BRPI0614076A2 - método e kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doença de alzheimer e uso de pelo menos um gene que codifica lamp-1 - Google Patents

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Abstract

MéTODO E KIT PARA O DIAGNóSTICO E/OU PROGNóSTICO DE DOENçA DE ALZHEIMER E USO DE PELO MENOS UM GENE QUE CODIFICA LAMP-l. A presente invenção se refere a um método para o diagnóstico e/ou o prognóstico da doença de Alzheimer, consistindo em determinar o nível de expressão de um gene que codifica um marcador de lisossomo.

Description

"MÉTODO E KIT PARA O DIAGNÓSTICO E/OU PROGNÓSTICO DE DOENÇA DEALZHEIMER E USO DE PELO MENOS UM GENE QUE CODIFICA LAMP-1"
Campo da Invenção
O campo de aplicação da presente invenção é o dosetor da saúde, principalmente ao que se refere a doençasneurodegenerativas, e tem como principal objetivo o método dediagnóstico de doença de Alzheimer.
Antecedentes da Invenção
A doença de Alzheimer (AD) é considerada ser aprincipal causa de demência, a última sendo a quarta causa demorte em paises desenvolvidos (1). É definido como uma doençaneurodegenerativa o sofrimento do sistema nervoso central e écaracterizada por uma deterioração progressiva das funçõessuperiores do cérebro.
A doença de Alzheimer é microscopicamentecaracterizada pela presença de placas senis (difusa e clássica),entrelaçamentos neurofibrilares, cordões de neuropil, degeneraçãoneuronal, depósitos de proteína β A-amilóide, degeneraçãogranulovacuolar e a presença de corpos de Hirano, dentre outraspatologias (2).
Os critérios clínicos que foram bem estabelecidospela quarta edição do Diagnostic and Statistical Manual of theAmerican Psychiatric Association (DSM-IV) (3) ou pelo NationalInstitute of Neurologic, Communicative Disorders and Stroke -Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) (4) são usados para diagnosticar doença de Alzheimer.
Entretanto, o maior dilema dos referidos estudos clínicos é acerteza do diagnóstico. Atualmente a única maneira de confirmar odiagnóstico clínico é de se conduzir uma análise post-mortem notecido cerebral para encontrar a existência de entrelaçamentosneurofibrilares e placas.
Os diferentes marcadores genéticos foramrecentemente estudados para a aplicação dos mesmos no diagnósticode doença de Alzheimer tais como:
- determinação de mutações em um gene de proteínaprecursora amilóide (APP), mutações no gene presenilina-1 (PSl) eno gene presenilina-2 (PS2), apenas válido para um númeroreduzido de casos de doença de Alzheimer com uma ocorrênciaprecoce ou familiar (5).
- valor genético do genótipo ApoE, que é apenasdeterminado naqueles casos de acordo com os critérios clínicos dedoença de Alzheimer provável, o problema é que o mesmoproporciona um alto número de falsos positivos.
Além dos referidos marcadores genéticos, hámarcadores bioquímicos tais como:
- Proteína Tau: a referida proteína é determinadapor meio de anticorpos neuronais que podem detectar a proteínatau no fluido cérebro-espinhal entretanto, os níveis de tau emdoença de Alzheimer não estão relacionados à idade, sexo,evolução da doença, ou ao grau de demência; ainda, para detectarelevados níveis de tau em outras patologias tais como meningite,infiltrações meníngeas, demências frontais e Creutzfeldt-Jakob.
- Proteína β A-amilóide: a referida proteína faltade utilidade diagnostica em formas esporádicas de doença deAlzheimer (6).
Não há ainda atualmente nenhum instrumentodiagnóstico pouco invasivo com sensibilidade, especificidade evalor previsivo adequado para a doença de Alzheimer. A referidadoença adicionalmente envolve um enorme custo social em virtude,entre outros, da incapacidade do paciente de cuidar de si mesmo,portanto há necessidade de um método diagnóstico confiável pormeio de marcadores que permitam a prevenção da doença,aprimoramento do tratamento e a previsão da evolução da doença.
Breve Descrição da Invenção
A presente invenção proporciona um método para odiagnóstico e/ou o prognóstico da doença de Alzheimer por meio dadeterminação do nível de expressão de um gene que codifica omarcador de lisossomo. 0 marcador de lisossomo épreferivelmente Lamp-I ou Lamp-2.
Um aspecto particular da presente invenção consisteem um método in vitro de diagnóstico e/ou o prognóstico da doençade Alzheimer por meio da determinação do nível de expressão de umgene que codifica o marcador de lisossomo em uma amostrabiológica e comparar o referido nível com um valor de referência,no qual a alteração do referido nível é indicativo de doença deAlzheimer e do estágio da referida doença.
"Valor de Referência" na presente invenção designaos níveis de mRNA e da proteína codificada pelo gene marcador delisossomo presente em um indivíduo saudável que não sobre dedoença de Alzheimer ou de outras doenças que afetam os níveis demRNA ou da proteína codificada pelo referido gene marcador delisossomo.
De acordo com uma modalidade preferida da presenteinvenção, o gene que codifica o marcador de lisossomo épreferivelmente Lamp-I ou Lamp-2.
De acordo com uma modalidade preferida da presenteinvenção, a amostra biológica compreende um tecido, o referidotecido é preferivelmente um tecido de homogenato. O homogenatode tecido é preferivelmente obtido a partir de células dotecido nervoso ou células neuroendócrinas periféricas.De acordo com uma outra modalidade preferida dapresente invenção, a amostra biológica é um fluido biológico, oreferido fluido biológico preferivelmente compreende um fluidocérebro-espinhal, sangue ou soro.
A determinação do nível de expressão do gene quecodifica o marcador de lisossomo é realizada em uma modalidadeparticular por meio de se medir a quantidade de mRAN codificadopelo referido gene ou fragmentos do mesmo. 0 gene marcador delisossomo é preferivelmente Lamp-1 ou Lamp-2.
A análise da quantidade de mRNA codificada peloreferido gene ou fragmentos do mesmo é pref erivelmenterealizada por meio de amplificação, usando os oligonucleotídeosespecíficos para PCR, DAS, ou qualquer outro método deamplificação de cDNA que permita a estimativa de quantidade dosníveis do transcripts de marcador de lisossomo.
A análise da quantidade de mRNA codificada peloreferido gene ou fragmentos do mesmo é pref erivelmenterealizada por meio de biochips de DNA produzidos comoligonucleotídeos depositados por qualquer mecanismo conhecidosdaqueles versados na técnica, ou sintetizado in situ por meio defotolitografia ou por meio de qualquer outro mecanismo conhecidodaqueles versados na técnica.
De acordo com uma outra modalidade preferida dapresente invenção, a determinação do nível de expressão do geneque codifica o marcador de lisossomo é realizada por meio demedir a quantidade de proteína codificada pelo referido gene oufragmentos do mesmo. A proteína medida é pref erivelmente Lamp-1ou Lamp-2.
A medição da quantidade de proteína codificada peloreferido gene ou fragmentos do mesmo é pref erivelmenterealizada por meio de Western blot.
A medição da quantidade de proteína codificada peloreferido gene ou fragmentos do mesmo é também realizada por meiode chips de proteína que usam anticorpos ou fragmentos deanticorpos específicos contra o marcador de lisossomo ou por meiode perfis protéicos realizados por espectrometria de massa ou porqualquer outro mecanismo que permita a estimativa quantitativados níveis de proteína do marcador de lisossomo.
Em uma outra modalidade preferida, a medição daquantidade de proteína codificada pelo referido gene oufragmentos do mesmo é também realizada por meio de técnicas deimunohistoquímica.
Outra modalidade preferida da presente invençãocompreende determinar o nível de expressão do gene que codifica omarcador de lisossomo por meio de análise de imagem.
De acordo com uma modalidade mais específica dapresente invenção, a determinação do nível de expressão do geneque codifica o marcador de lisossomo é realizada por meio deanálise de imagem a partir da quantificação em imagensimunohistoquímicas. Exemplos dos métodos de quantificação incluemmas não são limitados a, morfometria, densitometria e intensidadede fluorescência.
Outro aspecto da presente invenção consiste em umkit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doença de Alzheimerque compreende os reagentes necessários para realizar adeterminação do nível de expressão do gene que codifica omarcador de lisossomo, preferivelmente determinando o nível deexpressão de Lamp-I ou Lamp-2. O kit permite realizar o método deacordo com a invenção que foi agora descoberto.
O kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doençade Alzheimer pref erivelmente compreende os reagentesnecessários para realizar a determinação do nivel de mRNAcodificado pelo gene marcador de lisossomo e de forma maispreferida compreende os reagentes necessários para a determinaçãodo nivel de mRNA codificado pelo gene marcador de lisossomo pormeio de amplificação.
O kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doençade Alzheimer pref erivelmente compreende os reagentesnecessários para realizar a determinação do nivel de mRNAcodificado pelo gene marcador de lisossomo. O mesmo de forma maispreferida compreende os reagentes necessários para a determinaçãodo nivel de mRNA codificado pelo gene marcador de lisossomo pormeio de biochips de DNA.
Por outro lado, o kit para o diagnóstico e/ouprognóstico de doença de Alzheimer pode compreender os reagentesnecessários para a determinação do nivel de proteína codificadapelo gene marcador de lisossomo. O mesmo de forma mais preferidacompreende os reagentes necessários para a determinação do nívelde proteína codificada pelo gene marcador de lisossomo por meiode Western blot.
O kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doençade Alzheimer pode compreender os reagentes necessários para adeterminação do nível de proteína codificada pelo gene marcadorde lisossomo. O mesmo de forma mais preferida compreende osreagentes necessários para a determinação do nível de proteínacodificada pelo gene marcador de lisossomo por meio de chips deproteína.
O kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doençade Alzheimer pref erivelmente compreende os reagentesnecessários para a determinação do nível de proteína codificadapelo gene marcador de lisossomo. 0 mesmo de forma mais preferidacompreende os reagentes necessários para a determinação do nívelde proteína codificada pelo gene marcador de lisossomo por meiode técnicas de imunohistoquímica.
De acordo com uma modalidade preferida da presenteinvenção, a determinação do nível de expressão de um gene quecodifica o marcador de lisossomo é realizado por meio de umasubstância que se liga especificamente ao mRNA ou à proteínacodificada pelo referido gene.
"Substância reportadora" na presente invenção serefere a um anticorpo, um anticorpo monoclonal, umoligonucleotídeo, uma macromolécula, uma molécula orgânica ou emgeral, a qualquer substância que possa se ligar especificamenteao mRNA ou à proteína codificada pelo gene marcador de lisossomo.A referida substância indicadora compreende uma marcação que podeser uma enzima, um radioisótopo, um corante, um compostofluorescente, um composto quimioluminescente, um compostobioluminescente, um quelato de metal ou em geral, qualquermarcação conhecida no estado da técnica que pode ser detectadapor meio de um método de detecção.
Um aspecto particular da presente invenção é formadopelo kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doença deAlzheimer compreendendo os reagentes necessários para a realizara determinação do nível de expressão que codifica um marcador delisossomo compreendendo uma composição que contém uma substânciareportadora que se liga especificamente ao mRNA ou à proteínacodificada pelo referido gene, no qual a referida subst6anciaindicadora é marcada com um marcador detectável e um fluidofisiologicamente aceitável.
Um aspecto particular da presente invenção érepresentado pelo uso de pelo mesmo um gene que codifica omarcador de lisossomo selecionado a partir de Lamp-1 e Lamp-2,como um marcador genético para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer.
Outros aspectos da presente invenção se tornarãomais evidentes para aqueles versados na técnica.
Descrição dos Desenhos
A figura 1a mostra uma amplificação de Lamp-1 queusa diluições em série de RNA de controle do cérebro humano. Alinha horizontal mostra a linha limiar manualmente ajustada nafase exponencial. A intensidade de fluorescência aumenta com oaumento dos ciclos de PCR. O número de ciclos de PCR no qual aintensidade de fluorescência excede a linha limiar foi definidocomo o valor CT no qual a quantificação relativa foi baseada.
A figura IB mostra as curvas padrão representativaspara β-actina e Lamp-I construídos a partir de diversasconcentrações de RNA de controle do cérebro humano. Os valores deCT (eixo Y) com relação ao logaritmo da concentração de RNA dasamostras de controle (eixo X) mostraram uma correlação linearinversa.
A figura 2A mostra os níveis de mRNA de Lamp-1(média + SEM) no córtex frontal das amostras de controle (C, η =4), seis casos doença de Alzheimer, estágios I - IIA/B (de acordocom Braak e Braak) (ADI, η = 6) , e cinco casos de doença deAlzheimer, estágios V - VIC (ADV, η = 5). Os níveis de mRNA deLamp-I foram padronizados com β-actina.
A figura 2B mostra os níveis de mRNA de Lamp-1normalizados com β-actina e GUS no córtex frontal de uma únicaamostra (3 horas pós-morte) . As amostras foram congeladasdiretamente em nitrogênio líquido (0 hora) ou deixadas atemperatura ambiente por 3, 6, 22 horas e então congeladas emnitrogênio liquido.
Não houve degradação aparente de mRNA até 22 horas*p < 0,05 comparados com as amostras de controle (teste ANOVA conpost-hoc LSD).
A figura 3 mostra Lamp-I (aproximadamente 125 KDa)como detectado por meio de Western blot nos homogenatos de córtexfrontal (área 8). B-actina é usada como o controle de cargaprotéica. A imagem é representativa de todas as amostrasindicadas na tabela 1. as analises de densitometria dos níveisprotéicos de Lamp-I (média ± SEM) foram realizadas com o programaTotalLab v2.01. Os valores de proteína Lamp-I foram normalizadoscom β-actina ***p < 0,001 em comparação as amostras de controle(teste ANOVA com post-hoc LSD); n.s.: diferenças nãosignificativas quando comparadas ao controle.
A figura 4 mostra a análise da imagem da atividadede imunoluminescência de Lamp-I no córtex frontal (A-E) e nohipocampo (F), no controle (A, B) e em casos doença de Alzheimer(estágios VC) (C - F) . Uma imunoreatividade de Lamp-I moderadafoi observada em citoplasma de neurônio em doença de Alzheimer.Entrelaçamentos neurofibrilares não foram corados com Lamp-I (D -E). Os neurônios com degeneração granulovacuolar mostraram umaimunoreatividade forte de Lamp-I.
A e C, linha em C = 50 μπι. Β, D-F, linha em F = 25 μπι.
A figura 5 mostra a análise da imagem deimunoreatividade de Lamp-I, indicando que a mesma foi localizadano processo celular em torno dos depósitos amilóides nas placasestéreis (A - D), além dos neurônios.
Linha = 50 μπι.A figura 6 mostra a análise da imagem daimunofluorescência de marcação dupla para Lamp-I (verde) e paraTau-fosforilado (anticorpo AT8, vermelho) em doença de Alzheimer(superposição de C e F, amarelo). A maior parte dos neurônios comdepósitos de proteína Tau fosforilada mostram uma expressão baixapara Lamp-I, enquanto que poucos neurônios com forteimunoreatividade para Lamp-I mostram um deposito de taufosforilado (A, BeD, E). As seções de controle coradas apenascom os anticorpos secundários foram negativas (G-I).
A figura 7 mostra a análise da imagem daimunofluorescência de marcação dupla para Lamp-I (verde) e para βA-amilóide (vermelho), e microscopia confocal (superposição,amarelo), depósitos de Lamp-I imunoreativos foram encontrados emtorno de placas amilóides (A - C) . a imunoreatividade de Lamp-Iaparece com a condensação de β A-amiloide nas placas senis. Poucoou nenhum perfil imunoreativo de Lamp-I apareceu nas placasdifusas (D - F) , enquanto que o processo de Lamp-I imunoreativoaumentou nas placas com núcleos amilóides (G - I) . As seções decontrole coraram com apenas anticorpos secundários foramnegativos (J - L).
A figura 8A mostra os níveis protéicos de Lamp-I,analisados por Western blot, no córtex cerebral no caso de doençade Alzheimer com encefalite após a imunização com β A peptídeo.Não foram observadas diferenças nos níveis de expressão quando osmesmos foram comparados com o estagio de doença de Alzheimer V -VI/C.
A figura B mostra a análise da imagem deimunoreatividade Lamp-I, indicando que o mesmo apareceuprincipalmente em células microgliais que envolvem os depósitosamilóides colabados (A-C) e em células gigantes multinucleadas(D - F) , o resultado sendo a fagocitose de resíduos β A-amiloide.
A e B, linha em B = 50 μιτι, C-F, linha em F = 25 pm.
A figura 9 mostra a análise da imagem para aimunofluorescência de marcação dupla para Lamp-I (verde) e paraCD68 (vermelho), e microscopia confocal (superposição, amarelo)no caso de doença de Alzheimer com encefalite após imunização comβ peptídeo. A imunoreatividade dom Lamp-I foi observada emcélulas microgliais e células gigantes multinucleadas (A -F). Asseções de controle que coraram apenas com anticorpos secundáriosforam negativas (G - 1).
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção proporciona um método para odiagnostico e o prognostico de doença de Alzheimer em uma maneirasimples e confiável, com uma grande importância para umdiagnóstico precoce da doença e para avaliar a evolução dopaciente com doença de Alzheimer.
Um experimento foi realizado no qual os níveis deexpressão de mRNA Lamp-I e de proteína em amostras de cérebro depacientes com doença de Alzheimer e amostras de controle decérebro foram comparadas.
As amostras de cérebro foram obtidas por autópsia de11 pacientes com doença de Alzheimer e 4 controles. Oconsentimento informado dos pacientes ou de seus parentes foinecessário e o estudo foi aprovado por comitês éticos.
O tempo entre a morte e o processamento do tecidofoi de 2 - 10 horas. Metade do cérebro foi seccionado em seçõescoronais de 1 cm de espessura e foram congeladas em gelo seco a -80°C até o uso.
Para os exames morfológicos, os cérebros foramfixados por imersão em um tampão de 10% de formalina por duas atrês semanas.
O estudo neurológico foi realizado em seções deparafina livre de cera de 4 μπι de espessura do frontal (área 8),motor primário, sensor primário, parietal, temporal superior,temporal inferior, cingulato anterior, insular anterior e córtexprimário e associativo visual; córtex entorinal e hipocampo;caudato, putâmen e palidum; tálamo médio e posterior; subtálamo,núcleo de Meynert; amídala, mesencéfalo, ponte e bulbo, e córtexcerebelar e núcleo dentado.
As seções foram coradas com hematoxilina e eosina,azul rápido luxol com o método Klüver Barreira e para aimunohistoquimica das proteínas acidas das fibras gliais, CD 68 elecitina tomate para microglia, (β A-amiloide, pan-tau, tauespecificamente fosforilado em Thrl81, Ser202, Ser214, Ser262,Ser396 e Ser422 e aB-cristalina, α-sinucleina e ubiquitina.
Os estágios doença de Alzheimer foram estabelecidosde acordo com a carga de deposito amilóide e de acordo com apatologia neurofibrilar seguindo a classificação de Braak e Braak(7).
Estágio A: depósitos iniciais no neocórtex basal
Estágio B: depósitos estendidos nas áreas associadasa neocórtex
Estágio C: grandes depósitos em todo o córtex.
I - II: estágios de patologia neurofibrilar emtransentorinal
III - IV: limbico
V -VI: neocortical
6 pacientes foram classificados como doença deAlzheimer I - IIA/B, e 5 como doença de Alzheimer V - VIC. Osdados clínicos principais e neuropatológicos são resumidos natabela 1. Os referidos pacientes não apresentaram patologiasassociadas (vascular, sinocleinopatia). O cérebro de um casodoença de Alzheimer que apresentou encefalite após imunização compeptídeo amilóide (11) foi incluído no estudo com objetivo decomparação.
As amostras de córtex frontal de um indivíduo decontrole foram adicionalmente incluídas, as referidas amostrasforam obtidas 3 horas após a morte, algumas foram imediatamentecongeladas e outras foram armazenadas a 4°C por 3 horas, 6 horase 22 horas e as mesmas foram posteriormente congeladas paralimitar o retardo variável após a morte nos tecidos processados eo seu efeito na preservação de mRNA Lamp-I.
Uma vez que as amostras foram preparadas, adeterminação tanto de mRNA Lamp-I e da proteína foi realizada eos estudos bioquímicos, imunohistoquímico e microscópico foramconduzidos como descrito nos exemplos. 0 controle e as amostrasde cérebro doente foram processados em paralelo. Os resultadosdos referidos estudos mostram que há um aumento dos níveis deexpressão de mRNA Lamp-I e da proteína no córtex cerebral emestágios avançados de doença de Alzheimer, Lamp-I éadicionalmente localizado no citoplasma dos neurônios e emneurite distrófica que circunda as placas senis.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são úteis para a ilustração masnão limitam a presente invenção.
Exemplo 1: isolamento de mRNA e a confirmação dosresultados por síntese de cDNA e TaqMan PCR
O RNA total foi isolado usando Trizol Reagent® (LifeTechnologies) seguido de RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen). Ostecidos cerebrais humanos congelados foram diretamentehomogeneizados em 1 mL de Trizol por 100 mg de tecido. 0 RNAtotal foi extraído usando o protocolo sugerido pelo fornecedor. 0RNA total purificado foi então resuspenso em 100 yL de água livrede RNase, o MRNA foi purificado em seguida do protocolo de RNeasyProtect Mini Kit com modificações mínimas. 0 tratamento dom DNasefoi descartado em virtude da eliminação de DNA genômico durante aextração com Trizol. A concentração de cada amostra foi medida aA260f e a integridade de RNA foi confirmada por meio deeletroforese de gel de formaldeído - agarose.
A síntese de cDNA e TaqMan PCR foram realizadas.Para cada 100 pL de reação de transcrição reversa, 1 pg de RNAhumano com 1,5 μΜ de hexâmeros aleatórios, tampão RT TaqMan lx,5,5 mM MgCl2, 500 μΜ de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 0,4 U/μΙ deinibidor de RNase e 1,25 U/μΙ transcriptase reversa MultiScribe(Applied Biosystems). As reações foram realizadas a 250C por 10minutos para aumentar a ligação de molde de RNA ao primer,seguido por 30 minutos a 480C e então por incubação por 5 minutosa 950C para desativar a transcriptase reversa. Para checar o graude contaminação por DNA genômico, as reações paralelas foramrealizadas para cada amostras de RNA na ausência de transcriptasereversa MultiScribe.
A sonda TaqMan (Applied Biosystems) se liga aofilamento de molde de DNA entre os primers direto e reverso. Asonda contém um corante reportador que é liberado por Taqpolimerase durante a amplificação, portanto a fluorescênciagerada será proporcional à quantidade do produto acumulado.
B-actina e β-glucuronidase (GUS) foram usadas comoos controles internos. Os primers e as sondas fluorescentesespecíficas para Lamp-I, GUS e β-actina foram adquiridas da Taq-Man Gene Expression Assays (Applied Biosystems).
Os testes TaqMan PCR para Lamp-I e para os controlesinternos foram realizados em triplicata em amostras de cDNA emplacas de 96 cavidades em um sistema de detecção de seqüência ABIPrism 7700 (PE Applied Biosystem) . Para cada 20 pL de reaçãoTaqMan, 9 pL de cDNA (diluído 1/50, correspondendo aaproximadamente 4 ng de RNA) foi misturado com 1 pL 20x de Testesde expressão de gene TaqMan e 10 pL de 2x TaqMan Universal PCR30Master Mix (Applied Biosystem). Os estudos paralelos foramrealizados para cada amostra usando primers e sondas com β-actinae GUS para a padronização. A reação foi realizada usando osparâmetros a seguir: 50°C por 2 minutos, 950C por 10 minutos e 40ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. As curvaspadrão foram preparadas para Lamp-I e para cada controle internousando diluições em série das amostras de controle de RNA humano.Os dados de TaqMan PCR foram finalmente capturados usando oprograma de detector de seqüência (versão SDS, 1,9; AppliedBiosystem).
O aumento dos níveis de Lamp-I mRNA foramconfirmados por meio dos testes de TaqMan PCR com as amostras decontrole de cérebro e com doença de Alzheimer. 0 ABI 7700 mede oacúmulo de fluorescência dos produtos PCR pelo monitoramentocontínuo do limiar de ciclo (Ct) que é um valor arbitrário que émanualmente determinado a um nível acima da linha basal, na faseexponencial do PCR na qual não há fator limitante. 0 valor Ctestabelece o ponto no qual a amplificação da amostra cruza olimiar (figura IA) . Para cada amostra a quantidade de alvo e decontroles internos é determinada a partir das curvas padrão queforam traçadas mostrando Ct (Y) com relação ao Iog de ng do RNAde controle total. A quantidade de cada alvo Lamp-I foi divididapela quantidade dos controles internos para se obter um valoralvo padronizado que permitiu a determinação dos níveis de Lamp-ImRNA nas amostras de controle e nas amostras patológicas. Osníveis nas amostras de controles internos usados para padronizaros valores de Lamp-I mRNA não forma modificados nas amostraspatológicas comparadas aos controles e foram adicionalmentesimilares entre as patologias diferentes.
Os resultados mostrados mostraram um aumentorelativo dos níveis de Lamp-I mRNA no córtex frontal em doença deAlzheimer pertencentes aos estágios V - VIC quando comparados comos controles: p<0.05, ANOVA com o teste LSD (post-hoc diferençamínima significante de Fisher's) (Figure 2A). Os níveis de Lamp-ImRNA no córtex frontal não foram modificados nos estágiosprecoces de doença de Alzheimer (estágios I - IIA/B) (figura 2A)em comparação aos valores de controle.
Exemplo 2: Eletroforese de Gel e Western BlotAs amostras de córtex frontal congeladas (área 8,100 mg) foram diretamente homogeneizadas em 1 mL de tampão Iise(20 mM Hepes, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mNDDT, 2 mM PMSF, 1 μg/mL de aprotinina, leupeptina e pepstatina) esubmetido a sonicação. Os lisados foram configurados a 5.000 rpmpor 10 minutos a 4°C e a concentração protéica foi determinadapor meio do método BCA (Pierce). 50 μg de proteínas totais foramsubmetidas a 95 0C e foram então abastecidas em géis de SDS-poliacrilamida com tampão de elução Tris-glicina. As proteínasforam submetidas a eletroforese usando um sistema de mini-proteína (Bio-Rad) e transferidas a membranas de microcelulose(Bio-Rad) com a célula de transferência mini trans blot poreletroforese (Bio-Rad) por 1 hora a 100 V. As membranas demicrocelulose foram bloqueadas com Tween 20 TBS (TBST) contendo5% de leite desnatado por 30 minutos. As membranas forma entãoincubadas durante a noite 1 4°C com um dos anticorpos primáriosem TBST com 3% de BSA. Os anticorpos a seguir foram usados:anticorpo anti-Lamp-1 (H-228, sc-5570, Santa Cruz) 1:1000 dediluição, anticorpo anti-p-actina (AC-74 clone, Sigma) 1:5000 dediluição. Após a incubação com o anticorpo primário, as membranasforam então incubadas com anticorpos anti-IgG de coelho e ratomarcados com peroxidase de rábano silvestre (Dako), diluição de1:1000 (1:5000 para β-actina) por 1 hora a temperatura ambiente.As membranas foram então lavadas 4 vezes, 5 minutos cada vez comTBST a temperatura ambiente e desenvolvidas com o sistema deguimioluminescência de Western Blot ECL (Amersham/Pharmacia), asmembranas foram então expostas a uma película autoradiográfica(Hyperfilm ECL, Amersham).
A quantificação densitométrica das faixas de WesternBlot foi realizada por meio do programa totalLab v2.01. para aanálise estatística foi usado Statgraphics Plus v5.
Os resultados mostraram que os níveis da proteínaLamp-I, como os níveis de Lamp-I mRNA, foram aumentados no córtexfrontal em estágios de doença de Alzheimer V - VIC (p < 0,001,ANOVA com teste LSD), mas na houveram aumentos nos estágiosprecoces de doença de Alzheimer I - IIA/B em comparação com asamostras de controle (figura 3).
Exemplo 3: imunohistoguímica
Seções livres de cera de 5 ym de espessura do córtexfrontal, hipocampo e córtex entoretinal foram processados porimunohistoquímica de acordo com o método de biotina peroxidasemarcado com streptavidina (LSAB). Após a incubação com metanol eH2O2 em PBS e soro normal, as seções foram incubadas comanticorpo anti-Lamp-1 (Santa Cruz) em uma diluição de 1:100. Apósa incubação com o anticorpo primário, as seções foram incubadascom LASB por 15 minutos a temperatura ambiente. A reação comperoxidase foi observada com diaminobenzidina e H2O2. 0 controlede imunomancha incluiu a omissão do anticorpo primário, nenhumsinal foi obtido com seqüência da incubação exclusivamente comanticorpo secundário. As seções foram relativamente coradas comhematoxilina.
A imunoreatividade de Lamp-I moderada caracterizadapor grânulos citoplasmáticos pequenos foi observada em neurôniose células microgliais (figura 4A, Β) , enquanto que o aumento deimunoreatividade de Lamp-I foi observado em neurônios corticaisem doença de Alzheimer (figura 4C).
Curiosamente, o referido aumento não esteveassociado à patologia individual dos neurônios, uma vez que aimunoreatividade de Lamp-I não foi encontrada nos entrelaçamentos(figura 4D, E) . um aumento da imunoreatividade de Lamp-I foitambém observada em neurônios com degeneraçâo granulovacuolar nohipocampo (figura 4F), e uma forte imunoreatividade de Lamp-I foiobservada nas células da placa neuritica (figura 5), sendolimitada no córtex frontal dos estágios doença de Alzheimer I -IIB (caso 8), mas muito visíveis no córtex frontal dos estágiosde doença de Alzheimer V/VIC.
Exemplo 4: Imunofluorescência de marcação dupla emicroscopia confocal
As seções livres de cera do córtex frontal foramcoradas com uma solução saturada de Sudan Black (Merck) por 30minutos para bloquear a autofluorescência dos grânulos delipofuscina presentes nos corpos neuronais, enxaguadas em 70% deetanol e lavadas com água destilada. As seções foram incubadasdurante a noite a 4°C com um anticorpo anti-Lamp-1 policlonal(Santa Cruz) usando uma diluição de 1:100 e um anticorpo β A-amilóide monoclonal (Dako) com uma diluição de 1:50, anticorpoanti AT8 de rato (Innogenetics, Gent) 1:50 de diluição, ou CD68(Dako) 1:100 de diluição. As seções foram então lavadas em PBS, eincubadas no escuro com um coquetel de anticorpo secundário ediluídas na mesma solução veículo que as dos anticorpos primáriospor 45 minutos a temperatura ambiente. Os anticorpos secundáriosforam: Alexa488 de Coelho (verde) e Alexa 546 de rato (vermelho)(ambos oferecidos pela Molecular Probes, OR) em uma diluição de1:400. Após lavagem com PBS, as seções foram montadas em um meiode Imuno Fluore (ICN Biomedicals, Barcelona), seladas e secasdurante a noite. As seções foram examinadas com microscópioconfocal Leica TCS-SL.
A ausência de co-localização da expressão de Lamp-Ie de degeneração neurofibrilar, como mostrado com o anticorpoAT8, fio também mostrada com imunofluoresc6encia de marcaçãodupla e microscopia confocal. Os neurônios que mostram forteimunoreatividade de Lamp-I apresentaram depósitos de proteínatau-fosforilada baixos, enquanto que os neurônios da placaneurofibrilar mostraram imunoreatividade de Lamp-I (figura 6).
A forte imunoreatividade associada às placas foirestrita ao processo celular que circunda as áreas do amilóide,como foi descrito nas seções imunomanchadas com Lamp-I e β A-amilóide. A imonoatividade foi raramente observada em associaçãocom a placa difusa embora alguma imunoreatividade tenha ocorridoem processos de condensação β A-amilóide. (figura 7).
Imunoreatividade de Lamp-I em doença de Alzheimercom encefalite após imunização com β A.
Os pacientes de doença de Alzheimer com encefaliteapós imunização com β A mostraram uma carga amilóide cerebralreduzida em comparação aos pacientes com doença de Alzheimerconvencional, uma redução ou ausência de tau-fosforilado nasplacas restantes e uma ativação marcada de microglia e em célulasgigantes multinucleadas com resíduos de β A-amilóide (13, 19). Osníveis de expressão em Western Blot foram checados porimunofluorescência de marcação dupla, Lamp-I e CD68, usado como omarcador para microglia e células gigantes multinucleadas,examinando as mesmas com um microscópio confocal (figura 9).
Discussão
Os dados mostram um aumento de Lamp-I no córtexcerebral em casos de doença de Alzheimer, os níveis de mRNA e deproteína dos quais aumentam com a progressão da referida doença.As técnicas imunohistoquímicas, de imunofluorescência de marcaçãodupla e de microscopia confocal mostraram uma localização deLamp-I predominantemente em neurite circundando as placasamilóides. Os hidrolisados de lisossomo foram localizados emperikarion e dendritos proximais nos neurônios corticais decérebros de doença de Alzheimer, e altos níveis em placas senis(8, 9).
Há diversos estudos que sugerem que os distúrbios delisossomo promovem o deposito β A-amilóide em cérebros de doençade Alzheimer (10, 15) e que as mutações em presenilina estãoassociadas a uma patologia lisossomal neuronal acelerada (17). Aexpressão de Lamp-I está mais relacionada à neurite distrófica deplacas senis do que com depósitos amilóides difusos, embora oprocesso de imunoreatividade de Lamp-I ainda ocorra em placascorticais difusas, no cerebelo e em placas estriadas difusas (9).Neste sentido, deve ser observado que os dendritos e as sinapsesem doença de Alzheimer contêm um maior número de lisossomos (12).
Catepsina D também esteve envolvida na degradação daproteína tau, sugerindo um papel dos lisossomos na degradação dosentrelaçamentos neurofibrilares em doença de Alzheimer (13). Comrelação a isto, os camundongos transgênicos com uma mutaçãotripla na proteína Tau mostram um aumento no número de lisossomosmostrando uma morfologia aberrante, assim como depósitos de Tauhiperfosforilados nos neurônios corticais e no hipocampo (14). Osreferidos dados sugerem que as anormalidades lisossomais podemser a razão para a degeneração dos neurônios com depósitos de Tauhiperfosforilados.
Os resultados mostram uma relação inversa entre aexpressão de Lamp-I e o depósito de Tau hiperfosforilado emneurônios corticais com entrelaçamentos neurofibrilares em doençade Alzheimer, embora a imunoreatividade marcada foi encontrada emneurônios com degeneração granulovacuolar.
O estudo do caso de doença de Alzheimer comencefalite após imunização com β A apresenta dados reveladores.Os estudos neuropatológicos em um número limitado de casos mostrauma carga amilóide reduzida e placas amilóides reduzidas juntocom uma ativação da microglia e com a presença de célulasgigantes multinucleadas cheias de resíduos amilóides; proteínaTau hiperfosforilada não foi observada em placas colabadas,embora os neurônios com entrelaçamentos neurofibrilares nãotenham sido afetados (11, 16) . A imunoreatividade de Lamp-I nãofoi observada no processo neuronal após a imunização com β A, masa mesma foi observada em células microglias ativadas e em célulasgigantes multinucleadas contendo amilóide e resíduos celulares.
Tabela I: Dados clínicos e patológicos principais do estudo.
Estágios de doença de Alzheimer de acordo com a classificação eos controles de Braak e Braak; M = macho, F = fêmea; NFT =entrelaçamentos neurofibrilares.<table>table see original document page 23</column></row><table>
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Claims (18)

1. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer, caracterizado pelo fato que compreende:- determinar o nível de expressão de um gene quecodifica um marcador de lisossomo em uma amostra biológica, e- comparar o referido nível de expressão com umvalor de referência no qual a alteração do referido nível éindicador de doença de Alzheimer.
2. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato que o gene que codifica o marcador delisossomo é Lamp-I.
3. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato que o gene que codifica o marcador delisossomo é Lamp-2.
4. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 3, caracterizado pelo fato que o gene que a amostra biológicaé um tecido.
5. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 3, caracterizado pelo fato que o gene que a amostra biológicaé um fluido corporal.
6. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato que o fluido compreende fluido cérebro-espinhal.
7. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 3, caracterizado pelo fato que o gene que a determinação donivel de expressão do gene que codifica um marcador de lisossomoé realizado por meio de medir a quantidade de mRNA codificadopelo referido gene ou fragmentos dos mesmos.
8. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato que a medição da quantidade de mRNA érealizada por meio de amplificação de RT-PCR.
9. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato que a medição da quantidade de mRNA érealizada por meio de biochips de DNA.
10. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com qualquer uma das reivindicações- 1 a 3, caracterizado pelo fato que o gene que a determinação donivel de expressão do gene que codifica um marcador de lisossomoé realizado por meio de medir a quantidade de proteína codificadapelo referido gene e/ou fragmento do mesmo.
11. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato que a medição da quantidade de proteína érealizada por meio de Western Blot.
12. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato que a medição da quantidade de proteína érealizada por meio de chips de proteína.
13. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato que a medição da quantidade de proteína érealizada por meio de imunohistoquímica.
14. Kit para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer, caracterizado pelo fato que compreende osreagentes necessários para a determinação do nível de expressãodo gene que codifica um marcador de lisossomo de acordo comqualquer uma das reivindicações de 1 a 3.
15. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato que a determinação do nível deexpressão do gene que codifica um marcador de lisossomo érealizado por meio de uma substância que indica a ligação dasubstância especificamente ao mRNA ou à proteína que codifica oreferido gene.
16. Método para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato que o nível de expressão do marcador delisossomo é determinado por meio de imagens.
17. Kit para o diagnóstico e/ou prognóstico dedoença de Alzheimer, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 a 16, caracterizado pelo fato que compreendeuma substância reportadora que se liga especificamente ao RNA oua proteína codificada pelo referido gene, onde a referidasubstância reportadora é marcada com uma marcação que pode serdetectada por meio de um método de detecção, e um fluido veículofisiologicamente aceitável.
18. Uso de pelo menos um gene que codifica ummarcador de lisossomo, caracterizado pelo fato de ser selecionadoa partir de Lamp-1 e Lamp-2 como um marcador genético para odiagnóstico de doença de Alzheimer.
BRPI0614076-9A 2005-05-16 2006-05-17 método e kit para o diagnóstico e/ou prognóstico de doença de alzheimer e uso de pelo menos um gene que codifica lamp-1 BRPI0614076A2 (pt)

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