BRPI0613593A2 - método de teste "phage display" filamentoso, vetor de fago ou de fagomìdeo e biblioteca de vetores de fago ou fagomìdeo - Google Patents

Abstract

MéTODO DE TESTE "PHAGE DISPLAY" FILAMENTOSO, VETOR DE FAGO OU DE FAGOMìDEO E BIBLIOTECA DE VETORES DE FAGO OU FAGOMìDEO. A presente invenção refere-se a um método de teste "phage display" filamentoso em que os polipeptídeos de interesse apresentados na partícula de fago são transiocados co-traducionalmente através da membrana citopíasmática de bactérias gram-negativas com base na via de partícula de reconhecimento de sinal. Esse método é particularmente adequado para polipeptídeos, que são conhecidos por serem difíceis de apresentar em fagos, e para proteínas de bibliotecas de cDNA e outras bibliotecas combinatórias, em particular quando derivadas de esqueletos de proteína estáveis, de enovelamento muito rápido. A invenção refere-se ainda a vetores de fago ou de fagomídeo úteis no método que compreendem um construto gênico que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende o polipeptídeo a ser apresentado na partícula de fago e uma sequência de sinal N-terminal que promove transíocação co-traducional.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DETESTE "PHAGE DISPLAY" FILAMENTOSO, VETOR DE FAGO OU DEFAGOMÍDEO E BIBLIOTECA DE VETORES DE FAGO OU FAGOMÍDEO".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a um novo método de teste "pha-ge display", vetores de fago ou fagomídeo usados nesse e as partículas defago assim obtidas.

Antecedentes da invenção

A apresentação de polipeptídeos em bacteriófagos (teste "phagedisplay") é uma técnica de seleção que permite extrair polipeptídeos com aspropriedades desejadas de uma grande coleção de variantes (Russel, M.,Lowman1 H.B. e Clackson1 T., Introduction to phage biology and phage dis-play, em "Phage Display", Clackson, T., & Lowman, H.B., Eds., Oxford Uni-versity Press, 2004, pp. 1-26). Teste "phage display" tem sido intensamenteinvestigada para a seleção a partir de bibliotecas combinatórias de anticorpoou de peptídeo.

Sem dúvida, os bacteriófagos mais amplamente usados em tes-te "phage display" são fagos filamentosos. Os fagos filamentosos constituemuma grande família de vírus bacterianos que infectam várias bactérias Gram-negativas. Os fagos filamentosos melhor conhecidos são aqueles que infec-tam Escherichia coll·, esses são, f1/M13/fd e IKe. Os fagos f1, M13 e fd sãoaqueles que têm sido usados até agora para teste "phage display" filamento-so. Seus genomas são mais do que 98% idênticos e seus produtos de genesão intercambiáveis.

Um aspecto singular da montagem de fago filamentoso, em con-traste com a montagem de vários outros bacteriófagos, é que este é um pro-cesso secretório. A incorporação de polipeptídeos de revestimento no fagoem crescimento ocorre na membrana citoplasmática e os fagos nascentessão expelidos da célula conforme eles se montam (Russel et ai, loc.cit.). Acélula de E.coli não lisa nesse processo. As cinco proteínas de revestimentovirais (plll, pVI, pVII, pVIII e pIX) são inseridas na membrana citoplasmáticaantes de sua incorporação em partículas de fago (Figura 1). Por exemplo, amaior parte de plll é translocada através da membrana para dentro do peri-plasma, enquanto que sua cauda hidrofóbica C-terminal ancora a proteínana membrana.

Um pré-requisito para teste "phage display" filamentoso é atranslocação do polipeptídeo de interesse (POI) através da membrana cito-plasmática. Isso é normalmente obtido fundindo geneticamente o POI a umaproteína de revestimento de fago e translocando o polipeptídeo de fusão cor-respondente. Alternativamente, o POI e a proteína de revestimento de fagosão translocados independentemente. Nessa situação, o POI é estavelmenteligado à partícula de fago no periplasma, por exemplo, pela formação deuma ponte dissulfeto (Cys-DispIay) ou formação de um zíper de Ieucina (sis-tema pJuFo) com uma proteína de revestimento de fago correspondente. Emteste "phage display"s filamentosos convencional usando fusões a plll, a viaSec é usada para a translocação do polipeptídeo de fusão que compreendeo POI. Nessa via, o polipeptídeo é primeiro sintetizado no ribossomo e entãotranslocado pós-traducionalmente, em seu estado não enovelado, pelo SECtranslocon (Figura 2, (3)-(4)-(5)). Ou seja, a translocação através da mem-brana citoplasmática começa apenas depois que uma quantidade substanci-al da cadeia do polipeptídeo foi sintetizada. Entretanto, a contribuição domecanismo de translocação para o sucesso da teste "phage display" nãoestá completamente elucidada, e a possibilidade de usar uma via de translo-cação co-traducional não foi explorada na técnica anterior.

Proteínas intracelulares e extracelulares de uma ampla varieda-de de tamanhos e estruturas foram apresentadas funcionalmente em fagofilamentoso (Russel et ai, loc.cit.). No entanto, alguns polipeptídeos são re-calcitrantes em se apresentar em fago devido a propriedades individuais,principalmente por causa de razões desconhecidas. Isso faz com que o su-cesso da apresentação de uma certa proteína seja imprevisível. Assim, ge-ralmente tem sido recomendado testar primeiro a eficiência da teste "phagedisplay" filamentoso para cada proteína a ser usada. Além disso, quandouma biblioteca combinatória é criada para teste "phage display", nem todosos clones serão apresentados com eficiência similar; isso é especialmenteverdadeiro para bibliotecas geradas a partir de cDNAs. Os problemas deapresentação de polipeptídeos podem ser um resultado da sua interferênciacom a produção do fago, sua agregação periplasmática, sua proteólise, suatoxicidade para E. coli ou sua incompatibilidade com a via de translocaçãousada. Especialmente, a etapa que precede a translocação é um importantefator que influencia a incorporação dos polipeptídeos de fusão nas partículasde fago. Se os polipeptídeos se enovelam prematuramente, eles podem serrefratários à translocação ou até mesmo exibir toxicidade citoplasmática.

Assim, é importante se a proteína é translocada pós-traducionalmente (per-mitindo potencialmente o enovelamento precoce) ou co-traducionalmente(não permitindo o enovelamento citoplasmático). Métodos de teste "phagedisplay" filamentoso atuais usam vias pós-traducionais para a translocaçãodo polipeptídeo de fusão através da membrana citoplasmática (Russel etal.,loc.cit.; Paschke, M. & Hóhne, W., Gene 350, 79-88, 2005). Assim, polipeptí-deos incompatíveis com essas vias serão refratários em se apresentar, tor-nando as seleções de teste "phage display" muito ineficientes ou até mesmoimpossíveis. Por exemplo, a via Sec pós-traducional, que é quase exclusi-vamente usada em teste "phage display", é inerentemente incapaz de trans-Iocar proteínas que não podem permanecer em um estado não enoveladono citoplasma, já que o translocon Sec propriamente dito pode transportarapenas polipeptídeos não enovelados (Huber, D., Boyd D., Xia, Y., Olma,M.H., Gerstein M., & Beckwith, J.,J. Bacteriol. 187, 2983-2991; 2005, Pasch-ke et ai, loc.cit.).

Dessa forma, o problema técnico que fundamenta a presenteinvenção é identificar novas abordagens de translocação para apresentaçãoeficiente daqueles polipeptídeos em fagos filamentosos que são apresenta-dos de forma ineficiente pelo uso de translocação pós-traducional. A soluçãopara esse problema técnico é obtida pelo fornecimento das modalidades ca-racterizadas nas reivindicações.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se a um método de teste "phage dis-play" filamentoso em que o polipeptídeo de interesse (POI) apresentado naspartículas de fago é translocado co-traducionalmente através da membranacitoplasmática de bactérias Gram-negativas, em particular com base na viade partícula de reconhecimento de sinal.

Conseqüentemente, a presente invenção possibilita a teste"phage display" por translocação co-traducional de polipeptídeos de fusãoque compreendem o POI. Esse método é particularmente adequado parapolipeptídeos que são conhecidos por serem difíceis de apresentar em fa-gos, empara proteínas de bibliotecas de cDNA e outras bibliotecas combinató-rias, em particular quando derivadas de esqueletos de proteínas estáveis, deenovelamento muito rápido.

A invenção ainda se refere a vetores de fago ou fagomídeo quecompreendem um construto de gene que codifica um polipeptídeo de fusãoque compreende o POI a ser apresentado na partícula de fago e uma se-qüência de sinal N-terminal que promove a translocação co-traducional combase na via de partícula de reconhecimento de sinal, e a fagos obtidos pelométodo da invenção.

Breve descrição das Figuras

Figura 1. Inserção na Membrana e Apresentação do Polipeptídeo de Interes-se

Terminação-N (N), terminação-C (C), polipeptídeo de interesse(POI); domínios N-terminais de plll (N1, N2), domínio C-terminal de plll (CT).

A) A apresentação do polipeptídeo de interesse (POI) em umapartícula de fago filamentoso sempre inclui a translocação do POI através damembrana citoplasmática (cm) para dentro do periplasma (PP). Mais fre-qüentemente, o POI é translocado como um polipeptídeo de fusão que incluia proteína de revestimento Ill (plll) ou um fragmento dessa, plll compreendedois domínios N-terminais (N1, N2) e o domínio C-terminal (CT). Nesse e-xemplo específico, o polipeptídeo de fusão consiste no POI N-terminal e oCT C-terminal. O polipeptídeo de fusão e plll estão ancorados à membranacitoplasmática através de uma fita C-terminal hidrofóbica na porção CT apósa translocação e antes de sua incorporação na partícula de fago. Citoplasma(cp), membrana externa (om), espaço extracelular (ex).Β) Uma visão simplificada de uma partícula de fago filamentoso apresentan-do plll e o polipeptídeo de fusão de A). Os domínios N-terminais de plll (N1,N2) e o POI estão incorporados na partícula de fago através da porção CT.Figura 2. Translocação de Polipeptídeos Através da Membrana Citoplasmá-tica de Bactérias Gram-negativas.

Uma visão simplificada das três vias principais conhecidas paraa translocação de polipeptídeos através da membrana citoplasmática (cm)para dentro do periplasma (pp) de bactérias Gram-negativas. Essas vias sãoa via SRP1 a via Sec e a via Tat. Ambas as vias Sec e SRP contam com otranslocon Sec (SecRT)1 enquanto que a via Tat conta com o translocon Tat(TatTR). Ambas as vias Sec e Tat translocam polipeptídeos pós-traducionalmente enquanto que a via SRP transloca polipeptídeos co-traducionalmente. As vias Sec e SRP convergem na Sec translocase quetransporta proteínas em um estado não enovelado (uf) através da membra-na. Em contraste, o translocon Tat transloca apenas proteínas enoveladas(f). A composição de aminoácidos da seqüência de sinal (ss) favorece forte-mente o direcionamento da pré-proteína para uma dessas vias. Após atranslocação, a seqüência de sinal é clivada da pré-proteína por uma pepti-dase. A via SRP é mediada pela partícula de reconhecimento de sinal (S-RP), uma ribonucleoproteína que consiste no homólogo de proteína de 54-kDa e um RNA 4,5S. Nessa via, é a SRP que direciona a pré-proteína para otranslocon Sec. A SRP reconhece e se liga as seqüências de sinal corres-pondentes que emergem do ribossomo (R), entrega o complexo ribossomo-cadeia nascente para o receptor SRP (SR) e subseqüentemente, a pré-proteína é co-traducionalmente translocada através do translocon Sec. Poli-peptídeos que são incompatíveis com a via Sec devido ao seu enovelamentocitoplasmático prematuro podem ser eficientemente translocados pela viaSRP enquanto estão sendo traduzidos. (1) A SRP se liga a seqüências desinal particularmente hidrofóbicas de proteínas nascentes que emergem doribossomo. (2) A SRP direciona o complexo ribossomo-cadeia nascente a-través do receptor SRP para o translocon Sec, onde a translocação co-traducional ocorre. A maioria das pré-proteínas tem menos seqüências desinal hidrofóbicas e sofre exportação dependente de SecB. (3) Fator "trigger"(TF), uma chaperona citossólica que tem uma afinidade geral por polipeptí-deos nascentes, se liga a região madura de pré-proteínas nascentes e per-manece eficazmente ligada até que a tradução esteja quase terminada. (4)

Após a dissociação de TF, fatores citossólicos tais como SecB ajudam amanter as pré-proteínas em uma conformação estendida não enovelada. (5)

Pré-proteínas que retém a conformação estendida são transportadas efi-cazmente através do translocon Sec. (6) Entretanto, se o enovelamento dapré-proteína ocorre no citoplasma, a proteína é geralmente degradada (10)ou pode até bloquear o translocon Sec.

Pré-proteínas com seqüências de sinal que contêm o motivo dedupla arginina são destinados para o translocon Tat. (7) Associação comuma chaperona (TC), tal como DnaK ou outro fator específico de Tat, prova-velmente protege a seqüência de sinal até que o enovelamento esteja com-pleto (8). Esse mesmo fator ou um fator adicional podem também promovero enovelamento correto. A translocação de Tat prossegue apenas se a pré-proteína estiver corretamente enovelada; caso contrário, a pré-proteína édegradada pelo maquinário proteolítico (9, 10) da célula.

Figura 3. Representação Esquemática da Série de Vetor de FagomídeopDST.

A) Visão ampliada do cassete de expressão da série de vetor defagomídeo pDST. O cassete de expressão compreende um elemento promo-tor/operador do gene IacZ de E. coli (LacZ p/o), um sítio de ligação de ribos-somo (não descrito), as seqüências codificantes para a seqüência de sinal(ss) e um polipeptídeo de interesse (POI) a ser apresentado, um códon deparada supressor (TAG), as seqüências codificantes para um Iigante flexívelglicina/serina (G/S) e para o domínio C terminal (aminoácidos 250-406) deproteína Ill de fago filamentoso (CTpIII) que mediam a incorporação do poli-peptídeo de fusão na partícula de fago, dois códons de parada (TGATAA,não descritos) e um elemento terminador da transcrição (não descrito). Aseqüência codificante do POI é flanqueada por seqüências de DNA que co-dificam um Flag-tag (FIag) e um c-myc-tag (c-myc). As seqüências de ami-noácidos de uma letra para a seqüência de sinal DsbA (DsbAss) como umrepresentante de seqüências de sinal que atingem a via SRP e para a se-qüência de sinal PhoA (PhoAss) como um representante de seqüências desinal que atingem a via Sec são mostradas. Essas seqüências de sinal con-têm uma região N-terminal carregada positivamente (região-η), um núcleoapoiar hidrofóbico (região-h) e uma região C-terminal mais polar (região-c).

B) Representação esquemática do fagomídeo pDST23. Alémdos elementos mostrados em A), a origem de replicação do fago filamentoso(Ff ori), o gene repressor Iac de E.coli (Iacl'), que produz o repressor Iac ne-cessário para o controle rígido de IaeZ p/o, , a origem de replicação CoIEI(ColE1 ori) para a replicação bacteriana do vetor, o gene de resistência aantibiótico (cai) que codifica uma cloranfenicol-acetil-transferase que mediaa resistência ao cloranfenicol e os sítios de restrição Xba\, BamH\, Ps/l e E-coRI são descritos. O POI codificado em pDST23 é a proteína de repetiçãode anquirina (DARPin) 3a indicada.

Figura 4. Comparação de Rendimento de Apresentação por Análise porWestern Blot

A) e B) Partículas de fagos purificadas em CsCI produzidas pelouso dos fagomídeos respectivos foram separadas por SDS-PAGE, transferi-das para membranas de PVDF e detectadas com anticorpos específicos pa-ra o domínio C-terminal de proteína plll (anti-plll) ou Flag-tag (anti-FlagM1).

Alíquotas aplicadas por raia foram normalizadas e correspondem a 5 χ 1011partículas de fago. Os rendimentos de apresentação em partículas de fagopara vários polipeptídeos são analisados. Os nomes abreviados dos polipep-tídeos estão indicados acima das raias e referem-se aos polipeptídeos lista-dos na Tabela 1. Além disso, a Tabela 1 indica os fagomídeos correspon-dentes usados para produzir as partículas de fago e um esboço do cassetede expressão é dado na Figura 3A. Os rendimentos da apresentação sãocomparados para cada polipeptídeo usando tanto as seqüências de sinalPhoA (raias marcadas "p") quanto as seqüências de sinal DsbA (raias mar-cadas "d") para translocar o polipeptídeo de fusão correspondente pela viaSec ou pela via SRP, respectivamente. Bandas mais fortes indicam rendi-mentos de apresentação maiores. Os pesos moleculares das proteínas mar-cadoras em kDa estão indicados em ambos os lados do blot. A banda de 62kDa no blot anti-plll corresponde a proteína plll selvagem.Figura 5. Comparação de Rendimento de Apresentação por Análise por ELISA

Partículas de fago apresentando DARPin de ligação a cJun N-terminal quinase 2 (JNK2) chamado 2_3 (símbolos não preenchidos) ouDARPin de ligação a aminoglicosídeo quinase APH(3')-llla (APH) chamado3a (símbolos preenchidos) foram incubadas em cavidades revestidas comneutravidina e bloqueados com BSA contendo proteínas JNK2 ou APH bioti-niladas imobilizadas, respectivamente. Após a lavagem, as partículas de fa-go ligadas foram detectadas com anticorpo anti-M13 acoplado à peroxidasede rábano silvestre e visualizadas com substrato solúvel BM Blue POD. Osdados plotados mostram a absorbância (Abs) na coordenada-y medida em360 nm após a subtração da interferência em 392 nm versus o número departículas de fago (pp) aplicadas por cavidade sobre o eixo-x. As partículasde fago produzidas usando as variantes de fagomídeo que codificam a se-qüência de sinal DsbA (símbolos triangulares) mostraram metade do sinalmáximo já em cerca de 8x108 fagos por cavidade, enquanto que as partícu-las de fago produzidas a partir de variantes que codificam a seqüência desinal PhoA (símbolos quadrados) mostraram metade do sinal máximo ape-nas em cerca de 2x1011 partículas de fago por cavidade, indicando rendi-mento de apresentação 100 vezes menores. Assim o uso da via SRP medi-ada pela seqüência de sinal DsbA para a translocação de polipeptídeos defusão aumentou acentuadamente os rendimentos de apresentação em com-paração com o uso da via Sec mediada pela seqüência de sinal PhoA.Figura 6. Quantificação do Rendimento da Apresentação pela Análise porELISA

Partículas de fago apresentando DARPin 2_3 ou 3a foram anali-sadas como descrito na Figura 5. Os resultados são dados em uma diagra-ma de coluna (escala logarítmica) com rendimentos de apresentação dePhoAss ajustado para 1. O nível de apresentação (número de vezes de au-mento) para cada seqüência de sinal usada corresponde ao número de par-tículas de fago dando um sinal de OD45o=0,5 em relação ao número de par-tículas de fago contendo PhoAss dando um sinal de OD45o=0,5. PeIBss: se-qüência de sinal de Erwinia carotovora PeIB (uma seqüência de sinal putati-va dependente de Sec). Seqüências de sinal dependentes de SRP das pro-teínas TorT (TorTss), ToIB (ToIBss) e SfmC (SfmCss) de E.coli foram testa-das além de DsbAss. Um rendimento de apresentação aumentado em até700 vezes foi observado com TorTss dependente de SRP comparado aoPhoAss dependente de Sec. ToIBss e SfmCss dependentes de SRP deramum rendimento de apresentação aumentado em até 300 vezes. PeIBss de-pendente de Sec putativo mostrou um rendimento de apresentação aumen-tado apenas em 2 a 6 vezes.

Descrição detalhada da invenção

No contexto da presente invenção, o termo "teste "phage dis-play" filamentoso" refere-se a teste "phage dispiay" baseada em fagos fila-mentosos. Fagos filamentosos constituem uma grande família de vírus bac-terianos que infectam várias bactérias Gram-negativas. Os fagos filamento-sos preferidos são aqueles que infectam E.coli·, em particular f1/M13/fd eIKe. Métodos para praticar teste "phage dispiay" filamentoso são bem-conhecidas pelo versado na técnica (por exemplo, Russel et al., loc.cit.).

No contexto da presente invenção, o termo "seqüência de sinal"refere-se a uma extensão N-terminal de aminoácidos de um polipeptídeoque resulta no direcionamento do polipeptídeo para uma translocase. EmE.coli, seqüências de sinal N-terminais geralmente compreendem 15 a 52aminoácidos. A maioria das seqüências de sinal contém uma região N-terminal carregada positivamente (região-η), um núcleo hidrofóbico apoiar(região-h) e uma região C terminal mais polar (região-c). A região-c contém osítio de clivagem para a peptidase de sinal. Peptidase de sinal é uma prote-ase ligada à membrana que remove a seqüência de sinal do polipeptídeodurante a reação de translocação. Tais seqüências de sinal que compreen-dem 18 a 30 aminoácidos são preferidas. A determinação de seqüências desinal é bem-conhecida pelo veersado na técnica. Por exemplo, elas podemser obtidas a partir de bancos de dados tais como Swiss-Prot ou GenBankou usando conjuntos de dados de genoma detalhados.

No contexto da presente invenção, o termo "pré-proteína" refere-se a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinal N-terminal. Aseqüência de sinal é clivada da pré-proteína durante a reação de transloca-ção assim produzindo a proteína madura.

No contexto da presente invenção, o termo "polipeptídeo de fu-são" refere-se a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de sinalN-terminal, o polipeptídeo de interesse (POI) e uma seqüência de aminoáci-dos adicional que permite a teste "phage display" filamentoso. Preferivel-mente, essa seqüência adicional compreende um polipeptídeo de revesti-mento de fago filamentoso ou um fragmento desse. Alternativamente, essaseqüência conecta o POI à partícula de fago no periplasma pela formaçãode uma ligação estável, por exemplo, pela formação de uma ponte dissulfeto(Cys-DispIay) ou pela formação de um zíper de Ieucina (sistema pJuFo) comuma proteína de revestimento de fago correspondente. Nessa estratégia al-ternativa, o POI e a proteína de revestimento de fago correspondente sãotranslocados independentemente através da membrana citoplasmática.

No contexto da presente invenção, o termo "translocação" refe-re-se à translocação de um polipeptídeo através de uma membrana biológi-ca mediada por um translocon (Holland, I.B. et ai, Biochim. Biophys. Acta1694, 5-16, 2004). A translocação ocorre pós-traducionalmente ou co-traducionalmente. Uma translocase é então uma enzima ou complexo deenzimas que transporta especificamente um polipeptídeo através do translo-con (Holland et ai, loc. cit).

No contexto da presente invenção, o termo "via Sec" refere-se aum mecanismo de transporte de proteína para translocação pós-traducionalde pré-proteína através da membrana citoplasmática de bactérias Gram-negativas através do translocon Sec (Holland et ai, loc. cit). A via Sec é me·diada por chaperonas moleculares, mais freqüentemente SecB, que mantêmas pré-proteínas em um estado não enovelado antes da translocação. A viaSec é a principal via de translocação de proteína em bactérias Gram-negativas.

No contexto da presente invenção, o termo "via SRP" refere-se aum mecanismo de transporte de proteína para translocação co-traducionalde pré-proteínas através da membrana citoplasmática de bactérias Gram-negativas através do translocon Sec (Schierle, C.F., Berkmen, M., Huber, D.,Kumamoto1 C., Boyd1 D. & Beckwith1 J. J. Bacteriol. 185, 5706-5713, 2003;Huber et ai, loc. cit.). A via SRP é mediada pela partícula de reconhecimen-to de sinal (SRP), uma ribonucleoproteína que consiste no homólogo de pro-teína de 54-kDa (homólogo "54"; Ffh) e um RNA 4,5S. Na via SRP, a se-qüência de sinal interage com SRP assim que ele surge do ribossomo. Ocomplexo que consiste em SRP, polipeptídeo nascente e ribossomo é entãotransferido através do receptor de SRP para o translocon Sec onde o poli-peptídeo é translocado co-traducionalmente através do translocon Sec.

As vias Sec e SRP convergem na translocase Sec que transpor-ta as proteínas em um estado não enovelado através da membrana. Esta éa composição de aminoácidos da seqüência de sinal que favorecerá forte-mente o direcionamento da pré-proteína para a via SRP ao invés da via Secpara sua translocação (Huber et ai, loc. cit.).

No contexto da presente invenção, o termo "DsbA" refere-se àproteína de intercâmbio tiohdissulfeto periplasmático DsbA (número de a -cesso do Swiss-Prot P24991) de E. coli. DsbA é um substrato da via SRP(Huber et al., loc. cit.). DsbA é exportada co-traducionalmente para evitarseu enovelamento no citoplasma, o que poderia inibir sua exportação.

No contexto da presente invenção, o termo "TrxA" refere-se àproteína tioredoxina 1 de E. coli (número de acesso Swiss-Prot P00274).TrxA pode ser usada como uma proteína repórter para distinguir seqüênciasde sinal que direcionam uma pré-proteína para a via SRP ou via Sec (Schier-le et.al., loc. cit.; Huber et ai, loc. cit.).

No contexto da presente invenção, o termo "via Tat" refere-se àvia de translocação de proteína de dupla arginina (Tat) (Paschke et ai, loc.cit.). A via Tat difere fundamentalmente da via Sec e da via SRP. Ao contrá-rio do translocon Sec, o translocon Tat exporta apenas proteínas completa-mente enoveladas. Ao contrário da via SRP, o translocon Tat passa proteí-nas pós-traducionalmente através da membrana.

Em uma modalidade particular, a seqüência de sinal do polipep-tídeo de fusão que compreende o POI a ser apresentado sobre a partículade fago é uma seqüência de sinal que promove translocação co-traducional.

Métodos para testar se uma seqüência de sinal de interessepromove translocação co-traducional através da membrana citoplasmáticade bactérias Gram-negativas são bem-conhecidos pela pessoa versada natécnica. Por exemplo, a seqüência de sinal de interesse é fundida genetica-mente à MaIE madura (número de acesso do Swiss-Prot P02928, resíduos27 a 396). Essa pré-proteína artificial é então expressa em E. coli e o rendi-mento do processamento proteolítico co-traducional de sua cadeia nascenteé analisado por eletroforese em gel bidimensional como descrito (Josefsson,L-G. & Randall1 L.L., Methods Enzymol. 97, 77-85, 1983; Schierle et.al., Ioc.cit.). A remoção da seqüência de sinal N-terminal de interesse enquanto ascadeias de pré-proteína ainda estão nascentes indica que a translocação éiniciada antes da síntese do polipeptídeo estar completa e assim que atranslocação é co-traducional. Seqüências de sinal preferidas são aquelasque promovem rendimentos de translocação co-traducional acima de 80%,mais preferivelmente acima de 90%, quando fundidas à MaIE madura. Asseqüências de sinal mais preferidas são aquelas que promovem apenastranslocação co-traducional e não translocação pós-traducional quando fun-didas à MaIE madura. Alternativamente, seqüências de sinal já conhecidaspor promover translocação co-traducional, tal como a seqüência de sinal deDsbA, podem ser usadas.

Em outra modalidade particular, a seqüência de sinal do polipep-tídeo de fusão que compreende o POI a ser apresentado sobre a partículade fago é uma seqüência de sinal que atinge a via de reconhecimento desinal.

A via de reconhecimento de sinal de bactérias Gram-negativas emétodos para testar se uma seqüência de sinal de interesse direciona umapré-proteína para a via SRP são bem-conhecidos pela pessoa versada natécnica. Por exemplo, a translocação de TrxA fundido a uma seqüência desinal que atinge a via SRP é fortemente inibida em E. coli que carrega umamutação no gene ffh (por exemplo, uma cepa mutante ffh77 ou ffh87), quecodifica um componente de SRP (Schierle et. ai, loc. cit.; Huber et. al., Ioc.cit.). Assim, essas seqüências de sinal que atingem a via SRP promovem atranslocação de TrxA através da membrana citoplasmática em E. coli selva-gem, mas são muito ineficazes em uma cepa mutante ffh. Seqüências desinal podem então ser agrupadas em duas classes distintas: aquelas queatingem a via SRP e aquelas que não atingem a via SRP. Seqüências desinal que atingem a via Sec podem ser redirecionadas para a via SRP peloaumento da hidrofobicidade global da seqüência de sinal, em particular peloaumento da hidrofobicidade de sua região-h. Por exemplo, alterações mo-destas da seqüência de sinal de MaIE que aumentam simplesmente sua hi-drofobicidade pela substituição de aminoácidos polares ou pequenos (Gly ouAla) na região-h por grandes resíduos hidrofóbicos redirecionam a proteínada via Sec para SRP. Alternativamente, seqüências de sinal já conhecidaspor atingir a via SRP, tal como a seqüência de sinal de DsbA, podem serusadas. Outros exemplos de seqüências de sinal que usam a via SRP sãoaquelas de um subgrupo de autotransportadores, tal como aquela da hemo-globina protease (Hbp, número de acesso UniProtKB 088093). Excepcio-nalmente, a seqüência de sinal de Hbp é relativamente longa (52 aminoáci-dos) e contém uma extensão N-terminal que precede uma seqüência de si-nal clássica, Além disso, a região-h da seqüência de sinal de Hbp não é par-ticularmente hidrofóbica. A seqüência de sinal de SecM (número de acessodo Swiss-Prot P62395) é outro exemplo de uma seqüência de sinal longaque compreende uma extensão N-terminal e uma região-h moderadamentehidrofóbica que é conhecida por atingir a via SRP.

Em ainda outra modalidade particular, a seqüência de sinal dopolipeptídeo de fusão que compreende o POI a ser apresentado na partículade fago é uma seqüência de sinal que promove a translocação de TrxA atra-vés da membrana citoplasmática de bactérias Gram-negativas.

Várias seqüências de sinal comumente usadas, por exemploaquelas de PhoA (número de acesso do Swiss-Prot P00634) e MaIE (núme-ro de acesso do Swiss-Prot P02928), apenas promovem translocação inefi-caz de TrxA através da membrana citoplasmática (Schierle et. ai, loc. cit).Em contraste, a seqüência de sinal de DsbA promove translocação eficaz deTrxA. O fracionamento subcelular de células hospedeiras que expressamTrxA fundido à seqüência de sinal de interesse permite discriminar aquelasseqüências de sinal que são capazes de promover a translocação de TrxAatravés da membrana citoplasmática para dentro do periplasma daquelasque não são capazes (Huber et. ai, loc. cit). A quantidade de TrxA na fraçãoperiplasmática descreve a eficácia da seqüência de sinal em promover atranslocação de TrxA. Alternativamente, seqüências de sinal já conhecidaspor promover a translocação de TrxA, tal como a seqüência de sinal de Ds-bA, podem ser usadas.

Em uma modalidade preferida, a seqüência de sinal do polipep-tídeo de fusão que compreende o POI a ser apresentado na partícula de fa-go é uma seqüência de sinal selecionada do grupo que consiste em TorT1SfmC, FocC, CcmH, Yral, ToIB, NikA1 Flgl e DsbA e homólogas dessas.

Em uma modalidade particularmente preferida, a seqüência desinal do polipeptídeo de fusão que compreende o POI a ser apresentado napartícula de fago é uma seqüência de sinal selecionada do grupo que con-siste em TorT, SfmC, ToIB e DsbA.

No contexto da presente invenção, o termo "homólogo" de umaseqüência de sinal significa uma seqüência de aminoácidos com 70%, prefe-rivelmente 80% e em particular 90% ou mais de identidade de aminoácidoscom qualquer uma das seqüências de sinal mencionadas aqui anteriormen-te, embora conservando a carga global, hidrofobicidade e propriedades declivagem da região-η, região-h e região-c da seqüência de sinal, respectiva-mente. Exemplos de tais homólogos são as seqüências de aminoácidos emque um, dois, três ou quatro, em particular um ou dois, aminoácidos sãosubstituídos por outros aminoácidos, em que um, dois, três ou quatro amino-ácidos são deletados ou um ou dois aminoácidos são adicionados, ou com-binações de substituições, deleções e adições como mencionado aqui ante-riormente. Nas substituições de aminoácidos, aminoácidos apolares são pre-ferivelmente substituídos por outros aminoácidos apolares, por exemplo, Ilepor Leu, Vai, Ala, Trp, Phe ou Met ou vice-versa, aminoácidos polares poroutros aminoácidos polares, por exemplo, Thr por Ser, Asn ou Gln ou vice-versa, aminoácidos carregados negativamente por outros aminoácidos car-regados negativamente, por exemplo, Asp por Glu ou vice-versa ou aminoá-cidos carregados positivamente por outros aminoácidos carregados positi-vamente, por exemplo, Lys por Arg ou His ou vice-versa.

Por exemplo, para a seqüência de sinal de DsbA preferida com aseqüência de aminoácidos MKKIWLALAG LVLAFSASA (SEQ ID NO: 1), asubstituição de aminoácido Lys2 por Arg, Ala9 por Leu, Ala 14 por Val eSer16 por Thr é possível.

As seqüências de sinal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, ToIB,NikA, Flgl e DsbA são conhecidas por promover translocação co-traducionalde TrxA por atingirem a via SRP e por possuírem, na maioria dos casos,uma hidrofobicidade global maior em comparação às seqüências de sinalque atingem a via Sec (Huber et. ai, loc. cit). As proteínas têm os seguintesnúmeros de acesso do Swiss-Prot: TorT P38683, SfmC P77249, FocCP62609, CcmH P33925, Yral P42914, ToIB P0A855, NikA P33590, FlglP0A6S3 e DsbA P24991.

Cálculos de hidrofobicidade sozinhos não permitem discriminarseqüências de sinal dependentes de SRP ou não dependentes de SRP nafaixa de alta hidrofobicidade (Huber et. al., loc. cit). Assim, outras caracterís-ticas além da hidrofobicidade (por exemplo, a estrutura do peptídeo de sinal)influenciam a preferência por uma via de translocação.

Em uma modalidade particularmente preferida, a seqüência desinal é a seqüência de sinal de DsbA ou qualquer seqüência de aminoácidosque possua 90% de identidade com a seqüência de sinal de DsbA.

O método é aplicável a qualquer um dos métodos de teste "pha-ge display" filamentoso, por exemplo, com fagos f1, M13, fd e Ike, em parti-cular f1, M13 e fd.

Em particular, o método da invenção compreende as etapas de:(a) construir um vetor de fago filamentoso ou de fagomídeocontendo um cassete de expressão para um polipeptídeo de fusão que pos-sui uma seqüência de sinal N-terminal que promove translocação co-traducional do polipeptídeo de fusão através da membrana citoplasmática debactérias Gram-negativas;

(b) construir uma biblioteca combinatória de vetores fago oude fagomídeo pela clonagem de uma biblioteca de DNA que codifica os poli-peptídeos de interesse no cassete de expressão do vetor da etapa (a);

(c) transformar as bactérias Gram-negativas adequadas com abiblioteca de vetores da etapa (b); e

(d) realizar ciclos de seleção de teste "phage display" paraseparar partículas de fago com base nas propriedades das proteínas de inte-resse apresentadas.

Na etapa (a), o vetor de fago filamentoso ou de fagomídeo éconstruído usando métodos padronizados de tecnologia gênica. Por exem-plo, a seqüência de sinal que codifica parte do cassete de expressão para opolipeptídeo de fusão de um vetor de fago ou de fagomídeo estabelecido ésubstituído pela seqüência codificante da dita seqüência de sinal usandotécnicas padronizadas de DNA. Alternativamente, um novo vetor de fago oude fagomídeo contendo um cassete de expressão para o polipeptídeo defusão que contém a dita seqüência de sinal é construído de novo usando oconhecimento geral sobre a composição de tais vetores (por exemplo, Rus-sel et ai., Ioc. cit) e síntese padronizada de DNA e métodos de montagem.Vetores de fago ou de fagomídeo úteis para esses propósitos são, por e-xemplo, pAK100, pComb3, pEXmide3, pHEN1, pJuFo ou pSEX. Um exem-plo de tal vetor de fagomídeo (pDST23) é descrito na Figura 3 e no Exemploque a acompanha, como uma ilustração da invenção sem limitar a invençãoa essa modalidade particular.

Preferivelmente, a seqüência de sinal do polipeptídeo de fusãona etapa (a) promove translocação do polipeptídeo de fusão através da viaSRP.

Mais preferivelmente, a seqüência de sinal do polipeptídeo defusão na etapa (a) promove a translocação co-traducional de TrxA.

Na etapa (b), métodos padronizados para a preparação de bibli-otecas combinatórias de vetores são usados. Por exemplo, bibliotecas com-binatórias de DNA que codificam as proteínas de interesse são geradas pormutagênese aleatória ou direcionada ao sítio, por embaralhamento de DNA,pela preparação de cDNA através de RNAm celular ou por estruturação deconsenso e então ligados no cassete de expressão do dito vetor por técnicasde DNA padronizadas.

Na etapa (c), os métodos padronizados para a transformação debactérias Gram-negativas são usados. Por exemplo, as bactérias são trans-formadas pela biblioteca combinatória de vetores da etapa (b) por eletropo-ração ou meios químicos. Tais métodos são bem-conhecidos pela pessoaversada na técnica.

Na etapa (d), ciclos de seleção de teste "phage display" padroni-zados são realizados. Tais ciclos de seleção de teste "phage display" sãobem-conhecidos pela pessoa versada na técnica (por exemplo, Russel etal.,loc.cit.).

Preferivelmênte, a propriedade do polipeptídeo de interesse a-presentado da etapa (d) é a ligação específica a uma molécula-alvo de inte-resse. Nesse caso, partículas de fago que apresentam um POI se ligando àmolécula-alvo são separadas das partículas de fago que apresentam poli-peptídeos irrelevantes pela aplicação das partículas de fago amplificadas emcada ciclo de seleção à molécula-alvo funcionalmente imobilizada sobre umasuperfície, lavagem das partículas de fago não ligadas, eluição das partícu-Ias de fago ligadas e utilização das partículas de fago eluídas como materialpara a amplificação de partículas de fago do próximo ciclo de seleção.

É entendido que, sempre que no contexto dessa invenção, "umaseqüência de sinal" ou "a seqüência de sinal" for mencionada, tal expressãotambém significa "uma ou mais", por exemplo, uma, duas, três ou quatro se-qüências de sinal de composição diferente. Usar mais do que uma seqüên-cia de sinal pode ser vantajoso para aplicações particulares e também estádentro do âmbito dessa invenção.A invenção ainda refere-se a um vetor de fago ou de fagomídeoque compreende um construto de gene que codifica um polipeptídeo de fu-são que compreende o POI fundido a uma seqüência de sinal N-terminal quepromove a translocação co-traducional de TrxA1 em particular uma seqüên-cia de sinal selecionada do grupo que consiste nas seqüências de sinal deTorT, SfmC, FocC1 CcmH1 Yral, ToIB1 NikA1 Flgl e DsbA e homólogas des-sas, preferivelmente selecionadas a partir de TorT, SfmC, ToIB e DsbA. Omais preferido é um vetor de fago ou de fagomídeo que compreende a se-qüência de sinal DsbA ou um homólogo dessa.

Preferivelmente, o polipeptídeo de fusão compreende POI fundi-do a proteína de revestimento de fago plll ou pVIII ou a um fragmento daproteína de revestimento plll. Tal fragmento é, por exemplo, um fragmentoque compreende os aminoácidos 250 a 406 de plll.

A seqüência de sinal da enzima DsbA periplasmática direcionaproteínas repórter fundidas para a via SRP e assim aumenta sua exportaçãoco-traducional. Isso indica que o peptídeo de sinal de DsbA relativamentehidrofóbico interage com SRP e promove translocação co-traducional de Ds-bA. Assim, a seqüência de sinal de DsbA pode ser usada como uma se-qüência de sinal genérica para outras proteínas, como será mostrado abaixono Exemplo.

Da mesma maneira, homólogos da seqüência de sinal de DsbAe seqüências de sinal de TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, ToIB, NikA e Flgl ehomólogos dessas podem ser usadas.

O método da invenção é particularmente adequado para aplica-ção com bibliotecas de compostos, por exemplo, bibliotecas de DNA, emparticular bibliotecas de cDNA. Ao contrário dos métodos usados até agoraem teste "phage display", o método da invenção permite a apresentaçãoconfiável de polipeptídeos obtidos pela expressão de tais bibliotecas.

Uma modalidade particular da invenção é o método descrito deteste "phage display" filamentoso em que POIs codificados por uma bibliote-ca de DNA são apresentados em partículas de fagos. Preferivelmente, atranslocação co-traducional para os POIs codificados por uma biblioteca deDNA é realizada com base na via de partícula de reconhecimento sinal, talcomo uma seqüência de sinal que promove translocação co-traducional deTrxA. O mais preferido é o método aqui descrito para a teste "phage display"de proteínas de repetição.

Como em qualquer tecnologia de seleção, o sucesso das sele-ções de teste "phage display" depende grandemente da diversidade dosmembros da biblioteca apresentados. Uma grande biblioteca combinatóriade DNA não garante por si só que uma grande diversidade de membros dabiblioteca possa ser apresentada. Na teste "phage display", os polipeptídeosa serem apresentados têm que ser translocados através da membrana cito-plasmática antes de sua incorporação nas partículas de fago. Todos os mé-todos de teste "phage display" filamentoso atuais usam uma via pós-traducional para translocação do polipeptídeo de fusão através da membra-na citoplasmática (Russel et ai, loc. cit; Paschke et ai, loc. cit.). Assim,membros de bibliotecas incompatíveis com essas vias serão refratários àapresentação, reduzindo assim claramente a diversidade da biblioteca apre-sentada.

Bibliotecas de DNA consideradas são todas as bibliotecas deDNA combinatórias possíveis incluindo aquelas produzidas por mutagênesealeatória ou direcionada ao sítio, por embaralhamento de DNA ou por estru-turação de consenso. Tais métodos gerarão membros da biblioteca com no-vas propriedades, tais como propriedades de ligação; alguns deles serãoincompatíveis com a translocação usando a via Sec. Tais bibliotecas incluembibliotecas de DNA que codificam bibliotecas de peptídeos, bibliotecas deanticorpo ou bibliotecas baseadas em esqueletos alternativos (Russel et ai,loc. cit.; Nygren P A. & Skerra, A. J. Immunol. Methods, 290, 3-28, 2004).

Bibliotecas de DNA adicionais consideradas são bibliotecas decDNA, especialmente aquelas de origem eucariótica. Bibliotecas de cDNAcodificam uma grande variedade de proteínas celulares de ocorrência natu-ral incluindo proteínas citoplasmáticas, proteínas de membrana e proteínasextracelulares. Alguns desses membros de biblioteca de ocorrência naturalserão incompatíveis com a translocação usando a via Sec.Bibliotecas de DNA adicionais consideradas são aquelas quecodificam bibliotecas de anticorpo de cadeia única (scFv) que são usadospara selecionar fragmentos de scFv intracelularmente ativos (intracorpos).

Um pré-requisito para intracorpos é que eles se enovelem bem e sejam es-táveis no citoplasma de E. coli. Assim, intracorpos citoplasmáticos estáveis ebem enovelados são ineficazmente translocados pelo mecanismo pós-traducional da via Sec.

Bibliotecas de DNA adicionais consideradas são aquelas quecodificam bibliotecas de esqueletos alternativos baseados em proteínas derepetição, incluindo proteína de repetição de anquirina, proteínas de repeti-ção ricas em leucina, proteínas de repetição de tetratricopeptídeo, proteínasde repetição de pentatricopeptídeo ou proteínas de repetição armadil-lo/HEAT.

Uma biblioteca de DNA preferida é uma biblioteca que codificaproteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) (Binz, H.K., Ams-tutz, P., Kohl1 A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grütter, M.G. & Plück-thun, A., Nat. Biotechnol., 22, 575-582, 2004). Exemplos de DARPins apre-sentadas em partículas de fago são mostrados no Exemplo.

A invenção ainda refere-se aos fagos produzidos pelo método dainvenção.

A invenção ainda refere-se à expressão periplasmática de prote-ínas de enovelamento muito rápido e citoplasmaticamente estáveis, em par-ticular à expressão periplasmática de DARPins. A DsbAss e DARPins quecodificam fagomídeos dos Exemplos podem ser usadas diretamente para aexpressão periplasmática eficaz de DARPins em uma E.coli não supressora.

Alternativamente, vetores de expressão periplasmática padronizados podemser adaptados pela substituição do DNA que codifica a seqüência de sinalusada para expressão periplasmática por DNA que codifica uma seqüênciade sinal da invenção atual, em particular pelo DNA que codifica DsbAss. Porexemplo, a expressão periplasmática eficaz de DARPins serve de instrumen-to para a expressão de DARPins fundidas com proteínas efetoras, em parti-cular toxinas ou citocinas, que são muito difíceis de expressar no citoplasma.O novo método de teste "phage display" exemplificado aqui a-baixo permite incorporar eficazmente uma variedade muito grande de POIs aserem apresentados em partículas de fago e assim possibilita teste "phagedisplay" eficaz. A diferença chave desse novo método comparado aos méto-dos tradicionais de teste "phage display" é o uso de seqüências de sinal quedirecionam o polipeptídeo de fusão que compreende o POI a ser apresenta-do para a via SRP co-traducional (Figura 2, (1)-(2)). Dessa maneira, o POI aser apresentado é translocado eficazmente através da membrana citoplas-mática para dentro do periplasma, possibilitando assim a incorporação doPOI nas partículas de fago. Proteínas de fusão preferidas também compre-endem uma das proteínas de revestimento de fago filamentoso ou versõestruncadas das proteínas de revestimento. Nesse caso, o POI está ancoradoà membrana citoplasmática pela extensão hidrofóbica da proteína de reves-timento de fago após a translocação (Figura 1) e antes da incorporação napartícula de fago.

Um exemplo particular de uma seqüência de sinal que atinge avia SRP é a seqüência de sinal da proteína DsbA de E.coli (DsbAss). Todosos outros elementos dos fagomídeos pDST exemplificados são derivados defagomídeos clássicos tais como a série pAKIOO, que carrega as seqüênciasde sinal de PeIB (PeIBss) ou PhoA (PhoAss) que direciona os polipeptídeosde interesse a serem apresentados através da via Sec pós-traducional (Figu-ra 2, (3)-(4)-(5)).

Em uma série de experimentos, os rendimentos de apresenta-ção foram comparados entre partículas de fago produzidas a partir de fago-mídeos pDST que codificam PhoAss e fagomídeos pDST que codificam Ds-bAss. As partículas de fago foram produzidas com protocolos padronizadoscomo descrito abaixo e purificadas por centrifugação em gradiente de CsCI.Western Blotting mostrou que para a apresentação de um anticorpo Fv decadeia única o fagomídeo pDST produziu partículas de fago que têm cercados mesmos rendimentos de apresentação do POI independente da se-qüência de sinal usada (Figura 4A, ScFv). Em nítido contraste, entretanto,todas as quatro DARPins testadas puderam apenas ser eficazmente apre-sentadas quando se usou fagomídeos pDST contendo DsbAss, e quase ne-nhuma proteína apresentada pôde ser detectada quando se usou fagomí-deos pDST contendo PhoAss (Figura 4A, DARPins). Similarmente, os fago-mídeos pDST contendo DsbAss resultaram em rendimentos de apresenta-ção consideravelmente elevados no caso de polipeptídeos GCN4 (Figura4A), proteína D de cabeça lambda, TrxA e APH (Figura 4B). Rendimentos deapresentação apenas discretamente maiores foram observados para as pro-teínas Taq polimerase, proteína fosfatase de fago Lambda (λΡΡ) e nenhumaproteína apresentada pôde ser detectada no caso de c-jun Nterminal quina-se 2 (JNK2, Figura 4B). Isso demonstra que os rendimentos de apresenta-ção em partículas de fago produzidas pelo uso de fagomídeos pDST con-tendo DsbAss são pelo menos comparáveis àqueles produzidos por fagomí-deos clássicos usando PhoAss, mas mostram rendimentos de apresentaçãoacentuadamente aumentados quando apresentam DARPins e outras proteí-nas de enovelamento rápido e termodinamicamente estáveis.

Para quantificar essa diferença, partículas de fago foram usadasem experimentos ELISA de fago. Partículas de fago apresentando DARPinsque se ligam especificamente às proteínas APH e JNK2 foram comparadasapós a produção a partir de fagomídeos pDST contendo DsbAss ou fagomí-deos pDST contendo PhoAss. Baseado na detecção de partículas de fagoligadas quando quantificadas com um anticorpo anti-M13, um rendimento deapresentação aumentado de mais de 100 vezes foi observado (Figura 5).

Para demonstrar que rendimentos de apresentação maiores ob-tidos pelo uso de DsbAss também beneficiam experimentos de seleção, du-as misturas de teste contendo três tipos diferentes de partículas de fago pro-duzidas a partir de fagomídeos que codificam tanto DsbAss quanto PhoAssforam misturados em várias diluições. Para ambas as misturas de teste par-tículas de fago apresentando DARPins que se ligam especificamente às pro-teínas APH e JNK2 foram adicionadas em uma diluição de 1:107 em partícu-Ias de fago que apresentam DARPins não selecionadas E3_5 e E3_19. Es-sas duas misturas foram usadas como bibliotecas de material para seleçõesde teste "phage display" padronizadas das proteínas-alvo APH e JNK2. (Ta-bela 2). Enquanto as partículas de fago específicas para APH e JNK2 pude-ram ser enriquecidas a partir das misturas de teste produzidas a partir defagomídeos que codificam DsbAss cerca de 1000 vezes por ciclo de seleção(mais do que 10% dos clones testados eram específicos para seus alvosapós apenas dois ciclos de seleção), nenhum enriquecimento a partir da bi-blioteca de teste produzida a partir de fagomídeos contendo PhoAss pôdeser observado mesmo após cinco ciclos de seleção (nenhum clone específi-co observado).

Em outra série de experimentos, os rendimentos de apresenta-ção foram comparados por ELISA de fago entre partículas de fago produzi-das por fagomídeos pDST que codificam PhoAss1 PeIBss1 DsbAss, TorTss,ToIBss ou SfmCss. Partículas de fago que apresentam DARPins que se li-gam especificamente às proteínas APH e JNK2 foram comparadas após aprodução a partir de fagomídeos pDST individuais. Com base na detecçãode partículas de fago ligadas quando quantificadas com um anticorpo anti-M13, um rendimento de apresentação aumentado de até 700 vezes foi ob-servado com as seqüências de sinal dependentes de SRP (DsbAss, TorTss1ToIBss ou SfmCss) em comparação com a seqüência de sinal dependentede Sec, PhoAss (Figura 6).

Tabela 1. Descrição de proteínas apresentadas sobre a superfície de bacte-riófagos filamentosos

<table>table see original document page 24</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Tabela 2: Enriquecimento de fagos apresentando DARPins 3a e 2_3a

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Tabela 3. Seqüências de sinal

<table>table see original document page 25</column></row><table>Exemplo

Materiais

Químicos foram adquiridos de Fluka (Suíça). Oligonucleotídeosforam de Microsynth (Suíça). Vent DNA polimerase, enzimas de restrição etampões foram de New England Biolabs (EUA) ou Fermentas (Lituânia). Fa-go auxiliar VCS M13 foi de Stratagene (EUA). Toda a clonagem e amplifica-ção de fago foi realizada em E. coli XLI-BIue de Stratagene (EUA).

Biologia Molecular

A menos que estabelecido de outra maneira, todos os métodosde biologia molecular foram realizados de acordo com protocolos descritos(Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore1 D.D., Sedman1 J.G., Smith,J.A. & Stuhl, K. Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Nova Iorque:John Wiley and Sons, 1999). Protocolos resumidos são dados abaixo.

Métodos Relacionados à Teste "phaqe displav"

A menos que estabelecido de outra maneira, todos os métodosrelacionados à teste "phage display" foram realizados de acordo com proto-colos descritos (Clackson, T. & Lowman, H.B. Eds., Phage Display A Practi-cal Approach, Nova Iorque: Oxford University Press, 2004; Barbas III, C.F.,Burton, D.R., Scott, J.K. Eds., Phage Display: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001). Protocolos resumidos são dadosabaixo.

Clonagem

Um derivado do fagomídeo pAKIOO (Krebber, A., Bornhauser,S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, H.R. & Plückthun, A.,J. Immunol. Methods 201, 35-55, 1997) que codifica a DARPin 3a foi o pontode partida para a clonagem do primeiro fagomídeo desse estudo, chamadopDST23.

Para substituir a seqüência de sinal desse derivado de pAKIOO,os oligonucleotídeos oDST4 (SEQ ID NO: 5), oDST5 (SEQ ID NO: 6),0DST6 (SEQ ID NO: 7) e 0DST8 (SEQ ID NO: 8) foram desenhados. Essesquatro oligonucleotídeos codificam a seqüência de sinal DsbA de E. coli. Aproteína DsbA de E. coli pode ser encontrada na base de dados Swiss-Prot(número de acesso P24991). Sua seqüência de sinal é MKKIWLALAG L-VLAFSASA (SEQ ID NO: 1). Os oligonucleotídeos oDST4, oDST5, 0DST6 e0DST8 foram anelados e amplificados com oligonucleotídeos 0DST6 e0DST8 por PCR. O fragmento de DNA resultante codifica a seqüência desinal de DsbA e é flanqueado pelos sítios de endonuclease de restrição Xbale BamH\. Esse fragmento de DNA foi digerido com Xba\ e BamHl e ligado noderivado de pAKIOO similarmente tratado e defosforilado. O fagomídeo re-sultante pDST23 (Figura 3) foi isolado e a seqüência correta foi verificadapor seqüenciamento de DNA.

Para possibilitar comparação experimental direta com fagomí-deos que codificam a seqüência de sinal de PhoA (SEQ ID NO: 9), um se-gundo fagomídeo chamado pDST22 foi gerado. Novamente, quatro oligonu-cleotídeos - chamados oDST4p (SEQ ID NO: 10), oDST5p (SEQ ID NO:11), 0DST6 (SEQ ID NO: 7) e oDST8p (SEQ ID NO: 12) - foram anelados eamplificados com 0DST6 e oDST8p por PCR. O fragmento de DNA resultan-te codifica a seqüência de sinal de PhoA e é flanqueado pelos sítios de en-donuclease de restrição Xba\ e BamH. Esse fragmento de DNA foi digeridocom Xba\ e BamHI e ligado a pDST23 similarmente tratado e defosforilado.O fagomídeo resultante pDST22 foi isolado e a seqüência correta foi verifi-cada por seqüenciamento de DNA.

Os outros fagomídeos usados nesse estudo estão listados naTabela 1 e foram obtidos como se segue:

As seqüências codificantes das proteínas de interesse foramamplificadas por PCR usando iniciadores de PCR desenhados apropriados emolde de DNA, tal como cDNA preparado ou DNA de plasmídeo disponívelpara o público. Com isso, um sítio de restrição BamHl ou BghI foi introduzido5-prime a cada uma das seqüências codificantes e dois sítios de restrição{EcoR\ e PstI) foram introduzidos 3-prime em cada uma das seqüências co-dificantes. Esses fragmentos de PCR foram digeridos com BamHl ou BglIl ecom EcoRl ou PstI, e então ligados nos fagomídeos pDST23 ou pDST22similarmente tratados e defosforilados. A fase aberta de leitura do cassetede expressão para o polipeptídeo de fusão que compreende o produto dePCR clonado foi mantida para todos os construtos, especialmente a fase deleitura correta para a fusão C-terminal ao domínio C-terminal de proteína Illde fago (CTp3) foi mantida. O primeiro e o último aminoácidos das proteínasde interesse clonadas são dados na Tabela 1 assim como a referência ounúmero de acesso da base de dados do GenBank ou do Swiss-Prot. A se-qüência correta de todos os fagomídeos foi verificada por seqüenciamentode DNA.

Para as proteínas anquirina projetadas (DARPins) 3a e 2_3, fa-gomídeos que codificam PeIBss (pDST80 e pDST81, respectivamente),SfmCss (pDST86 e pDST87, respectivamente), ToIBss (pDST84 e pDST85,respectivamente) e TorTss (pDST88 e pDST89, respectivamente), foramgerados, usando a mesma estratégia de clonagem descrita acima para Ds-bAss e PhoAss.

Produção e purificação de fago

5ml de meio 2xYT contendo 1% de glicose, 34 μg/ml de cloran-fenicol (cam) e 15 μg/ml de tetraciclina (tet) foram inoculados com uma únicacolônia de E. coliXL-1 Blue hospedando o fagomídeo de interesse e as célu-las foram cultivadas durante a noite em 30QC com agitação. 5 ml de meio2xYT fresco contendo 1% de glicose, 34 μg/ml de cam e 15 μg/ml de tet fo-ram inoculados nas culturas da noite anterior em uma proporção de 1:100(ODeoo » 0,04) e cultivadas a 37°C para uma OD60O de 0,5 com agitação. Asculturas foram infectadas com fago auxiliar VCS M13 a 4 χ 1010 pfu (unida-des formadoras de placa) por ml (multiplicidade de infecção ~ 20) e as célu-las foram incubadas por 30 min a 37°C sem agitação e então por 30 min a37°C com agitação. O meio foi trocado pela coleta das células por centrifu-gação (3500 g, 24°C, 10 min) e ressuspensão do pélete em 50 ml de meio2xYT contendo 34pg/ml de cam, 50 μ g/m I de canamicina (kan) e 0,1 mM deisopropil-p-D-tiogalactosidase (IPTG). Após o crescimento por 14 a 16 h a30°C com agitação, as células foram removidas por centrifugação (5600 g,4°C, 10 min). O sobrenadante da cultura foi incubado sobre gelo por 1 h comum quarto de volume de solução de PEG/NaCI gelada (20% de polietilenoglicol (PEG) 6000, NaCI 2,5 M). As partículas de fago precipitadas foram en-tão coletadas por centrifugação (5600 g, 4°C, 15 min) e redissolvidas em 1ml de TBS150 (Tris HCI 25 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5). Purificação adicionaldas partículas de fago foi feita por centrifugação em gradiente de CsCI comose segue. Após a adição de 1,6 g de CsCI, o volume foi ajustado para 4 mlcom TBSi50. A solução de CsCI foi transferida para um tubo polialômero de12,7 χ 38,1 mm (1/2 χ VÁ polegada) (Beckmann, EUA, Ng. 358980) e centri-fugada a 100.000 r.p.m. por 4 h em um rotor TLN-100 (Beckmann Instru-ments) a 4°C. Após a centrifugação, a banda de fago foi recuperada. Os fa-gos foram transferidos para tubos de policarbonato de 12,7 χ 50,8 mm (Vz χ 2polegadas) (Beckmann, EUA, Ng 349622), que foram preenchidos comTBSi50 até 3 ml. Após centrifugação a 50.000 r.p.m. por 1 h em um rotorTLA-100.3 a 4°C, os fagos precipitados foram redissolvidos em 3 ml de TBS.

Após uma centrifugação adicional a 50.000 r.p.m. por 1 h em um rotor TLA-100.3 a 4°C, os fagos foram dissolvidos em 1 ml de TBS. A concentraçãototal de partículas de fago foi quantificada espectrofotometricamente. O títuloinfeccioso das amostras de fago foi determinado por titulação em células XL-1 Blue de E. coli usando plagas de ágar 2xYt contendo 1 % de glicose e 34μ g/m I de cam. As colônias foram contadas após incubação durante a noite a 37eC.

Blots de faao

5 χ 1011 partículas de fago, purificadas por gradiente de CsCI,foram aplicadas a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio poliacrila-mida 15% (SDS-PAGE) sob condições redutoras e transferidas para umaMembrana de transferência Immobilon-P de fluoreto de polivinilideno (PVDF)(Millipore, EUA) por eletrotransferência. A membrana foi bloqueada comMTTBSi50 (TBS150, Tween 20 0,1%, leite em pó desnatado 5%) por 1 h emtemperatura ambiente (RTA) e incubada com anticorpo anti-plll de murino(MoBiTec, Alemanha, No. PSKAN3) (1:1000 em MTTBS150, 20 min, RTA)como anticorpo primário, que reconhece o domínio C terminal de plll. Umfragmento F(ab')2 de cabra anti-lgG de camundongo conjugado a peroxidasede rábano silvestre (Pierce, USA, No. 31438) (1:10.000 em MTTBS150, 1 h aRTA) foi usado como anticorpo secundário. As proteínas foram detectadascom substrato ChemiGIowWest (Alpha Innotech1 EUA).

Em um segundo experimento, a membrana bloqueada foi incu-bada com anticorpo anti-FLAG M1 de murino (Sigma, EUA, No. F3040)(1:5000 em MTTBS150l 1 h a RTA) como anticorpo primário. Um anticorpo decabra anti-lgG de camundongo conjugado a fosfatase alcalina (Sigma, USA,No. A3562) (1:10.000 em MTTBS150, 1 h em RTA) foi usado como anticorposecundário. As proteínas foram detectadas com os substratos fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP) e nitro azul de tetrazólio (NBT) (Fluka, Suíça).

ELISA de fago

ELISAs de fago foram realizados para examinar a quantidade deDARPins apresentadas funcionalmente sobre partículas de fago M13. Prote-ínas APH e JNK2 biotiniladas (Binz et al., Ioc. cit.) foram imobilizadas comose segue: Neutravidina (66 nM, 100 μΙ/cavidade; Socochim, Suíça) emTBS150 foi imobilizada em placas MaxiSorp (Nunc, Dinamarca, No. 442404)por incubação durante a noite a 4°C. As cavidades foram bloqueadas com300 μΙ de BTTBS150 (TBS150, Tween 20 0,1%, BSA 1%) por 1 h em tempera-tura ambiente. A ligação das proteínas APH e JNK2 biotiniladas (100 μΙ, 1μΜ) em BTTBS150 foi feita por 1 h a 4°C.

Diluições seriadas de partículas de fago em BTTBS150 foram adi-cionadas às cavidades e incubadas a RTA por 2 h. Após a lavagem das ca-vidades cinco vezes com 300 μΙ de TTBS150 (TBS150, Tween 20 0,1%) por 5min, as partículas de fago ligadas foram detectadas com conjugado de pero-xidase de rábano silvestre anti-M13 (Amersham Pharmacia Biotech, UK, No.27-9421-01) e substrato POD BM Blue solúvel (Roche Diagnostics, Alema-nha, No. 148281).

Pannina de fago

Partículas de fago apresentando E3_5, E3_19, 3a e 2_3 foramproduzidas a partir de fagomídeos que codificam a seqüência de sinal dePhoA (pDST30, pDST65, pDST22, pDST34) ou a partir de fagomídeos quecodificam a seqüência de sinal de DsbA (pDST32, pDST66, pDST23,pDST37), respectivamente. Essas partículas de fago foram usadas parapreparar misturas de partículas de fagos produzidas a partir de fagomídeosque codificam tanto PhoAss quanto DsbAss. Para uma mistura 1:1 de partí-culas de fagos que apresentam as DARPins E3_5 e E3_19 não-ligantes,partículas de fago que apresentam as DARPins 3a ou 2_3 alvo-específicasforam adicionadas em uma diluição de 1:107.

Proteínas APH e JNK2 biotiniladas foram revestidas como des-crito para o ELISA de fago. A cada cavidade, 0,1 ml de misturas de partícu-las de fago (1013 cfu/ml) foram adicionadas a 0,1 ml de BTTBS150 e incuba-das por 2 h. Após a lavagem (3 vezes para o primeiro ciclo de seleção, 4vezes para o segundo ciclo e 5 vezes para os ciclos adicionais) com TTBS150e (3vezes para o primeiro ciclo de seleção, 4 vezes para o segundo ciclo e 5vezes para os ciclos adicionais) com TBS150, as partículas de fago forameluídas por incubação por 15 min com 0,2 ml de tampão de eluição (0,2 Mglicina/HCI, pH 2.2) a cerca de 22°C seguido por uma eluição por 30 mincom 0,2 ml de tripsina (10 mg/ml em TBS150) a 37°C. Os eluados combina-dos (neutralizados com 10 μΙ de Tris-base 2M) foram usados para a infecçãode 4 ml de E coli XLI-BIue em crescimento exponencial. Após 30 min a37QC sem agitação e 30 min a 37°C com agitação, as células foram espa-lhadas sobre placas de ágar 2xYT contendo 1% de glicose e 34Mg/ml decam e 15pg/ml de tet e incubadas durante a noite a 37°C. As células foramlavadas das placas com 2xYT contendo 1% de glicose, 15% de glicerol,34pg/ml de cam e 15pg/ml de tet e usadas para a produção de fago para opróximo ciclo de panning. Após cada ciclo de panning, a identidade de 9 a16 partículas de fago eluídas foi determinada. Isso foi feito pela infecção deE coli com essas partículas de fagos e rastreamento das colônias por PCRcom iniciadores clone-específicos.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Universitãt Zürich

<120> Teste "phage display" usando translocação co-traducional de poli-peptídeos de fusão

<130> P332A

<150> EP05106236 .2<151> 2005-07-08

<150> 60/555,818<151> 2004-03-23

<160> 16

<170> Patentin versão 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Lys Lys Ils Trp Leu Ala Leu Aia G,y Leu Vsl Leu Aia Phe Ser15 10 15

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> El - T245 de cadeia simples FV ligando gpD contendo dissulfeto<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ty Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Va! Tyr Tyr Cys85 90 95

Als Arq Lys Gly Gly Leu Met Asp Va: Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Giy Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125

Gly Gly Ser G!y Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg145 150 155 160

Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr ι yr Cys210 215 220

Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg Thr245

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> D13 - Q166 de DARPin 3a ligando APH

<400> 3

Asp Leu Gty Lys Lys Leu Leu Giu A\a Aia Arg Ate Gty Gta Asp Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp20 25 30Trp Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Val Val Asn Asn Gly His Leu35 40 45

Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Tyr Ala Ala Asp Val Asn Ala Ser50 55 60

Asp Lys Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Arg Gly His65 70 75 80

Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala85 90 95

Met Asp Tyr Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Asp Gly100 105 110

His Leu Glu lie Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn115 120 125

Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn130 135 140

Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln145 150

<210> 4

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> Peptídeo derivado do fator de transcrição GCN4 (R249 a R281, E259-S262P)

<400> 4

Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Asn Tyr15 10 15

His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg20 25 30

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oDST4 oligonucleotídeo

<400> 5

agagcatgcg tagg3gsaaa taaaalgaaa aagatttggc tggcgctggc tgg

53<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oDST5 oligonucleotídeo<400> 6

tctttgiagt ccgccgatgc gctaaacgct aaaactaaac cagccagcgc cagcc

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 0DST6 oligonucleotídeo<400> 7

gctctagagc atgcgtagga g 21

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 0DST8 oligonucleotídeo<400> 8

gcggetccat clttglagtc cgccg 25

<210> 9<211> 21<212> PRT

<213> Escherichia coli<400> 9

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Lej Leu Pro Lej Leu Phe Thr15 10 15

Pro Val Thr Lys Ala20

<210> 10<211> 60<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> oDST4p oligonucleotideo<400> 10

agagcatgcg laggagaaaa taaaatgaaa caaagcacta ttgcactggc actcttaccg 60

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oDST5p oligonucleotideo<400> 11

ccatcfflgt agtcggcttt ggtaacaggg gtgaagagca acggtaagag tgccagtgc 59

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oDST8p oligonucleotideo<400> 12

gcggatccat ctttgtaglc ggc 23

<210> 13

<211> 22

<212> PRT

<213> Erwinia carotovora

<400> 13

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gfy Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala20

<210> 14<211> 23<212> PRT<213> Escherichia coli<400> 14

Mel Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Mel Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile1 5 10 15

Ile Ser Ala Ser Ala His Ala20

<210> 15<211> 21<212> PRT

<213> Eseherichia coli<400> 15

Mel Lys Gln A;a Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp Ala15 10 15

Ser Val Leu His Ala20

<210> 16<211> 18<212> PRT

<213> Eseheriehia coli<400> 16

Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala15 10 15

PheSer

Claims (15)

1. Método de teste "phage display" filamentoso, caracterizadopelo fato de que polipeptídeos de interesse codificados por uma biblioteca deDNA são apresentados em partículas de fago, em que a dita biblioteca deDNA é uma biblioteca de cDNA ou uma biblioteca combinatória de DNA, quecodifica uma biblioteca de peptídeo, uma biblioteca de anticorpo ou uma bi-blioteca baseada em esqueletos alternativos, e em que os polipeptídeos deinteresse são translocados co-traducionalmente através da membrana cito-plasmática de bactérias gram-negativas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a translocação co-traducional é realizada com base na via departícula de reconhecimento de sinal.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a seqüência de sinal usada para a translocação do polipep-tídeo de interesse a ser apresentado na partícula de fago é uma seqüênciade sinal que promove a translocação co-traducional de TrxA.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracteriza-do pelo fato de que a seqüência de sinal usada para a translocação dos po-lipeptídeos de interesse a serem apresentados na partícula de fago é sele-cionada a partir do grupo que consiste nas seqüências de sinal de TorT1SfmC, FocC1 CcmH1 Yral, ToIB1 NikA1 Flgl e DsbA1 seqüências de aminoáci-dos com 70% de identidade com uma das ditas seqüências de sinal, em queas ditas seqüências de aminoácidos conservam a carga global, hidrofobici-dade e propriedades de clivagem da região-η, da região-h e da região-c dadita seqüência de sinal, respectivamente.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a seqüência de sinal usada para a translocação dos polipeptí-deos de interesse a serem apresentados nas partículas de fago é seleciona-da a partir do grupo que consiste nas seqüências de sinal de TorT, SfmC1ToIB e DsbA.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos de interesse a serem a-presentados nas partículas de fago são proteínas de repetição.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de(a) construir um vetor de fago filamentoso ou de fagomídeocontendo um cassete de expressão para um polipeptídeo de fusão que pos-sui uma seqüência de sinal N-terminal que promove a translocação co-traducional do polipeptídeo de fusão através da membrana citoplasmática debactérias gram-negativas;(b) construir uma biblioteca combinatória de vetores de fagoou de fagomídeo pela clonagem da biblioteca de DNA que codifica os poli-peptídeos de interesse no cassete de expressão do vetor da etapa (a);(c) transformar bactérias gram-negativas adequadas com abiblioteca de vetores da etapa (b); e(d) realizar ciclos de seleção de teste "phage display" paraseparar partículas de fago com base nas propriedades dos polipeptídeos deinteresse apresentados.

8. Método de teste "phage display" filamentoso, caracterizado pelofato de que um polipeptídeo de interesse apresentado na partícula de fago étranslocado co-traducionalmente através da membrana citoplasmática de bac-térias gram-negativas usando uma seqüência de sinal selecionada a partir dogrupo que consiste nas seqüências de sinal de TorT1 SfmC1 FocC1 Yral1 ToIB1NikA1 Flgl1 e DsbA1 seqüências de aminoácidos com 70% de identidade comuma das ditas seqüências de sinal, em que as ditas seqüências de aminoácidosconservam a carga global, hidrofobicidade e propriedades de clivagem da regi-ão-n, da região-h e da região-c da dita seqüência de sinal, respectivamente.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a seqüência de sinal é selecionada a partir do grupo que consis-te nas seqüências de sinal de TorT, SfmC, ToIB e DsbA.

10. Vetor de fago ou de fagomídeo, caracterizado pelo fato deque compreende uma construto gênico que codifica uma proteína de fusãoque compreende a polipeptídeo de interesse a ser apresentado na partículade fago e uma seqüência de sinal selecionada a partir do grupo que consistenas seqüências de sinal de TorT1 SfmC1 FocC1 CcmH1 Yral1 ToIB1 NikA1 Flgle DsbA1 seqüências de aminoácidos com 70% de identidade com uma dasditas seqüências de sinal, em que as ditas seqüências de aminoácidos con-servam a carga global, hidrofobicidade e propriedades de clivagem da regi-ão-n, da região-h e da região-c da dita seqüência de sinal, respectivamente.

11. Vetor de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato de que a seqüência de sinal é selecionada a partir do grupo que consis-te nas seqüências de sinal de TorT1 SfmC1 ToIB1 e DsbA.

12. Biblioteca de vetores de fago ou fagomídeo, caracterizadapelo fato de que compreende construtos gênicos que codificam proteínas defusão em que cada uma das proteínas de fusão compreende uma seqüênciade sinal que promove a translocação co-traducional de TrxA e um polipeptí-deo de interesse a ser apresentado em uma partícula de fago em que cadapolipeptídeo de interesse é codificado por um membro de uma biblioteca deDNA1 em que a dita biblioteca é uma biblioteca de cDNA ou uma bibliotecacombinatória de DNA1 que codifica uma biblioteca de peptídeo, uma bibliote-ca de anticorpo ou uma biblioteca baseada em esqueletos alternativos.

13. Biblioteca de vetores de acordo com a reivindicação 12, ca-racterizada pelo fato de que a seqüência de sinal é selecionada a partir dogrupo que consiste nas seqüências de sinal de TorT1 SfmC1 FocC1 CcmH1Yral1 ToIB1 NikA1 Flgl1 e DsbA1 seqüências de aminoácidos com 70% de i-dentidade com uma das ditas seqüências de sinal, em que as ditas seqüên-cias de aminoácidos conservam a carga global, hidrofobicidade e proprieda-des de clivagem da região-η, da região-h e da região-c da dita seqüência desinal, respectivamente.

14. Biblioteca de vetores de acordo com a reivindicação 12, ca-racterizada pelo fato de que a seqüência de sinal é selecionada a partir dogrupo que consiste nas seqüências de sinal de TorT, SfmC, ToIB. e DsbA.

15. Biblioteca de vetores de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que a biblioteca de DNA quecodifica os polipeptídeos de interesse é uma biblioteca de DNA que codificaproteínas de repetição.