnesilação, que é uma modificação pós-translacional dasproteínas que aumenta a capacidade hidrofóbica da proteínamodificada que faz com que ela se localize na superfície damembrana da célula. Essa localização na membrana da célula étipicamente necessária para a função normal de proteínasfarnesiladas. As porções de aceptor de farnesil foramcaracterizadas em várias proteínas como uma seqüência dequatro aminoácidos encontrada no terminal carbóxi dasproteínas alvo. Essa seqüência de quatro aminoácidos foicaracterizada como -C-A-A-X, em que "C" é um resíduo decisteína, "A" refere-se a qualquer aminoácido alifático, e"X" refere-se a qualquer aminoácido. Os inibidores de faresiltransferase (FTIs), tal como Fti-277, inibem a modificação delipidio pós-translacional de Ras e outras proteínasfarnesiladas, tal como Rheb. Conforme relatado maisdetalhadamente a seguir, o FTI-277 é um inibidor de farnesiltransferase exemplificador que induz a autofagia nas célulasmediante a inativação de mTOR. MTOR controla negativamente aautofagia como um alvo a jusante para AKT/PKB em resposta aosaminoácidos. Baseado em parte nessa descoberta, outrosagentes que inibem as farnesil transferases também são úteisnos métodos da invenção.

Os inibidores de farnesil transferase úteis nosmétodos da invenção são conhecidos no estado da técnica e sãodescritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n°.:7.022.704,6.936.431, 6.800.636, 6.790.633, 6.740.661, 6.737.410,6.576.639, 6.528.523, 6.498.152, 6.440.974, 6.432.959,6.410.541, 6.399.615, 6.372.747, 6.362.188; em outrasrealizações, FTIs de 3-mercaptopirrolidinas são descritos,por exemplo, na Patente U.S. n° . 6.946.468; FTIs detetralonas substituídas na posição 5 são descritos, porexemplo, na Patente U.S. n°. 6.943.183; inibidores bicíclicossão descritos na Patente U.S. n° . 6.528.535; e triazóis comoinibidores de farnesil transferase são descritos, porexemplo, na publicação 20050234117. Outros FTIsexemplificadores úteis nos métodos da invenção são descritonas publicações de pedidos de patentes norte-americanosnúmeros: 20060079530. 20050148609, 20050059672, e20050020516; e nas seguintes publicações científicas:Santucci et al., Câncer Control 10:384-387, 2003; Mégnin-Chanet et al. , BMC Pharmacology, 2:2, 2002, BMS-214662; eAppels et al. , (The Oncologist, 10: 565-578, 2005). Osinibidores de farnesil transferase exemplificadores incluem,mas sem ficar a eles limitados, R115777, GGTI-2166, BMS-214664, que são descritos por Santucci et al., Câncer Control10:384-387, 2003; RPR-130401, que é descrito por Mégnin-Chanet et al. , BMC Pharmacology, 2:2, 2002; BMS-214662(Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ); L778123 (Merck & Co.,Inc., Whitehouse Station, NJ); tipifarnib (nome experimental,R115777; Zarnestra™; Ortho Biotech Products, L.P.,Bridgewater, NJ); lonafarnib (nome experimental, SCH66336;Sarasar™; Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) ; FTI-277 (Calbiochem, EMD Biosciences, San Diego); e L744832(Biomol International L.P., Plymouth Meeting, PA).

As doses clínicas sugeridas dos FTIs ficamtipicamente compreendidas entre 100 μg e 10.000 mg ao dia. Aadministração pode ser através de qualquer método conhecidono estado da técnica. Particularmente, tipifarnib éadministrado em doses de 150, 200, 300, 400, 500, e 600 mgoralmente duas vezes ao dia durante 21 dias. Lonafarnib éadministrado em doses de 100, 200, 300, e 400 mg oralmenteduas vezes ao dia em um regime contínuo. BMS-214662 éadministrado tipicamente intravenosamente em uma infusão de 1hora uma vez a cada três semanas a 100 mg/m2, 200 mg/m2, 275mg/m2, e 3 00 mg/m2 para uma infusão de 24 horas;

alternativamente, BMS-214662 é administrado a 300 mg/m2 emuma programação semanal e a 102 mg/m2 em uma programaçãosemanal. A administração de BMS-214662 em uma base diária a81 mg/m2 também é útil nos métodos da invenção. Outros modosde administração de FTIs são conhecidos no estado da técnica,e são descritos, por exemplo, por Appels et al. , (TheOncologist, 10: 565-578, 2005).

Distúrbios Conformacionais de Proteínas Oculares

As composições da invenção são particularmenteúteis para o tratamento de virtualmente qualquer DistúrbioConformacional de Proteína (PCD) ocular. Tais distúrbios sãocaracterizados pela acumulação de proteínas erroneamentedesdobradas como agregados de proteínas ou fibrilos dentro doolho. As composições da invenção intensificam seletivamente adegradação de proteínas erroneamente desdobradas enquantodeixam os níveis de proteínas corretamente desdobradaspreponderantemente não afetados. A retinite pigmentosa é umPCD ocular exemplificador que é associado com o desdobramentoerrôneo de uma opsina (por exemplo, opsina de P23H) (Númerosde Acesso no GenBank NM-000539 e NP-000530) , bem como com asmutações na anidrase carbônica IV (Números de Acesso noGenBank NM-000717 e NP-000708 (Rebello et al., Proc Acad NatlSci USA. 2004 27 de abril; 101 (17) : 6617-22) . A CA4 é umaproteína ancorada por glicosilfosfatidilinositol que éaltamente expressa nos coriocapillaris do olho humano. Umamutação de R14W faz com que a proteína CA4 seja desdobradaincorretamente e os pacientes que possuem essa mutação sofremde retinite pigmentosa dominante autossomal. As composiçõesda invenção que intensificam a degradação de uma formamutante do polipeptídeo CA4 são úteis para o tratamento daretinite pigmentosa dominante autossomal associada com asmutações no polipeptídeo CA4.

A retinosquise (RS) juvenil ligada a X é um outroPCD ocular. A RS é uma causa comum da degeneração macularjuvenil no sexo masculino. As mutações em RSl (NM-000330, NP-000321), ou retinosquesina, são as responsáveis pelaretinosquise ligada a X, uma degeneração macular desurgimento prematura comum no sexo masculino que resulta naseparação das camadas internas da retina e uma perda grave davisão. As mutações em RSl resultam no desdobramento deproteína (J Biol Chem. 2005 18 de março; 280(11) :10721-30) .As composições da invenção que intensificam a degradação deuma forma mutante de RSl são úteis para o tratamento daretinosquise.

O glaucoma é um PCD ocular que é associado com asmutações na miocilina. A miocilina é uma glicoproteínasecretada de função desconhecida que é expressa de maneiraonipresente em muitos órgãos humanos, incluindo o olho. Asmutações nessa proteína miocilina causam uma forma deglaucoma, uma causa principal da cegueira em todo o mundo. Asmiocilinas mutantes se acumulam no reticulum endoplásmico decélulas transfectadas como agregados insolúveis (Aroca-Aguilar et al. , Biol Chem. 2005 03 de junho; 280 (22) :21043-51; Números de Acesso no Genbank NM-000261 e NP-000252) . Ascomposições da invenção que intensificam a degradação de umaforma mutante de miocilina são úteis para o tratamento deglaucoma associado à miocilina.

A degeneração macular do tipo Stargardt é um PCDocular que é associado com mutações em EL0VL4. O ELOVL4(Alongamento de ácidos graxos de cadeia muito longa 4) é ummembro da família ELO das proteínas envolvidas na biosíntesede ácidos graxos de cadeia muito longa. As mutações em ELOVL4foram identificadas nos pacientes com degeneração macular dotipo Stargardt dominante autossomal (STGD3/adMD). Asproteínas mutantes de ELOVL4 se acumulam como grandesagregados em células transfectadas (Grayson et al. , J BiolChem. 2 005 21 de julho; Epub) (Números de Acesso no GenBankNM-022726 e NP-073563) . As composições da invenção queintensificam a degradação de uma forma de ELOVL4 mutante sãoúteis para o tratamento da degeneração macular do tipoStargardt.

A Malattia Leventinese (ML) e a distrofia retinalde colméia de Doyne (DHRD) referem-se a dois PCDs dominantesautossomal que são caracterizados pelos depósitos amarelo-brancos conhecidos como gânglios que se acumulam abaixo doepitélio do pigmento retinal (RPE) . O EFEMP 1 tem um papel naformação de gânglios retinais e está envolvido na etiologiada degeneração macular (Stone et al. , Nat Genet. 1999 Jun.;22 (2) :199-202) (Números de Acesso no Genbank NM-004105 e NP-004 096). O EFEMPI mutante é erroneamente desdobrado e retidodentro das células. As composições da invenção queintensificam a degradação de uma forma de EFEMPI mutante sãoúteis para o tratamento de gânglio dominante autossomal.

A distrofia macular de Best é um PCD dominanteautossomal que é causado por mutações em VMD2 (hBESTl) , quecodifica a Bestrofina, um canal de Cl(-) (Gomez et al. , DNASeq. Dez. 2001; 12 (5-6) :431-5) (Números de Acesso no GenBank:NM-004183 e NP-004174). As mutações na bestrofinaprovavelmente causam desdobramento errôneo de proteína. Ascomposições da invenção que intensificam a degradação de umaforma de bestrofina mutante corretamente desdobrada são úteispara o tratamento da distrofia macular de Best.

As distrofias corneais ligadas a 5q31 são PCDs dominantesautossomais que são caracterizados pela acumulaçãoprogressiva dependente da idade de depósitos de proteína nacórnea seguida pela degeneração visual. Foi verificado que asmutações no gene BIGH3 (Número de Acesso no GenBank: NM-000358), também denominado TGFBI (fator de crescimento detransformação-β-induzido) são as responsáveis por este grupointeiro de condições. As substituições em Arg-124, assim comooutros resíduos, resultam na deposição específica de córneada proteína codificada (Número de Acesso no GenBank NP-000349) através de passagens de agregação distintas queenvolvem o turnover alterado da proteína no tecido corneal.As composições da invenção que intensificam a degradação deuma forma mutante de proteína TGFBI corretamente dobrada sãoúteis para o tratamento de distrofias corneais ligadas a5q31.

Métodos Terapêuticos

A presente invenção apresenta métodos para otratamento de uma doença PCD e/ou distúrbios ou sintomas damesma (por exemplo, citotoxicidade) mediante a intensificaçãoseletiva da degradação de uma proteína incorretamentedesdobrada. Os métodos compreendem a administração de umaquantidade terapeuticamente eficaz de uma composiçãofarmacêutica que compreende um composto (por exemplo, uminibidor de mTOR, tal como a rapamicina, um inibidor defarnesil transferase, tal como FTI-277) descrito na presenteinvenção, a um indivíduo (por exemplo, um mamífero tal comoum ser humano). Desse modo, uma realização consiste em ummétodo para o tratamento de um indivíduo que sofre ou estásuscetível a uma doença de conformação de proteína ou umdistúrbio ou um sintoma da mesma. 0 método inclui a etapa deadministração ao mamífero de uma quantidade terapêutica deuma quantidade de um composto da presente invenção suficientepara tratar a doença ou o distúrbio ou os sintomas dosmesmos, sob condições tais que a doença ou o distúrbio sejatratado.

Os métodos da presente invenção incluem aadministração ao indivíduo (incluindo um indivíduoidentificado como com necessidade de tal tratamento) de umaquantidade eficaz de um composto descrito na presenteinvenção ou uma composição descrita na presente invenção paraproduzir tal efeito. A identificação de um indivíduo comnecessidade de tal tratamento pode estar no julgamento de umindivíduo ou de um profissional da área da saúde e pode sersubjetiva (por exemplo, opinião) ou objetiva (por exemplo,mensurável por um método de teste ou de diagnóstico).

Os métodos terapêuticos da invenção, que incluem otratamento profilático, compreendem em geral a administraçãode uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos dapresente invenção, tal como um composto das fórmulas dapresente invenção a um indivíduo (por exemplo, animal,humano) com necessidade dos mesmos, incluindo um mamífero,particularmente um ser humano. Tal tratamento seráadministrado apropriadamente aos indivíduos, particularmenteaos seres humanos que sofrem de, têm, estão suscetíveis oucorrendo o risco de ter uma doença, um distúrbio ou umsintoma dos mesmos. A determinação desses indivíduos"correndo o risco" pode ser feita por qualquer determinaçãoobjetiva ou subjetiva por um teste de diagnóstico ou opiniãode um indivíduo ou fornecedor de serviços de saúde (porexemplo, teste genético, marcador de enzima ou de proteína(tal como definido na presente invenção) , histórico genéticode família e outros ainda). Os compostos da presente invençãotambém podem ser utilizados no tratamento de todos os outrosdistúrbios em que o desdobramento da proteína (incluindo odesdobramento incorreto) pode estar implicado.

Em uma realização, a invenção apresenta um métodode monitoramento do progresso do tratamento. 0 método incluia etapa de determinação de um nível do marcador dediagnóstico (Marcador) (por exemplo, qualquer alvo delineadoda presente invenção modulado por um composto da presenteinvenção, por uma proteína ou por um indicador dos mesmos,etc.) ou a medição diagnostica (por exemplo, seleção, ensaio)em um indivíduo que sofre ou está suscetível a um distúrbioou sintomas dos mesmos associados com o desdobramento daproteína (incluindo o desdobramento incorreto), em que foiadministrada uma quantidade terapêutica de um composto napresente invenção ao indivíduo suficiente para tratar adoença ou os sintomas da mesma. 0 nível do Marcadordeterminado no método pode ser comparado aos níveisconhecidos do Marcador em controles normais saudáveis ou emoutros pacientes afetados para estabelecer o status da doençado indivíduo. Nas realizações preferidas, um segundo nível deMarcador no indivíduo é determinado a um ponto de tempoposterior à determinação do primeiro nível e os dois níveissão comparados para monitorar o curso da doença ou a eficáciada terapia. Em determinadas realizações preferidas, um nívelde pré-tratamento do Marcador no indivíduo é determinadoantes do início do tratamento, de acordo com a presenteinvenção; este nível de pré-tratamento do Marcador pode entãoser comparado ao nível do Marcador no indivíduo depois que otratamento é iniciado, para determinar a eficácia dotratamento.

Composições Farmacêuticas

A presente invenção caracteriza preparadosfarmacêuticos que compreendem compostos conjuntamente comveículos farmaceuticamente aceitáveis, onde os compostospropiciam a degradação seletiva de uma proteínaincorretamente desdobrada. Tais preparados têm aplicaçõesterapêuticas e profiláticas. Em uma realização, umacomposição farmacêutica inclui 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal em combinação com o composto que intensifica adegradação de uma proteína incorretamente desdobrada. 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal e o composto são formulados emconjunto ou separadamente. Os compostos da invenção podem seradministrados como parte de uma composição farmacêutica. Ascomposições devem ser estéreis e devem conter uma quantidadeterapeuticamente eficaz dos polipeptídeos em uma unidade depeso ou volume apropriada para a administração a umindivíduo. As composições e as combinações da invenção podemfazer parte de um pacote farmacêutico, onde cada um doscompostos está presente em quantidades de dosagemindividuais.

Tal como empregado na presente invenção, oscompostos da presente invenção, que incluem os compostos dasfórmulas descritas na presente invenção, são definidos demodo a incluir derivados farmaceuticamente aceitáveis ou pró-medicamentos dos mesmos. Um "derivado ou um pró-medicamentofarmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal, éster,sal de éster ou outro derivado farmaceuticamente aceitável deum composto da presente invenção que, quando da administraçãoa um receptor, pode formar (direta ou indiretamente) umcomposto da presente invenção. Os derivados e os pró-medicamentos particularmente favorecidos são aqueles queaumentam a biodisponibilidade dos compostos da presenteinvenção quando tais compostos são administrados a ummamífero (por exemplo, permitindo que um composto oraladministrado seja absorvido mais facilmente no sangue) ouintensificam a aplicação do composto original a umcompartimento biológico (por exemplo, o cérebro ou o sistemalinfático) em relação à espécie original.

Os pró-medicamentos preferidos incluem derivadosonde um grupo que intensifica a solubilidade aquosa ou otransporte ativo através da membrana do tubo digestivo éadicionado à estrutura das fórmulas descritas na presenteinvenção. Vide, por exemplo, Alexander, J. et al., Journal ofMedicinal Chemistry 1988, 31, 318-322; Bundgaard, Design ofProdrugs; Elsevier: Amsterdam, 1985; pp. 1-92; Bundgaard, H.;Nielsen, Ν. M. Journal of Medicinal Chemistry 1987, 30,451-454; Bundgaard, Η. A Textbook of Drug Design and Development;Harwood Publ. Academic: Suíça, 1991; páginas 113-191;Digenis, G. A. et al. Handbook of Experimental Pharmacology1975, 28, 86-112; Friis, G. J.; Bundgaard, Η. A Textbook ofDrug Design and Development; 2a ed. ; Overseas Publ.:Amsterdam, 1996; páginas 351-385;0 Pitman, I. H. MedicinalResearch Reviews 1981, 1, 189-214; Sinkula, Α. A.; Yalkowsky.Journal of Medicinal Chemistry 1975, 64, 181-210; Verbiscar,A. J.; Abood, L. G Journal of Medicinal Chemistry 1970, 13,1176-1179; Stella, V. J.; Himmelstein, K. J. Journal ofMedicinal Chemistry 1980, 23, 1275-1282; Bodor, N.; Kaminski,J. J. Annual Reports in Medicinal Chemistry 1987, 22,303-313.

Os compostos da presente invenção podem sermodificados ao adicionar funcionalidades apropriadas paraintensificar as propriedades biológicas seletivas. Taismodificações são conhecidas no estado da técnica e incluemaquelas que aumentam a penetração biológica em um determinadocompartimento biológico (por exemplo, o sangue, o sistemalinfático, o sistema nervoso), aumentam a disponibilidadeoral, aumentam a solubilidade para permitir a administraçãopor injeção, alteram o metabolismo, e alteram a taxa deexcreção.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostosda presente invenção incluem aqueles derivados de ácidos ebases inorgânicos e orgânicos farmaceuticamente aceitáveis.Os exemplos de sais ácidos apropriados incluem o acetato,adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenosulfonato,bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato,digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato,fumarato, glucoeptanoato, glicolato, hemisulfato, heptanoato,hexanoato, cloridreto, bromidreto, hidroiodeto, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato,metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato,palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato,picarato, pivalato, propionato, salicilato, succinato,sulfato, tartarato, tiocianato, tosilato e hendecanoato.Outros ácidos, tais como o ácido oxálico, embora não sejampor si farmaceuticamente aceitáveis, podem ser empregados napreparação de sais úteis como intermediários na obtenção doscompostos da invenção e seus sais de adição ácidafarmaceuticamente aceitáveis. Os sais derivados das basesapropriadas incluem sais de metais alcalinos (por exemplo,sódio), sais de metais alcalino-terrosos (por exemplo,magnésio), amônio e sais de N-(alquila)4+. A presenteinvenção também prevê a quaternização de todos os grupos quecontêm nitrogênio básicos dos compostos descritos na presenteinvenção. Produtos solúveis ou dispersíveis em água ou emóleo podem ser obtidos por tal quaternização.

As composições farmacêuticas da invenção a seremutilizadas para a administração profilática ou terapêuticadevem ser estéreis. A esterilidade é facilmente obtida pelafiltração através de membranas de filtração estéreis (porexemplo, membranas de 0,2 μπι) , irradiação gama ou qualqueroutro dispositivo apropriado conhecido pelos elementosversados na técnica. As composições terapêuticas dopolipeptídeo são colocadas geralmente em um recipiente quetem uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco desolução intravenosa ou um frasco que tem um bloqueadorperfurável por uma agulha de injeção hipodérmica. Estascomposições serão armazenadas ordinariamente em recipientesunitários ou de múltiplas doses, por exemplo, em ampolas oufrascos vedados, como uma solução aquosa ou como umaformulação liofilizada para reconstituição.

Os compostos podem ser combinados, opcionalmente,com um excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 termo"excipiente farmaceuticamente aceitável", tal como empregadona presente invenção, significa uma ou mais cargas sólidas oulíquidas compatíveis, diluentes ou substâncias deencapsulação que são apropriadas para a administração a umser humano. 0 termo "veículo" denota um ingrediente orgânicoou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingredienteativo é combinado para facilitar a administração. Oscomponentes das composições farmacêuticas também podem sermisturados com as moléculas da presente invenção e entre si,de uma maneira tal que não haja nenhuma interação queprejudique substancialmente a eficácia farmacêutica desejada.

O excipiente contém, de preferência, quantidadesmenores de aditivos tais como substâncias que intensificam aisotonicidade e estabilidade química. Tais materiais sãoatóxicos aos receptores nas dosagens e concentraçõesempregadas e incluem tampões tais como o fosfato, citrato,succinato, acetato, lactato, tartarato e outros ácidosorgânicos ou seus sais; tris-hidroximetilaminometano (TRIS),bicarbonato, carbonato e outras bases orgânicas e seus sais;antioxidantes, tal como o ácido ascórbico; polipeptídeos debaixo peso molecular (por exemplo, menos de aproximadamentedez resíduos), por exemplo, poliarginina, polilisina,poliglutamato e poliaspartato; proteínas, tais como albuminado soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos,tais como polivinil pirrolidona (PVP), propileno glicóis(PPGs) e polietileno glicóis (PEGS); aminoácidos, tais comoglicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, histidina, lisinaou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos incluindo a celulose ou seus derivados, glicose,manose, sacarose, dextrinas ou derivados de carboidratossulfatados, tais como a heparina, o sulfato de condroitina ouo sulfato de dextrano; íons de metais polivalentes, tais comoos íons de metais divalentes incluindo íons de cálcio, íonsde magnésio e íons de manganês; agentes guelantes, tais comoo ácido tetracético de etilenodiamina (EDTA); álcoois deaçúcar, tais como o manitol ou o sorbitol; contra-íons, taiscomo o sódio ou o amônio; e/ou tensoativos não-iônicos, taiscomo polisorbatos ou poloxâmeros. Outros aditivos podem serincluídos, tais como estabilizantes, microbicidas, gasesinertes, reabastecedores de fluido e. de nutrientes (isto é,dextrose de Ringer), reabastecedores de eletrólitos e outrosainda, que podem estar presentes em quantidadesconvencionais.

As composições, tal como descrito acima, podem seradministradas em quantidades eficazes. A quantidade eficazirá depender do modo de administração, da condição particularque estiver sendo tratada e do resultado desejado. Ela tambémpode depender do estágio da condição, da idade e da condiçãofísica do indivíduo, da natureza da terapia simultânea, sehouver uma, e de fatores similares conhecidos pelo clínicomédico. Para aplicações terapêuticas, é a quantidadesuficiente para obter um resultado medicamente desejável.

No que se refere a um indivíduo que tem uma doençaou um distúrbio de conformação de proteína, uma quantidadeeficaz é suficiente para aumentar o nível de uma proteínacorretamente desdobrada em uma célula. No que se refere a umindivíduo que tem uma doença ou um distúrbio relacionado auma proteína incorretamente desdobrada, uma quantidade eficazé uma quantidade suficiente para estabilizar, retardar oureduzir um sintoma associado com uma patologia. Geralmente,as doses dos compostos da presente invenção devem ser deaproximadamente 0,01 mg/kg por dia a aproximadamente 1000mg/kg por dia. Espera-se que doses que variam deaproximadamente 50 a aproximadamente 2000 mg/kg sejamapropriadas. Doses mais baixas resultarão de determinadasformas de administração, tal como a administraçãointravenosa. Caso uma resposta em um indivíduo sejainsuficiente nas doses iniciais aplicadas, doses maiselevadas (ou doses eficazmente mais elevadas por uma viadiferente de aplicação, mais localizada) podem ser empregadasaté ao ponto em que a tolerância do paciente permitir. Dosesmúltiplas por dia são contempladas para atingir níveissistêmicos apropriados de uma composição da presenteinvenção.

Uma variedade de vias de administração édisponível. Os métodos da invenção, de modo geral, podem serpraticados empregando qualquer modo de administração que sejamedicamente aceitável, o que significa qualquer modo queproduza níveis eficazes dos compostos ativos sem causarefeitos clinicamente adversos inaceitáveis. Em uma realizaçãopreferida, uma composição da invenção é administrada intra-ocularmente. Outros modos de administração incluem as viasoral, retal, tópica, intra-ocular, oral, intravaginal,intracisternal, intracerebroventricular, intratraqueal,nasal, transdermal, dentro de/em implantes ou parenteral. 0termo "parenteral" inclui as vias subcutânea, intratecal,intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou infusão. Ascomposições que compreendem uma composição da invenção podemser adicionadas a um fluido fisiológico, tal como ao humorintravitreal. Para a administração ao SNC, uma variedade detécnicas está disponível para promover a transferênciaterapêutica através da barreira do sangue no cérebroincluindo o rompimento por cirurgia ou injeção, as drogas queabrem contato de aderência de modo transiente entre ascélulas endoteliais da vasculatura do SNC e os compostos quefacilitam a translocação através de tais células. Aadministração oral pode ser a preferida para o tratamentoprofilático por causa da conveniência ao paciente bem como aprogramação de dosagem.

As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem conter opcionalmente uma ou mais proteínas adicionaisconforme desejado, incluindo proteínas do plasma, proteases eoutro material biológico, contanto que não causem efeitosadversos quando da administração a um indivíduo. Asproteínas ou o material biológico apropriado podem serobtidos do plasma humano ou mamífero por qualquer um dosmétodos de purificação conhecidos e disponíveis aos elementosversados na técnica; de sobrenadantes, extratos ou lisatos dacultura de tecido, vírus, leveduras, bactérias recombinantesou similares que contêm um gene que expressa uma proteína doplasma humano ou de mamífero que é introduzida de acordo comas técnicas do DNA recombinante padrão; ou de fluidos (porexemplo, sangue, leite, Iinfa, urina ou similares) ou animaistransgênicos que contêm um gene que expressa uma proteína doplasma humano que é introduzida de acordo com as técnicastransgênicas padrão.

As composições farmacêuticas da invenção podemcompreender um ou mais compostos de tamponamento do pH paramanter o pH da formulação em um nível predeterminado quereflita o pH fisiológico, tal como na faixa deaproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0. 0 composto detamponamento do pH empregado na formulação líquida aquosapode ser um aminoácido ou uma mistura de aminoácidos, talcomo a histidina ou uma mistura de aminoácidos tal comohistidina e glicina. Alternativamente, o composto detamponamento do pH é de preferência um agente que mantém o pHda formulação em um nível predeterminado, tal como na faixade aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 e que não causea quelação dos íons de cálcio. Os exemplos ilustrativos detais compostos de tamponamento do pH incluem, mas sem ficar aeles limitados, íons de imidazol e de acetato. 0 composto detamponamento do pH pode estar presente em qualquer quantidadeapropriada para manter o pH da formulação em um nívelpredeterminado.

As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem conter um ou mais agentes de modulação osmótica, istoé, um composto que module as propriedades osmóticas (porexemplo, a tonicidade, a osmolalidade e/ou a pressãoosmótica) da formulação a um nível que seja aceitável para acorrente sangüínea e células sangüíneas de indivíduosreceptores. 0 agente de modulação osmótica pode ser um agenteque não cause a quelação dos íons de cálcio. 0 agente demodulação osmótica pode ser qualquer composto conhecido oudisponível aos elementos versados na técnica que module aspropriedades osmóticas da formulação. O elemento versado natécnica pode determinar empiricamente a adequabilidade de umdeterminado agente de modulação osmótica para ser utilizadona formulação da invenção. Os exemplos ilustrativos dos tiposapropriados de agentes de modulação osmótica incluem, mas semficar a eles limitados: sais, tais como o cloreto de sódio eo acetato de sódio; açúcares, tais como a sacarose, adextrose e o manitol; aminoácidos, tal como a glicina; e asmisturas de um ou de mais destes agentes e/ou tipos deagentes. 0(s) agente(s) de modulação osmótica pode(m) estarpresente(s) em qualquer concentração suficiente para modularas propriedades osmóticas da formulação.

As composições que compreendem um composto dapresente invenção podem conter íons de metais multivalentes,tais como íons de cálcio, íons de manganês e/ou íons demagnésio. Qualquer íon de metal multivalente que ajude aestabilizar a composição e que não afete adversamente osindivíduos receptores poderá ser utilizado. O elementoversado na técnica, com base nestes dois critérios, podedeterminar os íons de metal apropriados empiricamente e asfontes apropriadas de tais íons de metal são conhecidas eincluem sais inorgânicos e orgânicos.

As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem ser uma formulação líquida não-aquosa. Qualquer líquidonão-aquoso apropriado pode ser empregado, contanto quepropicie estabilidade aos agentes ativos(s) contidos nomesmo. De preferência, o líquido não-aquoso é um líquidohidrofílico. Os exemplos ilustrativos de líquidos não-aquososapropriados incluem: glicerol; ulfóxido de dimetila (DMSO);polidimetilsiloxano (PMS); etileno glicóis, tais como etilenoglicol, dietileno glicol, trietileno glicol, polietilenoglicol ("PEG") 200, PEG 300 e PEG 400; e propileno glicóis,tais como dipropileno glicol, tripropileno glicol,polipropileno glicol ("PPG") 425, PPG 725, PPG 1000, PPG2000, PPG 3000 e PPG 4000.As composições farmacêuticas da invenção tambémpodem ser uma formulação líquida aquosa/não-aquosa mista.Qualquer formulação líquida não-aquosa apropriada, tais comoaquelas descritas acima, pode ser empregada conjuntamente comqualquer formulação líquida aquosa, tais como aquelasdescritas acima, contanto que a formulação líquidaaquosa/não-aquosa mista propicie estabilidade ao compostocontido na mesma. De preferência, o líquido não-aquoso em talformulação é um líquido hidrofílico. Os exemplos ilustrativosde líquidos não-aquosos apropriados incluem: glicerol; DMSO;PMS; etileno/glicóis, tais como PEG 200, PEG 300 e PEG 400; epropileno glicóis, tais como PPG 425, PPG 725, PPG 1000, PPG2000, PPG 3000 e PPG 4000.

As formulações estáveis apropriadas podem permitira armazenagem dos agentes ativos em um estado líquidocongelado ou descongelado. As formulações líquidas estáveispodem ser armazenadas a uma temperatura de pelo menos -70°C,mas também podem ser armazenadas a temperaturas mais elevadasde pelo menos 0°C ou entre aproximadamente 0,1°C eaproximadamente 42°C, dependendo das propriedades dacomposição. Geralmente, o elemento versado na técnica sabeque as proteínas e os polipeptídeos são sensíveis às mudançasno pH, na temperatura e em uma multiplicidade de outrosfatores que podem afetar a eficácia terapêutica.

Outros sistemas de aplicação podem incluir sistemasde aplicação de liberação com o tempo, de liberação retardadaou de liberação prolongada. Tais sistemas podem evitaradministrações repetidas de composições da invenção,aumentando a conveniência ao indivíduo e ao médico. Muitostipos de sistemas de aplicação de liberação são disponíveis econhecidos pelos elementos versados na técnica. Eles incluemsistemas base de polímero tais como polilactídeos (PatenteU.S. N°. 3.773.919; Patente Européia N°. 58.481),poli(lactídeo-glicolídeo) , copolioxalatos, policaprolactonas,poliesteramidas, poliortoésteres, ácidos polidroxibutiricos,tal como o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (PatenteEuropéia N°. 133.988), copolímeros do ácido L-glutâmico egama-etil-L-glutamato (Sidman, I.R. et al. , Biopolimers22:547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietila) ou etileno -acetato de vinila (Langer, R. et al. , J. Biomed. Mater. Res.15:267-277; Langer, R. Chem. Tech. 12:98-105) epolianidridos.

Outros exemplos de composições de liberaçãosustentada incluem matrizes de polímero semi-permeáveis naforma de artigos moldados, por exemplo, películas oumicrocápsulas. Os sistemas de aplicação também incluem ossistemas de não-polímeros que são: lipídeos incluindo osesteróis tais como o colesterol, os ésteres de colesterol eos ácidos graxos ou as gorduras neutras tais como mono-, di-e tri-glicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel taiscomo o hidrogel biorreabsorvível derivado biologicamente(isto é, os hidrogéis de guitina ou os hidrogéis dequitosana) ; sistemas silásticos; sistemas baseados empeptídeos; revestimentos de cera; tabletes comprimidos queutilizam aglutinantes e excipientes convencionais; implantesparcialmente fundidos; e outros ainda. Os exemplosespecíficos incluem, mas sem ficar a eles limitados:(a)sistemas erosionais em que o agente é contido em uma formadentro de uma matriz, tal como aqueles descritos nas PatentesU.S. N0.4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 e 5.239.660 e (b)sistemas difusionais em que um componente ativo é permeado auma taxa controlada de um polímero tal como descrito nasPatentes U.S. N°.3.832.253 e 3.854.480.

Um outro tipo de sistema de aplicação que pode serutilizado com os métodos e as composições da invenção é umsistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersãocoloidal incluem os sistemas baseados em lipídeos incluindoas emulsões do tipo óleo-em-água, micelas, micelas misturadase lipossomos. Os lipossomos são vasos artificiais damembrana, que são úteis como um vetor de aplicação in vivo ouin vitro. Os vasos unilamelares grandes (LUV), que variam notamanho de 0,2 - 4,0 μπι, podem encapsular macromoléculasgrandes dentro do interior aquoso e podem ser aplicados àscélulas de uma forma biologicamente ativa (Fraley, R. ePapahadjopoulos, D., Trends Biochem. Sei. 6:77-80).

Os lipossomos podem ser visados em um tecidoparticular ao acoplar o lipossomo em um ligando específicotal como um anticorpo, um açúcar, um glicolipídeo ou umaproteína monoclonal. Os lipossomos estão comercialmentedisponíveis junto à Gibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTIN™e LIPOFECTACE™, os quais são formados de lipídeos catiônicostais como o cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-Ν,Ν,Ν-trimetil amônio (DOTMA) e o brometo de dimetil dioctadecilamônio (DDAB). Os métodos para a preparação dos lipossomossão bem conhecidos no estado da técnica e foram descritos emmuitas publicações, por exemplo, na patente DE 3.218.121;Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 82:3688-3692(1985); Hwang et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA) 77:4030-4034 (1980); na Patente Européia 52.322; na Patente Européia36.676; na Patente Européia 88.046; na Patente Européia14 3.94 9; na Patente Européia 142.641; no Pedido de PatenteJaponês 83-118008; nas Patentes U.S N°.4.485.045 e 4.544.545;e na Patente Européia 02.324. Os lipossomos também foramrevistos por Gregoriadis, G., Trends Biotechnol. 3:235-241).

Um outro tipo de veículo é uma micropartícula ou umimplante biocompatível que é apropriado para o implante noreceptor mamífero. Os implantes bioerosíveis exemplificadoresque são úteis de acordo com este método são descritos nopedido PCT Internacional N0 . PCT/US/03307 (publicação depedido de patente WO n°. 95/24929, intitulado "Polymeric GeneDelivery System"). 0 PCT/US/0307 descreve matrizespoliméricas biocompatíveis, de preferência biodegradáveispara conter um gene exógeno sob o controle de um promotorapropriado. As matrizes poliméricas podem ser utilizadas paraobter a liberação sustentada do gene exógeno ou do produto dogene no indivíduo.

A matriz polimérica está de preferência na forma deuma micropartícula tal como uma microesfera (onde um agente édisperso em toda a matriz polimérica sólida) ou umamicrocápsula (onde um agente é armazenado no núcleo de umescudo polimérico) . As microcápsulas dos polímerosantecedentes que contêm drogas são descritas, por exemplo, naPatente U.S. N°. 5.075.109. Outras formas de matrizpolimérica para conter um agente incluem películas,revestimentos, géis, implantes e stents. 0 tamanho e acomposição do dispositivo da matriz polimérica sãoselecionados para resultar em cinética de liberação favorávelno tecido em que a matriz é introduzida. 0 tamanho da matrizpolimérica é adicionalmente selecionado de acordo com ométodo de aplicação que deve ser empregado. De preferência,quando uma via em aerossol é usada, a matriz polimérica e acomposição são englobadas em um veículo tensoativo. Acomposição da matriz polimérica pode ser selecionada para terambas as taxas de degradação favoráveis e também pode serformada a partir de um material que seja bioaderente paraaumentar adicionalmente a eficácia da transferência. Acomposição da matriz também pode ser selecionada para nãodegradar, mas para ser liberada por difusão durante umperíodo de tempo prolongado. O sistema de aplicação tambémpode ser uma microesfera biocompatível que seja apropriadapara a aplicação local e específica do sítio. Taismicroesferas são descritas em Chickering, D.E., et al.,Biotechnol. Bioeng., 52:96-101; Mathiowitz, E., et al. ,Nature 386: 410-414.

Ambos as matrizes poliméricas biodegradáveis e não-biodegradáveis podem ser utilizadas para a aplicação dascomposições da invenção ao indivíduo. Tais polímeros podemser polímeros naturais ou sintéticos. 0 polímero éselecionado com base no período de tempo em que a liberação édesejada, geralmente da ordem de algumas horas a um ano oumais. Tipicamente, a liberação com o tempo que varia dealgumas horas a três a doze meses é a mais desejável. 0polímero está opcionalmente na forma de um hidrogel que podeabsorver até aproximadamente 90% de seu peso em água e,adicionalmente, é opcionalmente reticulado com íonsmultivalentes ou outros polímeros.

Os polímeros sintéticos exemplificadores que podemser utilizados para formar o sistema de aplicaçãobiodegradável incluem: poliamidas, policarbonatos,polialquilenos, polialquileno glicóis, óxidos depolialquileno, tereftalatos de polialquileno, álcooispolivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos,haletos polivinílicos, polivinil pirrolidona,poliglicolídeos, polisiloxanos, poliuretanos e co-polímerosdos mesmos, alquil celulose, hidróxi alquil celulose, éteresde celulose, ésteres de celulose, nitrocelulose, polímeros deésteres acrílicos e metacrílicos, metil celulose, etilcelulose, hidróxi propil celulose, hidróxi propil celulosemetil, hidróxi butil celulose, acetato de celulose,propionato de celulose, butirato de acetato de celulose,ftalato de acetato de celulose, carbóxi etil celulose,triacetato de celulose, sal de sódio de sulfato de celulose,poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila),poli(metacrilato de butila), poli(metacrilato de isobutila),poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato de isodecila),poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilato de fenila),poli(acrilato de metila) , poli(acrilato de isopropila),poli(acrilato de isobütila), poli(acrilato de octadecila),polietileno, polipropileno, poli(etileno glicol), óxido depoli(etileno) , poli(etileno tereftalato), álcooispoli(vinílicos), acetato de polivinila, cloreto depolivinila, poliestireno, polivinil pirrolidona e polímerosde ácido láctico e de ácido glicólico, polianidridos,poli(orto)ésteres, ácido poli(bútico), ácido poli(valérico) epoli(lactídeo-cocaprolactona) e polímeros naturais tais comoo alginato e os outros polissacarídeos incluindo o dextrano ea celulose, colágeno, derivados químicos dos mesmos(substituições, adições de grupos químicos, por exemplo,alquila, alquileno, hidroxilações, oxidações e outrasmodificações feitas rotineiramente pelos elementos versadosna técnica), albumina e outras proteínas hidrofílicas, zeínae outras prolaminas e proteínas hidrofóbicas, copolímeros eas misturas dos mesmos. Em geral, esses materiais sãodegradados através de hidrólise enzimática ou pela exposiçãoà água in vivo, pela erosão da superfície ou do volume.

Métodos de Aplicação ao Epitélio Pulmonar

Em determinadas realizações, tal como para otratamento da fibrose cística, onde é desejável aadministração de um composto da invenção diretamente aoepitélio pulmonar, uma via de administração desejável podeser feita por aerossol pulmonar. As drogas destinadas àaplicação pulmonar podem ser administradas como formulaçõesaquosas, como suspensões ou soluções em propelentes dehidrocarboneto halogenado, ou como pós secos. As formulaçõesaquosas devem ser aerossolizadas por nebulizadores líquidosque empregam a atomização hidráulica ou ultra-sônica,sistemas à base de propelente requerem inaladorespressurizados apropriados com medidor de dose, e os pós secosrequerem dispositivos inaladores de pó seco que são capazesde dispersar a substância da droga eficazmente. Para ossistemas aquosos e outros sistemas líquidos não-pressurizados, uma variedade de nebulizadores (incluindonebulizadores de pequeno volume) está disponível paraaerossolizar as formulações. Os nebulizadores dirigidos porcompressor incorporam a tecnologia de jato e utilizam arcomprimido para gerar o aerossol líquido. Os nebulizadoresultra-sônicos são baseados na energia mecânica na forma devibração de um cristal piezoelétrico para gerar gotaslíquidas respiráveis. Um inalador impelido por propulsorlibera uma dose medida do medicamento em cada atuação. 0medicamento é formulado como uma suspensão ou solução de umasubstância da droga em um propelente apropriado. Osinaladores em pó seco são normalmente baseados em um borrifode ar inspirado que é extraído através da unidade paraaplicar uma dosagem da droga. Tais dispositivos sãodescritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°. 4.807.814 e5.785.049.

A aplicação de droga pulmonar é executada pelainalação de um aerossol através da boca e da garganta. Aspartículas que têm diâmetros de aproximadamente 2 aaproximadamente 5 micra são suficientemente pequenas paraalcançar a região pulmonar superior e média (vias aéreascondutoras) , mas são demasiadamente grandes para alcançar osalvéolos. Até mesmo as partículas menores, isto é, deaproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 micra, podem alcançara região alveolar. As partículas que têm diâmetros menores doque aproximadamente 0,5 micra também podem ser depositadas naregião alveolar por sedimentação, embora partículas muitopequenas possam ser exaladas. As técnicas para a preparaçãode sistemas de aplicação em aerossol são bem conhecidas peloselementos versados na técnica. Vide as Patentes U.S N° .4.512.341, 4.566.452, 4.746.067, 5.008.048, 6.796.303 e aPublicação de Patente U.S. N°. 20020102294. Os elementosversados na técnica podem facilmente modificar os váriosparâmetros e condições para produzir aerossóis pulmonares semrecorrer à experimentação imprópria.

Métodos de Aplicação Ocular

As composições da invenção (por exemplo, umintensificador de autofagia, um inibidor de mTOR, tal como arapamicina, um inibidor de farnesil transferase, tal comoFTI-277) são particularmente apropriadas para o tratamentodas doenças de conformação de proteína oculares, tais como oglaucoma, a retinite pigmentosa, a degeneração macularrelacionada à idade, distrofias corneais, retinosquises, omal de Stargardt, gânglio dominante autossomal e distrofiamacular de Best.

Em uma abordagem, as composições da invenção sãoadministradas através de um dispositivo ocular apropriadopara o implante direto no vítreo do olho. As composições dainvenção podem ser fornecidas em composições de liberaçãosustentada, tais como aquelas descritas, por exemplo, nasPatentes U.S. N°.5.672.659 e 5.595.760. Foi verificado quetais dispositivos propiciam a liberação controlada sustentadade várias composições para tratamento do olho sem o risco deefeitos colaterais locais e sistêmicos prejudiciais. Umobjetivo do presente método ocular de aplicação é amaximização da quantidade de droga contida em um dispositivointra-ocular ou implante enquanto minimiza o seu tamanho afim de prolongar a duração do implante. Vide, por exemplo, asPatentes U.S. N°. 5.378.475; 6.375.972 e 6.756.058 e asPublicações U.S. 20050096290 e 200501269448. Tais implantespodem ser implantes biocompatíveis e/ou biodegradáveis oupodem ser implantes não-biodegradáveis. Os implantes ocularesbiodegradáveis são descritos, por exemplo, na Publicação dePatente U.S. N°. 20050048099. Os implantes podem serpermeáveis ou impermeáveis ao agente ativo e podem serintroduzidos em uma câmara do olho, tais como as câmarasanterior ou posterior, ou podem ser implantados na esclera,no espaço transcoroidal ou na região avascularizada externaao vítreo. Alternativamente, uma lente de contato que ajacomo um depósito para as composições da invenção também podeser utilizada para a aplicação da droga.

Em uma realização preferida, o implante pode serposicionado sobre uma região avascular, tal como na esclera,para permitir a difusão transcleral da droga ao sítiodesejado do tratamento, por exemplo, o espaço intra-ocular ea mácula do olho. Além disso, o sítio de difusão transcleralfica de preferência na proximidade da mácula. Os exemplos deimplantes para a aplicação de uma composição incluem, mas semficar a eles limitados, os dispositivos descritos nasPatentes U.S. N°. 3.416.530; 3.828.777; 4.014.335; 4.300,557;4 327 725; 4 853.224; 4 946 450; 4 997 652; 5.147.647 ;5 164 18 8; 5 178 . 635; 5 . 300 114 ; 5 322 691; 5 .403.901;5 443 5 05; 5 466.466; 5 .476 511; 5 516 522 ; 5.632.984;5 . 679 666; 5 710.165; 5 . 725 .4 93 ; 5 . 743 274 ; 5.766.242;5 . 766 619; 5 770,592; 5 . 773 019; 5 . 824 072; 5.824.073 ;5 . 830 173 ; 5 .836.935; 5 . 869 079, 5 . 902 598 ; 5.904.144;5 . 916 584 ; 6 .001.386; 6 . 074 . 661; 6 . 110 .485; 6.126.687;6 . 146 .3 66; 6.251.090; e 6 299 895, no pedido de patente WO01/30323 e no pedido de patente WO 01/28474, os quais sãoincorporados na presente invenção a título de referência.

Os exemplos incluem, mas sem ficar a eleslimitados, os seguintes: um sistema de aplicação de droga deliberação sustentada que compreende um reservatório internoque compreende uma quantidade eficaz de um agente eficaz paraobter um efeito fisiológico ou farmacológico local ousistêmico desejado, um tubo interno impermeável à passagem doagente, sendo que o tubo interno tem uma primeira e segundaextremidades e cobre pelo menos uma porção do reservatóriointerno, sendo que o tubo interno é feito sob medida e éformado de um material de modo que o tubo interno possasuportar o seu próprio peso, um elemento impermeávelposicionado na primeira extremidade do tubo interno, sendoque o elemento impermeável impede a passagem do agente parafora do reservatório através da primeira extremidade do tubointerno, e um elemento permeável posicionado na segundaextremidade do tubo interno, sendo que o elemento permeávelpermite a difusão do agente para fora do reservatório atravésda segunda extremidade do tubo interno; um método para aadministração de um composto da invenção a um segmento de umolho, sendo que o método compreende a etapa de implante de umdispositivo de liberação sustentada para aplicação docomposto da invenção ao vítreo do olho ou de um dispositivode liberação sustentada implantável para administração de umcomposto da invenção a um segmento de um olho; sendo quedispositivo de aplicação de droga de liberação sustentadacompreende: a) um núcleo da droga que compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um primeiroagente eficaz para obter um efeito diagnóstico ou eficaz paraobter um efeito fisiológico ou farmacológico local ousistêmico desejado; b) pelo menos um copo unitárioessencialmente impermeável à passagem do agente que circundae define um compartimento interno para receber o núcleo dadroga, sendo que o copo unitário compreende uma extremidadesuperior aberta com pelo menos um sulco de reentrância emtorno de pelo menos uma porção da extremidade superior abertado copo unitário; c) um plugue permeável que é permeável àpassagem do agente, sendo que o plugue permeável éposicionado na extremidade superior aberta do copo unitárioonde o sulco interage com o plugue permeável mantendo o mesmona posição e fechando a extremidade superior aberta, sendoque o plugue permeável permite a passagem do agente para forado núcleo da droga, através do plugue permeável e para forada extremidade superior aberta do copo unitário; e d) pelomenos um segundo agente eficaz para obter um efeito dediagnóstico ou eficaz para obter um efeito fisiológico oufarmacológico local ou sistêmico desejado; ou um dispositivode aplicação de droga de liberação sustentada que compreende:um núcleo interno que compreende uma quantidade eficaz de umagente que tem uma solubilidade desejada e uma camada derevestimento do polímero, sendo que a camada do polímero épermeável ao agente, onde a camada de revestimento dopolímero cobre completamente o núcleo interno.

Outras abordagens para a aplicação ocular incluem ouso de lipossomos para visar um composto da presente invençãoao olho e, de preferência, às células epiteliais do pigmentoretinal e/ou à membrana de Bruch. Por exemplo, o compostopode ser complexado com os lipossomos da maneira descritaacima e esse complexo de composto/lipossomo pode ser injetadoem pacientes com um PCD ocular, utilizando injeçãointravenosa para dirigir o composto ao tecido ocular ou àcélula desejada. A injeção direta do complexo do lipossomo naproximidade das células epiteliais do pigmento retinal ou damembrana de Bruch também pode propiciar o alvejamento docomplexo com algumas formas de PCD ocular. Em uma realizaçãoespecífica, o composto é administrado através de aplicaçãosustentada intra-ocular (tal como VITRASERT ou ENVISION). Emuma realização específica, o composto é aplicado por injeçãosubcutânea posterior. Em uma outra realização específica, aspartículas de microemulsão que contêm as composições dainvenção são aplicadas ao tecido ocular para extrair lipídeoda membrana de Bruch, das células epiteliais do pigmentoretinal ou de ambas.As nanopartícuias constituem um sistema carreadorcoloidal que demonstrou melhorar a eficácia da drogaencapsulada ao prolongar a meia vida do soro. Asnanoparticulas de polialguilcianoacrilatos (PACAs) constituemum sistema de aplicação de droga coloidal de polímero queestá em desenvolvimento clínico, tal como descrito por Stellaet al., J. Pharm. Sci., 2000.89: páginas 1452-1464; Briggeret al., Int. J. Pharm., 2001.214: páginas 37-42; Calvo etal., Pharm. Res., 2001.18: páginas 1157-1166; e Li et al. ,Biol. Pharm. Bull., 2001.24: páginas 662-665. Os ácidos depoli(hidroxila) biodegradáveis, tais como os copolímeros deácido poli(láctico) (PLA) e ácido poli(láctico-co-glicólico)(PLGA), estão sendo utilizados extensivamente em aplicaçõesbiomédicas e receberam a aprovação do FDA para determinadasaplicações clínicas. Além disso, as nanoparticulas de PEG-PLGA têm muitas características carreadoras desejáveis,incluindo: (i) que o agente a ser encapsulado compreende umafração de peso razoavelmente elevado (carga) do sistemacarreador total; (ii) que a quantidade de agente utilizada naprimeira etapa do processo de encapsulação é incorporada nocarreador final (eficiência de captura) a um nívelrazoavelmente elevado; (iii) que o carreador tem a capacidadede ser secado por congelamento e reconstituído em solução semagregação; (iv) que o carreador é biodegradável; (v) que osistema carreador é de um tamanho pequeno; e (vi) que ocarreador intensifica a persistência das partículas.

As nanoparticulas são sintetizadas utilizandovirtualmente qualquer envoltório biodegradável conhecido noestado da técnica. Em uma realização, é utilizado umpolímero, tal como o ácido poli (láctico) (PLA) ou o ácidopoli(láctico-coglicólico) (PLGA). Tais polímeros sãofotoquímicos biocompatíveis e biodegradáveis, e eles sãosujeitos às modificações que aumentam desejavelmente aeficácia e a vida útil em circulação das nanopartículas. Emuma realização, o polímero é modificado com um grupo de ácidocarboxílico (COOH) terminal que aumenta a carga negativa dapartícula e limita desse modo a interação com os aptâmeros deácido nucléico carregados negativamente. As nanopartículastambém são modificadas com polietileno glicol (PEG), quetambém aumenta a meia vida e a estabilidade das partículas emcirculação. Alternativamente, o grupo COOH é convertido em uméster de N-hidróxi succinimida (NHS) para a conjugaçãocovalente em aptâmeros modificados com amina.

Os polímeros biocompatíveis úteis na composição enos métodos da invenção incluem, mas sem ficar a eleslimitados, poliamidas, policarbonates, polialquilenos,polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatosde polialquileno, álcoois polivinílicos, éterespolivinílicos, ésteres polivinílicos, haletos de polivinila,polivinil pirrolidona, poliglicolídeos, polisiloxanos,poliuretanos e copolímeros dos mesmos, alquil celulose,hidróxi alquil celulose, éteres de celulose, ésteres decelulose, nitrocelulose, polímeros de ésteres acrílicos emetacrílicos, metil celulose, etil celulose, hidróxi propilcelulose, metil hidróxi propil celulose, metil hidróxi butilcelulose, acetato de celulose, propionato de celulose,butirato acetato de celulose, ftalato acetato de celulose,carboxil etil celulose, triacetato de celulose, sal de sódiode sulfato de celulose, poli(metacrilato de metila),poli(metacrilato de etila), poli(metacrilato de butila),poli(metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila),poli(metacrilato. de isodecila), poli(metacrilato de laurila),poli(metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila),poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila),poli(acrilato de octadecila), polietileno, polipropileno,poli(etileno glicol), óxido de poli(etileno), tereftalato depoli(etileno) , álcoois polivinílicos, acetato de polivinila,cloreto de polivinila, poliestireno, polivinil pirrolidona,ácidos poli-hialurônicos, caseína, gelatina, glutina,polianidridos, ácido poliacrilico, alginato, quitosana,poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila),poli(metacrilato de butila), poli(metacrilato de isobutila),poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato de isodecila),poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilato fenila),poli(acrilato de metila), poli(acrilato de isopropila),poli(acrilato de isobutila), poli(acrilato de octadecila) eas combinações de quaisquer destes. Em uma realização, asnanoparticulas da invenção incluem polímeros de PEG-PLGA.

As composições da invenção também podem seraplicadas topicamente. Para a aplicação tópica, ascomposições são fornecidas em qualquer excipientefarmaceuticamente aceitável que seja aprovado para aaplicação ocular. De preferência, a composição é aplicada naforma de gotas à superfície do olho. Para alguma aplicação, aaplicação da composição é baseada na difusão dos compostosatravés da córnea ao interior do olho.

Os elementos versados na técnica irão reconhecerque os melhores regimes de tratamento para a utilização doscompostos da presente invenção no tratamento de um PCD ocularpodem ser determinados diretamente. Esta não é uma questão deexperimentação, mas, ao invés disto, uma otimização, a qual érealizada rotineiramente nas técnicas médicas. Os estudos invivo em camundongos pelados fornecem freqüentemente um pontode partida a partir do qual é iniciada a otimização dosregimes de dosagem e de aplicação. A freqüência de injeçãoserá inicialmente uma vez por semana, tal como foi feito emalguns estudos de camundongos. No entanto, essa freqüênciapode ser ajustada idealmente de um dia a cada duas semanaspara mensal, dependendo dos resultados obtidos dasexperimentações clínicas iniciais e das necessidades de umpaciente em particular.

As quantidades de dosagens humanas para ascomposições da invenção (por exemplo, um intensificador deautofagia, um inibidor de mTOR, tal como a rapamicina, uminibidor de farnesil transferase, tal como FTI-277) podem serinicialmente determinadas mediante a extrapolação daquantidade de composto utilizada nos camundongos, tal como umelemento versado na técnica reconhece como rotineira noestado da técnica a modificação da dosagem para os sereshumanos em comparação aos modelos animais. Em determinadasrealizações é contemplado que a dosagem pode variar entreaproximadamente 1 mg/kg do peso corpóreo a aproximadamente5.000 mg de composto/Kg do peso corpóreo; ou deaproximadamente 5 mg/Kg do peso corpóreo a aproximadamente4.000 mg/Kg, ou de aproximadamente 10 mg/Kg do peso corpóreoa aproximadamente 3.000 mg/Kg do peso corpóreo; ou deaproximadamente 50 mg/Kg do peso corpóreo a aproximadamente2.000 mg/Kg do peso corpóreo; ou de aproximadamente 100 mg/Kgdo peso corpóreo a aproximadamente 1.000 mg/Kg do pesocorpóreo; ou de aproximadamente 150 mg/Kg do peso corpóreo aaproximadamente 500 mg/Kg do peso corpóreo. Em outrasrealizações essa dose pode ser de aproximadamente 1, 5, 10,25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550,600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050, 1.100,1.150, 1.200, 1.250, 1.300, 1.350, 1.400, 1.450, 1.500,1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, 3.000, 3500, 4.000,4.500, 5.000 mg/Kg do peso corpóreo. Em outras realizações, écontemplado que podem ser utilizadas doses mais elevadas, etais doses podem estar compreendidas na faixa deaproximadamente 5 mg de composto/Kg do corpo aaproximadamente 20 mg de composto/Kg do corpo. Em outrasrealizações, as doses podem ser de aproximadamente 8, 10, 12,14, 16 ou 18 mg/Kg do peso corpóreo. Onde a rapamicina éutilizada, dosagens de 1 mg, 2 mg, 3 mg, 5 mg, 7 mg, 10 mg,15 mg, 20 mg, ou 25 mg podem ser utilizadas por dia.Naturalmente que essa quantidade de dosagem pode ser ajustadapara cima ou para baixo, tal como é feito rotineiramente emtais protocolos de tratamento, dependendo dos resultados dasexperimentações clínicas iniciais e das necessidades de umpaciente em particular.

Ensaios de Seleção

Tal como aqui discutido, as proteínasincorretamente desdobradas freqüentemente interferem nafunção biológica normal das células e causam PCD. Em muitoscasos, a acumulação de proteínas incorretamente desdobradasnos agregados de proteínas causa danos celulares ecitotoxicidade. Os compostos úteis intensificam a degradaçãode tais proteínas, melhorando desse modo a citotoxicidade.Qualquer número de métodos é disponível para a realização deensaios de seleção para identificar tais compostos. Em umaabordagem, uma proteína mutante que não consegue adotar umaconformação de proteína do tipo selvagem é expressa em umacélula (por exemplo, uma célula in vitro ou in vivo); acélula é colocada em contato com um composto candidato; e oefeito do composto na autofagia é ensaiado utilizandoqualquer método conhecido no estado da técnica ou aquidescrito. Um composto que intensifica a autofagia éidentificado pela medição de uma diminuição no nível de umaproteína incorretamente desdobrada, na medição de umadiminuição na citotoxicidade, na medição de um aumento napresença de vacúolos autofágicos, ou na medição de um aumentono nível de um marcador autofágico (por exemplo, mTORdesfosforilado ou quinase S6) utilizando qualquer métodopadrão (por exemplo, imunoensaio). Um composto que reduz aquantidade de proteína incorretamente desdobrada presente nacélula contatada em relação a uma célula de controle que nãofoi colocada em contato com o composto é considerado útil nosmétodos da invenção. Uma diminuição na quantidade da proteínaincorretamente desdobrada é analisada, por exemplo, pelamedição de uma diminuição na agregação de proteínaintracelular, pela medição de uma diminuição nacitotoxicidade, ou pela medição de uma diminuição no nível daproteína. De preferência, a proteína incorretamentedesdobrada é degradada seletivamente. Em uma abordagemcorrelata, a seleção é realizada na presença de rapamicina,FTI-277, 11-cis-retinal, 9-cis-retinal, ou um análogo ou umderivado dos mesmos. Os compostos úteis diminuem a quantidadeda proteína incorretamente desdobrada em pelo menos 10%, 15%,ou 20%, ou de preferência em 25%, 50%, ou 75%; ou com maiorpreferência em pelo menos 100%, 200%, 300% ou até mesmo 400%.

Caso desejado, a eficácia do composto identificadoensaiado em um modelo animal que tem um PCD (por exemplo, ummodelo animal de retinite pigmentosa, fibrose cística, mal deHuntington, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, diabeitesinsipidus nefrogênico, câncer (por exemplo, câncerrelacionado a mutações p53), e distúrbios relacionados compríons (por exemplo, mal de Jacob-Creutzfeld) ) .

Seleção Para Intensificadores da Atividade da Rapamicina

A invenção refere-se a métodos para intensificar aautofagia para o tratamento de uma PCD. Os compostos queintensificam a atividade biologia de rapamicina ou de FTI-277devem intensificar a degradação de proteínas incorretamentedesdobradas. Consequentemente, os compostos identificadoscomo intensificadores de um efeito biológico de rapamicina oude FTI-277 são úteis nos métodos da invenção. Em umarealização, as pequenas moléculas que intensificam umaatividade biológica de rapamicina são identificadasutilizando uma estratégia de identificação alvo de pequenamolécula em células de levedura. A rapamicina inibe ocrescimento das células de levedura do tipo selvagem. Oscompostos que intensificam o efeito inibidor no crescimentodas células de levedura podem ser identificados utilizandométodos rotineiros, tais como uma seleção de modificadorgenético químico. Tais seleções são conhecidas no estado datécnica e descritas, por exemplo, por Huang et al. , PNAS 101:16594-16599, 2004. 0 tratamento com rapamicina induz umestado reminiscente da resposta à carência de nutrientes,freqüentemente resultando na inibição do crescimento.Utilizando uma seleção de modificador genético químico, osintensificadores de pequenas moléculas de rapamicina (SMERs)aumentam (por exemplo, um aumento em pelo menos 5%, 10%, 25%,50%, 75%, 85%, 90%, ou 95%) o efeito da rapamicina nalevedura Saccharomyces cerevisiae. A sondagem de chips deproteoma com SMERs biotinilados irão identificar as proteínasalvo intracelulares putativas que modificam um efeito celularda rapamicina. Em uma realização, a rapamicina é adicionadaao meio de cultura de uma célula de levedura na presença ouna ausência de um composto candidato. A célula de levedura émantida na cultura e a proliferação das células de levedura émonitorada (por exemplo, utilizando densidade óptica). Umcomposto que reduz a proliferação das células de levedura emcombinação com a rapamicina é identificado como um SMER. Taiscompostos são provavelmente úteis para a intensificação daautofagia sozinhos ou em combinação com a rapamicina. Casodesejado, o efeito de SMER na autofagia ensaiada utilizandoqualquer método aqui descrito (por exemplo, aumento emmarcadores de autofagia, aumento na vesícula autofágica,degradação intensificada de uma proteína incorretamentedesdobrada) ou conhecido no estado da técnica.

Compostos e Extratos de Teste

Geralmente, os compostos que são capazes dediminuir a quantidade de proteína incorretamente desdobradaou de aumentar a degradação seletiva de tais proteínas em umacélula são identificados de grandes bibliotecas de extratosde produtos naturais ou sintéticos (ou semi-sintéticos) ou debibliotecas químicas de acordo com métodos conhecidos noestado da técnica. Os elementos versados na técnica dedescoberta e desenvolvimento de drogas irão compreender que afonte precisa dos extratos ou compostos de teste não écrítica ao(s) procedimento(s) de seleção da invenção.

Consequentemente, virtualmente qualquer número de extratos oucompostos químicos pode ser selecionado utilizando os métodosaqui descritos. Os exemplos de tais extratos ou compostosincluem, mas sem ficar a eles limitados, extratos baseados emvegetais, fungos, procarióticos ou animais, caldos defermentação, e compostos sintéticos, bem como a modificaçãode compostos existentes. Numerosos métodos também estãodisponíveis para a geração da síntese aleatória ou dirigida(por exemplo, semi-síntese ou síntese total) de qualquernúmero de compostos químicos, incluindo, mas sem ficar a eleslimitados, compostos baseados em sacarídeos, lipídios,peptídeos, e ácidos nucléicos. As bibliotecas de compostossintéticos são comercialmente disponíveis junto a BrandonAssociates (Merrimack, N.H.) e à Aldrich Chemical (Milwaukee,Wis.). Alternativamente, as bibliotecas de compostos naturaisna forma de extratos bacterianos, fungais, vegetais, eanimais estão comercialmente disponíveis junto a um número defontes, incluindo Biotics (Sussex, UK) , Xenova (Slough, UK) ,Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.), ePharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.). Além disso, asbibliotecas produzidas natural e sinteticamente sãoproduzidas, caso desejado, de acordo com métodos conhecidosno estado da técnica, por exemplo, por métodos de extração efracionamento padrão. Além disso, caso desejado, qualquerbiblioteca ou composto é modificado imediatamente utilizandométodos químicos, físicos, ou bioquímicos padrão.

Além disso, os elementos versados na técnica dadescoberta e do desenvolvimento de drogas compreendemimediatamente que os métodos para a desreplicação (porexemplo, a desreplicação taxonômica, a desreplicaçãobiológica e a desreplicação química, ou qualquer combinaçãodestas) ou a eliminação de replicatas ou de repetições dosmateriais já conhecidos pela sua atividade de correção de umaproteína incorretamente desdobrada devem ser empregadossempre que possível.

Quando é verificado que um extrato corrige aconformação de uma proteína incorretamente desdobrada, umfracionamento adicional do extrato de chumbo positivo énecessário para isolar os constituintes químicos responsáveispelo efeito observado. Desse modo, o objetivo do processo deextração, fracionamento e purificação é a caracterização e aidentificação cuidadosas de uma entidade química dentro doextrato cru que aumenta o rendimento de uma proteínadesdobrada corretamente. Os métodos de fracionamento epurificação de tais extratos heterogêneos são conhecidos noestado da técnica. Caso desejado, os compostos mostrados comoagentes úteis para o tratamento de qualquer patologiarelacionada a uma proteína incorretamente desdobrada ou àagregação de proteínas é modificado quimicamente de acordocom métodos conhecidos no estado da técnica.

Terapias de Combinação

As composições da invenção úteis para o tratamentode uma PCD (por exemplo, retinite pigmentosa, mal deHuntington, mal de Parkinson, mal de Alzheimer, diabetesinsipidus nefrogênico, câncer, e distúrbios relacionados compríons, tais como o mal de Jacob-Creutzfeld) podem, casodesejado, ser administradas em combinação com qualquerterapia padrão conhecida no estado da técnica. Para aretinite pigmentosa, as terapias padrão incluem suplementosda vitamina A. No caso do mal de Parkinson7 as terapiaspadrão incluem a administração de qualquer um ou mais dosseguintes agonistas de receptores de dopaminalevodopa/carbidopa, amantadina, bromocriptina, pergolide,apomorfina, benserazida, lisurida, mesulergina, lisuride,lergotril, memantina, metergolina, piribedil, tiramina,tirosina, fenilalanina, mesilato de bromocriptina, mesilatode pergolide; outras terapias padrão incluem anti-histaminas,antidepressivos, agonistas de dopamina, inibidores de oxidasede monoamina. Para o mal de Huntington, as terapias padrãoincluem a administração de qualquer um ou mais do seguintes:haloperidol, fenotiazina, reserpina, tetrabenazina,amantadina, e co-enzima QlO. Para o mal de Alzheimer, asterapias padrão incluem a administração de qualquer um oumais dos seguintes: donepezil (Aricept)7 rivastigmine(Exelon), galantamine (Razadyne), e tacrine (Cognex). Para odiabetes insipidus nefrogênico, as terapias padrão incluem aadministração de qualquer um ou mais dos seguintes:clorotiazida/hidroclorotiazida, amiloride, e indometacin.Para a fibrose cística, as terapias padrão incluem aadministração de qualquer uma ou mais drogas diluentes demuco (por exemplo, alfa dornase), broncodilatadores (porexemplo, albuterol) , e antibióticos para o tratamento deinfecção. Para o câncer, as terapias padrão incluem aadministração de qualquer um ou mais dos seguintes: acetatode abiraterona, altretamina, anidrovinblastina, auristatina,bexaroteno, bicalutamida, BMS184476, 2 , 3 , 4 , 5 , 6-pentafIuoro-N-(3-fluoro-4-metoxifenil)benzeno sulfonamida, bleomicina, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-proli-l-L-prolina-t-butilamida, caquectina, cemadotina, clorambucil,ciclofosfamida, 3' , 4'-dideidro-4-deóxi-8'-norvin-caleucoblastina, docetaxol, doxetaxel, ciclofosfamida,carboplatina, carmustina (BCNU), cisplatina, criptoficina,citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, daunorubicina,dolastatina, doxorubicina (adriamicina), etoposide, 5-fluorouracil, finasterida, flutamida, hidróxi uréia e hidróxiuréia taxanos, ifosfamida, liarozol, lonidamina, lomustina(CCNU), mecloretamina (mostarda de nitrogênio), melfalan,isetionato de mivobulina, rizoxina, sertenef, estreptozocina,mitomicina, metotrexate, nilutamida, onapristona, paclitaxel,prednimustina, procarbazina, RPR109881, fosfato deestramustina, tamoxifen, tasonermina, taxol, tretinoina,vinblastina, vincristina, sulfato de vindesina e vinflunina.

A invenção apresenta kits para o tratamento ou aprevenção de uma PCD ou de sintomas da mesma. Em umarealização, o kit inclui um pacote farmacêutico quecompreende uma quantidade eficaz de rapamicina ou de umanálogo da mesma. Em outras realizações, o kit inclui arapamicina e 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal. Em uma outrarealização, o kit inclui uma quantidade eficaz de um inibidorde farnesil transferase (por exemplo, FTI-277). Depreferência, as composições estão presentes na forma dedosagem unitária. Em algumas realizações, o kit compreende umrecipiente estéril que contém uma composição terapêutica ouprofilática; tais recipientes podem ser caixas, ampolas,garrafas, frascos, tubos, sacos, bolsas, embalagens debolhas, ou outras formas apropriadas de recipientesconhecidas no estado da técnica. Tais recipientes podem serfeitos de plástico, vidro, papel laminado, folha de metal, oude outros materiais apropriados para a contenção demedicamentos.

Caso desejado, as composições da invenção ou ascombinações das mesmas são fornecidas junto com instruçõespara a sua administração a um indivíduo que tem uma PCD ouestá correndo o risco de desenvolver uma PCD. As instruçõesirão incluir geralmente as informações sobre o uso doscompostos para o tratamento ou a prevenção de uma PCD. Emoutras realizações, as instruções incluem pelo menos um dosseguintes: descrição do composto ou da combinação doscompostos; programação e administração de dosagem para otratamento de uma PCD ou de sintomas da mesma; precauções;avisos; indicações; contra-indicações; informações sobredosagem excessiva; reações adversas; farmacologia animal;estudos clínicos; e/ou referências. As instruções podem serimpressas diretamente no recipiente (quando presentes), oucomo uma etiqueta aplicada ao recipiente, ou como uma folha,um panfleto, um cartão, ou um folheto separado fornecidodentro ou com o recipiente.

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrara invenção, e não para limitar a mesma. Os elementos versadosna técnica irão compreender que as construções específicasfornecidas abaixo podem ser alteradas de numerosas maneiras,consistentes com a invenção acima descrita enquanto mantêm aspropriedades críticas dos compostos ou das combinações dosmesmos.

EXEMPLOS

A retinite pigmentosa (RP) é uma PCD que compreendeum grupo heterogêneo de distúrbios retinais herdados queconduzem à morte do fotorreceptor da haste. A morte dosfotorreceptores resulta na cegueira noturna e na visão detúnel subseqüente devido à perda progressiva da visãoperiférica nos pacientes que sofrem de retinite pigmentosa.Entre 20-25% dos pacientes com Retinite Pigmentosa DominanteAutossomal (ADRP) têm uma mutação no gene de rodopsina, emque a mutação mais comum é P23H. A mutação P23H resulta emuma proteína opsina incorretamente desdobrada que nãoconsegue se associar com 11-cis-retinal. A proteína P23Hincorretamente desdobrada é retida dentro das células, ondeforma agregados (Saliba et al., 2002. JCS 115: 2907-2918;Illing et al. , 2002. JBC 277: 34150-34160). Essecomportamento de agregação classifica algumas mutações de RP,incluindo P23H, como distúrbios conformacionais de proteínas(PCD).

Os defeitos no gene que codifica o regulador decondutância de transmembrana de fibrose cística (CFTR) causaa fibrose cística, que é uma outra PCD. A fibrose cística é adoença genética letal mais comum nos caucasianos, comaproximadamente 30.000 pacientes de fibrose cística nosEstados Unidos. A CFTR forma um canal de Cl" que é umcomponente essencial de sistemas de transporte de Cl"epiteliais em muitos órgãos, incluindo os intestinos, opâncreas, os pulmões, as glândulas sudoríparas, e os rins. Noepitélio intestinal secretor de Cl", o Cl" entra nas célulasatravés de um cotransportador de Na+-K+-2C1" na membranabasolateral e sai através da CFTR na membrana apical; a águasegue osmoticamente. Defeitos no gene que codifica CFTR quereduzem tanto a sua capacidade de transporte de Cl" quanto oseu nível de expressão da superfície da célula causam afibrose cística. Este defeito no transporte de cloreto conduzao afastamento prejudicado de secreções das vias aéreas e umasuscetibilidade à infecção bacteriana. Embora a fibrosecística seja um distúrbio de multisistema, a falharespiratória permanece sendo a causa principal da morte.

Embora os seguintes exemplos sejam dirigidos ao usode proteínas mutantes específicas para a identificação doscompostos que intensificam a degradação de uma proteínaopsina ou de CFTR mutante, a invenção não é limitada dessamaneira. Os compostos identificados como úteis paraintensificar seletivamente a degradação (por exemplo, adegradação autofágica) de opsina incorretamente desdobrada oude CFTR mal desdobrado em uma célula são úteis para otratamento da retinite pigmentosa ou da fibrose cística,respectivamente. Tais compostos irão provavelmenteintensificar a degradação de qualquer proteína incorretamentedesdobrada, e são geralmente úteis para o tratamento devirtualmente qualquer distúrbio conformacional de proteína.Os métodos úteis na realização das seguintes experiências sãodescritos em Noorwez et al. , Journal of Biological Chemistry279:16278-16284 (2004), que é aqui incorporado a título dereferência em sua totalidade.

Exemplo 1: A indução de autofagia resulta na degradação deproteínas incorretamente desdobradas

Utilizando linhagens de células estáveis induzíveispor tetraciclina HEK293 que expressam o P23H ou opsina dotipo selvagem, a macroautofagia foi induzida pelo esgotamentode aminoácido ou pela exposição de rapamicina. A figura IAmostra perfis da degradação de imunotransferência de opsinado tipo selvagem quando a autofagia foi induzida peloesgotamento de aminoácido sozinho (pistas 4-6) ou pelarapamicina (pistas 7-9), ou por uma combinação do esgotamentode aminoácido e da exposição de rapamicina (pistas 10-12) . 0gráfico na figura IB compara as quantidades relativas deopsina do tipo selvagem opsin durante o curso do tempo daexperiência e demonstra que os níveis de opsina do tiposelvagem ficaram essencialmente inalterados durante o cursode doze horas da indução autofágica. Por outro lado, aquantidade de opsina de P23H diminuiu rapidamente quando aautofagia foi induzida nas células por qualquer um dessesmétodos (figura 1C) . Os perfis da degradação de opsina deP23H (figura 1D) mostraram que quando a autofagia foiinduzida pelo esgotamento de aminoácido, trinta e três porcento de opsina incorretamente desdobrada foram degradadosdentro de doze horas (figura ID, quadrados). Quando aautofagia foi induzida pela rapamicina, quarenta e seis porcento da proteína foram degradados dentro de seis horas detratamento (figura ID, triângulos) . A degradação foiintensificada ainda mais quando o esgotamento de aminoácidofoi combinado com o tratamento com rapamicina (figura ID,círculos), onde quase cinqüenta e dois por cento de opsinaincorretamente desdobrada foi degradado dentro de duas horase oitenta e um por cento foram degradados após doze horas.

Exemplo 2: A autofagia degrada especificamente proteínasincorretamente desdobradas

Para determinar se este efeito foi modulado pelainibição proteassomal ou se foi mediado pela autofagiaapenas, a degradação de P23H foi examinada nas células onde aautofagia foi induzida na presença de um inibidorproteassomal ou um inibidor autofágico. A 3-metiladenina, uminibidor de autofagia, e MG132, um inibidor proteassomal,foram adicionados ao meio de cultura de célula por ocasião daindução da autofagia. A figura IF mostra que 3-MA inibiu adegradação de P23H nas células esgotadas com aminoácido. Afigura IG mostra que o inibidor proteasomal MG132 não tevenenhum efeito na degradação da opsina de P23H (figura 1D).

Esses estudos indicam que a autofagia degradaespecificamente a opsina de P23H incorretamente desdobrada.

Exemplo 3: A rapamicina intensifica a autofagia de proteínasincorretamente desdobradas

Os estudos precedentes mostraram que o 11-eis-retinal funciona como um acompanhante farmacológico que ajudano desdobramento e na estabilização de opsinaAl P23H. Aadministração de 11-cis-retinal permite que a maioria doaglomerado de proteína P23H alcancem a superfície^l dacélula, onde se associa com 11-cis-retinal para formarrodopsina. Quando 11-cis-retinal foi administrado no momentoque a autofagia foi induzida, os níveis de degradação de P23Hnão foram alterados (figura IE, pistas 4-6) . Não obstante, éprovável que a administração de 11-cis-retinal em combinaçãocom a rapamicina para o tratamento de uma PCD ocular teráintensificado a eficácia clínica porque o 11-cis-retinal iráaumentar os níveis da proteína corretamente desdobrada e arapamicina irá intensificar a degradação de todo o restantede proteína incorretamente desdobrada.

Os níveis de rodopsina eram similares no meiosuplementado com ou sem aminoácidos (figura 1E, pistas 1-3,pistas 4-6) . 0 perfil da degradação da proteína P23H nascélulas tratadas com 11-cis-retinal durante o esgotamento deaminoácido foi comparado ao perfil de degradação das célulasque expressam opsina do tipo selvagem ou das células queexpressa, opsina de P23H que não receberam 11-cis-retinal. Napresença de 11-cis-retinal, a degradação da proteína P23Hexibiu um perfil intermediário de degradação em comparação àscélulas que expressam opsina do tipo selvagem ou queexpressam a proteína P23H na ausência de 11-cis-retinal.

É interessante observar que o tratamento com arapamicina sozinha induz uma degradação rápida de rodopsinade P23H independente do fato se foi administrada sozinha ouem combinação com a carência de aminoácido das células(figura IE, pistas 7-9, 10-12). Os perfis de degradação deP23H na presença da 11-cis-retinal eram similares nas célulascultivadas sob condições normais (figura 1F, losangos) ou nomeio esgotado com aminoácido (figura SE, quadrados). Adegradação intensificada foi observada quando a rapamicinafoi administrada na ausência de 11-cis-retinal (figura SE,triângulos). Perto de trinta e três por cento da proteínaP23H foram degradados dentro de doze horas. Quando arapamicina foi administrado às células com carência deaminoácido, nenhum aumento adicional na degradação derodopsina foi observado. Realmente, a administração derapamicina às células esgotadas cora aminoácido era similar aoefeito do tratamento da rapamicina sozinha. Quase trinta e umpor cento da proteína P23H foram degradados dentro de dozehoras (figura SE, círculos). Desse modo, a autofagia induzidapela rapamicina aumentou seletivamente a degradação daproteína P23H na presença de 11-cis-retinal.

Exemplo 4: A indução de autofagia induz mudançascaracterísticas na fosforilação de mTOR

mTOR é o alvo mamífero da rapamicina, e os níveisdo mTOR são reduzidos caracteristicamente em célulasautofágicas. Para confirmar que a autofagia foi induzidaatravés do uso dos métodos descritos acima, a fosforilação demTOR foi caracterizada em células esgotadas com aminoácido eem células que receberam rapamicina. Conforme esperado, umadiminuição na quantidade de mTOR fosforilado foi observadadepois da indução da autofagia nas células esgotadas comaminoácido e naquelas tratadas com rapamicina. A induçãoautofágica foi caracterizada nas células que expressam opsinado tipo selvagem ou opsina de P23H, bem como nas célula nasquais também foi administrado 11-cis-retinal. Esse aumento nafosforilação foi específico para mTor, uma vez que os níveiscelulares de Bip e de calnexina, os acompanhantes reguladospara cima pela resposta de proteína não desdobrada (UPR), eHsp70, um acompanhante citoplásmico regulado para cima pelaresposta de choque de calor (HSR), ficaram inalterados sobcondições autofágicas. As quantidades desses acompanhantespermaneceram constantes com o passar do tempo (figuras IH,II) seguindo a autofagia induzida pela carência de aminoácidoou pelo tratamento com rapamicina.

Para determinar se a autofagia fornece um mecanismogeral para a degradação das proteínas incorretamentedesdobradas, a degradação autofágica de uma proteína deregulador de condutância de transmembrana de fibrose císticamutante (CFTR) foi caracterizada. A CFTR é ura canal decloreto ativado por cAMP expresso na membrana apical decélulas epiteliais. Tal como a opsina de P23H, a CFTR é umaproteína de membrana politópica. Tais proteínas politópicastêm muitos segmentos de transmembrana alfa helicoidais. Asmutações em CFTR afetam a sua capacidade de ser produzida,processada e conduzida para a membrana do plasma, onde a suafunção é requerida.

Proteínas CTFR do tipo selvagem (figura 2A) e CFTRAF508 mutantes (figura 2C) foram expressas em linhagens decélulas estáveis BHK. A autofagia foi induzida nas célulasque expressam as proteínas do tipo selvagem ou CFTR mutantespelo esgotamento de aminoácido, pelo tratamento comrapamicina, ou por uma combinação do tratamento comrapamicina e do esgotamento de aminoácido (figura 2A). Emboraa indução autofágica não tenha afetado os níveis da proteínaCFTR do tipo selvagem (figura 2B) , a proteína AF508 (figura2D) passou por uma degradação rápida em resposta à induçãoautofágica pelo esgotamento de aminoácido, pelo tratamentocom rapamicina, ou por ambos (figura 2C) . Os perfis dedegradação indicaram que a carência de aminoácido degradouaproximadamente trinta e quatro por cento da proteína AF5 08dentro de doze horas (figura 2D, triângulos), ao passo que otratamento com rapamicina fez com que cinqüenta por cento daproteína fossem degradados após doze horas (figura 2D,quadrados). A degradação foi maior quando a carência deaminoácido foi combinada com o tratamento de rapamicina.Quase setenta e cinco por cento de proteína mutante foramdegradados dentro de seis horas e oitenta por cento foramdegradados após doze horas de tratamento (figura 2D,círculos). Essas observações indicam que a autofagia degradaseletivamente a proteína incorretamente desdobrada AF508. Afosforilação de MTor foi reduzida depois da induçãoautofágica nas células que expressam a proteína do tiposelvagem ou CFTR mutante. Nenhuma diferença nos níveis dosacompanhantes, Bip, calnexin e hsp7 0 foi observada. Asfiguras 2E e 2F são imunotransferências que mostram adesfosforilação de mTor (figura 2E) e a expressão de proteínacalnexin, calreticulin, Hsp70, ou Bip nas células cultivadasem meios normais ou em meios esgotados com aminoácido napresença ou na ausência de rapamicina.

Exemplo 5: Os marcadores autofágicos ficam colocalizados comas proteínas incorretamente desdobradas depois da indução daautofagia

A indução de autofagia pode ser monitorada pelaidentificação da presença de vacúolos autofágicos (AVs) nascélulas utilizando microscopia eletrônica. As células de P23Hem meios normais contêm alguns AVs, mas o número de taisvacúolos é aumentado significativamente quando as células sãoincubadas em meios esgotados com aminoácido (figura 5).

Para determinar se as proteínas incorretamentedesdobradas ficam colocalizadas com os marcadoresautofagosomos, células que expressam opsina do tipo selvagem(figura 3A) ou P23H mutante (figura 3B) foram tingidas paraos marcadores autofágicos Atg7, LC3 e Lampl. As células foramincubadas com anticorpos específicos de marcadoresautofagosomos depois da indução da autofagia. A proteína dotipo selvagem não pode ser colocalizada com nenhum marcadorautofagosomo (figura 3A) . A proteína opsina do tipo selvagemestava presente na membrana da célula, ao passo que P23Hformou agregados intracelulares. Os mesmos marcadoresautofágicos foram examinados nas células BHK que expressamproteína do tipo selvagem (figura 4A) ou AF508 CFTR mutante(figura 413). Nessas células, a proteína AF508 CFTR nãoformou agregados visíveis. A proteína CFTR do tipo selvagemfoi observada na membrana da célula, bem comintracelularmente (figura 4A) , ao passo que a AF508 foiretida em ER (figura 4B) . As figuras 5A-5C são micrografiaseletrônicas que mostram agregados de P23H, lisossomos ecélula autofágicas.

O tingimento por imunoflorescência com Atg 7revelou um tingimento pontilhado que ficou colocalizado comambas as proteínas mutantes. A colocalização de Atg 7 comP23H é mostrada na figura 3B e a colocalização com AF508 émostrada na figura 4B. 0 tingimento com Atg8 também foicolocalizado com ambas as proteínas mutantes. Atg8 revelou umtingimento pontilhado distinto que foi colocalizado comagregados de proteína incorretamente desdobrada de P23H(figura 3B) . 0 tingimento com Atg8 também foi colocalizadocom a proteína AF508 que foi retida em ER (figura 4B) . Essasobservações também suportam um papel para a autofagia nadegradação de proteínas politópicas mutantes, tais como P32He AF508.

Resumidamente, a passagem autofágica degradouespecificamente proteínas politópicas incorretamentedesdobradas, tais como P23H e AF508, enquanto teve um efeitomuito pequeno nas proteínas do tipo selvagem. Esse resultadoera independente da linhagem de célula utilizada paraexpressar as proteínas mutantes, uma vez que as proteínas dotipo selvagem e opsina mutantes foram expressas em umalinhagem de células dos rins embriônicas humanas ao passo queas proteínas do tipo selvagem e CFTR mutantes foram expressasem linhagens de células dos rins de hamsters bebês.

Os autofagosomos foram visualizados utilizandomicroscopia eletrônica. Os números aumentados dos vacúolosautofágicos de membranas duplas foram observados nas célulasque expressaram opsina de P23H. Depois da indução autofágica,essas células continham agregados grandes ou agregadosdesintegrados pequenos de opsina de P23H. Lisossomas tingidoscom fosfatase de ácido escura também foram observados emassociação com os AVs e os agregados. Sem desejar ficar presoa uma teoria particular, isto poderia indicar um papel para apassagem lisosomal na degradação de opsina incorretamentedesdobrada.

Os marcadores autofagosomos foram colocalizados comproteínas opsina de P23H e AF508 incorretamente desdobradas.0 Atg7 é um gene autofágico chave que codifica uma proteínaque se assemelha à enzima ativadora de ubiquitin El requeridapara a formação de AVs. 0 Atg7 promove a conjugação de Atg8,uma cadeia leve de proteína associada a microtúbulo 3, aoslipídios que formam as membranas seqüestradoras de AVs eintensifica a sua formação. 0 Atg8 existe nas membranas dosprimeiros e últimos autofagosomos. 0 tingimento pontilhadodistinto de Atg7 e Atg8 que são colocalizados com asproteínas P23H e AF508 sugere um papel para os AVs nadegradação de proteínas incorretamente desdobradas.Exemplo 6: 0 tratamento com rapamicina intensifica a funçãoretinal na retinite pigmentosa

Camundongos transgênicos que expressam opsina decamundongo mutante que têm uma mutação de P23H passam por umadegeneração progressiva rápido do fotorreceptor que seassemelha às mudanças patofisiológicas observadas empacientes com retinite pigmentosa. Os estudos in vivo comcamundongos mutantes heterozigóticos P23H revelaram que otratamento com rapamicina resgatou a função retinal por umcurso de três meses (figura 6).

Exemplo 7: A rapamicina intensifica a função retinal nadegeneração macular

Os fluoróforos bis-retinóides que se acumulam emcélulas epiteliais do pigmento retinal (RPE) comoconstituintes de lipofuscina são considerados como osresponsáveis pela perda de células RPE no mal de Stargardtrecessivo, uma forma primordial do início de degeneraçãomacular, e também podem estar envolvidos na etiologia dadegeneração macular relacionada com a idade. Os estudos invivo em um modelo de camundongo de degeneração macularmostram que o tratamento com rapamicina resgata a funçãoretinal nos camundongos heterozigóticos mutantes Abcr que têmuma cópia defeituosa do gene de ABCR, que é associado com omal de Stargardt (figura 7) . 0 gene de ABCR codifica aproteína de borda (RmP) , um transportador de cassete deligação de ATP expresso nas bordas de discos de segmentoexterno do fotorreceptor.

Exemplo 8: FTI277 induz a degradação rápida de rodopsina deP23H

O tratamento com o inibidor de proteína farnesiltransferase, FTI277, {N-[2-fenil-4-N[2(R)-amino-3-mercaptopropilamino]benzoil] }metionato de metila (Calbiochem)induz a degradação rápida de rodopsina de P23H exatamente talcomo com a rapamicina (figura 8) . É provável que FTI277O intensifique a autofagia exatamente tal como a rapamicina, eque FTI277 seja útil para o tratamento de doenças deconformação de proteínas.

Exemplo 9: FTI-277 estimula a degradação de opsina de P23H.

Para estudar o efeito de FTI-277 nos níveis deopsina mutante, células HEK2 93 que expressam opsina de P23Hforam incubadas com concentrações diferentes (1, 5, 10 e 50pM) de FTI-277. Uma degradação de opsin P23H dependente dotempo a 50 pM foi observada. Nenhum efeito de FTI-277 foidetectado a 10 pM (figura 9A). Quando comparado à rapamicina,70% de opsina de P23H foram perdidos após doze horas detratamento com rapamicina, ao passo que FTI-277 resultou emuma perda de 50% de opsina de P23H durante esse período detempo (figura 9B).Exemplo 10: FTI-277 não induz UPR/HSR.

Depois do tratamento com FTI-277, diferenças nosníveis do calnexin e de calreticulin, acompanhantes deendoplasmireticulum envolvidos com a resposta de proteína nãodesdobrada (UPR) , ou os níveis de Hsp70 e Hsp90,acompanhantes citoplásmicos associados com a resposta dechoque de calor (HSR) foram analisados. O FTI-277 não afetouos níveis de qualquer uma das duas respostas, sugerindo que adegradação induzida por FTI-277 de opsina de P23H é exclusivade UPR e de HSR (figura 10).

Exemplo 11: 0 tratamento com FTI-277 bloqueia a sinalizaçãode mT0R/S6K.

O FTI-277 inibiu eficazmente a fosforilação de mTore S6 quinase tal como predito se esta droga estivessesuprimindo a atividade de Rheb (figuras IlA7 B) . mTorfosforilado e S6 quinase foram observados nas célulasalimentadas com aminoácido e soro. Tal como com o tratamentocom rapamicina, o FTI-277 induz a desfosforilação de mTOR, oque foi intensificado ainda mais em combinação com a carênciade aminoácido e soro (figura 11A) . Similarmente, afosforilação de S6 quinase foi reduzida drasticamente nascélulas tratadas com FTI-277 ou rapamicina (figura 11B). Poroutro lado, a estimulação da fosforilação de Akt nas célulasHEK293 não foi afetada pelo tratamento de FTI-277, sugerindoque a atividade de Ras não foi afetada, embora um ligeiroaumento na fosforilação de MAPK fosse observado similar aBasso et al. , J. Biol. Chem. 280, 31101-31108, 2005 (Figura11C).

Exemplo 12: Colocalização de opsina de P23H com Atg7 e Atg8com o tratamento com FTI-277.

Uma vez que a degradação induzida por rapamicina deopsina de P23H foi mediada por autofagia, é provável que adegradação de FTI-277 também prossiga através da autofagia. Arelação de agregados de opsina de P23H com marcadoresautofagosomos conhecidos, Atg7 e Atg8, foi analisada atravésde microscopia de imunofluorescência. Esses marcadores nãoficam normalmente localizados com a opsina de P23H nascélulas não-tratadas cultivadas em um meio completo (figuras12A e 12B). Um aumento drástico na colocalização de ambos osmarcadores com a opsina de P23H com o tratamento com FTI-277foi observado (figura 12A e figura 12B) . A posição de Atg7 ede Atg8 com respeito aos agregados de opsina de P23H foimelhor observada por meio de microscopia confocal (figura12C). Os pontos de Atg7 aparecem aglomerados com os agregadosde opsina de P23H, ficando colocalizados com a opsina deP23H.

Similarmente, há uma colocalização intensificada dealguns pontos de Atg8 com agregados de opsina de P23H,enquanto que o restante dos pontos ficou situado em torno doagregado. A presença de proteínas Atg7 e Atg8 dentro e emtorno dos agregados suporta um papel de autofagia nadegradação da opsina de P23H.

Exemplo 13: A indução de autofagia por FTI-277.

Estes resultados indicam que o FTI-277 ativa aautofagia. Portanto, a resposta autofágica a FTI-277 foianalisada utilizando um instrumento lysotracker paravisualizar o número e o tamanho dos vacúolos lisossomais nacélula. Um aumento nos números e no tamanho de lisossomaisfoi observado quando as células foram tratadas com rapamicinaou FTI-277 (figura 13A). Em seguida, a microscopia eletrônicafoi utilizada para avaliar as respostas autofágicas emcélulas HEK293 tratadas com FTI-277 que expressam opsina deP23H. Conforme observado pelo instrumento lysostraker, ascélulas tratadas com FTI-277 continham muitos vacúolosautofágicos grandes contendo fosfatase de ácido lisossomal(figura 13B) . Além disso, alguns desses vacúolos pareciamestar no processo de engolfamento de agregados citoplásmicosgrandes (figura 13B) . Com a quantificação morfométrica, umaumento de quatro a seis vezes no volume fracionário de AVsnas células tratadas com FTI-277 foi encontrado comparado àscélulas não-tratadas (figura 13C). Estes dados sugerem que oFTI-277 promoveu a resposta autofágica nas células HEK293.

Os efeitos de FTI-277 nas células de hepatoma HuH7que expressam estavelmente GFP-LC3, um marcador de autofagia,também foram investigados. Em células de alimentação, o GFP-LC3 foi encontrado predominantemente de modo difuso por todoo citoplasmá. Quando essas células foram tratadas com FTI-277, o GFP-LC3 foi localizado nas numerosas estruturasconsistentes com a sua associação com vacúolos autofágicos eo inicio da autofagia (figura 14) . Estes estudos demonstramque a autofagia é regulada para cima drasticamente nascélulas tratadas com FTI-277.

A indução de autofagia em células HEK2 93 queexpressam opsina de P23H foi examinada utilizando um inibidorde Pi3 quinase, a 3-metiladenina (3 MA), que bloqueia aautofagia. 0 tratamento com 3 MA na presença de FTI-277impediu a degradação da opsina. Este efeito não foi observadoquando as células foram tratadas com FTI-2 77 apenas (figura15A) . Para confirmar ainda mais que a degradação da opsina deP23H era autofágica, foi utilizado o inibidor proteassomal,MGl32. A degradação da opsina de P23H teve uma cinéticasimilar na presença de FTI-277 e de MGl32 da mesma forma quecom FTI-277 sozinho, sugerindo que o papel da degradaçãoproteassomal nessa passagem era limitado (figura 15B).

Os inibidores de farnesil transferase (FTIs) foramprojetados originalmente para bloquear a ação deoncoproteinas Ras. A atividade de Ras depende dafarnesilação, uma modificação pós-translacional que liga umaâncora de membrana de farnesil isoprenóide à proteína. Asfarnesil transferases catalisam a transferência de um lipídiode isoprenil de 15 carbonos do difosfato de farnesila para umresíduo de cisteína de vários substratos de proteína. Asfarnesil transferases reconhecem a caixa CAAX de terminalcarboxila do substrato.

Rheb é uma proteína de ligação de nucleotídeo deguanina e uma GTPase. As proteínas Rheb contêm caixas G1-G5que são estiramentos curtos das seqüências envolvidas noreconhecimento e na hidrólise de GTP (Bourne et al. , (1990)Nature 348, 125-132). Além disso, as proteínas Rheb terminamcom um motivo de CAAX (CSVM) que é requerido para afarnesilação. Nas células de mamíferos, a capacidade de Rhebde ativar S6K foram estabelecidas. Essa função é dependenteda farnesilação, uma vez que os mutantes de Rheb que nãopossuem o motivo de CAAX não podem ativar S6K (Castro et al. ,J Biol. Chem. 278, 32493-32496, 2003; Tee et al., Curr. Biol.13, 1259-1268, 2003). Além disso, ficou bem estabelecido queos FTIs, tal como FTI-277, bloqueiam completamente aprenilação de Rheb (Basso et al., J. Biol. Chein. 280, 31101-31108, 2005). A Rheb não passa por geranilgeranilação. Háoutros alvos de FTIs além de Rheb. Os estudos mostram que asproteínas tais como K-Ras413 exibem uma resistência a FTIsporque elas passam pela geranilação quando a farnesilação éinibida [(22, 23) . Estes estudos sugerem que a Rheb é um alvomais específico de FTIs do que outras proteínas que passampela farnesilação. Além disso, a fosforilação de Akt não éafetado por FTI-277, sugerindo que a dose de FTI-277 nãoafeta a atividade de Ras. A Rheb é um componente da passagemde sinalização de insulina/T0R/S6K (Castro et al. , J. Biol.Chem. 278, 39921-39930, 2003; Tabancay et al., J. Biol. Chem.278, 39921-39930, 2003; Tee et al., Curr. Biol. 13, 1259-126824, 2003; Inoki et al. , Genes Dev. 17, 1829-1834, 2003;Garami et al., Mol. Cell 11, 1457-1466, 2003). Tal como aquirelatado, a desfosforilação de mTOR e S6K com FTI-277,consistente com a inibição de Rheb, foi observada. Umadiminuição similar na fosforilação de mTOR e S6K é observadaquando a autofagia é induzida nas célula pelo uso darapamicina. Além da inibição de mTOR, estes resultadosindicam que a autofagia pode ser induzida nas células pelotratamento com FTI-277, que bloqueia Rheb mais a montante demTOR (figura 16).

O tratamento de células que expressam opsina deP23H com FTI-277 a 50 fiM induziu a degradação de opsinamutante tal como no tratamento com rapamicina. Os estudos deimunofluorescência utilizando anticorpos para os marcadoresautofagosomos Atg7 e Atg8 confirmaram a indução de autofagianessas células. O Atg7 é um gene autofágico chave quecodifica uma proteína que se assemelha à enzima ativadora deubiquitina Elrequerida para a formação de AVs (Tanida et al.,(2001) J. Biol. Client. 276, 1701-1706. O Atg7 promove aconjugação de Atg8, uma cadeia leve de proteína associada commicrotúbulos, aos lipídios que formam as membranasseqüestradoras de AVs (Ohsumi et al. , Nat. Rev. Mol. CellBiol. 2, 211-216, 2001; Kabeya et al. , J. Cell Sei. 117,2805-2812, 2004). Ambos os marcadores ficam colocalizados coma opsina de P23H. Além disso, os estudos de ultra-estruturarealizados utilizando microscopia eletrônica revelaram aexpressão aumentada de AVs nas células quando tratadas comFTI-277. Em algumas micrografias, os AVs que engolfam osagregados citoplásmicos também foram observados. Além disso,a análise morfométrica revelou um aumento de seis vezes novolume fracionário de AVs nas células tratadas com FTI-277,estabelecendo desse modo firmemente a indução de autofagianessas células.

Resumidamente, esses dados sugerem que a passagemautofágica pode ser estimulada não somente através dobloqueio de mTOR com rapamicina, mas também ao modular a oscomponentes a montante de mTOR utilizando inibidores defarnesil transferase de moléculas pequenas, tal como FTI-277.Tal como outros FTIs, o FTI-277 reduz a farnesilação de Rheb,inativando desse modo essa G-proteína. Esses estudos abrem apossibilidade de utilizar FTIs para o tratamento de váriosdistúrbios conformacionais de proteínas (PCDs), uma vez que aautofagia é envolvida na degradação das proteínas agregadasmutantes implicadas em várias doenças neurodegenerativasincluindo o mal de Parkinson (Cuervo et al. , Science 305,1292-1295, 2004), o mal de Huntington (Ravikumar et al. Nat.Genet. 36, 585-595, 2004). A estimulação da autofagia no malde Huntington (Ravikumar et al. Nat. Genet. 36, 585-595,2004), ambos na cultura de células e no modelo de camundongo,e na Retinite Pigmentosa Dominante Autossomal (ADRP), conduzà perda de agregados acumulados. Além disso, o uso atual deFTIs em experimentações clínicas (fases II e III) para ocâncer também assegura a falta de toxicidade desse compostoem ambos os seres humanos e animais testados. As drogas deFTI podem fornecer uma alternativa terapêutica à rapamicina,especialmente na intensificação da remoção de agregados deproteína pela autofagia.

As experiências descritas acima foram realizadasutilizando os seguintes materiais e métodos.

Culturas de células de mamíferos

Opsina do tipo selvagem e P23H foram expressas emlinhagens de células estáveis induzíveis por tetraciclinaHEK293. As células foram cultivadas em meio Eagle modificadopela Dulbecco que contém um elevado teor de glicose(Invitrogen, San Diego, CA) suplementado com soro fetal debovino 10% inativado por calor (Sigma) com uma solução deantibiótico-antimicótico (Invitrogen, San Diego, CA),blasticidin (Cayla, Toulouse, France), zeocin (Invitrogen,San Diego, CA) a 37°C na presença de 5,0% de CO2. A síntesede opsina nas células foi induzida pela adição detetraciclina (1 pg/ml). Linhagens de células dos rins dehamsters bebês (BHK) expressando estavelmente o tipo selvageme a variante AF508 CFTR com um epítopo HA de C-terminal(CTR-HA) (consultar Sharma et al. , J. Cell Biol. 2004164 (6) : 923-33) . As células foram cultivadas a uma relação deDMEM/Fl2 (Invitrogen, San Diego, CA) de 1:1 com 10% de FBS a370C na presença de 5,0% de CO2.

As células de hepatoma HuH7 foram transfectadasestavelmente com pGFP-LC3 (Ogawa et al. , Science 307(5710):727 - 731, 2005) utilizando um kit de otimização de lipídio,o lipídio Perfect (pFx-3), adquirido junto à Invitrogen (SanDiego, Califórnia). Pfx-3 (Invitrogen) de acordo com osprotocolos do fabricante. As colônias que cresceram napresença de 0,5 mg/ml de G418 foram então isoladas,amplificadas, e selecionadas quanto à expressão de GFP-LC3através de microscopia de fluorescência e transferênciaWestern.

Indução de autofagia

A autofagia foi induzida nas células através da suaincubação em um meio esgotado com aminoácido ou de tratamentocom rapamicina (50 mM) , ou ambos. As células foram incubadassob condições indutoras de autofagia por duas, seis, ou dozehoras. No ponto indicado do tempo, as célula foram lisadas em1% de n-dodecil-p-maltoside (DM) (Anatrace, Maumee, OH) napresença de inibidores de protease (tabletes de mistura deinibidor de protease completa (Roche Molecular Biochemicals,Mannhe im, Alemanha) por uma hora a 4 °C. As células foramcentrifugadas a 36.000 rpm em uma ultracentrífuga Beckman portrinta minutos a 4°C. 0 material lisado foi coletado e aimunotransferência foi executada.Eletroforese com Gel de SDS e Imunotransferência

Os lisados de células foram submetidos àeletroforese em géis de poliacrilamida com 10% de SDS etransferidos para membranas de nitrocelulose Immobilon-NC(Millipore, Billerica, MA) . As membranas foram incubadas àtemperatura ambiente por uma hora com um tampão de bloqueiocomercialmente disponível (Li-Cor', Lincoln, Nebraska)diluídas 1:1 em PBST (PBS com 0,1 % de Triton X-IOO, pH 7,4),seguida por uma incubação de uma hora com o anticorpoprimário indicado. Os borrões foram lavados três vezes porcinco minutos cada um em PBST, e incubados por uma hora comuma tintura quase infravermelha verdadeira, anticorposecundário conjugado com IRDye8 0 0 (Rockland ImmunochemicalsInc., Gilbertsville, PA). Finalmente, as membranas foramlavadas novamente três vezes com PBST e submetidas àvarredura em um scanner infravermelho Odyssey (Li-Cor,Lincoln, Nebraska) . As quantificações em imunoborrões foramexecutadas utilizando o software Licor. Os anticorposprimários incluíram anticorpos para a opsina, HA-tag (CovancePrinceton, NJ) , mTOR, mTOR fosforilado (UpstateCharlottesville, VA) , calnexin, hsp70 (Stressgen, Victoria,BC, CA) , Bip (BD PharMingen, San Diego, CA) para tubulina(Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), 1D4 (University ofBritish Columbia), Akt, fosfo-Akt, S6K, fosfo-S6K, MAPK efosfor-MAPK (Cell Signaling Technology, Beverly, MA).

Imunofluorescência

As células foram cultivadas em lâminas de vidro efixadas em paraformaldeído a 4%. Depois do resfriamentobrusco com 50 mm de NH4Cl, as células foram lavadas com PBS eincubadas por uma hora com o anticorpo primário indicado àtemperatura ambiente. As células foram lavadas cinco vezes emPBS e incubadas com um anticorpo secundário (TRITC- e FITC-conjugado) por uma hora. As células foram lavadas outra vez emontadas com Vectashield contendo DAPI. Os anticorposprimários incluíram anticorpos para LC3, Lamp-1, Atg7 (Dr.Dunn), opsina, Atg720; Atg8 e HA-tag. As células foram entãoobservadas utilizando um microscópio Zeiss Axiophot.

O tingimento com instrumento lysotracker (sondasmoleculares) também foi executado em células vivas a 37°C. Aformação de imagem confocal foi executada utilizando umMicroscópio Confocal Espectral TCS SP2 AOBS a uma ampliaçãode 63 vezes.

Modelos de Camundongos

Camundongos abcr +/- são descritos por Mata et al.,Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2001;42:1685-1690.

Os camundongos que expressam a proteína opsina deP23H são descritos por Liu et al. , Journal of Cell Science110, 2589-2597 (1997).Tratamento com rapamicina in vivo

Camundongos abcr +/- foram tratados com 20 mg/kg derapamicina uma vez por semana começando quando os camundongostinham quatro meses de idade. A rapamicina foi administradapor meio de injeção intraperitoneal.

Os camundongos transgênicos P23H heterozigóticosforam tratados uma vez por semana com a rapamicina começandoquando os camundongos tinham vinte e um dias de idade.

Eletroretinografia

Os camundongos são adaptados ao escuro vinte equatro horas antes da ERG. Uma mistura de cetamina e xilazinafoi utilizada para anestesiar os camundongos. A dosagem foideterminada pelo peso. Os olhos dos camundongos foramentorpecidos com gotas de proparacaína e dilatados com Ak-dilate. 0 camundongo foi colocado então na máquina (UTAS-E2000), um eletrodo de aterramento foi inserido no membro dapata, um outro eletrodo foi inserido no pescoço, e um par deeletrodos foi utilizado para gravar a ERG de cada olho.Depois de obter uma leitura de linha base, a ERG foi medida a20, 10 e 0 dB. Mensalmente, as ERGs foram medidas e foideterminada a amplitude de ondas B.

Tratamento com FTI-277

FTI-277 (Calbiochem) foi utilizado a 50 pM. Depoisda lavagem com tetraciclina, as células foram tratadas por 0,2, 6 e 12 horas e a seguir lisadas em tampão de fosfatocontendo 1% de n-dodecil-(3-maltoside (DM) (Anatrace) napresença de inibidores de protease (tabletes de mistura deinibidor de protease completa; Roche Molecular Biochemicals)por uma hora a 4 °C. Como um controle positivo para aautofagia, as células foram tratadas com rapamicina (50 nM) ,seguindo a lavagem com tetraciclina. Os lisatos foramcentrifugados a 36.000 rpm em uma ultracentrifuga Beckman pordez minutos a 4 °C. 0 sobrenadante foi coletado e aimunotransferência foi executada. 3-metiladenina (3MA), quebloqueia a autofagia (10 mM) (Sigma Chemical (St. Louis,Missouri)) e MG132 (25 pM) (Sigma Chemical (St. Louis,Missouri)) também foram utilizados.

Microscopia Eletrônica

Células expressando opsina de P23H foram cultivadasem folhas de ACLAR em uma placa de 24 cavidades. A produçãode opsina foi induzida pela adição de tetraciclina por 4 8horas e as células foram tratadas com FTI-277 por seis horasapós a remoção da tetraciclina. Depois de uma lavagem comPBS, as células foram fixadas com paraformaldeído a 2%,glutaraldeido a 2% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH7,4, por trinta minutos a 4°C, e processadas para acitoquímica CMPase tal como descrito anteriormente (31) . Aquantificação morfométrica dos AVs foi feita em 20micrografias eletrônicas por condição utilizando o softwareImage J. A análise do T-teste foi executada e o valor de P(significância de duas caudas) inferior ou igual a 0,05 foiconsiderado como significativo (marcado com asterisco).Outras Realizações

A partir da descrição antecedente, ficará aparenteque variações e modificações podem ser feitas na invençãoaqui descrita para a sua adoção para vários usos e condições.Tais realizações também estão dentro do âmbito das seguintesreivindicações.

A recitação de uma lista de elementos em qualquerdefinição de uma variável inclui aqui as definições dessavariável como qualquer elemento individual ou combinação (ousubcombinação) de elementos listados. A recitação de umarealização inclui aqui essa realização como qualquerrealização individual ou em combinação com quaisquer outrasrealizações ou partes das mesmas.

Todas as patentes e publicações mencionadas nesterelatório descritivo são aqui incorporadas a título dereferência até a mesma extensão que cada patente e publicaçãoindependentes fosse indicada específica e individualmentepara serem incorporadas a título de referência.

Referência

1. s. M. Noorwez et al., Journal of Biological Chemistry279:16278-16284 (2004)

Claims (9)

1. USO DE UM COMPOSTO caracterizado por ser nafabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevençãode um distúrbio de conformação de proteína (pcd) selecionadodo grupo que consiste de deficiência al-alantitripsina,fibrose cística, mal de Huntington, mal de Parkinson, mal deAlzheimer, diabetes insipidus nefrogênico, câncer, e mal deJacob-Creutzfeld, retinite pigmentosa, degeneração macularrelacionada com a idade seca ou úmida, glaucoma, distrofiascorneais, retinosquise, mal de Stargardt, gânglio dominanteautossomal, e distrofia macular de Best, em um indivíduo, emque o dito tratamento compreende uma quantidade efetiva de umcomposto selecionado do grupo entre rapamicina,FTI-277, umcomposto inibe o alvo mamífero da rapamicina (mTOR), umcomposto inibe o homólogo de Ras enriquecido no cérebro(Rheb), um inibidor de farnesil transferase, em que ocomposto que intensifica a degradação autofágica da proteína,ao indivíduo.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o tratamento compreendeadicionalmente a administração de 11-cis-retinal, 9-cis-retinal, ou de um isômero travado de sete anéis de 11-cis-retinal, ao indivíduo.

3. USO DE UM COMPOSTO caracterizado por ser nafabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevençãoda retinite pigmentosa ou da degeneração macular em umindivíduo, sendo que o tratamento compreende:a) a administração ao indivíduo de um composto queintensifica a degradação autofágica de proteína; eb) a administração de 11-cis-retinal ou 9-cis-retinal, em que o 11-cis-retinal ou o 9-cisretinal e ocomposto são administrados simultaneamente ou dentro dequatorze dias de intervalo entre eles em quantidadessuficientes para tratar ou prevenir a retinite pigmentosa oua degeneração macular no indivíduo.

4. USO DE UM COMPOSTO caracterizado por ser nafabricação de um medicamento para a intensificação dadegradação de uma proteína incorretamente desdobradaselecionada do grupo que consiste em opsina, miocilina,lipofuscina, proteína (5-H3, ou uma proteína mutante que formaum agragado ou uma fibrila, em uma célula ocular ouepitelial, em que o dito tratamento consiste em colocar umacélula em contato com uma quantidade eficaz de um compostoselecionado do grupo entre rapamicina,FTI-277, um compostoinibe o alvo mamífero da rapamicina (mTOR), um composto inibeo homólogo de Ras enriquecido no cérebro (Rheb), um inibidorde farnesil transferase, que intensifica a autofagia.

5. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender uma quantidade eficaz de um compostoselecionado do grupo que consiste em rapamicina,FTI-2 77, umcomposto inibe o alvo mamífero da rapamicina (mTOR), umcomposto inibe o homólogo de Ras enriquecido no cérebro(Rheb), um inibidor de farnesil transferase, em um excipientefarmacêutico, para o tratamento de uma PCD ocular.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a composição contémadicionalmente uma quantidade eficaz de 11-cis-retinal ou de 9-cis-retinal.

7. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fatode compreender uma quantidade eficaz de 11-cis-retinal ou de 9-cis-retinal e uma quantidade eficaz de um inibidor deautofagia, que pode ser uma rapamicina, um inibidor defarnesil transferase, ou um FTI-277, em um excipientefarmaceuticamente aceitável, para o tratamento da retinitepigmentosa ou da degeneração macular relacionada com a idade.

8. KIT, caracterizado pelo fato de compreenderuma quantidade eficaz de 11-cis-retinal ou de 9-cis-retinal euma quantidade eficaz de rapamicina ou de um análogo damesma, para o tratamento de uma PCD ocular.

9. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender rapamicina ou um análogo da mesma e umcomposto que intensifica uma atividade biológica derapamicina em um excipiente farmaceuticamente aceitável, emque cada um dentre a rapamicina e o composto está presente emuma quantidade suficiente para tratar ou prevenir a PCD noindivíduo, para o tratamento de uma PCD ocular.