BRPI0612972A2 - mÉtodo para tratar doenÇa de alzheimer, mÉtodo para tratar demÊncia, artigo de fabricaÇço e usos de um anticorpo cd20 - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA TRATAR DOENÇA DE ALZHEIMER, METODO PARA TRATAR DEMÊNCIA, ARTIGO DE FABRICAÇçO E USOS DE UM ANTICORPO CD2O A presente invenção refere-se a métodos para tratar doença de Alzheimer (AD) ou demência usando-se um anticorpo CD2O como descrito. Artigos de fabricação para uso em tais métodos também são descritos.

Description

"MÉTODO PARA TRATAR DOENÇA DE ALZHEIMER, MÉTODO PARATRATAR DEMÊNCIA, ARTIGO DE FABRICAÇÃO E USOS DE UMANTICORPO CD20"

Este é um pedido não provisório reivindicando prioridade combase na regra 35 USC §119 para o pedido provisório US 60/674.028depositado em 22 de abril de 2005, cujo relatório descritivo é integralmenteincorporado ao presente como referência.

Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se aos métodos para tratar AD oudemência em um sujeito humano usando-se um anticorpo CD20, e um artigode fabricação com instruções para tal uso.

Antecedentes Da Invenção

Doença de Alzheimer é uma questão importante na saúde públicade hoje, e até a década passada, não teve tratamentos benéficos conhecidos.A disfunção degenerativa do cérenro mais comum, AD conta comaproximadamente 70% de todos os casos de demência. Esta demênciageralmente se manisfesta como problemas com a memória, confusão, visãoespacial, cálculos, julgamentos, e possivelmente ilusões e alucinações. Noinício da doença as manifestações de comportamento da demência são comfreqüência suficientemente sutis para não serem percebidas. Durante o estágiomédio da doença, enquanto as vítimas podem ainda executar tarefas de formaindependente, a assistência é freqüentemente necessária para tarefascomplicadas. Nos últimos estágios, mesmo funções comuns do corpo sãoperdidas, tais como a habilidade de mastigar e engolir, controle do intestino ebexiga, e movimentos respiratórios, e o paciente freqüentemente se tornaacamado. Tipicamente a morte ocorre em aproximadamente 5-10 anos doprincípio da doença. AD é atualmente classificada como a 4a causa principal demorte nos Estados Unidos.Em AD1 a degeneração progressiva ocorre em múltiplas áreas docérebro, incluindo envolvimento relativamente seletivo da base do núcleo,hipocampo, amígdala, córtex lateral, e eventualmente o córtex de associaçãode alta ordem da região temporal, frontal e parietais. A lesão neuronal e aperda generosa da densidade sináptica desabilita diversos sistemas neuraisessenciais para o aprendizado e resgate de memória.

A forma mais comum de AD, referida como AD esporádica, contacom aproximadamente 90% de todos os casos diagnosticados. Esta forma deAD é geralmente denominada esporádica porque não está ligada a causasgenéticas de AD hereditária. Os fatores de risco herdados podem aindadesempenhar um papel nesta forma da doença.

Lal e Forster fornecem uma revisão da auto-imunidade e declíniocognitivo associado a idade e discutem a presença de anticorpos reativos nocérebro (BRA) em camundongos C57BL/6 (Lal e Forster, Neurobiology ofAging, 9:733-742 (1988)). Toro et al. Rev.Neurol. 29(12):1104-7 (1999)invetigaram níveis de autoanticorpos contra cardiolipina e beta amilóide do sorode pacientes de Alzheimer que carregam a mutação E280A do gene presenilin-1 (PS-1). Autoanticorpos em AD foram avaliados por outros incluindo:Terryberry et al. Neurobiology of Aging, 19(3):205-216 (1998); Singh et aiNeurosci. Lett 147(1):25-28 (1992); Davydova et al. Bull Exp. Biol. Med.134(1 ):23-25(2002); capsoni et al. Mol. Celi Neurosci. 21(1);15-28 (2002),Evseev et al. Bull. Exp. Biol. Med. 131(4):305-308(2001); Appel et al. Ann. Ν. Y.Acad. Sei. 747:183-194 (1994); D'Andrea, M. Brain Res. 982(1): 19-30 (2003);Mruthinti et al. Neurobiol Aging 25(8): 1023-1032 (2004); Nath et aiNeuromolecular Med. 3(1):29-39 (2003); Weksler e Goodhardt Exp Gerontol.37:971-979 (2002); e Furlan et ai Brain 126(Pt2):285-291 (2003).

Ver também, Keimowitz, R. Arch Neuroi 54(4):485-8 (1997);Aisen et al. Neurology. 54(3):588-93 (2000); e Aisen et al. Dementia 7(4);201-6(1996), relacionando terapia de AD.

Cinco prescrições de drogas são aprovadas pela Food and DrugAdministration dos Estados Unidos (FDA) para tratar AD. Quatro dasmedicações aprovadas para tratamento de AD branda-moderada são inibidoresde colinesterase: galantamina, (REMINYL®), rivastigmina (EXELON®),donepezil (ARICEPT®), e tacrina (COGNEX®). A quinta medicação aprovada éum antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA)1 chamado memantina(NAMENDA®), aprovado para terapia de AD moderada-severa.

Anticorpos CD20 E Terapia Com Estes

Linfócitos são um dos muitos tipos de glóbulos brancos do sangueproduzidos na medula óssea durante o processo de hematopoiese. Existemduas populações principais de linfócitos: Linfócitos B (células B) e linfócitos T(células T). Os linfócitos de interesse particular no presente são as células B.

As células B amadurecem na medula óssea e deixam a medulaexpressando um anticorpo que se liga a um antígeno na superfície de suascélulas. Quando uma célula B virgem encontra pela primeira vez o antígenopara o qual o anticorpo de sua membrana é específico, a célula começa a sedividir rapidamente e sua progênie diferencia-se em células B de memória ecélulas efetoras denominadas "plasmócitos". As células B de memória têm umperíodo de vida mais longo e continuam a expressar o anticorpo na membranacom a mesma especificidade que a célula parental original. Os plasmócitos nãoproduzem anticorpo na membrana, mas ao invés disto, produzem o anticorpode uma forma que possa ser secretado. Os anticorpos secretados são asprincipais moléculas efetoras da imunidade humoral.

O antígeno CD20 (também denominado antígeno dediferenciação restrito por linfócitos B humanos, Bp35) é uma proteínahidrofóbica de transmembrana com um peso molecular de aproximadamente35kD localizada em linfócitos pré-B e B maduros. Valentine et ai, J. Biol.Chem. 264(19): 11282-11287 (1989) e Einfeld et al., EMBO J. 7(3):711-717(1988). O antígeno é também expressado em mais de 90% dos Iinfomas não-Hodgkin de célula B (NHL) (Anderson et al. Blood 63(6):1424-1433 (1984)),mas não é encontrado em células tronco hematopoiéticas, células pró-B,plamócitos normais ou em outros tecidos normais (Tedder et al. J. Immunol.135(2):973-979 (1985)). CD-20 regula a(s) etapa(s) inicial(is) no processo deativação para a iniciação do ciclo e diferenciação celular (Tedder et al., supra),e possivelmente funciona como um canal de íon cálcio. Tedder et al., J. Ce//.Biochem. 14D:195 (1990).

Dado a expressão de CD20 em Iinfomas de células B, esteantígeno pode servir como um possível "alvo" de tais linfomas. Essencialmente,tais alvos podem ser generalizados como segue: anticorpos específicos aoantígeno CD20 de superfície de células B são administrados a um paciente.Estes anticorpos anti-CD20 ligam-se especificamente ao antígeno CD20(ostensivamente) em ambas as células normais e malignas; o anticorpo ligadoà superfície do antígeno CD20 pode levar à destruição e à depleção dascélulas B neoplásticas. Adicionalmente, os agentes químicos ou as marcasradioativas que têm o potencial de destruir o tumor podem ser conjugados aoanticorpo anti-CD20 de tal forma que o agente é especificamente "entregue" àscélulas B neoplásticas. Independentemente da abordagem, o objetivo primárioé destruir o tumor, a abordagem específica pode ser determinada peloanticorpo anti-CD20 específico que é utilizado, e assim, as abordagensdisponíveis para atingir o antígeno CD20 podem variar consideravelmente.

O anticorpo rituximab (RITUXAN®) é um anticorpo monoclonalquimérico elaborado geneticamente direcionado contra o antígeno CD20.Rituximab é o anticorpo denominado "C2B8" na patente US 5.736.137 emitidaem 7 de abril de 1998 (Anderson et al.). Rituximab é indicado para o tratamentode pacientes com Iinfoma não-Hodgkin de células B, CD20-positivo, folicular oude baixo grau refratário ou recidivado. In vitro, rituximab também demonstroumediar citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidadecelular dependente de anticorpo (ADCC) e induzir apoptose (Reff et al., Blood83(2):435-445 (1994); Maloney et al., Blood 88:637a (1996); Manches et al.,Blood 101:949-954 (2003)). A sinergia entre rituximab e quimioterapia foiobservada também experimentalmente. Em particular, rituximab sensibilizalinhagens celulares de Iinfoma de células B humanas resistentes aos efeitoscitotóxicos da doxorubicina, CDDP1 toxina de difteria e ricina (Demidem et al.,Câncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186 (1997)). Estudospré-clínicos in vivo demonstraram que rituximab depleta as células B do sangueperiférico, nódulos linfáticos e da medula óssea de macacos cynomolgus. Reffet al., Blood 83:435-445 (1994).

Rituximab foi também estudado em uma variedade de disfunçõesauto-imunes não malignas, nas quais células B e auto-anticorpos parecemdesempenhar um papel na patofisiologia da doença. Edwards et al., BiochemSoe. Trans. 30:824-828 (2002). Rituximab foi relatado aliviar potencialmentesinais e sintomas de, por exemplo, artrite reumatóide (RA) (Leandro et al., Ann.Rheum. Dis. 61:883-888 (2002); Edwards et ai, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S46 (2002); Stahl et al., Ann. Rheum. Dis., 62 (Suppl. 1): OP004 (2003); Emeryet al., Arthritis Rheum. 48(9): S439 (2003)), lúpus (Eisenberg, Arthritis. Res.Ther. 5:157-159 (2003); Lenadro et al. Arthritis Rheum. 46: 2673-2677 (2002);Gorman et al., Lupus, 13: 312-316 (2004)), púrpura trombocitopênica imune(D'Arena et al., Leuk. Lymphoma 44:561-562 (2003); Stasi et al., Bloodl 98:952-957 (2001); Saleh et al., Semin. Oncol., 27 (Supp 12):99-103 (2000); Zajaet al., Haematologica, 87: 189-195 (2002); Ratanatharathorn et al., Ann. Int.Med., 133: 275-279 (2000)), aplasia pura de células vermelhas (Auner et al., Br.J. Haematol., 116: 725-728 (2002)); anemia auto-imune (Zaja et al.,Haematologica 87:189-195 (2002) (errata aparece em Haematologica 87:336(2002); doença por aglutinina fria (Layios at al., Leukemia115: 187-8 (2001);Berentsen et al., Blood1 103: 2925-2928 (2004); Berentsen et al., Br. J.Haematol., 115: 79-83 (2001); Bauduer1 Br. J. Haematol., 112: 1083-1090(2001); Damiani et al., Br. J. Haematol., 114: 229-234 (2001)), síndrome tipo Bde resistência à insulina severa (Coll et al., N. Engl. J. Med., 350: 310-311(2004), crioglobulinemia mista (DeVita et al., Arthritis Rheum. 46 Suppl 9:S206/S469 (2002)), miastenia grave (Zaja et al., Neurology, 55: 1062-63(2000); Wylam et al., J. Pediatr., 143: 674-677 (2003)), granulomatose deWegener (Specks et al., Arthritis & Rheumatism 44: 2836-2840 (2001)), pênfigovulgar refratário (Dupuy et al., Arch Dermatol., 140:91-96 (2004)), dermatose(Levine, Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9):S1299 (2002)), síndrome de Sjogren(Somer et al., Arthritis & Rheumatism, 49: 394-398 (2003)), crioglobulinemiamista tipo Il ativa (Zaja et al., Blood, 101: 3827-3834 (2003)), pênfigo vulgar(Dupay et al., Arch. Dermatol., 140: 91-95 (2004)), neuropatia auto-imune(Pestronk et al., J. Neuroi Neurosurg. Psychiatry 74:485-489 (2003); síndromeopsoclono-mioclono (Pranzatelli et ai Neurology 60(Suppl. 1) P05.128:A395(2003)) e esclerose múltipla remitente-recorrente (RRMS). Cross et ai(resumo) "Preliminary Results from a Phase Il Trial of Rituximab in MS" OitavoEncontro Anual dos Comitês das Américas para Pesquisa e Tratamento deEsclerose Múltipla, 20-21 (2003).

Um estudo Fase Il (WA16291) foi conduzido em pacientes comartrite reumatóide (RA), fornecendo 48 semanas de acompanhamento dosdados de segurança e eficácia de rituximab. E mery et al. Arthritis Rheum48(9):S439 (2003); Szczepanski et al. Arthritis Rheum 48(9):S121 (2003);Edwards et ai, N Engl. J. Med. 350:2572-82 (2004). Um total de 161 pacientesforam igualmente randomizados para quatro braços de tratamento:metotrexato, rituximab sozinho, rituximab mais metotrexato e rituximab maisciclofosfamida (CTX). O regime de tratamento de rituximab foi uma gramaadministrada intravenosamente nos dias 1 e 15. Infusões de rituximab namaioria dos pacientes com RA foram bem toleradas pela maioria dospacientes, com 36% de pacientes experimentando pelo menos um eventoadverso durante sua primeira introdução (comparado com 30% de pacientesrecebendo placebo). Geralmente, a maioria dos eventos adversos foiconsiderada branda a moderada na severidade e foi bem equilibrada por todosos grupos de tratamento. Houve um total de 19 eventos adversos sérios pelosquatro braços ao longo das 48 semanas, que foram levemente mais freqüenteno grupo rituximab/CTX. A incidência de infecções foi bem equilibrada portodos os grupos. A média da taxa de infecções sérias nesta população depacientes RA foi 4,66 por cento de pacientes por ano, que é mais baixa que ataxa de infecções que exigem entrada hospitalar nos pacientes RA (9,57 por100 pacientes por ano) relatado em um estudo epidemiológico baseado emuma comunidade. Doran et ai, Arthritis Rheum. 46:2287-2293 (2002).

O perfil de segurança relatado de rituximab em um pequenonúmero de pacientes com disfunção neurológica, incluindo neuropatia auto-imune (Pestronk et aí., supra), síndrome opsoclono-mioclono (Pranzatelli et al.,supra), e RRMS (Cross et al., supra), foi similar àquele relatado em onclogia ouRA. Em um estudo patrocinado de investigação avançada (IST) de rituximabem combinação com interferon-beta (IFN-β) ou acetato de glatiramer empacientes com RRMS (Cross et al., supra), 1 de 10 pacientes tratados foiadmitido para o hospital por uma noite em observação após ter sentido febremoderada e seguindo primeira introdução de rituximab, enquanto os outros 9pacientes completaram os quatro regimes de introdução sem qualquer eventoadverso relatado.

Patentes e publicações de patentes que relacionam anticorposCD20 e moléculas de ligação CD20 incluem patentes US. 5.776.456,5.736.137, 5.843.439, 6.399.061 e 6.682.734, assim como patente US2002/0197255, patente US 2003/0021781, patente US 2003/0082172, patenteUS 2003/0095963, patente US 2003/0147885 (Anderson et a/.); patente US6.455.043, patente US 2003/0026804 e documento WO 2000/09160 (Grillo-Lopez, A.); documento WO 2000/27428 (Grillo-Lopez e White); documento WO2000/27433 e patente US 2004/0213784 (Grillo-Lopez e Leonard); documentoWO 2000/44788 (Braslawsky et a/.); documento WO 2001/10462 (Rastetter,W.); documento WO 2001/10461 (Rastetter e White); documento WO2001/10460 (White e Grillo-Lopez); patente US 2001/0018041, patente US2003/0180292, documento WO 2001/34194 (Hanna e Hariharan); patente US2002/0006404 e documento WO 2002/04021 (Hanna e Hariharan); patente US2002/0012665 e documento WO 2001/74388 (Hanna, N.); patente US2002/0058029 (Hanna, N.); patente US 2003/0103971 (Hariharan e Hanna);patente US 2002/0009444 e documento WO 2001/80884 (Grillo-Lopez, A.);documento WO 2001/97858 White, C.); patente US 2002/0128488 edocumento WO 2002/34790 (Reff, M.); documento WO 2002/060955(Braslawsky et al.); documento WO 2002/096948 (Braslawsky et a/.);documento WO 2002/079255 (Reff and Davies); patente US 6,171,586 edocumento WO 1998/56418 (Lam et al.)] documento WO 1998/58964 (Raju,S.); documento WO 1999/22764 (Raju, S.); documento WO 1999/51642,patente US 6,194,551, patente US 6,242,195, patente US 6,528,624 e patenteUS 6,538,124 (Idusogie et al.)] documento WO 2000/42072 (Presta, L.);documento WO 2000/67796 (Curd et al.)] documento WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et al.)] patente US 2002/0004587 e documento WO 2001/77342 (Miller ePresta); patente US 2002/0197256 (Grewal, I.); patente US 2003/0157108(Presta, L.); documento WO 04/056312 (Lowman et al.)] patente US2004/0202658 e documento WO 2004/091657 (Benyunes, K.); documento WO2005/000351 (Chan, A.); pedido de patente US 2005/0032130A1 (Beresini etal.)] pedido de patente US 2005/0053602A1 (Brunetta, P.); patentes US6.565.827, 6.090.365, 6.287.537, 6.015.542, 5.843.398 e 5.595.721 (Kaminskiet a/.); patente US 5.500.362, 5.677.180, 5.721.108, 6.120.767 e 6.652.852(Robinson et a/.); patente US 6.410.391 (Raubitschek et al.)] patente US6.224.866 e documento W000/20864 (Barbera-Guillem, E.); documento WO2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); documento WO 2000/67795 (Goldenberg);patente US 2003/0133930 e documento WO 2000/74718 (Goldenberg eHansen); pedido de patente US 2003/0219433 e documento WO 2003/68821(Hansen et al.)] documento WO 2004/058298 (Goldenberg e Hansen);documento WO 2000/76542 (Golay et ai.)] documento WO 2001/72333 (Woline Rosenblatt); patente US 6.368.596 (Ghetie et al.)] patente US 6.306.393 epedido de patente US 2002/0041847 (Goldenberg, D.); patente US2003/0026801 (Weiner e Hartmann); documento WO 2002/102312 (Engleman,E.); patente US 2003/0068664 (Albitar et al.); documento WO 2003/002607(Leung, S.); documento WO 2003/049694, patente US 2002/0009427, epatente US 2003/0185796 (Wolin et al.)] documento WO 2003/061694 (Sing eSiegall); documento US 2003/0219818 (Bohen et al.)] patente US2003/0219433 e documento WO 2003/068821 (Hansen et al.)·, patente US2003/0219818 (Bohen et al.)] patente US 2002/0136719 (Shenoy et al.);documento WO 2004/032828 (Wahl et al.)] e documento WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter); patente US 2003/0219433 A1 (Hansen et al.)] documentoWO 2004/035607 (Teeling et al.)] patente US 2004/0093621 (Shitara et al.)]documento WO 2004/103404 (Watkins et al.)] documento WO 2005/000901(Tedder et al.)] patente US 2005/0025764 (Watkins et al.)] documentoW02005/016969 e patente US 2005/0069545 A1 (Carr et al.)] e documentoWO 2005/014618 (Chang et al.). Ver também a patente US 5.849.898 e apatente EP 0.330.191 (Seed el al.)] patente EP 0.332.865a2 (Meyer e Weiss);patente US 4.861.579 (Meyer et al.)] pedido de patente US 2001/0056066(Bugelski et al.)] e documento WO 1995/03770 (Bhat et al.).Ver também os pedidos de patente US 2005/0079184 A1, US2004/0018557 A1 e documentos WO 2005/016241 A2, WO 2005/009539 A2,WO 2004/105684 A2, WO 2004/080387 A2, WO 2004/074434 A2, WO2004/060911 A2, WO 2004/032828 A2 e WO 2003/043583 A2.

Publicações relacionando terapia com rituximab incluem: Perottae Abuel1 "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab"Resumo # 3360 Blood 10(1)(parte 1-2): ρ. 88B (1998); Perotta et ai, "Rituxan inthe treatment of chronic idiopathic thrombocytopaenic purpura (ITP)", Blood, 94:49 (resumo) (1999); Matthews1 R., "Medicai Heretics" New Scientist (7 April12001); Leandro et al., "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: earlyevidence for safety, efficacy and dose response" Arthritis and Rheumatism 44(9):S370 (2001); Leandro et ai, "An open study of B lymphocyte depletion insystemic Iupus erythematosus", Arthritis and Rheumatism, 46:2673-2677 (2002),em que durante um período de 2 semanas, cada paciente recebeu duasintroduções de 500 mg de rituximab, duas introduções de 750 mg deciclofosfamida, e dose alta oral de corticoesteróides, e em que dois dospacientes recidivados tratados em 7 e 8 meses, respectivamente, e foramretratados, embora com diferentes protocolos; Weide et al., "Successful Iong-term treatment of systemic Iupus erythematosus with rituximab maintenancetherapy", Lupus, 12: 779-782 (2003), em que um paciente foi tratado comrituximab (375 mg/m2 χ 4, repetido em intervalos semanais) e, além disso,aplicações de rituximab foram distribuídas a cada 5-6 meses e então amanutenção da terapia foi aceita com 375 mg/m2 a cada três meses, e umsegundo paciente com SLE refratária foi tratado com sucesso com rituximab eé aceita manutenção de terapia a cada três meses, com ambos pacientesrespondendo bem à terapia de rituximab; Edwards e Cambridge, "Sustainedimprovement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete Blymphocytes" Rheumatology 40:205-211 (2001); Cambridge et al., "Blymphocyte depletion in patients with rheumatoid arthritis: serial studies ofimmunological parameters" Arthritis Rheum., 46 (Suppl. 9): S1350 (2002);Edwards et al., "Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targeted chimericmonoclonal antibody: Um teste controlado placebo randomizado em pacientescom artrite reumatóide. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002); Pavelkaet al., Ann. Rheum. Dis., 63: (S1):289-90 (2004); Emery et al., Arthritis Rheum.50 (S9):S659 (2004); Levine e Pestronk1 "IgM antibody-relatedpolyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using rituximab" Neurology52: 1701-1704 (1999); DeVita et al., "Efficacy of selective B cell blockade in thetreatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002);Hidashida et al. "Treatment of DMARD-refractory rheumatoid arthritis withrituximab." Apresentado no Annual Scientific Meeting of the American Collegeof Rheumatology, 24 a 29 de outubro; Nova Orleans1 LA (2002); Tuscano, J."Successful treatment of infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab"Apresentado no Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology, 24 a 29 de outubro; Nova Orleans1 LA (2002); "Pathogenic rolesof B cells in human autoimmunity; insights from the clinic" Martin e Chan,Immunity 20:517-527 (2004); Silverman e Weisman, "Rituximab Therapy andAutoimmune Disorders1 Prospects for Anti-B Cell Therapy", Arthritis andRheumatism, 48: 1484-1492 (2003); Kazkaz e lsenberg, "Anti B cell therapy(rituximab) in the treatment of autoimmune diseases", Current opinion inpharmacology, 4: 398-402 (2004); Virgolini e Vanda1 "Rituximab in autoimmunediseases", Biomedicine & pharmacotherapy, 58: 299-309(2004); Klemmeret al.,'Treatment of antibody mediated autoimmune disorders with a AntiCD20monoclonal antibody Rituximab", Arthritis And Rheumatism , 48.S624-S624(2003); Kneitz et al., "Effective B cell depletion with rituximab in the treatment ofautoimmune diseases" Immunobiology 206: 519-527 (2002); Arzoo et al.,'Treatment of refractory antibody mediated autoimmune disorders with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab) 7\/7/7a/s of the Rheumatic Diseases, 61(10):922-4 (2002) Looney, R., "Treating human autoimmune disease bydepleting B cells" Ann Rheum Dis. 61: 863-866 (2002); Lake e Dionne1 "FutureStrategies in Immunotherapy" em BurgerjS Medicinal Chemistry and DrugDiscovery (2003 por John Wiley & Sons, Inc.) artigo on-line com data depostagem: 15 de janeiro de 2003 (Capítulo 2 "Antibody-DirectedImmunotherapy"); Liang e Tedder, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine,Seção: CD20 as an Immunotherapy Target, artigo on-line com data depostagem: 15 de janeiro de 2002 entitulado "CD20"; Apêndice 4A entitulado"Monoclonal Antibodies to Human Cell Surface Antigens" por Stockinger et ai,edições: Coligan et ai, em Current Protocols in Immunology (2003 John Wiley& Sons, Inc) on-line com data de postagem: maio de 2003; data da publicaçãoimpressa: fevereiro de 2003, Penichet e Morrison, "CD Antibodies/molecules:Definition; Antibody Engineering" em Wiley Encyclopedia of Molecular MedicineSeção: Chimeric, Humanized and Human Antibodies; postado on-line em 15 dejaneiro de 2002, Speacks et ai "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthritis & Rheumatism 44:2836-2840 (2001), resumo on-line submissão e convite Koegh et ai, "Rituximab forRemission Induction in Severe ANCA-Associated Vasculitis: Report of aProspective Open-Label Pilot Trial in 10 Patients", American College ofRheumatology, Seção número: 2 8-100, Título da Seção: V asculitis, Tipo daSeção: ACR Seção Concorrente, Categoria Primária: 28 Vasculitis, Seção 18 deoutubro de 2004 (http://www.abstractsonline.com/viewer/SearchResults.asp):Eriksson, "Short-term outcome and safety in 5 patients with ANCA-positivevasculitis treated with rituximab", Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294(2003); Kneitz et ai, "B cell depletion with rituximab for refractory vasculitis"Kidney and Blood Pressure Research, 26: 294 (2003); Jayne, pôster 88 (11 thInternational Vasculitis and ANCA workshop), 2003 American Society ofNephrology; Stone e Specks, "Rituximab Therapy for the Induction ofRemission and Tolerance in ANCA-associated Vasculitis", no Clinicai TrialResearch Summary de 2002-2003 Immune Tolerance Network1http://www.immunetolerance.orq/research/autoimmune/trials/stone.html; eLeandro et ai, "B cell repopulation occurs mainly from naíve B cells in patientwith rheumatoid arthritis and systemic Iupus erythematosus" Arthritis Rheum.,48 (Suppl 9): S1160 (2003).

Descrição Resumida Da Invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo para tratar doença de Alzheimer em um sujeito humano que compreendeadministrar ao sujeito uma quantidade efetiva de um anticorpo CD20 nu para osujeito em uma quantidade efetiva para tratar doença de Alzheimer.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo para tratar demência em um sujeito humano que compreendeadministrar um anticorpo CD20 nu para o sujeito em uma quantidade efetivapara tratar a demência.

A presente invenção também refere-se a um artigo de fabricaçãoque compreende:

(a) um recipiente que compreende um anticorpo CD20 nu; e

(b) uma bula com instruções para tratar doença de Alzheimer oudemência em um sujeito.

Breve Descrição Das Figuras

FIG. 1A é um alinhamento de seqüência que compara asseqüências de aminoácidos de domínio variável leve (Vl) de cada um dos 2H7murino (SEQ ID NO: 1), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID NO: 2), e osubgrupo I de cadeia leve kappa humano (SEQ ID NO: 3). As CDRs de Vl do2H7 e hu2H7v.16 são como segue: CDR1 (SEQ ID NO:4), CDR2 (SEQ IDNO:5), e CDR3 (SEQ ID NO:6).FIG. 1Β é um alinhamento de seqüência que compara asseqüências de aminoácidos de domínio variável pesado (Vh) de cada um dos2H7 murino (SEQ ID NO:7), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID NO:8), e aseqüência consenso humana do subgrupo Ill de cadeia pesada (SEQ ID NO:9).

As CDRs de Vh do 2H7 e hu2H7v.16 são como segue: CDR1 (SEQ ID N0:10),CDR2 (SEQ ID NO:11), e CDR3 (SEQ ID NO:12).

Nas FIG. 1A e FIG. 1B, a CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeiaestão fechadas dentro de parênteses, ladeadas pelas regiões de estruturaFR1-FR4, como indicado. 2H7 refere-se ao anticorpo 2H7 murino. Osasteriscos entre as duas linhas das seqüências indicam as posições que sãodiferentes entre as duas seqüências. A numeração de resíduo está de acordocom Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5a Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), com inserçõesmostradas como a, b, c, d, e e.

FIG. 2 mostra um alinhamento das cadeias leves de 2H7.v16 e2H7.v511 maduros (SEQ ID NOS: 13 e 15, respectivamente), com numeraçãode resíduo de domínio variável Kabat e numeração de resíduo de domínioconstante Eu.

FIG. 3 mostra um alinhamento das cadeias pesadas de 2H7.v16 e2H7.V511 maduros (SEQ ID NOS: 14 e 16, respectivamente), com numeraçãode resíduo de domínio variável Kabat e numeração de resíduo de domínioconstante Eu.

Descrição Detalhada Das Realizações Preferidas

I. Definições

"Demência" refere-se a uma deterioração mental geral devido afatores orgânicos ou psicológicos; caracterizado por desorientação, memória,julgamento e intelecto enfraquecidos, e uma afeição superficial instável.Demência no presente inclui demência vascular, demência vascular isquêmica(IVD), demência frontotemporal (FTD), demência com corpos de Lewy1demência de Alzheimer (AD).

"Doença de Alzheimer" refere-se à deterioração mentalprogressiva manifestada pela perda de memória, confusão e desorientação,geralmente iniciando ao final da vida, e comumente resultando na morte em 5-10 anos. A doença de Alzheimer pode ser diagnosticada por um neurologistaou clínico especialista. Em uma realização, o sujeito com AD irá corresponderaos critérios do Instituto Nacional de Disfunções Neurológicas e Comunicativase Derrame/Doença de Alzheimer e Associação de Disfunções Relacionadas(NINCDS/ADRDA) para a presença de provável AD.

As expressões "branda-moderada" ou "estágio inicial" de AD sãousadas como sinônimo para se referir a AD que não é avaçada e cujos sinaisou sintomas da doença não são severos. Sujeitos com AD branda-moderadaou estágio inicial podem ser identificados por um neurologista ou clínicoespecialista. Em uma realização, o sujeito com AD branda-moderada éidentificado usando-se o Mini-Exame do Estado Mental (MMSE).

No presente, AD "moderada-severa" ou "estágio tardio" refere-sea AD que é avançada e os sinais ou sintomas da doença são pronunciados.

Tais sujeitos podem ser identificados por um neurologista ou clínicoespecialista. Sujeitos com esta forma de AD podem não mais responder àterapia com inibidores de colinesterase, e podem ter um nível de acetilcolinaacentuadamente reduzido. Em uma realização, o sujeito com AD moderada-severa é identificado usando-se o Mini-Exame do Estado Mental (MMSE).

O Mini-Exame do Estado Mental (MMSE) é o teste maiscomumente utilizado para queixas de problemas de memória ou quando umdiagnóstico de demência está sendo considerando. Sujeitos com umapontuação de 12 a 26 pontos pode ser considerado como tendo demênciasevera ou AD. O MMSE compreende uma série de questões e testes, se cadauma destas pontuações é respondida corretamente. Se todas as resposta sãocorretas, é possível uma pontuação máxima de 30 pontos. Pessoas comdoença de Alzheimer geralmente apresentam 26 pontos ou menos. Cópias doteste completo estão disponíveis pelo website Psychological AssessmentResources (PAR) http://www.parinc.com.

"AD hereditária" é uma forma herdada de AD causada por umdefeito genético.

"AD esporádica" é a forma mais comum de AD que acredita-seque seja causada por uma combinação de fatores ambientais e genéticos, porexemplo, genótipo Apo E4+. Quase 90% de todos os pacientes disgnosticadoscom AD possuem a forma esporádica da doença.

Por medicações de "tratamento padrão" entende-se um ou maismedicamentos mais comumente utilizados para tratar AD ou demência, porexemplo, o tratamento padrão para AD pode ser inibidor de colinesterase e/ouantagonista de NMDA.

Um "sintoma" de AD ou demência é qualquer fenômeno mórbidoou afastamento da estrutura, função ou sensação normal, sentida pelo sujeito eindicativa de AD ou demência.

Um "sujeito" no presente é um sujeito humano. Para os propósitosno presente, o sujeito refere-se a um sujeito com AD ou demência. Geralmenteo sujeito é elegível para tratamento de AD ou demência. Para os propósitos nopresente, tal sujeito elegível é aquele que está sentindo, sentiu ou é provávelsentir um ou mais sintomas de AD ou demência. O diagnóstico de AD oudemência pode incluir um diagnóstico de demência mista (MIX), onde os sinaise sintomas de AD coexistem com aqueles de demência vascular isquêmica(IVD). Em uma realização, o sujeito não está sofrendo de uma doença auto-imune, exceto de AD. Aquele que está sofrendo ou está em risco de sofrer deAD ou demência pode opcionalmente ser identificado como aquele que foiselecionado para níveis elevados de células B CD20-positivo no soro, fluidocérebro espinhal (CSF) e/ou placas senis. Alternativamente ou adicionalmente,o sujeito pode ser selecionado para uso em teste para detectar auto-anticorpos,qualitativamente avaliados e preferivelmente quantitativamente. Tais auto-anticorpos podem ser detectados no soro do sujeito, fluido cérebro espinhal(CSF) e/ou placas senis, por exemplo, por ELISA.

Um "auto-anticorpo" é um anticorpo produzido por um sujeito edirigido contra um antígeno do próprio sujeito. Auto-anticorpos exemplaresassociados com AD ou demência incluem, mas não estão limitados a,anticorpos reativos do cérebro (BRAs), e anticorpos para: beta-amilóide,cardiolipina, tubulina, proteína ácida fibrilar glial, proteína dos neurofilamentos(NFL), gangliosídeo, proteína do citoesqueleto, proteína básica da mielina(MBP), serotonina, dopamina, presenilina, amilóide beta-peptídeo (Abeta),receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE), fator decrescimento do nervo (NGF) e similares.

Por "nível atípico"de auto-anticorpo, entende-se um nível de talauto-anticorpo que excede o nível normal. Tal nível normal ou típico de auto-anticorpo pode ser o nível encontrado em uma amostra biológica de um sujeitonormal, ou sujeito que não está sofrendo de AD ou demência. A amostrabiológica pode ser soro, CSF ou placas senis.

"Anticorpos reativos do cérebro" ou "BRAs" são qualquerpopulação de anticorpos humanos que ocorrem espontaneamente no soro,fluido cérebro espinhal (CSF), e/ou tecidos do cérebro de um sujeito, quepodem reagir com tecidos do cérebro humano e/ou sistema nervoso central(CNS) com maior especificidade do que eles reagem com outros tecidoshumanos normais.

"Tratamento" de um sujeito no presente refere-se a ambos,tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles comnecessidade de tratamento incluem aqueles já com AD ou demência, assimcomo aqueles em que AD será prevenida. Portanto, o sujeito pode serdiagnosticado como tendo AD ou demência ou pode estar predisposto à oususcetível à AD ou demência. Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia" comousados no presente incluem tratamento preventivo (tal como, profilático),paliativo e curativo.

A expressão "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade deanticorpo (ou outra droga) que é efetiva para prevenir, melhorar ou tratardemência ou AD. Tal quantidade efetiva irá geralmente resultar em umamelhora dos sinais ou sintomas de demência ou doença de Alzheimer, talcomo: manutenção da função cognitiva (por exemplo, memória, habilidadespara linguagem, pensamento crítico, leitura e/ou escrita), mostrando oprogresso da doença; atrasando seu início ou prevenção geral da doença;gerenciando problemas comportamentais associados com a doença, tratando adepressão e/ou apatia; tratando comportamentos tais como agressão e/ouansiedade; retardando a perda de habilidades para vida diária, tais comocomer, se vestir e ir ao banheiro; reduzindo os níveis de auto-anticorpos; ereduzindo os números de células B CD20 positivo (por exemplo, no soro, CNSe/ou placas senis).

Um "inibidor de colinesterase" é um agente ou composição quebloqueia ou interfere na decomposição da acetilcolina e/ou butirilcolina.

Exemplos de inibidores de colinesterase incluem: galantamina, (REMINYL®),rivastigmina (EXELON®), donepezil (ARICEPT®), tacrina (COGNEX®) eHUPRINEX™.

Por "antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA)" no presenteentende-se um agente ou composição que bloqueia ou interfere em NMDAe/ou regula o excesso de glutamato e/ou ativação de glutamato. Antagonistasde NMDA exemplares incluem memantina (NAMENDA®) e neramexano.O termo "agente imunosupressivo" como usado no presente paraterapia adjunta refere-se a substâncias que agem para suprimir ou mascarar osistema imune do sujeito sendo tratado no presente. Estes agentes incluiriamsubstâncias que suprimem a produção de citocinas, regulam para baixo ousuprimem a auto-expressão de antígeno, ou mascaram os antígenos MHC.Exemplos de tais agentes incluem 2-amino-6-aril-5- pirimidinas substituídas(ver patente US 4.665.077); drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs),ganciclovir, tacrolimus, glucocorticóides tais como cortisol ou aldosterona,agentes anti-inflamatórios tais como um inibidor de ciclooxigenase, um inibidorde 5-lipoxigenase, ou um antagonista do receptor Ieucotrieno1 antagonistas depurina tal como azatioprina ou micofenolato mofetil (MMF)1 agentes alquilantestais como ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona, glutaraldeído (quemascara os antígenos MHC1 como descritos na patente US 4.120.649);anticorpos anti-idiotípicos para antígenos MHC e fragmentos MHC;ciclosporina; 6 mercaptopurina, esteróides tais como corticoesteróides ouglicocorticoesteróides ou análogos de glicocorticóides, tais como, predsona,metilprednisolona, incluindo succinato de sódio de prednisolona SOLU-MEDROL®, e dexametasona, inibidores dihidrofolato redutase tal comometotrexato (oral ou subcutâneo), agentes anti-malária tais como cloroquina ehidroxicloroquina, sulfasalazina, leuflunomida, citocina ou anticorpos doreceptor de citocina ou antagonistas incluindo anticorpos anti-interferon alfa,beta ou gama, anticorpos TNF-alfa do fator de necrose anti-tumor (infliximab(REMICADE®) ou adalimumab), imunoadesina anti-TNF-alfa (etanercept),anticorpos anti-TNF-beta, anticorpos anti-leucina-2 (IL-2) e anticorposreceptores anti-IL-2, e anticorpos receptors anti-interleucina-6 (IL-6) eantagonistas; anticorpos anti-LFA-1, incluindo anticorpos anti-CD11a e anti-CD18; anticorpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfócito; anticorpos pan-T1 preferivelmente anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4/CD4a; peptídeo solúvelcontendo um domínio de ligação LFA-3 (documento WO 90/08187 publicadoem 26 de julho de 1990); estreptoquinase; que transforma o fator decrescimento beta (TGF-beta); estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro;FK506; RS-61443; clorambucil; desoxiespergualina; rapamicina; receptor decélula T (Cohen et al., patente US 5.114.721); fragmentos de receptor de célulaT (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); documento WO 90/11294;laneway, Nature, 341: 482 (1989); e documento WO 91/01133); antagonistasde BAFF tal como BAFF ou anticorpos BR3 ou imunoadesinas e antagonistasde zTNF4 (para revisão, ver Mackay e Mackay1 Trends Immunol., 23:113-5(2002) e ver também definição abaixo); agentes biológicos que interferem nossinais de células T auxiliares, tal como receptor anti-CD40 ou Iigante anti-CD40(CD154), incluindo anticorpos que bloqueiam ligação CD40-CD40 (e.g., Durieet al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohan et al., J. Immunol., 154: 1470-80(1995)) e CTLA4-lg (Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)); e anticorposreceptores de célula T (EP 340,109) tal como T10B9.

O termo "agente citotóxico" como usado no presente refere-se auma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruiçãode células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (por exemplo,At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, BÍ212, P32 e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, e toxinas tal como toxinas demolécula pequena ou toxinas enzimáticamente ativas de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes.

Um "agente quimioterapêutico" é um componente químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluemagentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonados tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais comobenzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas emetilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina,trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análogatopotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina;calistatina; CC-1065 (incluindo suas análogas adozelesina, carzelesina ebizelesina sintética); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas(particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina(incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina;pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio taiscomo clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida,mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin,fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas taiscomo carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, eranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo,caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicinaômega 11 (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994));dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como cromóforosde neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedina cromoproteínasrelacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluindo ADRIAMYCIN® morfolino-doxorubicina,cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, injeção de IipossomaHC1 doxorubicina (DOXIL®) e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina,idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C1 ácidomicofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina,puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina,tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais comometotrexato, gencitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina(XELODA®), uma epotilona, e 5-fluorouracil (5-FU); ácido fólico análogos taiscomo denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina taiscomo fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos depirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina,dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; anti- adrenais tais comoaminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico restabeiecedor tais comoácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico;eniluracil; amsacrina; bestrabucila; bisantrena; edatraxato; defofamina;demecólcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucideo; nitrato degálio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina eansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina;pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina;complexos polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR);razoxana; rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona;2,2',2"-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurinaA, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®);dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina;arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®),formulação de paclitaxel de nanopartículas de albumina engenherada(ABRAXANE™), e doxetaxel (TAXOTERE®); cloranbucila; 6-tioguanina;mercaptopurina; metotrexatO; análogos da platina tais como cisplatina ecarboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposide (VP-16); ifosfamida;mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina(NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina;ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO);retinóides tais como ácido retinóico; sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidosou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois oumais dos acima tais como CHOP1 uma abreviação para uma terapia combinadade ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, umaabreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™)combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos dehormônios que podem promover o crescimento de câncer, e estãofreqüentemente na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Elespodem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos emoduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, porexemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno(EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018,onapristona, e toremifene (FARESTON®); anti-progesteronas; baixosreguladores de receptores de estrógeno (ERDs); antagonistas de receptores doestrógeno tal como fulvestrante (FASLODEX®); agentes de função desupressão ou fechamento dos ovários, por exemplo, hormônio Iuteinizante quelibera hormônios agonistas (LHRH) tais como acetato de Ieuprolida (LUPRON®e ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina;outros anti-androgênicos tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; einibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produçãode estrógeno na glândula adrenal, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas,aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestano(AROMAS IN®), formestano, fadrozola, vorozola (RIVISOR®), Ietrozola(FEMARA®), e anastrozola (ARIMIDEX®). Além disto, tal definição de agentesquimioterapêuticos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo,BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácidozoledrônico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato(AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedronato (ACTONEL®); assim comotroxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga);oligonucleotídeos anti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão degenes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular anormal, taiscomo, por exemplo, PKC-alfa, Raf1 H-Ras1 e receptor do fator de crescimentoepidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina TH E RATO PE® e vacinas deterapia de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, evacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®);rmRH (por exemplo, ABARELIX®); Iapatinib ditosilato (uma ErbB-2 e inibidor demolécula pequena de tirosina quinase EGFR duplo também conhecido comoGW572016); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados dequalquer um dos acima.

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadaspor uma população de células que agem em outra célula como mediadorasintercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas;interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, incluindo PROLEUKIN® rlL-2 e IL-4 humana e mutantesde IL-4 humana, tais como, por exemplo, um mutante que contém umamutação na região de IL-4 que está envolvida na ligação com IL-2R gamma,por exemplo, Arg 21 é trocada por um resíduo Glu; fator de necrose tumoral talcomo TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e kit Iigante(KL). Como usado no presente, o termo citocina inclui proteínas de fontesnaturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes ativosbiologicamente de citocinas de seqüência nativa, incluindo entidades demolécula pequena produzidas sinteticamente e sais e derivados destesfarmaceuticamente aceitáveis.

O termo "hormônio" refere-se a hormônios polipeptídicos, que sãogeralmente secretados por órgãos glandulares com dutos. Incluídos entre oshormônios estão, por exemplo, hormônios de crescimento tais como hormôniosde crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionil,hormônios de crescimento bovino; hormônio da paratireóide, tiroxina; insulina;pró-insulina; relaxina; estradiol; terapia de reposição hormonal; andrógenos taiscomo calusterona, propionate de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, outestolactona; prorelaxina; hormônios glicoproteina tais como hormônio folículoestimulante (FSH)1 hormônio estimulante da tireóide (TSH), e hormônioIuteinizante (LH); prolactina, lactogênio placentário, peptídeo associado agonadotrofina de camundongo, hormônio de liberação de gonadotrofina; inibina;activina; substância de inibição mulleriana; e trombopoietina. Como usado nopresente, o termo hormônio inclui proteínas de fontes naturais ou de culturacelular recombinante e equivalentes ativos biologicamente de hormônios deseqüência nativa, incluindo entidades de molécula pequena produzidassinteticamente e sais e derivados destes farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "fator de crescimento" refere-se a proteínas quepromovem crescimento, e incluem, por exemplo, fator de crescimento hepático;fator de crescimento do fibroblasto, fator de crescimento endotelial vascular;fator de crescimento do nervo tal como NGF-β; fator de crescimento derivado deplaqueta; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α eTGF-β; fator de crescimento Iell similar a insulina; eritropoietina (EPO); fatoresosteoindutivos; interferons tais como interferon α, β e γ; e fatores que estimulamcolônias (CSFs) tais como macrófagos CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF). Como usado no presente, o termofator de crescimento inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celularrecombinante e equivalentes ativos biologicamente de fator de crescimento deseqüência nativa, incluindo entidades de molécula pequena produzidassinteticamente e sais e derivados destes farmaceuticamente aceitáveis.O termo "integrina" refere-se a uma proteína receptora quepermite às células tanto se ligarem como responderem à matriz extracelular eestá envolvida em uma variedade de funções celulares tais como cicatrização,diferenciação celular, correção de rumo de células tumorais e apoptose. Elassão parte de um grande família de receptores celulares adesina que estãoenvolvidos na matriz extracelular e interações célula-célula. Integrinasfuncionais consistem de duas sub-unidadaes de glicoproteína detransmembrana, chamadas alfa e beta, que não são ligadas covalentemente.Todas as sub-unidades alfa compartilham alguma homologia entre si, comotambém as sub-unidades beta. Os receptores sempre contêm uma cadeia alfae uma cadeia beta. Exemplos incluem Alfa6beta1, Alfa3beta1, Alfa7beta1, LFA-1 etc. Como usado no presente, o termo "integrina" inclui proteínas de fontesnaturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes ativosbiologicamente de integrinas de seqüência nativa, incluindo entidades demolécula pequena produzidas sinteticamente e sais e derivados destesfarmaceuticamente aceitáveis.

Para os propósitos no presente, "fator de necrose tumoral alfa(TNF-alfa)" refere-se a uma molécula TNF-alfa que compreende a seqüênciade aminoácido como descrito em Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) ouAggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985).

O "inibidor de TNF-alfa" no presente é um agente que inibe, decerta forma, uma função biológica de TNF-alfa, geralmente através de ligação aTNF-alfa e neutralizando sua atividade. Exemplos de inibidores TNFespecificamente contemplados no presente são etanercept (ENBREL®),infliximab (REMICADE®) e adalimumab (HUMIRA™).

Exemplos de "drogas anti-reumáticas modificadoras de doença" ou"DMARDs" incluem hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida,etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, sais de ouro (oral), sais deouro (intramuscular), minociclina, ciclosporina incluindo ciclosporina A eciclosporina tópica, Proteína A stafilocóccia., (Goodyear e Silverman1 J. Exp.Med., 197, (9), p1125-39 (2003)), incluindo sais e derivados destes, etc.

Exemplos de "drogas anti-inflamatórias não esteroidais " ou"NSAIDs" incluem aspirina, ácido acetil salicílico, ibuprofen, naproxen,indometacina, sulindac, tolmetina, inibidores de COX-2 tais como celecoxib(CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il)benzenesulfonamida e valdecoxib (BEXTRA®), e meloxicam (MOBIC®),incluindo sais e derivados destes, etc.

Exemplos de "anticorpos ou antagonistas de integrina" nopresente incluem um anticorpo LFA-1, tal como efalizumab (RAPTIVA®)comercialmente disponível por meio da Genentech, ou um anticorpo integrinaalfa 4 tal como natalizumab (ANTEGREN®) disponível por meio da Biogen, ouderivados de fenilalanina diazacíclica (documento WO 2003/89410), derivadosde fenilalanina (documento WO 2003/70709, documento WO 2002/28830,documento WO 2002/16329 e documento WO 2003/53926), derivados do ácidofenilpropiônico (documento WO 2003/10135), derivados de enamina(documento WO 2001/79173), derivados do ácido propanóico(WO2000/37444), derivados do ácido (documento WO 2000/32575), derivados fenilsubstituídos (patente US 6.677.339 e 6.348.463), derivados amina aromáticas(patente US 6.369.229), polipeptídeos do domínio disintegrina ADAM (patenteUS 2002/0042368), anticorpos para integrina alfavbeta3 (patente EP 633945),derivados do aminoácido bicíclico com pontes aza (documento WO2002/02556), etc.

"Corticoesteróides" referem-se a qualquer uma de diversas substânciassintéticas ou que ocorrem naturalmente com a estrutura química geral de esteróidesque imitam ou aumentam os efeitos dos corticoesteróides que ocorrem naturalmente.

Exemplos de corticoesteróides sintéticos incluem prednisona, prednisolona (incluindometilprednisolona, tal como SOLU-MEDROL® succinato de sódio demetilprednisolona), dexametasona ou dexametasona triancinolona, hidrocortisona, ebetametasona. Os corticoesteróides preferidos no presente são prednisona,metilprednisolona, hidrocortisona ou dexametasona.

Uma "célula B" é um linfócito que amadurece na medula óssea, einclui uma célula B virgem, célula B de memória, ou células B efetoras (células doplasma). A célula B no presente pode ser uma célula B normal ou não-maligna.

Um "marcador de superfície de célula B" ou "antígeno desuperfície de célula B" no presente é um antígeno expressado na superfície deuma célula B que pode ser atingido com um antagonista ou anticorpo que se ligaa este. Marcadores de superfície de célula B exemplares incluem os marcadoresde superfície de leucócitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24,CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78,CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86 (paradescrições, ver The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a Edição. 1997, ed. Barclayet ai Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nova York). Outros marcadores desurpefície de célula B incluem RP105, FcRH2, célula B CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHI, IRTA2,ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA, e 239287. O marcador de surpefíciede célula B de interesse particular é preferencialmente expressado nas células Bcomparado a outros tecidos de célula não B de um sujeito e pode serexpressado em ambas, células B precursoras e células B maduras.

O antígeno "CD20", ou "CD20" é uma fosfoproteína não-glicosiladade aproximadamente 35 kDa, encontrada na superfície de mais de 90% dascélulas B do sangue periférico ou órgãos linfóides. CD20 está presente emambas as células B normais assim como células B malignas, mas não éexpressado em células tronco. Outros nomes para CD20 na literatura incluem"antígeno restrito de linfócito B" e "Bp35". O antígeno CD20 está descrito emClark et ai Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82:1766 (1985), por exemplo.

Um "antagonista de marcador de superfície de célula B" é umamolécula que sob ligação a um marcador de superfície de célula B nas células B1destroem ou depletam células B em um sujeito e/ou interferem em uma ou maisfunções da célula B, por exemplo, pela redução ou prevenção de uma respostahumoral produzida pela célula Β. O antagonista preferivelmente é capaz dedepletar células B (isto é, reduzir níveis de célula B circulante) em um sujeitotratado com este. Tal depleção pode ser alcançada via vários mecanismos talcomo citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC), inibição de proliferação decélula B e/ou indução de morte de célula B (por exemplo, via apoptose).

Antagonistas incluídos dentro do escopo da presente invenção incluem anticorpos,peptídeos sintéticos ou peptídeos de seqüência nativa, imunoadesinas, eantagonistas de molécula pequena que se ligam a um marcador de superfície decélula B tal como CD20, opcionalmente conjugado ou fundido a um agentecitotóxico. O antagonista preferido compreende um anticorpo.

Um "antagonista do anticorpo CD20" no presente é um anticorpoque sob ligação ao CD20 em células B, destroem ou depletam células B em umsujeito e/ou interferem em uma ou mais funções da célula B, por exemplo, porredução ou prevenção de uma resposta humoral produzida pela célula Β. Oanticorpo antagonista preferivelmente é capaz de depletar células B (isto é,reduzir níveis de célula B circulante) em um sujeito tratado com este. Taldepleção pode ser alcançada via vários mecanismos tal como citotoxidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC), inibição de proliferação de célula B e/ouindução de morte de célula B (por exemplo, via apoptose).

O termo "anticorpo" no presente é usado no senso mais amplo eespecificamente abrange anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais,anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formadospor pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo, contantoque eles exibam a atividade biológica desejada.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo intacto, preferivelmente que compreende a região de ligação deantígeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab1Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas deanticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados defragmentos de anticorpo.

Um anticorpo intacto no presente é aquele que compreende duasregiões de ligação de antígeno, e uma região Fc. Preferivelmente, o anticorpointacto possui uma região Fc funcional.

Exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8" que é agora chamado"rituximab" ("RITUXAN®") (patente US 5.736.137); o anticorpo murino 2B8 marcadocom ítrio-[90] designado Ύ2Β8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®)comercialmente disponível pela Idec Pharmaceuticals, Inc. (patente US 5.736.137;2B8 depositada com ATCC sob acesso no HB11388 em 22 de junho de 1993);lgG2a "B1" murino, também chamado "Tositumomab", opcionalmente marado com131I para gerar o "131I-BI" ou anticorpo "iodo I131 tositumomab" (BEXXAR™)comercialmente disponível pela Corixa (ver também, patente US 5.595.721);anticorpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987) evariantes destes incluindo "estrutura embutida" ou 1F5 humanizado (documentoWO 2003/002607, Leung, ATCC depósito HB-96450); anticorpo 2H7 murino e 2H7quimérico (patente US 5.677.180); um 2H7 humanizado (documento WO2004/056312 (Lowman et al.)] e como apresentado abaixo), 2F2 (HuMAX-CD20),um anticorpo humano completo de alta afinidade (Genmab, Denmark; ver, porexemplo, Glennie e van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) eCragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); documento WO 2004/035607; patenteUS 2004/0167319); os anticorpos monoclonais humanos apresentados nodocumento WO 2004/035607 e patente US 2004/0167319 (Teeling et a/.); osanticorpos que possuem complexos de cadeias de açúcar ligados a N-glicosídeounidos à região Fc descritos na patente US 2004/0093621 (Shitara et ai.)]anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação de antígeno a CD20 (documentoWO 2005/000901, Tedder et al.) tais como HB20-3, ΗΒ20Λ HB20-25 e MB20-11;moléculas de ligação CD20 tais como as séries AME de anticorpos, por exemplo,anticorpos AME 33 como apresentados no documento WO 2004/103404 e patenteUS 2005/0025764 (Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME);moléculas de ligação CD20 tais como aquelas descritas na patente US2005/0025764 (Watkins et al.)] anticorpo A20 ou variantes destes tal como anticorpoA20 quimérico ou humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (patente US2003/0219433, Immunomedics); anticorpos de ligação CD20, incluindo Leu-16 comepitopo depletado, 1H4, ou 2B8, opcionalmente conjugado com IL-2, como napatente US 2005/0069545A1 e documento WO 2005/16969 (Carr et al.)] anticorpobiespecífico que se liga a CD22 e CD20, por exemplo, hLL2xhA20 (W02005/14618,Chang et al.)] anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ou NU-B2disponíveis por meio da International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al.,Em: Leukocyte Typing Ill (McMichaeI1 Ed., pág. 440, Oxford University Press(1987)); 1H4 (Haisma et al. Blood 92:184 (1998). Os anticorpos CD20 preferidos nopresente são anticorpos CD20 quiméricos, humanizados ou humanos, maispreferivelmente rituximab, 2H7 humanizado, 2F2 (Hu-Max-CD20) anticorpo CD20humano (Genmab), e anticorpo A20 humanizado (Immunomedics).

Os termos "rituximab" ou "RITUXAN®" no presente referem-se aoanticorpo monoclonal murino/humano quimérico geneticamente engenheiradodirecionado contra o antígeno CD20 e designado "C2B8" na patente US 5.736.137,incluindo fragmentos destes que retêm a capacidade de se ligar a CD20.

Puramente para os propósitos no presente e a menos queindicado de outra forma, um anticorpo "2h7 humanizado" é um variantehumanizado do anticorpo 2H7 murino, em que o anticorpo é efetivo parareduzir células B circulantes in vivo.

Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende um,dois, três, quatro, cinco ou seis das seguintes seqüências de CDR:

CDR L1 seqüência RASSSVSYXH em que X é M ou L (SEQ ID NO. 21), porexemplo, SEQ ID NO. 4 (Fig. 1A),

CDR L2 seqüência de SEQ ID NO:5 (Fig. 1A),

CDR L3 seqüência QQWXFNPPT em que X é S ou A (SEQ ID NO. 22), porexemplo, SEQ ID NO:6 (Fig. 1A),

CDR H1 seqüência de SEQ ID N0:10 (Fig. 1B),

CDR H2 seqüência de AIYPGNGXTSYNQKFKG em que X é D ou A (SEQ IDNO. 23), por exemplo, SEQ ID NO. 11 (Fig. 1B), e

CDR H3 seqüência de WYYSXXYWYFDV em que X na posição 6 é Ν, A, Y,W ou D, e o X na posição 7 é S ou R (SEQ ID NO. 24), por exemplo SEQ IDNO. 12 (Fig. 1B).

As seqüências CDR acima estão geralmente presentes nasseqüências de estrutura variável leve e variável pesada humanas, tais comosubstancialmente os resíduos de FR consenso humano do subgrupo I kappacadeia leve humana (V|_kI), e substancialmente os resíduos de FR consensohumano do subgrupo Ill cadeia pesada humana (VHlll). Ver também documentoWO 2004/056312 (Lowman et ai).

A região pesada variável pode estar unida a uma região constanteda cadeia IgG humana, em que a região pode ser, por exemplo, IgGI ou lgG3,incluindo seqüência nativa e regiões constantes variantes.

Em uma realização preferida, tal anticorpo compreende aseqüência de domínio variável pesada da SEQ ID NO:8 (v16, como mostrado naFig. 1B), opcionalmente também compreende a seqüência de domínio variávelleve da SEQ ID N0:2 (v16, como mostrado na Fig. 1A), que opcionalmentecompreende uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 56, 100,e/ou 100a, por exemplo, D56A, N100A ou N100Y, e/ou S100aR no domíniovariável pesado e uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 32e/ou 92, por exemplo, M32L e/ou S92A, no domínio variável leve.Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo intacto que compreende asseqüências de aminoácidos de cadeia leve da SEQ ID NOs. 13 ou 15, eseqüências de aminoácidos de cadeia pesada da SEQ ID NO. 14, 16, 17 ou 20.

Um anticorpo 2H7 humanizado preferido é ocrelizumab (Genentech).

O anticorpo no presente pode, além disso, compreender pelomenos uma substituição de aminoácido na região Fc que melhora atividadeADCC, tal como aquele em que as substituições de aminoácido estão nasposições 298, 333, e 334, preferivelmente S298A, E333A, e K334A, usando-senumeração Eu de resíduos de cadeia pesada. Ver também patente US6.737.056B1, Presta.

Qualquer um destes anticorpos pode compreender pelo menosuma substituição na região Fc que melhora ligação de FcRn ou meia vida dosoro, por exemplo, uma substituição na posição 434 da cadeia pesada, talcomo N434W. Ver também patente US 6.737.056B1, Presta.

Qualquer um destes anticorpos podem, além disso, compreenderpelo menos uma substituição de aminoácido na região Fc que aumentaatividade CDC, por exemplo, que compreende pelo menos uma substituição naposição 326, preferivelmente K326A ou K326W. Ver também patente US6.528.624B1 (Idusogi eetal.).

Alguns variantes 2H7 humanizados preferidos são aqueles quecompreendem o domínio variável leve da SEQ ID NO:2 e o domínio variávelpesado da SEQ ID NO:8, incluindo aqueles com ou sem substituições em umaregião Fc (se presente), e aqueles que compreendem um domínio variávelpesado com alteração N100A; ou D56A e N100A; ou D56A, N100Y, e S100aR;na SEQ ID NO:8 e um domínio variável leve com alteração M32L; ou S92A; ouM32L e S92A; na SEQ ID NO:2.

M34 na cadeia pesada variável de 2H7v16 foi identificado comouma fonte potencial de estabilidade do anticorpo e é outro candidato potencialpara substituição.

Em um resumo de várias realizações preferidas da invenção, aregião variável de variantes baseada no 2H7.v16 compreende as seqüênciasde aminoácidos de v16, exceto nas posições de substituições de aminoácidosque estão indicadas na Tabela 1 abaixo. A menos que indicado de outra forma,os variantes 2H7 terão a mesma cadeia leve como aquela de v16.

Tabela 1

Variantes De Anticorpo 2H7 Humanizado Exemplares

<table>table see original document page 35</column></row><table>Um 2Η7 humanizado preferido compreende seqüência de domíniovariável leve 2H7.v16:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:2);

e seqüência de domínio variável pesada 2H7.v16:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:8).

Onde o anticorpo 2H7v16 humanizado é um anticorpo intacto, elepode compreender a seqüência de aminoácido de cadeia leve:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:13);

e a seqüência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID NO:14 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:17).

Outro anticorpo 2H7 humanizado preferido compreendeseqüência de domínio variável leve 2H7.v511:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N0:18)

e seqüência de domínio variável pesada 2H7.v511:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 19).

Onde o anticorpo 2H7.v511 humanizado é um anticorpo intacto,ele pode compreender a seqüência de aminoácido de cadeia leve:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:15)

e a seqüência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID NO:16 ou:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWD VS H E D PEVKF N WYVDG VEVH N AKTKP RE EQ YN ATYR WS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO. 20).

Anticorpos "inibitórios do crescimento" são aqueles que previnemou reduzem proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual oanticorpo se liga. Por exemplo, o anticorpo pode prevenir ou reduzirproliferação de células B in vitro e/ou in vivo.Anticorpos que "induzem apoptose" são aqueles que induzemmorte celular, por exemplo, de uma célula B, como determinado pelos testespadrão de apoptose, tal como ligação de anexina V, fragmentação do DNA,dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação devesículas na membrana (chamados corpos apoptóticos).

"Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínasheterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compostas de duascadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeialeve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação bissulfeto covalente,enquanto o número de ligações bissulfeto varia entre as cadeias pesadas dediferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também temregularmente pontes bissulfeto espaçadas entre cadeias. Cada cadeia pesadatem em uma terminação um domínio variável (Vh) seguida por um número dedomínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em umaterminação (Vl) e um domínio constante na sua outra terminação, o domínioconstante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante dacadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com odomínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidosespecíficos formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve ecadeia pesada.

O termo "variável" refere-se ao fato que certas porções dodomínio variável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpose são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seuantígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuídauniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela estáconcentrada em três segmentos chamados regiões hipervariáveis ambos nosdomínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamenteconservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura(FRs). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas, cada umcompreende quatro FRs adotando amplamente uma configuração β-folha,conectada por três regiões hipervariáveis, na qual formam Ioops que seconectam, e em alguns casos formam parte da estrutura β-folha. As regiõeshipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidadepelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para aformação do sítio de ligação do antígeno dos anticorpos, (ver Kabat et ai,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantesnão estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno,mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo nacitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

Digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos deligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com umúnico sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nomereflete sua habilidade para cristalizar de imediato. Tratamento por pepsinarende um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de ligação de antígeno e éainda capaz de interligar-se ao antígeno.

"Fv" é um fragmento mínimo de anticorpo que contém umreconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação de antígeno. Estaregião consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável decadeia leve em associação não covalente estreita. É nesta configuração que astrês regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir umsítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivemente, asseis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígeno aoanticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de uma Fvque compreende somente três regiões hipervariáveis específicas para umantígeno) possui a habilidade de reconhecer e ligar-se a um antígeno, emboracom afinidade mais baixa que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeialeve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab'diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminaçãocarboxila de um domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou maiscisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designação nopresente para Fab' na qual o(s) resíduo(s) cisteína(s) dos domínios constantesproduz pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpo F(ab')2originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuemdobradiças cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentosde anticorpo são também conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquerespécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramentedistintos, chamados kappa (κ) e Iambda (λ), baseados nas seqüências deaminoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constantede suas "cadeias pesadas", (se presentes) os anticorpos podem serdesignados para diferentes classes. Existem cinco classes principais deanticorpos intactos: IgA1 IgD1 IgE1 IgG1 e IgM, e várias destas podem tambémser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4,IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem àsdiferentes classes de anticorpos são chamados de α, δ, ε, γ, e μ,respectivamente. As subunidades de estruturas e configurações tridimensionaisde diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

A menos que indicado de outra forma, no presente a numeraçãodos resíduos nos domínios constantes de uma cadeia pesada deimunoglobulina é aquela do indicador EU como em Kabat et ai, Sequences ofProteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, EU. (1991)), expressamente incorporada aopresente como referência. O "indicador EU como em Kabat" refere-se ànumeração de resíduos do anticorpo IgGI EU humano.

O termo "região Fc" no presente é usado para definir uma regiãoC-terminal de uma imunoglobulina de cadeia pesada, incluindo seqüêncianativa de regiões Fc e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc deuma imunoglobulina de cadeia pesada possam variar, a região Fc de cadeiapesada IgG humana é usualmente definida por se estender de um resíduo deaminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, até a terminação carboxiladeste. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeraçãoEU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação doanticorpo ou pela recombinação do ácido nucléico engenheirado que codificauma cadeia pesada do anticorpo. Consequentemente, uma composição deanticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo com todos osresíduos K447 removidos, populações de anticorpo sem resíduos K447removidos, e populações de anticorpo que possuem uma mistura de anticorposcom e sem resíduos K447.

Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de umaregião Fc de seqüência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligaçãoC1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor Fc;citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose;baixa regulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor decélula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a regiãoFc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um anticorpo dedomínio variável) e podem ser avaliadas usando-se várias análises comodivulgado no presente, por exemplo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüênciade aminoácido idêntica a uma seqüência de aminoácido de uma região Fcencontrada na natureza. Regiões Fc humanas de seqüência incluem umaregião Fc IgGI humana de seqüência nativa (alótipos A e não A); região FclgG2 humana de seqüência nativa; região Fc lgG3 humana de seqüêncianativa; região Fc lgG4 humana de seqüência nativa assim como naturalmentevariantes das acima que ocorrem naturalmente.

Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência deaminoácido que difere daquela região Fc de seqüência nativa em virtude depelo menos uma modificação de aminoácido, preferivelmente uma ou maissubstituições de aminoácido. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelomenos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fc deseqüência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, deaproximadamente uma a aproximadamente dez substituições de aminoácidos,e preferivelmente de aproximadamente uma a aproximadamente cincosubstituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ou naregião Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante no presente irápreferivelmente possuir pelo menos aproximadamente 80% de homologia comuma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeoparental, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% dehomologia com esta, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95%de homologia com esta.

"Citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo" e"ADCC" referem-se à reação mediada por célula na qual células citotóxicas nãoespecíficas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células NaturalKiller (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado na célulaatingida e subseqüentemente causam Iise da célula atingida. As célulasprimárias para mediação de ADCC, células NK1 expressam somente FcyRIII,enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcRem células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 deRavetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991). Para avaliar atividadede ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio in vitro de ADCC, tal comodescrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser apresentado. Célulasefetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangueperiférico (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativamente, ouadicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada invivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et al.PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um oumais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplosde leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células Tcitotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas.

Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados para descrever umreceptor que se liga a região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcRhumano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se ligaa um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui subclasses dos receptores FcyRI,FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidasdestes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor deativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências similares deaminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes.Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação de imuno-receptorbaseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de ativaçãoFcyRIIB contém um motivo de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina(ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol9:457-492 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al.,J. Lab. Clin. Med. 126:330-341 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a seremidentificados no futuro, estão englobados pelo termo "FcR" no presente. O termotambém inclui o receptor neonatal, FcRn1 que é responsável por transferir as IgGsmaternas para os fetos e homeostase de imunoglobulina (Guyer et al., J.Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-seà habilidade de uma molécula Iisar um alvo na presença de complemento. A viade ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente dosistema complemento (C1q) para uma molécula complexa (por exemplo, umanticorpo) com um antígeno cognato. Para avaliar ativação de complemento,um teste CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J.Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv"compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que estes domínios estãopresentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, opolipeptídeo Fv1 além disso, compreende um Iigante polipeptídeo entre osdomínios Vh e Vl que permite o scFv formar a estrutura desejada para a ligaçãode antígeno. Para uma revisão de scFv ver Plückthun em The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag,Nova York, páginas 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequenocom dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem umdomínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável decadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl). Pelo uso de umIigante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios namesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínioscomplementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno.

Diacorpos estão descritos mais inteiramente em, por exemplo, patente EP404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 90:6444-6448 (1993).

O termo "anticorpo monoclonal" como usado no presente refere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmentehomogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a populaçãosão idênticos e/ou ligam-se ao(s) mesmo(s) epitopo(s), exceto por possíveisvariantes que podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal,tais variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Talanticorpo monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende umaseqüência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a seqüência depolipeptídeo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção deuma seqüência de polipeptídeo de ligação alvo única de uma pluralidade deseqüências de poplipepídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser aseleção de um único clone de uma pluralidade de clones, tais como um grupode clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinantes.

Deve ser entendido que a seqüência de ligação alvo selecionada pode sertambém alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para este alvo, parahumanizar a seqüência de ligação alvo, para melhorar sua produção na culturacelular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar anticorpomultiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a seqüência deligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal desta invenção. Emcontraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluemdiferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cadaanticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigidocontra um único determinante no antígeno. Além disso, para suasespecificidades, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas,pois elas são tipicamente descontaminadas de outras imunoglobulinas. Omodificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido deuma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não sendoconstruído como produção requerida do anticorpo por qualquer métodoespecífico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem usados deacordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade detécnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo., Kohleret al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies\ A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., em:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, Ν. I., 1981)),métodos de DNA recombinantes (ver, por exemplo., patente US 4.816.567),tecnologias de exposição por fago (ver, por exemplo, Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991); Marks et al., J. Moi Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al.,J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol.Biol.340(5): 1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 101 (34): 12467-12472 (2004); eLee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias paraprodução de anticorpos humanos e similares a humanos em animais quepossuem partes ou todos os Ioci de imunoglobulina ou genes que codificamseqüências de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, documento WO1998/24893; documento WO 1996/34096; documento WO 1996/33735;documento WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA,90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann etal., Yearin Immuno., 7:33 (1993); patentes US 5.545.806, US 5.569.825, US5.591.669 (todas da GenPharm), 5.545.807, documento WO 1997/17852,patentes US 5.545.807, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126; US5.633.425 e US 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992);Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, lntern. Rev.Immunol., 13: 65-93 (1995).Os anticorpos monoclonais no presente especificamente incluemanticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas), nos quais uma porção da cadeialeve e/ou pesada é idêntica a, ou homóloga às seqüências correspondentes emanticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencendo a uma classeou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) éidêntico a, ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorposderivados de uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ousubclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contantoque eles exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567;Morrison et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorposquiméricos de interesse no presente incluem anticorpos "primatizados" quecompreendem seqüências de ligação de antígeno de domínio variávelderivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo,tal como babuíno, rhesus ou macaco cynomolgus) e seqüências de regiãoconstante humana (patente US 5.693.780).

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo,murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada deimunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma regiãohipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a desejadaespecificidade, afinidade e capacidade. Em alguns exemplos, resíduos daregião de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos porresíduos correspondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizadospodem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptorou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinaro desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irácompreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois,domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os Ioopshipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana etodas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência deimunoglobulina humana, exceto para substituições em FR como apontadoacima. O anticorpo humanizado opcionalmente irá também compreender pelomenos uma porção de uma região constante da imunoglobulina, tipicamenteaquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones etal., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332:323-329 (1988);e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-596 (1992).

O termo "região hipervariável" quando usado no presente refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis porligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos deaminoácido de uma "região determinada por complementaridade" ou "CDR"(por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variávelde cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável decadeia pesada; Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)) e/ou aqueles resíduos de um uIoop hipervariável" (por exemplo,resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia levee 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada;Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Região de estrutura" ouresíduos "FR" são aqueles resíduos de domínio variável, exceto os resíduos deregião hipervariável como definido no presente.

Um "anticorpo nu" é um anticorpo (como definido no presente)que não é conjugado a um componente citotóxico ou marca radioativa.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separadoe/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentescontaminantes de seu meio natural são materiais que poderiam interferir nodiagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas,hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em realizaçõespreferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% por peso deanticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente maisque 99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de umsequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGEsob condições de redução ou não redução utilizando-se Coomassie blue ou,preferivelmente, silver stain. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentrode células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambientenatural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpoisolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou maisalterações em uma ou mais regiões hipervariáveis deste que resultam em umaprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com umanticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos deafinidade madura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidadespicomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura sãoproduzidos por processos conhecidos na técnica. Marks et aí. Bio/Technology10:779-783 (1992) descreve a maturação da afinidade por mistura dosdomínios VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura édescrita por: Barbas et ai. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994);Schier et ai Gene 169:147-155 (1995); Yelton et ai. J. Immunol. 155:1994-2004(1995); Jackson et ai, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J.Moi Bioi 226:889-896 (1992).

"Exposição ao anticorpo" refere-se ao contato ou exposição aoanticorpo no presente em uma ou mais doses administradas por um período detempo de aproximadamente 1-20 dias. As doses podem ser dadas de uma vezou em intervalos de tempo fixos ou irregulares sobre este período deexposição. Exposições ao anticorpo iniciais ou posteriores (por exemplo,segunda ou terceira) são separadas por tempo entre cada uma como descritoem detalhes no presente.

Uma "bula" refe-se a instruções incluídas como de costume emembalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm infomaçõessobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra-indicações, outrosprodutos terapêuticos a serem combinados com o produto embalado, e/ouadvertências referentes ao uso de tais produtos terapêuticos, etc.

II. Tratamento De AD ou Demência

A presente invenção fornece um método para tratar AD oudemência em um sujeito sofrendo destas, que compreende administrar aosujeito uma quantidade efetiva de um antagonista (preferivelmente umanticorpo) que se liga a um marcador de superfície de célula B (preferivelmenteum anticorpo CD20). A AD ou demência a ser tratada no presente inclui AD oudemência branda, moderada, severa, branda-moderada, moderada-severa,esporádica, hereditária, de princípio precoce, e princípio tardio.

De acordo com um protocolo de dosagem exemplar, o métodocompreende administrar a um sujeito humano uma quantidade efetiva de umanticorpo CD20 nu para o sujeito com AD ou demência para fornecer umaexposição inicial ao anticorpo de aproximadamente 0,5 a 4 gramas(preferivelmente cerca de 1,5 a 2,5 gramas) seguido por uma segundaexposição ao anticorpo de aproximadamente 0,5 a 4 gramas (preferivelmentecerca de 1,5 a 2,5 gramas), a segunda exposição ao anticorpo não sendofornecida até aproximadamente 16 a 60 semanas da exposição inicial aoanticorpo. Para os propósitos desta invenção, a segunda exposição aoanticorpo é na próxima vez que o sujeito é tratado com o anticorpo CD20 apósa exposição inicial ao anticorpo, não existindo interferência no tratamento como anticorpo CD20 ou exposição entre as exposição inicial e segunda.

O intervalo entre a exposição ao anticorpo inicial e segunda ousubseqüente pode ser medido tanto pela primeira como segunda dose deexposição inicial ao anticorpo, mas preferivelmente da primeira dose deexposição inicial ao anticorpo.

Nas realizações preferidas no presente, as exposições aoanticorpo são separadas por aproximadamente 24 semanas ou 6 meses; ouseparadas por aproximadamente 48 semanas ou 12 meses.

Em uma realização, a segunda exposição ao anticorpo não éfornecida até aproximadamente 20 a 30 semanas da exposição inicial,opcionalmente seguida por uma terceira exposição ao anticorpo deaproximadamente 0,5 a 4 gramas (preferivelmente cerca de 1,5 a 2,5 gramas),a terceira exposição não sendo administrada até aproximadamente 46 a 60semanas (preferivelmente cerca de 46 a 54 semanas) da exposição inicial, eentão, preferivelmente nenhuma exposição adicional ao anticorpo é fornecidaaté pelo menos cerca de 70-75 semanas da exposição inicial.

Em uma realização alternativa, a segunda exposição ao anticorponão é fornecida até aproximadamente 46 a 60 semanas da exposição inicial eexposições ao anticorpo subseqüentes, se não são fornecidas atéaproximadamente 46 a 60 semanas da exposição prévia ao anticorpo.

Qualquer uma ou mais exposições ao anticorpo no presentepodem ser fornecidas aos sujeitos como uma dose única do anticorpo, ou comoduas doses separadas do anticorpo (isto é, constituindo uma primeira esegunda dose). O número específico de doses (se uma ou duas) empregadaspara cada exposição ao anticorpo é dependente, por exemplo, do tipo de ADtratada, o tipo de anticorpo empregado, se e que tipo de segundo medicamentoé empregado, e o método e freqüência da administração. Onde duas dosesseparadas são administradas, a segunda dose é preferivelmente administradaa partir de aproximadamente 3 a 17 dias, mais preferivelmente a partir deaproximadamente 6 a 16 dias, e mais preferivelmente a partir deaproximadamente 13 a 16 dias a partir do período que a primeira dose foiadministrada. Onde duas doses separadas são administradas, a primeira esegunda dose do anticorpo é preferivelmente cerca de 0,5 a 1,5 g, maispreferivelmente cerca de 0,75 a 1,3 gramas.

Em uma realização, é fornecido ao sujeito pelo menos cerca detrês, ou pelo menos cerca de quatro exposições ao anticorpo, por exemplo,cerca de 3 a 60 exposições, e mais particularmente cerca de 3 a 40 exposições,mais particularmente cerca de 3 a 20 exposições. Preferivelmente, taisexposições são administradas em intervalos de aproximadamente 24 semanasou 6 meses, ou 48 semanas ou 12 meses. Em uma realização, cada exposiçãoao anticorpo é fornecida como uma dose única do anticorpo. Em uma realizaçãoalternativa, cada exposição ao anticorpo é fornecida como duas dosesseparadas do anticorpo. No entanto, nem todas as exposições ao anticorpoprecisam ser fornecidas como uma dose única ou como duas doses separadas.

Em uma realização preferida, o método compreende administraruma ou mais doses na faixa de aproximadamente 200 mg a 2000 mg,preferivelmente cerca de 500 mg a 1500 mg e mais preferivelmente cerca de 750mg a 1200 mg. Por exemplo, uma a quatro doses, ou somente uma ou duasdoses podem ser administradas. De acordo com esta realização, o anticorpopode ser administrado dentro de um período de aproximadamente um mês,preferivelmente dentro de um período de aproximadamente 2 a 3 semanas, emais preferivelmente dentro de um período de aproximadamente 2 semanas.

Onde mais do que uma dose é administrada, a última dose (porexemplo, segunda ou terceira dose) é preferivelmente administrada emaproximadamente 1 a 20 dias, mais preferivelmente em aproximadamente 6 a16 dias, e mais preferivelmente em aproximadamente 14 a 16 dias a partir doperíodo em que a dose anterior foi administrada. As doses separadas sãopreferivelmente administradas dentro de um período total entreaproximadamente 1 dia a 4 semanas, mais preferivelmente entreaproximadamente 1 a 20 dias (por exemplo, dentro de um período de 6-18dias). Cada dose separada do anticorpo é preferivelmente cerca de 200 mg a2000 mg, preferivelmente cerca de 500 mg a 1500 mg, e mais preferivelmentecerca de 750 mg a 1200 mg.

O sujeito pode ser tratado novamente com o antagonista ouanticorpo, como sendo dado mais do que uma exposição ou conjunto de doses,de modo que pelo menos aproximadamente duas exposições do antagonistaou anticorpo, por exemplo, de aproximadamente 2 a 60 exposições, e maisparticularmente aproximadamente 2 a 40 exposições, mais particularmenteaproximadamente, 2 a 20 exposições. Tais exposições adicionais podem seradministradas intermitentemente, tal como para os intervalos de tempoapontados acima.

O antagonista preferido é um anticorpo. Nos métodosapresentados no presente, o anticorpo CD20 é um anticorpo nu.Preferivelmente , o anticorpo é um anticorpo nu intacto. O anticorpo CD20preferido no presente é um anticorpo CD20 quimérico, humanizados ouhumano, mais preferivelmente rituximab, 2H7 humanizado, 2F2 (Hu-Max-CD20) anticorpo CD20 humano (Genmab), e anticorpo A20 humanizado(Immunomedics). Ainda mais preferido é rituximab ou 2H7 humanizado.

Em uma realização, o sujeito nunca foi previamente tratado comdroga(s), tal como um agente(s) imunosupressivo(s), para tratar AD oudemência e/ou nunca foi previamente tratado com um anticorpo para ummarcador de superfície de célula B (por exemplo, nunca foi previamente tratadocom um anticorpo CD20). Preferivelmente o sujeito não possui umamalignidade de célula Β. Em uma realização, o sujeito não está sofrendo deuma doença auto-imune, exceto AD ou demência.

O anticorpo é administrado por qualquer via adequada, incluindoadministração parenteral, tópica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar,intranasal e/ou intralesional. Infusões parenterais incluem administraçãointramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal e subcutânea.Administração intratecal é também contemplada (ver, por exemplo, patente US2002/0009444, Grillo-Lopez, A, relacionando entrega intratecal de um anticorpoCD20), assim como infusão intersticial do cérebro e injeções estereotácticasbilaterais. Preferivelmente, a dosagem é dada de forma intravenosa, subcutâneaou intratecal, mais preferivelmente por infusão intravenosa.

Em uma realização o anticorpo CD20 é a única drogaadministrada ao sujeito para tratar AD ou demência.

No entanto, geralmente, o anticorpo CD20 será combinado comum segundo medicamento ou mais. Por exemplo, pode-se opcionalmenteadministrar um segundo medicamento, tal como: inibidor de colinesterase(incluindo, mas não limitando a galantamina (REMINYL®), rivastigmina(EXELON®) incluindo rivastigmina em adesivo transdérmico, donepezil(ARICEPT®), tacrina (COGNEX®), e HUPRINEX™, antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA) (por exemplo, memantina (NAMENDA®) ou neramexano),Liberação de NGF em vírus associado a adeno (por exemplo, CERE-10), beta-bloqueador, antipsicótico, precursor de acetilcolina, agonista nicotínico oumuscarínico (por exemplo, adesivo XANOMELINE™), anticorpo anti-amilóidebeta; anticorpo anti-NGF, tal como RA624; vacinas, por exemplo, vacinaamilóide humana; agente que bloqueia a atividade de enzima(s), secretasesbeta ou gama envolvidas na formação de amilóide; terapia anti-amilóide;serotonina; norepinefrina; somatostatina; agente que interfere na conversão deAPP para amilóide-beta ou na formação de placas senis e trançasneurofibrilares; proteína precursora do sítio amilóide beta; antagonista de beta-secretase (BACE); antagonista de BASE1; antagonista de BASE2; antagonistade gama-secretase; antagonista de presenilina-1 (PSEN-1); antagonista depresenilina-2 (PSEN-2); antagonista APO-E4; antidepressivos;

anticonvulsivantes; inibidor de reabsorção de serotonina, sertralina(ZOLOFT™), trazodona (DESYREL™); divalproex (DEPAKOTE™);gabapentina (NEURONIN™); risperidona (RISPERDAL®); olanzapina(ZYPREXA™); quetiapina (SEROQUEL™); tioridazina (MELLARIL™); droga ouestatina para baixar colesterol (por exemplo, HMG-CoA redutase ousinvastatina); agente imunomodulatório; antioxidante, tal como vitamina E (alfa-tocoferol), óleo de peixe ou ácido alfa lipólico; caroteno; nicotina; extrato deginkgo; selegilina; mesilatos ergolóides; estrógeno, agente anti-inflamatório,incluindo drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs), tal como aspirina,ibuprofeno, inibidor de COX-2, rofecoxib (VIOXX®), naproxeno (ALEVE®),celecoxib (CELEBRIX®), ou naproxeno; ginkgo biloba; PPI-1019; huperzina A;vitamina tal como folato (ácido fólico), B6, B12, vitamina C, vitamina E, selênio(PREADVISE™); antagonista do receptor GABA (B), tal como SGS742; NC-758 (ALZHEMED™); C-1073 (MIFEPRISTONA™); FK962; curcumin; ONO-2506PO; mesilato de rasagilina; valproato; SR57746A (XALIPRODEN™); NS2 330; MPC-7869; um interferon, tal como interferon alfa, fragmento deanticorpo de cadeia leve amilóide beta proteolítica; agente citotóxico (verdefinição acima); inibidor TNF-alfa; DMARD; antagonista ou anticorpo integrina;corticosteróide; purina; derivado de hipoxãntina (por exemplo, AIT-082), etc.

Preferivelmente, o segundo medicamento é: inibidor decolinesterase (tal como galantamina (REMINYL®), rivastigmina (EXELON®)incluindo rivastigmina em adesivo transdérmico, e donepezil (ARICEPT®),especialmente quando a AD ou demência é branda-moderada, ou umantagonista de N-metil D-aspartato (NMDA) (por exemplo, memantina(NAMENDA®), especialmente quando a AD ou demência é moderada-severa.

O segundo medicamento pode ser administrado com a exposiçãoinicial e/ou exposições posteriores do anticorpo CD20, tal administraçãocombinada inclui co-administração, usando-se formulações separadas ou umaúnica formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem,em que preferivelmente exista um período de tempo enquanto ambos (ou todos)os agentes ativos exerçam simultaneamente suas atividades biológicas.

Além da administração de anticorpos ao sujeito o presente pedidocontempla administração de anticorpos por terapia gênica. Tal administraçãode ácido nucléico que codifica o anticorpo é englobada pela expressãoadministrar uma "quantidade efetiva" de um anticorpo. Ver, por exemplo,documento WO 96/07321 publicado em 14 de março de 1996 relacionando ouso de terapia gênica para gerar anticorpos intracelulares.

Existem duas abordagens principais para obtenção de ácidonucléico (opcionalmente contido em um vetor) na célula do sujeito; in vivo e exvivo. Para entrega in vivo, o ácido nucléico é injetado diretamente no sujeito,usualmente no local onde o anticorpo é requerido. Para o tratamento ex vivo,as células do sujeito são removidas, o ácido nucléico é introduzido nestascélulas isoladas e as células modificadas são administradas ao sujeito tantodiretamente como, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosasque são implantadas no sujeito (ver, por exemplo, patente US 4.892.539 e5.283.187). Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introdução deácido nucléico em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácidonucléico é transferido para células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células dohospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácidonucléico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos,eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método deprecipitação por fosfato de cálcio, etc. Um vetor comumente utilizado paraentrega ex vivo do gene é um retrovírus.

As técnicas atualmente preferidas para transferência de ácidonucléico in vivo incluem transfecção com vetores virais (tal como adenovírus,vírus Herpes simplex ou vírus associado a adeno) e sistemas baseados emlipídeo (lipídeos úteis para transferência de gene mediada por lipídeo sãoDOTMA, DOPE e DC-ChoI1 por exemplo). Em algumas situações é desejávelfornecer o ácido nucléico. Em algumas situações é desejável fornecer a fontede ácido nucléico com um agente que atinge as células alvo, tal como umanticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície celular, umligante para um receptor na célula alvo, etc. Onde são empregados lipossomos,as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celularassociada com endocitose pode ser usada para atingir e/ou facilitar a absorção,por exemplo, proteínas capsídeo ou fragmentos destas trópicos para um tipocelular específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização no ciclo,e proteínas que atingem locais intracelulares e aumentam a meia vidaintracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, porexemplo, por Wu et ai., J. Bioi. Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner et ai.,Proc. Nati. Acad. Sei. USA 87:3410-3414 (1990). Para revisão do gene demarcação conhecido atualmente e protocolos de terapia gênica ver Andersonet al., Science 256:808-813 (1992). Ver também documento WO 93/25673 e asreferências citadas nestes.

III. Produção De Anticorpos

Os métodos e artigos de fabricação da presente invenção usam,ou incorporam um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de célulaB, especialmente aquele que se liga a CD20. Conseqüentemente, métodospara gerar tais anticorpos serão descritos aqui.

O marcador de superfície de célula B a ser usado para aprodução ou seleção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúveldo marcador ou uma porção deste contendo o epitopo desejado.Alternativamente ou adicionalmente, células que expressam o marcador na suasuperfície celular são usadas para gerar ou selecionar anticorpos. Outrasformas de marcador de superfície de célula B úteis para geração de anticorposserão aparentes para aqueles técnicos no assunto.

Segue uma descrição como técnicas exemplares para a produçãodos anticorpos usados de acordo com a presente invenção.

(I) Anticorpos Policlonais

Anticorpos policlonais são preferivelmente cultivados em animaispor múltiplas injeções subcutânea (sc) ou intraperitonial (ip) do antígenorelevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a umaproteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo,hemocianina keyhole limpet, soro de albumina, tiroglobulina bovina, ou inibidorde tripsina de soja utilizando-se um agente bifuncional ou de derivação, porexemplo, éster sulfosuccinimida maleimidobenzoil (conjugação através deresíduos cisteína), N-hidroxsuccinimida (através de resíduos lisina),glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 sã ogrupos alquil diferentes.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, 100 pg ou 5 pg deproteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por viaintradérmica em múltiplos locais. Um mês depois os animais são estimuladoscom 1/5 a 1/10 da quantidade original do peptídeo ou conjugado em adjuvantecompleto de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 diasdepois os animais são sangrados e o soro é analisado por titulação deanticorpo. Os animais são estimulados até a titulação platô. Preferivelmente, oanimal é estimulado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado comuma proteína diferente e/ou através de um reagente de interligação diferente.Conjugados também podem ser feitos na cultura celular recombinante comoproteína de fusão. Também, agentes de agregação tal como alúmen sãoadequadamente usados para aprimorar a resposta imune.

(II) Anticorpos Monoclonais

Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais quecompreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epitopoexceto pela possível ocorrência natural de mutações que podem estarpresentes em menores quantidades. Dessa forma, o modificador "monoclonal"indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorposdistintos ou anticorpos policlonais.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitosusando-se o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et ai Nature,256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante(patente US. 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado na forma descrita acimapara gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos queirão ligar-se especificamente à proteína utilizada para imunização.Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos sãoentão fundidos com uma linhagem de células de mieloma, utilizando-se umagente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célulade hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas.59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas ecultivadas em meio de cultura apropriado que contém preferivelmente uma oumais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células demieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mielomaparentais não contêm a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase(HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomas iráincluir tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT),substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundemeficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelascélulas produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio talcomo meio HAT. Entre estas, linhagens celulares de mieloma preferidas sãolinhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores decamundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute CellDistribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 ou célulasX63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Americana de Tipos de Cultivo,Manassas, Virgínia, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humanoe heteromieloma humano de camundongos também foram descritas para aprodução de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, páginas. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendoé testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contrao antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorposmonoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio deimunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal comoradioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado por enzimas (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, porexemplo, ser determinada por meio da análise Scatchard de Munson et al.,AnaLBiochem., 107:220(1980).

Após células de hibridoma serem identificadas para produção deanticorpos de especificidade desejada, afinidade e/ou atividade, os clones podemser subclonados por procedimentos de diluição Iimitantes e cultivados pormétodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice1páginas. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meio de cultura adequado para estepropósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as célulasde hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones sãoadequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro porprocedimentos de purificação de imonuglobulina convencional, tais como, porexemplo, proteína A sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese emgel, diálises ou cromatografia de afinidade.

O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmenteisolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais (porexemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligarespecificamente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada deanticorpos murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferidade tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores deexpressão, que são transfectados em seguida em células hospedeiras taiscomo células de E. coli, células de COS de símios, células de Ovário deHamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, nãoproduzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorposmonoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisãosobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpoincluem Skerra et ai, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Plückthun,Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Em uma realização adicional, anticorpos ou fragmentos deanticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas usando-se técnicas descritas em McCafferty et ai Nature 348:552-554 (1990).Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai, J. Moi Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos,respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Publicações subsequentesdescrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (variação nM)pela mistura de cadeia (Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assimcomo infecções combinatórias e recombinação in vivo, como uma estratégiapara a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et ai,Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Desta forma, essas técnicas sãoalternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonaistradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.

O DNA pode ser também modificado, por exemplo, pelasubstituição das seqüências de codificação de domínios constantes de cadeialeve e cadeia pesada humana no lugar das seqüências de murino homólogas(patente US 4.816.567; Morrison, et ai, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81:6851(1984)) ou por ligação covalente para toda ou parte da seqüência codificadorade imunoglobulina a um polipeptídeo não imunoglobulina.

Tipicamente tais polipeptídeos de não-imunoglobulina sãosubstituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, ou eles são substituídospelos domínios variáveis de um sítio de combinação de um anticorpo para criarum anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação deantígeno que tem especificidade para um antígeno e outro sítio de combinaçãode antígeno que tem especificidade para um antígeno diferente.

(III) Anticorpos Humanizados

Métodos para humanização de anticorpos não humanos foramdescritos na técnica. Preferivelmente, um anticorpo humanizado possui um oumais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que nãoé humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentementereferidos como resíduos "importados", que são tipicamente retirados de umdomínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmenteapresentada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et aí.Nature1 321:522-525 (1986); Riechmann et ai Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen et ai Science 239:1534-1536 (1988)), pela substituição deseqüências de região hipervariável para as seqüências correspondentes de umanticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" sãoanticorpos quiméricos (patente US 4.816.567) em que substancialmente menosde um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüênciacorrespondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos deregião hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos porresíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve comopesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muitoimportante para reduzir antigenicidade. De acordo com o método tambémconhecido como "melhor ajuste", a seqüência de domínio variável de umanticorpo de roedor é selecionada em relação à completa biblioteca dasseqüências de domínio variável humana conhecida. A seqüência humana queé a mais próxima daquela de roedor é então aceita como a região de estruturahumana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunoi, 151:2296(1993); Chothia et ai, J. Moi Bioi, 196:901 (1987)). Outro método utiliza umaregião de estrutura específica derivada da seqüência consenso de todos osanticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas.A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizadosdiferentes (Carter et ai, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285 (1992); Prestaet ai., J. Immunoi, 151:2623 (1993)).

É, além disto, importante que anticorpos sejam humanizados comretenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicasfavoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido,anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise dasseqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais que usammodelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos deimunoglobulina tridimensional estão comumente disponíveis e são familiarespara aqueles técnicos no assunto. Programas de computador estão disponíveis,os quais ilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensionaldas seqüências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção destasexibições permite a análise do papel provável no funcionamento da seqüência deimunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam nahabilidade da imunoglobulina candidata ligar-se ao seu antígeno. Desta maneira,resíduos FR podem ser selecionados e combinados das seqüências do receptore importada de forma que a característica do anticorpo desejada, tal comoaumento de afinidade para o antígeno(s) alvo, é atingida. Em geral, resíduos deregião hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos nainfluência da ligação do antígeno.

(iv) Anticorpos Humanos

Como uma alternativa para humanização, podem ser geradosanticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animaistransgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, medianteimunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos naausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descritoque a deleção homozigótica do gene (Jh) da região de união da cadeia pesadado anticorpo em camundongos de linhagem de origem mutante e quiméricoresulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. Atransferência da linhagem de origem humana do conjunto de gene deimunoglobulina em tal camundongo de linhagem de origem mutante irá resultarna produção de anticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Ver, porexemplo, Jakobovits et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993);Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al. Year inImmuno., 7:33 (1993); e patentes US 5.591.669, US 5.589.369 e US 5.545.807.

Alternativamente, tecnologia de exibição por fago (McCafferty et al.pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos invitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina dedoadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V doanticorpo são clonados em quadro tanto em um gene de proteína de revestimentomaior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos naforma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula defago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita única dogenoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpotambém resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelaspropriedades. Dessa forma, o fago imita algumas das propriedades da célula Β. Aexibição por fago pode ser realizada em uma série de formatos; para sua revisão,ver, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion inStructural Biology 3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene Vpodem ser utilizadas para exibição por fago. Clackson et al. Nature, 352:624-628(1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de umapequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços decamundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos nãoimunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso deantígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados seguindo-seessencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. Moi Biol. 222:581-597(1991), ou Griffith et al. EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, também, patentes US5.565.332 e 5.573.905.

Anticorpos humanos podem também ser gerados por células Bativadas in vitro (ver patentes US 5.567.610 e 5.229.275).(ν) Fragmentos De Anticorpos

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção defragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadosvia digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto etal. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); eBrennan et al. Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podemser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Porexemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir debibliotecas de fago discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab1-SHpodem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente paraformar fragmentos F(ab')2 (Carter et al. BioiTechnoIogy 10:163-167 (1992)). Deacordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isoladosdiretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outrastécnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para ostécnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo da seleção é umfragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver documento WO 93/16185; PatenteUS 5.571.894; e Patente US 5.587.458. O fragmento de anticorpo podetambém ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na patente US5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo linear podem sermonoespecíficos ou biespecíficos.

(VI) Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuemespecificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes.Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epitopos diferentesdo marcador de superfície de célula B. Outros tais anticorpos podem se ligar aum primeiro marcador e também se ligar a um segundo marcador de superfíciede célula B. Alternativamente, um braço do marcador de superfície de célula Bpode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora emum leucócito como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ouCD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR)1 tal como FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) e FcyRIII (CD 16) assim como focalizar o mecanismo de defesa celularpara a célula B. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados paralocalizar agentes citotóxicos para a célula B. Estes anticorpos possuem umbraço que se liga ao marcador de célula B e um braço que se liga ao agentecitotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, ricina decadeia A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorposbiespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total oufragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos sãoconhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficosde comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeialeve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuemespecificidades diferentes (Millstein et aí. Nature 305:537-539 (1983).Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina,esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dezmoléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui aestrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que énormalmente realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade,é um tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos.Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829 e emTraunecker et al. EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveisde anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios decombinação de anticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências dedomínio constante de imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão é comum domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, quecompreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Épreferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1)contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, presente empelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeiapesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve deimunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e sãoco-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornecegrande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentosde polipeptídeo em realizações quando razões desiguais das três cadeiasde polipeptídeo utilizadas na construção fornecerem os rendimentosótimos. É, no entanto, possível inserir as seqüências de codificação paraduas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressãoúnico quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeoem razões iguais resultarem em altos rendimentos ou quando as razõesnão forem de significância específica.

Em uma realização preferida desta abordagem, os anticorposbiespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbridacom uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeiasleve e cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segundaespecificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estruturaassimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado decombinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença decadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da moléculabiespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem édescrita no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes de geração deanticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et al. Methods inEnzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita na patente US5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode serengenheirada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que sãorecuperados da cultura celular recombinante. A interface preferidacompreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínioconstante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais deaminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo sãosubstituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina outriptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similarà(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface dasegunda molécula de anticorpo, pela substituição de grandes cadeiaslaterais de aminoácidos com cadeias menores (por exemplo, alanina outreonina). Isto fornece um mecanismo de aumento do rendimento doheterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais comohomodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos interligados ou"heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugadopode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. T ais anticorpos, porexemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico acélulas indesejadas (Patente US 4.676.980), e para o tratamento deinfecções por HIV (documento WO 91/00360, documento WO 92/200373 epatente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricadosutilizando-se qualquer método de interligação conveniente. Os agentes deinterligação apropriados são bem conhecidos na técnica e estão descritosna patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas deinterligação.

As técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partirde fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Porexemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando-seligações químicas. Brennan et al. Science 229: 81 (1985) descreve umprocedimento em que anticorpos intactos são clivados proteolicamentepara gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos napresença do agente complexante ditiol arsenato de sódio para estabilizarditióis próximos e prevenir formação bissulfeto intermolecular. Osfragmentos Fab' gerados são então convertidos para derivados detionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB é entãoreconvertido para o Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e émisturado com uma quantidade equimolar do outro derivado do Fab1-TNBpara formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficosproduzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletivade enzimas.

Diversas técnicas para fabricação e isolamento de fragmentos deanticorpos biespecíficos diretamente de cultura celular recombinante tambémforam descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidosutilizando-se fechos de leucina. Kostelny et ai, J. Immunol., 148(5): 1547-1553(1992). Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foramligados às porções Fab1 de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Oshomodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça paraformarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros deanticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção dehomodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollingeret ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu ummecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorposbiespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeiapesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) por umIigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios namesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento sãoforçados a parear-se com os domínios Vl e Vh complementares de outrofragmento, através disto, formando dois sítios de ligação de antígenos. Outraestratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso dedímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et ai., J.Immunol., 152:5368(1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Porexemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J.Immunol. 147: 60 (1991).

IV. Outras modificações Do Anticorpo

Modificações da seqüência de aminoácidos do anticorpo descritossão contempladas. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade deligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Seqüências de aminoácidos variantes do anticorpo são preparadas pela introdução apropriada detrocas de nucleotídeos no ácido nucléico do anticorpo ou por síntese depepitídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções dos resíduos,e/ou inserções e/ou substituições nas seqüências de aminoácido do anticorpo.Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição são feitas para sechegar à construção final, provendo que a construção final possua ascaracterísticas desejadas. As trocas de aminoácido também podem alterarprocessos pós-tradução do anticorpo, tal como troca do número ou posição dossítios de glicolisação.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiõesdo anticorpo que estão em localizações preferidas para mutagênese échamado "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunninghame Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduosalvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp,his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ouneutro (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação deaminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácidos que demonstramsensibilidade funcional para as substituições então são refinadas pelaintrodução, além disto, ou outras variantes no, ou para, os sítios de substituições.Dessa forma, enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüência deaminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação por si mesma nãoprecisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho deuma mutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese aleatória éconduzida no códon ou região alvo e os anticorpos variantes expressados sãoselecionados para a atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões aminoe/ou carboxi-terminal variando em comprimento de um resíduo parapolipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim comoinserções intrasequência de simples ou múltiplos resíduos de aminoácido.Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduometionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outrasinserções variantes da molécula do anticorpo incluem a fusão para o N ou C-terminal do anticorpo de uma enzima, ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição doaminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido namolécula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maiorinteresse para mutagênese substitucional dos anticorpos incluem as regiõeshipervariáveis, mas alterações FR também são contempladas. Substituiçõesconservativas são mostradas na Tabela 2 sob o título de "substituiçõespreferidas". Se tais substituições resultam em uma troca na atividade biológica,então mais trocas substanciais, denominadas "substituições exemplares" naTabela 2 ou também como descritas abaixo na referência para classes deaminoácido, podem ser introduzidas e os produtos selecionados.Tabela 2

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorposão realizadas por seleções de substituições que diferem significantemente em seusefeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área desubstituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helicoidal (b) da carga ouhidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral.Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as similaridades nas propriedadesde suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger1 em Biochemistry, segunda edição, pág.73-75, Worth Publishers, Nova Iorque (1975)):(1) apoiar: Ala (A), Val (V), Leu (L)1 Ile (I), Pro (P)1 Phe (F)1 Trp (W), Met (M)

(2) polar não carregada: Gly (G)1 Ser (S), Thr (T)1 Cys (C)1 Tyr (Y)1 Asn (N)1 Gln (Q)

(3) acída: Asp (D)1 Glu (E)

(4) básica: Lys (K)1 Arg (R)1 His (H)

Resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos emgrupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;

(3) acída: asp, glu;

(4) básica: asn; gln; his, lys; arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromática: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas irão conferir troca de um membrode uma destas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmentecom serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenirinterligação anormal. De modo oposto, cisteína(s) ligada(s) pode seradicionada ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente ondeo anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo de variante substitucional particularmente preferidaenvolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de umanticorpo parental. Geralmente, a variante(s) resultante(s) selecionada(s) paraposterior desenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativas aoanticorpo parental a partir do qual elas são geradas. Uma maneira convenientepara gerar tais variantes substitucionais é maturação de afinidade usando-seexibição por fago. Resumidamente, diversos sítios de região hipervariável (porexemplo, sítios 6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituiçõesde aminoácido em cada sítio. Os anticorpos variantes dessa forma gerados sãoexibidos em uma forma monovalente a partir de partículas de fago filamentosocomo fusões para o gene Ill produto de M13 empacotado no interior de cadapartícula. As variantes de fago exibidas são então selecionadas para suasatividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação) como divulgado nopresente. Com o objetivo de identificar candidatos para sítios de regiãohipervariável para modificações, pode ser realizada mutagênese de varredurade alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuemsignificantemente para ligação do antígeno. Alternativamente, ouadicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina docomplexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre oanticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos sãocandidatos para substituições de acordo com as técnicas elaboradas nopresente. Uma vez que tais variantes são geradas, as variantes do painel sãosujeitas à seleção como descrito no presente e anticorpos com propriedadessuperiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados paraposterior desenvolvimento.

Outro tipo de aminoácido variante do anticorpo altera o padrão deglicosilação original do anticorpo. Pela alteração é intencionado deletar um oumais componentes carboidratos encontrados no anticorpo, e/ou adicionar umou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado comoO-ligado. N-Iigado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeialateral de um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina,são seqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componentecarboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença deambas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio deglicosilação potencial. Glicosilação O-Iigado refere-se à conexão de um dosaçúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido,mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisinapodem também ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo éconvenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, talcomo aquela que contém um ou mais das seqüências de tripeptídeos descritasacima (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feitapor adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina àseqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc1 o carboidratoconectado a este pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com umaestrutura de carboidrato madura que é desprovida de fucose conectada a umaregião Fc do anticorpo estão descritos no pedido de patente US 2003/0157108A1, Presta, L. Ver também patente US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko KogyoCo., Ltd). Anticorpos com uma N-acetilglucosamina dividida (GIcNAc) nocarboidrato conectado a uma região Fc do anticorpo estão referidos nodocumento WO 03/011878, Jean-Mairet et ai e patente US 6.602.684 Umanaet al. Anticorpos com pelo menos um resíduo galactose no oligossacarídeoconectado a uma região Fc do anticorpo estão relatados no documento WO97/30087, Patel et ai Ver, também, documento WO 98/58964 (Raju, S.) edocumento WO 99/22764 (Raju, S.) que relaciona anticorpos com carboidratoalterado inserido à região Fc deste.

Moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências variantesdo anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos natécnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento de umafonte natural (no caso de ocorrer seqüência variante de aminoácidonaturalmente) ou preparação por mutagênese de oligonucleotídeo mediada (ousítio-dirigida), mutagênese de PCR e mutagênese cassete de uma variantepreparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo.

Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com relaçãoà função efetora, por exemplo, para aumentar citotoxicidade mediada por céluladependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente decomplemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançado pela introdução deuma ou mais substituições em uma região Fc de um anticorpo.Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode ser introduzidona região Fc1 através disso permitindo formação de ponte bissulfeto entrecadeias nesta região. O anticorpo homodimérico dessa forma gerado pode termelhorado a capacidade de internalização e/ou aumento de morte celularmediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC). Ver Caron et ai, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J.Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumor aumentada podem também ser preparados usando-se interligantesheterobifuncionais como descrito em Wolff et al. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo que possui regiões Fc dupla podeser engenheirado e pode através disso ter aumento de capacidades de Iise decomplemento e de ADCC. Ver Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Documento WO 00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos comfunção ADCC melhorada na presença de células efetoras humanas, onde osanticorpos compreendem substituições de aminoácidos na região Fc regiondeste. Preferivelmente, o anticorpo com ADCC melhorada compreendesubstituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração deresíduos Eu). Preferivelmente, a região Fc alterada é uma região Fc IgGIhumana que compreende ou que consiste de substituições em uma, duas outrês destas posições.Anticorpos com ligação C1q alterada e/ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC) estão descritos no documento WO99/51642, patente US 6.194.551 B1, patente US 6.242.195B1, patente US6.528.624B1 e patente US 6.538.124 (Idusogie et aí.). Os anticorposcompreendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posiçõesdo aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 da região Fc destes.

Para aumentar a meia vida do soro do anticorpo, pode-seincorporar um epitopo de ligação do receptor de resgate no anticorpo(especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na patente US5.739.277, por exemplo. Como usado no presente, o termo "epitopo de ligaçãodo receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma moléculaIgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar invivo a meia vida do soro da molécula de IgG. Anticorpos com substituições emuma região Fc deste e aumento da meia vida do soro estão também descritosno documento WO 00/42072 (Presta, L.).

Anticorpos engenheirados com três ou mais (preferivelmentequatro) sítios de ligação de antígeno funcionais estão também contemplados(pedido de patente US 2002/0004587 A1, Miller et ai).

V. Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas dos anticorpos usados de acordo com apresente invenção são preparadas para armazenamento pela mistura doantagonista ou anticorpo que tem o grau desejado de purificação com veículosopcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes,(Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), naforma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis,excipientes ou estabilizantes não tóxicos para receptores nas dosagens econcentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, eoutros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina;conservantes (tal como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto dehexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ouálcool benzil; alcila parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol;resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo pesomolecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tais comosoro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos taiscomo polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina,arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratosincluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA;açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais decontra íons tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexoproteína Zn); e/ou surfactantes não-iônicos tais como TWEEN™,PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

Formulações de anticorpo anti-CD20 exemplares estão descritasno documento WO 1998/56418. Esta publicação descreve uma formulaçãolíquida multidose que compreende 40 mg/ml de rituximab, 25 mM de acetato,150 mM de trealose, 0,9% de álcool benzílico, 0,02% de polissorbato 20 em pH5,0 que tem uma vida mínima de armazenamento em prateleira de dois anos a2-8°C. Outra formulação de anticorpo anti-CD20 de interesse compreende10mg/ml de rituximab em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de diidratocitrato de sódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e água estéril para injeção, pH 6,5.

Formulações Iiofilizadas adaptadas para administraçãosubcutânea estão descritas na patente US 6.267.958 (Andya et.al). Taisformulações Iiofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequadopara uma alta concentração de proteína e a formulação reconstituída pode seradministrada subcutaneamente para o sujeito a ser tratado no presente.

Formas cristalizadas do anticorpo são também contempladas.Ver, por exemplo, patente US 2002/136719A1 (Shenoy et al.)A formulação no presente pode também conter mais que umcomposto ativo como necessário para a indicação específica sendo tratada,preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetemcontrariamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável para tambémfornecer um segundo medicamento, tais como aqueles discutidos na Seção Ilde Tratamento acima. O tipo e quantidades efetivas de tais medicamentosdependem, por exemplo, da quantidade de anticorpo presente na formulação, otipo de AD ou demência sendo tratada, e parâmetros clínicos dos sujeitos.Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotas deadministração como usadas anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagensempregadas até aqui.

Os ingredientes ativos podem também ser colocados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou porpolimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulasde gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, emsistemas de distribuição coloidal de droga (por exemplo, lipossomos,microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ouem macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em RemingtorísPharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas.Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizessemipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo,cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes oumicrocápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluempoliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), oupoli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável,copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRONDEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácidoglicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico.

Embora a barreira sangüínea do cérebro em AD ou demência possaser rompida ou alterada em sua permeabilidade ou transporte, agentes ou métodosque aumentam a permeabilidade e/ou transporte terapêutico através desta podemser formulados com o anticorpo. Por exemplo, vetores lipídicos tais comoprocarbazina, podem ser usados para permeabilizar a barreira sangüínea docérebro, e/ou transportar terapêuticos para o cérebro. Imunolipossomos, Iipossomosdirigidos a anticorpos, e complexos lipofílicos biomoleculares podem também serusados como veículos através da barreira sangüínea do cérebro. Estespreferivelmente incluem ácidos graxos tais como as séries Omega-3 ou lipídeosderivados destas séries. Adicionalmente moléculas lipofílicas incluindo, mas nãolimitando a: outros ácidos graxos, lisofosfolipídeos, diacil fosfolipídeos, diacilgliceróis, colesterol, esteróides, incluindo aqueles que produzem gruposhidrocarbono poliinsaturados de 18-46 átomos de carbono. Adicionalmente, podemser usados biopolímeros. Estes incluem, mas não são limitados a: aminoácidos poli-alfa, soro de albumina humano ou agentes que se ligam e se conectam à albuminahumana, aminodextrano e caseína. Preferivelmente tais veículos possuembiocompatibilidade apropriada e farmacocinética para uso como um sistema deentrega, ver, por exemplo, patente US 5.716.614. Outro exemplo de um agente quepode aumentar a permeabilidade da barreira sangüínea do cérebro é um anticorporeceptor transferina. O receptor transferina é detectável em células endoteliaiscapilares do cérebro. Alguns exemplos de tais anticorpos incluem: B3/25, OKT-9,OX-26, TÍ6/14, L5.1, 5E-9. T58/30 e R17217, ver patente US 5.182.107.Adicionalmente, a barreira sangüínea do cérebro pode ser rompida osmoticamente.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivodevem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através demembrana de filtração estéril.VI. Artigos De Fabricação

Em outra realização da invenção, são fornecidos artigos defabricação que contêm materiais úteis para o tratamento de AD ou demênciadescrita acima. Preferivelmente, o artigo de fabricação compreende (a) umrecipiente que compreende uma composição que compreende um antagonistaantígeno de superfície de célula B (por exemplo, um anticorpo CD20) e um umveículo ou diluente farmaceuticamente aceitável no recipiente, e (b) uma bulacom instruções para administrar a composição ao sujeito com AD ou demência.

O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo oubula neste ou associado a este. Recipientes adequados incluem, por exemplo,garrafas, frascos, seringas, etc. Os recepientes podem ser formados de umavariedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente inclui oucontém uma composição que é eficaz para tratar AD ou demência e pode teruma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa desolução intravenosa ou um frasco que possui uma rolha perfurável por umaagulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição éo anticorpo. O rótulo ou bula indicam que a composição é usada para tratar ADou demência de um sujeito que sofre desta, com guias específicos comrespeito às quantidades e intervalos de dosagem do anticorpo e qualquer outromedicamento sendo fornecido. O artigo de fabricação pode, além disso,compreender um segundo recipiente que compreende um tampão diluentefarmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção(BWFI), fosfato salino tamponado, solução de Ringer e/ou solução de dextrose.O artigo de fabricação pode, além disso, incluir outros materiais desejáveis apartir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões,diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Opcionalmente, o artigo de fabricação no presente tambémcompreende um segundo recipiente no qual é incluído um agente exceto oanticorpo para tratamento e também compreende instruções para tratamentodo mamífero com tal agente, tais segundo medicamentos são discutidos naSeção II de Tratamento acima.

Detalhes adicionais da invenção estão ilustrados pelos seguintesExemplos não limitantes. As divulgações de todas as citações na especificaçãosão expressamente incorporadas ao presente como referência.

Exemplo 1

Tratamento De Doença De Alzheimer Branda-Moderada

Um sujeito com AD branda-moderada é tratado com um anticorpoCD20 neste exemplo.

Sujeitos com 50-80 anos, homens e mulheres, com doença deAlzheimer como determinado pelo critério NINCDS/ADRDA (McKhann et ai"Clinicai diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA WorkGroup under the auspices of Department of Health and Human Services TaskForce on Alzheimer's Disease". Neurology 34, 939-944 (1984)) serão tratadosno presente. Tais sujeitos terão AD branda-moderada como determinadousando-se o Mini-Exame do Estado Mental (MMSE), por exemplo, a pontuaçãoMMSE pode ser na faixa de 16 a 24. Sujeitos estão preferivelmente com asmedicações de tratamento padrão (isto é, inibidores de acetilcolinesterase)para AD por 3 meses antes da terapia com o anticorpo CD20. Além disso, ossujeitos terão acuidade visual e de audição para permitir testesneuropsicológicos.

Rituximab, disponível comercialmente pela Genentech, éformulado para administração IV como um produto estéril em 9,0 mg/ml decloreto de sódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80, 7,35 mg/ml de citrato de sódiodiidrato, e Água Estéril para Injeção (ph 6,5). Alternativamente a formulaçãoque compreende 2H7.v16 humanizado intacto ou 2h7.v511 humanizado intactoé administrada.O primeiro curso de tratamento irá consistir de 1 dose de 1 gintravenosa (IV) de anticorpo CD20 administrada nos Dias 1 e 15. Sujeitos irãoreceber acetaminofeno (1 g) e HCL de difenildramina (50 mg) por boca, 30-60minutos antes do início de cada infusão.

Cursos subseqüentes de tratamento serão administrados cominício na Semana 24 (Dia 169), Semana 48 (Dia 337), e Semana 72 (Dia 505).A segunda infusão dos cursos subseqüentes de tratamento serão de 14 + 1 diaapós a primeira infusão.

A administração do anticorpo CD20 como descrito no presente iráresultar na manutenção da função cognitiva, progressão lenta da doença,gerenciamento dos problemas comportamentais associados com a doença,desaceleração da perda das habilidades de vida diária, redução nos níveis deauto-anticorpos ou BRA, e/ou redução na circulação de células B CD20positivo. Por exemplo, a administração do anticorpo CD20 pode resultar napontuação MMSE, mantendo a mesma ou decréscimo de < 4 pontos (em ADbranda-moderada não tratada, e o declínio esperado na pontuação MMSE é de2-4 pontos por ano). Tal melhora no resultado será superior àquele alcançadocom as medicações de tratamento padrão sozinho.

Exemplo 2

tratamento de doença de alzheimer moderada-severa

Este exemplo descreve terapia de AD moderada-severa, usando-se um anticorpo CD20. Sujeitos homens e mulheres, > 50-80 anos, com ADmoderada-severa são tratados neste exemplo. Tais sujeitos têm AD moderada-severa com uma pontuação maior ou igual a 4 no domínio de NPI deagitação/agressão. Sujeitos estiveram em uma dose estável de memantina porpelo menos 3 meses.

Rituximab, disponível comercialmente pela Genentech, éformulado para administração IV como um produto estéril em 9,0 mg/ml decloreto de sódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80, 7,35 mg/ml de citrato de sódiodiidrato, e Água Estéril para Injeção (ph 6,5). Alternativamente a formulaçãoque compreende 2H7.v16 humanizado intacto ou 2h7.v511 humanizado intactoé administrada.

O primeiro curso de tratamento irá consistir de 1 dose de 1 gintravenosa (IV) de anticorpo CD20 administrada nos Dias 1 e 15. Sujeitos irãoreceber acetaminofeno (1g) e HCL de difenildramina (50 mg) por boca, 30-60minutos antes do início de cada infusão.

Cursos subseqüentes de tratamento serão administrados cominício na Semana 24 (Dia 169), Semana 48 (Dia 337), e Semana 72 (Dia 505).A segunda infusão dos cursos subseqüentes de tratamento serão de 14 + 1 diaapós a primeira infusão.

A função pode ser avaliada dia-a-dia usando-se um inventário deAtividades De Vida Diária (ADL), que compreende uma bateria de questõescompreensivas de ADL usadas para medir as capacidades funcionais do sujeito.Cada item ADL é medido a partir do nível mais alto do desempenhoindependente à perda completa. O médico apresenta o inventário pela entrevistade um profissional de saúde familiarizado com o comportamento do sujeito.

O desempenho cognitivo pode ser avaliado usando-se uminstrumento multi-item validado para a avaliação da função cognitiva empacientes com demência moderada-severa. Por exemplo, o instrumento podeexaminar aspectos selecionados do desempenho cognitivo, incluindoelementos de atenção, orientação, linguagem, memória, habilidade visualespacial, construção, rotina e interação social. Por exemplo, a Bateria de DanoSevero (SIB) pode ser usada, com uma pontuação na faixa de 0 a 100, compontuações mais baixas indicando maior dano cognitivo.

A administração do anticorpo CD20 como descrito no presente iráresultar na manutenção da função cognitiva, progressão lenta da doença,gerenciamento dos problemas comportamentais associados com a doença,desaceleração da perda das habilidades de vida diária, redução nos níveis deauto-anticorpos ou BRA1 e/ou redução na circulação de células B CD20positivo. A administração do anticorpo CD20 irá resultar em uma pontuação deADL àquela alcançada com placebo, ou onde o anticorpo CD20 é combinadocom memantina, superior àquela alcançada com memantina sozinha.Listagem de Seqüência

<110> Martin E. Sanders

<120> MÉTODO PARA TRATAR DEMÊNCIA OU DOENÇA DE ALZHEIMER

<130> P2028R1

<141> 20-04-2006

<150> US 60/674,028<151> 22-04-2005

<160> 24

<210> 1<211> 107<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 1

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro35 40 45

Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser65 70 75

Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu95 100 105

Lys Arg

<210> 2<211> 107<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile95 100 105

Lys Arg

<210> 3<211> 108<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105

Ile Lys Arg

<210> 4<211> 10<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 4

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

5 10<210> 5<211> 7<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 5

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser

5

<210> 6<211> 9<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 6

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

5

<210> 7<211> 122<212> PRT

<213> Mus musculus

Pro Gly15

Phe Thr30

Gly Leu45

Ser Tyr60

Lys Ser75

Glu Asp90

Asn Ser105

Thr Val120

Ser Ser

<210> 8<211> 122<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 8

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg15 10

Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr20 25

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln35 40

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr50 55

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp65 70

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser80 85

Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser95 100

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val110 115Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser

<210> 9<211> 119<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu95 100 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210> 10<211> 10<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

5 10

<210> 11<211> 17<212> PRT

<213> Mus musculus<400> 11

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe15 10 15

Lys Gly

<210> 12<211> 13<212> PRT

<213> Mus musculus<4 00> 12

Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

5 10

<210> 13<211> 213<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile95 100 105Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

110 115 120

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

125 130 135

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

140 145 150

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

185 190 195

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

200 205 210

Gly Glu Cys

<210> 14<211> 452<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<4 00> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

320 325 330

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu425 430 435Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445 450

Gly Lys

<210> 15<211> 213<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90

Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile95 100 105

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser110 115 120

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu125 130 135

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp140 145 150

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln155 160 165

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu170 175 180

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val185 190 195

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg200 205 210

Gly Glu Cys<210> 16<211> 452<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300

Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn320 325 330

Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445 450

Gly Lys

<210> 17<211> 451<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285

Gly Val Glu Val His290

Tyr Asn Ser Thr Tyr305

Asn Ala Lys Thr Lys295

Arg Val Val Ser Val310

Pro Arg Glu Glu Gln300

Leu Thr Val Leu His315

Gln Asp Trp Leu Asn320

Lys Ala Leu Pro Ala335

Gly Lys Glu Tyr Lys325

Pro Ile Glu Lys Thr340

Cys Lys Val Ser Asn330

Ile Ser Lys Ala Lys345Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

380 385 390

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

440 445 450

Gly

<210> 18<211> 107<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp80 85 90

Ala Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile95 100 105

Lys Arg

<210> 19<211> 122<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser

<210> 20<211> 451<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45

Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr50 55 60

Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg95 100 105

Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val110 115 120

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro125 130 135

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu140 145 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser155 160 165

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln170 175 180

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser185 190 195

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys200 205 210

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys215 220 225

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln290 295 300

Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His305 310 315

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn320 325 330

Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys335 340 345

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg350 355 360

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys365 370 375

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly380 385 390Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser395 400 405

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser410 415 420

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu425 430 435

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro440 445 450

Gly

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 9

<223> Xaa é M ou L<400> 21

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His

5 10

<210> 22<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 4

<223> Xaa é S ou A<400> 22

Gln Gln Trp Xaa Phe Asn Pro Pro Thr

5

<210> 23<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 8

<223> Xaa é D ou A<400> 23

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe1 5 10 15

Lys Gly

<210> 24<211> 13<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência é Sintetizada

<220><221> Xaa<222> 6

<223> Xaa é Ν, A, Y, W ou D

<220><221> Xaa<222> 7

<223> Xaa é S ou R

<400> 24

Val Val Tyr Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

5 10

Claims (49)

1. MÉTODO PARA TRATAR DOENÇA DE ALZHEIMER emum sujeito caracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticorpoCD20 nu em uma quantidade efetiva para tratar doença de Alzheimer.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o sujeito não está sofrendo de uma malignidade de célula B.

3. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que o sujeito não possui uma doença auto-imune,exceto doença de Alzheimer.

4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui doença de Alzheimer branda-mòderada.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente administrar um inibidor decolinesterase ao sujeito.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que inibidor de colinesterase é selecionado do grupo que consistede galantamina, rivastigmina e donepezil.

7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui doença de Alzheimer branda-severa.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente administrar um antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA) ao sujeito.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o antagonista de NMDA é memantina.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivinidicações 1 a 9,caracterizado pelo fato de que o sujeito possui um nível de auto-anticorpo atípico.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o auto-anticorpo é um anticorpo para beta-amilóide,cardiolipina, tubulina, proteína ácida fibrilar glial, proteína dos neurofilamentos(NFL), gangliosídeo, proteína do citoesqueleto, proteína básica da mielina(MBP), serotonina, dopamina, fator de crescimento do nervo (NGF),presenilina, amilóide beta-peptídeo (Abeta), receptor para produtos finais deglicação avançada (RAGE) ou anticorpo reativo do cérebro (BRA).

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11,caracterizado pelo fato de compreede ainda administrar um segundomedicamento ao sujeito em uma quantidade efetiva para tratar doença deAlzheimer, em que o anticorpo CD20 é um primeiro medicamento.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o segundo medicamento é selecionado do grupo que consisteem inibidor de colinesterase, galantamina, rivastigmina, rivastigmina em adesivotransdérmico, donepezil, tacrina, antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA)1memantina, liberação de NGF em vírus associado a adeno, CERE-10, beta-bloqueador, antipsicótico, precursor de acetilcolina, agonista nicotínico oumuscarínico, anticorpo anti-amilóide beta; anticorpo anti-NGF, RA624, vacina,vacina amilóide humana, agente que bloqueia a atividade secretases beta ougama envolvidas na formação de amilóide, terapia anti-amilóide, serotonina,norepinefrina, somatostatina, agente que interfere na conversão de APP paraamilóide-beta ou na formação de placas senis e tranças neurofibrilares,antagonista da enzima de clivagem da proteína precursora do sítio amilóide beta,antagonista de beta-secretase (BACE), antagonista de BASE1, antagonista deBASE2, antagonista de gama-secretase, antagonista de presenilina-1 (PSEN-1);antagonista de presenilina-2 (PSEN-2), antagonista APO-E4, antidepressivos,anticonvulsivantes, inibidor de reabsorção de serotonina, sertralina, trazodona,divalproex, gabapentina, risperidona, olanzapina, quetiapina, tioridazina, drogaou estatina para baixar colesterol, HMG-CoA redutase, sinvastatina, agenteimunomodulatório, antioxidante, vitamina E1 óleo de peixe, ácido alfa lipólico,caroteno, nicotina, extrato de ginkgo, selegilina, mesilato ergolóide, estrógeno,agente anti-inflamatório, droga anti-inflamatória não esteroidal (NSAID)1 aspirina,ibuprofeno, inibidor de COX-2, rofecoxib, naproxeno, celecoxib, naproxeno,ginkgo biloba, PPI-1019, huperzina A, vitamina tal como folato, B6, B12, vitaminaC, vitamina E, selênio, antagonista do receptor GABA (B)1 SGS742, NC-758 , Ο-Ι 073, FK962, curcumin, ONO-2506PO, mesilato de rasagilina, valproato,SR57746A, NS 2330; MPC-7869, interferon, interferon alfa, fragmento deanticorpo de cadeia leve amilóide beta proteolítica, agente citotóxico, agentequimioterápico, agente imunossupressor, inibidor de TNF-alfa, droga anti-reumática modificadora de doença (DMARD)1 antagonista ou anticorpo integrina,corticosteróide e derivado hipoxantina purina.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo fato de que o sujeito nunca foi previamente tratado com umanticorpo CD20.

15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanoou humanizado.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende rituximab.

17. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2H7 humanizado.

18. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2F2 (huMax-CD20).

19. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 18,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado de formaintravenosa, subcutânea ou intratecal.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é administrado de forma intravenosa.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que compreende administrar o anticorpo como uma dose na faixade aproximadamente 200 mg a 2000 mg em uma freqüência deaproximadamente uma a quatro doses dentro de um período deaproximadamente um mês.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a dose está na faixa de aproximadamente 500 mg a 1500 mg.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a dose está na faixa de aproximadamente 750 mg a 1200 mg.

24. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 23,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em uma ou duas doses.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que uma ou duas doses são administradas dentro de um períodode aproximadamente 2 a 3 semanas.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo CD20 é o único medicamento administrado aosujeito para tratar doença de Alzheimer.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que essencialmente consiste na administração do anticorpo CD20ao sujeito para tratar AD e um segundo medicamento selecionado do grupoque consiste de inibidor de colinesterase e N-metil D-aspartato (NMDA).

28. MÉTODO PARA TRATAR DEMÊNCIA em um sujeitocaracterizado pelo fato de que compreende administrar um anticorpo CD20 nuao sujeito em uma quantidade efetiva para tratar a demência.

29. ARTIGO DE FABRICAÇÃO, caracterizado pelo fato de quecompreende:(a) um recipiente que compreende em seu interior um anticorpoCD20 nu; e(b) uma bula com instruções para tratar doença de Alzheimer oudemência em um sujeito.

30. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de compreende ainda outro recipiente que compreende em seuinterior um segundo medicamento, em que o anticorpo CD20 é um primeiromedicamento, e também compreende instruções na bula para tratar o sujeitocom o segundo medicamento.

31. ARTIGO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o segundo medicamento é um inibidor de colinesterase ouantagonista de N-metil D-aspartato (NMDA).

32. USO DE UM ANTICORPO CD20, caracterizado pelo fatode ser na fabricação de um medicamento para tratar doença de Alzheimer.

33. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de ser na fabricação de um medicamento para tratar doença de Alzheimerbranda-moderada.

34. USO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelofato de que o medicamento compreende ainda um inibidor de colinesterase.

35. USO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelofato de que inibidor de colinesterase é selecionado do grupo que consiste degalantamina, rivastigmina e donepezil.

36. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de ser na fabricação de um medicamento para tratar doença de Alzheimerbranda-severa.

37. USO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelofato de que o medicamento compreende ainda um antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA).

38. USO1 de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelofato de que o antagonista de NMDA é memantina.

39. USO, de acordo com uma das reivinidicações 32 a 38,caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamenro para tratardoença de Alzheimer em que o nível de auto-anticorpo é atípico.

40. USO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelofato de que o auto-anticorpo é um anticorpo para beta-amilóide, cardiolipina,tubulina, proteína ácida fibrilar glial, proteína dos neurofilamentos (NFL),gangliosídeo, proteína do citoesqueleto, proteína básica da mielina (MBP),serotonina, dopamina, fator de crescimento do nervo (NGF), presenilina,amilóide beta-peptídeo (Abeta), receptor para produtos finais de glicaçãoavançada (RAGE) ou anticorpo reativo do cérebro (BRA).

41. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 40,caracterizado pelo fato de compreede ainda a combinação a um segundomedicamento para tratar doença de Alzheimer, em que o anticorpo CD20 é umprimeiro medicamento.

42. USO, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelofato de que o segundo medicamento é selecionado do grupo que consiste eminibidor de colihesterase, galantamina, rivastigmina, rivastigmina em adesivotransdérmico, donepezil, tacrina, antagonista de N-metil D-aspartato (NMDA),memantina, liberação de NGF em vírus associado a adeno, CERE-10, beta-bloqueador, antipsicótico, precursor de acetilcolina, agonista nicotínico oumuscarínico, anticorpo anti-amilóide beta; anticorpo anti-NGF, RA624, vacina,vacina amilóide humana, agente que bloqueia a atividade secretases beta ougama envolvidas na formação de amilóide, terapia anti-amilóide, serotonina,norepinefrina, somatostatina, agente que interfere na conversão de APP paraamilóide-beta ou na formação de placas senis e tranças neurofibrilares,antagonista da enzima de clivagem da proteína precursora do sítio amilóidebeta, antagonista de beta-secretase (BACE)1 antagonista de BASE1,antagonista de BASE2, antagonista de gama-secretase, antagonista depresenilina-1 (PSEN-1); antagonista de presenilina-2 (PSEN-2), antagonistaAPO-E4, antidepressivos, anticonvulsivantes, inibidor de reabsorção deserotonina, sertralina, trazodona, divalproex, gabapentina, risperidona,olanzapina, quetiapina, tioridazina, droga ou estatina para baixar colesterol,HMG-CoA redutase, sinvastatina, agente imunomodulatório, antioxidante,vitamina E, óleo de peixe, ácido alfa lipólico, caroteno, nicotina, extrato deginkgo, selegilina, mesilato ergolóide, estrógeno, agente anti-inflamatório,droga anti-inflamatória não esteroidal (NSAID), aspirina, ibuprofeno, inibidor deCOX-2, rofecoxib, naproxeno, celecoxib, naproxeno, ginkgo biloba, PPI-1019,huperzina A, vitamina tal como folato, B6, B12, vitamina C, vitamina E, selênio,antagonista do receptor GABA (B)1 SGS742, NC-758 , C-1073, FK962,curcumin, ONO-2506PO, mesilato de rasagilina, valproato, SR57746A, NS 2330; MPC-7869, interferon, interferon alfa, fragmento de anticorpo de cadeialeve amilóide beta proteolítica, agente citotóxico, agente quimioterápico, agenteimunossupressor, inibidor de TNF-alfa, droga anti-reumática modificadora dedoença (DMARD), antagonista ou anticorpo integrina, corticosteróide ederivado hipoxantina purina.

43. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 42,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanoou humanizado.

44. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 43,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende rituximab.

45. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 44,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2H7 humanizado.

46. USO, de acordo com uma das reivindicações 32 a 45,caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende 2F2 (huMax-CD20).

47. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que é o único usado na fabricação do medicamento para tratar doençade Alzheimer.

48. USO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de ser essencialmente para tratar AD em combinação com um segundomedicamento selecionado do grupo que consiste de inibidor de colinesterase eN-metil D-aspartato (NMDA).

49. USO DE UM ANTICORPO CD20 NU1 caracterizado pelofato de na fabricação de um medicamento para tratar demência.