BRPI0612947A2

BRPI0612947A2 - método para o tratamento de uma condição fibrótica, método para tratar a fibrose pulmonar, método para tratar a fibrose hepática, método para tratar a fibrose renal, métodos para tratar uma doença fibrótica e método para prevenir uma doença fibrótica

Info

Publication number: BRPI0612947A2
Application number: BRPI0612947-1A
Authority: BR
Inventors: Tatiana Novobrantseva; Sheila Violette; Victor Koteliansky; Alexander Ibraghimov
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2010-12-07
Also published as: WO2006125140A3; AU2006247064A1; WO2006125140A9; US20070009518A1; RU2007142523A; CA2609190A1; IL187450A0; NO20076473L; WO2006125140A2; MX2007014463A; JP2008540678A; EP1883424A2; KR20080025066A

Abstract

MéTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA CONDIçãO FIBRóTICA, MéTODO PARá TRATAR A FIBROSE PULMONAR, MéTODO PARA TRATAP. A FIBROSE HEPáTICA, MéTODO PARA TRATAR A FIBROSE RENAL, MéTODOS PARA TRATAR UMA DOENçA FIBRóTICA E MéTODO PARA PREVENIR UMA DOENçA FIBRóTICA. A presente invenção é dirigida aos métodos para o tratamento de doenças fibróticas, tais como a fibrose de fígado, rim e pulmão, bem como as doenças fibróticas de outros tecidos do corpo. Os métodos da invenção compreendem a administração a um paciente com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de célula B. Exemplos de antagonistas de célula B que podem ser usados na prática dos métodos da invenção incluem anticorpos contra antígenos de superfície da célula B (por exemplo, anticorpos contra CD20, e antagonistas de BAFF.

Description

"MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA CONDIÇÃO FIBRÓTICA,MÉTOQO PARA TRATAR A FIBROSE PULMONAR, MÉTODO PARATRATAR A rIBROSE HEPÁTICA, MÉTODO PARA TRATAR A FIBROSERENAL,,MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA FIBRÓTICA E MÉTODOPARA PREVENIR UMA DOENÇA FIBRÓTICA"

Antecedentes Da Invenção

Campo Da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento dafibrose ou doenças fibróticas. Mais especificamente, a invenção refere-se aouso de antagonistas de células B ou agentes depletores para tratar doençasfibróticas.

Técnica Relacionada

O dano tecidual pode resultar de uma variedade de estímulosçrônicos ou agudos, incluindo infecçõés, reações auto-imunes e lesãomecânica. O processo de cicatrização normalmente envolve uma fase durantea qual o tecido conjuntivo substitui o tecido parenquimatoso. (Wynn, NatureReviews 4:583-594 (2004)). Se este processo continua sem controle, noentanto, pode resultar na formação de tecido cicatricial permanente e, emalguns casos, pode finalmente levar a falência do órgão e morte.

Doenças fibróticas são condições patológicas, que se caracterizampelo acúmulo anormal e/ ou excessivo de material fibrótico (por exemplo, matrizextracelular), após dano tecidual. Doenças fibróticas incluem doençasfibroproliferativas que estão associadas a doenças cardiovasculares, tais comodoença cardíaca, doença cerebral e doença vascular periférica, bem como emtodos os principais sistemas de órgãos e tecidos, incluindo a pele, rins, pulmões,fígado e tubo digestivo. (Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004)). Apesar dasdoenças fibróticas serem um grupo diversificado de patologias, acredita-se que namaioria das doenças fibróticas, os mecanismos gerais que levam ao acúmulo dotecido fibrótico possuem muitos elementos em comum.

A imaioria dos métodos terapêuticos para tratar as doençasfibróticas visa à resposta inflamatória, que é acreditada por desempenhar umpapel importante no desenvolvimento geral da fibrose. (Wynn1 Nature Reviews4:583-594 (2004)). Exemplos de estratégias farmacêuticas para o tratamentode doenças fibróticas incluem o uso de fármacos imunossupressores, taiscomo corticosteróides, outros imunossupressores tradicionais ou agentescitotóxicos e anti-fibróticos

Há, no entanto uma necessidade no estado da técnica de novasabordagens e mais especificamente dirigida para o tratamento das doençasfibróticas.

Descrição Resumida Da Invenção

A presente invenção está relacionada, pelo menos em parte, àsurpreendente descoberta de que a extensão da fibrose em uma lesão induzidaexperimentalmente é substancialmente reduzida em camundongos deficientesde células B ou com células B farmacologicamente depletadas, indicando comisso que a depleção de células B ou a diminuição da atividade de células B emanimais é um método eficaz no tratamento de doenças fibróticas.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui métodos para otratamento de doenças fibróticas. Os métodos da invenção compreendem aadministração a um paciente com necessidade de tal tratamento de umaquantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de célula B.

Desde que se acredita que a fibrose ocorre por um mecanismobiomolecular semelhante independentemente dos tecidos específicosenvolvidos, a presente invenção pode ser usada para tratar qualquer condiçãofibrótica afetando qualquer tecido de um paciente. Por exemplo, a presenteinvenção pode ser usada para tratar, reduzir ou retardar a fibrose de pulmão(pulmonar), rim (renal), fígado (hepática), pele, vascular, intestino e tecidocorneal. Os presentes métodos podem ser usados para tratar uma doençafibrótica resultantes de qualquer tipo de dano tecidual incluindo danos teciduaisresultantes de *infecções, reações auto-imunes, dano mecânico, químico, dodiabetes, da hipertensão e etc. Exemplos específicos de doenças fibróticas quepodem ser tratadas utilizando os métodos da invenção estão descritos emoutros locais deste documento.

Os métodos da presente invenção podem ser usados tambémpara prevenir o desenvolvimento de uma doença fibrótica em um paciente comrisco de desenvolver uma doença fibrótica. Os pacientes com risco paradesenvolver uma doença fibrótica incluem, por exemplo, pacientes que tenhamsido expostos a uma ou mais condições ambientais que são conhecidas porcausar ou estimular o acúmulo de tecido cicatricial nos pulmões, rins e fígado.Exemplos de condições ambientais incluem, por exemplo, exposição à fumaça,exposição à poeira, exposição ao amianto, consumo excessivo de álcool,exposição à radiação, exposição à bleomicina, exposição à sílica, bactérias,vírus e etc. Pacientes com risco de desenvolver uma doença fibrótica, emcertos exemplos de realização, também incluem, por exemplo, indivíduos comdiabetes, asma crônica, lúpus, esclerodermia, artrite reumatóide, doençavascular, glaucoma, neuropatia por IgA1 síndrome de Alport, bem comoindivíduos que tenham sido submetidos a transplante pulmonar e / outransplante renal.

Exemplos de antagonistas de células B que podem ser utilizadosna prática dos métodos da presente invenção incluí qualquer molécula oucompostos (polipeptídeo, ligante, proteínas de fusão, anticorpos, moléculaspequenas, etc) que possa inibir ou debilitar o crescimento, sobrevivência,proliferação ou função das células B (incluindo a secreção de imunoglobulinas),ou que possa causar a morte ou destruição das células B. De acordo com apresente invenção o antagonista de células B pode, mas não necessariamente,depletar as células B. Exemplos de realizações preferidas selecionadas dapresente invenção incluem o uso de antagonistas de células B que resultam nadiminuição de fielo menos uma parte das células B circulantes ou outrascélulas B, através da citotoxicidade celular dependente anticorpos (ADCC)1citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ou apoptose. Para ospropósitos da presente descrição tais antagonistas podem ser denominadosagentes depletantes de células B.

Em certos exemplos de realizações da invenção, o antagonista decélula B ou o agente depletante é um anticorpo contra um antígeno desuperfície da célula B. Em um exemplo de realização particular preferido, oantagonista de célula B é um anticorpo contra CD20. Um exemplo de anticorpoanti- CD20 que possa ser utilizado na prática dos métodos da invenção é orituximab (RITUXAN®).

Em outros exemplos de realizações, da invenção, o antagonista decélula B é um antagonista BAFF ou de receptores de BAFF (BR3, BCMA, ou TACI),que é expresso em células B. Aqueles hábeis na técnica apreciarão que BAFF é umpotente fator de sobrevivência para células B como eles transferem células damedula óssea para o baço durante os quais células B auto-reativas sãoparticularmente susceptíveis a se tomarem patogênicas. Assim, utilizando umantagonista BAFF para interromper as interações entre BAFF e BR podeinfrarregular, interferir com, ou inibir a geração de células B potencialmente auto-reativas. A este respeito, antagonistas úteis podem incluir anticorpos anti-BAFF(como o belimumab), anticorpos anti-BR, moléculas pequenas que interagem comBAFF ou BR, Iigantes baseados em antagonistas de polipeptídeo. Em exemplos derealizações preferidas o antagonista de BAFF é uma molécula solúvelcompreendendo a totalidade ou parte dos receptores BAFF ligados a uma regiãoconstante da imunoglobulina. Exemplos específicos de polipeptídeos antagonistasde BAFF são discutidos com mais detalhes a baixo.A presente invenção inclui ainda métodos que constam daadministração de múltiplos antagonistas de células B. Por exemplo, emdeterminaclos exemplos de realizações, um anticorpo contra CD20 (porexemplo, o rituximab) é administrado a um paciente, juntamente com umantagonista de BAFF.

A invenção inclui também métodos que compreende aadministração de um ou mais antagonistas de células B e um ou mais agentesadicionais que são úteis no tratamento de uma ou mais doenças fibróticas. Porexemplo, a presente invenção também abrange métodos que compreende daadministração de um ou mais antagonistas de células B e um ou maisantagonistas de receptores de integrina. Como aqueles conhecedores datécnica apreciarão antagonistas de receptores de integrina podem incluirpeptídeos, anticorpos, Iigantes solúveis ou moléculas pequenas que inibem afunção da integrina ou receptores de integrina, por exemplo, anticorpos contraavp6. avp5, avps, a5Pi, aiPi, a4pi (VLA - 4), a4p7; etc. Um anticorpo exemplar quese liga especificamente ao receptor de integrina Ct4P1 e que pode ser usado emcombinação com um antagonista de célula B para o tratamento de uma doençafibrótica no contexto da presente invenção é o natalizumab (Tysabri ®).

A presente invenção também abrange métodos que compreendea administração de um ou mais antagonistas de células B e um ou mais inibidorda via do TGF-P, tais como, por exemplo, um antagonista do Iigante deTGF-Pou um antagonista de receptor de TGF-p (por exemplo, anticorposmonoclonais, proteína de fusão solúvel TGF-P Rll-Fc, proteína de fusão LAP-Fc1 inibidores de quinase do TGF-P Rl ou Rll1 inibidores de moléculaspequenas, etc).

O técnico qualificado será capaz de identificar rapidamente outrosagentes anti-fibróticos que sejam compatíveis com os ensinamentos dopresente.Outros objetos, características e vantagens da presente invençãoserão evidente! para os técnicos hábeis no assunto pelas informações dadescrição detafhada dos seguintes exemplos de incorporação preferidos dopresente.

Breve Descrição Das Figuras

A FIG. 1A exibe a população de células B no baço, cavidade peritonial(PC) e fígado de um camundongo adulto. Os linfócitos foram isolados e coradoscom anti-lgD (eixo-X) e anti-lgM (eixo-Y). Porcentagens de células IgM+, IgD+ entreos linfócitos estão demonstrados nos gráficos. A FIG. 1B exibe os níveis deexpressão de CD21, CD23 e CD5 em células B isoladas do baço, sangue, PC efígado. A FIG. 1C exibe a quantidade de Anexina V vinculada ás células B hepáticase células B - esplénicas. A FIG. 1D exibe o grau de proliferação de células Bifitrahepática e células B esplénicas e a supraregulação (upregulation) de CFSE eCD86 (B7.2), em resposta as vários estímulos.

A FIG. 2A exibe o grau de lesão hepática, avaliada pela libertaçãoda enzima ALT específica de hepatócitos no soro 24 horas após uma únicadose de CCI4, em camundongos deficientes de célula B (JH -/-) e emcamundongo tipo selvagem (BALB/c). A FIG. 2B exibe a análise histológica dotecido hepático corado com o corante específico para colágeno "Sirius Red' emcamundongos com deficiência de células B (JH -/-) e em camundongo tiposelvagem (BALB/c) uma semana após a sexta dose semanal de um dos dois;óleo (Controle) ou CCI4. As FIGS. 2C e 2D exibem a quantificação de colágenopela coloração específica por uSirius Red' (em unidades arbitrárias) em trêsexperimentos representativos. Os experimentos 1 e 2 (FIG. 2C) exibem aextensão da deposição de colágeno intersticial uma semana após a sexta dosesemanal de 3,5 mg/kg de CCI4, e o experimento 3 (FIG. 2D) mostra o grau dedeposição intersticial de colágeno uma semana após a sexta dose semanal de1,75 mg/kg de CCI4. A coluna de pontos representa uma série de secções deum animal. Os valores médios são exibidos em barras.

A VlG. 3 exibe a análise histológica das secções de fígado decamundongos deficientes de célula B (JH -/-) e camundongos tipo selvagem(BALB /c), 1, 3 e 5 dias após uma única prova de provocação com CCI4. Assecções foram submetidas à coloração de TUNEL específica para apoptose(duas primeiras linhas), coloração para actina de músculo liso (a-SMA) (duaslinhas médias), ou coloração F4/80 específicas para macrófago (duas linhasinferiores).

A FIG. 4A exibe a análise histológica da deposição de colágenono tecido hepático de camundongos com ausência de células B e células T(RAG2 -/-) e camundongos tipo selvagem após o tratamento com CCI4 a longoprazo. A FIG. 4B exibe a quantificação da deposição de colágeno intersticial nofígado de camundongos RAG2 -/- e camundongos tipo selvagem após otratamento com CCI4 a longo prazo.

A FIG. 5A exibe a quantificação da deposição de colágenointersticial no tecido hepático em camundongos expressando a proteína LMP2aderivado do vírus Epstein-Barr e de camundongos tipo selvagem após otratamento de 6 semanas com 1,75 mg/kg de CCI4. A FIG 5B exibe aquantificação da deposição de colágeno intersticial no tecido hepático emcamundongos mlgM tg expressando Ig de superfície e camundongos do tiposelvagem após 6 semanas de tratamento com 1,75 mg/kg de CCI4.

A FIG. 6 exibe o percentual de actina de músculo liso emcamundongos de tipo selvagem "B6BWT" (C57BL/6J) e de camundongosdeficientes de células B "B6BKO" (B6.\29S2-lgh-6tm1CanU) após 28 dias de umadas administrações de 60 mg/kg/7d ou 100 mg/kg/7d de bleomicina.

A FIG. 7 exibe a análise imuno-histoquímica do tecido pulmonarde camundongos do tipo selvagens (C57BL/6J) e de camundongos deficientesde células B (B6.\29S2-lgh-6tm1CanIJ) após 28 dias de qualquer uma dasadministrações de 100 mg/kg/7d de bleomicina ou de salina.

A FIG. 8 exibe o percentual de sobrevivência de camundongos dotipo selvagem (C57BL/6J, quadrados cheios) e de camundongos deficientes decélulas B (B6.\29S2-lgh-6tm1°9n/J, quadrados abertos) após a administração de100 mg/kg/7d de bleomicina ao longo de 28 dias.

As FIGs. 9A, 9B, 9C e 9D exibem o percentual de a- actina demúsculo liso (FIG. 9A), fibrose intersticial (FIG. 9B), túbulos dilatados (FIG. 9C)e túbulos saudáveis (FIG. 9D) em camundongos do tipo selvagem "B6Bwt"(C57BL/6J) e de camundongos deficientes de células B (B6.\29S2-lgh-6tm1C9n/J)submetidos a obstrução ureteral unilateral (Op) ou não operado (Unop).

A FIG. 10 exibe a análise histológica do tecido renal corado portricrômio de Masson obtido a partir de camundongos tipo selvagem (C57BL/6J)é de camundongos deficientes de células B (B6.\29S2-lgh-6tm1Can/J) submetidosa obstrução ureteral unilateral (Operated) ou não operado.

A FIG. 11 exibe a contagem de células B nos pulmões noscamundongos tratados, sem bleomicina (controle), com bleomicina e combleomicina mais anticorpo monoclonal anti-CD20.

A FIG. 12 exibe a contagem de células B esplênicas noscamundongos tratados, sem bleomicina (controle), com bleomicina e combleomicina mais anticorpo monoclonal anti-CD20.

A FIG. 13 exibe a análise por citometria de fluxo de células Bisoladas de pulmões de camundongos não tratados, ou de camundongos 9dias após a instilação de bleomicina e tratados com um anticorpo anti-CD20depletor de célula B, ou PBS.

A FIG. 14 exibe a quantificação da imuno-coloração de a- actinade músculo liso no tecido hepático de camundongos tratados com um anticorpoanti-CD20 depletor de células B1 um anticorpo controle isotipo ou PBS, após 6semanas de tratamento com 1,75 mg/kg de CCI4. Losangos, quadrados,triângulos e círculos representam os resultados obtidos para cada um doscamundongos tratados como indicado.

Descrição Detalhada Da Invenção

A presente invenção diz respeito a métodos de tratamento paraatenuar, reduzir ou prevenir a fibrose ou doenças fibróticas. Os métodos dainvenção compreendem em administrar a um paciente com necessidade de taltratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de célula B.

A expressão "doença fibrótica", conforme utilizado no presentedocumento refere-se a qualquer condição na qual o material do tecido fibrótico,tecido cicatricial, tecido conjuntivo, e/ou matriz extracelular (ECM) se acumulesobre ou dentro de um ou mais órgãos do corpo em resposta a uma lesãonestes tecidos (por exemplo, infecção, reação auto-imune, lesões mecânicas,lêsão químicas, diabetes, hipertensão, etc.) Conforme utilizado nestedocumento, a expressão "condições de fibrose" e a expressão "doençasfibróticas" pretende ter o mesmo significado.

Exemplos de doenças fibróticas incluem, mas não estão limitados a:

(I) Doenças associadas com fibrose, por exemplo, fibrosepulmonar idiopática, fibrose induzida por radiação, doença pulmonar obstrutivacrônica (DPOC), esclerodermia, fibrose pulmonar induzida por bleomicina,asma crônica, silicose, fibrose pulmonar induzida por amianto, lesão pulmonaraguda e desconforto respiratório agudo (incluindo a pneumonia induzida porbactérias, pneumonias induzidas por trauma, induzidas por vírus, induzidas porventilação, induzida por sepse não-pulmonar, e induzida por aspiração);

(II) Nefropatias crônicas associada com lesões/fibrose (fibroserenal), por exemplo, lúpus, diabetes, esclerodermia, nefrite glomerular,esclerose glomerular focai segmentar, nefropatia por IgA1 hipertensão,transplante, lúpus e Alport;

(III) Fibrose intestinal, por exemplo, esclerodermia, e fibroseintestinal induzida por radiação.

(IV) Fibrose hepática, por exemplo, cirrose, fibrose hepáticainduzida pelo álcool, esteatohepatite não alcoólica (NASH), lesão do duetobiliar, cirrose biliar primária, fibrose hepática induzidas por infecções virais (porexemplo, infecção crônica por HCV), e hepatite auto-imune;

(V) Fibrose de cabeça e pescoço, por exemplo, induzida porradiação;

(VI) Cicatriz corneal, por exemplo, LASIX, transplante de córnea,e trabeculotomia;

(VII) Cicatriz hipertrófica e quelóides, por exemplo, induzidas porqueimaduras e cirurgias; e

(VIII) Outras doenças fibróticas, por exemplo, sarcoidose,ésclerodermia, fibrose/lesões da medula espinhal, mielofibrose, reestenosevascular, aterosclerose, granulomatose de Wegener, doença mista do tecidoconjuntivo e doença de Peyronie.

A expressão "um paciente que necessite de tal tratamento",conforme usado neste documento designa um humano ou animal não humanoque necessita de tratamento para uma ou mais doença fibrótica como, porexemplo, qualquer uma das doenças fibróticas enumeradas acima. Um "umpaciente que necessita de tal tratamento", pode ser um humano ou animal não-humano que possuí acumulo de material de tecido fibrótico, tecido cicatricial,e/ou matriz extracelular (por exemplo, colágeno, vimentina, actina, etc) sobreou no interior de um ou mais órgãos do corpo. Um "um paciente que necessitede tal tratamento" pode ser, mas não necessariamente, um humano ou animalnão-humano que recebeu o diagnóstico clínico de uma ou mais doençafibrótica. Um "um paciente que necessita de tal tratamento" pode ser umhumano ou animal não-humano que apresenta um ou mais sintomas defibrose. (Khalil e O1Connor1 Canadian MedicaIJourna1171:153-160 (2004)). Porexemplo, um "um paciente que necessita de tal tratamento" pode ser umhumano ou animal não-humano que apresenta um ou mais sintomas de: umadoença fibróticâ do fígado (por exemplo, causada por lesão ou cicatrizaçãotecidual hepática, por exemplo, hepatites virais, abuso de álcool, drogas,doenças metabólicas devido à sobrecarga de ferro ou cobre, ataque auto-imune dos hepatócitos ou do epitélio do dueto biliar, ou anomalias congênitas)(Friedman, Biol. Chem. 275:2247-2250 (2000)); uma doença fibróticâ nopulmão (por exemplo, lesões ou cicatriz no tecido pulmonar causada por, ourelacionada a, uma resposta inflamatória no pulmão em resposta à um evento,incluindo, por exemplo, pneumonia intersticial idiopática) (Garantziotis et ai, J.Clin. Invest. 114:319 -321 (2004)); esclerodermia da pele ou de outro(s) órgão(s) (Trojanowska, Frontiers Biosci. 7:d608-618 (2002); e/ou uma doençafibróticâ do rim (por exemplo, lesão ou cicatrização no tecido renal relacionadoá glomerulosclerose ou fibrose intersticial tubular) (Negri, J. Nephrol. 77:496-503 (2004)).

De acordo com certos exemplos de realizações, "um paciente quenecessita de tal tratamento" não tem e/ou não possui risco de ter uma doençaauto-imune. Por exemplo, um "um paciente que necessita de taltratamento"pode ser, mas não é necessariamente, um paciente que nãorecebeu o diagnóstico clínico de uma ou mais doenças auto-imunes. Um"paciente que necessita de tal tratamento" pode ser, mas não énecessariamente, um paciente que não apresenta um ou mais sintomas deuma ou mais doenças auto-imunes. Conforme utilizado neste documento, aexpressão "doença auto-imune" é uma doença ou disfunção não-malignadecorrente e dirigida contra um antígeno e/ou tecido próprio do indivíduo. (Vide,por exemplo, a publicação do pedido de Patente US 2005/0095243). Destemodo, em certos exemplos de realização da presente invenção, um "pacienteque necessite de tal tratamento" é um paciente que não tenha recebido umdiagnóstico clínico de, ou que não apresenta um ou mais sintomas de uma oumais das seguintes doenças auto-imunes: Artrite reumatóide, artrite reumatóidejuvenil, lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença de Wegener1 doençaintestinal, inflamatória, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), púrpuratrombocitopênica trombótica (TTP), trombocitopênia auto-imune, esclerosemúltipla, psoríase, nefropatia por IgA1 polineuropatia por IgM, miastenia grave,vasculite, pacientes com diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndrome deSjõrgen ou glomerulonefrite.

Animais não humanos incluem, por exemplo, animais domésticose de criação, bem como animais de zoológico, animais de esporte e animais deestimação (por exemplo, gatos, cães, cavalos, vacas, etc).

A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz", conformeüsado no presente documento designa uma quantidade de antagonista ouantagonista de célula B, que é eficaz para prevenir, atenuar, ou melhorar otratamento dos sintomas da doença fibrótica em questão. Por exemplo, umaquantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de célula B, comoutilizada no presente, pode ser uma quantidade de antagonista de célula Bsuficiente para levar a uma diminuição em um ou mais marcadores de umadoença fibrótica. Exemplos de marcadores de doença fibrótica incluem, porexemplo, deposição de colágeno, deposição de a- actina de músculo liso, etc.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de células B emcertos exemplos de realização da presente invenção, é uma quantidade deantagonista de célula B suficiente para causar uma diminuição de 5%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 35 %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,80%, 90%, 95%, ou 100% na deposição de colágeno em relação ao nível dedeposição de colágeno observado antes da administração do antagonista decélula B. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de células Bem outros exemplos de realização da presente invenção, é uma quantidade deantagonista de célula B suficiente para causar uma diminuição de 5%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,80%, 90%, 95%, ou 100% na deposição de a- actina de músculo liso emrelação à deposição de a- actina de músculo liso observada antes daadministração do antagonista de célula B. Ainda em outros exemplos derealização da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz éuma quantidade de antagonista de célula B suficiente para causar uma melhorade 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 90%, 95%, ou 100% na função dos órgãos (por exemplo,função hepática, função pulmonar, função renal) em relação ao função doórgão observados antes da administração do antagonista de célula B.

Antagonistas ou Agentes Depletores de Células B

A expressão "antagonista de células B", conforme utilizado nopresente documento designa qualquer material ou agente capaz de inibir,afetar, retardar, melhorar ou infraregular o crescimento, sobrevivência,multiplicação ou função das células B (por exemplo, através da redução ouprevenção da resposta humoral pela célula B), ou que causem a morte oudestruição na totalidade ou em parte de uma população de células B. No casodeste último, tal antagonista de célula B pode ser denominado agente depletorde células B. Antagonistas de célula B pode ser peptídeos de seqüência nativaou sintética e moléculas pequenas que se ligam ou interagem com o antígenode superfície da célula B ou interagem com moléculas de sinalizaçãointracelular para inibir a função celular da célula B. Em alguns exemplos dereivindicações, o antagonista de célula B pode ser fundido ou conjugado comum agente citotóxico. De acordo com outros exemplos de realização dainvenção, o antagonista de célula B é uma proteína de fusão (por exemplo, BR-Fc) ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo contra um ou mais antígenos dasuperfície da célula B.Conforme mencionado acima, o antagonista de célula B pode serum agente que depleta células B sob ou após a administração do antagonistade célula B ao iPaciente. Por exemplo, o antagonista de célula B pode causaruma depleção de 2% a 100% de células B em 24 a 100 horas após aadministração do antagonista de célula B.

Por exemplo, o antagonista de célula B pode causar umadepleção de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%,26%, 28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%,52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%,78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, ou 100% decélulas B periféricas dentro de 24 horas da adminstração do antagonista decélula B (Por exemplo, como estabelecido na patente US 6.399.061).

Alternativamente, o antagonista de células B pode causar umadepleção de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 24%, 26%,28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 50%, 52%, 54%,56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%,84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, ou 100% de células B periféricasdentro de 48 horas da adminstração do antagonista de célula B.

Ainda em outro exemplo de realização, o antagonista de células Bpode causar uma depleção de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%,20%, 22%, 24%, 26%, 28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, 40%,42%, 44%, 46%,48%, 50%, 52%, 54%, 56%, 58%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%,74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, ou100% de células B periféricas dentro de 72 horas da adminstração doantagonista de célula B. A capacidade dos antagonistas ou agentes depletoresde célula B para tratar doenças fibróticas podem ser avaliados utilizando um oumais modelos de fibrose in vitro ou in vivo. Exemplos de modelosexperimentais de fibrose incluem, por exemplo, modelos de fibrose induzido portrauma (por exemplo, traumas cirúrgicos ou transplante de órgão, queimaduras,oclusão do dueto biliar, obstrução ureteral unilateral, isquemia e reperfusão,lesão pulmonar^nduzida por ventilação, lesões vasculares induzidas por balão,nefrectongia, irradiação, fistula aorto-caval traumática, e ritmo ventricularrápido); modelos de fibrose induzidas por toxina ou droga (por exemplo,bleomicina, amianto, sílica, ovalbumina, acetaldeído, tetracloreto de carbono,concanavalina A, cloreto de vinil, trinitrobenzeno sulfónico; oxazolona,ciclosporina A, Sulfato de níquel, e ceruleina); modelos de fibrose por doençasauto-imunes ou mediada pelo mau funcionamento do sistema imune (porexemplo, modelos de doenças por anticorpos ou imuno-complexos, rejeição dotransplante, modelo de camundongo "tight skin", lesão por isquemia ereperfusão, induzida pela lesão enxerto versus hospedeiro, artrite reumatóide);modelos de fibrose induzida por doença infecciosa crônica (espécies deSchistosoma ou hepatites virais crônica, Aspergillus fumigatus, Mycobacteriumtuberculosis, Trypanosoma cruzi); e modelos de camundongos geneticamentemodificados ou modelos de camundongos com infecções virais. (Por exemplo,camundongos transgênicos e knockout para fator de crescimentotransformador -(3 (TGF-|3) ou receptores de TGF-p, camundongos deficientesde moléculas de sinalização (por exemplo, camundongos com deficiência deSMAD-3 (mothers-against-decapentaplegic-homologue-3), camundongosdeficientes de Col4A3 (Alport), camundongos com deficiência de moléculas queafetam a ativação do TGF- p (por exemplo, integrina-a1 ou matrizmetaloproteinase-9), e camundongos transgênicos com genes de citocinas,infectados por vírus e camundongos knockout (por exemplo, Fator de necrosetumoral, interleucina-4 (IL-4), IL-13 ou IL-10)). (Wynn, Nature Reviews 4:583-594). Antagonistas de célula B da invenção incluem, por exemplo, antagonistasde célula B que demonstram melhor os sintomas da fibrose ou reduzem,retardam, prejudicar e/ou diminuem o grau da lesão fibrótica ou reduzem um oumais marcadores da lesão fibrótica. A análise de um agente, incluindo umantagonista de célula B1 pela sua capacidade de melhorar os sintomas dafibrose ou por reduzir a extensão da lesão fibrótica, em qualquer um dosmodelos, de fibrose acima mencionados está dentro das habilidades econhecimento dos técnicos hábeis no assunto.

Anticorpos

Os antagonistas ou agentes depletores de célula B da invençãopodem ser um anticorpo. A expressão "anticorpo", como usado nestedocumento, inclui, por exemplo, anticorpos nativos, anticorpos monoclonaisintactos, anticorpos policlonais, anticorpos muItiespecificos (por exemplo,anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos, dois anticorposintactos, fragmentos de anticorpos (por exemplo, fragmentos de anticorpos quese ligam e/ou reconhecem um ou mais antígenos), outros anticorposconstruídos multivalentes, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados,anticorpos humanos (Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551(1993); Jakobovits et ai., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et ai, Yearin Immunol. 7:33 (1993); Patente US 5.591.669 e 5.545.807), anticorpos efragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de fagos (McCafferty et al.,Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 552:624-628 (1991); Markset al., J. Moi Biol. 222:581-597 (1991); Marks et al., BiofTechnoIogy 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)).Métodos para a produção e utilização dos anticorpos são bem conhecidos noestado da técnica. (Vide, por exemplo, o documento WO 00/67796 e asreferências aí citadas).

Dois anticorpos que são particularmente úteis como antagonistaou agente depletor de célula B em conjunto com a presente invenção é orituximab, que é um anticorpo quimérico murino/humano, e o 2H7, um anticorpomurino humanizado contendo CDRs murino. O Rituximab está divulgado napatente US 6.399.061 enquanto o 2H7 e variantes destes estão divulgadas nodocumento WO 04/056312. Cada um destes documentos está incorporado aopresente docurrfento pela referência na sua totalidade.

Outros anticorpos anti-CD20 que são compatíveis com osensinamentos no presente inclui o anticorpo murino 2B8 marcado por ítrio [90]denominado "Y2B8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® disponívelcomercialmente pela Biogen-Idec (vide também patente US 5.736.137,incorporada ao presente pela referência); lgG2a "B1" murino, tambémdenominado "Tositumomab", marcado, opcionalmente com I131 para gerar oanticorpo "I131-Bl 38 (iodo I131 BEXXAR®) (Patente US 5.595.721,expressamente incorporada ao presente como referência); anticorpomonoclonal murino "1F5" (Press et al., Blood 69 (2):584-591 (1987) e variantesdeste incluindo anticorpos com "estrutura remendada" (framework patched) ouanticorpo 1F5 humanizado (documento WO 03/002607),; depósito ATCC HB-96450); HuMax-CD20™ (um anticorpo IgGI inteiramente humano, patentepedido de patente US 2004/167319; documento W004/035607, Genmab,Dinamarca); AME-133 (uma anticorpo CDR otimizado enxertado, Pedido dePatente US 2005/025764 e documento W004/103404, Applied MolecularEvolution); HumaLym™ (um anticorpo humano complete, lntracel); e hA20 (umanticorpo IgGI humanizado, Pedido de Patente US 2003/0219433; documentoWO 00/74718, lmmunomedics); e anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3,B-C1 ou NU-B2 disponíveis pela International Leukocyte Typing Workshop(Valentine et al., em: Leukocyte Typing III) (McMichael, Ed., pág. 440, OxfordUniversity Press (1987)).

A expressão "Fragmentos de anticorpos" compreende uma porçãode anticorpo intacto, geralmente contendo a ligação de antígeno ou regiãovariável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab,Fab', F(ab')2, fragmentos de Fv1 fragmentos Fv de cadeia única (scFv),anticorpos com domínios deletados, diacorpos; anticorpos lineares; moléculasde anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados porfragmentos de anticorpos.

A expressão "Anticorpos nativos" como utilizado no presente éutilizado para designar glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000D, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H)idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligaçãodissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações dissulfeto varia entreas cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeialeve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmenteespaçadas. Cada cadeia pesada contém, em uma extremidade, um domíniovariável (Vh) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia levecontém um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constantena sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado aoprimeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeialeve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se queresíduos de aminoácidos específicos formam uma superfície intermediáriaentre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.

A expressão "variável" indica o fato de que certas porções dosdomínios variáveis diferem extensamente na seqüência entre os anticorpos esão utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seuantígeno específico. A variabilidade não é, entretanto, distribuída regularmenteao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Tal variabilidade é concentradaem três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domíniosvariáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As porções mais altamenteconservadas dos domínios variáveis são denominadas regiões de estrutura(FRs). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendemquatro FRs cada um, adotando em grande parte uma configuração folha-p,conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam alças que conectam e,em alguns casos, fazem parte da estrutura folha- p. As regiões hipervariáveisde cada cadeia^são mantidas unidas em boa proximidade pelas FRs e, com asregiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio deligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et ai, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5a edição, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, Estados Unidos). (1991)). Os domínios constantes nãoestão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, masexibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo emcitotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual comüm único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujonome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento compepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém dois sítios de ligação deantígenos e ainda é capaz de reticular o antígeno.

"Fv" é o menor fragmento de anticorpo, que contém um sítiocompleto de reconhecimento e de ligação de antígenos. Esta região consisteem um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e em um de cadeialeve em forte associação não-covalente. É nesta configuração que as trêsregiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítiode ligação de antígenos sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, asseis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígenos aoanticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou a metade de umFv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para umantígeno) possui a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, emboraem afinidade mais baixa que o sítio de ligação completo.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentosFab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínasda região de articulação do anticorpo. Fab1-SH é a denominação do presentepara Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantescontém(êm) pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorposF(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos deFab' que contêm cisteínas de articulação entre tais fragmentos. Outrosacoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramentedistintos, denominados kappa (k) e Iambda (A), com base nas seqüências deáminoácidos dos seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de áminoácidos do domínio constantedas suas cadeias pesadas, anticorpos podem ser atribuídos a classesdiferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA1 IgD1IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas emsubclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e lgA2. Osdomínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classesdiferentes de anticorpos são denominados a,, õ, £, y e |j, respectivamente. Asestruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentesclasses de imunoglobulinas são bem conhecidas.

A expressão, fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou"scFv" como utilizado no presente pretende designar fragmentos de anticorposque compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que esses domíniosestão presentes em uma única cadeia de polipeptídeos. Preferencialmente, opolipeptídeo Fv compreende adicionalmente de um Iigante de polipeptídeoentre os domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejadapara se ligar aos antígenos. (Plückthun em The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag1 Nova Iorque,Estados Unidos, págs. 269-315 (1994)).

A expressão "diacorpos" como utilizado no presente, refere-se apequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígenos,que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a umdomínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl).Utilizando um Iigante que é curto demais para permitir o pareamento entre osdois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são obrigados a parear-secom os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligaçãode antígenos (Patente EP 404.097; Documento WO 93/11161, Hollinger et ai,Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993)).

Anticorpos policlonais incluem anticorpos que sãopreferencialmente, elevados em animais por meio de múltiplas injeçõessubeutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante.Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que sejaimunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina domolusco keyhole limpet, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor detripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo,maleimidobenzoiléster sufossuccinimida (conjugação através de resíduos decisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído,anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquiladiferentes.

Para produzir os anticorpos policlonais, os animais sãoimunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados por meiode combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado(para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvantecompleto de Freund e injeção da solução de forma intradérmica em diversoslocais. Após um mês, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 daquantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo deFreund, por meio de injeção subcutânea em diversos locais. Após 7 a 14 dias,os animais são sangrados e o soro é analisado para a titulação de anticorpos.

Os animais são estimulados até atingir o platô do título. Preferencialmente, oanimal é estimulado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado auma proteína diferente e/ou através de um reagente reticulante diferente. Osconjugados podem também ser feitos em cultura de células recombinantes naforma de fusões de proteínas. Além disso, agentes agregantes, tais como oalúmen (sulfato de alumínio), são adequadamente utilizados para amplificar aresposta imune.

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma como utilizado nopresente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpossubstancialmente homogêneos, por exemplo, cada anticorpo individual quecompreendem a população é idêntico e/ou se liga ao mesmo epítopo, excetopor possíveis variantes que surgem durante a produção do anticorpomonoclonal, em que tais variantes estão, geralmente, presentes emquantidades menores. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonaisque incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentesdeterminantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra umúnico determinante no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorposmonoclonais são vantajosos por não serem contaminados por outrasimunoglobulinas. O adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo comosendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmentehomogênea, e não deve ser interpretada como requerida a produção deanticorpos por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorposmonoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem serpreparados por meio do método de hibridoma descrito primeiramente porKohler et ai, Nature, 256:495 (1975), ou podem ser fabricados por meio demétodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente US 4.816.567). Os"anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas deanticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, emClackson et ai, Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai, J. Moi Biol.,222:581-597 (1991).

A expressão "anticorpos monoclonais" como utilizado no presenteinclui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), em que umaporção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, oupertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto orestante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentesèm anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ousubclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde queexibam a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; Morrison et ai,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos deinteresse no presente incluem anticorpos "primatizados", que compreendemseqüências de ligação de antígenos de domínio variável derivadas de primatasnão-humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo, tal como babuíno,rhesus ou macaco cinomolgo) e seqüências de região constante humana(Patente US 5.693.780).

Como utilizado no presente, formas "humanizadas" de anticorposnão-humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêmuma seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maiorparte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorporeceptor), nas quais os resíduos de uma região hipervariável do receptor sãosubstituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Emalguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humanasão substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, osanticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificaçõessão feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, oanticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelomenos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ousubstancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem aos de umaimunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são asde uma seqüência de imunoglobulina humana, exceto pela(s) substituição(ões)de FR indicada(s) acima. O anticorpo humanizado também compreenderá,opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região constante deimunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. (Jones etal., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988);e Presta, Curr. Op. Struct Biol. 2:593-596 (1992); Documento WO 00/67796).

A expressão "região hipervariável", quando utilizada no presente,designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveispela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende resíduos deaminoácidos de uma "região de determinação de complementaridade" ou"CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domíniovariável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domíniovariável de cadeia pesada; (Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest1 5a edição, Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, Estados Unidos. (1991)) e/ou os resíduos de uma "alçahipervariável" (por exemplo, os resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) nodomínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) nodomínio variável de cadeia pesada; (Chothia e Lesk, J. Moi Biol. 196:901-917(1987)). Resíduos de "estrutura" ou "FR" são os resíduos de domínios variáveisdiferentes dos resíduos de região hipervariável, conforme definido no presente.

Antígenos de Superfície da Célula B

Em certos exemplos de realização da invenção, os antagonistasde célula B são anticorpos contra um antígeno de superfície da célula B.Conforme utilizado neste documento, a expressão "antígeno de superfície decélulas B" no presente refere-se a qualquer antígeno expresso na superfície dacélula B, em alguns exemplos de realização da invenção, o "antígeno desuperfície de células B" é um antígeno que é expresso na superfície dascélulas B em indivíduos saudáveis. Em outros exemplos de realização, o"antígeno de superfície de células B" é um antígeno que é expresso nasuperfície das células B de pessoas que sofrem de uma doença. Ainda emõutros exemplos de realização o "antígeno de superfície de células B" é umantígeno que é expresso na superfície das células B tanto em indivíduossaudáveis quanto em indivíduos que sofrem de uma doença. De acordo comalguns exemplos de realização da invenção, o antígeno de superfície decélulas B é expresso em células B a uma maior escala (por exemplo, 2x maior,3x maior, 4x maior, 5x maior, 10x maior, 100x maior, ou mais) do que emcélulas não B. Alternativamente, o antígeno de superfície de células B, deacordo com certos exemplos de realização, pode ser expresso em células B namesma medida ou em menor escala do que em células não B. Certosantígenos de superfície de células B podem ser expressos constitutivamentesobre células não B e/ou expressa em células B ativadas. Em determinadosexemplos de realização da invenção, o antígeno de superfície da célula B estáexpresso apenas nas células B.

Exemplos de marcadores de células B incluem os marcadores desuperfície de leucócitos CD 10, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24,CD37, CD40, CD52, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77,CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86.Outros marcadores de superfície de células B incluem receptores 'To// Like"(por exemplo, "TLR-7 e TLR-9) receptores de quimiocinas (por exemplo,CXCR3) e APRIL (Medema et al, Cell Death Differ. 70:1121-1125 (2003)) Osreceptores BAFF (BAFFR/BR3, BCMA e TACI) podem também serconsiderados antígenos de superfície de célula B para os propósitos dapresente divulgação.

De acordo com certos exemplos de realização da invenção, oantígeno de superfície da célula B é CD19. O antígeno "CD19" refere-se a umantígeno de - 90kDa identificado, por exemplo, como HD237-CD19 ouanticorpo B4 (Kiesel et al - Leukemia Research // 12:1119 (1987)). O CD 19 éencontrado na diferenciação de todas as linhagens de células tronco a partir dafase até um ponto pouco antes da diferenciação terminal em célulasplasmáticas. Ligação do antígeno de superfície da célula B ao antígeno CD 19pode causar internalização do antígeno CD 19.

O antagonista de célula B pode ser, por exemplo, o Lym-1, umanticorpo lgG2a que reconhece células B; B2, um anticorpo direcionado contrao antígeno CD21; B3, um anticorpo dirigido contra o antígeno CD22; ou J5, umanticorpo dirigido contra o antígeno CD10 (Patente US 5.843.398). Anticorposanti-CD22 que são úteis como antagonistas de células B no contexto dapresente invenção estão descritos, por exemplo, nas patentes US 5.484.892,US 5.789.557, US 5.789.554, documento WO 98/42378, documento WO00/20864, documento WO 98/41641, e em Campana, D. et al., J. Immunol.134:1524 (1985), Dorken et al., J. Immunol. 150:4719 (1993) e Engel et al., J.Immunol. 150:4519 (1993). Neste aspecto, o anticorpo anti-CD22 epratuzumabé particularmente útil na presente invenção.

Exemplos adicionais de anticorpos CD22 que possam serutilizados como antagonistas de células B no contexto da presente invençãoestão descritos, por exemplo, nas Patentes US 5.484.892, US 5.789.557, US6.846.476, e nos documentos WO 98/42378, WO 00/20864, e WO 98/41641.

Dé acordo com certos exemplos de realização da invenção, oantígeno.de superfície de célula B é CD23. CD23 é um receptores para IgE debaixa afinidade. CD23 é conhecido por regular a adesão celular mediada porIgE e liberação de histamina, inibição da apoptose em células B e regulação docrescimento de células mielóides. Vide, por exemplo, Conrad, Annu RevImmunol 5:623-645 (1990); Delespesse et al Adv. Immunol. 49:149-191 (1991);Bonnefoy et al., Curr Opin Immunol 5:944-947 (1993). Anticorpos específicospara CD23 e seu uso são discutidos em, por exemplo, Rector et al. Immunol.55:481-488 (1985); Suemura et al,. J. Immunol. 137:1214-1220 (1986); Noro etal., J. Immunol 737:1258-1263 (1986); Bonnefoy et al. J. Immunol 138:2970-.2978 (1987); Flores-Romo et al. Science 2(57:1038-1046 (1993); Sherr et al. J.Immunol. 742:481-489 (1989); Pene et al. Proc. Nati Acad. Sei, 55:6880-6884(1988); e Bonnefoy et al.. (documento W087/07302); Bonnefoy et al.(documento W096/12741)); Bonnefoy et al. Eur. J. Immunol. 20:139-144(1990); Sarfati et al. J. Immunol. 141:2195-2199 (1988) e Wakai et al.Hybridoma 12:25-43 (1993); Vide, também as Patentes US 7.008.623, US6.893.638 e US 6.011.138.

De acordo com certos exemplos de realização da invenção, oantígeno de superfície de célula B é CD80. O CD80 (também conhecido como"B7.1") revelou-se crucial na geração de respostas imune. (Azuma et al., J.Exp. Med. 777:845-850 (1993); Freeman et al., J. Immunol. 143:2714-2722(1989); Hathcock et al, Science 262:905-911 (1993); Hart et al, Immunol.79:616-620 (1993)). Anticorpos específicos para CD80 foram descritos,incluindo, por exemplo, um anticorpo IgGI primatizado específico para CD80humano designado de "IDEC-114n. (Patentes US 5.736.137, US 6.113.898).

De acordo com certos exemplos de realização preferidos dainvenção, o antígeno de superfície da célula B é CD20. O antígeno "CD20" éuma fosfoproteína não glicosilada de ~35 kDa, encontradas na superfície demais de 90% (Jas céluals B do sangue periférico ou dos órgãos linfóides. OCD20 é expresso precocemente no desenvolvimento da célula pré-B epermanece até a diferenciação da célula no plasma. O CD20 está presentetanto nas células B normais, quanto nas células B malignas. Outros nomes doantígeno CD20 na literatura incluem "antígeno restrito de linfócitos B" e "Bp35".O antígeno CD20 está descrito, por exemplo, em Clark et al. Proc. Natl. Acad.Sei. 82:1766 (1985).

Anticorpos Contra CD20

O antagonista de célula B da invenção pode ser um anticorpo contraCD20. Qualquer anticorpo contra CD20 conhecido no estado da arte que funcionaeomo um antagonista de células B pode ser utilizado no contexto da presenteinvenção. (Vide, por exemplo, Patentes US 6.682.734, 6.538.124, 6.528.624,6.455.043, 6.410.391, 6.399.061, 6.368.596, 6.287.537, 6.242.195, 6.224.866,6.171.586, 6.194.551, 6.120.767, 6.015.542, 6.090.365, 5.849.898, 5.843.439,5.843.398, 5.776.456, 5.736.137, 5.721.108, 5.677.180, 5.595.721; Pedidos depatente US , 2005/0069545, 2005/0053602, 2005/0025764, 2004/0167319,2004/0093621, 2003/0219433, 2003/0157108, 2003/0147885, 2003/01339301,2003/0103971, 2003/0095963, 2003/0082172, 2003/0068664, 2003/0026801,2003/0021781, 2002/0197256, 2002/0197255, 2002/0128448, 2002/0058029,2002/0041847, 2002/0012665, 2002/0009444, 2002/0006404, 2002/0004587;Pedidos de patentes internacionais WO00/09160, WOOO/27428, WOOO/27433,WOOO/44788, W001/10462, W001/10461, W001/10460, W002/04021,WO01/74388, W001/80884, W001/97858, W002/34790, W002/060955,W02/096948, W002/079255, W098/56418, W098/58964, W099/22764,W099/51642, W000/42072, WOOO/67796, W001/03734, W001/77342,WO00/20864, W001/13945, WOOO/67795, WOOO/74718, WOOO/76542,W001/72333, W002/102312, W003/002607, W0049694, W003/061694,W095/0377Q; e pedido de patente Europeu 330,191 e 332,865).

Exemplos de anticorpos que ligam ao CD20 estão definidos, porexemplo, no pedido de patente US 2005/0053602e incluí "C2B8", que étambém denominado "Rituximab" ("RITUXAN®") (Patente US 5.736.137); oanticorpo murino 2B8 marcado por ítrio [90] denominado "Y2B8" ou"Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® (Patente US 5.736.137); lgG2a "B1" murino,também denominado "Tositumomab", marcado, opcionalmente com I131 paragerar o anticorpo "I131-Bl" (iodo I131 tositumomab, BEXXAR®) (US 5.595.721);anticorpo monoclonal murino "1F5" (Press et ai, Blood 69 (2):584-591 (1987) e1F5 humanizado ou "estrutura remendada" (framework patched) (documentoWO 03/002607); depósito ATCC: HB-96450); anticorpo 2H7 murino e 2H7jquimérico (US 5.677.180); 2H7 humanizado; huMax-CD20 (Genmab,pinamarca); AME-133 (Applied Molecular Evolution); e os anticorposmonoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ou NU-B2 disponíveis por meio doInternational Leukocyte Typing Workshop (Valentine et aí., em: LeukocyteTyping III) (McMichael, Ed., pág. 440, Oxford University Press (1987)).

Os termos "rituximab" ou "RITUXAN®" no presente indicam oanticorpo monoclonal, humano/murino, quimérico geneticamente elaboradodirecionado contra o antígeno CD20 e denominado "C2B8" na US 5.736.137,incluindo seus fragmentos que retêm a capacidade de se ligar ao CD20.

Em certos exemplos de realização, os anticorpos anti-CD20 seligam ao CD20 humano e primata. Em um exemplo de realização específico, osanticorpos que se ligam ao CD20 são humanizados ou quiméricos que se ligamao CD20 e incluem rituximab (RITUXAN ®), m2H7 (2H7 murino), hu2H7 (2H7humanizado) e todas as suas variantes funcionais, incluindo, sem se limitar,hu2H7.vl6 (v é utilizado para versão), v31, v73, v75, v114, v511, bem comovariantes deficiente de fucose. As seqüências de algumas variantes doanticorpo hu2H7 são definidas no documento WO 04/056312, a qual éincorporada ao presente pela referência na sua totalidade, e são fornecidas abaixo, com a Seqüência de aminoácido N-terminal em negrito sendo que aseqüência líder é removida no polipeptídeo maduro:hu2H7.vl6 L cadeia [232 aa] (SEQ ID N0:1):

MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

hu2H7.vl6 H cadeia [471 aa] (SEQ ID N°:2):MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEVWGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRedtavyycarwyysnsywyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIERTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKhu2H7.v31 H cadeia [471 aa] (SEQ ID N°:3):MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

A"cadeia L da v31 é a mesma que o da vl6 acima, ou seja, SEQID N0: 1..,

O termo "2H7v.l6 humanizado", conforme usado no presentedocumento, refere-se a um anticorpo intacto ou fragmento de anticorpocontendo a seqüência da cadeia leve variável:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLrYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID N°:4);

E a seqüência pesada variável:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAI

YpgngdtsynqkfkgrftisvdkskntlylqmnslraedtavyycarwyysJhJSY WYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N°:5).

Se o anticorpo 2H7v.l6 humanizado é um anticorpo intacto, esteconsta preferencialmente da seqüência de aminoácido da cadeia leve vl6:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRPSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N°:6);

E da seqüência de aminoácido da cadeia pesada v16:EVQLVESGGGLVQPGGSLPvLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N°:7).

Anticorpos variantes 2H7 exemplares, contendo a seqüência deaminoácidos da v16 exceto nas posições da substituição dos aminoácidos queestão indicados na tabela abaixo. A não ser que seja de outra forma indicado,as variantes 2H7 terão a mesma cadeia pesada que a v16.

Tabela 1

<table>table see original document page 33</column></row><table>Uma variante do mAb 2H7 humanizado anterior é o 2H7v.31 coma mesma seqüência da cadeia L como na SEQ ID N°: 6 acima, com aseqüêncisrda cadeia H:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N°:8)

O anticorpo murino anti-CD20 humano, m2H7,tema seqüência VH:QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARWYYSNSY WYFDVWGTGTTVTVS (SEQ ID N°:9);E a seqüência VL:

QrVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLELK (SEQ ID N0: 10).

Outro anticorpo 2H7 humanizado preferido consta da seqüênciado domínio leve variável do 2H7.v511:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N°:11)

e a seqüência do domínio pesado variável do 2H7.v511:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRY WYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0: 12).

Se o anticorpo 2H7.v511 humanizado é um anticorpo intacto, estepode constar da seqüência aminoácido da cadeia leve:QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRPSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSWIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N°:20)

e da seqüência aminoácido da cadeia pesada da SEQ ID N°:7 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFepvwswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvn

HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPPvEPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID N°: 13).

A menos que seja indicado, as seqüências aqui informadas doanticorpo 2H7v.l6 humanizado e seus variantes são de polipeptídeos maduros,ou seja, sem a a seqüência líder. (Pedido de Patente US 2005/0095243).Antagonistas BAFF, Antagonistas dos Receptores de BAFF. ε Outros

Antagonistas de célula B

BAFF (também conhecido como BLyS, TALL - 1, THANK,TNFSF13B, ou zTNF4) é um membro da superfamília do TNF1 Iigante que éessencial para a sobrevivência e maturação das células B. a superexpressãode BAFF em camundongos transgênicos leva a hiperplasia de célula B e aodesenvolvimento de doença auto-imune grave (Mackay, et ai (1999) J. Exp.Med. 190, 1697-1710; Gross, et al. (2000) Nature 404, 995 -999; Khare, et al.(2000) Proc. Natl. Acad. Sei. 97, 3370-33752-4). O BAFF atua em células Batravés da ligação de três membros da superfamília dos receptores TNF1 TACI,BCMA, e BR3 (também conhecido como BAFF-R) (Gross, et al.., Supracitado;Thompson1JS, et ai, (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., et ai (2001)Curr. Bioi 11:1547-1552; Yan, M., et ai (2000) Nat. Immunol. 1:37-41;Schiemann, B., et ai (2001) Science 293:2111-2114). Dos três receptoresBAFF, apenas BR3 é específico para BAFF; os outros dois também se ligam aomembro da família do TNF, APRIL. BR3 é uma proteína transmembrana tipo Illde 184 resíduos expresso na superfície de células B. (Pedido de Patente US2005/0095243).

De acordo com certos exemplos de incorporações da invenção, oantagonista de célula B é um antagonista BAFF ou um antagonista de receptor'BAFF. O termo "antagonista de BAFF", como usado no presente documento,inclui qualquer molécula capaz de se ligar, associar, e/ou interagir com umaseqüência de polipeptídeo nativo de BAFF e bloquear parcial ou totalmente,inibir, ou neutralizar a seqüência nativa da sinalização de BAFF. Em exemplosde realização selecionados, a presente invenção inclui o uso de anticorpos oufragmentos, que se ligam ou se associam a BAFF. Aqueles hábeis na técnicaapreciarão que a sinalização da seqüência nativa do polipeptídeo BAFFpromove, entre outras coisas, a sobrevivência e a maturação da célula B. Porexemplo, um Iigante de BAFF biologicamente ativo potencializa qualquer umaou a combinação dos seguintes eventos in vitro ou in vivo: (i) um aumento dasobrevida das células B, (ii) um maior nível de IgG e/ou IgM, (iii) um aumentono número de células plasmáticas; e (iv) processamento do NF-KB2/100 emNF-KB p52 em células B esplênicas (por exemplo, Batten et al. J. Exp. Med.192:1453-1465 (2000); Moore, et al Science 285:260-263 (1999); Kayagaki etai, Immunity 77: 515-524 (2002). Assim, a inibição, bloqueio ou neutralizaçãoda sinalização de BAFF resulta na, dentre outras coisas, redução do número decélulas B. Conseqüentemente, um antagonista de BAFF1 de acordo comdeterminados aspectos da invenção, irá bloquear, inibir ou neutralizar parcialou totalmente uma ou mais atividades biológicas in vitro ou in vivo de umpolipeptídeo BAFF e, assim, reduzir ou inibir a atividade das células B. Váriosensaios úteis para testar antagonistas BAFF estão descritos; nos pedidos dePatente 2005 / 0095243.

Peptídeos úteis como antagonistas de BAFF incluem, porexemplo, peptídeos referidos como TALL-1 12-3 no documento WO 02/092620,com a seguinte seqüência de aminoácidos:

MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVjLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALFfNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N0:14).

Este peptídeo, bem como outros exemplos de peptídeosdivulgado no documento WO 02/092620, se liga a BAFF e inibe a ligação doBAFF aos seus receptores, BR3, TACI e BCMA. Os peptídeos antagonistas deBAFF estabelecidos no documento WO 02/092620 pode, por exemplo, emcertas incorporações, estar acoplado a um Fc ou PEG.

Peptídeos antagonistas de BAFF adicionais podem incluirpeptídeos ou polipeptídeos que contenham uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo constituído pela: ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID N0:15), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID N0: 16), ECFDLLVRRWVPCEMLG(SEQ ID NO: 17), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID N0: 18), eECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N0: 19), e polipeptídeos que contenhamuma seqüência de aminoácidos que é idêntica em pelo menos 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%97% 98% ou 99% a qualquer uma das SEQ ID N°: 15,16,17,18 ou 19.

Peptídeos antagonistas de BAFF adicionais que podem serusados na prática dos métodos da presente invenção incluem polipeptídeosque constam da seqüência de aminoácidos da Fórmula I, Il ou Formula III,conforme definido no pedido de Patente US 2005/0095243.

Em alguns exemplos de realização da invenção, o antagonistaBAFF é um anticorpo anti-BAFF, imunoadesina ou moléculas pequenas. Aimunoadesina, em certos exemplos de realização contém uma região deligação de BAFF de um receptor de BAFF (por exemplo, um domínioextracelular do BR3, BCMA ou TACI) construído sob a forma solúvel. Em umexemplo de realização preferido, a imunoadesina é BR3 - Fc, ou polipeptídeosque possuem uma das seqüências da SEQ ID N0: 15, 16, 17, 18 ou 19(conforme definido no pedido de Patente US 2002/0037852, US 2003/0059937,US 2005/0095243 e US 2005/0163775). Em outros exemplos de realização aimunoadesina é uma forma solúvel de TACI ou BCMA (por exemplo, TACI-Fc,ou BCMA-Fc).

Os técnicos no assunto irão apreciar que os anticorpos oufragmentos, que se ligam ou se associam especificamente ao BAFF, tambémsão compatíveis com os ensinamentos do presente e são de técnicasconhecidas, por exemplo, no pedido de Patente US 2003/0059937. Umexemplo de anticorpo, de acordo com este aspecto da invenção é oLymphoStat-B™ (belimumab) (Human Genome Sciences, Inc.), um anticorpomonoclonal humano que reconhece e inibe especificamente a atividadebiológica do BAFF.

De acordo com alguns outros exemplos de realização dainvenção, o antagonista de célula B é um antagonista do receptor BAFF. Otermo "antagonista de receptor BAFF", conforme utilizado no presente incluiqualquer molécula que se liga ou se associa a um polipeptídeo de seqüêncianativa do receptor BAFF (por exemplo, BR3, TACI ou BCMA) e/ou bloqueia,inibe ou neutraliza parcial ou totalmente a sinalização da seqüência nativa deBAFF através dos receptores. Desta forma, em um exemplo de realizaçãoespecífico da invenção, o antagonista de célula B compreende um anticorpo oufragmento deste, polipeptídeo ou moléculas pequenas que se ligaespecificamente com Btk, TACI, BCMA (pedido de Patente US 2002/0081296)ou BAFF-R (pedido de Patente US 2002/0165156). Outros exemplos deantagonistas de célula B incluem, por exemplo, anticorpos, polipeptídeos oumoléculas pequenas que inibem a interação dos motivos ITAM da lg-a/lg-βcom os seus anticorpos alvos, polipeptídeos ou moléculas pequenas queinibem a ativação da via clássica ou alternativa do NF-KB, e anticorpos,polipeptídeos ou moléculas pequenas que inibem a OCA-B, CD40, LT-P e etc.

Conjugados ε Outras Modificações de Antagonistas de Célula B

De acordo com certos exemplos de realização da invenção, oantagonista de célula B é conjugado com um agente citotóxico.

Agentes quimioterápicos úteis para a geração de antagonistas decélulas B conjugados com agentes citotóxicos são bem conhecidas no estadoda arte.

Conjugados de um antagonista de célula B e uma ou mais toxinasde moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansina (patente US5.208.020), tricoteno e CC1065, também são contemplados no presente. Emuma realização da presente invenção, o antagonista de célula B é conjugado auma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10moléculas de maitansina por molécula antagonista de célula Β). A maitansinapode ser convertida, por exemplo, em May-SS-Me, que pode ser reduzido emMay-SH3 e reagido com antagonista modificado (Chari et ai, Câncer Research52:127-131 (1992)) para gerar um conjugado de antagonista e maitansinóide.Alternativamente, o antagonista de célula B é conjugado a uma oumais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos écapaz de produzir rupturas de DNA de fita dupla em concentrações sub-picomolgres. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizadosincluem, mas não se limitam a, γΛ a.2, az, N-acetil-γ-ι1, PSAG e θ'ι (Hinman etal, Câncer Research 53:3336-3342 (1993) e Lode et ai, Câncer Research58:2925-2928 (1998)).

Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podemser utilizados incluem a cadeia A diftérica, fragmentos ativos não-ligantes datoxina diftérica, cadeia A da exotoxina (da Pseudomonas aeruginosa), cadeia Ade rícino, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteínasde Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana(PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcina, crotina,inibidor da Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina,fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, o documento WO93/21232, publicado em 28 de outubro de 1993. Maitansinóides podemtambém ser conjugados a um antagonista de célula B.

A presente invenção contempla adicionalmente um antagonista decélula B conjugado a um composto com atividade nucleolítica (por exemplo,uma ribonuclease ou uma endonuclease de DNA, tal como umadesoxirribonuclease; DNase).

Uma série de isótopos radioativos está disponível para aprodução de antagonistas de célula B radioconjugados. Exemplos incluemAt211, I131,1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu.

Os conjugados do antagonista de célula B e agente citotóxicopodem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores deproteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)(SPDP), cicloexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila),iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidatode dimetila HÒL), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila),aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(para-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(para-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato detolieno) e compostos fluorados bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Pode-se preparar, por exemplo, uma imunotoxina rícina,conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono14 (MX-DTPA) é exemplo de um agente quelante para conjugação deradionucleotídeo ao antagonista de célula B. Vide o documento WO 94/11026.

O Iigante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação do fármacocitotóxico na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, um ligante de ácido lábil,ligante sensível a peptidase, ligante de dimetila ou ligante que contémdissulfeto (Chari etal., CancerResearch 52:127-131 (1992)).

Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende oantagonista de célula B e agente citotóxico pode ser elaborada, por exemplo,por meio de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos.

Em ainda outro exemplo de realização, o antagonista de célula Bpode ser conjugado a um "receptor" (tal como a estreptoavidina) para serutilizado em uma pré-localizador, onde o conjugado antagonista de célula B-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não-Iigado na circulação, utilizando um agente de limpeza e, em seguida, éadministrado um "ligante" (por exemplo, a avidina) que é conjugada a umagente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

Os antagonistas de célula B de acordo com a presente invençãopodem também ser conjugados a uma enzima ativadora de pró-fármacos, queconverte um pró-fármaco (por exemplo, um agente quimioterápico de peptidíla,vide o documento WO 81/01145) em um fármaco anticancerígeno ativo. Vide,por exemplo, o documento WO 88/07378 e a patente US 4.975.278. Ocomponente dê enzima de tais conjugados inclui qualquer enzima capaz deagir sobre um pró-fármaco, de forma tal a convertê-lo em sua forma citotóxicamais ativa.

Enzimas que são úteis no método de acordo com a presenteinvenção incluem, mas não se limita a, fosfatase alcalina útil para a conversãode pró-fármacos que contenham fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útilpara a conversão de pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres;citosina desaminase útil para a conversão de 5-fluorocitosina atóxica nofármaco anti-cancerígeno, 5-fluorouracila; proteases tais como serratiaprotease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais comocatepsinas BeL) que são úteis para a conversão de pró-fármacos contendopeptídeos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para aconversão de pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimasde clivagem de carboidratos tais como O-galactosidase e neuraminidase úteispara a conversão de pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamaseútil para a conversão de fármacos derivados com β-lactamas em fármacoslivres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina Gamidase, úteis para a conversão de fármacos derivados nos seus nitrogêniosamina com grupos fenoxiacetil ou fenilacetil, respectivamente, em fármacoslivres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, tambémconhecidos no estado da técnica como "abzimas", podem ser utilizados paraconverter os pró-fármacos de acordo com a presente invenção em fármacosativos livres (vide, por exemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)).

Conjugados de antagonista de célula B-abzima podem ser preparadosconforme descrito no presente para o fornecimento da abzima a umapopulação de células ou tecido.As enzimas de acordo com a presente invenção podem serligadas covalentemente ao antagonista de célula B por meio de métodos bemconhecidos no ^estado da técnica, tais como o uso dos reagentes reticulantesheterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, as proteínas de fusãoque compreendem pelo menos o sítio de ligação de antígenos de umantagonista de acordo com a presente invenção ligado a pelo menos umaporção funcionalmente ativa de uma enzima de acordo com a presenteinvenção podem ser construídas utilizando métodos de DNA recombinante bemconhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Neuberger et al., Nature,312:604-608(1984)).

Outras modificações do antagonista de célula B sãocontempladas no presente. O antagonista de célula B pode ser ligado, porexemplo, a um dentre uma série de polímeros não-proteináceos, tais comopolietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros depolietilenoglicol e polipropilenoglicol.

Um exemplo de polímero que pode ser usado para conjugação de umantagonista de célula B é uma polialqileno (PEG). Frações de PEG, por exemplo, 1,2, 3,4 ou 5 polímeros de PEG, podem ser conjugados a cada antagonista de célulaB para aumentar sua meia vida sérica, quando comparado com um antagonista decélula B sozinho. As frações do PEG não são antigênicas e são biologicamenteinertes. Frações do PEG utilizados na prática da invenção podem ser ramificadasou não ramificadas (de cadeia linear).

O número de frações do PEG ligado ao antagonista de célula B ea massa molecular das cadeias individuais do PEG podem variar. Em geral,quanto maior o peso molecular do polímero, menos cadeias de polímero estãoanexadas ao polipeptídeo. Normalmente, a massa total do polímero anexadoao antagonista de célula B é de 20 kDa a 40 kDa. Assim, se uma cadeia dopolímero encontra-se anexada, o peso molecular da cadeia é geralmente de20-40 kDa. Se duas cadeias encontram-se anexadas, o peso molecular decada cadeia é geralmente de 10-20 kDa. Se três cadeias encontram-seanexadas, o pêso molecular é geralmente de 7-14 kDa.

Os polímeros, por exemplo, PEG, podem ser acoplados aoantagonista de célula B através da exposição de um grupo reativo adequado nopolipeptídeo. O(s) grupo(s) reativo(s) exposto(s) pode(m) ser, por exemplo, umgrupo amino N-terminal ou um grupo amino épsilon de um resíduo de Iisinainterna, ou de ambos. Um polímero ativado pode reagir e fazer uma ligaçãocovalente em qualquer grupo de aminoácidos livre no antagonista de célula B.

Grupos carboxílicos livres, grupos carbonil devidamente ativados, hidroxila,guanidila, imidazol, frações de carboidratos oxidados e grupos mercapto doantagonista de célula B (se disponível) também podem ser utilizados comogrupos reativos para a ligação do polímero.

Em uma reação de conjugação, é tipicamente empregada cercade 1,0 a 10 moles de polímero ativado por mol de polipeptídeo, dependendo daconcentração de polipeptídeo, Normalmente, a relação escolhida representaum equilíbrio entre a maximização da reação enquanto minimiza reaçõesparalelas (muitas vezes não específicas), que pode prejudicar a atividadefarmacológica desejada do antagonista de célula B. De preferência, pelomenos 50% da atividade biológica (como demonstrado, por exemplo, emqualquer um dos ensaios aqui descritos ou de técnicas conhecidas), doantagonista de célula B é mantida, e de preferência aproximadamente 100% émantida.

O polímero pode ser conjugado com a utilização de antagonistade célula B utilizando a química convencional. Por exemplo, um grupopolialquileno glicol pode ser acoplado a um grupo amino de Iisina épsilon doantagonista de célula Β. A ligação às cadeias laterais da Iisina pode serexecutada com um éster ativo N-hidroxilsuccinimida (NHS) como o succinatode succinimidil PEG (SS-PEG) e o propionato de succinimidil (SPA-PEG).Frações adequadas de polialquileno glicol incluem, por exemplo, carboximetil-NHS e norleucina-NHS, SC. Estes reagentes são comercialmente disponíveis.Outros Iigantes de PEG amino reativos podem ser substituídos pelo gruposuccinimidil. Estes incluem, por exemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos(PNP), epóxido, carbonatos de benzotriazol, SC-PEG, tresilato, aldeído,epóxido, carbonilimidazol e carbonato PNP. As condições são geralmenteotimizadas para maximizar a seletividade e extensão da reação. Tais condiçõesde otimização da reação estão dentro das habilidades dos técnicos no assunto.

A PEGilação pode ser realizada por qualquer uma das reações dePEGilação conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Focus on Growth Factors3:4-10,1992 e Pedidos de patente européia EP 0154316, EP 0401384. APEGilação pode ser realizada através de uma reação de acilação ou umareação de alquilação com uma molécula reativa de polietileno glicol (ou de umpolímero análogo reativo solúvel em água).

A PEGilação por acilação geralmente envolve a reação de uméster ativo derivado de polietileno glicol. Qualquer molécula de PEG reativapode ser empregada na PEGilação. PEG esterificados em N-hidroxisuccinimida(NHS) são freqüentemente utilizados como éster de PEG ativado. Comoutilizado no presente o termo "acilação" incluí, sem se limitar, os seguintestipos de ligações entre as proteínas terapêuticas e os polímeros solúveis emágua, como o amido PEG, carbamato, uretano, e similares. Vide, por exemplo,Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994. Os parâmetros de reação sãogeralmente selecionados para evitar que as condições de temperatura,solvente, e pH possa prejudicar ou desativar o antagonista de célula B.

Geralmente, o vínculo de ligação é um amido e, normalmente,pelo menos, 95% do produto resultante é mono-, di- ou tri-PEGilado. Noentanto, algumas espécies com graus maiores de PEGilação pode serconstituída nos montantes dependendo das condições de reação específicasutilizadas. Opcionalmente, esécies pegiladas purificadas são separadas damistura, 'particularmente espécies que não reagiram, por métodosconvencionais de depuração, incluindo, por exemplo, diálise, precipitação porsalificação, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica, cromatografia defiltração em gel, cromatografia de troca hidrofóbica e eletroforese.

A PEGilação por alquilação geralmente envolve a reação de umaldeído terminal derivado do PEG com um antagonista de célula B da invençãona presença de um agente redutor. Além disso, é possível manipular ascondições da reação para favorecer substancialmente a PEGilação apenas nogrupo N-amino terminal do antagonista de célula B, ou seja, uma proteínamonoPEGilado. Em qualquer um dos casos de mono- PEGilação ou poli-PEGilação, os grupos de PEG normalmente são ligados à proteína através deum grupo -CH2-NH. Com especial referência ao grupo -CH2, este tipo deligação é conhecido como ligação "alquila".

A derivatização através de alquilação redutora para produzir umproduto mono-PEGilado marcado no segmento N-terminal explora a reatividadediferencial de diferentes tipos de grupos de aminoácidos primários (lisinaversus o N-terminal) disponíveis para a derivação. A reação é realizada em umpH que permite aproveitar as diferenças do pKa entre os grupos amino-épsilondos resíduos de lisina do grupo amino N-terminal das proteínas. Por taisderivatizações seletivas, a fixação de um polímero solúvel em água que contémum grupo reativo, por exemplo, um aldeído, para uma proteína é controlada:conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-terminal daproteína e nenhuma alteração significativa de outros grupos reativos, como ogrupo amino das cadeias laterais de lisina, ocorre.

As moléculas de polímero usadas tanto no acesso da acilaçãoquanto na alquilação são selecionadas entre polímeros solúveis em água. Opolímero selecionado é tipicamente modificado para ter um único grupo reativo,como um éster ativo de acilação ou um aldeído de alquilação, a fim de que ograu de polimêrização possa ser controlado, assim como previsto para ospresentes métodos. Um exemplo de aldeído PEG reativo a é o polietilenoglicolpropionaldeído, que é estável em água, ou o mono C1-C10 alcóxi ou derivadosde arilóxi (vide, por exemplo, Harris et ai., Patente US 5.252.714). O polímeropode ser ramificado ou de cadeia linear. Para as reações de acilação, o(s)polímero(s) selecionado(s) tem(têm) tipicamente um único grupo éster reativo.Para a alquilação redutora, o(s) polímero(s) selecionado(s) têm tipicamente umúnico grupo aldeído reativo. Geralmente, o polímero solúvel em água não seráselecionado pela ocorrência natural dos resíduos glicosilados, uma vez queestas são feitas geralmente de forma mais conveniente pelos sistemas deexpressão recombinante em mamíferos.

Métodos para preparar um antagonista de célula B PEGiIado dainvenção geralmente inclui os passos: (a) reação do antagonista de célula B dainvenção com o polietileno glicol (como, por exemplo, um éster reativo oualdeído derivado do PEG), sob condições em que a molécula torna-se ligada aum ou mais grupos de PEG, e (b) obtenção do(s) produto(s) da reação. Emgeral, as condições de reação ótimas para a reação de acilação serádeterminada caso a caso, com base nos parâmetros conhecidos e resultadodesejado. Por exemplo, uma maior relação de PEG a proteína, geralmente levaa uma maior percentagem de produto poli-PEGilado.

A alquilação redutora para produzir uma populaçãosubstancialmente homogênea de antagonista de célula B/mono-polímerogeralmente inclui as etapas de: (a) reação de um antagonista de célula B dainvenção com uma molécula de PEG reativa sob condições redutoras dealquilação, em um pH adequado para as modificações seletivas pen-nit dogrupo amino N-terminal do NgR; e (b) obtenção do(s) produto(s) da reação.Para uma população substancialmente homogênea deantagonista de célula B/mono-polímero, as condições redutoras da alquilaçãosão aquelas que permitem a fixação seletiva do polímero solúvel em água aogrupo N-terminal do antagonista de célula B da invenção. Essas condições dereação geralmente possibilita diferenças de pKa entre os grupos amino dascadeias laterais da Iisina e do grupo amino N-terminal. Para os propósitos dapresente invenção, o pH está geralmente na faixa de 3-9, e tipicamente entre 3-6.

Antagonistas de célula B da invenção podem incluir um marcador,por exemplo, um grupo Iisina que pode ser introduzida por proteólise. Assim, ogrupo Iisina pode ser seletivamente modificado pela primeira reação a uma His-Tag modificada com Iigante de baixo peso molecular tais como o reagente deTraut (Pierce Chemical Company, Rockford, IL), que vai reagir tanto com aIisina quanto com o N-terminal, e, em seguida, liberando seu marcador (tag). Opolipeptídeo conterá então um grupo SH livre, que podem ser modificadoseletivamente com um PEG contendo um grupo principal contendo um tiolreativo como, por exemplo, um grupo maleimida, um grupo vinilsulfona, umgrupo haloacetato, ou um SH livre ou protegido.

O reagente de Traut pode ser substituído por qualquer Iigante queirá criar um sítio de ligação específico para o PEG. Por exemplo, o reagente deTraut pode ser substituído por SPDP, SMPT, SATA, ou SATP (Pierce ChemicalCompany, Rockford, IL). Paralelamente poderia se reagir à proteína com umaIigante amino-reativo que insere uma maleimida (por exemplo, SMCC, AMAS,BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, ou GMBS), um grupo haloacetato(SBAP, SIA, SLAB), ou um grupo vinilsulfona e reagir o produto resultante comum PEG que contenha um SH livre.

Em alguns exemplos de realização, a fração de polialquileno glicolé acoplada a um grupo de cisteína do antagonista de célula Β. O acoplamentopode ser efetuado utilizando, por exemplo, um grupo maleimida, grupovinilsulfona, grupo haloacetato ou um grupo tiol.

Opcionalmente, o antagonista de célula B é conjugado com umgrupo polietilenb glicol através de uma ligação lábil. A ligação lábil pode serclivada, 4)or exemplo, por hidrólise bioquímica, proteólise, ou clivagemsulfídrica. Por exemplo, a ligação pode ser clivada sob condições in vivo(fisiológica).

As reações podem ocorrer por qualquer método adequado parareagir os materiais biologicamente ativos com polímeros, geralmente a cercado pH 5,8, por exemplo, pH 5, 6, 7 ou 8, se os grupos reativos estão no grupoalfa amino no N-terminal. Geralmente o processo envolve a elaboração de umpolímero ativado e depois reagindo este com as proteínas para produzir umaproteína solúvel adequada para a formulação.

Os antagonistas de célula B descritos no presente podemtambém ser formulados como lipossomos. Os Iipossomos contendo oantagonista de célula B são preparados por meio de métodos conhecidosna técnica, conforme descrito, por exemplo, em Epstein et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,77: 4030 (1980); Patentes US 4.485.045 e US 4.544.545; e documento WO97/38731. Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos naPatente US 5.013.556.

Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio dométodo de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeos quecompreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG(PEG-PE). Lipossomos são extraídos através de filtros com tamanho de porodefinido para gerar lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab'de um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugadosaos lipossomos descritos em Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)por meio de reação de intercâmbio de dissulfetos. Um agente quimioterápico éopcionalmente contido no interior do lipossomo. Vide Gabizon et ai, J. NationalCâncer Inst. 8Í (19) 1484 (1989).

É. (são) contemplada(s) modificação(ões) de seqüência deaminoácidos da proteína ou peptídeos do antagonista de célula B descritosno presente. Pode-se desejar, por exemplo, aprimorar a afinidade deligação e/ou outras propriedades biológicas do antagonista de célula B.

Variantes de seqüências de aminoácidos do antagonista de célulaB são preparadas através da introdução de substituições de nucleotídeosapropriadas no ácido nucléico do antagonista de célula B, ou através dasíntese de peptídeos. Ditas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ouinserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidos doantagonista de célula B. Pode ser realizada qualquer combinação com deleção,inserção e substituição para chegar à construção final, desde que ditaconstrução possua as características desejadas. As substituições deaminoácidos podem também alterar processos pós-traducional do antagonistade célula B, tais como a substituição do número ou posição de sítios deglicosilação.

Um método útil para a identificação de certos resíduos ouregiões do antagonista de célula B que são locais preferidos paramutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina",conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244: 1081-1085(1989). Na presente invenção, um resíduo ou grupo de resíduos alvo éidentificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, Iyse glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado(de maior preferência alanina ou polialanina). Ditos sítios de aminoácidosque demonstram sensibilidade funcional às substituições são entãorefinados pela introdução de outras variantes ou adicionais nos ou para ossítios de substituição. Desta forma, embora o sítio para a introdução deuma variação de seqüência de aminoácido seja previamente determinado,a natureza da mutação per se não necessita ser previamente determinada.Para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, porexemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códonou região alvo e as variantes de antagonista de célula B expressas sãoselecionadas para a atividade desejada.

As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusõesde carbóxi e/ou amino terminais que variam em comprimento de umresíduo até polipeptídeos que contenham 100 ou mais resíduos, bem comoinserções intra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados oumúltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um antagonista decélula B com um resíduo metionila N-terminal ou o antagonista de célula Bfundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção doantagonista de célula B incluem a fusão ao N- ou C-terminal do antagonistade célula B a uma enzima ou um polipeptídeo que aumente a meia-vida doantagonista de célula B no soro.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição deaminoácidos. Ditas variantes possuem pelo menos um resíduo de aminoácidona molécula do antagonista de célula B substituída por um resíduo diferente.Os sítios de maior interesse para mutagênese do antagonista de célula Bincluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladassubstituições de FR.

Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 2 sob o títulode "substituições preferidas". Caso estas substituições resultem em mudançada atividade biológica, mudanças mais substanciais, denominadas "exemplosde substituições" na Tabela 2, ou conforme ,descrito adicionalmente, abaixocom referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e osprodutos são selecionados.Tabela 2

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas doanticorpo são atingidas através da seleção de substituições que difiramsignificativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma defolha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade damolécula no sítio alvo; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos deocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedadescomuns da cadeia lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, Iys1 arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não-conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação adequada do antagonista de célula B pode também sersubstituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa damolécula e prevenir reticulamento anormal. Por outro lado, ligação(ões) decisteína pode(m) ser adicionada(s) ao antagonista de célula B para aprimorarsua estabilidade (particularmente quando o antagonista de célula B for umfragmento de anticorpo, tal como fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de umanticorpo parental. Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s)para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradasem relação ao anticorpo parental do qual é(são) gerado(s). Uma formaconveniente para a geração de ditas variantes de substituição envolve amaturação de afinidade utilizando exibição de fago. Em resumo, diversos sítiosde regiões hipervariáveis (por exemplo, 6 a 7 sítios) sofrem mutações paragerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes deanticorpos geradas desta forma são exibidas de forma monovalente a partir departículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto gene Ill deM13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago são entãoselecionadas de acordo com a sua atividade biológica (por exemplo, afinidadede ligação), da forma descrita no presente. A fim de identificar possíveis sítiosde regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varredura dealanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveisque contribuem de forma significativa para a ligação de antígenos. Alternativaou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal docomplexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre oanticorpo e o antígeno. Ditos resíduos de contato e resíduos vizinhos sãocandidatos para substituição de acordo com as técnicas desenvolvidas nopresente. Após a geração de ditas variantes, o quadro de variantes ésubmetido à seleção conforme descrito no presente e os anticorpos compropriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem serselecionados para desenvolvimento adicional.

Outro tipo de variante de aminoácido do antagonista de célula Baltera o padrão original de glicosilação do antagonista de célula B. Poralteração, designa-se a deleção de uma ou mais unidades de carboidratoencontradas no antagonista de célula B e/ou adição de um ou mais sítios deglicosilação que não estejam presentes no antagonista de célula B.

A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente N-Iigada ou O-ligada. N-Iigado designa a ligação da unidade carboidrato à cadeia lateral deum resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagina-X-serinae asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto a prolina,são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidadecarboidrato à cadeia lateral de asparagina. Por essa razão, a presença dequalquer uma dessas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria umsítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigada designa a ligação de umdos açúcares. N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácidohidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora também possam serutilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.

A adição de sítios de glicosilação ao antagonista de célula B éalcançada de forma conveniente através da alteração da seqüência deaminoácidos, de forma que contenha uma ou mais das seqüências detripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteraçãopode também ser realizada através da adição de, ou substituição por, um oumais resíduos de serina ou treonina à seqüência do antagonista de célula Boriginal (para sítios de glicosilação O-ligados).

Quando o anticorpo compreende uma região Fc1 o carboidratoligado a tal anticorpo pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com umaestrutura de carboidrato madura que não contém fucose ligada a uma região Fcdo anticorpo, são descritos no pedido de patente US 2003/0157108. Anticorposcom N-acetilglucosamina (GIcNAc) bisseccionada no carboidrato ligado a umaregião Fc do anticorpo são indicados no documento WO 03/011878 e na patenteUS 6.602.684. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose nooligossacarídeo ligado a uma região Fc do anticorpo são relatados no documentoWO 97/30087. Vide, também os documentos WO 98/58964 e WO 99/22764referentes a anticorpos com carboidrato alterado ligados a sua região Fc.

Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes daseqüência de aminoácidos do antagonista de célula B são preparadas atravésde uma série de métodos conhecidos na técnica. Ditos métodos incluem, massem limitar-se a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso devariantes de seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparaçãoatravés de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida),mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma variante preparadaanteriormente ou uma versão não-variante do antagonista de célula B.

Pode ser desejável modificar o antagonista de célula B de acordocom a presente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de formaa aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno(ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do antagonistade célula B. Isso pode ser alcançado através da introdução de uma ou maissubstituições de aminoácidos em uma região Fc do antagonista de célula B.

Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s)na região Fc1 de forma a permitir a formação de ligação de dissulfetointercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado podepossuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediadapor complemento aprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos(ADCC). Vide Caron et ai, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B., J.Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividadeantitumoral aprimorada podem também ser preparados através da utilização dereticulantes heterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al., CâncerResearch 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído umanticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentarcapacidades aprimoradas de ADCC e Iise mediada por complemento. VideStevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). O documentoWO 00/42072 descreve anticorpos com função ADCC aprimorada na presençade células efetoras humanas, em que os anticorpos compreendemsubstituições de aminoácidos na região Fc.

Os anticorpos com ligação C1q alterada e/ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC) estão descritos no documento WO99/51642, patentes US 6.194.551 B1, US 6.242.195 B1, US 6.528.624 B1 e US6.538.124. Os anticorpos compreendem uma substituição de aminoácido emuma ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333e/ou 334 de sua região Fc.

Para aumentar a meia vida do antagonista de célula B no soro,pode-se incorporar um epítopo de ligação do receptor recuperado aoantagonista de célula B (especialmente um fragmento de anticorpo), conformedescrito, por exemplo, na patente US 5.739.277. Da forma como utilizada nopresente, a expressão "epítopo de ligação do receptor recuperado" designa umepítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo damolécula de IgG. Anticorpos com substituições em uma de suas regiões Fc emaior meia-vida em soro também estão descritos no documento WO 00/42072.

Anticorpos elaborados com três ou mais (preferencialmentequatro) sítios de ligação de antígenos funcionais também são contemplados(pedido de patente US 2002/0004587).

Formulação ε Administração dos Antagonistas de Célula B

Os antagonistas de célula B da invenção são preferencialmenteadministrados aos pacientes sob a forma de formulações terapêuticas. Asformulações terapêuticas dos antagonistas de célula B utilizados de acordocom a presente invenção são preparadas para a armazenagem por meio damistura de um antagonista de célula B que possua o grau desejado de purezacom veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveisopcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed.(1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos,excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nasdosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato,citrato e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico emetionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio,cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcoolfenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metil oupropilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol e meta-cresol);polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos);proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeroshidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina,asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais comoEDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íonsformadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexosprotéicos de Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como Tween®, Pluronics® oupolietilenoglicol (PEG).

Exemplos de formulações de anticorpos anti-CD20 estãodescritos no documento WO 98/56418. Essa publicação descreve umaformulação líquida de múltiplas doses que compreende 40 mg/ml de rituximab,25 mM de acetato, 150 mM de trehalose, álcool benzílico a 0,9%, polissorbato20 a 0,02% em pH 5,0 que possui uma vida mínima de armazenagem de 2anos a 2-8 °C. Outra formulação anti-CD20 de interesse compreende 10 mg/mlde rituximab em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de diidratocitrato desódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e Água Estéril para Injeção, pH 6,5.

As formulações Iiofilizadas adaptadas para administraçãosubcutânea estão descritas na patente US 6.267.958. Tais formulaçõesIiofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente apropriado até uma altaconcentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administradapor via subcutânea no mamífero a ser tratado no presente.

A formulação do presente pode também conter mais de umcomposto ativo, conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente, aqueles com atividades complementares que nãose prejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, forneceradicionalmente um agente citotóxico, agente quimioterápico, citocina, inibidorda via do TGF-β (por exemplo, anticorpo monoclonal, peptídeo, antagonistasde moléculas pequenas, inibidor da ativação do TGF-β), receptor de integrina,ou agente imunossupressor (por exemplo, um que aja sobre células T, tal comoa ciclosporina ou um anticorpo que se ligue a células T, por exemplo, um quese ligue a LFA-1). A quantidade eficaz desses outros agentes depende daquantidade de antagonista presente na formulação, do tipo de doença,disfunção ou tratamento e de outros fatores.

Os antagonistas de célula B podem também ser inseridos emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de coacervação oupolimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou degelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metila), respectivamente, emsistemas de fornecimento de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou emmacroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's PharmaceuticalSciences, 16a edição, Osol, A., Ed. (1980).

Podem ser fabricadas preparações de antagonista de célula B deliberação controlada. Exemplos apropriados de preparações de liberaçãoprolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicossólidos que contenham o antagonista de célula B, que se encontram na formade artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos dematrizes de liberação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo,poli-(metacrilato de 2-hidroxietila) ou poli-(álcool vinílico)), polilactídeos (patenteUS 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ-etila,etilenovinilacetato não-degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico eácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostasde copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácidopoli-D-(-)-3-hidroxibutírico.As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Isso é facilmente conseguido por meio de filtragem atravésde membranas de filtragem estéreis.

O antagonista de célula B é administrado por qualquer meioapropriado, que inclui administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal,intrapulmonar, intranasal. As infusões parenterais incluem administraçãointramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso,o antagonista de célula B pode ser adequadamente administrado por meio deinfusão de pulso, por exemplo, com doses decrescentes de antagonista de célula B.

Preferencialmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções intravenosas,dependendo, em parte, se a administração é breve ou crônica.

Em algumas incorporações exemplares da invenção, osantagonistas de célula B são administrados ao paciente (por exemplo, por viaintravenosa), em uma dose entre 1 mg/m2 e 500 mg/m2. O antagonista decélulas B pode, por exemplo, ser administrado em uma dosagem de 1 mg/m2, 2mg/m2, 3 mg/m2, 4 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, 15 mg/m2, 20 mg/m2, 25 mg/m2,30 mg/m2, 35 mg/m2, 40 mg/m2, 45 mg/m2, 50 mg/m2, 55 mg/m2, 60 mg/m2, 65mg/m2, 70 mg/m2, 75 mg/m2, 80 mg/m2, 85 mg/m2, 90 mg/m2, 95 mg/m2, 100mg/m2, 105 mg/m2, 110 mg/m2,115 mg/m2,120 mg/m2,125 mg/m2,130mg/m2,135 mg/m2,140 mg/m2,145 mg/m2, 150 mg/m2, 155 mg/m2, 160 mg/m2,165 mg/m2, 170 mg/m2, 175 mg/m2, 180 mg/m2, 185 mg/m2, 190 mg/m2, 195mg/m2, 200 mg/m2, 205 mg/m2, 210 mg/m2, 215 mg/m2, 220 mg/m2, 225 mg/m2,230 mg/m2, 235 mg/m2, 240 mg/m2, 245 mg/m2, 250 mg/m2, 255 mg/m2, 260mg/m2, 265 mg/m2, 270 mg/m2, 275 mg/m2, 280 mg/m2, 285 mg/m2, 290 mg/m2,295 mg/m2, 300 mg/m2, 305 mg/m2, 310 mg/m2, 315 mg/m2, 320 mg/m2, 325mg/m2, 330 mg/m2, 335 mg/m2, 340 mg/m2, 345 mg/m2, 350 mg/m2, 355 mg/m2,360 mg/m2, 365 mg/m2, 370 mg/m2, 375 mg/m2, 380 mg/m2, 385 mg/m2, 390mg/m2,395 mg/m2 ou 400 mg/m2.Οφ, antagonista de célula B pode ser administrado de acordo comuma grande variedade de cronograma de dosagens. (vide, por exemplo, pedidode Patente US'2006/0002930). O antagonista de células B pode, por exemplo,ser administrado uma vez por dia por um determinado período de tempo (porexemplo, de quatro a oito semanas, ou mais), ou de acordo com umcronograma semanal (por exemplo, um dia por semana, dois dias por semana,três dias por semana, quatro dias por semana, cinco dias por semana, seis diaspor semana ou sete dias por semana) por um determinado período de tempo(por exemplo, de quatro a oito semanas, ou mais). Um exemplo específico deum cronograma de dosagem de "uma vez por semana" é administração doantagonista de célula B nos dias 1, 8,15 e 22 do período de tratamento. Emexemplos de realizações alternativos o antagonista de célula B pode seradministrado intermitentemente, durante um período de meses. O antagonistade células B pode, por exemplo, ser administrado semanalmente durante trêssemanas consecutivas duas vezes por ano (ou seja, repetir a posologiasemanal, de seis em seis meses). Será apreciado que tais regimes deadministração possam ser prolongados por períodos maiores (na ordem deanos) para manter o efeito terapêutico benéfico fornecido pelos primeirostratamentos. Em outros exemplos de realização, tais terapias de manutençãodo tratamento podem ser realizadas na seqüência de um regime posológicoagudo designado para reduzir os sintomas imediatos da doença fibrótica.

A quantidade de antagonista de célula B administrado de cadavez por todo o período de tratamento pode ser a mesma; alternativamente, aquantidade administrada de cada vez durante o período de tratamento podevariar (por exemplo, a quantidade administrada num dado momento pode sermaior ou menor do que a quantidade administrada anteriormente). Porexemplo, a dose administrada durante a a terapia de manutenção pode sermenor do que a dose administrada durante a fase aguda do tratamento. Ocronograma de dosagem adequado depende da situação específica que seráperceptível para aqueles hábeis na técnica.

Além da administração de proteína de antagonistas de célula B aopaciente* o presente pedido contempla a administração de antagonistas decélula B por meio de terapia gênica. Tal administração de ácido nucléicocodificador do antagonista de célula B é englobada pela expressão"administração a um paciente com necessidade de tal tratamento de umaquantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de célula B". Vide1 porexemplo, o documento WO 96/07321 referente à utilização da terapia gênicapara gerar anticorpos intracelulares.

Existem duas abordagens principais para a colocação do ácidonucléico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente: in vivo eex vivo. Para fornecimento in vivo, o ácido nucléico é injetado diretamente nopaciente, normalmente no local em que é necessário o antagonista de célula B.Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácidonucléico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas sãoadministradas ao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas emmembranas porosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, aspatentes US 4.892.538 e US 5.283.187). Existe uma série de técnicasdisponíveis para a introdução de ácidos nucléicos em células viáveis. Astécnicas variam dependendo da transferência ou não do ácido nucléico paracélulas cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro desejado.Técnicas apropriadas para a transferência de ácido nucléico para células demamíferos in vitro incluem a utilização de lipossomos, eletroporação,microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método de precipitação de fosfatode cálcio etc. Um vetor comumente utilizado para fornecimento ex vivo do geneé um retrovírus.

Exemplos de técnicas de transferência de ácido nucléico in vivoatualmente preferidas incluem transfecção com vetores virais (tais comoadenovírus, vírus Herpes simplex I ou vírus adeno-associado) e sistemas combase em lipídeos (lipídeos úteis para transferência mediada por lipídeos dogene são, por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol). Em algumas situações, édesejável fornecer a fonte de ácido nucléico com um agente que dirija ascélulas alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membranada superfície celular ou a célula alvo, um Iigante para um receptor sobre acélula alvo etc. Ao empregar-se lipossomos, as proteínas que se ligam a umaproteína de membrana da superfície celular associada à endocitose podem serutilizadas para dirigir e/ou facilitar a absorção, por exemplo, de proteínascapsídicas ou seus fragmentos trópicos para um tipo celular específico,anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização e proteínasque dirigem localização intracelular e aumentam a meia vida intracelular. Ométodo de endocitose mediada por receptor é descrito, por exemplo, por Wu etai, J. Bioi Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 87: 3410-3414 (1990). Para análise dos protocolos de terapia gênica emarcação gênica atualmente conhecidos, vide Anderson et al,. Science256:808-813 (1992). Vide também o documento WO 93/25673 e as referênciasnele mencionadas.

Combinações de Antagonistas de Célula B ε Outros Agentes

Em certos exemplos de realização da invenção, vários tipos deantagonista de célula B são combinados entre si e administrado a um pacientepara tratar uma ou mais condição de fibrose. Por exemplo, a invenção incluimétodos para o tratamento de doenças fibróticas que compreende administrara um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contrao CD20 (por exemplo, o rituximab) e um antagonista BAFF como descrito nopresente e em outros locais como no pedido de Patente US 2005/0095243 queestá incorporada ao presente em sua totalidade pela referência. Quando váriosantagonistas de célula B são administrados a um paciente, os diferentesantagonistas de célula B podem ser administrados em conjunto em uma únicacomposição farmacêutica, ou, de preferência, pode ser administradoseqüencialmente em doses separadas em qualquer ordem.

A presente invenção também inclui métodos para o tratamento dedoenças fibróticas que compreende administrar a um paciente comnecessidade de tal tratamento uma combinação composta por um primeiro eum segundo agente, onde o primeiro agente é uma antagonista de célula B e, osegundo agente é um agente útil para tratar uma ou mais doenças fibróticas,mas não é necessariamente um antagonista de célula B. Por exemplo, deacordo com certos exemplos de realização da invenção, um antagonista decélula B é administrado a um paciente juntamente com um antagonista de umou mais receptores de integrina (por exemplo, O1P1, ανβ6, ανβ8, ανβ5, Ct5P1, O4P1,α4β7 e etc.), incluindo anticorpos, polipeptídeos antagonistas e/ou antagonistasde moléculas pequenas específicas para um ou mais receptores de integrina(por exemplo, O1 βι, ανβ6, ανβ8, ανβ5, α5βι, α4βι, α4β7, etc). (Patentes US6.652.856 e US 6692741, e pedidos de Patentes US 2004/0248837, US2004/0208878, US 2002/0004482, US 2005/0255102, US 2005/0226885). Umexemplo de anticorpo que se liga especificamente ao receptor de integrinaα4βι, e que pode ser usado em combinação com uma antagonista de célula Bpara o tratamento de uma doença fibrótica, no âmbito da presente invenção é onatalizumab (Tysabri®), conforme definido no pedido de patente US2005/0276803.

Em certos exemplos de realização deste aspecto da invenção, osegundo agente que é administrado com um antagonista de célula B é, porexemplo, um esteróide, um agente citotóxico, colquicina, oxigênio, antioxidante(por exemplo, N-acetilcisteína), agente quelante de metal (Por exemplo,tetratiomolibdato), IFN-γ, ou antitripsina-alfa. O segundo agente, emdeterminados exemplos de realização, pode ser um inibidor da Btk1 incluindo,por exemplo, moléculas pequenas inibidoras de Btk. O segundo agente, emdeterminados " exemplos de realização, pode ser um inibidor de TWEAK,incluindo, por exemplo, anticorpos e moléculas pequenas inibidoras deTWEAK. Ainda em outros exemplos de realização, o segundo agente podeenglobar uma antagonista LTBR (por exemplo, um anticorpo ou proteína defusão solúvel); vide USPN 7.030.080 e 7.001.921; ou de um antagonista daTRAIL - R2.

De acordo com certos exemplos de realização deste aspecto dainvenção, o segundo agente que é administrado com o antagonista de célula Bpode ser, por exemplo, um inibidor da via de sinalização do TGF-β. Exemplosde inibidores da via de sinalização do TGF-β que podem ser utilizados noâmbito da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos,peptídeos de seqüência sintética ou nativa e moléculas pequenas que inibemou antagonizam um ou mais componentes do da via de sinalização do TGF-β,incluindo, por exemplo, Ang II, IL-1, IL-4, IL-10, IL-13, MIF, PDGF, RAGE, AGE,TNF-α, trombospondina-1, VLA-1, SMAD-2, SMAD-3 (pedido de Patente US2003/0139366), SMAD-4, ERK1 p15, Ink4b, p21 Wafll p27Kip1, p38, CTGF(pedido de Patente US 2004/0248206), PAI-1, PTHrP, Endotelina-1,Farnesóide X, HGF, IGF-1, MMP-1, MMP-9, PGE2, Hidroxilase propil,procolágenos, fibrilina, TEVIP, CXCR4, CXCL12, CCR2, CCL2, CCL-7 e CCL-22. Outros exemplos de inibidores da via de sinalização do TGF-β que podemser utilizados no âmbito da presente invenção incluí, por exemplo, antagonistade receptor e TGF- β ligante, incluindo, por exemplo, anticorpos, proteína defusão TGF-β Rll-Fc solúvel, proteína de fusão PAL-Fc, inibidores da quinaseTGF-β Rl ou Rll, inibidores de moléculas pequenas a jusante do TGF- β Rll.

Outros agentes que podem ser administrados com umantagonista de célula B, no âmbito da presente invenção incluem, por exemplo,pirfenidona, arçtagonistas da endotelina, inibidores do TNF-alfa, inibidores dePDGF, inibidores de CTGF1 antagonistas de CD40 Iigante (USPN 6.506.383),BCMA-Ig , inibidores da P38 MAP quinase, prednisona, Cytoxan, e azatioprina.

Exemplos específicos de produtos clínicos que podem ser usadosem combinação com um antagonista de célula B para tratar uma doençafibrótica no contexto da atual invenção incluem aqueles listados na Tabela 3.

Tabela 3

<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>

Kits

A presente invenção inclui também kits para tratar doençasfibróticas. Os kits da invenção constam de um ou mais frascos onde pelomenos um dos frascos contém um antagonista de célula B. Qualquer um dosantagonistas de célula B descritos em outros locais do presente poderá serincluído no kit da invenção. Os kits da invenção pode também incluir um oumais recipientes constando de um ou mais agentes adicionais que podem seradministrados em combinação com um antagonista de célula B para tratar umadoença fibrótica. Esses agentes estão descritos em outros locais do presente.

Os kits pode opcionalmente incluir um ou mais conjuntos de instruções para otratamento de uma doença fibrótica. As instruções podem incluir, inter alia,informação relativas a quantidade de antagonista de célula B e/ou outrosagentes a serem administrados ao paciente, o tempo e a freqüência deadministração, as vias de administração sugeridas, bem como, ascaracterísticas e/ou sintomas mostrado pelos pacientes que receberam aadministração do antagonista de célula B e/ou outros agentes.

Será de evidente imediato aos técnicos no assunto que outrasmodificações e adaptações adequadas aos métodos e aplicações aquidescritas são óbvias e podem ser feitas sem sair do escopo da invenção e dequalquer incorporação. Tendo agora descrita em detalhes a presente invenção,a mesma será mais claramente entendida pela referência aos seguintesexemplos, que são incluídas aqui somente para fins de ilustração e não comoforma de limitação da invenção.

Exemplos

Exemplo 1

Atenuado a Fibrose Hepática na Ausência de Células B

Introdução

As características de doenças hepáticas crônicas como, porexemplo, degeneração hepática induzida pelo álcool, infecção por hepatite C,esteatohepatite não-alcoólica, são inflamações crônicas, danos celulares,regeneração e fibrose. Todos essas características podem ser incitadas pordanos hepáticos induzido tetracloreto de carbono (CCI4). (Jungermann e Katz,Physiol. Rev. 69:708-764 (1989); Friedman1 Semin. Liver Dis. 19:129 - 140(1999)). Neste exemplo, a fibrose induzida por CCI4 foi avaliada emcamundongos tipo selvagens deficientes de célula B.

Em um modelo alternativo, a lesão hepática é induzida por umatoxina biliar um α-naftilisotiocianato (ANIT), mimetizando a cirrose biliar e acolangite esclerosante. (Tjandra et al Hepatology 57:280-290 (2000)). A ANIT,semelhantemente ao CCI4, induz a uma hepatotoxicidade não imune-direcionada seguido por respostas inflamatórios e fibróticas, porém em umaoutra localização anatômica hepática em comparação ao CCI4.

Após 6 semanas de tratamento com CCI4, a análise histoquímicamostrou redução significante na deposição de colágeno nos camundongosdeficientes de célula B, em comparação aos camundongos similarmentetratados do tipo selvagem. Além disso, foi analisado camundongos comnúmero normal de células B, mas com deficiência de células T, e foiestabelecido qye células B contribuem para a fibrose de maneira independentedas células T. Camundongos JH -I- tratados mostraram resultadossemelhantes nb que diz respeito à deposição colágeno.

Material ε Métodos

Camundongo

Salvo se indicação de outra maneira, os camundongos forammantidos em um biotério livre de agentes patogênicos na Biogen Idec(Cambridge, MA). Todos os procedimentos animais foram aprovados peloInstitutional Animal Care and Use Committee da Biogen Idec Os camundongosmachos das linhagens listadas na Tabela 4 tinha que pesar 20g ou mais e terpelo menos 6 semanas de idade para serem incluídos no estudo.

Tabela 4

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* Vide, Mackay et al, J. Exp. Med. 190:1697-1710 (1999).11Vide1 Chan et. al, J. Exp. Med. 759:1639-1648 (1999).§ vide, Casola etal, Nat. Immunol 5:317-327 (2004).

Modelos de Lesão por CCu ε ANIT

Uma mistura de CCI4 (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO), com óleomineral (Sigma-AIdrich), foi entregue por gavagem em um volume nãoexcedendo 0,2ml com uma agulha de alimentação. Experimentos foramrealizados utilizando uma dose de 3,5mg/kg ou 1,75mg/kg de CCI4. A últimadose foi preferida porque reduziu a morbidade / mortalidade e ainda induziumudanças na alanina aminotransferase (ALT) no soro e níveis de deposição decolágeno comparável à dose mais elevada. Para uma exeprimento de períodoprolongado, camundongos foram gavados uma vez por semana durante 6semanas. Experimentações a curto prazo, incluíram a adminstração de CCI4.

ANIT (1-naftil isotiocianato, Sigma - Aldrich Corp) foi dissolvido emóleo mineral (Sigma - Aldrich) a 30 mg/ml. Os camundongos foram gavadoscom 50 mg/Kg duas vezes por semana, durante 8 semanas.

Níveis séricos de ALT foram mensurados 24 horas após aadministração de CCI4. Uma semana após a 6a semana de gavagem ou no diaindicado após a gavagem única, camundongos foram sacrificados e trêsdiferentes lobos do fígado foram excisados e incubados em 4% de PFA emPBS por 2 dias antes do emblocamento para as análises imuno-histoquímicasadicionais.

Isolamento de Linfócitos Hepáticos

Os camundongos foram eutanasiados por inalação de CO2. A veiaporta hepática foi canulada com uma agulha 25G e perfundida com 10 ml dePBS frio. Após a remoção da vesícula biliar, o fígado foi cortado em segmentose passada através de uma peneira de 70pm (BD Falcon, Bedford, MA), em 50ml de RPMI/5% FBS gelado. O fígado foi centrifugado a 300g por 10 minutos a4°C em um tubo de 50 ml por fígado. O pellet foi ressuspenso em 10 ml de0,02% de colagenase IV (Sigma - Aldrich Corp), em RPMI 1640 e deixado por45 minutos a 37 °C. e 30 ml de RPMI/5% FBS gelado foi adicionado a cadatubo, e então -centrifugado por 3 minutos a 30g. O pellet foi descartado. Osobrenadante foi centrifugado durante 10 minutos a 300g a 4°C. A pellet decélulas foram ressuspensas em 6 ml de RPMI 1640 gelado (ou em 45% percoll)(Amersham Biosciences1 Suécia) e colocado sob metrizamida 24% (Sigma-Aldrich Corp), em PBS (ou com 70% Percoll, respectivamente) . Seguido pelacentrifugação a 1000g durante 20 minutos a 4 °C. Lymphocytes na interfaceforam colhidas, lavadas com RPMI/5% FBS e utilizadas para as análisesposteriores.

O grau de contaminação dos linfócitos intrahepáticos por linfócitosdo sangue é provavelmente mínimo, como os resultados indicam um aumentoespecífico das células NK-T do fígado e uma relação diferente de inserções Nnucleotídeos nas junções V-D e D-J nos linfócitos B intra-hepáticos (3,5 e 4,4) ,

Em comparação as células B do sangue (4,5 e 3,4, vide também Resultados).

Isolamento de Linfócitos B do Baco. Sangue ε Cavidade Peritoneal

Os baços foram moídos através de uma malha de Nylon (CellStrainer; BD Falcon, Bedford, MA) para obter uma suspensão de célula únicaem DMEM1 5% FCS, e 2 mM de L-glutamina. Eritrócitos foram Iisados pelaincubação em tampão de Iise (140 mM de NH4CI, 17 mM de Tris-HCI, pH 7,65)por 3 minutos no gelo. O sangue foi coletado em tubos contendo EDTA (BDPharmingen1 San Diego1 CA). Para isolar os linfócitos, 200 μΙ de sangue foicolocado sob- Ficoll-Paque (Amersham Biosciences1 Suécia) e centrifugadas a1000g em RT durante 20 minutos. Linfócitos foram coletados a partir dainterface. A cavidade peritoneal (PC) foi lavada com 5 ml de DMEM1 5% FCS, e2 mM de L-glutamina para recolher leucócitos da PC. Após estesprocedimentos, os linfócitos foram lavados duas vezes em DMEM, 5% FCS, e2 mM de L-glutamina e centrifugados por 300g a 4 ° C e ressuspensos emPBS/BSA/azida para análise por citometria de fluxo ou para estudos deproliferação em meios de cultura.

Citometria de Fluxo

A coloração por fluorescência foi realizada como descritoanteriormente. (Forster e Rajewsky1 Eur. J. Immunol. 17:521-528 (1987)). AAnexinaV1 7AAD1 e anticorpos específicos para IgM1 IgD, CD19, CD23, CD5,CD69, CD86, B220, MHCII1 CD43, Mac-1, CD4, CD8 (BD Pharmingen, SanDiego CA) ou CD21 (Ebioscience, San Diego1 CA), foram utilizados. Anticorposforam conjugado com FITC, PE, APC1 PerCP, Cy-Chrome ou biotina. Foramdetectados anticorpos biotinilados com estreptoavidina conjugados com PerCP.Células coradas foram fixadas e analisadas utilizando o FACScaIibur (BDBiosciences).

Estimulacão In Vitro de Células B Marcadas com CFSE

Para gerar uma solução de estoque, CFSE (Molecular Probes) foidissolvido a 5mM em DMSO e armazenado a -80 °C. As células B esplênicasforam purificadas pelo enriquecimento com partículas MACS aliada aanticorpos anti-B220 (Miltenyi Biotec) sobre colunas magnéticas LS (MiltenyiBiotec), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram entãolavadas duas vezes com RPMI 1640, e ressuspensas em 5x107 células/ml emuma concentração de 5mM de CSFE em RPMI 1640 morno por 10 min a 37 0C.

As células foram então lavadas 3 vezes em RPMI 1640/5% FCS gelado,ressuspendidas em RPMI 1640/5% FCS/pME/L- glutamina em 2X105/1 OOmL etransferidos para uma placa de 96 poços com 100μί por poço). Outros 100 μίde RPMI foram adicionados aos reagentes estimulantes a uma quantidade de 2vezes a concentração final. Os estímulos utilizados foram F(ab')2 puro,fragmento cabra anti-lgM de camundongo (2,5pg/ml; Jackson Immunoresearch1West Grove, PA), IL-4 (25U/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN), anticorpoanti-CD40 de camundongo (0,25 pg/ml, Ebioscience), anticorpo anti-RP105(10,5 Mg/ml, Ebioscience), LPS (20 Mg/ml, Sigma-Aldrich Corp).

iMUNO-HISTOQUÍMICA

Anticorpos específicos para alfa actina de músculo liso (clone1A4, DakoCytomation1 Carpinteria1 CA), foi utilizado em uma diluição de 1:50com 30 minutos incubação. A recuperação antigênica mediante exposição doepítopo ao calor foi realizada em 10 mM de tampão Citrato, pH 6,0 por 30segundos a 125°C, mantida a 90°C durante 10 segundos e levados atemperatura ambiente por mais 20 minutos antes de imuno-coloração. Aligação do anticorpo primário aos elementos do tecido foram detectadosatravés de um kit de biotinilação MM (Biocare Medicai, Walnut Creek, CA), como substrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB). As lâminas foram contra-coradas comHematoxilina de Mayer por 1 minuto.

O anticorpo específico F4/80 (clone CLA3-1, Serotec Inc.,Raleigh, NC), foi utilizado em uma concentração de 20pg/ml por 30 minutos. Assecções de tecido foram pré-tratadas com Proteinase K (DakoCytomation,Dinamarca) durante 5 minutos a temperatura ambiente. A ligação do anticorpoprimário foi detectada utilizando um kit Vector Elite ABC (Vector Laboratories,Burlingame, CA), utilizando o substrato DAB. As lâminas foram contra-coradascom Hematoxilina de Mayer por 1 minuto.

A coloração por TUNEL foi realizada utilizando o kit de detecçãode apoptose In situ ApopTag (Chemicon International, Temecula, CA), deacordo com as instruções do fabricante. Células apoptóticas marcadas foramdetectadas utilizando DAB/ cloreto de níquel como substrato. As lâminas foramcontra-coradas durante 5 minutos com Verde Metíla (Vector Laboratories,Burlingame, CA).

As fibras Colágenas foram detectadas pela coloração de SiriusRed (Luna, Histopathologic Methods and Color Atlas of Special Stains andTissue Artifacts·. American HistoLabs Incorporated. Pág 767. (1992)); Acoloração de H&E foi realizada conforme descrito em outros locais (Luna,Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute ofPathology. No\fa Iorque: McGraw-HiII Book Company (1968)).

PCR ε Análise do Rearranjo do Gene de Ig

O DNA foi extraído a partir de células CD19+selecionadaspositivamente a partir de partículas magnéticas (Miltenyi Biotec), de acordo com oprotocolo do fabricante do kit de isolamento Genomic DNA (Qiagen, Valencia, CA).

O DNA (2 μΙ, equivalente a cerca de 103 células B), foi usado para amplificação dasarticulações VDJ. Duas etapas de amplificação foram realizados utilizando prímersVHA1 VHB e VHE 5 específicos para J558L, Q52 e 7183 famílias de Vh e prímerJH4E 3' (16) para a primeira etapa e prímer JH1 ou JH4A 3* para a segunda etapado PCR (denominada nested PCR). Todos os prímers foram sintetizados pelaBiogen Idec. Vinte ciclos foram realizados para a primeira etapa (1 minuto a 95 0C11minuto a 60 °C, e 1,5 minutos a 72 °C), e 30 ciclos foram realizados para a segundaetapa (1 minuto a 95 °C, 1 minuto a 63 °C, e 1,5 minutos a 72 °C), utilizando 2μΙ dareação da primeira etapa como modelo. O fragmento de 0,4kD esperado foipurificado do gel e subclonado no vetor pCR4-T0P0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). ODNA a partir de diferentes colônias foi preparado e seqüenciado usando prímersespecíficos de vetores padrões.

Quantificação do Colágeno Intersticial

Um total de 3 seções de um fígado (cada um de um lobodiferente), de cada animal foi corado. Fotos em preto e branco da coloração deSirius Red foram feitas sob luz polarizada em ampliação de 5 vezes. Fotosforam realizadas de tal forma que o tecido hepático ocupou toda a áreacapturada pela câmara para garantir que o a área total da imagem fosseidêntica em cada foto (4-10 fotos por animal). Vasos que continham colágenoconstitutivamente foram eletronicamente removidos de cada imagem. Aquantidade aproximada de coloração branca (colágeno intersticial), foiquantificado pelo software de análise de imagem MetaMorph (UniversalImaging Corporation, Downingtown, PA). Quantificação é exibida em unidadesarbitrárias"(1 correlaciona a 1000 pixels). A quantidade absoluta de área brancanão pode ser comparada diretamente entre os diferentes experimentos, umavez que variava a intensidade da coloração de Sirius Red.

Resultados

Células B Representam a Maior População de Linfócitos no Fígado

As células B têm sido extensivamente estudadas no fígadoembrionário, o principal local da hematopoiese no desenvolvimentoembrionário. No entanto, pouco se sabe sobre hepática as células B hepáticasnos adultos. Neste exemplo, células B intra-hepáticas (DH) foramfenotipicamente e funcionalmente caracterizadas.

Após o enriquecimento da população de linfócitos do fígadoperfundido com PBS, a proporção de células IHB foi quantificada pelacoloração para CD 19, um marcador específico da linhagem B. Em ambos oscamundongos BALB/c e C57BL/6, as células B representam cerca de 50% doslinfócitos IH (intervalo de 30-60%, FIG. 1A e dados não apresentados). Onúmero absoluto de células B isoladas de um fígado foi -2x106. CD19+ decélulas IHB que mostram expressar IgM, IgD, B220, MHCH, e CD62L em níveissemelhantes aos seus homólogos esplênicos (FIG. 1A e B e dados nãoapresentados). Células IHB não expressam CD43 e Mac-1 marcadores típicosde células Bl ou células B imaturas (dados não apresentados), células IHBexpressam CD5 em quantidades mais elevadas do que o detectado em célulasB do sangue, mas em quantidades inferiores ao observado em células B dacavidade peritoneal (FIG. 1B). Altos níveis de CD5 são indicativos da ativaçãode células B convencionais. (Cong et ai., Int. Immunol. 3:467-476 (1991)).Células IHB expressam CD23, mas a um nível menor que células B esplênicasou células B sangüíneas. A expressão de CD21 na superfície também éligeiramente m.enor para células IHB do em células B esplênicas, mas superiorem células B do sangue (FIG. 1B). Tomadas em conjunto, no que se refere àexpressão desses marcadores, as células B do fígado são mais semelhantesàs de células B folicular esplênicas.

CÉLULAS B HEPATICAS SÃO FUNCIONALMENTE COMPETENTES

Como fígado é freqüentemente considerado como um destinopara os linfócitos degenerados (Crispe et al, Immunol. Rev. 174:47-62 (2000)),foi determinado se células IHB são pró-apoptóticas usando anexina V, que seliga ao fosfolipídio fosfatidilserina (PS), se transloca do interior para a camadaexterna da membrana celular como células que sofrem apoptose. A anexina Vvinculada em até 30% de células B hepáticas, em comparação com ~15% decélulas B esplênicas (FIG. 1C e dados não apresentados). Assim, a maior partedas células B hepáticas, não mostra uma predisposição a apoptose, bem comoo maior número de células apoptóticas no fígado, em comparação com baçopode estar relacionada com diferenças no isolamento d linfócitos.

A capacidade proliferativa de linfócitos B em resposta areticulação de receptores mitogênicos e de células B é uma importantecaracterística funcional, que difere substancialmente dos outros subtipos decélula B. (Morris e Rothstein1J. Exp. Med. 777:857-861 (1993); Philips et al.Immunol. CeH Biol. 7 (5:332-342 (1998); Erickson et al 2001. J. Immunol.166:1531-1539 (2001)). Células B hepática e esplênica foram comparadas pelasua extensão da proliferação e supraestimulação de moléculas co-estimulatórias, como o CD86 (B7.2) e MHCH, em resposta a vários estímulos.Curiosamente, a resposta proliferativa das células IHB foi muito semelhante aodos linfócitos B esplênicos (FIG. 1D): a resposta a estimulação de receptoresToll Like 4, RP105 e CD40 foi a mesma, enquanto resposta a reticulação comIgM foi maior na ausência, mas não na presença da IL-4. A maior respostaproliferativa a reticulação com IgM só pode refletir melhor sobrevivência dacélulas IHB em cultura sem um fator exógeno de sobrevivência como a IL-4, eé consistente com um estado de célula IHB ativada sugerido pelasupraregulção* de CD5 (FIG. 1B). A extensão da supraregulção de MHCH,CD86 e CD5 por todos os estímulos testados foi muito semelhante para ascélulas B hepática e esplênica (FIGS. 1B, D e dados não apresentados).

Células IHB Parecem Células B2 Esplênicas ε Não São de Origem

Embrionária do Fígado

Células B hepáticas adultas podem representar geração decélulas B residuais hepáticas a partir de células embrionárias de fígado.Alternativamente, células IHB podem ser derivadas da medula óssea (BM),assim como células B derivadas do baço de um organismo adulto. Paraabordar a origem das células B intrahepáticas, a análise genéticas do rearranjode seus VDJ foram realizadas. Poucas inserções de nucleotídeos não-moldado(Ν, P) são vistas nas junções VDJ de células B neonatais geradas no fígadoembrionário, semelhante ao que foi relatado para células B1. (Feeney, J. Exp.Med. 172:1377-1390 (1990); Gu et al., EMBO J. 9:2133-2140 (1990); Meek,Science 250:820-823 (1990)). Em contraste, células B esplênicas e do sangueadultas possuem extensas adições nucleotídeos não-moldado. (Kantor et al, J.Immunol. 755:1175-1186 (1997); Kepler et al, J. Immunol. 757:4451-4457(1996)). As seqüências CDR3 obtidas a partir de linfócitos adultos de fígadoagrupados foram comparadas com as células B derivadas do baço decamundongos com 2 dias de idade ou células B do sangue de camundongosadultos. Células IHB de adultos se diferem acentuadamente em relação àscélulas B de neonatais e lembram células B2 sangüíneas do baço ou células Bdo sangue recirculantes em suas seqüências VDJ. O número médio denucleotídeos Ν, P em células B de neonatais é 0,5 para a junção VD e 0,1 paraa junção DJ. Esta é notavelmente diferente de 3,5 (ou 4,5), para VD e 4,4 (ou3,4) para as junções DJ de células B adultas no fígado (ou sangue).Curiosamente,.células B do fígado e sangue adultos também parecem diferir notamanho das junções VD e DJ; esta diferença está na fronteira de serestatisticamentfe significativa; ρ = 0,1, no teste T de Student. Células IHB têmmenos Ν-, P nucleotídeos em suas junções VD do que em suas junções DJ1 oinverso do que é relatado para células B2 em adultos. (Kantor et al. Immunol.755:1175-1186 (1997)). A diferença no comprimento das inserções N1 P nascélulas IHB de sangue adultos poderiam ser resultado da seleção de células Bintrahepática. Além disso, a diferença reforça a noção de que células Bhepáticas representam uma verdadeira população intra-hepática semcontaminação significativa por células B do sangue periférico.

Papel da Célula B na Fibrose Hepática

Para avaliar o papel fisiológico das células B que podemdesempenhar um papel importante no fígado, a doença hepática foi induzida ea progressão da doença foi comparada em camundongos deficientes decélulas B e camundongos WT. O modelo de lesão hepática induzida por CCI4foi utilizado, onde uma pronunciada lesão necro-inflamatória, ocorreu em cadaadminstração de CCI4, seguida por uma resposta de reparação crônica. Estemodelo foi considerada como tendo uma vantagem sobre muitos outrosmodelos de lesão hepática amplamente utilizados (por exemplo, porSchistosoma, LPS, ConA), porque o insulto tóxico induz a hepatotoxicidadegeral, em vez de, alvejar a priorí uma parte específica do sistema imunológico.

No entanto, curiosamente, verificou-se que a células B do fígado sãoparticularmente sensíveis à aplicação de CCI4. Uma quantidade de Célula IHBdiminuíram em aproximadamente 10 vezes 1 dia após o tratamento com CCI4em oposição a outros linfócitos intrahepáticos (células NK-T, células T), quepermaneceram inalterados neste ponto (dados não apresentados). No dia 5após a injeção de CCI4, o número de células B números foi recuperado (dadosnão apresentados).Para testar se células B têm um papel na lesão e reparaçãohepática, foi utilizados carnundongos deficientes de células B comhepatotoxicidade induzida por CCI4. A linhagem de carnundongos deficientesde células B foi escolhida para conduzir a análise da deleção alvo na região Jhdo gene da imunoglobulina de cadeia pesada, que se opõe montagem dacodificação do gene da cadeia pesada, assim, evita a geração de célula B eanticorpos. (Chen et ai, Int. Immunoi 5:647-656 (1993)). Estes carnundongosdeficientes de células B são mencionados neste documento comocarnundongos JH-/-.

A extensão da lesão dos hepatócitos induzidas pelo CCI4,avaliada pela liberação específica da enzima ALT pelos hepatócitos no soro 24horas após o tratamento com CCI4, foi semelhante nos carnundongos JH-/- ecarnundongos BALB/c WT (FIG. 2A). É também evidente a partir de análisehistológica (FIG. 3 e vide abaixo). Curiosamente, porém, houve uma grandediferença em termos de quantidade de fibras de colágeno depositada;carnundongos JH -I- tinham cerca de 6-8 vezes menos deposição de colágenointersticial comparados com carnundongos WT uma semana após a sexta dosesemanal qualquer 1,75 ou 3,5 mg/Kg de CCI4 (FIGs. 2B e 2C). Não houvealterações significativas observadas quanto ao número ou localização demacrófagos F4/80+ e produção de actina de músculo liso por miofibroblastosapós 6 tratamentos com CCI4 (dados não apresentados). Assim, células Bparecem constituir uma população de células não-redundantes necessáriaspara o desenvolvimento de modificações fibróticas no fígado em resposta aotratamento com CCI4.

Para testar se a função das células B está limitada ao casoespecífico da lesão induzida pelo CCI4 ou, em vez disso, desempenha umpapel mais geral na reparação do tecido hepático, a hepatotoxicidade foiinduzida com 1-naftilisotiocianato (ANIT), como o ANIT causas destruição dofígado por um, mecanismo distinto do induzido pelo CCI4. A hepatotoxicidadeinduzida pelo ANIT manifesta-se como necrose dependente de neutrófilo nascélulas epitelials do dueto biliar e células parenquimatosas hepática. (Hill et al.,Toxicoi Sei. 47:118-125 (1999)). Após 8 semanas do tratamento com ANIT,verificou-se que os camundongos JH -/- tinham uma deposição de colágenocerca de 7 vezes menor do que camundongos WT. Deste modo, a fibrose émenor na ausência de células B em, pelo menos, dois sistemas de modelo.

Para analisar se aumento do número de células B acima donormal leva a fibrose mais acentuada, foram utilizados camundongos BAFF-tgque demonstram um aumento de 20-30% no número de células B (Mackay etal - J. Exp. Med. 190:1697-1710 ( 1999)), em comparação com oscamundongos correspondentes C57B1/6 WT controle. Após seis tratamentoscom CCU, a fibrose foi desenvolvida nos camundongos BAFF-tg e C57B1/6controle. Esta fibrose foi caracterizada por menos deposição de fibras decolágeno comparado ao camundongo BALB/c (dados não apresentados e Shiet al. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 94:10663-10668 (1997)). Curiosamente,porém, os camundongos BAFF transgênicos tinham cerca de duas vezes aquantidade de depósito de colágeno comparado como os seus homólogos WTC57B1/6 (FIG. 2D).

Camundongos Deficientes de Célula B ε WT Respondem Diferentemente a

Uma Única Lesão Induzida por CCl4.

Para entender o que efeitos agudos ativam para levar amudanças na deposição de colágeno após 6 semanas de tratamento, a cinéticadas mudanças no tecido foi analisada nas secções de fígado doscamundongos deficiente de célula B e camundongos controle 1, 3 e 5 diasapós uma única provocação com CCI4. Curiosamente, a coloração por TÚNEL,detectando células apoptóticas, mostrou que, apesar de semelhante lesãoinicial no dia 1, camundongos JR -/- não tinham células apoptóticas no dia 3,enquanto que ,em camundongos WT algumas células em apoptose ainda sãodetectadas em até 5 dias após lesão (FIG. 3). Quando as seções de tecidoforam coradas' com marcador específico para macrófago F4/80, verificou-seque, preeocemente no dia 1, houve um pequeno aumento no número demacrófagos nos camundongos JH -/- em comparação aos camundongos WT1que se torna muito importante nos dias 3 e 5 (FIG. 3). Assim, afigura-se que, naausência de células B, macrófagos estão em melhores condições para limparhepatócitos degenerados. Como a maior fonte celular de fibras colágeno é apopulação de miofibroblastos (Rockey et al. Clin. Liver Dis. 4:319-355 (2000)),a actina de músculo liso que marca miofibroblastos no fígado lesado tambémfoi monitorada. Miofibroblastos são detectáveis no dia 3, com níveis similarestanto nos camundongos deficientes de célula B quanto nos camundongoscontrole. Pelo dia 5, no entanto, camundongos WT demonstram muito maismiofibroblastos (FIG. 3). Com repetidas lesões, a incapacidade dos macrófagosremoverem eficientemente hepatócitos degenerados pode levar a um excessode estimulação dos miofibroblastos e eventualmente resultar no maiordeposição de colágeno observado após lesão prolongada. Em um estudorecente (Duffield et al., J. Clin. Invest. 115:56-65 (2005)), foi demonstrado quemacrófagos desempenham um papel distinto, oposto durante a lesão ereparação hepática. Parece que, na ausência de células B, os macrófagos quecontribuem para a recuperação da cicatriz inflamatória estão preferencialmenteativados.

Células T CD4 CD8 * Ou γδ Não Influenciam em Grau Significante aFibrose Hepática

Para avaliar se camundongos deficientes em células T tambémtêm um defeito no fibrogênese, uma série experimentos de lesões hepáticasinduzida por CCI4 foram realizados com camundongos deficientes tanto decélulas B quanto de células T (RAG2 -/-), células T CD4+ (Αβ3-/-), células TCD8+ (P2m -I-), ou células T γδ (TCR δ -I-). Para cada linhagem decamundongo mutante, uma linhagem controle do mesmo antecedente genéticofoi utilizada (vicie, Materiais e Métodos). Destes, apenas camundongos RAG2 -/- mostraram quantidades desiguais de deposição de colágeno após otratamento a longo prazo com CCI4 comparativamente ao homólogos WTadequado (FIG. 4 e dados não apresentados). Camundongos RAG2 -/-, comausência de todos linfócitos que exigem rearranjo de DNA para montar seusreceptores, demonstraram aproximadamente uma redução de 3-4 vezes emcomparação com o acúmulo de colágeno intersticial nos camundongos WT(FIG. 4B). Este resultado é muito semelhante ao resultado obtido emcamundongos apenas com deficiência de células B, e não implica um papelproeminente para células T no modelo de fibrose hepática por CCI4.

O Papel Da Célula B Na Fibrose Hepática é Independente De AnticorposCélulas B podem mediar efeitos locais, como apresentação deantígeno, liberação de citocinas, e/ou contato célula-célula regulado pormoléculas co-estimuladoras, e efeitos de longo intervalo através de anticorpos.Como animais deficientes de células T (vide acima), não demonstraramdiferenças na deposição de colágeno, é pouco provável que a apresentação deantígenos da célula B a células T influencie na fibrose hepática.

Para determinar se regulação da fibrose hepática por célula Bexigem imunoglobulinas, foram utilizadas duas linhagens de camundongos quepossuem número normal de células B, mas com deficiência nos níveis séricosde Ig ou que possuem níveis de Ig gravemente reduzidos. Camundongosexpressando proteínas LMP2a derivadas do vírus Epstein-Barr de um geneincorporado no local do elemento J do lócus da IgH (alelo DHLMP2a (Casola etal - Nat. Immunol. 5:317-327 (2004)) deficiente tanto de imunoglobulinas desuperfície quanto de imunoglobulinas circulantes, enquanto camundongosexpressam um transgene mlgM na linhagem de camundongo antecedente JH-/-no codificador de superfície, mas não secretam Ig. (Chan et al., J. Exp. Med.189:1639-1648(1999)).

Como demonstrado na FIG. 5A, após 6 semanas de tratamentocom 1,75 mg/kg CCI4, níveis semelhantes de deposição de colágeno foramobservados nos camundongos expressando proteína LMP2a derivada do vírusEpstein-Barr e seus controles WT BALB/cAnNCrIBr. Além disso, camundongostransgênicos mlgM-tg (JH -/-) expressando Ig de superfície, mas não Igsecretada (Chan et al - J. Exp. Med. 189:1639 - 1648 (1999)), mostraram omesmo grau de fibrose hepática induzida por CCU como o camundongocontrole WT BALB/c (FIG. 5B). Assim, os efeitos da célula B sobre a patologiada fibrose hepática induzida por CCI4 é independente de anticorpos. Éimportante realçar que o grau de fibrose no s camundongos WT BALB/c nestesexperimentos é menor do que nos anteriores (FIGS. 2, 4, 5) potencialmentedevido a diferentes condições habitacionais e/ou infecção concomitante destesanimais: Tanto as colônias de camundongos LMP2a e MIgM foram positivospara H. hepaticus\ portanto, estes camundongos, assim como as linhagens WTcorrespondentes foram mantidas em instalações de quarentena.

Discussão

Neste exemplo, está demonstrado que células B intra-hepáticasrepresentam uma população de tamanho considerável com característicasfenotípicas e funcionais semelhantes ao das células B2 convencionais. CélulasIHB expressam CD5 em maior grau do que células B2 convencionais e elasproliferam melhor in vitro em resposta a reticulação com IgM semsuplementação com IL-4 (FIG. 1), implicando no status de células IHB ativadas.Apesar do fato de fígados adultos serem conhecidos por conterem célulastronco hematopoiéticas pluripotentes c-kit+ que podem dar origem a muitaslinhagens de leucócitos (Watanabe et al - J. Exp. Med. 184:681-693 (1996);Taniguchi et al - Nat . Med. 2:198-203 (1996)), a maioria das células B nofígado adulto parecem ser derivadas da medula óssea em contraste com auto-propagação embrionárias derivadas da linhagem de células B1 do fígado.

(Herzenberg1 tmmunol. Rev. 175:9-22 (2000)). Células IHB são igualmente deorigem da medula: junções VD J das células B intra-hepáticas contêm extensasinserções de nucleotídeos N1 com extensão total média semelhante às célulasB2 convencionais. Notavelmente, a expressão terminal do deoxiribonucleotidiltranferase (TdT)1 a enzima responsável pela inserção do N nucleotídeo, não foiestudado no fígado de adultos (Benedict et al. Immunol. Rev. 775:150-157(2000)), Assim, formalmente, existe uma possibilidade improvável de que acélula B no fígado de adultos são geradas em uma forma dependente de TdT.

Neste exemplo é mostrado que células B desempenham um papelimportante no desenvolvimento da fibrose hepática independente de anticorpo,acrescentando outro modelo de doença igualmente dependente da função dacélula B local. Um papel imperativo das células B também foi demonstrada pordiabetes auto-imune em camundongos diabéticos não obesos (NOD).

Camundongos NOD deficientes de célula B Igpnull e camundongos NOD comcélulas B depletadas não desenvolvem insulite ou diabetes mellitus insulinodependente, reforçando a idéia de que as células B são cruciais para o inícioe/ou ativação de células T auto-reativas. (Serreze et al. J. Exp. Med. 184:2049-2053 (1996); Noorchashm et al, Diabetes 46:941-946 (1997)). Células Btambém se demonstraram necessárias para o desenvolvimento da nefritelúpica no poligênico, Modelo MRL fas-intacto e faz-deficiente de auto-imunidade sistêmica. (Chan et al. J. Exp. Med. 189:1639-1648 (1999); Chan etal., J. Immunol. 160:51-59 (1998); Chan et al. J. Immunol. 163:3592 - 3596(1999)). Em ambos os casos, um mecanismo independente de anticorporevelou-se crucial para o envolvimento da célula B. (Chan et al., J. Exp. Med.189:1639-164 (1999); Wong et al., Diabetes 53:2581-2587 (2004))

Neste exemplo, foram utilizados camundongos que sãoconstitutivamente desprovido de células B para o estudo do envolvimento dascélulas B na patologia fibrótica. Embora normal a fisiologia macroscópica,Camundongost com deficiência de células B faltam redes de dendritosfoliculares (Fu et al., J. Exp. Med. 187:1009-1018 (1998); Gonzalez et al, J.Exp. Med. 187:991-1001 (1998); Endres et al, J. Exp. Med. iSP:159-168(1999)), epitélio associados a folículos nas placas de Peyer no intestino(Golovkina et al - Science 25 (5:1965-1968 (1999)) , E um subconjunto decélulas NK-T não canônica. (Treiner et al., Nature 422:164-169 (2003)).

Camundongos com menos células B também têm defeitos na função dascélulas T CD4+ (Baumgarth et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA. 97:4766-4771(2000)), e talvez algumas outras deficiências funcionais ou de desenvolvimentoainda não descritas. Assim, os resultados obtidos com os camundongosdeficiente de células B indicam que as células B afetam indiretamente apatogênese da fibrose hepática.

Visto que, camundongos deficientes de células T não mostramqualquer diferença no desenvolvimento da fibrose hepática (dados nãoapresentados), é improvável que uma deficiência de células T CD4+ conte paraforte atenuação da fibrose hepática observada nos camundongos JH -/-. Noentanto, uma subclasse de célula B dependente de células NK-T que expressaVal9 contendo invariante TCR (Treiner et al., Nature 422:164-169 (2003)),residente no fígado murino (Shimamura et al., FEBS Lett. 516:91 - 100 (2002)),poderia contribuir para a redução fibrose observada nos camundongosdeficientes de célula B. Células NK-T são conhecidas pela sua capacidade deresponder de forma rápida e produzir citocinas tanto do tipo TH1 quanto do tipoTH2. (Godfrey et al., J. Clin. Invest. 774:1379-1388 (2004)). Essas qualidadespermitem que células NK-T participem da regulação da resposta imunológica.(Godfrey et al., J. Clin. Invest. 774:1379-1388 (2004)). Não houve diferençasacentuadas no desenvolvimento da fibrose hepática nos camundongos CD1 -/-(dados não apresentados), com ausência de células Va14 TCR NK-Tconvencional. Infelizmente, não há camundongo mutante disponível quepermita uma abordagem do papel das células não-canônicas Val9 invarianteNK-T na fibrose hepática. No entanto, animais RAG-/- mostraram inibição dafibrose em uma extensão semelhante aos camundongos deficientes de célulasΒ, o papel dos tipos celulares que exigem o rearranjo de genes para o seudesenvolvimento (diversas linhagens de células BeT) está implícito. Assim,em conjunto os dados sugerem tanto as células NK-T não CD 1 restritas queexigem células B para o seu desenvolvimento (Treiner et al., Nature 422:164-169 (2003)) ou a função autônoma das células B tem um papel importante nafibrose manifestada no modelo de hepatotoxicidade induzida pelo CCI4.

Usando duas linhagens de camundongos gerados anteriormente(camundongo com inserção de LMP2a e mlgM-Tg) deficiente na produção deimunoglobulina, demonstrou-se que os anticorpos não estão necessários nodesenvolvimento da fibrose hepática induzida por CCI4. Camundongos LMP2apossuem o número de células B normal e a ausência tanto de anticorpossecretados quanto de imunoglobulinas expressas na superfície. (Casola et al.,Nat. Immunol. 5:317-327 (2004)). LMP2A não só mimetiza a sinalização deBCR1 mas também desencadeia vias adicionais de sinalização (Ikeda et al., J.Viroi 77:5529-5534 (2003); Portis e Longnecker, J. Virol. 77:105-114 (2003)),

Deste modo, foi avaliada a fibrogênese no camundongo mlgM-Tg (JH -/-) queexpressa um BRC transgênico na superfície e têm de 300-500 vezes o título deanticorpo reduzido comparado com camundongos normais (Chan et al., J. Exp.Med. 189:1639-1648 (1999)). Ambas as linhagens de camundongosdesenvolveram fibrose hepática, a um nível semelhante ao dos controles.

Assim, o papel das células B na patologia fibrose hepática parece serindependente de anticorpos, sugerindo que ela seja mediada por funções (ex.secreção de citocinas e/ou contato célula-célula) de células B locais poroposição aos ffeitos potencialmente de longo duração mediada por células Blocalizadas em outras partes do organismo. É improvável que o papel daapresentação cie antígeno das células B desempenha um papel significativo nafibrose hepática, como camundongos convencionais deficiente em células Tmostraram fibrogênese semelhantes aos seus homólogos WT. Além disso,células B LMP2a B não têm a capacidade de se ligar, internalizar e apresentarantígenos, porque falta receptores de células B na superfície e tambémmostram depósitos de colágeno semelhantes aos camundongos WT. Emconjunto, estes dados sugerem que o tecido hepático reparado é afetado pelafunção local das células B, que podem ser mediadas em parte pelas célulasIHB definidas no presente. Formalmente, é possível que células B - dominemo(s) mecanismo(s) de clearence no fígado. No entanto, o número de células Bé muito pequeno em comparação ao número de hepatócitos.

Os resultados apresentados no presente exemplo estão deacordo com relatos de que o grau de lesão hepática em resposta ao CCI4 foisignificativamente mais suave em ratos esplenectomizados comparado a ratosoperados sham (Chen et al., Chin. Med. J. (EngI) 111:779-783 (1998)), e emcamundongos SCID em antecedente BALB/c, comparado com os controlesadequados. (Shi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 24:10663-10668 (1997)). Noentanto, a fibrose hepática induzida pelo parasita Schistosoma mansoni émaior em camundongos deficientes de célula B em comparação comcamundongos controle. (Ferru et al., Scand. J. Immunol. 48:233-240 (1998)).As diferenças no mecanismo da indução da fibrose pelo dano repetido aoshepatócitos (como é o caso do CCI4 e ANIT) ou pelo baixo nível de infecçãopelo parasita poderia explicar a discrepância.

A função das células B também tem sido associada comfibrose na pele, tanto em camundongos quanto em humanos. No modelode camundongos tight-skin (TSK/+), bem como em pacientes comesclerose sisjêmica, a ativação crônica de células B resultantes doaumento da expressão de CD 19 leva a fibrose da pele e a auto-imunidade.(Saito et ai.," J. Clin. Invest. 109:1453-1462 (2002)). Além disso, umalinhagem de célula B estabelecida a partir do tecido pulmonar de umpaciente com esclerodermia exibe uma proliferação e resposta inflamatóriaaumentada que são susceptíveis a ativação de mudanças fibróticas.(Kondo et ai, Cytokine 13:220-226 (2001)).

Em suma, este exemplo descreve o isolamento e caracterizaçãode uma população de células B no fígado de adultos e demonstra diretamenteum papel importante das células B na reparação do tecido após a lesãohepática. Este exemplo demonstra que ainda que as células B estão envolvidasna patologia das doenças fibróticas. Assim, os resultados aqui apresentadosindicam que os antagonistas de célula B revelaram-se eficazes no tratamentode doenças fibróticas.

Exemplo 2

Fibrose Pulmonar em Um Modelo de Camundongo Deficiente de Célula B

Introdução

A fibrose pulmonar pode ser induzida em modelos animais, porexposição a bleomicina. A administração intratraqueal de bleomicina emroedores é o modelo mais utilizado de fibrose pulmonar. A bleomicina é umagente citotóxico que provoca danos endoteliais e epiteliais, em parte atravésda geração de radicais livres e indução de citocinas inflamatórias. (Sleijfer;Chest 120:617-624 (2001)). Fibroblastos são ativados, e em duas semanas, hásignificante fibrose e deposição de colágeno nos pulmões. Neste exemplo, édemonstrado que o camundongo deficiente de célula B, após a exposiçãosistêmica prolongada a bleomicina, exibiu melhor sobrevida e fibrose pulmonarreduzida em comparação com camundongos do tipo selvagem tratadosidenticamente.Material ε Métodos

Camundongos

Gamundongos C57BL/6J: tipo selvagens com função normal dascélulas;

Camundongos deficientes de células; B6A29S2-lgh-6,m1C9n /J:

Exposição Prolongada a Bleomicina

No dia O, camundongos tipo selvagens ou deficientes de célula Bforam implantados assepticamente com uma mini bomba osmótica subcutâneade 7 dias Alzet® contendo solução salina (n= 7, wt, η = 5, ko) ou solução debleomicina com doses de 60 mg/Kg (n=12, wt, n=10, ko), ou 100 mg/Kg (n=8,wt, n=10, ko) (dose total administrada durante 7 dias).

Medições

O peso corporal e os sinais clínicos foram monitorados por um 1mês. Os camundongos foram eutanizados no Dia 28 e os pulmões removidos,instilados e fixados em formalina tamponada 10%. Os pulmões foram coradoscom Tricrômio de Masson para identificar o colágeno/fibrose presente, e foirealizada uma imuno-histoquímica de actina para identificar o grau potencial defutura fibrose. A proporção da área tecidual ocupada por colágeno ou actina foideterminada histo-morfométricamente usando o software Metamorph®.

Resultados

A administração de 60 mg/kg/7d de bleomicina produziu apenasuma modesta acumulação de actina no Dia 28. Camundongos tipo selvagem edeficientes de célula B apresentaram níveis semelhantes de actina (FIG. 6).

A administração de 100 mg/kg/7d de bleomicina produzido umaacumulação de actina de moderada a extensa no 28° dia. Animais tipo selvagemdemonstraram redução na sobrevida níveis de actina estatisticamente maior do quecamundongos knockout de célula B (FIGS. 6, 7 e 8).

Os resultados destes experimentos demonstram que a ausênciade linfócitos Β, reduz a extensão da fibrose pulmonar e aumenta a sobrevidaapós a exposição prolongada à bleomicina em camundongos C57BL6.Conseqüentemente, estes resultados sustentam ainda a utilização deantagonistas de células B para tratar doenças fibróticas e, em particular,doenças fibróticas do sistema pulmonar.

Exemplo 3

Fibrose Renal em Modelo de Camundongo Deficiente de Célula B

Introdução

A obstrução ureteral unilateral (UUO) é um modelo de nefropatiaobstrutiva que produz progressiva compressão do tecido, degeneração tubular,e fibrose glomerular e intersticial. (Miyajima et al, Kidney International 55:2301-2313 (2000)). Neste exemplo, demonstra-se que camundongos deficientes decélula B exibem uma fibrose renal reduzida em resposta à UUO emcomparação com camundongos do tipo selvagem.

Material ε Métodos

Camundongos

Camundongos C57BL/6J: tipo selvagens com função normal dascélulas;

Camundongos deficientes de células: B6A29S2-lgh-6tm1Cgn /J

Obstrução Ureteral Unilateral

No Dia 0, sob condições assépticas e sob anestesia comcetamina/xilazina o ureter esquerdo foi isolado, ligado e seccionado entre asligaduras nos camundongos do tipo selvagem (n = 10) ou nos camundongosdeficientes de células B (n= 10). Camundongos tipo selvagens (n= 5) oucamundongos deficientes de células B (n= 5) não operados também foramincluídos como controles normais.

Medições

O peso corporal e os sinais clínicos foram monitorados durante os10 dias da progressão de pico doença. Os camundongos foram eutanizados noDia 10 e ambos os rins removidos e fixados em formalina tamponada 10%. OsRins foram corados com Tricrômio de Masson para identificar ocolágenotfibrose presente, e foi realizada uma imuno-histoquímica de actinapara identificar o grau potencial de futura fibrose. A proporção da área tecidualocupada por colágeno ou actina foi determinada histo-morfométricamenteusando o software Metamorph®.

Resultados

Após a UUO1 camundongos deficientes de células Bapresentaram uma redução estatisticamente significativa de 29% na coloraçãode actina, comparado aos camundongos tipo selvagem homólogos (FIG. 9A) euma redução estatisticamente significativa de 62% no acúmulo de colágenointersticial (FIG. 9B). Será apreciado que estas condições patológicasconstituem dois marcadores clássicos para a medição e quantificação decondições fibróticas.

Após a UUO, camundongos deficientes de células B tambémexibiram uma redução significante da dilatação tubular (FIG. 9C) e aumentaramsignificativamente a coloração de túbulos saudáveis (FIG. 9D). O aumento dacoloração de túbulos saudáveis foi observado em camundongos deficientes decélulas B, mesmo na ausência da lesão (FIG. 9D; vide também FIG. 10).

Os resultados destes experimentos demonstram que aausência de linfócitos B reduz a extensão da fibrose renal após a lesãoinduzida pela UUO.

A observação de que a extensão das lesões fibróticas induzidaexperimentalmente, em múltiplos modelos é substancialmente menor emcamundongos que são deficientes de células B (vide Exemplos 1-3) sustentamfortemente a utilização de antagonistas de célula B para tratar uma série dedoenças associadas com indicações de patologia inflamatória/fibrótica.Exemplo 4

Anticorpo Monoclonal Anti-CD20 E Contagem No Aumento De Células BDo Pulmão E Baco Causado Pelo Tratamento Com Bleomicina

Introdução

Conforme demonstrado no Exemplo 2, a fibrose pulmonar éinduzida em modelos animais, pela exposição à bleomicina, e a extensão dafibrose pulmonar induzida pela bleomicina é menor em camundongosdeficientes de célula B. Neste exemplo, é mostrado que camundongos tratadoscom bleomicina apresentam um aumento de células B em seus pulmões, e,sobretudo, esta aumento de células B induzido pela bleomicina ésignificativamente menor em camundongos que são tratados com um anticorpoanti-CD20. Estes resultados fornecem um apoio adicional para a utilização deantagonistas de célula B para tratar doenças fibróticas.

Material ε Métodos

Neste exemplo, camundongos C57B1/6 machos de 9 semanasde idade foram utilizados para os experimentos. No Dia O os camundongosforam anestesiados com cetamina/Xilazina IP, e receberam 0,025 unidadesem um volume de 50μΙ IT de Bleomicina usando um PennCennturyAerosolizer. O PennCenntury Aerosolizer foi inserido pela boca e traquéia.

Os camundongos receberam anticorpo monoclonal anti-CD-20 murino(designado "18B12", desenvolvido pela Biogen Idece, pedido de PatenteUS 60/741491), ou PBS, por via intraperitoneal nos dias -7 (7 dias antes daadministração de bleomicina) e no dia 7. Um grupo separado decamundongos recebeu apenas PBS intratraquealmente e nenhum outrotratamento.

Os animais foram eutanizados por CO2 no Dia 9 e pulmões ebaço foram recolhidos. Os pulmões e baço foram cortadas em segmentoscom tesoura, homogeneizados e depois transferidos para um tubo decentrífuga de 50 ml. 40 ml de RPMI1640/5% FBS gelado foi adicionado aotubo e centrifugadas durante 10 minutos a 300 χ g (1200 RPM no IECCentra 8R cotri rotor padrão), a 4 0C para sedimentos e retirar detritoscelularesc O pellet foi ressuspenso em 10 ml de meio de digestão por 40-60minutos a 37 ° C.

Para isolar a população de células enriquecida de linfócitos 30ml de RPMI 1640 sem soro gelado foi adicionado a cada tubo para chegarao volume final de 40 ml. Os tubos foram centrifugados durante 10 minutosa 300 χ g (1200 RPM no IEC Centra 8R com rotor padrão), 4 °C. Osobrenadante foi descartado e o pellet de células foi ressuspenso em umvolume finâl de 6 ml em 45% de Percoll em RPMI 1640 sem soro gelado,suplementado com 70% de Percoll em PBS para obter um gradiente.

A interface foi colhida e adicionada a 10 vol de RPMI 1640sem soro gelado é os tubos centrifugados durante 10 minutos a 400 χ g(1500 RPM no IEC Centra 8R com rotor padrão), 4°C. Célulasexpressando CD5 e CD19 foram analisadas com o uso de FACS. (Figuras11, 12 e 13).

Resultados

Como mostrado nas figuras 11 e 13, camundongos tratadoscom bleomicina apresentaram um aumento de células B (CD 19+) nospulmões, e este aumento foi significativamente menor nos camundongosque receberam anticorpos anti-CD20 além da bleomicina. Como mostradona Figura 12, o tratamento com o anticorpo anti-CD20 também reduziueficazmente o número de células B no baço. Conforme mencionado noExemplo 2, acima, a fibrose pulmonar pode ser induzida em modelosanimais, por exposição a bleomicina. Estes resultados suportam aconclusão de que, antagonistas de célula B, como um anticorpo anti-CD20,são eficazes no tratamento de doenças fibróticas.Exemplo 5

Um Anticorpo Monoclonal Anti-CD20 é Protetor Contra A Fibrose

Hepática Induzida Pelo CcuIntrodução

Conforme demonstrado no Exemplo 1, fibrose hepática é induzidaem modelos animais pela exposição ao CCI4, bem como a extensão da fibrosehepática induzida pelo CCI4 é reduzida em camundongos deficientes de célulaB. Neste exemplo, é demonstrado que a fibrose hepática induzida por CCI4 ésignificativamente reduzida em camundongos tratados com anticorpos anti-CD20. Estes resultados fornecem ainda mais evidências para o uso deantagonistas de célula B para tratar doenças fibróticas.

Material ε Métodos

Um anticorpo depletor de células B anti-CD20 murino (designado"18B12", desenvolvido pela Biogen Idec1 pedido de Patente US. 60/741491) foitestado em um modelo de fibrose hepática em camundongo, induzida pelaadministração do químico tetracloreto de carbono (CCI4). Uma dose de 1,75ml/Kg de CCI4 preparado em óleo mineral foi administrado uma vez por semanadurante seis semanas e os camundongos foram tratados concomitantemente(via intraperitoneal), apenas com PBS1 250 pg de anticorpo monoclonal anti-CD20, ou 250 pg de um anticorpo monoclonal isotipo controle. Camundongosforam injetados com PBS e anticorpos e uma semana antes da administraçãoda primeira dose de CCI4 e um dia antes de cada dose subseqüente de CCI4.

Sete dias após a sexta dose de CCI4, os camundongos foram sacrificados e osfígados foram excisados e imuno-corados para marcar a expressão de actinade músculo liso, um marcador de fibrose.

Resultados

Como demonstrado na Figura 14, o grau de fibrose hepática(como indicado pela marcação de actina de músculo liso), em animais tratadoscom o anticorpo anti-CD20 foi de, aproximadamente, 20% menor do que nosanimais controle que receberam PBS1 e cerca de 28% menor do que emanimais contrcrte recebendo anticorpo monoclonal isotipo controle. Mais umavez, este.exemplo mostra a aplicabilidade dos métodos da presente invençãopara tratar, retardar ou impedir o aparecimento ou progressão de doençasfibróticas, em especial no fígado.

Exemplo 6

Métodos Para O Tratamento De Doenças Fibróticas

Um paciente com diagnóstico de um ou mais sintomas de umadoença fibrótica é tratado de acordo com este exemplo. Exemplo de doençasfibróticas para ser tratada no presente inclui, por exemplo, doenças pulmonaresassociadas lesão/fibrose, nefropatias crônicas associada com lesões/fibrose(fibrose renal), fibrose intestinal, fibrose hepática (incluindo, por exemplo, iV)cirrose), fibrose de cabeça e pescoço, cicatriz corneana, vasculopatias,doeViças auto-imunes associadas à fibrose, como, por exemplo, esclerodermia,lúpus, e doença enxerto contra hospedeiro.

Um paciente com diagnóstico de um ou mais sintomas de doençafibrótica é tratado

O paciente é tratado com rituximab ou 2H7 humanizado, ou umfragmento (por exemplo, um Fab, F(ab')sub.2, Fv, scFv ou diacorpo) derituximab ou 2H7 humanizado.

Preferivelmente, o anticorpo é administrado por via intravenosa(IV), para o paciente, de acordo com qualquer um dos seguintes esquemas dedosagens:

(A) 50 mg/m2 no dia 1; 150 mg/m2 nos dias 8,15 e 22;

(B) 150 mg/m2 no dia 1; 375 mg/m2 nos dias 8,15 e 22; ou

(C) 375 mg/m2 no dia 1, 8,15 e 22.

Os pacientes tratados com o anticorpo CD20 demonstrarão umamelhora nos sintomas da doença fibrótica.

Em um esquema de dosagem alternativo, o paciente é tratadocom rituximab conforme definido no esquema (A) acima e com um anticorpopara avp6.como descrito na Patente USPN 6316601, que está incorporada aopresente na sua totalidade pela referência. Novamente o paciente demonstrarámelhora nos sintomas da doença fibrótica.

Em outro esquema de dosagem alternativo, o paciente é tratadocom rituximab conforme estabelecido no esquema de dosagem (Β). O nível decélulas B periféricas do paciente é monitorado bem como a quantidade dedeposição de colágeno no órgão de interesse. Oito meses depois, como areconstituição da reposta imune por células B do paciente e/ou é alcançado aquantidade de deposição colágeno à um nível predeterminado, o paciente étratado novamente com rituximab, de acordo com o esquema de dosagem (A).

Tendo agora a presente invenção completamente descrita comdetalhes com o objetivo de ilustrar e exemplificar a fim de esclarecer oentendimento, será óbvio para aqueles hábeis no assunto que as mesmaspodem ser realizadas através de modificações ou alterações da invençãodentro de uma gama de condições, formulações e outros parâmetrosequivalentes, sem afetar o escopo da invenção ou qualquer exemplo derealização específico apresentado no presente, e que essas modificações oualterações se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentesmencionados nesta especificação são indicativas do nível de qualificação dostécnicos no assunto ao qual pertence esta invenção, e são incorporadas aopresente pela referência à mesma proporção que cada publicação, patente oupedido de patente foi especificamente e individualmente indicada para serincorporada ao presente pela referência.Listagem de Seqüência

<110> Tatiana NovobrantsevaShelia VioletteVictor KotelianskyAlexander Ibraghimov

<120> Métodos para Tratamento de Condições Fibróticas

<130> 2159.0530002

<150> US 60/682,005

<151> 18-05-2005

<150> US 60/741,867

<151> 12-05-2005

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu1 5

B

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr20

Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly10 15

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala25 3 0

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val35 40 45

Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro50 55 60

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe65 70 75 80

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu85 90 95

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn100 . 105 110

Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg145 150 155 160Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly AsnJ 165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly15 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln,j 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45

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Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn85 90 95

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Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe115 120 125

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His180 185 190Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu225 230 235 240

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro245 250 255

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp325 330 335

Trp ^Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu340 345 350

Pro jAla Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470

<210> 3

<211> 471

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3Met Gly1

Val His

Pro Gly

Thr Ser50

Glu Trp65

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Thr Leu

Tyr Tyr

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Lys ,ply145

Gly ,Gly

Pro Val

Thr Phe

Val Val210

Asn Val225

Pro Lys

Glu Leu

Asp Thr

Asp Val290

Trp Ser

Ser Glu. 20

Gly Ser35

Tyr Asn

Val Gly

Phe Lys

Tyr Leu' 100

Cys Ala115

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Val Glu240

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Pro LysVal ValVal Asp

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr305 310 315 320Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu340 345 350

Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu385

Ile Ala Val Glu Trp405

Thr Thr Pro Pro Val420

Thr Cys Leu Val Lys Gly390 395

Glu Ser Asn Gly Gln Pro410

Leu Asp Ser Asp Gly Ser425

Phe Tyr Pro Ser Asp400

Glu Asn Asn Tyr Lys415

Phe Phe Leu Tyr Ser430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro1 5

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg20

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly50 55

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly10 15

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met25 30

Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr45

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 OO > 5 α

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

y)

<210 > 6

<211> 213

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 0 0 > 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125

4

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 7

<211> 452

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

15 10 15

y

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr145 150 155 160Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr290 295 300

Tyr ,Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn305 310 315 320

Gly Jjys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro385 390 395 400

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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu435 440 445

Ser Pro Gly Lys450

<210> 8<211> 452<212> PRT

<213> Homo sçpiens

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro■β 115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly ThrJ.30 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser260 265 270

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Tyr Lys Thr Thr Pro400

Tyr Ser Lys Leu Thr415

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Ser ,Pro Gly Lys450

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 . 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp100 105 110

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser115 120

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30

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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105

<210 > 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu20 25 30

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Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105

<210> 12

<211> 122

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 13

<211> 451

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr100

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val115 120

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser130 135

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys145 150

Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro165 170 175

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu435 440 445

Ser Pro Gly450

<210> 14

<211> 291

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys15 10 15

Asp Pro Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala20 25 30

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp35 40 45

Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly50 55 60

Gly -Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu65 70 75 80

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr85 90 95

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Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly145 150 155 160

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile165 170 175

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val180 185 190

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser195 200 205

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu210 215 220

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro225 230 235 240Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val245 250 255

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met260 265 270

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser275 280 285

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<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ala Trp Val Pro Cys Ser Val Leu1 5 10 15

Lys

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400_> 16

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Pro Cys Gly Leu Leu15 10 15

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<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Arg Trp Val Pro Cys Glu Met Leu15 10 15

Gly

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg Ser Trp Val Pro Cys His Met Leu15 10 15Arg

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapíens

<400> 19"

Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Trp Val Ala Cys Gly Leu Leu1 5 10 15

Arg

<210> 20

<211> 213

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala180 185 190Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys210

Claims

1. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA CONDIÇÃOFIBRÓTICA, em que o dito método compreende a administração a um pacientecom necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficazde antagonista de célula B.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que oantagonista de célula B mencionado é um anticorpo contra o antígeno desuperfície da célula B.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, em que oantígeno de superfície da célula B mencionado é CD20.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, em que oantígeno de superfície da célula B mencionado é selecionado a partir do grupoque consiste de CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40,CD52, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a,CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86, TLR-7, TLR-9,CXCR3, APRIL, BR3, BCMA e TACI.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, em que o ditoanticorpo é um anticorpo monoclonal.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, em que oanticorpo mencionado é um anticorpo monoclonal contra o CD20.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, em que oanticorpo mencionado é um anticorpo murino quimérico/ monoclonal humanocontra CD20.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, em que oanticorpo mencionado contra CD20 é rituximab (RITUXAN®).

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, em que o ditoanticorpo é um anticorpo humanizado.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, em que o ditoanticorpo é um anticorpo humano completo.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, compreendeadicionalmente, a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz deum antagçnista de BAFF ao paciente mencionado.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, em que o ditoantagonista de BAFF é um polipeptídeo contendo uma seqüência deaminoácido selecionado a partir do grupo que consiste deECFDLLWAWVPCSVLK (SEQ ID N0: 15), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ IDN0:16), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID N0 17), ECFDLLVRSVWPCHMLR(SEQ ID N0: 18), e ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID N0: 19).

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, em que o ditoantagonista de BAFF compreende de uma proteína de fusão solúvel contendopelo menos uma porção do receptor BAFF e uma porção da região constantede uma imunoglobulina.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, onde opaciente não possui uma doença autoimune.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, onde o pacientenão é um paciente de risco para o desenvolvimento de doença autoimune.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, onde oantagonista de célula B mencionado causa 20% de depleção de células Bperiféricas nos pacientes dentro de 24 horas após a administração doantagonista de célula B mencionado ao dito paciente.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, onde oantagonista de célula B mencionado causa 60% de depleção de células Bperiféricas nos pacientes dentro de 24 horas após a administração doantagonista de célula B mencionado ao dito paciente.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, onde oantagonista de célula B mencionado causa 80% de depleção de células Bperiféricas nos pacientes dentro de 24 horas após a administração doantagonista de célula B mencionado ao dito paciente.

19. MÉTODO PARA TRATAR A FIBROSE PULMONAR, emque o cito método compreende a administração a um paciente comnecessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz deantagonista de célula B.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, em que oantagonista de célula B mencionado é um anticorpo contra CD20.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, onde oanticorpo mencionado é um anticorpo murino quimérico/ monoclonal humanocontra CD20.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, onde oanticorpo mencionado contra CD20 é rituximab (RITUXAN®).

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, onde após aadministração do antagonista de células B ao dito paciente, este apresenta umadiminuição de um ou mais marcadores de fibrose quando comparado ao pacientemencionado antes da administração do antagonista de célula B referido.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, em que umou mais marcadores de fibrose mencionados é a deposição de actina demúsculo liso ou deposição de colágeno.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, onde após aadministração do dito antagonista de célula B ao dito paciente, a extensão dacoloração de actina de músculo liso observada em um ou mais tecidos dopaciente é, pelo menos, 5% menor do que a extensão da coloração de actinade músculo liso observada em um ou mais tecidos de paciente mencionadoantes da administração do dito antagonista de célula B.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, onde após aadministração do dito antagonista de célula B ao dito paciente, a extensão dacoloração de actina de músculo liso observada em um ou mais tecidos dopaciente é, pelo menos, 25% menor do que a extensão da coloração de actinade músculo liso observada em um ou mais tecidos do paciente mencionadoantes da administração do dito antagonista de célula B.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, onde após aadministração do dito antagonista de célula B ao dito paciente, a extensão dacoloração de actina de músculo liso observada em um ou mais tecidos dopaciente é, pelo menos, 50% menor do que a extensão da coloração de actinade músculo liso observada em um ou mais tecidos do paciente mencionadoantes da administração do dito antagonista de célula B.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, onde após aadministração do dito antagonista de célula B ao dito paciente, a extensão dacoloração de colágeno observada em um ou mais tecidos do paciente é, pelomenos, 5% menor do que a extensão da coloração de colágeno observada emum bu mais tecidos do paciente mencionado antes da administração do ditoantagonista de célula B.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, onde após aadministração do dito antagonista de célula B ao dito paciente, a extensão dacoloração de colágeno observada em um ou mais tecidos do paciente é, pelomenos, 25% menor do que a extensão da coloração de colágeno observadaem um ou mais tecidos do paciente mencionado antes da administração do ditoantagonista de célula B.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, onde após aadministração do dito antagonista de célula B ao dito paciente, a extensão dacoloração de colágeno observada em um ou mais tecidos do paciente é, pelomenos, 50% menor do que a extensão da coloração de colágeno observadaem um ou mais tecidos do paciente mencionado antes da administração do ditoantagonista de célula B.

31. MÉTODO PARA TRATAR A FIBROSE HEPÁTICA, onde odito método compreende a administração a um paciente com necessidade de taltratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de célula B.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, onde oantagonista de célula B mencionado é um anticorpo contra CD20.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, onde oanticorpo mencionado é um anticorpo murino quimérico/ monoclonal humanocontra CD20.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, onde oanticorpo mencionado contra CD20 é rituximab (RITUXAN®).

35. MÉTODO PARA TRATAR A FIBROSE RENAL, em que o ditométodo compreende a administração a um paciente com necessidade de taltratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de antagonista de célula B.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, onde oantágonista de célula B mencionado é um anticorpo contra CD20,

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, onde oanticorpo mencionado é um anticorpo murino quimérico/ monoclonal humanocontra CD20.

38. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 37, onde oanticorpo mencionado contra CD20 é rituximab (RITUXAN®).

39. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA FIBRÓTICA,onde o dito método compreende a administração a um paciente comnecessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz deantagonista de célula B e uma quantidade terapeuticamente eficaz de umantagonista de receptor de integrina.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, onde o ditoantagonista de receptor de integrina é um anticorpo específico para umreceptor de integrina.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, onde o ditoantagonista de receptor de integrina é selecionado do grupo que consiste daav(36, av(35, a5(31, a1(31, a4(31 e a4(37.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 41, onde o ditoantagonista de receptor de integrina é um receptor de integrina a4|31 ou a4f37.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, onde o ditoantagonista de receptor de integrina é natalizumab (TYSABRI®).

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, em que opaciente não possui uma doença autoimune.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, onde o pacientenão é um paciente de risco para o desenvolvimento de doença autoimune.

46. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA FIBRÓTICA,onde o dito método compreende a administração a um paciente comnecessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz derituximab (RITUXAN®) e uma quantidade terapeuticamente eficaz denatalizumab (TYSABRI®).

47. MÉTODO PARA PREVENIR UMA DOENÇA FIBRÓTICA,onde o dito método compreende a administração a um paciente de risco para odesenvolvimento de uma ou mais doenças fibróticas de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de antagonista de célula B.

48. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 47, onde o ditopaciente com risco de desenvolver uma ou mais doenças fibróticas foi expostoa uma ou mais condições ambientais que são conhecidas por aumentar o riscode fibrose de pulmão, fígado ou rins.