BRPI0613185A2 - revestimento de superfìcie celular com agentes ativos - Google Patents

revestimento de superfìcie celular com agentes ativos Download PDF

Info

Publication number
BRPI0613185A2
BRPI0613185A2 BRPI0613185-9A BRPI0613185A BRPI0613185A2 BR PI0613185 A2 BRPI0613185 A2 BR PI0613185A2 BR PI0613185 A BRPI0613185 A BR PI0613185A BR PI0613185 A2 BRPI0613185 A2 BR PI0613185A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
group
lipid
glycero
dioleoyl
cell
Prior art date
Application number
BRPI0613185-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Claudio Maldonado
Federico Grossi
Perez-Abadia Gustavo
William D Ehringer
Original Assignee
Univ Louisville Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Louisville Res Found filed Critical Univ Louisville Res Found
Publication of BRPI0613185A2 publication Critical patent/BRPI0613185A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A61K38/58—Protease inhibitors from animals; from humans from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

REVESTIMENTO DE SUPERFìCIE CELULAR COM AGENTES ATIVOS. é revelada uma vesícula lipídica compreendendo um lípídio funcionalizado compreendendo uma parcela de ligação tendo afinidade de ligação por uma parte de ligante de um agente ativo e o agente ativo. São também revelados métodos de revestimento de células endoteliais, tecidos e órgãos com agentes ativos utilizando as vesiculas lipídicas reveladas.

Description

"REVESTIMENTO DE SUPERFÍCIE CELULAR COM AGENTESATIVOS"
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido dePatente Provisória Norte-Americana Número de Série 60/676.049,depositado em 29 de abril de 2005, cuja revelação é aqui incorporadana íntegra por referência.
INTERESSE GOVERNAMENTAL
O assunto ora revelado foi realizado com o suportedo governo dos Estados Unidos da América sob a Concessão número 1 R41HL079855-01 pelos Institutos Nacionais de Saúde [National Institutesof Health]. Assim, o governo norte-americano detém alguns direitossobre o presente assunto.
CAMPO TÉCNICO
O assunto ora revelado refere-se, de modo geral, amétodos de revestimento de células com agentes ativos e, maisparticularmente, a métodos de revestimento de células utilizandovesículas lipídicas fusogênicas formuladas com lipídiosfuncionalizados que ligam agentes ativos com afinidade.
ABREVIAÇÕES
ACI = August e Copenhagen-Irish
(cruzamento de linhagem de rato)
APC célula de apresentação de antígeno
CABG revascularização coronariana
CPB revascularização cardiopulmonar
CRl receptor complementar 1
CTLA4 proteína 4 citotóxica associada aolinfócito T<table>table see original document page 3</column></row><table><table>table see original document page 4</column></row><table>
HISTÓRICO
Tecidos que são submetidos à isquemia prolongada elesão por reperfusão (IRI) produzem radicais de oxigênio enitrogênio, entre outras toxinas, resultando em lesão endotelial quepode levar a inflamação, aumento da atividade trombogênica emartérias e veias, e aumento da taxa de rejeição aguda de aloenxertos.A isquemia pode ser causada por lesão traumáticaaos vasos ou por oclusão vascular intencionalmente induzida em váriosprocedimentos clínicos, incluindo o transplante de tecidos e órgãos.
A IRI é considerada um processo bifásico. A isquemia inicia a lesãopor privação de energia e acúmulo de metabólito e a reperfusão agravaa lesão ao desencadear uma reação inflamatória que envolve radicaislivres de oxigênio, (Halliwell, B. et al., 1992, FEBS Lett., 307:108-112; Kalayoglu, M. et al., 1988b, Lancet, 331:617-619; Lominadze, D.et al., 1997, J.Nutr., 127:1320-1327; Weisman, H. F. et al. , 1990b,Science, 249:146-151; Wink, D. A. et al. , 1994, Environ. HealthPerspect., 102 Suppl 3:11-15), ativação complementar (Hill, J. H. etal., 1971d, 133:885-900) e leucócitos (Krishnaswamy, G. et al., 2001,Front Biosci., 6 .-D1109-D1127; Kvietys, P. R- et al., 2001, NewsPhysiol Sci., 16:15-19). Depois que o fluxo sangüíneo é restabelecidoem tecidos isquêmicos, o oxigênio é reaplicado e mecanismos de reparosão colocados em ação. Durante a reperfusão, os metabólitos tóxicosacumulados são liberados na circulação sistêmica e podem afetaradversamente órgãos remotos e/ou o processo regenerativo no órgãoisquêmico.
A evidência de acúmulo sugere complemento como ummediador central de lesão por reperfusão (Amsterdam, E. A. et al. ,1995, 268:H448-H457; Hill, J. H. et al., 1971b, 133:885-900; Smith,G. W. et al., 1983, J.Clin.Lab Iimunol., 12:197-199; Weiser, M. R. etal., 1996, 183:2343-2348). A ativação complementar em coraçõesisquêmicos foi relatada pela primeira vez por Hill et al. em 1971(Hill, J. H. et al., 1971c, 133:885-900). Desde então, pelo menostrês vias complementares separadas (as vias clássica, da lectina ealternativa) foram identificadas para ativar o complemento (Stahl, G.L. et al. , 2003, 162:449-455). A via clássica é ativada pelainteração antígeno-anticorpo, que então leva à ativação do componentecomplementar Clq, seguido dos componentes complementares C2- e C4-dependentes da clivagem do componente complementar C3 e, por fim, aclivagem do componente complementar C5 pela formação da C5 convertaseclássica (C4b2a3b). A via alternativa é ativada pela presença delipopolissacarídeo (LPS), e, até certo ponto, C3b geradoespontaneamente. Nessa via, C3b liga-se ao fator B e forma umcomplexo que é clivado pelo fator D para formar a C3 convertasealternativa, C3b (H2O) Bb. A properdina atua como um ativador deamplificação e estabiliza esse complexo, permitindo que o produto declivagem C3b se ligue a ela, formando assim a C5 convertasealternativa (C3b3bBb). Todas as vias, portanto, utilizam C3 e clivamC5, o que resulta nos potentes produtos pró-inflamatórios de clivagemC5a e C5b-9 (Complexo de ataque à membrana, MAC). Acredita-se queesses dois produtos de ativação complementar desempenham um papelfundamental na IRI (Mollnes, Τ. E. et al., 2002, Trends Immunol.,23:61-64), como confirmado em animais com deficiência de C5, o quereduziu a lesão remota e local nos modelos de IRI.
No transplante autólogo de tecido, incluindo, porexemplo, enxertos de veia safena (SVGs), a lesão endotelial após aIRI pode induzir a formação de trombo, o que pode levar à oclusão doenxerto (Motwani, J. G. et al. , 1998, Circulation, 97:916-931). Atrombose aguda de SVGs ocorre em até 12% dos pacientes no período de30 dias após a revascularização coronariana (CABG) (Bourassa, M. G.,1991, J.Am. Coll. Cardiol., 17:1081-1083; Fitzgibbon, G. M. et al. ,1996, J.Am.Coll.Cardiol., 28:616-626). 0 rompimento endotelial devidoao manuseio físico dos SVGs durante a coleta e/ou devido a fatoresassociados à IRI, contribui bastante para a ativação da cascata decoagulação (Motwani, J. G. et al., 1998, 97:916-931). Novamente, aisquemia inicia a lesão pela privação de energia e acúmulo deprodutos residuais metabólicos, e reperfusão, aumenta a lesão aodesencadear reações inflamatórias que envolvem radicais livres deoxigênio, (Halliwell, B. et al., 1992, FEBS Lett., 307:108-112;Kalayoglu, M. et al., 1988a, Lancet, 331:617-619; Lominadze, D. etal., 1997, J.Nutr. ,127:1320-1327; Weisman, H. F. et al. , 1990a,Science, 249:146-151; Wink, D. A. et al. , 1994, Environ.HealthPerspect., 102 Suppl 3:11-15), ativação complementar (Hill, J. H. etal., 1971a, 133:885-900) e aderência de leucócitos (Krishnaswamy, G.et al., 2001, Front Biosci., 6-.D1109-D1127; Kvietys, P. R. et al.,2001, News Physiol Sci., 16:15-1919). Além disso, a CABG propriamentedita parece interferir nos fatores locais que influenciam ahemostasia, e, durante a revascularização cardiopulmonar (CPB) , ofibrinogênio plasmático é elevado, favorecendo uma respostaprotrombótica (Moor, E. et al., 1994, Thromb.Haemost., 72:335-342). ACPB dispara uma cascata de mediadores inflamatórios que contribuemainda mais para o rompimento endotelial (Gu, Y. J. et al. , 1998,Ann.Thorac.Surg., 65:420-424).
Estratégias intra-operatórias para evitar atrombose do SVG incluem a "técnica sem toque" de manuseio de tecidosdurante a coleta, (Tsui, J. C. et al. , 2001, Br. J.Surg., 88:1209-1215) e evitam a distensão do SVG ao garantir que as pressões deinfusão nunca excedam 100 mmHg (Adcock, O. T., Jr. et al. , 1984,Surgery, 96:886-894). A preservação do SVG após a coleta utilizandosoluções de preservação também pode ser utilizada, embora a eficáciaseja controversa. No entanto, as soluções de preservação de órgãosforam utilizadas experimentalmente com algum sucesso (Anastasiou, N.et al., 1997, J.Vasc.Surg., 25:713-721). Relatou-se que a Solução daUniversidade de Wisconsin (UW) protege a função de células lisas,(Cavallari, N. et al., 1997, Surgeryl 121:64-71) e a viabilidade dascélulas endoteliais dos SVGs (Barner, Η. B. et al., 1990,J.Thorac.Cardiovasc.Surg., 100:148-149). Tem sido observado que a UWprotege principalmente os tecidos contra a isquemia, porém tem poucoou nenhum efeito contra a lesão por reperfusão (Gao, W. et al., 1992,Transpl.Int., 5 Suppl 1:S329-S335) . 0 uso de hipotermia (4°C) parapreservar os SVGs tem demonstrado ser prejudicial ao endotélio,particularmente, com soluções fisiológicas. Os enxertos preservados a2O0C parecem ter significativamente menos lesões (Solberg, S. et al.,1987, J.Cardiovasc.Surg. , 28:571-575). Há um certo consenso que osSVGs devem ser armazenados em temperatura ambiente caso sejamtransplantados em 2 horas, uma vez que o endotélio se torna frágil embaixas temperaturas, (Solberg, S. et al. , 1987, 28:571-575) e orelaxamento dependente do endotélio pode serprejudicado.(Ingemansson, R. et al., 1996, Ann.Thorac.Surg., 61:1413-14171417)
Nos aloenxertos sólidos de órgão, a IRI temimplicado um fator de risco para o desenvolvimento da função gráficaretardada (DGF). A DGF afeta cerca de 20% dos transplantes renais(Pirsch, J. D., 2002, Medscape Transplantation, 3:), aumentando aquantidade de intervenções pós-transplante e aumentando o tempo dehospitalização. Além disso, relatou-se que a isquemia prolongadacontribui para a rejeição crônica de aloenxertos em um estudo desobrevida crônica em um modelo de rato (Yilmaz, S. et al. , 1992b,53:823-827). Nos transplantes de pulmão, as técnicas de preservaçãoreduziram a disfunção precoce do enxerto; no entanto, a IRI graveainda ocorre em mais que 10% dos transplantes de pulmão (Yilmaz, S.et al., 1992a, 53:823-827). Também tem sido sugerido que a IRI é umfator independente do aloantígeno que influencia a ocorrência derejeição crônica do aloenxerto (Tullius, S. G. et al., 1995, 59:313-318). Também, a duração da isquemia e o insucesso agudo do enxertosão duas das graves variáveis associadas à mortalidade precoce(Bonet, L. A., 2003, 35:1946-1950) e à rejeição crônica (Baldwin, W.M., III et al., 1999, 68:894-900) em paciente submetidos atransplante cardíaco. Desde a introdução da Solução da Universidadede Wisconsin (UW) em 1987, nenhuma outra solução utilizadaclinicamente proporcionou proteção similar ou melhor contra a lesãoisquêmica e, embora tenha se tornado o padrão de ouro para apreservação de órgãos intra-abdominais (Belzer, F. O. et al., 1992,Ann.Surg., 215:579-583) e também demonstrado proteger o coração,(Swanson, D. K. et al. , 1988, 7:456-467), a UW protege somente ostecidos contra a isquemia e tem pouco ou nenhum efeito contra a lesãopor reperfusão (Gao, W. et al. , 1992, Transpl.Jnt., 5 Suppl 1:S329-S335), conforme anteriormente observado.
Os órgãos e tecidos transplantados com aloenxertotambém são vulneráveis à rejeição pelo sistema imune. Em aloenxertosde órgão/tecido, há três fases distintas, porém que se sobrepõem noprocesso de rejeição do transplante: hiperaguda, aguda e crônica.
Embora a aloresposta direta pareça diminuir com o tempo, aaloresposta indireta, abastecida por um contínuo fornecimento deantígeno doador aos leucócitos passageiros no órgão, parece serindefinida.
A rejeição hiperaguda é quase imediata (ou seja,durante as primeiras 48 horas) e é mediada por anticorpos pré-formados no receptor contra moléculas MHC-I no endotélio do enxertoe/ou nos antígenos do grupo sangüíneo (A, B, Rh). Esse tipo derejeição é especialmente relevante no xenotransplante. As rejeiçõesaguda e crônica começam tipicamente por volta do terceiro dia após otransplante e podem durar anos. Supostamente, depois que um órgão étransplantado, as células de apresentação de antígeno (APCs) doadorasmigram de fora do órgão para os linfonodos do receptor, que por fimprovocam uma resposta imune direta contra os antígenos doadores emcélulas T receptoras auxiliares e citotóxicas. Supõe-se que essaresposta, que domina a rejeição aguda, recruta várias células Tauxiliares de reação cruzada que são submetidas a prime contradiversos antígenos ambientais no contexto de auto-MHC (Lombardi etal.,1990, Int. Immunol. 2: 9-13; Merkenschlager et al., 1991, Eur. JImmunol., 21:79-88).
Uma aloresposta indireta é mediada por APCsreceptoras que escolhem antígenos doadores das APCs doadores corantesnos linfonodos de drenagem, porém também diretamente do órgão (assimchamados leucócitos passageiros) e apresenta aquelas principalmentepara as células T receptoras auxiliares. Acredita-se que essaaloresposta indireta seja responsável pela rejeição crônica (Benichouet al., 1999, J Immunol., 162:352-358), embora recentes achadospareçam indicar que essa resposta também pode contribuir para arejeição aguda (Benham et al. , 1995, Transplante, 59:1028-1032; eBraun et al. , 2001, J Immunol., 166:4879-4883).
Assim, há uma necessidade contínua de agentes quepossam proteger tecidos e órgãos contra a IRI e rejeição do sistemaimune por períodos durante e após a isquemia acidental ou induzida, edurante e após o transplante autólogo, aloenxerto e xenoenxerto.
SUMÁRIO
Esse sumário apresenta diversas configurações damatéria ora revelada e, em muitos casos, apresenta variações e trocasdessas configurações. Este resumo é meramente um exemplo das diversase variadas configurações. A menção de uma ou mais característicasrepresentativas de uma determinada configuração também é um exemplo.
Essa configuração pode geralmente existir com ou sem a(s)característica(s) mencionada(s); da mesma forma, essascaracterísticas podem ser aplicadas a outras configurações da matériaora revelada, estando listada ou não neste Resumo. Para evitar arepetição excessiva, este Sumário não lista nem sugere todas aspossíveis combinações dessas características.
Em algumas configurações da matéria ora revelada,uma vesícula lipídica é provida compreendendo um lipídiofuncionalizado compreendendo uma parcela de formação de ponte tendoafinidade de ligação por uma parte de ligante de um agente ativo. Emalgumas configurações, o lipídio funcionalizado compreende umfosfolipídeo, por exemplo, fosfoetanolamina, ou ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil}. Emalgumas configurações, a parcela de formação de ponte é selecionada apartir do grupo consistindo em biotina, níquel, tiol, maleimida,amina e ácido carboxílico. Em algumas configurações, a parte deligante do agente ativo é selecionada a partir do grupo consistindoem avidina, estreptavidina, uma poli-histidina, um grupo cisteínatiol, um grupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico. Em algumas configurações, o agente ativo é umpolipeptídeo, um aptâmero ou uma molécula pequena. Ainda, em algumasconfigurações, o agente ativo é uma molécula terapêutica selecionadaa partir do grupo consistindo em uma molécula de indução de apoptosede células T, um inibidor complementar, uma molécula de bloqueiocoestimulatório de células T, um inibidor de infiltração deleucócitos, um inibidor de hiperplasia neointimal, um anticoagulantee um trombolítico. Além disso, em algumas configurações, a moléculaterapêutica é selecionada a partir do grupo consistindo em FasL,receptor-1 de fator de necrose tumoral (TNF), receptor DR4 de ligantede indução de apoptose relacionada a TNF (TRAIL), receptor DR5 deTRAIL, proteína de controle complementar de vírus para vacina (VCP),receptor complementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento(DAF), compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares(SPICE), proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4),anti-CD40L, hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena,inibidores de trombina de molécula pequena, inibidor 9.3tC deaptâmero de fator IXa, uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual(tPA), metaloproteinases de matriz (MMP), receptores dummy deneuropeptídeo Y (NPY) e glicoproteínas ou proteoglicanos naturais ousintéticos. Em algumas configurações, a vesícula lipídica éliofilizada. Em algumas configurações, a vesícula lipídica é umavesícula lipídica fusogênica tendo uma velocidade de fusão de pelomenos aproximadamente 2 0 fusões de vesícula/segundo/mm2 de membranacelular.
Ainda, em algumas configurações, a vesículalipídica compreende um fosfolipídeo que é um formador de vesículaestável; e pelo menos um membro de formação de vesícula instável,onde o membro de formação de vesícula instável é selecionado a partirdo grupo consistindo em um lipídio polar não formador de vesículaestável, um PEG, um formador de domínio tipo "raft" e uma proteína defusão. Em algumas configurações, a vesícula lipídica tem uma razãoentre o formador de vesícula estável e o lipídio funcionalizado deaproximadamente 1:1 a aproximadamente 500:1. Em algumasconfigurações, o fosfolipídeo, que é um formador de vesícula estávelou o lipídio polar não formador de vesícula estável, tem a estruturada fórmula (I):
X-L-(Z)2 (I),
onde X é H, A, ou tem a estrutura da fórmula (II)
<formula>formula see original document page 13</formula>
B é um cátion ou um grupo alquila;A é H ou um grupo alquila;
L é um grupo alquila onde dois átomos de hidrogênioestão ausentes; e
cada Z é, independentemente, Η, E, ou a estruturada fórmula (XI),
<formula>formula see original document page 13</formula>
onde E é uma alquila ou alquenila, e quando um Zfor Η, o outro Z não é H.
A vesícula lipídica da reivindicação 13, onde A éH, ou tem uma estrutura selecionada a partir do grupo consistindo nasfórmulas (III), (IV), (V) , (VI) e (VII):<formula>formula see original document page 14</formula>
onde η é um número inteiro de 0 a 4;L tem uma estrutura selecionada a partir do grupoconsistindo nas fórmulas (VIII), (IX) ou (X)
<formula>formula see original document page 14</formula>
; e
E tem uma estrutura selecionada a partir do grupoconsistindo em (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) e (XVII)<formula>formula see original document page 15</formula>
Em algumas configurações, o fosfolipídeo, que é umformador de vesícula estável, ê uma fosfatidilcolina e, em algumasconfigurações, a fosfatidilcolina é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), l-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PDPC), fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina deovo, ou uma mistura destes. Em algumas configurações, o membro deformação de vesícula instável é um lipídio polar de formação devesícula instável selecionado a partir do grupo consistindo em 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato (POPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOPC-e), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-l-serina](DOPS), uma esfingomielina, 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP).
Em algumas configurações da matéria ora revelada, éprovido um kit para revestimento de células endoteliais. Em algumasconfigurações, o kit compreende uma vesícula lipídica compreendendoum lipídio funcionalizado compreendendo uma parcela de formação deponte tendo afinidade de ligação por uma parte de ligante de umagente ativo e o agente ativo compreendendo a parte de ligante. Emalgumas configurações, o kit compreende instruções para orevestimento das células endoteliais. Em algumas configurações, avesícula lipídica está contida em um primeiro recipiente e a moléculaterapêutica está contida em um segundo recipiente.
Em algumas configurações da matéria ora revelada, éprovido um método de revestimento da membrana celular com um agenteativo. Em algumas configurações, o método compreende o contato de umacélula com uma vesícula lipídica compreendendo um lipídiofuncionalizado compreendendo uma parcela de formação de ponte tendoafinidade de ligação por uma parte de ligante de um agente ativo,onde a parcela de formação de ponte é selecionada a partir do grupoconsistindo em níquel, maleimida, tiol, amina e ácido carboxílico; econtato da célula com o agente ativo compreendendo a parte deligante, onde a parte de ligante liga a parcela de formação de ponte.
Em algumas configurações, a célula é uma célula endotelial. Emalgumas configurações, a célula endotelial é uma célula endotelial deum tecido ou órgão. Em algumas configurações, o tecido ou órgão éperfundido com uma primeira composição compreendendo uma vesículalipídica e uma segunda composição compreendendo o agente ativo. Emalgumas configurações, a parcela de formação de ponte é ligada deforma não covalente a uma parte de ligante do agente ativo. Emalgumas configurações, a membrana celular é revestida com diversosagentes ativos diferentes.
Em algumas configurações da matéria ora revelada, éprovido um método de inibição da rejeição de um tecido ou órgãotransplantado em um indivíduo. Em algumas configurações, o métodocompreende o contato do tecido ou órgão com uma primeira composiçãocompreendendo uma vesícula lipídica, onde a vesícula lipídicacompreende um lipídio funcionalizado que compreende uma parcela deformação de ponte tendo afinidade de ligação por uma parte de ligantede uma molécula terapêutica, onde a parcela de formação de ponte éselecionada a partir do grupo consistindo em níquel, maleimida, tiol,amina e ácido carboxílico; e contato do tecido ou órgão com umasegunda composição compreendendo a molécula terapêutica quecompreende a parte de ligante, onde a parte de ligante liga a parcelade formação de ponte. Em algumas configurações, o tecido ou órgãoentra em contato com a primeira e segunda composições antes dotransplante no indivíduo. Em algumas configurações, a parcela deformação de ponte é ligada de forma não covalente a uma parte deligante da molécula terapêutica.
Em algumas configurações da matéria ora revelada, éprovido um método de inibição de lesão de isquemia-reperfusão em umtecido ou órgão. Em algumas configurações, o método compreende ocontato do tecido ou órgão com uma primeira composição compreendendouma vesícula lipídica, onde a vesícula lipídica compreende um lipídiofuncionalizado que compreende uma parcela de formação de ponte tendoafinidade de ligação por uma parte de ligante de uma moléculaterapêutica selecionada a partir do grupo consistindo em inibidorescomplementares, anticoagulantes e trombolíticos; e contato do tecidoou órgão com uma segunda composição compreendendo uma moléculaterapêutica que compreende a parte de ligante, onde a parte deligante liga a parcela de formação de ponte. Em algumasconfigurações, a parcela de formação de ponte é ligada de forma nãocovalente a uma parte de ligante da molécula terapêutica.
Dessa forma, é um objetivo da matéria ora reveladaprover métodos de revestimento de superfície celular com moléculasterapêuticas e composições relacionadas. Esse objetivo é atingidototal ou parcialmente pela matéria ora revelada.
Depois de ter mencionado um objetivo da matéria orarevelada, outros objetivos e vantagens ficarão evidentes aos técnicosno assunto após um estudo da seguinte descrição da matéria orarevelada e dos exemplos não limitativos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os detalhes de uma ou mais configurações da matériaora revelada são definidos na descrição abaixo. Outrascaracterísticas, objetivos e vantagens da matéria ora reveladaficarão evidentes a partir da descrição detalhada e dasreivindicações. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes eoutras referências aqui mencionadas são incorporadas por referênciana íntegra. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindoas definições, prevalecerá.
Células, tecidos e órgãos podem sofrer lesão devidoà IRI durante e após períodos de isquemia e reperfusão e/ou rejeiçãopelo sistema imune após transplante autólogo, aloenxerto ouxenoenxerto. A matéria ora revelada provê materiais e métodos deinibição ou tratamento de lesões em células, tecidos e órgãosdecorrentes de IRI e/ou transplante. A matéria ora revelada provêcomposições e métodos para introduzir moléculas terapêuticas exógenasem membranas celulares endógenas por interações exploratórias, quepode ser forte e/ou não covalente, entre as parcelas de formação deponte e ligantes com os quais as pontes têm afinidade de ligação. Osmétodos e materiais da matéria ora revelada evitam problemas quepodem ocorrer ao se tentar incorporar moléculas exógenas diretamenteem membranas lipídicas.
Em algumas configurações, a matéria ora reveladaprovê vesículas lipídicas compreendendo lipídios modificados com aparcela de formação de ponte que tem afinidade de ligação por umligante específico (ou seja, "lipídios funcionalizados"). A matériaora revelada provê ainda moléculas terapêuticas tendo uma parte deligante à qual a parcela de formação de ponte tem afinidade deligação. A vesícula lipídica, quando entra em contato com uma célula,se fundirá com a membrana da célula, e dessa forma os lipídiosfuncionalizados, incluindo a parcela de formação de ponte, seincorporarão à membrana celular (na superfície interna e/ou externada membrana celular). A célula tratada pode então entrar em contatocom a molécula terapêutica, que irá se ligar especificamente àparcela de formação de ponte da superfície externa da membranacelular por uma parte de ligante da molécula terapêutica, resultandono revestimento da superfície exterior da célula com a moléculaterapêutica. A célula pode ser uma célula endotelial de um tecido ouórgão e a molécula terapêutica pode ser selecionada para prover àcélula (e ao tecido circunvizinho) proteção ou tratamento de lesões àcélula e ao tecido circunvizinho decorrente da isquemia e reperfusãoe/ou transplante.
Dessa forma, a matéria ora revelada provê vesículaslipídicas compreendendo lipídios funcionalizados, moléculasterapêuticas compreendendo ligantes com especificidade de ligaçãopelas parcelas de formação de ponte de lipídios funcionalizados,métodos de revestimento de células com as moléculas terapêuticas ecélulas assim revestidas, e métodos de inibição da rejeição de umacélula, tecido ou órgão transplantado e/ou métodos de inibição deIRI.
I. Definições
Embora se acredite que os termos a seguir sejamamplamente conhecidos pelos técnicos no assunto, as seguintesdefinições têm como objetivo facilitar a explicação da matéria orarevelada.
A menos que de outra forma definido, todos ostermos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significadocomumente conhecido pelos técnicos na área à qual pertence a matériaora revelada. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiaissimilares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam serutilizados na prática ou no teste da matéria ora revelada, métodos,dispositivos e materiais representativos serão agora descritos.
Seguindo uma convenção sobre leis de patenteexistente há anos, os termos "um(a)" e "o(s)/a(s)" se referem a"um(a) ou mais" quando utilizados neste pedido, inclusive nasreivindicações. Assim, por exemplo, a referência a "uma célula" (porexemplo, "uma célula endotelial") inclui diversas células desse tipo(ou seja, diversas células endoteliais) e assim por diante.
A menos que de outra forma indicado, todos osnúmeros que expressam quantidades de componentes, condições dereação, e assim por diante, utilizados na especificação e nasreivindicações, devem ser entendidos como modificados em todos oscasos pelo termo "aproximadamente". Dessa forma, a menos que indicadoao contrário, os parâmetros numéricos definidos nesta especificação enas reivindicações anexadas são aproximações que podem variardependendo das propriedades desejadas que se procura obter pelamatéria ora revelada.
Conforme aqui utilizado, o termo "aproximadamente,"ao se referir a um valor ou uma quantidade de massa, peso, tempo,volume, concentração ou percentual, deve abranger, em algumasconfigurações, variações de ±20%, em algumas configurações ±10%, emalgumas configurações ±5%, em algumas configurações ±1%, em algumasconfigurações ±0,5% e, em algumas configurações, ±0,1% do valorespecificado, uma vez que essas variações são adequadas para arealização dos métodos revelados.
Conforme aqui utilizada, "Alquila" (ou alquila- oualq-) refere-se a uma cadeia de hidrocarbonetos substituída ou nãosubstituída, linear, ramificada ou cíclica, preferencialmentecontendo de 1 a 20 átomos de carbono. Exemplos adequados de gruposalquila não substituídos incluem metila, etila, propila, isopropila,ciclopropila, butila, iso-butila, terc-butila, sec-butila,ciclobutila, pentila, ciclopentila, hexila, ciclohexila, e similares.
Um ou mais átomos de oxigênio, enxofre ou nitrogênio substituído ounão substituído podem ser opcionalmente inseridos ao longo da cadeiade alquila. Os grupos "alquilarila" e "alquilheterocíclico" sãogrupos alquila covalentemente ligados a um arila ou grupoheterocíclico, respectivamente.
"Alquenila" refere-se a uma cadeia dehidrocarbonetos substituída ou não substituída, linear, ramificada oucíclica, insaturada que contém pelo menos uma ligação dupla, epreferencialmente 2 a 22 átomos de carbono. Exemplos de gruposalquenila não substituídos incluem etenila (ou vinila), 1-propenila,2-propenila (ou alila) 1,3-butadienila, hexenila, pentenila, 1,3,5-hexatrienila, e similares. Os grupos cicloalquenila preferidos contêmde cinco a oito átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla.Exemplos de grupos cicloalquenila incluem ciclohexadienila,ciclohexenila, ciclopentenila, cicloheptenila, ciclooctenila,ciclohexadienila, cicloheptadienila, ciclooctatrienila e similares.
"Alcóxi" refere-se a um grupo -0-alquilasubstituído ou não substituído. Exemplos de grupos alcóxi incluemmetoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi e similares.
"Arila" refere-se a qualquer grupo carbocíclico ouheteroaromático monovalente aromático, preferencialmente contendo de3 a 10 átomos de carbono. 0 grupo arila pode ser bicíclico (ou seja,fenila (ou Ph) ) ou policíclico (ou seja, naftila) e pode ser nãosubstituído ou substituído. Os grupos arila preferidos incluemfenila, naftila, furila, tienila, piridila, indolila, quinolinila ouisoquinolinila.
"Amino" refere-se a um grupo -NRR1 não substituídoou substituído. A amina pode ser primária (-NH2) , secundária (-NHR)ou terciária (-NRR'), dependendo do número de substituintes (R ouR'). Exemplos de grupos amino substituídos incluem metilamino,dimetilamino, etilamino, dietilamino, 2-propilamino, 1-propilamino,di(n-propil)amino, di(iso-propil)amino, metil-n-propilamino, t-butilamino, anilino, e similares.
"Radical heterocíclico" refere-se a um anelestável, saturado, parcialmente insaturado ou aromático,preferencialmente contendo de 5 a 10 átomos, mais preferencialmente 5ou 6 átomos. 0 anel pode ser substituído uma ou mais vezes(preferencialmente 1, 2, 3, 4 ou 5 vezes) por um substituinte. 0 anelpode ser mono-, bi- ou policíclico. 0 grupo heterocíclico consiste emátomos de carbono e de 1 a 3 heteroátomos independentementeselecionados a partir do grupo consistindo em nitrogênio, oxigênio eenxofre. Os heteroátomos podem ser protegidos ou não protegidos.
Exemplos de grupos heterocíclicos úteis incluem acridina,benzatiazolina, benzimidazol, benzofurano, benzotiofeno, benztiazol,benzotiofenil, carbazol, cinolina, furano, imidazol, lH-indazol,indol, isoindol, isoquinolina, isotiazol, morfolina, oxazol (porexemplo, 1,2,3-oxadiazol), fenazina, fenotiazina, fenoxazina,ftalazina, piperazina, pteridina, purina, pirazina, pirazol,piridazina, piridina, pirimidina, pirol, quinazolina, quinolina,quinoxalina, tiazol, 1,3,4-tiadiazol, tiofeno, 1,3,5-triazinas,triazol (por exemplo, 1,2,3-triazol) substituídos ou nãosubstituídos, protegidos ou não protegidos, e similares.
"Substituído(a)" significa que a parcela contémpelo menos um, preferencialmente 1 a 3 substituinte(s). Ossubstituintes adequados incluem hidrogênio (H) e hidroxila (-0H),amino (-NH2), oxi (-0-), carbonila (-C0-), tiol, alquila, alquenila,alquinila, alcóxi, halo, nitrila, nitro, arila e gruposheterocíclicos. Esses substituintes podem ser opcionalmentesubstituídos por 1 a 3 substituintes. Exemplos de substituintessubstituídos incluem carboxamida, alquilmercapto, alquilsulfonil,alquilamino, nitrogênio quaternário, dialquilamino, carboxilato,alcoxicarbonila, alquilarila, aralquila, alquilheterocíclico, esimilares.
0 termo "afinidade de ligação" refere-se a umaafinidade entre duas moléculas, por exemplo, uma parcela de formaçãode ponte e um ligante. Assim, conforme aqui utilizado, o termo"afinidade de ligação" refere-se a uma ligação preferencial de umamolécula com outra em uma mistura de moléculas. Em algumasconfigurações, a ligação de um ligante a uma parcela de formação deponte pode ser considerada específica caso a afinidade de ligaçãoseja de aproximadamente 1 χ IO4 M"1 a aproximadamente 1 χ IO6 M"1 oumaior. As frases "liga-se especificamente (ou seletivamente)" e"liga-se com especificidade", quando se refere à capacidade deligação de um ligante ou uma parcela de formação de ponte, se referema uma reação de ligação que é determinante da presença do respectivoalvo em uma população heterogênea de proteínas e outros materiaisbiológicos.
O termo "inibidor" refere-se a uma substânciaquímica ou biológica que inibe, ou seja, inativa ou reduz, aatividade biológica de uma molécula, polipeptídeo (por exemplo, acomponente complementar), ou célula (por exemplo, uma célula T).
Um "lipídio funcionalizado" é um lipídio que, alémda sua estrutura nativa, contém uma modificação ou adição molecular.A adição pode ser acrescentada covalentemente ou não covaIentemente(por exemplo, por quelação). Essas modificações incluem a adição demoléculas pequenas (por exemplo, biotina ou FITC), polissacarídeos,heparina e elementos (por exemplo, níquel).
O termo "ácido nucléico" refere-se adesoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes naforma de fita única ou dupla fita. A menos que especificamentelimitado, o termo abrange ácidos nucléicos contendo análogosconhecidos de nucleotídeos naturais que possuem propriedadessimilares de ligação como o ácido nucléico de referência e sãometabolizados de maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrêncianatural. A menos que de outra forma indicado, uma seqüência de ácidonucléico particular também abrange implicitamente variantesconservativamente modificadas desta (por exemplo, substituições decódon degenerativas) e seqüências complementares e também a seqüênciaexplicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códondegenerativas podem ser realizadas gerando-se seqüências nas quais aterceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) ésubstituída por resíduos de base mista e/ou de desoxiinosina (Batzeret al. (1991) Nucleic Acid Res 19:5081; Ohtsuka et ai. (1985) J BiolChem 260:2605-2608; Rossolini et al. (1994) Mol Cell Probes 8:91-98).Os termos "ácido nucléico" ou "seqüência de ácido nucléico" tambémpodem ser utilizados de forma intercambiável com o gene, quadro deleitura aberto (ORF), cDNA e mRNA codificados por um gene.
Os termos "polipeptídeo", "proteína" e "peptídeo",que são aqui utilizados de forma intercambiável, referem-se a umpolímero dos 20 aminoácidos protéicos, ou análogos de aminoácido,independente de seu tamanho ou função. Embora o termo "proteína" sejageralmente utilizado em referência a polipeptídeos relativamentegrandes, e o termo "peptídeo" é geralmente utilizado em referência apolipeptídeos pequenos, o uso desses termos na técnica se sobrepõe evaria. 0 termo "polipeptídeo", conforme aqui utilizado, refere-se apeptídeos, polipeptídeos e proteínas, a menos que de outra formaindicado. Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são aquiutilizados de forma intercambiável quando se referem a um produto degene. Assim, exemplos de polipeptídeos incluem produtos de gene,proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, paralogos,fragmentos e outros equivalentes, variantes e análogos destes.
Os termos "transformado(a)", "transgênico(a)" e"recombinante" referem-se a uma célula de um organismo hospedeiro,por exemplo, um mamífero, na qual uma molécula de ácido nucléicoheterólogo foi introduzida. A molécula de ácido nucléico pode serestavelmente integrada no genoma da célula ou a molécula de ácidonucléico também pode estar presente como uma moléculaextracromossômica. Essa molécula extracromossômica pode ser auto-replicante. Entende-se que as células transformadas, tecidos ouindivíduos abrangem não somente o produto final de um processo detransformação, mas também sua progênie transgênica. Um hospedeiro"não transformado," "não transgênico" ou "não recombinante" refere-sea um organismo do tipo selvagem, por exemplo, um mamífero ou umaceúla deste, que não contém a molécula heteróloga de ácido nucléico.
Um "transplante" é qualquer célula, tecido,apêndice ou órgão que seja transferido de um doador para um receptor.No caso dos transplantes autólogos, o doador e o receptor são o mesmoindivíduo. Exemplos de transplantes incluem esperma, óvulos,plaquetas, sangue, pele, músculo, tecido adiposo, tecido nervoso,vasos sangüíneos, linfa, ossos, ligamento, olhos, língua, pulmão,traquéia, coração, baço, estômago, intestino, rim, fígado, dedos dasmãos, mão, dedos dos pés, pé, braço e perna.
II. Vesículas lipídicas
Em algumas configurações da matéria ora revelada,são providas vesículas lipídicas que podem ser utilizadas paradistribuição das parcelas de formação de ponte que ligam agentesativos (ou seja, moléculas terapêuticas) de interesse às membranascelulares de células alvo e, em algumas configurações, à superfícieexterna da membrana celular de células alvo. As parcelas de formaçãode ponte, uma vez incorporadas nas membranas celulares alvo, permitema distribuição alvo e o "revestimento" de células com agentes ativoscom os quais as parcelas de formação de ponte têm afinidade deligação. Além disso, a densidade do revestimento em uma célula podeser controlada alterando-se a concentração de parcelas de formação deponte na formulação da vesícula, alterando-se o número de vesícuiasem uma solução e/ou alterando-se a densidade de vesícuias em umasolução.
As vesículas lipídicas (ou seja, lipossomas) podemser utilizadas para distribuir moléculas, incluindo, por exemplo,drogas tais como antibióticos e agentes contra o câncer. As vesículaspodem ser preenchidas com diversos agentes que podem ser entãodistribuídos às células alvo. Esse método de distribuição pode servantajoso, pois seqüestra a molécula dentro de uma vesícula até adistribuição a uma célula, protegendo assim as células não-alvocontra a exposição às moléculas encapsuladas se tóxicas (comodeterminados agentes contra o câncer). Além disso, as vesículaslipídicas são geralmente não tóxicas devido à sua semelhança com asmembranas celulares. Também podem proteger sua carga contra adiluição ou degradação no sangue.
As vesículas podem ser compostas por fosfolipídios(moléculas anfipáticas) que formam esferas fechadas preenchidas comfluido quando misturadas em soluções aquosas. Como a vesículalipídica forma, as moléculas solúveis em água na solução sãoencapsuladas no espaço aquoso no interior da esfera, ao passo que asmoléculas solúveis em lipídio na solução são incorporadas na bicamadalipídica. Assim, além de incorporar as moléculas no interior de umavesícula lipídica, as moléculas de interesse também podem serincorporadas na membrana lipídica da vesícula, resultando nadistribuição das moléculas solúveis em lipídio e anfipáticas âmembrana celular de uma célula alvo.
As interações entre vesículas lipídicas e membranascelulares podem assumir diversas formas. As vesículas lipídicas podemadsorver quase qualquer tipo de célula. Uma vez adsorvidas, asesferas podem ser submetidas a endocitose por algumas células. Asvesículas lipídicas adsorvidas também podem trocar lipídios com asmembranas celulares e podem, em determinados casos, se fundir com ascélulas. A composição em particular de uma vesícula pode determinarse uma vesícula pode ou não se fundir com as membranas celulares. 0termo "vesícula lipídica", conforme aqui utilizado, inclui vesículaslipídicas que se fundem com membranas celulares (ou seja, "vesículasfusogênicas")· Quando ocorre a fusão, uma membrana da vesícula éintegrada na membrana celular e o conteúdo aquoso da vesículalipídica se mistura com o fluido no citosol. Uma vez que vesículaslipídicas individuais podem carregar milhares de moléculasterapêuticas, essa técnica pode ser desejável para distribuir deoutra forma substâncias impermeáveis às células.
A vesícula lipídica pode ser formada em diversascamadas e tamanhos. Vesículas multilamelares podem ser construídas epossuem múltiplas camadas de lipídio e água, ao passo que asvesículas unilamelares possuem uma única bicamada fosfolipídica. Paramodificar geneticamente pequenas vesículas fusogênicas queefetivamente distribuem seu componente de membrana lipídica, asvesículas não devem fundir entre si, porém ainda devem ser capazes dese fundir com a membrana de células alvo. Para intensificar a fusãoda vesícula com as membranas celulares, a carga do grupofosfolipídico "cabeça" pode ser manipulada para criar regiõesdiferentes na camada lipídica. Além disso, o raio de curvatura davesícula pode ser ajustado para prover diferentes níveis de energiacinética armazenada. As vesículas multilamelares geralmente não sãoprontamente fusogênicas, em partes porque a energia armazenada doraio de curvatura da vesícula é mínima. No entanto, pequenasvesículas unilamelares (SUVs), que possuem um raio de curvatura muitorestrito, são muito fusogênicas. Sem se prender à teoria, foirelatado que alterações na composição lipídica pode alterardrasticamente as taxas de fusão de vesícula-membrana celular, e foideterminado que, restringindo-se o raio de curvatura da vesícula, avelocidade de fusão pode aumentar ainda mais.
Métodos para produzir vesículas fusogênicasunilamelares (FUVs) são conhecidos na técnica. As FUVs podem serproduzidas utilizando-se vários métodos, incluindo a sonificação,homogeneização ou pelo método de congelamento-descongelamento. Vide,por exemplo, as Publicações de Patente Norte-Americana N222004/0213766 e 2003/0235611; a Patente Norte-Americana N5 6,417,326,Szoka et al. , Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); PatentesNorte-Americanas N— 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975,4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,946,787; Publicação PCTN2 WO 91/17424; Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sei. USA75: 4194 4198 (1978); Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629 634 (1976); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 33483352 (1979); Hope et al. , Biochim. Biophys. Acta 812: 55 65 (1985);Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161 168 (1986); Williams etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 242 246 (1988), Liposomes, ch. 1(Ostro, ed., 1983); e Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986),cada uma delas aqui incorporadas na íntegra por referência.A matéria ora revelada provê vesículas lipídicascompreendendo lipídios modificados tendo uma parcela de formação deponte anexada a elas. 0 lipxdio modificado compreendendo a parcela deformação de ponte, também aqui denominada "lipídio funcionalizado",pode ser incorporado como um lipídio componente de uma vesículalipídica. A parcela de formação de ponte tem afinidade de ligação porum ligante específico. O ligante pode ser uma parte natural de, ouincorporado em (ou seja, um polipeptídeo de fusão ou quimérico) umagente ativo (por exemplo, uma molécula terapêutica). Dessa forma, olipídio funcionalizado pode atuar para ligar com afinidade o agenteativo por meio da parcela de formação de ponte no lipídiofuncionalizado e a parte de ligante do agente ativo.Conseqüentemente, um agente ativo pode ser destinado a uma superfíciede membrana celular primeiramente pelo contato da vesícula lipídicacompreendendo o lipídio modificado com a célula para permitir que avesícula se funda com a membrana celular e incorpore o lipídiofuncionalizado (e parcela de formação de ponte) na membrana celular,e então pelo contato da célula com o agente ativo. A moléculaterapêutica liga-se com afinidade à parcela de formação de ponteincorporada na membrana celular, revestindo a superfície da célulaalvo com a molécula terapêutica. 0 agente ativo pode então funcionarconforme desejado na(s) célula(s) revestida(s) e/ou em células,tecidos e órgãos nas adjacências da(s) célula(s) revestida(s).
Utilizando vesículas lipídicas para incorporarlipídios funcionalizados dentro da membrana de células alvo, umagente ativo, incluindo um ligante, especificamente liga a parcela deformação de ponte e permanece ligado à superfície da célula porperíodos significativamente maiores do que quando ligantes nãoespecificamente ligados (não incorporados em lipídiosfuncionalizados) são utilizados para ligar moléculas à superfície deuma célula. Além disso, uma vez que os lipídios funcionalizados nãoestão ligados ao citoesqueleto, eles têm muito mais liberdade lateralno folheto externo das membranas celulares. Isso permite a"flutuação" de lipídios funcionalizados para facilmente seaproximarem uns dos outros e os agentes ativos estão livres para semovimentar conforme necessário para funcionar adequadamente. Porexemplo, a trimerização necessária para a funcionalização de FasL éconsideravelmente facilitada utilizando as vesículas lipídicas damatéria ora revelada para incorporar parcelas de formação de pontenas membranas celulares alvo.
A parcela de formação de ponte é selecionada combase em sua compatibilidade com o lipídio funcionalizado, bem como aconsideração com o ligante com o qual a parcela de formação de pontetem afinidade de ligação. Por exemplo, e sem intenção de limitar oescopo da presente matéria, em algumas configurações a parcela deformação de ponte pode ser biotina, níquel (utilizando, por exemplo,o grupo quelante de níquel Ν",N"-bis[carboximetil]-L-Iisina (ácidonitriloacético) (NTA) , ou um grupo funcional no lipídio, por exemplo,tiol, maleimida, amina ou ácido carboxílico, incluindo, por exemplo,N-[3-(2-piridilditio)propionato], N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] ,N-hexanoilamina, N-(dodecanilamina), N-(glutaril), N-(succinil) e N-(dodecanoil).
A parte de ligante do agente ativo pode ser umaparte natural do agente ativo, ou seja, é encontrado como umcomponente do agente ativo de funcionamento sem manipulaçãoadicional, ou o ligante pode ser incorporado no agente ativo. Porexemplo, se o agente ativo for um polipeptídeo terapêutico,determinados ligantes podem ser incorporados no polipeptídeoterapêutico por meio de técnicas genéticas recombinantes, como égeralmente compreendido pelos técnicos no assunto. Em algumasconfigurações, a parte de ligante do agente ativo é estreptavidina,avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteína tiol, um grupocarboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico.Cada um dos exemplos de ligante acima mencionado possui afinidade deligação por uma parcela de formação de ponte revelada. Outrasinterações moleculares do tipo "fechadura e chave" também podem serexploradas de forma análoga onde: a parcela de formação de ponte podeser conjugada em um lipídio; existe um ligante relacionado, com. oqual a parcela de formação de ponte tem afinidade de ligação; e oligante pode ser incorporado em ou já faz parte de um agente ativo deinteresse.
Em algumas configurações da matéria ora revelada, olipídio funcionalizado compreende um fosfolipídeo, por exemplo, umafosfoetanolamina. Exemplos de fosfolipídeos úteis com a matéria orarevelada incluem, porém de forma não limitada, N- 4- (p-maleimidofenil)-butiril dipalmitoilfosfatidiletanolamina (MPB-DPPE) ,N-4-(p-maleimidofenil)-butirildimiristoilfosfatidiletanolamina (MPB-DMPE) e N-4-(p-maleimidofenil)-butiril fosfatidiletanolamina de ovo(MPB-EPE). Em configurações particulares, a parcela de formação deponte é biotina e o lipídio funcionalizado é uma fosfoetanolamina. Abiotina pode ser ligada de forma covalente ao lipídio funcionalizado.A parcela de formação de ponte de biotina liga-se com afinidade aosligantes de estreptavidina e avidina. Por exemplo, em algumasconfigurações, o lipídio funcionalizado, incluindo a parcela deformação de ponte, é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) e 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil). Cada um desses exemplos de lipídios funcionalizados eoutros lipídios comparáveis estão comercialmente disponíveis porexemplo pela Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama, E.U.A.)e/ou Molecular Probes (Eugene, Oregon, E.U.A.).
Em outras configurações, o lipídio funcionalizado éácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil}. Em configuraçõesparticulares, o lipídio funcionalizado, incluindo a parcela deformação de ponte, é ácido 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil} (sal de níquel) (Avanti PolarLipids, Inc.). A parcela de formação de ponte de níquel é quelada aogrupo hidrofílico "cabeça" do lipídio funcionalizado. A parcela deformação de ponte de níquel tem afinidade de ligação ao ligante depoli-histidina, que pode ser incorporado em moléculas terapêuticas,por exemplo, polipeptídeos terapêuticos.
As células podem ser revestidas com qualquer um devários agentes ativos, incluindo, por exemplo> moléculasterapêuticas, utilizando as vesícuias lipídicas aqui reveladas parafixar parcelas de formação de ponte na superfície de membranascelulares alvo. O termo "molécula terapêutica", conforme aquiutilizado, refere-se a moléculas que podem reduzir ou impedir lesõescelulares devido à IRI e/ou transplante de órgão, e inclui, porexemplo, polipeptídeos, aptâmeros e moléculas pequenas. Por exemplo,as moléculas que podem amenizar uma resposta de um braço do sistemaimune, incluindo respostas imunes mediadas por complemento erespostas imunes mediadas por leucócitos, bem como anticoagulantes etrombolíticos são exemplos de moléculas terapêuticas da matéria orarevelada. Assim, as moléculas terapêuticas da matéria ora reveladapodem ser utilizadas para tratar, por exemplo, IRI, hiper-rejeiçãoaguda, função retardada do enxerto, rejeição crônica ou falha tardiado enxerto. Classes de moléculas terapêuticas que podem serutilizadas para inibir, evitar ou tratar lesões celulares associadasà IRI e/ou transplante de órgão e tecido incluem, porém de forma nãolimitada, moléculas de indução de apoptose de células T, inibidorescomplementares, moléculas de bloqueio coestimulatório de células T,inibidores de infiltração de leucócitos, glicoproteínas ouproteoglicanos naturais ou sintéticos, anticoagulantes, trombolíticose inibidores de hiperplasia neointimal.
Por exemplo, com relação aos inibidores dehiperplasia neointimal, o neuropeptídeo Y (NPY) regula a funçãocardiovascular, a contração de músculo liso e proliferação de célulasde músculo liso. 0 bloqueio do receptor de NPY Yl com, por exemplo,BIBP3226 ((R) -N2-(difenilacetil)-N-[(4-hidroxi-fenil)metil]-D-arginina-amida) reduz a atividade da proteína quinase ativada pormitógeno (MAPK) em células de músculo liso, e reduz a hiperplasianeointimal após a angioplastia. A exibição de receptores de NPY Yldummy sem o componente de sinalização intracelular ligará a proteínaNPY e inibirá competitivamente a ativação de receptores de NPY Ylendógenos, reduzindo assim a hiperplasia neointimal. Similarmente,uma vez que a ativação dos receptores de NPY Y2 também foi associadaà hiperplasia neointimal, porém em menor extensão que NPY Yls, aexibição dos receptores de NPY Y2 dummy também poderia ser utilizadapara a mesma finalidade.Por exemplo, moléculas de indução de apoptose decélulas T podem ser utilizadas para revestir células. Uma "moléculade indução de apoptose" é uma molécula que, quando entra em contatocom uma célula, induz a apoptose naquela célula. A molécula pode serum polipeptídeo, uma molécula orgânica, um lipídio, um hormônio,etc., ou uma combinação dessas moléculas (ou parcelas ou fragmentosdestas). A molécula pode ser modificada a partir do seu estadonatural; por exemplo, um polipeptídeo que é uma molécula de induçãode apoptose pode ser modificado tanto por modificações pós-translaçãocomo pelo uso de tecnologia recombinante para criar, por exemplo,moléculas quiméricas (fusão).
Fas e FasL são duas proteínas que interagem paraativar uma das vias apoptóticas (morte celular programada) mais bemdefinidas. A Fas e FasL são membros da família TNF (fator de necrosetumoral). A Fas faz parte da família de receptor de transmembrana e aFasL faz parte da família de citocina associada à membrana. Trêsdiferentes formas de FasL são conhecidas: ligada à membrana, solúvele vesicular. Cada uma difere em termos de função em relação àapoptose e regulação imune. A apoptose é mediada principalmente pelasformas vesicular e ligada à membrana da FasL, ao passo que a formasolúvel é ineficaz ao mediar a apoptose e serve como um fator anti-apoptótico ao competir pelo receptor de Fas com a FasL ligada àmembrana (Schneider et al., 1998, J.Exp.Med., 187:1205-1213.; Suda etal., 1993, Cell, 75:1169-1178). A atividade apoptótica da FasL é maiseficientemente mediada por sua trimerização e por meio do contatocélula-célula, que é contrabalanceado pela atividade anti-apoptóticada forma solúvel. Os quatro principais papéis conhecidos da ligaçãoda Fas à FasL pro-apoptótica são: (1) para que as células T CD4mantenham a homeostase de linfócitos; (2) para desencadear a morte demacrófagos infectados com bactérias; (3) para eliminar células Banérgicas; e (4) para que as células T CD8 eliminem células alvoinfectadas por vírus (Janeway et al., 2001, Immunobiology, GarlandPublishing, New York, Ν. Y.). Diversos estudos demonstraram efetivobloqueio de respostas aloreativas e sobrevida de ilhotas alogênicashepáticas, renais, tireóides e pancreáticas utilizando FasL expressapor modificações genéticas como uma abordagem imunomodulatória (vide,por exemplo, Pedido Publicado de Patente Norte-Americana N52004/0213766, aqui incorporado na íntegra por referência).
As moléculas terapêuticas que bloqueiam a ativaçãocomplementar também podem ser utilizadas para revestir células. Asmoléculas terapêuticas representativas que bloqueiam a ativaçãocomplementar incluem, porém de forma não limitada: fator deaceleração do decaimento (DAF), proteína de controle complementar devírus para vacina (VCP), um polipeptídeo produzido por vírus vaccinia(Vide Patentes Norte-Americanas N— 5,157,110 e 5,187,268, cada umadelas aqui incorporada por referência); receptor complementar 1(CRI), uma proteína anticomplemento humana; inibidor de varíola deenzimas complementares (SPICE), um homólgo de VCP produzido pelovírus da varíola; e compstatina, um inibidor de C3. Inibidorescomplementares representativos de moléculas terapêuticas pequenasincluem, porém de forma não limitada, inibidores de hemólisecomplementares FUT-175 e composto 4077, e os inibidores de Cls Cls-INH-248 e composto 53 (3-Dimensional Pharmaceuticals, Yardley,Pensilvânia, E.U.A.). A VCP, por exemplo, demonstrou inibir tanto asvias clássicas como as vias alternativas de ativação complementar.
Essas moléculas de inibição complementar servem como moléculasterapêuticas contra doenças inflamatórias (incluindo a IRI) eautoimunes. A VCP é uma proteína 28 kDa com semelhanças estruturais efuncionais às proteínas humanas da família de controle complementar(C4b-BP e CRI) . A VCP liga C3b e C4b na presença de co-fator I ebloqueia a formação do complexo de C3 convertase, uma etapa crucialna síntese do potente fator quimiotático C5a e na formação do MAC.Além da VCP, outros membros da família Poxvirus codificam homólogos àVCP, incluindo, porém de forma não limitada, SPICE, que também podeser utilizado com a matéria ora revelada como moléculas terapêuticas.
Além disso, moléculas terapêuticas envolvidas nobloqueio coestimulatório (por exemplo, moléculas de bloqueiocoestimulatório de células T) podem ser utilizadas para revestircélulas. Moléculas terapêuticas representativas envolvidas nobloqueio coestimulatório incluem, porém de forma não limitada,proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA4), que bloqueiaa via CD28-B7, e anti-CD40L, que bloqueia a via CD40-CD40L.
Moléculas terapêuticas representativas que impedema infiltração de leucócitos (ou seja, inibidores de infiltração deleucócitos) incluem, porém de forma não limitada, glicoproteínas eproteoglicanos de ocorrência natural ou sintética. As glicoproteínasou os proteoglicanos podem revestir ou se acumular sobre outrasmoléculas de adesão celular (por exemplo, selectinas, ICAMs ouintegrinas), que são essenciais para a movimentação de leucócitos,adesão e translocação através do endotélio. Exemplos deglicoproteínas e proteoglicanos úteis como inibidores de infiltraçãode leucócitos incluem, porém de forma não limitada, lectinas inativasgrandes (por exemplo, selectinas L, PeE) e α-1-glicoproteína ácida(AGP) . A AGP inibe a proliferação de linfócitos e a ativação deneutrófilos ao interagir com a superfície de suas membranascelulares.
Anticoagulantes representativos incluem, porém deforma não limitada, hirudina, produzida tanto de forma recombinanteou isolada a partir de fontes naturais, inibidores de Xa de fator demolécula pequena: DPC-423, DPC-602, razaxaban, GSK 813893,otamixaban, DU-176b, KFA-1982, BAY-59-7939, DX-9065a, YM-150, LY-517717, MCMO9; inibidores de trombina de molécula pequena: SSR-182289, LB-30057, LB-30870, BIBR-1048, L-374,087; e inibidor 9.3tCdeaptâmero de fator IXa.
Trombolíticos representativos incluem, porém deforma não limitada, uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual(tPA) (incluindo tPA recombinante) e metaloproteinases de matriz(MMPs) (incluindo, por exemplo: gelatinases (MMP-2,9), colagenases(MMP-1,8,13,14,18) e MMPs ligadas a membrana (MMP-14,15,16,17,23,24,25)).
Em algumas configurações, a vesícula lipídicacompreende um fosfolipídeo que é um formador de vesícula estável;pelo menos um membro de formação de vesícula instável, onde o membrode formação de vesícula instável é selecionado a partir do grupoconsistindo em um lipídio polar não formador de vesícula estável, umPEG, um formador de domínio tipo "raft" e uma proteína de fusão; e umlipídio funcionalizado conforme aqui revelado.
Um membro de formaçãode vesícula instável é uma molécula que reduz a estabilidade davesícula, o que pode aumentar vantajosamente a capacidade de umavesícula se fundir com membranas celulares (ou seja, aumentam afusogenicidade da vesícula).
Lipídios polares são moléculas orgânicas quepossuem uma terminação hidrofóbica e uma terminação hidrofílica, econtém pelo menos seis átomos de carbono; possuem a estrutura dafórmula (I), onde X é um grupo "cabeça", L é um grupo "backbone", ecada Z é um grupo graxo. Os dois grupos Z podem ser iguais oudiferentes. Um fosfolipídeo é um lipídio polar que possui um grupo"cabeça" da fórmula (II) , onde AeB são substituintes do grupo"cabeça".
<formula>formula see original document page 39</formula>
Nos lipídios das vesícuias atualmente reveladas, ogrupo "cabeça", X, pode ser qualquer grupo polar, preferencialmenteum grupo catiônico, aniônico ou zwiteriônico, ou H. Maispreferencialmente, X é um grupo da fórmula (II) . B pode ser umcátion, por exemplo, íon Na+, K+ ou tetrametil amônio; ou um grupoalquila. A pode ser H, ou um grupo alquila e, em algumasconfigurações, A é um grupo alquila substituído por uma amina, porexemplo, um grupo da fórmula (III), (IV), (V), (VI) ou (VII). Deveser observado que em toda a especificação, as fórmulas podemapresentar as estruturas em forma protonada, porém incluem a formanão protonada (e vice-versa); o fato de a forma estar presente emqualquer composição dependerá do pH exato da composição e a presençade água e/ou contra-íons apropriados.<formula>formula see original document page 40</formula>
0 grupo "backbone", L, pode ser uma alquila ondedois átomos de hidrogênio estão ausentes (para proporcionar um totalde três pontos de ligação abertos), em algumas configurações umalcóxi, ou alquila substituída por amino. Em configuraçõesparticulares, L é um grupo da fórmula (VIII), (IX) ou (X).
<formula>formula see original document page 40</formula>
Os grupos graxos, Z, podem ser iguais oudiferentes, e são H, um grupo E ou uma estrutura da fórmula (XI) ,onde E é uma alquila ou alquenila. Em determinadas configurações, E éuma alquila ou alquenila de cadeia linear não substituída, com 6 a 26átomos de carbono. Por exemplo, E pode ser um grupo da fórmula (XII),(XIII), (XIV), (XV), (XVI) ou (XVII). Se um dos grupos graxos for H,então o outro deve ser diferente. Se ligações duplas estiverem<formula>formula see original document page 41</formula>
Um fosfolipídeo (ou lipídio polar) que é umformador de vesícula estável é um fosfolipídeo (ou lipídio polar) queformará vesículas, pelo menos 50% das quais persistem por pelo menosuma hora, quando preparadas da seguinte maneira: o fosfolipídeo édissolvido em clorofórmio e colocado em um tubo de ensaio de vidro. 0solvente é removido por evaporação sob um fluxo contínuo denitrogênio, seguido de remoção de ar submetendo a amostra ao vácuopor doze horas. O material lipídico seco é então reidratado emNa2HPO4 10 mM por 60 minutos a uma temperatura acima da temperaturade transição da fase lipídica; a concentração final desejada é de 25mg/ml. A mistura lipídica é então agitada por sonificação com umsonificador de microponta de 450 watts utilizado a um ciclo detrabalho de 40%.
Além do fosfolipídeo que é um formador de vesículaestável, pelo menos um outro lipídio polar pode ser incluído (com olipídio funcionalizado) em uma vesícula lipídica, que é um membro deformação de vesícula instável.
Um formador de domínio tipo "raft" é um compostoque se assentará dentro da camada lipídica de uma vesícula quando umavesícula está em uma solução aquosa e formará ou levará à formação deregiões discretas dentro da parede de uma vesícula (também conhecidacomo domínios do tipo "raft"). Essas regiões discretas tendem adesestabilizar a vesícula, aumentando sua fusogenicidade. Exemplos deformadores de domínio tipo "raft" são colesterol, esfingomielina eproteínas e polipeptídeos conhecidos por estarem ligados à membrana.
A fusogenicidade também pode ser intensificada selecionando-selipídios polares que resultarão em uma carga de superfície sobre avesícula, que é o contrário da carga da camada de Gouey-Chapman dascélulas alvo (tipicamente a camada de Gouey-Chapman é carregadapositivamente).
Em algumas configurações particulares, ofosfolipídeo, que é um formador de vesícula estável ou o lipídiopolar não formador de vesícula estável, tem a estrutura da fórmula (I) =
<formula>formula see original document page 42</formula>
onde X é H, A, ou tem a estrutura da fórmula (II)
<formula>formula see original document page 42</formula>
B é um cátion ou um grupo alquila;
A é H ou um grupo alquila;
L é um grupo alquila onde dois átomos de hidrogênioestão ausentes (para proporcionar um total de três pontos de ligaçãoabertos) e, em algumas configurações, L é um alcóxi ou alquilasubstituída por amino; e
cada Z é, independentemente, Η, E, ou a estruturada fórmula (XI),
<formula>formula see original document page 43</formula>
onde E é uma alquila ou alquenila, e quando um Zfor Η, o outro Z não é H.
Em algumas configurações, A é H, ou tem umaestrutura selecionada a partir do grupo consistindo nas fórmulas(III), (IV), (V), (VI) e (VII):
<formula>formula see original document page 43</formula>
onde η é um número inteiro de 0 a 4;
L tem uma estrutura selecionada a partir do grupoconsistindo nas fórmulas (VIII), (IX) ou (X)<formula>formula see original document page 44</formula>
E tem uma estrutura selecionada a partir do grupoconsistindo em (XII), (XIII), (XIV), (XV), (XVI) e (XVII)
<formula>formula see original document page 44</formula>
Em algumas configurações, o fosfolipídeo, que é umformador de vesícula estável, é uma fosfatidilcolina. Exemplos delipídios de fosfatidilcolina adequados para uso como membros deformação de vesícula estável incluem, porém de forma não limitada,1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), l-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PDPC), fosfatidilcolina desoja, fosfatidilcolina de ovo, e misturas destas.Exemplos de lipídios polares para uso na presentematéria como membros de formação de vesícula instável incluem, porémde forma não limitada, l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato(POPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOPC-e), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-l-serina] (DOPS), uma esfingomielina (colesterolformará domínios do tipo "raft" quando adicionado a uma vesículaformada a partir de uma mistura de uma esf ingomielina e DOPC) , 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, l-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP).
Outros lipídios polares úteis para a prática damatéria ora revelada como membros de formação de vesícula instávelincluem fosfatidil serina (PS), fosfatidil glicerol (PG) , fosfatidilcolina de cadeia mista (MPC), fosfatidil etanol (PE) e fosfolipídeoscontendo ácidos docosahexaenóicos. Cit-DOPC e cit-DOPC-e são exemplosde lipídios polares úteis como membros de formação de vesículainstável. As fosfatidilcolinas, incluindo aquelas tendo um ácidodocosahexaenóico nas posições sn-1 e sn-2 (DHPC) podem serutilizadas. Outros lipídios diinsaturados, por exemplo,diaraquidonilfosfatidilcolina (por exemplo 20:4 DOPC : DArPC) ,dilinolenoilfosfatidilcolina (por exemplo, 18:3 DOPC : DLnPC) tambémsão úteis. Por exemplo, DOPC pode ser misturado com quantidadescrescentes de DLnPC, DArPC e DHPC durante a preparação da vesícula.Razões úteis incluem (DOPC.-DLnPC, DArPC ou DHPC) de 1 a 1000:1, porexemplo, 1:1 e 25 a 500:1, incluindo 25:1, 50:1, 100:1 e 500:1.Combinações de fosfolipídeos tendo grandes áreas moleculares médiastambém podem ser utilizadas, por exemplo DOPC:DLnPC:DHPC.Diacilglicerol, um lipídio de fase não lamelar, também pode sermisturado com DOPC. Além disso, pode-se utilizar polietilenoglicol(PEG) com pesos de 20 repetições até 4000 repetições.
Em algumas configurações, a razão entre ofosfolipídeo formador de vesícula estável e o lipídio polar nãoformador de vesícula estável é de 1:1 a 500:1, mais preferencialmente10:1 a 100:1 (por exemplo, 50:1). Exemplos incluem: DOPC/DOPC-e(1:1); DOPC/POPA (50:1) e DOPC/POPA (1:1). Em algumas configurações,a vesícula lipídica tem uma razão entre o formador de vesículaestável e o lipídio funcionalizado de aproximadamente 1:1 aaproximadamente 500:1, em algumas configurações uma razão deaproximadamente 1:1 a aproximadamente 200:1 e em algumasconfigurações uma razão de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1.
A velocidade de fusão de uma vesícula lipídica podeser alterada mudando-se diversos fatores, tais como temperatura,íons, concentração de lipídio, composição da vesícula lipídica, taxasde fluxo, tamanho da vesícula lipídica, etc. Alterando-se ofosfolipídeo, a formulação de vesículas lipídicas pode ser utilizadapara maximizar as taxas de fusão bem como minimizar a toxicidade.
Quatro abordagens gerais podem ser utilizadas para alterar as taxasde fusão manipulando-se a composição lipídica:
(1) aumento das interações eletrostáticas;
(2) desestabilização das bicamadas de membrana;
(3) aumento das fases não bicamadas; e
(4) criação de fases lipídicas diferentes.
As interações eletrostáticas podem ser exploradaspara aumentar as taxas de fusão. Os fosfolipídeos são classificadosde acordo com sua carga (catiônicos, aniônicos e zwiteriônicos).Vários dos fosfolipídeos catiônicos, por exemplo PE, e fosfolipídeosaniônicos, por exemplo ácido fosfatídico (POPA), não formam vesícuiasfechadas em pH fisiológico. No entanto, os lipídios aniônicos ecatiônicos misturados com fosfatidilcolinas zwiteriônicas podemformar vesículas fechadas em pH fisiológico.
A membrana plasmática da maioria das células possuiuma carga líquida negativa. Devido a essa carga negativa, há umacamada de íons de contrabalanceamento, geralmente cálcio, magnésio,sódio e potássio, que apresentam uma carga líquida positiva.
Aproveitando a interação eletrostática entre lipossomas e membranasplasmáticas, as vesículas lipídicas podem ser modificadasgeneticamente para terem uma carga líquida negativa, aumentando assima fusão célula-vesícula lipídica. No entanto, algumas membranasplasmáticas celulares contêm mais lipídios catiônicos que sãocontrabalanceados por uma camada iônica aniônica. Nesses casos, asvesículas são modificadas geneticamente para ter uma carga líquidapositiva para maximizar a fusão célula-lipídio.
As membranas plasmáticas contêm domínios lipídicosou domínios do tipo "raft" que são enriquecidos em uma espécieparticular de lipídio. No limite dessa membrana "raft" existemregiões de espécies lipídicas diferentes. Essas regiões têm opotencial de instabilidade, afetando a maneira pela qual a membranainterage com outras membranas. Diversos fosfolipídeos são conhecidospor aumentarem a formação de domínio lipídico tipo "raft", incluindoas misturas de fosfatidilcolinas, esfingomielina e colesterol. Porexemplo, DOPC, 18:0 esfingomielina, e colesterol podem ser misturadosem uma razão de 1:1:1 durante a preparação da FUV. O colesterolpreferencialmente se divide na fase de esfingomielina, criandoregiões que são ricas em DOPC e pobres em colesterol, e regiões quesão ricas em esfingomielina e ricas em colesterol.
Uma alteração dos parâmetros físicos de fusão,temperatura, concentração, potência iônica, pode ser utilizada paraafetar as taxas de fusão. Alterando-se a temperatura, a energia livre(G) do sistema é alterada, levando a diferentes taxas de fusão. 0aumento da concentração da vesícula lipídica também afeta as taxas defusão da membrana, especialmente em altíssimas concentrações. 0período de fusão (duração da fusão) e o número de períodos de fusãotambém afetam a quantidade de teor encapsulado e os componentes demembrana distribuídos pelas FUVs.
A temperatura também pode afetar as taxas de fusão.0 aumento da temperatura da solução da vesícula aumenta a energiacinética das vesícuias e, conseqüentemente, aumenta a capacidade defusão. A temperatura também afeta a livre difusão das vesículas.
Embora seja intuitivo que o aumento da concentraçãoleva ao aumento da fusão da vesícula até certo ponto, a velocidade defusão da membrana não é linear. Uma vez que os lipídios da FUV ocupamtoda a superfície disponível da membrana plasmática, a fusãoadicional é limitada. A extensão da fusão com a membrana plasmáticaafeta o volume e as propriedades da membrana, por exemplo, apermeabilidade iônica e a organização lipídica. Portanto, aoadministrar FUVs, a concentração de FUV deve ser controlada de modoque as células alvo sejam efetivamente tratadas.
0 tempo que se permite que a fusão ocorra ajuda acontrolar a extensão da distribuição das substâncias encapsuladas.Para interromper a fusão, as vesículas são removidas (por exemplo,lavando-se com um tampão) ou a concentração das vesículasadministradas é tal que pode ocorrer depleção das vesículas ao finaldo tempo desejado. A fusão também pode ser otimizada de modo que adistribuição total das vesículas seja controlada através de uma ouvárias administrações. Por exemplo, se o período visado de fusão forde 120 minutos, dois períodos de 60 minutos podem ser utilizados, ouquatro períodos de fusão de 30 minutos, doze de 10 minutos ou vinte equatro períodos de 5 minutos podem ser utilizados. Contanto que osequipamentos adequados estejam disponíveis, períodos de fusão de 1minuto ou menos também podem ser permitidos, embora sejam geralmenteinconvenientes e tecnicamente exigentes.
Em algumas configurações, a vesícula lipídicafusogênica tem uma velocidade de fusão de pelo menos aproximadamentefusões de vesícula/segundo/mm2 de membrana celular.
Em alguns casos, é desejável poder armazenar asvesículas lipídicas por longos períodos de tempo sem perdasubstancial das vesículas dos materiais selecionados que estãocarregando e sem fusão não intencionada das vesículas entre si. Maisparticularmente, de modo a serem úteis em determinadas configuraçõescomerciais, as preparações de vesícula lipídica devem ter validadeslongas o suficiente para permitir que sejam facilmente fabricadas,transportadas e armazenadas por usuários intermediários e finais sobdiversas condições de temperatura. Assim, em algumas configurações damatéria ora revelada, as vesículas lipídicas são liofilizadas parapreservar as vesículas por longos períodos de armazenamento etransporte antes do uso.
Técnicas de preservação de vesícula lipídica porliofilização são geralmente conhecidas na técnica. Vide, por exemplo,a Patente Norte-Americana N^ 5,578,320, 5,008,109 e 4,857,319 e oPedido Publicado de Patente Norte-Americana N5 2006/0045910, cada umadelas aqui incorporada na íntegra por referência.
De modo geral, a liofilização (ou seja,"liofilização") de vesículas compreende o rápido congelamento dasvesícuias seguido do descongelamento destas sob vácuo, o que resultana remoção do teor de água das formulações, preservando assim asvesículas em uma forma estável. 0 termo «liofilização", conforme aquiutilizado, também se refere à desidratação das vesículas semcongelamento prévio, simplesmente colocando-as sob pressão reduzida.
Os períodos de armazenamento antes da reidratação eativação das vesículas podem ser, por exemplo, de aproximadamente 10minutos até aproximadamente 5 anos, incluindo os períodosintermediários.
Uma vez que as vesículas podem ser muitorapidamente congeladas até temperaturas de por exemplo -400C e abaixoe uma vez que os tempos de armazenamento podem ser extensos,componentes adicionais podem ser adicionados como agentes protetorespara ajudar a preservar as vesículas de forma mais eficiente. Porexemplo, a bicamada da membrana e outras porções da vesícuia, porexemplo, o espaço interno da vesícula, podem incluir um sacarídeo.
Assim, as superfícies interna e externa da bicamada da membrana podemser revestidas pelo sacarídeo, enquanto o espaço interno pode contero sacarídeo. Em algumas configurações, o sacarídeo pode serincorporado na vesícula a uma razão (m/m) entre o membro de formaçãode vesícula estável de aproximadamente 5:1 a 1:5 e, em algumasconfigurações, a uma razão de aproximadamente 1:1.
Em algumas configurações, o sacarídeo é qualquersacarídeo solúvel em água, incluindo os monossacarídeos,dissacarídeos e polissacarídeos. O sacarídeo também pode incluirenantiômeros, diastereoisômeros, derivados e misturas racêmicas de umou mais sacarídeos, que podem preservar a vesícula lipídica, ao passoque mantêm a fusogenicidade desejada. Não querendo ficar preso aqualquer teoria em particular, acredita-se que o sacarídeo impede afusão da vesícula durante o processo de desidratação ligando-se aosgrupos polares "cabeça" dos lipídios, deslocando água e criando umvidro que envolve e protege a membrana de bicamada contra aautofusão. Mediante a reidratação, o sacarídeo é provavelmenteliberado, permitindo assim a estabilização em água da bicamada.
Exemplos de monossacarídeos úteis no procedimentode preservação incluem, porém de forma não limitada, manose, frutoseou ribose, porém preferencialmente não a glicose. Exemplos dedissacarídeos incluem, porém de forma não limitada, trehalose,lactose, maltose, sacarose ou turanose. Exemplos de polissacarídeosincluem, porém de forma não limitada, hidroxietilamido, inulina oudextrano. Um sacarídeo preferido é o dissacarídeo D-trehalose.
III. Métodos de Revestimento de Células com Agentes Ativos
A matéria ora revelada provê métodos derevestimento de uma célula, por exemplo, uma superfície externa deuma membrana celular de uma célula, com um agente ativo, por exemplo,moléculas terapêuticas, incluindo, por exemplo, polipeptídeos,aptâmeros e moléculas pequenas. A célula pode ser uma célula de umtecido ou órgão (por exemplo, uma célula endotelial). A matéria orarevelada inclui ainda células revestidas com moléculas terapêuticasde acordo com os métodos revelados.O método compreende o contato de uma célula com umavesícula lipídica aqui revelada, compreendendo um lipídiofuncionalizado. 0 lipídio funcionalizado compreende uma parcela deformação de ponte tendo afinidade de ligação por uma parte de ligantede um agente ativo. A célula entra em contato com o agente ativocompreendendo a parte de ligante tanto simultaneamente comoseqüencialmente depois que a célula entra em contato com a vesícula.
0 ligante se liga com afinidade à parcela de formação de ponte,revestindo assim a célula com o agente ativo.
Em algumas configurações particulares, o métodocompreende a perfusão de um tecido ou órgão com uma primeiracomposição, onde a primeira composição compreende uma vesículalipídica fusogênica que inclui o lipídio funcionalizado tendoparcelas de formação de ponte a ele ligada e então a perfusão dotecido ou órgão com uma segunda composição, onde a segunda composiçãocompreende um agente ativo que inclui a parte de ligante com a qual aparcela de formação de ponte tem especificidade de ligação. Avesícula lipídica se funde com as membranas das células perfundidas,o que resulta na incorporação do lipídio funcionalizado e da parcelade formação de ponte na membrana celular. A parcela de formação deponte é então fixada à superfície externa da membrana celular. Depoisque o tecido é perfundido com a segunda composição compreendendo oagente ativo, o agente ativo então se liga com afinidade (porexemplo, por ponte de ligação não covalente) às células compreendendoas parcelas de formação de ponte embutidas, resultando norevestimento das membranas celulares com os agentes ativos.
Em algumas configurações, o lipídio funcionalizadocompreende um fosfolipídeo, por exemplo, fosfoetanolamina. Em outrasconfigurações, o lipídio funcionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N (5-amino-l-carboxipentil) iminodiacético] succinil} . Emalgumas configurações, aparcela de formação de ponte é selecionada a partir do grupoconsistindo em biotina, níquel, tiol, maleimida, amina e ácidocarboxílico. Além disso, em algumas configurações, a parte de liganteda molécula terapêutica é selecionada a partir do grupo consistindoem estreptavidina, avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteínatiol, um grupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico.
A parcela de formação de ponte e o ligante sãoselecionados com base na afinidade de ligação que possuem entre si.Por exemplo, em configurações particulares, o lipídio funcionalizadocompreende fosfoetanolamina ligada à biotina, por exemplo, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil). Nessasconfigurações, o ligante é estreptavidina ou avidina. Em outrasconfigurações, o lipídio funcionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-l-carboxipentil) iminodiacético] succinil} quelado com níquel. Nessasconfigurações, o ligante pode ser poli-histidina incorporada namolécula terapêutica, por exemplo, um polipeptídeo de fusãoterapêutico.
Ainda, os presentes métodos provêem o usosimultâneo ou seqüencial de diversos lipídios funcionalizadosdiferentes, cada um compreendendo diferentes parcelas de formação deponte. Nessas configurações, diversos agentes ativos diferentes (cadaum compreendendo diferentes ligantes tendo afinidades de ligação comas parcelas de formação de ponte) podem ser direcionados às célulasde tecidos ou órgãos, permitindo assim o revestimento de células comvários agentes ativos diferentes, se desejado.
O agente ativo pode ser uma molécula terapêuticaselecionada para proteger a célula, tecido ou órgão contra a ativaçãocomplementar induzida por IRI ou formação de trombo devido à lesão dacélula endotelial, e/ou rejeição do tecido ou órgão pelo sistemaimune em caso de transplante. A molécula terapêutica também pode serselecionada para o tratamento da célula, tecido ou órgão lesionadocomo resultado da IRI ou rejeição pelo sistema imune. Dessa maneira,em algumas configurações, a molécula terapêutica pode ser umamolécula de indução de apoptose de células T, um inibidorcomplementar, uma molécula de bloqueio coestimulatório de células T,um inibidor de infiltração de leucócitos, um inibidor de hiperplasianeointimal, um anticoagulante ou um trombolítico. Em algumasconfigurações particulares, a molécula terapêutica é selecionada apartir do grupo consistindo em FasL, receptor-1 de fator de necrosetumoral (TNF), receptor DR4 de ligante de indução de apoptoserelacionada a TNF (TRAIL), receptor DR5 de TRAIL, proteína decontrole complementar de vírus para vacina (VCP), receptorcomplementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento (DAF) ,compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares (SPICE),proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4), anti-CD40L,hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena, inibidoresde trombina de molécula pequena, uroquinase, ativador deplasminogênio tecidual (tPA), metaloproteinases de matriz (MMP),neuropeptídeo Y (NPY) receptores, e glicoproteínas ou proteoglicanosnaturais ou sintéticos.
Em outro aspecto, a matéria ora revelada provêcélulas, tecidos ou órgãos revestidos gerados pelo uso dos métodos ecomposição revelados. Em algumas configurações, as células revestidas(por exemplo, células endoteliais), tecidos e órgãos compreendemlipídios funcionalizados que incluem uma parcela de formação de pontetendo afinidade de ligação por um ligante. As células, tecidos eórgãos revestidos compreendem ainda um agente ativo que reveste olado externo das células, onde o agente ativo compreende a parte deligante ligada à parcela de formação de ponte. Em algumasconfigurações, a célula, tecido ou órgão é um aloenxerto, xenoenxertoou auto-enxerto. Ou seja, o tecido ou órgão pode ser transplantado deum indivíduo para outro, ou retirado e recolocado no mesmo indivíduo,tanto no mesmo local como em um local diferente.
IV. Métodos de Tratamento
A tolerância imunológica pode ser definida como aausência de uma resposta imune patogênica contra antígenos externosespecíficos na ausência de imunossupressão exógena em andamento (porexemplo, com a retenção de respostas imunes contra outros antígenos).Os métodos aqui descritos realizam a regulação descendente de formasegura e eficaz da resposta imune de um receptor contra antígenosexternos produzidos, por exemplo, por uma célula, tecido ou órgãotransplantado. Além disso, os métodos aqui revelados inibem oscomponentes do sistema imune responsáveis pela IRI, também umapreocupação significativa relacionada ao transplante e outrosprocedimentos que resultam em isquemia do tecido.
De modo geral, os métodos de revestimento decélulas conforme aqui descritos podem ser utilizados como métodos detratamento para inibir a rejeição de uma célula, tecido ou órgãotransplantado e/ou para inibir a IRI de uma célula, tecido ou órgão.Em algumas configurações, esses métodos de tratamento compreendem ouso de duas composições (por exemplo, soluções). A primeiracomposição compreende uma vesícula lipídica compreendendo um lipídiofuncionalizado tendo uma parcela de formação de ponte, conforme aquirevelado. A célula, tecido ou órgão a ser tratado é perfundido com aprimeira composição e as vesícuias lipídicas presentes, ao entraremem contato com as membranas celulares, se fundem com as membranas. Aprimeira composição contendo as vesículas lipídicas fusogênicas podeser perfundida, por exemplo, por via intra-arterial (tanto in vivocomo ex vivo) ou por imersão e as vesículas são deixadas interagircom a membrana celular. Durante esse tempo, pelo menos parte dasvesículas se funde com as membranas celulares, incorporando assim oslipídios funcionalizados na bicamada lipídica dessas células. Assim,a primeira solução pode revestir a camada externa da membrana celularcom parcelas de formação de ponte. A segunda composição compreendeuma molécula terapêutica compreendendo uma parte de ligante tendoafinidade de ligação com as parcela de formação de ponte. A moléculaterapêutica se liga com afinidade em seu ligante à parcela deformação de ponte na bicamada lipídica externa das células. A segundacomposição também pode ser perfundida, por exemplo, por via intra-arterial (tanto in vivo como ex vivo) e deixada interagir com asmembranas celulares revestidas. 0 resultado é o revestimento dascélulas, tecidos e órgãos com diversas cópias da moléculaterapêutica.
Uma vantagem dessa tecnologia em relação a outrossistemas que tentam incorporar moléculas terapêuticas em ou dentro decélulas é a longevidade do revestimento em, por exemplo, vasos comfluxo sangüíneo. As parcelas de formação de ponte são diretamenteligadas aos fosfolipídeos funcionalizados nas vesículas, que sãoentão incorporados na bicamada lipídica da membrana celular. Assim, orevestimento da molécula terapêutica na superfície celular podepermanecer enquanto os fosfolipídeos permanecerem dentro da membranacelular.
As vesículas lipídicas fusogênicas que incluem oslipídios funcionalizados (ou seja, a primeira composição) e asmoléculas terapêuticas com ligantes (ou seja, a segunda composição)podem ser administradas de várias formas. Por exemplo, a célula,tecido ou órgão já coletada de um doador pode ser perfundida nasolução. Além disso, a célula, tecido ou órgão que já foitransplantada em um receptor (que pode ser o mesmo indivíduo doador,por exemplo, nos casos de revascularização coronariana (CABG)) podeser revestida administrando-se as soluções por via intravenosa aoreceptor. Ainda, em casos em que há risco de IRI (por exemplo, lesãoou oclusão vascular), as soluções podem ser administradas diretamenteno local da isquemia ou sistemicamente, por exemplo, por viaintravenosa. A administração pode ser repetida em intervalosregulares até (ou se) a tolerância ao transplante for induzida ou seo risco de IRI for substancialmente eliminado.
Em uma configuração, os compostos ativos sãopreparados com veículos que protegem o composto contra a rápidaeliminação do organismo, por exemplo, uma formulação de liberaçãocontrolada, incluindo implantes e sistemas de distribuiçãomicroencapsulados. Polímeros biodegradáveis ou biocompatíveis podemser utilizados, por exemplo, etileno vinil acetato, polianidridos,ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico.Esses materiais podem ser obtidos comercialmente pela ALZACorporation (Mountain View, Califórnia, E.U.A.) e pela NOVAPharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, Califórnia, E.U.A.), oupreparados pelos técnicos no assunto.
A dosagem é definida e depende diretamente dascaracterísticas únicas da vesícula lipídica, que varia com asdiferentes composições lipídicas, o efeito terapêutico particulardesejado e a via de administração. 0 nível posológico específico e afreqüência para qualquer indivíduo ou aplicação em particular podemser variados. Os fatores que devem ser considerados, incluindo (1) atemperatura na qual a administração é realizada e na qual a fusão épermitida; (2) o ambiente iônico do local de administração e dapotência iônica de uma composição de vesícula lipídica; e (3) o tempode duração que a fusão é permitida. 0 controle desses fatores ajuda acontrolar a extensão da distribuição dos lipídios funcionalizados.
Ao administrar vesículas lipídicas, a concentraçãoda vesícula é controlada para tratar eficazmente as células alvo, aopasso que não inibem sua função por saturação das membranasplasmáticas com lipídios da vesícula. Concentrações preferíveis dasvesículas lipídicas, dependendo da composição lipídica, da dispersãoda célula alvo e do volume a ser administrado, podem ser de 0,5mg/ml-100 mg/ml, por exemplo, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml,20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml,90 mg/ml e 100 mg/ml.
A fusão da vesícula, que ocorre por meio deinterações eletrostáticas, é significativamente afetada poralterações nas concentrações de cálcio e/ou magnésio e, em menorextensão, por alterações nas concentrações de sódio e/ou potássio. Amodulação dessas concentrações iônicas tanto nas composiçõesutilizadas para administrar as vesículas lipídicas como nascomposições administradas a um local alvo antes ou depois daadministração da vesícula, afetam as considerações posológicas.Preferencialmente, são utilizadas as concentrações iônicas de 0,01 nMa 1 mM, incluindo 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, 10micromols/L e 100 micromols/L. Combinações desses e de outros íonstambém podem ser utilizadas.
Conforme observado, os regimes de administraçãocrônica ou simples podem ser utilizados e são escolhidos de acordocom o tipo de tratamento, a via de administração e o tipo devesículas. Períodos preferíveis de fusão incluem 1 a 180 minutos, porexemplo, 1, 5, 10, 30, 60, 120 e 180 minutos. Para interromper afusão, a vesícula é removida (por exemplo, lavando-se com um tampão)ou a concentração de vesículas é tal que pode ocorrer depleção davesícula ao final do tempo desejado. A fusão também pode serotimizada de modo que a distribuição total das vesículas sejacontrolada através de uma ou várias administrações. Por exemplo, se operíodo de fusão pretendido for de 12 0 minutos, dois períodos de 60minutos podem ser utilizados, ou quatro períodos de fusão de 3 0minutos, doze de 10 minutos ou 24 períodos de cinco minutos.
Ainda, com relação aos métodos terapêuticos damatéria ora revelada, um indivíduo preferido é um vertebrado. Umvertebrado preferido é um vertebrado homeotérmico; um vertebradohomeotérmico preferido é um mamífero. Um mamífero preferido é maispreferencialmente um humano. Conforme aqui utilizado, o termo"indivíduo" inclui tanto humanos como animais. Assim, usosterapêuticos veterinários são providos de acordo com a matéria orarevelada.Dessa forma, a matéria ora revelada provê otratamento de mamíferos tais como humanos, bem como mamíferos deimportância pelo fato de estarem ameaçados de extinção, por exemplo,tigres siberianos; de importância econômica, por exemplo, animaiscriados em fazendas para consumo por humanos; e/ou animais deimportância social aos humanos, por exemplo, animais de estimação oucriados em zoológicos. Exemplos desses animais incluem, porém deforma não limitada: carnívoros como gatos e cães; suínos, incluindoleitões, porcos e porcos selvagens; ruminantes e/ou ungulados, taiscomo bovinos, bois, carneiros, girafas, veados, bodes, bisões ecamelos; e cavalos. É também provido o tratamento de aves, incluindoo tratamento das espécies de aves ameaçadas de extinção e/ou mantidasem zoológicos, bem como galináceas, e mais particularmente galináceasdomesticadas, a saber, aves domésticas, por exemplo, perus, galinhas,patos, gansos, galinhas d'Angola, e similares, uma vez que também sãode importância econômica aos humanos. Assim, é também provido otratamento de animais domésticos, incluindo, porém de forma nãolimitada, suínos domesticados, ruminantes, ungulados, cavalos(incluindo cavalos de corrida), aves domésticas e similares.
iv.a. Métodos de Inibição de Rejeição deTransplante
Os métodos e composições da matéria ora reveladapodem ser utilizados para evitar a rejeição do transplante em auto-enxertos, xenoenxertos e aloenxertos por meio da supressão derespostas imunes, incluindo, por exemplo, infiltração e ativação deleucócitos, e ativação complementar.
Sem prejudicar ou pré-tratar o receptor,endotélio de um auto-enxerto, aloenxerto ou xenoenxerto é "decorado"(ou seja, "revestido") com um véu protetor que consiste em moléculasterapêuticas selecionadas. No caso de, por exemplo, polipeptídeos deindução de apoptose de células T, por exemplo, FasL, as células Tativadas pelo doador e receptor são submetidas a apoptose ao entrarem contato com as moléculas terapêuticas, evitando assim a rejeição.
A matéria ora revelada permite a redução significativa, se não aeliminação, da terapia de imunossupressão não específica após otransplante.
Vantagens representativas da matéria ora reveladaem relação a outras terapias de imunorejeição incluem: (1) os tecidosalvo podem ser rapidamente tratados para "expressar" moléculasterapêuticas exógenas funcionais em menos de uma hora; (2) o receptornão exige pré-tratamento; (3) os materiais e procedimentos sãoseguros tanto para o tecido tratado como o receptor; e (4) asmoléculas terapêuticas podem permanecer na superfície da célula porpelo menos duas semanas, tempo suficiente para permitir odesenvolvimento de tolerância ao transplante.
Em algumas configurações, são providos métodos deinibição da rejeição de um tecido ou órgão transplantado em umindivíduo. Em algumas configurações, os métodos compreendem o contatoda célula, tecido ou órgão com uma primeira composição compreendendouma vesícula lipídica, onde a vesícula lipídica compreende um lipídiofuncionalizado que compreende uma parcela de formação de ponte tendoafinidade de ligação por uma parte de ligante de uma moléculaterapêutica e o contato da célula, tecido ou órgão com uma segundacomposição compreendendo uma molécula terapêutica que compreende umaparte de ligante, onde a parte de ligante liga a parcela de formaçãode ponte. Em algumas configurações, a célula, tecido ou órgão entraem contato com a primeira e segunda composições antes do transplanteno indivíduo e em outras configurações, após o transplante aoindivíduo.
Em algumas configurações, o lipídio funcionalizadocompreende um fosfolipídeo, por exemplo, fosfoetanolamina. Em outrasconfigurações, o lipídio funcionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil) iminodiacético] succinil} . Em algumas configurações, aparcela de formação de ponte é selecionada a partir do grupoconsistindo em biotina, níquel, tiol, maleimida, amina e ácidocarboxílico. Além disso, em algumas configurações, a parte de liganteda molécula terapêutica é selecionada a partir do grupo consistindoem estreptavidina, avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteínatiol, um grupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico.
A parcela de formação de ponte e o ligante sãoselecionados com base na afinidade de ligação que possuem entre si.Por exemplo, em configurações particulares, o lipídio funcionalizadocompreende fosfoetanolamina ligada à biotina, por exemplo, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil). Nessasconfigurações, o ligante é estreptavidina ou avidina. Em outrasconfigurações, o lipídio funcionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-l-carboxipentil) iminodiacético] succinil} quelado com níquel. Nessasconfigurações, o ligante pode ser poli-histidina incorporada namolécula terapêutica, por exemplo, um polipeptídeo de fusãoterapêutico.
Ainda, os presentes métodos provêem o usosimultâneo ou seqüencial de diversos lipídios funcionalizadosdiferentes, cada um compreendendo diferentes parcelas de formação deponte. Nessas configurações, diversas moléculas terapêuticasdiferentes (cada uma compreendendo diferentes ligantes tendoafinidades de ligação com as parcelas de formação de ponte) podem serdirecionadas às células de tecidos ou órgãos, permitindo assim orevestimento de células com várias moléculas terapêuticas diferentes,se desejado.
A molécula terapêutica pode ser selecionada paraproteger a célula, tecido ou órgão contra a rejeição pelo sistemaimune da célula, tecido ou órgão durante ou após o transplante. Amolécula terapêutica também pode ser selecionada para tratamento deuma célula, tecido ou órgão lesionado como resultado da rejeição pelosistema imune. Dessa forma, em algumas configurações, a moléculaterapêutica pode ser uma molécula de indução de apoptose de célulasT, um inibidor complementar, uma molécula de bloqueio coestimulatóriode células T, um inibidor de infiltração de leucócitos, um inibidorde hiperplasia neointimal, um anticoagulante ou um trombolítico. Emalgumas configurações particulares, a molécula terapêutica éselecionada a partir do grupo consistindo em FasL, receptor-1 defator de necrose tumoral (TNF), receptor DR4 de ligante de indução deapoptose relacionada a TNF (TRAIL), receptor DR5 de TRAIL, proteínade controle complementar de vírus para vacina (VCP), receptorcomplementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento (DAF) ,compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares (SPICE) ,proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4), anti-CD40L,hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena, inibidoresde trombina de molécula pequena, uroquinase, ativador deplasminogênio tecidual (tPA), metaloproteinases de matriz (MMP),receptores dunrny de neuropeptídeo Y (NPY) e glicoproteínas ouproteoglicanos naturais ou sintéticos.
IV.B. Métodos de Inibição de Lesão de Isquemia-Reperfusão
A matéria ora revelada provê ainda métodos deprevenção, inibição ou tratamento de lesão de isquemia-reperfusão emum indivíduo. As moléculas terapêuticas que podem inibir os primeirosestágios da resposta imune observada na IRI, por exemplo, a ativaçãocomplementar e as moléculas terapêuticas que podem inibir a formaçãode trombo ou dissolver trombos, podem ser revestidas nas células paraevitar, inibir ou tratar a IRI. Em algumas configurações, os métodoscompreendem o contato do tecido ou órgão com uma primeira composiçãocompreendendo uma vesícula lipídica, onde a vesícula lipídicacompreende um lipídio funcionalizado que compreende uma parcela deformação de ponte tendo afinidade de ligação por uma parte de ligantede uma molécula terapêutica e contato do tecido ou órgão com umasegunda composição compreendendo a molécula terapêutica quecompreende a parte de ligante, onde a parte de ligante liga a parcelade formação de ponte.
Em algumas configurações, o lipídio funcionalizadocompreende um fosfolipídeo, por exemplo, fosfoetanolamina. Em outrasconfigurações, o lipídio funcionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil}. Emalgumas configurações, aparcela de formação de ponte é selecionada a partir do grupoconsistindo em biotina, níquel, tiol, maleimida, amina e ácidocarboxílico. Além disso, em algumas configurações, a parte de liganteda molécula terapêutica é selecionada a partir do grupo consistindoem estreptavidina, avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteínatiol, um grupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico.
A parcela de formação de ponte e o ligante sãoselecionados com base na afinidade de ligação que possuem entre si.Por exemplo, em configurações particulares, o lipídio funcionalizadocompreende fosfoetanolamina ligada à biotina, por exemplo, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil). Nessasconfigurações, o ligante é estreptavidina ou avidina. Em outrasconfigurações, o lipídio funcionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético]succinil} quelado com níquel. Nessasconfigurações, o ligante pode ser poli-histidina incorporada namolécula terapêutica, por exemplo, um polipeptídeo de fusãoterapêutico.
Ainda, os presentes métodos provêem o usosimultâneo ou seqüencial de diversos lipídios funcionalizadosdiferentes, cada um compreendendo diferentes parcelas de formação deponte. Nessas configurações, diversas moléculas terapêuticasdiferentes (cada uma compreendendo diferentes ligantes tendoafinidades de ligação com as parcelas de formação de ponte) podem serdirecionadas às células de tecidos ou órgãos, permitindo assim orevestimento de células com várias diferentes moléculas terapêuticas,se desejado.
Conforme observado, a molécula terapêutica pode serselecionada para proteger, inibir e/ou tratar a célula, tecido ouórgão contra a IRI. Dessa forma, em algumas configurações, a moléculaterapêutica pode ser um inibidor complementar, um anticoagulante ouum trombolítico. Em algumas configurações particulares, a moléculaterapêutica é selecionada a partir do grupo consistindo em proteínade controle complementar de vírus para vacina (VCP), receptorcomplementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento (DAF),inibidor de varíola de enzimas complementares (SPICE), compstatina,FUT-175, composto 4077, Cls-INH-248, composto 53, hirudina,inibidores de Xa de fator de molécula pequena, inibidores de trombinade molécula pequena, inibidor 9.3tC de aptâmero de fator IXa,uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual (tPA) emetaloproteinases de matriz (MMP).
V. Kits
A matéria ora revelada provê ainda kits pararevestir células endoteliais. Em algumas configurações, o kitcompreende uma vesícula lipídica conforme aqui revelado,compreendendo um lipídio funcionalizado compreendendo uma parcela deformação de ponte tendo afinidade de ligação por uma parte de ligantede um agente ativo e o agente ativo compreendendo a parte de ligante.
Em algumas configurações, a vesícula lipídica está contida em umprimeiro recipiente e o agente ativo está contido em um segundorecipiente. Os recipientes podem ainda incluir outros componentes,incluindo diluentes, tampões e preservativos.
A vesícula e/ou agente ativo pode ser preservado,por exemplo, por Iiofilização, para prover armazenamento prolongadodo kit antes do uso. Em algumas configurações, o kit também incluiinstruções para utilização das vesículas e dos agentes ativos pararevestimento das células endoteliais.
Os kits podem ser utilizados para revestir célulasendoteliais de tecidos e órgãos, que são, por exemplo, utilizadaspara transplante ou como agentes ativos administrados diretamente aosindivíduos.
EXEMPLOS
Os Exemplos a seguir provêem configuraçõesilustrativas. Com base na presente revelação e no nível geral dehabilidade na técnica, os técnicos no assunto reconhecerão que osExemplos a seguir devem ser apenas exemplares e que diversasmudanças, modificações e alterações podem ser utilizadas sem sair doescopo da matéria ora reivindicada.
Materiais e Métodos para os Exemplos
Preparação da Vesicula Lipídica Fusogênica deBiotina. i,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato (POPA) e/ou N-biotinoil-1, 2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (BDGP) são misturados emclorofórmio. O clorofórmio é removido do material lipídico porexposição ao gás nitrogênio. O filme lipídico é bombeado a vácuo porum período de 12 horas para remover traços de clorofórmio. O materiallipídico é hidratado em solução tampão (Ringer lactato ou KrebsHenseleit modificado) até uma concentração de 25 mg/ml. O tampão e olipídio são agitados por um período de 1 minuto para criar vesículasmultilamelares e colocados em um banho a 37°C por 5 minutos. Oprocedimento é repetido 6 vezes. As vesículas multilamelares sãocolocadas em um banho de gelo utilizando sonificação por pulso (ciclode trabalho de 40%) por um período de 5 minutos. As pequenasvesículas fusogênicas unilamelares (FUVs) resultantes são brevementecentrifugadas para remover traços de titânio da sonda do sonificador.
0 tamanho da FUV é homogeneizado por tração em uma extrusora.Depois que as FUVs são preparadas, uma amostra écoletada para medição do raio hidrodinâmico médio das FUVs utilizandoum Analisador de Tamanho de Partícula Proterion DYNAPRO™ LSD(Proterion Corp., Piscataway, Nova Jersey, E.U.A.) para confirmar otamanho da vesícula.
Preparação da Vesícula Lipídica Fusogênica deNíquel. 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), l-palmitoil-2-OIeol-sn-glicerol-3-fosfato (POPA) e/ou ácido 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil} (salde níquel) (DOGS-NTA-Ni) são misturados em clorofórmio. 0 clorofórmioé removido do material lipídico por exposição ao gás nitrogênio. 0filme lipídico é bombeado a vácuo por um período de 12 horas pararemover traços de clorofórmio. 0 material lipídico é hidratado emsolução tampão (Ringer lactato ou Krebs Henseleit modificado) até umaconcentração de 25 mg/ml. 0 tampão e o lipídio são agitados por umperíodo de 1 minuto para criar vesículas multilamelares e colocadosem um banho a 37°C por 5 minutos. 0 procedimento é repetido 6 vezes.
As vesículas multilamelares são colocadas em um banho de geloutilizando sonificação por pulso (ciclo de trabalho de 40%) por umperíodo de 5 minutos. As pequenas vesículas fusogênicas unilamelares(FUVs) resultantes são brevemente centrifugadas para remover traçosde titânio da sonda do sonificador. 0 tamanho da FUV é homogeneizadopor tração em uma extrusora. Depois que as FUVs são preparadas, umaamostra é coletada para medição do raio hidrodinâmico médio das FUVsutilizando um Analisador de Tamanho de Partícula Proterion DYNAPRO™LSD (Proterion Corp., Piscataway, Nova Jersey, E.U.A.) para confirmaro tamanho da vesícula.
Preparação e Incubação de Linhas HUVEC. HUVECs (BioWhittaker Corporation) são revestidas em 12 placas de poço ecultivadas para confluência em Clonetics (San Diego, Califórnia,E.U.A.) Meio EGM-2 (MCDB modificado a 131,5% FBS, hidrocortisona a0,04%, hFGF 0,4%, VEGF 0,1%, R3-IGF 0,1%, ácido ascórbico 0,1%, hEGF0,1%, GA-I 000 0,1%, heparina 0,1%, pH 7,35). O meio de cultura ésubstituído diariamente. Após 3 a 5 dias, as células são lavadas ecolocadas em um meio experimental (MCDB modificado 131 + FBS 2%inativado por calor) e incubadas por 24 horas. As células são lavadas3x com HBSS (pH 7,35) . Os efeitos da contaminação por endotoxina sãoreduzidos utilizando-se cellware descartável, meios e tampões combaixo teor de endotoxina, bem como grupos controle adequados.
Preparação de Pata Traseira para Estudos deIsquemia e Lesão por Reperfusão. Os animais são anestesiados compentobarbital sódico (60 mg/kg, i.p.) e tricotomizados na região davirilha. O acesso ao retalho ocorre por incisão padrão na virilha. Aartéria femoral e a veia são dissecadas do ligamento inguinal até abifurcação dos vasos epigástricos inferiores. Os ramos de Murphy sãounidos utilizando nylon 8/0. 0,5 cc de heparina (1,000 Ul/ml) éadministrado pela veia peniana do rato. Após um período de 10minutos, a pata, com exceção do osso femoral e dos nervos, é separadado corpo do rato. A artéria femoral e a veia são presas próximas aoligamento inguinal e a artéria sofre incisão e é canulada com umcateter 24G. A veia é separada e a pata é perfundida com uma soluçãoheparinizada de Ringer lactato (1 UI/ml) por 10 minutos. A pata éperfundida com soluções contendo várias formulações de FUV com e semlipídios funcionalizados e, após um período de incubação, a soluçãode FUV é lavada. A seguir, ocorre uma perfusão de uma soluçãocontendo moléculas terapêuticas com o ligante apropriado. A solução éincubada na pata por um período especificado e então lavada comRinger lactato. A artéria e a veia são reparadas e o fluxo sangüíneoé restabelecido.
Isolamento de Células Endoteliais da Pata Traseirade Rato. As células endoteliais são isoladas da circulação da patatraseira utilizando colagenase. Em resumo, o vaso é perfundidorapidamente com colagenase (2% dissolvida em PBS), clampeadodistalmente e proximalmente, e incubado por um período de 20 minutos.O clamp distai é liberado e a suspensão de colagenase/célula éisolada. Para inibir os efeitos da colagenase sobre as células, umasolução de FBS 10% é adicionada ao isolado. 0 isolado é centrifugadoa 2OOxg por 10 minutos para granular as células. As células sãolavadas 3 vezes em PBS e então colocadas em placas para análise.
Transplante de Coração de Rato: Operação do doador.Os ratos são anestesiados (pentobarbital sódico 60 mg/kg, i.p.),preparados e tricotomizados, e heparina 100 VI é injetada na veiacava infrahepática inferior. O tórax é aberto por meio de incisõesdorsolaterais esquerda e direta, e o diafragma é separado da paredeanterior do tórax. A veia cava superior direita é ligada e cortada nolado distai da ligação. O primeiro ramo da aorta é ligado com umasutura de seda 6-0, e a sutura é retida no primeiro ramo da aorta. Aveia cava superior esquerda, as artérias pulmonares, as veiaspulmonares e a veia ázigo são unidas com uma sutura de seda 4-0.Então, o coração é coletado do doador e armazenado em solução geladade Ringer lactato. Operação do receptor. Depois de tricotomizar opescoço do receptor, é feita uma incisão anterolateral direita nopescoço. A pele é separada do tecido subcutâneo para formar uma bolsapara acomodar frouxamente o coração enxertado. A veia jugular éisolada de seus ramos de entrada e a artéria carótida comum é ligadao mais distante possível da artéria subclávia. Anastomose entre aveia cava superior direita do coração enxertado e a veia jugular doreceptor, bem como entre a aorta do doador e a artéria carótida comumdo receptor é realizada utilizando nylon 10/0. Depois de retirartodos os clamps bulldog e certificar-se de que o enxerto combatimento não está congestionado, a incisão é fechada com uma camadade sutura contínua.
Transplante de Retalho de Pele: Cirurgia do doador.
Retalhos epigástricos livres de virilha de ratos ACI doadores sãocultivados como anteriormente descrito (Fernandez-Botran et al.,2002, Transplante, 74:623-629). Os retalhos medem 5 cm2 e incluempele, músculo panniculus carnosus, gordura subcutânea, enchimentoadiposo epigástrico, linfonodos inguinais e vasos femorais. Osanimais são anestesiados com pentobarbital sódico (60 mg/kg, i.p.) etricotomizados na região da virilha. 0 acesso ao retalho ocorre porincisão padrão na virilha. A artéria e a veia femoral são dissectadasdo ligamento inguinal até a bifurcação dos vasos epigástricosinferiores. As extremidades distais dos vasos femorais são ligadasutilizando nylon 8-0. 0 retalho isolado é então lavado com soluçãoheparinizada de Ringer lactato através da artéria femoral por 10minutos (o retorno venoso não é interrompido). Ao final da lavagem,as extremidades proximais dos vasos femorais são clampeadas e todo oretalho é levantado com os vasos epigástricos e o enchimento adiposo.
Cirurgia do receptor. Ratos Nude receptores são anestesiados comisoflurano 2 a 5% e tricotomizados no aspecto ventral da região dopescoço. A artéria carótida externa direita (ECA) e a veia jugularexterna (EJV) são expostas e a ECA cuidadosamente separada do plexocervical simpático, clampeadas proximalmente e cortadas. A EJV éclampeada distalmente e cortada. 0 retalho é então posicionado naregião do pescoço com quatro suturas de fixação, e a anastomosevascular é realizada entre a artéria femoral e a ECA e a veia femorale a EJV. A pele é fechada utilizando nylon 6-0.
Modelo de Trombose Venosa em Rato. Após a induçãode anestesia (isoflurano 2 a 5%), uma incisão longitudinal é feita navirilha direita do animal, se estendendo por 2 cm na direção dojoelho. Através dessa incisão, a veia femoral direita écuidadosamente dissectada livremente entre o ligamento inguinalproximalmente e o ramo epigástrico superficial distalmente. A veiafemoral direita é canulada para infusão retrograda de solução detratamento contendo FLVs. Um clamp vascular é colocado na extremidadedistai do segmento isolado para reter a solução de tratamento. Asolução permanece no segmento de interesse por um períodopredeterminado. A solução é então aspirada com uma seringa por meiode uma cânula, e a veia é lavada com solução de Ringer lactatosimples. Imediatamente após a lavagem da veia, a solução contendo HN-SA é infundida na veia por meio da cânula e mantida por 30 minutos. Asolução é então aspirada, a veia é lavada com solução de Ringer, acânula é retirada, a veia é reparada e o clamp da veia distai éliberado, permitindo o fluxo sangüíneo normal. Após 1 hora dereperfusão, o animal é colocado em um microscópio de dissecção comuma câmera de vídeo digital que é conectada a um computador. Afreqüência cardíaca e a pressão arterial são monitoradas. Atemperatura do animal também é monitorada com um termômetrointraperitoneal e mantida entre 36 e 37°C utilizando uma almofada decalor ajustável. Uma lesão trombogênica padronizada é produzida naveia utilizando pinças especialmente projetadas que exercem umapressão de pinçamento de 1500 g/mm2. Em outros experimentos, umasolução de cloreto férrico 2,5% a 10% é aplicada topicamente na veiapara induzir a formação de trombos. Para observar e medir o padrão deformação de trombo, um transiluminador é colocado debaixo da veiaenquanto um microscópio de operação estereoscópica triocular (CarlZeiss Jena) equipado com uma câmera de vídeo digital Imaging SourceFireWire (DFK 31F03) conectada a um cartão de vídeo em um PC éutilizada para visualizar e registrar as imagens. Uma sonda de fluxocom Doppler também é colocada na extremidade proximal da veia femoralpara monitorar o fluxo sangüíneo e a oclusão do vaso. 0 tempo paracompletar a oclusão do vaso é medido.
Exemplo 1
Vesículas lipídicas fusogênicas
As FUVs aqui descritas compreendem os fosfolipídeos1,2 dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DOPC), l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfato (POPA) e dioleoiletilfosfatidilcolina (DOPC-E).A velocidade de fusão in vitro de FUVs às células (n=6 por tipo deFUV) foi determinada. Pequenas vesículas unilamelares compreendendoDOPC isoladamente, D0PC/D0PC-E ou D0PC/P0PA foram feitas em umasolução contendo carboxifluoresceína 1 mM. Células endoteliais daveia umbilical humana (HUVECs) foram incubadas com vesículascarregadas com carboxifluoresceína e a taxa de distribuição nodecorrer do tempo foi quantificada. Os resultados demonstraram que acinética da distribuição de carboxifluoresceína às células eraaltamente dependente da composição das vesículas lipídicas. Asvesículas de DOPC demonstraram uma taxa de distribuição logarítmicana qual pouca ou nenhum fusão foi observada nos primeiros 30 minutos.Esse tipo de taxa de distribuição é mais característico de endocitoseque a fusão. Ao contrário, DOPC/DOPC-E proporcionou uma taxa dedistribuição inicial muito mais rápida, porém uma taxa final maislenta. A taxa de distribuição mais rápida foi encontrada utilizandoFÜVs de DOPC/POPA, que demonstraram uma taxa de distribuiçãoexponencial na qual uma distribuição significativa decarbôxifluoresceína foi observada em 5 minutos. Esse tipo de taxa dedistribuição é característica de fusão e não de endocitose. Os trêstipos de vesículas foram capazes de realizar a coloração fluorescentedifuso de células em 60 minutos. A mistura de D0PC/P0PA atingiu umacoloração difusa completa em menos de 2 minutos.
Exemplo 2
Incorporação de Lipídios de Vesículas Fusogênicasem Membrana de Célula Endotelial Quando Perfundida In Vitro
Foram preparadas vesículas fusogênicas compostaspor DOPC/POPA e lipídios biotinilados (N-biotinoil-1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (BDGP); MolecularProbes, Eugene Oregon, E.U.A.) a uma razão de 1 fosfolipídeo deBDGP/5 fosfolipídeos de DOPC. Uma cultura celular de HUVEC foi entãoincubada com as vesículas fusogênicas por 60 minutos, a cultura foilavada 3 vezes, e então a cultura foi incubada com 1 ml de SAfluorescente (0,5 mg/ml) por 15 minutos. A cultura foi então lavadanovamente 3 vezes. Como controle, o mesmo protocolo foi seguido,porém os fosfolipídeos biotinilados não foram incorporados àsvesículas fusogênicas de D0PC/P0PA. Os resultados dos experimentosdemonstraram que após a lavagem, as células controle apresentarampouquíssima fluorescência em comparação às células brilhantes nogrupo tratado com FUVs biotiniladas. Esses resultados mostramclaramente que as pontes de biotina foram incorporadas na membranacelular das HUVECs e foram capazes de ligar SA fluorescente marcada.
Exemplo 3
Incorporação de Lipídios de Vesículas Fusogênicasem Membrana de Célula Endotelial Quando Perfundida In Vivo
A capacidade de as FUVs se fundirem com célulasendoteliais de microvasos foi avaliada utilizando DOPC/POPA e ofosfolipídeo 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(carboxifluoresceína) (DOPE-CF) fluorescente marcado. Utilizando umapreparação de músculo de rato cremaster isolada (pedículo simples) emicroscopia por vídeo fluorescente intravital, observou-se fusão deFUV a células endoteliais. Depois que o cremas ter foi isolado, osangue foi lavado com solução fisiológica e seguido por uma infusãode FUVs feita com DOPC/P0PA/D0PE-CF. Imediatamente após a infusão, opedículo de cremaster foi clampeado por 20 minutos. 0 microclamp foientão removido e o cremaster foi deixado reperfundir. Depois que asFUVs fluorescentes livres foram lavadas pelo fluxo sangüíneo, umaárvore microvascular fluorescente visível permaneceu, na qual asbordas dos vasos demonstraram um efeito halo, indicando que osfosfolipídeos fluorescentes se incorporaram nas membranas de célulasendoteliais. Após duas horas de reperfusão, a intensidade dafluorescência permaneceu inalterada, sugerindo a ocorrência de realfusão de FUVs à membrana celular em vez de apenas agregação nasuperfície da célula. Quando os tecidos foram seccionados eanalisados em microscopia fluorescente, o endotélio se projetouclaramente do tecido circunvizinho com coloração fluorescentedistinto do endotélio. Também, embora menos aparente, as fibrasmusculares em volta dos vasos foram coradas com fluorescência,indicando que as vesículas fusogênicas saíram da vasculatura em algumponto e se fundiram com as células em volta dos vasos.
Exemplo 4
Vesículas Fusogênicas Podem Ser Utilizadas paraLigar Moléculas Quiméricas à Superfície de Células Endoteliais InVivo por um Período de Pelo Menos 14 DiasRatos Wistar Furth (WF) foram anestesiados epreparados para a cirurgia. Os vasos femorais foram dissecados e aspatas traseiras foram separadas do corpo, com exceção dos ossos enervos (femoral e ciático). As artérias foram clampeadas e canuladas,e as veias foram clampeadas e separadas distalmente dos clamps. Apata foi lavada por 10 minutos com uma solução de Ringer lactatoheparinizada. A pata foi perfundida com 3 ml de solução de Ringerlactato e os vasos foram clampeados por 1 hora. Após 1 hora, a patafoi lavada por 10 minutos com solução de Ringer lactato e então apata foi perfundida com 1 ml de estreptavidina fluorescente (0,1 mg).
Após 15 minutos de incubação, a pata foi novamente lavada por 10minutos com solução de Ringer lactato. No Grupo Ia (controlenegativo), a artéria e veia femoral foram coletadas após a fixaçãocom formalina 5%. Os vasos foram cortados em 10 seções transversaiscom 5 mícrons de espessura e a intensidade da fluorescência foiquantificada. No Grupo Ib (controle negativo), os vasos foramreanastomosados e os músculos e pele da pata traseira foramreanexadas cirurgicamente. Os animais foram acompanhados por 14 dias.
Os animais foram então anestesiados, exsanguinados e perfundidos comuma solução de formalina 5%. Os vasos foram dissectados e cortados emseções transversais e analisados como no Grupo la.
Os Grupos 2a e 2b foram grupos controle parademonstrar que a estreptavidina não se liga ao endotélio que foiexposto às vesículas fusogênicas não biotiniladas. Os ratos forampreparados da mesma forma descrita acima para os Grupos Ia e lb,exceto pelo fato de que as patas foram perfundidas com 3 ml devesículas fusogênicas que contêm somente DOPC/POPA (sem BDPG). Osvasos foram clampeados. Após 1 hora, a pata foi lavada conformedescrito acima e perfundidas com 1 ml de estreptavidina fluorescente(0,1 mg). Após 15 minutos de incubação, a pata foi novamente lavada.A quantidade de fluorescência foi medida conforme acima descrito paraos Grupos la e lb. Pouquíssima fluorescência foi observada em ambosos grupos.
Os Grupos 3a e 3b foram os grupos experimentaispara demonstrar que a estreptavidina se liga ao endotélio que foiexposto a vesículas fusogênicas biotiniladas. Os ratos forampreparados conforme acima descrito para os Grupos Ia e Ib, excetopelo fato de que as patas foram perfundidas com 3 ml de vesículasfusogênicas. Os vasos foram clampeados. Após 1 hora, a pata foilavada conforme acima descrito e perfundida com 1 ml deestreptavidina fluorescente (0,1 mg). Após 15 minutos de incubação, apata foi lavada novamente. A quantidade de fluorescência foi medidaconforme acima descrito para os Grupos Ia e lb. Foi descoberta umadiferença notável entre os animais experimentais e os animais controle.
Esses achados fornecem evidências de que osfosfolipídeos biotinilados podem ser eficientemente integrados nasmembranas de células endoteliais com a ajuda de vesículasfusogênicas. Esses fosfolipídeos biotinilados podem ser utilizadoscomo pontes para funcionalizar o endotélio com estreptavidina (SA) eproteínas de fusão ou quiméricas baseadas em SA.
Exemplo 5
Otimização da Razão de Biotinilação
A quantidade ideal de biotina em vesículasfusogênicas foi determinada. As vesículas fusogênicas forampreparadas com vários níveis de biotinilação e foram determinadasvesículas capazes de incorporar a maior quantidade de fosfolipídeosbiotinilados nas células endoteliais cultivadas. As células HUVECforam preparadas em placas de Petri e incubadas a 37°C em CO2 5%. AsFUVs foram preparadas tendo as composições identificadas na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 78</column></row><table>
Peso Molecular do Fosfolipídeo: DOPC (786,1), POPA(696,92), BDGP (1019,45).
Três experimentos foram realizados em placas de 96poços revestidas com monocamadas de HUVEC. Em cada experimento, 4poços foram designados para cada uma das cinco formulações. Os demaispoços foram utilizados como controles. A monocamada de HUVEC foiexposta a 1 ml de vesículas fusogênicas preparadas de acordo com asformulações aqui descritas e incubada por 20, 40 e 60 minutos. Ascélulas foram lavadas 3 vezes com meio de HBSS e incubadas com 1 mlde estreptavidina fluorescente (Molecular Probes, Eugene, Oregon,E.U.A.)(0,1 mg/ml) por 15 minutos. As células foram lavadas novamente3 vezes. A quantidade de fluorescência por poço foi medida utilizandoum leitor de microplaca (Molecular Devices). O processo foi repetido3 vezes para estabelecer qual(ais) formulação(ões) foi(foram) maiseficiente(s) ao incorporar lipídios biotinilados nas membranas dascélulas endoteliais. Os resultados demonstraram que a composição de1/25 BDGP/DOPC proporcionou a maior cobertura de biotinilação quandoincubada por 40 minutos.
Exemplo 6
Otimização da Razão de Niquelação
A quantidade ideal de níquel nas vesículasfusogênicas pode ser determinada. As vesículas fusogênicas sãopreparadas com vários níveis de biotinilação e as vesículas capazesde incorporar a maior quantidade de fosfolipídeos biotinilados nascélulas endoteliais cultivadas são determinadas. As células HUVECpodem ser preparadas em placas de Petri e incubadas a 37°C em CO2 5%.As FUVs podem ser preparadas tendo as composições identificadas naTabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table>
Peso Molecular do Fosfolipídeo: DOPC (786,1), POPA(696,92), DOGSNTA-Ni (1.055,59)
Três experimentos são realizados em placas de 96poços revestidos com monocamadas de HUVEC. Em cada experimento, 4poços são designados para cada uma das cinco formulações. Os demaispoços foram utilizados como controles. A monocamada de HUVEC foiexposta a 1 ml de vesículas fusogênicas preparadas de acordo com asformulações aqui descritas e incubada por 1 hora. As células sãolavadas 3 vezes com meio de HBSS e incubadas com 1 ml de 6xHis (poli-histidina) GFP (proteína fluorescente verde [Qiagen]) (0,1 mg/ml) foimarcada por 15 minutos. As células são lavadas novamente 3 vezes. Aquantidade de fluorescência por poço é medida utilizando um leitor demicroplaca (Molecular Devices). 0 processo é repetido 3 vezes paraestabelecer qual(ais) formulação(ões) foi(foram) mais eficiente(s) aoincorporar lipídios biotinilados nas membranas das célulasendoteliais.
Exemplo 7
Os Polipeptídeos SA-FasL Quiméricos Mantêm aCapacidade de Ligação à Biotina da Estreptavidina Nativa
Para determinar se a SA-FasL pode ou não se ligaraos fosfolipídeos biotinilados em membranas endoteliais, as HUVECssão revestidas em placas de 96 poços e deixadas se tornar umamonocamada. Os experimentos são repetidos três vezes. Em cadaexperimento, 6 poços são designados a três formulações de FUVbiotinilada e os demais poços são utilizados como controles. Asmonocamadas de HUVEC são incubadas por 1 hora com FUVs biotiniladas.
Após a incubação, as células são lavadas 3 vezes e incubadas com 1 mlde SA-FasL (100 ng - P.M. 32 kDa) por 15 minutos. As células sãolavadas 3 vezes e são incubadas com anticorpo policlonal fluorescenteanti-FasL (Santa Cruz Biotech) por 20 minutos e lavadas 3 vezes. Aquantidade de fluorescência por poço é medida utilizando um leitor demicroplaca (Molecular Devices). Os resultados são analisadosestatisticamente e em comparação aos valores controle. Para oscontroles, as monocamadas de HUVEC são incubadas por 1 hora com HBSSbiotinilada, com vesículas não fusogênicas biotiniladas e com ambos.
Exemplo 8
Eficácia da SA-FasL Ligada
As células T ativadas que entram em contato comEstreptavidina-FasL (SA-FasL) ligadas em ponte aos fosfolipídeos emcélulas endoteliais podem sofrer apoptose. Em três gruposexperimentais, esplenócitos de ratos WF sensibilizados com ACI sãocoletados e expostos a células endoteliais ACI in vitro. A seguir, osesplenócitos de WF são separados e adotivamente transferidos para umrato nude receptor (PVG rnu/rnu) . 0 rato nude é então transplantadocom um retalho de pele vascularizada de ACI e a rejeição émonitorada.
O Grupo 1 é um grupo controle negativo. No dia -7,são injetados IO7 de esplenócitos de ACI em ratos ACI. No dia -4, osratos nude são transplantados com retalhos de pele de ACT na regiãodo pescoço. Também no dia -4, os esplenócitos são coletados dos ratosACI auto-sensibilizados e expostos em uma reação de co-cultura acélulas endoteliais de ACI. No dia O, os esplenócitos são isolados eavaliados quanto aos fenótipos apoptóticos utilizando PI e anexina V-FITC e, Citometria de Fluxo. Dez milhões (IO7) de esplenócitos sãoinjetados na veia peniana do rato nude receptor. O rato nude éacompanhado por 28 dias e as biópsias são realizadas no retalho depele nos dias O, 2, 7 e 14 pós-operatórios ou quando surgem sinais derejeição ou de doença enxerto versus hospedeiro (GVHD). No dia 28, osratos são submetidos a eutanásia e amostras do retalho de pele, bemcomo da língua, orelha, fígado e intestino delgado são coletadas.Este último serve para avaliar o potencial de desenvolvimento de GVHDnos ratos nude receptores. Nenhuma rejeição dos retalhos de pele deACI transplantados é esperada.
O Grupo 2 é um grupo controle positivo. No dia -7,são injetados IO7 de esplenócitos de ACI em ratos WF. No dia -4, osratos nude são transplantados com retalhos de pele de ACI na regiãodo pescoço. Também no dia -4, os esplenócitos são isolados dos ratosWF alosensibilizados e expostos em uma co-cultura a célulasendoteliais de ACI. No dia 0, os esplenócitos são coletados e IO7 sãoinjetados na veia peniana do rato nude receptor. Os ratos sãoacompanhados e sofrem eutanásia conforme acima descrito para o Grupo1. Espera-se forte rejeição dos retalhos de pele de ACItransplantados.
O Grupo 3 é o grupo experimental. No dia -7, saoinjetados IO7 de esplenócitos de ACI em ratos WF. No dia -4, os ratosnude são transplantados com retalhos de pele de ACI na região dopescoço. Também no dia -4, os esplenócitos são isolados dos ratos WFalosensibilizados e expostos em uma co-cultura a células endoteliaisde ACI que são revestidas com SA-FasL utilizando o procedimento aquidescrito. No dia O, os esplenócitos são coletados e IO7 deesplenócitos são injetados na veia peniana do rato nude receptor. Osratos são acompanhados e sofrem eutanásia conforme acima descritopara o Grupo 1.
Exemplo 9
A Perfusão com Vesículas Fusogênicas e SA-FasLRetarda ou Impede a Rejeição Imune de um Coração de RatoTransplantado
Um modelo de transplante cardíaco heterotópico derato é utilizado para determinar se o endotélio de um aloenxertocardíaco revestido com SA-FasL através de pontes de fosfolipídeobiotinilado é protegido contra a rejeição imune in vivo. 0 Grupo I éum grupo controle. Ratos WF e ACI são preparados e anestesiados nodia 0. Os corações são coletados dos doadores ACI, preparadosconforme anteriormente descrito, perfundidos com Ringer lactatogelado, clampeados, incubados por 1 hora e transplantadossubcutaneamente no pescoço de WF receptores. Os vasos utilizados paraanastomose são a artéria carótida e a veia jugular. Os receptores sãoacompanhados por 12 semanas. A rejeição é monitorada por palpação dopescoço e avaliação da existência de batimento cardíaco. Em 12semanas ou antes disso caso o coração seja rejeitado, os receptoressão submetidos a eutanásia e o sangue e corações são coletados paraestudos histológicos. Especificamente, o grau de rejeição do tecido ea presença de SA-FasL no endotélio são avaliados.
0 Grupo 2 é um grupo experimental. Os experimentossão realizados conforme descrito para o Grupo 1, com exceção dasolução utilizada para perfundir os corações de ACI. Em vez de Ringerlactato gelado conforme acima descrito, os corações no Grupo 2 sãoperfundidos com vesículas fusogênicas otimizadas compreendendolipídios biotinilados em Ringer lactato gelado. Após 1 hora deincubação, 1 ml de SA-FasL (100 ng) é infundido nas artériascoronarianas e o transplante do coração é concluído. Espera-se que oscorações transplantados no Grupo 2 sobrevivam por um períodoprolongado, enquanto os corações transplantados no Grupo 1 sejamtotalmente rejeitados em aproximadamente 9 dias.
Exemplo 10
Os Polipeptídeos 6xHis-VCP Possuem Capacidade deLigação ao Níquel
Esse Exemplo serve para determinar se a parcela dePoli-Histidina em um polipeptídeo quimérico 6xHis-VCP possui ou nãocapacidade de ligação ao níquel. São realizados experimentosutilizando HUVECs cultivadas. No total, doze grupos podem serutilizados. Os experimentos utilizam placas de 96 poços, nas quais 8poços são designados por grupo. Os experimentos são repetidos 3vezes. Um ensaio fluorimétrico baseado em células é utilizado paraquantificar o efeito do tratamento nos Grupos 2 a 12. Os Grupos 2 a 6são controles negativos e os Grupos 7 a 12 são grupos experimentaisnos quais células endoteliais niqueladas são tratadas com diferentesconcentrações de 6xHis-VCP. A cobertura percentual média de 6xHis-VCPpor célula é calculada. Grupo 1 (controle de contagem de células). 0Grupo 1 é utilizado para determinar o número de células por poço. Aofinal de cada experimento, o meio dos 96 poços é removido e as placassão congeladas. Após 24 horas, as placas são descongeladas e 200 mLde corante CyQUANT GRe/tampão de Iise celular (Molecular Probes) sãoadicionados aos poços do Grupo 1. As placas são então incubadas emambiente totalmente escuro por 5 minutos em temperatura ambiente. Afluorescência de cada poço é medida utilizando um leitor de placa noqual os filtros de excitação e emissão são ajustados em -480 nm e-520 nm, respectivamente. A fluorescência média dos 8 poços édeterminada e utilizada para calcular o número de células por poço apartir de uma curva padrão. Uma vez que todos os 96 poços em cadaplaca são semeados na mesma densidade celular, o Grupo 1 serve paraquantificar o número médio de células por poço.
Grupos 2 a 6. Os Grupos 2 a 6 são controlesnegativos e servem para determinar a ligação não específica de 6xHis-VCP às células sem pontes de níquel ou ligação não específica doanticorpo anti-VCP às células que não foram tratadas com SxHis-VCP-As células são incubadas com HBSS, FUVs não niqueladas ou Ni-FUVs.
Grupo 2 (nenhum controle de tratamento). As HUVECssão incubadas com HBSS por 30 minutos, lavadas três vezes com HBSS eincubadas com HBSS por mais 3 0 minutos. Ao final do período deincubação, um anticorpo anti-VCP primário (200 μΐι) é adicionado edeixado incubar por 30 minutos. Um anticorpo fluorescente secundárioé então adicionado e incubado por 15 minutos. A fluorescência équantificada. O Grupo 2 serve para medir a ligação não específica doanticorpo anti-VCP às HUVECs que não recebem Ni-FUVs ou 6xHis-VCP.Espera-se que as células no Grupo 2 exibam pouca ou nenhuma ligaçãodo anticorpo anti-VCP. Observa-se que embora sejam incubadas somentecom HBSS neste grupo, as células são lavadas em 30 minutos para expô-Ias ao mesmo procedimento experimental dos outros grupos.
Grupo 3 (ligação não específica de 6xHis-VCPcontrole). Os procedimentos experimentais para o Grupo 3 são osmesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que as HUVECs são incubadascom HBSS por 3 0 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com200 ML de uma solução de 100 ng/mL de 6xHis-VCP por 30 minutos. OGrupo 3 serve para medir a ligação não específica de 6xHis-VCP àsHUVECs. Espera-se que o Grupo 3 exiba pouca ou nenhuma ligação doanticorpo anti-VCP.
Grupo 4 (ligação não específica de anti-VCP àscélulas tratadas com FUVs controle). Os procedimentos experimentaispara o Grupo 4 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que asHUVECs são incubadas com 200 μΐ, de solução de FUV não niquelada por30 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com 200 μΙ> deHBSS por mais 30 minutos. O Grupo 3 serve para medir a ligação nãoespecífica de anti-VCP às HUVECs tratadas com FUVs não niqueladas.
Espera-se que o Grupo 4 exiba pouca ou nenhuma ligação do anticorpoanti-VCP.
Grupo 5 (ligação não específica de 6xHis-VCP àscélulas tratadas com FUVs controle). Os procedimentos experimentaispara o Grupo 5 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que asHUVECs são incubadas com 200 μΐι de solução de FUV não niquelada por30 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com 200 μΙ, de umasolução de 100 ng/ml de GxHis-VCP por mais 30 minutos. O Grupo 5serve para medir a ligação não específica de 6xHis-VCP às HUVECstratadas com FUVs não niqueladas e 6xHis-VCP- Espera-se que o Grupo 5exiba pouca ou nenhuma ligação do anticorpo anti-VCP.
Grupo 6 (ligação não específica de anti VCP àscélulas tratadas com Ni-FUVs controle). Os procedimentosexperimentais para o Grupo 6 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelofato de que as HUVECs são incubadas com solução de Ni-FUV por 30minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com HBSS por mais 30minutos. 0 Grupo 6 serve para medir a ligação não específica doanticorpo anti-VCP às HUVECs tratadas somente com Ni-FUVs. Espera-seque o Grupo 6 exiba pouca ou nenhuma ligação do anticorpo anti-VCP.
Grupos 7 a 12 (Grupos experimentais - ligaçãoespecífica de GxHis-VCP ao níquel). Os procedimentos experimentaispara os Grupos 7 a 12 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelo fato deque as HUVECs são incubadas com 2 00 μΐ, de solução de Ni-FUV por 3 0minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas por 30 minutos com200 ML de solução de 6xHis-VCP em uma das seguintes concentrações:100 pg/mL (grupo 7), 1 ng/mL (grupo 8), 10 ng/mL (grupo 9), 100 ng/mL(grupo 10), 1 Mg/mL (grupo 11) ou 10 Mg/mL (grupo 12). Esses gruposservem para determinar a concentração mínima de 6xHis-VCP exigidapara obter a máxima cobertura protéica das membranas celulares.
Exemplo 11
Construção da Proteína de Fusão Estreptavidina-VCP(SA-VCP)
0 polipeptídeo construído é uma fusão entre aproteína controle complementar de vaccinia (VCP) e a estreptavidina(SA) a partir de Streptomyces avidinii. O domínio VCP realiza amediação dos efeitos imunomodulatórios da proteína quimérica e odomínio SA é utilizado para direcionar a proteína às pontes debiotina no endotélio vascular. A proteína de fusão de SA-VCP foiconstruída no nível genético. O gene de fusão, contendo 865 pares debase de DNA, codifica a proteína de fusão contendo o domíniocatalítico VCP e o domínio de ligação SA. Inicialmente, as seqüênciasde genes que codificam os componentes constitucionais da proteína VCPe SA foram obtidas da base de dados GenBank da NCBI. Ao avaliar aviabilidade da ligação de fusão e das enzimas de restrição adequadaspara clonagem do vetor de expressão, 32 primers oligonucleotídeosforam solicitados à Invitrogen, Inc. Os primers compreendem quarentamers do tipo forward e reverso com uma sobreposição de 13 pares debase. Os primers foram irreversivelmente fosforilados com T4-polinucleotídeo quinase (PNK) em uma reação forward de 95% napreparação para ligação covalente. Nas subseqüentes reações em cadeiade ligase (LCR) utilizando Pfu DNA ligase, os segmentos desobreposição guiaram os primers para tratamento com calor e ligaçãona ordem correta ao longo das regiões flanqueadas por primers denucleotídeo específico. A PCR (com Taq polimerase) foi adicionalmenteutilizada para amplificar o produto da LCR para detecção poreletroforese.
Esse protocolo foi utilizado para sintetizar erecuperar os segmentos de comprimento de par de base correto paratoda a construção genética. As técnicas de PCR são utilizadas paraligar as quatro regiões de VCP em todo o comprimento da construção. 0arranjo de clonagem correto foi verificado por seqüenciamento de DNA.
A construção genética foi clonada em células de levedura Pischiapastoris utilizando o vetor pPIC9K comercialmente disponível(Invitrogen). Mediante a expressão, a proteína é coletada do meio decultura e purificado usando cromatografia de afinidade. A expressãoadequada da proteína quimérica e o processo de purificação foramverificados por análise Western Blot.
Exemplo 12
Qs Polipeptídeos SA-VCP Quiméricos Mantém aCapacidade de Ligação à Biotina da Estreptavidina Nativa
Esse Exemplo serve para determinar se aestreptavidina em um polipeptídeo SA-VCP quimérico mantêm ou não suacapacidade de ligação à biotina. São realizados experimentosutilizando HUVECs cultivadas. No total, doze grupos podem serutilizados. Os experimentos utilizam placas de 96 poços, nas quais 8poços são designados por grupo. Os experimentos são repetidos 3vezes. Um ensaio fluorimétrico baseado em células é utilizado paraquantificar o efeito do tratamento nos Grupos 2 a 12. Os Grupos 2 a 6são controles negativos e os Grupos 7 a 12 são grupos experimentaisnos quais células endoteliais biotiniladas são tratadas comdiferentes concentrações de SA-VCP. A cobertura percentual média deSA-VCP por célula é calculada. Grupo 1 (controle de contagem decélulas). 0 Grupo 1 é utilizado para determinar o número de célulaspor poço. Ao final de cada experimento, o meio dos 96 poços éremovido e as placas são congeladas. Após 24 horas, as placas sãodescongeladas e 200 mL de corante CyQUANT GR*/tampão de Iise celular(Molecular Probes) são adicionados aos poços do Grupo 1. As placassão então incubadas em ambiente totalmente escuro por 5 minutos emtemperatura ambiente. A fluorescência de cada poço é medidautilizando um leitor de placa no qual os filtros de excitação eemissão são ajustados em -480 nm e -520 nm, respectivamente. Afluorescência média dos 8 poços é determinada e utilizada paracalcular o número de células por poço a partir de uma curva padrão.Uma vez que todos os 96 poços em cada placa são semeados na mesmadensidade celular, o Grupo 1 serve para quantificar o número médio decélulas por poço.
Grupos 2 a 6. Os Grupos 2 a 6 são controlesnegativos e servem para determinar a ligação não específica de SA-VCPàs células sem ligações à biotina ou ligação não específica doanticorpo anti-VCP às células que não foram tratadas com SA-VCP. Ascélulas são incubadas com HBSS, FLVs não biotiniladas ou BioFLVs.
Grupo 2 (nenhum controle de tratamento). As HUVECssão incubadas com HBSS por 30 minutos, lavadas três vezes com HBSS eincubadas com HBSS por mais 30 minutos. Ao final do período deincubação, um anticorpo anti-VCP primário (200 μΐ,) é adicionado edeixado incubar por 30 minutos. Um anticorpo fluorescente secundárioé então adicionado e incubado por 15 minutos. A fluorescência équantificada. 0 Grupo 2 serve para medir a ligação não específica doanticorpo anti-VCP às HUVECs que não recebem BioFLVs ou SA-VCP.Espera-se que as células no Grupo 2 exibam pouca ou nenhuma ligaçãodo anticorpo anti-VCP. Observa-se que embora sejam incubadas somentecom HBSS neste grupo, as células são lavadas em 30 minutos para expô-las ao mesmo procedimento experimental dos outros grupos.
Grupo 3 (ligação não específica de SA-VCPcontrole) . Os procedimentos experimentais para o Grupo 3 são osmesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que as HUVECs são incubadascom HBSS por 30 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com200 ML de uma solução de 100 ng/mL de SA-VCP por 30 minutos. 0 Grupo3 serve para medir a ligação não específica de SA-VCP às HUVECs.
Espera-se que o Grupo 3 exiba pouca ou nenhuma ligação do anticorpoanti-VCP.
Grupo 4 (ligação não específica de anti-VCP àscélulas tratadas com FUVs controle). Os procedimentos experimentaispara o Grupo 4 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que asHUVECs são incubadas com 200 mL de solução de FUV não biotinilada por30 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com 2 00 mL deHBSS por mais 30 minutos. 0 Grupo 3 serve para medir a ligação nãoespecífica de anti-VCP às HUVECs tratadas com FUVs não biotiniladas.Espera-se que o Grupo 4 exiba pouca ou nenhuma ligação do anticorpoanti-VCP.
Grupo 5 (ligação não específica de SA-VCP àscélulas tratadas com FUVs controle). Os procedimentos experimentaispara o Grupo 5 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que asHUVECs são incubadas com 200 de solução de FUV não biotinilada por30 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com 200 μ1> de umasolução de 100 ng/ml de SA-VCP por mais 30 minutos. O Grupo 5 servepara medir a ligação não específica de SA-VCP às HUVECs tratadas comFUVs não biotiniladas e SA-VCP. Espera-se que o Grupo 5 exiba poucaou nenhuma ligação do anticorpo anti-VCP.
Grupo 6 (ligação não específica de anti VCP àscélulas tratadas com FUVs biotiniladas controle). Os procedimentosexperimentais para o Grupo 6 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelofato de que as HUVECs são incubadas com solução de FUVs biotiniladaspor 3 0 minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas com HBSS pormais 30 minutos. Grupo 6 serve para medir a ligação não específica doanticorpo anti-VCP às HUVECs tratadas somente com FUVs biotiniladas.
Espera-se que o Grupo 6 exiba pouca ou nenhuma ligação do anticorpoanti-VCP.
Grupos 7 a 12 (Grupos experimentais - ligaçãoespecífica de SA-VCP à biotina). Os procedimentos experimentais paraos Grupos 7 a 12 são os mesmos do Grupo 2, exceto pelo fato de que asHUVECs são incubadas com 200 ML de solução de FUV biotinilada por 30minutos, lavadas três vezes com HBSS e incubadas por 30 minutos com200 ML de solução de SA-VCP em uma das seguintes concentrações: 100pg/mL (grupo 7), 1 ng/mL (grupo 8), 10 ng/mL (grupo 9), 100 ng/mL(grupo 10), 1 Mg/mL (grupo 11) ou 10 Mg/mL (grupo 12) . Esses gruposservem para determinar a concentração mínima de SA-VCP exigida paraobter a máxima cobertura protéica das membranas celulares.
Exemplo 13
Construção da Proteína de Núcleo de Hirudina-Estreptavidina (HN-SA)
Esse exemplo descreve a construção de uma proteínaquimérica anti-trombótica projetada para funcionar com nossas FUVsbiotiniladas. A proteína construída é uma fusão entre HN natural dasaliva de sanguessuga e núcleo de estreptavidina (SA) de Streptomycesavidinii. 0 domínio HN pode mediar os efeitos anti-trombóticos daproteína quimérica e o domínio SA pode ser utilizado para direcionara proteína às ligações à biotina no endotélio vascular. A SA liga-sefirmemente à biotina, que pode ser eficientemente incorporada nasuperfície de células endoteliais vasculares pelas FUVs biotiniladasaqui reveladas. A proteína de fusão HN-SA pode ser construída aonível genético. Duas formas do gene, diferindo na ordem dos domíniosSA e HN, são criadas. Cada versão do gene tem aproximadamente 700pares de base de DNA de comprimento e contém tanto o domínio HN comoo domínio SA separados por um ligante flexível (um padrão (Gly4-Ser)3pode ser utilizado). As seqüências dos componentes HN e SA sãoreveladas na base de dados GenBank da NCBI. As seqüências decodificação podem ser otimizadas por códon para expressão ideal emPischia pastoris. Além disso, os sítios de restrição para troca dedomínios e conexão de toda a seqüência de codificação estãoincluídos. Após a síntese, ambos os genes de fusão HN-SA são clonadosem um vetor de expressão que contém elementos para expressão,integração genômica e seleção em Pischia. Após a transformação, osclones com os maiores níveis de expressão são escolhidos paraprodução da proteína. A expressão é determinada por análise Westernblot (utilizando anticorpos anti-SA). Mediante a expressão, aproteína HN-SA é coletada do sobrenadante e purificada porcromatografia de afinidade (também para o domínio SA). A função de HNde cada uma das duas proteínas de fusão é comparada com a HN do tiposelvagem. Depois que a HN-SA é purificada, várias concentrações daproteína de fusão ou da HN do tipo selvagem são misturadas em 1 ml desangue de rato recém coletado e o tempo de coagulação em ecarina(ECT) é medido utilizando um Cartão de Teste ECT (Pharmanetics Inc,Cary, Carolina do Norte, E.U.A.). As curvas geradas pelas duasdiferentes proteínas HN-SA e HN do tipo selvagem são comparadas entre si.
Exemplo 14
Construção de Hirudina-Poli-histidina (HN-6xHis)
Esse exemplo descreve a construção de uma proteínaquimérica anti-trombótica projetada para funcionar com as FUVsniqueladas aqui reveladas. A proteína construída é uma fusão entre HNnatural da saliva de sanguessuga e um peptídeo de seis poli-histidinas (6xHis). 0 domínio HN pode mediar os efeitos anti-trombóticos da proteína quimérica e o domínio His pode ser utilizadopara direcionar a proteína às pontes de níquel no endotélio vascular.A His liga-se firmemente ao níquel, que pode ser eficientementeincorporado na superfície de células endoteliais vasculares pelasFUVs niqueladas aqui reveladas. A proteína de fusão HN-6xHis pode serconstruída ao nível genético. Duas formas do gene, diferindo na ordemda 6xHis e do domínio HN, podem ser criadas. 0 gene HN-6xHis temaproximadamente 220 pares de base de DNA de comprimento e contémtanto o domínio HN como o domínio 6xHis que, em alguns casos, éseparado por um ligante flexível (um padrão (Gly4-Ser)3 · seráinicialmente utilizado). As seqüências para HN são reveladas na basede dados GenBank da NCBI. As seqüências de codificação podem serotimizadas por códon para expressão ideal em Pischia pastoris. Alémdisso, os sítios de restrição para troca de domínios e conexão detoda a seqüência de codificação estão incluídos. Após a síntese,ambos os genes de fusão HN-6xHis são clonados em um vetor deexpressão que contém elementos para expressão, integração genômica eseleção em Pischia. Após a transformação, os clones com os maioresníveis de expressão são escolhidos para produção da proteína. Aexpressão é determinada por análise Western blot (utilizandoanticorpos anti-His). Mediante a expressão, a proteína HN-6xHis écoletada do sobrenadante e purificada por cromatografia de afinidade(também para o domínio His) . A função de HN de cada uma das duasproteínas de fusão construídas é comparada com a HN do tipo selvagem.Depois que a HN-6xHis é purificada, várias concentrações da proteínade fusão ou da HN do tipo selvagem são misturadas em 1 ml de sanguede rato recém coletado e o tempo de coagulação em ecarina (ECT) émedido utilizando um Cartão de Teste ECT (Pharmanetics Inc). Ascurvas geradas pelas duas diferentes proteínas HN-6xHis e HN do tiposelvagem são comparadas entre si.
Exemplo 15
Determinação da Cinética de Ligação de HN-SA àsPontes de Biotina
Nesses experimentos, a cinética de ligação de HN-SAàs pontes de biotina é quantificada. As mínimas concentrações de HN-SA exigidas para atingir a máxima cobertura de célula protéica sãoquantificadas quando o número máximo de pontes de biotina é exibidona superfície das HUVECs cultivadas. Seis grupos experimentais podemser incluídos. Os experimentos utilizam placas de 96 poços, nas quais8 poços são designados por grupo. As HUVECS são biotiniladasutilizando FUVs biotiniladas feitas com uma combinação de DOPC, POPA,e 1, 2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil)(BDPG). Em cada grupo experimental, as HUVECs são tratadas comdiferentes concentrações de HN-SA. Um ensaio fluorimétrico baseado emcélulas é utilizado para quantificar a HN-SA ligada às células. Acobertura percentual média de HN-SA por célula é calculada. Váriosgrupos controle são incluídos para determinar a ocorrência dequalquer ligação não específica de HN-SA a HUVECs não biotiniladas oude anticorpo anti-HN a células não tratadas. Em cada experimento, 8poços são utilizados para calcular o número médio de células por poçoutilizando o kit de ensaio de proliferação celular CyQUANTe(Molecular Probes). Os experimentos são repetidos em triplicata. AsHUVECs são incubadas por 3 0 minutos com uma solução de FUVbiotinilada. As células são então lavadas e incubadas por mais 30minutos com solução de HN-SA em uma das seguintes concentrações: 100pg/mL (Grupo 1), 1 ng/mL (Grupo 2), 10 ng/mL (Grupo 3), 100 ng/mL(Grupo 4), 1 ]ig/mh (Grupo 5) ou 10 ug/mL (Grupo 6). Esses gruposservirão para determinar a concentração mínima de HN-SA exigida paraobter a máxima cobertura protéica das membranas celulares. Os Grupos7, 8 e 9 são controles negativos. 0 Grupo 7 mede a ligação nãoespecífica do anticorpo anti-HN às HUVECs que não recebem BioFLVs ouHN-SA. As células são incubadas somente com HBSS e então comanticorpos monoclonais anti-HN (mAb) marcados com FITC. 0 Grupo 8mede a ligação não específica de HN-SA às HUVECs não biotiniladas. Ascélulas são incubadas somente com solução de HN-SA e então com anti-HN mAb marcado com FITC. 0 Grupo 9 mede a ligação não específica deHN-SA às HUVECs tratadas com FLVs não biotiniladas. As células sãotratadas com FLVs não biotiniladas e então com solução de HN-SA. Aseguir, as células são incubadas com anti-HN mAb marcado com FITC.
Exemplo 16
Eficácia Anti-Trombotica da Exibição de HN-SA
As veias femorais são tratadas no dia 1 com osníveis máximos de FUVs biotiniladas e HN-SA da mesma forma descritaacima. Após a administração da terapia, as veias são reparadas e ossegmentos tratados são marcados com duas suturas. A pele é fechada eos animais se recuperam da anestesia. Sete, 14, 21 ou 3 0 dias após otratamento, a formação de trombo após uma lesão por "pinçamento" outratamento com cloreto férrico é quantificada em diferentes grupos deanimais. Para determinar a completa oclusão do vaso, uma sonda comDoppler é colocada na extremidade proximal do trontoo para monitorar ofluxo sangüíneo. Todos os estudos são conduzidos com ratos Sprague-Dawley anestesiados com isoflurano inalatório (2 a 5%) . 0 desenhoexperimental para estudos de eficácia aguda de várias concentraçõesde HN-SA exibidas consiste em 2 tratamentos (FUVs biotiniladas e FUVsnão biotiniladas) χ 3 tempos de exposição χ 2 concentrações devesícula χ 1 concentração de HN-SA = 12 grupos experimentais. 0desenho experimental para os estudos de longevidade efetiva de HN-SAexibida consiste em 2 tratamentos (FUVs biotiniladas e FUVs nãobiotiniladas) χ 4 tempos de avaliação (7, 14, 21 e 30 dias) χ 1 tempode exposição χ 1 concentração de vesícula χ 1 concentração de HN-SA =8 grupos experimentais. Durante os estudos de formação de trombo, apressão arterial dos ratos, a freqüência cardíaca, a respiração e atemperatura são monitoradas. Ao final de cada experimento, os animaissofrem eutanásia e são perfundididos sistemicamente com formalina 5%para fixar por pressão todos os tecidos. As veias femorais tratadas econtra-Iaterais são coletadas para análise histológica eimunohistoquímica.
Exemplo 17
Construção de Ativador de Plasminogênio Uroquinasede Tecido Humano-Poli-Histidina (UK-6xHis)
Esse exemplo descreve a construção de uma proteínaquimérica trombolítica projetada para funcionar com as FUVsniqueladas aqui reveladas. A construção envolve um vetor de ácidonucléico capaz de alta expressão de uma proteína ativadora deplasminogênio uroquinase (UK) de tecido humano e de um peptídeo deseis poli-histidinas (6xHis). O vetor de ácido nucléico incluifragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA que codificam umaUK de tecido humano e um marcador selecionável amplificável dominanteligado de forma operacional a uma ou mais seqüências regulatórias. Asseqüências regulatórias controlam a expressão de uma transcrição demRNA que inclui quadros de leitura. As seqüências regulatóriasincluem promotores, intensificadores e outros elementos de controlede expressão. 0 vetor de expressão é projetado para expressar a UKhumana em uma célula hospedeira de mamífero. São utilizados ospromotores derivados de Adenovírus 2 ou citomegalovírus comumenteempregados. 0 ácido nucléico vetor pode ser introduzido nas célulashospedeiras utilizando técnicas de transformação convencional ou detransfecção utilizadas para introduzir ácido nucléico estranho em umacélula hospedeira incluindo fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio,lipofecção ou eletroporação. O domínio UK da proteína mediará osefeitos trombolíticos da proteína quimérica e o domínio 6xHis seráutilizado para direcionar a proteína às pontes de níquel no endotéliovascular. A 6xHis se liga firmemente ao níquel, que pode sereficientemente incorporado na superfície de células endoteliaisvasculares pelas FUVs niqueladas. A proteína de fusão UK-SxHis éconstruída com a 6xHis ligada tanto ao N-terminal como ao C-terminalpor um ligante flexível (o padrão (Gly4-Ser)3). Duas formas do gene,diferindo na ordem dos domínios 6xHis e UK, são criadas. 0 gene UK-6xHis tem aproximadamente 1850 pares de base de DNA de comprimento econtém tanto o domínio UK como o domínio 6xHis. A seqüência para UK érevelada na base de dados GenBank da NCBI. As seqüências decodificação são otimizadas por códon para expressão ideal em célulasde ovário de hamster chinês (CHO) (a saber, DG44 ou DXB11) . Alémdisso, os sítios de restrição para troca de domínios e conexão detoda a seqüência de codificação estão incluídos. Após atransformação, os clones com os maiores níveis de expressão sãoescolhidos para produção da proteína. A expressão é determinada poranálise Western blot (utilizando anticorpos anti-His). Mediante aexpressão, a proteína UK-6xHis é coletada das células de CHO lisadase purificada por cromatografia em coluna. A função de UK de cada umadas duas proteínas de fusão construídas é comparada com a UK natural.
Depois que as duas proteínas UK-6xHis são purificadas, a atividadefibrinolítica é medida utilizando o ensaio de placa de fibrina-ágar ecomparada com a UK comercialmente disponível. Os reagentes defibrina-ágar são preparados em um tampão de fosfato da Dulbecco. ATPA protease é incubada nas placas de fibrina-ágar por 48 horas emconcentrações variando de 0,5 a 5,0 μ9/πΛ. Trombina (36 unidades/mLem tampão PBS) é misturada com plasminogênio (2,5 unidades/mL emtampão PBS) a 47°C. ME-Agarose 15 mL (5,3 mg/ml em tampão PBS) éadicionada e acompanhada pela adição de 5 ml de fibrinogênio (11mg/ml em tampão PBS) para cada 3 0 mL de placa Falcon. Vários pluguesde 3 mm são feitos nas placas e soluções de teste contendo 10 μΐ, decontrole e soluções de teste são adicionadas a cada plugue. As placassão colocadas em uma caixa umidificada e as soluções deixadas incubarpor 48 horas. Os diâmetros das zonas líticas são medidos para cadaamostra. Uma curva padrão é construída utilizando o diâmetro de umazona lítica produzida pelas soluções TPA controle e plotada contra asunidades de atividade das diluições. A curva padrão é então utilizadapara determinar a atividade e a quantidade de uma amostra de UK-6xHis.
Exemplo 18
Eficácia Anti-Trombótica da Exibição de UK-6xHis
As veias femorais são tratadas no dia 1 com osníveis máximos de FUVs niqueladas e UK-6xHis. Após a administração daterapia, as veias são reparadas e os segmentos tratados são marcadoscom duas suturas. A pele é fechada e os animais se recuperam daanestesia. Sete, 14, 21 ou 30 dias após o tratamento, a formação detrombo após uma lesão por «pinçamento" ou tratamento com cloretoférrico é quantificada em diferentes grupos de animais. Paradeterminar a completa oclusão do vaso, uma sonda com Doppler écolocada na extremidade proximal do trombo para monitorar o fluxosangüíneo. Todos os estudos são conduzidos com ratos Sprague-Dawleyanestesiados com isoflurano inalatório (2 a 5%). 0 desenhoexperimental para estudos de eficácia aguda de várias concentraçõesde UK-6xHis exibidas consiste em 2 tratamentos (FUVs niqueladas eFUVs não niqueladas) χ 3 tempos de exposição χ 2 concentrações devesícula χ 1 concentração de UK-6xHis = 12 grupos experimentais. 0desenho experimental para os estudos de longevidade efetiva de UK-6xHis exibida consiste em 2 tratamentos (FUVs niqueladas e FUVs nãoniqueladas) χ 4 tempos de avaliação (7, 14, 21 e 30 dias) χ 1 tempode exposição χ 1 concentração de vesícula χ 1 concentração de UK-6xHis = 8 grupos experimentais. Durante os estudos de formação detrombo, a pressão arterial dos ratos, a freqüência cardíaca, arespiração e a temperatura são monitoradas. Ao final de cadaexperimento, os animais sofrem eutanásia e são perfundididossistemicamente com formalina 5% para fixar por pressão todos ostecidos. As veias femorais tratadas e contra-laterais serão coletadaspara análise histológica e imunohistoquímica.
Deve ser compreendido que diversos detalhes damatéria ora revelada podem ser alterados sem sair do escopo damatéria. Além disso, a descrição acima tem propósito apenasilustrativo e não limitativo.

Claims (61)

1. Vesícula lipídica, compreendendo um lipídiofuncionalizado compreendendo uma parcela de ligação tendo afinidadede ligação por uma parte de ligante de um agente ativo, caracterizadapelo fato de que a parcela de ligação é selecionada a partir do grupoconsistindo em biotina, um íon de metal de transição, tiol,maleimida, amina e ácido carboxílico.
2. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o lipídiofuncionalizado compreende um fosfolipídeo ou ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético] succinil} .
3. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o lipídiofuncionalizado compreende ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5 -amino-1-carboxipentil)iminodiacético]succinil} e a parcela de ligaçãoé níquel.
4. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo é umafosfoetanolamina.
5. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a parte de ligante doagente ativo é selecionada a partir do grupo consistindo em umaestreptavidina, avidina, poli-histidina, um grupo cisteína tiol, umgrupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminalpeptídico.
6. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é umamolécula terapêutica selecionada a partir do grupo consistindo em umamolécula de indução de apoptose de células T, um inibidorcomplementar, uma molécula de bloqueio coestimulatória de células T1um inibidor de infiltração de leucócitos, um inibidor de hiperplasianeointimal, um anticoagulante e um trombolítico.
7. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a moléculaterapêutica é selecionada a partir do grupo consistindo em FasL,receptor-1 de fator de necrose tumoral (TNF), receptor DR4 de ligantede indução de apoptose relacionada a TNF (TRAIL) , receptor DR5 deTRAIL, proteína de controle complementar de vírus para vacina (VCP) ,receptor complementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento(DAF), compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares(SPICE), proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4) ,anti-CD40L, hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena,inibidores de trombina de molécula pequena, inibidor 9.3tC deaptâmero de fator IXa, uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual(tPA), metaloproteinases de matriz (MMP), receptores duirny deneuropeptídeo Y (NPY) e glicoproteínas ou proteoglicanos naturais ousintéticos.
8. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a vesícula lipídica éIiofilizada.
9. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a vesícula lipídicacompreende:(a) um fosfolipídeo que é um formador de vesículaestável; e(b) pelo menos um membro de formação de vesículainstável, onde o membro de formação de vesícula instável éselecionado a partir do grupo consistindo em um lipídio polar que nãoé um formador de vesícula estável, um PEG, um formador de domíniotipo "raft" e uma proteína de fusão.
10. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a vesícula lipídicapossui uma razão entre formador de vesícula estável e lipídiofuncionalizado de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 500:1.
11. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo, queé um formador de vesícula estável, é 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), i-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PDPC), fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina deovo, ou uma mistura destes.
12. Vesícula lipídica, de acordo com areivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o membro de formaçãode vesícula instável é um lipídio polar de' formação de vesículainstável selecionado a partir do grupo consistindo em l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato (POPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOPC-e), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina(DOPE), 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3- [fosfo-l-serina] (DOPS), umaesfingomielina, 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, l-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-3-trimetilamÔnio-propano(DOTAP) e 1, 2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP) .
13. Célula revestida, compreendendo um lipídiofuncionalizado que compreende uma parcela de ligação, caracterizadapelo fato de que a parcela de ligação é ligada a uma parte de ligantede um agente ativo, e onde a parcela de ligação é selecionada apartir do grupo consistindo em biotina, um íon de metal de transição,maleimida, tiol, amina e ácido carboxílico.
14. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a célula revestida é uma célulaendotelial de um tecido ou órgão.
15. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a célula revestida é revestida comdiversas moléculas terapêuticas diferentes.
16. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o lipídio funcionalizadocompreende um fosfolipídeo ou ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{ [N(5-amino-1-carboxipent i1)iminodiacético]succinil}.
17. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o lipídio funcionalizadocompreende ácido 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil} e uma parcela de ligação éníquel.
18. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o fosfolipídeo é umafosfoetanolamina.
19. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a parte de ligante do agente ativoé selecionada a partir do grupo consistindo em estreptavidina,avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteína tiol, um grupocarboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico.
20. Célula revestida, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o agente ativo é uma moléculaterapêutica selecionada a partir do grupo consistindo em uma moléculade indução de apoptose de células T, um inibidor complementar, umamolécula de bloqueio coestimulatória de células T, um inibidor deinfiltração de leucócitos, um inibidor de hiperplasia neointimal, umanticoagulante e um trombolítico.
21. Célula revestida, de acordo com a reivindicação-46, caracterizada pelo fato de que a molécula terapêutica éselecionada a partir do grupo consistindo em FasL, receptor-1 defator de necrose tumoral (TNF), receptor DR4 de ligante de indução deapoptose relacionada a TNF (TRAIL), receptor DR5 de TRAIL, proteínade controle complementar de vírus para vacina (VCP), receptorcomplementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento (DAF),compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares (SPICE) ,proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4), anti-CD40L,hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena, inibidoresde trombina de molécula pequena, inibidor 9.3tC de aptâmero de fatorIXa, uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual (tPA),metaloproteinases de matriz (MMP), receptores duimy de neuropeptídeoY (NPY) e glicoproteínas ou proteoglicanos naturais ou sintéticos.
22. Kit para revestir uma membrana celular com umagente ativo, o kit caracterizado pelo fato de que compreende:(a) uma vesícula lipídica compreendendo um lipídiofuncionalizado compreendendo uma parcela de ligação tendo afinidadede ligação por uma parte de ligante de um agente ativo; e(b) o agente ativo compreendendo a parte deligante.
23. Kit, de acordo com a reivindicação 61,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica está contida em umprimeiro recipiente e o agente ativo está contido em um segundorecipiente.
24. Método de revestimento de uma membrana celularcom um agente ativo, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) contato de uma célula com uma vesícula lipídicacompreendendo um lipídio funcionalizado compreendendo uma parcela deligação tendo afinidade de ligação por uma parte de ligante de umagente ativo, caracterizado pelo fato de que a parcela de ligação éselecionada a partir do grupo consistindo em biotina, um íon de metalde transição, maleimida, tiol, amina e ácido carboxílico; e(b) contato da célula com o agente ativocompreendendo a parte de ligante, onde a parte de ligante liga aparcela de ligação.
25. Método, de acordo com a reivindicação 64,caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de um tecido ouórgão.
26. Método, de acordo com a reivindicação 66,caracterizado pelo fato de que o tecido ou órgão é perfundido com umaprimeira composição compreendendo a vesícula lipídica e uma segundacomposição compreendendo o agente ativo.
27. Método, de acordo com a reivindicação 64,caracterizado pelo fato de que a membrana celular é revestida comdiversos agentes ativos diferentes.
28. Método, de acordo com a reivindicação 64,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado compreende umfosfolipídeo ou ácido 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil) iminodiacético]succinil}.
29. Método, de acordo com a reivindicação 70,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado compreendecido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[Ν(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil} e a parcela de ligação éníquel.
30. Método, de acordo com a reivindicação 70,caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo é uma fosfoetanolamina.
31. Método, de acordo com a reivindicação 64,caracterizado pelo fato de que a parte de ligante do agente ativo éselecionada a partir do grupo consistindo em estreptavidina, avidina,uma poli-histidina, um grupo cisteína tiol, um grupo carboxila Ο-terminal peptídico e um grupo amino N-terminal peptídico.
32. Método, de acordo com a reivindicação 64,caracterizado pelo fato de que o agente ativo é uma moléculaterapêutica selecionada a partir do grupo consistindo em uma moléculade indução de apoptose de células T, um inibidor complementar, umamolécula de bloqueio coestimulatória de células T, um inibidor deinfiltração de leucócitos, um inibidor de hiperplasia neointimal, umanticoagulante e um trombolítico.
33. Método, de acordo com a reivindicação 75,caracterizado pelo fato de que a molécula terapêutica é selecionada apartir do grupo consistindo em FasL, receptor-1 de fator de necrosetumoral (TNF), receptor DR4 de ligante de indução de apoptoserelacionada a TNF (TRAIL), receptor DR5 de TRAIL, proteína decontrole complementar de vírus para vacina (VCP), receptorcomplementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento (DAF),compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares (SPICE),proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4) , anti-CD40L,hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena, inibidoresde trombina de molécula pequena, inibidor 9.3tC de aptâmero de fatorIXa, uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual (tPA),metaloproteinases de matriz (MMP) , receptores duirimy de neuropeptídeoY (NPY) e glicoproteínas ou proteoglicanos naturais ou sintéticos.
34. Método, de acordo com a reivindicação 64,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica compreende:(a) um fosfolipídeo que é um formador de vesículaestável; e(b) pelo menos um membro de formação de vesículainstável, onde o membro de formação de vesícula instável éselecionado a partir do grupo consistindo em um lipídio polar que nãoé um formador de vesícula estável, um PEG, um formador de domíniotipo "raft" e uma proteína de fusão.
35. Método, de acordo com a reivindicação 79,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica tem uma razãoentre o formador de vesícula estável e o lipídio funcionalizado deaproximadamente 1:1 a aproximadamente 500:1.
36. Método, de acordo com a reivindicação 79,caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo, que é um formador devesícula estável, é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) , 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PDPC),fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de ovo, ou uma misturadestes.
37. Método, de acordo com a reivindicação 79,caracterizado pelo fato de que o membro de formação de vesículainstável é um lipídio polar de formação de vesícula instávelselecionado a partir do grupo consistindo em l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3- fosfato (POPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina(DOPC-e), l,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-l-serina] (DOPS) , uma esfingomielina,-1,2-dimiristoil-sn-glicerol, l-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP).
38. Método de inibição da rejeição de um tecido ouórgão transplantado em um indivíduo, compreendendo:(a) contato do tecido ou órgão com uma primeiracomposição compreendendo uma vesícula lipídica, caracterizado pelofato de que a vesícula lipídica compreende um lipídio funcionalizadoque compreende uma parcela de ligação tendo afinidade de ligação poruma parte de ligante de uma molécula terapêutica, onde a parcela deligação é selecionada a partir do grupo consistindo em biotina, umíon de metal de transição, maleimida, tiol, amina e ácidocarboxílico; e(b) contato do tecido ou órgão com uma segundacomposição compreendendo a molécula terapêutica que compreende aparte de ligante, onde a parte de ligante liga a parcela de ligação.
39. Método, de acordo com a reivindicação 110,caracterizado pelo fato de que o tecido ou órgão entra em contato coma primeira e segunda composições antes do transplante no indivíduo.
40. Método, de acordo com a reivindicação 110,caracterizado pelo fato de que a parcela de ligação é ligada de formanão covalente a uma parte de ligante da molécula terapêutica.
41. Método, de acordo com a reivindicação 110,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado compreende umfosfolipídeo ou ácido 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil}.
42. Método, de acordo com a reivindicação 113,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado compreendeácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil} e a parcela de ligação éníquel.
43. Método, de acordo com a reivindicação 113,caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo é uma fosfoetanolamina.
44. Método, de acordo com a reivindicação 110,caracterizado pelo fato de que a parte de ligante da moléculaterapêutica é selecionada a partir do grupo consistindo emestreptavidina, avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteína tiol,um grupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminalpeptídico.
45. Método, de acordo com a reivindicação 110,caracterizado pelo fato de que a molécula terapêutica é selecionada apartir do grupo consistindo em uma molécula de indução de apoptose decélulas T, um inibidor complementar, uma molécula de bloqueiocoestimulatória de células T, um inibidor de infiltração deleucócitos, um inibidor de hiperplasia neointimal, um anticoagulantee um trombolítico.
46. Método, de acordo com a reivindicação 118,caracterizado pelo fato de que a molécula terapêutica é selecionada apartir do grupo consistindo em FasL, receptor-1 de fator de necrosetumoral (TNF), receptor DR4 de ligante de indução de apoptoserelacionada a TNF (TRAIL), receptor DR5 de TRAIL, proteína decontrole complementar de vírus para vacina (VCP) , receptorcomplementar 1 (CRI), fator de aceleração do decaimento (DAF),compstatina, inibidor de varíola de enzimas complementares (SPICE) ,proteína 4 citotóxica associada ao linfócito T (CTLA-4), anti-CD40L,hirudina, inibidores de Xa de fator de molécula pequena, inibidoresde trombina de molécula pequena, inibidor 9.3tC de aptâmero de fatorIXa, uroquinase, ativador de plasminogênio tecidual (tPA),metaloproteinases de matriz (MMP), receptores dummy de neuropeptídeoY (NPY) e glicoproteínas ou proteoglicanos naturais ou sintéticos.
47. Método, de acordo com a reivindicação 110,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica compreende:(a) um fosfolipídeo que é um formador de vesículaestável; e(b) pelo menos um membro de formação de vesículainstável, onde o membro de formação de vesícula instável éselecionado a partir do grupo consistindo em um lipídio polar que nãoé um formador de vesícula estável, um PEG, um formador de domíniotipo "raft" e uma proteína de fusão.
48. Método, de acordo com a reivindicação 122,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica tem uma razãoentre o formador de vesícula estável e o lipídio funcionalizado deaproximadamente 1:1 a aproximadamente 500:1.
49. Método, de acordo com a reivindicação 122,caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo, que é um formador devesícula estável, é 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) , 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PDPC),fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de ovo, ou uma misturadestes.
50. Método, de acordo com a reivindicação 122,caracterizado pelo fato de que o membro de formação de vesículainstável é um lipídio polar de formação de vesícula instávelselecionado a partir do grupo consistindo em l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato (POPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina(DOPC-e), l, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[fosfo-l-serina] (DOPS), uma esfingomielina,-1,2-dimiristoil-sn-glicerol, l-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP).
51. Método de inibição de lesão de isquemia-reperfusão em um tecido ou órgão, compreendendo.-(a) contato do tecido ou órgão com uma primeiracomposição compreendendo a vesícula lipídica, caracterizado pelo fatode que a vesícula lipídica compreende um lipídio funcionalizado quecompreende uma parcela de ligação tendo afinidade de ligação por umaparte de ligante de uma molécula terapêutica, onde a parcela deligação é selecionada a partir do grupo consistindo em biotina, umíon de metal de transição, maleimida, tiol, amina e ácido-carboxílico; e(b) contato do tecido ou órgão com uma segundacomposição compreendendo a molécula terapêutica que compreende aparte de ligante, onde a parte de ligante liga a parcela de ligação.
52. Método, de acordo com a reivindicação 150,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado compreende umfosfolipídeo ou ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-l-carboxipentil)iminodiacético]succinil}.
53. Método, de acordo com a reivindicação 152,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado compreendecido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[N(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético]succinil} e a parcela de ligação éníquel.
54. Método, de acordo com a reivindicação 152,caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo é uma fosfoetanolamina.
55. Método, de acordo com a reivindicação 150,caracterizado pelo fato de que o lipídio funcionalizado quecompreende a parcela de ligação é selecionado a partir do grupoconsistindo em 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil), l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) e 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil).
56. Método, de acordo com a reivindicação 150,caracterizado pelo fato de que a parte de ligante da moléculaterapêutica é selecionada a partir do grupo consistindo emestreptavidina, avidina, uma poli-histidina, um grupo cisteína tiol,um grupo carboxila C-terminal peptídico e um grupo amino N-terminalpeptídico.
57. Método, de acordo com a reivindicação 150,caracterizado pelo fato de que a molécula terapêutica é selecionada apartir do grupo consistindo em proteína de controle complementar devírus para vacina (VCP), receptor complementar 1 (CRI), fator deaceleração do decaimento (DAF), inibidor de varíola de enzimascomplementares (SPICE), compstatina, FUT-175, composto 4077, Cls-INH-248, composto 53, hirudina, inibidores de Xa de fator de moléculapequena, inibidores de trombina de molécula pequena, inibidor 9.3tCde aptâmero de fator IXa, uroquinase, ativador de plasminogêniotecidual (tPA) e metaloproteinases de matriz (MMP).
58. Método, de acordo com a reivindicação 150,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica compreende:(a) um fosfolipídeo que é um formador de vesículaestável; e(b) pelo menos um membro de formação de vesículainstável, onde o membro de formação de vesícula instável éselecionado a partir do grupo consistindo em um lipídio polar que nãoé um formador de vesícula estável, um PEG, um formador de domíniotipo "raft" e uma proteína de fusão.
59. Método, de acordo com a reivindicação 163,caracterizado pelo fato de que a vesícula lipídica tem uma razãoentre o formador de vesícula estável e o lipídio funcionalizado deaproximadamente 1:1 a aproximadamente 500:1.
60. Método, de acordo com a reivindicação 163,caracterizado pelo fato de que o fosfolipídeo, que é um formador devesícula estável, is 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-docosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PDPC),fosfatidilcolina de soja, fosfatidilcolina de ovo, ou uma misturadestes.
61. Método, de acordo com a reivindicação 163,caracterizado pelo fato de que o membro de formação de vesículainstável é um lipídio polar de formação de vesícula instávelselecionado a partir do grupo consistindo em l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfato (POPA), 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina(DOPC-e), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- [fosfo-l-serina] (DOPS), uma esfingomielina,1,2-dimiristoil-sn-glicerol, l-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP).
BRPI0613185-9A 2005-04-29 2006-05-01 revestimento de superfìcie celular com agentes ativos BRPI0613185A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67604905P 2005-04-29 2005-04-29
US60/676,049 2005-04-29
PCT/US2006/016480 WO2006119121A2 (en) 2005-04-29 2006-05-01 Cell-surface decoration with active agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0613185A2 true BRPI0613185A2 (pt) 2010-12-21

Family

ID=37308558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0613185-9A BRPI0613185A2 (pt) 2005-04-29 2006-05-01 revestimento de superfìcie celular com agentes ativos

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20090202621A1 (pt)
EP (1) EP1877038B1 (pt)
JP (1) JP5264478B2 (pt)
AU (1) AU2006242354B2 (pt)
BR (1) BRPI0613185A2 (pt)
CA (1) CA2605863C (pt)
NZ (1) NZ562946A (pt)
WO (1) WO2006119121A2 (pt)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110008343A1 (en) * 2007-06-08 2011-01-13 Lambris John D Method Of Reducing Tissue Loss In Pancreatic Islet Cell Transplantation
ES2326458B1 (es) * 2008-04-04 2010-07-26 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) (85%) Compuestos fluorescentes para diagnostico de infecciones, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones.
MX2012010810A (es) 2010-03-19 2013-02-07 Massachusetts Inst Technology Composiciones de vesícula de lípido y métodos de uso.
US9149432B2 (en) 2010-03-19 2015-10-06 Massachusetts Institute Of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
WO2011123525A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-06 The Regents Of The University Of California Forming an artificial cell with controlled membrane composition, asymmetry and contents
US10460998B2 (en) 2010-11-09 2019-10-29 Nikon Corporation Method for inspecting substrate, substrate inspection apparatus, exposure system, and method for producing semiconductor device
US9132025B2 (en) 2012-06-15 2015-09-15 Trivascular, Inc. Bifurcated endovascular prosthesis having tethered contralateral leg
US9500639B2 (en) * 2012-07-18 2016-11-22 Theranos, Inc. Low-volume coagulation assay
EP3096742B1 (en) 2014-01-20 2024-06-12 University of Utah Research Foundation Compositions and methods for modifying the surface of cells and methods of use
CN106279469B (zh) * 2016-08-29 2018-06-08 中山大学 一种快速制备干净聚合物微球的方法
CN106366217B (zh) * 2016-08-29 2018-06-08 中山大学 一种可切除稳定剂的聚合物功能微球及其制备方法
CA3060442A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Apa- Advanced Technologies Ltd. Fusogenic liposomes, compositions, kits and use thereof for treating cancer
AU2019210204B2 (en) 2018-01-18 2024-05-16 EndoProtech, Inc. Treating microvascular dysfunction
JP7467429B2 (ja) * 2018-09-20 2024-04-15 アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティー オブ アリゾナ 標的化部分－薬物グラフト化免疫細胞組成物および使用方法
CN109453123B (zh) * 2018-11-19 2021-05-11 中国药科大学 一种康普瑞汀类衍生物冻干粉针及其制备方法
CN110702653B (zh) * 2019-10-16 2020-11-24 华中科技大学 一种聚集诱导荧光探针在指纹荧光成像中的应用
EP4251738A4 (en) * 2020-11-30 2025-01-08 The University of North Carolina at Chapel Hill MANIPULATED CELLS FUNCTIONALIZED WITH IMMUNE CHECKPOINT MOLECULES AND USES THEREOF
EP4480500A1 (en) * 2023-06-21 2024-12-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified cell, pharmaceutical composition and method of preparing a modified cell

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) * 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) * 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) * 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4483921A (en) * 1981-01-12 1984-11-20 Collaborative Research, Inc. Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme
ZA828453B (en) * 1981-12-08 1983-12-28 Boots Co Plc Therapeutic agents
US4429008B1 (en) * 1981-12-10 1995-05-16 Univ California Thiol reactive liposomes
US4485054A (en) * 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US5008109A (en) * 1984-05-25 1991-04-16 Vestar, Inc. Vesicle stabilization
US4880635B1 (en) * 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4946787A (en) * 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4857319A (en) * 1985-01-11 1989-08-15 The Regents Of The University Of California Method for preserving liposomes
US5059421A (en) * 1985-07-26 1991-10-22 The Liposome Company, Inc. Preparation of targeted liposome systems of a defined size distribution
US4774085A (en) * 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US4920016A (en) * 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5187268A (en) * 1988-08-20 1993-02-16 United States Of America Gene encoding an anti-complement protein from vaccinia
US5157110A (en) * 1988-08-20 1992-10-20 The Government Of The United States Of America Synthetic, anti-complement protein
US20030113369A1 (en) * 1991-01-16 2003-06-19 Martin Francis J. Liposomes with enhanced circulation time and method of treatment
JP3220180B2 (ja) * 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
CA2137297C (en) * 1993-12-06 2000-04-18 Tsuyoshi Miyazaki Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
DE69433343D1 (de) * 1993-12-07 2003-12-24 Neorx Corp Pretargeting verfahren und mitteln
US6773719B2 (en) * 1994-03-04 2004-08-10 Esperion Luv Development, Inc. Liposomal compositions, and methods of using liposomal compositions to treat dislipidemias
AUPQ002399A0 (en) * 1999-04-28 1999-05-20 Australian National University, The Model membrane systems
US7238360B2 (en) * 2000-06-30 2007-07-03 Unversity Of Louisville Research Foundation, Inc. Alteration of cell membrane with B7
US20020122820A1 (en) * 2001-01-16 2002-09-05 Hildebrand William H. Soluble MHC artificial antigen presenting cells
US20030026831A1 (en) * 2001-04-20 2003-02-06 Aparna Lakkaraju Anionic liposomes for delivery of bioactive agents
US7056529B2 (en) * 2002-05-14 2006-06-06 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Direct cellular energy delivery system
US20040132652A1 (en) * 2002-08-30 2004-07-08 Shire Biochem Inc. Pharmaceutical compositions
WO2004049907A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-17 University Of Louisville Research Foundation Compositions and methods for treating transplants
DK1633327T3 (da) * 2003-06-04 2010-11-15 Univ Georgetown Fremgangsmåde til forbedring af stabilitet og opbevaringslevetid af liposomkomplekser
EP1660040B1 (en) * 2003-08-21 2010-02-24 Lipotek Pty Ltd. In vivo targeting of dendritic cells
EP1766393A4 (en) * 2004-05-07 2008-06-18 Beckman Coulter Inc MHC-BRIDGE SYSTEM FOR DETECTION OF THE CTL-MEDIATED LYSE OF ANTIGEN-PRESENTING CELLS
US7449196B2 (en) * 2004-07-09 2008-11-11 Robert Sabin Anti tumor compositions and methods of use
US20060045910A1 (en) * 2004-09-02 2006-03-02 Ehringer William D Preserved fusogenic vesicles

Also Published As

Publication number Publication date
EP1877038A4 (en) 2010-10-06
EP1877038A2 (en) 2008-01-16
CA2605863A1 (en) 2006-11-09
WO2006119121A3 (en) 2007-06-21
AU2006242354A1 (en) 2006-11-09
US20090202621A1 (en) 2009-08-13
JP5264478B2 (ja) 2013-08-14
AU2006242354B2 (en) 2012-03-15
US20160120807A1 (en) 2016-05-05
JP2008540341A (ja) 2008-11-20
EP1877038B1 (en) 2017-03-22
CA2605863C (en) 2016-07-05
NZ562946A (en) 2011-08-26
WO2006119121A2 (en) 2006-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20160120807A1 (en) Cell-surface decoration with active agents
Shin et al. Curvature-sensing peptide inhibits tumour-derived exosomes for enhanced cancer immunotherapy
ES2287974T3 (es) Terapia genica supresora de tumor y quimioterapia combinadas en el tratamiento neoplasmas.
JP2005537253A (ja) 組織損傷の治療におけるおよび／または組織修復を促進するためのｈｍｇｂ１の使用
Aplin et al. Regulation of angiogenesis by macrophages, dendritic cells, and circulating myelomonocytic cells
AU2022279445A1 (en) Compositions and methods for targeting connexin hemichannels
Gregoriadis Fate of liposomes in vivo and its control: a historical perspective
EP2134352A2 (en) Wnt compositions and methods of use thereof
US20040213766A1 (en) Compositions and methods for treating transplants
JP2020524141A (ja) がんを処置するための方法および組成物
Dong et al. ZIF‐8‐Encapsulated Pexidartinib Delivery via Targeted Peptide‐Modified M1 Macrophages Attenuates MDSC‐Mediated Immunosuppression in Osteosarcoma
JP2026021440A (ja) がん治療のための治療用ペプチドに関する方法および組成物
JP7573582B2 (ja) Ｐｅｇ化リポソームおよび血液凝固因子の製剤処方
US6660905B1 (en) Mice comprising engrafted functional human hepatocytes
US20180369336A1 (en) B cell-based cancer immunotherapy
KR101530402B1 (ko) 급성 인간 골수성 백혈병 세포를 죽이는 트롬보포이에틴 수용체 효능제 (ｔｐｏｒａ)
US20050233961A1 (en) Methods for treating cancer using vascular endothelial cell growth inhibitor VEGI-192A
US20240285692A1 (en) Use of death ligands on hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stromal cells for cancer therapy
CN1997277A (zh) 利用血管内皮细胞生长抑制剂vegi－192a治疗癌症的方法
JP2025526398A (ja) 末梢血管疾患を治療するための組成物及び方法
Miyauchi The Role of Neuropilin 1 in Glioma Associated Microglia and Macrophages
Bhatia The Role of Secreted Hsp90α in Tissue Repair and Cancer
CA2883385A1 (en) Modulating transendothelial migration and recruitment of granulocytes by modulating c-met pathway
HK1109301A (en) Methods for treating cancer using vascular endothelial cell growth inhibitor vegi192a

Legal Events

Date Code Title Description
B08E Application fees: payment of additional fee required [chapter 8.5 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 3A ANUIDADE, GUIA 220804513535 DE 18/07/2008, 4A ANUIDADE, GUIA 220904419930 DE 13/07/2009, 5A ANUIDADE, GUIA 221003675640 DE 22/07/2010, 6A ANUIDADE, GUIA 221106990646 DE 29/07/2011 E 7A ANUIDADE, GUIA 221203098019 DE 14/05/2012.

B08G Application fees: restoration [chapter 8.7 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]
B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]