BRPI0613417A2 - inibidor de peptìdeo identificado através de um processo para a identificação de peptìdeos inibidores do dobramento de uma proteìna de n aminoácidos de comprimento l - Google Patents

Abstract

INIBIDOR DE PEPTìDEO IDENTIFICADO ATRAVéS DE UM PROCESSO PARA A IDENTIFICAçãO DE PEPTìDEOS INIBIDORES DO DOBRAMENTO DE UMA PROTEìNA DE N AMINOáCIDOS DE COMPRIMENTO L. A presente invenção refere-se a um método para a identificação de peptídeos inibidores do dobramento e, portanto, da(s) função (ões) biológica(s) de proteínas, que não cria(m) resistência. Em particular, a invenção refere-se a inibidores de enzimas virais com uma elevada taxa de mutação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIDOR DEPEPTÍDEO IDENTIFICADO ATRAVÉS DE UM PROCESSO PARA A I-DENTIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS INIBIDORES DO DOBRAMENTO DEUMA PROTEÍNA DE N AMINOÁCIDOS DE COMPRIMENTO L".

A presente invenção refere-se a um método para a identificaçãode inibidores de dobramento e, portanto, da(s) função (ões) biológica(s) deproteínas e, mais em particular, de inibidores peptídicos de dobramento dasproteínas dobráveis que são altamente seletivas e que não criam resistência.

Antecedentes

O fato das proteínas desempenharem um papel fisiológico pri-mário é bastante conhecido na técnica. Muitos esforços foram feitos paraempregar proteínas como agentes terapêuticos, como catalisadores, e tam-bém como materiais apropriados que possuem propriedades específicas.

Muitas doenças provêm de mutações em proteínas que fazem-nas perder funcionalidade. Em alguns casos, por exemplo, a atividade catalí-tica exercida por proteínas pode ser prejudicada, resultando assim em viametabólica alterada (por exemplo, fenilcetonuria). Em alguns outros casos,propriedades estruturais das proteínas elas próprias podem ser afetadas demodo a levar a uma perda de funcionalidade física (por exemplo, distrofiamuscular). A doença de Creutzfeld - Jacob e outras encefalopatias transmis-síveis podem resultar de modificações estruturais de proteínas, modificandosua forma e formando polímeros [1]. Similarmente, doenças também podemresultar de amiloidose, onde proteínas gradualmente se convertem em ca-deias longas de laminados beta polimerizados e precipitam para formar fibri-las [2],

Sabe-se que muitos cânceres ocorrem devido a mutações deproteínas. Neste contexto, sabe-se que aproximadamente 50% dos câncereshumanos são causados por mutações no fator P53 supressor de tumor queprimariamente reduz sua estabilidade [3].

Enzimas e receptores são os alvos usuais de fármacos, tantopara restaurar a função ou para destruir agentes infecciosos ou cânceres. Oalvo final da ciência das proteinases é o de ser capaz de predizer ambos aestrutura e atividade de proteínas a partir de sua seqüência de amino-ácido(o denominado "problema de dobramento"), bem como de inibir esta ativida-de [4,5]. Com esta conquista é possível projetar e sintetizar novos catalisa-dores, materiais e agentes farmacologicamente ativos, em particular medi-camentos apropriados para inibir a atividade enzimática.

As propriedades principais que esses medicamentos podemmostrar são especificidade (por exemplo, não ser tóxicos) e eficiência. Con-vencionalmente, isto pode ser obtido tanto por capeamento do local ativo daenzima (inibição competitiva) ou através de ligação em alguma outra regi-ão/partes da proteína provocando, portanto, mudanças estruturais que tor-nam a enzima inapropriada para ligação ao substrato (inibição aloestérica).

Para atingir quaisquer desses objetivos, a ligação entre o Iigantee a proteína tem que ser otimizada. Este é um problema que demanda muitotempo, devido ao fato de ser necessário calcular não somente as energiasentre enzimas e substrato ou outros ligantes, mas também suas energias deiteração com água e a mudança da entropia durante a reação. As energiasde ligação são as menores diferenças entre dois grandes números.

Uma outra complicação surge no caso do alvo ser uma proteínaviral que apresenta uma alta taxa de mutação, comumente associada com oconhecido desenvolvimento de resistência. Portanto, é de crucial importânciaplanejar novas estratégias que permitam um projeto mais eficiente e econô-mico de inibidores de proteína do que os projetos conhecidos centrados emlocais ativos, bem como o de gerar estratégias com o objetivo de bloquear aiteração entre enzimas e seu substrato que não geram resistência.

Um série de estudos experimentais [6-8, 38, 41] e teóricos [9,10]sugere que proteínas globulares, de domínio simples (por exemplo, proteí-nas de comprimento N compreendidas entre 60 e 150 amino-ácidos [28]) sedobram através de um mecanismo hierárquico, onde unidades pequenascompostas de alguns amino-ácidos consecutivos constroem unidades maio-res que, por sua vez, constroem unidades ainda maiores, que eventualmenteenvolvem toda a proteína.

Estudos experimentais de dobramento e da associação dossegmentos de cadeia de amino-ácidos, antes da formação nativa, identifica-ram estruturas parcialmente semelhantes às nativas entre os eventos dedobra iniciais [39]. Esses elementos estruturais são comumente referidoscomo domínios de dobra ou foldons [9]. A definição operacional dessas uni-dades é: "a estrutura tridimensional das estruturas observáveis semelhantesàs nativas, nas quais a proteína primeiramente é dobrada, partindo de umestado desnaturado". Mutações dentro daqueles domínios estruturais podemlimitargravemente a formação de uma proteína propriamente dobrada [10].

Modelos de cálculo [11,12] mostraram que a dobra de proteínaspequenas, monoméricas, de domínio único, prosseguem a partir de umaconformação não dobrada, seguido por uma sucessão hierárquica de even-tos: 1) formação de algumas estruturas (2-4) locais elementares (comumentereferidas como LES) contendo no total cerca de 20% até cerca de 30% dosamino-ácidos da proteína (e, portanto, entre 5% e 15% de cada um dos ami-no-ácidos da proteína), estabilizada por alguns amino-ácidos hidrófobos("quente") interagindo fortemente (<10% dos amino-ácidos da proteína) quese situam próximo da cadeia de polipeptídeos; 2) ancoragem de LES no nú-cleo de dobra (pós crítico) [13], isto é, formação do conjunto mínimo de con-tatos nativos que traz o sistema acima da principal barreira de energia livrede todo o processo de dobramento; 3) relaxamento dos amino-ácidos rema-nescentes na estrutura nativa brevemente depois da formação do núcleo dedobramento. Os locais "quentes" que estabilizam LES são consideradosmuito sensíveis a mutações de ponto (não-conservadoras). Já que a maiorparte da energia de estabilização de proteína está concentrada nesses Io-cais, a possibilidade de mutação de um ou dois deles tem uma grande pro-babilidade de desestabilizar a conformação dobrada. É natural identificar odomínio de dobra do parágrafo anterior ao LES dos modelos de cálculo.

O mesmo modelo indica que é possível desestabilizar a confor-mação nativa de uma proteína fazendo uso de peptídeos (que devemoschamar p-LES) cuja seqüência é idêntica àquela da LES das proteínas [14].

Há duas importantes vantagens desses inibidores de dobramen-to no que se refere aos convencionais. Primeiro, sua estrutura molecular ésugerida diretamente pela proteína alvo. Não é preciso projetar ou otimizarnada, apenas encontre a LES da proteína alvo. Por que o desenho de LESfoi realizado por evolução através de uma miríade de gerações do vírus (oudo organismo com expressa a proteína), para reconhecer e interagir forte-mente uma com a outra de modo a fazer com que a proteína dobre rápidobem como a evitar a agregação com outras proteínas, é de se esperar queos inibidores resultantes projetem pouca toxidade. Em segundo lugar, é pou-co provável que ela possa se tornar não-operante através dos mutantes deescape. De fato, p-LES se liga ao LES complementar da proteína alvo, se-gundo o mesmo paradigma que estabiliza o núcleo de dobra, estabilizaçãoque é controlada pelos amino-ácidos "quentes" da proteína [15,16].

Conseqüentemente, mutantes de escape devem conter muta-ções naqueles amino-ácidos "quentes" que são essenciais para a estabiliza-ção e ancoragem de LES. Tais mutações têm, como regra, a desnaturaçãoda proteína. Em outras palavras, mutações estruturais que não evitam que aproteína dobre a seu estado natural, biologicamente ativo, não evitam nem aancoragem nem a ação inibidora das estruturas elementares locais, no nú-cleo de dobra, nem a ação inibidora de p-LES. Mutações que evitam a for-mação do núcleo de dobra, tanto a desestabilização de LES ou sua ancora-gem podem, em princípio, evitar a ação de p-LES, mas não serão expressasdevido à incapacidade da proteína modificada dobrar.Sumário da Invenção

Além disso, a invenção refere-se a um método simples, econô-mico e (essencialmente) livre de erro para individualizar a LES das proteínasglobulares de domínio único (o comprimento típico dessas proteínas sendode 60 até 150). Conseqüentemente, ela refere-se à individualização de inibi-dores altamente específicos, fortemente suficientes para o dobramento des-sas proteínas (peptídeos p-LES) que criam resistência apenas muito impro-vavelmente.

Devido a proteínas globulares, de domínio múltiplo, serem, comouma regra, construídas como uma combinação das unidades das seqüên-cias (domínios, blocos [17-24], ou módulos [25,26]) de comprimento caracte-rístico de cerca de 125 aminoácidos para eucariotas e cerca de 150 amino-ácidos para procariotas [27,28]), unidades de seqüência que dobram comoproteínas de domínio único, a invenção também refere-se a um método deidentificação de inibidores de peptídeo das proteínas de dobramento semlevar em conta seu tamanho ou modularidade, bem como a cada um dosmonômeros de multímeros de três estados [29,30].

A seguir foi explicada a invenção dentro do quadro das unidadesde seqüência de uma proteína globular ou de um monômero pertencendo aum multímero de três estados.

Objeto da Invenção

A presente invenção, portanto, refere-se a um método para aidentificação de inibidores peptídicos de dobramento e, portanto, à atividadebiológica específica [4] de proteínas sem induzir mutantes de escape.

É, portanto, um primeiro objeto da presente invenção um métodopara a identificação de peptídeos inibidores de dobramento de uma proteínacontendo N amino-ácidos, cujo método compreende:

a) projetar M peptídeos de comprimento L, cada qual apresentando uma se-qüência idêntica a um segmento da proteína alvo, de modo a cobrir comple-tamente a proteína, permitindo alguma quantidade de sobreposição entre osdiferentes peptídeos. Tipicamente L contém cerca de 10 amino-ácidos, e depreferência varia de cerca de 4 até cerca de 20. Conseqüentemente, M variade cerca de 5 até cerca de 50, tipicamente sendo cerca de 20.

b) preparar os peptídeos M projetados tanto singularmente ou em grupos;

c) preparar soluções M cada qual contendo a proteína sob consideração eum dos peptídeos em uma proporção molar apropriada e incubar cada umadas soluções a 37°C.

d) avaliar a eficácia inibidora do peptídeo nas soluções acima ou o grau dedesdobramento ou ambos, por meio de técnicas padrão, de modo a identifi-car o peptídeo dotado de uma atividade inibidora, ou mesmo dotado da maisalta atividade inibidora, em relação à proteína.

O método da presente invenção é particularmente vantajoso jáque ele permite identificar de uma maneira confiável, razoavelmente simples,o peptídeo, entre os peptídeos M propositadamente projetados e prepara-dos, que possui uma atividade inibidora, ou mesmo a maior atividade inibido-ra, em relação à proteína sob consideração.

Descrição detalhada da Invenção

De acordo com a presente invenção, a menos que fornecido deoutro modo, com o termo "peptídeo(s)" quer-se dizer cadeia(s) peptídica(s)curta(s) compreendendo, tipicamente, uma ordem de dez amino-ácidos. Depreferência, o peptídeo compreende L amino-ácidos, com L variando de cer-ca de 4 até cerca de 20. A seqüência do(s) "peptídeo(s)", a menos que defi-nido de outro modo, coincide com um segmento de igual comprimento daproteína.

Além disso, foi pretendido por "inibidor peptídico" denominar umpeptídeo que bloqueia o dobramento da proteína alvo e, além disso, suafunção biológica específica. Isto é, o inibidor tem uma seqüência essencial-mente idêntica àquela de uma LES da proteína e pode, portanto, ser tam-bém denominada uma p-LES [14].

Por "LES' ( Estrutura Elementar Local) foi pretendido denominaras primeiras estruturas nativas formadas muito anteriormente no processode dobramento [11, 12] (também denominado foldons ou domínio de dobra-mento) na literatura [9, 10, 38]). Essas estruturas são estabilizadas por forteiteração, em regra com amino-ácidos hidrófobos, altamente conservados("quentes"). Pode-se distinguir entre LES bem estruturada, a denominadaLES fechada, e menos estruturada, a denominada LES aberta [15]. Este úl-timo tipo de LES não apresenta, quando isolado no solvente, qualquer conta-to nativo (importante). Pelo contrário, LES fechadas, quando isoladas apre-sentam contatos nativos que desempenham um importante papel tambémno núcleo de dobramento (pós crítico) [13].

Por núcleo "FN" de dobramento (pós-crítico) foi pretendido de-nominar o conjunto mínimo de contatos nativos necessários para sobrepujara principal barreira de energia livre encontrada pela proteína em todo o pro-cesso de dobramento [13]. Uma grande fração desses contatos surge daancoragem de LES. Este evento é essencialmente controlado pelo LES fe-chado. Por amino-ácidos "quentes" foi entendido amino-ácidos que desem-penham um papel central no dobramento de uma proteína. Mutação nãoconservativa desses aminoácidos leva, como uma regra, à desnaturação deproteína [16].

De acordo com a etapa (a) do presente método, juntamente comqualquer variante dele, M peptídeos de comprimento L podem, portanto, serassim projetados mostrando uma seqüência idêntica a um segmento da pro-teína sob consideração. Os valores de M e L são escolhidos de modo a co-brir toda a seqüência de amino-ácidos da proteína, permitindo também quealguma quantidade se sobreponha. Tipicamente L representa 10 amino-ácidos (correspondendo, para proteínas de domínio único de comprimentoN, a aproximadamente um décimo do número total de amino-ácidos N, istoé, L s N/10) e, de preferência, varia de cerca de 4 até cerca de 20. Conse-qüentemente, M varia de cerca de 5 até cerca de 50, tipicamente sendo decerca de 20.

Apenas como um exemplo explicativo não limitante, o presentemétodo pode fornecer a identificação de peptídeos possuindo atividade inibi-dora perante uma proteína, por exemplo compreendendo 120 amino-ácidos,projetando 19 peptídeos (por exemplo M é igual a 19) cada qual contendouma cadeia de amino-ácido de 12 amino-ácidos.

A partir do exposto acima, 19 peptídeos cada qual contendo umcomprimento de 12 amino-ácidos mostram uma seqüência idêntica para ori-ginar segmentos da proteína, e já que toda a seqüência de proteína tem queser coberta, é claro para aqueles com conhecimento na técnica que ocorre-rão peptídeos com segmentos sobrepostos (a sobreposição entre cada pep-tídeo consecutivo sendo neste exemplo particular de cerca de 50%).

Tipicamente, a etapa (a) do presente método pode fornecer porprojeto sistemático os peptídeos M dados iniciando pelo amino-ácido número1 e seguindo, de modo a cobrir progressivamente toda a proteína (permitin-do assim cerca de 50% até cerca de 70% de sobreposição entre os diferen-tes peptídeos; ver o exemplo 4 que se segue.

Alternativamente, os referidos peptídeos M podem ser projeta-dos iniciando dessas regiões que correspondem aos segmentos de proteínapróximos a nitrogênio e aos carbono terminais, bem como, ao centro da pro-teína, permitindo novamente uma sobreposição entre os diferentes peptídeos.

A Etapa (b) compreende a preparação dos peptídeos M de acor-do com métodos bastante conhecidos na técnica. Os referidos métodos po-dem incluir, como um exemplo, qualquer abordagem sintética conhecida pa-ra a síntese dos peptídeos ou, alternativamente, a possibilidade de levá-losdiretamente da proteína, cortando-os nos locais apropriados, por métodosconhecidos.

A Etapa (c) é realizada por dissolução de quaisquer dos peptí-deos preparados na etapa (b) juntamente com a proteína alvo em qualquersolvente apropriado. A proporção molar entre o peptídeo e a proteína podeser variada propriamente na faixa de 1:1 até 10:1 (peptídeo/proteína); depreferência, a concentração relativa de peptídeo/proteína é de 3 até 1. Assoluções assim obtidas são incubadas a cerca de 37°C por alguns minutos,por exemplo até 10 minutos.

Alternativamente, as etapas b) e c) podem ser substituídas porsimulações de computador onde é feito uso de modelos simplificados de pro-teínas (por exemplo, o modelo all-atom Gõ, o modelo C0 Gõ, etc. [33]) ligadoa uma amostra termodinâmica ou dinâmica simulada (por exemplo, algoritmode Monte Cario, Dinâmica de Newton, etc), para simular a evolução da pro-teína na presença de cada tipo de peptídeo ( partindo tanto de conformaçõesnão dobradas ou dobradas da proteína) e portanto determinando o grau denão dobramento da própria proteína na presença desses peptídeos.

Essas simulações podem fornecer informação não somente so-bre a seqüência dos inibidores, sendo idênticas a um segmento da proteína,mas também sobre a sua conformação nativa no solvente. Aquelas quemostram um elevado grau de estrutura e estabilidade são preferidas secomparado aos inibidores que mostram uma pequena estrutura e/ou grandeflutuações. Isto mais o fato de que inibidores altamente estruturados (corres-pondendo ao denominado estruturas elementares locais "fechadas" (LES),por exemplo segmentos de motivos que apresentam contatos nativos impor-tantes na estabilidade da proteína) são esperados que sejam mais específi-cos e, portanto, menos tóxicos do que outros menos estruturados, o deno-minado LES "aberto" [11,12,15]. A este respeito é válido notar que os mode-los de cálculo, que só consideram o átomo de Ca dos resíduos, enfatizam asdiferenças que existem entre esses dois tipos de LES.

Quando existe uma informação experimental sistemática con-cernente aos valores φ [4] associados a um grande número de locais da pro-teína, de modo a permitir uma determinação dos locais "mornos e "quentes"da proteína (por exemplo aqueles locais que desempenham um papel cen-tral no dobramento da proteína [16], os amino-ácidos correspondentes ocu-pando-os sendo altamente conservados), pode-se eventualmente ajustarlevemente o comprimento e o número de amino-ácidos iniciais e finais aolongo da proteína de modo a garantir que os inibidores de peptídeos incluamtodos os amino-ácidos quentes e a maioria, se não todos, os amino-ácidosmornos.

O processo de iteração pode ser sempre executado calculando-se os valores φ associados a um grande número de amino-ácidos diferentesda proteína alvo, fazendo uso de um software apropriado (ver o Exemplo 1seguinte). Uma vez que os novos inibidores tiverem sido projetados, tambémé possível testar sua eficiência através de ensaios, como pela etapa (d) acima.

De acordo com a etapa (d) do presente método da invenção, aeficiência inibidora do peptídeo ou o grau de desdobramento ou ambos, nassoluções acima, podem ser executadas de acordo com os métodos conven-cionais. Como um exemplo não limitante, ensaios espectrofotométricos, tes-tes de equilíbrio de sedimentação, dicroísmo circular ou técnicas de resso-nância nuclear magnética podem ser todos empregados e executados paradeterminar o efeito inibidor acima.

Igualmente, experimentos de absorção são conhecidos na técni-ca [4] para determinar a eficácia inibidora quando a proteína é uma enzima[4, 31].Como reportado anteriormente, uma vez observado um peptídeoque bloqueia eficientemente o dobramento da proteína, não é uma necessi-dade prioritária proceguir com o processo de checar as propriedades inibido-ras dos peptídeos remanescentes, e a busca e identificação podem ser ter-minados neste ponto.

Em outras palavras, o método da invenção pode ser aplicadopara identificar o peptídeo ótimo dotado de atividade inibidora máxima, entretodos aqueles peptídeos M sendo preparados e assim testados.

Alternativamente, como reportado acima, as diferentes soluçõesda etapa (C ) podem ser testadas em qualquer ordem, e todo o método podeser interrompido uma vez que um peptídeo contendo a atividade inibidoradesejada é encontrado, sem a necessidade de testar e assim preparar todasas soluções.

Como tal, de acordo com uma modalidade alternativa da presen-te invenção, a etapa (a) pode compreender o projeto de um peptídeo únicode comprimento variando de 4 até 20; a etapa (b) pode compreender a pre-paração do referido peptídeo; a etapa (c ) pode compreender a preparaçãode uma solução da proteína com o mesmo peptídeo; a etapa (d) pode com-preender a avaliação da atividade inibidora do peptídeo. Se é verificado quea eficácia inibidora do referido peptídeo é satisfatória, o método pode serterminado, já que ele se permite identificar facilmente o próprio inibidor depeptídeo. Pelo contrário, se não for satisfatório ou se de qualquer forma opeptídeo é desprovido de qualquer eficácia inibidora significativa, as etapasde (a) até (d) podem ser repetidas com outro peptídeo até a identificação doótimo.

Alguns peptídeos (1-4) que inibem o dobramento da proteína eque foi denominado p-LES, identificam os segmentos de amino-ácido da pro-teína que, no processo de dobramento, dão origem ao LES.

Porque uma proteína tem que estar, para satisfazer sua ativida-de biológica, na conformação nativa (dobrada), espera-se que p-LES tam-bém sejam inibidores eficientes, específicos, perduravelmente eficazes dasfunções da proteína.A p-LES deveria ser testada quanto à solubilidade no meio decultura, e pode ser modificada para reduzir sua hidrofobicidade, se necessário.

A modificação pode ocorrer, por exemplo, através de: 1) adiçãode um amino-ácido polar e/ou carregado; encurtamento da cadeia, isto é,afrouxando um ou dois amino-ácidos hidrófobos tanto nos terminais C ou N,ou ambos; 3) mutações conservadoras, isto é substituindo um amino-ácidohidrófobo por outro amino-ácido algo menos hidrófobo.

Em adição, como p-LES são peptídeos, eles também podem serportanto digeridos pelas células e/ou criar alergias.

Neste caso, p-LES pode ser empregado como guias de inibido-res de dobramento, correspondendo a suas moléculas miméticas, ou even-tualmente a peptídeos da mesma seqüência de amino-ácido sintetizada quefaz uso dos amino-ácidos D, bem como métodos conhecidos.

Vários aspectos e modalidade da presente invenção serão agoradescritos em maior detalhe por meio de exemplos, com referência a miméti-ca de peptídeos e solubilidade de p-LES.

Os referidos exemplos não são pretendidos como Iimitantes dapresente invenção, como será apreciado que modificações de detalhes dométodo podem ser aplicadas sem se afastar do âmbito da invenção.

Figuras:

figura 1: um modelo da estrutura cristalográfica de src SH3. Os (cinco) la-minados beta antiparalelos são representados como fitas em forma de setas(verde claro), enquanto alfa helix é evidenciado em cinza escuro;

figura 2: a probabilidade de distribuição do equilíbrio da ordem do parâmetroq definido como o número relativo de contatos nativos, calculado em trêsdiferentes temperaturas para a proteína SH3 sozinha. A proteína está naconformação nativa para valores q > 0,7 e no estado desnaturado para q <0,5. A temperatura T = 0,843 na qual o pico dos estados nativos e desnatu-rados têm a mesma área é a temperatura de dobramento;

figura 3: a probabilidade da distribuição de equilíbrio em T = 0,825 do outroparâmetro q para o sistema composto do domínio de proteína Src = SH3 etrês peptídeos com a mesma seqüência como um dos segmentos de proteí-na na caracterizados pelo primeiro e último aminoácido disposto no inset;figura 4: probabilidade de distribuição de equilíbrio do parâmetro de ordem qcalculado em T = 0,825 para o sistema composto do domínio de proteínaSrc-SH3 e três peptídeos com a mesma seqüência como um dos fragmentosde proteína caracterizado pelo primeiro e último aminoácido disposto no inset;

figura 5: a população do estado nativo em T = 0,825 para um sistema com-posto de domínio de proteína Src-SH3 e três peptídeos cuja seqüência éidêntica àquela do fragmento da proteína de comprimento 6 que inicia nolocal indicado na abscissa, normalizada no que se refere à população doestado nativo da proteína ela própria (pNsem"p"LES). Os peptídeos iniciam como segmento 1-6 e com o segmento 55-60, as sobreposições entre os diferen-tes peptídeos são de 67%. A linha é para guiar a vista. Os pontos abertosfornecem informação das propriedades inibidoras de peptídeos p-S'2 (= 18-28) e p-S'3 (- 36-42) obtido por ligeira modificação de dois dos peptídeos ori-ginais, a saber os peptídeos p-S2 (=21-27) e p-S3 ( = 35-40) (ver texto);figura 6: população do estado nativo do domínio da proteína Src SH3 (pon-tos abertos) em T = 0,825. Os resultados indicados para o valor 0 da abscis-sa correspondem à seqüência do tipo selvagem. Os outros resultados cor-respondem à proteína que carrega uma mutação nos locais 9, 30 (frio, C), 5,49 e 55 (morno, W), e 18, 26 (quente, Η). A população relativa do domínioproteína do estado nativo de Src SH3 em T = 0,825 na presença de três p-S3(35-40) é mostrado em termos de triângulos sólidos. As linhas devem guiar oolho. Os valores em locais de mutação diferentes correspondem à seqüênciado tipo selvagem da proteína que carrega a mutação indicada na abscissa;figura 7: a mudança AAG na energia livre com mutação do Src-SH3 calcu-lado fazendo uso de um modelo Gõ modificado. O valor de [AAG] e [AAG] +2σ também são mostrados. As larguras dos locais AAG > [AAG] + 2o (núme-ro 18, 26, 27 e 40) são denominados aminoácidos quentes, enquanto aque-les com [AAG] G < AAG [AAG] + 2σ (número 4, 5, 6, 28, 39, 41, 48, 50 e 55)qualificado como aminoácidos mornos. Cálculos sistemáticos e informaçãoexperimental indicam que locais de domínio simples"quente" e "morno", deproteínas monoglobulares, estão presentes nas proporções acima mencio-nadas (cf. [40] e refs.);

figura 8: o mesmo que a Figura 7 mas para os valores |Gu-n experimental-mente determinados através de engenharia de proteína [32]. Neste caso, oslocais 10, 20, 24 e 26 são locais quentes, enquanto os locais 5, 7, 18, 23, 38,41, 44, 48, 49 e 50 se qualificam como locais mornos;

figura 9: um modelo da conformação nativa do homodímero HIV-1-PR. Ca-da monômero contem 99 aa. Mostrados com diferentes níveis de cinza estãoos dois monômeros. No monômero exposto à direita possíveis candidatos deLES associados com este monômero são evidenciados em cinza escuro [37];

figura 10: o efeito das mutações em um número de locais do monômero deHIV-1-PR (eixo x) na estabilidade de pN do estado nativa da proteína (eixoy), calculado fazendo uso de um modelo generalizado C= Gõ [37], Cruzessólidas correspondem à estabilidade da conformação nativa do monômerosozinho (na temperatura biológica T = 2,5 kJ/mol), enquanto os pontos sóli-dos reportam o valor de Pn do monômero na presença de três p-LES do tipoP-S8 (= 83-93). A cruz e pontos fechados desenhados no local da mutação =0 indicam os resultados associados com a seqüência do tipo selvagem. Aslinhas são para guiar os olhos;

figura 11: a absorbância da atividade do banco de dados do HIV-1-PR comouma função do tempo na presença do peptídeo 83-93 (1), de nenhum peptí-deo inibidor (2), de peptídeos 61-70 (3) e peptídeos 9-19 (4) (da ref. [36]).

Exemplos

Exemplo 1 (Src-SH3)

Este domínio mostra cinco laminados beta antiparalelos e umalfa-helix e é composto de 60 resíduos (ver Figura 1).

É um banco de dados interessante para o método da invençãocomo foi amplamente caracterizado através da termodinâmica bem comoexperimentos cinéticos [32], Fazendo uso de um modelo Gõ [33] generaliza-do, simulações do dobramento do domínio de SH3 foram executadas e aprobabilidade de que o domínio esteja em sua conformação nativa é calcuIada (ver Figura 2). Foram repetidos os cálculos envolvendo em cada caso odomínio SH3 na presença de um peptídeo mostrando uma seqüência idênti-ca àquela de um dos 28 segmentos da proteína de comprimento N/10 (= 6),a saber 1, 6, 3-8, 5,10, 000, 55-60, na proporção do domínio-peptídeo de3:1. Os resultados são mostrados nas Figuras 3, 4 e 5.

A partir desses resultados pode ser claramente apontado que adobra é inibida por peptídeos p-Si= 3-8, p-S2 - 21-27, p-S3 = 35-40, e p-S4=45-50, o peptídeo P-S3 sendo o mais eficaz.

Conseqüentemente, os segmentos S,{i = 1, 2, 3 e 4) se qualificam como LESdo domínio src SH3.

O fato de que peptídeos p-Si(i=1,2,3 e 4) não são somente inibi-dores eficientes, mas também permanentemente eficazes, é documentadopelos resultados na Figura 6.

Na Figura 6 são reportados os efeitos que as mutações do pontotêm na estabilidade da proteína, ela própria e na presença de três P-S3 pep-tídeos. Mutações que não afetam a estabilidade nem a capacidade de do-bramento da proteína (por exemplo mutação em locais número9 e núme-ro30) deixam imutáveis a capacidade inibidora do peptídeo P-S3. Por outrolado, mutantes de escape (por exemplo, mutações no local número (5, 18,26, 49 e 55)) não são capazes de dobrar. Esses resultados são consistentescom o fato de que locais número (9,30), número (5, 49, 55) e número (18,26) qualificam locais como frio, morno e quente, respectivamente.

Combinando os resultados dispostos na Figura 5 e 7, pode seajustar levemente o comprimento e o número inicial e final de amino-ácidodos quatro inibidores p-S, (i = 1,2,3 e 4), para assegurar que eles incluemtodos os locais quentes (locais número18, 26, 27 e 40) e a maior parte doslocais mornos (4,5,6,28,39,41,48,49,50,55). Um possível resultado de umaprimeira iteração executada juntamente com essas linhas dá: P-S1=P-Si-3-8(contendo o amino-ácido morno 4, 5 e 6), p-S'2= 18-28 (amino-ácido quente18, 26, 27; amino-ácido morno 28), p-S'3= 36-42 (amino-ácido quente 40;amino-ácido morno 39, 41), p-S'4=p-S4=45-50 (amino-ácido morno 48, 49,50). Nota-se que um único amino-ácido (morno) (número55) não está englo-bado/incluído por este conjunto de peptídeos inibidores. Isto, juntamentecom o fato de que nem todos os locais mornos, participando no FN (pós crí-tico), pertencem necessariamente a LES (por exemplo, o amino-ácido mornonúmero16 do modelo de proteína S36 é parte de FN pós crítico mas não per-tence a qualquer LES [16]). A eficiência aperfeiçoada dos peptídeos iteradosé exemplificada pelos resultados dispostos na Figura 5 para p-S'2 e p-Sa(pontos abertos).

Vale à pena notar que todos os resultados reportados até agoraemergem de modelos de cálculo. Porque no presente caso (domínio de pro-teína Src-SH3), informação experimental detalhada existe referindo-se aosamino-ácidos que desempenham um importante papel no processo de do-bramento (isto é, é conhecido os valores de AAG da engenharia das proteí-nas [32], ver Figura 8), é possível tirar vantagem desta informação para exe-cutar o processo de iteração.

A partir dos resultados dispostos na Figura 8 deve ser indicadoque os locais "quente" e "morno" correspondem a aminos ácidos númerolO,20, 24, 26, e aos amino-ácidos número 5, 7, 18, 23, 38, 41, 48, 50, respecti-vamente.

Fazendo uso desses resultados e daqueles dispostos nas Figu-ras 5 e 6, observa-se que uma possível primeira iteração origina p-S-Γ = 5-10(contendo o amino-ácido quente 10, e o amino-ácido morno númeroõ, 7), p-S2' = 20-26 (amino-ácido quente número20, 24, 26; amino-ácido morno nú-mero23), P-S3' = 38-44 (amino-ácido morno número 38, 41, 44) e p-S4' = p-S4= 45-50 (amino-ácido morno número 48,50).

As propriedades inibidoras desses peptídeos determinados atra-vés da abordagem acima deveriam ser testadas através dos ensaios cota-dos na etapa (d) do método da invenção.

Exemplo 2 (HIV-PR, computacional)

O HIV-1-PR é um homodímero formado por cadeia contendo 99 aacada (Figura 9). As propriedades de estabilidade desta enzima tem sido es-tudadas através de longas simulações de todos os átomos por centenas denanossegundos (ns). Fazendo uso dos resultados correspondentes desen-volveu-se o modelo generalizado Ca Gõ. Ele foi usado depois para simular aevolução dinâmica total do dobramento da enzima, e os resultados foramcomparados àqueles das simulações do modelo padrão G de todos os áto-mos Gõ disponíveis na literatura. Combinando a percepção obtida dessassimulações e a informação que surge dessas mutações dessas mutações(Tabela 1), os locais "quente" e "morno" da proteína foram determinados eos possíveis candidatos de LES foram individualizadas. Em particular, a re-gião Se = (83-93) ( para detalhes ver [37] e refs, nela).

Simulações do dobramento do monômero HIV-1-PR foram reali-zadas na presença de três peptídeos p-Se. Definindo a população pN do es-tado nativo como a probabilidade normalizada de que a cadeia mostra umRMSD menor do que 10 A e mais do que 70% dos contatos nativos forma-dos, encontra-se pN = 0,28. Este número tem que ser comparado com pN =0,87 para a proteína sozinha sob as mesmas condições biológicas, e aosnúmeros pN = 0,72 e 0,66 para a proteína na presença de peptídeos de con-trole contendo a mesma seqüência como o fragmento 61-71 e 4-14 ) [37],Evidência para o fato de que este inibidor não cria resistência é mostrada naFigura 10. Mutações que não afetam a estabilidade e nem a capacidade dedobrar da proteína deixam essencialmente imutáveis as propriedades inibi-doras do peptídeo p-S8 (por exemplo mutação no local número 19). Mutan-tes de escape (por exemplo, mutação no local número 33) são essencial-mente incapazes de dobrar.

Exemplo 3 (HIV-PR, experimental)

Peptídeos apresentando uma seqüência idêntica aos segmentos83-93 (S8) e aos segmentos 9-19 e 61-70 do monômero HIV-1-PR tipo sel-vagem foram obtidos por síntese de fase sólida. Cada solução foi preparadaadicionando 0,8 mm de NaCI, 1 nM de EDTA e 1 mM de ditiotritol a uma so-lução tampão de fosfato 20 mM (pH 6), adicionando ainda 2,78 pg de HIV-1Protease e 5,4 μΜ de peptídeo (por exemplo, a concentração de cada umdos diferentes peptídeos é 3 vezes aquela da protease).

Ensaios espectroscópicos foram realizados fazendo uso de umsubstrato cromogênico [34], medindo sua mudança na absorbância no quese refere ao tempo em 310 nm [36]. Alguns dos resultados correspondentessão reportados na Figura 11. Observa-se que peptídeos 83-93 diminuemconsistentemente a atividade da protease e podem, portanto, ser emprega-dos como inibidores. Esta seqüência pode, assim, ser interpretada comodando origem a uma LES do HIV-1-PR. Conforme observado a partir da Fi-gura 9, esta LES é bem estruturada, contendo um número de contatos nati-vos internos (que estabilizam uma volta da/ alfa-helix). Ela, portanto, se qua-lifica como um inibidor de peptídeo particularmente específico. É válido notarque mutações observadas neste fragmento [35] ou em seu fragmento com-plementar (por exemplo fragmento 24-34), são observados como conserva-dores, se induzidos por medicamentos comerciais (objetivados na inibiçãodo local ativo da protease) ou não (ver Tabela 1).<table>table see original document page 19</column></row><table>

Tabela 1: as mutações observadas do HIV-1-PR conforme indicado na ref.[35]. Para cada resíduo da seqüência do tipo selvagem (wt) são listadas asmutações observadas nos pacientes tratados e/ou não-tratados (mut) e acontagem PAM250 associada com a menor dessas mutações conservado-ras (o PAM250 é uma contagem derivada da análise de substituições de a-mino-ácidos que ocorrem entre proteínas relativas. Ela especifica uma faixade valores positivos para substituições que comumente ocorrem entre prote-ínas relativas (mutações conservadoras), e contagem zero ou negativa parasubstituições improváveis (mutações não-conservativas)). Em negrito sãoindicados os locais que se submetem a mutações não-conservadoras.Exemplo 4

Dada uma proteína contendo N amino-ácidos, podem ser prepa-rados peptídeos de comprimento L = (N/10) ± 2, cada qual mostrando amesma seqüência de um segmento da proteína. O peptídeo númerol coin-cide com o segmento iniciando com um amino-ácido 1 e terminando comamino-ácido L, peptídeo número2 coincide com o segmento (L/z + 1)_[(11+z)L/z], ..., enquanto in peptídeos coincide com o segmento(iL/z+1 )_[(i+z)L/z], com i= 1,2,...im, onde im = zN/L-z. Conseqüentemente, onúmero máximo de peptídeos a serem produzidos é im+ 1. A quantidade ζcontrola a sobreposição permitida entre dois peptídeos consecutivos. Osvalores recomendados de ζ = 2,3 levam a 50% e 67% de sobreposição.

Será escolhido em prol de uma exemplificação (realística) osvalores N = 100, L = 10, ζ = 3. Então obtém-se im = 27 e 67% de sobreposi-ção. Os números correspondentes ao primeiro e ao último amino-ácido, decada um dos 28 peptídeos possíveis, são coletados na Tabela 2.

Será correlacionado esses resultados com o caso do monômerodo dímero HIV-1-PR e assumir três diferentes cenários, seguido da buscados peptídeos que inibem o dobramento: a) procura ordenada iniciando como amino-ácido (aa) 1 e procedimentos para aa 100 (por exemplo, partindo daterminação N e prosseguindo para a extremidade C), b) busca ordenadamas na ordem inversa (100 para 1, por exemplo, da terminação C até N), c)busca randômica partindo da terminação N e da terminação C, bem como dametade da proteína, depois saindo dessa região de modo a cobrir toda aproteína. No primeiro caso seriam necessárias 26 tentativas para encontrar oinibidor p-LES (peptídeo número26 da Tabela 2), no segundo caso 3 tentati-vas, enquanto no terceiro caso 12 tentativas (ver Tabela 2).<table>table see original document page 21</column></row><table>Tabela 2: Um exemplo de divisão da seqüência de HIV-1-PR em peptídeos.As colunas indicam, respectivamente, o número de identificação do peptí-deo, o índice i (ver texto), o fragmento correspondente na seequência HIV-1-PR1 e (em números romanos) um exemplo de um teste inibidor não-seqüencial, partindo do centro da proteína e extremidades terminais CeNsimultaneamente. Neste caso a busca é concluída depois de doze etapasquando o peptídeo número26 é testado.

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Claims (12)

1. Processo para a identificação de peptídeos inibidores do do-bramento de uma proteína de N aminoácidos de comprimento L1 caracteri-zado pelo fato de que compreende:a) projetar M peptídeos de comprimento L, cada qual apresentando uma se-qüência idêntica a um segmento da proteína alvo, de modo a cobrir comple-tamente a proteína, permitindo alguma quantidade de sobreposição entre osdiferentes peptídeos. Tipicamente L contem cerca de 10 aminoácidos e, depreferência, varia de cerca de 4 até cerca de 20. Conseqüentemente, M va-ria de cerca de 5 até cerca de 50, tipicamente sendo cerca de 20.b) preparar os peptídeos M projetados tanto singularmente ou em grupos;c) preparar soluções M cada qual contendo a proteína sob consideração eum dos peptídeos em uma proporção molar apropriada e incubar cada umadas soluções a 37°C.d) avaliar a eficácia inibidora do peptídeo nas soluções acima ou o grau dedobramento ou ambos, por meio de técnicas padrão, de modo a identificar opeptídeo dotado de uma atividade inibidora em relação à proteína.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que N é composto de 60 até 150.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o comprimento de L do peptídeo está compreendido entre 4 e 20.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o comprimento do peptídeo corresponde a L = N/10.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a etapa (B) é executada pela síntese de M peptídeos ou por cor-te apropriado da proteína alvo, de acordo com métodos padrão.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proporção molar de peptídeo/proteína pode variar de 1:1 até 10:1.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a proporção molar peptídeo/proteína é de 3 para 1.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as etapas (b) e (c) podem ser substituídas por simulações comprogramas de computador.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as etapas (b) e (c) são executadas através de ensaios espectro-fotométricos, testes de equilíbrio de sedimentação, dicroísmo circular ou téc-nicas de ressonância nuclear magnética.

10. Inibidor de peptídeo, caracterizado pelo fato de que é identi-ficado através de um processo como definido em quaisquer umas das rei-vindicações de 1 até 8.

11. Inibidor de peptídeo como definido na reivindicação 9, carac-terizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é aplicado a cada domínio de proteínas multidomínio.