BRPI0612942A2

BRPI0612942A2 - forma variante de oxidase de urato e uso do mesmo

Info

Publication number: BRPI0612942A2
Application number: BRPI0612942-0A
Authority: BR
Inventors: Jacob Hartman; Simona Mendelovitz
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2012-10-09
Also published as: JP2013090636A; JP2015077144A; US20090209021A1; EP2918676B1; JP2008535499A; RU2007141683A; WO2006110761A2; IL223476A0; CA2604545A1; US20120070876A1; CN101194016B; CN102807973A; CZ2007700A3; IL281228A; SG161248A1; IL256157B; US20110217755A1; HUP0700729A3; KR20080007360A; EP2918676A1

Abstract

FORMA VARIANTE DE OXIDASE DE URATO E USO DO MESMO. A presente inveção se refere a proteínas modificadas geneticamente com atividade urolítica. Mais especialmente, a invenção relata proteínas compreendendo oxidases de urato mutiladas e métodos para produzi-las incluindo proteínas PEGilatadas compreendendo oxidases de urato mutiladas.

Description

iFORMAVARIANTE DE OXIDASE DE URATO E USO DO MESMO"

A presente invenção reivindica a prioridade e os benefícios do Pedido de Patente Provisional No. 60/670.541 requerido em 11 de abril de 2005, cuja revelação é incorporada à presente para referência. A presente invenção refere-se a proteínas modificadas geneticamente com atividade uricolítica. Mais especificamente, a invenção relata proteínas compreendendo oxidases de urato mutiladas (uricases; E.C. 1.7.3.3) são enzimas que catalizam a oxidação do ácido úrico para um produto mais solúvel, alantoína, um metabólito purina que é mais adequadamente expelido. Humanos não produzem uricase ativa enzimaticamente, como um resultado de várias mutações no gene para a uricase adquirida durante a evolução dos maiores primatas, Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84, incorporada à presente por referência em sua integridade. Como uma conseqüência, suscetíveis indivíduos, com excessiva concentração de ácido úrico no sangue (Hiperuricemia) poderá conduzir a árduas dores com artrite (gôta) que desfigurando depósitos de urato (tofo) e falência renal. Em alguns indivíduos afetados, viáveis frogad como alopurinol (um inibidor da síntese do ácido úrico) produz adverso Iimitante efeito no tratamento ou não alivias essas condições adequadamente. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG1 (1990) BaiIIiere1S Clin Rheumatol 4:177-192, cada um deles incorporado à presente por referência em sua integridade. Injeções de uricase podem diminuir a hiperuricemia e a hiperuricosuria , ao menos temporariamente. Uma vez que a uricase é uma proteína estranha em humanos, mesmo a primeira injeção de proteína não modificada de Aspergillus flavus tem induzido a reações anafiláticas em grande percentual de pacientes tratados (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemina 11: 1813-1816, incorporo à presente por referência em sua integridade), e respostas imunológicas limitam sua utilidade para tratamentos crônicos ou intermitentes. Donadio, D, et, al., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M1 et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-55, cada um deles ou incorporado à presente por referência, em sua integridade. A presente invenção relacionada à proteínas uricase recominadoras mutantes tendo mutilações e acentuando a estabilidade estrutural. É um objetivo da presente invenção prover novidade nas proteínas uricase recombinadoras. As proteínas da invenção contempladas serão mutiladas e terão aminoácidos alterados relativos às proteínas uricase que ocorrem naturalmente. A referida invenção provê uma uricase recombinadora mutante compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO. 8. Também é provida uma uricase recombinadora mutante compreendendo a seqüência de aminoácido SEQ ID NO. 13. Um adicional objetivo da presente invenção provê um meio para a metabolização do ácido úrico compreendendo uma nova proteína uricase recombinadora tendo atividade uricolítica. A atividade uricolítica será usada aqui para referir a conversão enzimática do ácido úrico em alantoína. Em uma incorporação, a uricase compreende a seqüência de aminoácido da posição 8 até a posição 287 da SEQ ID NO. 7 ou SEQ ID NO. 12. Também são providas uricases compreendendo seqüência de aminoácido SEQ ID NO. 8 ou SEQ iD NO. 13. Em uma incorporação, a uricase compreende um aminoácido de amina termial, onde o aminoácido de amina terminal é alanina, glícina, prolina, serina ou treonina. Em uma particular incorporação, o aminoácido da amina terminal é metionina. Também são providos ácido nucléicos compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma uricase da invenção. Em particulares incorporações, a uricase condificando o ácido nucléico é ligada à um promotor heterólogo, por exemplo, o promotor osmB, Também são providos vetores de ácido nucléico compreendendo a uricase codificando o ácido nucléico, células hospedeiras compreendendo vários vetores, e métodos para a produção de uma uricase compreendendo as etapas de cultivação da referida célula hospedeira sob condições que a seqüência de ácido nucléico seja expressada pela célula hospedeir e isolando a uricase expressa. Para umam melhor compreensão da invenção se fará referência aos desenhos em anexo, apresentados em caráter explicitativo e exempiificativo, mas não limitativo, nos quais:

- A Figura 1 ilustra a estrutura da plasmídeo pOUR-P-AN-ks-1. Números próximos aos locais de restrição indicam a posição nucleotídeo. Relativa ao local Harll1 designado como 1. Os locais de restrição que são perdidos durante a clonagem são marcados entre parênteses; - A Figura 2 representa o DNA e as seqüências de aminoácido deduzidas da uricase Porco-KS-ΔΝ (SEQ ID NO. 9 e SEQ IN DNO. 7, respectivamente). A numeração do aminoácido na Figura 1 é relativa à completa seqüência da uricase do porco. Seguindo o resíduo de metionina iniciador, uma treonina substitui o ácido aspártico 7 da seqüência da uricase do porco. Os locais de restrição que são usadas para as várias etapas da sub-clonagem são indicadas. A seqüência não interpretada ou não convertida é mostrada em letras minúsculas. O códon de paralisação da interpretação é indicado por um asterisco;

- A Figura 3 mostra o alinhamento relativo das seqüências de aminoácido deduzidas de várias seqüências da uricase recombinadora do porco (SEQ ID NO. 11), PBC-ANC (SEQ ID NO. 12) e Porco-KS-AN- (SEQ ID NO. 7). Os asteriscos indicam as posições nas quais existem diferenças nos aminoácidos quando comparados com a seqüência da uricase do porco publidada; os círculos indicam posições nas quais existem diferenças nos aminoácidos no Porco-KS- AN quando comparado ao PBC-AN. Linhas traçadas indicam a remoção dos aminoácidos;

- A Figura 4 representa a uricase do porco SDS-PAGE e as variantes uricase altamente purificadas de acordo com os Exemplos 1 - 3. A data de produção( (mês/ano) e número da rota relevante para cada amostra é indicado na chave abaixo. O Y é rotulado com os marcadores de peso dos pesos moleculares, e o topo da Figura é rotulado com os números das rotas. As rotas são as seguintes: Rota 1 - Marcadores do peso molecular; Rota 2 - Porco KS-AN (7/98); Rota 3 - Porco (9/98); Rota 4 - Porco KS (6/99); Rota 5 - Porco KS (6/99); Rota 6 - Porco-AN (6/99); Rota 7 - Porco KS-AN (7/99); Rota 8 -Porco KS-AN (8/99);

- A Figura 5 representa os perfis farmacêuticos da uricase PEGiIatada (9x10 kD) Porco-KS-AN em ratos seguindo as injeções IN (intra-muscular), SC (subcutânea) e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase em amostras de plasma, que são coletadas nos pontos de tempo indicados, é determinada usando análise clorimétrica. Os valores da atividade (mAU = unidades de mili- absorção) representam a taxa de proporção a reação enzimática por 1 μ! da amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga que atinge a circulação relativa à uma injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir da área sob a curva do gráfico;

- A Figura 6 representa os perfis farmacocinéticos da uricase PEGiIatada (9x10 kD) Porco-KS-AN em coelhos seguindo as injeções IM (intra-muscular), SC 4/31

(subcutânea),e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase em amostras de plasma coletadas em pontos de tempo indicados é determinada usando uma análise colorimétrica. Os valores da atividade (mAU = Unidades de mili-absorção) representam a taxa de proporção da reação enzimática por dl da amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga que tinge a circulação relativa à uma injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir da área sob a curva do gráfico;

-A Figura 7 representa perfis farmacocinéticos da uricase PEGiIatada (9x10 kD) Porco-KS-ΔΝ em cães seguindo as injeções IM (intra-muscular), SB (subcutânea) e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase nas amostras de plasma, que são coletadas nos pontos de tempo indicados, é determinada usando a análise colorimétrica. Os valores da atividade (mAU = unidades de mili-absorção) representam a taxa de proporção da reação enzimática por 1 μΙ de amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga que atinge a circulação relativa à injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir da área son a curva do gráfico;

-A Figura 8 representa os perfis farmacocinéticos da uricase PEGiIatada (9x10 20 k) Porco-KS-ΔΝ em porcos seguindo as injeções IM (intra-muscular), SB (subcutânea), e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase nas amostras de plasma, que são coletadas nos pontos de tempo indicados, é determinada usando a análise colorimétrica. Os valores da atividade (mAU = unidades de mili-absorção) representam a taxa de proporção da reação enzimática por 1 μΙ de amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga que atinge a circulação relativa à uma injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir da área sob a curva do gráfico.

Estudos prévios ensinam que uma significante redução na imunogenicidade e/ou antigenicidade da uricase é alcançada pela PEGilação, que é invariavelmente associada com uma substancial perda da atividade uricolítica. A segurança, conveniência e efetividade dos bio-farmacêuticos são todos adversamente comprimidos pelo decréscimo em suas potências e resultando na necessidade da aumento na administração da dose. Assim há uma necessidade para meios alternativos efetivos para a perda de níveis elevados de ácido úrico em fluídos sangüíneos, incluindo sangue. A presente invenção provê uma uricase recombinadora mutante compreendendo as seqüências de aminoácido de SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 12, ou SEQ ID NO. 13. A uricase como aqui utilizada, inclui sub-unidades individuais, bem como tetramérico, a não ser que contrariamente indicado. Em uma particular incorporação, a uricase tem uma amina terminal metionina. Esta metionina poderá ser removida pela modifação pós-translacional, ou pós-transferência. Em uma particular incorporação da invenção, a metionina amina terminal é removida após a uricase ser produzida. Em uma particular incorporação da invenção, a metionina é removida pela aminopeptidase bacterial endógena. O penúltimo aminoácido poderá ser um que permita a remoção da metionina terminal-N pela aminopeptidase metionina bacterial (MAP). Os aminoácidos seguindo a mais completa remoção da metionina terminal-N, são a alanina, glicina, prolina, serina, e treonina. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase compreende dois aminoácidos de amina terminanlonde os aminoácidos da amina terminal são uma metionina seguida por um aminoácido selecionado de um grupo consistindo de alanina, glicina, prolina, serina e treonina. A referida invenção provê uma seqüência de ácido nucléico codificando a uricase. A referida invenção ainda provê um vetor compreendendo a seqüência de ácido nucléico. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase é isolada. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase é isolada. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase é isolada e purificada. A presente invenção provê um método para a produção da uricase codificando a seqüência de ácido nucléico, compreendendo modificação por técnicas PCR ( reação da cadeia polimerase) de uma seqüência de ácido nucléico codificando uma uricase. Um especialista no assunto aprecia que uma deseja da seqüência de ácido nucléico seja preparado por PCR via de escorvadores oligonucleotídeo sintéticos, que são complementares às regiões do DNA alvo (um para cada filamento) a ser amplificado. Os escorvadores são adicionados ao DNA alvo (que não necessita ser puro), na presença do excesso de desoxinucleotídeos e polimerase Taq, um polimerase DNA estável aquecido. Em uma séria (tipicamente 30) de ciclos de temperatura, o DNA alvo é repetidamente desnaturado (aproxidamente 90° C), anelado aos escorvadores (tipicamente à 50-60° C) e uma filamento filhote estendido a partir dos escorvadores (72° C). Os filamentos filhotes propriamente agem como gabaritos para os subseqüentes ciclos, os fragmentos do DNA se igualando aos escorvadores que são amplificados exponencialmente, preferivelmente linearmente. A referida invenção prove um método para a produção de uma uricase recombinadora mutante compreendendo a transfecção (transferência de genes) de uma célula hospedeira como o vetor, onde a célula hospedeira expressa a uricase, isolando a uricase recombinadora mutante da célula hospedeira, isolando a uricase recombinadora mutante purificada, por exemplo, usando técnicas cromatográficas e purificando a uricase recombinadora. Por exemplo, a uricase poderá ser produzida de acordo com os métodos descrito na Publicação da Patente internacional No. WO 00/08196 e no Pedido de Patente Norte-Americano No. 60/095.489, incorporados à presente por referência em sua integridade. Em uma particular incorporação da invenção, a célula hospedeira é tratada de modo a causar a expressão da uricase recombinadora mutante. Um especialista no assunto reconhece que a transfecção das células com um vetor é usualmente acompanhada usando DNA precipitado com íons de cálcio, podendo uma variedade de outros métodos também serem usados (por exemplo, eletroporação). A uricase poderá ser isolada e/ou purificada por qualquer método conhecido pelo estado da técnica. Expressos poliptídios desta invenção são geralmente isolados de forma substancialmente pura. Preferivelmente, os poliptídios são isolados para uma pureza de pelo menos 80% por peso, mais preferivelmente à uma pureza de ao menos 95% por peso, e mais preferivelmente por ao menso 99% por peso. Em gerai, a referida purificação poderá ser alcançada usando, por exemplo, as técnicas padrões do fracionamento do sulfato de amônia, eletroforese SDS- PAGE, e por afinidade cromatográfica. A uricase é preferentemente isolada usando um sufactante catiônico, por exemplo, cloreto piridina cetila (CPC) de acordo com método descrito no Pedido de Patente Dependente Norte- Americano requerido em 11 de abril de 2005, sob No. 60/670.520 intitulado "Purificação de Proteínas com Surfactante Catiônico", incorporado à presente por referência em sua integridade. Em uma particular incorporação da invenção, o vetor está sob o controle de um promotor sensitivo de pressão osmótica. Um promotor é uma região do DNA ao qual o polimerase RNA se liga antes de iniciar a transcrição do DNA em RNA. Um promotor sensitivo de pressão osmótica inicia a transcrição como um resultado de uma pressão osmótica aumentada sentida pela célula. A uricase da invenção inclui uricase que é conjugada com um polímero, por exemplo, uma uricase conjugada ao glicol polietileno, ou seja uricase PEGilatada. Em uma particular incorporação da invenção, uma composição farmacêutica compreendendo a uricase é provida. Em uma particular incorporação da invenção, a composição é uma solução d auricase. Em uma particular incorporação da invenção, a solução é estéril e adequada para injeção. Em uma particular incorporação da invenção, referida composição compreende uricase como uma solução em salina isoladora de fosfato. Em uma particular incorporação da invenção, a composição é provida em um frasco, opcionalmente tendo uma tampa de injeção de borracha. Em particulares incorporações, a composição compreende uricase em solução em uma concentração de 2 à 16 miligramas de uricase por mililitro de solução, de 4 à 12 miligramas por mililitro, e de 6 à 10 miligramas por mililitro. Em uma particular incorporação da invenção, a composição compreende uricase em uma concentração de 8 miligramas por mililitro. Preferivelmente, a massa da uricase é medida com relação à massa da proteína. Efetivos regimes de administração das composições da invenção poderão ser determinada por um especialista na matéria. Adequados indicadores para acessar a efetividade de um determinado regime são conhecidos pelo estado da técnica. Exemplos dos referidos indicadores incluem a normalização ou diminuição dos níveis de ácido úrico do plasma (PUA) e a diminuição ou manutenção do PUA para 6.8 mg/dL ou menos, preferivelmente de 6 mg/dL ou menos. Em uma particular incorporação da invenção, o indivíduo sendo tratado com a composição da invenção tem uma PUA de 6 mg/ml ou menos pelo emnso em 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90% do período do tratamento. Por exemplo, para um período de tratamento de 24 semanas, o indivíduo tem um PUA de 6 mg/ml ou menos por pelo menos 80% das 24 semanas de período de tratamento, ou seja, ao menos um tempo igual à quantidade de tempo de 134. 4 dias (24 semanas χ 7 dias/semana χ 0.8 = 134.4 dias). Em uma particular incorporação da invenção, 8/31

0.5 à 24 mg de uricase em solução é administrada uma vez a cada 2 à 4

semanas. A uricase poderá ser administrada de uma forma apropriada conhecida pelo estado da técnica, por exemplo, intra-venosa, instra-muscular ou subcutânea. Preferivelmente1 quando a administração for intra-venosa, 0.5 mg à 12 mg de uricase será administrada. Preferivelmente1 quando a administração for subcutânea, 4 à 24 mg de uricase será administrada. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase é administrada pela infusão intra-venosa por um período de 30 à 240 minutos. Em uma particular incorporação da invenção, 8 mg de uricase é administrada uma vez a cada duas semanas. Em particulares incorporações, a infusão poderá ser realizada usando 100 à 500 mL de solução de salina. Em uma particular incorporação da invenção, 8 mg de uricase em solução é administrada por um período de 120 minutos uma vez a cada 2 semanas ou uma vez a cada 4 semanas, preferível mente a uricase é dissolvida em 250 mL de solução de salina par infusão. Em uma particular incorporação da invenção, a administração da uricase é realizada por um período d tratamento de 3 meses, 6 meses, 8 meses ou 12 meses. Em uma particular incorporação da invenção, o período de tratamento é de 12 semanas, 24 semanas, 36 semanas ou 48 semanas. Em uma particular incorporação da invenção, o período de tratamento é um um período estendido de tempo, por exemplo, 2 anos ou mais, para até toda a vida do indivíduo que está sendo tratado. Em adição, múltiplos períodos de tratamento poderão ser utilizados com intervalos de períodos sem tratamento, por exemplo, 6 meses de tratamento seguidos de 3 meses sem tratamento, seguido por adicionais 6 meses de tratamento, etc.. Em certas incorporações, compostos anti-inflamatórios poderão ser profilaticamente administrados para eliminar ou reduzir a ocorrência de reações de infusão devido à administração da uricase. Em uma particular incorporação da invenção, ao menos um corticosteróide, ao menos um anti-histamina, ao menos um NSAID, ou uma combinação dos mesmos, deverá ser administrada. Adequados corticosteróides incluem betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona e triancinolona. Apropriados NSAIDs incluem ibufreno, indometacina, naproxeno, aspirina, acetominofeno, celecoxibo e caldecoxibo. Adequados anti-histamínicos incluem azatadina, bromofeniramina, cetirizina, clorofeniramina, clemastina, ciproeptadina, desloratadina, dexaciorofeniramina, dimenidrinato, difenidramina, doxilamina, fexofenadina, hidroxizina, Ioratadina e fenindamina. Em uma particular incorporação da invenção, a anti-histamina será fexofedina, o NSAI será a acetaminofeno e o corticosteróide será a hidrocortisona e/ou prednisolona.

Preferivelmente, uma combinação dos três (não necessariamente concomitante) deverá ser administrada antes da infusão da solução da uricase. Em uma particular incorporação da invenção, o NSAID e o anti-histamina são administrados oralmente de 1 à 4 horas antes da infusão da uricase. Uma adequada dose de fexodenadina inclui aproximadamente 30 à 180 mg, aproximadamente 40 à 150 mg, aproximadamente 50 à 120 mg, aproximadamente 60 à 90 mg, aproximadamente 60 mg, preferivelmente 60 mg. Uma apropriada dose de acetominofeno inclui aproximadamente 500 à 1500 mg, aproximadamente 700 à 1200 mg, aproximadamente 800 à 1100 mg, aproximadamente 1000 mg, preferivelmente 1000 mg. Uma adequada dose de hidrocortisona inclui aproximadamente 100 à 500 mg, aproximadamente 150 à 300 mg, aproximadamente 200 mg, preferivelmente 200 mg. Em uma particular incorporação da invenção, o anti-histamina não é difenidramina. Em outra incorporação, o NSAID não é acetaminofeno. Em uma preferida incorporação, 60 mg de fexofenadina é administrada oralmente à noite ante da infusão da uricase, 60 mg de fexofenadina e 1000 mg de acetaminofeno são administrados oralmente na próxima manhã, e finalmente, 200 mg de hidrocortisona é administrada justamente antes da infusão da solução de uricase. Em uma particular incorporação da invenção, a prednisolona é adminstrada ao dia, preferivelmente à noite antes da administração da uricase. Uma apropriada dose de prednisolona inclui 5 à 50 mg, preferivelmente 20 mg. Em determinadas incorporações, esses tratamentos profiláticos para eliminar ou reduzir a ocorrência de reações da infusão são utilizadas para indivíduos que recebem uricase, incluindo uricase PEGilatada, e uricase não PEGilatada. Em uma particular incorporação da invenção, esses tratamentos profiláticos são utilizados para indivíduos que recebem peptídios terapêuticos outros do que a uricase, onde os outros peptídios terapêuticos são PEGiIatados e não PEGilatados. Em uma particular incorporação da invenção, a composição farmacêutica compreende uma uricase conjugada com um polímero, e a modificada uricase retém a atividade uricolítica. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase é uma uricase pegilatada. Em uma particular incorporação da invenção, a composição farmacêutica compreende uma uricase que tenha sido modificada pela conjugação com um polímero, a a modificada uricase retém a atividade uricolítica. Em uma particular incorporação da invenção, a uricase-polímero conjugados são preparados como descrito na Publicação do Pedido Internacional No. WO 01/59078 e Pedido de Patente Norte-Americano No. 09/501.730 incorporados à presente por referência em sua integridade. Em uma particular incorporação da invenção, o polímero é selecionado a partir de um grupo compreendendo glicol de polietileno, dextrana, gliclo de polipropileno, hidroxipropilmetila celulose, caboximetilacelulose, pirolidina polivinil, e álcool polivinil. Em uma particular incorporação da invenção, o polímero é um glicol de polietileno e a uricase é uma uricase PEGilatada. Em incorporações da invenção, a composição compreende 2-12 moléculas de polímero em cada sub-unidade de uricase, preferivelmente de 3 à 10 moléculas de polímero por sub-unidade de uricase. Em uma particular incorporação da invenção, a molécula de polímero tem um peso molecular entre 1 kD à aproximadamente 100 kD. Em uma particular incorporação da invenção, cada molécula de polímero tem um peso molecular entre 1 kD e 50 kD. Em outra incorporação, cada molécula de polímero tem um peso molecular entre 5 kD e 20 kD, entre 8 kD e 15 kD, entre 10 kD e 12 kD, e preferivelmente aproximadamente 10 kD. Em uma particular incorporação da invenção, cada molécula de polímero tem um peso molecular entre aproximadamente 5 kD à 20 kD. Em uma especial incorporação, cada molécula de polímero tem um peso molecular de 10 kD. Em uma particular incorporação da invenção, a composição é adequada para repetida administração da composição. A referida invenção prove um meio para a metabolização do ácido úrico usando a uricas. A presente invenção ainda provê um uso de uma composição para a redução dos níveis de ácido úrico em um fluído biológico. Em uma particular incorporação da invenção, a composição da uricase é usada para a redução do ácido úrico em um fluído biológico compreendendo sangue. Também são providas moléculas de ácido nucléico codificando a uricase da invenção. As manipulações que resultam em suas produções são muito conhecidas pelo estado da técnica. Por exemplo, as 11/31

seqüências de ácido nucléico poderão ser modificadas por quaisquer uma das numerosas estratégias conhecidas pelo estado da técnica (Maniatis, T)., 1990, Molecular Diclonina, A Laboratoty Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). A seqüência poderá ser clivada em locais apropriados com restrição endonuclease (s) seguida por adicional modificação enzimática se desejado, e ligada in vitro. Na produção do gene codificando uma uricase, cuidados deverão ser tomados para assegurar que o modificado gene permaneça dentro da apropriada estrutura de leitura translacional por sinais de paralisação translacional (transferência de proteínas). A seqüência nucleotídeo codificando uma proteína uricase poderá ser inserida em um apropriado vetor de expressão, isto é, em um vetor que contenha os elementos necessários para a transcrição, interpretação e transferência da seqüência codificando a proteína inserida. Uma variedade de sistemas vetores hospedeiros poderão ser utilizados para expressar a seqüência codificando a proteína. Estas incluem, mas não limitam aos sistemas de células mamíferas infectadas com vírus (como por exemplo, vírus vacínia, adenovírus, etc,); contendo vetores germinais, ou bactéria transformada com bacteriófago DNA, plasmídeo DNA ou cosmídio DNA. Os elementos da expressão desses vetores variam em suas resistências e especificidades. Dependendo do sistema vetor hospedeiro utilizado, quaisquer um dos inúmeros elementos de transcrição e translação poderão ser usados. Quaisquer dos métodos conhecidos para a inserção dos fragmentos do DNA no vetor poderão ser usados para construir os vetores de expressão contendo um gene quimérico consistindo de apropriados sinais de controle transcricional e translacional e as seqüências codificando proteína. Esses métodos poderão incluir recombtnadores DNA in vitro e técnicas sintéticas de recombinações in vivo (recombinação genética). A expressão da seqüência do ácido nucléico codificando proteína uricase poderá ser regulada por uma segunda seqüência de ácido nucléico de modo que a proteína uricase seja expressada em um vetor hospedeiro transformado com a molécula DNA recombinadora. Por exemplo, a expressão da uricase poderá ser controlada por qualquer elemento promotor/realçador conhecido no estado da técnica. Promotores que poderão ser usados para controlar a expressão da uricase, incluem, mas não se limitam à região do promotor inicial SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304- 310), o promotor contido no terminal longo 3' repetido no vírus sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), o promotor cinase timidina herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 133-1445) as seqüencias regulatórias do gene metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42);

vetores de expressão procarióticas como o promotor β-lactamase (Villa- Kamaroff, et, al., 1978. Proc. Natl., Acad. Sei. U.S.A. 75: 3727-3732) o promotor tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:21-25) e o promotor osmB.

Em uma particular incorporação da invenção, o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácido nucléico codificando aa uricase perativamente ligada a um promotor heterólogo. Uma vez que uma particular molécula DNA recombinadora compreendendo uma seqüência de ácido nucléico codificada é preparada e isolada, vários métodos conhecidos pelo estado da técnica poderão ser usados para propagá-la. Uma vez que um adequado sistema e condições de crescimento são estabelecidas os vetores de expressão recombinadores poderão ser preparados e propagados em quantidade. Como previamente explanado, os vetores de expressão que poderão ser usados incluem, mas não se limitam aos seguintes vetores e seus derivativos: viroses humana ou animal como o vírus vicína ou adenovírus; viroses inseticidas como a baculovírus, vetores germinais, vetores bacteriófago (por exemplo, lâmbda), e vetores DNA plasmídeo e cosmídeo, etc.. Em adição, a composição da célula hospedeira poderá ser escolhida de modo que venha a modular a expressão das seqüências inseridas, ou modificar e processar o produto do gene de forma desejada. A expressão de determinados promotores poderá ser elevada na presença de determinados indutores; assim sendo a expressão da proteína uricase construída geneticamente poderá ser controlada. Além disso, diferentes células hospedeiras tem características e específicos mecanismos para o processamento e modificação translacional e pós-translacional (como por exemplo, clivagem com glicosação) das proteínas. Apropriadas linhas de células ou sistemas hospedeiros poderão ser escolhidos para assegurar a desejada modificação e o processamento da proteína estranha expressada. Diferentes sistemas de expressão de vetor/célula poderão efetuar o processamento das reações como clivagem proteolítica para extensões diferentes. Em uma particular incorporação da invenção, a expressão da uricase em E. coli é preferivelmente realizada

usando vetores que compreendem o promotor osmB.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Construção do Gene e Expressão Plasmídeo Para a Expressão Uricase

A uricase suína recombinadora (oxidase de urato), Porco-KS-ΔΝ (proteína uricase de porco mutilada com amina terminal substituindo os aminoácidos 291 e .301 com Iisina e serina, respectivamente) foi expressado em E. coli 12 com a composição W3110F-. Uma série de plasmídeos foi construída culminando e, pOUR-P-AN-ks-1, que após a transformação das células hospedeiras E. coli foi capaz de direcionar eficiente expressão da uricase.

Isolamento e Sub-clonagem da Uricase DNA do Fígado do Porco e babuíno Os cDNAs uricase foram preparados dos fígados do porco e do babuíno pelo isolamento e sub-clonagem do relevante RNA. 0 total RNA celular foi extraído dos fígados do porco e do babuíno (Erlich, H.A. (1989). PCR Techmoiogy; Principies and Application for DNA Amplification; Sambrook J., et al., (1989). Molecular Cloning : A Laboratory Manual 2nd editiona; Ausubelj F. M. et al. (1998). Current Protocols in molecular Biology) , então contrariamente transcritos usando o Primeiro Kit de Filamento de Síntese cDNA (Pharmacia Biotech). A amplificação do PCR foi realizada usando o polimerase DNA Taq (gibco BRL, Life Technologies). Os escorvadores oligonucleotídeos sintéticos usados para a amplificação dos oxidases de urato (uricases) do porco e do babuíno são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Escorvadores Para Amplificação PCR do cDNA Uricase <table>table see original document page 14</column></row><table> 14/31

As seqüências de restrição da enzimas, introduzidas nas extremidades dos escorvadores e mostradas em letras minúsculas na Tabela 1, foram sendo EcoRI e Ncol (porco e babuíno) e anti-senso Ncol, HindMI e Xbal (porco), Xbal e Ncol (babuíno). No senso escorvador do babuíno, o terceiro códon GAC (ácido aspártico) presente na uricase do babuíno foi substituído com CAC (histidina) o códon que está presente nesta posição codificando a seqüência da pseudogene oxidase urato humana. A uricase do babuíno recombinadora construída geneticamente usando os escorvadores é nominada Uricase de Babuíno D3H.

Os cDNAs ligados foram usados para transformar a composição E. coli XL1- Blue (Stratagene, La Jolla, CA). O DNA piasmídeo contendo uricase cDNA clonada foi preparada, e os clones que possuíam a uricase DNA publicada condicando as seqüências (exceto para a substituição na uricase de babuíno. Mostrado na Tabela 1), foram selecionados e isolados. O clone da uricase do babuíno pCR™ll-D3H escolhido, e as seqüências pCR™ll ficaram próximas do códon de paralisação da uricase, resultando na anulação da seqüências introduzidas pelo PCR. Como uma conseqüência, os locais de restrição Xbal e Ncol da região não interpretada 3' foram eliminadas, e dessa forma permitindo direcionada clonagem usando Ncol na extremidade 5' do produto PCR e BamHI que é derivado do vetor pCR™ll.

Sub-Clonagem da Uricase cDNA nos Vetores de Expressão pET Sub-clonagem da Uricase do Babuíno

O cDNA do babuíno D3H contendo completa dimensão da uricase condificando a seqüência foi introduzido no vetor de expressão pET-3d (Novagen, Madison, Wl). A uricase do babuíno D3H foi digerida com Ncol e BamHI, r o fragmento 960 bp foi isolado. O piasmídeo da expressão pET-3d foi digerido com Ncol e BamHI, e o fragmento 4600 bp foi isolado. Os dois fragmentos foram ligados para criar o Babuíno pET-3d-D3H.

Sub-clonagem da Uricase Quimérica do Porco-Babuino

A uricase quimérica do porco-babuíno (PBC) foi construída no sentido de ganhar a mais alta expressão, estabilidade e atividade do gene recombinador. O PBC foi construído pelo isolamento do fragmento 4936bp Ncol-Apal do clone do Babuíno pET-3d-D3H e ligando o fragmento isolado com o pET-3d-PBC. A uricase cDNA PBC consiste dos códons da uricase do porco 1-225 unidas em estruturas aos códons 226-304 da uricase do babuíno. Sub-clonagem da Uricase Porco-Ks

A uricase Porco-KS foi contruída no sentido de adicionar um resíduo de lisina, que poderá prover um adicional local de PEGilação. KS se refere ao aminoácido inserido da lisina na uricase do porco, na posição 291, no lugar da arginina (R291K). Em adição, a treonina na posição 301 foi substituída com serina (T301S). O plasmídeo da uricase PorcoKS foi construído pelo isolamento do fragmento 4696 bp Ncol-Ndel do Babuíno pET-3d-D3H, e então ele foi ligado com o fragmento 864 bp Ncol-Ndel isolado da uricase do Porco pUC18, resultando na formação do Porco-KS-pET-3d. A seqüênica da uricase PorcoKS consiste dos códons 1-288 da uricase do porco unidas na estruturas aod códons 289-304 da uricase do babuíno.

Sub-clonagem da Seqüência da Uricase Sob a Regulação do Promotor osmB

O gene da uricase foi sub-clonado em um vetor de expressão contendo o promotor osmB (seguindo o ensinamento da Patente Norte-Americana No. 5.795.776, incorporada à presente por referência em sua integridade). Este vetor possibilitou a indução da expressão da proteína em resposta à alta pressão osmótica da cultura existente. A expressão do plasmídeo pMFOA-18 contida no promotor osmB, uma seqüência de local com ligação ribossomal (rbs) e uma seqüência terminadora da transcrição (ter). Ela confere uma resistência à amplicilina (AmpR) e expressa a esterease da acetilcolina humana recombinadora (AchE). Sub-clonagem da Uricase do Babuíno-D3H

O plasmídeo pMFOA-18 foi digerido com Ncoi eBamHl, e o grande fragmento foi isolado. A construção do Babuíno pET-3d-D3H foi digerida com Ncol e BamHI e o fragmento 960 bp, que incluiu o gene da Uricase Babuíno D3H que foi isolado. Esses dois fragmentos foram ligado para criar o pMF0U18. O plasmídeo da expressão pMFXT133 contendo o promotor osmB, um rbs (E. coli deo operon), ter (E. coli TrypA), o polipeptídio inibidor XA fator recombinador (Fxal), e ele conferiram o gene de resistência tetraciclina (TetR). O gene da uricase do babuíno foi inserido neste plasmídeo no sentido de alterar os genes de resistência antibiótica. O plasmídeo pMFOU 18 foi digerido com Ncol1 preenchido, e então digerido com Xhol, e um fragmento bp 1030 que foi isolado. O plasmídeo pMFXT133 foi digerido com Ndel, preenchido, e então digerido com Xhol, e o grande fragmento sendo isolado. Os dois fragmentos foram ligados para criar o vetor de expressão da uricase do babuíno, pURBA16. Sub-ctonagem da Uricase Quimérica do Porco-Babuino O plasmídeo pURBA16 foi digerido com Apal e AlwNW, e o fragmento bp 2320 foi isolado. O plasmídeo pMFXT133 foi digerido com Ndel, preenchido, e então digerido com AlwNI, e o fragmento bp 620 foi isolado. A construção do pET-PBC foi digerifo com XbaI, preenchido, e então digerido com Apal, e o fragmento bp 710 foi isolado. Os três fragmentos foram ligados para criar pUR-PB, um plasmídeo que expressa a uricase PBC sob o controle do promotor osmB e rbs bem como o rbs T7, que foi derivado do vetor pET-3d. O rbs T7 foi imposto em uma adicional etapa. O pUR-PB foi digerido com Ncol, preenchido com AIwNIj e o fragmento bp 3000 sendo isolado, O plasmídeo pMXFT133 foi digerido com Ndel, preenchido e então digerido com AIwNI e o fragmento bp 620 foi também isolado. Os dois fragmentos foram ligados para formar o pDUR-PB, que expressa o PBC sob o controle do promotor osmB. Construção do pOUR-ΡΒ-ΔΝ

Várias alterações foram introduzidas na uricase cDNA, que resultaram em um substancial aumento na estabilidade da enzima recombinadora. O plasmídeo pOUR-PBC-ΔΝ foi construído, no qual o peptídio de maturação do resíduo seis no terminal-N e o tri-peptídio no terminal-C, que funciona in vivo como sinal rotulado peróxidosomal, onde sendo ambos removidos. Este fato ocorreu pela utilização da seqüência PBC mo plasmídio pDUR-PB e nos específico escorvador oligonucleotídeo listado na Tabela 2, usando amplificação PCR.

Tabela 2. Escorvadores para Amplificação PCR na Uricase pBC-ΔΝΟ

<table>table see original document page 17</column></row><table> As seqüências da restrição da enzima introduzidas nas extremidades dos escorvadores mostrado em negrito, e as regiões não codificadas são mostradas em letras minúsculas na Tabela 2. Ndel é o senso e Xbal é o anti-senso. O escorvador anti-senso foi ainda usado para eliminar um local de restrição interno Ndel pela instrodução de um ponto de mutação (sublinhado) que não afetou a seqüência de aminoácido, e assim facilitando a sub-clonagem pelo uso do Ndel. O fragmento par-base 800 gerado pela amplificação PCR do pDUR-PB foi clivada com Ndel e Xbal e isolada. O fragmento obtido foi então inserido em um plasmídeo pDBAST-RAT-N de expressão deo, que ancora o promotor deo-P1P2 e o rbs derivado do E. coli e constitutivamente expressa o precursor da insulina recombinadora humana. O plasmídeo foi digerido com Ndel e Xbal e o fragmento bp 4035 foi isolado e ligado à uricase PBC do produto PCR. O resultante construído, o pDUR-PB-ANC foi usado para transformar o E. coli 12 βΦ733 (F- cyRstrA) que expressa um alto nível de uricase ativa mutilada. A seqüência dupla PBC-ANC foi também expressada sob o controle do promotor osmB. O plasmídeo pDUR-PB-ANC foi digerida com AIwNI - Ndel, e o fragmento bp 3459 foi isolado. O plasmídeo pMFXT133m acima descrito, foi digerido com Ndel- AIwNI, e o fragmento bp 660 foi isolado. Os fragmentos foram isolados para criar o pOUR-PB-ANC que foi introduzido no E. coli da composição W3110F e expressando alto nível de uricase mutilada ativa.

Construção do Plasmídeo da Expressão da Uricase pOUR-PAN-ks-1 Este plasmídeo foi construído no sentido de aperfeiçoar a atividade e a estabilidade da enzima recombinadora. A uricase Porco-KS-ΔΝ foi mutilada somente no terminal-N (ΔΝ), onde o peptídeo de maturação do resíduo seis no terminal-N foi removido, e contendo as mutações S46T R291K e T301S. Na posição 46, havia um resíduo de treonina ao invés da serina devido à uma mutação conservante que ocorreu durante a amplificação PCR e a clonagem. Na posição 291, a Iisina substituiu a arginina, e na posição 301, a serina foi inserida ao invés da treonina. Ambas foram derivadas da seqüência da uricase do babuíno. As modificações do R291K e T301S são designadas KS, e discutidas acima. O resíduo extra de Iisina provido proveu um adicional local potencial de PEGilação. Para construir o pOUR-P-AN-ks-1 (Figura 1), o plasmídeo pOUR-PB- ΔΝ foi digerido com Apal - Xbal e o fragmento bp 3873 foi isolado. O plasmídeo pET-3d-PKS (construção mostrada na Figura 4) foi digerida com Apa! - Speli e o fragmento bp 270 foi isolado. A clivagem do Spel deixou uma extensão CTAG 5' que foi eficientemente ligada aos fragmentos DNA gerados pelo Xbal. Os dois fragmentos foram ligados para criar o pOUR-P-AN-ks-1. Após a ligação, o reconhecimento dos Spel e Xbal foram perdidos (seus lugares são mostrados em parênteses na Figura 9). A construção do pOUR-P-AN-ksOl foi introduzida no E. coli da combinação W3110F, prototrófico ATCC#27325. A resultante uricase Porco-KS-ΔΝ, expressada sob controle do promotor osmB, permitiu altos níveis da enzima recombinadora tendo maios estabilidade e atividade. A Figura 1 ilustra a estrutura do plasmídeo pOUR-P-AN-ks-1. Números próximos aos locais de restrição indicam a posição nucleotídeo, relativa ao local Haell, designado como 1; locais de restrição que foram perdidos durante a clonagem e marcados em parênteses; O plasmídeo pOUR-P-AN-ks-1, codificando a uricase Porco-KS-ΔΝ é a base de par 4143 (bp) e compreende os seguintes elementos:

1. Um fragmento DNA, longo bp113, espanado no nucleotídeo número 1 para o local Ndel (na posição 113), que inclui o promotor osmB e o ribossoma ligando o local (rbs).

2. Um fragmento DNA1 longo bp 832, espanado do Ndel (na posição 113) para a junção Spel/Xbal (na posição 1045), que inclui: 900 bp de

Porco-KS-ΔΝ (seqüência de ácido nucléico da proteína da uricase do porco mutilada amina terminal na qual os aminoácidos 291 e 301 com Iisina e serina, respectivamente, são substituídos) codificando a região e flanqueando a seqüência 32 bp derivada do pCR™!! , do local de clonagem TA acima do local de restrição Spel/Xbal.

3. Uma seqüência de locais de clonagem múltipla de 25 bp )MCS) da junção Spel/Xbal (na posição 1045) para Hindlll (na posição 1070).

4. Um nucleotídeo sintético 40 bp contendo o terminador de transcrição TrpA (ter) com Hindlll (na posição 1070) e na extremidade Aatll (na

posição 1110).

5. Um fragmento DNA1 longo bp 1519, espanado do Aatll (na posição 1110) para os locais Mscl/Scal (na posição 2629) no pBR322 que inclui o gene de resistência tetraciciina (TetR). 6. Um fragmento DNA5 longo bp 1514, espanado do Scal (na posição 2629) para Haell (na posição 4143) no pBR322 que inclui a origem da replicação do DNA.

A Figura 2 mostra e DNA e as seqüências de aminoácido deduzidas da uricase do Porco-KS-ΔΝ. Nesta Figura, a numeração do aminoácido é de acordo com completa seqüência da uricase do porco. Seguindo o resíduo de metionina iniciador, uma treonina foi inserida no local do ácido aspártico da seqüência da uricase do porco. Este resíduo de treonina possibilitou a remoção da metionina pela aminopeptidase bacterial. O intervalo na seqüência do aminoácido ilustra o peptídio de maturação do terminal-N removido. Os locais de restrição que foram usadas para as várias etapas de sub-clonagem de diferentes seqüências de uricase (Apal, Ndel1 BamHI, EcoRI e Spel) sãi indicadas. A seqüência não traduzida 3', mostrada em letras minúsculas, foi derivada da seqüência pCR™ll. O códon da paralisação translacional é indicada por um asterisco. A Figura 3 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos de várias seqüências da uricase recombinadora. A linha superior representa a uricase do porco, que incluiu completa seqüência de aminoácido. A segunda linha é a seqüência da uricase quimérica duplamente mutilada do porco-babuíno (PBOANC). Aterceira linha mostra a seqüência da uricase Porco-KS-ΔΝ, que somente é mutilada no terminal-N e contendo as mutações S46T e as alterações do aminoácido R291K e T301S, ambas refletindo a origem do babuíno do terminal carboxila da seqüência codificando a uricase. Os asteriscos indicam as posições nas quais existem diferenças nos aminoácidos Porco-KS-ΔΝ quando comparados aos da seqüência da uricase do porco publicada;os círculos indicam as posições nas quais existem diferenças nos aminoácidos no Porco-KS-ΔΝ comparados aos do PBC-ΔΝ, da quimérica do porco-babuíno e as linhas traçadas indicam a remoção dos aminoácidos. O cDNA para a uricase nativa do babuíno, porco, e coelho com a mutação Y97H, e a quimérica porco/babuíno (PBC) foram construídas para a clonagem no E. coli. Os clones expressando altos níveis de uricase variante foram construídos e selecionados para serem todos W3110 F E.coli, e a expressão sendo regulada pelo osmB. O DNA plasmídeo foi isolado, verificado pelo DNA seqüencial e análise da restrição da enzima, a as células foram cultivadas. A construção das uricases mutiladas, incluindo porco-ΔΝ e Porco-KS- ΔΝ foram feitas pela ligação cruzada entre o PBC-ANC e o Porco-KS5 seguindo a clivagem com restrições endonucleases Apal e Xbal , e Apal mais Spel. Respectivamente. É razoável que esses mutantes mutilados serão retidos em atividade, uma vez que o resíduo seis do terminal-N, o "peptídio da maturação" (1-2) e o tri-peptídio do terminal-C, "sinal rotulado peroxissomal" (3-5) não tem funções que significantemente afetem a atividade enzimática, sendo possível que essas seqüências poderão ser imunogenéticas. Clones expressando altos níveis de uricases variantes foram selecionados.

Exemplo 2. Transformação do Plasmídeo de Expressão Em Uma Célula Hospedeira Bacterial

O plasmído de expressão pOUR-P-AN-ks-1, foi introduzido no E. coli da composição W3110F. As células bacteriais foram preparadas para a transformação do crescimento envolvido para a fase meia-longa no caldo Luria (LB)j sendo as células colhidas por centrifugação, lavadas em água fria, e suspensas em 10% de glicerol, em água, em uma concentração de aproximadamente 3 χ 1010 células por ml. As células foram armazenadas em alíquotas, à 70° C. O DNA plasmídeo foi precipitado em etano! e dissolvido em água. As células bacteriais e o DNA plasmídeo foram misturados, e a transformação foi feita pelo método de eletroporação de alta voltagem usando Gene Pulsador Il de BIO-RAD (Trevors et al (1992). A eletro-transformação da bactéria pelo DNA plasmídeo, no Guia para Eletroporação e Eletrofusão (D.C. Chang, B.M. Chassy, J.A. Saunders and A. E. Sowers, eds.), pp. 265-290 Academic Press Inc., San Diego, Hanahan et al (1991) Meth. Enzymol., 204, 63- 113). As células transformadas foram suspensas em média de SOC (2% de triptona ; 0.5 de extrato de levedura, 10 mM de NaC1, 2.5 nM KC1, 10 mM de MgCI2l 10mM de Mg SO4. 20 mM de glicose) incubadas à 37° C, por 1 hora e selecionadas para resistência tetraciclina. Um clone de alta expressão foi então selecionado.

Exemplo 3. Preparação da Uricase Recombinadora

Bactérias como aquela transformada (ver acima) foram cultivadas em uma média contendo glicose, o pH foi mantido em 7.2+0.2, em aproximadamente 37° C. Após 5-6 horas de cultivo, a média foi suplementada com KC1 para uma final concentração de 0.3M. O cultivo foi continuado de maneira a permitir acumulação de uricase. A uricase recombinadora acumulada dentro das células bacteriais para a inclusão dos corpos (IBs). A suspensão da célula foi iavada por centrifugação e suspensa em um isolante 50 mM Tris1 pH 8.0 e 10mM EDTA e trazido para um volume final de aproximadamente 40 vezes o peso da célula seca. A uricase recombinadora contendo IBs, foram isoladas por centrifugação seguindo o rompimento das células bacteriais usando Iisossoma e alta pressão. O tratamento com Iisossoma (2000-3000 unidades/ml) foi feito por 16-20 horas em um pH 8.0 e 7+3° C, enquanto misturava. O grânulo foi lavado com água e armazenado à -20° C até o uso. Os IBs enriquecidos foram ainda processados após suspensão em um isolante ,50 mM NaHCO3, pH 10.3+0.1. A suspensão foi incubada por toda a noite, em temperatura ambiente, para permitir a solubilização da uricase derivada-IB, e subseqüentemente purificada por centrifugação. A uricase foi ainda purificada por várias etapas cromatográficas.

Inicialmente, a cromatografia foi feita em uma Coluna FF Q-Sefarose. O coluna carregada foi lavada com um isolante de bicarbonato contendo 150 mM NaC1, e a uricase foi eluída com o isolante de bicarbonato, contendo 250 mM de NaC1.

Assim, a resina de Xantina-agarose (Sigma) foi usada para remover as menores impurezas da preparação da uricase. O FF Q-Sefarose foi diluído com um isolante de 50 mM de glicina, pH 10.3+0.1, para uma concentração de proteína de aproximadamente 0.25 mg/ml e carregada. A coluna foi lavada com o isolante de bicarbonato, pH de 10.3+0.1 contendo 100 mM de NaC1, e a uricase foi eluída com o mesmo isolante suplementado com 60 μΜ de xantina.

Neste estágio, a uricase foi purificada por cromatografia Q-Sefarose para remover formas agregadas. A pureza de cada preparação de uricase é maior do que 95%, determinada pelo tamanho da exclusão cromatográfica.

Menos do que 0.5% das formas agregadas são detectadas em cada preparação usando uma coluna Superdex 200. A Tabela 3 resume a purificação da uricase do Porco-KSAN do Ins derivado de 25 L do caldo de fermentação. Tabela 3. Purificação da Uricase Porco-KSAN <formula>formula see original document page 23</formula>

Exemplo 4. Características das Uricases Recombinadoras

SDS-PAGE

A análise de SDS-PAGE de uricases variantes altamente purificadas (Figura 4) revelou um melhor distintivo padrão. As amostras foram armazenadas à 4o C, em isolante de carbonato, pH 10.3 por até vários meses. A completa dimensão das variantes, Porco, Porco-KS, e PBC, mostram o acúmudo dos dois maiores produtos de degradação tendo pesos moleculares de aproximadamente 20 e 15 kD. Esta observação sugere que tenha ao menos um única pequena incisão na molécula da sub-unidade da uricase. Um diferente padrão de degradação nos clones diminuídos do terminal de amina e também da uricase do coelho, mas em baixa proporção. O terminal de amina do coelho assemelha-se com o dos clones diminuídos. As seqüências de terminal de amina dos fragmentos da uricase gerada durante a purificação e armazenados foram determinados. Peptídio Seqüencial

As preparações de uricase volumosa seqüencial terminal-N foram feitas usando o método de degradação Edman. Dez ciclos foram realizados. A uricase de Porco Recombinadora (clone do completo tamanho) gerado por uma maior abundâncoia de fragmentos de degradação comparados ao Porco-KS-ΔΝ. Os locais deduzidos da clivagem conduziram os fragmentos da degradação da seguinte maneira:

1) Maior local na posição 168 tendo a seqüência: -- QSG1FEGFI--

2) Menor local na posição 142 tendo a seqüência: -IRNjGPPVI—

As seqüências acima não sugerem nenhuma conhecida ciivagem proteolítica. Todavia, a ciivagem poderá ser alcançada ou pela poteólise ou por alguma reação química. As uricases de amina mutiladas são surpreendentemente mais estáveis do que as uricase de amino não mutiladas. O PBC-ANC também tinha estabilidade similar às outras moléculas ΔΝ e menos do que aquelas PBC de amina não mutiladas. Potência

A atividade da uricase foi medida por um método UV. A taxa da reação enzimática foi determinada pela medição do decréscimo na absorção de 292 nm resultante da oxidação do ácido úrico para alantoína. Uma unidade da atividade é definida pela quantidade da uricase requerida para oxidar um pmole de ácido úrico por minuto, à 25° C, em específicas condições. A potência da uricase é expressada nas unidades da atividade por mg de proteína (U/mg). O coeficiente de extinção de 1mM de ácido úrico em 292 nm é de 12.2 mM"1cm"1. Assim sendo, a oxidação de 1 pmole de ácido úrico por ml da mistura da reação resultou em um decréscimo na absorção de 12.2mA292· A alteração da absorção com tempo (ΔΔ292 por minuto) foi derivada de uma parte linear da curva. A concentração da proteína foi determinada usando um método Bradford modificado (Macart and Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-101). A específica atividade (potência) da uricase foi calculada pela divisão da atividade em U/ml com concentração de proteína em mg/ml. A atividade enzimática resulta de várias uricases recombinadoras que são sumarizadas na Tabela 4. Os resultados das preparações comerciais são incluídas nesta Tabela como valores de referência. Será aparente a partir desses resultados que a mutilação das proteínas uricase não tem qualquer significativo efeito nas sua atividades enzimáticas.

Tabela 4. Sumário dos Parâmetros Cinéticos das Uricases Nativas e Recombinadoras

Uricases Concentração (1) do Estoque (mg/ml) Atividade Específica (U/mg)(2) Km[4) (μηη de Ácido Úrico (U/mg)(2) Kcat151 (1/mun) Recombinante 24/31

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Tabela 4 Notas:

(1) A concentração da proteína foi determinada pela absorção medida em 278 nm, usando um Coeficiente de Extinção de 11.3 par um solução de uricase de 10 mg/ml (Mahler, 1963).

(2) 1 unidade de atividade de uricase é definida como a quantidade de enzima que oxida 1 pmole de ácido úrico para alantoína, por minuto, à 25° C.

(3)Específicos valores de atividade derivada dos mapas/gráficos Lineweaver- Burk, em uma concentração de substato equivalente a 60 μΜ.

(4)Misturas de Reação foram compostas de várias combinações do seguinte estoque de soluções:

100 nM de isolante borato de sódio, pH 9.2

300 μΜ de ácido úrico em 50 mM de isolante de borato de sódio, pH 9.2 1 mg/ml em 50 mM de isolante de borato de sódio, pH 9.2

(5)Kcat foi calculado pela divisão do Vmax (calculado a partir dos mapas/gráficos Lineweaver-Buk pela concentração da uricase na mistura da reação (expressada em equivalentes mol, baseada nos pesos moleculares tetraméricos da uricas)

Exemplo 5. Conjugação da Uricase Com m-PEG (PEGilação) O Porco-KS-ΔΝ foi conjugado usando m-PEG-NPC (monometoxi-poli (glicol- etileno)-carbonato de nitrofenila). As condições resutaram em 2 - 12 filamentos de 5, 10 ou 20 kD PEG por sub-unidade de uricase sendo estabelecido m-PEG- NPG que foi gradualmente adicionado à solução da proteína, Após a adição do PEG ter sido concluída, a mistura da reaçaõ da uricase / m-PEG-NPC foi incubada à 2-8° C por 16-18 horas, até a máxima liberação dos filamentos m- PEG que foram conjugados à uricase. O número de filamentos PEG pelo monômero uricase-PEG foi determinado pela Superose cromatográfica de exclusão tamanho 6 (SEC), usando PEG e padrões uricase. O número de filamentos PEG ligados por sun-unidade foi determinado pela seguinte equação: PEG 3.42 χ Quantidade de PEG em Amostra Injetada (uci)

Filamentos/sub-unidade = Quntidade de proteína na amostra injetada (pg) A concentração de PEG e de metades de amostra de uricase-PEG foi determinada pelo tamanho excluvo cromatográfico (SEC) usando detetores ultravioleta (UV) e índice refratário (RI) harmonizados em séries (comko desenvolvido por Kunitani, et al., 1991). Três curvas de calibragem foram geradas: uma curva de proteína (absorção medida à 220 nm); uma curva de proteína (medida por RI); e uma curva PEG (medida por RI). Dessa forma, as amostras de uricase PEG foram analisadas usando o mesmo sistema. Os valores de pico do resultante UV e Rl das amostras experimentais foram usados para calcular as concentrações da proteína-PEG relativa à curvas de calibragem. O índice de 3.42 é a proporção entre o peso molecular do monômero da uricase (34.192 Daltons) para aquele de 10 kD PEG. O anexado PEG aperfeiçoado da solubilidade da uricase em soluções tendo valores fisiológicos pH. A Tabela 5 provê uma indicação da variação entre lotes do produto uricase PEGiIatada Porco-KS-ΔΝ. Em geral, há uma relação inversa entre o número de filamentos PEG anexados e retidos na atividade específica (SA) da enzima.

Tabela 5. Atividade Enzimática dos Conjugados da Uricase PEQitatada Porco-KS-ΔΝ

<table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table>

A uricase Porco-KS-ΔΝ foi conjugada usando 1000 D e 100.000 D em m-PEG-

NPC como descrito no Exemplo 5. As condições resultantes nos filamentos 1 - 12 de PEG por sub-unidade de uricase foram usados. Após a adição do PEG ser concluída, a mistura da reação da uricase /m-PEG-NPC foi conjugada à uricase. O número de filamentos PEG pelo monômetro uricase-PEG foi determinado como descrito acima. O anexado PEG aperfeiçoado da solubilidade da uricase em soluções tendo valores fisiológicos pH. Exemplo 7. Farmacocinéticos do Porco-KS-ΔΝ Conjugado com PEG Experimentos biológicos foram realizados para determinar a extensão ideal e o tamanho da PEGilação necessária para prover benifício terapêutico. Estudos farmacocinéticos em ratos, usando injeções i.v. de 0.4 mg (2U) por kg do peso do corpo da uricase não modificada, administrada no 1o dia e no 8o dia, permitiram uma circulação meia vida de aproximadamente 10 minutos. Entretanto, estudos na taxa purificadora com uricase com 2-11x1 OkD PEG- Porco-KS-ΔΝ, após mais de 9 semanas de injeções, indicou que a purificação não dependeu do número de filamentos PEG (dentro deste limite de variação) e permanecida relativamente constante através de todo o período de estudo (ver Tanela 6. com uma meia vida de aproximadamente 30 horas). As diferenças semana-a-semana estçao dentros da margem erros experimentais. Esse mesmo padrão é aparente após nove injeções de conjugados uricase 10x5kD de PEG, e 10x20kD de PEG. Os resultados indicaram que a não ser pela extensão da PEGilação da uricase, neste limite, similares efeitos biológicos foram observados no rato modelo.

Tabela 6. Meias-Vidas das Preparações de Uricase PEGiIatada Porco-KS-ΔΝ em Ratos

Extensão da Modificação (Filamentos PEG por Sub-unidade de Uricase) <table>table see original document page 27</column></row><table> <table>table see original document page 28</column></row><table> Tabela 6 Notas: Resultados são indicadosd em horas ± padrão de erro do meio. Números entre parênteses indicam o número de animais testados. Ratos que receberam semanalmente injeções i.v. de 0.4 mg por kilograma do peso do corpo da uricase do Porco-KS-ΔΝ modificada como indicado na Tabela. Cada grupo inicialmente compreendeu 15 ratos, que foram alternativamente combinados em sub-grupos de 5. Vários ratos morreram durante o estudo devido à anestesia. Meias-vidas foram usadas para a medição da atividade da uricase (análise colorimétrica) em amostras de plasma coletadas em 5 minutos, e 6, 24 e 48 horas após a injeção. A Tabela 5 descreve os lotes da uricase PEGiIatada usada no estudo. Estudos de bio-viabilidade com uricase 6x5 kD PEG-Porco-KS- ΔΝ em coelhos indicam que, após a primeira injeção, a circulação meia-vida pe 98.2 + 1.8 horas (i.v.), e a bio-viabilidade após as injeções i.m. (intra-muscular) e s.c. (subcutânea) foi de 71% e 52% respectivamente. Entretanto, significantes padrões de anti-corpos de uricase foram detectados, após a segundas injeções i.m. e s.c., em todos os coelhos, e a pureza foi acelerada seguindo as subseqüentes injeções. Injeções de ratos com o mesmo conjugado resultou em uma meia-vida de 26+1.6 horas (i.v), e a bio-viabilidade após as injeções i.m. e s.c. foram de 33% e 22% respectivamente. Estudos em ratos, com a uricase 9x10 kD Porco-KS-ΔΝ indicam que a circulação meia-vida ap'pos a primeira injeção pe de 24 horas (i.v.) e a bio-viabilidade, appos as injeções i.m. e s.c., foram de 26.1% e 14.9% respectivamente. Similares estudos farmacocinéticos, em coelhos, com uricase 9x10 kP PEG-Porco-KS-ΔΝ indicam que nenhuma aceleração na pureza foi observada seguindo a injeção desse conjugado (4 injeções bi-semanalmente foram administradas). Nesses animais, a circulação meia-vida após a primeira injeção foi de 88.5 horas (i.v.) e a bio-viabilidade, após as injeções i.m. e s.c. foram de 98.3% e 84.4%, respectivamente (ver Figura 6 e Tabela 7). Após a quarta injeção na circulação meia-vida foi de 141.1+ 15.4 horas e a bio-viabilidade, após as injeções i.m. e s.c. foram de 85% e 83% respectivamente. Similares estudos com uricase 9x10 kD PEG-Porco-SK-ΔΝ foram feitos para acessar a bio-viabilidade em cães bigles (2 machos e 2 fêmeas em cada grupo). Uma circulação meia-vida de 70+11.7 horas foi gravada após a primeira injeção i.v., e a bio-viabilidade, após as injeções i.m. e s.c. foram de 69.5% e 50.4%, respectivamente (ver Figura 7 e Tabela 7). Estudos com as preprações 9x10 kD PEG-Porco-KS-ΔΝ foram feitas usando porcos. Três animais por grupo foram usados para administração por via das rotas i.v., s.c., e i.m.. Uma circulação meia-vida de 178+24 horas foi gravada após a primeira injeção, e a bio-viabilidade, após as injeções i.m. e s.c. foram de 71.6% e 76.8%, respectivamente (ver Figura 8 e Tabela 7) .

Tabela 7. Estudos Farmacocinéticos com a Uricase 9x10 kD PEG-Porco-KS- <table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table>

Estudos de absorção, distribuição, metabolismo. E excrecão (ADME) foram feitos

após a iodaçáo da uricase 9x10 kD PEG-Porco-KS-ΔΝ pelo método Bolton & Hunter com 125LO rotulado conjugado foi injetado em 7 grupos de 4 ratos cada (2 machos e 2 fêmeas). A distribuição da radioatividade foi analisada após 1 hora e a cada 24 horas por 7 dias (exceto o 5o dia). Cada grupo, em seu turno, foi sacrificado e os diferentes órgãos foram extirpados e analisados. O sétimo grupo foi mantido em uma gaiola metabólica, na qual a urina e as fezes foram coletadas. A distribuição de todo o material do corpo do animal foi avaliado e medida a radioatividade total em cada órgão e a fração da conta (rim, fígado, pulmão e baço) que foram viabilizados por precipitação com TCA (ou seja, proteína ligada, normalizada ao tamanho do órgão). Dos órgãos que foram extirpados, nenhum tinha uma mais alta radioatividade do que os outros, e dessa forma nenhum significante acúmulo foi visto por exemplo no fígado ou no rim. 70% de radioatividade foi expelida no 7o dia. Exemplo 8. Resultados dos Testes Clínicos

Um grupo de estudo aleatório, multicental, paralelo foi realizado para acessar a resposta do urato, e os perfis farmacocinéticos e seguros da Uricase-PEG (Puricase®, Savient Pharmaceutics), em pacientes humanos com hiperuricemia e severa gota que foram irresponsáveis ou intolerantes na terapia convencional. A média de duração da doença foi de 14 anos e 70 porcento da população de estudo tinha um ou mais tofos. No estudo, 41 pacientes (idade média de 58.1 anos) foram aleatoriamente por 12 semanas de tratamento com uricase-PEG intra-venoisa em regimes de 1 à 4 doses; 4 mg cada duas semanas (7 pacientes);8 mg cada duas semanas (8 pacientes); 8 mg cada quatro semanas (13 pacientes), ou 12 mg cada quatro semanas (13 pacientes). A atividade da uricase plasma e os níveis de urato foram medidos em intevalos definidos. Parâmetros farmacocinéticos, concentração média de urato plasma e a percentagem do tempo que o urato de plasma foi menor ou igual à 6 mg/dL foram derivados a partir das análises das atividades da uricase e níveis de urato. Pacientes que receberam 9 mg de uricase-PEG cada duas semanas tinham maior redução em PUA com níveis inferiores a 5 mg/dL 92 porcento do tempo de tratamento (pré-tratamento médio de 9.1 mg/dL de urato de plasma vs. 1.4 mg/dL de urato de plasma por 12 semanas. Substancias e sustentados níveis baixos de urato de plasma foram também observados nos outros grupos com tratamento de dosagem com uricase-PEG: PUA inferior à 6 mg/dL 86 porcento do tempo de tratamento em 8 mg cada quatro semanas por grupo (pré- tratamento com 9.1 mg/dL de urato de plasma vs. 2.6 mg/dL de urato de plasma por 12 semanas): PUA inferior à 6 mg/ml 84 porcento do tempo de tratamento com 12 mg a cada quatro semanas por grupo (pré-tratamento com 8.5 mg/dL de urato de plasma vs. 2.6 mg/dL de urato de plasma por 12 semanas); e PUA inferior à 6mg/ml 73 porcento do tempo do tratamento com 4 mg a cada duas semanas por grupo (pré-tratamento de 7.6 mg/dL de urato de plasma vs. 4.2 mg/dL de urato de plasma por 12 semanas). O máximo percentual de decréscimo do ácido úrico plasma a partir da linha de base dentro das primeiras 24 horas da dosagem da uricase-PEG foi de 72% para indivíduos recebendo 4 mg/ 2 semanas (p. igual à .0002); 94% para indivíduos recebendo 8 mg/ 2 semanas (p. menos do que .0001); 87% para indivíduos recebendo 8 mg/ 4 semanas (p. menos do que .0001); e 93% para indivíduos recebendo 12 mg/ 4 semanas (p. menos do que .0001). O percentual do decréscimmo do ácido úrico plasma da linha de base em 12 semanas de período de tratamento foi de 38% para indivíduos recebendo 4 mg / 2 semanas (p. igual à .0002); 86% para indivíduos recebendo 8 mg / 2 semanas (p. menos do que .0001); 58% para indivíduos recebendo 8 mg / 4 semanas (p. igual à .0003); e 67% para indivíduos recebendo 12 mg / semanas (p. menos do que .0001). Surpreendentemente, alguns indivíduos recebendo uricase-PEG experimentando uma infusão relativa a evento adverso, ou seja, reação à infusão. Essas reações ocorreram em 14% do total das infusões. Todas as referências aqui citadas são incorporadas à presente invenção, por referência em sua integridade e para todos os propósitos da mesma extensão de cada publicação individual, patente concendida ou pedido de patente que foram especificamente indicadas por referência em sua integridade para as devidas finalidades. Muitas modificações e variações na presente invenção poderão ser feitas sem fugir-se do espírito e escopo da invenção, para um especialista na matéria, conhecedor do estado da técnica ao caso aplicado. As específicas incorporações aqui descritas são oferecidas somente com o caráter exemplificativo, e a invenção somente estará limitada aos termos das reivindicações em anexo. Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência

<110> Savient Pharmaceuticais, Inc. Hartman, Jacob Mendelovitz, Simona

<120> FORMAS VARIANTES DE OXIDASE URATO E USO DO MESMO

<130> 103864-156066

<150> US 60/670,541 <151> 2005-04-11

<160> 16

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Uricase de Fígado de Porco (senso)

<400> 1

gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca 36

<210> 2

<211> 40

<212> dna

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Uricase de Fígado de Porco (antisenso)

<400> 2

gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcagc 40

<210> 3

<211> 35

<212> dna

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Babuíno (d3h) Uricase de Fígado (senso)

<400> 3

gcgcgaattc catggcccac taccataaca actat 35

<210> 4

<211> 40

<212> dna

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Babuíno (d3h) Uricase de Fígado (antisenso)

<400> 4

gcgcccatgg tctagatcac agtcttgaag acaacttcct 40

<210> 5 <211> 36 <212> dna Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Uricase PBC-DeltaNC (senso) <400> 5

gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag 35

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Uricase PBC-DeItaNC (antisenso)

<400> 6

ccgtctagat taagacaact tcctcttgac tgtaccagta atttttccgt atgg 54

<210> 7

<211> 299

<212> prt

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Porcos-KS-DeltaN

<400> 7

Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu vai Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr 1 5 10 15

Gly Lys Asp Met Ile Lys vai Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tvr 20 25 30

His Ser He Lys Glu vai Ala Thr Thr vai Gln Leu Thr Leu ser ser 35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp 50 55 60

Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys 65 70 75 80

Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser ser 85 90 95

Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln vai Tyr vai Glu Glu Val Pro Trp 100 105 110

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly vai Lys His vai His Ala Phe Ile Tyr 115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly 130 135 140

Pro Pro vai Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência 145 150 155 160

Thr Gln ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu 165 170 175

Pro Glu vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln vai Tyr Cys Lys Trp 180 185 190

Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp vai Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr 195 200 205

vai Arg ser lie Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly 210 215 220

Glu Tyr Ser Pro ser vai Gln Lys Thr Leu Tyr Asp lie Gln vai Leu 225 230 235 240

Thr Leu Gly Gln vai Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile ser Leu Pro 245 250 255

Asn He His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn 260 265 270

Lys Glu Glu-val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr 275 280 285

Gly Thr vai Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295

<210> 8 <211> 298 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Pig-KS-DeltaN without starting Met

<400> 8

Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu vai Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly 15 10 15

Lys Asp Met lie Lys vai Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30

Ser lie Lys Glu vai Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser ser Lys 35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp vai Ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60

lie Lys Asn Thr vai Asn vai Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser 65 70 75 80 Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência

lie Glu Thr Phe Ala vai Thr lie Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe 85 90 95

Lys His Val lie Arg Ala Gln vai Tyr vai Glu Glu vai Pro Trp Lys 100 105 110

Arq Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr 115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140

Pro vai He His ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys vai Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160

Gln ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro 165 170 175

Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg 180 185 190

Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr vai 195 200 205

Arg ser lie vai Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220

Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Thr 225 230 235 240

Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile ser Leu Pro Asn 245 250 255

Ile His Tyr Leu Asn lie Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270

Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285

Thr vai Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295

<210> 9

<211> 897

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<2 2 3> Porco -KS-Del taNA

<400> 9

atgacttaca aaaagaatga tgaggtagag tttgtccgaa ctggctatgg gaaggatatg Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência

ataaaagttc tccatattca gcgagatgga aaatatcaca gcattaaaga ggtggcaact 120 acagtgcaac tgactttgag ctccaaaaaa gattacctgc atggagacaa ttcagatgtc 180 atccctacag acaccatcaa gaacacagtt aatgtcctgg cgaagttcaa aggcatcaaa 240 agcatagaaa cttttgctgt gactatctgt gagcatttcc tttcttcctt caagcatgtc 300 atcagagctc aagtctatgt ggaagaagtt ccttggaagc gttttgaaaa gaatggagtt 360 aagcatgtcc atgcatttat ttatactcct actggaacgc acttctgtga ggttgaacag 420 ataaggaatg gacctccagt cattcattct ggaatcaaag acctaaaagt cttgaaaaca 480 acccagtctg gctttgaagg attcatcaag gaccagttca ccaccctccc tgaggtgaag 540 gaccggtgct ttgccaccca agtgtactgc aaatggcgct accaccaggg cagagatgtg 600 gactttgagg ccacctggga cactgttagg agcattgtcc tgcagaaatt tgctgggccc 660 tatgacaaag gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc 720 accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac 780 ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta 840 gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg 897

<210> 10

<211> 894

<212> DNA

<21B> Seqüência Artificial <220>

<223> Pig-KS-DeItaN without starting ATG

<400> 10

acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata 60 aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca 120 gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc 180 cctacagaca ccatcaagaa cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc 240 atagaaactt ttgctgtgac tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc 300 agagctcaag tctatgtgga agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag 360 catgtccatg catttattta tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata 420 aggaatggac ctccagtcat tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc 480 cagtctggct ttgaaggatt catcaaggac cagttcacca ccctccctga ggtgaaggac 540 cggtgctttg ccacccaagt gtactgcaaa tggcgctacc accagggcag agatgtggac 600 tttgaggcca cctgggacac tgttaggagc attgtcctgc agaaatttgc tgggccctat 660 gacaaaggcg agtactcgcc ctctgtccag aagacactct atgacatcca ggtgctcacc 720 ctgggccagg ttcctgagat agaagatatg gaaatcagcc tgccaaatat tcactactta 780 aacatagaca tgtccaaaat gggactgatc aacaaggaag aggtcttgct acctttagac 840 aatccatatg gaaaaattac tggtacagtc aagaggaagt tgtcttcaag actg 894 Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência

<210> 11

<211> 304

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 11

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu vai Glu Phe 15 10 15

vai Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln 20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser lie Lys Glu Val Ala Thr ser vai Gln 35 40 45

Leu Thr Leu ser ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60

Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn vai Leu Ala Lys 65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys ser Ile Glu Thr Phe Ala vai Thr Ile Cys Glu 85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val 100 105 110

Glu Glu vai Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125

His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu vai Glu 130 135 140

Gln lie Arg Asn Gly Pro Pro Val lie His ser Gly lie Lys Asp Leu 145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp 165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln 180 185 190

vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp vai Asp Phe Glu 195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly 210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr ser Pro Ser vai Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Giy Gin vai Pro Giu Iie Giu Asp Met 245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys 260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro 275 280 285

Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr vai Lys Arg Lys Leu Thr ser Arg Leu 290 295 300

<210> 12 <211> 296 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> PBC-DeltaNC

<400> 12

Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe vai Arg Thr Gly Tyr 15 10 15

Gly Lys Asp Met Ile Lys vai Leu His lie Gln Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30

His ser lie Lys Glu vai Ala Thr Thr vai Gln Leu Thr Leu Ser ser 35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp vai Ile Pro Thr Asp 50 55 60

Thr Ile Lys Asn Thr vai Asn vai Leu Ala Lys Phe Lys Gly lie Lys 65 70 75 80

Ser Ile Glu Thr Phe Ala vai Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser 85 90 95

Phe Lys His vai lie Arg Ala Gln vai Tyr vai Glu Glu Val Pro Trp 100 105 110

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly vai Lys His vai His Ala Phe lie Tyr 115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu vai Glu Gln Ile Arg Asn Gly 130 135 140

Pro Pro Val Ile His Ser Gly lie Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr 145 150 155 160

Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu 165 170 175 Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência

Pro Glu vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln vai Tyr Cys Lys Trp 180 185 190

Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp vai Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr 195 200 205

vai Arg ser Ile vai Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly 210 215 220

Glu Tyr Ser Pro Ser vai Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu 225 230 235 240

ser Leu ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile ser Leu Pro 245 250 255

Asn lie His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn 260 265 270

Lys Glu Glu vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr 275 280 285

Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295

<210> 13 <211> 295 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> PBC-DeltaNC without starting Met

<400> 13

Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu vai Glu Phe vai Arg Thr Gly Tyr Gly 15 10 15

Lys Asp Met Ile Lys vai Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His 20 25 30

Ser lie Lys Glu vai Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser ser Lys 35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60

lie Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Il 65 70 75

e Lys Ser 80

lie Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser 85 90 95

Phe Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência Lys His vai Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu vai Pro Trp Lys 100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly vai Lys His vai His Ala Phe Ile Tyr Thr 115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140

Pro vai Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160

Gln ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro 165 170 175

Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg 180 185 190

Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val 195 200 205

Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220

Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu ser 225 230 235 240

Leu Ser Arg vai Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn 245 250 255

lie His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270

Glu Glu vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285

Thr vai Lys Arg Lys Leu Ser 290 295

<210> 14 <211> 13 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> PBC-DeltaNC (Fragmento 44-56 do PBC-DeltaNC)

<400> 14

Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp 15 10

<210> 15 <211> 936 Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência <212> DNA

<213> Papio hamadryas (hamadryas babuíno)

<400> 15 ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180 cctgcatgga gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt 240 cttggcaaag tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta 300 ttttctttct tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg 360 gaagcgtctt gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg 420 aacacacttc tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat 480 caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca 540 gttcaccacc ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg 600 gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct 660 tgtcctggag aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa 720 gaccctctat gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga 780 aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa 840 caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa 900 gaggaagttg tcttcaagac tgtgacattg tggcca 936

<210> 16 <211> 304 <212> PRT

<213> Papio hamadryas (hamadryas babuíno)

<400> 16

Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe 15 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln 20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His ser Ile Lys Glu vai Ala Thr Ser Val Gln 35 40 45

Leu Thr Leu ser ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp 50 55 60

lie lie Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 70 - 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu 85 90 95 Forma variante de Oxidase de Urato e uso do mesmo PCT Listagem de Seqüência Tyr Phe Leu Ser ser Phe Asn His Val lie Arg Ala Gln vai Tyr Val 100 105 110

Glu Glu lie Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140

Gln Leu Arg ser Gly Pro Pro Val Ile Thr ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160

Lys vai Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240

Asp Ile Gln vai Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn lie Asp Met Ser Lys 260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu vai Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300

Claims

REIVINDICAÇÕES:

1. iiURICASE ISOLADA", caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido da posição 8 através da posição 287 de SEQ ID NO. 7.

2. "URICASE", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 8.

3. "URICASE", de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um terminal aminoácido, caracterizada por o terminal aminoácido ser alanina, glicina, serina ou treonina.

4. "URICASE", de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um terminal aminoácido, caracterizada por o ácido do terminal aminoácido ser metionina.

5. "URICASE ISOLADA", caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido da posição 8 através da posição 287 da SEQ ID NO. 12.

6. "URICASE ISOLADA", de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 13.

7. "URICASE ISOLADA", de acordo com a reivindicação 5, compreendendo ainda um terminal aminoácido, caracterizada por o ácido do terminal aminoácido ser alanina, glicina, prolina, serina ou treonina.

8. "URICASE ISOLADA", compreendendo um terminal aminoácido, caracterizada por o ácido do terminal aminoácido ser metionina.

9. "URICASE", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a uricase ser uma uricase PEGilatada.

10. "ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", caracterizado por compreender uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma uricase a partir de um grupo consistindo de: a uricase da reivindicação 1, a uricase da reivindicação 2, a uricase da reivindicação 3, a uricase da reivindicação 5, a uricase da reivindicação 6, e a uricase da reivindicação 7.

11. "ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a seqüência do ácido nucléico ser operativamente ligada a um promotor heterólogo.

12. "ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o promotor ser um promotor osmB.

13. "VETOR DE ÁCIDO NUCLÉICO", caracterizado por compreender o ácido nuciéico da reivindicação 11.

14. "CÉLULA HOSPEDEIRA", caracterizada por compreender o vetor da reivindicação 13.

15. "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE URICASE", caracterizado por compreender as etapas de cultura de uma célula hospedeira da reivindicação 14 sob condições nas quais a seqüência de ácido nuciéico é expressada pela célula hospedeira e isolando a expressa uricase.