BRPI0613259A2 - método de tratamento de amostra biológica e kit de diagnóstico - Google Patents

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Abstract

MéTODO DE TRATAMENTO DE AMOSTRA BIOLóGICA E KIT DE DIAGNóSTICO. A presente invenção refere-se a método de tratamento prévio de amostra biológica de paciente com doença autoimune, a fim de evitar interferência, especialmente quando a amostra necessitar ser submetida a teste de atividade biológica com base em células, tal como teste de anticorpos neutralizantes.

Description

"MÉTODO DE TRATAMENTO DE AMOSTRA BIOLÓGICA E KIT DEDIAGNÓSTICO"
Este é pedido não provisório que reivindica prioridade com baseem 35 USC § 119 para o pedido provisório n° 60/682.990 depositado em vintede maio de 2005, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado aopresente como referência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a método de tratamento préviode amostra biológica de paciente com doença autoimune, a fim de evitarinterferência, especialmente quando a amostra necessitar ser submetida ateste de atividade biológica com base em células, tal como teste deanticorpo neutralizante.
Antecedentes da Invenção
Os linfócitos são um dos muitos tipos de glóbulos brancos do sangueproduzidos na medula óssea durante o processo de hematopoiese. Existem duaspopulações principais de linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T).
Os linfócitos de interesse específico no presente são as células B.
As células B amadurecem na medula óssea e deixam a medulaexpressando anticorpo de ligação de antígenos sobre a sua superfície celular.
Quando célula B nativa encontra em primeiro lugar o antígeno para o qual oseu anticorpo ligado a membrana é específico, a célula começa a dividir-serapidamente e a sua prole diferencia-se entre células B de memória e célulasefetoras, denominadas "células plasmáticas". As células B de memóriapossuem período de vida mais longo e continuam a expressar anticorpo ligadoa membrana com a mesma especificidade da célula parental original. Ascélulas plasmáticas η ão produzem anticorpo ligado à me mbrana, mas simproduzem o anticorpo em forma que pode ser secretada. Os anticorpossecretados são as principais moléculas efetoras da imunidade humoral.O antígeno CD20 (também denominado antígeno dediferenciação restrito por linfócitos B humanos, Bp35) é proteínatransmembrana hidrofóbica com peso molecular de cerca de 35 kD localizadasobre linfócitos pré-B e B maduros. Valentine et al, J. Biol. Chem. 264 (19):11282-11287 (1989) e Einfeld et al, EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988). O antígenotambém é expresso sobre mais de 90% dos Iinfomas não de Hodgkin (NHL) decélulas B (Anderson et al, Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), mas não éencontrado sobre células haste hematopoiéticas, células pró-B, célulasplasmáticas normal ou outros tecidos normais (Tedder et al, J. Immunol. 135(2): 973-979 (1985)). Acredita-se que CD20 regule etapa(s) precoce(s) noprocesso de ativação para início e diferenciação do ciclo celular (Tedder et al,acima) e possivelmente funcione como canal de íons de cálcio. Tedder et al, J.CeH. Biochem. 14D: 195 (1990).
Dada a expressão de CD20 em Iinfomas de células B, esteantígeno pode servir como possível "alvo" desses linfomas. Essencialmente,esses alvos podem ser generalizados conforme segue: anticorpos específicospara o antígeno de superfície CD20 de células B são administrados a paciente.
Estes anticorpos anti-CD20 ligam-se especificamente ao antígeno CD20 de(ostensivamente) células B normais e malignas; o anticorpo ligado ao antígenode superfície CD20 pode gerar a destruição e o esgotamento de células Bneoplásicas. Além disso, agentes químicos ou marcas radioativas quepossuem o potencial de destruição do tumor podem ser conjugados aoanticorpo anti-CD20 de tal forma que o agente seja especificamente "fornecido"para as células B neoplásicas. Independentemente da abordagem, objetivoprimário é a destruição do tumor; a abordagem específica pode serdeterminada pelo anticorpo anti-CD20 específico que é utilizado e, desta forma,as abordagens disponíveis para definir o alvo do antígeno CD20 podem variarconsideravelmente.O anticorpo ritixumab (RITUXAN®) é anticorpo monoclonalhumano/murino quimérico geneticamente elaborado dirigido contra o antígenoCD20. Rituximab é o anticorpo denominado "C2B8" na Patente Norte-Americana n° 5.736.137, emitida em sete de abril de 1998 (Anderson et al).
Rituximab é indicado para o tratamento de pacientes com Iinfoma não deHodgkin de células B, CD20-positivos, foliculares ou de grau baixo refratáriosou retardados. In vitro, demonstrou-se que rituximab media citotoxicidadedependente de complemento (CDC) e citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC) e para induzir apoptose (Reff et al, Blood 83 (2): 435-445(1994); Maloney et al, Blood 88: 637a (1996); Manches et al, Blood 101: 949-954 (2003)). Sinergia entre rituximab e quimioterapias e toxinas também foiobservada experimentalmente. Particularmente, rituximab sensibiliza linhagensde células de Iinfoma de células B humanas resistentes a drogas aos efeitoscitotóxicos de doxorubicina, CDDP, VP-16, toxina de difteria e rícino (Demidemet al, Câncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3): 177-186 (1997)).
Estudos clínicos prévios in vivo demonstraram que rituximab esgota células Bdo sangue periférico, nódulos linfáticos e medula óssea de macacoscynomolgus. Reff et al, Blood 83: 435-445 (1994).
Rituximab também foi estudado em uma série de disfunçõesautoimunes não malignas, nas quais as células B e autoanticorposaparentemente desempenham papel na patofisiologia da doença. Edwards etal, Biochem Soe. Trans. 30: 824-828 (2002). Rituximab foi relatado comopotencialmente reduzindo sinais e sintomas, por exemplo, de artrite reumatóide(RA) (Leandro et al, Ann. Rheum. Dis. 61: 883-888 (2002); Edwards et al,Arthritis Rheum., 46 (Supl. 9): S46 (2002); Stahl et al, Ann. Rheum. Dis., 62(Suppl. 1): OP004 (2003); Emery et al, Arthritis Rheum. 48 (9): S439 (2003)),lúpus (Eisenberg, Arthritis. Res. Ther. 5: 157-159 (2003); Leandro et al,Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002); Gorman et al, Lupus, 13: 312-316(2004)), púrpura trombocitopênica imune (D'Arena et al, Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al, Blood, 98: 952-957 (2001); Saleh et al, Semin. Oncol.,27 (Supl. 12): 99-103 (2000); Zaia et al, Haematolgica, 87: 189-195 (2002);Ratanatharathorn et al, Ann. Int Med., 133: 275-279 (2000)), aplasia dos glóbulosvermelhos pura (Auner et al, Br. J. Haematol., 116: 725-728 (2002)); anemiaautoimune (Zaja et al, Η aematologica 8 7: 189-195 (2002) (errata aparece emHaematologica 87: 336 (2002)), doença de aglutinina fria (Layios et al, Leukemia,15: 187-8 (2001); Berentsen et al, Blood, 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al,Br. J. Haematol., 115: 79-83 (2001); Bauduer, Br. J. Haematol., 112: 1083-1090(2001); Damiani et al, Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001)), síndrome do tipo B deresistência severa à insulina (Coll et al, N. Engi J. Med., 350: 310-311 (2004),crioglobulinemia mista (DeVita et al, Arthritis Rheum. 46 Supl. 9: S206/S469 (2002)),miastenia grave (Zaja et al, Neurology, 55: 1062-63 (2000); Wylam et al, J. Pediatr.,143: 674-677 (2003)), granulomatose de Wegener (Specks et al, Arthritis &Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), pênfigo refratário vulgar (Dupuy et al, ArchDemiatol., 140: 91-96 (2004)), dermatomiosite (Levine, Arthritis Rheum., 46 (Supl.9): S1299 (2002)), síndrome de Sjõgren (Somer et al, Arthritis & Rheumatism, 49:394-398 (2003)), crioglobulinemia mista do tipo Il ativa (Zaja et al, Blood, 101: 3827-3834 (2003)), pênfigo vulgar (Dupay et al, Arch. Dermato!., 140: 91-95 (2004)),neuropatia autoimune (Pestronk et al, J. Neuroi Neurosurg. Psychiatry 74: 485-489(2003)), síndrome de opsoclono-miocolono paraneoplásica (Pranzatelli et al,Neurology 60 (Supl. 1) P05.128:A395 (2003)), e esclerose múltiplaremitente/reincidente (RRMS). Cross et al (resumo), Preliminary Results from aPhase Il Trial of Rituximab in MS, Oitava Reunião Annual do Comitê das Américaspara Pesquisa e Tratamento em Esclerose Múltipla, 20-21 (2003).
Foi conduzido estudo de Fase Il (WA16291) em pacientes comartrite reumatóide (RA), fornecendo dados de acompanhamento por 48semanas sobre a segurança e eficácia de rituximab. Emery et al, ArthritisRheum. 48 (9): S439 (2003); Szczepanski et ai, Arthritis Rheum. 48 (9): S121(2003); Edwards et al, Efficacy of B-cell-targeted therapy with rítuximab inpatients with rheumatoid arthrítis, N. Engl. J. Med. 350: 2572-82 (2004). Totalde 161 pacientes foram aleatorizados homogeneamente para quatro formas detratamento: metotrexato, rituximab isolado, rituximab mais metotrexato erituximab mais ciclofosfamida (CTX). O regime de tratamento de rituximab foium grama administrado por via intravenosa nos dias 1 e 15. Infusões derituximab na maior parte dos pacientes com RA foram bem toleradas pelamaior parte dos pacientes, com 36% dos pacientes experimentando pelomenos um evento adverso durante a sua primeira infusão (em comparaçãocom 30% dos pacientes que receberam placebo). De forma geral, a severidadeda maior parte dos eventos adversos foi considerada suave a moderada e foibem equilibrada ao longo de todos os grupos de tratamento. Houve total dedezenove eventos adversos ao longo das quatro formas nas 48 semanas, queforam levemente mais freqüentes no grupo de rituximab/CTX. A incidência deinfecções foi bem equilibrada em todos os grupos. A taxa média de infecçõessérias nesta população de pacientes com RA foi de 4,66 por cem anos-paciente, que é mais baixa que a taxa de infecções que necessita de admissãohospitalar em pacientes com RA (9,57 por cem anos-paciente) relatada emestudo epidemiológico com base comunitária. Doran et al, Arthrítis Rheum. 46:2287-2293 (2002).
O perfil de segurança relatado de rituximab em pequeno númerode pacientes com disfunções neurológicas, que incluem neuropatia autoimune(Pestronk et al, acima), síndrome de opsoclono-mioclono (Pranzatelli et al,acima) e RRMS (Cross et al, acima) foi similar ao relatado em oncologia ou RA.
Em teste financiado por pesquisadores em andamento (IST) de rituximab emcombinação com interferona-3 (IFN-3) ou acetato de glatirâmero em pacientescom RRMS (Cross et al, acima), um dentre dez pacientes tratados foi admitidono hospital para observação por uma noite depois de sofrer febre e rigoresmoderados após a primeira infusão de rituximab, enquanto os outros novepacientes completaram o regime de quatro infusões sem nenhum eventoadverso relatado.
As patentes e publicações de patentes referentes aos anticorposCD20 e moléculas de ligação de CD20 incluem as Patentes Norte-Americanasn° 5.776.456, 5.736.137, 5.843.439, 6.399.061 e 6.682.734, bem como US2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US2003/0147885 (Anderson et al); Patente Norte-Americana n° 6.455.043, US2003/0026804 e WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez e White); WO 2000/27433 e US 2004/0213784 (Grillo-Lopez e Leonard);WO 2000/44788 (Braslawsky et al); WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter e White); WO 2001/10460 (White e Grillo-Lopez); US2001/0018041, US 2003/0180292, WO 2001/34194 (Hanna e Hariharan); US2002/0006404 e WO 2002/04021 (Hanna e Hariharan); US 2002/0012665 eWO 2001/74388 (Hanna, N.); US 2002/0058029 (Hanna, N.); US 2003/0103971(Hariharan e Hanna); US 2002/0009444 e WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.);WO 2001/97858 (White, C.); US 2002/0128488 e WO 2002/34790 (Reff, M.);WO 2002/060955 (Braslawsky et al); WO 2002/096948 (Braslawsky et al); WO2002/079255 (Reff e Davies); Patente Norte-Americana n° 6.171.586 e WO1998/56418 (Lam et al); WO 1998/58964 (Raju, S.); WO 1999/22764 (Raju, S.);WO 1999/51642 e Patente Norte-Americana n° 6.194.551, Patente Norte-Americana n° 6.242.195, Patente Norte-Americana n° 6.528.624 e PatenteNorte-Americana n° 6.538.124 (Idusogie et al); WO 2000/42072 (Presta, L.);WO 2000/67796 (Curd et al); WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et al); US2002/0004587 e WO 2001/77342 (Miller e Presta); US 2002/0197256 (Grewal,I.); US 2003/0157108 (Presta, L.); WO 04/056312 (Lowman et al); US2004/0202658 e WO 2004/091657 (Benyunes, K.); WO 2005/000351 (Chan,A.); US 2005/0032130Α1 (Beresini et al); US 2005/0053602A1 (Brunetta1 P.);Patentes Norte-Americanas n° 6.565.827, 6.090.365, 6.287.537, 6.015.542,5.843.398 e 5.595.721 (Kaminski et al); Patentes Norte-Americanas n°5.500.362, 5.677.180, 5.721.108, 6.120.767 e 6.652.852 (Robinson et al);
Patente Norte-Amerieana n° 6.410.391 (Raubitsehek et al); Patente Norte-Amerieana n° 6.224.866 e WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); US 2005/0079174A1 Barbera-Guillem et al);WO 2000/67795 (Goldenberg); US 2003/0133930 e WO 2000/74718(Goldenberg e Hansen); US 2003/0219433 e WO 2003/68821 (Hansen et al);WO 2004/058298 (Goldenberg e Hansen); WO 2000/76542 (Golay et al); WO2001/72333 (Wolin e Rosenblatt); Patente Norte-Amerieana n° 6.368.596(Ghetie et al); Patente Norte-Amerieana n° 6.306.393 e US 2002/0041847(Goldenberg, D.); US 2003/0026801 (Weiner e Hartmann); WO 2002/102312(Engleman, E.); US 2003/0068664 (Albitar et al); WO 2003/002607 (Leung, S.);WO 2003/049694, US 2002/0009427 e US 2003/0185796 (Wolin et al); WO2003/061694 (Sing e Siegall); US 2003/0219818 (Bohen et al); US2003/0219433 e WO 2003/068821 (Hansen et al); US 2003/0219818 (Bohen etal); US 2002/0136719 (Shenoy et al); WO 2004/032828 (Wahl et al); e WO2002/56910 (Hayden-Ledbetter). Vide também a Patente Norte-Amerieana n°5.849.898 e EP 330.191 (Seed et al); EP 332.865 A2 (Meyer e Weiss); PatenteNorte-Amerieana n° 4.861.579 (Meyer et al); US 2001/0056066 (Bugelski et al);WO 1995/03770 (Bhat et al); US 2003/0219433 A1 (Hansen et alj; WO2004/035607 (Teeling et al); US 2004/0093621 (Shitara et al); WO2004/103404 (Watkins et al); WO 2005/000901 (Tedder et al); US2005/0025764 (Watkins et al); WO 2005/016969 e US 2005/0069545 A1 (Carret al); WO 2005/014618 (Chang et al).
As publicações referentes à terapia com rituximab incluem:Perotta e Abuel, Response of Chronic Relapsing ITP of 10 Years Duration toRituximab, Resumo n° 3360, Blood 10 (1) (parte 1-2): pág. 88B (1998); Perottaet al, Rituxan in the treatment of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP), Blood, 94: 49 (resumo) (1999); Matthews1 R., Medicai Heretics, NewScientist (sete de abril de 2001); Leandro et al, Lymphocyte depletion inrheumatoid arthrítis: early evidence for safety, efficacy and dose response,Arthritis and Rheumatism 44 (9): S370 (2001); Leandro et al, An open study ofB Iymphocyte depletion in systemic Iupus erythematosus, Arthrítis andRheumatism, 46: 2673-2677 (2002), em que, durante período de duassemanas, cada paciente recebeu duas infusões de 500 mg de rituximab, duasinfusões de 750 mg de ciclofosfamida e corticoesteróides orais com altadosagem e em que dois dos pacientes tratados sofreram reincidência apóssete e oito meses, respectivamente, e foram tratados novamente, embora comprotocolos diferentes; Weide et al, Sucessful Long-Term Treatment of SystemicLupus Erythematosus with Rituximab Maintenance Therapy, Lupus, 12: 779-782 (2003), em que paciente foi tratado com rituximab (375 mg/m2 χ 4, repetidoem intervalos semanais) e aplicações de rituximab adicionais foram fornecidasa cada cinco ou seis meses e, em seguida, terapia de manutenção foi recebidacom 375 mg/m2 de rituximab a cada três meses e segundo paciente com SLErefratário foi tratado com sucesso com rituximab e está recebendo terapia demanutenção a cada três meses, em que os dois pacientes reagem bem aterapia com rituximab; Edwards e Cambridge, Sustained Improvement inRheumatoid Arthrítis Following a Protocol Designed to Deplete B Lymphocytes,Rheumatology 40: 205-211 (2001); Cambridge et al, B Lymphocyte Depletion inPatients with Rheumatoid Arthrítis: seria! studies of immunological parameters,Arthrítis Rheum., 46 (Supl. 9): S1350 (2002); Edwards et al, Efficacy and safetyof rituximab, a B-cell targeted chimeríc monoclonal antibody: A Randomized,Placebo Controlled Trial in Patients with Rheumatoid Arthrítis, Arthrítis andRheumatism 46 (9): S197 (2002); Pavelka et al, Ann. Rheum. Dis. 63: (S1):289-90 (2004); Emery et al, Arthritis Rheum. 50 (S9): S659 (2004); Levine ePestronk, IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletionchemotherapy using rituximab, Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al,Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis,Arthritis & Rheum. 46: 2029-2033 (2002); Hidashida et al, Treatment ofDMARD-Refractory Rheumatoid Arthritis with Rituximab, apresentado naReunião Científica Anual da Faculdade Norte-Americana de Reumatologia1 24a 29 de outubro, Nova Orleans LA, 2002; Tuscano1 J., Successful treatment ofinfliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab, apresentado naReunião Científica Anual da Faculdade Norte-Americana de Reumatologia, 24a 29 de outubro; Nova Orleans LA, 2002; Pathogenie roles of B eells in humanautoimmunity; insights from the elinie, Martin e Chan, Immunity 20: 517-527(2004); Silverman e Weisman, Rituximab Therapy and Autoimmune Disorders,Prospeets for Anti-B Cell Therapy1 Arthritis and Rheumatism, 48: 1484-1492(2003); Kazkaz e lsenberg, Anti B cell therapy (rituximab) in the treatment ofautoimmune diseases, Current opinion in pharmaeology, 4: 398-402 (2004);Virgolini e Vanda1 Rituximab in autoimmune diseases, Biomedieine &pharmaeotherapy, 58: 299-309 (2004); Klemmer et al, Treatment of antibodymediated autoimmune disorders with a AntiCD20 monoelonal antibodyRituximab, Arthritis and Rheumatism, 48: (9) S624-S624 (2003); Kneitz et al,Effeetive B Cell Depletion with Rituximab in the Treatment of AutoimmuneDiseases, Immunobiology, 206: 519-527 (2002); Arzoo et al, Treatment ofRefraetory Antibody Mediated Autoimmune Disorders with an anti-CD20Monoelonal Antibody (Rituximab), Annals of the Rheumatie Disease, 61 (10),pág. 922-4 (2002), Comment in Ann. Rheum. Dis. 61: 863-866 (2002); FutureStrategies in Immunotherapy de Lake e Dionne1 em Burger1S MedicinalChemistry and Drug Discovery (2003 por John Wiley & Sons1 Inc.), data deenvio online do artigo: quinze de janeiro de 2003 (Capítulo 2, Antibody-DirectedImmunotherapy); Liang e Tedder1 Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine,Capítulo: CD20 as an Immunotherapy Target, data de envio online do artigo:quinze de janeiro de 2002 intitulado CD20; Apêndice 4A intitulado MonoclonalAntibodies to Human Cell Surfaee Antigens por Stoekinger et al, eds.: Coliganet al, em Current Protocols in Immunology (2003, John Wiley & Sons, Inc) datade envio online: maio de 2003; data de publicação impressa: fevereiro de 2003;Penichet e Morrison, CD Antibodies/Moleeules: Definition; Antibody Engineeringem Wiley Encyelopedia of Molecular Medicine, capítulo: Chimeric, Humanizedand Human Antibodies; enviado online em quinze de janeiro de 2002; Speckset al, Response of Wegenefs Granulomatosis to anti-CD20 ChimericMonoclonal Antibody Therapy, Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001);apresentação do resumo online e convite, Koegh et al, Rituximab for RemissionInduction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of a Prospective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients, Faculdade Norte-Americana de Reumatologia,Sessão Número: 28-100, Sessão Título: Vasculitis, Sessão Tipo: ACRConcurrent Session, Primary Category: 28 Vasculitis, Sessão de 18 de outubrode 2004 (http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp); Eriksson,Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positive vasculitistreated with rituximab, Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003);Jayne et al, B-cell depletion with rituximab for refractory vasculitis, Kidney andBlood Pressure Research, 26: 294 (2003); Jayne, pôster 88 (11° WorkshopInternacional da ANCA e Vasculite), 2003 Sociedade Norte-Americana deNefrologia; Stone e Specks, Rituximab Therapy for the Induction of Remissionand Tolerance in ANCA-associated Vasculitis, no Resumo de Pesquisa deTestes Clínicos da Rede de Tolerância Imunológica 2002-2003,http://www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html. Videtambém Leandro et al, B cell repopulation occurs mainly from nafve B cells inpatient with rheumatoid arthritis and systemic Iupus erythematosus, ArthritisRheum., 48 (Supl. 9): S1160 (2003).
O Pedido de Patente Norte-Americano n° 2003/0068664 (Albitaret al) descreve teste ELISA para determinar anticorpo antiquimérico humano(HACA) dirigido contra Rituximab.
O Pedido de Patente Norte-Americano n° US 2005/0032130A1(Beresini e Song) descreve método de detecção de anticorpos neutralizantespara anticorpo terapêutico, tal como anticorpo CD20.
Mire-Sluis et al, J. Immunol. Methods 289: 1-16 (2004) fornecerecomendações para detecção e otimização de imunotestes utilizados nadetecção de anticorpos hospedeiros contra produtos de biotecnologia.
Hong et al descrevem ELISA com base em anticorpo antiidiotípico ecélula viva quantitativa simples para anticorpo humanizado dirigido contra a proteínada superfície celular CD20 (Hong et al, J. Immunol. Methods 294:189-197 (2004)).
Wei et al, J. Immunol. Methods 293: 115-26 (2004) descrevembioteste com base em células para detecção de anticorpos neutralizantescontra eritropoietina humana recombinante em estudos clínicos.
Leon et al descrevem interferência por atividade de fatorreumatóide na detecção de anticorpos antiaviários em criadores de pombos(Leon et al, Clin. Exp. Med. 2 (2): 59-67 (2002); errata em: Leon et al, Clin. Exp.Med. 2 (3): 157 (2002)). Stahl et al, Vox Sang. 74 (4): 253-255 (1998) referem-se a cromatografia de afinidade em soro para a detecção de aloanticorpos IgGem paciente com aglutinas frias de IgM com alto título. Koper et al, Clin. Chem.Lab. Med. 36 (1): 23-28 (1998) quantificaram interferência de anticorposanticamundongos humanos (HAMA) IgG e IgM em medições de CA125utilizando cromatografia de afinidade. Crowley e Walters referem-se àdeterminação de imunoglobulinas em soro sangüíneo por meio decromatografia de afinidade de alto desempenho (Crowley e Walters, J.Chromatogr. 266: 157-162 (1983)).Vide também Maeda et al, Intl. J. Hematology IA (1): 70-75(2001); Gordon et al, Blood 98 (11 Parte 2): 228b (2001); Kaminski et al, Blood96 (11 Parte 1): 734a (2000); Shan et al, Câncer Immunology Immunotherapy48 (12): 673-683 (2000); Idusogie et al, Journal of Immunology 166 (4): 2571-2575 (2001); Reff et al, Blood 83 (2): 435-445 (1994); e Zaya et al, Blood 98 (11Parte 2): 41b (2001).
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção refere-se, ao menos em parte, à revelaçãode que soro de pacientes com doenças autoimunes, tais como RA ou SLE1contém substância(s) que interfere(m) no desempenho de bioteste com baseem células, tal como teste de anticorpo neutralizante. Vários métodos paraabordar o problema de interferência foram testados, até que a purificação porafinidade de imunoglobulina foi identificada como o método preferido deremoção da interferência, de forma que resultados mais confiáveis pudessemser atingidos no bioteste.
Conseqüentemente, em primeiro aspecto, a presente invençãofornece método de tratamento de amostra biológica de paciente com doençaautoimune que compreende:
(a) deslipidação da amostra;
(b) purificação por afinidade de imunoglobulinas na amostra;
(c) concentração das imunoglobulinas purificadas; e
(d) submissão das imunoglobulinas concentradas a teste deatividade biológica com base em células
A presente invenção fornece ainda método de tratamento depaciente com doença autoimune que compreende:
(a) administração de anticorpo terapêutico ou imunoadesina aopaciente para tratamento da doença autoimune;
(b) obtenção de amostra biológica do paciente;(c) purificação por afinidade de imunoglobulinas na amostrabiológica; e
(d) submissão das imunoglobulinas purificadas a teste deanticorpos neutralizantes.
Para uso nos métodos acima, a presente invenção fornece aindakit de diagnóstico que compreende:
(a) reagente de deslipidação;
(b) tampões para purificação por afinidade de imunoglobulinas; e
(c) manual de instruções que instrui o usuário do kit dediagnóstico a praticar qualquer dos métodos acima ou ambos.
Breve Descrição das Figuras
A Fig. 1A é alinhamento de seqüências que compara asseqüências de aminoácidos do domínio leve variável (Vl) de cada um dos 2H7murinos (SEQ ID N0 1), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID N0 2) e dosubgrupo I de cadeia leve capa humano (SEQ ID N0 3). As CDRs de Vl de 2H7e hu2H7.v16 são as seguintes: CDR1 (SEQ ID N0 4), CDR2 (SEQ ID N0 5 ) eCDR3 (SEQ ID N0 6).
A Fig. 1B é alinhamento de seqüências que compara asseqüências de aminoácidos do domínio pesado variável (Vh) de cada um dos2H7 murinos (SEQ ID N0 7), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID N0 8) e daseqüência de consenso humana do subgrupo Ill de cadeia pesada (SEQ ID N0
9). As CDRs de Vh de 2H7 e hu2H7.v16 são as seguintes: CDR1 (SEQ ID N010), CDR2 (SEQ ID N0 11) e CDR3 (SEQ ID N0 12).
Na Fig. 1A e na Fig. 1B, as CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeiasão incluídas entre parênteses, ladeadas pelas regiões de estrutura, FR1 aFR4, conforme indicado. 2H7 indica o anticorpo 2H7 murino. Os asteriscosentre duas fileiras de seqüências indicam as posições que são diferentes entreas duas seqüências. A numeração de resíduos é de acordo com Kabat et al,Sequences of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda MD (1991), com as inserções exibidascomo a, b, c, d e e.
A Fig. 2 exibe alinhamento das cadeias leves de 2H7.v16 e2H7.v511 maduras (SEQ ID N0 13 e 15, respectivamente), com numeração deresíduos de domínio variável de Kabat e numeração de resíduos de domínioconstante de Eu.
A Fig. 3 exibe alinhamento das cadeias pesadas de 2H7.v16 e2H7.v511 maduras (SEQ ID N0 14 e 16, respectivamente), com numeração deresíduos de domínio variável de Kabat e numeração de resíduos de domínioconstante de Eu.
A Fig. 4 ilustra citotoxicidade dependente de complemento (CDC)como teste de anticorpo neutralizante (NAb) para Rituximab.
A Fig. 5 representa CDC como teste de NAb com relação àsamostras a seguir: controle, anticorpos CDR anti-rituximab de cabra eanticorpos anti-Fc humano de cabra.
A Fig. 6 exibe tolerância de soro no teste de CDC NAb, quecompara resultados de soro de pacientes humanos normais (esquerda) e sorode pacientes com artrite reumatóide (RA) (direita).
A Fig. 7 representa leitura de teste do teste de CDC NAb para:Teste de Viabilidade Celular Luminescente CELLTITER-GLO®, calceína,desidrogenase de Iactose (LDH) e ALAMAR BLUE® (resazurin).
A Fig. 8 compara interferência de soro de RA que compreendeALAMAR BLUE® (resazurin) (esquerda) ou CELLTITER-GLO® (direita) paraleitura de teste.
A Fig. 9 ilustra procedimento preferido para tratamento prévio desoro no presente.
A Fig. 10 exibe o efeito de tratamento prévio de soro sobre aleitura de soro com RA sem tratamento prévio de soro (esquerda) e comtratamento prévio de soro (direita).
A Fig. 11 ilustra o efeito da variação do número celular utilizadono teste NAb.
A Fig. 12 representa a seleção de dose de rituximab, sensibilidadea NAb.
A Fig. 13 exibe interferência de drogas em teste de NAb comrazões NAb: Rituxan de 0,1 (esquerda) ou 5,1 (direita).
Descrição Detalhada da Invenção
Definições
A menos que indicado em contrário, por "amostra biológica" nopresente, indica-se amostra obtida de paciente humano. O paciente épreferencialmente paciente com doença autoimune. A amostra podecompreender imunoglobulinas do paciente que se liga a anticorpo ou drogacom o qual o paciente pode haver sido tratado, tal como anticorpo antimurinohumano (HAMA)1 anticorpo antiquimérico humano (HACA) ou anticorpo anti-humano humano (HAHA). A amostra biológica pode compreender, porexemplo, soro, plasma, Iisato celular, leite, saliva, fluido vítreo, fluido sinovial,fluido da cavidade peritoneal, fluido lacrimal, homogenado de tecido, maspreferencialmente soro. A amostra pode ser de paciente que tenha sido tratadocom droga (neste caso, a amostra pode compreender adicionalmente a droga,tal como anticorpo terapêutico ou imunoadesina), ou pode ser de pacientenativo de droga ou não tratado.
"Doença autoimune" no presente designa doença ou disfunçãoque surge dos próprios tecidos ou órgãos do indivíduo e é dirigida contra eles,sua manifestação, co-secretado ou condição resultante. Em uma realização,refere-se a uma condição que resulta da produção por células B de anticorposque são reativos com antígenos e tecidos normais do corpo, ou por ela éagravada. Em outras realizações, a doença autoimune envolve a secreção deautoanticorpo que é específico para epítopo a partir de auto-antígeno (tal comoantígeno nuclear). Exemplos de doenças ou disfunções autoimunes incluem,mas sem limitar-se a artrite (artrite reumatóide, tal como atrite aguda, artritrereumatóide crônica, gota ou artrite da gota, artrite da gota aguda, artriteimunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artriteinduzida por colágeno do tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artriteproliferativa, artrite psoriática, mal de Still1 artrite vertebral e artrite reumatóidede início juvenil, osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformans,poliartrite crônica primária, artrite reativa e espondilite anquilosante), doençasda pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase tal como psoríase de placas,psoríase gutatte, psoríase pustular e psoríase das unhas, atopia incluindodoenças atópicas tais como febre do feno e síndrome de Job, dermatiteincluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatiteesfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatiteherpetiforme, dermatite numular, dermatite seborréica, dermatite nãoespecífica, dermatite de contato irritante primária e dermatite atópica, síndromede hiper IgM ligada por x, doenças inflamatórias intraoculares alérgicas,urticária tal como urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica,incluindo urticária autoimune crônica, miosite, polimiosite/dermatomiosite,dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, escleroderma (incluindoescleroderma sistêmico), esclerose tal como esclerose sistêmica, esclerosemúltipla (MS) tal como MS espinhoótica, MS progressiva primária (PPMS) e MSreincidente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose,arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, neuromielite ótica(NMO), doença intestinal inflamatória (IBD) (por exemplo, mal de Crohn,doenças gastrointestinais mediadas por autoimunidade, colite tal como coliteulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colitepoliposa, enterocolite necrotizante e colite transmural, bem como doençaintestinal inflamatória autoimune), inflamação intestinal, pioderma gangrenoso,eritema nodoso, colangite esclerosante primária, síndrome de mal-estarrespiratório, incluindo síndrome de mal-estar respiratório em adultos ou aguda(ARDS), meningite, inflamações totais ou parciais da úvea, irite, coroidite,disfunção hematológica autoimune, espondilite reumatóide, sinovitereumatóide, angioedema hereditário, lesões dos nervos cranianos tais comoem meningite, herpes gestacional, penfigóide gestacional, prurite scroti, falhaovariana prematura autoimune, perda súbita da audição devida a condiçãoautoimune, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica eatópica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen e encefalite dos membrose/ou do tronco cerebral, uveíte tal como uveíte anterior, uveíte anterior aguda,uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíteposterior ou uveíte autoimune, gIomeruIonefrite (GN) com e sem síndromenefrótica tal como gIomeruIonefrite aguda ou crônica como GN primária, GNmediada imune, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosaidiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN membranoproliferativa ouproliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, bem como GN derápida progressão, nefrite proliferativa, falha endócrina poliglandular autoimune,balanite incluindo balanite circunscrita plasmacelular, balanopostite, centrifugoanular de eritema, eritema discrômico perstans, eritema multiforme, granulomaanular, Iichen nitidus, Iichen sclerosus et atrophicus, Iichen simplex chronicus,Iichen spinulosus, Iichen planus, ictiose lamelar, hiperqueratose epidermolítica,queratose pré-maligna, pioderma gangrenoso, reações e condições alérgicas,reações alérgicas, eczema incluindo eczema alérgico ou atópico, eczemaasteótico, eczema disidrótico e eczema palmoplantar vesicular, asma, tal comoasma dos brônquios, asma brônquica e asma autoimune, condições queenvolvem a infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas, reaçõesimunes contra antígenos exógenos tais como grupos sangüíneos A-B-O fetaisdurante a gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocarditeautoimune, deficiência da adesão de leucócitos, lúpus incluindo lúpus nefrite,lúpus cerebrite, lúpus pediátrico, lúpus não renal, lúpus extra-renal, lúpusdiscóide e eritematose do lúpus discóide, alopecia lúpus, eritematose do lúpussistêmico (SLE) tal como SLE cutâneo ou SLE cutâneo subagudo, síndrome dolúpus neonatal (NLE) e eritematose do lúpus disseminada, diabetes mellitus deinício juvenil (Tipo I), incluindo diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM)pediátrica, diabetes mellitus de início em adultos (diabetes Tipo II), diabetesautoimune, diabetes insipidus idiopática, retinopatia diabética, nefropatiadiabética, disfunção de artérias grandes diabética, reações imunes associadasà hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T,tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide,granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculitide incluindo vasculite,vasculite de vasos grandes (incluindo polimialgia reumática e artrite de célulasgigantes (de Takayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo mal de Kawasakie poliartrite nodosa/periartrite nodosa), poliartrite microscópica, imunovasculite,vasculite do SNC, vasculite cutânea, vasculite por hipersensibilidade, vasculitenecrotizante tal como vasculite necrotizante sistêmica e vasculite associada aANCA, tal como síndrome ou vasculite de Churg-Strauss (CSS) e vasculite devasos pequenos associada a ANCA, artrite temporal, anemia aplásica, anemiaaplásica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia Diamond Blackfan,anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolíticaautoimune (AIHA), anemia perniciosa, mal de Addison, aplasia ou anemia deglóbulos vermelhos pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A,neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvam adiapedese de leucócitos, doenças inflamatórias do SNC, mal de Alzheimer, malde Parkinson1 síndrome de lesões a múltiplos órgãos tais como as que seseguem a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexode antígeno e anticorpo, doença da membrana base anti-glomerular, síndromede anticorpos anti-fosfolipídios, neurite alérgica, mal/síndrome de Behçet,síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud,síndrome de Sjõgren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide tal comopenfigóide bolhosa e penfigóide da pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar,pênfigo foliáceo, penfigóide do muco-membrana do pênfigo e pênfigoeritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, síndrome ou mal de Reiter,lesão térmica, preeclampsia, disfunção do complexo imune tal como nefrite docomplexo imune, nefrite mediada por anticorpos, polineuropatias, neuropatiacrônica tal como polineuropatias IgM ou neuropatia mediada por IgM,trombocitopenia (conforme desenvolvido por pacientes com enfarte domiocárdio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP)1púrpura pós-transfusão (PTP)1 trombocitopenia induzida por heparina etrombocitopenia autoimune ou mediada por imunidade tal como púrpuratrombocitopênica idiopática (ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, esclerite talcomo ceratoesclerite idiopática, episclerite, doença autoimune dos testículos eovário incluindo orquite autoimune e ooforite, hipotireoidismo primário,hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite talcomo tireoidite autoimune, mal de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite deHashimoto) ou tireoidite subaguda, mal da tireóide autoimune, hipotireoidismoidiopático, mal de Grave, síndromes poliglandulares tais como síndromespoliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular),síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicastais como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome de rigidez humana ou de rigidez pessoal, encefalomielite talcomo encefalomielite alérgica ou alergia de encefalomielite e encefalomielitealérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia graveassociada a timoma, degeneração do cerebelo, neuromiotonia, opsoclonus ousíndrome de opsoclonus mioclonus (OMS) e neuropatia sensorial, neuropatiamotor multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica,hepatite lupóide, hepatite de células gigantes, hepatite ativa crônica ou hepatiteativa crônica autoimune, pneumotite intersticial linfóide (LIP), bronquioliteobliterans (não de transplante) contra NSIP1 síndrome de Guillain-Barré, mal deBerger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática, dermatose de IgAlinear, dermatose neutrofílica febril aguda, dermatose pustular subcorneana,dermatose acantolítica transitória, cirrose tal como cirrose biliar primária epneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, psilosecelíaca (enteropatia do glúten), psilose refratária, psilose idiopática,crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; mal de Lou Gehrig),doença das artérias coronarianas, doença dos ouvidos autoimune tal comodoença dos ouvidos interna autoimune (AIED), perda de audição autoimune,policondrite tal como policondrite refratária, retardada ou reincidente,proteinose alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratite intersticial nãosifilítica, paralisia de Bell, mal/síndrome de Sweet, rosácea autoimune, dorassociada a zóster, amiloidose, esclerite, Iinfocitose não cancerosa, Iinfocitoseprimária, que inclui Iinfocitose de células B monoclonais (tal como gamopatiamonoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significado indeterminado,MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplásica, canalopatias taiscomo epilepsia, enxaqueca, arritmia, disfunções musculares, surdez, cegueira,paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória,glomeruloesclerose focai, segmentai ou segmentai focai (FSGS), oftalmopatiaendócrina, uveorretinite, coriorretinite, disfunção hepatológica autoimune,fibromialgia, falha endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofiagástrica, demência pré-senil, doenças demielinantes tais como doençasdemielinantes autoimunes e polineuropatia demielinante inflamatória crônica,síndrome de Dressler1 alopecia areata, alopecia total, síndrome de CREST(calcinose, fenômeno de Raynaud, dismobilidade do esôfago, esclerodactilia etelangiectasia), infertilidade autoimunológica masculina e feminina devido, porexemplo, a anticorpos anti-espermatozóides, doença de tecidos conjuntivosmisturados, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão defazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome deCushing, pulmão de criador de pássaros, angite granulomatosa alérgica, angitelinfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite tal como alveolite alérgica ealveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação de transfusão,hanseníase, malária, doenças parasíticas tais como leishmaníase,cipanossomíase, esquistossomíase, ascaríase, aspergilose, síndrome deSampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose do endomiocárdio,fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrosepulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritemaelevatum et diutinum, eritroblastose fetal, facite eosinofílica, síndrome deShulman, síndrome de Felty, flaríase, ciclite tal como ciclite crônica, cicliteheterocrônica, iridociclite (aguda ou crônica) ou ciclite de Fuch, púrpura deHenoch-Schonlein, infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV),SCID, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), infecção por ecovírus,sepsia, endotoxemia, pancreatite, tireoxicose, infecção por parvovírus, infecçãopor vírus da rubéola, síndromes pós-vacinação, infecção por rubéola congênita,infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, falha gonadalautoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós-estreptococo, tromboangiteubiterans, tirotoxicose, tabes dorsalis, coriodite, polimialgia de células gitantes,pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca,ceratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia pormudanças mínimas, lesões por reperfusão de isquemia e familiar benigna,reperfusão de órgãos de transplante, autoimunidade da retina, inflamação dasjuntas, bronquite, doença pulmonar/das vias aéreas obstruídas crônica,silicose, aftas, estomatite aftosa, disfunções arterioscleróticas,aspermiogênese, hemólise autoimune, mal de Boeck, crioglobulinemia,contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritemanodosum leprosum, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febrereumática, mal de Hamman-Rich, perda de audição sensoneural,hemoglubinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia,mononucleose infecciosa, mielite transversal, mixedema idiopático primário,nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatose, pancreatite, poliradiculiteaguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia espênica adquirida,timoma não maligna, vitiligo, síndrome de choque tóxico, envenenamento comalimentos, condições que envolvem a infiltração de células T, deficiência naadesão de leucócitos, reações imunes associadas à hipersensibilidade aguda eretardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvemdiapedese de leucócitos, síndrome por lesões de múltiplos órgãos, doençasmediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana baseantiglomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite,mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doençasreumáticas, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite,falhas poliendócrinas, síndrome poliglandular autoimune do tipo I,hipoparatireoidismo idiopático com início em adultos (AOIH), cardiomiopatia talcomo cardiomiopatia dilatada, epidermiólise bolhosa adquirida (EBA),homocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosanteprimária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica,sinusite etmóide, frontal, maxilar ou esfenóide, disfunção relativa a eosinófilostal como eosinofilia, eosinofilia por infiltração pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofiliapulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomasque contêm eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritides soronegativas, doençaautoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclerose, episclerose,candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemiainfantil transitória, síndrome de Wiskott-Ald rich, síndrome de ataxiatelangiectasia, angiectase, disfunções autoimunes associadas a doença decolágeno, reumatismo, doença neurológica, linfadenite, redução da reação dapressão sangüínea, disfunção vascular, lesões dos tecidos, isquemiacardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral e doença queacompanha vascularização, disfunções por hipersensibilidade alérgica,glomerulonefritides, lesões por reperfusão, disfunção por reperfusão isquêmica,lesões por reperfusão de tecidos do miocárdio e outros, traqueobronquitelinfomatosa, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentesinflamatórios agudos, falha de múltiplos órgãos, doenças bolhosas, necrosecortical renal, meningite purulenta aguda ou outras disfunções inflamatórias dosistema nervoso central, disfunções inflamatórias oculares e orbitais,síndromes associadas a transfusão de granulócitos, toxicidade induzida porcitocinas, narcolepsia, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica,pielite, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, vasculite e endometriose.
"Paciente" no presente é paciente humano.
"Paciente de doença autoimune" no presente é paciente quepossui ou encontra-se em risco de desenvolver doença autoimune.
"Deslipidação" no presente destina-se a remover lipídio deamostra biológica, tal como soro. Deslipidação é desejável para a remoção delipídios que podem estar presentes na amostra e podem bloquear ou obstruircoluna de purificação. Deslipidação pode ser atingida por meio de váriosmétodos que incluem o uso de absorvente (tal como LIPOSORB®; ésteres desorbitan/ésteres de polioxietileno sorbitan), extração orgânica, filtragem,centrifugação e similares.Por "purificação por afinidade", pretende-se o uso de adsorvente,preferencialmente imobilizado, que se liga seletiva ou preferencialmente acomposto ou composição (tal como polipeptídeos que contêm região Fc) paraque seja purificado. Exemplos incluem purificação de Proteína A + G;purificação por afinidade de IgG (utilizando, por exemplo, MELON GEL®, daPierce); anticorpos antiimunoglobulina (utilizados isoladamente ou emcombinação com especificidade para um ou mais isotipos; por exemplo,combinação de IgG anti-humano, IgA, IgM e IgE1 acoplados para purificaçãopor afinidade específica de cada isotipo); qualquer outro adsorvente compropriedades de ligação de imunoglobulina (tal como PIERCE T-GEL®). Ométodo de purificação por afinidade preferida do presente envolve o uso depurificação por afinidade de Proteína A + G (vide definição abaixo) parapurificar isotipos de anticorpos de IgG, IgA, IgM e IgE de amostra biológica.
Preferencialmente, a purificação por afinidade do presente purificapolipeptídeos que contêm região Fc de essencialmente todos os isotipos.
"Polipeptídeo que contém região Fc" do presente é polipeptídeoque compreende região Fc. Exemplos destes polipeptídeos incluem anticorposterapêuticos, imunoadesinas e imunoglobulinas de pacientes (incluindo asimunoglobulinas antidrogas do paciente).
"Adsorvente" no presente é substância ou composição que écapaz de ligar outras substâncias à sua superfície sem nenhuma ligaçãocovalente. Preferencialmente, o adsorvente é imobilizado.
Adsorvente "imobilizado" é aquele que é afixado a fase sólida.
"Fase sólida" indica matriz não aquosa à qual pode ser ligadoadsorvente. A fase sólida de interesse no presente geralmente é aquela quecompreende superfície de vidro, sílica, agarose ou poliestireno. A fase sólidapode compreender, por exemplo, coluna de purificação ou fase descontínua departículas discretas."Purificação por afinidade de proteína A + G" indica no presente ouso de Proteína A e Proteína G, incluindo suas variantes, fragmentos e/oufusões, preferencialmente imobilizadas sobre fase sólida, para removerimunoglobulinas ou polipeptídeos que contêm região Fc de amostra. Estapurificação inclui purificação de Proteína A e Proteína G essencialmentesimultânea, bem como purificação seqüencial em qualquer ordem (ou seja,Proteína A seguida por Proteína G e vice versa).
"Concentração" no presente indica o aumento da concentração decomposto ou composição de interesse. A concentração de imunoglobulinas emamostra pode ser aumentada, por exemplo, utilizando concentrador (tal comoconcentrador de proteínas Pierce ICON® ou CENTRICON-30®), centrifugação,filtragem etc.
A expressão "atividade biológica" designa função mensurável deagente, tal como anticorpo terapêutico ou imunoadesina no presente. Váriasatividades são contempladas e incluem, mas sem limitar-se a citotoxicidadedependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célulasdependente de anticorpos (ADCC), apoptose, modulação de canais de íons,inibição do crescimento de células (tais como células que expressem antígenoao qual o anticorpo terapêutico ou imunoadesina pode ligar-se, etc.
"Teste de atividade biológica" designa teste que avalia aatividade biológica de agente ou composição, tal como anticorpoterapêutico ou imunoadesina.
No presente, "teste com base em células" é bioteste que utilizacélulas, incluindo linhagens celulares, para avaliar a atividade biológica deagente ou composição, tal como anticorpo terapêutico ou imunoadesina.Preferencialmente, a célula ou linhagem celular utilizada no teste expressaantígeno ao qual liga-se anticorpo terapêutico ou imunoadesina.
A capacidade de amostra biológica (incluindo amostrapreviamente tratada ou preparação de imunoglobulina purificada) para"bloquear" atividade biológica de antagonista ou anticorpo designa o bloqueiocompleto ou parcial daquela atividade.
"Anticorpos neutralizantes" no presente indica anticorpos que nãoapenas se ligam a antígeno (como anticorpo terapêutico ou imunoadesina) deinteresse, mas adicionalmente inibem, até certo ponto, atividade biológicadaquele antígeno.
No presente, "teste de anticorpo neutralizante" é teste que avaliaa presença de anticorpos neutralizantes em amostra.
"Interferência" no presente designa a presença de composto(s) oucomposição(ões) que interfere(m) com a capacidade de reprodução de teste deatividade biológica com base em células, tal como teste de anticorponeutralizante. A presença de interferência em amostra pode ser confirmada,por exemplo, por meio de teste de soro de pacientes autoimunes nativos dadroga da população alvo na qual o bioteste deve ser realizado. Quando o testedemonstrar reações celulares altamente variáveis entre esses indivíduos, pode-se concluir que a interferência de soro está presente em uma ou maisamostras. Preferencialmente, a interferência não é fator reumatóide (RF),imunoglobulina ou droga com a qual paciente tenha sido tratado.
"Célula B" é linfócito que amadurece dentro da medula óssea einclui célula B nativa, célula B de memória ou célula B efetora (célulasplasmáticas). A célula B no presente pode ser célula B normal ou não maligna.
"Marcador da superfície de células B" ou "antígeno da superfíciede células B" no presente, é antígeno expresso sobre a superfície de células Bque pode ser dirigido com antagonista ou anticorpo que se liga a ela. Exemplosde marcadores da superfície de células B incluem os marcadores da superfíciede leucócitos de CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40,CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b,CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (para descrições, vide TheLeukocyte Antigen Facts Book, segunda edição, 1997, ed. Barclay et al,Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nova Iorque). Outros marcadores dasuperfície de células B incluem RP105, FcRH2, CR2 de células B, CCR6,P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHI,IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA e 239287. O marcador dasuperfície de células B de interesse específico é preferencialmente expressosobre células B em comparação com outros tecidos não de células B e podeser expresso sobre células B precursoras e células B maduras. Os marcadoresda superfície de células B preferidos no presente são CD20, CD22 e BR3.
O antígeno "CD20" ou "CD20" é fosfoproteína não glicosilada decerca de 35 kDa encontrada sobre a superfície de mais de 90% das células Bde sangue periférico ou órgãos linfóides. CD20 está presente tanto sobrecélulas B normais quanto sobre células B malignas, mas não é expresso emcélulas haste. Outros nomes para CD20 na literatura incluem "antígeno restritopor linfócitos B" e "Bp35". O antígeno de CD20 é descrito, por exemplo, emClark et al, Proc. Natl. Acad. Sei. (U. S. A.) 82: 1766 (1985).
"Antagonista marcador da superfície de células B" é molécula que,mediante ligação a marcador da superfície de células B, destrói ou esgota ascélulas B em mamíferos e/ou interfere com uma ou mais funções de células B,por exemplo, por meio da redução ou prevenção de reação humoral permitidapela célula Β. O antagonista é preferencialmente capaz de esgotar células B(ou seja, reduzir os níveis de células B em circulação) em pacientes com eletratados. Este esgotamento pode ser atingido por meio de vários mecanismos,tais como citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos(ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), inibição daproliferação de células B e/ou indução da morte de células B (por exemplo, viaapoptose). Os antagonistas incluídos dentro do escopo da presente invençãoincluem anticorpos, peptídeos sintéticos ou de seqüência nativa,imunoadesinas e antagonistas de moléculas pequenas que se ligam amarcador da superfície de células B tal como CD20, opcionalmente conjugadosou fundidos a agente citotóxico. O antagonista preferido compreende anticorpo.
"Antagonista de anticorpo CD20" no presente é anticorpo que,mediante ligação a CD20 sobre células B, destrói ou esgota as células B emmamíferos e/ou interfere com uma ou mais funções de células B, por exemplo, pormeio da redução ou prevenção de reação humoral permitida pela célula Β. Oantagonista de anticorpo é preferencialmente capaz de esgotar células B (ou seja,reduzir os níveis de células B em circulação) em pacientes com ele tratados. Esteesgotamento pode ser atingido por meio de vários mecanismos, tais comocitotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) e/oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC), inibição da proliferação decélulas B e/ou indução da morte de células B (por exemplo, via apoptose).
Da forma utilizada no presente, "esgotamento de células B" indicaredução dos níveis de células B em animais ou seres humanos após otratamento com anticorpo ou droga, em comparação com o nível antes dotratamento. O esgotamento de células B pode ser parcial ou completo. Osníveis de células B são mensuráveis utilizando métodos bem conhecidos, taiscomo os descritos em Reff et al, Blood 83: 435-445 (1994), ou na PatenteNorte-Americana n° 5.736.137 (Anderson et al). Como forma de exemplo,mamífero (tal como primata normal) pode ser tratado com várias dosagens doanticorpo ou imunoadesina e concentrações de células B periféricas podem serdeterminadas, por exemplo, por meio de método FACS que conta as células B.
Exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8", que agora édenominado "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente Norte-Americana n° 5.736.137);o anticorpo murino 2B8 marcado com ítrio [90] denominado "Y2B8" ou"Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) disponível comercialmente por meio daIDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente Norte-Americana n° 5.736.137; 2B8depositado na ATCC sob número de acesso HB11388 em 22 de junho de1993); lgG2a murino "B1", também denominado "Tositumomab", opcionalmentemarcado com 131I para gerar o anticorpo "131I-BI" ou "iodo I131 tositumomab"(BEXXAR®) disponível comercialmente por meio da Corixa (vide também aPatente Norte-Americana n° 5.595.721); anticorpo monoclonal murino "1F5"(Press et al, Blood 69 (2): 584-591 (1987) e suas variantes, incluindo 1F5humanizado ou com "emplastro de estrutura" (WO 2003/002607, Leung, S.;depósito ATCC HB-96450); anticorpo 2H7 murino e 2H7 quimérico (PatenteNorte-Americana n° 5.677.180); 2H7 humanizado (WO 2004/056312 (Lowmanet al) e conforme descrito abaixo); 2F2 (HuMax-CD20), anticorpo totalmentehumano de alta afinidade dirigido à molécula CD20 na membrana celular decélulas B (Genmab, Dinamarca; vide, por exemplo, Glennie e van de Winkel,Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) e Cragg et al, Blood 101: 1045-1052(2003)); WO 2004/035607; US 2004/0167319); os anticorpos monoclonaishumanos descritos em WO 2004/035607 e US 2004/0167319 (Teeling et al);em que os anticorpos contêm cadeias de açúcar ligadas por N-glicosídeoscomplexas ligadas à região Fc descrita em US 2004/0093621 (Shitara et al);anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação de antígenos que se ligam aCD20 (WO 2005/000901, Tedder et al), tais como HB20-3, HB20-4, HB20-25 eMB20-11; moléculas de ligação de CD20, tais como a série AME de anticorpos,tais como anticorpos AME 33 conforme descrito em WO 2004/103404 e US2005/0025764 (Watkins et al, Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME)]moléculas de ligação de CD20 tais como as descritas em US 2005/0025764(Watkins et al); anticorpo A20 ou suas variantes tais como anticorpo A20humanizado ou quimérico (cA20, hA20, respectivamente) ou IMMU-106 (US2003/0219433, Immunomedics); anticorpos de ligação de CD20, incluindo Leu-16, 1H4 ou 2B8 esgotados por epítopos, opcionalmente conjugados com IL-2,como em US 2005/0069545A1 e WO 2005/16969 (Carr et al); anticorpobiespecífico que liga CD22 e CD20, tal como hLL2xhA20 (WO 2005/14618,Chang et al); anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ou NU-B2disponíveis por meio da International Leukocyte Typing Workshop (Valentine etal, em: Leukocyte Typing Ill (McMichael, Ed., pág. 440, Oxford University Press(1987)); 1H4 (Haisma et al, Blood 92: 184 (1998)); conjugado de auristatina Eanti-CD20 (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope);terapia com MAb anti-CD20 (EpiCyte); anticorpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion).
Os anticorpos CD20 preferidos no presente são anticorpos CD20 quiméricos,humanizados ou humanos, de maior preferência rituximab, 2H7 humanizado,anticorpo CD20 humano 2F2 (Hu-Max-CD20) (Genmab) e anticorpo A20humanizado ou IMMUN-106 (Immunomedics).
Os termos "rituximab" ou "RITUXAN®" no presente indicam oanticorpo monoclonal humano/murino quimérico geneticamente elaborado dirigidocontra o antígeno CD20 e denominado "C2B8" na Patente Norte-Americana n°5.736.137, incluindo seus fragmentos que retêm a capacidade de ligar CD20.
Puramente para os propósitos do presente e a menos queindicado em contrário, anticorpo "2H7 humanizado" é variante humanizada deanticorpo 2H7 murino, em que o anticorpo é eficaz para reduzir células B emcirculação in vivo.
Em uma realização, o anticorpo 2H7 humanizado compreendeuma, duas, três, quatro, cinco ou seis das seqüências de CDR a seguir:
seqüência de CDR L1 RASSSVSYXH em que X é M ou L (SEQID N0 21), tal como SEQ ID N0 4 (Fig. 1A),seqüência de CDR L2 de SEQ ID N0 5 (Fig. 1A),
seqüência de CDR L3 QQWXFNPPT em que X é S ou A (SEQ IDN0 22), tal como SEQ ID N0 6 (Fig. 1A),
seqüência de CDR H1 de SEQ ID N0 10 (Fig. 1B),seqüência de CDR H2 de AIYPGNGXTSYNQKFKG em que X é Dou A (SEQ ID N0 23), tal como SEQ ID N0 11 (Fig. 1B) e
seqüência de CDR H3 de WYYSXXYWYFDV em que o X naposição 6 é N1 A, Y1 W ou D e o X na posição 7 é S ou R (SEQ ID N0 24), talcomo SEQ ID N0 12 (Fig. 1B).
As seqüências de CDR acima geralmente estão presentes emseqüências de estrutura leve variável e pesada variável humanas, tais comosubstancialmente os resíduos de FR de consenso humano de subgrupo I capade cadeia leve humana (VlI) e substancialmente os resíduos de FR deconsenso humano de subgrupo de cadeia pesada humana Ill (VrIII). Vid etambém WO 2004/056312 (Lowman et al).
A região pesada variável pode ser ligada a região constante dacadeia de IgG humana, em que a região pode ser, por exemplo, IgGI ou lgG3,que inclui regiões constantes variáveis e de seqüência nativa.
Em realização preferida, esse anticorpo compreende a seqüênciade domínio pesado variável de SEQ ID N0 8 (v16, conforme exibido na Fig. 1B),que opcionalmente também compreende a seqüência de domínio leve variávelde SEQ ID N0 2 (v16, conforme exibido na Fig. 1A), que compreendeopcionalmente uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 56,100 e/ou 100a, tais como D56A, N100A, N100Y e/ou SIOOaR no domíniopesado variável e uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 32e/ou 92, tais como M32L e/ou S92A, no domínio leve variável.Preferencialmente, o anticorpo é anticorpo intacto que compreende asseqüências de aminoácidos de cadeia leve de SEQ ID N0 13 ou 15 eseqüências de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID N0 14, 16, 17 ou 20.
Anticorpo 2H7 humanizado preferido é ocrelizumab (Genentech).O anticorpo do presente pode compreender adicionalmente pelomenos uma substituição de aminoácido na região Fc que aumenta a atividadede ADCC1 tal como aquele em que as substituições de aminoácidos estão nasposições 298, 333 e 334, de maior preferência S298A, E333A e K334A,utilizando numeração Eu de resíduos de cadeia pesada. Vide também aPatente Norte-Americana n° 6.737.056 B1, Presta.
Qualquer destes anticorpos pode compreender pelo menos umasubstituição na região Fc que aumenta a ligação de FcRn ou meia vida emsoro, tal como substituição na posição 434 de cadeia pesada, tal como N434W.Vide também a Patente Norte-Americana n° 6.737.056 B1, Presta.
Qualquer desses anticorpos pode ainda compreender pelo menosuma substituição de aminoácido na região Fc que aumenta a atividade deCDC, compreendendo, por exemplo, pelo menos uma substituição na posição326, preferencialmente K326A ou K326W. Vide também a Patente Norte-Americana n° 6.528.624 B1 (Idusogie et al).
Algumas variantes 2H7 humanizadas preferidas são aquelas quecompreendem o domínio leve variável de SEQ ID N0 2 e o domínio pesadovariável de SEQ ID N0 8, que incluem aqueles com ou sem substituições emregião Fc (quando presente) e os que compreendem domínio pesado variávelcom alteração N100A; ou D56A e N100A; ou D56A, N100Y e S100aR; em SEQID N0 8 e domínio leve variável com alteração M32L; ou S92A; ou M32L eS92A; em SEQ ID N0 2.
M34 no domínio pesado variável de 2H7.v16 foi identificadocomo fonte potencial de estabilidade de anticorpos e é outro candidatopotencial para substituição.
Em resumo de algumas das diversas realizações preferidas dapresente invenção, a região variável de variantes com base em 2H7.v16compreende as seqüências de aminoácidos de v16, exceto nas posições desubstituições de aminoácidos que são indicadas na Tabela 1 abaixo. A menos queindicado em contrário, as variantes de 2H7 conterão a mesma cadeia leve de v16.Tabela 1
Exemplos de Variantes de Anticorpo 2H7 Humanizado
<table>table see original document page 34</column></row><table>
2H7 humanizado preferido compreende a seqüência de domínioleve variável 2H7.v16:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N0 2);e a seqüência de domínio pesado variável 2H7.v16:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHVWRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0 8).
Quando o anticorpo 2H7.v16 humanizado for anticorpo intacto, elepode compreender a seqüência de aminoácidos de cadeia leve:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0 13);
e a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID N0 14 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID N0 17).
Outro anticorpo 2H7 humanizado preferido compreendeseqüência de domínio leve variável 2H7.v511:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N0 18)
e a seqüência de domínio pesado variável 2H7.v511:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGN GATS YN Q KF KG RFTIS VD KS KNTLYLQ M N S LRAE DTA VYYCAR WYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0 19).
Quando o anticorpo 2H7.v511 humanizado for anticorpo intacto,ele pode compreender a seqüência de aminoácidos de cadeia leve:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0 15)
e a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada de SEQ ID N° 16 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID N0 20).
Para os propósitos do presente, "imunoterapia" designará método detratamento de mamífero (preferencialmente paciente humano) com anticorpo, emque o anticorpo pode ser anticorpo não conjugado ou "bruto", ou o anticorpo podeser conjugado ou fundido com agente(s) ou molécula(s) heteróloga(s), tal(is) comoum ou mais agentes citotóxicos, de forma a gerar "imunoconjugado".
Da forma utilizada no presente, "anticorpo terapêutico" é anticorpoque é eficaz no tratamento de doença ou disfunção (preferencialmente doençaautoimune) em mamíferos com a doença ou disfunção ou a elas pré-dispostos.Exemplos de anticorpos terapêuticos incluem anticorpos HER2 que incluemtrastuzumab (HERCEPTIN®) (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 89:4285-4289 (1992), Patente Norte-Americana n° 5.725.856) e pertuzumab(OMNITARG®) (WO 01/00245); anticorpos CD20 (vide abaixo); anticorpos IL-8(St. John et al, Chest1 103: 932 (1993) e Patente Internacional n0 WO95/23865); anticorpos VEGF ou receptores de VEGF que incluem anticorposVEGF humanizados e/ou amadurecidos por afinidade, tais como o anticorpoVEGF humanizado huA4.6.1 bevacizumab (AVASTIN®) e ranibizumab(LUCENTIS®) (Kim et al, Growth Factors, 7: 53-64 (7: 53-64 (1992)), PatentesInternacionais n° WO 96/30046 e WO 98/45331, publicadas em quinze deoutubro de 1998); anticorpos PSCA (WO 01/40309); anticorpos CD11a queincluem efalizumab (RAPTIVA®) (Patente Norte-Americana n° 5.622.700, WO98/23761, Steppe et al, Transplant Intl. 4: 3-7 (1991) e Hourmant et al,Transplantation 58: 377-380 (1994)); anticorpos que ligam IgE incluindoomalizumab (XOLAIR®) (Presta et al, J. Immunol. 151: 2623-2632 (1993) ePatente Internacional n° WO 95/19181; Patente Norte-Americana n° 5.714.338,emitida em três de fevereiro de 1998, ou Patente Norte-Americana n°5.091.313, emitida em 25 de fevereiro de 1992, WO 93/04173, publicada emquatro de março de 1993, ou Pedido Internacional n° PCT/US 98/13410,depositado em trinta de junho de 1998, Patente Norte-Americana n° 5.714.338);anticorpos CD18 (Patente Norte-Americana n° 5.622.700, emitida em 22 deabril de 1997, ou como em WO 97/26912, publicada em 31 de julho de 1997);anticorpos receptores de Apo-2 (WO 98/51793, publicada em 19 de novembrode 1998); anticorpos de Fator de Tecido (TF) (Patente Européia n° 0.420.937B1, concedida em nove de novembro de 1994); anticorpos α4-α7 integrina (WO98/06248, publicada em 19 de fevereiro de 1998); anticorpos EGFR (tais comoanticorpo 225 quimerizado ou humanizado, cetuximab, ERBUTIX® como emWO 96/40210, publicada em 19 de dezembro de 1996); anticorpos CD3 taiscomo OKT3 (Patente Norte-Americana n° 4.515.893, emitida em sete de maiode 1985); anticorpos CD25 ou Tac tais como CHI-621 (SIMULECT®) eZENAPAX® (vide Patente Norte-Americana n° 5.693.762, emitida em dois dedezembro de 1997); anticorpos CD4, tais como o anticorpo cM-7412 (Choy etal, Arthritis Rheum. 39 (1): 52-56 (1996); anticorpos CD52, tais comoCAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al, Nature 332: 323-337 (1988));anticorpos receptores de Fc tais como o anticorpo M22 dirigido contra FcyRIcomo em Graziano et al, J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 (1995); anticorposantígenos carcinoembriônicos (CEA)1 tais como hMN-14 (Sharkey et al, CâncerRes. 55 (23 Supl.): 5935s-5945s (1995)); anticorpos dirigidos contra célulasepiteliais mamárias que incluem huBrE-3, huMc 3 e CHL6 (Ceriani et al, CâncerRes. 55 (23): 5852s-5856s (1995); e Richman et al, CancerRes. 55 (23 Supl.):5916s-5920s (1995)); anticorpos que se ligam a células de carcinoma do cólontais como C242 (Litton et al, Eur. J. Immunol. 26 (1): 1-9 (1996)); anticorposCD38, tais como AT 13/5 (Ellis et al, J. Immunol. 155 (2): 925-937 (1995));anticorpos CD33, tais como Hu M195 (Jurcic et al, Câncer Res. 55 (23 Supl.):5908s-5910s (1995)) e CMA-676 ou CDP771; anticorpos EpCAM, tais como17-1A (PANOREX®); anticorpos Gpllb/llla, tais como abciximab ou c7E3 Fab(REOPRO®); anticorpos RSV, tais como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticorposCMV1 tais como PROTOVIR®; anticorpos HIV, tais como PR0542; anticorposda hepatite, tais como o anticorpo Hep B OSTAVIR®; anticorpo CA 125OvaRex; anticorpo de epítopo GD3 idiotípico BEC2; anticorpo Vv33 (tal comoVITAXIN®; Medimmune); anticorpo de carcinoma das células renais humanas,tais como ch-G250; ING-1; anticorpo anti-17-1A humano (3622W94); anticorpoanti-tumor colo-retal humano (A33); anticorpo anti-melanoma humano R24dirigido contra GD3 gangliosídeo; anti-carcinoma de células escamosashumano (SF-25); anticorpo de antígeno de leucócitos humanos (HLA) tal comoSmart ID10 e o anticorpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1); anticorpo CD37, talcomo TRU 016 (Trubion); anticorpo IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk);anticorpo anti-células B (lmpheron); MAb direcionador de células B(Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS);anticorpo Lym-1, tal como Lym-1Y-90 (USC) ou anti-Lym-1 Oncolym(USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); anticorpo BAFF (tal comoWO 03/33658); anticorpo receptor de BAFF (tal como WO 02/24909);anticorpo BR3; anticorpo Blys1 tal como belimumab; LYMPHOSTAT-B®;ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); gomilixima (Idec 152; Biogen Idec);anticorpo receptor de IL-6, tal como atlizumab (ACTEMRA®;Chugai/Roche); anticorpo IL-15, tal como HuMax-ll-15 (Genmab/Amgen);anticorpo receptor de quemoquina, tal como anticorpo CCR2 (por exemplo,MLN1202; Millieneum); anticorpo anti-complemento, tal como anticorpo C5(por exemplo, eculizumab, 5G1.1; Alexion); formulação oral deimunoglobulina humana (tal como IgPO; Protein Therapeutics); anticorpoIL-12, tal como ABT-874 (CAT/Abbott); Teneliximab (BMS-224818; BMS);anticorpos CD40, incluindo S2C6 e suas variantes humanizadas (WO00/75348) e TNX 100 (Chiron/Tanox); anticorpos TNF-α, incluindo cA2 ouinfliximab (REMICADE®), CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA®);fragmento de anticorpo TNF-V pegilado, tal como CDP-870 (Celltech),D2E7 (Knoll), anticorpo policlonal anti-TNF-oc (por exemplo, PassTNF;Verigen); anticorpos CD22, tais como LL2 ou epratuzumab(LYMPHOCIDE®; Immunomedics), incluindo epratuzumab Y-90 eepratuzumab 1-131, anticorpo CD22 da Abiogen (Abiogen, Itália), CMC 544(Wyeth/Celltech), combotox (UT Southwestern), BL22 (NIH) e LympoScanTc99 (Immunomedics). Preferencialmente, o anticorpo terapêutico dopresente é anticorpo intacto bruto útil no tratamento de doençasautoimunes, tais como RA e/ou SLE.
Da forma utilizada no presente, o termo "imunoadesina" designamoléculas que combinam a especificidade de ligação de proteína heteróloga("adesina") com as funções efetoras de domínios constantes deimunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem fusão deseqüência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada, que édiferente do sítio de ligação e reconhecimento de antígenos de anticorpo (ouseja, é "heteróloga") e seqüência de domínio constante de imunoglobulina (taiscomo seqüências CH2 e/ou CH3 de IgG). Exemplos de seqüências de adesinaincluem seqüências de aminoácidos contíguas que compreendem uma porçãode receptor (no presente, "domínio de ligação de ligante") ou Iigante (nopresente, "domínio de ligação de receptor") que se liga a proteína de interesse.
Seqüências de adesina também incluem seqüências que se ligam a proteínade interesse, mas não são seqüências de Iigantes ou receptores (tais comoseqüências de adesina em corpos de peptídeos). Essas seqüências depolipeptídeos podem ser selecionadas ou identificadas por meio de diversosmétodos, que incluem métodos de exibição de fagos e métodos deordenamento de alto rendimento.
A expressão "domínio de ligação de ligante", da forma utilizada nopresente, designa qualquer receptor da superfície celular nativo ou qualquer regiãoou seu derivado que retenha pelo menos a capacidade de ligação de ligantequalitativo de receptor nativo correspondente. Em realização específica, o receptoré de polipeptídeo de superfície celular que contém domínio extracelular que éhomólogo a membro da superfamília genética da imunoglobulina. Outros receptoresque não são membros da superfamília genética da imunoglobulina mas que,mesmo assim, são especificamente cobertos pela presente definição, sãoreceptores para citocinas, particularmente receptores com atividade de tirosinoquinase (tirosino quinases receptoras), membros das superfamílias de receptoresde fator de crescimento dos nervos e hematopoietina e moléculas de adesãocelular, tais como (E-, L- e P-) seletinas.
A expressão "domínio de ligação de receptor" é utilizada paradesignar qualquer Iigante nativo para receptor, incluindo moléculas de adesãocelular, ou qualquer região ou derivado desse Iigante nativo que retenha pelomenos a capacidade de ligação de receptor qualitativo de Iigante nativocorrespondente. Esta definição, entre outras, inclui especificamente seqüênciasde ligação de Iigantes para os receptores mencionados acima.
"Quimera de anticorpo e imunoadesina" compreende moléculaque combina pelo menos um domínio de ligação de anticorpo (conformedefinido no presente) com pelo menos uma imunoadesina (conforme definidono presente pedido). Exemplos de quimeras de anticorpos e imunoadesina sãoas quimeras CD4-lgG biespecíficas descritas em Berg et al, PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) e Chamow et al, J. Immunol. 153: 4268 (1994).
"Tratamento" de paciente no presente designa tratamentoterapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Os necessitados detratamento incluem os que já detêm a doença, bem como aqueles em que adoença deve ser evitada. Desta forma, o paciente pode haver sidodiagnosticado como tendo a doença ou pode ser predisposto ou suscetível àdoença. O termo "tratamento", "tratar" ou "em tratamento", da forma utilizada nopresente, inclui tratamento preventivo (tal como profilático), paliativo e curativo.
A expressão "quantidade eficaz" designa quantidade de droga (talcomo anticorpo ou imunoadesina) que é eficaz para prevenir, melhorar ou tratarda doença. Essa quantidade eficaz geralmente resultará em melhoria dossinais ou sintomas da doença.
A expressão "agente imunossupressivo", da forma utilizada nopresente para terapia adjunta, designa substâncias que agem para suprimir oumascarar o sistema imunológico do paciente sendo tratado no presente. Issoincluiria substâncias que suprimem a produção de citocinas, regulam parabaixo ou suprimem a expressão de autoantígenos ou mascaram os antígenosde MHC. Exemplos desses agentes incluem pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituídas (vide a Patente Norte-Americana n° 4.665.077); drogasantiinflamatórias não esteroidais (NSAIDs); ganciclovir, tacrolimus,glucocorticóides tais como cortisol ou aldosterona, agentes antiinflamatóriostais como inibidor da ciclooxigenase, inibidor da 5-lipoxigenase ou antagonistareceptor de leucotrienos; antagonistas de purina, tais como azatioprina oumicofenolato mofetil (MMF); agentes alquilantes, tais como ciclofosfamida;bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldeído (que mascara os antígenos deMHC1 conforme descrito na Patente Norte-Americana n° 4.120.649); anticorposanti-idiotípicos para antígenos de MHC e fragmentos de MHC; ciclosporina; 6-mercaptopurina; esteróides, tais como corticoesteróides, glucocorticoesteróidesou análogos de glucocorticóides, como prednisona, metilprednisolona, incluindometilprednisolona succinato de sódio SOLU-MEDROL® e dexametasona;inibidores da di-hidrofolato reductase tais como metotrexato (oral ousubcutâneo); agentes anti-malária, tais como cloroquina e hidroxicloroquina;sulfasalazina; leflunomida; citocina ou anticorpos ou antagonistas receptores decitocina, incluindo anticorpos anti-interferona-alfa, beta ou gama; anticorposanti-fator de necrose tumoral (TNF) alfa (infliximab (REMICADE®) ouadalimumab); imunoadesina anti-TNF-alfa (etanercept), anticorpos anti-TNF-beta, anticorpos anti-interleucina-2 (IL-2) e anticorpos anti-receptor IL-2; eantagonistas e anticorpos receptores anti-interleucina-6 (IL-6); anticorpos anti-LFA-1, incluindo anticorpos anti-CD11a e anti-CD18; anticorpos anti-L3T4;globulina anti-linfócitos heterólogos; anticorpos pan-T, preferencialmenteanticorpos anti-CD3 ou anti-CD4/CD4a; peptídeos solúveis que contêmdomínio de ligação de LFA-3 (WO 90/08187, publicada em 26 de julho de1990); estreptoquinase; fator beta de crescimento de transformação (TGF-beta); estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro; FK506; RS-61443;clorambucil; desoxiespergualin; rapamicin; receptor de células T (Cohen et al,Patente Norte-Americana n° 5.114.721); fragmentos receptores de células T(Offner et al, Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway1 Nature,341: 482 (1989); e WO 91/01133; antagonistas de BAFF1 tais como anticorposBAFF ou BR3 ou imunoadesinas e antagonistas de zTNF4 (para análise, videMackay e Mackay1 Trends Immunol., 23: 113-5 (2002) e vide também adefinição abaixo); agentes biológicos que interferem com sinais auxiliares decélulas T1 tais como receptor anti-CD40 ou Iigante anti-CD40 (CD154),incluindo anticorpos bloqueadores para Iigante CD40-CD40 (por exemplo,Durie et al, Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al, J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)) e CTLA4-lg (Finck et al, Science, 265: 1225-7 (1994)); e anticorposreceptores de células T (EP 340.109), tais como T10B9.
Da forma utilizada no presente, "antagonista de BAFF" designageralmente qualquer composto que iniba diretamente a atividade biológica deBAFF. Molécula inibe diretamente a atividade biológica de BAFF por meio deinteração com polipeptídeo de BAFF, gene BAFF1 transcripto de BAFF oureceptor de BAFF. Antagonista de BAFF pode, por exemplo, ligar-se eneutralizar a atividade de BAFF; reduzir os níveis de expressão de BAFF;afetar a estabilidade de BAFF; afetar a divisão proteolítica da forma ligada pormembrana de BAFF na forma solúvel; interferir com a ligação de BAFF a um oumais receptores; ou pode interferir com a sinalização intracelular de um oumais receptores de BAFF. Antagonistas de BAFF podem ser proteináceos (taiscomo anticorpos, proteínas de fusão de receptores, peptídeos, corpos depeptídeos, mutantes de BAFF negativos dominantes) ou moléculas nãoproteináceas (tais como moléculas orgânicas pequenas (menos de cerca de500 Da)), incluindo siRNA e aptâmeros etc. Métodos de determinação daatividade biológica neutralizadora de antagonistas de BAFF incluem osconhecidos e descritos na técnica. Exemplos de antagonistas de BAFF incluempolipeptídeos que compreendem porção de ligação de BAFF de receptor deBAFF ou sua variante de ligação de BAFF (tais como WO 01/12812, WO02/24909, WO 00/40716, WO 03/024991), anticorpos anti-BAFF (tais como WO03/33658), corpo de peptídeo de ligação de BAFF (tal como WO 02/092620),anticorpos anti-BAFF-R (tais como WO 02/24909) e peptídeos de ligação deBAFF (tais como WO 02/16412). Segundo realização, o antagonista de BAFF éselecionado a partir do grupo que consiste de BCMA-Fc (tal como WO01/12812), BAFF-R-Fc (tal como WO 02/24909), TACI-Ig (tal como WO00/40716), anticorpo anti-BAFF (tal como WO 03/33658), anticorpo anti-BAFF-R (tal como WO 02/24909), corpos de peptídeos de ligação de BAFF (taiscomo WO 02/092620), BAFF negativo dominante (tal como WO 04/081043).
Segundo realização adicional, anticorpos anti-BAFF e anticorpos receptoresanti-BAFF são humanos, humanizados, quimerizados ou aprimorados de outraforma para tratamento em seres humanos.
A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente,indica substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causadestruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos(tais como At211, I1311 I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas demoléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos.
"Agente quimioterápico" é composto químico útil no tratamento decâncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, taiscomo tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquila, tais comobusulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa,carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas,incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida,trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmentebulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®);beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; camptotecin (incluindoo análogo sintético topotecan (Η YCAMTI Ν®), CPT-11 (irinotecan,CAMPTOSAR®), acetilcamptotecin, escopolectin e 9-aminocamptotecin);briostatin; calistatin; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticosadozelesin, carzelesin e bizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico;teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8);dolastatin; duocarmicin (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobin; pancratistatin; sarcodictiin; espongistatin; mostardas denitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina,ifosfamida, mecloretamina, cloridrato oxido de mecloretamina, melfalan,novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil;nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, Iomustina1nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (porexemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 ecaliqueamicina ômega 11 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicin, incluindo dinemicin A; esperamicin; bem comoneocarzinostatin cromoforo e cromoforos antibióticos de enediinacromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicin, autramicin,azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin,cromomicinas, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicin (incluindo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicin,cianomorfolino-doxorubicin, 2-pirrolino-doxorubicin, injeção de Iipossomodoxorubicin HCI (DOXIL®), doxorubicin lipossômico TLC D-99 (MYOCET®),doxorubicin lipossômico pegilado (CAELYX®) e desoxidoxorubicin), epirubicin,esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicinas tais como mitomicina C, ácidomicofenólico, nogalamicin, olivomicinas, peplomicin, potfiromicin, puromicin,quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin, tubercidin, ubenimex,zinostatin, zorubicin; antimetabólitos, tais como metotrexato, gemcitabina(GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), epotilona e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterin, metotrexato,pteropterin, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais comoancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina,doxifluridina, enocitabina, fioxuridina; anti-adrenais, tais como aminogiutetimida,mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico;aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil;amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina;diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio;hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatin;fenamet; pirarubicin; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo depolissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxin;sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridinA e anguidina); uretano; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol;pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, tais comopaclitaxel (TAXOL®), formulação de nanopartículas elaboradas com albuminade paclitaxel (ABRAXANE®) e docetaxel (TAXOTERE®); clorambucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais comocisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vincas, que evitam que a polimerizaçãode tubulin forme microtúbulos, incluindo vinblastina (VELBAN®); vincristina(ONCOVIN®); vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) e vinorelbina (NAVELBINE®);etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovovin; novantrona;edatrexato; daunomicin; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomeraseRFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico,incluindo bexaroteno (TARGRETIN®); bifosfonatos, tais como clodronato (porexemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácidozoledrônico/zoledronato (ZOMETA(R)), alendronato (FOSAMAX(R)),pamidronato (AREDIA(R)), tiiudronato (SKELID(R)) ou risedronato(ACTONEL(R)), troxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeocitosina);®igonucleotídeos sem sentido, particularmente os que inibem aexpressão de genes em processos de sinalização implicados na proliferação decélulas aberrantes, tais como PKC-alfa, Raf1 H-Ras e receptor de fator decrescimento epidérmico (EGF-R); ;vacinas, tais como vacina THERATOPE(R)e vacinas de terapia genética, tais como vacina ALLOVECTIN(R), vacinaLEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor de topoisomerase 1 (tal comoLURTOTECAN®), rmRH (tal como ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib;Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifosine, inibidor de COX-2 (tal como celecoxib ouetoricoxib), inibidor de proteossomo (tal como PS341); bortezomib(VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inibidor de Bcl-2,tal como oblimersen sódio (GENASENSE®); pixantrona; e sais, ácidos ouderivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem comocombinações de dois ou mais dos acima, tais como CHOP, abreviação deterapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina e prednisolona, eFOLFOX, abreviação de regime de tratamento com oxaliplatin (ELOXATIN®)combinada com 5-FU e leucovovin.
No presente, agentes quimioterápicos incluem "agentes anti-hormonais" ou "terapêuticos endócrinos", que agem para regular, reduzir,bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimentodo câncer. Eles próprios podem ser hormônios, incluindo, mas sem limitar-se a:antiestrógenos com perfil agonista/antagonista misturado, incluindo tamoxifen(NOVALDEX®), 4-hydroxytamoxifen, toremifeno (FARESTON®), idoxifeno,droloxifeno, raloxifeno (EVISTA®), trioxifeno, queoxifeno e moduladoresreceptores de estrógenos seletivos (SERMs), tais como SERM3;antiestrógenos puros sem propriedades agonistas, tais como fulvestrante(FASLODEX®) e EM800 (esses agentes podem bloquear a dimerização dereceptores de estrógenos (ER), inibir a ligação de DNA1 aumentar o rendimentode ER e/ou suprimir os níveis de ER); inibidores da aromatase, incluindoinibidores da aromatase esteroidais, tais como formestano e exemestano(AROMASIN®), e inibidores da aromatase não esteroidais, tais como anastrazol(ARIMIDEX®), Ietrozol (FEMARA®) e aminoglutetimida, e outros inibidores daaromatase incluem vorozol (RIVISOR®), acetato de megestrol (MEGASE®),fadrozol e 4 (5)-imidazóis; agonistas de hormônios que liberam hormôniosIuteinizantes1 incluindo Ieuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), goserelin,buserelin e tripterelin; esteróides sexuais, incluindo progestinas tais comoacetato de megestrol e acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tais comodietilestilbestrol e premarin e andrógenos/retinóides tais como fluoximesterona,todo ácido transretiônico e feretinida; onapristona; antiprogesteronas;diminuidores de receptores estrógenos (ERDs); antiandrógenos tais comoflutamida, nilutamida e bicalutamida; e sais, ácidos ou derivadosfarmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem comocombinações de dois ou mais dos acima.
Da forma utilizada no presente, a expressão "inibidor de EGFR"designa compostos que se ligam ou interagem de outra forma diretamente comEGFR e evitam ou reduzem a sua atividade sinalizadora, e é alternativamentedenominado "antagonista de EGFR". Exemplos desses agentes incluemanticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Exemplos deanticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb455 (ATCC CRL HB 8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL8509) (vide Patente Norte-Americana n° 4.943.533, Mendelsohn et al) e suasvariantes, tais como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e 225humano remodelado (H225) (vide WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, anticorpo dirigido a EGFR totalmente humano (Imclone); anticorpos queligam EGFR mutante do tipo Il (Patente Norte-Americana n° 5.212.290);anticorpos quiméricos e humanizados que ligam EGFR conforme descrito naPatente Norte-Americana n° 5.891.996; e anticorpos humanos que ligamEGFR1 tais como ABX-EGF ou Panitumumab (vide WO 98/50433,Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al, Eur. J. Câncer 32A: 636-640(1996)); EMD7200 (matuzumab), anticorpo EGFR humanizado dirigido contraEGFR que compete com EGF e TGF-alfa pela ligação de EGFR (EMD/Merck);anticorpo EGFR humano, HuMax-EGFR (GenMab); anticorpos totalmentehumanos conhecidos como E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 e E7.6.3e descritos em US 6.235.883; MDX-447 (Medarex Inc.); e mAb 806 ou mAb806 humanizado (Johns et al, J. Biol. Chem. 279 (29): 30375-30384 (2004)). Oanticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com agente citotóxico, de forma agerar imunoconjugado (vide, por exemplo, EP 659.439 A2, Merck PatentGmbH). Os antagonistas de EGFR incluem moléculas pequenas tais como oscompostos descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 5.616.582, 5.457.105,5.475.001, 5.654.307, 5.679.683, 6.084.095, 6.265.410, 6.455.534, 6.521.620,6.596.726, 6.713.484, 5.770.599, 6.140.332, 5.866.572, 6.399.602, 6.344.459,6.602.863, 6.391.874, 6.344.455, 5.760.041, 6.002.008 e 5.747.498, bem comoas publicações PCT a seguir: WO 98/14451, WO 98/50038, WO 99/09016 eW099/24037. Antagonistas de EGFR de moléculas pequenas específicosincluem OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSIPharmaceuticals); PD 183805 (Cl 1033, 2-propenamida, dicloridrato de N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propóxi]-6-quinazolinil]-, PfizerInc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) 4-(3'-cloro-4'-fluoroanilino)-7-metóxi-6-(3-morfolinopropóxi)quinazolina, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-quinazolina, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-cloro-4-fluoro-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4-d]pirimidino-2,8-diamina, BoehringerIngelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1 H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroxifenil)^-[(1-feniletil)amino]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinaCL-387785 (N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida); EKB-569(N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-3-ciano-7-etóxi-6-quinolinil]-4-(dimetilamm2-butenamida) (Wyeth); AG1478 (Sugen); AG1571 (SU 5271; Sugen); inibidoresde tirosino quinase EGFR/HER2 duplos, tais como Iapatinib (GW 572016 ou N-[3-cloro-4-[(3 fluorofenil)metóxi]fenil]6[5[[[2metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-quinazolinamina; GIaxo-SmithKIine).
"Inibidor da tirosino quinase" é molécula que inibe a atividade detirosino quinase de tirosino quinase tal como receptor de HER. Exemplosdesses inibidores incluem as drogas dirigidas a EGFR observadas no parágrafoanterior; inibidor de tirosino quinase de HER2 de moléculas pequenas, tal comoTAK165 disponível por meio da Takeda; CP-724.714, inibidor seletivo oral datirosino quinase receptora de ErbB2 (Pfizer e OSI); inibidores de HER duplostais como EKB-569 (disponível por meio da Wyeth) que liga preferencialmenteEGFR mas inibe células que sobreexpressam HER2 e EGFR; Iapatinib(GW572016; disponível por meio da GIaxo-SmithKIine), inibidor de tirosinoquinase HER2 e EGFR oral; PKI-166 (disponível por meio da Novartis);inibidores pan-HER tais como canertinib (CI-1033; Pharmacia); inibidores deRaf-1 tais como agente sem sentido ISIS-5132 disponível por meio da ISISPharmaceuticals, que inibe a sinalização de Raf-1; inibidores de TK nãodirigidos por HER tais como mesilato de Imatinib (GLEEVAC®) disponível pormeio da Glaxo; inibidor de quinase I regulado extracelular MAPK CI-1040(disponível por meio da Pharmacia); quinazolinas, tais como PD 153035,4-(3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas;pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706;pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina(diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contêm porçõesnitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas sem sentido (tais como asque se ligam a ácido nucleico codificador de HER); quinoxalinas (Patente Norte-Americana n° 5.804.396); trifostinas (Patente Norte-Americana n° 5.804.396);ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores pan-HER, taiscomo CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinib (Gleevac;Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKIine); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787(Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em qualquer daspublicações de patentes a seguir: Patente Norte-Americana n° 5.804.396; WO99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396(Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, lnc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397(Zeneca); e WO 96/33980 (Zeneca).
"Agente antiangiogênico" designa composto que bloqueia ouinterfere, até certo ponto, no desenvolvimento de vasos sangüíneos. O fatorantiangiogênico pode ser, por exemplo, molécula pequena ou anticorpo que seliga a fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido napromoção da angiogênese. O fator anti-angiogênico preferido do presente éanticorpo que se liga a Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) ouseu receptor, tal como bevacizumab (AVASTIN®) ou ranibizumab(LUCENTIS®), ou anticorpo Vv33, tal como VITAXIN® (Medimmune).
O termo "citocina" é termo genérico para proteínas liberadas poruma população celular que agem sobre outra célula como mediadoresintercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfoquinas, monoquinas;interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-Ia1 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,IL-11, IL-12, IL-15, incluindo PROLEUKIN® rlL-2 e IL-4 humano e mutantes deIL-4 humano, tais como mutante que contém mutação na região de IL-4 que estáenvolvida na ligação a IL-2R gama, tal como Arg 21 é alterado para resíduo deGlu; fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores depolipeptídeos que incluem LIF e Iigante de kits (KL). Da forma utilizada nopresente, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celularrecombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüênciasnativas, que incluem entidades de moléculas pequenas produzidassinteticamente e seus sais e derivados farmaceuticamente aceitáveis.
O termo "hormônio" designa hormônios de polipeptídeos, quegeralmente são secretados por órgãos glandulares com dutos. Incluem-seentre os hormônios, por exemplo, hormônio do crescimento, tal como hormôniodo crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila ehormônio do crescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina, insulina,proinsulina, relaxina, estradiol, terapia de substituição de hormônios;andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona,epitiostanol, mepitiostano ou testolactona; pró-relaxina; hormônios deglicoproteínas tais como hormônio estimulante dos folículos (FSH), hormônioestimulante da tireóide (TSH) e hormônio Iuteinizante (LH); prolactina,lactogênio da placenta, peptídeo associado a gonadotropina de camundongos,hormônio Iiberador de gonadotropina; inibina; activina; substância inibidoramulleriana e trombopoietina. Da forma utilizada no presente, o termo hormônioinclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante eequivalentes biologicamente ativos do hormônio de seqüência nativa, queincluem entidades de moléculas pequenas produzidas sinteticamente e seussais e derivados farmaceuticamente aceitáveis.
A expressão "fator de crescimento" designa proteínas quepromovem o crescimento e incluem, por exemplo, fator de crescimentohepático; fator de crescimento de fibroblastas; fator de crescimento endotelialvascular; fatores de crescimento dos nervos, tais como NGF-β; fator decrescimento derivado de plaquetas; fatores de crescimento de transformação(TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar a insulina I e II;eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferonas, tais como interferonaα, β e γ; e fatores estimulantes de colônias (CSFs)1 tais como macrófago-CSF(M-CSF), granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF) e granulócito-CSF (G-CSF).
Da forma utilizada no presente, a expressão fator de crescimento incluiproteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentesbiologicamente ativos do fator de crescimento de seqüência nativa, queincluem entidades de moléculas pequenas produzidas sinteticamente e seussais e derivados farmaceuticamente aceitáveis.
O termo "integrina" designa proteína receptora que permite quecélulas se unam e reajam à matriz extracelular e está envolvido em umasérie de funções celulares tais como cura de feridas, diferenciação decélulas, abrigo de células de tumores e apoptose. Elas são parte de grandefamília de receptores da adesão celular que estão envolvidos em interaçõesentre células e entre célula e matriz extracelular. Integrinas funcionaisconsistem de duas subunidades de glicoproteína transmembranas,denominadas alfa e beta, que são ligadas de forma não covalente. Todas assubunidades alfa compartilham alguma homologia entre si, bem como assubunidades beta. Os receptores sempre contêm uma cadeia alfa e umacadeia beta. Exemplos incluem alfa6beta1, alfa3beta1, alfa7beta1, LFA-1etc. Da forma utilizada no presente, o termo "integrina" inclui proteínas defontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentesbiologicamente ativos da integrina de seqüência nativa, que incluementidades de moléculas pequenas produzidas sinteticamente e seus sais ederivados farmaceuticamente aceitáveis.
Para os propósitos do presente, "fator de necrose tumoral alfa"(TNF-alfa) designa molécula de TNF-alfa humana que compreende aseqüência de aminoácidos descrita em Pennica et al, Nature, 312: 721 (1984)ou Aggarwal et al, JBC, 260: 2345 (1985)."Inibidor de TNF-alfa" no presente é agente que inibe, até certo ponto,função biológica de TNF-alfa, geralmente por meio da ligação a TNF-alfa eneutralização da sua atividade. E xemplos de inibidores de TNF contempladosespecificamente no presente são etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®),adalimumab (HUMIRA®), pegsunercept TNF-R solúvel pegilado (sTNF-R1;Amgen); fragmento de anticorpo anti-TNF pegilado, CDP-870 (Celltech).
Exemplos de "drogas anti-reumáticas modificadoras de doenças"ou "DMARDs" incluem hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato,leflunomida, etanercept, infliximab (mais metotrexato oral e subcutâneo),azatioprina, D-penicilamina, sais de ouro (oral), sais de ouro (intramuscular),minociclina, ciclosporina incluindo ciclosporina A e ciclosporina local, proteína Ade estafilococo (Goodyear e Silverman, J. Exp. Med., 197 (9), págs. 1125-39(2003)), incluindo seus sais e derivados etc.
Exemplos de "drogas antiinflamatórias não esteroidais" ou"NSAIDSs" incluem aspirina, ácido acetilsalicílico, ibuprofen, naproxen,indometacin, sulindac, tolmetin, inibidores de COX-2 tais como celecoxib(CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1-il)benzenossulfonamida e valdecoxib (BEXTRA®) e meloxicam (MOBIC®),incluindo seus sais e derivados etc. Preferencialmente, eles são aspirina,naproxen, ibuprofen, indometacin ou tolmetin.
Exemplos de "anticorpos ou antagonistas de integrina" nopresente incluem anticorpo CD11a ou LFA-1, tal como efalizumab (RAPTIVA®)disponível comercialmente por meio da Genentech ou anticorpo alfa 4 integrinatal como natalizumab (ANTÈGRÈN®) disponível por meio da Biogen Idec/Elan,ou derivados de fenilalanina diazacíclicos (WO 2003/89410), derivados defenilalanina (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 e WO2003/53926), derivados de ácido fenilpropiônico (WO 2003/10135), derivadosde enamina (WO 2001/79173), derivados de ácido propanóico (WO2000/37444), derivados de ácido alcanóico (WO 2000/32575), derivados defenila substituído (Patentes Norte-Americanas n° 6.677.339 e 6.348.463),derivados de amina aromática (Patente Norte-Americana n° 6.369.229),polipeptídeos de domínio de disintegrina ADAM (US 2002/0042368), anticorpospara alfavbeta3 integrina (EP 633.945), derivados de aminoácidos bicíclicoscom ponte aza (WO 2002/02556) e 683699 (Tanabe) etc.
"Corticoesteróide" designa qualquer dentre uma série desubstâncias sintéticas ou de ocorrência natural com a estrutura química geralde esteróides que imitam ou aumentam os efeitos dos corticoesteróides deocorrência natural. Exemplos de corticoesteróides sintéticos incluemprednisona, prednisolona (incluindo metilprednisolona), tal comometilprednisolona succinato de sódio SOLU-MEDROL®), dexametasona oudexametasona triancinolona, hidrocortisona e betametasona. Oscorticoesteróides preferidos no presente são prednisona, metilprednisolona,hidrocortisona ou dexametasona.
O termo "anticorpo" é utilizado no presente no sentido mais amploe cobre especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais,anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos) formados apartir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos,desde que exibam a atividade biológica desejada.
"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma parte de anticorpointacto, que compreende preferencialmente a sua região de ligação de antígenos.Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 eFv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de fita simples; eanticorpos multiespecíficos formados com fragmentos de anticorpos.
"Anticorpo intacto" no presente é aquele que compreende duasregiões de ligação de antígenos e região Fc. Opcionalmente, o anticorpointacto possui região Fc funcional.Anticorpos "inibidores do crescimento" são aqueles que evitam oureduzem a proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual seliga o anticorpo. O anticorpo pode, por exemplo, evitar ou reduzir a proliferaçãode células B in vitro e/ou in vivo.
Os anticorpos que "induzem a apoptose" são aqueles queinduzem a morte celular programada, por exemplo de célula B, conformedeterminado por meio de testes padrão de apoptose, tais como ligação deanexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação do retículoendoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de bolhas de membrana(denominadas corpos apoptóticos). "Anticorpos nativos" são normalmenteglicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas deduas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cadacadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por ligação de dissulfeto covalente,enquanto a quantidade de ligações de dissulfeto varia entre as cadeiaspesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesadatambém contém pontes de dissulfeto intracadeias em espaços regulares. Cadacadeia pesada contém, em uma extremidade, domínio variável (Vh) seguido poruma série de domínios constantes. Cada cadeia leve contém um domíniovariável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante na sua outraextremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeirodomínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve éalinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos deaminoácidos esp ecíficos formem superfície intermediária entre os domíniosvariáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
O termo "variável" indica o fato de que certas partes dos domíniosvariáveis diferem extensamente de seqüência entre os anticorpos e sãoutilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seuantígeno específico. A capacidade de variação não é, entretanto, distribuídaregularmente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela éconcentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nosdomínios variáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As partes maisaltamente conservadas de domínios variáveis são denominadas regiões deestrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativascompreendem quatro FRs cada um, que adotam em grande parte configuraçãode folha β, conectadas por três regiões hipervariáveis, que formam laços queconectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. As regiõeshipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelasFRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para aformação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Os domíniosconstantes não estão diretamente envolvidos na ligação de anticorpo aantígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação doanticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).
A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual comum único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento "Fc" residual, cujonome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento compepsina gera fragmento de F(ab')2 que contém dois sítios de ligação deantígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.
"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio deligação de antígeno e de reconhecimento de antígeno completo. Esta regiãoconsiste de dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domíniovariável de cadeia leve em associação firme e não covalente. É nestaconfiguração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variávelinteragem para definir um sítio de ligação de antígenos sobre a superfície dodímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferemespecificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo umdomínio variável isolado (ou a metade de um Fv que compreende apenas trêsregiões hipervariáveis específicas para um antígeno) possui a capacidade dereconhecer e ligar antígeno, embora em afinidade mais baixa que o sítio deligação completo.
O fragmento de Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos deFab' diferem de fragmentos de Fab pela adição de alguns resíduos no terminalcarbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, que inclui uma ou mais cisteínas daregião de articulação do anticorpo. Fab-SH é a denominação do presente paraFab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém(êm) pelomenos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmenteproduzidos na forma de pares de fragmentos de Fab' que contêm cisteínasarticuladas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpostambém são conhecidos.
As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramentedistintos, denominados capa (κ) e Iambda (λ), com base nas seqüências deaminoácidos dos seus domínios constantes.
Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constantedas suas "cadeias pesadas" (quando presentes), anticorpos podem seratribuídos a classes diferentes. Existem cinco classes principais de anticorposintactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmentedivididas em subclasses (isotipos), tais como IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA elgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem àsdiferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ,respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionaisde diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
A menos que indicado em contrário, no presente a numeraçãodos resíduos em cadeias pesadas de imunoglobulina é a do índice EU comoem Kabat et a!, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991),expressamente incorporado ao presente como referência. O "índice EU comoem Kabat" designa a numeração de resíduos do anticorpo IgGI EU humano.
A expressão "região Fc" é utilizada no presente para definir regiãoC-terminal de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões Fc deseqüência nativa e regiões Fc variantes. Embora as fronteiras da região Fc decadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesadade IgG humano é normalmente definida como estendendo-se a partir deresíduo de aminoácido na posição Cys226 ou de Pro230, até o seu terminalcarboxila. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema denumeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante aprodução ou purificação do anticorpo ou por meio de elaboração recombinantedo ácido nucléico que codifica cadeia pesada do anticorpo.Conseqüentemente, composição de anticorpos intacos pode compreenderpopulações de anticorpos com todos os resíduos de K447 removidos,populações de anticorpos sem resíduos de K447 removidos e populações deanticorpos que possuem mistura de anticorpos com e sem o resíduo de K447.
"Região Fc funcional" possui "função efetora" de região Fc deseqüência nativa. Exemplos de "funções efetoras" incluem ligação de C1q,citotoxicidade dependente de complemento, ligação de receptor Fe;citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC);fagocitose; regulagem para baixo de receptores da superfície celular (tais comoreceptor de células B; BCR) etc. Essas funções efetoras geralmentenecessitam que a região Fc seja combinada com domínio de ligação (tal comodomínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas utilizando váriostestes conforme descrito no presente, por exemplo.
"Região Fc de seqüência nativa" compreende seqüência deaminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos de região Fc encontrada nanatureza. Regiões Fc humanas de seqüência nativa incluem região Fc de IgGIhumano de seqüência nativa (alotipos A e não A); região Fc de lgG2 humanode seqüência nativa; região Fc de lgG3 humano de seqüência nativa; e regiãoFc de lgG4 humano de seqüência nativa, bem como variantes de ocorrêncianatural de quaisquer das acima.
"Região Fc variante" compreende seqüência de aminoácidos quedifere daquela de região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos umamodificação de aminoácido, preferencialmente uma ou mais substituições deaminoácidos. Preferencialmente, a região Fc variante contém pelo menos umasubstituição de aminoácido em comparação com região Fc de seqüência nativaou com a região Fc de polipeptídeo parental, tal como cerca de uma a cerca dedez substituições de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cercade cinco substituições de aminoácidos em região Fc de seqüência nativa ou naregião Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante do presente possuirápreferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com região Fc deseqüência nativa e/ou com região Fc de polipeptídeo parental e, de maiorpreferência, pelo menos cerca de 90% de homologia com ele, de maiorpreferência pelo menos cerca de 95% de homologia com ele.
"Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos" e"ADCC" designam reação mediada por células na qual células citotóxicas nãoespecíficas que expressam receptores de Fc (FcRs) (tais como CélulasMatadoras Naturais (NK)1 neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpoligado sobre célula alvo e causam em seguida a Iise da célula alvo. As célulasprimárias para a mediação de ADCC, células NK1 expressam unicamenteFcyRIII1 enquanto monócitos expressam FcyRI1 FcyRII e FcyRIII. A expressãode FeR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, deRaveteh e Kinet1 Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para determinar aatividade de ADCC de molécula de interesse, pode ser realizado teste ADCC invitro, tal como o descrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou5.821.337. Células efetoras úteis para esses testes incluem célulasmononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais(NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula deinteresse pode ser determinada in vivo, tal como em modelo animal como odescrito em Clynes et al, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998).
"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam umaou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplosde leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononuclearessangüíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos,células T citotóxicas e neutrófilos; em que PBMCs e células NK são preferidas.
As expressões "receptor de Fc" ou "FcR" são utilizadas paradescrever receptor que se liga à região Fc de anticorpo. O FcR preferido é FcRhumano de seqüência nativa. Além disso, FcR preferido é aquele que ligaanticorpo de IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI,FeyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formasdivididas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FeyRIIA ("receptorde ativação") e FcyRIIB ("receptor de inibição"), que possuem seqüências deaminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínioscitoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém motivo de ativaçãocom base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático.
O receptor de inibição FcyRIIB contém motivo de inibição com base em tirosinaimunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide Daéron, Annu.Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capei et al, Immunomethods 4: 25-34(1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs1incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo"FcR" no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn1 que éresponsável pela transferência de IgGs maternos para o feto e homeostase deimunoglobulina (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim et al, J.Immunol. 24: 249 (1994)).
"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" designa acapacidade de molécula de Iisar alvo na presença de complemento. Oprocesso de ativação de complementos é iniciado pela ligação do primeirocomponente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (tal comoanticorpo) em complexo com antígeno cognato. Para determinar a ativação docomplemento, pode ser realizado teste de CDC1 conforme descrito, porexemplo, em Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Fragmentos de anticorpos "Fv de fita simples" ou "scFv"compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em que esses domínios estãopresentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, opolipeptídeo Fv compreende adicionalmente um Iigante de polipeptídeo entreos domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada paraligação de antígenos. Para análise de scFv, vide Plückthun em ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).
O termo "diacorpos" designa pequenos fragmentos de anticorposcom dois sítios de ligação de antígenos, que compreendem um domínio variávelde cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) namesma cadeia de polipeptídeo (Vh - VL). Utilizando Iigante que é curto demaispara permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, osdomínios são forçados a parear-se com os domínios complementares de outracadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritosmais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger etal, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A, 90: 6444-6448 (1993).
A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada nopresente, designa anticorpo obtido a partir de população de anticorpossubstancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos e/ou ligam o(s) mesmo(s) epítopo(s),exceto por possíveis variantes que podem surgir durante a produção doanticorpo monoclonal, em que essas variantes estão geralmente presentes emquantidades menores. Esse anticorpo monoclonal inclui tipicamente anticorpoque compreende seqüência de polipeptídeos que liga alvo, em que a seqüênciade polipeptídeos de ligação de alvos foi obtida por meio de processo que incluia seleção de uma única seqüência de polipeptídeos de ligação de alvo a partirde uma série de seqüências de polipeptídeos. O processo de seleção pode ser,por exemplo, a seleção de um único clone a partir de uma série de clones, talcomo conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos ou clones de DNArecombinante. Dever-se-á compreender que a seqüência de ligação de alvoselecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para aumentar aafinidade para o alvo, para humanizar a seqüência de ligação de alvo, paraaumentar a sua produção em cultura celular, para reduzir a suaimunogenicidade in vivo, para criar anticorpo multiespecífico etc., e queanticorpo que compreende a seqüência de ligação de alvo alterada também éanticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção. Ao contrário daspreparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentesanticorpos dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpomonoclonal de preparação de anticorpos monoclonais é dirigido a um únicodeterminante sobre antígeno. Além da sua especificidade, as preparações deanticorpos monoclonais são vantajosas por tipicamente não seremdescontaminadas por outras imunoglobulinas. O adjetivo "monoclonal" indica ocaráter do anticorpo como sendo obtido a partir de população de anticorpossubstancialmente homogênea e não deve ser considerado como exigindo aprodução do anticorpo por meio de qualquer método específico. Os anticorposmonoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem serpreparados, por exemplo, por meio de uma série de métodos, que incluem, porexemplo, o método de hibridoma (tal como em Kohler et al, Nature, 256: 495(1975); Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring HarborLaboratory Press, segunda edição, 1988); Hammerling et al, em: MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY, 1981)), métodos deDNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n°4.816.567), tecnologias de exibição de fagos (vide, por exemplo, Clackson etal, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991);Sidhu et al, J. Mol. Bioi 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Moi Bioi 340 (5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. U. S. A. 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al, J. Immunol. Methods 284 (1-2): 119-132 (2004), etecnologias de produção de anticorpos humanos ou similares a humanos emanimais que possuem todos ou parte dos sítios de imunoglobulina humana ougenes que codificam seqüências de imunoglobulina humana (vide, porexemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741;Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90: 2551 (1993); Jakobovits etal, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33(1993); Patentes Norte-Americanas n° 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todasda GenPharm); 5.545.807; WO 1997/17852; PatentesNorte-Americanas n°5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 e 5.661.016; Marks etal, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature, 368: 856-859(1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, NatureBiotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826(1996); e Lonberg e Huszar1 lntern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).
Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamenteanticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), em que uma parte da cadeia levee/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a classe ousubclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) éidêntico ou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivadosde outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos,bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividadebiológica desejada (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al,Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A1 81: 6851-6855 (1984)). Os anticorposquiméricos de interesse no presente incluem anticorpos "primatizados", quecompreendem seqüências de ligação de antígenos de domínio variávelderivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macaco do Velho Mundo,tal como babuíno, rhesus ou macaco cynomolgus) e seqüências de regiõesconstantes humanas (Patente Norte-Americana n° 5.693.780).
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (porexemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínimaderivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorposhumanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais osresíduos de região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos deregião hipervariável de espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade,afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de regiãoestrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos nãohumanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podemcompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem noanticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais odesempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderásubstancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveiscorrespondem aos de imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as FRs são as de seqüência de imunoglobulinahumana, exceto pela(s) substituição(ões) de FR indicada(s) acima. O anticorpohumanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte deregião constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulinahumana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525(1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
A expressão "região hipervariável", da forma utilizada no presente,indica os resíduos de aminoácidos de anticorpo que são responsáveis pelaligação de antígenos. A região hipervariável compreende resíduos deaminoácidos de "região de determinação de complementaridade" ou "CDR"(tais como os resíduos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no domíniovariável de cadeia leve e 31 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no domíniovariável de cadeia pesada; Kabat et al, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda MD (1991)) e/ou os resíduos de "circuito hipervariável" (ou seja, osresíduos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no domínio variável decadeia leve e 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no domínio variável decadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Moi Biol. 196: 901-917 (1987)).Resíduos de"estrutura" ou "FR" são os resíduos de domínios variáveis diferentes dosresíduos de região hipervariável conforme definido no presente.
"Anticorpo bruto", para os propósitos do presente, é anticorpo quenão é conjugado a porção citotóxica ou radiomarca.Anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ourecuperado de componente do seu ambiente natural. Os componentescontaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usosterapêuticos ou em diagnóstico para o anticorpo e podem incluir enzimas,hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizaçõespreferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo,conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, maisde 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinzeresíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizandoseqüenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio deSDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul deCoomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. Anticorpo isolado inclui oanticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componentedo ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, oanticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.
Anticorpo "amadurecido por afinidade" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais de suas regiões hipervariáveis, o que resulta emaumento da afinidade do anticorpo para antígeno, em comparação comanticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorposamadurecidos por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou atépicomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade sãoproduzidos por meio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al,Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descrevem amadurecimento por afinidadepor meio de troca de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos decadeia principal e/ou CDR é descrita por: Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sei, U.S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schieret al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton etal,J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154 (7): 3310-9(1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)."Exposição ao anticorpo" designa contato com o anticorpo dopresente ou exposição a ele em uma ou mais doses administradas ao longo deperíodo de tempo de cerca de um a cerca de vinte dias. As doses podem seradministradas de uma vez ou em intervalos de tempo fixos ou irregulares aolongo desse período de exposição. Exposições de anticorpos iniciais eposteriores (tais como segunda e terceira) são separadas no tempo entre siconforme descrito em detalhes no presente.
O termo "bula" é utilizado para designar instruçõescostumeiramente incluídas em embalagens comerciais de produtosterapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem,administração, contra-indicações, outros produtos terapêuticos a seremcombinados com o produto embalado e/ou avisos referentes à utilizaçãodesses produtos terapêuticos etc.
Tratamento prévio de amostra
Revelou-se no Exemplo abaixo que soro de pacientes comdoenças autoimunes, tais como RA ou SLE, contém substância(s) queinterfere(m) na capacidade de reprodução de bioteste com base em células, talcomo teste de anticorpo neutralizante. A interferência não foi fator reumatóide(RF) nem imunoglobulina.
Vários métodos foram avaliados para abordar este problema, masnão foram particularmente bem sucedidos na recuperação ou anticorposespecíficos, ou na eliminação da interferência do teste. Embora o aumento dadiluição da amostra minimizasse a interferência, a sensibilidade do teste foimuito comprometida. Outros métodos para abordar o problema da interferênciaforam avaliados. Alteração do teste de ligação com base em células ou leiturade teste, por exemplo, não solucionou o problema, nem o tratamento prévio daamostra por meio de dessalinização, deslipidação, correlação de citocinas ouprecipitação de sulfato de amônio saturado.Purificação por afinidade de imunoglobuilina foi identificada porfim como o método preferido de remoção da interferência. Esta etaparecuperou as imunoglobulinas do paciente para longe da interferência, deforma que as imunoglobulinas purificadas pudessem ser submetidas de formamais confiável a bioteste com base em células.
Conseqüentemente, a presente invenção fornece método detratamento de amostra biológica de paciente com doença autoimune quecompreende:
(a) deslipidação da amostra;
(b) purificação por afinidade de imunoglobulinas na amostra;
(c) concentração das imunoglobulinas purificadas; e
(d) submissão das imunoglobulinas concentradas a teste deatividade biológica com base em células (preferencialmente teste de anticorposneutralizantes).
As etapas (a), (b) e (c) podem ser realizadas em qualquer ordem,mas são preferencialmente conduzidas na forma da etapa (a), seguida pelaetapa (b), seguida pela etapa (c).
A amostra biológica do presente inclui várias amostras queincluem soro, plasma, Iisato celular, leite, saliva, fluido vítreo e outrassecreções, fluido sinovial, fluido da cavidade peritoneal, fluido Iacrimal ehomogenado de tecido, mas preferencialmente a amostra compreende amostrade soro. Além disso, a amostra pode apresentar-se em várias formas, queincluem líquida, congelada, resfriada, Iiofilizada etc. A amostra pode sersubmetida a etapas de tratamento ou purificação adicionais, antes e/ou depoisda etapa de purificação de afinidade do presente.
A amostra biológica pode compreender imunoglobulinas dopaciente que se ligam a anticorpo ou droga com o qual o paciente foi tratado,tal como anticorpo antimurino humano (HAMA)1 anticorpo antiquiméricohumano (HACA) ou anticorpo anti-humano humano (HAHA). HAHA pode sercontra anticorpo terapêutico humano ou humanizado. Em uma realização, aamostra é aquela que se tenha determinado contendo esses anticorpos. Sorodo paciente pode ser encontrado, por exemplo, compreendendo anticorpospara a droga em questão por meio de teste ELISA, tal como os testes ELISAdescritos no Pedido de Patente Norte-Americano n° 2005/0032130A1 (Beresinie Song) ou Pedido de Patente Norte-Americano n° 2003/0068664 (Albitar et al).
A amostra é de paciente com doença autoimune, tal como asrelacionadas acima, mas preferencialmente artrite reumatóide (RA), eritematose dolúpus sistêmico (SLE) ou mal de Sjogren, de maior preferência RA.
Além disso, o paciente de quem a amostra é obtida pode ser ouhaver sido tratado com anticorpo terapêutico, imunoadesina ou outra drogabiológica, tal como TNF-R solúvel pegilado (incluindo sTNF-R1 pegsunercept,Amgen), antagonista receptor de IL-1 (IL-IRa), tal como anaquira (KINERET®),DN-BAFF (Xencor) ou vacina tal como vacina de Iinfoma de células B (incluindoas disponíveis por meio da CRV/ATROS, Intracel, Large Scale Biology, Favrille,NCI1 Genitope etc.) ou LeukoVAX (Inflammatics).
Quando o paciente houver sido tratado com anticorpo terapêutico,o anticorpo pode ligar marcador da superfície de células B, tal como anticorpoCD20, em que exemplos desses anticorpos incluem rituximab, 2H7humanizado, anticorpo CD20 humano 2F2 (HuMax-CD20) (Genmab), anticorpoA20 humanizado ou IMMU-106 (lmmunomedics), TRU 015 (Trubion) etc. Oanticorpo CD20 preferido no presente é rituximab ou 2H7 humanizado.
Outros anticorpos terapêuticos de interesse incluem anticorpofator de necrose tumoral (TNF)-a (tal como infliximab (REMICADE®), CDP571,MAK-195, adalimumab (HUMIRA®), fragmento de anticorpo TNF-V pegilado talcomo CDP-870, anticorpo policlonal anti-TNF-α tal como PassTNF); anticorpode integrina (tal como efalizumab ou natalizumab); anticorpo BAFF (tal comoWO 03/33658); anticorpo BR3; anticorpo receptor de BAFF (tal como WO02/24909); anticorpo Blys (tal como LYMPHOSTAT-B®, belimumab;HGS/CAT); anticorpo CD37 (tal como TRU 016, Trubion); anticorpo CD22, talcomo LL2 ou epratuzumab (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), anticorpo CD22da Abiogen, CMC 544 (Wyeth/Celltech), combotox (UT Southwestern), BL22(NIH), LIF 226 (Enhanced Lifesci.); VEGF ou anticorpo receptor de VEGF1incluindo bevacizumab (AVASTIN®) e ranibizumab (LUCENTIS®); anticorpoanti-HER, incluindo trastuzumab (HERCEPTIN®), pertuzumab (OMNITARG®)e cetuximab (ERBUTIX®); anticorpo anti-IgE, incluindo omalizumab(XOLAIR®); anticorpo IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); anticorpo anti-células B (lmpheron); MAb direcionador de células B (Immunogen/Aventis);1D09C3 (Morphosys/GPC); anticorpo Lym-1 tal como Oncolym anti-Lym-1(USC/Peregrine); ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); gomilixima (Idec 152; BiogenIdec); anticorpo receptor de IL-6 tal como atlizumab (ACTEMRA®;Chugai/Roche); anticorpo IL-15 tal como HuMax-ll-15 (Genmab/Amgen);anticorpo receptor de quemoquina, tal como anticorpo CCR2 (por exemplo,MLN1202; Millieneum); anticorpo anti-complemento, tal como anticorpo C5 (porexemplo, eculizumab, 5G1.1; Alexion); formulação oral de imunoglobulinahumana (tal como IgPO; Protein Therapeutics); anticorpo IL-12 tal como ABT-874 (CAT/Abbott); Teneliximab (BMS-224818; BMS); anticorpo CD40, incluindoS2C6 e suas variantes humanizadas (WO 00/75348) e TNX 100(Chiron/Tanox); anticorpo CD52 (tal como Campath); anticorpo Vv53(VITAXIN®; Medimmune) etc.
Quando o paciente com doença autoimune houver sido tratadocom imunoadesina, a imunoadesina pode ser BR3-lg; imunoadesina TNF-α (talcomo etanercept); peptídeo anti-BAFF (tal como WO 02/092620; Amgen);TACI-Ig (Zymogenetics) (tal como WO 00/40716); BCMA-Ig (Zymo Genetics)(tal como WO 01/12812); CTLA4-lg, bloqueador de coestímulo de CD28 e B7,tal como abatacept (BMS); BAFF-R-Fc (tal como WO 02/24909); etc.
A amostra biológica é geralmente obtida do paciente antes e/oudepois que o paciente tenha sido tratado com a droga, anticorpo ou imunoadesina.Normalmente, amostras biológicas são obtidas do paciente em uma série demomentos, tais como do tratamento prévio ao longo de todo(s) o(s) ciclo(s) detratamento. A fim de evitar interferência da droga com o desempenho do teste,amostra biológica será normalmente tomada quando ocorrer a lavagem da droga.Pode-se testar, por exemplo, amostra na linha base e após três, seis e nove meses.Caso o paciente seja novamente tratado posteriormente, amostra da linha base eapós três ou seis meses pode ser tratada previamente e testada em seguida paradeterminar o anticorpo neutralizante.
Etapa de deslipidação antes da purificação por afinidade édesejável para reduzir a obstrução durante a etapa de purificação porafinidade. Pode-se utilizar absorvente líquido (tal como LIPOSORB®; ésteresde sorbitan/ésteres de polioxietileno sorbitan), mas outros métodos tais comoextração orgânica, filtragem, centrifugação etc. são disponíveis paradeslipidação da amostra.
A etapa de purificação por afinidade compreendepreferencialmente a purificação de substancialmente todos os isotipos deimunoglobulina (nomeadamente IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgEhumano, mesmo se a afinidade do adsorvente selecionado for diferente para osdiferentes isotipos). Pode-se atingir purificação por afinidade por meio decromatogarfia de proteína G, cromatografia de proteína G, cromatografia deproteína A + G (tal como cromatografia de proteína A/G conformeexemplificado, ou mistura de resinas de Proteína A e Proteína G etc.),purificação por afinidade de IgG (utilizando, por exemplo, MELON GEL® daPierce), purificação por afinidade de anticorpo antiimunoglobulina (em que osanticorpos antiimunoglobulina são utilizados isoladamente ou em combinaçãocom especificidade para um ou mais isotipos; por exemplo, combinação de IgGanti-humano, IgA1 IgM e IgE1 acoplados para purificação por afinidadeespecífica de cada isotipo); outro adsorvente com propriedades de ligação deimunoglobulina (tal como PIERCE T-GEL®) etc. Preferencialmente, purificaçãopor afinidade compreende purificação por afinidade de Proteína A + G.
A purificação por afinidade (tal como purificação por afinidade deProteína A + G) é preferencialmente repetida duas, três, quatro ou mais vezes, demaior preferência três vezes. Após o carregamento da coluna de afinidade, a fasesólida é preferencialmente lavada para remover ligação não específica e asimunoglobulinas podem ser eluídas utilizando vários tampões de eluição. O tampãode eluição preferido é compatível com teste de anticorpo neutralizante com base emcélulas subseqüente. O tampão de eluição pode ter, por exemplo, baixo pH e/ouconter ácido clorídrico (HCI), glicina, ácido trifluoroacético (TFA)1 ácido acético etc. Otampão de eluição é opcionalmente neutralizado com tampão básico e/ou soluçãosalina tamponada com fosfato (PBS) pode ser adicionada antes da realização deteste de anticorpo neutralizante.
Em uma realização, as imunoglobulinas purificadas sãosubmetidas a etapas de purificação, tratamento e concentração adicionais. Asimunoglobulinas podem ser concentradas, por exemplo, utilizandoconcentrador, ou precipitadas e novamente suspensas, ou Iiofilizadas etc.
A amostra que compreende imunoglobulinas concentradas oupurificadas é capaz em seguida de ser submetida a teste de anticorposneutralizantes, tais como os descritos no capítulo a seguir. A amostra podecompreender polipeptídeos que contêm Fc purificados, tais comoimunoglobulinas do paciente (incluindo autoanticorpos e anticorpos antidrogas),anticorpos terapêuticos e imunoadesinas e fator reumatóide (RF).
Embora teste de anticorpos neutralizantes seja o bioteste combase em células preferido no presente, a amostra previamente tratada pode sersubmetida a outros testes biológicos com base em células, que incluem, porexemplo, teste biomarcador farmacodinâmico (PD) que pode medir a atividadefuncional de droga em soro do paciente sobre células etc.
Teste de Anticorpos Neutralizantes
O método de tratamento prévio de amostra no presente épreferencialmente empregado em conjunto com teste de detecção deanticorpos neutalizantes para a droga, tais como anticorpo terapêutico ouimunoadesina ou outro biológico, ou anticorpo ou antagonista que se liga amarcador da superfície de células B (tal como para anticorpo que liga CD20). Oteste determina a capacidade de amostra biológica de paciente tratado com oanticorpo terapêutico, imunoadesina ou outra droga de bloquear atividadebiológica da droga, em que a atividade bloqueadora pode indicar redução daeficácia da droga.
Anticorpos neutralizantes podem reduzir o nível farmacológicoesperado da droga em infusão, de forma a reduzir a eficácia ou tornar maisvariável a probabilidade de reação. Anticorpos neutralizantes podem serassociados a doenças do soro ou doenças do complexo imunológico mediantenovo tratamento. Ao observar-se reação de anticorpo neutralizante, porexemplo, o tratamento pode ser suspenso ou postergado, ou a dosagem podeser aumentada, ou o paciente pode receber agentes adicionais que aumentema eficácia da droga e/ou que reduzam qualquer reação imunológica. Váriosagentes imunossupressivos que podem ser combinados com o tratamento parareduzir reação imunológica, em que reação de anticorpos neutralizantes éobservada, são conhecidos e exemplos dessas drogas são indicadosespecificamente no presente.
Além do uso dos resultados de teste por médicos no tratamentode pacientes, a propriedade neutralizante de anticorpos antidrogas, emconjunto com dados de HAMA, HACA ou HAHA, demonstram aimunogenicidade, ou tendência à imunogenicidade, bem como a natureza daimunogenicidade de drogas. Esta informação é útil para avaliar a segurança dadroga e prever potenciais reações imunológicas de pacientes a terapias.
No contexto de anticorpo CD20 ou outro antagonista que unamarcador da superfície de células B, acredita-se que o teste sejaparticularmente útil quando o tratamento com ele gere apenas esgotamentoparcial de células B, em que esteja ocorrendo hiperativação de células B (talcomo em SLE) ou em que existam sintomas persistentes da doença por váriosanos (tai como em SLE e RA).
O uso do teste com relação a pacientes que estão sendo tratadoscom a droga para tratar doença autoimune é especialmente desejável. Váriasdoenças autoimunes são descritas no presente, mas exemplos incluem artritereumatóide (RA), eritematose do lúpus sistêmico (SLE), mal de Wegener,doença intestinal inflamatória, púrpura trombocitopênica imune ou idiopática(ITP)1 púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), trombocitopenia autoimune,esclerose múltipla (MS), psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM,miastenia grave, vasculite, diabetes mellitus, síndrome de Reynaud, síndromede Sjogren, glomerulonefrite, anemia hemolítica autoimune etc.
Na realização preferida da presente invenção, o teste de atividadebiológica compreende teste biológico com base em células, tal como teste quedetermina a citotoxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidademediada por células dependente de anticorpos (ADCC), apoptose, modulaçãode canais de íons ou inibição do crescimento celular.
Preferencialmente, o teste estuda a atividade de CDC. Segundoesta realização da presente invenção, células que expressam o antígeno (talcomo marcador da superfície de células B, tal como CD20) ao qual liga-se oanticorpo terapêutico ou imunoadesina podem ser expostas a complemento(preferencialmente complemento humano) na presença (ou ausência) dadroga, bem como amostra biológica de paciente tratado com a droga. Opresente pedido contempla a exposição dos quatro componentes (células,complemento, droga e amostra biológica) simultânea ou seqüencialmente emqualquer ordem; todas estas possibilidades são englobadas no presente.
Segundo a realização preferida da presente invenção, entretanto, a amostrabiológica (tal como soro) é combinada com a droga, de forma a permitir aneutralização da atividade da droga e, em seguida, células e complemento sãoadicionados a esta mistura.
Citotoxicidade dependente de complemento (CDC) como teste deanticorpos neutralizantes de Rituximab é ilustrada na Fig. 4. O domínio de Fabde Rituximab liga -se a CD20, antígeno da superfície celular sobre linfócitos B.Uma vez ligado, o domínio Fc de Rituximab recrutará complemento e mediaráa lise celular. In vitro, o Rituximab é adicionado junto com complemento de sorohumano normal a células WIL2-S. A Iise celular é medida proporcionalmente àatividade metabólica mitocôndrica de células vivas utilizando ALAMAR BLUE®ou CELLTITER GLO® (painel superior). Ao utilizar este teste de CDC paradeterminar anticorpos de neutralização de Rituximab em soro do paciente, oRituximab é previamente incubado com os anticorpos do paciente, antes daintrodução de complemento e células (painel inferior). Anticorpo neutralizantereduzirá a potência de Rituximab, resultando em quantidades maiores decélulas vivas metabolicamente ativas. A quantidade de atividade neutralizanteem soro de paciente é medida proporcionalmente a aumento de sinaisALAMAR BLUE® ou CELLTITER GLO® em com relação a controle negativo.
Após a etapa de exposição, é determinada a atividade de CDC,preferencialmente determinando-se a viabilidade celular (ou seja,quantificando-se as células vivas). Vários métodos são disponíveis paradeterminar a viabilidade celular, incluindo a determinação da perda deintegridade da membrana conforme avaliado por meio de absorção de iodetode propídio (PI), azul de tripano (vide Moore et al, Cytotechnology 17: 1-11(1995)), anexina V ou 7AAD com relação a células não tratadas, o teste deALAMAR BLUE® (resazurin) como no Pedido de Patente Norte-Americano n°2005/0032130A1 (Beresini e Song) ou teste modificado utilizando Teste deViabilidade de Células Luminescentes CELLTITER-GLO® para a leitura deteste conforme descrito abaixo etc. Redução da capacidade do anticorpo ou daimunoadesina de mediar CDC pode indicar que anticorpos neutralizantes estãopresentes na amostra biológica.
Para teste com base em células, geralmente será utilizada linhagemcelular que expressa o antígeno ao qual se liga o anticorpo ou a imunoadesina. Nocaso do antígeno CD20, várias células são disponíveis, incluindo células WIL2-S(ATCC CRL 8885, Coleção Norte-Americana de Culturas de Tipos) ou WIL2-NS(ATCC CRL-8155), SU-DHL^ (DSMZ N0 ACC495, Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zelkulturen), ou linhagem de células B linfoblastóides queexpressam CD20. Testes de CDC que utilizam células CD20 positivas foramdescritas em Idusogie et al, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000); Idusogie et al, J.Immunol. 166: 2571-2575 (2001); Reff et al, Blood 83 (2): 435^45 (1994); PatenteNorte-Americana n° 6.194.551 B1 (Idusogie et al); e Patente Norte-Americana n°5.736.137 (Anderson et al).
Quando o teste avaliar ADCC, o anticorpo ou imunoadesina pode sertestado para determinar a sua capacidade de mediar a Iise de células MatadorasNaturais (células NK) e/ou células mononucleares do sangue periférico (PMBC) queexpressam o antígeno ao qual se liga o anticorpo terapêutico. No caso do antígenoCD20, podem ser utilizadas células WIL2-S e Shields et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001) e WO 00/42072 (Presta, L.) descrevem exemplo de teste deADCC utilizando estas células. Vide também Clynes et al, Nature Medicine 6: 443-6(2000). A Patente Norte-Americana n° 5.736.137 (Anderson et al) também descreveteste ADCC utilizando células CD20 positivas.Apoptose designa morte celular programada, por exemplo decélula B1 e pode ser determinada por meio de uma série de testes diferentes,tais como ligação de anexina V, fragmentação de DNA1 contração celular,dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação debolhas de membrana (denominadas corpos apoptóticos). Testes quedeterminam a capacidade de anticorpo (tal como Rituximab) de induzir aapoptose foram descritos em Shan et al, Câncer Immunol. Immunther. 48: 673-83 (2000); Pedersen et al, Blood 99: 1314-9 (2002); Demidem et al, CâncerChemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3): 177-186 (1997), por exemplo.
A capacidade de anticorpo ou imunoadesina de inibir ocrescimento de células, tais como células B cancerosas que expressam oantígeno ao qual se liga o antagonista ou anticorpo, pode ser determinada pormeio de uma série de diferentes testes. Taji et al, Jpn. J. Câncer Res. 89: 748-56 (1998), descrevem como determinar a inibição do crescimento de linhagensde células de Iinfoma B CD20 positivas por anticorpo CD20.
Utilizando o teste de anticorpos neutralizantes do presente, pode-se determinar a eficácia de droga (tal como uma que una CD20) medindo-se acapacidade de amostra biológica de paciente tratado com a droga de bloqueara sua atividade biológica, em que redução da atividade biológica com relação aamostra controle indica que o paciente está levantando anticorpos contra adroga em questão e/ou que esses anticorpos podem neutralizar, ao menos atécerto ponto, a sua atividade biológica. Reação significativa pode ser aquela queresulta em problema relativo à segurança a partir do desenvolvimento deanticorpos neutralizantes e/ou da necessidade de alterar a dosagem da drogaprimária em resposta à liberação alterada da droga. Em comparação com amesma quantidade de parceiro de tratamento prévio (tal como HAMA, HACA eHAHA negativo), por exemplo, amostra que neutraliza cerca de 20% ou maisda atividade da droga (tal como na faixa de cerca de 20% a cerca de 100%) emdada concentração pode ser considerada positiva para anticorposneutralizantes dirigidos contra a droga.
O teste de anticorpos neutralizantes preferido do presente ébaseado no descrito em US 2005/0032130 A1 (Beresini e Song), publicada emdez de fevereiro de 2005, mas modificado em vários aspectos conformedescrito com mais detalhes no Exemplo 1 abaixo. Particularmente, a amostrabiológica (ou seja, soro) é agora soro previamente tratado; Teste de Viabilidadede Células Luminescentes CELLTITER-GLO® é agora a leitura de teste em vezde ALAMAR BLUE® (resazurin); anticorpo controle utilizado é preparaçãopurificada de Proteína A de macaco cynomolgus (HER2 adsorvida), não anti-Rituximab de cabra; e tampões, volumes, complemento, controles, efeitos emmatriz de soro, análise de dados e interpretação foram alterados conformedescrito no Exemplo 1.
Produção de Anticorpos
A droga de interesse no presente pode ser anticorpo terapêutico,tal como um que se liga a marcador da superfície de células B, especialmenteum que se liga a CD20. Conseqüentemente, serão descritos no presentemétodos de geração de anticorpos.
O antígeno a ser utilizado para a produção ou seleção deanticorpos pode ser, por exemplo, forma solúvel do antígeno ou sua parte quecontém o epítopo desejado. Alternativa ou adicionalmente, as células queexpressam o antígeno na sua superfície celular podem ser utilizadas para gerarou selecionar anticorpos. Outras formas do antígeno úteis para a geração deanticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.
Segue-se descrição de exemplos de técnicas de produção dosanticorpos utilizados de acordo com a presente invenção.
(i) Anticorpos policlonais
Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados emanimais por meio de diversas injeções subcutâneas (sc), intraperitoneais (ip) ouintramusculares (im) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útilconjugar o antígeno relevante a uma proteína que seja imunogênica na espéciea ser imunizada tal como hemocianina de conchas, albumina de soro,tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando agente bifuncionalou derivatizante, tal como éster maleimidobenzoil sufossuccinimida(conjugação por meio de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (por meiode resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR1em que R e R1 são grupos alquila diferentes.
Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos ou derivados por meio da combinação, por exemplo, de 100 μgou 5 μg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos,respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeçãoda solução de forma intradérmica em diversos sítios. Um mês mais tarde, osanimais são incentivados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ouconjugado em adjuvante completo de Freund, por meio de injeção subcutâneaem diversos sítios. Sete a quatorze dias mais tarde, os animais são sangradose o soro é testado para determinar a titulagem de anticorpos. Os animais sãoincentivados até a estabilização do título. Preferencialmente, o animal éincentivado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a proteínadiferente e/ou por meio de reagente reticulante diferente. Os conjugadospodem também ser elaborados em cultura celular recombinante, na forma defusões de proteínas. Além disso, agentes agregantes tais como alúmen sãoadequadamente utilizados para aumentar a reação imunológica.
(ii) Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos e/ou ligam o mesmo epítopo, exceto porpossíveis variantes que surgem durante a produção do anticorpo monoclonal, emque essas variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Destaforma, o adjetivo "monoclonal" indica a característica do anticorpo como não sendomistura de anticorpos discretos ou policlonais.
Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados, por exemplo,utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al,Nature 256: 495 (1975) ou podem ser fabricados por meio de métodos de DNArecombinante (Patente Norte-Americana n° 4.816.567).
No método de hibridoma, camundongo ou outro animal hospedeiroapropriado, tal como hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerarlinfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligamespecificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitospodem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são fundidos em seguida a células demieloma, utilizando agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, paraformar célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultura apropriada que contém preferencialmente umaou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das célulasde mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais nãocontenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ouHPRT), por exemplo, o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamentehipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam ocrescimento de células com deficiência de HGPRT.
Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, apoiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a meio tal comomeio HAT. Dentre estas, as linhagens celulares de mieloma preferidas sãolinhagens de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores decamundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute CellDistribution Center1 San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e células SP-2 ouX63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Culturas deTipos, Rockville, Maryland1 Estados Unidos. Linhagens celulares de mielomahumano e heteromieloma humano-de camundongos também foram descritaspara a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol.,133: 3001 (1984); e Brodeur et al, MonoclonalAntibodyProduction Techniquesand Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo étestado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra oantígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonaisproduzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitaçãoou de teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaioimunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).
A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode serdeterminada, por exemplo, por meio da análise Scatchard de Munson et al,Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Após a identificação de células de hibridoma que produzemanticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clonespodem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição ecultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios deculturas apropriadas para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEMou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas invivo na forma de tumores de ascite em animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro pormeio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, taiscomo proteína A Sepharose1 cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese degel, diálise ou cromatografia de afinidade.
DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isoladoe seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (empregando, porexemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-seespecificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorposmurinos). As células de hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Umavez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que sãotransfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E.coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) oucélulas de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína deimunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas célulashospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressãorecombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo incluem Skerraet al, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) e Plückthun, Immunol.Revs., 130: 151-188 (1992).
Em realização adicional, anticorpos ou fragmentos de anticorpospodem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizandoas técnicas descritas em McCafferty et al, Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson etal, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks et al, J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991)descrevem o isolamento de anticorpos humanos e murinos, respectivamente,utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subseqüentes descrevem a produçãode anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por meio de mistura decadeias (Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), bem como infecçõescombinatórias e recombinação in vivo, como estratégia de construção de bibliotecasde fagos muito grandes (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)).Desta forma, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma deanticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.
O DNA pode também ser modificado, por exemplo, por meio desubstituição da seqüência de codificação por domínios constantes de cadeialeve e pesada humana no lugar das seqüências murinas homólogas (PatenteNorte-Americana n° 4.816.567; Morrison et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A.,81: 6851 (1984)), ou por meio de ligação covalente da seqüência decodificação de imunoglobulina com a seqüência de codificação parapolipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte.
Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina sãosubstituídos pelos domínios constantes de anticorpo ou são substituídos pelosdomínios variáveis de sítio de combinação de antígenos de anticorpo para criaranticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação deantígenos que possui especificidade para um antígeno e outro sítio decombinação de antígenos que possui especificidade para antígeno diferente.
(iii) Anticorpos Humanizados
Métodos de humanização de anticorpos não humanos foramdescritos na técnica. Preferencialmente, anticorpo humanizado contém um oumais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que nãoé humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentementedenominados resíduos "importados", que são tomados tipicamente a partir dedomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenterealizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al,Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988);Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio de substituição deseqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes deanticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" sãoanticorpos quiméricos (Patente Norte-Americana n° 4.816.567), em quesubstancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituídopela seqüência correspondente de espécie não humana. Na prática, osanticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais algunsresíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR sãosubstituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quantopesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado métodode "melhor adequação", a seqüência do domínio variável de anticorpo deroedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências dedomínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que é maispróxima da do roedor é aceita como a região de estrutura humana (FR) para oanticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al,J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza região de estruturaespecífica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorposhumanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve oupesada. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorposhumanizados diferentes (Carter et al, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285(1992); Presta et al, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo commétodo preferido, anticorpos humanizados são preparados por meio deprocesso de análise das seqüências parentais e diversos produtoshumanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüênciasparental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais sãocomumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. Sãodisponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveisestruturas de conformação tridimensional de possíveis seqüências deimunoglobulina selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise dopapel provável dos resíduos no funcionamento da possível seqüência deimunoglobulina, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidadeda possível imunoglobulina de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduosde FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüênciasreceptora e importada para atingir a característica de anticorpo desejada, talcomo maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos daregião hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos nainfluência da ligação de antígenos.
(iv) Anticorposhumanos
Como alternativa para a humanização, podem ser geradosanticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animaistransgênicos (tais como camundongos) que são capazes, medianteimunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos naausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, porexemplo, que a exclusão homozigótica do gene da região de ligação de cadeiapesada de anticorpos (Jh) em camundongos quiméricos e mutantes delinhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorposendógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina dalinhagem germinativa humana nesses camundongos com mutação da linhagemgerminativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafiocom antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A., 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993);Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); e Patentes Norte-Americanas n° 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.
Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fagos(McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990)) para produzir anticorposhumanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes dedomínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. Deacordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonadosem quadro em gene de proteína de revestimento maior ou menor debacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma defragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago.Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples dogenoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais doanticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo queexibe essas propriedades. Desta forma, o fago imita algumas das propriedadesda célula Β. A exibição de fagos pode ser realizada em uma série de formatos;para sua análise, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell1 David J.,Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Diversas fontes desegmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição de fagos. Clackson etal, Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de pequena biblioteca combinatória aleatória de genes Vderivados de baços de camundongos imunizados. Repertório de genes V dedoadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos paraconjunto diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isoladosseguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al, J. Mol. Bioi222: 581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Videtambém as Patentes Norte-Americanas n° 5.565.332 e 5.573.905.
Anticorpos humanos podem também ser gerados por células Bativadas in vitro (vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.567.610 e 5.229.275).
(v) Fragmentos de anticorpos
Foram desenvolvidas diversas técnicas de produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo,Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992); e Brennan et al, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, esses fragmentospodem ser agora produzidos diretamente por células hospedeirasrecombinantes. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo,a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima.
Alternativamente, fragmentos de Fab1-SH podem ser recuperados diretamentede E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Carteret al, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem,fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir do cultura decélulas hospedeiras recombinantes. Outros métodos de produção defragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Emoutras realizações, o anticorpo selecionado é fragmento de Fv de fita simples(scFv). Vide WO 93/16185; Patente Norte-Americana n° 5.571.894; e PatenteNorte-Americana n° 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser"anticorpo linear", tal como descrito na Patente Norte-Americana n° 5.641.870,por exemplo. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem sermonoespecíficos ou biespecíficos.
(vi) Anticorpos biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuemespecificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplosde anticorpos biespecíficos podem ligar-se a dois epítopos diferentes domarcador da superfície de células B. Outros desses anticorpos podem ligar omarcador de células B e ligar adicionalmente segundo marcador da superfíciede células B diferente. Alternativamente, braço de ligação anti-marcador dasuperfície de células B pode ser combinado com um braço que se liga a umamolécula acionadora sobre um leucócito, tal como uma molécula receptora decélulas T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR),tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a dirigirmecanismos de defesa celular para a célula B. Anticorpos biespecíficos podemtambém ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para a célula B. Essesanticorpos possuem braço de ligação de marcador da superfície de células B ebraço que liga o agente citotóxico (tal como saporina, anti-interferona-α, vincaalcalóide, cadeia A rícina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo).
Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos decomprimento total ou fragmentos de anticorpos (tais como anticorposbiespecíficos F(ab')2).
Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos decomprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve ecadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuemespecificidades diferentes (Millstein et al, Nature, 305: 537-539 (1983)). Devidoà seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esseshibridomas (quadromas) produzem mistura potencial de dez moléculas deanticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecíficacorreta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada pormeio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e osrendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos emWO 93/08829 e em Traunecker et al, EMBO J. 10: 3655-3659 (1991).
De acordo com abordagem diferente, domínios variáveis deanticorpos com as especificidades de ligações desejadas (sítios de combinaçãode anticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências de domínio constante deimunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constantede cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte dasregiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constantede cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeialeve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusõesde cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e sãocotransfectados em organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grandeflexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeosem realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeosutilizadas na construção fornecerem os rendimentos ideais. É possível, entretanto,inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias depolipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duascadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quandoas razões não forem de significação específica.
Em realização preferida desta abordagem, os anticorposbiespecíficos são compostos de cadeia pesada de imunoglobulina híbrida comprimeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve ecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece segunda especificidadede ligação) no outro braço. Concluiu-se que esta estrutura assimétricapossibilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações decadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve deimunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporcionaforma fácil de separação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Paradetalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, porexemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
De acordo com outra abordagem descrita na Patente Norte-Americana n° 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpospode ser elaborada de forma a maximizar o percentual de heterodímeros quesão recuperados do cultura de células recombinantes. A interface preferidacompreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de domínio constante deanticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidospequenos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas comcadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). "Cavidades"compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is)grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, pormeio da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeiasmenores (tais como alanina ou treonina). Isso proporciona mecanismo deaumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finaisindesejados, tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado, porexemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos, porexemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas (PatenteNorte-Americana n° 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (WO91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem serfabricados utilizando qualquer método reticulante conveniente. Agentes reticulantesapropriados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente Norte-Americana n° 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas reticulantes.
As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir defragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorposbiespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligações químicas.Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) descrevem procedimento em que anticorposintactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos de F(ab')2. Estesfragmentos são reduzidos na presença do agente formador de complexo de ditiolarsenito de sódio para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfetointermolecular. Os fragmentos de Fab' gerados são convertidos em seguida emderivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é entãonovamente convertido no Fab'-tiol por meio de redução com mercaptoetilamina e émisturado com quantidade eqüimolar do outro derivado de Fab-TNB para formar oanticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizadoscomo agentes para a imobilização seletiva de enzimas.Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinantetambém foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, porexemplo, utilizando zíper de leucina. Kostelny et al, J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Junforam ligados às partes Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusãogenética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região dearticulação para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidadospara formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também serutilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de"diacorpos" descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90:6444-6448 (1993) forneceu mecanismo alternativo de fabricação defragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem umdomínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável decadeia leve (Vl) por um Iigante que é curto demais para permitir opareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia.
Conseqüentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados aparear-se com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento, demaneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia defabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fvde fita simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al, J. Immunol.,152: 5368 (1994).
São contemplados anticorpos com mais de duas valências.Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al, J.Immunol. 147: 60 (1991).
Produção de Imunoadesinas
A droga no presente pode ser, em outra realização, imunoadesina, talcomo BR3-lg ou TNF-α imunoadesina. Exemplos de métodos de elaboração deimunoadesinas são descritos com mais detalhes abaixo.
O projeto mais simples e mais direto de imunoadesina combinao(s) domínio(s) de ligação da adesina (por exemplo, o domínio extracelular(ECD) de um receptor) com a região Fc de uma cadeia pesada deimunoglobulina. Normalmente, ao preparar as imunoadesinas de acordo com apresente invenção, ácido nucleico que codifica o domínio de ligação da adesinaserá fundido C-terminal a ácido nucleico que codifica o terminal N de umaseqüência de domínio constante de imunoglobulina, mas fusões N-terminaistambém são possíveis.
Tipicamente, nessas fusões, o polipeptídeo quiméricocodificado reterá pelo menos domínios CH2, CH3 e de articulaçãofuncionalmente ativos da região constante de cadeia pesada deimunoglobulina. Também são realizadas fusões para o terminal C daporção Fc de domínio constante ou imediatamente N-terminal para o CH1da cadeia pesada ou a região correspondente da cadeia leve. O sítiopreciso no qual a fusão é realizada não é crítico; os sítios específicos sãobem conhecidos e podem ser selecionados a fim de otimizar a atividadebiológica, secreção ou características de ligação da imunoadesina.
Em realização preferida, a seqüência de adesina é fundida aoterminal N da região Fc de imunoglobulina Gi (IgG1). É possível fundirtoda a região constante de cadeia pesada à seqüência de adesina.Entretanto, de maior preferência, seqüência que se inicia na região dearticulação pouco acima do sítio de divisão de papaína que define IgG Fcquimicamente (ou seja, o resíduo 216, tomando o primeiro resíduo daregião constante de cadeia pesada como sendo 114) ou sítios análogosde outras imunoglobulinas é utilizada na fusão. Em realizaçãoparticularmente preferida, a seqüência de aminoácidos de adesina éfundida (a) à região de articulação e CH2 e CH3 ou (b) aos domínios CH1,de articulação, CH2 e Ch3 de cadeia pesada de IgG.
Para imunoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas sãoligadas na forma de multímeros e, particularmente, como heterodímerosou heterotetrâmeros. De forma geral, essas imunoglobulinas ligadasconterão estruturas unitárias conhecidas. Uma unidade estrutural comquatro cadeias básica é a forma na qual existem IgG1 IgD e IgE. Unidadede quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas com peso molecularmais alto; IgM geralmente existe na forma de pentâmero de quatrounidades básicas mantidas juntas por ligações de dissulfeto. IgA globulinae, ocasionalmente, IgG globulina podem também existir em formamultimérica no soro. No caso de multímero, cada uma das quatrounidades pode ser idêntica ou diferente.
Vários exemplos de imunoadesinas ligadas dentro do escopo dopresente são diagramadas esquematicamente abaixo:
(a) ACl-ACl;
(b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, ou VlCl-ACh);
(c) ACl-ACh-(ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh, ou VlCl-VhCh)
(d) ACl-VhCh-(ACh, or ACl-VhCh, ou VlCl-ACh);
(e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh, ou VlCl-ACh); e
(f) (A-Y)r-(VlCl-VhCh)2,
em que cada A representa seqüências de aminoácidos deadesina idênticas ou diferentes;
Vl é domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
Vh é um domínio variável de cadeia pesada deimunoglobulina;
Cl é domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;
Ch é domínio constante de cadeia pesada de
munoglobulina;η é número inteiro maior que 1;
Y designa o resíduo de agente reticulante covalente.
Por motivo de brevidade, as estruturas acima exibem apenasas características principais; elas não indicam ligação (J) ou outrosdomínios das imunoglobulinas, nem as ligações de dissulfeto sãoexibidas. Entretanto, quando esses domínios forem necessários paraatividade de ligação, eles deverão ser construídos para que estejampresentes nos sítios comuns que ocupam nas moléculas deimunoglobulina.
Alternativamente, as seqüências de adesina podem ser inseridasentre seqüências de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, de talforma que seja obtida uma imunoglobulina que compreende cadeia pesadaquimérica. Nesta realização, as seqüências de adesina são fundidas àextremidade 3' de cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço deimunoglobulina, seja entre a articulação e o domínio Ch2 ou entre os domíniosCh2 e Ch3. Construções similares foram relatadas por Hoogenboom et al, Mol.Immunol. 28: 1027-1037 (1991).
Embora a presença de cadeia leve de imunoglobulina não sejanecessária nas imunoadesinas de acordo com a presente invenção, cadeialeve de imunoglobulina poderá estar presente associada covalentemente apolipeptídeo de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina e adesina oufundida diretamente à adesina. No caso anterior, DNA que codifica cadeialeve de imunoglobulina é tipicamente coexpresso com o DNA que codificaa proteína de fusão da cadeia pesada de imunoglobulina e adesina.Mediante secreção, a cadeia leve e a cadeia pesada híbrida serãocovalentemente associadas para fornecer estrutura similar aimunoglobulina que compreende dois pares de cadeia leve e cadeiapesada de imunoglobulina ligados por dissulfeto. Os métodos apropriadospara a preparação dessas estruturas são, por exemplo, descritos naPatente Norte-Americana n° 4.816.567, emitida em 28 de março de 1989.
As imunoadesinas são construídas de forma maisconvenientemente por meio da fusão da seqüência de cDNA que codificaa porção de adesina em quadro a seqüência de cDNA de imunoglobulina.
Pode ser também utilizada, entretanto, fusão a fragmentos deimunoglobulina genômica (vide, por exemplo, Aruffo et al, Cell 61: 1303-1313 (1990); e Stamenkovic et al, Cell 66: 1133-1144 (1991)). Este últimotipo de fusão requer a presença de seqüências reguladoras de Ig paraexpressão. cDNAs que codificam regiões constantes de cadeia pesada deIgG podem ser isolados com base em seqüências publicadas debibliotecas de cDNA derivadas de linfócitos de sangue periférico ou dobaço, por meio de técnicas de hibridização ou reação em cadeia depolimerase (PCR). Os cDNAs que codificam a "adesina" e as partes deimunoglobulina da imunoadesina são inseridos em conjunto em vetor deplasmídeo que dirige a expressão eficiente nas células hospedeirasselecionadas.
As imunoadesinas do presente incluem corpos de peptídeos, quepodem ser elaborados, por exemplo, conforme descrito em WO 02/092620.
Outras publicações que descrevem imunoadesinas de interesseincluem: WO 01/12812 que descreve BCMA-Fc; WO 02/24909 relativa a BAFF-R-Fc; WO 00/40716 referente a TACI-Ig etc.
Conjugados ε Outras Modificações do Anticorpo ou Imunoadesina
O anticorpo ou imunoadesina do presente é opcionalmenteconjugado a outro agente, tal como agente citotóxico, ou citocina (tal como IL2;vide, por exemplo, WO 2005/016969).
A conjugação normalmente será atingida por meio de ligaçãocovalente, cuja natureza precisa será determinada pela moléculadirecionadora e pelo sítio de ligação sobre o polipeptídeo anticorpo ouantagonista de CD20. Tipicamente, agente não peptídico é modificado pormeio da adição de Iigante que permite a conjugação a anticorpo ouimunoadesina por meio das suas cadeias laterais de aminoácidos, cadeiasde carboidratos ou grupos reativos introduzidos sobre o anticorpo ouimunoadesina por meio de modificação química. Droga pode ser ligada, porexemplo, por meio do grupo ε-amino de resíduo de lisina, por meio degrupo α-amino livre, por meio de troca de dissulfeto para resíduo decisteína ou por oxidação dos 1,2-dióis em cadeia de carboidrato com ácidoperiódico para permitir a ligação de drogas que contêm vários nucleófilospor meio de ligação de base Schiff. Vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.256.833. Os agentes modificadores de proteínas incluemreagentes amino-reativos (tais como ésteres reativos, isotiocianatos,aldeídos e haletos de sulfonila), reaentes tiol-reativos (tais como derivadosde haloacetila e maleimidas) e reagentes reativos a ácido carboxílico ealdeído. Polipeptídeos de anticorpos ou antagonistas de CD20 podem serligados covalentemente a agentes peptídicos utilizando reagentesreticulantes bifuncionais. Reagentes heterobifuncionais são maiscomumente utilizados e permitem o acoplamento controlado de duasproteínas diferentes utilizando duas porções reativas diferentes (tais comoamino-reativas mais tiol, iodoacetamida ou maleimida). O uso dessesagentes Iigantes é bem conhecido na técnica. Vide, por exemplo, a PatenteNorte-Americana n° 4.671.958. Ligantes peptídicos podem também serempregados. Alternativamente, o anticorpo ou imunoadesina pode serligada a porção peptídica por meio da preparação de polipeptídeo de fusão.
Exemplos de agentes acopladores de proteínas bifuncionaisadicionais incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP),cictohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila),iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tais comoadipimidato de dimetila HCI), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido(tais como bis(p-azidobenzoii) hexanodiamina), derivados bis-diazônio(tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (taiscomo 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos de flúor bis-ativo (taiscomo 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno).
Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão quecompreende o anticorpo/imunoadesina e agente, por exemplo, por meio detécnicas recombinantes ou síntese de peptídeos.
Outras modificações do anticorpo ou imunoadesina sãocontempladas no presente. O anticorpo imunoadesina pode ser ligado, porexemplo, a um dentre uma série de polímeros não proteináceos, tais comopolietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros depolietileno glicol e polipropileno glicol.
O anticorpo ou imunoadesina descrito no presente podetambém ser formulado na forma de lipossomos. Os Iipossomos que contêmo antagonista ou anticorpo são preparados por meio de métodosconhecidos na técnica, tais como conforme descrito em Epstein et al, Proc.Natl. Acad. Sei. U. S. A., 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc. Nati Acad.Sei. U. S. A., 77: 4030 (1980); Patentes Norte-Americanas n° 4.485.045 e4.544.545; e WO 97/38731 publicada em 23 de outubro de 1997.Lipossomos com maior tempo de circulação são descritos na PatenteNorte-Americana n° 5.013.556.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados por meio dométodo de evaporação de fase reversa com composição de lipídios quecompreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG(PEG-PE). Os lipossomos são extrudados por meio de filtros com tamanho deporo definido para gerar Iipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentosde Fab' de anticorpo de acordo com a presente invenção podem serconjugados aos Iipossomos descritos em Martin et al, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por meio de reação de troca de dissulfetos. Agente quimioterápico éopcionalmente contido no interior do lipossomo. Vide Gabizon et al, J. NationalCâncer Inst. 81 (19): 1484 (1989).
É (são) contemplada(s) modificação(ões) de seqüências deaminoácidos do anticorpo ou imunoadesina. Pode ser desejável, por exemplo,aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas doanticorpo ou imunoadesina. Variantes de seqüências de aminoácidos doanticorpo são preparadas por meio da introdução de mudanças denucleotídeos apropriadas no ácido nucleico do anticorpo, ou por meio dasíntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusõese/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidosdo anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feitapara chegar à construção final, desde que a construção final possua ascaracterísticas desejadas. As mudanças de aminoácidos podem tambémalterar processos pós-tradução do anticorpo, tais como a mudança do númeroou posição de sítios de glicosilação.
Método útil de identificação de certos resíduos ou regiões doanticorpo que são sítios preferidos para mutagênese é denominado"mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunninghame Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo deresíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais comoarg, asp, his, Iys e glu) e substituído por aminoácido neutro ounegativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina)para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Esses sítios deaminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições sãorefinados em seguida por meio da introdução de outras variantes ouadicionais nos sítios de substituição ou para estes. Desta forma, embora osítio para introdução de variação de seqüência de aminoácidos sejapreviamente determinado, a natureza intrínseca da mutação não necessitaser previamente determinada. Para analisar o desempenho de mutação emum dado sítio, por exemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatória éconduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpos expressassão selecionadas para a atividade desejada.
As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusõesde terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de umresíduo até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem comoinserções intra-seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados oumúltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo com resíduode metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a polipeptídeo citotóxico.
Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão aoterminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou polipeptídeo que aumentea meia vida do anticorpo em soro.
Outro tipo de variante é variante de substituição deaminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo deaminoácido na molécula de anticorpo substituída por resíduo diferente.
Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição deanticorpos incluem as regiões hipervariáveis, mas também sãocontempladas alterações de FR. Substituições conservadoras sãoexibidas na Tabela 2 sob o título "substituições preferidas". Caso essassubstituições resultem em mudança da atividade biológica, mudançasmais substanciais, denominadas "exemplos de substituições" na Tabela 2ou conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes deaminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos são selecionados.Tabela 2
<table>table see original document page 101</column></row><table>Modificações substanciais das propriedades biológicas doanticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que difiramsignificativamente de efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeiaprincipal de polipeptídeo na área da substituição, tal como na forma de folha ouem conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula nosítio desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem seragrupados de acordo com as similaridades das propriedades das suas cadeiaslaterais (em A. L. Lehninger, Biochemistry, segunda edição, págs. 73-75, WorthPublishers1 Nova Iorque (1975)):
(1) não polares: Ala (A), Val (V), Leu (L)1 Ile (I), Pro (P)1 Phe(F)1 Trp (W)1 Met (M)
(2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S)1 Thr (T), Cys (C),Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) ácidos: Asp (D)1 Glu (E)
(4) básicos: Lys (K)1 Arg (R), His(H)
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem serdivididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, Ieu1 ile;
(2) hidrofílicos neutros: Cys1 Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: His, Lys1 Arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituições não conservadoras causarão a substituição de ummembro de uma dessas classes por outra classe.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação adequada do anticorpo pode também ser substituído, geralmentecom serina, para aumentar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar retículaaberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s)ao anticorpo para aumentar a sua estabilidade (particularmente quando oanticorpo for fragmento de anticorpo, tal como fragmento de Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante de substituiçãoenvolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável deanticorpo parental. Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s)para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradascom relação ao anticorpo parental do qual é (são) gerada(s). Uma formaconveniente de geração dessas variantes de substituição é a maturação porafinidade utilizando exibição de fagos. Resumidamente, diversos sítios deregiões hipervariáveis (por exemplo, seis a sete sítios) sofrem mutações paragerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes deanticorpos geradas desta forma são exibidas de maneira monovalente a partirde partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de geneIll de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago sãoselecionadas em seguida de acordo com a sua atividade biológica (tal comoafinidade de ligação), da forma descrita no presente. A fim de identificarpossíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese devarredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiõeshipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos.Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar estrutura de cristal docomplexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre oanticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos sãocandidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas nopresente. Após a geração dessas variantes, o quadro de variantes é submetidoa seleção conforme descrito no presente e os anticorpos com propriedadessuperiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados paradesenvolvimento adicional.Outro tipo de variante de aminoácidos do anticorpo altera opadrão de glicosilação original do anticorpo ou imunoadesina. Essa alteraçãoinclui a exclusão de uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpoe/ou a adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estejam presentesno anticorpo ou imunoadesina.
A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente N-Iigada ou O-ligada. N-Iigado designa a ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral deresíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagino-X-serina easparagino-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, com exceção deprolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática daporção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desta forma, a presença dequalquer dessas seqüências de tripeptídeos em polipeptídeo cria potencial sítiode glicosilação. Glicosilação O-Iigada designa a ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a ácido hidroxiamino, maiscomumente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina.
A adição de sítios de glicosilação é convenientemente conseguidapor meio da alteração da seqüência de aminoácidos, de forma que contenhauma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios deglicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita por meio da adiçãode um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência da proteína original,ou substituição por ele (para sítios de glicosilação O-ligados).
Quando a proteína compreender região Fc1 o carboidrato a elaligado pode ser alterado. Anticorpos com estrutura de carboidrato madura quenão contém fucose ligada a região Fc do anticorpo, por exemplo, são descritosno Pedido de Patente Norte-Americano n0 US 2003/0157108 A1, Presta, L.Vide também US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) comreferência a composição de anticorpos CD20. Anticorpos com N-acetilglucosamina (GIcNAc) bisseccionada no carboidrato ligado a região Fc doanticorpo são indicados em WO 03/011878, Jean-Mairet et al, e na PatenteNorte-Americana n° 6.602.684, Umana et al. Anticorpos com pelo menos umresíduo de galactose no oligossacarídeo ligado a região Fc do anticorpo sãorelatados em WO 97/30087, Patel et al. Vide também WO 98/58964 (Raju, S.)e WO 99/22764 (Raju, S.) referentes a anticorpos com carboidrato alteradoligado à sua região Fe.
A variante de glicosilação preferida do presente compreenderegião Fc, em que estrutura de carboidrato ligada à região Fc não contémfucose. Essas variantes possuem função ADCC aprimorada. Opcionalmente, aregião Fc compreende ainda uma ou mais substituições de aminoácidos queaumentam ainda mais ADCC, tais como substituições nas posições 298, 333e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu). Exemplos de publicaçõesrelativas a anticorpos "desfucosilados" ou "com deficiência de fucose" incluem:Pedido de Patente Norte-Americano n0 US 2003/0157108 A1, Presta, L; WO00/61739A1; W001/29246A1; US2003/0115614A1; US2002/0164328A1;US2004/0093621A1; US2004/0132140A1; US2004/0110704A1;US2004/0110282A1; US2004/0109865A1; W003/085119A1; W003/084570A1;W02005/035778; W02005/035586 (que descreve a inibição por RNA (RNAi)de fucosilação); Okazaki et al, J. Moi Biol. 336: 1239-1249 (2004); e Yamane-Ohnuki et al, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celularesque produzem anticorpos defucosilados incluem células CHO de Lecl 3 comdeficiência na fucosilação de proteínas (Ripka et al, Arch. Biochem. Biophys.249: 533-545 (1986); Pedido de Patente Norte-Americano n0 US2003/0157108, Presta, L.; e WO 2004/056312 A1, Adams et al, especialmenteno Exemplo 11) e linhagens de células knockout, tais como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (Yamane-Ohnuki et al,Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes da seqüênciade aminoácidos são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos natécnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-se ao isolamento a partir de fontenatural (no caso de variantes de seqüências de aminoácidos de ocorrêncianatural) ou preparação por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (oudirigida para sítio), mutagênese de PCR e mutagênese de conjunto de umavariante preparada anteriormente ou versão não variante.
Pode ser desejável modificar o anticorpo ou imunoadesina de acordocom a presente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de forma aaumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antígenos (ADCC)e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isso pode seratingido por meio da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos emregião Fc de anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteínapode(m) ser introduzido(s) na região Fc, de forma a permitir a formação de ligaçõesde dissulfeto intercadeias nessa região. O anticorpo homodimérico gerado destaforma pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celularmediada por complemento aprimorada e citotoxicidade celular dependente deanticorpos (ADCC). Vide Caron et al, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes,B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividadeantitumoral aprimorada podem também ser preparados utilizando reticulantesheterobifuncionais, conforme descrito em Wolff et al, Câncer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído anticorpo que possui regiões Fcduplas e pode, portanto, apresentar capacidades de ADCC e Iise de complementoaprimoradas. Vide Stevenson et al, Anti-CancerDrug Design 3: 219-230 (1989).
WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com função ADCCaprimorada na presença de células efetoras humanas, em que os anticorposcompreendem substituições de aminoácidos na sua região Fc.Preferencialmente, o anticorpo com ADCC aprimorado compreendesubstituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração Eu deresíduos). Preferencialmente, a região Fc alterada é região Fc de IgGI humanaque compreende ou consiste de substituições em uma, duas ou três destasposições. Estas substituições são opcionalmente combinadas comsubstituição(ões) que aumenta(m) a ligação de C1q e/ou CDC.
Anticorpos com ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC) são descritos em WO 99/51642, PatenteNorte-Americana n° 6.194.551 B1, Patente Norte-Americana n° 6.242.195 B1,Patente Norte-Americana n° 6.528.624 B1 e Patente Norte-Americana n°6.538.124 (Idusogie et al). Os anticorpos compreendem substituição deaminoácidos em uma ou mais das posições de aminoácidos 270, 322, 326,327, 329, 313, 333 e/ou 334 da sua região Fc (numeração Eu de resíduos).Substituição de um ou mais resíduos nas posições 326, 327, 333 e/ou 334pode aumentar a ligação de C1q e/ou a função de CDC.
Para aumentar a meia vida do anticorpo em soro, pode-seincorporar epítopo de ligação de receptor de salvados ao anticorpo(especialmente fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, naPatente Norte-Americana n° 5.739.277. Da forma utilizada no presente, aexpressão "epítopo de ligação de receptor de salvados" designa epítopo daregião Fc de molécula de IgG (tal como IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que éresponsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG.
Anticorpos com ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn) emeias-vidas maiores são descritos em WO 00/42072 (Presta, L.) e US2005/0014934 A1 (Hinton et al). Estes anticorpos compreendem região Fc com umaou mais substituições que aumentam a ligação da região Fc a FcRn. A região Fepode conter por exemplo, substituições em uma ou mais das suas posições 238,250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376,378, 380, 382, 413, 424, 428 ou 434 (numeração Eu de resíduos). A variante deanticorpo que compreende região Fc preferida com ligação de FcRn aprimoradacompreende substituições de aminoácidos em uma, duas ou três posições 307, 380e 434 da sua região Fc (numeração Eu de resíduos).
Anticorpos elaborados com três ou mais (preferencialmentequatro) sítios de ligação de antígenos funcionais também são contemplados(Pedido de Patente Norte-Americano n0 US 2002/0004587 A1, Miller et al).
Formulações Farmacêuticas
Formulações terapêuticas dos anticorpos ou imunoadesinasutilizados de acordo com a presente invenção são preparadas paraarmazenagem por meio da mistura de anticorpo ou imunoadesina queapresente o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ouestabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington'sPharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma deformulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ouestabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens econcentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato eoutros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico emetionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio,cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcoolfenólico, butílico ou benzílico; alquil parabéns tais como metil ou propil paraben;catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixopeso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais comoalbumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, taiscomo polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina,asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos eoutros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantestais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol;contraíons formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (tais comocomplexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®,PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
Exemplos de formulações de anticorpos anti-CD20 são descritosem WO 98/56418. Essa publicação descreve formulação líquida de múltiplasdoses que compreende 40 mg/ml de rituximab, 25 mM de acetato, 150 mM detrehalose, álcool benzílico a 0,9%, polissorbato 20 a 0,02% sob pH 5,0 quepossui vida mínima de armazenagem de dois anos a 2-8 °C. Outra formulaçãoanti-CD20 de interesse compreende 10 mg/ml de rituximab em 9,0 mg/ml decloreto de sódio, 7,35 mg/ml de di-hidrato citrato de sódio, 0,7 mg/ml depolissorbato 80 e Água Estéril para Injeção, pH 6,5.
Formulações Iiofilizadas adaptadas para administraçãosubcutânea são descritas na Patente Norte-Americana n° 6.267.958 (Andya etal). Essas formulações Iiofilizadas podem ser reconstituídas com diluenteapropriado até alta concentração de proteína e a formulação reconstituída podeser administrada por via subcutânea ao mamífero a ser tratado no presente.
Formas cristalizadas do anticorpo ou imunoadesina também sãocontempladas. Vide, por exemplo, US 2002/0136719 A1 (Shenoy et al).
A formulação do presente pode também conter mais de umcomposto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendotratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não seprejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, fornecer adicionalmentesegundo medicamento, tal como os descritos no Capítulo Tratamento abaixo. Otipo e as quantidades eficazes desses outros agentes dependem, por exemplo,da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doençaautoimune sendo tratada e de parâmetros clínicos dos pacientes. Estes sãogeralmente empregados nas mesmas dosagens e com vias de administraçãoconforme utilizado acima no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagensempregadas até aqui.Os ingredientes ativos podem também ser capturados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por métodos de aglutinação ou porpolimerização interfacial, tais como microcápsulas de hidroximetilcelulose ougelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, emsistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington'sPharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada.Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm oanticorpo, que se encontram na forma de artigos moldados, tais comofilmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongadaincluem poliésteres, hidrogéis (tais como póli(2-hidroxietilmetacrilato) ouálcool (poli)vinílico, polilactidas (Patente Norte-Americana n° 3.773.919),copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ e tila, etileno vinilacetato não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico e ácidoglicólico, tais como LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostasde copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) eácido póli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através demembranas de filtragem estéreis.
Tratamento de Pacientes com Doenças Autoimunes
A presente invenção fornece método de tratamento de paciente comdoença autoimune que compreende: administração de anticorpo terapêutico,imunoadesina ou outra droga biológica ao paciente para tratar doença autoimune;obtenção de amostra biológica do paciente; purificação por afinidade deimunoglobulinas a partir da amostra biológica; e submissão das imunoglobulinaspurificadas a teste de anticorpo neutralizante. Preferencialmente, a amostrabiológica é soro e pode haver-se concluído que contém interferência que interferecom o desempenho de teste de anticorpo neutralizante.
Várias doenças autoimunes que podem ser tratadas no presente sãodescritas acima no capítulo de definições. Exemplos de doenças autoimunespreferidas incluem disfunções reumatológicas autoimunes (tais como artritereumatóide (RA)1 síndrome de Sjogren, escleroderma, lúpus tal como SLE e nefritedo lúpus, polimiosite/dermatomiosite crioglobulinemia, síndrome de anticorpos anti-fosfolipídios, artrite psoriática), disfunções do fígado e gastrointestinais autoimunes(tais como doenças intestinais inflamatórias (por exemplo, colite ulcerativa e mal deCrohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliarprimária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (vasculiteassociada a ANCA, vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener epoliartrite), doenças neurológicas autoimunes (tais como esclerose múltipla,síndrome de opsoclonus myoclonus, miastenia grave, neuromielite ótica, mal deParkinson, mal de Alzheimer, polineuropatias autoimunes), doenças renais(glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture, mal de Berger), disfunçõesdermatológicas autoimunes (psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigóide bolhosa,eritematose do lúpus cutâneo), disfunções hematológicas (púrpuratrombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura pós-transfusão,anemia hemolítica autoimune), arteriosclerose, uveíte, doenças auditivasautoimunes tais como doença do ouvido interno e perda de audição, mal de Behcet,síndrome de Raynaud, transplante de órgãos e disfunções endócrinas autoimunes(doenças autoimunes relacionadas à diabetes, mal de Addison, doença da tireóideautoimune (mal de Graves, tireoidite)). Indicações autoimunes de maior preferênciaincluem artrite reumatóide (RA)1 SLE, colite ulcerativa, vasculite associada a ANCA,lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, mal de Graves, IDDM, anemiaperniciosa, tireoidite e glomerulonefrite, em que RA e SLE são as de preferênciasuperior para os propósitos do presente.
O anticorpo terapêutico preferido no presente é anticorpo que seliga a marcador da superfície de células B, de maior preferência anticorpoCD20, de preferência superior anticorpo CD20 quimérico, humanizado ouhumano, de maior preferência rituximab, 2H7 humanizado, anticorpo CD20humano 2F2 (HuMax-CD20) (Genmab), anticorpo A20 humanizado(Immunomedics), conjugado de auristatina E anti-CD20 (Seattle Genetics), anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope), terapia de MAb anti-CD20 (EpiCyte)ou anticorpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion) etc. É de preferência ainda maiorrituximab ou 2H7 humanizado.
Outros anticorpos terapêuticos ou imunoadesinas de interesse nopresente incluem: rituximab, 2H7 humanizado, anticorpo CD20 humano 2F2(HuMax-CD20), anticorpo A20 humanizado ou IMMU-106, TRU 015, anticorpo fatorde necrose tumoral (TNF)-a, infliximab, CDP571, MAK-195, adalimumab,fragmento de anticorpo TNF-V pegilado, CDP-870, anticorpo policlonal anti-TNF-a,PassTNF1 anticorpo de integrina, efalizumab, natalizumab, anticorpo BAFF,anticorpo BR3, anticorpo receptor de BAFF, anticorpo Blys, belimumab, anticorpoCD37, TRU 016, anticorpo CD22, epratuzumab, anticorpo Abiogen CD22, CMC544, combotox, BL22, LIF 226, anticorpo VEGF1 anticorpo receptor de VEGF,bevacizumab, anticorpo anti-HER, trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, anticorpoanti-IgE, omalizumab, anticorpo IL-21, anticorpo anti-células B Impheron, 1D09C3,anticorpo Lym-1, oncolym, ISF 154, gomilixima, anticorpo receptor de IL-6,atlizumab, anticorpo IL-15, HuMax-ll-15, anticorpo receptor de quemoquina,anticorpo CCR2, MLN1202, anticorpo anti-complemento, anticorpo C5, eculizuma,formulação oral de imunoglobulina humana, IgPO, anticorpo IL-12, ABT-874,teneliximab, anticorpo CD40, S2C6 humanizado, TNX 100, anticorpo CD52,campath-1 H e anticorpo Vv33.Quando o anticorpo for anticorpo CD20, tal como Rituximab ou2H7 humanizado, o anticorpo pode ser dosado como 1 g χ 2, 375 mg/m2 χ 4etc. Preferencialmente, duas ou mais exposições de anticorpos são fornecidas,por exemplo, a cada cerca de seis meses ou a cada cerca de doze meses.
O anticorpo é administrado por qualquer meio apropriado, queinclui administração parenteral, local, subcutânea, intraperitoneal,intrapulmonar, intranasal e/ou intralesional. As infusões parenterais incluemadministração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ousubcutânea. Também é contemplada administração intratecal (vide, porexemplo, o Pedido de Patente Norte-Americano n° 2002/0009444, Grillo-Lopez,A., com referência ao fornecimento intratecal de anticorpo CD20).Preferencialmente, a dosagem é fornecida por via intravenosa ou subcutânea.
Embora o anticorpo terapêutico, imunoadesina ou outro bioilógicopossa ser administrado na forma de agente isolado para tratar a doençaautoimune, geralmente, o anticorpo terapêutico ou imunoadesina serácombinado com um ou mais segundo(s) medicamento(s). Para RA, porexemplo, e outras doenças autoimunes, o anticorpo, imunoadesina ou outradroga biológica é preferencialmente combinado com qualquer uma ou maisdrogas imunossupressivas, agentes quimioterápicos, antagonistas de BAFF,antagonistas ou anticorpos de integrina e/ou citocinas relacionadas no capítulode definições acima; qualquer uma ou mais drogas antirreumáticasmodificadoras de doenças (DMARDs), tais como hidroxicloroquina,sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, azatioprina, D-penicilamina, Gold(oral), Gold (intramuscular), minociclina, ciclosporina, imunoadsorção deproteína A de estafilococo; imunoglobulina intravenosa (IVIG); drogasantiinflamatórias não esteroidais (NSAIDs); glucocorticóide (por exemplo, pormeio de injeção nas juntas); corticoesteróide (tal como metilprednisolona e/ouprednisona); folato; antagonista de fator anti-necrose tumoral (TNF), tal comoetanercept/ENBREL®, infliximab/REMICADE®, D2E7 (KnoII) ou CDP-870(Celltech); antagonista IL-1R (tal como Kineret); antagonista 1L-10 (ta! comollodecakin); modulador da coagulação sangüínea (tal como WinRho);antagonista de IL-6/anti-TNF (CBP 1011); antagonista de CD40 (tal como IDEC131); antagonista receptor de Ig-Fc (MDX33); imunomodulador (tal comotalidomida ou ImmuDyn); anticorpo anti-CD5 (tal como H5g1.1); inibidor demacrófagos (tal como MDX 33); bloqueador coestimulante (tal como BMS 188667ou Tolerimab); inibidor de complementos (tal como h5G1.1, 3E10 ou anticorpo fatorde aceleração anti-deterioração (DAF); antagonista de IL-2 (zxSMART); inibidor deEGFR (vide definição acima); inibidor da tirosino quinase (vide definição acima);agente antiangiogênico (tal como anticorpo de VEGF como bevacizumab);anticorpos CD22 tais como LL2 ou epratuzumab (LYMPHOCIDE®;Immunomedics), incluindo epratuzumab Y-90 (Juweid et al, Câncer Res. 55 (23Supl.): 5899s-5907s (1995)), anticorpo CD22 da Abiogen (Abiogen, Itália), CMC 544(Wyeth/Celltech), combotox (UT Southwestern), BL22 (NIH) e LympoScan Tc99(Immunomedics); anticorpo EpCAM, tal como 17-1A (PANOREX®); anticorpo ΧΛ/Ξ3(tal como VITAXIN®; Medimmune); anticorpo CD37 tal como TRU 016 (Trubion);anticorpo IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); anticorpo anti-células B (Impheron);MAb direcionador de células B (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC);LymphoRad 131 (HGS); anticorpo Lym-1 Y-90 (USC); LIF 226 (Enhanced Lifesci.);anticorpo BAFF (tal como WO 03/33658); anticorpo receptor de BAFF (tal como WO02/24909); anticorpo BR3; anticorpo Blys tal como belimumab; LYMPHOSTAT-B®;Oncolym anti-Lym-1 (USC/Peregrine); ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); gomilixima(Idec 152; Biogen Idec); anticorpo receptor de IL-6 tal como atlizumab(ACTEMRA™; Chugai/Roche); anticorpo IL-15 tal como HuMax-ll-15(Genmab/Amgen); anticorpo receptor de quemoquina, tal como anticorpo CCR2(por exemplo, MLN1202; Millieneum); anticorpo anti-complemento, tal comoanticorpo C5 (por exemplo, eculizumab, 5G1.1; Alexion); formulação oral deimunoglobulina humana (tal como IgPO; Protein Therapeutics); anticorpo IL-12 talcomo ABT-874 (CAT/Abbott); Teneliximab (BMS-224818); vacina de células B; DN-BAFF (Xencor); CRx-119 (CombinatoRx); antagonista BAFF da Amgen; Pentostatin(Pfizer); IC-485 (ICOS); antagonista de quemoquina tal como T-487 (TuIarik) ouReticulose (AVR-118); SCO-323 (SCIOS); antagonista de integrina 683699,Tanabe, NGD-2001-1 (Neurogen); SCICM69 (SCIOS); BIRB-796 (BoehringerIngelheim); VX702, VX850 (Vertex); antagonista Leucotrieno B-4 (tal comoamelubunt, BIIL-284; BI); modulador de microtúbulos (Paxceed; Angiotech); inibidorde protease (MBS561392; BMS); AGIX-4207 (Atherogenics); ISIS-104838(ISIS/Elan); MFG-IRAP (Univ. Pitt.); IL-1 Trap (RGN-303; Regeneron/Novartis);oprelvequina (Wyeth); everolimo (Certican; Novartis); Amevive (Biogen ldec); ORG-39141 (Organon); FK-506 (Fujisawa); antagonista de IL-2 (tacrolimo; Fujisawa); etc.
O segundo medicamento pode ser administrado com a exposiçãoinicial e/ou exposições posteriores do anticorpo terapêutico ou imunoadesina,em que essa administração combinada inclui a coadministração, utilizandoformulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, eadministração consecutiva em qualquer ordem, em que há preferencialmenteperíodo de tempo em que ambos (ou todos) os agentes ativos exercemsimultaneamente suas atividades biológicas.
Além da administração do anticorpo ou imunoadesina diretamenteao paciente, o presente pedido contempla a administração de anticorpos ouimunoadesinas por meio de terapia genética. Essa administração de ácidonucleico codificador do anticorpo é englobada pela expressão administração de"quantidade eficaz" de anticorpo. Vide, por exemplo, WO 96/07321 publicadaem 14 de março de 1996, referente à utilização de terapia genética, para geraranticorpos intracelulares.
Existem duas abordagens principais para a obtenção do ácidonucléico (opcionalmente contido em vetor) nas células do paciente: in vivo e exvivo. Para fornecimento in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente nopaciente, normalmente no sítio em que é necessário o anticorpo. Paratratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico éintroduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradasao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranasporosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo, as PatentesNorte-Americanas n° 4.892.538 e 5.238.187). Existe uma série de técnicasdisponíveis para a introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. Astécnicas variam dependendo da transferência ou não do ácido nucleico paracélulas cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro desejado.
Técnicas apropriadas de transferência de ácido nucleico para células demamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos, eletroporação, microinjeção,fusão celular, DEAE-dextran, método de precipitação de fosfato de cálcio etc.Vetor comumente utilizado para fornecimento ex vivo do gene é retrovírus.
As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo atualmentepreferidas incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus Isimplex da Herpes ou vírus adenoassociado) e sistemas com base em lipídios(lipídios úteis para transferência mediada por lipídios do gene são, porexemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol). Em algumas situações, é desejávelfornecer à fonte de ácido nucleico um agente que se dirija às células alvo, talcomo anticorpo específico para proteína de membrana da superfície celular oua célula alvo, Iigante para receptor sobre a célula alvo etc. Ao empregar-selipossomos, proteínas que se ligam a proteína de membrana da superfíciecelular associada a endocitose podem ser utilizadas para dirigir e/ou facilitar aabsorção, por exemplo, de proteínas de capsida ou seus fragmentos trópicospara um tipo de célula específico, anticorpos para proteínas que sofreminternalização na ciclização e proteínas que dirigem localização intracelular eaumentam a meia vida intracelular. O método de endocitose mediada porreceptor é descrito, por exemplo, por Wu et al, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432(1987); e Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 87: 3410-3414 (1990).Para análise dos protocolos de terapia genética e marcação genéticaatualmente conhecidos, vide Anderson et al, Science 256: 808-813 (1992). Videtambém WO 93/25673 e as referências ali mencionadas.
Kits de Diagnóstico
A presente invenção também fornece kit de diagnóstico ou artigoindustrializado, para uso com o método de tratamento prévio do presente. O kitde diagnóstico pode compreender qualquer um ou mais dos seguintes: materialde referência de antagonista/anticorpo/droga (tal como material de referênciade rituximab); anticorpo neutralizante de controle positivo (preferencialmentecabra de macaco cyno); coluna Proteína A + G (tal como Proteína A/G);reagente de deslipidação; tampão(ões) de purificação por afinidade deimunoglobulina (tal como tampões de ligação, eluição e neutralização); soro decomplemento; diluente de teste para células; manual de instruções ouliteratura; ampola de células congeladas (tais como células WIL2); reagentemarcador de células (tal como CELL TITER GLO®) etc.
O kit de diagnóstico pode compreender, por exemplo, (a) reagentede deslipidação; (b) tampões (tais como tampões de ligação e de eluição) parapurificação por afinidade de imunoglobulinas;. e (c) manual de instruções queinstrui o usuário do kit de diagnóstico a utilizar o kit para o tratamento prévio deamostra biológica de paciente com doença autoimune antes da condução debioteste com base em células (tal como teste de anticorpo neutralizante) sobrea amostra (tal como para evitar o problema de interferência de soro).Opcionalmente, a amostra biológica foi tratada com droga, tal como anticorpoterapêutico ou imunoadesina.
O kit de diagnóstico pode ainda compreender opcionalmentequalquer um ou mais dos seguintes: material de referência da droga, anticorponeutralizante controle positivo, soro de complemento, diluente de teste paracélulas, reagente marcador celular etc.
Detalhes adicionais da presente invenção são ilustrados peloExemplo não limitador que se segue. As descrições de todas as citações norelatório descritivo são expressamente incorporadas ao presente como referência.
Exemplo 1
Teste de Anticorpos Neutralizantes com Tratamento Prévio de Soro
Este exemplo refere-se ao desenvolvimento de teste de anticorponeutralizante para anticorpo CD20, rituximab, em indicações autoimunes.Rituximab é anticorpo monoclonal quimérico de camundongo humano quereconhece a molécula CD20 humana sobre células B e esgota células B pormeio de funções efetoras de anticorpos. Rituximab é aprovado nos EstadosUnidos e na Europa para determinar Iinfoma não de Hodgkin (NHL) reincidenteindolente e está sendo desenvolvido para indicações autoimunes, que incluemartrite reumatóide (RA) e eritematose do lúpus sistêmico (SLE), entre outras.
Determinação da atividade de anticorpo neutralizante (NAb)soropositivo contra Rituximab foi desenvolvida com base no teste de potência,teste de citotoxicidade celular dependente de complemento (CDC). Neste teste,o Rituximab é incubado com fonte padronizada de complemento de sorohumano e linhagem de células de linfócitos B alvo, WIL2-S, por duas horas.Após duas horas, a quantidade de células mortas por Rituximab-CDC é medidaem proporção à quantidade de células vivas remanescentes.
Reagentes
Reagente de deslipidação: Absorvente PHM-L LIPOSORB®,Calbiochem, cat524371
Proteína A/G imobilizada IMMUNOPURE®: Pierce, cat 20422Colunas de polipropileno de 5 ml: Pierce, cat 29922Tampão de eluição: HCI em ddH20 estéril, pH 2,1Tampão de neutralização: 20X PBS1 A410 (sem Ca++/Mg++), pH6,5, HyCIone cat SH3A648.01
Tampão bloqueador: 1% BSA em PBS
BSA: 7,5% BSA1 Fração V, cultura celular testada, Sigma cat. A8412
PBS: Prep. Meios GNE B5, código A0829
Concentrador CENTRICON-30®: tamanho de 2 ml, Amicon cat. 4209
Centrífuga para deslipidação: Centrífuga EPPENDORF® 5415C
Centrífuga para células e concentração: Beckman GS-6R
Células WIL2-S (ATCC CRL-8885)
Meio de crescimento: RPMI 1640, 2 mM L-glutamina, 10% FBS,gentamicina
Diluente de Teste (AD): RPMI 1640, 20 mM HEPES, 0,1% BSA,25 μg/mL gentamicina.
Meio de escassez: 10% Meio de Crescimento em AD
Complemento: soro complementar humano, Quidel parte A112,lote 3M0174
Padrão Rituximab: material de referência C2B81298-2, 9,8 mg/ml.
Padrão NAb Rituximab: Cyno anti-Rituxan pAb (lote 44082-81),0,5 mg/mL
Rituximab NAb controle: NHSp00i contendo NAb (título baixo e alto,lote 44083-48)
CELLTITER-GLO®: Promega, cat. G7571 (10 χ ampolas de 10 ml)
GUAVA® VIACOUNT®: GUAVA® Inc. 4000-0040
Placas de TC brancas com 96 cavidades, fundo transparente comtampa: Corning costar 3610
Leitor Molecular Devices SOFTMAX® Pro Lmax
Concentrador Pierce iCON®, 7 ml tamanho, cat-89886 (alternativapara CENRICON-30®)Pierce IMMUNOPURE® Proteína A Plus (cat 22811) (alternativapara Proteína A/G)
Pierce IMMUNOPURE® Proteína G Plus imobilizada (cat 22851)(alternativa para Proteína A/G)
Procedimento de Tratamento Prévio de Amostra
1. Deslipidar o soro. Adicionar 200 μΙ de solução LIPOSORB®(reconstituída em PBS1 de acordo com as instruções do fabricante) a 0,25 mlde soro em tubo de polipropileno de 1,5 ml siliconado. Turbilhonar por 45segundos e centrifugar por dez minutos a 4500 rpm (1600 χ g). Remover ediluir o sobrenadante em 1 ml de PBS em tubo de polipropileno de 1,5 mlsiliconado. (É aceitável se algum LIPOSORB® for conduzido para a amostra;ele não obstrui a coluna.)
2. Preparar coluna separada de 0,5 ml de Proteína A/G paracada amostra de paciente e controles. Adicionar 1 ml de calda de Proteína A/G acoluna de 5 ml e medir a altura do leito para garantir volume de leito de 0,5 ml.
3. Caso o gel tenha sido utilizado anteriormente, conduzir 5 mlde tampão de eluição através da coluna para limpar esferas de coluna. Onúmero de vezes em que a coluna pode ser reutilizada não foi determinado.
4. Equilibrar a coluna utilizando 2 χ 5 ml de PBS.
5. Aplicar os 1,25 ml de soro diluído à coluna. Recolher ofluxo em tubo de polipropileno de 1,5 ml siliconado e reaplicar duas vezes.
6. Lavar coluna utilizando 3 χ 5 ml de PBS.
7. Eluir anticorpo com 4 ml de tampão de eluição em tuboFALCON® de 15 ml que contém 0,2 ml de tampão de neutralização.
8. Bloquear 2 ml de concentrador CENTRICON-30®adicionando 0,5 ml de tampão bloqueador e centrifugando o concentrador pordez minutos a 3000 rpm (1000 χ g). Descartar qualquer tampão bloqueador notopo ou fundo do concentrador.9. Concentrar os eluentes neutralizados até atingir-sevolume final de 0,25 ml. Caso a amostra seja excessivamente concentrada,utilizar o fluxo de CENTRICON-30® para diluição de volta para 0,25 ml.Utilizar tubo de polipropileno de 1,5 ml siliconado para medir o volume finalaté a marca de 0,25 ml.
10. Armazenar o concentrado a -70 0C até que esteja prontopara teste no teste de CDC de neutralização.
Procedimento de Teste de Neutralização
O teste de anticorpos neutralizantes do presente é baseado nodescrito em US 2005/0032130 A1 (Beresini e Song), publicada em dez defevereiro de 2005. O teste foi modificado, entretanto, nos aspectos aseguir: A amostra biológica (ou seja, soro) é agora soro previamentetratado; CELLTITER-GLO® é agora a leitura de teste em vez de ALAMARBLUE® (resazurin); anticorpo controle utilizado é preparação purificada deProteína A de macaco cynomolgus (HER2 adsorvida), não anti-Rituximabde cabra; e tampões, volumes, complemento, controles, efeitos em matrizde soro, análise de dados e interpretação foram alterados conformedescrito abaixo.
1. No dia antes do teste, semear 8 χ 106 células em 20 ml demeio de escassez (0,4 χ 106 células/ml).
2. Preparar 100 (CDCmax)1 0,4 (CDCNAb) e 0 (CDCzero)de Rituximab.
100 μg/ml: 10,2 μΙ_ Rituximab Padrão a 1 ml AD
20 μg/ml: 150 μΙ 100 μg/ml Rituximab em 600 μΙ AD0,4 μg/ml: 100 μΙ 20 μg/ml Rituximab em 4,9 ml AD0 μg/ml: AD isolado
3. Adicionar 25 μΙ a cavidades de teste conforme exibidoabaixo (Tabela 3).Tabela 3
Disposição em Placas de Concentrações de Rituximab
<table>table see original document page 122</column></row><table>
4. Adicionar 25 μΙ cada em duplicata de controle negativo,baixo controle e amostras conforme exibido na Tabela 4. A disposição deplacas atual possui espaço para 24 amostras. Pode ser possível utilizar maisda placa, mas isso não foi testado.
Tabela 4
Disposição em Placas de Controles ε Amostras
<table>table see original document page 122</column></row><table>
5. Incubar com suave agitação à temperatura ambiente porpelo menos duas horas para permitir a ligação e neutralização de Rituximabpor anticorpos purificados do soro.6. Descongelar soro de complemento à temperatura ambiente(RT) e colocar sobre gelo em seguida.
7. Remover células WIL2-S do frasco, lavando os ladosinferiores do frasco, em tubo falcon de 50 ml. Remover 10 μΙ de suspensãocelular e adicionar 190 μΙ de VIACOUNT®. Após dois minutos, contar ascélulas e registrar #/ml (diluição 20X) e percentual de viabilidade.Alternativamente, as células podem ser contadas utilizando hemocitômetro.
8. Centrifugar células a 1200 rpm (150 χ g), por oito minutos.Decantar meios e suspender novamente as células em 1 ml de AD. Preparar10 a 20 ml de células WIL2-S em AD a 0,25 χ 106/ml para o teste.
9. Adicionar 50 μΙ de complemento a cada cavidade.
10. Adicionar 50 μΙ de 0,25 χ 106/ml de células WIL2-Spreparadas na etapa 9 a cada cavidade.
11. Agitar placa para mistura por um minuto à temperaturaambiente. Incubar por duas horas a 37 °C/5% CO2. Nos últimos dez minutos,trazer a placa para a temperatura ambiente.
12. Permitir que o reagente CELLTITER-GLO® chegue àtemperatura ambiente. Adicionar 100 μΙ a cada cavidade. TampãoCELLTITER-GLO® e substrato são armazenados a -20 0C. Os doiscomponentes podem ser colocados para descongelar a 4-8 0C por umanoite e, no dia do teste, misturados e deixados sobre a bancada por trinta a45 minutos antes do uso. Reagente misturado adicional pode serarmazenado a -20 0C por pelo menos um mês.
13. Agitar placa para mistura por dez minutos à temperaturaambiente.
14. Ler luminescência sobre leitor Molecular DevicesLMAX®, utilizando tempo de integração de um segundo, sem subtraçãode padrão.Análise de Dados
1. Calcular os valores médios das réplicas de teste para todasas amostras e controles. Não utilizar valores caso o percentual de CV do meioseja > 25%.
2. Calcular o ponto de corte conforme segue:(Valor de Controle Negativo Médio CELLTITER-GLO® a 0,4 μς/ιτιΙde Rituximab) χ 1,03
Ponto de corte do teste é definido como o nível de resposta do testeacima do qual amostra é definida como sendo positiva e abaixo do qual é definidacomo sendo negativa. O ponto de corte é determinado estatisticamente a partir donível de fundo não específico no teste, conforme descrito em Mire-Sluis et al,Joumal of Immunological Methods 289: 1-16 (2004)). Neste teste, o fator de pontode corte de 1,03 foi determinado por meio de teste de dez soros nativos individuaisde RA ao longo de três dias e representa aumento de 3% sobre a resposta decontrole negativo entre testes. Os dez soros individuais de RA foram selecionados apartir de população de cem indivíduos, para refletir toda a série de interferências desoro e efeitos não específicos. O procedimento de tratamento prévio de soro,realizado como parte de cada teste, normalizou as reações de amostras e permitiua aplicação do baixo fator de ponto de corte de 1,03. Utilizando o fator de ponto decorte de 1,03, todos os soros de RA nativos de Rituximab seriam definidos comonegativos, enquanto 1 μg/ml de pAb anti-Rituximab de macaco cynomolgus ou 0,25μg/ml de pAb anti-Rituximab de cabra seriam definidos como positivos.
3. Examinar valores médios de amostra e relatar de acordocom os critérios a seguir:
Caso valor médio de amostra ^ ponto de corte, relatar amostracomo negativa.
Caso valor médio de amostra > ponto de corte, relatar amostracomo positiva.4. O teste é válido caso a razão do controle baixo caia >ponto de corte e se houver queda de dez vezes no sinal entre as respostas deteste de 0 μρ/ηηΙ e 100 μ9/ιηΙ de Rituximab.
5. No momento, as amostras são relatadas como positivas ounegativas, com base no ponto de corte entre testes. No futuro, pode-se desejarcalcular os valores de títulos de amostras. "Título" é o recíproco da diluiçãomais alta da amostra com resultados positivos de testes no método. É práticacomum expressar título como o Iogaritmo comum da diluição mais alta daamostra com resultados positivos de testes no método. (Mire-Sluis et al,Journal of Immunological Methods 289: 1-16 (2004)). Caso isso fosse feito,controle com alto título também seria incluído.
Interpolação de Título
O título de amostra é definido como IogIO do fator de diluição daamostra que resulta em resposta de teste equivalente ao ponto de corte noteste. Portanto, caso diluição 1/100 de amostra resulte em sinal no testeequivalente ao ponto de corte, o título seria logi0100 ou 2,00. Amostra quenecessita de diluição 1/1000 receberia título de 3,00. Caso a resposta de pontode corte caia entre duas respostas de diluição de amostra (o que geralmenteocorre), o título é calculado utilizando fórmula para solucionar pontodesconhecido sobre linha em eixo X-Y, desde que todos os pontos Y sejamconhecidos ("unidades de sinal") e dois dos pontos X sejam conhecidos("unidades de diluição").
É utilizada a fórmula a seguir:
a = sinal da amostra positiva ou controle acima do ponto de corte
b = sinal da amostra positiva ou controle abaixo do ponto de corte
c = sinal do ponto de corte
d = diluição da amostra positiva ou sinal de controle acima doponto de cortee = diluição da amostra positiva ou sinal de controle abaixo doponto de corte
Para calcular o título:
Título = Iog (a-c) · (e-d) + d (a-b)
6. O teste é válido caso a razão do baixo controle caia > 1,03e o título de alto controle > 2,0.
7. As amostras são relatadas como valor de título de atividadeneutralizante. Caso a resposta de amostra a 0 μοΛηΙ de Rituximab indiqueinterferência de teste, relatar dados como "não determinados devido asubstâncias interferentes".
Passagem de Células WIL2-S
1. O teste de neutralização de Rituximab-CDC utiliza alinhagem de células de Iinfoblastas B WIL2-S imortais como célula alvo.
Esta linhagem celular idealmente passa após atingir densidade de 1-2 χ106 células/ml. Para manter as células, a nova densidade de semeaduradeverá dirigir-se a 0,04-0,3 χ 106 células/ml em meios de crescimento.
Para preparar teste de CDC, as células são semeadas em densidade de0,4 χ 106 células/ml em diluente de teste contendo 10% de meios decrescimento. As células podem ser passadas pelo menos até P31.Idealmente, as células deverão ser mantidas em densidade celular de0,25 a 2,5 χ 106 células/ml.
Tabela 5
Semeadura de Células WIL2-S para Passagem
<table>table see original document page 126</column></row><table>Resultados ε Discussão
O teste de anticorpo neutralizante de CDC Rituximab é ilustradoesquematicamente na Fig. 4. A Fig. 5 demonstra que a citotoxicidadedependente de complemento (CDC) de Rituximab pode ser neutralizada nosdomínios Fab e Fe. Rituximab media CDC de forma dependente de dosagem,em que a Iise celular máxima ocorre em concentração de 5 μg/ml (dados decontrole exibidos na forma de círculos). A fim de testar a capacidade desteteste de detectar anticorpos neutralizantes, Rituximab foi previamente incubadocom anticorpos policlonais anti-Fcy humano de cabra (dados exibidos comolosangos) ou anti-Rituximab de cabra (específico de CDR; dados exibidoscomo quadrados). Após duas horas, adicionou-se complemento de sorohumano normal e 12.500 células. Após duas horas, o número de células vivasfoi medido utilizando CELLTITER GLO®. Na presença de anticorpos anti-CDRou Fc, a potência da atividade de Rituximab-CDC foi reduzida, indicada poralterações nas curvas de reação à dosagem à direita. Conforme indicado pelassetas, por exemplo, o percentual de células vivas restantes a 1 μg/ml deRituximab é maior em amostras previamente incubadas com anti-CDR decabra (100%), seguidas por amostras previamente incubadas com anti-Fcy decabra (70%) em comparação com o controle (40%).
A primeira etapa na alteração de potência para neutralização doformato de teste é testar a capacidade do teste para tolerar soro nativo dedroga não tratado. Testes iniciais do ensaio de Rituximab-CDC na presença desoro humano normal demonstraram desempenho dependente de dosagemequivalente entre vinte indivíduos machos e fêmeas. Dentre a população alvodo teste de NAb, pacientes com artrite reumatóidè (RA), entretanto, o teste nãofoi confiável, demonstrando reações celulares de CDC e Rituximab altamentevariáveis entre os indivíduos. Em alguns indivíduos, a adição de soro nativo aoteste inibiu completamente a capacidade de mediação de CDC por Rituximab.A Fig. 6 exibe tolerância de soro no Teste de Rituximab-CDC. Oteste de Rituximab-CDC foi realizado para determinar a sua capacidade detolerar soro nativo de droga não tratado. Testes iniciais do ensaio na presençade soro humano normal demonstraram desempenho dependente de dosagemequivalente entre dez indivíduos machos e fêmeas (plotagem à esquerda).Dentre a população alvo do teste de NAb1 pacientes com artrite reumatóide(RA)1 entretanto, o teste não foi confiável, demonstrando reações celulares deCDC e Rituxan altamente variáveis entre os indivíduos (plotagem à direita). Emalguns indivíduos, a adição de soro nativo ao teste inibiu completamente acapacidade de mediação de CDC por Rituxan (tal como dados individuaisexibidos como losangos).
A falta de especificidade e variabilidade de tecido de potência deRituximab na presença de soro de RA, a chamada "interferência de soro",gerou a adição de etapa de tratamento prévio em soro para "limpar" a amostraantes da sua submissão ao teste de Rituximab CDC.
Os métodos testados para tratamento prévio de soro foramdesenvolvidos com níveis crescentes de manipulação.
Em primeiro lugar, embora a interferência pudesse ser minimizada pormeio do aumento da diluição de amostra mínima (até pelo menos 1/80), asensibilidade do teste foi muito comprometida (> 5 μg/ml de anticorpo anti-Rituximab).
Em segundo lugar, várias leituras de teste alternativas foramcomparadas. Neste teste, a quantidade de CDC causada por Rituximab pôdeser medida pela quantidade de células vivas restantes ou a quantidade decélulas mortas. Células vivas são tipicamente medidas por leitura metabólica,tais como o indicador redox ALAMAR BLUE® ou o indicador ATP, CELLTITERGLO®. Células mortas podem ser medidas por meio da liberação de conteúdocitoplasmático, seja endógeno (tal como Iactose desidrogenase) ou por tinturapreviamente carregada (tal como calceína). Conceitualmente, caso reagentegerasse leitura de teste após dez minutos (tal como CELLTITER GLO®), emcomparação com dezesseis horas (tal como ALAMAR BLUE®), haveria menostempo para interferência não específica do soro com o metabolismo celular.
Alternativamente, caso reagente fosse adicionado de forma exógena e,portanto, não conectado ao metabolismo celular (tal como calceína), podehaver menos interferência.
A Fig. 7 representa leituras de teste alternativas para o teste deRituximab-CDC. A quantidade de Iise celular causada por Rituximab-CDC pôde sermedida pela quantidade de células vivas restantes ou a quantidade de célulasmortas. Células vivas são tipicamente medidas por leitura metabólica, tais como oindicador redox ALAMAR BLUE® ou o indicador ATP, CELLTITER GLO®. Célulasmortas podem ser medidas por meio da liberação de conteúdo citoplasmático, sejaendógeno (tal como Iactose desidrogenase) ou por tintura previamente carregada(tal como calceína). ALAMAR BLUE® (dados exibidos em x) e CELLTITER GLO®(dados exibidos em círculos) demonstraram perfis de Rituximab-CDC similares,com faixa dinâmica aprimorada evidente para CELLTITER GLO®. Calceína (dadosexibidos em quadrados) também foi capaz de medir Rituximab-CDC, embora commenos sensibilidade e menor faixa dinâmica. Lactose desidrogenase (dadosexibidos em losangos) não foi indicador sensível de Rituximab-CDC.
A Fig. 8 é comparação de interferência de soro de RA no teste deRituximab-CDC ao utilizar leituras diferentes. Em esforço para reduzir interferênciade soro de artrite reumatóide no teste de Rituximab-CDC, foi testada a tolerância detrês leituras de teste de CDC diferentes (vide Fig. 7) para cinco soros de RAindividuais. A interferência de soro foi observada com todos os três reagentes dedetecção, CELLTITER GLO®, ALAMAR BLUE® (ponto intermediário) e calceína.CELLTITER GLO® foi selecionado como leitura para desenvolvimento de testefuturo, pois exibiu a menor interferência de soro, melhor faixa dinâmica e EC5O deRituximab mais uniformemente sensível.Conforme exibido nas Figs. 7 e 8, neste teste, leituras alternativasnão solucionaram a interferência de soro de RA1 o que sugere que ainterferência ocorre no início do teste, durante as duas horas as células sãoincubadas com Rituximab e soro de complemento padronizado. Infelizmente,testes de MOA funcionais apropriados alternativos para Rituximab ou trajetosalternativos para medição de CDC não são disponíveis.
Terceira linha de abordagem foi a remoção da substânciainterferente. Dois métodos razoavelmente suaves testados inicialmenteincluíram: coluna de dessalinização (coluna NAP-5®, Pharmacia Biotech) pararemover moléculas pequenas; e procedimento de deslipidação (PHM-LLIPOSORB® Calbiochem) para remover lipídios do soro. Nenhum método foicapaz de remover a substância interferente. Terceira possibilidade seria aadição de anticorpo inibidor contra citocina interferente ou sua desativação porcalor. Entretanto, embora perfis de citocina do soro de RA de paciente nãofossem normais, eles não demonstraram correlação entre níveis de citocinaespecíficos e interferência de teste. Forma bruta de precipitarpreferencialmente imunoglobulinas totais é "salinizá-las" por meio da adição desulfato de amônio saturado (SAS) até volume final de 33%. Interferência deamostra ainda era problema após o procedimento de SAS. Por fim, acreditou-se que seria necessário purificar especificamente as imunoglobulinas do soroantes de testar amostras no teste de Rituximab-CDC.
A purificação específica de imunoglobulinas do soro pôde serconduzida por meio de (a) purificação específica de anticorpos anti-Rituximab;ou (b) purificação específica de imunoglobulinas totais.
A purificação de anticorpos anti-Rituximab aparentemente foi aabordagem mais direta, com o benefício adicional de captura de todos osisotipos de anticorpos anti-drogas e a remoção de interferência de Rituximabcausada por droga terapêutica residual nas amostras de pacientes. Váriasestratégias de purificação por afinidade de Rituximab foram testadas, incluindo:Rituximab-GLY-CPG® (Controlled Pore Glass Products Inc.), Rituximab-BIOMAG® (Bangs Laboratories, Inc.) e Rituximab-EMPORE® (3M BioanalyticalTechnologies). Após extensa otimização de parâmetros de acoplamento,bloqueio, ligação e eluição, estes métodos foram suspensos devido à baixarecuperação, particularmente em concentrações de anticorpos específicos desoro de menos de 1 μg/ml (recuperação de menos de 25%).
Método clássico de purificação de imunoglobulinas totais é ouso das proteínas recombinantes de origem microbiana, Proteína A eProteína G. A Proteína G liga-se fortemente a todos os quatro subtipos de Ig(IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4), enquanto a Proteína A liga-se fortemente a IgGi,IgG2 e IgG4, fracamente a IgG3, IgM, IgA e moderadamente a IgE.Combinação das propriedades de Proteína A e Proteína G capturarão todosos isotipos de anticorpos anti-drogas, embora com orientação dirigida aossubtipos IgGii2l4. Utilizando esta abordagem, a atividade neutralizadora deanticorpos para Rituximab foi equivalente em soro humano normal e sorohumano normal previamente tratado no teste CDC. De forma importante, areação à dosagem da atividade de Rituximab-CDC tornou-se equivalente nosoro previamente tratado de indivíduos com RA (indivíduos que demonstramextremos de variação de teste CDC em soro não tratado). A baixasensibilidade da atividade de neutralização foi determinada como sendo de0,25 μg/ml e 1 μg/ml (concentração em soro puro) de anticorpos anti-Rituximab de cabra e macaco cynomolgus, respectivamente. Por fim,procedimento utilizando purificação de Proteína A+G antes do teste deamostras de anticorpos anti-Rituximab soropositivos no teste de Rituximab-CDC com base em células foi desenvolvido, otimizado e qualificado. Ascaracterísticas de desempenho de teste foram consideradas aceitáveis parateste de caracterização de anticorpos clínicos validados.A Fig. 9 exibe o procedimento de tratamento prévio de soroutilizado para purificar imunoglobulinas totais a partir da amostra de soro. Estemétodo de purificação de imunoglobulinas no soro total foi desenvolvido paraeliminar interferência de soro no teste de Rituximab-CDC. Gráfico de fluxo queresume o procedimento é exibido a seguir.
Procedimento do pré-tratamento com soro250 μΙ de Soro
Adicionar 167 μΙ PHM-1 LIPOSORB®, vortex, centrifugação por 10 min.
Remover o soro deslipidado, adiciona-se 1 ml PBS
Aplicar a resina A+G de proteína 0,5 ml, em uma coluna com 5 ml pré-equilibrada em PBS
Coletar escoamento e reaplicação 2X
Lavar 3X com 5ml PBS
Fluir com 4 ml de HCI1 pH 2,1 dentro de 0,2ml 20X PBS1 pH 6,5
Concentrar
O procedimento de tratamento prévio de soro superou o problemade interferência. A Fig. 10 exibe o desempenho do teste de Rituximab-CDCantes e depois do procedimento de tratamento prévio de soro. Dentre apopulação alvo do teste de NAb1 pacientes com artrite reumatóide (RA)1 o testede Rituximab-CDC não foi confiável, demonstrando reações celulares de CDCe Rituximab altamente variáveis entre os indivíduos (plotagem esquerda). Dezsoros de RA individuais foram testados no ensaio antes (plotagem esquerda) edepois (plotagem direita) de realizar-se o procedimento de tratamento prévio desoro. Tratamento prévio de soro removeu os componentes da matrizinterferente e normalizou a reação à dosagem da atividade de Rituxan-CDCentre indivíduos com RA.
Além do procedimento de tratamento prévio de soro, várias melhoriasadicionais no teste de anticorpos de neutralização também foram desenvolvidas.
Foi determinada a sensibilidade do teste utilizando diferentesnúmeros celulares. A Fig. 11 exibe sensibilidade mais alta do teste deRituximab-CDC à neutralização em números celulares mais baixos. O teste depotência de Rituximab-CDC, utilizado para liberação de lotes de material, foiadaptado como teste de neutralização. Durante a otimização do teste deneutralização, observou-se maior sensibilidade utilizando números celularesquatro vezes mais baixos (plotagem direita) que os utilizados no teste depotência (plotagem esquerda), mantendo ao mesmo tempo a robustez do teste.Concentrações crescentes de anticorpos policlonais CDR anti-Rituximab decabra, de 0,125 a 2 μg/ml, foram previamente incubadas com Rituximab aolongo de toda a faixa de reação à dosagem do teste. A alteração à direita dacurva de reação à dosagem aumentou de forma diretamente proporcionai àconcentração de pAb dirigida contra Rituximab (plotagens esquerda e direita).A alteração à direita foi maior em números celulares menores (plotagem àdireita). Também se observou que, em todas as concentrações de anticorposneutralizantes, a alteração comparada com o controle não foi linear, alterandoaté maior ponto em concentrações mais baixas de Rituximab (seçõessuperiores das plotagens esquerda e direita).
A seleção de doses de Rituximab também foi avaliada como meioadicional de aumento da sensibilidade do teste de anticorpos neutralizantes. A Fig.12 reflete a seleção da concentração de Rituximab utilizada para determinar aatividade neutralizante. Na avaliação das amostras de paciente, deseja-se relatar aatividade neutralizante em uma única concentração selecionada de Rituximab comrelação a ponto de corte. Com base na maior sensibilidade da curva de reação àdosagem de Rituximab à neutralização sob concentrações de Rituximab maisbaixas (Fig. 12), a concentração de Rituximab foi testada a 0,2, 0,4 e 0,6 μg/ml comquantidades crescentes de pAb de CDR anti-Rituximab de cabra (de 0,1 a 1 μg/ml).Sob concentração de Rituximab de 0,2 μg/ml, a atividade de CDC é apenasmarginalmente acima da Iise celular de fundo na ausência de droga e aneutralização encontra-se abaixo de significado estatístico. Sob concentração deRituximab de 0,4 μg/ml, a atividade de CDC é 25 a 30% acima de Iise celular defundo na ausência de droga e a neutralização é estatisticamente significativa eproporcional à concentração de anticorpos neutralizantes. Aumentos adicionais dasconcentrações de Rituximab comprometeram a sensibilidade do teste para adetecção de níveis mais baixos de anticorpos neutralizantes. Conforme indicado,por exemplo, pela estrela acima, 0,1 μg/ml de pAb CDR anti-Rituximab de cabranão neutralizam 0.6 μg/ml, bem como 0.4 μg/ml de Rituximab.
A Fig. 13 exibe o efeito de interferência de droga sobre o teste deRituximab-CDC neutralizante. O soro de paciente para teste no ensaio deRituximab-CDC neutralizante pode conter Rituximab terapêutico residual. Casoos níveis de anticorpos neutralizantes sejam insuficieintes para desativarbiologicamente terapêutico em circulação, a amostra pode contribuir comRituximab ativo para o teste, resultando em atividade de CDC anormalmentealta. A atividade neutralizante no teste é avaliada contra controles positivosbaixos e negativos entre testes. Atividade com teor de CDC anormalmente altoem amostra resultaria em leitura falsa negativa. A plotagem à esquerdademonstra o efeito da adição de 1 μg/ml de Rituximab (quadrados) à curvanormal de reação à dosagem de Rituximab de teste (círculos). A toxicidade delinha base é mais alta e a EC50 alterna para concentração aparente mais baixa.Conforme descrito na plotagem à direita, entretanto, quando a mesmaconcentração de 1 μ9/ηιΙ de Rituximab é adicionada junto com excesso molarde cinco vezes (5 μg/ml) de anticorpo policlonal de CDR anti-Rituximab decabra (quadrados), a toxicidade de linha base retorna ao normal e ainda háanticorpo neutralizante suficiente além de Rituximab para ser como medidopositivo no teste (conforme indicado por alteração significativa à direita nacurva de reação à dosagem).Listagem de Seqüência
<110> GENENTECH, INC.
KRISTA MCCUTCHEONAN SONG
<120> TRATAMENTO PRÉVIO DE AMOSTRA BIOLÓGICA DE PACIENTE COM DOENÇA AUTOIMUNE
<130> P2233R1 PCT
<140> PCT/US2006/019576<141> 19-05-2005
<150> US 60/682,990<151> 20-05-2005
<160> 24
<210> 1<211> 107<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1Gln Ile Val Leu1
Gly Glu Lys Val
Tyr Met His Trp
Trp Ile Tyr Ala
Phe Ser Gly Ser
Arg Val Glu Ala
Ser Phe Asn Pro
Lys Arg
<210> 2<211> 107<212> PRT<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro5 10 15
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro35 40 45
Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser65 70 75
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90
Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu95 100 105Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg
<210> 3<211> 108<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser20 25 30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105
Ile Lys Arg
<210> 4<211> 10<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 4
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
10
<210> 5<211> 7<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser<210> 6<211> 9<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr
5
<210> 7<211> 122<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser
65 70 75
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
80 85 90
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
<210> 8<211> 122<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
<210> 9<211> 119<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu95 100 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115
<210> 10<211> 10<212> PRT
<213> Mus musculus<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
5 10
<210> 11<211> 17<212> PRT
<213> Mus musculus
<4 00> 11
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe15 10 15
Lys Gly
<210> 12<211> 13<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
5 10
<210> 13<211> 213<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30
Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
185 190 195
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
200 205 210
Gly Glu Cys
<210> 14<211> 452<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn320 325 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly380 385 ' 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser395 400 405Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys
<210> 15<211> 213<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<4 00> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
80 85 90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
95 100 105
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
110 115 120
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
125 130 135
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
140 145 150
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
155 160 165
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
170 175 180
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val185 190 195Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg200 205 210
Gly Glu Cys
<210> 16<211> 452<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<4 00> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
230 235 24 0
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys
335 340 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly Lys
<210> 17<211> 451<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
320 325 330
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
335 340 345
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
380 385 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
440 445 450
Gly
<210> 18<211> 107<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90
Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile95 100 105Lys Arg
<210> 19<211> 122<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg
95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
110 115 120
Ser Ser
<210> 20<211> 451<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg95 100 105
Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn320 325 330
Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys365 370 375
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly380 385 390
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser395 400 405
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu425 430 435
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445 450
Gly
<210> 21<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<220><221> Xaa<222> 9
<223> Xaa é M ou L<400> 21
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His
5 10
<210> 22<211> 9<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<220><221> Xaa<222> 4
<223> Xaa é S ou A<400> 22
Gln Gln Trp Xaa Phe Asn Pro Pro Thr
5<210> 23<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência Arificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<220><221> Xaa<222> 8
<223> Xaa é D ou A<400> 23
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe15 10 15
Lys Gly
<210> 24<211> 13<212> PRT
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Seqüência é Sintetizada
<220><221> Xaa<222> 6
<223> Xaa é Ν, Α, Υ, W ou D
<220><221> Xaa<222> 7
<223> Xaa é S ou R
<400> 24
Val Val Tyr Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
5 10

Claims (23)

1. MÉTODO DE TRATAMENTO DE AMOSTRA BIOLÓGICA,de paciente com doença autoimune com artrite reumatóide ou lúpuseritematoso sistêmico (SLE)1 caracterizado pelo fato de que o paciente comdoença autoimune foi tratado com um anticorpo terapêutico ou imunoadesinacompreendendo:(a) deslipidação da amostra;(b) purificação por afinidade de imunoglobulinas na amostra;(c) concentração das imunoglobulinas purificadas; e(d) submissão das imunoglobulinas concentradas a teste deatividade biológica com base em células.
2. MÉTODO, conforme a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o teste em (d) é teste de anticorpo neutralizante.
3. MÉTODO, conforme a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a amostra em (a) é amostra de soro.
4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o paciente possui artrite reumatóide.
5. MÉTODO, de acordo com uma d as reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o paciente possui lúpus eritematoso sistêmico (SLE).
6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende a purificação deessencialmente todos os isotipos de imunoglobulina.
7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende purificação porafinidade de Proteína A + G.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que a purificação por afinidade da Proteína A + G é repetida porduas ou mais vezes.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a purificação por afinidade da Proteína A + G é repetida portrês vezes.
10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de que a amostra na etapa (a) compreendeinterferência.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o paciente com doença autoimune foi tratado com anticorpoterapêutico.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o anticorpo terapêutico é anticorpo CD20.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o anticorpo terapêutico é rituximab ou 2H7 humanizado.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que o anticorpo terapêutico é selecionado a partir do grupo queconsiste de rituximab, 2H7 humanizado, anticorpo CD20 humano 2F2 (HuMax-CD20), anticorpo A20 humanizado ou IMMU-106, TRU 015, anticorpo fator denecrose tumoral (TNF)-a, infliximab, CDP571, MAK-195, adalimumab,fragmento de anticorpo TNF-V pegilado, CDP-870, anticorpo policlonal anti-TNF-α, PassTNF, anticorpo de integrina, efalizumab, natalizumab, anticorpoBAFF, anticorpo BR3, anticorpo receptor de BAFF, anticorpo Blys, belimumab,anticorpo CD37, TRU 016, anticorpo CD22, epratuzumab, anticorpo AbiogenCD22, CMC 544, combotox, BL22, LIF 226, anticorpo VEGF, anticorpo receptorde VEGF, bevacizumab, ranibizumab, anticorpo anti-HER, trastuzumab,pertuzumab, cetuximab, anticorpo anti-IgE, omalizumab, anticorpo IL-21,anticorpo anti-células B Impheron, 1D09C3, anticorpo Lym-1, oncolym, ISF-154, gomilixima, anticorpo receptor de IL-6, atlizumab, anticorpo IL-15, HuMax--11-15, anticorpo receptor de quemoquina, anticorpo CCR2, MLN1202, anticorpoanti-complemento, anticorpo C5, eculizuma, formulação oral de imunoglobulinahumana, IgPO1 anticorpo IL-12, ABT-874, teneliximab, anticorpo CD40, S2C6humanizado, TNX 100, anticorpo CD52, campath-1H e anticorpo W33.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o anticorpo terapêutico é anticorpo de integrina.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o anticorpo de integrina é efalizumab ou natalizumab.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o paciente com doença autoimune foi tratado comimunoadesina.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a imunoadesina é selecionada a partir do grupo que consistede BR3-lg, imunoadesina TNF-α, etanercept, corpo de peptídeo anti-BAFF,TACI-lg, BCMA-lg, CTLA4-lg, abatacept e BAFF-R-lg.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o paciente com doença autoimune foi tratado com anticorpofator de necrose tumoral (TNF)-a ou imunoadesina TNF-a.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o paciente com doença autoimune foi tratado com infliximab,adalimumab, etanercept, CDP-870 ou D2E7.
21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o paciente com doença autoimune foi tratado com drogaselecionada a partir do grupo que consiste de TNF-R solúvel pegilado,pegsunercept, antagonista receptor de IL-1 (IL-IRa)1 anaquira, DN-BAFF evacina.
22. KIT DE DIAGNÓSTICO, caracterizado pelo fato de quecompreende:(a) reagente de deslipidação;(b) tampões para purificação por afinidade de imunoglobulinas;(c) material de referência da droga; e(d) manual de instruções que instrui o usuário do kit dediagnóstico a praticar o método conforme definido na reivindicação 1.
23. KIT DE DIAGNÓSTICO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente qualquer um oumais dentre: anticorpo neutralizante controle positivo, soro de complemento,diluente de teste para células e reagente marcador celular.
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