ES2632360T3 - Plexina D1 como diana para el diagnóstico y terapia de tumores - Google Patents

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Abstract

Anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra plexina D1 para uso en el tratamiento de un trastorno que implica la expresión de plexina D1 en células tumorales o en macrófagos activados, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en tumores cerebrales, astrocitomas, oligodendrogliomas, hemangioblastomas, carcinomas de colon, carcinomas ductales del colon, carcinomas de próstata, carcinomas de células renales, carcinomas de células renales claras, carcinomas de ovario, carcinomas de células escamosas, melanomas, carcinomas de pulmón, carcinomas de pulmón microcíticos, carcinomas de pulmón no microcíticos y sarcomas de tejidos blandos.

Description

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DESCRIPCION
Plexina D1 como diana para el diagnostico y terapia de tumores CAMPO DE LA INVENCION
La presente descripcion se refiere a la identificacion de una nueva protema seleccionable como diana que se puede usar en el tratamiento y diagnostico de tumores, en particular tumores solidos, y trastornos que implican inflamacion, en particular artritis reumatoide, aterosclerosis y esclerosis multiple.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Para que crezcan mas alla de un tamano de 2-3 mm3, los tumores tienen que reclutar una neovasculatura via angiogenesis. Los tumores logran esto via la expresion del factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A), ya sea inducido por hipoxia en el centro del tumor o como resultado de productos genicos supresores de tumores que funcional mal o protooncogenes activados. Se ha desarrollado un numero de compuestos que seleccionan como diana la ruta de senalizacion de VEGF-A con el objetivo de inhibir la angiogenesis y, en consecuencia, el crecimiento tumoral. Aunque tales terapias antiangiogenicas han sido eficaces en modelos de tumores de animales, la traduccion al nivel clmico hasta ahora ha demostrado ser menos exitosa (Eichhorn, ME et al., Drug Resist Update 7:125-138 (2004)).
Para esto, hay un numero de posibles explicaciones. En situaciones clmicamente relevantes, los tumores pueden haber estado creciendo durante meses o incluso anos en el momento del diagnostico, y una proporcion significativa de la vasculatura puede ser mas o menos madura y de este modo insensible a la inhibicion de la angiogenesis. Esta situacion contrasta fuertemente con aquella en la mayona de los modelos de animales en la que, como regla, se estudian tumores agresivos que crecen rapidamente. Ademas, los pacientes que son candidatos para la terapia antiangiogenica son tfpicamente pacientes con cancer diseminado incontrolable, y el crecimiento de las metastasis puede no depender siempre estrictamente de la angiogenesis. Debido a que la mayona de las metastasis son portadas por la sangre, crecen en organos con densidades de vasos intnnsecamente elevadas como el hfgado, pulmon y cerebro, donde pueden crecer de una manera independiente de la angiogenesis mediante coopcion de vasos preexistentes.
De hecho, un inhibidor de la angiogenesis que inhibe muy eficazmente el crecimiento tumoral en un numero de modelos de tumor subcutaneo (Wedge, SR et al., Cancer Res 62:4645-4655 (2002)) no inhibe el crecimiento de tumores infiltrativos en cerebro de raton. Ademas, al tratar ratones que portan tumores cerebrales muy angiogenicos, la inhibicion de la angiogenesis no dio como resultado una detencion de la progresion tumoral posterior, sino mas bien dio como resultado una progresion tras un desplazamiento fenotfpico hacia coopcion e infiltracion (Leenders, WP et al., Clin Cancer Res 10:6222-6230 (2004)). Estos resultados implican que la terapia antiangiogenica debena suplementarse con terapias dirigidas vasculares en las que se ataca el lecho vascular del tumor existente, dando como resultado la muerte indirecta de las celulas tumorales debido a la interrupcion del suministro sangumeo de los tumores.
Para lograr una terapia dirigida vascular eficaz, se han identificado marcadores que tienen especificicad por la vasculatura tumoral. Ya se ha puesto mucho esfuerzo en esto, pero con exito variable. La seleccion como diana de tumores vasculares eficaz se ha logrado usando anticuerpos monocatenarios, dirigidos contra el dominio de fibronectina ED-B, que se expresa selectivamente y se deposita en la matriz extracelular de vasos recientemente formados en tumores angiogenicos (Santimaria, M et al., Clin Cancer Res 9:571-579 (2003)). La seleccion como diana de avP3-integrina (cuya expresion esta restringida a vasos inmaduros) usando peptidos RGD o Vitexina produjo un resultado decepcionante, mientras que la expresion de endoglina no fue espedfica para vasos sangumeos tumorales (Posey, JA et al., Cancer Biother Radiopharm 16:125-132 (2001); Balza, E et al., Int J Cancer 94:579-585 (2001)).
En enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide (RA) o aterosclerosis, la angiogenesis y la activacion de la vasculatura es tambien a menudo parte de la patologfa. La vasculatura allana aqrn el camino para que las celulas inflamatorias se extravasen y ejerzan su accion destructora. Tales enfermedades pueden de este modo beneficiarse tambien de la seleccion de vasos sangumeos como dianas.
SUMARIO DE LA INVENCION
Por lo tanto, es el objeto de la presente descripcion proporcionar una protema seleccionable como diana que se puede usar en el tratamiento y diagnostico de cancer y enfermedades inflamatorias o enfermedades que impliquen inflamacion.
En la investigacion que condujo a la presente descripcion, se encontro que plexina D1 es expresada en el lado luminal de celulas endoteliales en vasos sangumeos tumorales, en las propias celulas tumorales, y en macrofagos activados que se encuentran en tumores, en inflamacion y en placas ateroscleroticas.
De este modo, la descripcion se refiere a plexina D1 para uso como una protema seleccionable como diana en el
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tratamiento o diagnostico de trastornos que implican expresion de plexina D1.
La familia de receptores de plexinas consiste en cuatro clases (PLXNA-D) y nueve miembros en mamnferos. Las plexinas comprenden una familia de protemas grandes, que pasan una sola vez la membrana, con homologfa con receptores del factor de dispersion, codificadas por la familia del gen MET. Los miembros de la familia de plexinas comparten los dominios Sema, secuencias relacionadas con Met (MRS), una region transmembranica y motivos intracelulares que son predictivos de la senalizacion de Rac/Rho-GTPasas (Figura 1).
Puesto que la senalizacion via GTPasas da como resultado reorganizaciones citoesqueleticas, sucesos que estan cnticamente implicados en la formacion de filopodios y lamelipodios y migracion celular, las plexinas se pueden considerar como reguladores de la migracion.
Las plexinas son receptores para las semaforinas, una familia de protemas segregadas, ancladas a GPI o transmembranicas que se subdivide en siete subclases. Cada plexina tiene su propio (conjunto de) parejas de union a semaforina, y cada combinacion de plexina-semaforina da como resultado una respuesta espedfica. Las semaforinas de clase 3 son potentes repelentes de axones, y como tal estan implicadas en la morfogenesis del sistema nervioso (para un repaso, vease RJ et al., Curr Opin Neurobiol 13:79-89 (2003); Fujisawa, H, J Neurobiol 59:24-33 (2004)). Para activar plexinas mediante las semaforinas, se pueden necesitar parejas de union a plexinas adicionales. Estas parejas de union, neuropilina-1 y -2 (NP-1 y NP-2), no tienen motivos de senalizacion en el dominio intracelular, y se piensa que son correceptores pasivos, permitiendo la interaccion entre semaforinas y plexinas.
Algunas plexinas forman incluso complejos de membrana mas grandes con, y activan, receptores de senalizacion como Off Track (Otk) y los receptores del factor de dispersion Met y Ron. Tambien se ha demostrado una interaccion directa entre plexina A1 y el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) angiogenico (Toyofuku, T et al., E-publication in Genes Dev 18:435-447 (2004)). Debido a que NP-1 se une a la familia de plexinas, pero tambien a VEGFR2, es concebible que existan complejos de protemas de membrana multicomponentes que engloben VEGFR2, NP-1 y plexinas, estableciendo una conexion entre las plexinas y la angiogenesis (vease tambien Weinstein, BM, Cell, 120:299-302 (2005)).
Las neuropilinas tambien son correceptores para el potente factor angiogenico factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A165), y potencian su afinidad por VEGFR2. De forma interesante, el sitio de union a VEGF-A165 en NP-1 se solapa con aquel para semaforina 3A (Miao, H Q et al., J Cell Biol 146:233-242 (1999)). Se ha postulado que la union de VEGF-A a NP-1 promueve la migracion de celulas endoteliales al competir por la union de semaforinas de clase 3, lo que es seguido generalmente por la despolimerizacion de la F-actina y la repulsion de extensiones celulares (Bachelder, RE, Cancer Res 63:5230-5233 (2003)). Se ha descrito un comportamiento antagonista similar de VEGF-A y semaforinas de clase 3 en una estirpe celular progenitora neuronal (Bagnard, D et al., J Neurosci 21:3332-3341 (2001)) y celulas tumorales (Bachelder (2003), mas arriba). Puesto que se observaron efectos antagonistas en celulas tumorales que estan desprovistas de receptores de VEGF, es concebible que el mecanismo subyacente implique miembros de la familia de plexinas, estableciendo una conexion adicional entre plexinas y la senalizacion de VEGF-A.
Los presentes inventores han encontrado previamente que el miembro de la familia plexina D1 (plxnD1) no solo es expresado en celulas neuronales, sino tambien en celulas endoteliales de la vasculatura durante etapas tempranas del desarrollo (van der Zwaag, B et al., Dev Dyn 225:336-343 (2002)), una observacion que fue confirmada por otros dos grupos (Gitler, AD et al., Dev Cell 7:107-116 (2004); Torres-Vazquez, J et al., Dev Cell 7:117-123 (2004)). En la vasculatura adulta, plxnD1 esta ausente. Los ratones carentes de Plxndl y el pez cebra que porta mutaciones en el gen plxndl se caracterizan por un mal desarrollo del sistema cardiovascular (Gitler, AD et al. (2004), mas arriba; Torres-Vazquez, J et al.,(2004), mas arriba). Los ratones carentes de neuropilina-1 (NP-1) y doblemente de NP- 1/neuropilina-2 (NP-2) tambien sufren defectos letales en la vascularizacion, y malformaciones del arco aortico durante el desarrollo embrionario (Kawasaki, T et al., Development 126:4895-4902 (1999); Takashima, S et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662 (2002); Gu, C et al., Dev Cell 5:45-57 (2003)).
Ademas, la atenuacion de NP-1 mediada por morfolino en el pez cebra conduce a un mal desarrollo de los vasos intersegmentarios, y en este modelo se ha establecido una conexion clara entre NP-1 y VEGF-A165 (Lee, P et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:10470-10475 (2002)). La semejanza de los fenotipos de ratones carentes de plxndl, neuropilina-1 y semaforina 3C (Feiner, L et al., Development 128:3061-3070 (2001)) es consistente con el hallazgo de que plexina D1 es un receptor dependiente de neuropilina-1 para semaforina 3C (Gitler, AD et al. (2004), mas arriba). Sin embargo, PlxnD1 es tambien un receptor para semaforina 3E, y esta interaccion no requiere neuropilinas para la senalizacion mediada por Semaforina 3E (Gu, C et al., Science 307:265-268 (2005)).
Segun la descripcion, ahora se encontro que plexina D1 tambien esta implicada en la angiogenesis durante el crecimiento tumoral, y es expresada en el lado luminal de celulas endoteliales en vasos sangumeos tumorales. Ademas, se encontro que plexina D1 es expresada por macrofagos activados. Tambien se encontro que plexina D1 es expresada en celulas tumorales en una amplia variedad de tipos de tumores.
De este modo, la presente descripcion se refiere a plexina D1 para uso como una protema seleccionable como diana
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en el tratamiento o diagnostico de trastornos que implican expresion de plexina D1.
El diagnostico se efectua detectando en el cuerpo o en un tejido o fluido corporal la presencia de plexina D1 o un acido nucleico que codifica plexina D1.
El tratamiento se efectua seleccionando como diana plexina D1 para el suministro de sustancias terapeuticas al sitio en el que se necesite el tratamiento, interfiriendo en la interaccion entre plexina D1 y su ligando, interfiriendo en la expresion del gen de plexina D1, o capturando ligandos de plexina D1 para inhibir la interaccion con plexina D1.
La descripcion se refiere asf ademas al uso de moleculas que se unen a plexina D1, a un acido nucleico que codifica plexina D1, o a un ligando de plexina D1 para la preparacion de una composicion terapeutica para el tratamiento o diagnostico de trastornos que implican la expresion de plexina D1. Todas estas moleculas se identificaran aqu como “moleculas de union” o “entidades de union”.
Los trastornos comprenden, en particular, trastornos en los que plexina D1 es expresada en celulas tumorales, vasos sangumeos tumorales, o en macrofagos activados.
Las celulas tumorales en las que se expresa plexina D1 comprenden tumores cerebrales, en particular astrocitomas, oligodendrogliomas y hemangioblastomas, carcinomas de colon, en particular carcinoma ductal del colon, carcinomas de prostata, carcinomas de celulas renales, en particular carcinomas de celulas renales claras, carcinomas de mama, en particular carcinomas ductales de la mama, carcinomas de ovario, carcinomas de celulas escamosas, melanomas, carcinomas de pulmon, en particular carcinomas de pulmon microdticos y carcinomas de pulmon no microdticos, sarcomas de tejidos blandos, etc.
Cuando los trastornos que se tratan segun la descripcion son enfermedades inflamatorias, en particular son enfermedades autoinmunitarias, mas en particular artritis reumatoide, o son aterosclerosis o esclerosis multiple.
Las moleculas que se unen a plexina D1 se seleccionan por ejemplo de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, protemas, dominios proteicos, peptidos, pequenas moleculas. Estas moleculas se pueden usar para seleccionar a plexina como diana.
Las moleculas que se unen al acido nucleico que codifica plexina D1 son, por ejemplo, oligonucleotidos, tales como aptameros de ARN o ADN, por ejemplo seleccionados de ARNpi, ARN antisentido, fosfotio-oligonucleotidos antisentido. Estas moleculas pueden ser usadas para interferir con la expresion de plexina D1.
Las moleculas que se unen a un ligando de plexina D1 se seleccionan, por ejemplo, de anticuerpos contra ligandos, el ectodominio soluble de plexina D1, o pequenas moleculas, tales como peptidos, que se unen a ligandos de plexina D1. Estas moleculas se pueden usar para capturar al ligando de plexina D1 circulante, para prevenir la union del ligando a plexina D1 en celulas de vasos tumorales, celulas tumorales o macrofagos activados, y para interferir con la funcion de plexina D1 en estas celulas.
Para el diagnostico, la molecula de union se marca adecuadamente con un marcador detectable. Tal marcador detectable se selecciona, por ejemplo, de un marcador radioactivo, un marcador paramagnetico, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente. El diagnostico se puede llevar a cabo en una muestra de un fluido o tejido corporal in vivo, in situ o ex vivo. Los ejemplos de tecnicas de diagnostico son la hibridacion in situ de, por ejemplo, ARNm de plexina D1, o inmunohistoqmmica en biopsias o celulas tumorales.
Para el tratamiento, la molecula de union se proporciona, por ejemplo, con una entidad que dana o extermina la celula tumoral y/o la celula endotelial tumoral, en particular una entidad citotoxica, tal como un radionuclido, una toxina, boro para terapia por captura neutronica en boro (BNCT), o un profarmaco que se acopla a la entidad de union via un enlazado escindible, que se activa en respuesta a la escision de ese enlazador, o peptidos inductores de la apoptosis, un ejemplo de los cuales es la secuencia (KLAKLAK)2. Tales peptidos se anaden a la entidad de union mediante tecnicas de ingeniena genetica molecular. Las entidades descritas anteriormente se pueden conjugar directamente a la entidad de union, o pueden estar presentes en nanodispositivos, tales como liposomas o polimerosomas, que se conjugan a la entidad de union.
La terapia por captura neutronica en boro (BNCT) comprende irradiar un area enferma, tal como un tumor o una inflamacion, en la que se ha acumulado boro tras la inyeccion intravenosa del conjugado liposomico, con neutrones, tras lo cual los atomos de boro se desintegraran hasta litio bajo emision de partmulas alfa destructivas.
Como alternativa, la terapia se puede efectuar induciendo trombosis local en los vasos tumorales para bloquear el suministro de sangre al tumor e inducir la muerte celular. Un ejemplo de tal molecula es el factor tisular (TF).
Ventajosamente, la plexina D1 se puede seleccionar como diana con moleculas de union espedficas con la administracion intravenosa, puesto que plexina D1 se expresa en el lado luminal de celulas endoteliales en vasos sangumeos tumorales. Los compuestos terapeuticos para danar o exterminar celulas tumorales que se acoplan a la molecula de union pueden alcanzar el tumor desde dentro, y los compuestos que inducen la trombosis se suministran facilmente a su sitio de accion.
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La interferencia con la funcion de plexina D1 representa una forma para inhibir la angiogenesis, para inhibir la migracion de celulas tumorales, y para inhibir la migracion de macrofagos. De este modo, la descripcion proporciona metodos para tratar o suprimir trastornos en los que esta implicada la plexina D1, usando la presencia espedfica de plexina D1 para suministrar sustancias terapeuticas localmente a tejidos enfermos, y/o mediante interferencia en la funcion de plexina D1 o en la interaccion entre plexina D1 y sus ligandos.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
De este modo, la descripcion se basa en el hecho de que plexina D1 se puede usar como un marcador seleccionable como diana en vasos sangumeos tumorales, como una protema seleccionable como diana implicada en la angiogenesis tumoral, como un marcador seleccionable como diana en celulas tumorales, y como una protema seleccionable como diana implicada en la migracion celular.
La descripcion tambien se refiere asf al uso de moleculas que se unen a plexina D1, su gen o ARNm, o sus ligandos en el diagnostico y la terapia. En los metodos como se describen aqrn se pueden usar todos los tipos de moleculas de union espedficas, y sus derivados, en particular compuestos proteinosos tales como, pero sin limitarse a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de un solo dominio, otros dominios de union proteinosos, tales como, pero sin limitarse a, lipocalinas, y pequenas moleculas que se unen espedficamente a plexina D1 o a sus ligandos. Para la union a la plexina D1, se puede usar el gen o el ARNm transcrito a partir de las moleculas de acido nucleico del gen de plexina D1, tales como aptameros de ADN o de ARN.
Como se describe aqrn adicionalmente, las moleculas que se unen a plexina D1 o al ligando de plexina D1 son anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, mas en particular anticuerpos humanos o humanizados en los que las regiones constantes del anticuerpo original se sustituyen por las regiones constantes de anticuerpos humanos, o sus fragmentos, que todavfa se unen a plexina D1 o a su ligando.
El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo IgG1 humano. Sin embargo, otros isotipos del anticuerpo humano tambien estan englobados por la presente descripcion, incluyendo IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. En los metodos como se describen aqrn se pueden usar tambien todos los anticuerpos derivados de animales de diversos isotipos.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de tamano completo o fragmentos de anticuerpos que se unen al antfgeno, incluyendo Fab, F(ab')2, fragmentos Fv monocatenarios, o VHH de dominio simple, dominios simples VH o VL.
Preferiblemente, los anticuerpos frente a plexina D1 son anticuerpos monoclonales humanos producidos mediante una celula de hibridoma que incluye una celula B obtenida a partir de un animal transgenico inmunizado que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera humana, fusionada a una celula inmortalizada, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo derivado de animal producido mediante una celula de hibridoma que incluye una celula B obtenida de un animal inmunizado, fusionada a una celula inmortalizada, o anticuerpos humanos y animales producidos mediante una celula eucariota transfectada con el ADNc o el ADN genomico codificado por dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Como se describe aqrn, se proporcionan anticuerpos de llama de un solo dominio (VHH) con afinidad por plexina D1, mas espedficamente anticuerpos de un solo dominio de llama A12 (SEC ID NO:1) y F8 (SEC ID NO:2), ya sea que se presenten o no en bacteriofagos M13, tambien conocidos por aquellos con pericia en la tecnica como anticuerpos VHH de presentacion de fagos.
Un anticuerpo monocatenario preferido deriva del anticuerpo 11F5H6 y 17E9C12. La secuencia del anticuerpo monocatenario se muestra en SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4.
Los anticuerpos para uso como se describe aqrn pueden ser anticuerpos de alta afinidad que son provocados en animales de laboratorio no transgenicos, o en animales transgenicos en los que el locus de globulina endogeno se ha sustituido por el locus de globulina humano, permitiendo asf la produccion de anticuerpos humanos en tales animales (Jakobovits, A. Curr Opin Biotechnol 6:561-566 (1995)).
La descripcion proporciona ademas un metodo para producir los anticuerpos como se describen aqrn, que comprende inmunizar un animal con plexina D1, o una celula que expresa plexina D1, o un acido nucleico que codifica plexina D1, o partes del dominio extracelular de plexina D1, de manera que los anticuerpos frente a plexina D1 son producidos por las celulas B del animal, aislar las celulas B del animal y fusionar las celulas B a una estirpe celular de mieloma para obtener celulas inmortalizadas que segregan el anticuerpo. El animal es preferiblemente un animal transgenico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera humana, de manera que el anticuerpo resultante esta humanizado.
Como se describe aqrn, el metodo incluye inmunizar un animal de laboratorio con un peptido sintetico, escogido del dominio extracelular de plexina D1, por ejemplo el peptido 47-63 que corresponde al termino amino de la secuencia de aminoacidos de plexina D1 madura. Sin embargo, las inmunizaciones se realizan preferiblemente con dominios extracelulares recombinantes, preferiblemente una region con baja similitud con otros miembros de la familia de las plexinas, por ejemplo una region que comprende los aminoacidos 47-546, que carece de las secuencias
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relacionadas con Met. Dichos dominios extracelulares de plexina D1 recombinantes se pueden producir en celulas de E. coli insertando los acidos nucleicos codificantes en un vector de expresion procariota adecuado, por ejemplo bajo el control del promotor de p-galactosidasa, transformando celulas de E. coli con dicho vector, y aislando las protemas recombinantes a partir de cuerpos de inclusion purificados. Sin embargo, se prefiere que los anticuerpos se provoquen mediante inmunizacion con dicho dominio extracelular de plexina D1 recombinante que se produce mediante celulas eucariotas, que contienen por lo tanto modificaciones post-traduccionales que son muy similares a aquellas presentes en plexina D1 nativa, por ejemplo mediante celulas de ovario de hamster chino (CHO), tras la transfeccion con un vector que contiene los acidos nucleicos codificantes para dichos dominios extracelulares bajo el control de un promotor de citomegalovirus. Los fragmentos de plexina D1 extracelulares recombinantes se pueden fusionar o no a etiquetas que facilitan la purificacion, por ejemplo una etiqueta de VSV o una region constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina.
El metodo para producir el anticuerpo tambien puede comprender clonar en un vector de expresion las regiones codificantes del anticuerpo a partir de dichas celulas B espedficas para plexina D1, y expresar la secuencia codificante. Se prefiere que el vector de expresion sea pHENlXHISVSV, que permite la expresion del anticuerpo mediante celulas hospedantes de E. coli, flanqueado en el extremo carboxiterminal por un virus de la estomatitis vesicular (etiqueta de VSV) y una etiqueta de His*8. La etiqueta de VSV pretende facilitar la deteccion inmunohistoqmmica, usando anticuerpos espedficos. La etiqueta de His*8 pretende facilitar la purificacion a base de cromatograffa de afinidad con mquel. Igualmente, se pueden usar otros vectores de expresion.
Mas espedficamente, la presente descripcion proporciona un anticuerpo de un solo dominio A12 aislado, que tiene una constante de disociacion menor que 2x10-8 M, que se une al termino amino de plexina D1, y que detecta plexina D1 en tinciones inmunohistoqmmicas y que se dirige hacia vasos sangumeos tumorales que expresan plexina D1; y tambien un anticuerpo de un solo dominio F8 aislado, que tiene una constante de disociacion menor que 3x10-8 M, que se une al termino amino de plexina D1, y que detecta plexina D1 en tinciones inmunohistoqmmicas, y que se dirige a vasos sangumeos tumorales que expresan plexina D1. Ambos anticuerpos de un solo dominio aislados se pueden fusionar a la region constante de una cadena pesada de IgG1 humana, o a la region constante de una cadena pesada de IgG1 de raton.
Preferiblemente, con los metodos como se describen aqm se usan anticuerpos completamente humanos. Tambien, se pueden usar anticuerpos humanizados o derivados de animales de laboratorio.
La descripcion proporciona ademas anticuerpos biespedficos que tienen una especificidad de union por plexina D1, y una especificidad de union por una celula presentadora de antfgenos humana, o por un receptor de Fc, en el que el receptor de Fc es un Fc (gamma) R1 o un receptor de Fc(alfa) humano.
La descripcion proporciona tambien moleculas de acidos nucleicos que codifican los anticuerpos preferidos, o porciones de union al antfgeno. Tambien se describen vectores de expresion recombinantes que incluyen acidos nucleicos que codifican los anticuerpos como se describen aqm, asf como celulas hospedantes transfectadas con tales vectores.
Otras moleculas de union como se describen aqm son pequenas moleculas que se unen espedficamente a plexina D1. La expresion “pequena molecula” se refiere a menudo a moleculas con pesos moleculares de 500 o menor. La expresion se usa normalmente estos dfas, y de este modo esta clara para la persona experta. Ademas, existen ya bibliotecas de pequenas moleculas, o se estan desarrollando. Un ejemplo de tal biblioteca es la NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR). Tales bibliotecas se someten a cribado de alto rendimiento (HTS) para identificar moleculas que se unen a plexina D1. La descripcion tambien proporciona pequenas moleculas que resultan de un cribado de tales bibliotecas.
Otros compuestos que se pueden usar en los metodos como se describen aqm comprenden peptidos o aptameros (Ulrich, Med. Chem. 1(2):199-208 (2005)) que se unen a dominios extracelulares de plexina D1 e interfieren de ese modo con la union de los ligandos de plexina D1 a plexina D1. Por el contrario, tales peptidos o aptameros tambien se pueden unir a los sitios de union a plexina D1 de los ligandos de plexina D1 e interferir de ese modo con la union del ligando a plexina D1.
Para interferir con la expresion del gen de plexina D1 se usa otro tipo de molecula de union, en particular ARNpi, ARN antisentido o fosfotionucleotidos antisentido. El ARN pequeno de interferencia (ARNpi) comprende pequenas hebras de ARN que interfieren con la traduccion del ARN mensajero. El ARNpi se une a la porcion complementaria del ARN mensajero diana y la etiqueta para la degradacion, inhibiendo asf la expresion del gen. Esto se conoce normalmente como “silenciamiento” genico. El ARNpi tiene habitualmente una longitud de 21 a 23 nucleotidos. El ARN antisentido es una molecula de ARN transcrita a partir de la hebra codificante, en vez de la del molde, de ADN, de manera que es complementario al ARNm sentido. La formacion de un duplex entre las moleculas de ARN sentido y antisentido bloquea la traduccion y tambien puede someter a ambas moleculas a nucleasas espedficas de dobles cadenas, inhibiendo asf la expresion del gen. La inhibicion de la expresion del gen se puede usar para bloquear la angiogenesis y la migracion de celulas tumorales y macrofagos.
Preferiblemente, las moleculas de union descritas anteriormente se unen a plexina D1, a su gen o a su ligando en
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celulas eucariotas. Dichas moleculas se acumulan espedficamente en tumores tras la inyeccion intravenosa, o se acumulan espedficamente en vasos sangumeos tumorales con la inyeccion intravenosa.
Los anticuerpos, sus fragmentos, las pequenas moleculas u otros compuestos proteinosos que se unen todos ellos a plexina D1 se pueden usar de diversas maneras.
Tambien se describen aqrn compuestos que se unen a la parte extracelular de plexina D1 y cuya union da como resultado la interferencia de la funcion de plexina D1. Como alternativa, la descripcion proporciona compuestos que se unen al dominio intracelular de plexina Dl y que previenen la senalizacion por plexina D1.
Tales moleculas de union se unen a plexina D1 para interferir con la formacion de complejos de membrana multicomponentes al inhibir la union de ligandos de plexina D1, en particular neuropilina-1, neuropilina-2, semaforina 3C, semaforina 3E, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF o VEGF-A, a plexina D1. Tales moleculas de union conducen a la inhibicion de la senalizacion de GTPasas inducida por ligandos mediante plexina D1, o a la inhibicion de la migracion de celulas que expresan plexina D1, en particular celulas endoteliales asociadas al tumor, celulas tumorales o macrofagos.
Tambien se proporciona aqrn un metodo para inducir la lisis de una celula que expresa plexina D1, que comprende poner en contacto una celula que expresa plexina D1 con las moleculas de union, en particular los anticuerpos como se describen aqrn, en presencia de celulas efectoras humanas, de manera que se produce la lisis de la celula que expresa plexina D1.
Como se describe aqrn, la molecula de union se combina con o se acopla a un compuesto efector que puede detectar la presencia de plexina D1 para fines de diagnostico, o que puede realizar un efecto sobre la celula que expresa plexina D1. El compuesto efector de diagnostico o terapeutico se puede acoplar directamente a la molecula de union, o puede estar presente en un vehnculo de transporte, tal como un nanodispositivo, en particular un liposoma o polimerosoma, que se acopla a la molecula de union. Como alternativa, la molecula de union puede ser un anticuerpo biespedfico que se une tanto a plexina D1 como al compuesto efector, dirigiendo asf el compuesto efector a un sitio o celula en el que se expresa plexina D1.
La descripcion proporciona asf el uso de tales moleculas de union en un metodo para diagnosticar una enfermedad mediada por la expresion de plexina D1, metodo el cual comprende el suministro intravenoso de las moleculas de union a plexina D1 proteinosas, aptamericas o de pequena molecula, conjugadas a un compuesto efector que permite la deteccion in vivo de las moleculas de union.
Los compuestos efectores de diagnostico son, por ejemplo, radioisotopos o agentes de contraste para formacion de imagenes mediante resonancia magnetica (MRI), tales como gadolinio-DTPA, o colorantes fluorescentes.
Los ejemplos de sustancia radioactiva comprenden pero no se limitan a, tecnecio99m (99mTc), yodo-123 (123I), yodo- 131 (131I), renio-186 o -188 (186/188Re), galio-67 (67Ga), las sustancias emisoras de radiacion beta itrio-90 (90Y) o lutecio-177 (177Lu), los isotopos emisores de positrones fluor-18 (18F) y carbono-11 (11C). Tales radioisotopos se pueden usar para detectar o danar o exterminar celulas que expresan plexina D1. Habitualmente se usan isotopos diferentes para el diagnostico y la terapia. La persona experta en la tecnica esta bien al tanto de cual isotopo usar para que tejido y para que tipo de uso.
Las moleculas de union proteinosas, aptamericas y de pequenas moleculas para uso como se describe aqrn se pueden combinar con o acoplar a un agente toxico, tal como un agente quimioterapeutico, ya sea directamente o en un vehnculo de transporte, en particular un nanodispositivo, tal como un liposoma o un polimerosoma.
Una entidad que se une a plexina D1 como se describe aqrn se acopla a uno o mas agentes quimioterapeuticos seleccionados del grupo que consiste en mostazas de nitrogeno (por ejemplo, ciclofosfamida e ifosfamida), aziridinas (por ejemplo, tiotepa), alquilsulfonatos (por ejemplo, busulfan), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina y estreptozocina), complejos de platino (por ejemplo, carboplatino y cisplatino), agentes alquilantes no clasicos (por ejemplo, dacarbazina y temozolamida), analogos de folato (por ejemplo, metotrexato), analogos de purina (por ejemplo, fludarabina y mercaptopurina), analogos de adenosina (por ejemplo, cladribina y pentostatina), analogos de pirimidina (por ejemplo, fluorouracilo (solo o en combinacion con leucovorina) y gemcitabina), ureas sustituidas (por ejemplo, hidroxiurea), antibioticos antitumorales (por ejemplo, bleomicina y doxorrubicina), epipodofilotoxinas (por ejemplo, etoposido y teniposido), agentes de microtubulos (por ejemplo, docetaxel y paclitaxel), analogos de camptotecina (por ejemplo, irinotecan y topotecan), enzimas (por ejemplo, asparaginasa), citocinas (por ejemplo, interleucina-2 y interferon-[alfa]), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, trastuzumab y bevacizumab), toxinas e inmunotoxinas recombinantes (por ejemplo, toxina B del colera recombinante y TP-38), terapias genicas contra el cancer, y vacunas contra el cancer (por ejemplo, vacuna frente a telomerasa).
Los agentes quimioterapeuticos se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en doxorrubicina, cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo y ciclofosfamida hidroxiurea. Otros compuestos son conocidos por la persona experta en la tecnica.
Un tumor tambien se puede tratar bloqueando su suministro de sangre al inducir trombosis local en la vasculatura
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del tumor. Las moleculas de union como se describen aqrn se pueden usar para dirigir moleculas inductoras de la trombosis, tales como el cofactor de la coagulacion de la sangre TF (factor tisular), una entidad radioactiva o una toxina, tal como ricina, al sitio del tumor. Los compuestos efectores se pueden acoplar a la molecula de union, en particular una molecula que se une a plexina D1, o pueden estar presentes en un nanodispositivo, tal como un liposoma o polimerosoma, que se acopla a la molecula que se une a plexina D1.
Un metodo alternativo para tratar cancer o un trastorno inflamatorio como se describe aqrn es con boro, las moleculas de union como se describen aqrn se pueden conjugar a vehnculos de transporte, en particular nanodispositivos, tales como liposomas o polimerosomas, que se llenan con boro para obtener una composicion terapeutica. Tras el suministro y la acumulacion de esta composicion en el area enferma, este area se irradia con neutrones, dando como resultado la emision de partmulas alfa radioactivas y citotoxicas que danan o exterminan las celulas endoteliales tumorales, las celulas tumorales y/o los macrofagos activados.
Es deseable que los anticuerpos dirigidos a los vasos sangumeos tumorales tengan afinidades elevadas frente a plexina D1, por ejemplo mayores que 10-8, preferiblemente mayores que 10-9, mas preferiblemente mayores que 100 M. La afinidad elevada y el peso molecular elevado de los anticuerpos restringiran sin embargo la penetracion en el tejido tumoral. Por lo tanto, los acidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos monoclonales, obtenidos via clonacion mediante RT-PCR, se pueden usar para generar derivados de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos que carecen de la region constante y son monovalentes, o fragmentos de anticuerpos que se adaptan a afinidades optimas para seleccionar como dianas a vasos sangumeos o para la penetracion en el tumor mediante procedimientos mutagenicos. Estos derivados de anticuerpos tendran menores afinidades y menores pesos moleculares, y tendran propiedades mejoradas de seleccion de celulas tumorales como dianas.
Las moleculas de union diferentes como se describen aqrn se pueden combinar en una mezcla. Espedficamente, los miembros de la mezcla tienen una afinidad variable. Un ejemplo de tal combinacion es una mezcla de anticuerpos monoclonales y/o fragmentos de anticuerpos, o una mezcla de anticuerpos con pequenas moleculas. Los anticuerpos monoclonales que tienen afinidad elevada se pueden usar para seleccionar como dianas a los vasos, mientras que los fragmentos mas pequenos que tienen una menor afinidad son mas capaces de penetrar y alcanzar las celulas tumorales. Como alternativa, se puede usar una mezcla de moleculas que se unen a plexina D1 junto con moleculas que se unen al ligando de plexina D1, y/o con moleculas que se unen a acidos nucleicos que codifican plexina D1. O moleculas que se unen al ligando de plexina D1 se pueden combinar con moleculas que se unen a acidos nucleicos que codifican plexina D1.
Las moleculas que se unen a plexina D1 como se describen aqrn se pueden usar en un metodo para tratar una enfermedad mediada por la expresion de plexina D1, que comprende el suministro intravenoso de las moleculas de union como se describen aqrn a una dosis eficaz para tratar esa enfermedad.
Las moleculas de union tambien se pueden usar en un metodo para diagnosticar una enfermedad mediada por la expresion de plexina D1, que comprende el suministro intravenoso de conjugados de moleculas que se unen a plexina D1 con un trazador paramagnetico, fluorescente o radioactivo, seguido de la formacion de imagenes mediante resonancia magnetica, formacion de imagenes opticas, SPECT o PET.
Las moleculas de union se pueden usar ademas en un metodo para tratar o suprimir una enfermedad mediada por la expresion de plexina D1, que comprende el suministro intravenoso de las moleculas de union proteinosas y de pequenas moleculas como se describen aqrn, o una composicion de moleculas de union proteinosas y de pequenas moleculas.
La enfermedad a tratar o diagnosticar puede ser cancer, una enfermedad inflamatoria, en particular una enfermedad autoinmunitaria, tal como artritis reumatoide, o aterosclerosis, o esclerosis multiple.
El diagnostico se puede realizar in vivo e in vitro. Un metodo in vivo se describe anteriormente, y se puede llevar a cabo con formacion de imagenes mediante resonancia magnetica (MRI) o con camaras de SPECT o PET tras la acumulacion de la molecula de union marcada radioactivamente en el tejido enfermo.
Otro metodo de diagnostico comprende detectar la presencia de plexina D1 en una muestra in vitro o ex vivo. Tal metodo comprende poner en contacto la muestra con moleculas de union de plexina D1, o acidos nucleicos que se unen al gen de plexina D1 o a su ARNm o un ADN copia derivado de este ARNm, todos ellos unidos a un marcador detectable, en condiciones que forman un complejo entre el anticuerpo y plexina D1, y detectar la formacion del complejo. El complejo se puede detectar visualizando el marcador detectable. Las muestras pueden ser fluidos corporales, tales como sangre, suero, plasma, saliva, orina, semen, heces, o tejidos, tales como biopsias de celulas tumorales.
La descripcion proporciona ademas un vector de expresion, que comprende la secuencia codificante para el anticuerpo de llama F8 o A12, o para el anticuerpo monocatenario derivado del anticuerpo 11F5H6, y secuencias reguladoras adecuadas. La descripcion tambien proporciona una celula transfectada con el mencionado vector de expresion. La descripcion se refiere ademas a la protema recombinante obtenible expresando el vector de expresion.
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La descripcion tambien proporciona un vector de expresion, que comprende la secuencia codificante para el dominio extracelular de plexina D1, opcionalmente fusionada a una region constante de una cadena pesada humana, y secuencias reguladoras adecuadas. La descripcion tambien proporciona una celula transfectada con el mencionado vector de expresion. La descripcion proporciona ademas la protema recombinante obtenible expresando el vector de expresion.
La protema recombinante comprende el dominio extracelular de plexina D1, que se une a ligandos de plexina D1 y previene de este modo la union de los ligandos a plexina D1 asociada a la celula. Preferiblemente, la secuencia codificante codifica una protema recombinante que comprende los aminoacidos 47-506 del dominio extracelular de plexina D1, que se une a ligandos de plexina D1 y previene de este modo la union de los ligandos a plexina D1 asociada a la celula, o los aminoacidos 507-1274 del dominio extracelular de plexina D1, que se une a los ligandos de plexina D1 y previene de este modo la union de los ligandos a plexina Dl asociada a la celula. Tal protema recombinante puede portar mutaciones que incrementan la afinidad por ligandos de plexina D1 y que tienen de ese modo una mayor potencia como receptor senuelo. Tales mutaciones se inducen habitualmente realizando cambios en la secuencia codificante usada para producir la protema recombinante.
La descripcion proporciona ademas el uso de las moleculas de union como se describen aqrn en un metodo para tratar o suprimir una enfermedad mediada por plexina D1, que comprende suministrar intravenosa o intratumoralmente dominios extracelulares de plexina D1 senuelos como se describen anteriormente, o en un metodo para tratar o suprimir una enfermedad mediada por plexina D1, que comprende el suministro intravenoso de adenovirus o lentivirus, que contienen los nucleotidos codificantes para los dominios extracelulares recombinantes de plexina D1 o partes de los mismos como se describe anteriormente.
Estos receptores de plexina D1 senuelo antagonistas interfieren con la interaccion entre plexina D1 y sus ligandos, en particular neuropilina-1, semaforina 3C y semaforina 3E, e interfieren de ese modo con la funcion de plexina D1.
Preferiblemente, los receptores de plexina D1 senuelo tienen una mayor afinidad frente a los ligandos de plexina D1, en comparacion con plexina D1. Tal mayor afinidad se puede obtener creando una biblioteca de dominios extracelulares de plexina D1, portandolos en mutaciones introducidas al azar, y seleccionando receptores senuelo con un comportamiento antagonista mas potente en ensayos de migracion celular.
A fin de producir dichas moleculas proteinosas (incluyendo peptidos, polipeptidos y polipeptidos glicosilados o polipeptidos que tienen otras modificaciones post- o peritraduccionales), es deseable insertar en vectores de expresion el acido nucleico recombinante que codifica fragmentos del dominio extracelular de plexina D1 que comprende los sitios de union para semaforina 3C, semaforina 3E y NP-1. Los antagonistas como se describen aqrn se producen preferiblemente a partir de un acido nucleico o un vector de expresion como se describe aqrn, preferiblemente en una celula hospedante.
Las moleculas como se describen aqrn tambien se pueden usar en una combinacion de metodos de tratamiento como se describen anteriormente y/o con terapias convencionales o terapia antiangiogenica para prevenir ademas la formacion de una neovasculatura tumoral, o con radioterapia y/o quimioterapia adyuvante.
La descripcion proporciona ademas un metodo para identificar moleculas que son capaces de unirse a plexina D1, metodo el cual comprende poner en contacto una coleccion de moleculas con plexina D1 y seleccionar las moleculas de la coleccion que muestren union a plexina D1 como moleculas de union a plexina D1. La coleccion de moleculas puede estar presente, por ejemplo, en bibliotecas de pequenas moleculas, en una matriz de protemas, etc. Las tecnicas para identificar colecciones de moleculas son conocidas en sf mismas. La descripcion proporciona la identificacion de la diana que se va a unir, que es plexina D1.
En esta solicitud, la expresion “molecula de union” se usa para todos los tipos de moleculas de union, es decir, aquellas que se unan a plexina D1, aquellas que se unan a acido nucleico que codifique el gen de plexina D1, y aquellas que se unan a ligandos de plexina D1. Todos estos tipos de moleculas se pueden acoplar a compuestos efectores como se describe anteriormente.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La presente descripcion se ilustrara adicionalmente en los Ejemplos que siguen. En los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes figuras:
Figura 1: Dominios estructurales de miembros de la familia de plexinas: se han identificado cuatro subfamilias, denominadas plexina A-D. Las cajas rayadas horizontalmente indican dominios Sema, las cajas rayadas en diagonal indican motivos de secuencias relacionadas con Met (MRS), y las cajas en blanco indican el motivo de MRS atfpico de PLXND1. Los miembros de la subfamilia de plexina B tienen un sitio proteolftico potencial similar a furina, marcado por una banda gris. La region transmembranica esta marcada por una caja sombreada, y es seguida de dos dominios intracelulares conservados, que comprenden juntos el dominio SP, marcado por dos ovalos.
Figura 2: A) Analisis de hibridacion in situ de lesiones cerebrales de Mel57- VEGF-A165 usando una sonda de
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ARN de plxndl espedfica para raton marcada con digoxigenina. Los vasos tumorales son muy positivos (flechas), mientras que los capilares cerebrales, distantes de las lesiones, son negativos (comparese el perfil de ISH con la tincion con CD34 en la Figura 2B).
Figura 3: Analisis de ISH espedfica para PLXND1 humana de glioblastoma multiforme (A), metastasis cerebrales de sarcoma (B), melanoma (C) y carcinoma de mama (D). Los recuadros muestran tinciones de secciones en serie mediante CD31. Las ISH de control que usan sondas sentido fueron negativas (no mostradas). Observese que en estos tumores la expresion de PLXND1 no esta confinada a los vasos sangurneos: tambien se encuentran en celulas tumorales niveles elevados del transcrito de PLXND1. t = tumor, V = vaso.
Figura 4: Analisis de ISH usando una sonda de ARN marcada con digoxigenina espedfica para ser humano (A) y tincion inmunohistoqmmica con CD31 (B) de cerebro normal. Observese que los vasos estan presentes abundantemente, pero estos no expresan el transcrito de plexina D1.
Figura 5: Especificidad de los fagos (A) y anticuerpos de un solo dominio (sdabs) correspondientes (B) A12 y F8 para el peptido H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC-CONH2. En A, se dejo que 1010 fagos se uniesen al peptido de PLXND1, BSA, IgG humana o a peptido irrelevante como se describe en el texto. Despues de un lavado riguroso, los fagos unidos se detectaron usando un anticuerpo anti-M13. En B, se llevaron a cabo incubaciones similares pero ahora con sdabs solubles. Tras lavar, los sdabs unidos se detectaron y se semicuantificaron via la etiqueta de VSV-G.
Figura 6: Las constantes de disociacion (kd) de la union entre los anticuerpos de un solo dominio A12 y F8 se determinaron usando el biosensor Biacore 2000 (Uppsala, Suecia). El chip sensor y las sustancias qmmicas que se acoplan a la protema se adquirieron de Biacore AB. El conjugado PLXND1-peptido-KLH (27 |ig/ml en acetato de sodio, pH 4,0) o BSA (1 |ig/ml en acetato de sodio, pH 5,0) se acoplo a superficies de CM5 activadas usando N-etil-N-(dimetilaminopropil)carbodiimida, N-hidroxisuccinimida, en condiciones
recomendadas por el fabricante. Los grupos sin reaccionar se inactivaron mediante 1 M de etanolamina, pH 8,5.
Las medidas cineticas se llevaron a cabo a 25°C con un caudal de 10 ml/min. en amortiguador de HBS-EP (10 mM de Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensioactivo P20). Se usaron seis concentraciones de sdabs purificados mediante afinidad con Ni (en el intervalo de 1 mM a 50 |iM) para determinar las constantes de disociacion (Kd) de la interaccion con el peptido de PLXND1. Despues de cada experimento, la regeneracion de la superficie del sensor se llevo a cabo con 10 mM de NaOH.
La union espedfica, definida por la union a una superficie de PLXND1 menos la union a una superficie de BSA de control, se analizo usando el software BIAevaluation 4.1 y un modelo de union de Langmuir 1:1. Las afinidades de los anticuerpos de un solo dominio A12 y F8 fueron 2,1 x 10"8 M y 3,5 x 10"8 M.
Figura 7: Evaluacion de la especificidad de los anticuerpos de un solo dominio por plexina D1. La figura A muestra la tincion inmunohistoqmmica de la placa de crecimiento del hueso trabecular de un embrion de raton (E16.5) con el anticuerpo de un solo dominio A12, utilizando la etiqueta de VSV-G para la deteccion del anticuerpo. El recuadro muestra una hibridacion in situ de una estructura embrionaria similar usando una sonda de plexina D1 marcada con digoxigenina espedfica para raton. Notese el solapamiento de la hibridacion in situ de plexina D1 y la inmunotincion. La figura 7b es un ejemplo representativo de una lesion Mel57-VEGF-A165 en el cerebro de un raton atimico. La vasculatura que es tambien positiva en ISH de plexina D1 (vease tambien la figura 2) es inmunopositiva con el anticuerpo de un solo dominio F8.
Figura 8: Inmunotinciones con el anticuerpo de un solo dominio A12 en una seleccion de tumores cerebrales humanos. Los tumores mostrados son A) glioblastoma multiforme, metastasis de B) melanoma, C) carcinoma de mama, y D) carcinoma de celulas renales. Los recuadros en A y B consisten en tinciones de control con el anticuerpo anti-VSV solamente, y muestran que la tincion del tumor es espedfica. Observese que los vasos y las celulas tumorales son muy reactivos con el anticuerpo.
Figura 9: Inmunotinciones con el anticuerpo de un solo dominio A12 en una serie de progresion de melanoma. Las inmunotinciones se llevaron a cabo en un nevo, un nevo displasico, y fases de crecimiento horizontal y vertical de melanoma. Observese que solamente las celulas neoplasicas expresan plexina D1.
Figura 10: Inmunotinciones con el anticuerpo de un solo dominio A12 en secciones de tumores cerebrales Mel57-VEGF-A en ratones, tratados con ZD6474. En ratones no tratados o tratados con placebo, los vasos tumorales se tinen de forma positiva con este anticuerpo. Sin embargo, en ratones tratados con ZD6474, hay una disminucion de la expresion de plexina D1 dependiente de la dosis. ZD6474 se administro oralmente, una vez al dfa, en la dosis segun se indica.
Figura 11: Inmunotinciones dobles con el marcador de macrofagos CD68 (que tine de azul) y con el anticuerpo de un solo dominio A12 (que tine de rojo) en carcinoma de mama. Una subpoblacion de macrofagos expresa plexina D1 como se revela mediante una protema que se tine de purpura.
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Figura 12: Migracion in vivo del fago A12, F8 o de un fago irrelevante hacia lesiones cerebrales Mel57- VEGF165. Se inyectaron a ratones que portan tumores 1012 fagos en la vena de la cola y, despues de 5 minutes, los ratones se anestesiaron y se sometieron a perfusion cardfaca con 15 ml de disolucion salina amortiguada con fosfato. Los ratones se sacrificaron, se retiraron los cerebros, y las secciones congeladas se analizaron para determinar el contenido y la distribucion de los fagos. A) Tincion con M13 de una seccion congelada de lesiones Mel57-VEGFi65 cerebrales. Los fagos estan claramente asociados a los vasos, como se evidencia por la inmunotincion anti-CD34 en una seccion en serie, como se muestra en B). Las flechas apuntan a un vaso positivo para CD34, distante de la lesion, que no esta resaltado por la tincion anti-M13. El recuadro en (A) muestra un experimento de control en el que se inyecto un fago irrelevante. C) Distribucion de sdab F8 tras la inyeccion intravenosa en ratones que poseen tumores. Los sdabs se visualizan mediante inmunohistoqmmica usando un anticuerpo anti-VSV. Observese que el sdab se detecta en vasos tumorales pero no en capilares cerebrales normales. El recuadro muestra el experimento de control en el que se inyecto un sdab irrelevante. Se observo una localizacion intersticial, consistente con la naturaleza permeable de los vasos en estos tumores. D) Cuantificacion de la migracion de fagos. Se diseco tejido tumoral a partir de secciones congeladas de 10 |im usando microscopfa de diseccion por captura laser. Se conto el numero de fagos formadores de colonias (cfp) tras la infeccion de celulas TG1. Se eluyeron veinte veces mas fagos F8 a partir de los tumores que de areas comparables de tejido cerebral no afectado.
Figura 13: El anticuerpo de un solo dominio migra hacia vasos tumorales que se forman recientemente per se. Se inocularon ratones atfmicos con una suspension celular de 1,5 x 105 celulas del xenoinjerto de glioma humano E98, que se obtuvo a partir de un tumor E98 subcutaneo. Despues de 3 semanas, los fagos que portan el anticuerpo de un solo dominio F8 se inyectaron en la vena de la cola, y despues de 5 minutos los ratones se anestesiaron y se sometieron a perfusion cardfaca usando 15 ml de disolucion salina amortiguada con fosfato. Los ratones se sacrificaron entonces, se retiraron los cerebros y se fijaron en formalina. Secciones en serie se tineron con anticuerpos frente a la protema p8 del fago M13 (A), frente al marcador endotelial CD34 (B) y frente a glut-1 (C, un marcador para capilares cerebrales preexistentes). La comparacion de A, B y C revela que no solo los vasos tumorales recientemente formados acumulan fago F8, sino tambien vasos cerebrales no dilatados que expresan glut-1 y que por lo tanto son considerados vasos cerebrales preexistentes que se habfan incorporado en el tumor.
Figura 14: Efectos de dominios extracelulares de plexina D1 sobre el desarrollo de la vasculatura tumoral. Transfectantes dobles de la estirpe celular de melanoma humano Mel57, que expresan VEGF-A165 y el dominio extracelular de plexina D1 que comprende los aminoacidos 1-850, se inyectaron en la arteria carotida interna derecha de ratones atfmicos. Despues de tres semanas, los ratones se sometieron a formacion de imagenes mediante resonancia magnetica potenciada por gadolinio-DTPA. La figura 14A muestra imagenes de MR de dos ratones de control que portan tumores cerebrales Mel57 que expresan VEGF-A165 solamente, y la figura 14B muestra imagenes de MR de cerebros de dos ratones que portan el transfectante doble. La permeabilidad vascular, como se ensaya mediante extravasacion de Gd-DTPA, tiende a ser menor en los transfectantes dobles, sugiriendo que la permeabilidad vascular inducida por VEGF-A es contrarrestada por el ectodominio de plexina D1. De forma mas importante, los vasos sangumeos en los tumores transfectados doblemente estan activados, como se indica por el aumento de CDR34, aunque expresan glut-1, sugiriendo fuertemente que estos vasos son vasos preexistentes que se incorporan en el tumor mediante el fenomeno de la coopcion. Observese que los vasos sangumeos en los tumores que expresan VEGF-A165 solamente, son negativos para glut-1, y por lo tanto se pueden considerar como recientemente formados.
Figura 15: Se generaron transferencias Western con ectodominios de plexina D1 recombinantes, expresados en E. coli y que engloban a los aminoacidos 47-506 (lmeas 1) o 225-388 (lmeas 2). El suero del raton 25 se evaluo antes (panel A) y despues (panel B) de la inmunizacion con la region 47-506 de plexina D1. Como se muestra en la figura 15B, el suero inmune de raton reconocio espedficamente la protema recombinante de E. coli 47-506 (52 kDa, lmea 1) y la protema que engloba a los restos 225-388 de plexina D1 (una protema de 18 kDa que se encuentra completamente dentro de la secuencia que se uso para la inmunizacion, lmea 2). El suero preinmune no mostro tal reactividad (panel A). Cuando se ensayo en tinciones inmunohistoqmmicas en una metastasis cerebral de un sarcoma alveolar de tejidos blandos, el suero inmune de raton (panel D), pero no el suero preinmune (panel C), mostro positividad frente a vasos sangumeos y celulas tumorales, un patron de tincion que fue similar al del anticuerpo de un solo dominio A12.
Figura 16: Inmunohistoqmmica con anticuerpos IgM monoclonales, obtenidos mediante linfocitos B procedentes del raton 25. Los anticuerpos 11F5H6 y 17E9C12 se seleccionaron basandose en la reactividad frente a la protema 47-506 en ELISA, y se analizaron en busca de su potencial para detectar plexina D1 en secciones congeladas de tumores humanos. Estos anticuerpos mostraron una positividad fuerte en metastasis cerebrales de sarcoma y melanoma, como se ilustra en la figura. Digno de mencion, los recuadros en los paneles C-F representan tinciones de control en las que se omitio el anticuerpo primario. Los paneles A y B muestran que estos anticuerpos no reconocen en particular estructuras de vasos en tejido cerebral normal.
Figura 17: Migracion del anticuerpo 11F5H6 al tumor.
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Para evaluar adicionalmente si el anticuerpo monoclonal 11F5H6 es capaz de reconocer vasos sangumeos tumorales, se hicieron crecer tumores Mel57-VEGF-A angiogenicos en cerebros de ratones atimicos, esencialmente como se describe en el ejemplo 10. El anticuerpo 11F5H6 (1 mg) se inyecto en una vena de la cola lateral, y se dejo circular durante l5 minutos. Despues de este penodo, los ratones se anestesiaron con 1,3% de isoflurano y se abrio el pecho, con lo que se llevo a cabo una perfusion cardfaca con 20 ml de disolucion salina amortiguada con fosfato. Despues de este procedimiento, los ratones se decapitaron, y los cerebros se retiraron y se congelaron instantaneamente o se fijaron en formalina. Las secciones congeladas de 4 |im se tineron con el anticuerpo anti-IgM. En la figura 17A se muestra que el anticuerpo 11F5H6 migra hacia y se acumula en vasos tumorales pero no en vasos normales (comparese la tincion anti-IgM en la figura 17A con la tincion anti-CD31 endotelial en la figura 17B). Tal tincion no se observa cuando se lleva a cabo la tincion anti-IgM en ratones no inyectados. De este modo, 11F5H6 es un anticuerpo prometedor que permite la seleccion de tumores como dianas.
Figura 18: Expresion de plexina D1 en macrofagos en un modelo de raton de artritis reumatoide. Las tinciones se llevaron a cabo con el anticuerpo de un solo dominio A12.
Figura 19: Expresion de plexina D1 en aterosclerosis. Un subconjunto de macrofagos en placas ateroscleroticas humanas expresa plexina D1. Se llevaron a cabo tinciones con el anticuerpo de un solo dominio A12. Se llevo a cabo una doble tincion, que presenta a plexina D1 en rojo y al marcador de macrofagos CD68 en azul. Un color purpura indica coexpresion.
Las tablas muestran lo siguiente:
Tabla I: Analisis de diferentes patologfas para la expresion de plexina D1.
Tabla II: La expresion de plexina D1 en lesiones melanocitmas aumenta de lesiones benignas a lesiones malignas.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Expresion espedfica de plexina D1 en vasos sangumeos asociados a tumores
La plexina D1 se expresa en neuronas, pero tambien en celulas endoteliales en vasos angiogenicos durante la embriogenesis. La presente descripcion demuestra que plexina D1 se expresa en vasos sangumeos asociados a tumores, pero no en vasos sangumeos normales. Esto se ha mostrado mediante hibridacion in situ de cerebros de raton, que contienen lesiones de melanoma humano angiogenicas (Figura 2). El modelo de tumor de animal se describe en (Kusters, B et al., Cancer Res 63:5408-5413 (2003)). De forma breve, se inyectan celulas tumorales via un procedimiento microquirurgico en la arteria carotida derecha, que da como resultado el crecimiento tumoral en el parenquima del hemisferio cerebral derecho. Despues de tres semanas, al comienzo de los smtomas neurologicos, los ratones se sacrifican y los cerebros se retiran y se fijan en formalina.
Secciones de 4 |im se sometieron a hibridacion in situ con fragmentos de ARN sentido y antisentido marcados con digoxigenina. Las sondas de ARN se generaron mediante transcripcion usando T3 y T7 ARN polimerasa, respectivamente, de un producto de PCR, que engloba 600 bases en la region no traducida de 3', y que estaba flanqueado por los promotores T7 y T3 (Van der Zwaag et al. (2002), mas arriba).
Las hibridaciones in situ usando sondas de ARN antisentido y sondas de ARN sentido como controles negativos se llevaron a cabo usando protocolos estandar. Las secciones se desparafinaron fundiendo parafina a 60°C y tratamientos subsiguientes con xileno y etanol. Tras la rehidratacion en disolucion salina amortiguada con fosfato (PBS), se llevo a cabo una digestion con proteinasa K (10 |ig/ml de PBS en 20 mM de Tris-HCl pH 7,4/5 mM de EDTA) durante 15 minutos a 37°C. Las secciones se post-fijaron en formaldelddo amortiguado al 4% durante 10 minutos, y se acetilaron en anhfdrido de acido acetico 0,1 M. Los portaobjetos se lavaron subsiguientemente en 2xSSC (citrato de sodio/cloruro de sodio) y milliQ. Tras secar, los portaobjetos se hibridaron con sondas de ARN marcadas con digoxigenina toda la noche a 65°C en formamida al 50%/2xSSC.
Se observaron niveles elevados de ARN de plexina D1 en vasos de tumores Mel57 angiogenicos (Figura 2) usando una sonda de ARN de plexina D1 espedfica para raton. Las celulas tumorales tambien fueron positivas para el transcrito. La homologfa no perfecta entre plexina D1 de raton y humana da como resultado una senal mas debil en las celulas tumorales humanas usando la sonda de raton.
EJEMPLO 2
Expresion de plexina D1 en tumores
Para investigar la expresion de ARN de plexina D1 en muestras tumorales humanas, se llevaron a cabo hibridaciones in situ con una sonda de ARN de plexina D1 espedfica para ser humano. Se encontraron niveles
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elevados de expresion de ARN de plexina D1 en un gran numero de tumores humanos, de ellos (glioblastoma multiforme, metastasis cerebrales de sarcoma, carcinoma de celulas renales, adenocarcinoma del colon y de la mama), tanto en la vasculatura tumoral como en celulas tumorales. En la Tabla 1 se da un resumen de los tipos de tumores que expresan plexina D1. La figura 3 muestra algunos ejemplos de hibridaciones in situ, por ejemplo un glioblastoma, una metastasis cerebral de melanoma y una metastasis cerebral de carcinoma de colon. El ARN de plexina D1 se encontro no solo en la vasculatura tumoral sino tambien excesivamente en las propias celulas tumorales. De forma importante como en la figura 4A, no se observa expresion de ARN de plexina D1 en vasculatura cerebral normal. En la figura 4B se muestra una tincion con CD31, demostrando que existen vasos abundantes en estas secciones.
EJEMPLO 3
Preparacion de anticuerpos frente a plexina D1
Para detectar la protema plexina D1, se seleccionaron anticuerpos con afinidad por plexina D1. Para este fin, se construyo una biblioteca del fago M13 pHENIX que expresa anticuerpos de llama con un solo dominio V-H, construidos mediante RT-PCR a partir de linfocitos B de llama como se describio (van Koningsbruggen, S et al., J Immunol Methods 279:149-161 (2003)). La poblacion de los ADNc resultantes que codifican fragmentos del anticuerpo de un solo dominio (sdab) V-H se ligo en el vector fagomido pHENIXHis8VSv (resultados no mostrados), dando como resultado un producto de fusion con una etiqueta de 8*His y una etiqueta de VSV-G en el termino C. Tras la electroporacion en celulas TG1 de E. coli, se recogieron y reunieron colonias resistentes a ampicilina.
La biblioteca resultante tuvo una complejidad de 8 x 108 clones. El ochenta por ciento de plasmidos contema el inserto de sdab de longitud completa segun se determina mediante analisis de PCR y mediante la deteccion inmunologica por transferencia de punto de la etiqueta de VSV-G en los sdabs (vease mas abajo). La biblioteca del fago se propago como fagomidos en bacterias TG1 de E. coli. Las partmulas del fago se rescataron mediante infeccion con el fago auxiliar sensible a tripsina M13K07 (50). Los fagos se purificaron y concentraron a partir del sobrenadante de cultivo mediante precipitacion con 20% de polietilenglicol/2,5 M de NaCl, via metodologfa estandar.
Para seleccionar fagos, que presentan anticuerpos con afinidad por plexina D1, se revistieron inmunotubos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) toda la noche a 4°C con 5 |ig/ml de peptido conjugado con KLH (H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC- CONH2, que corresponde a los aminoacidos 1-16 de la protema PLXND1 humana madura (n° de acceso AY116661) en 50 mM de NaHCO3 (pH 9,6). De forma importante, el acido glutamico en la posicion 3 en este peptido es una lisina en la secuencia de raton; los aminoacidos restantes son homologos a plxnd1 de raton.
Tras el lavado riguroso con PBS/0,05% de Tween 20 (PBST), los sitios de union no espedfica se bloquearon con 5% de Marvel (polvo de leche desnatada) en PBST (MPBST, 1 h a temperatura ambiente (RT)), y 1013 partmulas de fagos procedentes del lote de la biblioteca se incubaron durante 90 min. a RT con el peptido inmovilizado. Tras el lavado riguroso con PBST y PBS, los fagos unidos se eluyeron mediante tratamiento con tripsina (10 mg/ml, 30 min. RT).
Tras la inactivacion de la tripsina con 1% de suero de ternero neonato, el eluato se uso para infectar celulas TG1 de fase logantmica para amplificar los fagos que se unen a PLXND1 y calcular el numero de ligantes.
Para enriquecer a los fagos que se unen, se llevaron a cabo cuatro rondas de seleccion. Desde la segunda ronda en adelante, las selecciones se llevaron a cabo frente a peptidos no conjugados, inmovilizados en placas de union a ADN (Costar), para evitar la seleccion de ligantes a KLH.
Los fagos individuales que se unen a PLXND1 con insertos de sdab de longitud completa confirmados mediante PCR se evaluaron para determinar la especificidad por plexina D1. Pocillos de placas o inmunoplacas que se unen a ADN (Nunc) se revistieron toda la noche a 4°C con el peptido de PLXND1 o con un peptido irrelevante (1 |ig/pocillo en PBS/0,5 M de NaCl pH 9,0), seroalbumina bovina (1 |ig/pocillo en 50 mM de NaHCO3 pH 9,6) o inmunoglobulina G humana (1 |ig/pocillo en 50 mM de NaHCO3 pH 9,6). Despues de bloquear los sitios de union no espedfica con MPBST, los pocillos se incubaron con fagos en MPBST durante 1 h a RT, y los fagos no unidos se eliminaron mediante lavado riguroso. Los fagos unidos se detectaron usando anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) y tetrametilbencidina (TMB; bioMerieux B.V., Pafses Bajos). La reaccion se termino con H2SO4 2M, y la actividad enzimatica se cuantifico midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de ELISA.
Usando este procedimiento de seleccion, los fagos que presentan anticuerpos de un solo dominio V-H A12 y F8 sobre sus superficies se identificaron como ligantes espedficos. La Figura 5A muestra que los anticuerpos A12 y F8 asociados al fago M13 se unen espedficamente al peptido de plexina D1, pero no a seroalbumina bovina, a inmunoglobulinas o a un peptido irrelevante.
La expresion de los anticuerpos de un solo dominio solubles se indujo en celulas TG1 de E. coli de fase logantmica cultivando a 30°C en 2x medio TYA/1 mM de IPTG. Los sdabs se recogieron mediante lisis osmotica usando amortiguador de TES enfriado con hielo (200 mM de Tris-HCl, 0,5 mM de EDTA, 500 mM de sacarosa) que contiene un coctel de inhibidores de proteasas (Roche, Basel, Suiza). Las concentraciones de sdab se estimaron via analisis
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de transferencia de punto usando el anticuerpo monoclonal de raton anti-VSV-G P5D4, el anticuerpo de conejo anti- inmunoglobulina de raton conjugado con fosfatasa alcalina (Dako, Dinamarca) y tincion con NBT/BClP. Los sdabs se evaluaron en ELISA para determinar la especificidad por el peptido de PLXND1. Los anticuerpos de un solo dominio A12 y F8 no se unieron al peptido irrelevante, ni a seroalbumina bovina, ni tampoco a inmunoglobulina G humana (Figura 5B). Las constantes de disociacion (kd) de la union entre los anticuerpos de un solo dominio A12 y F8 se determinaron usando el biosensor de Biacore 2000 (Uppsala, Suecia). El chip sensor y las sustancias qmmicas que se acoplan a la protema se adquirieron de Biacore AB. El conjugado de peptido de PLXND1-KLH (27 |ig/ml en acetato de sodio, pH 4,0) o la BSA (1 |ig/ml en acetato de sodio, pH 5,0) se acoplo a las superficies de CM5 activadas, usando N-etil-N'-(dimetilaminopropil)carbodiimida, N-hidroxisuccinimida, en las condiciones
recomendadas por el fabricante. Los grupos sin reaccionar se inactivaron mediante 1 M de etanolamina, pH 8,5.
Las medidas cineticas se llevaron a cabo a 25°C con un caudal de 10 ml/min. en amortiguador de HBS-EP (10 mM de Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensioactivo P20).
Para determinar las constantes de disociacion (Kd) de la interaccion con el peptido de PLXND1 se usaron seis concentraciones de sdabs purificados mediante afinidad con Ni (en el intervalo de 1 mM a 50 |iM). Despues de cada experimento, la regeneracion de la superficie del sensor se llevo a cabo con 10 mM de NaOH. La union espedfica, definida por la union a una superficie de PLXND1 menos la union a una superficie de BSA de control, se analizo usando el software BIAevaluation 4.1 y un modelo de union de Langmuir 1:1.
Las afinidades de los anticuerpos de un solo dominio A12 y F8 fueron 2,1 x 10-8 M y 3,5 x 10-8 M, respectivamente (Figura 6).
EJEMPLO 4
Tinciones inmunohistoqmmicas con anticuerpos de un solo dominio A12 y F8
Los anticuerpos de un solo dominio se etiquetaron en el extremo carboxiterminal con la etiqueta de VSV-His, permitiendo tinciones inmunohistoqmmicas usando un anticuerpo anti-VSV. Se siguio el siguiente protocolo para las tinciones inmunohistoqmmicas con anticuerpos de un solo dominio A12 y F8. Tras la desparafinizacion, la actividad de peroxidasa endogena se bloqueo mediante incubacion con H2O2 al 0,03%. La recuperacion del antfgeno se llevo a cabo mediante tratamiento con pronasa segun protocolos estandar. Subsiguientemente, los portaobjetos se preincubaron con suero normal de caballo o de cabra (para bloquear los sitios de union no espedfica en las secciones de tejidos humanos y de raton, respectivamente), seguido de la incubacion con sdabs durante 1 h. Los sdabs se detectaron mediante incubaciones secuenciales durante 1 h con un antisuero de raton o de conejo anti- VSV-G (Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, Pafses Bajos), anticuerpo biotinilado anti-raton o anti-conejo segun sea apropiado (Vector, Burlingame, CA), y complejo de avidina-biotina peroxidasa (Vector, Burlingame, CA). Finalmente, la peroxidasa se visualizo mediante reaccion de peroxidasa con 3-amino-9-etilcarbazol (ScyTek, Utah, USA), con hematoxilina como contratincion. Todas las etapas se llevaron a cabo a RT.
La especificidad del anticuerpo A12 y F8 por plexina D1 en las tinciones inmunohistoqmmicas se examino en primer lugar tinendo embriones de raton en los que los patrones de expresion de plexina D1 a nivel del ARN estaban bien caracterizados (Van der Zwaag et al. (2002), mas arriba), y comparando los perfiles con inmunotinciones con el anticuerpo anti-endotelial anti-CD31 (DAKO, Glostrup, Dinamarca). En la placa de crecimiento de hueso trabecular de embriones de raton en E16.5, se observo inmunotincion en vasos sangmneos positivos para CD31. El perfil de tincion se correlaciono bien con la hibridacion in situ para el transcrito de plexina D1 (figura 7A). El origen de la expresion de PLXND1 en los vasos sangmneos se confirmo adicionalmente llevando a cabo tinciones en secciones en serie con sdabs y anticuerpo anti-CD31 anti-humano (anti-CD31 humano).
EJEMPLO 5
Tincion de celulas tumorales con F8
Secciones de cuatro |im de xenoinjertos de raton cerebrales de la estirpe celular de melanoma humano Mel57- VEGF-A (Kusters et al. (2003), mas arriba) se tineron con el anticuerpo de un solo dominio F8, segun el protocolo ejemplificado en el Ejemplo 4. El anticuerpo reconocio claramente plexina D1 en los vasos sangmneos tumorales (Figura 7B). Para investigar adicionalmente la expresion de la protema plexina D1 en tumores, tejido embebido en parafina de archivo o tumoral de diferente origen (glioblastoma multiforme (Figura 8A), metastasis cerebrales de melanoma (Figura 8B), carcinoma de colon (Figura 8C) y carcinoma de celulas renales (Figura 8D) se inmunotineron con sdabs anti-PLXND1. La inmunohistoqmmica usando el anticuerpo A12 y la comparacion con tinciones anti-CD31 humano en secciones en serie mostraron expresion en todos los tumores examinados, y confirmaron la expresion de plexina D1 a nivel proteico en celulas tumorales y en vasos sangmneos tumorales.
EJEMPLO 6
Ritmo de expresion de plexina en celulas malignas
para investigar si la expresion de plexina D1 se produce en celulas premalignas, tenimos una serie de progresion de
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melanoma que consiste en nevos benignos, nevos displasicos, melanoma en fase de crecimiento radial, melanoma invasivo y melanoma diseminado. Los melanocitos en nevos benignos y nevos displasicos no expresan la protema, mientras que las celulas transformadas malignamente, tanto en tumores en fase de crecimiento radial como en fase de crecimiento vertical, son positivas para la protema (Figura 9 y Tabla II).
EJEMPLO 7
Estado de activacion de celulas que expresan plexina D1
La expresion de plexina D1 esta relacionada con el estado de activacion de las celulas endoteliales en vasos sangumeos tumorales. Se mostro previamente que el tratamiento con ZD6474, un inhibidor de VEGFR2 y de EGFR, bloquea la angiogenesis en un modelo de tumor cerebral de raton, dando como resultado un desplazamiento fenotipico desde un fenotipo cooptante de vaso angiogenico a no angiogenico (43). El tratamiento con ZD6474 dio como resultado una disminucion de la expresion de plexina D1 en vasos sangumeos asociados a tumor, de una manera dependiente de la dosis (Figura l0). De este modo, la expresion de plexina D1 es una caractenstica de las celulas endoteliales activadas.
EJEMPLO 8
Inmunohistoqmmica con A12 en tejidos normales
La expresion de plexina D1 en cerebro normal, corazon, piel, rinon, bazo, intestino, endometrio, se examino mediante inmunohistoqmmica usando el anticuerpo A12. Los vasos en miometrio proliferativo expresaron plexina D1, mostrando que la plexina D1 esta asociada no solo con angiogenesis patologica, sino tambien con angiogenesis fisiologica (no mostrado).
En algunos casos, se llevaron a cabo coinmunotinciones con el marcador de macrofagos CD68. Estas tinciones revelaron que una subpoblacion de macrofagos expresa la protema (figura 11). Tambien se encontro que algunos fibroblastos en la piel y algunas celulas epiteliales intestinales proliferantes expresan plexina D1 (no mostrado).
EJEMPLO 9
Tincion de macrofagos en enfermedades inflamatorias
Para examinar adicionalmente la implicacion de plexina D1 en enfermedades con implicacion prominente de macrofagos, se llevaron a cabo tinciones inmunohistoqmmicas sobre placas ateroscleroticas, esclerosis multiple y artritis reumatoide. Los macrofagos expresaron plexina Dl.
EJEMPLO 10
Acceso a plexina D1 en vasos tumorales via inyeccion intravenosa
La expresion de la protema plexina D1 en vasos sangumeos tumorales sugiere que la plexina D1 es accesible via inyeccion intravenosa. Para evaluar esto, se inyectaron microquirurgicamente 2 x 105 celulas Mel57 transfectadas de forma estable, que expresan la isoforma VEGF-A165, en la arteria carotida interna derecha de ratones atfmicos BALB/C. Despues de 18 dfas, cuando los animales mostraron smtomas neurologicos (Kusters et al., (2003), mas arriba), se inyectaron 1012 fagos que se unen a PLXND1 de los clones A12, F8 o fagos no relevantes en la vena de la cola de ratones atfmicos, que potan las metastasis cerebrales Mel57-VEGF-A165 establecidas (n = 2 para A12, n = 4 para F8, n = 3 para fago de control).
En otros dos grupos de ratones, se inyectaron intravenosamente 30 |ig de sdab F8 o un sdab de control (n = 2 para cada grupo). Despues de 5 minutos, los ratones se anestesiaron usando isoflurano, se abrieron los pechos, y los fagos no unidos se lavaron del sistema mediante perfusion cardfaca con 15 ml de disolucion salina amortiguada con fosfato (PBS). Despues, los ratones se sacrificaron mediante dislocacion cervical, y partes de los cerebros, corazones, pulmones, hfgados, bazos y rinones se congelaron instantaneamente en nitrogeno lfquido.
Otras partes se fijaron en formalina para ser embebidas en parafina. Despues de una tincion corta con hematoxilina, los tumores se disecaron a partir de secciones cerebrales de 10 |im usando microscopfa de diseccion por captura laser (microscopio de diseccion por laser Leica). Se disecaron areas equivalentes de cerebro no afectado, contralaterales al tumor.
Subsiguientemente, los fagos se eluyeron de las muestras tisulares disecadas usando tratamiento con tripsina, y se usaron para infectar celulas TG1. Se contaron los numeros de fagos formadores de colonias, y se usaron como una medida de la migracion tumoral. Para evaluar cuantitativamente la migracion tumoral por fagos o sdabs, se tineron secciones de 4 |im, en serie con las secciones usadas para la diseccion por laser, con anticuerpo anti-p8 de M13 (Abcam Limited, Cambridge, UK) para detectar los fagos unidos, o anticuerpos anti-VSV-G (Sigma-Aldrich) para detectar anticuerpos de un solo dominio.
La inyeccion intravenosa de fagos M13 que presentan el anticuerpo de un solo dominio F8 anti-PLXNDI, pero no los
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fagos que portan anticuerpos de un solo dominio irrelevantes, en ratones que portan lesiones melanomicas angiogenicas dio como resultado la acumulacion de fagos en vasos tumorales pero no la presencia espedfica detectable de fagos en vasos cerebrales normales, ni vasos sangumeos en el hugado, bazo, rinon (Figura 12A, D y no mostrado). Esto indica que plexina D1 se expresa en el lado luminal de la celula endotelial espedficamente en vasos sangumeos tumorales, y de este modo se puede usar como un marcador seleccionable como diana.
La inyeccion del anticuerpo de un solo dominio parcialmente purificado condujo en consecuencia a la localizacion preferente del tumor (Figura 12C). En esta ultima situacion, se debe considerar que el pequeno peso molecular de 20 kDa de los anticuerpos de un solo dominio permite la extravasacion desde los vasos tumorales muy permeables y la acumulacion en el intersticio tumoral. Este ultimo efecto es no espedfico, y tambien se observa con anticuerpos de un solo dominio no relevantes. Se concibe que los anticuerpos de peso molecular pequeno y afinidades relativamente bajas tienen una mayor penetrabilidad a traves de los tumores y son mas adecuados para seleccionar como diana el compartimiento de celulas tumorales.
EJEMPLO 11
Acumulacion de F8 en vasos sangumeos tumorales
Se inyectaron transcranealmente ratones con E98, una estirpe de xenoinjerto de glioma. Los tumores E98 se mantienen como tumores subcutaneos. Se eutanasio un raton atfmico Balbc/c nu/nu que porta un tumor E98 subcutaneo, y se retiro el tumor. El tumor se troceo con un escalpelo esteril, y el homogenado se hizo pasar a traves de un filtro de nailon esteril de malla de 70 |im. Se inyectaron transcranealmente en el cerebro de ratones atfmicos veinte |il de la suspension celular resultante, que contiene 150.000 celulas. Despues de 3 semanas, se inyectaron intravenosamente fagos M13 que presentan el anticuerpo de un solo dominio F8, y despues de cinco minutos el raton se sometio a perfusion cardfaca con 15 ml de disolucion salina amortiguada con fosfato.
Los ratones se eutanasiaron, se retiraron los cerebros y se fijaron en formalina. Secciones de cuatro |im se sometieron a inmunohistoqmmica con anticuerpo anti-M13, y secciones en serie se tineron inmunohistoqmmicamente con anticuerpos frente a CD34 (marcador endotelial) y glut-1 (un marcador para celulas endoteliales cerebrales preexistentes (Kusters, B et al., Cancer Res 62:341-345 (2002)).
Los fagos que portan anticuerpos de un solo dominio anti-plexina D1 se acumularon espedficamente en vasos sangumeos asociados con el tumor, pero no en vasos normales (Figura 13). De forma importante, los fagos tambien se acumularon en vasos sangumeos tumorales que fueron positivos para glut-1, y que por lo tanto se pueden considerar como vasos sangumeos preexistentes, en lugar de vasos sangumeos recientemente formados. Esto indica que no solamente los vasos sangumeos angiogenicos se someten a una seleccion como dianas con anticuerpos anti-plexina D1, sino tambien los vasos sangumeos no angiogenicos aunque activados en tumores.
EJEMPLO 12
Ectodominios de plexina D1 recombinantes inhiben la angiogenesis
Celulas Mel57 de melanoma humano se transfectaron con la secuencia codificante de VEGF-A165 en el vector pIREShyg. Celulas transfectadas de forma estable se seleccionaron cultivandolas en 200 |ig/ml de higromicina en medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS) y penicilina/estreptomicina. Debido a que la expresion del gen de resistencia a higromicina esta enlazada a la del ADNc de VEGF-A via el sitio de entrada ribosomico interno (IRES), todas las celulas resistentes a higromicina produciran tambien la protema VEGF-A. Celulas Mel57-VEGF transfectadas de forma estable se transfectaron subsiguientemente con pIRESneo-PlexinD1 ED. El vector contiene el ADNc que codifica el dominio extracelular de nucleotidos 1-2745, enlazado via el IRES a la expresion del gen de resistencia a neomicina.
Se inyectaron transfectantes dobles en la arteria carotida derecha de ratones atfmicos, y se dejaron desarrollar los tumores. Al comienzo de los smtomas neurologicos (aproximadamente 18 dfas) los ratones se sometieron a formacion de imagenes mediante resonancia magnetica potenciada por gadolinio-DTPA. Subsiguientemente, los ratones se sacrificaron, los cerebros se fijaron en formalina y se sometieron a tinciones inmunohistoqdmicas para examinar la vasculatura tumoral.
Cuando se compara con los controles, que consisten en tumores que expresan solamente VEGF-A, la potenciacion por Gd-DTPA en la formacion de imagenes mediante resonancia magnetica (MRI) potenciada en T1 fue menor (comparese la Figura 14A, que representa dos ejemplos de tumores Mel57-VEGF-A-i65, con 14B, que representa dos ejemplos de tumores Mel57-VEGF-A-i65/PLEXIND1-ED. En los tumores que expresan VEGF-A165 y el ectodominio de plexina D1, la vasculatura muestra aumento del marcador endotelial CD34 (una marca distintiva de la activacion endotelial por VEGF-A165). La vasculatura en tumores que expresan solamente VEGF-A165 es negativa para el marcador de celulas endoteliales cerebrales glut-1, lo que es consistente con el hecho de que estos vasos estan recientemente formados y por lo tanto carecen de marcadores espedficos para celulas endoteliales cerebrales. Como se puede observar en la figura 12B, los vasos que estan asociados con tumores que expresan el ectodomino de plexina D1 tambien, sf expresan glut-1. Esto es una fuerte indicacion de que estos vasos estan actualmente preexistentes. De este modo, el ectodomino de plexina D1 no previene la activacion de celulas endoteliales por
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VEGF-Ai 65, pero sf previene la formacion de neovasculatura.
EJEMPLO 13
Anticuerpos de alta afinidad frente a plexina D1
Una secuencia proteica, que corresponde a los aminoacidos 47-506 (los 459 aminoacidos mas aminoterminales de la protema madura), se expreso en celulas de E. coli M15 pREP4, usando el vector de expresion pQE16 (Qiagen). La protema recombinante, que se produjo en las celulas bacterianas como cuerpos de inclusion, se disolvio en amortiguador desnaturalizante, que contiene 4M de urea y 1 mM de ditiotreitol (DTT), y posteriormente se dializo gradualmente frente a PBS. La protema se uso para inmunizar el raton BALB c/c 25 segun procedimientos estandar.
La Figura 15 muestra las caractensticas del suero de raton. Como se muestra en la Figura 15B, el suero inmune de raton reconocio espedficamente la protema recombinante 47-506 de E. coli (52 kDa, lmea 1), y una segunda secuencia de plexina D1 recombinante de 18 kDa, que comprende los aminoacidos 225-388 (estando asf completamente dentro de la secuencia que se uso para la inmunizacion, lmea 2). El suero preinmune no mostro tal reactividad (panel A).
Cuando se evaluo en tinciones inmunohistoqdmicas en una metastasis cerebral de un sarcoma alveolar de tejidos blandos, el suero inmune de raton (panel D), pero no el suero preinmune (panel C), mostro positividad para vasos sangumeos y celulas tumorales, un patron de tincion que fue similar al del anticuerpo de un solo dominio A12. De este modo, los linfocitos B de este raton fueron considerados adecuados para generar hibridomas de linfocitos B de bazo con la estirpe celular de mieloma SP2/0.
A partir de estos hibridomas, se selecciono un numero de estirpes celulares productoras de anticuerpos basado en la reactividad frente a la protema 47-506 en ELISA, y se analizaron en busca de su potencial para detectar plexina D1 en secciones congeladas de tumores humanos. De estos, 11F5H6 y 17E9C12, ambos anticuerpos del subtipo IgM, mostraron fuerte positividad en metastasis cerebrales de sarcoma y melanoma, como se ilustra en la Figura 16. Los recuadros en los paneles C-F representan tinciones de control en las que se omitio el anticuerpo primario. Los paneles A y B muestran que estos anticuerpos no reconocieron especialmente estructuras de vasos en tejido cerebral normal.
EJEMPLO 14
El anticuerpo monoclonal 11F5H6 es capaz de reconocer vasos sangumeos tumorales
Para evaluar adicionalmente si el anticuerpo monoclonal 11F5H6 es capaz de reconocer vasos sangumeos tumorales, se hicieron crecer tumores Mel57-VEGF-A angiogenicos en cerebros de ratones atfmicos, esencialmente como se describe en el Ejemplo 10. El anticuerpo 11F5H6 (1 mg) se inyecto en la vena lateral de la cola y se dejo circular durante 15 minutos. Despues de este penodo, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1,3% y se abrio el pecho, con lo que se llevo a cabo una perfusion cardfaca con 20 ml de disolucion salina amortiguada con fosfato.
Despues de este procedimiento, los ratones se decapitaron, y los cerebros se retiraron y se congelaron instantaneamente o se fijaron en formalina. Secciones congeladas de 4 pm se tineron con anticuerpo anti-IgM. En la Figura 17A se muestra que el anticuerpo 11F5H6 migra hacia y se acumula en vasos tumorales pero no en vasos normales (comparese la tincion anti-IgM en la Figura 17A con la tincion anti-CD31 endotelial en la Figura 17B). Tal tincion no se observa cuando se lleva a cabo la tincion anti-IgM en ratones no inyectados. De este modo, 11F5H6 es un anticuerpo prometedor que permite la seleccion de tumores como dianas.
EJEMPLO 15
Expresion de plexina D1 en artritis reumatoide
La plexina D1 se expresa en macrofagos en modelos de raton de artritis reumatoide (Figura 18). Un subconjunto de macrofagos en placas ateroscleroticas humanas tambien expresa plexina D1 (Figura 19). Se llevaron a cabo tinciones con el anticuerpo de un solo dominio A12. En la Figura 19, se llevo a cabo una tincion doble, que presenta a la plexina D1 en rojo y al marcador de macrofagos CD68 en azul. Un color purpura indica coexpresion.
SECUENCIAS
A12 (SEC ID NO:1):
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC
ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCAGTATCAGTATCAATAACTGGGGCTGGTACCGC
CAGGCTCCAGGAAAACAGCGCGAGCGGGTCGCAGCTATATCTGGTGGTGGTAAAACAGTC
TATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTG
TATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACGGCCGTCTATTACTGTAGAGCAGTC
CGGAAAAGTACGGGTTGGCTTAGGGGGCTTGACGTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACC
GTCTCCGCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCACCATCAT
CACCATCATTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA MAQVQLQESGGGLVQPGGSL RLSCAASGSSISINNWGWYR QAPGKQRERVAAISGGGKTV YADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCRAV RKSTGWLRGLDVWGQGTQVT VSAEPKTPKPQPAAAHHHHH HHHYTDIEMNRLGKGAA®
F8 (SEC ID NO:2):
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC
ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGAGACTCTCTG
AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTACTTTGATTATGGCCTGGTTCCGC
CAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCGGCGATTAGCCGGGGTGGCGGTAGCACA
AGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACGCG
GTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAAACCTGATGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCC
CGGTACGGTAGCCGAATTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCC
AAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCACCATCATCACCATCATTATACA
GACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA MAQVQLQESGGGLVQAGDSL RLSCAASGRTFSTLIMAWFR QAPGKEREFVAAISRGGGST SYADSVKGRFTISRDNSKNA VYLQMNSLKPDDTAVYYCNA RYGSRIYWGQGTQVTVSSEP KTPKPQPAAAHHHHHHHHYT
5 DIEMNRLGKGAAg
Secuencia de anticuerpo monocatenario, derivado del anticuerpo 11F5H6
(SEC ID NO:3)
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADYKDIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGN TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVFNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQ GSHVPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGRAPGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKI SCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAY MELLSLTSEDSAVYYCARAITTDGWFAYWGQGTLVTVSAAAAHHHHHHHHYTDIEMNRLG KGAA
Secuencia de anticuerpo monocatenario, derivado de anticuerpo 17E9C12 (SEC ID NO:4)
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADYKDIQMTQTPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQ KNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCH QYLSSWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSC TASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQ LSSLTSEDTAVYYCAMDYWGQGTSVTVSSAAAHHHHHHHHYTDIEMNRLGKGAA 5 Tabla 1
Expresion de PLXND1 en tejidos humanos
Tejido Maligno
Expresion de PLXND1
Adenocarcinoma de esofago (n = 1)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Adenocarcinoma de recto (n = 5)
Vasos tumorales, celulas tumorales y macrofagos
Adenocarcinoma de prostata (n = 1)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Sarcoma alveolar de partes blandas de femur (n = 1)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Astrocitoma (n = 1)
Vasos tumorales
Tumor carcinoide de pulmon (n = 1)
Vasos tumorales, celulas tumorales y macrofagos
Carcinoma ductal in situ de mama (n = 5)
Vasos tumorales, celulas tumorales, macrofagos, fibroblastos
Linfoma folicular (n = 8)
Vasos tumorales
Glioblastoma multiforme (n = 3)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Metastasis cerebral de adenocarcinoma (n = 4) (mama, pulmon, recto)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Metastasis cerebral de sarcoma alveolar de partes blandas (n = 1)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Metastasis cerebral de carcinoma de celulas renales (n = 1)
Vasos tumorales y celulas tumorales
Metastasis hepatica de adenocarcinoma de colon (n = 2)
Vasos tumorales, celulas tumorales y macrofagos
Carcinoma lobulillar in situ de mama (n = 3)
Vasos tumorales y celulas tumorales debilmente positivas, macrofagos y fibroblastos
Metastasis de ganglios linfaticos de carcinoma de mama ductal (n = 1)
Celulas tumorales y algunos vasos tumorales
Metastasis de ovario de adenocarcinoma de colon (n = 1)
Celulas tumorales y miofibroblastos
Carcinoma de celulas renales (n = 1)
Vasculatura tumoral y celulas tumorales
Carcinoma de celulas uroteliales de prostata (n = 2)
Vasos tumorales, celulas tumorales y macrofagos
No maligno
Vejiga (n = 1)
Macrofagos
Vaso sangumeo, aterosclerosis (n = 6)
Macrofagos
Medula osea (n = 2)
Corteza cerebral (n = 1)
Algunas neuronas perinucleares
Cerebro, Alzheimer + CAA (n = 1)
Endometrio
Fase de proliferacion (n = 5)
Macrofagos
Fase de secrecion (n = 4)
Macrofagos
Fase de secrecion/menstruacion (n = 1)
Macrofagos
Endometriosis interna (n = 1)
Macrofagos
Corazon (n = 1)
Algunas celulas musculares perinucleares
Intestino grueso (n = 1)
Cierta tincion luminal de epitelio, macrofagos, fibroblastos
Hfgado (n = 1)
Celulas hepaticas perinucleares granulares, macrofagos
Pulmon (n = 2)
Macrofagos
Mama (n = 2)
Algunas celulas epiteliales perinucleares
Mama, hiperplasia ductal (n = 1)
Celulas epiteliales focales perinucleares, macrofagos
Esofago (n = 1)
Macrofagos
Intestino delgado (n = 1)
Cierta tincion luminal de epitelio, macrofagos, fibroblastos
Bazo (n = 1)
Macrofagos
Tabla 2
Expresion de PLXND1 en series de progresion de melanoma
Ausente Moderada Abundante
Nevos nevocelulares (n = 18)
18
Nevos atfpicos (n = 14)
14
Melanomas in situ (n = 5)
5
Melanomas primarios (n = 26)
4 2 20
Metastasis de melanomas
Ganglios linfaticos (n = 9)
1 2 6
Piel (n = 5)
1 1 3
Cerebro (n = 5)
5
Pulmon (n = 1)
1

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra plexina D1 para uso en el tratamiento de un trastorno que implica la expresion de plexina D1 en celulas tumorales o en macrofagos activados, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en tumores cerebrales, astrocitomas, oligodendrogliomas, hemangioblastomas, carcinomas de colon, carcinomas ductales del colon, carcinomas de prostata, carcinomas de celulas renales, carcinomas de celulas renales claras, carcinomas de ovario, carcinomas de celulas escamosas, melanomas, carcinomas de pulmon, carcinomas de pulmon microcfticos, carcinomas de pulmon no microcfticos y sarcomas de tejidos blandos.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso segun la reivindicacion 1, acoplado a un compuesto efector.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso segun la reivindicacion 2, en el que el compuesto efector se selecciona del grupo que consiste en toxina, un compuesto inductor de trombosis, un agente quimioterapeutico, un resto radioactivo, un peptido inductor de apoptosis, un peptido que comprende el peptido KLAKLAKKLAKLAK, ricina, un liposoma, un polimerosoma, un polimerosoma compuesto de copoftmeros de bloques, un factor tisular truncado, doxorrubicina, cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida hidroxiurea, tecnecio 99m, yodo-123, yodo-l3l, renio-186 o -188, galio-67, itrio-90, y lutecio-177.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el trastorno es carcinoma ovarico.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se dirige contra el ectodominio soluble de plexina D1.
  6. 6. Metodo in vitro para diagnosticar un trastorno en un sujeto, en el que el trastorno implica la expresion de plexina D1 en celulas tumorales o macrofagos activados, que comprende las etapas de:
    a) proporcionar una muestra del sujeto que comprende celulas o macrofagos,
    b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido contra plexina D1,
    c) detectar la union del anticuerpo con las celulas o macrofagos en la muestra,
    en el que la union del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a las celulas o macrofagos indica la presencia de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en tumores cerebrales, astrocitomas, oligodendrogliomas, hemangioblastomas, carcinomas de colon, carcinomas ductales del colon, carcinomas de prostata, carcinomas de celulas renales, carcinomas de celulas renales claras, carcinomas de ovario, carcinomas de celulas escamosas, melanomas, carcinomas de pulmon, carcinomas de pulmon microcfticos, carcinomas de pulmon no microcfticos y sarcomas de tejidos blandos.
  7. 7. Metodo in vitro segun la reivindicacion 6, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo esta marcado con un marcador detectable.
  8. 8. Metodo in vitro segun la reivindicacion 7, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un marcador radioactivo, un marcador paramagnetico, un marcador fluorescente y un marcador quimioluminiscente.
  9. 9. Metodo in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la muestra procede de tejido o fluido corporal.
  10. 10. Metodo in vitro segun una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que el trastorno es carcinoma ovarico.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR070134A1 (es) * 2008-01-10 2010-03-17 Genentech Inc Agonistas de plexind1 que comprende un fragmento de semaforina 3e(sema3e) y su uso
WO2010023877A1 (en) * 2008-08-27 2010-03-04 Oncotherapy Science, Inc. Prmt1 for target genes of cancer therapy and diagnosis
CN101914542B (zh) * 2009-04-28 2013-03-06 中国科学院化学研究所 用于不同亚型非小细胞肺癌分型的一种核酸适体及其筛选方法
EP2385121A1 (en) * 2010-05-06 2011-11-09 Netris Pharma Antagonists of Sema3E/PlexinD1 interaction as anti-cancer agents
EP2487242A1 (en) 2011-02-09 2012-08-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg B-type plexin antagonists and uses thereof
CA2912801A1 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Medimmune, Llc Receptors for b7-h4
JP7037940B2 (ja) 2014-12-11 2022-03-17 シトリル べー．フェー． 特発性肺線維症の治療方法
CN106967789A (zh) * 2017-01-26 2017-07-21 上海长海医院 一种前列腺癌标志物plxna1及其应用
WO2018190365A1 (ja) * 2017-04-12 2018-10-18 国立大学法人九州大学 神経障害性疼痛マーカー及びその使用
EP3693380A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Dual inhibition of plexin-b1 and plexin-b2
CN117659171B (zh) * 2022-09-07 2024-10-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗HBeAg抗体或其功能性片段、检测HBeAg的试剂和试剂盒
CN116459356B (zh) * 2023-04-24 2024-03-19 中国人民解放军总医院第一医学中心 用于动脉粥样硬化斑块早期预警和动态监测的多模态分子成像纳米探针及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
AU7073800A (en) * 1999-08-25 2001-03-19 Regents Of The University Of California, The Novel plexins and uses thereof
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies
US20030190598A1 (en) * 2000-05-26 2003-10-09 Jasmid Tanha Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
EP2236614A3 (en) * 2002-08-15 2011-01-26 Genzyme Corporation Brain endothelial cell expression patterns
SE0203137D0 (sv) * 2002-10-24 2002-10-24 Karolinska Innovations Ab Drug target in cancer therapy
US20070015152A1 (en) * 2002-12-12 2007-01-18 Novartis Ag Methods for diagnosing and treating schizophrenia
CA2519630A1 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Gene expression in breast cancer
DE602004019556D1 (de) * 2003-10-30 2009-04-02 Kazusa Dna Res Instutite Found Neues plexin-polypeptid, dieses codierende dna und verwendung davon
DE102004037860A1 (de) * 2004-08-04 2006-03-16 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Turmormarker zur Diagnose von Karzinomen und/oder davon abstammender Metastasen

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