BRPI0613425A2 - plexina d1, uso de moléculas, moléculas de ligação de plexina d1, composição diagnóstica, composição terapêutica, e, método para identificar moléculas que são capazes de se ligar a plexina dl - Google Patents

Abstract

PLEXINA D1, USO DE MOLéCULAS, MOLéCULAS DE LIGAçãO DE PLEXINA D1, COMPOSIçãO DIAGNóSTICA, COMPOSIçãO TERAPêUTICA, E, MéTODO PARA IDENTIFICAR MOLéCULAS QUE SãO CAPAZES DE SE LIGAR A PLEXINA DL. A presente invenção se refere plexina D1 para uso como uma proteína marcável no tratamento ou diagnose de distúrbios que envolvem expressão de plexina D1. Diagnose é adequadamente efetuada detectando a presença de plexina D1 no corpo ou em um tecido ou fluido corporal, ao passo que tratamento é efetuado marcando plexina D1 para liberação de terapêuticos ao sítio onde tratamento é necessário. A invenção se refere adicionalmente ao uso de moléculas que se ligam a plexina D1, um ácido nucléico codificando plexina D1 ou um ligante de plexina D1 para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento ou diagnose de distúrbios que envolvem expressão de plexina D1. Os distúrbios compreendem distúrbios noa quais plexina D1 é expressa em células tumorosas, vasos sanguíneos de tumor ou macrófagos ativados.

Description

aPLEXINA Dl, USO DE MOLÉCULAS, MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE PLEXINA D1, COMPOSIÇÃO DIAGNOSTICA, COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA, E, MÉTODO PARA IDENTIFICAR MOLÉCULAS QUE SÃO CAPAZES DE SE LIGAR A PLEXINA DL" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere à identificação de uma nova proteína marcável que pode ser usada no tratamento e diagnose de tumores, em particular tumores sólidos, e desordens que envolvem inflamação, em particular artrite reumatóide, arteriosclerose e esclerose múltipla. ARTE DE FUNDO DA INVENÇÃO

Para crescer além de um tamanho de 2-3 mm3, tumores têm que recrutar uma neovasculatura através de angiogênese. Tumores realizam isto através de expressão de Fator de Crescimento Endotelial Vascular-A (VEGF-A), ou induzida por hipoxia no centro de tumor ou como um resultado de mau funcionamento de produtos de gene supressor de tumor ou proto- oncogenes ativados. Diversos compostos que marcam a via de sinalização de VEGF-A foram desenvolvidos com o objetivo de inibir angiogênese e, conseqüentemente, crescimento de tumor.

Embora tais terapias anti-angiogênicas tenham sido efetivas em modelos de tumores de animais, tradução para o nível clínico até agora provou ser menos bem sucedida (Eichhorn, ME et al., Drug Resist Update 7:125-138(2004)).

Para isto, existem diversas explicações possíveis.

Em situações clinicamente relevantes, tumores podem estar crescendo por meses ou mesmo anos no momento de diagnose, e uma proporção significante da vasculatura pode estar mais ou menos madura e assim insensível à inibição de angiogênese. Esta situação está em acentuado contraste com aquela na maioria dos modelos animais nos quais, como uma regra, tumores agressivos de crescimento rápido são estudados. Além disso, pacientes que são candidatos para terapia anti-angiogênica são tipicamente pacientes com câncer disseminado incontrolável e crescimento de metástase nem sempre é estritamente dependente de angiogênese. Devido à maioria das metástases ser de transmissão sangüínea, elas crescem em órgãos com densidades de vaso intrinsecamente altas como fígado, pulmão e cérebro onde elas podem crescer de uma maneira independente de angiogênese por co- opção de vasos pré-existentes.

De fato, um inibidor de angiogênese que inibe muito efetivamente crescimento de tumor em diversos modelos de tumor subcutâneo (Wedge, SR et ai., Câncer Res 62:4645-4655 (2002)) não inibe crescimento de tumores infiltrantes em cérebro de camundongo. Além disso, com tratamento de camundongos carregando tumores cerebrais altamente angiogênicos, inibição de angiogênese não resultou em uma interrupção de progressão de tumor adicional, mas sim em uma progressão depois de uma mudança fenotípica para co-opção e infiltração (Leenders, WP et ai., Clin Câncer Res 10:62226230 (2004)). Estes resultados implicam que terapia anti- angiogênica deve ser suplementada por terapias de marcação vascular nas quais a cama vascular de tumor existente é atacada, resultando em morte celular de tumor secundário devido à interrupção do abastecimento de sangue de tumor.

Para realizar terapia efetiva de marcação vascular, têm que ser identificados marcadores que têm especificidade para vasculatura de tumor. Muito esforço já foi posto nisto, mas com sucesso variado. Marcação efetivo de tumor vascular foi realizado usando anticorpos de cadeia única, marcados contra o domínio ED-B de fibronectina, que é seletivamente expresso e depositado na matriz extracelular de vasos recentemente formados em tumores angiogênicos (Santimaria, M et ai., Clin Câncer Res 9:571-579 (2003)). Marcação de avp3-integrina (a expressão da qual é restrita a vasos imaturos) usando peptídeos RGD ou Vitaxina produziu resultado decepcionante ao passo que expressão de endoglina não foi específica para vasos sangüíneos de tumor (Posey, JA et al., Câncer Biother Radiopharm 16:125-132 (2001); Balza5 E et al., Int J Câncer 94:579-585 (2001)).

Em doenças inflamatórias tal como artrite reumatóide (RA) ou arteriosclerose, angiogênese e ativação da vasculatura também freqüentemente é parte da patologia. A vasculatura aqui facilita o caminho para que células inflamatórias extravasem e exerçam sua ação destrutiva. Tais doenças podem assim também se beneficiar de marcação para vasos sangüíneos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Portanto o objetivo da presente invenção é fornecer uma nova proteína marcável que pode ser usada no tratamento e diagnose de câncer e doenças inflamatórias ou doenças que envolvem inflamação.

Na pesquisa que levou à presente invenção foi encontrado que plexina Dl é expressa no lado luminal de células endoteliais em vasos sangüíneos de tumor, nas próprias células tumorosas e em macrófagos ativados que são encontrados em tumores, em inflamação e em placas ateroscleróticas.

A invenção assim se refere a plexina Dl para uso como uma proteína marcável no tratamento ou diagnose de desordens que envolvem expressão de plexina Dl.

A família de receptores de plexina consiste de quatro classes (PLXNA-D) e nove membros em mamíferos. Plexinas compreendem uma família de grandes proteínas de membrana de passagem única com homologia para receptores de fator de dispersão, codificados pela família de gene MET. Membros da família de plexina compartilham domínios Sema, seqüências relacionadas a Met (MRS), uma região transmembrana e motivos intracelulares que são preditivos de sinalização de Rac/Rho GTPase (Figura 1). Uma vez que sinalização através de GTPases resulta em rearranjos citoesqueléticos, eventos que estão criticamente envolvidos em formação de filopodia e lamelipodia e migração celular, plexinas podem ser consideradas como reguladores de migração.

Plexinas são receptores para as semaforinas, uma família de proteínas secretadas GPI-ancoradas ou transmembranas que é subdividida em sete subclasses. Cada plexina tem seus próprios (conjunto de) parceiros de ligação de semaforina, e cada combinação de plexina-semaforina resulta em uma resposta específica. Semaforinas de classe 3 são potentes repelentes de axônio e como tal estão envolvidas em morfogênese do sistema nervoso (para revisão, veja (Pasterkamp, RJ et ai., Curr Opin Neurobiol 13:79-89 (2003); Fujisawa, H, J Neurobiol 59:24-33 (2004)). Para ativação de plexinas pelas semaforinas, parceiros de ligação de plexina adicionais podem ser requeridos. Estes parceiros de ligação, neuropilina-1 e -2 (NP-1 e NP-2) não têm nenhuma motivo de sinalização no domínio intracelular e são pensados como uns co-receptores passivos, possibilitando a interação entre semaforinas e plexinas.

Algumas plexinas formam ainda complexos maiores de membrana com e ativam receptores de sinalização como Off Track (Otk) e os receptores de fator de dispersão Met e Ron. Uma interação direta entre plexinAl e o receptor-2 Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR2) angiogênico também foi demonstrada (Toyofuku, T et ai., E-publication in Genes Dev 18:435-447 (2004)). Devido ao fato de NP-I se ligar a membros da família de plexina mas também a VEGFR2, é concebível que existam complexos multicomponentes de proteínas de membrana que abranjam VEGFR2, NP-I e plexinas, estabelecendo uma ligação entre plexinas e angiogênese (veja também Weinstein, BM, Cell9 120:299-302 (2005)).

Neuropilinas também são co-receptores para o potente fator angiogênico Fator de Crescimento Endotelial Vascular-A (VEGF-A165) e estimulam sua afinidade para VEGFR2.

Interessantemente, o sítio de ligação VEGF-A165 em NP-I se sobrepõe com aquele para semaforina 3A (Miao, H Q et al, J Cell Biol 146:233-242 (1999)). Foi postulado que ligação de VEGF-A com NP-I promove migração de células endoteliais competindo por ligação de semaforinas de classe 3, o que geralmente é seguido por despolimerização de F-actina e repulsão de extensões celulares (Bachelder, RE, Câncer Res 63:5230-5233 (2003)). Comportamento antagonístico similar de VEGF-A e semaforinas de classe 3 foi descrito em uma linhagem celular progenitora de neurônios (Bagnardj D et al, J Neurosci 21:3332-3341 (2001)) e células tumorosas (Bachelder (2003), acima). Uma vez que efeitos antagonísticos foram observados em células tumorosas que são desprovidas de receptores de VEGF, é concebível que o mecanismo de base envolva membros da família de plexina, estabelecendo uma ligação adicional entre plexinas e sinalização de VEGF-A.

Os presentes requerentes encontraram previamente que o membro da família plexina Dl (plxnDl) não é expresso apenas em células neuronais, mas também em células endoteliais da vasculatura durante estágios precoces de desenvolvimento (van der Zwaag, B et al, Dev Dyn 225:336-343 (2002)), uma observação que foi confirmada por dois outros grupos (Gitler, AD et al, Dev Cell 7:107-116 (2004); Torres-Vazquez, J et al, Dev Cell 7:117-123 (2004)). Em vasculatura adulta, plxnDl é ausente. Camundongos nocaute P/xnd/- e peixe-zebra carregando mutações no gene de plxndl são caracterizados por mau desenvolvimento do sistema cardiovascular (Gitler, AD et al. (2004), acima; Torres-Vazquez, J et al,(2004), acima). Camundongos nocaute duplo Neuropilina-I (NP-I) e NP-l/Neuropilina-2 (NP-2) também sofrem de defeitos letais em vascularização e má formações de arco aórtico durante desenvolvimento embrionário (Kawasaki, T et al, Development 126:4895-4902 (1999); Takashima, S et al, Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662 (2002); Gu5 C et al., Dev Cell 5:45-57 (2003)).

Além disso, bloqueio local mediado por morfolino de NP-I em peixe-zebra leva a mau desenvolvimento de vasos intersegmentares, e neste sistema de modelo foi estabelecida uma ligação clara entre MP-I e VEGF- Al 65 (Lee, P et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:10470-10475 (2002)). A semelhança dos fenótipos de camundongos nocaute de plxndl, neuropilina-1 e semaforina 3C (Feiner, L et al., Development 128:3061-3070 (2001)) é consistente com a observação de que Plexina Dl é um receptor dependente de neuropilina-1 para semaforina 3 C (Gitler, AD et al. (2004), acima). Entretanto5 PlxnDl também é um receptor para semaforina 3E, e esta interação não requer neuropilinas para sinalização mediada por Semaforina 3E (Gu, C et al., Science 307:265-268 (2005)).

De acordo com a invenção foi agora encontrado que plexina Dl também está envolvida em angiogênese durante crescimento de tumor e é expressa no lado luminal de células endoteliais em vasos sangüíneos de tumor. Além disso, foi encontrado que plexina Dl é expressa por macrófagos ativados. Também, foi encontrado que plexina Dl é expressa em células tumorosas em uma ampla variedade de tipos de tumor.

A presente invenção assim se refere a plexina Dl para uso como uma proteína marcável no tratamento ou diagnose de desordens que envolvem expressão de plexina DL

Diagnose é efetuada detectando a presença de plexina Dl ou uma plexina Dl codificando ácido nucléico no corpo ou um tecido ou fluido corporal.

Tratamento é efetuado marcando plexina Dl para liberação de

terapêuticos para o sítio onde tratamento é necessário, interferindo na interação entre plexina Dl e seus ligantes, interferindo na expressão do gene de plexina Dl ou capturando ligantes de plexina Dl para inibir interação com plexina DL A invenção assim além disso se refere ao uso de moléculas que se ligam a plexina Dl, um ácido nucléico codificando plexina Dl ou um ligante de plexina Dl para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento ou diagnose de desordens que envolvem expressão de plexina Dl.

Todas estas moléculas serão identificadas neste lugar como "moléculas de ligação" ou "entidades de ligação".

As desordens compreendem em particular desordens nas quais plexina Dl é expressa em células tumorosas, vasos sangüíneos de tumor ou macrófagos ativados.

As células tumorosas nas quais plexina Dl é expressa

compreendem tumores cerebrais, em particular astrocitomas, oligodendrogliomas e hemangioblastomas, carcinomas de cólon, em particular carcinomas ductais do cólon, carcinomas de próstata, carcinomas de célula renal, em particular carcinomas de célula clara renal, carcinomas de mama, em particular carcinomas ductais da mama, carcinomas de ovário, carcinomas de célula esquamosa, melanomas, carcinomas de pulmão, em particular carcinomas de célula pequena de pulmão e carcinomas de célula não pequena de pulmão, sarcomas de tecido macio etc.

Quando as desordens que são tratadas de acordo com a invenção são doenças inflamatórias, elas são em particular doença autoimune, mais em particular artrite reumatóide, ou elas são arteriosclerose ou esclerose múltipla.

Moléculas que se ligam a plexina Dl são por exemplo selecionadas a partir de anticorpos, fragmentos de anticorpos, proteínas, domínios protéicos, peptídeos, moléculas pequenas. Estas moléculas podem ser usadas para marcar plexina.

Moléculas que se ligam ao ácido nucléico codificando plexina Dl são por exemplo oligonucleotídeos, tal como aptâmeros de RNA ou DNA, por exemplo selecionadas a partir de siRNA, RNA antisentido, oligonucleotídeos fosfotio antisentido. Estas moléculas podem ser usadas para interferir na expressão de plexina Dl.

Moléculas que se ligam a um ligante de plexina Dl são, por exemplo, selecionadas a partir de anticorpos contra Hgantes, o ectodomínio solúvel de plexina Dl ou moléculas pequenas, tal como peptídeos, que se ligam a ligantes de plexina DL Estas moléculas podem ser usadas para capturar ligante de plexina Dl circulante, prevenir ligação do ligante a plexina Dl células de vaso de tumor, células tumorosas ou macrófagos ativados e interferir na função de plexina Dl nestas células.

Para diagnose, a molécula de ligação é adequadamente marcada com um marcador detectável. Um tal marcador detectável é por exemplo selecionado a partir de um marcador radioativo, marcador paramagnético, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente. Diagnose pode ser realizada em uma amostra de um fluido ou tecido corporal in vivo, in situ ou ex vivo. Exemplos de técnicas diagnosticas são hibridização in situ de por exemplo mRNA de plexina Dl ou imunohistoquímica em biópsias ou células tumorosas.

Para tratamento, a molécula de ligação é por exemplo fornecida com uma entidade que danifica ou mata a célula tumorosa e/ou a célula endotelial de tumor, em particular uma entidade citotóxica, tal como um radionuclídeo, uma toxina, boro para Terapia por Captura de Nêutrons por Boro (BNCT), ou um pró-fármaco que é acoplado à entidade de ligação através de um ligante clivável, que é ativado em resposta a clivagem daquele ligante, ou peptídeos indutores de apoptose, um exemplo dos quais é a seqüência (KXAKLAK)2. Tais peptídeos são adicionados à entidade de ligação por técnicas moleculares de engenharia genética.

As entidades descritas acima podem ser diretamente conjugadas com a entidade de ligação, ou elas podem estar presentes em nanodispositivos, tal como lipossomos ou polimersomos, que estão conjugados com a entidade de ligação.

Terapia por Captura de Nêutrons por Boro (BNCT) compreende irradiação de uma área doente, tal como um tumor ou uma inflamação, na qual boro acumulou depois de injeção intravenosa do conjugado lipossômico, com nêutrons, depois do que átomos de boro irão decair para lítio com emissão de partículas alfa destrutivas.

Alternativamente, terapia pode ser efetuada induzindo trombose local nos vasos de tumor para bloquear o abastecimento de sangue para o tumor e induzir morte celular. Um exemplo de tal molécula é Fator de Tecido(TF).

Vantajosamente, plexina Dl pode ser marcada com moléculas de ligação específicas mediante administração intravenosa uma vez que plexina Dl é expressa no lado luminal de células endoteliais em vasos sangüíneos de tumor. Compostos terapêuticos para danificar ou matar células tumorosas que estão acoplados à molécula de ligação podem atingir o tumor de dentro e compostos que induzem trombose são facilmente entregues ao seu sítio de ação.

Interferência na função de plexina Dl representa um meio para inibir angiogênese, para inibir migração de célula tumorosa, e para inibir migração de macrófago. Assim, a invenção fornece métodos de tratar ou suprimir desordens nas quais plexina Dl está envolvida, usando a presença específica de plexina Dl para entregar terapêuticos localmente para tecidos doentes, e/ou por interferência na função de plexina Dl ou na interação entre plexina Dl e seus ligantes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção é assim baseada no fato de que plexina Dl pode ser usada como um marcador marcável em vasos sangüíneos de tumor, como uma proteína marcável envolvida em angiogênese de tumor, como um marcador marcável em células tumorosas e como uma proteína marcável envolvida em migração celular.

A invenção assim também se refere ao uso de moléculas que se ligam a plexina Dl, seu gene ou mRNA ou seus ligantes em diagnose e terapia. Todos os tipos de moléculas de ligação específicas, e derivados desta podem ser usados na invenção, em particular compostos proteináceos, tal como, mas não limitado a, anticorpos, fragmentos de anticorpos, fragmentos de anticorpos de domínio único, outros domínios de ligação proteináceos, tal como, mas não limitado a, lipocalinas, e moléculas pequenas que se ligam especificamente a plexina Dl ou seus ligantes. Para ligação com o gene de plexina Dl ou o mRNA transcrito a partir do gene de plexina Dl moléculas de ácido nucléico, tal como aptâmeros de DNA ou RNA podem ser usadas.

Em uma primeira forma de realização da invenção moléculas de ligação de plexina Dl ou ligante de plexina Dl são anticorpos, em particular anticorpos monoclonais, mais em particular anticorpos humanos ou humanizados nos quais as regiões constantes do anticorpo original são substituídas com as regiões constantes de anticorpos humanos, ou fragmentos destes que ainda se ligam a plexina Dl ou seu ligante.

O anticorpo é preferivelmente um anticorpo humano IgGL Entretanto, outros isotipos de anticorpo humano também são abrangidos pela invenção, incluindo IgG2, IgG3, IgG4, IgM5 IgAl, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Também todos os anticorpos derivados de animais de vários isotipos podem ser usados na invenção.

Os anticorpos podem ser anticorpos de tamanho completo ou fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, incluindo fragmentos Fab, F(ab')2, Fv de cadeia única, ou VHH de domínio único, domínios únicos de VH ou VL.

Preferivelmente, anticorpos contra plexina Dl são anticorpos monoclonais humanos produzidos por uma célula de hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgênico imunizado tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana, fundido a uma célula imortalizada, ou um anticorpo derivado de animal ou fragmento de anticorpo produzido por uma célula de hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal imunizado, fundido a uma célula imortalizada, ou anticorpos humanos e animais, produzidos por uma célula eucariótica transfectada com o cDNA ou DNA genômico codificando dito anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, anticorpos de Lhama de domínio único (VHH) com afinidade para plexina Dl são fornecidos, mais especificamente anticorpos A12 de domínio único de Lhama (SEQ ID NO:l) e F8 (SEQ ID NO:2), apresentados ou não em bacteriófagos Ml3, também conhecidos por aqueles versados na arte como anticorpos VHH de apresentação em fago.

Um anticorpo de cadeia única preferido é derivado de anticorpo 11F5H6 e 17E9C12. A seqüência do anticorpo de cadeia única é mostrada em SEQ ID NO:3 e SEQID NO:4.

Os anticorpos para uso de acordo com a invenção podem ser anticorpos de alta afinidade que são evocados em animais de laboratório não transgênicos, ou em um animal transgênico no qual o locus de globulina endógena foi substituído pelo locus de globulina humana, assim permitindo produção de anticorpos humanos em tais animais (Jakobovits, A. Curr Opin Biotechnol 6:561-566 (1995)).

A invenção adicionalmente se refere a um método de produzir os anticorpos da invenção, compreendendo imunizar um animal com plexina Dl, ou uma célula expressando plexina Dl, ou um ácido nucléico codificando plexina Dl, ou partes do domínio extracelular de plexina Dl, de forma que anticorpos contra plexina Dl são produzidos pelas células B do animal, isolar as células B do animal e fundir as células B a uma linhagem celular de mieloma para obter células imortalizadas que secretam o anticorpo. O animal preferivelmente é um animal transgênico tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana de forma que o anticorpo resultante é humanizado.

Em uma forma de realização, o método inclui imunizar um animal de laboratório com um peptídeo sintético, escolhido a partir do domínio extracelular de plexina Dl5 por exemplo peptídeo 47-63 correspondendo ao término amino da seqüência de aminoácidos de plexina Dl madura. Imunizações entretanto são preferivelmente feitas com domínios extracelulares recombinantes, preferivelmente uma região com baixa similaridade com outros membros da família das plexinas, por exemplo uma região compreendendo aminoácidos 47-546, carecendo das Seqüências Relacionadas a Met. Ditos domínios extracelulares de plexina Dl recombinante podem ser produzidos em células de E.coli inserindo os ácidos nucléicos de codificação em um vetor de expressão procariótico adequado, por exemplo sob controle do promotor de β-galactosidase, transformação de células de E.coli com dito vetor, e isolamento das proteínas recombinantes de corpos de inclusão purificados. É preferido entretanto que anticorpos sejam evocados por imunização com dito domínio extracelular de plexina Dl recombinante que é produzido por células eucarióticas, portanto contendo modificações pós-traducionais que são muito similares àquelas presentes em plexina Dl nativa, por exemplo por células de ovário de hamster chinês (CHO) depois de transfecção com um vetor, contendo os ácidos nucléicos de codificação para ditos domínios extracelulares sob o controle de um promotor de citomegalovírus. Fragmentos de plexina Dl extracelular recombinante podem ou não estar fundido a etiquetas facilitando purificação, e.g. uma etiqueta VSV ou uma região constante de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina.

O método de produzir o anticorpo também pode compreender clonar as regiões de codificação de anticorpo a partir de ditas células B específicas para plexina Dl em um vetor de expressão e expressar a seqüência de codificação. Em uma forma de realização preferida o vetor de expressão é pHENIXHISVSV, possibilitando expressão por células hospedeiras de E.coli do anticorpo, flanqueado na extremidade carboxiterminal por um Vírus de Estomatite Vesicular (VSV-etiqueta) e uma etiqueta His*8. A etiqueta VSV é pretendida para facilitar detecção imunohistoquímica, usando anticorpos específicos. A etiqueta His*8 é pretendida para facilitar purificação baseada em cromatografia de afinidade de Níquel. Outros vetores de expressão podem ser usados da mesma maneira.

Mais especificamente a invenção fornece um anticorpo A12 de domínio único isolado, tendo uma constante de dissociação de menos do que 2x10-8 M, que se liga ao término amino de plexina Dl e que detecta plexina Dl em corantes imunohistoquímicos e volta para vasos sangüíneos de tumor expressando plexina Dl, e também a um anticorpo F8 de domínio único isolado, tendo uma constante de dissociação de menos do que 3x10-8 M, que se liga ao término amino de plexina Dl e que detecta plexina Dl em corantes imunohistoquímicos e volta para vasos sangüíneos de tumor expressando plexina Dl-. Ambos anticorpos de domínio único isolados podem ser fundidos à região constante de uma cadeia pesada de IgGl humana ou à região constante de uma cadeia pesada de IgGl de camundongo.

Preferivelmente anticorpos completamente humanos são usados dentro do escopo da invenção. Em outra forma de realização, anticorpos humanizados ou derivados de animal de laboratório podem ser usados.

A invenção fornece adicionalmente anticorpos biespecíficos que têm uma especificidade de ligação para plexina Dl, e uma especificidade de ligação para uma célula apresentando antígeno humano, ou para um receptor de Fci caracterizados pelo fato de que o receptor de Fc é um receptor de Fc(gama)Rl ou de um Fc(alfa) humano. A invenção também fornece moléculas de ácido nucléico codificando os anticorpos preferidos, ou porções de ligação de antígeno. Vetores de expressão recombinante que incluem ácidos nucléicos que codificam os anticorpos da invenção, assim como células hospedeiras transfectadas com tais vetores, também são abrangidos na invenção.

Outras moléculas de ligação para uso na invenção são moléculas pequenas que se ligam especificamente a Plexina DL O termo "molécula pequena" freqüentemente se refere a moléculas com pesos moleculares de 500 ou abaixo. O termo é comumente usado atualmente e assim claro para a pessoa versada. Além disso, bibliotecas de molécula pequena já estão disponíveis ou estão sendo desenvolvidas. Um exemplo de tal biblioteca é a NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR). Tais bibliotecas são sujeitas a Triagem de Alto Desempenho (HTS) para identificar moléculas que se ligam a to plexina Dl. A invenção também se refere às moléculas pequenas que resultam de uma triagem de tais bibliotecas.

Outros compostos que podem ser usados de acordo com a invenção compreendem peptídeos ou aptâmeros (Ulrich, Med. Chem. .1(2): 199-208 (2005)) que se ligam a domínios extracelulares de plexina Dl e com isso interferem em ligação de ligantes de plexina Dl a plexina Dl. Reciprocamente, tais peptídeos ou aptâmeros também podem se ligar aos sítios de ligação de plexina Dl dos ligantes de plexina Dl e com isso interferir em ligação de ligante a plexina DL

Para interferir na expressão do gene de plexina Dl outro tipo de molécula de ligação é usado, em particular siRNA, RNA antisentido ou fosfotio-nucleotídeos antisentido.

RNA (siRNA)de pequena interferência compreende pequenas fitas de RNA que interferem na tradução de RNA mensageiro. SiRNA se liga à porção complementar do RNA mensageiro alvo e marca ele para degradação assim inibindo expressão gênica. Isto é comumente conhecido como "silenciamento" de gene. SiRNA normalmente é de 21 a 23 nucleotídeos de comprimento. RNA antisentido é uma molécula de RNA transcrita a partir da fita de codificação, ao invés do que do modelo, de DNA, de forma que ele é complementar ao mRNA sentido. Formação de um duplex entre as moléculas de RNA sentido e antisentido bloqueia tradução e também pode sujeitar ambas as moléculas a nucleases específicas de dupla fita assim inibindo expressão do gene. Inibição de expressão do gene pode ser usada para bloquear angiogênese e migração de células tumorosas e macrófagos.

Preferivelmente, as moléculas de ligação descritas acima se ligam a plexina Dl, seu gene ou seu ligante em células eucarióticas. Ditas moléculas especificamente se acumulam em tumores com injeção intravenosa ou especificamente se acumulam em vasos sangüíneos de tumor mediante injeção intravenosa.

Os anticorpos, fragmentos destes, moléculas pequenas e outros compostos proteináceos que irão se ligar a plexina Dl podem ser usados de várias maneiras.

Em uma forma de realização, a invenção se refere a compostos que se ligam à parte extracelular de plexina Dl e cuja ligação resulta em interferência de função de plexina Dl. Alternativamente, a invenção se refere a compostos que se ligam ao domínio intracelular de plexina Dl e que previnem sinalização por plexina Dl.

Em uma forma de realização específica tais moléculas de ligação se ligam a plexina Dl para interferir na formação de complexos multicomponentes de membrana inibindo ligação de ligantes de plexina Dl, em particular neuropilina-1, neuropilina-2, semaforina 3C, semaforina 3E, VEGF-receptor 1, VEGF-receptor-2 ou VEGF-A, com plexina Dl. Tais moléculas de ligação levam a inibição de sinalização de GTPase induzida por ligante de plexina Dl ou a inibição de migração de células expressando plexina Dl, em particular células endoteliais associadas a tumor, células tumorosas ou macrófagos.

De acordo com outro aspecto desta invenção se refere a um método de induzir Iise de uma célula expressando plexina Dl, compreendendo colocar em contato uma célula expressando plexina Dl com as moléculas de ligação, em particular os anticorpos, da invenção na presença de células efetoras humanas, de forma que Iise da célula expressando plexina Dl ocorra.

Em uma forma de realização ainda adicional a molécula de ligação é combinada com ou acoplada a um composto efetor que pode detectar a presença de plexina Dl para propósitos diagnósticos ou que pode realizar um efeito na célula expressando plexina Dl. O composto efetor diagnóstico ou terapêutico pode ser diretamente acoplado à molécula de ligação ou pode estar presente em um veículo de transporte, tal como um nanodispositivo, em particular um lipossomo ou polimersomo, que está acoplado à molécula de ligação. Alternativamente, a molécula de ligação pode ser um anticorpo biespecífico que se liga tanto a plexina Dl como ao composto efetor assim marcando o composto efetor para o sítio ou célula onde plexina Dl é expressa.

A invenção assim fornece em uma forma de realização particular desta o uso de tais moléculas de ligação em um método de diagnosticar uma doença mediada por expressão de plexina Dl, cujo método compreende liberação intravenosa das moléculas de ligação de plexina Dl proteináceas, aptaméricas ou de molécula pequena, conjugadas a um composto efetor permitindo detecção in vivo das moléculas de ligação.

Compostos efetores diagnósticos são por exemplo radioisótopos ou agentes de contraste para Formação de imagem por ressonância magnética (MRI), tal como gadolínio-DTPA, ou corantes fluorescentes.

Exemplos de substância radioativa compreendem, mas não são limitados a tecnécio99m (99mTc), iodo-123 (1231), iodo-131 (1311), rênio-186 ou -188 (le6/18 8Re), gálio-67 (67Ga) as substância emitindo radiação beta ítrio-90 (90Y) ou lutécio-177 (177I,u), os isótopos emitindo positron Flúor-18 (18 F)e Carbono-Il (IlC'.) Tais radioisótopos podem ser usados ou para detectar ou danificar ou matar células expressando plexina DL Normalmente isótopos diferentes são usados para diagnose e terapia. A pessoa versada é bem consciente de que isótopo usar para que tecido e para que tipo de uso.

Em outra forma de realização, as moléculas de ligação proteináceos, aptaméricas e moleculares pequenas para uso na invenção podem ser combinadas com ou acopladas a um agente tóxico, tal como agente quimioterápico ou diretamente ou em um veículo de transporte, em particular um nanodispositivo, tal como um lipossomo ou polimersomo.

Em outra forma de realização, uma entidade de ligação de plexina Dl da invenção é acoplada a um ou mais agentes quimioterápicos selecionados a partir do grupo consistindo de mostardas de nitrogênio (e.g., ciclofosfamida e ifosfamida), aziridinas (e.g., tiotepa), alquil sulfonatos (e.g., busulfan), nitrosouréias (e.g., carmustina e estreptozocina), complexos de platina (e.g., carboplatina e cisplatina), agentes alquilantes não clássicos (e.g., dacarbazina e temozolamida), análogos de folato (e.g., metotrexato), análogos de purina (e.g., fludarabina e mercaptopurina), análogos de adenosina (e.g., cladribina e pentostatina), análogos de pirimidina (e.g., fluorouracil (sozinho ou em combinação com leucovorina) e gemcitabina), uréias substituídas (e.g., hidroxiuréia), antibióticos antitumor (e.g., bleomicina e doxorubicina), epipodofilotoxinas (e.g., etoposídeo e teniposídeo), agentes de microtúbulo (e.g., docetaxel e paclitaxel), análogos de camptotecina (e.g., irinotecano e topotecano), enzimas (e.g., asparaginase), citocinas (e.g., interleucina-2 e interferon-[alfa]), anticorpos monoclonais (e.g., trastuzumabe e bevacizumabe), toxinas e imunotoxinas recombinantes (e.g., toxina de cólera- B recombinante e TP-38), terapias gênicas de câncer, e vacinas de câncer (e.g., vacina contra telomerase).

Agentes quimioterápicos preferivelmente são selecionados a partir do grupo consistindo de doxorubicina, cisplatina, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil e ciclofosfamida hidroxiuréia. Outros compostos são conhecidos pela pessoa versada na arte.

Um tumor também pode ser tratado bloqueando seu abastecimento de sangue induzindo trombose local na vasculatura de tumor. As moléculas de ligação da invenção podem ser, nesta forma de realização, usadas para marcar moléculas indutoras de trombose, tal como o co-fator TF de coagulação sangüínea (Fator de Tecido), uma entidade radioativa ou uma toxina, tal como ricina para o sítio do tumor. Compostos efetores podem ser acoplados com a molécula de ligação, em particular uma molécula de ligação de plexina Dl, ou podem estar presentes em um nanodispositivo, tal como um lipossomo ou polimersomo, que é acoplado à molécula de ligação de plexina DL

Um método alternativo de tratar câncer ou uma desordem inflamatória de acordo com a invenção é com boro. As moléculas de ligação da invenção podem ser conjugadas a veículos de transporte, em particular nanodispositivos, tal como lipossomos ou polimersomos, que são carregados com boro para obter uma composição terapêutica. Depois de liberação e acumulação desta composição na área doente, esta área é irradiada com nêutrons, resultando em emissão de partículas alfa radioativas e citotóxicas que danificam ou matam as células endoteliais de tumor, células tumorosas e/ou macrófagos ativados.

É desejável que para marcação de vaso sangüíneo de tumor anticorpos tenham altas afinidades para plexina Dl, por exemplo maior do que 10-8, preferivelmente maior do que 10-9, mais preferivelmente maior do que 10-1° M. Alta afinidade e o alto peso molecular de anticorpos entretanto irá restringir penetração em tecido de tumor. Portanto, os ácidos nucléicos que codificam ditos anticorpos monoclonais, obtidos através de clonagem por RT- PCRj podem ser usados para gerar derivados de anticorpos, por exemplo anticorpos que carecem da região constante e são monovalentes, ou fragmentos de anticorpos que são adaptados a afinidades ótimas para marcação de vaso sangüíneo ou penetração em tumor por procedimentos mutagênicos. Estes derivados de anticorpos terão afinidades menores e pesos moleculares menores e terão propriedades melhoradas de marcação de célula tumorosa.

Diferentes moléculas de ligação da invenção podem ser combinadas em uma mistura. Em uma forma de realização específica os membros da mistura têm uma afinidade variada. Um exemplo de uma tal combinação é uma mistura de anticorpos monoclonais e/ou fragmentos de anticorpos ou uma mistura de anticorpos com moléculas pequenas. Os anticorpos monoclonais tendo alta afinidade podem ser usados para marcar vasos, ao passo que os fragmentos menores tendo uma afinidade inferior são mais capazes de penetrar e atingir as células tumorosas. Alternativamente, uma mistura de moléculas de ligação de plexina Dl pode ser usada junto com moléculas de ligação de ligante de plexina Dl e/ou com moléculas que se ligam a ácidos nucléicos codificando plexina Dl. Ou moléculas de ligação de ligante de plexina Dl podem ser combinadas com moléculas que se ligam a ácidos nucléicos codificando plexina DL

As moléculas de ligação de plexina Dl da invenção podem ser usadas em um método de tratar uma doença mediada por expressão de plexina Dl, compreendendo liberação intravenosa das moléculas de ligação da invenção em uma dose, efetiva para tratar aquela doença.

As moléculas de ligação também podem ser usadas em um método de diagnosticar uma doença mediada por expressão de plexina Dl, compreendendo liberação intravenosa de conjugados de moléculas de ligação de plexina Dl com um traçador paramagnético, fluorescente ou radioativo seguido por formação de imagem por ressonância magnética, formação de imagem ótico, SPECT ou PET.

As moléculas de ligação podem ser adicionalmente usadas em um método de tratar ou suprimir uma doença mediada por expressão de plexina Dl, compreendendo liberação intravenosa das moléculas de ligação proteináceas e moleculares pequenas da invenção ou uma composição de moléculas de ligação proteináceas e moleculares pequenas.

A doença a ser tratada ou diagnosticada pode ser câncer, uma doença inflamatória, em particular uma doença autoimune, tal como artrite reumatóide, ou arteriosclerose, ou esclerose múltipla.

Diagnose pode ser realizada in vivo e in vitro. Um método in vivo é descrito acima e pode ser realizado com formação de imagem por ressonância magnética (MRI) ou com câmeras SPECT ou PET depois de acumulação da molécula de ligação radioativamente marcada no tecido doente.

Outro método diagnóstico compreende detectar a presença de plexina Dl em uma amostra in vitro ou ex vivo. Tal método compreende colocar em contato a amostra com moléculas de ligação de plexina Dl, ou ácidos nucléicos que se ligam ao gene de plexina Dl ou seu mRNA ou um DNA de cópia derivada de seu mRNA, todos ligados a um marcador detectável, em condições que um complexo entre o anticorpo e plexina Dl se forma, e detectar a formação do complexo. O complexo pode ser detectado visualizando o marcador detectável. Amostras podem ser fluidos corporais, tal como sangue, soro, plasma, saliva, urina, sêmen, fezes, ou tecidos, tal como biópsias de células tumorosas.

A invenção adicionalmente se refere a um vetor de expressão, compreendendo a seqüência de codificação para anticorpo de Lhama F8 ou A12, ou para o anticorpo de cadeia única derivado de anticorpo 11F5H6 e seqüências reguladoras adequadas. A invenção também se refere a uma célula transfectada com o dito vetor de expressão. A invenção adicionalmente se refere à proteína recombinante viável expressando o vetor de expressão.

Outro aspecto da invenção se refere a um vetor de expressão, compreendendo a seqüência de codificação para o domínio extracelular de plexina Dl, opcionalmente fundida a uma região constante de uma cadeia pesada humana e seqüências reguladoras adequadas. A invenção também se refere a uma célula transfectada com o dito vetor de expressão. A invenção adicionalmente se refere à proteína recombinante obtenível expressando o vetor de expressão.

A proteína recombinante compreende o domínio extracelular de plexina Dl, que se liga a ligantes de plexina Dl e assim previne ligação dos ligantes a plexina Dl associada à célula. Preferivelmente, a seqüência de codificação codifica para uma proteína recombinante compreendendo aminoácidos 47-506 do domínio extracelular de plexina Dl, que se liga a ligantes de plexina Dl e assim previne ligação dos ligantes a plexina Dl associada à célula, ou aminoácidos 507-1274 do domínio extracelular de plexina Dl, que se liga a ligantes de plexina Dl e assim previne ligação dos ligantes a plexina Dl associada à célula. Tal proteína recombinante pode carregar mutações que aumentam a afinidade para ligantes de plexina Dl e com isso tendo potência aumentada como receptor de atração. Tais mutações normalmente são induzidas fazendo mudanças na seqüência de codificação usada para produzir a proteína recombinante.

A invenção adicionalmente se refere ao uso das moléculas de ligação da invenção em um método de tratar ou suprimir uma doença mediada por plexina Dl, compreendendo liberação intravenosa ou intratumoral de domínios extracelulares de plexina Dl de atração como descrito acima, ou em um método de tratar ou suprimir uma doença mediada por plexina Dl, compreendendo liberação intravenosa de adenovírus ou lentivírus, contendo os nucleotídeos de codificação para os domínios extracelulares recombinantes de plexina Dl ou partes destes como descrito acima.

Estes receptores antagonísticos de plexina Dl de atração interferem na interação entre plexina Dl e seus ligantes, em particular neuropilina-1, semaforina 3C e semaforina 3E, e com isso interferem em função de plexina Dl.

Preferivelmente, os receptores de plexina Dl de atração têm afinidade aumentada para ligantes de plexina Dl, se comparados com plexina Dl. Tal afinidade aumentada pode ser obtida criando uma biblioteca de domínios extracelulares de plexina Dlj carregando em mutações aleatórias introduzidas, e selecionando receptores de atração com o mais potente comportamento antagonístico em ensaios de migração celular.

A fim de produzir ditas moléculas proteináceas (incluindo peptídeos, polipeptídeos e polipeptídeos glicosilados ou polipeptídeos tendo outras modificações pós- ou peritraducionais) é desejável inserir o ácido nucléico recombinante que codifica fragmentos do domínio extracelular de plexina Dl que compreendem os sítios de ligação para semaforina 3C, semaforina 3E e NP-I em vetores de expressão. Os antagonistas de acordo com a invenção preferivelmente são produzidos a partir de um ácido nucléico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção, preferivelmente em uma célula hospedeira.

As moléculas da invenção também podem ser usadas em uma combinação de métodos de tratamento como descrito acima e/ou com terapias convencionais ou terapia anti-angiogênica para prevenir adicionalmente a formação de uma neovasculatura de tumor, ou radioterapia e/ou quimioterapia adjuvante.

A invenção adicionalmente se refere a um método para identificar moléculas que são capazes de se ligar a plexina Dl, cujo método compreende colocar em contato uma coleção de moléculas com plexina Dl e selecionar as moléculas da coleção que mostram ligação com plexina Dl como moléculas de ligação de plexina Dl. A coleção de moléculas pode por exemplo estar presente em bibliotecas de molécula pequena, em um arranjo protéico, etc. As técnicas para triar coleções de moléculas são conhecidas por si só. A invenção reside na identificação do alvo que deve ser ligado, que é plexina Dl.

Neste pedido o termo "molécula de ligação" é usado para todos os tipos de moléculas de ligação, i.e. aquelas que se ligam a plexina Dl, aquelas que se ligam a um ácido nucléico codificando o gene de plexina Dl e aquelas que se ligam a ligantes de plexina DL

Todos estes tipos de moléculas podem ser acoplados a compostos efetores como descrito acima.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A presente invenção será adicionalmente ilustrada nos Exemplos que seguem e que não são de maneira alguma pretendidos para limitar a invenção. Nos Exemplos referência é feita às seguintes figuras:

Figura 1: Domínios estruturais de membros da família de plexina: quatro subfamílias foram identificadas, denominadas plexina A-D. Caixas hachuradas horizontalmente indicam domínios Sema, caixas hachuradas diagonalmente indicam motivos de seqüências relacionadas a Met (MRS), e a caixa clara indica o atípico motivo de MRS de PLXND1. Membros da subfamília B de Plexina têm um sítio proteolítico potencial tipo furina, marcado por uma banda cinza. A região transmembrana é marcada por uma caixa sombreada e é seguida por dois domínios intracelulares conservados, juntos compreendendo o domínio SP, marcado por duas ovais.

Figura 2: A) Análise de hibridização in situ de lesões cerebrais Mel57- VEGF-A165 usando uma sonda de RNA plxndl específica de camundongo marcada com digoxigenina. Vasos de tumor são fortemente positivos (setas) ao passo que capilares cerebrais, distantes das lesões, são negativos (compare o perfil de ISH com a marcação com CD34 em Figura 2B).

Figura 3: Análise ISH específica para PLXNDl humano de glioblastoma multiforme (A) metástases cerebrais de sarcoma (B)s melanoma (C) e mamacarcinoma (D). Inserções mostram marcações com CD31 de seções em série. ISH de controle usando sondas sentido foram negativos (não mostrado). Observe que nestes tumores expressão de PLXNDl não é confinada aos vasos sangüíneos: também em células tumorosas altos níveis do transcrito de PLXNDl são encontrados. t=tumor, V=vaso.

Figura 4: Análise ISH usando uma sonda de RNA marcada com digoxigenina específica de humano (A) e marcação imunohistoquímica com CD31 (B) de cérebro normal. Observe que vasos estão abundantemente presentes mas estes não expressam o transcrito de plexina Dl.

Figura 5: Especificidade de fagos (A) e anticorpos de domínio único correspondentes (sdabs) (B) A12 e F8 para peptídeo H2N- ALEIQRRFPSPTPTNC-CONH2. Em A, IOl0 fagos foram permitidos se ligarem a PLXNDl-peptídeo, B SA, IgG humana ou peptídeo irrelevante como descrito no texto. Depois de rigorosa lavagem, fagos ligados foram detectados usando um anticorpo anti-M13. Em B, incubações similares foram realizadas mas agora com sdabs solúveis. Depois de lavagem, sdabs ligados foram detectados e semiquantificados através da VSV-G-etiqueta.

Figura 6: As constantes de dissociação (kd's) da ligação entre anticorpos A12 e F8 de domínio único foram determinadas usando o biosensor de Biacore 2000 (Uppsala, Sweden). O circuito integrado sensor e produtos químicos de acoplamento de proteína foram adquiridos a partir de Biacore AB. Conjugado PLXND 1-peptídeo-KLH (27 pg/ml em Na-Acetato, pH 4,0) ou BSA (1 pg/ml em Na-Acetato, pH 5,0) foi acoplado a superfícies ativadas de CM5 usando N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida, N- hidroxisuccinimida, em condições recomendadas pelo fabricante. Grupos não tratados foram inativados por 1 M de etanolamina, pH 8,5.

Medidas cinéticas foram realizadas a 25°C com uma vazão de ml/min em tampão HBS-EP (10 mM de Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaC 1,3 mM de EDTA, 0,005% de tensoativo P20). Seis concentrações de sdabs purificados por afinidade de Ni (no intervalo de 1 mM a 50pM) foram usadas para determinar as constantes de dissociação (Kds) da interação com o PLXND 1-peptídeo. Depois de cada experimento, regeneração da superfície de sensor foi realizada com 10 mM de NaOH.

Ligação específica, definida por ligação com uma superfície de PLXNDl menos ligação com uma superfície de BSA de controle, foi analisada usando o aplicativo computacional BlAevaluation 4.1 e um modelo de ligação de Langmuir 1:1. Afinidades de anticorpos A12 e F8 de domínio único foram 2,1 χ 10-8 M e 3,5 χ 10-8 Μ.

Figura 7: Avaliação de especificidade para plexina Dl de anticorpos de domínio único. Figura A mostra marcação imunohistoquímica da placa de crescimento de osso trabecular de um embrião de camundongo (E16.5) com anticorpo A12 de domínio único, utilizando a etiqueta VSV-G para detecção do anticorpo. A inserção mostra uma hibridização in situ de uma estrutura embriônica similar usando uma sonda de plexina Dl marcada com digoxigenina específica de camundongo. Observe a sobreposição de hibridização in situ de e imunomarcação de plexina Dl. Figura 7B é um exemplo representativo de uma lesão Mel57- VEGF-A165 em cérebro de um camundongo nu. A vasculatura que também é positiva em plexina Dl ISH (veja também figura 2) é imunopositiva com anticorpo F8 de cadeia única.

Figura 8: Imunomarcações com anticorpo Alt de cadeia única em uma seleção de tumores cerebrais humanos. Tumores mostrados são A) glioblastoma multiforme, metástases de B) melanoma C) mamacarcinoma e D) carcinoma de célula renal. As inserções em A e B consistem de marcações de controle com anticorpo anti-VSV apenas, e mostram que a marcação de tumor é específica. Observe que vasos e células tumorosas são altamente reativos com o anticorpo.

Figura 9: ImunomarcaçÕes com anticorpo A12 de domínio único em uma série de progressão de melanoma. ImunomarcaçÕes foram realizadas em um naevi, um naevi displásico e fases de crescimento horizontal e vertical de melanoma. Observe que apenas as células neoplásicas expressam plexina Dl.

Figura 10: ImunomarcaçÕes com anticorpo A12 de domínio único em seções de tumores cerebrais Mel57-VEGF-A em camundongos, tratados com ZD6474. Em camundongos não tratados ou tratados com placebo, vasos de tumor marcam positivos com este anticorpo.

Entretanto, em camundongos tratados com ZD6474, existe uma diminuição dose-dependente de expressão de plexina Dl. ZD6474 foi dado oralmente, uma vez por dia, na dosagem como indicado.

Figura 11: ImunomarcaçÕes duplas com o marcador de macrófago CD68 (colorido azul) e anticorpo A12 de cadeia única (colorido vermelho) em mamacarcinoma. Uma subpopulação de macrófagos expressa plexina Dl como revelado por proteína de marcação roxa.

Figura 12: Rastreamento in vivo de fago A12, F8 ou um fago irrelevante para lesões cerebrais Mel57-VEGF165. Camundongos portando tumor foram injetados com 1012 fagos na veia caudal e depois de 5 minutos camundongos foram anestesiados e sujeitos a perfusão cardíaca com 15 ml de salina tamponada com fosfato. Camundongos foram sacrificados, cérebros removidos e seções congeladas foram analisadas para teor e distribuição de fagos. A) Marcação com M13 de uma seção congelada de lesões cerebrais Me 157-VEGF165. Fagos são claramente associados a vaso, como evidenciado pela imunomarcação com anti-CD34 em uma seção serial, mostrada em Β). O ponto de setas em um vaso positivo para CD34, distante da lesão, que não é destacado por marcação com anti-M13. A inserção em (A) mostra um experimento de controle onde um fago irrelevante foi injetado. C) Distribuição de sdab F8 depois de injeção intravenosa em camundongos portando tumor. Sdabs são visualizados por imunohistoquímica usando um anticorpo anti-VSV. Observe que o sdab é detectado em vasos de tumor mas não em capilares cerebrais normais. A inserção mostra o experimento de controle onde um sdab irrelevante foi injetado. Uma localização intersticial foi observada, consistente com a natureza vazada dos vasos nestes tumores. D) Quantificação de rastreamento de fagos. Tecido de tumor foi dissecado a partir de seções congeladas de 10 pm usando microscópio de dissecção por captura a laser. Número de fagos formadores de colônia (cfp) foi contado depois de infecção de células TGl. Vinte vezes mais fagos F8 foram eluídos de tumores do que de áreas comparáveis de tecido cerebral não afetado.

Figura 13: Anticorpo de domínio único volta para vasos de tumor que não são recentemente formados por si. Camundongos nus foram inoculados com uma suspensão celular de 1,5x105 células do xenotransplante de glioma humano E98, que foi obtida a partir de um tumor E98 subcutâneo. Depois de 3 semanas, fagos carregando anticorpo F8 de domínio único foram injetados na veia caudal, e depois de 5 minutos camundongos foram anestesiados e sujeitos a perfiisão cardíaca usando 15 ml de salina tamponada com fosfato. Camundongos foram então sacrificados, cérebros removidos e fixados em formalina. Seções seriais foram marcadas com anticorpos contra proteína Ml 3 p8 (A), o marcador endotelial CD34 (B) e glut-1 (C, um marcador para capilares cerebrais pré-existentes). Comparação de A, B e C revela que não apenas vasos de tumor recentemente formados acumulam fago F8, mas também vasos cerebrais não dilatados que expressam glut-1 e que portanto são considerados vasos cerebrais pré-existentes que foram incorporados no tumor.

Figura 14: Efeitos de domínios extracelulares de plexina Dl no desenvolvimento de vasculatura de tumor. Transfectantes duplos da linhagem celular Mel57 de melanoma humano, expressando VEGF-A165 e o domínio extracelular de plexina Dl compreendendo aminoácidos 1-850, foram injetados na artéria carótida interna direita de camundongos nus. Depois de três semanas os camundongos foram sujeitos a formação de imagem por ressonância magnética estimulado por Gadolínio-DTPA. Figura 14A mostra imagens MR de dois camundongos de controle carregando tumores cerebrais Mel57 que expressam VEGF-A165 apenas, Figura 14B mostra imagens MR de cérebros de dois camundongos carregando o transfectante duplo. Extravasamento vascular, como ensaiado por extravasamento com Gd-DTPA, tende a ser menor nos transfectantes duplos, sugerindo que extravasamento vascular induzido por VEGF-A é contrabalançado pelo ectodomínio de plexina Dl. Mais importantemente, vasos sangüíneos nos tumores duplamente transfectados são ativados, como indicado por aumento de CD34, ainda que eles expressem glut-1, sugerindo fortemente que estes vasos são vasos pré- existentes que estão incorporados no tumor pelo fenômeno de co-opção. Observe que os vasos sangüíneos nos tumores expressando VEGF-Al 65 apenas, são negativos para glut-1 e portanto podem ser considerados como sendo recentemente formados.

Figura 15: Western blots foram gerados com ectodomínios de plexina Dl recombinante, expressos em E.coli e abrangendo aminoácidos 47-506 (linhas 1) ou 225-388 (linhas 2). Soro de camundongo foi testado antes de (painel A) e depois de (painel B) imunização com região 47-506 de plexina Dl. Como mostrado em figura 15B, o soro imune de camundongo reconheceu especificamente proteína recombinante 47-506 de E.coli (52 kDa, linha 1) e a proteína abrangendo resíduos 225-388 de plexina Dl (uma proteína de 18 kDa que fica completamente dentro da seqüência que foi usada para imunização, linha 2). O soro pré-imune não mostrou uma tal reatividade (painel A). Quando testado em corantes imunohistoquímicos em uma metástase cerebral de um sarcoma de tecido macio alveolar, o soro imune de camundongo (painel D), mas não o soro pré-imune (painel C), mostrou positividade para vasos sangüíneos e células tumorosas, um padrão de marcação que foi similar àquele de anticorpo A12 de domínio único.

Figura 16: Imunohistoquímica com anticorpos monoclonais IgM5 obtidos a partir de linfócitos B de camundongo. Anticorpos 11F5H6 e .17E9C12 foram selecionados baseado em reatividade contra proteína 47-506 em ELISA, e foram analisados para seu potencial de detectar plexina Dl em seções congeladas de tumores humanos. Estes anticorpos mostraram forte positividade em metástases cerebrais de sarcoma e melanoma, como ilustrado na figura. De importância, as inserções em painéis C-F representam marcações de controle nas quais o anticorpo primário foi omitido. Painéis A e B mostram que estes anticorpos não reconhecem particularmente estruturas de vasos em tecido cerebral normal.

Figura 17: Rastreamento de tumor de anticorpo 11F5H6

Para avaliar adicionalmente se anticorpo monoclonal 11F5H6 é capaz de reconhecer vasos sangüíneos de tumor, tumores angiogênicos Me 15 7-VEGF-A foram crescidos em cérebros de camundongos nus, essencialmente como descrito em exemplo 10. Anticorpo 11F5H6 (1 mg) foi injetado em uma veia caudal lateral e permitido para circular por 15 minutos. Depois deste período, os camundongos foram anestesiados com 1,3% de isoflurano e o tórax foi aberto, com o qual uma perfusão cardíaca foi realizada com 20 ml salina tamponada com fosfato. Depois deste procedimento, camundongos foram decapitados, e cérebros removidos e imediatamente congelados ou fixados em formalina. Seções congeladas de 4 μηι foram marcadas com anticorpo anti-IgM. Em figura 17A é mostrado que anticorpo .11F5H6 volta para e se acumula em vasos de tumor mas não em vasos normais (compare marcação com anti-IgM em figura 17A com a marcação com CD31 anti-endotelial em figura 17B). Tal marcação não é vista quando realizando marcação com anti-IgM em camundongos não injetados. Assim, 11F5H6 é um anticorpo promissor que permite marcação de tumor.

Figura 18: Expressão de Plexina Dl em macrófagos em um modelo de camundongo de artrite reumatóide. Marcações foram realizadas com anticorpo Al2 de domínio único

Figura 19: Expressão de Plexina Dl em arteriosclerose. Um subconjunto de macrófagos em placas ateroscleróticas humanas expressa plexina DL Marcações foram realizadas com anticorpo Al2 de domínio único. Uma marcação dupla foi realizada, apresentando plexina Dl em vermelho e o marcador de macrófago CD68 em azul. Uma cor roxa indica co-expressão.

As tabelas mostram o seguinte:

Tabela I: Análise de diferentes patologias para expressão de plexina Dl.

Tabela II: Expressão de plexina Dl em lesões melanocíticas aumenta de lesões benignas para malignas

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Expressão específica de plexina Dl em vasos sangüíneos associados a tumor

Plexina Dl é expressa em neurônios mas também células endoteliais em vasos angiogênicos durante embriogênese. A presente invenção demonstra que plexina Dl é expressa em vasos sangüíneos associados a tumor mas não em vasos sangüíneos normais. Isto foi mostrado por hibridização in situ de cérebros de camundongo, contendo lesões angiogênicas de melanoma humano (Figura 2). O modelo de tumor de animal é descrito em (Kusters, B et ai., Câncer Res 63:5408-5413 (2003)). Em resumo, células tumorosas são injetadas através de um procedimento microcirúrgico na artéria carótida direita, resultando em crescimento de tumor no parênquima do hemisfério cerebral direito. Depois de três semanas, no início de sintomas neurológicos, camundongos são sacrificados e cérebros removidos e fixados em formalina.

Seções de 4 pm foram sujeitas à hibridização in situ com fragmentos de RNA sentido e antisentido marcados com digoxigenina. Sondas de RNA foram geradas por transcrição usando RNA polimerase T3 e Tl9 respectivamente, a partir de um produto de PCR5 abrangendo 600 bases na região 3' não traduzida, e que foi flanqueado por promotores de T7 e T3(Van der Zwaag et ai. (2002), acima).

Hibridizações in situ usando sondas de RNA antisentido e sondas de RNA sentido como controles negativos, foram realizadas usando protocolos padrão. Seções foram desparafinadas por parafina derretida a 60°C e tratamentos subseqüentes com xileno e etanol. Depois de reidratação em salina tamponada com fosfato (PBS) uma digestão com proteinase K foi realizada (10 pg/ml PBS em 20 mM de Tris-HCl pH7,4/5 mM de EDTA) por minutos a 37°C. Seções foram pós-fíxadas em 4% de formaldeído tamponado por 10 minutos, e acetiladas em 0,1 M de anidrido de ácido acético. Lâminas foram lavadas subseqüentemente em 2xSSC (citrato de sódio/cloreto de sódio) e milliQ. Depois de secagem, lâminas foram hibridizadas com sondas de RNA marcadas com digoxigenina durante a noite a 65°C em 50% de formamida/2xSSC.

Altos níveis de plexina Dl RNA foram observados em vasos de tumores angiogênicos Mel57 (Figura 2) usando uma sonda de RNA de plexina Dl específica de camundongo. Células tumorosas também foram positivas para o transcrito. A homologia não perfeita entre plexina Dl de camundongo e humana resulta em um sinal mais fraco nas células tumorosas humanas usando a sonda de camundongo.

EXEMPLO 2

Expressão de plexina Dl em tumores

Para investigar expressão de RNA de plexina Dl RNA em amostras de tumores humanos, foram realizadas hibridizações in situ com uma sonda de RNA de plexina Dl específica de humano. Altos níveis de expressão de RNA de plexina Dl foram encontrados em diversos tumores humanos, dos quais (glioblastoma multiforme, metástases cerebrais de sarcoma, carcinoma de célula renal, adenocarcinoma do cólon e da mama) tanto em vasculatura de tumor como células tumorosas. Um resumo de tipos de tumores expressando plexina Dl é dado em Tabela 1. Figura 3 mostra alguns exemplos de hibridizações in situ, e.g. um glioblastoma, uma metástase cerebral de melanoma e uma metástase cerebral de carcinoma de cólon. RNA de plexina Dl foi encontrado não apenas na vasculatura de tumor, mas também excessivamente nas próprias células tumorosas. Importantemente como em figura 4A, nenhuma expressão de RNA de plexina Dl é observada em vasculatura de cérebro normal. Em figura 4B uma marcação com CD31 é mostrada, demonstrando que vasos abundantes estão presentes nestas seções. EXEMPLO 3

Preparação de anticorpos contra plexina Dl

Para detectar proteína plexina Dl, anticorpos foram selecionados com afinidade para plexina Dl. Para este fim, uma biblioteca de fago Ml 3 pHENIX foi construída expressando anticorpos de Lhama V-H de domínio único, construídos por RT-PCR a partir de linfócitos B de Lhama como descrito (van Koningsbruggen, S et al.s J Immunol Methods 279:149-161 (2003)). A população de cDNAs resultantes codificando fragmentos de anticorpo de domínio único (sdab) V-H foi ligada em fagomídeo vetor pHENIXHis8VSV (resultados não mostrados), resultando em um produto de fusão com uma etiqueta 8*His e uma etiqueta VSV-G no término C. Depois de eletroporação em células TGl de E. coli, colônias resistentes a ampicilina foram coletadas e combinadas.

A biblioteca resultante teve uma complexidade de 8x108 clones. Oitenta porcento de plasmídeos tiveram inserto de sdab de comprimento completo como determinado por análise de PCR e detecção imunológica dot-blot da etiqueta VSV-G em sdabs (veja abaixo). A biblioteca de fago foi propagada como fagomídeos em bactérias E. coli TGl. Partículas de fagomídeos foram resgatadas por infecção com fago ajudante sensível a tripsina M13K07 (50). Fagos foram purificados e concentrados a partir do sobrenadante de cultura por precipitação com 20% de Polietilenoglicol/2,5 M de NaCl através de metodologia padrão.

Para selecionar por fagos, anticorpos apresentados com afinidade para plexina Dl, imunotubos (Nunc, Roskilde, Denmark) foram revestidos durante a noite a 4°C com 5 pg/ml de peptídeo conjugado de KLH (H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC-CONH2), correspondendo a aminoácidos 1-16 da proteína PLXNDl humana madura (no. de acesso AYl 16661) em 50 mM de NaHC03 (pH 9,6). De importância, o ácido glutâmico em posição 3 neste peptídeo é uma Usina na seqüência de camundongo, os aminoácidos remanescentes são homólogos a plxndl de camundongo.

Depois de rigorosa lavagem com PBS/0,05% de Tween 20 (PBST), sítios de ligação não específicos foram bloqueados com 5% de maravilha em PBST (MPBST, 1 h em temperatura ambiente (RT)) e 1013 partículas de fagos do estoque de biblioteca foram incubadas com o peptídeo imobilizado por 90 min em RT. Depois de rigorosa lavagem com PBST e PBS, fagos ligados foram eluídos por tratamento com tripsina (10 mg/ml, 30 min RT).

Depois de inativação com tripsina com 1% de soro de bezerro recém-nascido, o eluato foi usado para infectar células TGl em fase Iog para amplificar fagos de ligação de PLXNDl e calcular número de ligantes.

Para enriquecer para fagos de ligação, quatro ciclos de seleção foram realizados. A partir do segundo ciclo, seleções foram realizadas contra peptídeos não conjugados, imobilizados em placas de ligação de DNA (Costar) para prevenir seleção de ligantes de KLH. Fagos de ligação de PLXNDl individuais com insertos de sdab de comprimento completo confirmados por PCR foram testados para especificidade para plexina Dl. Poços de placas de ligação de DNA ou imunoplacas (Nunc) foram revestidos durante a noite a 4°C com PLXNDl- peptídeo ou um peptídeo irrelevante (1 pg/poço em PBS/0,5 M de NaCl pH .9,0), Albumina de soro bovino (1 pg/poço em 50 mM de NaHC03 pH 9,6) ou imunoglobulina G humana (1 pg/poço em 50 mM de NaHC03 pH 9,6). Depois de bloquear sítios de ligação não específicos com MPB ST, poços foram incubados com fagos em MPBST por 1 h em RT e fagos não ligados removidos por lavagem rigorosa. Fagos ligados foram detectados usando anti- M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech5 Piscataway5 NJ, USA) e tetrametilbenzidina (TMB; bioMerieux B.V., Netherlands). A reação foi interrompida com 2M de H2S04 e atividade enzimática quantificada medindo absorbância em 450 nm usando um leitor de ELISA.

Usando este procedimento de seleção, fagos apresentando anticorpos A12 e F8 de domínio único V-H em suas superfícies foram identificados como ligantes específicos. Figura 5A mostra que anticorpos A12 e F8 associados a fago Ml3 se ligam especificamente a peptídeo plexina Dl, mas não a albumina de soro bovino, imunoglobulinas ou um peptídeo irrelevante.

Expressão de anticorpos de domínio único solúveis foi induzida em células TGl em fase Iog de E.coli cultivando a 30°C em 2x meio TYA /1 mM de IPTG. Sdabs foram coletados por Iise osmótica usando tampão TES congelado (200mM de TrisHCl, 0,5 mM de EDTA, 500 mM de sucrose) contendo um coquetel inibidor de protease (Roche, Basel, Switzerland). Concentrações de sdab foram estimadas através de análise dot- blot usando o anti-VSV-G P5D4 monoclonal de camundongo, imunoglobulina de coelho anti-camundongo conjugada a fosfatase alcalina (Dako, Denmark) e marcação com NBT/BCIP. Sdabs foram testados em ELISA para especificidade de PLXND 1-peptídeo. Anticorpos A12 e F8 de domínio único não se ligaram a peptídeo irrelevante, não a albumina de soro bovino, e não a imunoglobina G humana (Figura 5B). As constantes de dissociação (kd's) da ligação entre anticorpos A12 e F8 de domínio único foram determinadas usando o biosensor de Biacore 2000 (Uppsala, Sweden). Os circuitos integrados de sensor e produtos químicos de acoplamento de proteína foram adquiridos a partir de Biacore AB. Conjugado PLXNDl- peptídeo-KLH (27 pg/ml em Na-Acetato, pH 4,0) ou BSA (1 pg/ml em Na- Acetato, pH 5,0) foi acoplado a superfícies ativadas de CM5 usando N-etil- N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida, N-hidroxisuccinimida, em condições recomendadas pelo fabricante. Grupos não tratados foram inativados por 1 M de etanolamina, pH 8,5.

Medidas cinéticas foram realizadas a 25°C com uma vazão de 10 ml/min em tampão HBS-EP (10 mM de Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensoativo P20).

Seis concentrações de sdabs purificados por afinidade de Ni (no intervalo de 1 mM a 50pM) foram usadas para determinar as constantes de dissociação (Kds) da interação com o PLXND 1-peptídeo. Depois de cada experimento, regeneração da superfície de sensor foi realizada com 10 mM de NaOH.

Ligação específica, definida por ligação com uma superfície de PLXNDl menos ligação com uma superfície de BSA de controle, foi analisada usando o aplicativo computacional BlAevaluation 4.1 e um modelo de ligação Langmuir 1:1.

Afinidades de anticorpos A12 e F8 de domínio único foram 2,1 χ 10-8 M e 3,5 χ 10-8 M, respectivamente (Figura 6).

EXEMPLO 4

Marcações imunohistoquímicas com anticorpos A12 e F8 de domínio único Os anticorpos de domínio único são etiquetados na extremidade carboxiterminal com uma etiqueta VSV-His, possibilitando marcações imunohistoquímicas usando um anticorpo anti-VSV. O protocolo seguinte foi seguido para marcações imunohistoquímicas com anticorpos A12 e F8 domínio único. Seguindo desparafmização, atividade de peroxidase endógena foi bloqueada por incubação com 0,03% de H202. Recuperação de antígeno foi realizada por tratamento com pronase de acordo com protocolos padrão. Subseqüentemente, lâminas foram pré-incubadas com soro normal de cavalo ou cabra (para bloquear sítios de ligação não específicos em seções de tecidos humanos e de camundongo, respectivamente), seguido por incubação com sdabs por 1 hr. Sdabs foram detectados por incubações seqüenciais em 1 h com um antisoro anti-VSV-G de camundongo ou coelho (Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, The Netherlands), anticorpo biotinilado anti- camundongo ou anti-coelho como apropriado (Vector, Burlingame, CA), e complexo de avidina-biotina peroxidase (Vector, Burlingames CA). Finalmente, peroxidase foi visualizada pela reação de 3-amino-9-etilcarbazol (ScyTek, Utah, USA) peroxidase com hematoxilina como contra corante. Todas as etapas foram realizadas em RT.

A especificidade do anticorpo A12 e F8 para plexina Dl em corantes imunohistoquímicos foi primeiro examinada marcando embriões de camundongo nos quais padrões de expressão de plexina Dl no nível de RNA foram bem caracterizados (Van der Zwaag et al. (2002), acima), e comparando perfis com imunomarcações com anticorpo anti-endotelial anti- CD31 (DAKO, Glostrup, Denmark). Em placa de crescimento de osso trabecular de embriões de camundongos em E 16.5, imunomarcação foi observada em vasos sangüíneos CD31-positivos. O perfil de marcação se correlacionou bem com hibridização in situ para o transcrito de plexina Dl (figura 7A). A origem de vaso sangüíneo de expressão de PLXNDl foi adicionalmente confirmada realizando marcações em seções seriais com sdabs e anticorpo anti-CD31 anti-humano (CD31 anti-humano).

EXEMPLO 5

Marcação de células tumorosas com F 8

Xenotransplantes cerebrais de camundongo de seções de quatro pm da linhagem celular de melanoma humano Mel57-VEGF-A (Kusters et ai. (2003), acima) foram marcadas com anticorpo F8 de domínio único, de acordo com o protocolo exemplificado em Exemplo 4. O anticorpo claramente reconheceu plexina Dl em vasos sangüíneos de tumor (Figura .7B). Para investigar adicionalmente expressão de proteína plexina Dl em tumores, tecido embebido em parafina do arquivo ou tumor de origem diferente (glioblastoma multiforme (Figura 8A), metástases cerebrais de melanoma (Figura 8B) carcinoma de cólon (Figura 8C) e carcinoma de célula renal (Figura 8D)) foram imunomarcados com sdabs anti-PLXND 1. Imunohistoquímica usando anticorpo A12 e comparação com marcações de CD31 anti-humano em seções seriais, mostrou expressão em todos os tumores examinados e confirmou expressão de plexina Dl no nível protéico em células tumorosas e em vasos sangüíneos de tumor.

EXEMPLO 6

Programação de expressão de plexina em células malignas

Para investigar se expressão de plexina Dl ocorre em células pré-malignas, foi colorida uma série de progressão de melanoma, consistindo de naevis benignos, naevis displásicos, melanoma de fase de crescimento radial, melanoma invasivo e melanoma disseminado. Melanócitos em naevis benignos e naevis displásicos não expressam a proteína, ao passo que células transformadas malignamente, tanto em tumores em fase de crescimento radial como em fase de crescimento vertical são positivos para a proteína (Figura 9 e Tabela II).

EXEMPLO 7

Estado de ativação de células expressando plexina Dl Expressão de plexina Dl é relacionada com o estado de ativação das células endoteliais em vasos sangüíneos de tumor. Tratamento com ZD6474, um inibidor de VEGFR2 e EGFR5 foi previamente mostrado bloqueando angiogênese em um modelo de tumor cerebral de camundongo, resultando em uma mudança fenotípica de um fenótipo co-optante de vaso angiogênico para não angiogênico (43). Tratamento com ZD6474 resultou em uma diminuição de expressão de plexina Dl em vasos sangüíneos associados a tumor de uma maneira dose dependente (Figura 10). Assim5 expressão de plexina Dl é uma característica de células endoteliais ativadas.

EXEMPLO 8

Imunohistoquímica com A12 em tecidos normais Expressão de plexina Dl em cérebro normal, coração, pele, rim5 baço, intestino, endométrio foi examinada por imunohistoquímica usando anticorpo A12. Vasos em miométrio proliferativo expressaram plexina Dl, mostrando que plexina Dl está associada não apenas com angiogênese patológica, mas também com angiogênese fisiológica (não mostrado).

Em algumas instâncias, co-imunomarcações foram realizadas com o marcador de macrófago CD68. Estas marcações revelaram que uma subpopulação de macrófagos expressou a proteína (figura 11). Também fibroblastos em pele e algumas células epiteliais intestinais proliferantes foram encontradas expressando plexina Dl (não mostrado).

EXEMPLO 9

Marcação de macrófagos em doenças inflamatórias Para examinar adicionalmente o envolvimento de plexina Dl em doenças com envolvimento proeminente de macrófago, marcações imunohistoquímicas foram realizadas em placas ateroscleróticas, esclerose múltipla e artrite reumatóide. Macrófagos expressam plexina Dl.

EXEMPLO 10

Acesso em plexina Dl em vasos de tumor através de injeção intravenosa

A expressão de proteína plexina Dl em vasos sangüíneos de tumor sugere que plexina Dl é acessível através de injeção intravenosa. Para testar isto, 2x105 células Me 157 estavelmente transfectadas expressando a isoforma VEGF-Al 65 foram microcirurgicamente injetadas na artéria carótida interna direita de camundongos nus BALB/C. Depois de 18 dias, quando animais mostraram sintomas neurológicos (Kusters et ai, (2003), acima), 1012 fagos de ligação PLXND/- de clones A12, F8 ou fagos não relevantes foram injetados na veia caudal de camundongos nus, carregando metástases cerebrais Mel57-VEGF-A165 estabelecidas (n=2 para A12, n=4 para F8, n=3 para fago de controle).

Em dois outros grupos de camundongos, foram injetados intravenosamente 30 pg de sdab F8 ou um sdab de controle (n=2 para cada grupo). Depois de 5 minutos, camundongos foram anestesiados usando isoflurano, os tórax foram abertos, e fagos não ligados foram lavados do sistema por perfusão cardíaca com 15 ml de salina tamponada com fosfato (PBS). Então, camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, e partes de cérebros, corações, pulmões, fígados, baços e rins foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido.

Outras partes foram fixadas em formalina para serem embebidas em parafina. Depois de curta marcação com hematoxilina, tumores foram dissecados a partir de seções cerebrais de 10 pm usando microscopia de dissecção por captura a laser (microscópio de dissecção a laser de Leica). Areas equivalentes foram dissecadas a partir de cérebro não afetado, contralateral ao tumor.

Subseqüentemente, fagos foram eluídos a partir de amostras de tecido dissecado usando tratamento com tripsina e usados para infectar células TG1. Números de fagos formadores de colônia foram contados e usados como uma medida de rastreamento de tumor. Para verificar qualitativamente rastreamento de tumor por fagos ou sdabs, seções de 4 pm, seriais para as seções usadas para dissecção a laser, foram marcadas com anticorpo anti-M13 p8 (Abcam Limited, Cambridge, UK) para detectar fagos ligados, ou anticorpos anti-VSV-G (Sigma-Aldrich) para detectar anticorpos de domínio único.

Injeção intravenosa de fagos M13 apresentando anticorpo F8 de domínio único anti-PLXNDl, mas não fagos carregando anticorpos de domínio único irrelevantes, em camundongos carregando lesões angiogênicas de melanoma resultou em acumulação de fagos em vasos de tumor mas não a presença específica detectável de fagos em vasos cerebrais normais, nem vasos sangüíneos em fígado, baço, rim (Figura 12A,D e não mostrado). Isto indica que plexina Dl é expressa no lado luminal da célula endotelial especificamente em vasos sangüíneos de tumor e assim pode ser usada como um marcador marcável.

Injeção do anticorpo de domínio único parcialmente purificado por conseguinte levou a localização preferencial de tumor (Figura 12C). Na última situação deve ser considerado que o baixo peso molecular de 20 kDa dos anticorpos de domínio único permite extravasamento dos vasos de tumor altamente permeáveis e acumulação no interstício de tumor. Este último efeito não é específico e também é observado com anticorpos de domínio único não relevantes. É previsto que anticorpos de baixo peso molecular e afinidades relativamente baixas tenham maior penetrabilidade através de tumores e sejam mais adequados para marcar o compartimento de célula tumorosa.

EXEMPLO 11

Acumulação de F8 em vasos sangüíneos de tumor

Camundongos foram injetados transcranialmente com E98, uma linhagem de xenotransplante de glioma. Tumores E98 são mantidos como tumores subcutâneos. Um camundongo atímico Balbc/c nu/nu carregando um tumor E98 subcutâneo foi morto e o tumor removido. O tumor foi moído com um bisturi estéril e o homogenado foi passado através de um filtro de náilon estéril de malha de 70 pm. Vinte pl da suspensão celular resultante, contendo 150.000 células, foi injetado transcranialmente no cérebro de camundongos nus. Depois de 3 semanas, M13 fagos apresentando anticorpo F8 de domínio único foram injetados intravenosamente, e depois de cinco minutos o camundongo foi sujeito à perfusão cardíaca com 15 ml de salina tamponada com fosfato.

Os camundongos foram mortos, cérebros removidos e fixados em formalina. Seções de quatro pm foram sujeitas a imunohistoquímica com anticorpo anti-M13, e seções seriais foram marcadas imunohistoquimicamente com anticorpos contra CD34 (marcador endotelial) e glut-1 (um marcador para células endoteliais pré-existentes de cérebro (Kusters, B et al., Câncer Res 62:341-345 (2002)).

Fagos carregando anticorpos de domínio único anti-plexina Dl se acumularam especificamente em vasos sangüíneos associados a tumor, mas não em vasos normais (Figura 13). Importantemente, fagos também se acumularam em vasos sangüíneos de tumor que foram positivos para glut-1, e que portanto podem ser considerados como vasos sangüíneos pré-existentes, ao invés de vasos sangüíneos recentemente formados. Isto indica que não apenas vasos sangüíneos angiogênicos são sujeitos a marcação com anticorpos anti-plexina Dl, mas também vasos sangüíneos não angiogênicos, ainda ativados em tumores.

EXEMPLO 12

Ectodomínios recombinantes de plexina Dl inibem

angiogênese

Células Mel57 de melanoma humano foram transfectadas com a seqüência de codificação de VEGF-Al65 em vetor pIREShyg. Células estavelmente transfectadas foram selecionadas cultivando em 200 pg/ml de higromicina em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e penicilina/estreptomicina. Devido ao fato de expressão do gene de resistência a higromicina estar ligada com aquela do cDNA de VEGF-A através do sítio de entrada ribossômico interno (IRES), todas as células resistentes a higromicina irão produzir a proteína VEGF-A também. Células Me 157- VEGF estavelmente transfectadas foram subseqüentemente transfectadas com pIRESneo-PlexinDl ED. O vetor contém o cDNA codificando o domínio extracelular de nucleotídeos 1-2745, ligado através do IRES a expressão do gene de resistência a neomicina.

Transfectantes duplos foram injetados na artéria carótida direita de camundongos nus, e tumores foram permitidos para desenvolver. No início de sintomas neurológicos (aproximadamente 18 dias) camundongos foram sujeitos a formação de imagem por ressonância magnética estimulado por Gadolínio-DTPA. Subseqüentemente, camundongos foram sacrificados, cérebros fixados em formalina e sujeitos a marcações imunohistoquímicas para examinar a vasculatura de tumor.

Quando comparado com controles, consistindo de tumores expressando VEGF-A apenas, estimulação por Gd-DTPA em formação de imagem por ressonância magnética (MRI) sobrecarregado com Tl foi menor (compare Figura 14A, representando dois exemplos de tumores Me 157- VEGF-A165, com 14B representando dois exemplos de tumores Mel57- VEGF-Al 65/PLEXIND1-ED). Nos tumores expressando VEGF-A165 e ectodomínio de Plexina Dl, vasculatura mostra aumento do marcador endotelial CD34, (um carimbo de ativação endotelial por VEGF-Al65). A vasculatura em tumores expressando VEGF-A165 apenas, é negativa para o marcador de célula endotelial de cérebro glut-1, o que é consistente com o fato de que estes vasos são recentemente feitos e portanto carecem de marcadores específicos de célula endotelial de cérebro. Como pode ser visto em figura 12B, os vasos que estão associados com tumores que também expressam o ectodomínio de plexina Dl, expressam glut-1. Isto é uma forte indicação de que estes vasos são de fato pré-existentes. Assim, o ectodomínio de plexina Dl não previne ativação de células endoteliais por VEGF-A165, mas previne a formação de neovasculatura.

EXEMPLO 13

Anticorpos de alta afinidade contra plexina Dl

Uma seqüência protéica, correspondendo a aminoácidos 47- 506 (os 459 aminoácidos mais amino terminais da proteína madura), foi expressa em células M15 pREP4 de E.coli, usando o vetor de expressão pQE16 (Qiagen). A proteína recombinante, que foi produzida nas células bacterianas como corpos de inclusão, foi dissolvida em tampão desnaturante, contendo 4M de uréia e 1 mM de ditiotreitol (DTT) e depois disso gradualmente dialisada contra PBS. A proteína foi usada para imunizar camundongo BALB c/c de acordo com procedimentos padrão.

Figura 15 mostra as características do soro de camundongo. Como mostrado em Figura 15B, o soro imune de camundongo reconhece especificamente proteína recombinante 47-506 (52 kDa, linha 1) de E.coli, e uma segunda seqüência de plexina Dl recombinante de 18 kDa, compreendendo aminoácidos 225-388 (assim estando completamente dentro da seqüência que foi usada para imunização, linha 2). O soro pré-imune não mostrou uma tal reatividade (painel A).

Quando testado em corantes imunohistoquímicos em uma metástase cerebral de um sarcoma de tecido macio alveolar, o soro imune de camundongo (painel D), mas não o soro pré-imune (painel C), mostrou positividade para vasos sangüíneos e células tumorosas, um padrão de marcação que foi similar àquele de anticorpo A12 de domínio único. Assim, os linfócitos B deste camundongo foram considerados adequados para gerar hibridomas de linfócitos B de baço com linhagem celular de mieloma SP2/0.

A partir destes hibridomas a diversas linhagens celulares produtoras de anticorpos foram selecionadas baseado em reatividade contra proteína 47-506 em ELISA, e foram analisadas para seu potencial de detectar plexina Dl em seções congeladas de tumores humanos. Destas, 11F5H6 e 17E9C12, ambos os anticorpos do subtipo IgM, mostraram forte positividade em metástases cerebrais de sarcoma e melanoma, como ilustrado em Figura 16. As inserções em painéis C-F representam marcações de controle nas quais o anticorpo primário foi omitido. Painéis AeB mostram que estes anticorpos não reconhecem particularmente estruturas de vasos em tecido cerebral normal.

EXEMPLO 14

Anticorpo monoclonal 11F5H6 é capaz de reconhecer vasos sangüíneos de tumor

Para avaliar adicionalmente se anticorpo monoclonal 11F5H6 é capaz de reconhecer vasos sangüíneos de tumor, tumores angiogênicos Me 15 7-VEGF-A foram crescidos em cérebros de camundongos nus, essencialmente como descrito em Exemplo 10. Anticorpo 11F5H6 (1 mg) foi injetado em uma veia caudal lateral e permitido para circular por 15 minutos. Depois deste período, os camundongos foram anestesiados com 1,3% de isoflurano e o tórax foi aberto, com o qual uma perfusão cardíaca foi realizada com 20 ml salina tamponada com fosfato.

Depois deste procedimento camundongos foram decapitados, e cérebros removidos e imediatamente congelados ou fixados em formalina. Seções congeladas de 4 Tim foram marcadas com anticorpo com anti-IgM. Em Figura 17A é mostrado que anticorpo 11F5H6 volta para e se acumula em vasos de tumor mas não em vasos normais (compare marcação com anti-IgM em Figura 17A com a marcação com CD31 anti-endotelial em Figura 17B). Tal marcação não é vista ao realizar marcação com anti-IgM em camundongos não injetados. Assim, 11F5H6 é um anticorpo promissor que permite marcação de tumor. EXEMPLO 15

Expressão de plexina Dl em artrite reumatóide

Plexina Dl é expressa em macrófagos em modelos de camundongo de artrite reumatóide (Figura 18). Um subconjunto de macrófagos em placas ateroscleróticas humanas também expressa plexina Dl (Figura 19). Marcações foram realizadas com anticorpo Al2 de domínio único, em Figura 19, uma marcação dupla foi realizada, apresentando plexina Dl em vermelho e o marcador de macrófago CD68 em azul. Uma cor roxa indica co-expressão.

SEQÜÊNCIAS

A12 (SEQ ID NOi 1) :

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCAGTATCAGTATCAATAACTGGGGCTGGTACCGC F8 (SEQ ID NO:2):

ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCftGGCTGGAGACTCTCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTACTTTGATTATGGCCTGGTTCCGC CAGGC TCCAGG GAAGGAGC GT GAAT TTGTAG CGG CGATT AGC CGGGGTGGC GGTAG CACA AGC TATGCAGA CT CCG TGAAG GG CC GATTCACCATCT CCAGAGACAATT CCAAGAA CGCG GT GTATC TACAAATGAACAGCCTGAAACCTGAT GACACGGC C GTCTATTAC TGTAATGCC CGGTACGGTAGCCGAATTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCC AAGAC ACCAAAAC CACAACCAGCGGCCGC AC AT CAT C ACC ATCATC AC CATCAT T A TACA GACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG

MKYL L PTAAAG L L LLAAQ FA MAQVQLQESGGGLVQAG DSL RLSCAASGRTFSTLIMAWFR

QAPGKEREFVAAISRGGGST

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VYLQMNSLKPDDTAVYYCNA RYGSRIYWGQGTQVTVSSEP KTPKPQPAAAHHHHHHHHYT DIEMNRLGKGAAθ

Seqüência de anticorpo de cadeia única, derivado de anticorpo11F5H6 (SEQ IDNO:3)

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADYKDIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNT YLEWYLQKPGQSPKLLIYKVFNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGRAPGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCK ASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELL SLTSEDSAVYYCARAITTDGWFAYWGQGTLVTVSAAAAHHHHHHHHYTDIEMNRLGKGAA

Seqüência de anticorpo de cadeia única, derivado de anticorpo17E9C12 (SEQ IDNO:4)

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADYKDIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNT <table>table see original document page 48</column></row><table> Tabela 2

Expressao de PLXND1 emseries de progressao de melanoam

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Claims (38)

1. Plexina Dl, caracterizada por ser para uso como uma proteína marcável no tratamento ou diagnose de desordens que envolvem expressão de plexina Dl.

2. Plexina Dl de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a diagnose é efetuada detectando a presença de plexina Dl no corpo ou em um tecido ou fluido corporal.

3. Plexina Dl de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tratamento é efetuado marcando plexina Dl para liberação de terapêuticos ao sítio onde tratamento é necessário.

4. Plexina Dl de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tratamento é efetuado interferindo na interação of plexina Dl e seus ligantes.

5. Plexina Dl de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tratamento é efetuado interferindo na função de plexina Dl.

6. Plexina Dl de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tratamento é efetuado interferindo na expressão do gene codificando plexina Dl.

7. Uso de moléculas que se ligam a plexina Dl, um ácido nucléico codificando plexina Dl ou um ligante de plexina Dl, caracterizado por ser para a preparação de uma composição terapêutica para o tratamento ou diagnose de desordens que envolvem expressão de plexina Dl.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os distúrbios compreendem distúrbios nos quais plexina Dl é expressa em células tumorosas, vasos sangüíneos de tumor ou macrófagos ativados.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que os distúrbios são selecionados a partir de tumores cerebrais em particular astrocitomas, oligodendrogliomas e hemangioblastomas, carcinomas de cólon, em particular carcinomas ductais do cólon, carcinomas de próstata, carcinomas de célula renal, em particular carcinomas de célula clara renal, carcinomas de mama, em particular carcinomas ductais da mama, carcinomas de ovário, carcinomas de célula esquamosa, melanomas, carcinomas de pulmão, em particular carcinomas de célula pequena de pulmão e carcinomas de célula não pequena de pulmão, sarcomas de tecido macio.

10. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que os distúrbios são doenças inflamatórias.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é uma doença autoimune.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune é artrite reumatóide.

13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é arteriosclerose ou esclerose múltipla.

14. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que moléculas que se ligam a plexina Dl são selecionadas a partir de anticorpos, fragmentos de anticorpos, domínios protéicos, peptídeos, moléculas pequenas, aptâmeros de DNA ou RNA.

15. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que moléculas que se ligam ao ácido nucléico codificando plexina Dl são selecionadas a partir de siRNA, RNA antisentido, oligonucleotídeos fosfotio antisentido.

16. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que moléculas que se ligam a um ligante de plexina Dl são selecionadas a partir de anticorpos contra o ligante, o ectodomínio solúvel de plexina Dl, peptídeos com afinidade para o sítio de ligação de plexina Dl.

17. Uso de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 7 a 16, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é marcada com um marcador detectável.

18. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é selecionado a partir de um marcador radioativo, um marcador paramagnético, marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente.

19. Uso de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 7 a 18, caracterizado pelo fato de que a molécula de ligação é fornecida com um composto efetor ou um nanodispositivo compreendendo um composto efetor.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o composto efetor é uma toxina, um composto indutor de trombose, um agente quimioterápico, uma unidade radioativa, um peptídeo indutor de apoptose, em particular (KLAKLAK)2.

21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a toxina danifica ou mata células endoteliais para induzir trombose, e é em particular ricina.

22. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o composto indutor de trombose é fator de tecido truncado.

23. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é selecionado a partir de doxorubicina, cisplatina, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil e ciclofosfamida hidroxiuréia.

24. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a entidade radioativa é selecionada a partir de: tecnécio 99m, iodo-123, iodo-131, rênio-186 ou -188, gálio-67, ítrio-90, lutécio-177.

25. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os nanodispositivos são lipossomos, polimersomos, em particular polimersomos compostos de copolímeros de bloco.

26. Moléculas de ligação de plexina Dl.

27. Moléculas de ligação de plexina Dl de acordo com a reivindicação 26, caracterizadas pelo fato de compreenderem a parte de ligação de plexina Dl de A12 (SEQ ID NO:l), F8 (SEQ ID NO:2), 11F5H6 (SEQ ID NO:3) ou 17E9C12 (SE ID NO:4).

28. [claim missing on original document]

29. Moléculas de ligação de plexina de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadas pelo fato de serem acopladas a um marcador detectável como definido na reivindicação 18.

30. Moléculas de ligação de plexina de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadas pelo fato de serem acopladas a uma molécula efetora ou um nanodispositivo compreendendo um composto efetor, e o composto efetor é como definida no definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 24.

31. Moléculas de ligação de plexina de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizadas pelo fato de que o nanodispositivo é como definido na reivindicação 25.

32. Composição diagnostica, caracterizada pelo fato de compreender uma molécula de ligação de plexina como definida na reivindicação 29.

33. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma molécula de ligação de plexina como definida em qualquer uma das reivindicações 30 a 32.

34. Anticorpo de cadeia única A12 (SEQ ID NO:l).

35. Anticorpo de cadeia única F8 (SEQ ID NO:2).

36. Anticorpo de cadeia única 11F5H6 (SEQ ID NO:3).

37. Anticorpo de cadeia única 17E9C12 (SEQ ID NO:4).

38. Método para identificar moléculas que são capazes de se ligar a plexina Dl, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato uma coleção de moléculas com plexina Dle selecionar as moléculas da coleção que mostram ligação com plexina Dl como moléculas de ligação de plexina Dl.