CZ2007700A3 - Variantní forma urátoxidázy a její použití - Google Patents
Variantní forma urátoxidázy a její použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2007700A3 CZ2007700A3 CZ20070700A CZ2007700A CZ2007700A3 CZ 2007700 A3 CZ2007700 A3 CZ 2007700A3 CZ 20070700 A CZ20070700 A CZ 20070700A CZ 2007700 A CZ2007700 A CZ 2007700A CZ 2007700 A3 CZ2007700 A3 CZ 2007700A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- uricase
- porcine
- peg
- dna
- baboon
- Prior art date
Links
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 259
- 229940005267 urate oxidase Drugs 0.000 title claims description 5
- 230000001751 uricolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 claims description 18
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 3
- 241000984945 Simona Species 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 14
- 108091006006 PEGylated Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 33
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 31
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 24
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108010068701 Pegloticase Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 8
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 8
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 101150004298 osmB gene Proteins 0.000 description 7
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 229960003592 fexofenadine Drugs 0.000 description 5
- RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N fexofenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C(O)=O)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 RWTNPBWLLIMQHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 5
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 4
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 4
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 4
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- -1 acetominofen Chemical compound 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 2
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 2
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229960000520 diphenhydramine Drugs 0.000 description 2
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 description 1
- NFLLKCVHYJRNRH-UHFFFAOYSA-N 8-chloro-1,3-dimethyl-7H-purine-2,6-dione 2-(diphenylmethyl)oxy-N,N-dimethylethanamine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC(Cl)=N2.C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 NFLLKCVHYJRNRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101000981883 Brevibacillus parabrevis ATP-dependent tryptophan/phenylalanine/tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 101000981889 Brevibacillus parabrevis Linear gramicidin-PCP reductase Proteins 0.000 description 1
- VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N Budesonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(CCC)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O VOVIALXJUBGFJZ-KWVAZRHASA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- ZKLPARSLTMPFCP-UHFFFAOYSA-N Cetirizine Chemical compound C1CN(CCOCC(=O)O)CCN1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZKLPARSLTMPFCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000906861 Chondromyces crocatus ATP-dependent tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 102220483804 High mobility group protein B1_Y97H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAUOIFJMECXRGI-UHFFFAOYSA-N Neoclaritin Chemical compound C=1C(Cl)=CC=C2C=1CCC1=CC=CN=C1C2=C1CCNCC1 JAUOIFJMECXRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ISFHAYSTHMVOJR-UHFFFAOYSA-N Phenindamine Chemical compound C1N(C)CCC(C2=CC=CC=C22)=C1C2C1=CC=CC=C1 ISFHAYSTHMVOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940125715 antihistaminic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000383 azatadine Drugs 0.000 description 1
- SEBMTIQKRHYNIT-UHFFFAOYSA-N azatadine Chemical compound C1CN(C)CCC1=C1C2=NC=CC=C2CCC2=CC=CC=C21 SEBMTIQKRHYNIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229960000725 brompheniramine Drugs 0.000 description 1
- ZDIGNSYAACHWNL-UHFFFAOYSA-N brompheniramine Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(CCN(C)C)C1=CC=C(Br)C=C1 ZDIGNSYAACHWNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004436 budesonide Drugs 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229960000590 celecoxib Drugs 0.000 description 1
- RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N celecoxib Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC(C(F)(F)F)=NN1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960001803 cetirizine Drugs 0.000 description 1
- SOYKEARSMXGVTM-UHFFFAOYSA-N chlorphenamine Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(CCN(C)C)C1=CC=C(Cl)C=C1 SOYKEARSMXGVTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003291 chlorphenamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229960002881 clemastine Drugs 0.000 description 1
- YNNUSGIPVFPVBX-NHCUHLMSSA-N clemastine Chemical compound CN1CCC[C@@H]1CCO[C@@](C)(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YNNUSGIPVFPVBX-NHCUHLMSSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960001140 cyproheptadine Drugs 0.000 description 1
- JJCFRYNCJDLXIK-UHFFFAOYSA-N cyproheptadine Chemical compound C1CN(C)CCC1=C1C2=CC=CC=C2C=CC2=CC=CC=C21 JJCFRYNCJDLXIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 229960001271 desloratadine Drugs 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- SOYKEARSMXGVTM-HNNXBMFYSA-N dexchlorpheniramine Chemical compound C1([C@H](CCN(C)C)C=2N=CC=CC=2)=CC=C(Cl)C=C1 SOYKEARSMXGVTM-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229960001882 dexchlorpheniramine Drugs 0.000 description 1
- 229960004993 dimenhydrinate Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229960005178 doxylamine Drugs 0.000 description 1
- HCFDWZZGGLSKEP-UHFFFAOYSA-N doxylamine Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(C)(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 HCFDWZZGGLSKEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000930 hydroxyzine Drugs 0.000 description 1
- ZQDWXGKKHFNSQK-UHFFFAOYSA-N hydroxyzine Chemical compound C1CN(CCOCCO)CCN1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZQDWXGKKHFNSQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003088 loratadine Drugs 0.000 description 1
- JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N loratadine Chemical compound C1CN(C(=O)OCC)CCC1=C1C2=NC=CC=C2CCC2=CC(Cl)=CC=C21 JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OKXGHXHZNCJMSV-UHFFFAOYSA-N nitro phenyl carbonate Chemical compound [O-][N+](=O)OC(=O)OC1=CC=CC=C1 OKXGHXHZNCJMSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960003534 phenindamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 description 1
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 150000007971 urates Chemical class 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229960002004 valdecoxib Drugs 0.000 description 1
- LNPDTQAFDNKSHK-UHFFFAOYSA-N valdecoxib Chemical compound CC=1ON=C(C=2C=CC=CC=2)C=1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 LNPDTQAFDNKSHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
- C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
- C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Rešení se týká geneticky modifikovaných proteinu s urikolytickou aktivitou. Konkrétne se též týká proteinu zahrnujících zkrácené urátoxidázy a zpusobu jejich prípravy, vcetne PEGylovaných proteinu zahrnujících zkrácené urátoxidázy.
Description
(57) Anotace:
Řešení se týká geneticky modifikovaných proteinů s urikolytickou aktivitou. Konkrétně se též týká proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy a způsobů jejich přípravy, včetně PEGylovaných proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy.
CZ 2007 - 700 A3 • · · ·
Variantní forma urátoxidázy a její použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká geneticky modifikovaných proteinů s urikolytickou aktivitou. Konkrétně se vynález týká proteinů zahrnujících zkrácené urátoxidázy a způsobů jejich přípravy.
Dosavadní stav techniky
Výrazy urátoxidáza a urikáza se zde používají zaměnitelně. Urátoxidázy (urikázy, E.C. 1.7.3.3) jsou enzymy, které katalyzují oxidaci kyseliny močové na rozpustnější produkt alantoin, což je purinový metabolit, který je snadněji vylučován. Kvůli několika mutacím v genu pro urikázu, získaným během evoluce vyšších primátů, lidé enzymově aktivní urikázu neprodukují. Wu, X et al., (1992) J.Mol.Evol 34:78-84, úplné zněm je zde začleněno formou odkazu. V důsledku toho mohou nadměrné koncentrace kyseliny močové v krvi (hyperurikémie) vést u náchylných jedinců k bolestivé artritidě (dna), znetvořujícímu ukládání urátu (tofus) a selhání ledvin. Dostupné léky, např. allopurinol (inhibitor syntézy kyseliny močové) u některých postižených jedinců vyvolávají vedlejší účinky, které léčbu limitují, nebo dostatečně tyto chorobné stavy nezmírňují. Hande, KR et al:, (1984) AmJ.Med 76:4756, Fam, AG, (1990) Baillierďs Clin Rheumatol 4:177-192, úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu. Injekce urikázy mohou hyperurikémii a hyperurikosurii alespoň přechodně snížit. Jelikož urikáza je pro člověka cizí protein, již první injekce nemodifikovaného proteinu z Aspergillus flavus vyvolala u několika procent léčených pacientů anafylaktické reakce (Pui, C-H et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816, úplné znění je zde začleněno formou odkazu), a imunologické odpovědi její využitelnost pro chronickou nebo periodickou léčbu limitují. Donadio, D et al., (1981) Noův Presse Med 10:711-712, Leaustic, M et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, úplné znění obou prací je zde začleněno formou odkazu.
Předkládaný vynález se týká mutantmch rekombinantmch urikázových proteinů, které jsou zkrácené a mají zvýšenou strukturální stabilitu.
··· · ·· · ······ • · · · · ·
Λ ········ · · · · · · ··· · ······· ··
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nové rekombinantní urikázové proteiny. Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou zkrácené a mají mutované aminokyseliny ve srovnám s přirozeně se vyskytujícími urikázové proteiny.
Vynález poskytuje mutantní rekombinantní urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 8. Vynález dále poskytuje mutantní rekombinantní urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 13.
Předkládaný vynález dále poskytuje prostředek pro metabolizaci kyseliny močové, kde je zahrnut nový rekombinantní urikázový protein s urikolytickou aktivitou. Urikolytická aktivita se zde používá v souvislosti s označením enzymové konverze kyseliny močové na alantoin.
V dalším provedení urikáza obsahuje v polohách 8 až 287 aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7 nebo SEQ ID č. 12. Vynález dále poskytuje urikázy obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 8 nebo SEQ ID č. 13. V jednom provedení urikáza obsahuje na aminovém konci aminokyselinu, kterou je alanin, glycin, prolin, serin nebo threonin. V konkrétním provedení je na aminovém konci aminokyselina methionin.
Vynález dále poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující sekvenci, která kóduje urikázu podle vynálezu. V konkrétních provedeních je nukleová kyselina kódující urikázu připojená k heterologmmu promotoru, například promotoru osmB. Vynález dále poskytuje vektory obsahující nukleovou kyselinu kódující urikázu, hostitelské buňky obsahující takové vektory a způsoby přípravy urikázy zahrnující kultivaci hostitelské buňky za podmínek, kdy se sekvence nukleových kyselin exprimuje hostitelskou buňkou a exprimovaná urikáza se izoluje.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1 zobrazuje strukturu plasmidu pOUR-P-ON-ks-1. Čísla vedle restrikčmch míst označují polohu nukleotidu vzhledem k místu Haell, označenému jako 1. Restrikční místa, která během klonování mizí, jsou uvedena v závorkách.
Obrázek 2 zobrazuje DNA a odvozené aminokyselinové sekvence urikázy prasečí KSΔΝ (SEQ ID č. 9 a SEQ ID č. 7). Číslování aminokyselin na Obrázku 2 se vztahuje k úplné sekvenci prasečí urikázy. V sekvenci prasečí urikázy za iniciačním methioninovým zbytkem nahrazuje aspartamovou kyselinu v poloze 7 threonin. Vyznačená jsou restrikční místa, která • · · · se používají pro různé kroky subklonování. 3'-Netranslatované sekvence jsou označené malými písmeny. Hvězdička označuje stop kodon translace.
Obrázek 3 ukazuje relativní uspořádám odvozených aminokyselinových sekvencí různých rekombinantmch sekvencí prasečí urikázy (SEQ ID č. 11), PBC-ANC (SEQ ID č. 12) a prasečí KS-ΔΝ (SEQ ID č. 7). Hvězdička označuje polohy, ve kterých jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s publikovanou sekvencí prasečí urikázy, kroužky označují polohy, ve kterých jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s PBC-ΔΝ. Čárkovaně jsou vyznačené delece aminokyselin.
Obrázek 4 zobrazuje SDS-PAGE prasečí urikázy a velmi čistých variant urikázy připravených podle příkladů 1 až 3. Pro každý vzorek je vyznačeno datum přípravy (měsíc/rok) a odpovídající číslo pásu, viz následující klíč. Na ose Y je vyznačená molekulová hmotnost pomocí markérů a nahoře na obrázku jsou vyznačená čísla pásů. Pás 1 - markéry molekulové hmotnosti, Pás 2 - prasečí KS-AN (7/98), Pás 3 - prasečí (9/98), Pás 4 - prasečí KS (6/99), Pás 5 - prasečí KS (6/99), Pás 6 - prasečí-AN (6/99), Pás 7 - prasečí KS-AN (7/99), Pás 8 - prasečí KS-AN (8/99).
Obrázek 5 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9x10 kDa) prasečí KSAN urikázy na krysách následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci, stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnám s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafů.
Obrázek 6 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9x ÍOkDa) prasečí KSAN urikázy u králíků následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci, stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.
Obrázek 7 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9xÍOkDa) prasečí KS-AN urikázy u psů následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnání s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.
Obrázek 8 zobrazuje farmakokinetické profily PEGylované (9xlOkDa) prasečí KS-ΔΝ urikázy u prasat následně po IM (intramuskulámí), SC (podkožní) a IV (intravenózní) injekci stanovené sledováním enzymové aktivity v krevních vzorcích. Urikázová aktivita ve vzorcích plazmy, odebraných ve vyznačených časových úsecích, je stanovena s pomocí kolorimetrické analýzy. Hodnoty aktivity (mAU = jednotky miliabsorbance) představují rychlost enzymatické reakce v 1 μΐ vzorku plazmy. Biodostupnost (množství léku v oběhu ve srovnám s IV injekcí) IV aplikované urikázy byla spočítaná z plochy pod křivkou v grafu.
Detailní popis vynálezu
Předchozí studie uvádějí, že pokud podstatný pokles imunogenity a/nebo antigenity urikázy je dosažen pomocí PEGylace, je to vždy spojeno se značnou ztrátou urikolytické aktivity. Negativním dopadem bezpečnosti, výhodnosti a rentability bioléčiv je vždy pokles jejich síly a výsledná potřeba zvýšit podávanou dávku. Proto jsou zapotřebí bezpečné účinné alternativní způsoby pro snížení zvýšených hladin kyseliny močové v tělesných tekutinách včetně krve. Předkládaný vynález poskytuje mutantm rekombinantní urikázu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7, SEQ ID č.8, SEQ ID č. 12 nebo SEQ ID č. 13.
Pokud není stanoveno jinak, zde používaná urikáza zahrnuje jednotlivé podjednotky i tetramer.
V konkrétním provedení urikáza obsahuje na aminovém konci methionin. Tento methionin lze odstranit posttranslačm modifikací. V konkrétních provedeních se methionin na aminovém konci odstraní po přípravě urikázy. V konkrétním provedení se methionin odstraní endogenní bakteriální aminopeptidázou. Předposlední aminokyselina umožňuje odstranění Nkoncového methioninu bakteriální methionin-aminopeptidázou (MAP). Aminokyselinami umožňujícími co nejúplnější odstranění N-koncového methioninu jsou alanin, glycin, prolin, serin a threonin. V konkrétním provedení urikáza na aminové konci obsahuje dvě aminokyseliny, kterými jsou methionin následovaný aminokyselinou vybranou ze skupiny skládající se z alaninu, glycinu, prolinu, šeřinu a threoninu.
Vynález poskytuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu.
Vynález poskytuje vektor obsahující sekvenci nukleových kyselin.
V konkrétním provedení se urikáza izoluje. V dalším provedení se urikáza čistí. V dalších provedeních se urikáza izoluje a čistí.
Vynález poskytuje hostitelskou buňku obsahující vektor, který obsahuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu.
Vynález poskytuje způsob přípravy sekvence nukleových kyselin kódující urikázu, kdy se sekvence nukleových kyselin kódující urikázu modifikuje pomocí techniky PCR (polymerázová řetězová reakce). Odborník v oboru ví, že požadovaná sekvence nukleových kyselin se připravuje pomocí PCR přes syntetické oligonukleotidové primery, které jsou komplementární k oblastem cílové DNA (jeden pro každé vlákno), které mají být amplifikovány. Primery se přidávají k cílové DNA (nemusí být čištěná), v přítomnosti nadbytku deoxynukleotidů a Taq polymerázy, tepelně stálé DNA polymerázy. V sérii teplotních cyklů (typicky 30) se cílová DNA opakovaně denaturuje (při 90 °C), aneluje k primerům (typicky při 50-60 °C) a dceřiné vlákno se prodlužuje od primerů (72 °C). Dceřiná vlákna sama o sobě působí jako templáty pro následné cykly, a tak jsou DNA fragmenty odpovídající oběma primerům amplifikované spíše exponenciálně než lineárně.
Vynález poskytuje způsob přípravy mutantní rekombinantní urikázy, kdy se hostitelská buňka transfektuje vektorem, přičemž hostitelská buňka exprimuje urikázu, mutantní rekombinantní urikáza se izoluje z hostitelské buňky, čištěná mutantní rekombinantní urikáza se izoluje s použitím chromatografických technik a mutantní rekombinantní urikáza se čistí. Urikázu lze připravit způsoby popsanými například v mezinárodní patentové publikaci č. WO 00/08196 a US přihlášce č. 60/095 489, jejichž úplné zněm je zde začleněno formou odkazu.
Ve výhodném provedení se hostitelská buňka upraví tak, aby exprimovala mutantní rekombinantní urikázu. Odborník v oboru ví, že transfekce buněk vektorem se obvykle provádí s použitím DNA vy srážené vápenatými ionty, ačkoliv mohou být použité i jiné metody (např. elektroporace).
Urikázu lze izolovat a/nebo čistit libovolným způsobem známým odborníkům v oboru. Exprimované polypeptidy podle vynálezu jsou obecně izolované v podstatě v čisté formě. Výhodně jsou polypeptidy izolované v čistotě nejméně 80 % hmotnostních, výhodněji v čistotě nejméně 95 % hmotnostních a nejvýhodněji v čistotě nejméně 99 % hmotnostních. Čištění se obecně provádí s použitím standardních technik, například frakcionace síranem amonným, SDS-PAGE elektroforézou a afínitm chromatografií. Urikáza se výhodně izoluje s použitím kationtového surfaktantu, například cetylpyridinium-chloridu (CPC), způsobem popsaným v kopendující US patentové přihlášce podané 11. dubna 2005 pod číslem 60/670,520, patentová přihláška č. 103864.146644, s názvem Čištění proteinů kationtovým surfaktantem, jejíž úplné zněm je zde začleněno formou odkazu.
• · • ·
V dalším provedení vynálezu je vektor řízen promotorem citlivým k osmotickému tlaku. Promotor je oblast DNA, ke které se RNA polymerázy vážou před iniciací transkripce DNA na RNA. Promotor citlivý k osmotickému tlaku iniciuje transkripci jako výsledek zvýšeného osmotického tlaku zaznamenaného buňkou.
Urikáza podle vynálezu zahrnuje urikázu, která je konjugovaná s polymerem, například urikázu konjugovanou s polyethylenglykolem, tzn. PEGylovanou urikázu.
V jednom provedení vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující urikázu. V dalším provedení je přípravek roztok urikázy. Ve výhodném provedení je roztok sterilní a vhodný pro injekci. V jednom provedení přípravek obsahuje urikázu ve formě fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem. V dalším provedení vynález poskytuje přípravek ve vialce, výhodně s gumovou injekční zátkou. V konkrétních provedeních přípravek obsahuje urikázu v roztoku o koncentraci 2 až 16 mg urikázy na ml roztoku, 4 až 12 mg/ml nebo 6 až 10 mg/ml. Ve výhodném provedení přípravek obsahuje urikázu o koncentraci 8 mg/ml. Výhodně se množství urikázy měří vzhledem k množství proteinu.
Účinná schémata podávám přípravků podle vynálezu může určit odborník v oboru. Vhodné indikátory pro stanovení účinnosti daného schématu jsou odborníkům v oboru známé. Příklady takových indikátorů zahrnují normalizaci nebo snížení hladiny kyseliny močové v plazmě (PUA) a snížení nebo udržení PUA na hodnotě 6,8 mg/dl nebo nižší, výhodně 6 mg/dl nebo nižší. Ve výhodném provedení má subjekt léčený přípravkem podle vynálezu hodnotu PUA 6 mg/ml nebo nižší alespoň 70 %, alespoň 80 % nebo alespoň 90 % z celkové doby léčení. Například při 24-týdenm léčbě má subjekt výhodně hodnotu PUA 6 mg/ml nebo nižší alespoň po 80 % doby z 24-týdenní léčby, tzn. alespoň po dobu rovnou 134,4 dní (24 týdnů x 7 dní v týdnu x 0,8 = 134,4 dní).
V konkrétních provedeních se podává 0,5 až 24 mg urikázy v roztoku jedenkrát každé 2 až 4 týdny. Urikáza se podává libovolným vhodným způsobem, který odborník v oboru zná, například intravenózně, intramuskulámě nebo podkožně. Při intravenózním podávání se podává 0,5 mg až 12 mg urikázy. Při podkožním podávání se podávají až 24 mg urikázy. Ve výhodném provedení se urikáza podává intravenózní infuzi po dobu 30 až 240 minut. V jednom provedení se podává 8 mg urikázy jednou každé dva týdny. V konkrétních provedeních lze infuzi provádět s použitím 100 až 500 ml fyziologického roztoku. Ve výhodném provedení se podává 8 mg urikázy v roztoku po dobu 120 minut jednou každé dva týdny nebo jednou každé 4 týdny, výhodně se urikáza pro infuzi rozpustí ve 250 ml fyziologického roztoku. V konkrétních provedeních se urikáza podává po dobu léčení 3 měsíce, 6 měsíců, 8 měsíců nebo 12 měsíců. V dalších provedeních je doba léčení 12 týdnů, • · týdnů, 36 týdnů nebo 48 týdnů. V konkrétním provedení je doba léčení prodloužená, např. na 2 roky nebo delší, až po celou dobu života léčeného subjektu. Kromě toho lze použít mnohonásobné doby léčení přerušované obdobím bez léčby, např. 6 měsíců léčby následovaných 3 měsíci bez léčby, následovaných 6 dalšími měsíci léčby, atd.
V některých provedeních mohou být pro odstranění nebo redukování výskytu reakcí na infuzi při podávám urikázy profylakticky podávané protizánětlivé sloučeniny. V jednom provedení se tak podává alespoň jeden kortikosteroid, alespoň jedno antihistaminikum, alespoň jeden NSAID nebo jejich kombinace. Užitečné kortikosteroidy zahrnují betamethason, budesonid, kortison, dexamethason, hydrokortison, methylprednisolon, prednisolon, prednison a triamcinolon. Užitečné NSAID zahrnují ibuprofen, indomethacin, naproxen, aspirin, acetominofen, celecoxib a valdecoxib. Užitečná antihistaminíka zahrnují azatadin, brompheniramin, cetirizin, chlorfeniramin, clemastin, cyproheptadin, desloratadin, dexchlorfeniramin, dimenhydrinat, difenhydramin, doxylamin, fexofenadin, hydroxyzin, loratadin a fenindamin.
Ve výhodném provedení je antihistaminikum fexofenadin, NSAID je acetaminofen a kortikosteroid je hydrokortison a/nebo prednison. Výhodně se kombinace všech tří (není nutno souběžně) podává před vlastní infuzí roztoku s urikázou. Ve výhodném provedení se NSAID a antihistaminikum podávají orálně 1 až 4 hodiny před infuzí urikázy. Vhodná dávka obsahuje 30 až 180 mg, 40 až 150 mg, 50 až 120 mg, 60 až 90 mg, 60 mg, výhodně 60 mg fexofenadinu. Vhodná dávka obsahuje 500 až 1500 mg, 700 až 1200 mg, 800 až 1100 mg, 1000 mg, výhodně 1000 mg acetaminofenu. Vhodná dávka obsahuje 100 až 500 mg, 150 až 300 mg, 200 mg, výhodně 200 mg hydrokortisonu. V jednom provedení není antihistaminikum difenhydramin. V dalším provedení NSAID není acetaminofen. Ve výhodném provedení se 60 mg fexofenadinu podává orálně noc před infuzí urikázy, 60 mg fexofenadinu a 1000 mg acetaminofenu se podává orálně příští ráno a konečně 200 mg hydrokortisonu se podává těsně před infuzí roztoku s urikázou. V jednom provedení se prednison podává den, výhodně večer, před podáním urikázy. Vhodná dávka obsahuje 5 až 50 mg, výhodně 20 mg prednisonu. V některých provedeních se tato profylaktická léčba pro odstranění nebo redukování výskytu reakcí na infuzi používá pro subjekty, které dostávají nebo budou dostávat urikázu, včetně PEGylované urikázy a nePEGylované urikázy. V konkrétních provedeních se tato profylaktická léčba používá pro subjekty, které dostávají nebo budou dostávat terapeutické peptidy jiné než urikáza, přičemž jiné terapeutické peptidy jsou PEGylované nebo nePEGylované.
V jednom provedení vynálezu obsahuje farmaceutický přípravek urikázu konjugovanou s polymerem a modifikovaná urikáza si zachovává urikolytickou aktivitu. Ve výhodném provedení je urikáza PEGylovaná urikáza.
V jednom provedení vynálezu obsahuje farmaceutický přípravek urikázu, která byla modifikovaná konjugací s polymerem a modifikovaná urikáza si zachovává urikolytickou aktivitu. V konkrétním provedení se konjugáty polymer-urikáza připravují způsobem popsaným v mezinárodní patentové publikaci č. WO 01/59078 a U.S. přihlášce č. 5 09/501730, jejichž plné zněm je zde zahrnuto formou odkazu.
V jednom provedení vynálezu je polymer vybrán ze skupiny skládající se z polyethylenglykolu, dextranu, polypropylenglykolu, hydroxypropylmethylcelulózy, karboxymethylcelulózy, polyvinylpyrolidonu a polyvinylalkoholu. Ve výhodném provedení je polymer polyethylenglykol a urikáza je PEGylovaná urikáza.
V provedení vynálezu přípravek obsahuje 2-12 molekul polymeru na každou podjednotku urikázy, výhodně 3 až 10 molekul polymeru na podjednotku urikázy. V dalším provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 100 kDa.
V dalším provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 1 kDa až 50 kDa. Ve výhodném provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost v rozmezí 5 kDa až 20 kDa, 8 kDa až 15 kDa, 10 kDa až 12 kDa, výhodně 10 kDa. Ve výhodném provedení má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost 5 kDa nebo 20 kDa. V obzvláště výhodném provedení vynálezu má každá molekula polymeru molekulovou hmotnost 10 kDa.
V dalším provedení vynálezu je přípravek vhodný pro opakované podávání.
Vynález poskytuje prostředek pro metabolizaci kyseliny močové s použitím urikázy.
Vynález poskytuje použití přípravku s urikázou pro snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině.
V jednom provedení vynálezu se přípravek obsahující urikázu používá pro snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině zahrnující krev.
Vynález dále poskytuje nové molekuly nukleových kyselin kódující urikázu podle vynálezu. Způsoby jejich přípravy jsou odborníkovi v oboru dobře známé. Sekvence nukleových kyselin urikázy mohou být modifikované libovolnou z mnoha strategií známých v oboru (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, laboratorní manuál, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sekvence může být štěpena na příslušných místech restrikční endonukleázou (endonukleázami), případně následuje další enzymatická • · · · modifikace, izolace a ligace in vitro. Při přípravě genu kódujícího urikázu je zapotřebí zajistit, aby modifikovaný gen zůstal uvnitř příslušného čtecího rámce translace, nepřerušený stopsignály translace.
Nukleotidová sekvence kódující urikázový protein může být vložena do příslušného expresního vektoru, tzn. vektoru, který obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující protein. Pro expresi sekvence kódující protein může být použito mnoho různých systémů hostitel-vektor. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na systémy savčích buněk infikovaných virem (např. virus vakcinie, adenovirus, atd.), systémy hmyzích buněk infikovaných virem (např. baculovirus), mikroorganismy, např. kvasinky obsahující vektory kvasinek nebo bakterie transformované bakteriofágovou DNA, plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA. Prvky exprese se u těchto vektorů liší v jejich síle a specifitě. V závislosti na použitém systému hostitel-vektor lze použít libovolný z mnoha vhodných prvků transkripce a translace.
Ke konstruování expresních vektorů obsahujících chimérní gen, který se skládá z příslušných regulačních signálů pro transkripci/translaci a sekvencí kódujících protein, lze použít libovolný způsob známý pro inzerci DNA fragmentů do vektoru. Tyto způsoby mohou zahrnovat in vitro DNA rekombinantní a syntetické techniky a rekombinace in vivo (genetické rekombinace). Exprese sekvence nukleových kyselin kódující urikázový protein může být řízena druhou aminokyselinovou sekvencí, takže urikázový protein je exprimovaný v hostiteli transformovaném molekulou rekombinantm DNA. Exprese urikázy může být řízena libovolným elementem promotor/enhancer, který je v oboru známý. Promotory, které lze použít pro řízem exprese urikázy, zahrnují, ale nejsou omezeny na, oblast SV40 raného promotoru (Bemoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v dlouhé 3'koncové repetici Rous sarkoma viru (Yamamoto et al., (1980, Cell 22:787-797), promotor herpes thymidinkinázy (Wagner et al., (1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), regulátorové sekvence genu metallothioninu (Brinster et al., (1982, Nátuře 296:39-42); prokaryotické expresní vektory, například promotor 3-laktamázy (Villa-Kamaroff et al., (1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), promotor tac (DeBoer et al., (1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25) a promotor osmB. V konkrétních provedeních nukleová kyselina zahrnuje sekvenci nukleových kyselin kódující urikázu operativně připojenou k heterolognímu promotoru.
Jakmile se připraví a izoluje konkrétní molekula rekombinantm DNA obsahující kódující sekvenci nukleových kyselin, lze k její propagaci použít různé způsoby v oboru známé. Jakmile je ustaven vhodný hostitelský systém a vhodné podmínky růstu, mohou být ···· rekombinantaí expresní vektory propagovány a připraveny ve velkém množství. Jak bylo výše vysvětleno, použitelné expresní vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry, např. virus vakcinie nebo adenovirus, hmyzí viry, např. baculovirus, kvasinkové vektory, bakteriofágové vektory (např. lambda) a plasmidové a kosmidové DNA vektory a další.
Kromě toho lze vybrat kmen hostitelské buňky, který moduluje expresi vložených sekvencí nebo modifikuje a požadovaným způsobem genový produkt upravuje. Exprese u určitých promotorů může být zvýšena v přítomnosti některých induktorů, takže lze kontrolovat expresi geneticky zkonstruovaného urikázového proteinu. Různé hostitelské buňky dále mají charakteristické a specifické mechanismy pro translační a posttranslační úpravy a modifikaci proteinů (např. glykosylace, štěpem'). K zajištění požadované modifikace a úpravy exprimovaného cizího proteinu mohou být vybrány vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy. Různé systémy exprese vektor/hostitel mohou různou měrou ovlivnit reakce probíhající při úpravě, například proteolytické štěpem.
V konkrétních provedeních vynálezu se exprese urikázy E. coli výhodně provádí s použitím vektorů obsahujících promotor osmB.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce genu a expresního plasmidu pro expresi urikázy
Rekombinantní prasečí urikáza (urátoxidáza), prasečí KS-ΔΝ (protein prasečí urikázy zkrácený na aminovém konci nahrazující aminokyseliny v poloze 291 a 301 lysinem a serinem) byla exprimovaná na E. coli, K-12 kmen W3110 F-. Byla konstruována série plasmidů s výslednou pOUR-P-AN-ks-l, která po transformaci hostitelské buňky E. coli byla schopna řídit účinnou expresi urikázy.
Izolace a subklonování urikázy cDNA z prasečích a paviáních jater
Z prasečích a paviáních jater byly izolací a subklonováním relevantní RNA připraveny urikázové cDNA. Z prasečích a paviáních jater byla extrahována veškerá buněčná RNA (viz Erlich, H. A. (1989), PCR Technologie, principy a aplikace pro DNA amplifikaci, Sambrook, J. et al. (1989), Molekulární klonování: Laboratorní manuál, 2. vydání, Ausubel, F. M. et al. (1998), Současné protokoly v molekulární biologii), poté se provedla reverzní transkripce s ··«· ······· li · · · · · ··· · ······· · · použitím First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech). PCR amplifikace byla provedena s použitím Taq DNA polymerázy (Gibco BRL, Life Technologies).
V Tabulce l jsou uvedeny syntetické oligonukleotidové primery použité pro PCR amplifikaci prasečí a paviání urátoxidázy (urikázy).
Tabulka l. Primery pro PCR Amplifikaci Urikázy cDNA
| Prasečí jatemí urikáza | |
| sensní (SEQ ID č. I) | 5’ gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA 3' |
| anti-sensní (SEQ ID č. 2) | 5' gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3' |
| Paviání (D3H) jatemí urikáza | |
| sensní (SEQ ID č. 3) | 5' gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3' |
| anti-sensní (SEQ ID č. 4) | 5' gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3' |
Sekvence restrikčmch enzymů, zavedené na konce primerů a v Tabulce l označené malými písmeny, byly sensní EcoRI a Ncol (prasečí a paviání) a anti-sensní Ncol, HindlII 5 a Xbal (prasečí), Xbal a Ncol (paviání). U paviáního sensního primeru byl třetí kodon GAC (aspartamová kyselina), přítomný v paviání urikáze, nahrazen kodonem CAC (histidin), který je v této poloze přítomný v kódující sekvenci pseudogenu lidské urátoxidázy. Rekombinantní konstrukt paviání urikázy generovaný s použitím těchto primerů je nazván D3H Paviání urikáza.
PCR produkt prasečí urikázy byl natráven EcoRI a HindlII a klonování do pUC 18 za vzniku pUC 18 - Prasečí urikáza. PCR produkt D3H paviání urikázy byl nakloňován přímo do vektoru pCRTMII, použil se TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), za vzniku paviání urikázy pCR™II -D3H.
Pro transformaci kmene E. coli XLI-Blue (Stratagene, La Jolla, CA) byly použity ligované cDNA. Byla připravena plasmidová DNA obsahující klonovanou cDNA urikázu a byly selektovány a izolovány klony, které obsahují kódující sekvence DNA publikované urikázy (s výjimkou substituce D3H v paviání urikáze, viz Tabulka l). Ve vybraném klonu paviání urikázy pCR™II - D3H byly, v důsledku delece sekvencí zavedených PCR, sekvence pCR™II vedle stop-kodonu urikázy. V důsledku toho byla z 3 '-netranslatované oblasti • ·· · • · ··· · eliminována restrikční místa Xbal a Ncol, což na 5 '-konci produktu PCR umožnilo poziční klonování s použitím Ncol a BamHI, který je odvozený od vektoru pCR™II.
Subklonování urikázové cDNA do expresních vektorů pET
Subklonovám paviání urikázy
Do expresního vektoru pET-3d (Novagen, Madison, WI) byla zavedena D3H paviání cDNA obsahující celou kódující sekvenci urikázy. pCR™II - D3H paviání urikáza byla natrávena Ncol a BamHI a izoloval se fragment 960 bp. Expresní plasmid pET-3d byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se fragment 4600 bp. Ligací těchto dvou fragmentů byla vytvořena paviání pET-3d-D3H.
Subklonování chimémí urikázy prase-pavián
Pro získání vyšší exprese, stability a aktivity rekombinantního genu byla konstruována chimémí urikáza prase-pavián (PBC). PBC byla konstruována izolováním 4936 bp fragmentu Ncol-Apal z klonu paviání pET-3d-D3H a ligací izolovaného fragmentu s 624 bp fragmentem Ncol-Apal izolovaným z pUC 18 prasečí urikázy, čímž se vytvoří pET-3d-PBC. Urikázová PBC cDNA se skládá z kodonů 1-225 prasečí urikázy spojených do rámce s kodony 226-304 paviání urikázy.
Subklonování prasečí KS urikázy
Pro vložení jednoho lysinového zbytku, který může poskytnout další místo pro PEGylaci, byla konstruována prasečí KS urikáza. KS znamená vložení aminokyseliny lysinu do prasečí urikázy v poloze 291, namísto argininu (R291K). Navíc byl threonin v poloze 301 nahrazen šermem (T301 S). Plasmid prasečí KS urikázy byl konstruován izolováním 4696 bp Ncol-Ndel fragmentu paviání pET-3d-D3H a následnou ligací s 864 bp Ncol-Ndel fragmentem izolovaným z prasečí urikázy pUC18, za vzniku pET-3d prasečí KS. Výsledná sekvence prasečí KS urikázy se skládá z kodonů 1-288 prasečí urikázy spojených do rámce s kodony 289-304 paviání urikázy.
Subklonování urikázové sekvence regulované promotorem osmB
Gen urikázy byl subklonován do expresního vektoru obsahujícího promotor osmB (podle postupu z US patentu č. 5 795 776, jehož plné zněm je zde zahrnuto formou odkazu). Tento vektor umožňuje indukci exprese proteinu jako odpověď na vysoký osmotický tlak nebo stárnutí kultury. Expresní plasmid pMFOA-18 obsahoval promotor osmB, sekvenci pro • ·· >
• · · · · · • ···· ·· ♦ • · · · · · • · · ·«··· • · · · · · • ····*·· ·· · místo navázání rybozomu (rbs) a sekvenci pro terminátor transkripce (ter). Dodává rezistenci na ampicilin (AmpR) a exprimuje rekombinantní lidskou acetylcholinu-esterázu (AChE).
Subklonovám paviání D3H urikázy
Plasmid pMFOA-18 byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se velký fragment. Konstrukt paviání pET-3d-D3H byl natráven Ncol a BamHI a izoloval se 960 bp fragment obsahující gen D3H paviání urikázy. Tyto dva fragmenty byly ligovány za vytvoření pMFOU18.
Expresní plasmid pMFXT133 obsahuje promotor osmB, rbs (deo operon E. coli), ter (TrypA E. coli), rekombinantní polypeptidový inhibitor faktoru Xa (Fxal) a dodává gen rezistence na tetracyklin (TetR). Kvůli změně genů rezistence na antibiotika byl do tohoto plasmidu vložen gen paviání urikázy. Plasmid pMFOU18 byl natráven Ncol, vyplněn, poté natráven Xhol a izoloval se fragment 1030 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn, poté natráven Xhol a izoloval se velký fragment. Tyto dva fragmenty byly ligovány pro vytvoření expresního vektoru paviání urikázy pURBAló.
Subklonování chimémí urikázy prase-pavián
Plasmid pURBAló byl natráven Apal a AIwNI a izoloval se fragment 2320 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn, poté natráven AIwNI a izoloval se fragment 620 bp. Konstrukt pET-3d-PBC byl natráven Xbal, vyplněn, poté natráven Apal a izoloval se fragment 710 bp. Tyto tři fragmenty byly ligovány pro vytvoření pUR-PB, plasmidu exprimujícího PBC urikázu pod kontrolou promotoru osmB a rbs i T7 rbs, který byl odvozen z vektoru pET-3d.
V dalším kroku byl T7 rbs odstraněn. pUR-PB byl natráven Ncol, vyplněn, poté digestován AIwNI a izoloval se fragment 3000 bp. Plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel, vyplněn a poté natráven AIwNI a izoloval se fragment 620 bp. Tyto dva fragmenty byly ligovány za vzniku pDUR-PB, který exprimuje PBC pod kontrolou promotoru osmB.
Konstrukce pOUR-PB-ANC
Do urikázy cDNA bylo zavedeno několik změn, které vedly k podstatnému nárůstu stability rekombinantního enzymu. Byl konstruován plasmid pOUR-PBC-ANC, u kterého byly odstraněny N-koncový maturovaný peptid se šesti zbytky a tripeptid na C-konci, které působí in vivo jako peroxyzomálm cílový signál. Toto se provedlo s použitím PCR • *· « »« ··* 9 amplifikace PBC sekvence z plasmidu pDUR-PB a specifických oligonukleotidových primerů uvedených v Tabulce 2.
Tabulka 2. Primery pro PCR amplifikaci urikázy PBC-ANC
Zvýrazněné sekvence restrikčních enzymů zavedené na konce primerů nekódující oblasti jsou v Tabulce 2 označené malými písmeny. Ndel je sensní a Xbal je antisensm. Antisensní primer byl použit také pro eliminaci vnitřního místa restrikce Ndel zavedením bodové mutace (podtržené), která neovlivňuje aminokyselinovou sekvenci, a tak usnadňuje subklonování s použitím Ndel.
Fragment 900 bp (base-pair, spárovaných baží), generovaný PCR amplifikaci pDURPB, byl štěpen Ndel a Xbal a izolován. Získaný fragment byl poté vložen do deo-expresního plasmidu pDBAST-RAT-N, který obsahuje deo-PlP2 promotor a rbs odvozený z E. coli a konstitutivně exprimuje lidský rekombinantní prekurzor insulinu. Plasmid byl natráven Ndel a Xbal, fragment 4035 bp se izoloval a ligo val do PCR produktu PBC urikázy. Výsledný konstrukt pDUR-PB-ANC byl použit pro transformaci E. coli K 12 So733 (F- cytR strA), který exprimoval vyšší hladinu aktivní zkrácené urikázy.
Také dvojitě zkrácené sekvence PBC-ANC byly exprimované pod kontrolou promotoru osmB. Plasmid pDUR-PB-ANC byl natráven AlwNI - Ndel a izoloval se fragment 3459 bp. Výše popsaný plasmid pMFXT133 byl natráven Ndel AlwNI a izoloval se fragment 660 bp. Fragmenty byly poté ligované pro vytvoření pOUR PB-ANC, který byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F’ a exprimoval vyšší hladinu aktivní zkrácené urikázy.
• ···· « ·· toto ♦··· to* · ··<··· to • · · · · « · r to·»······ ·· · · to to · ··· · ··· ···· ·· ·
Konstrukce expresního plasmidu urikázy pOUR-P-AN-ks-l
Tento plasmid byl konstruován pro vylepšení aktivity a stability rekombinantního enzymu. Prasečí urikáza KS-ΔΝ byla zkrácená pouze na N-konci (ΔΝ), kde byl odstraněn Nkoncový maturovaný peptid se šesti zbytky, a obsahovala mutace S46T, R291K a T301S. V poloze 46 byl kvůli konzervativní mutaci, ke které došlo během PCR amplifikace a klonování, namísto šeřinu zbytek threoninový. Lysin v poloze 291 nahradil arginin a v poloze 301 byl namísto threoninu vložen serin. Obě záměny byly odvozené ze sekvence paviání urikázy. Modifikace R291 K a T301 S jsou označené KS a diskutované výše. Extra lysinový zbytek poskytl další místo pro potenciální PEGylaci.
Pro konstrukci pOUR-P-AN-ks-l (Obrázek 1) byl plasmid pOUR-PB-ANC natráven Apal - Xbal a izoloval se fragment 3873 bp. Plasmid pET-3d-PKS (konstrukce uvedena na Obrázku 4) byl natráven Apal - Spěl a izoloval se fragment 270 bp. Štěpení Spěl zanechalo extenzi 5' CTAG, která byla účinně ligovaná s fragmenty DNA generovanými Xbal. Tyto dva fragmenty byly ligovány pro vytvoření pOUR-P-ON-ks-1. Po ligaci zanikla místa rekognice Spěl a Xbal (jejich umístění je na Obrázku 9 uvedeno v závorkách). Konstrukt pOUR-P-ANks-1 byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F’, prototrofní, ATCC # 27325. Výsledná prasečí urikáza KS-ΔΝ, exprimovaná pod kontrolou promotoru osmB, poskytla vysoké hladiny rekombinantního enzymu s vyšší aktivitou a stabilitou.
Obrázek 1 ukazuje strukturu plasmidu pOUR-P-AN-ks-l. Čísla u restrikčmch míst ukazují polohu nukleotidu vzhledem k místu Haell, označenému jako 1. Restrikční místa, která zanikla během klonování, jsou uvedena v závorkách. Plasmid pOUR-P-AN-ks-l, kódující prasečí urikázu KS-ΔΝ, je dlouhý 4143 párů baží (bp) a zahrnuje následující prvky:
1. fragment DNA o délce 113 bp, sahající od nukleotidu číslo 1 do místa Ndel (v poloze 113), který zahrnuje promotor osmB a vazebné místo pro ribozom (rbs).
2. Fragment DNA o délce 932 bp, sahající od Ndel (v poloze 113) do spojky Spel/Xbal (v poloze 1045), který zahrnuje: kódující oblast 900 bp prasečí KS-ΔΝ (sekvence nukleových kyselin proteinu prasečí urikázy zkráceného na aminovém konci, kde jsou aminokyseliny v poloze 291 a 301 nahrazeny lysinem a serinem) a 32 bp boční sekvenci odvozenou z pCR™ II, od místa klonování TA v protisměru do místa restrikce Spel/Xbal.
3. 25 bp sekvenci místa vícečetného klonování (MCS) od spojky Spel/Xbal (v poloze 1045) do HindlII (v poloze 1070).
4. Syntetický 40 bp oligonukleotid obsahující TrpA terminátor transkripce (ter) s konci HindlII (v poloze 1070) a AatlI (v poloze 1110).
• ·
5. Fragment DNA o délce 1519 bp, sahající z místa AatlI (v poloze 1110) do MscI/Scal (v poloze 2629) na pBR322, který obsahuje gen rezistence na tetracyklin (TetR).
6. Fragment DNA o délce 1514 bp, sahající z místa Scal (v poloze 2629) do Haell (v poloze 4143) na pBR322, který obsahuje počátek replikace DNA.
Obrázek 2 ukazuje DNA a odvozené aminokyselinové sekvence prasečí urikázy KSΔΝ. V tomto obrázku je číslování aminokyselin provedeno podle úplné sekvence prasečí urikázy. Za iniciačním methioninovým zbytkem byl namísto kyseliny aspartamové ze sekvence prasečí urikázy vložen threonin. Tento threoninový zbytek umožňuje odstranění methioninu bakteriální aminopeptidázou. Mezera v aminokyselinové sekvenci ukazuje odstraněný N-koncový maturovaný peptid. Vyznačená jsou restrikční místa, která byla použitá pro různé kroky subklonování různých sekvencí urikázy (Apal, Ndel, BamHI, EcoRI a Spěl). 3 '-Netranslatovaná sekvence, označená malými písmeny, byla odvozena ze sekvence pCR™II. Hvězdička označuje stop kodon translace.
Obrázek 3 ukazuje uspořádání aminokyselinových sekvencí různých rekombinantních sekvencí urikázy. Vrchní řada představuje prasečí urikázu s úplnou aminokyselinovou sekvencí. Druhá řádka je sekvence dvojitě zkrácené prasečí-pavián chimémí urikázy (PBCANC). Třetí řádka ukazuje sekvenci prasečí urikázy KS-ΔΝ, která je zkrácená pouze na Nkonci a obsahuje mutace S46T a změny aminokyselin R291 K a T301 S, obě reflektující paviání původ karboxylového konce sekvence kódující urikázu. Hvězdička označuje polohy, kde jsou rozdíly v aminokyselinách u prasečí KS-ΔΝ ve srovnám s publikovanou sekvencí prasečí urikázy, kroužky označují polohy, kde jsou rozdíly v aminokyselinách v prasečí KSΔΝ ve srovnání s prasečí-paviám chimérou PBC-ΔΝ, a čárkovaně jsou vyznačené delece aminokyselin.
Pro klonování do E. coli byly konstruovány cDNA nativní urikázy, paviání, prasečí a králičí, s mutací Y97H a prasečí-paviání chiméra (PBC). Byly konstruovány klony exprimující vysoké hladiny urikázových variant a vybrány všechny E. coli W3110 F’, u kterých je exprese regulovaná osmB. Izolovaly se plasmidové DNA, ověřily DNA sekvenční analýzou pomocí restrikčmch enzymů a kultivovaly se buňky.
Konstrukce zkrácené urikázy, včetně prasečí-ΔΝ a prasečí KS-ΔΝ, byla provedena křížovou ligací mezi PBC-ANC a prasečí KS, následným štěpením restrikčními endonukleázami Apal a Xbal a Apal plus Spěl. Lze odůvodněně předpokládat, že si tyto zkrácené mutanty zachovají svou aktivitu, neboť šest N-koncových zbytků, „maturovaný peptid“ (1-2) a C-koncový tripeptid, „peroxyzomální cílový signál“ (3-5), nemají funkce, • ·· ·
které by podstatně ovlivnily enzymovou aktivitu, a že tyto sekvence budou imunogenní. Vybraly se klony exprimující velmi vysoké hladiny variantních urikáz.
Příklad 2
Transformace expresního plasmidu do bakteriální hostitelské buňky A
Expresní plasmid pOUR-P-AN-ks-l byl zaveden do E. coli K-12 kmene W3110 F'. Bakteriální buňky byly připraveny pro růst spojený s transformací do fáze mid log u Luria broth (LB), poté byly buňky odděleny centriíugací, promyty ve studené vodě, a suspendovány v 10% glycerolu ve vodě o koncentraci 3xlO10 buňky/ml. Buňky byly uchovávané v alikvotech při -70 °C. Plasmidová DNA byla vysrážena v ethanolu a rozpuštěna ve vodě.
Bakteriální buňky a plasmidová DNA byly smíchány a transformace byla provedena vysokonapěťovou elektroporační metodou s použitím Gene Pulser II z BIO-RAD (Trevors et al (1992). Electrotransformace bakterie plasmidovou DNA, viz Průvodce Elektroporace a Elektrofuze (D.C. Chang, B. M. Chassy, J. A. Saunders a A. E. Sowers, eds.), sír. 265-290, Academie Press lne., San Diego, Hanahan et al (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). Transformované buňky byly suspendované v médiu SOC (2% trypton, 0,5% kvasinkový extrakt, 10 mM NaCl, 2,5mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSC>4, 20 mM glukóza), inkubované 1 hodinu při 37°C, a vytříděné podle rezistence na tetracyklin. Byl vybrán klon s vysokou expresí.
Příklad 3
Příprava rekombinantní urikázy
Bakterie stejného typu jako ty výše popsané transformované byly kultivovány v médiu obsahujícím glukózu, pH bylo udržováno na hodnotě 7,2 ± 0,2, při 37 °C.
Pro posledních 5-6 hodin kultivace byl do média přidán KC1 na konečnou koncentraci 0,3 M. Kultivace pokračovala, aby se umožnila akumulace urikázy.
Rekombinantní urikáza se akumulovala uvnitř bakteriálních buněk jako nerozpustný precipitát podobný inkluzmm tělískům (IBs). Buněčná suspenze byla promytá centriíugací a suspendovaná v 50mM pufru Tris při pH 8,0 a 10 mM EDTA na konečný objem odpovídající 40-násobku suché hmotnosti buněk.
IBs obsahující rekombinantní urikázu byly izolované centrifugací a následným rozrušením bakteriálních buněk s použitím lysozymu a vysokého tlaku. Reakce s lysozymem (2000-3000 jednotek/ml) byla provedena za míchám při pH 8,0 a 7 ± 3° C po dobu 16-20 hodin. Peleta byla promyta vodou a uchovávána při -20 °C až do použití.
Obohacené IBs byly po suspendování dále zpracovávány v 50 mM NaHCOs pufru při pH 10,3 ± 0,1. Kvůli solubilizaci urikázy odvozené od IB byla suspenze přes noc inkubovaná při teplotě místnosti, a následně vyčeřená centrifugací.
Urikáza byla dále čištěná několika chromatografickými kroky. Nejprve byla chromatografie provedena na koloně Q-Sepharose FF. Kolona s látkou byla promyta bikarbonátovým pufrem obsahujícím 150 mM NaCl a urikáza byla eluovaná bikarbonátovým pufirem obsahujícím 250 mM NaCl. Pro odstranění minoritních nečistot z urikázového preparátu byla poté použita xanthin-agarózová pryskyřice (Sigma). Eluát po Q-Sepharose FF byl naředěn 50mM glycinovým pufrem o pH 10,3 ±0,1 na koncentraci proteinu 0,25 mg/ml a nanesen na kolonu. Kolona byla promyta bikarbonátovým pufrem při pH 10,3 ±0,1 obsahujícímlOOmM NaCl a urikáza byla eluovaná stejným pufrem doplněným 60 μΜ xanthinu. V tomto stádiu byla urikáza pro odstranění agregovaných forem přečištěná chromatografií na Q-Sepharose.
Čistota všech urikázových přípravků je vyšší než 95 %, jak bylo stanoveno velikostně vylučující chromatografií. Při použití kolony Superdex 200 bylo ve všech přípravcích detekováno méně než 0,5 % agregovaných forem.
Tabulka 3 podává souhrn čištění prasečí urikázy KSAN z IBs získaných z fermentační půdy 25 L.
Tabulka 3. Čištění prasečí KSAN urikázy
| Krok čištění | Protein (mg) | Aktivita (U) | Specifická aktivita (U/mg) |
| Rozpuštění IB | 12 748 | 47 226 | 3,7 |
| Vyčištěný roztok | 11 045 | 44 858 | 4,1 |
| Q-Sepharose I - hlavní podíl | 7 590 | 32 316 | 4,3 |
| Xanthin-Agaróza - hlavní podíl | 4 860 | 26 361 | 5,4 |
| Q-Sepharose II - hlavní podíl | 4 438 | 22 982 | 5,2 |
| Retentát 30 kDa UF | 4 262 | 27 556 | 6,5 |
Příklad 4
Charakteristiky rekombinantní urikázy
SDS-PAGE
SDS-PAGE analýza vysoce čištěné variantní urikázy (Obrázek 4) odhalila charakteristický profil. Vzorky byly uchovávány při 4 °C v uhličitanovém pufru při pH 10,3 až po dobu několika měsíců. Úplné prasečí, prasečí KS a PBC varianty vykazují akumulaci dvou hlavních degradačních produktů s molekulovou hmotností 20 a 15 kDa. Toto pozorování naznačuje, že alespoň jeden nick štěpí molekulu podjednotky urikázy. Rozdílný degradační profil je detekován u klonů zkrácených na aminovém konci a v nižší míře také u králičí urikázy. N-konec králičí urikázy připomíná N-konec zkrácených klonů. Určeny byly Nkoncové sekvence fragmentů urikázy generovaných během čištění a skladování.
Sekvencování peptidů
Dlouhé urikázové přípravky byly sekvenovány od N-konce s použitím Edmanovy degradace. Provedlo se deset cyklů. Rekombinantní prasečí urikáza (úplný klon) generovala větší množství degradačních fragmentů ve srovnání s prasečí KS-ΔΝ. Byla vyvozena tato místa štěpení vedoucí k degradačním fragmentům:
1) Majoritní místo v poloze 168 se sekvencí:
-QSG i FEGFI--
2) Minoritní místo v poloze 142 se sekvencí:
-IRN I GPPVI—
Výše uvedené sekvence nepřipomínají žádné známé proteolytické štěpení. Přesto ke štěpení mohlo dojít buď proteolýzou, nebo nějakou chemickou reakcí. Urikázy zkrácené na N-konci jsou překvapivě stabilnější než urikázy na N-konci nezkrácené. Také PBC-ANC měla stabilitu podobnou dalším ΔΝ molekulám a nižší než u PBC na N-konci nezkrácené.
Účinnost
Aktivita urikázy byla měřena pomocí UV. Rychlost enzymatické reakce byla určena z měření poklesu absorbance při 292 nm následkem oxidace kyseliny močové na alantoin. Jednotka aktivity je definovaná jako množství urikázy nutné k oxidaci jednoho mikromolu kyseliny močové za minutu při 25 °C při specifikovaných podmínkách. Účinnost urikázy je vyjádřená v jednotkách aktivity na mg proteinu (U/mg).
Extinkční koeficient lmM kyseliny močové při 292 nm je 12,2 mM^cm’1. Proto oxidace 1 mikromolu kyseliny močové na ml reakční směsi vedla k poklesu absorbance 12,2 Π1Α292. Změna v absorbanci s časem (ΔΑ292 za minutu) byla odvozená z lineárního úseku křivky.
Koncentrace proteinu byla stanovena s použitím modifikované Bradfordovy metody (Macart a Gerbaut, (1982) Clin Chim Acta 122, 93-101). Specifická aktivita (účinnost) urikázy byla vypočítaná vydělením aktivity v U/ml koncentrací proteinu v mg/ml. Výsledky enzymové aktivity různých rekombinantních urikáz jsou shrnuty v Tabulce 4. Jako referenční hodnoty jsou v této tabulce použity výsledky u komerčních přípravků. Z těchto výsledků je zřejmé, že zkrácení urikázových proteinů jejich enzymatickou aktivitu významně neovlivňuje.
Tabulka 4. Souhrn kinetických parametrů rekombinantních a nativních urikáz
| Urikázy | Koncentrace*υ zásobního roztoku (mg/ml) | Specifická aktivita (U/mg)(2) | Km(4} (μΜ kyseliny močové) | Kcat(5) (1/min) |
| Rekombinantní | ||||
| Prasečí | 0,49 | 7,41 | 4,39 | 905 |
| Prasečí-ΔΝ | 0,54 | 7,68 | 4,04 | 822 |
| Prasečí KS | 0,33 | 7,16 | 5,27 | 1085 |
| Prasečí KS-ΔΝ | 1,14 | 6,20 | 3,98 | 972 |
| PBC | 0,76 | 3,86 | 4,87 | 662 |
| PBC-ANC | 0,55 | 3,85 | 4,3 | 580 |
| Králičí | 0,44 | 3,07 | 4,14 | 522 |
| Nativní | ||||
| Prasečí (Sigma) | 2,70 | 3,26 | 5,85 | 901 |
| A. flavus (Měrek) | 1,95 | 0,97 | 23,54 | 671 |
Poznámky k Tabulce 4:
(1) Koncentrace proteinu byla stanovena z absorbance měřené při 278 nm, s použitím extinkčního koeficientu 11,3 pro roztok urikázy 10 mg/ml (Mahler, 1963).
(2) 1 jednotka aktivity urikázy je definovaná jako množství enzymu, které oxiduje 1 mikromol kyseliny močové na alantoin za minutu při 25 °C.
• ·· ·
(3) Hodnoty specifické aktivity byly odvozené z Lineweaverovy a Burkovy rovnice, při koncentraci substrátu ekvivalentní 60 μΜ.
(4) Reakční směsi byly složené z různých kombinací následujících zásobních roztoků lOOmM sodnoboritanový pufr, pH 9,2
300μΜ kyselina močová v 50 mM sodnoboritanovém pufru, pH 9,2 mg/ml BSA v 50mM sodnoboritanovém pufru, pH 9,2 (5) Kcat byla vypočítaná vydělením Vmax (vypočítaná z odpovídajících Lineweaverových a Burkových rovnic) koncentrací urikázy v reakční směsi (vyjádřené v molámích ekvivalentech, na základě tetramemí molekulové hmotnosti urikázy).
Příklad 5
Konjugace urikázy s m-PEG (PEGylace)
Prasečí KS-ΔΝ urikáza byl konjugovaná s použitím m-PEG-NPC (monomethoxy poly(ethylenglykol)nitrofenyl karbonátu). Byly stanovené podmínky, při kterých vznikalo 2 až 12 vláken 5kDa, lOkDa, nebo 20kDa PEG na podjednotce urikázy. Do roztoku proteinu byl postupně přidáván m-PEG-NPC. Po ukončení přidávání byla reakční směs PEG urikáza / m-PEG-NPC inkubovaná při 2-8 °C po dobu 16-18 hodin, aby se maximální počet volných vláken m-PEG konjugoval s urikázou.
Počet PEG vláken na monomer PEG-urikázy byl stanoven pomocí velikostně vylučující chromatografie na Superose 6 (SEC), s použitím standardů PEG a urikázy. Počet PEG vláken navázaných na podjednotku byl stanoven pomocí následujícího vztahu:
PEG 3,42 x množství PEG v injikováném vzorku (pg) vlákna/podjednotka množství proteinu v injikovaném vzorku (pg)
Koncentrace jednotek PEG a proteinu ve vzorku PEG-urikázy byla stanovena velikostně vylučující chromatografií (SEC) s použitím UV a sériově uspořádaných refrakčních (RI) detektorů (viz Kunitani et al., (1991)). Byly generované tři kalibrační křivky: křivka proteinu (absorpce měřená při 220 nm), křivka proteinu (měřená RI), a křivka PEG (měřená RI). Poté byly s použitím stejného systému analyzovány vzorky PEG-urikázy. Pro výpočet koncentrací PEG a proteinu bylo použito srovnání výsledných hodnot oblasti UV a RI maxim experimentálních vzorků s kalibračními křivkami. Index 3,42 je poměr mezi molekulovou hmotností monomeru urikázy (34 192 Daltonů) a molekulovou hmotností lOkDaPEG.
Navázané PEG vylepšily rozpustnost urikázy v roztocích s fyziologickými hodnotami pH. Tabulka 5 ukazuje variabilitu mezi šaržemi produktu obsahujícího PEGylovanou prasečí urikázu KS-ΔΝ. Mezi počtem navázaných vláken PEG a uchovanou specifickou aktivitou (SA) enzymu je obecně inverzní vztah.
Tabulka 5. Enzymová aktivita konjugátů PEGylované prasečí KS-ΔΝ urikázy
| Šarže konjugátu | PEG MW (kDa) | Vlákna PEG na podjednotku urikázy | Urikáza SA (U/mg) | S A procento kontroly |
| ΔΝ-prasečí KS | 8,2 | 100 | ||
| 1-17# | 5 | 9,7 | 5,8 | 70,4 |
| LP-17 | 10 | 2,3 | 7,8 | 94,6 |
| 1-15# | 10 | 5,1 | 6,4 | 77,9 |
| 13# | 10 | 6,4 | 6,3 | 76,9 |
| 14# | 10 | 6,5 | 6,4 | 77,5 |
| 5-15# | 10 | 8,8 | 5,4 | 65,3 |
| 5-17# | 10 | 11,3 | 4,5 | 55,3 |
| 4-17# | 10 | 11,8 | 4,4 | 53,9 |
| 1-18# | 20 | 11,5 | 4,5 | 54,4 |
Příklad 6
PEGylace urikázy s 1000D a 100 000D PEG
Prasečí urikáza KS-ΔΝ byla konjugovaná s použitím 1000D a 100 000D m-PEG-NPC postupem popsaným v Příkladu 5. Byly použity podmínky pro zavedení 2 až 11 vláken PEG na podjednotku urikázy. Po ukončení přidávání PEG byla reakční směs urikáza/m-PEG-NPC inkubovaná při 2-8 °C po dobu 16-18 hodin, aby se maximální počet volných vláken m-PEG konjugoval s urikázou.
Počet PEG vláken na monomer PEG-urikázy byl stanoven postupem popsaným výše.
Navázané PEG vylepšily rozpustnost urikázy v roztocích s fyziologickými hodnotami pH.
····
Příklad 7
Farmakokinetika konjugátu prasečí urikázy KS-ΔΝ s PEG
Pro stanovení optimálního rozsahu a velikosti PEGylace potřebné k poskytnutí terapeutického účinku byly provedeny biologické experimenty.
Při farmakokinetických studiích na krysách s použitím i.v. injekcí 0,4 mg (2U) na kg tělesné hmotnosti nemodifikované urikázy, podávaných v den 1 a den 8, byl poločas v cirkulaci 10 minut. Avšak studie rychlosti clearence na krysách u 2 až 11 x lOkDa PEGylované prasečí urikázy KS ΔΝ, i po 9 týdenních injekcích ukázaly, že clearence nezávisí na počtu PEG vláken (v tomto rozmezí) a zůstala během doby studie relativně konstantní (viz Tabulka 6, poločas 30 hodin). Rozdíly mezi týdny jsou v rámci experimentální chyby. Stejný profil je zřejmý po 9 injekcích 10 x 5kDa PEG a 10 x 20kDa PEG - urikázových konjugátů. Výsledky získané na krysím modelu ukazují, že biologické účinky byly podobné nezávisle na použitém rozsahu PEGylace urikázy.
Tabulka 6. Poločasy přípravků PEGylované prasečí KS-ΔΝ urikázy na krysách
| Rozsah modifikace (PEG vlákna na podjednotku urikázy) | |||||||
| 5kDa PEG | lOkDaPEG | 20kDa PEG | |||||
| Týden | lOx | 2x | 5x | 7x | 9x | llx | lOx |
| 1 | 25,7 | 29,4 | 37,7 | 37,6 | 36,9 | 31,4 | 21,6 |
| ±1,7 | ±3,4 | ±3,1 | ±3,9 | ±4,3 | ±4,3 | ±1,5 | |
| (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 2 | 26,7 ±3,0 (5) | 28,4 ±1,6 (5) | |||||
| 3 | 27,5 | 29,0 | 29,9 | 32,7 | 26,3 | 11,8 | 14,5 |
| ±3,8 | ±2,6 | ±11,7 | ± 11,1 | ±4,7 | ±3,3 | ±2,7 | |
| (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 4 | 27,1 ±5,3 (5) | 18,4 ±2,2 (4) | 19,7 ±5,6 (4) | ||||
| 5 | 28,6 | 22,5 | 34,3 | 37,3 | 30,4 | 30,5 | 19,3 |
| ±1,7 | ±2,7 | ±3,9 | ±3,0 | ±3,6 | ±1,3 | ±2,5 | |
| (5) | (5) | (4) | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 6 | 35,4 ±3,1 (14) | 27,1 ±3,6 (13) | 30,7 ±2,9 (13) | ||||
| 7 | 16,5 ±4,9 (5) | 32,5 ±4,3 (5) | 16,12 ±2,7 (5) | 25,8 ±2,5 (5) | |||
| 8 | - | - | - | - | - | - | - |
| 9 | 36,8 | 28,7 | 34,0 | 24,2 | 31,0 | 29,3 | 26,7 |
| ±4,0 | ±2,7 | ±2,4 | ±3,4 | ±2,6 | ±1,4 | ±0,5 | |
| (15) | (15) | (13) | (13) | (13) | (15) | (15) |
Poznámky k Tabulce 6: Výsledky jsou vyznačené v hodinách ± střední chyba. Čísla v závorkách udávají počet testovaných zvířat.
Krysám byly týdně podávány i.v. injekce 0,4 mg/kilogram tělesné hmotnosti prasečí urikázy KS-ΔΝ, jejíž modifikace jsou vyznačené v tabulce. V každé skupině bylo nejprve 15 krys, které byly střídavě odebírané v podskupinách po 5. V průběhu studie kvůli anestezi několik krys zemřelo. Poločasy byly stanoveny měřením urikázové aktivity (kolorimetrické stanovém) ve vzorcích plazmy odebíraných po 5 minutách a 6,24 a 48 hodin po injekci.
Tabulka 5 popisuje šarže PEGylované urikázy použité ve studii.
Studie biodostupnosti 6 x 5kDa PEGylované prasečí urikázy KS-ΔΝ u králíků naznačují, že po první injekci je poločas v cirkulaci 98,2 ± 1,8 hodiny (i.v.) a biodostupnost ···· .:. ; .· po i.m. a podkožní (s.c.) injekci byla 71 % a 52 %. Po druhé i.m. a s.c. injekci byly však u všech králíků detekovány signifikantní titry protilátek, a po následných injekcích byla clearence zrychlená. Injekce stejného konjugátu u krys poskytla výsledný poločas 26 ± 1,6 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 33 % a 22 %.
Studie na krysách prováděné s 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ naznačují, že po první injekci je poločas v cirkulaci 42,4 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 28,9 % a 14,5 % (viz Obrázek 5 a Tabulka 7). Po čtvrté injekci byl poločas v cirkulaci 32,1 ± 2,4 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 26,1 % a 14,9 %.
Podobné farmakokinetické studie prováděné u králíků s 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ naznačují, že následně po injekci tohoto konjugátu (po dobu 4 týdnů byla podávána injekce dvakrát týdně) nebyla žádná zrychlená clearence pozorovaná. U těchto zvířat byl po první injekci poločas v cirkulaci 88,5 hodiny (i.v.) a biodostupnost po i.m. a s.c. injekci byla 98,3 % a 84,4 % (viz Obrázek 6 a Tabulka 7). Po čtvrté injekci byl poločas v cirkulaci 141,1±15,4 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 85 % a 83 %.
Podobně byly provedeny studie s 9x10 kDa PEGylovanou prasečí urikázou KS-ΔΝ pro stanovém biodostupnosti u psů beaglů (v každé skupině byli 2 samci a 2 samice). Po první
i.v. injekci byl naměřen poločas v cirkulaci 70 ± 11,7 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 69,5 % a 50,4 % (viz Obrázek 7 a Tabulka 7).
Byly provedeny studie s přípravky obsahujícími 9 x lOkDa PEGylovanou prasečí urikázu KS-ΔΝ na prasatech. Pro i.v., s.c. a i.m. způsoby podávám byla použita tři zvířata ve skupině. Po první i.v. injekci byl naměřen poločas v cirkulaci 178 ± 24 hodiny a biodostupnost po i.m. a s.c. injekcích byla 71,6 % a 76,8 % (viz Obrázek 8 a Tabulka 7).
Tabulka 7. Farmakokinetická studie provedená s 9x10 kDa PEGylované prasečí KSAN urikázou
| Injekce # | Poločas (hodiny) | Biodostupnost | |
| i.v. | i.m. | s.c. | |
| Krysy | |||
| 1 | 42,4 ± 4,3 | 28,9 % | 14,5 % |
| 2 | 24,1 ±5,0 | 28,9 % | 14,5 % |
| 4 | 32,1 ± 2,4 | 26,1 % | 14,9 % |
| Králíci | |||
| 1 | 88,5 ± 8,9 | 98,3 % | 84,4 % |
| 2 | 45,7 ± 40,6 | 100% | 100 % |
| 4 | 141,1 ±15,4 | 85% | 83% |
| Psi | |||
| 1 | 70,0 ± 11,7 | 69,5 % | 50,4 % |
| Prasata | |||
| 1 | 178 ±24 | 71,6 % | 76,8 % |
Studie absorpce, distribuce, metabolismu a vylučování (ADME) byly provedeny po jodaci 9 x lOkDa PEGylované prasečí urikázy KS-ΑΝ s použitím I způsobem dle Boltona & Huntera. Značený konjugát byl injikován 7 skupinám po 4 krysách (2 samci a 2 samice). Distribuce radioaktivity byla analyzována po 1 hodině a každých 24 hodin po dobu 7 dní (s výjimkou pro den 5). Všechny skupiny byly postupně usmrceny a byly vyjmuty a analyzovány různé orgány. Sedmá skupina byla držena v metabolické kleci, ze které byla sbírána moč a výkaly. Distribuce látky ve zvířecím těle byla určená po změření celkové radioaktivity v každém orgánu a poměrné části (v ledvinách, játrech, plicích a slezině), která se srážela s TCA (tzn. navázaný protein, normalizováno na velikost orgánu). Žádný z vyjmutých orgánů neměl specifickou radioaktivitu vyšší než ostatní, takže žádná významná akumulace ani v játrech nebo ledvinách pozorována nebyla. Do 7. dne bylo vyloučeno 70 % radioaktivity.
·· ·· • ·· • ·· • · · · • ··
Příklad 8
Výsledky klinické studie
Randomizovaná, otevřená, multicentrická studie s paralelní skupinou byla provedena za účelem získání urátové odezvy a farmakokinetického a bezpečnostního profilu PEGurikázy (Purikase®, Safient Pharmaceuticals) u lidských pacientů s hyperurikémií a těžkou dnou, u kterých nebyla odezva na konvenční léčbu nebo ktéto léčbě nebyli tolerantní. Průměrná délka choroby byla 14 let a 70 % studované populace trpělo jedním nebo více tofy.
Při této studii bylo 41 pacientů (průměrný věk 58,1 let) randomizováno pro 12-týdenní léčbu intravenózní PEG-urikázou v jednom ze čtyř dávkovačích režimů: 4 mg každé dva týdny (7 pacientů), 8 mg každé dva týdny (8 pacientů), 8 mg každé čtyři týdny (13 pacientů), nebo 12 mg každé čtyři týdny (13 pacientů). V definovaných intervalech byla měřena aktivita urikázy v plazmě a hladiny urátů. Z analýzy aktivity urikázy a hladiny urátů byly odvozené farmakokinetické parametry, střední koncentrace urátů v plazmě a v procentech byla vyjádřena doba, po kterou byly uráty v plazmě nižší nebo rovné 6 mg/dl.
Největší pokles hladiny PUA pod 6 mg/dl po 92 % doby léčby byl zaznamenán u pacientů, kteří dostávali 8 mg PEG-urikázy každé dva týdny (před zahájením léčby byla koncentrace urátů v plazmě 9,1 mg/dl vs. střední koncentrace urátů v plazmě 1,4 mg/dl po 12 týdnech).
Také u dalších skupin léčených jinými dávkami PEG-urikázy bylo pozorováno podstatné a trvalé snížení hladiny urátů v plazmě: PUA nižší než 6 mg/ml po 86 % doby léčby ve skupině dostávající 8 mg každé čtyři týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 9,1 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 2,6mg/dl po 12 týdnech), PUA nižší než 6 mg/ml po 84 % doby léčby ve skupině dostávající 12 mg každé čtyři týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 8,5 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 2,6 mg/dl po 12 týdnech), a PUA nižší než 6 mg/ml po 73 % doby léčby ve skupině dostávající 4 mg každé dva týdny (koncentrace urátů v plazmě před zahájením léčby 7,6 mg/dl vs. průměrná koncentrace urátů v plazmě 4,2 mg/dl po 12 týdnech).
Během prvních 24 hodin dávkování PEG-urikázy byl maximální procentuální pokles kyseliny močové v plazmě 72 % z výchozí hodnoty u subjektů, kterým byly podávány 4 mg / 2 týdny (p rovno .0002); 94 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 2 týdny (p menší než .0001), 87 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 4 týdny (p menší než .0001), a 93 % u subjektů, kterým bylo podáváno 12 mg / 4 týdny (p menší než .0001).
• 4» • ·
Během 12-týdenm léčby byl procentuální pokles kyseliny močové v plazmě z výchozí hodnoty 38 % u subjektů, kterým byly podávány 4 mg / 2 týdny (p rovno .0002), 86 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 2 týdny (p menší než .0001), 58 % u subjektů, kterým bylo podáváno 8 mg / 4 týdny (p rovno .0003) a 67 % u subjektů, kterým bylo podáváno 12 mg / 4 týdny (p menší než .0001).
Překvapivě se u některých subjektů, kterým byla podávána PEG-urikáza, projevil vedlejší účinek spojený s iníuzí, tzn. reakce na infiizi. Tyto reakce se vyskytly u 14 % z celkového počtu infuzí.
Plné znění všech zde citovaných odkazů je zde zahrnuto formou odkazu ve smyslu stejného rozsahu, jako by zde bylo u každé individuální publikace nebo patentu nebo patentové přihlášky specificky uvedeno, že je začleněná formou odkazu ve smyslu plného znění.
Jak bude odborníkovi v oboru zřejmé, u předkládaného vynálezu lze provést mnoho modifikací a variací, aniž by se překročil jeho duch nebo rozsah. Zde popsaná specifická provedení jsou nabídnuta pouze jako ilustrativní příklad a vynález je limitován pouze přiloženými nároky společně s plným rozsahem analogie podstaty, na který jsou nároky vedeny.
Claims (1)
- Průmyslová využitelnostGeneticky modifikované proteiny s urikolytickou aktivitou připravené podle předkládaného vynálezu jsou použitelné ke snížení hladiny kyseliny močové v biologické tekutině včetně krve.···· •V ·«··Seznam sekvencí <110> Savient Pharmaceuticals, lne.Hartman, JacobMendelovitz, Simona <120> Variantní formy urátoxidázy a jejich použití <130> 103864-146638 <150> US 60/670 573 <151> 2005-04-11 <160> 16 <170> Patentln verze 3.3 <210> 1 <211> 36 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220><223> Urikáza z prasečích jater (sensní) <400> 1 gcgcgaattc catggctcat taccgtaatg actaca <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Umělá sekvence
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67054105P | 2005-04-11 | 2005-04-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2007700A3 true CZ2007700A3 (cs) | 2008-02-27 |
Family
ID=37087650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20070700A CZ2007700A3 (cs) | 2005-04-11 | 2006-04-11 | Variantní forma urátoxidázy a její použití |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US7811800B2 (cs) |
| EP (2) | EP2918676B1 (cs) |
| JP (3) | JP2008535499A (cs) |
| KR (1) | KR101304289B1 (cs) |
| CN (2) | CN102807973A (cs) |
| AU (1) | AU2006235437B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI0612942A2 (cs) |
| CA (1) | CA2604545A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2007700A3 (cs) |
| HU (1) | HU229626B1 (cs) |
| IL (6) | IL186511A (cs) |
| MX (1) | MX2007012548A (cs) |
| NZ (1) | NZ562291A (cs) |
| PL (1) | PL215157B1 (cs) |
| RU (1) | RU2435847C2 (cs) |
| SG (3) | SG2014009484A (cs) |
| TW (1) | TW200716751A (cs) |
| WO (1) | WO2006110761A2 (cs) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE498409T1 (de) * | 1998-08-06 | 2011-03-15 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-uricase konjugate und verwendung davon |
| US20080159976A1 (en) * | 2005-04-11 | 2008-07-03 | Jacob Hartman | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| US8148123B2 (en) * | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| SG161247A1 (en) | 2005-04-11 | 2010-05-27 | Savient Pharmaceuticals Inc | Variant forms of urate oxidase and use thereof |
| JP5033177B2 (ja) * | 2006-04-12 | 2012-09-26 | サビエント ファーマセウティカルズ インク． | 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製 |
| JP4890133B2 (ja) * | 2006-07-20 | 2012-03-07 | 東洋紡績株式会社 | 安定な尿酸測定試薬 |
| JP4890132B2 (ja) * | 2006-07-20 | 2012-03-07 | 東洋紡績株式会社 | ウリカーゼの比活性を向上させる方法、および比活性の向上した改変型ウリカーゼ |
| JP4890134B2 (ja) * | 2006-07-20 | 2012-03-07 | 東洋紡績株式会社 | ウリカーゼの安定性を向上させる方法、および安定性の向上した改変型ウリカーゼ |
| US9377454B2 (en) | 2009-06-25 | 2016-06-28 | Crealta Pharmaceuticals Llc | Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy |
| CN102051348B (zh) * | 2009-10-27 | 2012-10-03 | 重庆富进生物医药有限公司 | 人源化重组尿酸酶及其突变体 |
| US8940861B2 (en) | 2010-04-08 | 2015-01-27 | Georgia Tech Research Corporation | Variants of ancestral uricases and uses thereof |
| CN102634492B (zh) | 2011-02-14 | 2015-06-10 | 重庆富进生物医药有限公司 | 聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用 |
| CN102827073A (zh) | 2011-06-17 | 2012-12-19 | 安吉奥斯医药品有限公司 | 治疗活性组合物和它们的使用方法 |
| US9474779B2 (en) | 2012-01-19 | 2016-10-25 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compositions and their methods of use |
| EP2986720B1 (en) | 2013-04-17 | 2017-09-06 | Council of Scientific & Industrial Research | Uricase mutants |
| WO2015003360A2 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-15 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| WO2015003355A2 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-15 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| CN105593215B (zh) | 2013-07-11 | 2019-01-15 | 安吉奥斯医药品有限公司 | 用于治疗癌症的作为idh2突变体抑制剂的2,4-或4,6-二氨基嘧啶化合物 |
| WO2015010297A1 (en) | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| NZ723859A (en) | 2014-03-14 | 2023-01-27 | Servier Lab | Pharmaceutical compositions of therapeutically active compounds and their uses |
| US11098289B2 (en) * | 2015-05-15 | 2021-08-24 | Medimmune, Llc | Uricase sequences and methods of treatment |
| CN106554948B (zh) | 2015-09-29 | 2019-06-25 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 突变型尿酸酶、peg修饰的突变型尿酸酶及其应用 |
| KR102699521B1 (ko) | 2015-10-15 | 2024-08-26 | 르 라보레또레 쎄르비에르 | 악성 종양의 치료를 위한 조합물 요법 |
| FI3362065T3 (fi) | 2015-10-15 | 2024-06-19 | Servier Lab | Ivosidenibiä, sytarabiinia ja daunorubisiinia tai idarubisiinia käsittävä yhdistelmähoito akuutin myelooisen leukemian hoitamiseksi |
| CN116637177A (zh) | 2016-11-11 | 2023-08-25 | 好利恩治疗美国公司 | 泼尼松和尿酸酶分子的组合疗法及其用途 |
| US10980788B2 (en) | 2018-06-08 | 2021-04-20 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapy for treating malignancies |
| CN109207479A (zh) * | 2018-09-07 | 2019-01-15 | 大连大学 | 海洋低温尿酸氧化酶启动子和终止子 |
| WO2020160322A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-08-06 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Tolerization reduces intolerance to pegloticase and prolongs the urate lowering effect (triple) |
| WO2020160325A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-08-06 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Reducing immunogenicity to pegloticase |
| CN111088268B (zh) * | 2019-03-05 | 2022-08-02 | 北京锦篮基因科技有限公司 | 一种高尿酸血症的基因治疗药物 |
| KR20250041198A (ko) * | 2019-05-10 | 2025-03-25 | 피이지-바이오 바이오팜 컴퍼니 리미티드 (총칭) | 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 요산 산화효소 |
| EP4588513A3 (en) | 2020-08-10 | 2025-10-22 | Horizon Therapeutics USA, Inc. | Methods of treating gout |
| CN114438047B (zh) * | 2020-11-05 | 2024-11-22 | 重庆派金生物科技有限公司 | 制备聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶的方法 |
| EP4321179A4 (en) * | 2021-05-07 | 2025-02-19 | Peking University | PROCESS FOR INITIATING POLYMERIZATION OF N-CARBOXYANHYDRIDES OF AMINO ACIDS IN AQUEOUS PHASE |
| CN113244412B (zh) * | 2021-06-25 | 2021-10-26 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 一种基于mRNA剂型的治疗高尿酸血症或痛风的药物及其制备方法 |
| CA3258215A1 (en) | 2022-06-03 | 2023-12-07 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | RECOMBINANT EXPRESSION OF THE MYELOID-DERIVED GROWTH FACTOR |
| WO2024124142A2 (en) * | 2022-12-08 | 2024-06-13 | Insmed Incorporated | Uricase conjugates and methods of use thereof |
| AU2024268255A1 (en) * | 2023-05-05 | 2025-11-13 | Insmed Incorporated | Uricase variants and methods of use thereof |
| US12269875B2 (en) | 2023-08-03 | 2025-04-08 | Jeff R. Peterson | Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers |
| WO2025073372A1 (en) | 2023-10-05 | 2025-04-10 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Recombinant expression of myeloid-derived growth factor |
| WO2025120204A1 (en) | 2023-12-06 | 2025-06-12 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Novel formulation comprising myeloid-derived growth factor |
Family Cites Families (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3451996A (en) * | 1968-02-12 | 1969-06-24 | Thompson Farms Co | Method for the preparation of heparin |
| US3616231A (en) * | 1968-11-14 | 1971-10-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the production of uricase |
| US3931399A (en) * | 1970-12-22 | 1976-01-06 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for isolating a fibrin-stabilizing factor |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4169764A (en) * | 1975-08-13 | 1979-10-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of urokinase |
| US4141973A (en) * | 1975-10-17 | 1979-02-27 | Biotrics, Inc. | Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof |
| US4301153A (en) * | 1977-03-21 | 1981-11-17 | Riker Laboratories, Inc. | Heparin preparation |
| US4425431A (en) * | 1978-04-20 | 1984-01-10 | Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. | Production of an allose-containing polysaccharide |
| US4312979A (en) * | 1978-04-20 | 1982-01-26 | Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd. | Polysaccharides containing allose |
| JPS6031472B2 (ja) * | 1978-12-14 | 1985-07-22 | 協和醗酵工業株式会社 | 酸性ウリカ−ゼ |
| JPS5599189A (en) | 1979-01-22 | 1980-07-28 | Mihama Hisaharu | Modified uricase free from antigenicity and its preparation |
| DE2916711A1 (de) * | 1979-04-25 | 1980-11-06 | Behringwerke Ag | Blutgerinnungsfaktoren und verfahren zu ihrer herstellung |
| FR2475900A1 (fr) * | 1980-02-20 | 1981-08-21 | Fabre Sa Pierre | Complexe vaccinal contenant un antigene specifique et vaccin le contenant |
| JPS5740503A (en) * | 1980-08-22 | 1982-03-06 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Separation of saccharides |
| FR2497006A1 (fr) | 1980-12-24 | 1982-06-25 | Ind Electro Ste Gle | Contacts electriques pour cables coaxiaux et cables bifilaires |
| DE3126759A1 (de) * | 1981-07-07 | 1983-01-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
| US4485176A (en) * | 1982-06-28 | 1984-11-27 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Turbidimetric method for measuring protein in urine and cerebrospinal fluid |
| EP0109688A3 (en) * | 1982-11-23 | 1986-12-03 | The Wellcome Foundation Limited | Improved complexes, processes for obtaining them and formulations containing such complexes |
| US4732863A (en) | 1984-12-31 | 1988-03-22 | University Of New Mexico | PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors |
| JPH0671425B2 (ja) * | 1985-06-05 | 1994-09-14 | サッポロビール株式会社 | ウリカ−ゼおよびその製造法 |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4917888A (en) * | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| AU597924B2 (en) * | 1985-12-11 | 1990-06-14 | Natinco Nv | Solubilization of protein aggregates |
| DD279486A1 (de) | 1986-03-10 | 1990-06-06 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen |
| JPS6255079A (ja) | 1986-04-23 | 1987-03-10 | Mihama Hisaharu | 修飾ウリカ−ゼ |
| AU612133B2 (en) * | 1987-02-20 | 1991-07-04 | Natinco Nv | Production of proteins in active forms |
| CA1305285C (en) * | 1987-04-21 | 1992-07-14 | Malcolm Roy Brandon | Production of proteins in active forms |
| AU609824B2 (en) * | 1987-06-15 | 1991-05-09 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
| US5080891A (en) * | 1987-08-03 | 1992-01-14 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
| US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US4945086A (en) * | 1988-05-03 | 1990-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Smooth muscle cell growth inhibitor |
| US5955336A (en) * | 1988-08-17 | 1999-09-21 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | DNA sequence for uricase and manufacturing process of uricase |
| US5349052A (en) * | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US5324844A (en) * | 1989-04-19 | 1994-06-28 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
| US5010183A (en) * | 1989-07-07 | 1991-04-23 | Macfarlane Donald E | Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents |
| KR0159107B1 (ko) * | 1989-07-13 | 1998-11-16 | 쟝 르쌍드뢰 | 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포 |
| NZ234453A (en) | 1989-07-13 | 1993-01-27 | Sanofi Sa | Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith |
| US5286637A (en) * | 1989-08-07 | 1994-02-15 | Debiopharm, S.A. | Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same |
| US5362641A (en) * | 1989-08-23 | 1994-11-08 | Hadassah Medical Organization Kiryat Hadassah | Heparanase derived from human Sk-Hep-1 cell line |
| JPH03148298A (ja) | 1989-11-01 | 1991-06-25 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| US5766897A (en) * | 1990-06-21 | 1998-06-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cysteine-pegylated proteins |
| US5653974A (en) * | 1990-10-18 | 1997-08-05 | Board Of Regents,The University Of Texas System | Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor |
| DE69230613T2 (de) * | 1991-07-02 | 2000-12-28 | Inhale Inc | Verfahren und vorrichtung zum abgeben von medikamenten in aerosolform |
| YU66892A (sh) | 1991-08-20 | 1995-10-24 | Hoechst Ag. | Fosfoinositolglikan - peptid sa delovanjem kao insulin |
| US5298643A (en) * | 1992-12-22 | 1994-03-29 | Enzon, Inc. | Aryl imidate activated polyalkylene oxides |
| US5321095A (en) * | 1993-02-02 | 1994-06-14 | Enzon, Inc. | Azlactone activated polyalkylene oxides |
| AU6240494A (en) | 1993-02-16 | 1994-09-14 | Enzon, Inc. | Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity |
| US6385312B1 (en) * | 1993-02-22 | 2002-05-07 | Murex Securities, Ltd. | Automatic routing and information system for telephonic services |
| JP3875730B2 (ja) | 1993-02-22 | 2007-01-31 | サノフィ・アベンティス株式会社 | 自己免疫疾患の予防治療剤 |
| US5298410A (en) * | 1993-02-25 | 1994-03-29 | Sterling Winthrop Inc. | Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life |
| DE69426598T2 (de) | 1993-04-09 | 2001-08-09 | Bio-Technology General Corp., Iselin | Neues Peptid mit einer inhibierenden Aktivität gegen Faktor Xa |
| AU7113594A (en) * | 1993-06-21 | 1995-01-17 | Enzon, Inc. | Site specific synthesis of conjugated peptides |
| US5919455A (en) * | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| JPH09504174A (ja) | 1993-10-29 | 1997-04-28 | インサイト ファーマシューティカルズ，インク． | プロテアーゼネキシン１変異体を含むキメラ蛋白 |
| US5795776A (en) | 1994-03-22 | 1998-08-18 | Bio-Technology General Corp. | Expression plasmids regulated by an OSMB promoter |
| FI96317C (fi) * | 1994-05-31 | 1996-06-10 | Exavena Oy | Menetelmä hienojakoisten ja muunnettujen tärkkelyksien valmistamiseksi |
| DE4423131A1 (de) * | 1994-07-01 | 1996-01-04 | Bayer Ag | Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4 |
| US5633227A (en) * | 1994-09-12 | 1997-05-27 | Miles, Inc. | Secretory leukocyte protease inhibitor as an inhibitor of tryptase |
| FI972443A7 (fi) * | 1994-12-07 | 1997-06-09 | Novozymes As | Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| IL116696A (en) * | 1995-01-25 | 1999-08-17 | Bio Technology General Corp | Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b |
| FR2733914B1 (fr) * | 1995-05-11 | 1997-08-01 | Sanofi Sa | Composition de liquide stable contenant de l'urate oxydase et composition lyophilisee pour sa preparation |
| JPH09154581A (ja) | 1995-12-05 | 1997-06-17 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物 |
| US6006753A (en) | 1996-08-30 | 1999-12-28 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery |
| ATE342729T1 (de) | 1997-01-15 | 2006-11-15 | Phoenix Pharmacologics Inc | Modifizierter tumor-nekrosefaktor |
| KR100369838B1 (ko) | 1997-02-26 | 2003-09-29 | 주식회사 엘지생명과학 | 한국형c형간염바이러스의비구조단백질3에서유래한단백질분해효소단백질및그의제조방법 |
| JPH1175876A (ja) * | 1997-07-04 | 1999-03-23 | Ajinomoto Co Inc | 新規な微生物トランスグルタミナーゼの製造法 |
| EP1500661A1 (en) * | 1998-06-01 | 2005-01-26 | Genetech, Inc. | Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography |
| RU2246318C2 (ru) | 1998-08-06 | 2005-02-20 | Маунтэн Вью Фармасьютикэлз, Инк. | Конъюгаты peg-уриказы и их использование |
| US6783965B1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| WO2000008196A2 (en) | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Duke University | Urate oxidase |
| ATE498409T1 (de) * | 1998-08-06 | 2011-03-15 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-uricase konjugate und verwendung davon |
| US6429860B1 (en) * | 1999-06-15 | 2002-08-06 | Visicomp, Inc. | Method and system for run-time visualization of the function and operation of a computer program |
| US20020068857A1 (en) * | 2000-02-14 | 2002-06-06 | Iliff Edwin C. | Automated diagnostic system and method including reuse of diagnostic objects |
| US6913915B2 (en) * | 2001-08-02 | 2005-07-05 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | PEG-modified uricase |
| KR20030043780A (ko) | 2001-11-28 | 2003-06-02 | 주식회사 바이오폴리메드 | 생체적합성 비항원성 공중합체와 그 결합체 및 이들의제조방법 |
| US20080159976A1 (en) * | 2005-04-11 | 2008-07-03 | Jacob Hartman | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| US8148123B2 (en) * | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| SG161247A1 (en) * | 2005-04-11 | 2010-05-27 | Savient Pharmaceuticals Inc | Variant forms of urate oxidase and use thereof |
| JP5033177B2 (ja) * | 2006-04-12 | 2012-09-26 | サビエント ファーマセウティカルズ インク． | 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製 |
-
2006
- 2006-04-11 MX MX2007012548A patent/MX2007012548A/es active IP Right Grant
- 2006-04-11 JP JP2008505656A patent/JP2008535499A/ja active Pending
- 2006-04-11 EP EP14192835.8A patent/EP2918676B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2006-04-11 CA CA002604545A patent/CA2604545A1/en not_active Abandoned
- 2006-04-11 SG SG2014009484A patent/SG2014009484A/en unknown
- 2006-04-11 CZ CZ20070700A patent/CZ2007700A3/cs unknown
- 2006-04-11 AU AU2006235437A patent/AU2006235437B2/en not_active Expired
- 2006-04-11 KR KR1020077026114A patent/KR101304289B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2006-04-11 BR BRPI0612942-0A patent/BRPI0612942A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-04-11 SG SG201002408-1A patent/SG161248A1/en unknown
- 2006-04-11 NZ NZ562291A patent/NZ562291A/en unknown
- 2006-04-11 CN CN2012102463263A patent/CN102807973A/zh active Pending
- 2006-04-11 TW TW095112941A patent/TW200716751A/zh unknown
- 2006-04-11 CN CN2006800206898A patent/CN101194016B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2006-04-11 PL PL384263A patent/PL215157B1/pl unknown
- 2006-04-11 EP EP06740863A patent/EP1871877A2/en not_active Ceased
- 2006-04-11 WO PCT/US2006/013502 patent/WO2006110761A2/en not_active Ceased
- 2006-04-11 SG SG10201706384VA patent/SG10201706384VA/en unknown
- 2006-04-11 HU HU0700729A patent/HU229626B1/hu unknown
- 2006-04-11 RU RU2007141683/10A patent/RU2435847C2/ru active
- 2006-04-11 US US11/918,296 patent/US7811800B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-10-09 IL IL186511A patent/IL186511A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-09-10 US US12/879,084 patent/US7964381B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2010-10-12 IL IL208643A patent/IL208643A0/en active IP Right Grant
-
2011
- 2011-05-13 US US13/107,498 patent/US8034594B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2011-09-07 US US13/226,891 patent/US8178334B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-04-20 US US13/452,151 patent/US8293228B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2012-09-20 US US13/623,512 patent/US8465735B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2012-12-06 IL IL223477A patent/IL223477A/en active IP Right Grant
- 2012-12-06 IL IL223476A patent/IL223476A/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-01-23 JP JP2013009960A patent/JP2013090636A/ja not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-01-07 JP JP2015001757A patent/JP2015077144A/ja not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-12-06 IL IL256157A patent/IL256157B/en active IP Right Grant
-
2021
- 2021-03-03 IL IL281228A patent/IL281228A/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2918676B1 (en) | A variant form of urate oxidase and use thereof | |
| US9926538B2 (en) | Variant forms of urate oxidase and use thereof | |
| AU2011257764B2 (en) | A variant form of urate oxidase and use thereof | |
| HK1112021B (en) | Variant forms of urate oxidase and use thereof |