BRPI0613721A2

BRPI0613721A2 - transfecção estável isenta de soro e produção de proteìnas humanas recombinantes em linhagens de células humanas

Info

Publication number: BRPI0613721A2
Application number: BRPI0613721-0A
Authority: BR
Inventors: Carola Schrider; Cathleen Wegmann; Haiyan Ding
Original assignee: Octapharma Ag
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2011-02-08
Also published as: US20160177362A1; AU2006265173A1; WO2007003582A3; IL266122A; EP1896590A2; JP2016154537A; US20170152523A1; IL187676A; ES2574584T3; CN105755041A; MX2007015370A; JP5925407B2; US8871439B2; IL266122B2; KR20080028891A; RU2008103319A; CA2611708A1; EP1896590B1; US20150044720A1; JP2019058173A

Abstract

TRANSFECçãO ESTáVEL ISENTA DE SORO E PRODUçãO DE PROTEìNAS HUMANAS RECOMBINANTES EM LINHAGENS DE CéLULAS HUMANAS. A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para a produção isenta de soro, com um vetor específico transportando a codifiçação gênica para a proteína de interesse. Além disso, a invenção refere-se a uma linhagem de célula de produção obtida pelo dito método, um método de produção para a dita proteína de interesse que utiliza a dita linhagem de célula de produção, e o vetor específico transportando o próprio gene de interesse.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRANSFEC-ÇÃO ESTÁVEL ISENTA DE SORO E PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS HU-MANAS RECOMBINANTES EM LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS".

A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para aprodução isenta de soro de uma linhagem de célula humana imortalizadaestavelmente transfectada, sob condições isentas de soro, com um vetorespecífico transportando a codificação gênica para a proteína de interesse.Além disso, a invenção refere-se a uma linhagem de célula de produção ob-tida pelo dito método, um método de produção para a dita proteína de inte-resse que utiliza a dita linhagem de célula de produção, e o vetor específicotransportando o próprio gene de interesse.

TRANSFECCÁO ESTÁVEL ISENTA DE SORO E PRODUÇÃO DE PROTE-ÍNAS HUMANAS RECOMBINANTES EM LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS

A presente invenção refere-se a um método aperfeiçoado para aprodução isenta de soro de uma linhagem de célula humana imortalizadaestavelmente transfectada, sob condições isentas de soro, com um vetorespecífico transportando a codificação gênica para a proteína de interesse.

Além disso, a invenção refere-se a uma linhagem de célula de produção ob-tida pelo dito método, um método de produção para a dita proteína de inte-resse que utiliza a dita linhagem de célula de produção, e o vetor específicotransportando o próprio gene de interesse.

ANTECEDENTES

A produção recombinante de proteínas humanas é geralmenterealizada por cultivo de linhagens de células eucarióticas estavelmentetransfectadas e, preferivelmente, mamíferas e isolamento da proteína docaldo de cultura. No caso das proteínas recombinantes serem destinadas aaplicações farmacêuticas, foi, por um longo tempo, prática geral empregarlinhagens de células não-humanas de modo a excluir o risco de co-purificaragentes infecciosos, que podem ser alojados e expressos por células humanas.

Na produção de algumas proteínas humanas, tal como fator Vlllde coagulação do sangue humano, verificou-se que o uso de linhagens decélulas não-humanas acarreta certas desvantagens, por exemplo, níveis desecreção insatisfatórios da proteína expressa no meio. Acredita-se que issopode ser devido a ligeiras diferenças dentro dos tipos diferentes de célulasmamíferas com respeito a vias intracelulares para tradução e modificação deproteína, que pode também ter efeito sobre a atividade biológica do polipep-tídeo expresso. Além disso, há preocupações de que proteínas terapêuticaspurificadas de sistemas de expressão não-humanos fiquem contaminadascom componentes celulares que podem produzir reações antigênicas nospacientes. Também, uma outra preocupação era o padrão de glicosilaçãonão-humana encontrado nas proteínas humanas produzidas recombinante-mente em sistemas de expressão não-humanos. Imagina-se que isso au-menta a probabilidade de reações antigênicas no paciente. Ademais, a esta-bilidade e eficácia biológicas das proteínas do sangue, tais como fatores decoagulação, são substancialmente influenciadas pelo seu padrão de N-glicosilação. Especialmente, monossacarídeos periféricos e terminais sãoimportantes porque eles são detectados por receptores específicos proveni-entes de células que são responsáveis por sua degradação. Fatores de coa-gulação, por exemplo, transportam resíduos de ácido siálico como monossa-carídeos terminais. Modificação na composição dos ácidos siálicos nas an-tenas das glicoproteínas pode resultar em padrões de glicosilação heterogê-nea. Assim, a estabilidade e eficácia biológicas estão crucialmente envolvi-das quando a modificação ocorre. Logo, é uma consideração importante naprodução de fatores de coagulação recombinantes para avaliar a influênciada glicosilação de linhagens de células de produção não-humanas versuslinhagens de células humanas.

Por outro lado, métodos gerais para expressão de proteína dealto nível de um gene desejado compreendendo linhagens de células mamí-feras, imortalizadas, estavelmente transfectadas, expressando proteínas ati-vadoras de transcrição viral (por exemplo, Patente U.S. 5.712.119). Essaslinhagens de células podem ser transformadas com uma construção de ve-tor, onde um promotor de transcrição viral adequado é operavelmente asso-ciado a uma seqüência de DNA que define um gene de interesse, as proteí-nas ativadoras de transcrição fornecidas pelas linhagens de células ativam opromotor de transcrição viral e, logo, iniciam a expressão do gene de inte-resse.

Tão importante quanto à linhagem de célula é o vetor usado pa-ra a introdução do gene recombinante em uma linhagem de célula de produ-ção imobilizada. Uma grande variedade de vetores foi utilizada para tradu-ção de proteínas mamíferas (por exemplo, Witsch Baumgartner, M et al. Am.J. Genet (2000). 66, 402-412, clonaram DHCR7 cDNA em vetor de expres-são mamífero pCI-neo e expressaram nas células HEK 293; McGarvey, T.W. et al. Oncogene (2001) 20, 1041-1051 clonaram o gene TERE1 no vetorde expressão mamífero pTARGET e expressaram no carcinoma de célulastransicionais da bexiga humana; e Lin Lin et al. J Biol Chem (2002) 277 (44)41872-8 clonaram o gene AchR no vetor de expressão de célula de mamífe-ro, vetor pEF6/vetor myc-His e expressaram este em células 293. Um vetormuito potente recentemente desenvolvido, que provou que é capaz de cupe-rexpressar proteínas recombinantes, é o assim chamado vetor pcDNA®3.1da Invitrogen. Li J. et al., Life Sei. 2004, 16 de abril; 74(22):2693-705 têmsuperexpressado com sucesso histona desacetilases usando pcDNA 3.1 emcélulas HEK 293. As células foram estavelmente transfectadas e cultivadasem presença de soro. Yuan-Gen Fu. et al., World J Gastroenterol 2003 têmproduzido Caspase-3 recombinante usando um vetor eucariótico com baseem pcDNA 3.1 (+) em linhagem de célula de câncer gástrico SGC7901 tran-sientemente transfectada com o dito vetor e cultivada em presença de soro.Ma H. et al., Invest Ophthalmol Vis Sei. Dezembro de 2000; 41(13); 4232-9examinaram a carência de proteína estável e perda de atividade enzimáticaexpressando Lp82 e proteínas relacionadas a Lp82 subclonadas em vetorpcDNA3.1 usando COS-7 como linhagem de célula. As células foram transi-entemente transfectadas e cultivadas em presença de soro no meio. Super-expressão de tioredoxina previne a redução induzida por NO da atividade deNO sintase em células endoteliais do pulmão. Zhang J. et al., Am J Physiol.Agosto de 1998; 275(2 Pt 1): L288-93 descrevem a superexpressão de tio-redoxina em células endoteliais de artérias pulmonares de porco, cultivadas,por transfecção transiente destas células com vetor pcDNA 3.1. As célulastransfectadas foram cultivadas em meio suplementado com soro. Shinki T. etal., Proc Natl. Acad. Sei. U.S.A 25 de novembro de 1997; 94(24): 12920-5compararam um cDNA de comprimento completo para a oxidase de funçãomista de citocroma P450 mitocondrial de rim de rato, 25-hidrovitamina D3-1alfa-hidroxilase com cDNA de rim de rato com deficiência D e subclonarameste em vetor de expressão mamífero pcDNA 3.1 (+) e transfectaram transi-entemente o vetor em células de rim de macaco transformadas com COS-7.

As células transfectadas foram cultivadas em meio suplementado com soro.Zhang e al., Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004, 36(10); 707-712descrevem a transfecção de células 293 de rim embrionário humano compcDNA contendo um gene que codifica o anticorpo Fv de cadeia simples520C9 humanizado/proteína de fusão interleucina-2 humana. O sobrenadan-te foi retirado depois de ter cultivado as células por três dias em meios SFMIl isentos de soro. A proteína de fusão resultante possuía especificidade deligação contra p185 (alvo promissor para terapia com anticorpos em câncerda mama) e reteve as importantes atividades imunoestimulantes de IL-2.Chen, J.Z. et al., Int J Biochem Cell Biol., Agosto de 2004; 36(8):1554-61cuperexpressaram proteínas Bim1 que são fatores essenciais para apoptose,usando células HEK 293 tranfectadas com pcDNA alpha 3.

Uma outra medida para aumentar a segurança de proteínas re-combinantes para aplicações farmacêuticas é o uso de meio isento de sorono processo de cultura, pois o uso de soro representa um perigo para a se-gurança, bem como uma fonte de contaminações indesejadas. Tal cultivoisento de soro tem a desvantagem de que os rendimentos do processo deprodução são geralmente significantemente reduzidos. Uma outra preocupa-ção com a segurança é o uso de soro quando as células hospedeiras estãosendo transfectadas de um modo regular na prática, pois o uso de soro noprocedimento de transfecção pode fazer com que material biológico indese-jado seja integrado nas células, que mais tarde contaminarão o produto ex-presso pelas células no processo de produção. Embora alguns dos métodosdisponíveis para a produção de proteínas recombinantes (incluindo aquelesmencionados acima) realmente possibilitem o cultivo isento de soro, a trans-fecção estável isenta de soro de células humanas não é conhecida. No 19°ESACT Meeting1 Harrogate1 5-8 de junho de 2005, as transfecção isenta desoro de células CHO foi sugerida por Kuchenbecker et al.

Assim, é desejável desenvolver um método eficaz e seguro deproduzir proteínas recombinantes humanas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi verificado, surpreendentemente, que uma proteína humananão contaminada (isto é uma preparação de proteína isenta de subprodutosde proteína não desejados) pode ser obtida em bom rendimento a partir delinhagens de células humanas imortalizadas estavelmente transfectadas,sob condições isentas de soro, com o gene codificando a proteína de inte-resse. Em mais detalhes, a presente invenção proporciona:

1. um método para preparar uma linhagem de célula humanaimortalizada estavelmente transfectada com uma seqüência de ácidos nu-cléicos que compreende um gene que codifica uma proteína alvo humana ouum derivado ou mutante desta, um promotor e um sinal de poliadenilação(polyA) de hormônio de crescimento bovino, em que o dito promotor e o sinalpolyA estão ligados à extremidade 5' e 3' do gene que codifica a dita proteí-na alvo humana, respectivamente, cujo método compreende transfectar umalinhagem de célula hospedeira humana imortalizada, sob condições isentasde soro, com um vetor de transfecção que compreende a dita seqüência deácidos nucléicos e uma origem de replicação;

2. o método de (1) acima, em que o vetor de transfecção é deri-vado do vetor pcDNA 3.1 tendo a seqüência de SEQ ID NO:4 ou 5;(1) o método de (1) ou (2) acima, em que a linhagem de célula hu-mana é uma célula de rim embrionária selecionada de células 293 (ATCCCRL-1573; DSM ACC 305), células 293 Sem padrões (daqui por diante célu-las "293F"; Invitrogen R79007), e células 293Τ (ATCC CRL 11268; DSMACC 2494);

3. o método de (1) a (3), em que a proteína humana é o fator IXde coagulação do sangue, (por exemplo, conforme codificado por bps 939 a2324 da SEQ ID NO:1), alfa-1-antitripsina (daqui por diante "A1AT"; por e-xemplo, conforme codificado por bps 913 a 2259 da SEQ ID NO:2), fator Vlllde coagulação do sangue (incluindo o fator Vlll wt conforme mostrado naSEQ ID NO:8 ou um fator Vlll mutante deletado de domínio B como codifica-do por bps 783 a 5162 da SEQ ID NO:3), fator Vll/Vlla (incluindo a forma a eb deste codificada pelas SEQ ID NOs:13 e 14), G-CSF (incluindo a forma a,b e c de G-CSF mostrado nas SEQ ID NOs:15, 16 e 17, respectivamente),ou o fator de von Willebrand (vWF);

4. um vetor de transfecção que compreende uma origem de re-plicação e um gene que codifica uma proteína humana conforme definiçãoem (1) e (2) acima, preferivelmente o dito vetor de transfecção é um vetorpcDNA3.1 que compreende o gene para uma proteína humana como defini-da em (4) acima;

5. uma linhagem de célula humana imortalizada obtenível pelométodo como definido em (1) a (5) acima, preferivelmente a dita linhagem decélula humana é como definida em (3) ou (4) acima; eum método para a produção recombinante de uma proteína alvo humana ouum derivado ou mutante desta, que compreende cultivar uma linhagem decélula humana imortalizada como definida em (6) acima, preferivelmente sobcondições isentas de soro.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: a proteína do fator IX (FIX) de coagulação humano dotipo selvagem. Um desenho esquemático do gene FIX com suas região 5'não traduzida (5' TUR) e sua região 3' UTR. Os oitos domínios da proteínade aminoácido 461 não processado são indicados: Sj. peptídeo de sinal; P:propeptídeo; domínio Gla: domínio γ-carboxiglutamila; domínio H: seqüênciahidrofóbica; domínio EGF: domínio similar ao fator de crescimento epidérmi-co; L seqüência de ligação; AP: peptídeo de ativação; domínio catalítico. Aproteína madura FIX tem um comprimento de 415 aminoácidos e um pesomolecular aproximado de 55 kDa.

figura 2:_o vetor pcDNA3-FIX. O vetor de DNA circular compre-ende 6.960 pares de base, em que a seqüência exata destes é dada na SEQID NO:1. No desenho esquemático o promotor CMV (CMV), o gene do FIXhumano (hFIX), a origem f1 (f 1), o gene de higromicina (Hyg) sob controle dopromotor SV40 (SV40), um a região poly A (SV40 poly A), a origem pUC e ogene de resistência (Amp) à ampicilina estão indicados, bem como os nume-roso sítios de restrição. Esse vetor é derivado o vetor pcDNA 3.1 re-sequenciado, pcDNA3;1Hygro(+)-zz da SEQ ID NO:5.

figura 3: o vetor pcDNA3.1-A1AT. O vetor de DNA circular com-preende 6.914 bps, em que a sua seqüência exata é dada na SEQ ID NO:2.

No desenho esquemático, o promotor intensificador CMV, o cDNA de A1AT,sinal de poliadenilação (polyA) de hormônio de crescimento bovino incluindouma seqüência de terminação de transcrição para a estabilidade intensifica-da de mRNA, a origem f1 (f1), o gene de higromicina (Hyg) sob controle dopromotor SV40 (SV40), a região poly A de SV40 (SVA poly A), a origem pUCe o gene de resistência à ampicilina (Amp) são indicados, bem como os nu-merosos sítios de restrição. Esse vetor é derivado do vetor pcD-NA3.1 Hygro(+)-zz da SEQ ID NO:5.

figura 4: transfecção transiente de células de rim embrionáriohumano, diferentes, com vetores que codificam alfa-1 -antitripsina. É mostra-da uma comparação das linhagens de células em estudos de transfecção. Aquantidade (%) da alfa-1-antitripsina (A1AT) expressa por 106 células é mos-trada para células 293, 293T e 293F. A quantidade de A1AT expressa emcélulas 293F transfectadas transientemente com pcDNA3.1-A1AT foi estabe-lecida como 100%.

figura 5: transfecção de linhagem de células 293F com diferen-tes vetores codificando alfa-1-antitripsina. Uma comparação de concentra-ções de A1AT expressas de diferentes vetores usando linhagem de células293f sem padrões transfectadas transientemente é mostrada. O nível de ex-pressão de A1AT pcDNA3.1-A1 AT foi estabelecido como 100%. Vários ou-tros vetores transportando o gene de A1AT foram também testados. O vetor""interno"" pTG1-S1AT (um vetor "interno" para produzir A1AT recombinantehumano como mostrado na figura 10), o pCMV Script® A1AT (Stratagene) epcl neo-A1AT (Promega) foram comparados contra o pcDNA3.1-A1AT(pcDNA3.1). Nenhum dos outros vetores chegou perto dos altos níveis deexpressão observado com pcDNA3.1 -A1 AT.

figura 6: SDS-PAGE e Western blot de sobrenadante de culturade células. Alíquotas do sobrenadante de células 293F sem padrões trans-fectadas transientemente com pcDNA3.1-A1AT (faixas 1-3 e 6-8) ou com umplasmídio de controle de expressão de GFP (faixas 4 e 8) foram analisadastanto com SDS-PAGE como com Western blot. A faixa 1 contém um marca-dor de tamanho e a faixa 5 está vazia. A banda para A1AT é marcada comuma seta. Também visível está a banda de 27 kDa correspondente a GFPnas faixas 4 e 8.

figura 7: mostra o vetor pcDNA 3.1-F.VIII. O vetor compreende9.975 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID N0:3. Aproteína de fator Vlll codificada para bps 783 a 5162 é um fator Vlll mutantedeletado de domínio B conforme mostrado em WO 01/70968. Novamente,este vetor é derivado do vetor pcDNA 3.1 Hygro(+)-zz da SEQ ID NO:5.

figura 8: comparação da quantidade média de fator Vlll produzi-do dos três melhores clones estavelmente transfectados, transfectando célu-las 293 e 293F com pcDNA3.1-FVIII e o vetor "interno" pTGF8-2hyg-s, emque a sua seqüência exata é dada na SEQ ID NO:7.

figura 9: mostra o vetor pTG1-A1AT. O vetor compreende 5.610bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:6.

figura 10: mostra o vetor pCR2.1d2p-GCSFb. O vetor compre-ende 4.542 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ IDNO:21.

figura 11: mostra o vetor pDNA3.1-GCSFb. O vetor compreende6.237 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:22.

figura 12: mostra o vetor pCINeo-GCSFb. O vetor compreende6.101 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ ID NO:23.

figura 13: mostra o vetor pCMVScript-GCSFb. O vetor compre-ende 4.920 bps, em que a seqüência exata deste é mostrada na SEQ IDNO:24.figura 14: mostra o vetor pTG2-GCSFb-hyg-as. O vetor compre-ende 6.917 bps, em que a sua exata seqüência é mostrada na SEQ IDNO:25.

figura 15: compara a quantidade de rhG-CSF produzida por dife-rentes construções de expressão de acordo com o Exemplo 9.

figura 16: mostra um Western blot de rhG-CSF produzido de a-cordo com o Exemplo 9.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um método aperfeiçoado paraa transfecção e produção de proteínas recombinantes humanas em linha-gens de células humanas imortalizadas completamente sob condições isen-tas de soro e de proteína. Isso permite a transfecção e produção isenta desoro de proteínas humanas. O método pode incluir uma ou mais etapas depurificação incluindo procedimento de inativação viral, que reduz o risco decontaminação de proteína recombinante com patógenos humanos. Já queas proteínas recombinantes humanas produzidas em linhagens de célulashumanas transportam um padrão de glicosilação humana, elas são menossuscetíveis à degradação em comparação com as proteínas humanas quecarecem de seu padrão de glicosilação natural. Em resumo, o método dainvenção oferece várias vantagens em relação à técnica anterior.

Em particular, o método da modalidade (7) da invenção propor-ciona um sistema eficaz para produzir fatores de coagulação do sangue hu-mano, recombinantes, seguros e altamente ativos, por exemplo, fatores IX eFVIII para aplicação terapêutica para Hemofilia B e A em seres humanos. Ométodo é adequado para expressão daquelas proteínas do tipo selvagem,mas podem também ser usadas para mutantes daquelas proteínas, por e-xemplo, de fator VIII, que são excepcionalmente estáveis contra inativaçãoproteolítica e assim permitem ser submetidas a vigorosos protocolos de ina-tivação de vírus.

Em um modo preferido, o método da modalidade (7) da invençãocompreende cultivar, isenta soro, uma linhagem de célula imortalizadatransportando um vetor tendo um promotor ligado à extremidade 5' de umaseqüência de DNA que codifica a dita proteína de sangue humano. A extre-midade 3' da seqüência de DNA que codifica a dita proteína de sangue hu-mano é funcionalmente ligada a um sinal de polyA de hormônio de cresci-mento bovino. De acordo com a invenção, a linhagem de célula humana i-imortalizada é estavelmente transfectada com o vetor. Para detectar trans-fecção estável, o vetor pode compreender ainda, além do gene para a prote-ína de sangue humano, pelo menos um gene para um sistema de marcadorde seleção, que está funcionalmente ligado a um promotor.

Promotores adequados incluem promotores virais, promotoresde gene de manutenção, promotores específicos para tecido, etc. No casodo promotor ser um promotor viral, a linhagem de célula não compreende aproteína ativadora de transcrição viral de emparelhamento para o dito pro-motor. Contudo, a célula pode compreender uma proteína ativadora detranscrição viral tal como o antígeno T que complementa um outro promotorviral, que não está funcionalmente ligado ao gene que codifica a proteína dosangue humano. Preferivelmente, o promotor é um promotor SV40, promotorCMV, promotor EF-lalfa, promotor HSV TK etc., mais preferivelmente opromotor é um promotor CMV, isto é o principal promotor precoce intermedi-ário constitutivo do citomegalovírus.

A expressão "transfecção" ou "transfectado" refere-se à introdu-ção de um ácido nucléico em uma célula sob condições que permitem ex-pressar a proteína. Em geral, o ácido nucléico é uma seqüência de DNA, emparticular um vetor ou um plasmídio transportando um gene de interesse sobum promotor adequado, cuja expressão é controlada pelo dito promotor.

Contudo, o termo transfecção compreende também transfecção de RNA. Oversado na técnica está familiarizado com os vários métodos de transfecçãotais como aqueles que usam moléculas veículo como lipídios catiônicos, taiscomo DOTAP (Roche), DOSPER (Roche), Fugene (Roche), Transfectam®(Promega), TransFat® (Promega) e Tfx® (Promega), Lipofectamina (Invitro-gene) e 293fectin® (Invitrogene), ou fosfato de cálcio e DEAE dextrano. Eleestá também familiarizado com técnicas de transfecção por força bruta. Es-sas incluem eletroporação, bombardeio com partículas carreadoras revesti-das com ácido nucléico (pistola de genes), e microinjeção. Finalmente, oversado na técnica está também familiarizado com transfecção de ácido nu-cléico usando vetores virais.

"Transientemente transfectado" ou "transfecção transiente" refe-re-se à expressão transiente, isto é não permanente do gene de interessedevido à natureza epissômica do ácido nucléico introduzido. Devido à suaprópria natureza, transfecção de RNA ou vírus citolíticos podem ser somenteusados para expressão transiente. Ácidos nucléicos epissômicos, incluindoDNA (plasmídios ou vetores), são degradados pelas células depois de dois aquatro dias, e, logo, a expressão do gene de interesse então cessa.

"Estavelmente transfectado" ou "transfecção estável" refere-se àexpressão permanente do gene de interesse devido à integração do DNAtransfectado no genoma da célula. A maioria, quando não todas as células,tem o potencial para incorporar DNA epissômico em seu genoma, embora auma taxa muito baixa. Contudo, estratégias de seleção sofisticadas são em-pregadas para expandir aquelas células que têm integrado o DNA transfec-tado. Para isso, o vetor deve conter pelo menos um gene para um marcadorde seleção, tal como, por exemplo, higromicina.

O termo "transfecção estável" ou "estavelmente transfectado" étambém usado aqui com referência às células que transportam plasmídiosque podem replicar de modo autônomo e assim podem ser usadas para ex-pressão de longo prazo de genes estranhos. Um sistema de transferência degene particularmente aplicável para "transfectar estavelmente" células é ba-seado em retrovírus recombinantes. Já que integração do DNA proviral éuma etapa obrigatória durante o ciclo de replicação retroviral, infecção decélulas com um retrovírus recombinante produzirão um proporção bastantealta de células que têm integrado o gene de interesse e são assim estavel-mente transfectadas.

O termo "cultura" refere-se à manutenção de células/linhagensde células in vitro em recipientes com meio suportando sua proliferação eexpressão de gene. Assim, a cultura causa acumulação das proteínas secre-táveis expressas na meio de cultura. O meio de cultura normalmente contémsuplementos que estabilizam o pH, bem como aminoácidos, lipídios, elemen-tos em traços, vitaminas e outros intensificadores de crescimento.

Os termos "isento de soro", "transfecção isenta de soro" ou "cul-tura isenta de soro" referem-se à transfecção e à cultura de células em meiocontendo suplementos adequados exceto qualquer tipo de soro. Os suple-mentos são selecionados de aminoácidos, lipídios, elementos em traços,vitaminas e outros componentes intensificadores de crescimento. Freqüen-temente, condições de cultura "isenta de soro" são ainda mais severas e, senenhuma proteína exógena é adicionada, ou já incluída no médio, o meio échamado "isento de proteína".

O termo "linhagem de célula humana imortalizada" refere-se acélulas humanas que não são células primárias tiradas diretamente de umorganismo. Em particular, refere-se à cultura de célula permanentementeestabelecida que irá proliferar indefinidamente em meio fresco e espaço da-dos, apropriados, e assim têm escapado do limite de Hayflick.

O termo "concentração" refere-se à concentração da proteínarecombinante produzida do meio de cultura. Inerentemente, também emuma concentração da proteína. Aquele versado na técnica está familiarizadocom técnicas de concentração, tais como, filtração, incluindo uItrafiItração,centrifugação, precipitação, etc. A concentração não resulta necessariamen-te em uma proteína pura, e a proteína isolada pode compreender ainda con-taminantes não protéicos e protéicos. Etapas de purificação, adicionais, sãofreqüentemente requeridas.

O termo "purificação" refere-se a etapas aplicadas às quais aproteína isolada é submetida de modo a obter uma proteína recombinantesubstancialmente pura (pelo menos 60% pura, preferivelmente pelo menos75% pura, mais preferivelmente acima de 90% pura e, de maior preferência,mais que 99,9% pura). Pureza pode ser medida por um método apropriado.Aquele versado na técnica está familiarizado com técnicas empregáveis paraa purificação de uma proteína recombinante, tais como cromatografia de i-munoafinidade, cromatografia de afinidade, precipitação de proteína, trocasde tampão, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidro-fóbica, cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese. Além disso, apurificação pode compreender uma etapa de inativação de vírus, tais comotermotratamento e/ou tratamento com detergente solvente (SD), tanto noestado seco como líquido, em presença, oU.S.em, substâncias químicas,incluindo inibidores de protease. Adicionalmente, a purificação pode incluiruma ou mais etapas para remoção de príon, tais como etapas de precipita-ção de proteína, filtração, cromatografia, em particular cromatografia de afi-nidade (vide, por exemplo, "Partitioning of TSE infectivity during ethanol frac-tionation of human plasma", Gregori, L. et al., Biologicals 32 1-10; 2 (2004); e"Removal of TSE agents from blood products", Foster, P.R., Vax Sanguinis87 (Supl. 2), S7-S10 (2004)). Depois da inativação do vírus, uma outra etapade purificação selecionada de qualquer uma das etapas listadas acima podeser necessária para remoção das substâncias químicas usadas para inativação de vírus.

O termo "vetor" refere-se a qualquer construção genética, taiscomo plasmídio, fago, cosmídio, etc., que é capaz de replicação quando emassociação com os elementos de controle próprio, nos quais os fragmentosde DNA podem ser inseridos ou clonados. Um vetor compreende sítios derestrição únicos e pode ser capaz de replicação autônoma em uma célulahospedeira. O termo inclui veículos de clonagem e de expressão. O "vetor"pode transportar ainda um ou mais de outros elementos reguladores, emque os ditos elementos reguladores são selecionados de sítios de união,sítios de recombinação, sítios de polyA, intensificadores, sítio de multiclona-gem e seqüências de plasmídios procarióticos.

O termo "ligado funcionalmente" refere-se à configuração do ve-tor, onde o promotor está localizado dentro do vetor de tal modo que ele po-de estimular transcrição da seqüência de DNA que codifica a proteína deinteresse, em particular a proteína do sangue humano.

O termo "maduro" refere-se à estrutura molecular de uma dadaproteína processada, isto é uma proteína que carece do sinal de exportaçãoN-terminal.

O termo "promotor" refere-se a uma região de seqüência deDNA reguladora ligada por RNA polimerase e fatores de transcrição durantea iniciação da transcrição.

O termo "intensificador" refere-se a uma seqüência de atuação-cis que aumenta a utilização de um promotor eucariótico, e pode funcionartanto na orientação como em qualquer local (a montante ou a jusante) relati-vo ao promotor.

O termo "sinal de poliadenilação (polyA)" refere-se a uma se-qüência de terminação especializada. Ele sinaliza a adição de uma "cauda"de adeninas à extremidade do mRNA que permite exportar o mRNA para ocitoplasma. Ao atingir o citoplasma, a cauda de polyA do mRNA é mantidadurante a tradução de proteína e estabiliza o mRNA durante a expressão daproteína.

O termo "codifica" ou "codificando" refere-se a uma propriedadeda seqüência de ácidos nucléicos a ser transcrita (em caso de DNA) ou tra-duzida (em caso de mRNA) em um polipeptídeo (proteína) in vitro ou in vivo,quando colocada sob o controle de uma seqüência reguladora adequada.

Para o propósito do presente pedido, o termo "expressa", "ex-pressando" ou "expressão" refere-se à transcrição ou tradução de um geneque codifica uma proteína.

As "proteínas humanas" da invenção incluem, mas sem limita-ção, proteínas humanas, polipeptídeos, mutações e modificações destes.Em particular, as proteínas humanas incluem proteínas de plasma recombi-nantes, por exemplo, fatores de coagulação do sangue (tal como Fator VIII,Fator Vll/Vlla, Fator V, Fator IX, Fator XI, Fator de von Willebrand, etc.), fato-res de crescimento (tal como eritripoietina, etc.), fatores estimuladores decolônias (CSFs) (tal como fator estimulador de granulócitos (G-CSF), CSFmacrófago (M-CSF), CSF granulócito-macrófago (GM-CSF), citocinas (taiscomo interleucinas incluindo interleucina 3, etc.), inibidores de protease (taiscomo alfa-1 -antitripsina (A1AT), quimotripsina, etc.), proteínas de transporte(tais como hormônios, etc.), proteínas de ação inibidora ou reguladora e si-milares. Além disso, mutações e modificações dessas proteínas ou polipep-tídeos estão incluídos, especificamente mutações ou modificação que pro-porcionam uma melhor estabilidade da proteína recombinante, uma meia-vida prolongada, ou uma melhor recuperação e incluem mutantes de dele-ção, substituição ou inserção e mutações químicas de grupos funcionais,respectivamente. Proteínas particularmente preferidas, que podem ser pro-duzidas pelo método da invenção do pedido são fator Vlll humano (inclusivedomínio B deletado ou do tipo selvagem), fator IX humano, G-CSF humano,A1AT humano, fator VIIA/lla humano e fator de von Willebrand.

A produção recombinante do fator Vlll e IX é conhecida do esta-do da técnica (EP-A-160457; WO-A-86/01961, Patentes U.S. 4.770.999,U.S. 5.521.070 e U.S. 5.521.070).

No caso do fator VIII, expressão recombinante de subunidadespara a produção de complexos que mostram a atividade coagulante é co-nhecida da técnica (por exemplo, de EP-A-150735, EP-A-232112, EP-A-0500734, WO-91/07490, WO-95/13300, Patentes U.S. 5.045.455 e U.S.5.789.203). Além disso, a expressão de versões de cDNA truncadas care-cendo parcial ou inteiramente da seqüência que codifica o domínio B alta-mente glicosilado foram descritos (por exemplo, em WO 86/06101, WO87/04187, WO 87/07144, WO 88/00381, EP-A-251843, EP-A-253455, EP-A-254076, Patentes U.S. 4.868.112 e U.S. 4.980.456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 e WO 91/09122). Um mutante de fator VIII, particular,no qual o domínio B entre as posições Arg740 e Glu1649 foi substituído porum peptídeo Iigante rico em Arg tendo pelo menos 3 resíduos Arg e compre-endendo 10 a 25 resíduos de aminoácidos (em que a dita numeração dofator Vlll é relativa à seqüência de fator VIII, do tipo selvagem, maduro, mos-trada na SEQ ID NO:9) está descrito em WO 01/70968, que é aqui incorpo-rado em sua totalidade. Em particular, o peptídeo Iigante rico em Arg tem 14a 20 resíduos de aminoácidos, enquanto um ligante compreendendo:

a seqüência de aminoácidos SFSQNSRH (SEQ ID N0:10), e/ou

a seqüência de aminoácidos QAYRYRRG (SEQ ID NO:11), e/ou

a seqüência de aminoácidos SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO:12)

é particularmente preferido. Tal muteína de fator Vlll de domínio B é codifi-cada por nt 783 a 5162 da SEQ ID NO:3.

G-CSF é uma molécula pequena, específica da linhagem nosangue humano, que estimula a produção de um tipo de célula sangüíneabranca da medula óssea, conhecida como neutrófilos. Os neutrófilos desem-penham um papel central no sistema imune do corpo e defende de infec-ções. G-CSF (seqüências de DNA, particulares, da forma a, b e c destassendo dadas nas SEQ ID N0s:15, 16 e 17, respectivamente; a proteína daforma b de G-CSF (daqui por diante proteína G-CSF-b") é mostrada na SEQID NO:27) é naturalmente produzida por monócitos, fibroblastos, e célulasendoteliais. Normalmente, a concentração no sangue é de cerca de 40pg/mL em pessoas saudáveis. No plasma do paciente, o nível de G-CSFpode cair mais que dez vezes. G-CSF é também produzido em linhagens decélulas de câncer como células 5637, que secretam cerca de 70 ng/ml_. Paraterapia, G-CSF humano recombinante é produzido em E. coli como umaforma metilada, N-terminal, não glicosilada da Amgen Inc. (Filgras-tim/Neupogen®), que é também disponível como um produto pegilado (Peg-filgrastim/Neulasta®). Um outro fármaco é produzido em células CHO porChugai Pharmaceuticals Co, que resulta em um produto glicosilado (Leno-grastim/Granocyte®). G-CSF é usado como um fármaco para tratar neutro-penia tanto a herdada como a causada por quimioterapia (câncer), AIDS outransplante de medula óssea. Para isso, uma dose típica é de 5 μg/kg por dia.

Uma seqüência de cDNA de A1AT, particular, de acordo com ainvenção do presente pedido, é dada em bps 973 a 2259 da SEQ ID NO:2.Particulares seqüências de cDNA de fator Vll/Vlla são dadas nas SEQ IDNOs:13 e 14 correspondentes às suas formas a e b. Um particular cDNA devWF é dado na SEQ ID NO: 18.

O sistema de marcador de seleção inclui resistência à higromici-na, resistência à puromicina, resistência à neomicina, resistência à adenosi-na desaminase (ADA), resistência à aminoglicosídeo fosfotransferase (neo,G418, ΑΡΗ), resistência à bleomicina (fleo, bleo, zeocina), resistência à cito-sina desaminase (CDA, CD), resistência à citosina desaminase (CDA, CD),resistência à diidrofolato redutase (DHFR), resistência à histidinol desidroge-nase (hisD), resistência à higromicina-B-fosfotransferase (HPH), resistênciaà puromicin-N-acetil transferase (PAC, puro), resistência à timidina cinase(TK), e resistência à Xantina-guanina fosforibosiltransferase (XGPRT, gpt).

Particularmente preferido é o gene de resistência à higromicina. Também, ogene para o marcador de seleção pode estar funcionalmente ligado com umsinal de polyA, tal como aquele derivado do hormônio de crescimento bovino(BGH) ou o sinal de poliadenilação SV40.

As células transfectadas são constantemente expostas em seumeio de cultura à proteína do sistema de marcador de seleção, tal como hi-gromicina, durante a fase de seleção, resultando na sobrevivência de so-mente aquelas células que transportam o vetor. Aquele versado na técnicaestá familiarizado com marcadores de seleção alternativos para o estabele-cimento de células estavelmente transfectadas, bem como com as concen-trações dos agentes seletivos escolhidos que precisam ser aplicados.

Um vetor particularmente preferido da invenção transporta umpromotor CMV, um gene de higromicina, uma seqüência de polyA e o genede interesse e, preferivelmente, é o vetor pcDNA3.1 da Invitrogen tendo aseqüência de SEQ ID N0:4, em que ao resseqüenciar o dito vetor foi verifi-cado que ele tem, de fato, a seqüência mostrada na SEQ ID NO:5.

As linhagens de células imortalizadas adequadas para o métododa invenção são selecionadas do grupo de células de rim, bexiga, fígado,pulmão, músculo cardíaco, músculo liso, ovário ou gastrointestinais. Essascélulas podem transportar em seu genoma seqüências de DNA adenoviral,em particular os primeiros 4344 nucleotídeos das seqüências Ad5. Preferi-das são as células de rim de feto humano (HEK) selecionadas do grupo queconsiste em células 293 (ATCC CRL-1573); DSM ACC 305; ECACC ref.:85120602), células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229) ecélulas 293 Sem padrões (células 293F; Invitrogen R79007). Mais preferidassão as células 293F. Essas linhagens de células imortalizadas transportandoo vetor são cultivadas sob condições que permitem a expressão do generecombinante. Essas são, essencialmente, as condições de cultura padrãoconhecidas daqueles versados na técnica, contudo, em caso de célulastransportando o gene para fator IX humano, vitamina K deve ser incluída nomeio.

Uma modalidade particular da presente invenção é a produçãoisenta de soro da proteína recombinante em cultura isenta de soro das célu-las estavelmente imortalizadas, que são também transfectadas sob condi-ções isentas de soro. Por isso, qualquer uma das linhagens de células hu-manas, imortalizadas, descritas acima, preferivelmente a linhagem de célu-las 293F, é transfectada e cultivada sob condições isentas de soro. As célu-Ias são estavelmente transfectadas em cultura de suspensão em ausênciade soro e então adaptadas ao crescimento aderente de células para seleçãode clones de células simples. Uma vez que os clones individuais são obti-dos, eles são expandidos aderentemente. Depois da seleção dos melhoresclones produtores de células, as células são transfectadas para a cultura desuspensão. Durante o procedimento de linhagem de células, estável, com-pleto, e depois em posterior aumento de escala para produção, as célulassão crescidas em meio isento de soro e não ficam nunca em contato com asproteínas do soro ou humanas ou animais. A proteína do sangue recombi-nante, tal como qualquer um dos fatores de coagulação do sangue ou uminibidor de protease tal como A1AT, ou fatores de crescimento (tais como G-CSF e GM-CSF) são isolados do caldo de cultura, e em seguida são, de fa-to, efetuadas etapas de purificação padrão. Em mais detalhes, a modalidadeparticular de produção isenta de soro da proteína do sangue humano re-combinante, em particular fator Vlll humano ou Fator IX ou A1AT ou G-CSFbcompreende as seguintes etapas:

1. Transfecção de células imortalizadas humanas, preferivelmen-te células 293T, em cultura de suspensão, sem soro. As células são cultiva-das em frascos Erlenmeyer de policarbonato, estéreis, descartáveis. As célu-las são transfectadas com uma densidade de, por exemplo, 1 χ 106 célulasviáveis por mL com um agente de transfecção, preferivelmente um agentede transfecção catiônico, mais preferido sendo o reagente de Iipofectamina2000 CD (Invitrogen) ou um reagente para o método de transfecção de fos-fato de cálcio; um vetor é transfectado codificando a proteína do sangue hu-mano, preferivelmente o vetor é pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-FVIII, pcDNA3.1-A1AT ou pcDNA3.1 -gcsfB;

2. 24 a 120 h, preferivelmente 36-96, mais preferivelmente 48 hpós-transfecção, um número adequado de células (103 a 1010, preferivelmen-te 105 a 108, mais preferivelmente 106 células) são transferidas em um pratode cultura plano para sedimentação para estabelecer o crescimento aderen-te. Preferivelmente, o prato de cultura é um prato de 10 cm e as células sãocultivadas em meios isentos de soro e de proteína, preferivelmente meio deExpressão 293 Sem padrões (12338-018, Invitrogen) ou o meio "interno"isento de soro (Octapharma Stockholm).

3. Pressão de seleção é estabelecida em 2 a 50 h, preferivel-mente 48 horas após transferência para o prato de cultura plano. O meio ésuplementado com um agente seletivo adequado selecionado do grupo queconsiste em marcadores de seleção, por exemplo, higromicina, neomicina,G418 e Zeocina. O agente seletivo preferido é higromicina com uma concen-tração de 10 a 300 μg/mL, preferivelmente 50 a 200 μg/mL, mais preferivel-mente 50 μg/mL. A pressão é mantida por pelo menos 10 a 20 dias, preferi-velmente por 14 dias, por meio de que o meio suplementado com higromici-na é trocado um dia sim, dia não. Somente células estavelmente transfecta-das sobrevivem a essas condições de seleção e formam clones de célulasaderentes, que podem ser individualmente colhidos. Adicionalmente, um fa-tor de fixação pode ser usado de modo a grudar as células no prato e impe-dir que as células flutuem de um clone para um outro clone de célula. Essesfatores de fixação podem ser f.e. poly-D-Lisina, suplementos de meio sintéti-co sem proteínas humanas ou animais, ou outras substâncias. Alternativa-mente, anéis de clonagem podem ser usados para a coleta de clones.

4. Clones de células individuais são colhidos e transferidos pararecipientes de cultura separados para expansão isenta de soro de célula (emscaling up), enquanto a pressão seletiva é omitida. Qualquer recipiente decultura é adequado, mas, preferivelmente, os clones individuais são inicial-mente transferidos em placas de 96 cavidades com uma quantidade sufici-ente de meio, e então para placas de 48, para de 24, para de 12 e para de 6cavidades e então para tubos giratórios. No estágio de tubos giratórios, ascélulas são cultivadas em meio isento de soro por agitação branda de modoa fazer com que as células retornem para crescimento em suspensão. Umavez que as células tenham atingido o estágio da placa de 6 cavidades ou oestágio dos tubos giratórios, é opcional selecionar os melhores clones decélulas de acordo com alguns critérios de seleção, isto é a taxa de cresci-mento das células, células que crescem mais rapidamente são preferidas, ea quantidade da proteína recombinante que elas produzem. Contudo, a ditaseleção pode ser também realizada em qualquer estágio mais tarde.

5. Células obtidas da cultura em tubos giratórios foram semea-das em vasos de cultura Erlenmeyer com uma quantidade suficiente de meioisento de soro. Critérios adicionais de seleção para clones aumentados emescala de células isentos de soro e proteína, crescendo em suspensão, sãocomo a seguir: viabilidade, morfologia de célula, não agregação, robustezreferente à centrifugação e nenhum fragmento celular.

O método da presente invenção trabalha particularmente bem seo vetor é pcDNA3.1-hygro(+)-zz. É preferido que o gene que codifica a prote-ína humana, em particular FIX humano, FVIII, A1AT ou G-CSFb, seja inseri-do de tal modo que ele fique sob o controle do promotor CMV como mostra-do nas figuras 2, 3, 7, e 11, respectivamente. Preferivelmente, as seqüênciasdo tipo selvagem dos ditos genes são inseridas, de modo que a proteína ex-pressa recombinantemente esteja sem qualquer mutação e seja estrutural-mente idêntica à proteína do tipo selvagem isolada do plasma sangüíneo.Um desenho esquemático do fator IX humano do tipo selvagem é mostradona figura 1. SEQ ID Nos: 1, 2, 3 e 22 proporcionam a seqüência de ácidonucléicos para pcDNA3.1-FIX1 pcDNA3.1-A1AT, pcDNA3.1-FVIII e pcD-NA3.1-GCSFb, respectivamente. As proteínas respectivas são codificadaspelos nucleotídeos 930 a 2224, 913 a 2259, 679 a 5055 e 970 a 1584, res-pectivamente.

A presente invenção proporciona assim um método para a pro-dução recombinante de fator IX humano, A1AT, fator Vlll e G-CSFb clonadoem pcDNA3.1 produzindo pcDNA3.1-FIX, pcDNA3.1-A1 AT, pcDNA3.1-FVIIIe pcDNA3.1-GCSFb, respectivamente, que são integrados no genoma decélulas humanas imortalizadas, preferivelmente células de rim de embriãohumano tais como células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305; ECACCref.: 85120602), células 293 Sem padrões (células 293F; Invitrogen R79007)ou células 293T (DSM ACC 2494; ECACC: tsa201, ref. 96121229).

Essas células transportando ou pcDNA3.1-FIX ou pcDNA3.1-A1AT ou pcDNA 3.1-FVIII ou pcDNA 3.1-GCSFb são cultivadas em meio sobcondições padrão que permitem expressão de gene ou alternativamente elassão cultivadas sob condições isentas de soro para minimizar o risco de con-taminação com patógenos humanos. Uma ou mais etapas de remoção depríon podem ser incluídas, tais como etapas de precipitação de proteína,filtração, cromatografia, em particular etapas de crorriatografia por afinidade.

Alternativamente/adicionalmente, uma linhagem de células nocaute de príonpode ser usada como células de expressão. Isso pode ser obtido por nocau-te genômico completo ou tecnologia anti-sentido. No caso da produção parafator IX humano, as células são, preferivelmente, cultivadas em presença devitamina Κ. A proteína do sangue humano é isolada do sobrenadante da cul-tura e submetida a subseqüentes etapas de purificação conhecidas do esta-do da técnica para maximizar o rendimento de um produto puro, estável ealtamente ativo e são selecionadas de cromatografia por imunoafinidade,cromatografia de troca aniônica, cromatografia de exclusão de tamanho,etc., e combinações destes. Elas podem ser facilmente adaptadas às exi-gências específicas necessárias para isolar o fator IX recombinante, G-CSFbou A1AT. Quantidade e atividade da proteína purificada durante e depois doprocedimento de purificação podem ser monitoradas por ELISA e/ou ensaiosde tempo de coagulação de um estágio (aPTT).

Para superar os problemas de possíveis contaminações infec-ciosas nas amostras de proteína purificada ou no produto diretamente obtidodo sobrenadante de cultura de célula contendo a proteína recombinante,secretada, de escolha, o sobrenadante de cultura pode ser tratado com pro-cedimentos para inativação de vírus, incluindo termotratamento e/oU.S.D-tratamento (seco ou em estado líquido, com oU.S.em a adição de substân-cias químicas, incluindo inibidores de protease). Aquele versado na técnicaestá familiarizado com procedimentos de purificação. Por exemplo, o isola-mento e purificação e recuperação de fator Vlll inativado de vírus de altapureza de plasma sangüíneo por cromatografia de troca aniônica foi descrito(WO 93/15105). Além disso, vários processos para a produção de fatores decoagulação, não infecciosos, de alta pureza a partir de plasma sangüíneo oude outras fontes biológicas têm sido reportados. Vírus revestidos com lipídiosão eficazmente inativados por tratamento do material potencialmente infec-cioso com uma fase hidrofóbica que forma um sistema de duas fases, doqual a parte insolúvel em água é, subseqüentemente, removida. Uma outravantagem provou complementar o tratamento de fase hidrofóbica, simultâ-nea oU.S.equencialmente, com um tratamento com detergentes biocompatí-veis ou fosfatos de dialquila ou de trialquila (WO 96/36369, EP 0131740,U.S. 6.007.979). Vírus revestidos não lipídicos requerem protocolos de inati-vação que consistem no tratamento com detergentes não iônicos seguidopor uma etapa de aquecimento (60-65°C), por várias horas (WO 94/17834).Depois da inativação do vírus, pode ser necessária uma outra etapa de puri-ficação para remover substâncias químicas. Em resumo, a presente inven-ção proporciona um método de produção de proteína eficaz com base emuma linhagem de célula humana ligada a métodos aprovados de purificaçãode proteína e para inativação para produção de proteínas recombinantes,por exemplo, o fator IX ou Vlll de coagulação do sangue, A1AT e G-CSFb,foi estabelecido. A atividade recombinante das proteínas produzidas de for-ma recombinantemente pode ser examinada com testes padrão. No caso dofator IX humano, por exemplo, com um ensaio do tempo de tromboplastinaparcial ativada usando ativação de Dapptin TC (Caulim/Sulfatídeo-Fosfolipídio Cat. N0 5035090, Technoclone GmbH) com um instrumento decoagulação manual. Finalmente, as proteínas recombinantes assim obtidas,tal como a proteína do sangue descrita acima, em particular o fator IX huma-no, podem ser usadas em uma composição farmacêutica.

A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos. Os ditosexemplos não devem, contudo, ser interpretados como Iimitativos da invenção.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS

LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA:

Linhagens de células preferidas são ΉΕΚ293 (ECACC Ref.85120602), 293 Sem padrões (293F; Invitrogen R79007) e 293T (tsA201,ECACC Ref. 96121229), que é linhagem de célula de rim humano, embrio-nário, expressando estavelmente um antígeno T, sensível à temperatura,SV40. E ssas linhagens de células similares às epiteliais têm sido usadasem uma variedade de ensaios de expressão funcional e foi relatado que elasproduzem altos níveis de proteínas recombinantes. A linhagem de células293F (Invitrogen), que é derivada da linhagem de células 293, foi preferivel-mente usada nos Exemplos abaixo. A linhagem de células parental 293 éuma linhagem permanente estabelecida do rim humano embrionário primáriotransformada com DNA de adenovírus humano cisalhado, tipo 5 (Graham etal., 1977; Harrison et al., 1977). A linhagem de células 293F é uma varianteda linhagem de células 293 que foi adaptada para crescimento em suspen-são em Meio de Expressão para FreeStyle® 293 (293F) (12338-018, lnvitro:gen). A linhagem de célula 293F foi obtida de Robert Horlick, na Farmaco-péia. A linhagem de células 293F foi originalmente preparada de culturas doMater Cell Bank, de baixa passagem, derivadas das células parentais 293Fque foram reclonadas por limitação da diluição. As células foram crescidasconstantemente no meio de Expressão 293 Sem padrões, isento de soro ouum meio isento de Soro (Octapaharma Stockholm) com boa viabilidade eboa morfologia por mais que um ano durante o desenvolvimento da presenteinvenção.

Para produção eficaz de fator IX humano, o meio pode ser modi-ficado por adição da vitamina K. Essas linhagens de células são capazes deserem cultivadas em meio isento de soro e/ou meio isento de proteína con-tendo suplementos adequados.DETERMINAÇÃO E MEDIÇÃO DE PROTEÍNAS ALVO

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FATOR IX HUMANO POR ELISA:

níveis de fator IX recombinante humano no sobrenadante foramdeterminados por ELISA usando FIX anti-humano de bode (GAFIX-AP, Affi-nity Biologicals) com anticorpo de captura de acordo com procedimento pa-drão. Todas as incubações foram realizadas em uma câmara úmida emtemperatura ambiente. Foram usados Octanyne (FIX derivados de plasma) eBeneFIX (FIX recombinante, Genetics Institute), ambos padrões. O anticorpode detecção foi um FIX anti-humano de bode conjugado com peroxidase(GAFIX-APHRP, Affinity Biologicals). ABTS (Cat. N0 1682008, Roche Diag-nostics) foi adicionado a cada cavidade como substrato, reação colorimétricafoi detectada em 405 nm em 15 minutos. Os resultados foram calculados porregressão linear de concentração padrão versus absorbância padrão.

DETECÇÃO DA ATIVIDADE DE FATOR IX DE COAGULACÃO HUMANO:

A atividade de coagulação do fator IX recombinante, humano,em sobrenadantes foi determinado como a seguir: a atividade de coagulaçãofoi ensaiada com base em um ensaio do tempo de tromboplastina parcialativada usando ativação de Dapptin TC (Caulim/Sulfatídeo-Fosfolipídio Cat.N0 5035090, Technoclone GmbH) com um instrumento de coagulação ma-nual (Amelung KC 4A micro, Amelung GmbH). Para o estudo, 50 μί de so-brenadante de células transfectadas, 50 μί de plasma deficiente de FIX(Progen) e 50 μί. de Dapptin TC foram incubados por 2 minutos a 37°C. Acoagulação foi iniciada por adição de 50 μί de CaCI2 (Cat. N°84687-22F,Instrumentation Laboratory). O tempo de coagulação da amostra foi compa-rado com Octanyne ou/e com BeneFIX.

DETERMINAÇÃO DE BDDRHFVIII COM ENSAIO COAMATIC:FVIII (C-HROMOGENIX):

O kit de ensaio cromogênico comercial COAMATIC:FVIII (Chro-mogenix, cat. N0 82 25 85) contém FIX, FX e um cromógeno, que se tornaum corante solúvel em água, amarelo, por clivagem de FXa. As amostrascontendo FVIII completam esse sistema: FVIII ativa FIX por complexação,este complexo ativa FX por clivagem proteolítica para se tornar FXa. Fxatorna o cromógeno em um corante, que subseqüentemente é determinadofotometricamente em 405 nm. Esse teste é projetado para determinação deFVIII de plasmas de pacientes. O seguinte procedimento foi estabelecido demodo a tornar esse teste aplicável para a medição do fator Vlll em meios decultura diluídos. Como padrões de controle, fator Vlll de coagulação, huma-no, recombinante, de comprimento completo (NIBSC, ordem n° 57814F) eplasma de controle normal (lnstrumentation Laboratory Company) foram u-sados.

Preparação da amostra: As amostras foram diluídas com tampãode diluição distribuído com reagentes COAMATIC para uma atividade deFVIII final prospectiva entre 2 e 20 mlll/mL e são comparadas à curva pa-drão WHO N°6.

Método: Em uma fileira de 96 cavidades colocada no termoblo-co, tanto os padrões como as amostras são medidas em triplicata._

<table>table see original document page 26</column></row><table>

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE A1AT COM TESTE DE ATIVIDADEDE ELASTASE:

depois da transfecção de cDNA de A1AT, A1AT foi expressa esecretada em meio de cultura de células. Depois da remoção das células porcentrifugação (5 minutos, 1.000 rpm), a atividade de A1AT foi medida no so-brenadante da cultura. Nesse teste de atividade, a atividade de A1AT foi de-terminada por seu efeito inibidor em elastase. Elastase cliva pNA do substra-to N-succinil-(Ala)3-pNA. A liberação de pNA é medida fotometricamente em405 nm. Por comparação com amostras padrão com atividade de A1AT defi-nida, a atividade das respectivas amostras é determinada. Como provadoem outros experimentos, o teste é válido em meio Sem padrões isento desoro. Para confirmar o fato que o meio Sem padrões não influencia o teste,foram preparadas duas curvas padrão: plasma humano padrão foi diluído emT + tampão ou em meio Sem padrões.

Diluição das amostras: todas as amostras foram testadas nãodiluídas, diluídas 1:10 e 1:50 em meio Sem padrões e são comparadas comdiluições padrão de plasma humano.

Método: 50 μL de cada diluição padrão e diluição de amostra,respectivamente, foram pipetados em um cavidade da placa de microtítulode 96 cavidades. Depois da adição de 150 μL de solução de trabalho de E-lastase a cada cavidade, a placa de 96 cavidades foi agitada por 1 minutosobre a leitora ELISA e incubada por 30 minutos, a 37°C. 100 μL de soluçãode trabalho de substrato foram adicionados a cada cavidade com multipipe-ta. Absorção em 405 nm foi medida imediatamente após adição da soluçãode substrato e depois de 7 minutos incubação a 37°C, no escuro. O primeirovalor representa a absorção de base em reação catalisada por elastase e ésubtraído do segundo valor, que representa a absorção depois que a elasta-se clivou pNA do substrato. Usando o resultado depois da subtração, as ati-vidades de A1AT das amostras são calculadas de acordo com a curva pa-drão.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DO G-CSF POR ELISA:

níveis de G-CSF recombinante humano nos sobrenadantes decultura de células foram determinados por ELISA usando anticorpo de G-CSF anti-humano de camundongo (MAB0214, R&D Systems). Todas as in-cubações foram realizadas em uma câmara úmida, em temperatura ambien-te. O padrão de G-CSF (hG-CSF recombinante, E. coli, 214-CS025, R&DSystems) foi usado. O anticorpo de detecção era um G-CSF anti-humano debode, biotinilado (BAF-215, R&D Systems). Estreptavidina foi conjugada àraiz forte peroxidase (DY998, R&D Systems) ligada ao anticorpo de detec-ção. O substrato de Peroxidase Fluorgênica QuantBIu® (15169, Pierce) foiadicionado a cada cavidade como substrato, a reação fluormétrica foi detec-tada na extinção em 320 nm/Emissão a 420 nm, dentro de 60 minutos. Osresultados foram calculados por regressão linear de concentração padrãoversus unidades de fluorescência relativa padrão (RFU).

EXEMPLO 1: CLONAGEM DE PROTEÍNAS ALVO

A. CLONAGEM DO FATOR IX HUMANO:

do vetor pTG36 conforme descrito em WO 01/70968, um frag-mento de 1,4 kb contendo um grupo de leitura aberta do fator IX de coagula-ção, humano, foi cortado por digestão dupla com Hind Ill e Notl. Esse frag-mento foi ligado ao fragmento de 5,6 kb do vetor pcDNA3.1Hygro(+)-zz (de-rivado de V870-20, Invitrogen) de dupla digestão com Hindlll e Notl resul-tando no vetor pcDNA3.1-FIX mostrado na figura 2. A seqüência de DNA dopcDNA3.1-FIX é mostrada em SEQ ID NO:21. Três inserções de nucleotí-deos adicionais na cadeia principal do vetor estavam no vetor pcD-NA3.1Hygro(+)-zz (vide SEQ ID NO:5) em comparação com a seqüênciapublicada por Invitrogen (conforme mostrado na SEQ ID No: 4). O vetorpcDNA3.1-FIX contém um gene de resistência à higromicina do cassete parapermitir um método de seleção para um clone de célula estavelmente trans-fectado (vide figuras 2, 3 e 7). O vetor permite o estabelecimento de linha-gens de células que expressam estavelmente por transfecção com fosfatode cálcio ou outros, e seleção subseqüente para resistentes à higromicina.

B. CLONAGEM DO FATOR Vlll HUMANO:

a 430 bp FVIIIcDNA contendo o grupo de leitura aberta de umfator Vlll de coagulação, humano, deletado do domínio B, foi isolado do vetorpTGF8-2hyg-s (SEQ ID NO:7); cuja produção está descrita em WO01/70968, com digestão com Notl+XHol e ligado com pcDNA3.1Hygro(+)-zz,que foi Iinearizado com Xhol+PspOMI resultando no vetor pcDNA3.1-FVIIImostrado na figura 7.C. CLONAGEM DE A1AT HUMANA:

mRNA de AIAT humana foi isolado diretamente das célulasHepG-2 (DSMZng ACC 180) usando Kit de Miniprep de mRNA (Sigma, Catn5MRN-10). Na etapa seguinte, mRNA foi capturado com contas de oligo (dT).

Depois disso, mRNA será transcrito em cDNA de fita dupla com Transcripta-se Reversa do Vírus da Mieloblastose Aviária (AMV RT1 Promega, Catn5M5101) seguinte à RT-PCR (Transcrição Reversa - Reação em Cadeia dePolimerase). cDNA de A1AT foi ampliado com reação de PCT. O produto dePCR foi carregado em gel de agarose. A banda de DNA apropriada foi isola-da e depois disso purificada com o Kit de Extração de Gel Qiaquik (Qiagen,Catn9 28704). O fragmento de A1AT foi subclonado em um Vetor comercial(TOPO® Invitrogen, Catn5 K4650-01). Para clonagem do pCMV-Script: PCRIl TOPO-A1AT foi diferido com EcoRI, o fragmento de 1370 bp de A1AT foiligado com pCMV-Script Iinearizado com EcoRI.

Para clonagem de pCI-neo-A1AT, PCR Il TOPO-A1AT foi digeri-do com EcoRI, o fragmento de 1370 bp de A1AT foi ligado com pCI-neo Iine-rizado com EcoRI.

Para clonagem de pcdNA3.1, A1AT de 1370 bp foi isolada comPCR Il T0P0-A1AT digerida com Xhol+Hindlll e ligada com pcDNA3.1 Iinea-rizado por Xhol+Hindlll. O vetor resultante é mostrado na figura 3.

Para clonagem de pTG1-A1AT, PCR Il TOPO A1AT foi digeridacom Hindlll e Notl. O fragmento de 1370 bp de A1AT foi ligado com pTG1(sem PRE), Iinearizado com Hindlll e Notl. O vetor resultante é mostrado nafigura 9.

D. CLONAGEM DE CDNA DE G-CSF HUMANO:

RNA total foi isolado diretamente de células de carcinoma debexiga urinária humana 5637 com mini-Kit RNeasy (QIAGEN, cat. N074104). Depois disso, o RNA total isolado foi incubado com DNase I digeridopossivelmente com DNA genômico das células 5637. Para conseguir RNAtotal isento de DNase, a mistura reacional foi tratada com kit de limpezaRNeasy (QIAGEN, cat. N0 74204). RT-PCR com o RNA como molde foi rea-lizada com iniciador oligo(dT)12-18 (Invitrogen, Cat. N0 18418-012) e Su-perscritpt® Ii RNase H - Transcriptase Reversa (Invitrogen, Cat. N0 18064-022) em presença de inibidor de RNase (Roche, Cat. N0 799-017) para sinte-tizar um grupo de ds cDNA das células 5637. cDNA de G-CSF foi ampliadoentão com reação de PCR. cDNA de G-CSF foi isolado de gel de agarosecom kit de Extração de Gel, rápida, QIA (QIAGEN, Cat. 28704) e seqüencia-do com ambos dos seguintes iniciadores G-CSF:

- G-CSF de Avanço: 5'- ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAGAGC -3'(SEQ ID NO:19)

- G-CSF de Reverso: 5'- TCA GGG CTG GGC AAG GTG GCGTAG-3'(SEQ ID N0:20)

A seqüência do DNA sintetizado de células 5637 foi confirmadapor análise de seqüência como sendo um GCSF-forma b (tendo a seqüênciamostrada na SEQ ID NO:26).

O cDNA de GCSF-forma b isolado conforme descrito acima foientão diretamente ligado ao vetor comercial pCR2.1 (Invitrogen). O plasmí-dio resultante foi designado como pCR2.1d2-GCSF e é mostrado na figura10.

PCR2.1 d2-GCSFb foi digerido com Hindlll e Notl, o fragmentode cDNA dè GCSFb de 705 bp foi isolado e ligado ao vetor pcD-NA3.1Hygro(+)-zz, que foi Iinearizado com Hindlll e Notl. O vetor pDNA3.1-GCSFb resultante está mostrado na figura 11.

PCR2.1d2-GCSFb foi digerido com EcoRI, o fragmento de cDNAde GCSFb de 629 bp foi isolado e ligado ao vetor pCINeo, que foi Iinearizadocom EcoRI. O vetor pCINeo-GCSFb resultante é mostrado na figura 12.

PCR2.1-d2GCSFb foi digerido com BamHI e Xhol1 o fragmentode cDNA de GCSFb de 693 bp foi isolado e ligado ao vetor pCMVScript, quefoi Iinearizado com BamHI e Xhol. O vetor pCMVScript-GCSFb resultante émostrado na figura 13. PCR2.1d2-GCSFB foi digerido com Hindlll e Notl, ofragmento de cDNA de GCSFb de 705 bp foi isolado e ligado ao vetor pTG2-hyg-as, que foi Iinearizado com Hindlll e Notl. O vetor pTG2-GCSFb-hyg-asresultante é mostrado na figura 14.

EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ALVO EM LINHAGENS DECÉLULAS DIFERENTES E VETORES DIFERENTES:

quando se estava otimizando o presente método para produçãode proteína recombinante, foi testada a capacidade para altos níveis de ex-pressão de diferentes linhagens de células - todas transportando um vetorque compreende o gene recombinante para Alfa-1-antitripsina (A1AT). Foiverificado que linhagens de células CHO1 BHK e outras produziam menosproteína recombinante em ensaios de transfecção transiente em compara-ção com a linhagem de células 293T. Portanto, foram examinados outrosderivados de linhagens de células de rim embrionário, humano. Os resulta-dos são mostrados nas figuras 4 a 6.

EXEMPLO 3: TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS 293T E 293 EM MEIO CON-TENDO SORO EM COMPARAÇÃO COM AS CÉLULAS 293F. QUE FORAMTRANSFECTADAS E CULTIVADAS EM CONDIÇÕES ISENTAS DE SORO:0,1 a 0,2 χ 106 células viáveis de células 293T ou 293 foram plaqueadas nacavidade 6. No dia seguinte, as células foram transfectadas usando-se ométodo de fosfato de cálcio (Biotechniques 6:7 632-638 (1988)): 4 μg deDNA plasmidial foram diluídos em 0,1 χ tampão TE (ad 200 μί de mistura detransfecção), misturados suavemente, 20 μί de CaCI2 2,5M e 100 μί 2 χHBS foram adicionados à amostra de transfecção. A amostra de transfecçãofoi incubada por 20 minutos, à temperatura ambiente. Depois de 6 horas, omeio de incubação foi trocado e as células foram então incubadas por 48horas.

EXEMPLO 4: TRANSFECÇÃO ISENTA DE SORO E EXPRESSÃO DEPROTEÍNAS ALVO EM CÉLULAS 293F EM MEIO ISENTO DE SORO:

28 mL de cultura de suspensão foram preparados com umadensidade de 106 células 293F viáveis (no mesmo dia do experimento detransfecção). Um complexo de lipídio-DNA foi preparado por diluição de 30μg de DNA plasmidial em Opti-MEM® I (Invitrogen) para um volume total de1 mL, e 40 μL de 293fectin® foram diluídos em Opti-MEM® I para um volumetotal de 1 mL. Depois da incubação por 5 minutos, à temperatura ambiente,o DNA diluído foi adicionado à 293fectin® para obter um volume total de 2mL. As amostras transfectadas foram incubadas por 20 minutos à tempera-tura ambiente no escuro. 2 mL de mistura de transfecção foram adicionadosa 28 mL da cultura de suspensão de 293F (densidade de células final é de1x106 células/mL). As células 293F transfectadas foram incubadas a37°C/atmosfera umidificada de 8% de CO2, em ar, em um agitador orbitalgirando a 125 rpm por 72 horas.

A: TRANSFECÇÃO E EXPRESSÃO DE A1AT:

os resultados daqueles experimentos comparando células 293Fcom 293 e 293T são mostrados na figura 4. Em todos os experimentos, umaquantidade definida de células (106 células) foram transfectadas com pcD-NA3.1-A1AT. A quantidade de A1AT expressa em diferentes linhagens decélulas foi comparada. A quantidade expressa de A1AT em células 293F foiestabelecida como 100%. Como pode ser visto da figura 4, células 293 e293T produziram somente 12 a 13% da quantidade de A1AT que as células293F.

Além disso, foi testado se diferentes cadeias de vetor influenci-am a quantidade de proteína recombinante produzida em células 293F. Aseqüência de codificação para Alfa-1-antitripsina (A1AT) humana foi inseridaem pTG (vetores "interno"), pCMV Script® (Stratagene), pcl neo (Promega),bem como nó vetor pcDNA3.1®.

O nível de expressão de A1AT de pcDNA3.1-A1AT foi estabele-cido como 100%. Nenhum dos outros vetores chegaram perto da alta ex-pressão observada com pcDNA®3.1-A1AT. Foi constatado que pcDNA -A1AT produziu a maior quantidade de A1AT conforme detecção por ELISA(vide figura 5). O vetor "interno" expressou.S.omente uma quantidade de20% e os outros vetores comerciais revelaram uma faixa de 15-30% emcomparação com a quantidade de A1AT expressa de pcDNA 3.1. Portanto,pcDNA 3.1 foi escolhido para todos os futuros experimentos.

Em resumo, diferentes linhagens de células foram transiente-mente transfectadas com pcDNA3.1® transportando o gene de A1AT. Foimostrado que a linhagem de células 293F isenta de soro expressa 7 vezesmais A1AT por 106 células que as células 293T e 293. Portanto, a linhagemde células 293F sem padrões foram escolhidas para experimentos de trans-fecção estáveis.

Os resultados de experimentos de transfecção transiente sãomostrados na figura 6. O painel de topo (A) mostra a análise SDS-PAGE dosobrenadante de 6 experiências diferentes usando vetores de transfecçãodiferentes. Derivados de figuras analíticas se conclui que a α1-antitripsinapresente nos sobrenadantes de cultura de célula analisados é de boa quali-dade como pode ser deduzido da razão de atividade para antígeno sendo 1(dados não mostrados). A validade dos resultados de teste pode ser deduzi-da do fato que o controle negativo não mostra atividade de α1 -antitripsina oude antígeno.

A distribuição de peso molecular analisada por SDS-PAGE mos-tra resultados bem comparáveis para as três amostras contendo oc1-antitripsina. No controle negativo, além da falta na banda que representa aoc1 -antitripsina, uma banda adicional em um peso molecular de 27 kD é visí-vel, como esperado.

Por análise usando Western blotting (usando um anticorpo pri-mário de α1-antitripsina humana) a proteína pode ser identificada na regiãode peso molecular esperada sob condições redutoras. Produtos de divisãonão são visíveis.

A seta preta aponta para a banda proeminente, que correspondeà proteína recombinante alfa-1-antitripsina de 52 kDa. Também visível estáuma banda que corresponde à proteína GFP de 27 kDa nas faixas 4 e 8, quefoi transientemente expressa como controle em linhagem de células sempadrões - células 293F. As bandas adicionais na faixa 1,2,3 e 5,6 e 7 sãoproteínas de células hospedeiras (de células sem padrões 293F). O painelinferior (B) mostra a análise de Western blot. Os resultados são idênticosexceto que devido à severidade maior do ensaio, os resultados parecemmais completos, e somente a banda correspondente à A1AT está visível.

B: TRANSFECÇÃO E EXPRESSÃO DE FVIII:

na figura 8, a quantidade média do fator Vlll dos três melhoresclones transfectados estavelmente é mostrado. A quantidade média do fatorVlll dos três melhores clones expressos com o vetor pcDNA-FVIII é estabe-lecido como 100% de produtividade. Uma comparação com o vetor "interno"pTGF8-2hyg-s revela uma produtividade quase 3 vezes maior do fator Vlllcom o vetor pcDNA3.1-FVIII em células 293F.

C: TRANSFECÇÃO E EXPRESSÃO DE FIX:

em células 293F estavelmente transfectadas usando pcDNA3.1-FIX e um vetor pTGF36 baseado em pUC 19/X (vide WO 01/70968) que ex-pressa o fator IX, uma produtividade quase três vezes maior pode ser mos-trada com o uso do vetor pcDNA3.1 em células 293F como pode ser visto naseguinte Tabela 1.

TABELA 1: Produtividade de FIX em células 293 e 293F depois de transfec-

<table>table see original document page 34</column></row><table>

EXEMPLO 5: PRODUÇÃO DE G-CSFB

A. TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS 293F EM MEIO ISENTO DE SORO,TRANSFECÇÃO TRANSIENTE:

28 mL de cultura de suspensão de células 293F com uma densi-dade de células de 1,1x 106 de células 293F viáveis por mL foram prepara-dos no mesmo dia do experimento de transfecção. Um complexo de lipídio-DNA foi preparado por diluição de 30 μς de DNA plasmidial (pcDNA3.1-G-CSFb) em Opti-MEM® I (Invitrogen) para um volume total de 1 mL e 30 μί deLipofectamina 2000 CD foram diluídos em Opti-MEM® I para um volume totalde 1 mL. Depois de 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, DNAdiluído foi adicionado à Lipofectamina 2000 CD para obter um volume totalde 2 mL. As amostras de transfecção foram incubadas por 20 minutos, àtemperatura ambiente, no escuro. 2 mL da mistura de transfecção foram adi-cionados aos 28 mL de cultura de suspensão de 293F (densidade de célulasfinal é de 1x 106 células por mL). As células 293F transfectadas foram incu-badas a 37°C/atmosfera umídificada de 8% de CO2 em ar em um agitadororbital girando a 125 rpm, por 72 horas.

B. TRANSFECÇÂO ESTÁVEL:

72 horas depois da transfecção transiente, como estabelecidaem A. Acima, um número adequado de células (105 e 106 células) foi transfe-rido para um prato plano, para sedimentação, para estabelecer o crescimen-to aderente. Pressão de seleção foi iniciada depois de 2 a 50 horas, preferi-velmente 48 horas após a transferência para o prato plano. O agente seleti-vo preferido era higromicina com uma concentração de 75 μg/mL. A pressãofoi mantida por pelo menos 10 a 20 dias, preferivelmente 14 dias, por meiode que o meio suplementado com higromicina era todo trocado 2 a 3 dias.

C. SELEÇÃO DOS MELHORES CLONES PRODUTORES DE G-CSF U-SANDO A ANÁLISE E ROBÔ DE COLETA CLONEPIXFL (GENETIX):

células Sem padrões 293F estavelmente transferidas como emB., acima, foram semeadas em meio com base em metil-celuloses semi-sólidas contendo um antibiótico apropriado para seleção de clones depois decerca de dois dias e um anticorpo marcado para detecção dos clones demaior produção, via fluorescência. Números altos (milhares) de clones foramanalisados usando CIonePixFL (Genetix) com respeito ao número de célulase à secreção de G-CSF de modo a colher subseqüentemente somente umaspoucas centenas de melhores clones produtores de G-CSF. Em contrastecom outros métodos conhecidos, onde os clones não produtores e clonesmistos são também aleatoriamente colhidos, o uso do CIonePixFL permite acoleta de clones de crescimento rápido, que são somente altos produtoresoriginados de células simples. As células colhidas são expandidas em placasde microtítulo e depois disso em tubos giratórios, frascos de cultura de célu-las e fermentadores sob condições isentas de soro, para o procedimentocompleto.

Aqui também, o procedimento de transfecção estável completo égerado sob condições isentas de soro. Adicionalmente, durante a seguinteexpansão completa e o procedimento de cultura de células, a célula não tevenenhum contato com proteínas do soro ou proteínas derivadas de animal.

Durante a expansão, os melhores clones são selecionados comrespeito à robustez, alta taxa de crescimento, viabilidade e produção de G-CSF ativo conforme medição no formato ELISA. Depois dessa fase de sele-ção, os clones colhidos são cultivados sob condições isentas de soro, semsuplementos de antibióticos. Células 293F foram cultivadas completamenteisentas de soro; durante todo o procedimento, o meio foi trocado dia sim, dianão. Up-scaling das células foi realizado sob condições completamente isen-tas de soro de frascos Erlenmeyer em Agitadores Kühner para volumes maisaltos em reator de onda (Wave Biotech Europe). Durante essa seleção, onúmero é reduzido de novo para somente poucos dos melhores clones pro-dutores. A seqüência de cDNA correta, teor de mRNA e comportamento nafermentação são os critérios para identificar os melhores clones para sub-clonagem. Para isso, células do(s) clone(s) selecionado(s) são plaqueadas,analisadas e colhidas com CIonePixFL, e então expandidas e selecionadascomo descrito anteriormente. A subclonagem é uma etapa essencial de mo-do a selecionar novamente os melhores clones produtores, para eliminarpossíveis variações genéticas na subpopulação plaqueada do clone. Depoisda subclonagem, o(s) clone(s) selecionado(s) é(são) amontoado(s) de novosob condições isentas de soro. A proteína de G-CSF humana, recombinante,expressa, é caracterizada bioquimicamante em mais detalhes.

D. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE G-CSF HUMANO POR ELISA:

a quantidade do rhG-CSF expresso pelas linhagens de células293F Sem padrões assim obtidas foi determinada por ELISA, e o rendimentoda proteína obtida com células transfectadas com vetores diferentes foicomparado (vide figura 15). Como esperado dos experimentos de expressãocom FIX e A1AT conforme descrição nos Exemplos 2 e 3, aqui, de novo,uma combinação do vetor pcDNA 3.1-GCSFb com a linhagem de células293F mostrou a mais alta produtividade e foi, portanto, usado para a produ-ção de G-CSFb humano recombinante.

E. WESTERN BLOT DE RHG-CSF NA REDUÇÃO DE SDS-PAGE:

10 μί de G-CSF produzidos nos sobrenadantes de célulasHEK293 e HEK293F foram analisados em 15% de SDS-PAGE e Westernblot. A detecção de G-CSF foi efetuada via BAF214-bio/SA-HRP/DAB (videfigura 16). A seta indica a banda monomérica do rhG-CSF da massa mole-cular correta.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS, TEXTO LIVRESEQ ID NO:1: pcDNA3.1-FIX,

<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>

SEQ ID NO:5: pcDNA3.1Hygro(+)-zz, tendo 3ção 4380 comparada com SEQ ID NO:4

<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>4044 3796 promotor C HSV TK

4916 5704 AmpR

SEQ ID NO:26: cDNA de GCSF humano forma bSEQ ID NO:27: proteína de GCSF humano forma b

Claims

1. Método para preparar uma linhagem de célula humana imorta-lizada transfectada com uma seqüência de ácidos nucléicos, que compreen-de um gene que codifica uma proteína alvo humana ou um derivado ou mu-tante da mesma, um promotor e um sinal de poliadenilação (polyA) de hor-mônio de crescimento bovino, em que o dito promotor e o sinal de polyA es-tão ligados à extremidade 5' e 3' do gene que codifica a dita proteína alvohumana, respectivamente, cujo método compreende transfectar uma linha-gem de célula hospedeira humana imortalizada sob condições isentas desoro com um vetor de transfecção que compreende a dita seqüência de áci-dos nucléicos e uma origem de replicação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a proteínaalvo humana é uma proteína de plasma humano selecionadas de fatores decoagulação do sangue tais como fator IX, fator Vlll (tipo selvagem e domínioB deletado), Fator Vll/Vlla, e fator de von Willebrand (vWF), fatores de cres-cimento, tal como eritropoietina, fatores estimuladores de colônias (CSFs)tais como fator estimulador de granulócitos (G-CSF), CSF macrófago (M-CSF) e CSF granulócito-macrófago (GM-CSF), citocinas tais como interleu-cinas, inibidores de protease tais como alfa-1 -antitripsina (A1AT) e quimo-tripsina, proteínas de transporte tais como hormônios, proteínas de ação ini-bidora e reguladora, e derivados e mutantes dos mesmos, preferivelmente aproteína humana é selecionada de fator IX, fator Vlll incluindo fator Vlll tiposelvagem e fator Vlll de domínio B deletado, fator Vll/Vlla, G-CSF, vWF eA1AT, mais preferivelmente a proteína humana é fator IX de coagulação dosangue conforme codificada por bps 939 a 2324 da SEQ ID NO:1, A1AThumana como codificada por bps 973 a 2259 da SEQ ID NO:2, fator Vlll wtcomo mostrado na SEQ ID NO:9, fator Vlll humano deletado de domínio Bcomo codificado por bps 783 a 5162 da SEQ ID NO:3, fator Vll/Vlla comocodificado por SEQ ID Nos: 13 e 14, G-CSF como codificado por SEQ IDNos: 15, 16 e 17, ou vWFcomo codificado por SEQ ID NO: 18.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que no ve-tor de transfecção(i) o promotor é selecionado de promotores virais, promotores degene de manutenção e promotores específicos de tecido, preferivelmente opromotor é um promotor CMV com oU.S.em intron A, promotor SV40, pro-motor EF-lalfa, promotor HSV TK, etc., mais preferivelmente é um promotorCMV; e/ou(ii) a origem de replicação permite a replicação e ampliação doplasmídio em bactérias;(iii) o vetor transporta pelo menos um gene para um marcador deseleção, preferivelmente selecionado de resistência à higromicina, resistên-cia à neomicina, resistência à aminoglicosídeo fosfotransferase (neo, G418,ΑΡΗ), resistência à bleomicina (fleo, bleo, zeocina) e resistência à xantina-guanina fosforribosiltransferase (XGPRT, gpt), e/ou estando sob controle deum promotor como definido acima;e/ou(iv) o vetor ainda transporta um ou mais de outros elementosreguladores, em que os ditos elementos reguladores são selecionados desítios união, sítios de recombinação, sítios polyA, intensificadores, sítios demulticlonagem e seqüências de plasmídios procarióticos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o vetor detransfecção transporta um promotor CMV, um gene de higromicina, uma se-qüência de polyA e o gene de interesse e preferivelmente é derivado do ve-tor pcDNA3.1 tendo a seqüência de SEQ ID NO:4 ou 5.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a linhagem de célula humana imortalizada(i) é capaz de ser transfectada e ser cultivada sob condições i-sentas de soro; e/ou(ii) tem seqüências adenovirais integradas em seu genoma; e/ou(iii) é selecionada do grupo de células do rim, bexiga, pulmão,músculo cardíaco, músculo liso, ovários e gastrointestinais, preferivelmenteé uma linhagem de células de rim humano; e/ou(iv) não é capaz de expressar uma proteína príon humana.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que a células derim são células de rim de feto humano, preferivelmente células de rim de fetohumano selecionadas de células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305),células 293T (DSM ACC 2494), células 293 Sem padrões (células 293F; In-vitrogen R79007), preferivelmente são células 293F (INVITROGEN R79007).

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a linhagemde células é 293F e o vetor de transfecção é derivado de pcDNA3.1, o vetorcodifica preferivelmente fator IX de coagulação do sangue humano comomostrado por bps 939 a 2324 da SEQ ID NO:1; A1AT humana como codifi-cada por bps 973 a 2259 da SEQ ID NO:2. fator Vlll humano wt como mos-trado na SEQ ID NO:9, ou fator Vlll humano de domínio B deletado comomostrado na SEQ ID NO:3, FVII/FVIIa, G-CSF incluindo G-CSFb mostradona SEQ ID NO:27, ou fator de von Willebrand.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que a transfecção isenta de soro é efetuada em cultura de suspensãosem soro com um agente de transfecção catiônico ou fosfato de cálcio, pre-ferivelmente reagente de Iipofectamina 2000 CD (Invitrogen).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-8, que compreende ainda a seleção para células estavelmente transfecta-das, preferivelmente por produtividade, atividade e qualidade do produto daproteína recombinante produzida.

10. Linhagem de célula humana imortalizada, estavelmentetransfectada, obtenível pelo método como definido nas reivindicações 1 a 9.

11. Linhagem de célula, de acordo com a reivindicação 10, que éobtenível pelo método como definido nas reivindicações 4 a 9, preferivel-mente, a linhagem de célula é 293F e o vetor de transfecção é derivado depcDNA3.1.

12. Método para produção recombinante de uma proteína alvohumana ou um derivado ou mutante da mesma, que compreende cultivaruma linhagem de célula humana imortalizada como definida na reivindicação-10 ou 11.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a proteí-na alvo humana é um fator IX de coagulação do sangue humano como mos-trado por bps 939 a 2324 da SEQ ID NO:1; A1AT humana como codificadapor bps 973 a 2259 da SEQ ID NO:2, fator Vlll humano wt como mostradona SEQ ID NO:9, ou fator Vlll humano deletado de domínio B como mostra-do na SEQ ID NO:3, FVII/FVIIa, G-CSF incluindo G-CSFb mostrado na SEQID NO:27, ou fator de von Willebrand.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em quecompreende ainda as etapas de concentrar a proteína humana recombinan-te do caldo de cultura e/ou purificar a proteína, e/ou remoção de príon.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12a 14, em que a produção da proteína humana é realizada sob condições i-sentas de soro.

16. Vetor de transfecção que compreende uma origem de repli-cação e uma seqüência de ácidos nucléicos compreendendo um gene quecodifica uma proteína alvo humana ou um derivado ou mutante da mesma,como definida nas reivindicações 1 a 4.

17. Vetor de transfecção, de acordo com a reivindicação 16, queé um vetor pcDNA3.1 que compreende o gene que codifica uma proteínaalvo selecionada do grupo que consiste em fator IX de coagulação do san-gue de proteína humana, A1AT humana, fator Vlll de coagulação do sanguehumano incluindo tipo selvagem e seus mutantes deletados de domínio B,G-CSF incluindo a forma a, b, e c deste, FVII/Vlla incluindo a forma a e bdeste, e vWF, preferivelmente o dito vetor de transfecção tem a seqüênciade ácidos nucléicos mostrada na SEQ ID NO:1, 2, 3 ou 22.