ES2301280A1 - Metodo para diagnosticar la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

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Abstract

Método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. La presente invención se refiere a un método para diagnosticar y/o pronosticar la enfermedad de Alzheimer mediante la determinación del nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal. (Ver figura)

Description

Método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.
Campo de la invención
La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, principalmente aquel relacionado con las enfermedades neurodegenerativas, en concreto está dirigida a métodos de diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer.
Antecedentes de la invención
La enfermedad de Alzheimer (EA) está considerada como la principal causa de demencia, siendo ésta la cuarta causa de muerte en países desarrollados (1). Se define como un padecimiento neurodegenerativo del sistema nervioso central y se caracteriza por un deterioro progresivo de las funciones cerebrales superiores.
Microscópicamente la EA se caracteriza por la presencia de placas seniles (difusas y clásicas), ovillos neurofibrilares, hilos del neurópilo, degeneración neuronal, depósitos de la proteína \betaA-amiloide, degeneración gránulo-vacuolar y presencia de cuerpos de Hirano, entre otras patologías (2).
Para diagnosticar la EA se utilizan unos criterios clínicos bien establecidos por la cuarta edición del manual de diagnóstico y estadístico de la sociedad Americana de Psiquiatría (DSM-IV) (3) o por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos, Alteraciones de la Comunicación, Ictus y Enfermedad de Alzheimer y Enfermedades Asociadas (NINCDS-ADRDA) (4) (National Institute of Neurologic, Communicative Disorders and Stroke - Alzheimer's Disease and Related Disorders Association). Sin embargo, el mayor dilema de estos estudios clínicos es la certeza diagnóstica. Actualmente la única manera de confirmar el diagnóstico clínico es haciendo un análisis post-mortem en tejido cerebral para encontrar la existencia de placas y ovillos neurofibrilares.
En los últimos años, se han estudiado distintos marcadores genéticos para su aplicación en el diagnóstico de EA como son:
-
determinación de mutaciones en el gen de la proteína precursora amiloide (PPA), mutaciones en el gen de la presenilina-1 (PSI) y presenilina-2 (PS2), únicamente válidos para un número reducido de casos de EA de aparición precoz o familiar (5).
-
valor genético del genotipo ApoE, que se determina tan sólo en aquellos casos en los que se cumplen los criterios clínicos de EA probable, el problema es que da un número elevado de falsos positivos.
Además de estos marcadores genéticos, existen marcadores bioquímicos como:
-
la proteína Tau: esta proteína se determina mediante anticuerpos neuronales capaces de detectar la tau en el líquido cefalorraquídeo, sin embargo los niveles de tau en EA no guardan relación con la edad, sexo, evolución de la enfermedad, ni con el grado de demencia, además de detectarse niveles elevados de tau en otras patologías como meningitis, infiltraciones meníngeas, demencias frontales y Creutzfeldt-Jacob.
-
la proteína \betaA-amiloide: esta proteína carece de utilidad diagnóstica en las formas esporádicas de la EA (6).
Actualmente no se dispone todavía de ningún instrumento diagnóstico escasamente invasivo y con adecuada sensibilidad, especificidad y valor predictivo para la Enfermedad de Alzheimer. Además esta enfermedad conlleva un enorme coste social debido, entre otros, a la incapacidad de los pacientes de valerse por sí mismos, por lo que existe la necesidad de un método de diagnóstico fiable mediante marcadores que permita prevenir la enfermedad, mejorar el tratamiento y pronosticar la evolución de la enfermedad.
Breve descripción de la invención
La presente invención proporciona un método para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer mediante la determinación del nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal. El marcador lisosomal es preferiblemente Lamp-1 o Lamp-2.
Un aspecto particular de la invención lo constituye un método para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer mediante la determinación del nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal en una muestra biológica y la comparación de dicho nivel con un valor de referencia, donde la alteración de dicho nivel es indicativo de la Enfermedad de Alzheimer y del estadio de dicha enfermedad.
"Valor de referencia" en la presente invención designa unos niveles de mRNA y de proteína codificada por el gen marcador lisosomal presentes en un individuo sano que no sufre EA ni otras enfermedades que afecten a los niveles de mRNA ni de proteína codificada por el gen marcador lisosomal.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el gen que codifica el marcador lisosomal es preferiblemente Lamp-1 o Lamp-2.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la muestra biológica comprende un tejido, preferentemente dicho tejido es un homogeneizado de tejido, preferiblemente el homogeneizado de tejido se obtiene a partir de células de tejido nervioso o células neuroendocrinas periféricas.
De acuerdo con otra realización preferida de la invención, la muestra biológica es un fluido biológico, preferentemente dicho fluido biológico comprende líquido cefalorraquídeo, sangre o suero.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante el análisis de la cantidad de RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo. El gen que codifica el marcador lisosomal es preferiblemente Lamp-1 o Lamp-2.
Preferentemente, el análisis de la cantidad de RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo se realiza mediante amplificación, utilizando oligonucleótidos específicos para PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación de cDNA que permita una estimación cuantitativa de los niveles del trascrito del marcador lisosomal.
Preferentemente, el análisis de la cantidad de RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo se realiza mediante biochips de DNA realizados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo conocido por un experto medio en la materia o sintetizados in situ mediante fotolitografía o mediante cualquier otro mecanismo conocido por un experto medio en la materia.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante el análisis de la cantidad de proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma. El gen que codifica un marcador lisosomal es preferiblemente Lamp-1 o Lamp-2.
Preferentemente, el análisis de la cantidad de proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma se realiza mediante Western-blot.
Preferiblemente, el análisis de la cantidad de proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma se realiza mediante chips de proteína utilizando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos contra el marcador lisosomal o mediante perfiles proteicos realizados por espectrometría de masas o por cualquier otro mecanismo que permita una estimación cuantitativa de los niveles de proteína o del marcador lisosomal.
Preferiblemente, el análisis de la cantidad de proteína codificada pro dicho gen o fragmentos de la misma se realiza mediante técnicas inmunohistoquímicas.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante análisis de imagen.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante análisis de imagen a partir de la cuantificación sobre imágenes inmunohistoquímicas. Ejemplos de métodos de cuantificación incluyen, pero no se limitan a, morfometría, densitometría e intensidad de fluorescencia.
Un aspecto particular de la invención lo constituye un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo la determinación del nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal, preferiblemente para determinar el nivel de expresión de Lamp-1 o Lamp-2. El kit permite llevar a cabo el método según la invención que se acaba de describir.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado por el gen marcador lisosomal mediante amplificación.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de RNA codificado pro el gen marcador lisosomal mediante biochips de DNA.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada por el gen marcador lisosomal mediante Western-blot.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada por el gen marcador lisosomal mediante chips de proteína.
Preferiblemente el kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada por el gen marcador lisosomal. Preferentemente comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de proteína codificada por el gen marcador lisosomal mediante técnicas inmunohistoquímicas.
De acuerdo con una realización preferida de la invención la determinación del nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante una sustancia indicadora que se une específicamente al RNA o a la proteína codificados por dicho gen.
"Sustancia indicadora" en la presente invención se refiere a un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un oligonucleótido, una macromolécula, una molécula orgánica o, en general, cualquier sustancia que pueda unirse específicamente al RNA o a la proteína codificados por el gen que codifica un marcador lisosomal. Dicha sustancia indicadora comprende un marcaje que puede ser un enzima, un radioisótopo, un colorante, un compuesto fluoresecente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un quelato metálico o, en general, cualquier marcaje conocido en el estado de la técnica que pueda detectarse mediante un método de detección.
Un aspecto particular de la invención lo constituye un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de la Enfermedad de Alzheimer que comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal que comprende una composición que contiene una sustancia indicadora que se une específicamente al RNA o a la proteína codificados por dicho gen, donde dicha sustancia indicadora está marcada con un marcador detectable y un líquido fisiológicamente aceptable.
Un aspecto particular de la invención lo constituye el uso de al menos un gen que codifica una marcador lisosomal seleccionado entre Lamp-1 y Lamp-2, como marcador genético para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer.
Otros aspectos de la invención se harán aparentes para el experto medio en la materia.
Descripción de las figuras
Figura 1: A: Amplificación de Lamp-1 usando diluciones sucesivas de RNA de cerebros humanos control. La línea horizontal representa la línea umbral ajustada manualmente en la fase exponencial. La intensidad de fluorescencia incrementa con el aumento de los ciclos PCR. El número de ciclos PCR en los cuales la intensidad de fluorescencia excedió la línea umbral se definió como el valor de CT en el cual se basó la cuantificación relativa. B: Curvas estándar representativas para \beta-actina y Lamp-1 construidas a partir de varias concentraciones de RNA de cerebros humanos control. Los valores CT (eje Y) frente al logaritmo de la concentración de RNA de las muestras control (eje X) mostraban una correlación lineal inversa.
Figura 2: A: Niveles de mRNA de Lamp-1 (media \pm SEM) en la corteza frontal de las muestras control (C, n = 4), seis casos de EA estadios I-IIA/B (según Braak and BraaK) (ADI, n = 6), y cinco casos de EA estadios V-VIC (ADV, n = 5). Los niveles de mRNA de Lamp-1 fueron normalizados con \beta-actina.
B: Niveles de mRNA de Lamp-1 normalizados con \beta-actina y GUS en la corteza frontal de una única muestra (3 h post-mortem). Las muestras fueron congeladas directamente en nitrógeno líquido (0 h) o dejadas a temperatura ambiente durante 3, 6 o 22 horas y luego congeladas en nitrógeno líquido. No hay degradación aparente del mRNA hasta las 22 h. *p<0.05 comparada con las muestras control (ANOVA con post-hoc LSD test).
Figura 3: Lamp-1 (aproximadamente 125 KDa) tal y como se detectó mediante Western Blot en homogenizados de la corteza frontal (área 8). La \beta-actina es utilizada como control de carga de proteína. La imagen es representativa de todas las muestras indicadas en la Tabla I. Los análisis densitométricos de los niveles de proteína Lamp-1 (media \pm SEM) fueron realizados con el software TotalLab v2.01. Los valores de proteína Lamp-1 se normalizaron con \beta-actina ***p<0.001 comparados con las muestras control (ANOVA con post-hoc LSD test); n.s.; diferencias no significativas cuando se comparó con los controles.
Figura 4: Análisis de la imagen de la inmunorreactividad Lamp-1 en la corteza frontal (A-E) y en hipocampo (F) en control (A, B) y en los casos EA (estadios VC) (C-F). Se encontró una inmunorreactividad Lamp-1 moderada en el citoplasma de neuronas con EA. Los ovillos neurofibrilares no se tiñeron con anticuerpos Lamp-1 (D, E). Las neuronas con degeneración granulovacuolar presentaban una inmunorreactividad Lamp-1 fuerte. A y C línea en C = 50 \mum. B, D-F, línea en F = 25 \mum.
Figura 5: El análisis de imagen de la inmunorreactividad Lamp-1 indicó que se localizaba además de en las neuronas, en el proceso celular que rodea los depósitos amiloides en las placas seniles (A-D).
Línea = 50 \mum.
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Figura 6: Análisis de imagen de la inmunofluorescencia de doble marcaje para Lamp-1 (A, D) y para Tau-Fosforilada (anticuerpo AT8, B, E), en EA (superposición C y F). La mayoría de las neuronas con depósitos de proteína Tau-fosforilada muestran una baja expresión de Lamp-1, mientras que sólo algunas neuronas con una inmunorreactividad Lamp-1 fuerte presentan depósito de proteínas Tau-fosforilada (A, B, y D, E). Las secciones control teñidas únicamente con anticuerpos secundarios fueron negativas (G-I).
Figura 7: Análisis de imagen de la inmunofluorescencia de doble marcaje para Lamp-1 (A, D, G) y para \betaA-amiloide (B, E, H), y microscopia confocal (superposición C, F). Se encontraron depósitos inmunoreactivos Lamp-1 alrededor de las placas amiloides (A-C). La inmunorreactividad Lamp-1 aparece con condensación \betaA-amiloides en las placas seniles. Pocos o ningún perfil inmunoreactivo Lamp-1 aparecen en las placas difusas (D-F), mientras que el proceso inmunoreactivo Lamp-1 incrementa en las placas con núcleos amiloides (G-I). Las secciones control teñidas únicamente con anticuerpos secundarios fueron negativas (J-L).
Figura 8: A: Niveles de proteína Lamp-1, analizados por Western blot, en la corteza cerebral en el caso de EA con encefalitis tras la inmunización con péptido \betaA. No se observaron diferencias en los niveles de expresión cuando se compararon con EA estadio V-VI/C.
B: El análisis de imagen de la inmunorreactividad Lamp-1 indicó que principalmente aparecía en las células microgliales que rodean los depósitos colapsados amiloides (A-C) y en células gigantes multinucleadas (D-F), siendo el resultado de la fagocitosis de los restos \betaA-amiloide.
A y B, línea en B = 50 \mum, C-F, línea en F = 25 \mum.
Figura 9: Análisis de imagen de la inmunofluorescencia de doble marcaje para Lamp-1 (A, D) y para CD68 (B, E), y microscopia confocal (superposición, C, F) en el caso EA con encefalitis tras la inmunización con el péptido \betaA. Se encontró inmunorreactividad Lamp-1 en células microgliales y en células gigantes multinucleadas (A-F). Las secciones control teñidas únicamente con anticuerpos secundarios fueron negativas (G-I).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un método de diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer de forma sencilla y fiable, de gran importancia para un diagnóstico temprano de la enfermedad y para valorar la evolución del paciente con EA.
Se realizó un experimento en el que se compararon los niveles de expresión del mRNA de Lamp-1 y de la proteína en muestras cerebrales de pacientes con EA y muestras cerebrales control.
Las muestras de cerebro se obtuvieron por autopsia de 11 pacientes con EA y 4 controles. Se pidió el consentimiento informado de los pacientes o de sus familiares y el estudio fue aprobado por los comités de ética.
El tiempo entre la muerte y el procesamiento del tejido fue de 2-10 horas. La mitad del cerebro fue cortado en secciones coronales de 1 centímetro de espesor, y se congelaron en hielo seco a -80ºC hasta su uso.
Para los exámenes morfológicos, los cerebros fueron fijados por inmersión en un tampón de formalina al 10% durante dos o tres semanas.
El estudio neuropatológico fue llevado a cabo en secciones de parafina sin cera de 4 \mum de espesor del frontal (área 8), motor primario, sensor primario, parietal, temporal superior, temporal inferior, cingulado anterior, insular anterior y córtice primario y asociativo visual; cortex entorinal e hipocampo; caudado, putamen y pallidum; tálamo medio y posterior; subtálamo; núcleo de Meynert; amígdala; mesencéfalo, pons y bulbo; y cortex cerebelar y núcleo dentado.
Las secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina, azul oscuro luxol con el método Klüver Barrera y para inmunohistoquímica de las proteínas ácidas de las fibras gliales, CD 68 y lecitina de tomate para microglia, \betaA-amiloide, pan-tau, tau fosforilada específicamente Thrl8l, Ser202, Ser214, Ser262, Ser396 y Ser422 y \alphaB-cristalina, \alpha-sinucleína y ubiquitina.
Los estados de AD fueron establecidos de acuerdo con la carga de depósito amiloide y según la patología neurofibrilar siguiendo la clasificación de Braak and Braak (7):
Estado A: depósitos iniciales en el neocortex basal
Estado B: depósitos extendidos en áreas asociadas a neocortex
Estado C: fuertes depósitos en todo el cortex
I-II: estados patología neurofribrilar en transentorinal
III-IV: límbico
V-VI: neocortical
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6 pacientes fueron catalogados como AD I-IIA/B, y 5 como AD V-VIC. Los principales datos clínicos y neuropatológicos están resumidos en la Tabla 1. Estos pacientes no presentaron ninguna patología asociada (vasculares, sinucleinopatías). Se incluyó en el estudio el cerebro de un caso de AD que presentó encefalitis post inmunización con péptido amiloide (11) con propósitos comparativos.
Además se incluyeron muestras de corteza frontal de un control individual, estas muestras se obtuvieron a las 3 horas post-mortem unas fueron congeladas inmediatamente y otras se almacenaron a 4ºC durante 3 horas, 6 y 22 horas y después se congelaron para limitar el retraso variable post-mortem en los tejidos procesados y su efecto en la preservación del mRNA de Lamp-1.
Una vez preparadas las muestras, se procedió a la determinación tanto del mRNA de Lamp-1 como de la proteína, y se realizaron estudios bioquímicos, inmunohistoquímicos y microscópicos como se describe en los ejemplos. Las muestras de cerebros control y enfermos fueron procesados en paralelo. Los resultados de estos estudios demuestran que existe un incremento de los niveles de expresión del mRNA de lamp-1 y de la proteína en la corteza cerebral en estadios de EA avanzados. Además Lamp-1 está localizado en el citoplasma de las neuronas y en neuritas distróficas que rodean las placas seniles.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar pero no limitar la presente invención.
Ejemplo 1 Aislamiento de mRNA y confirmación de los resultados por Síntesis de cDNA Y PCR TaqMan
El RNA total se aisló usando Trizol Reagent® (Life Technologies) seguido por RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen). Los tejidos cerebrales humanos congelados fueron directamente homogenizados en 1 ml de Trizol por 100 mg de tejido. El RNA total fue extraído siguiendo el protocolo sugerido por el proveedor. A continuación el RNA total purificado se resuspendió en 100 \mul de agua libre de RNasa, el mRNA se purificó siguiendo el protocolo de RNeasy Protect Mini Kit con mínimas modificaciones. El tratamiento con DNasa se descartó debido a la eliminación del DNA genómico durante la extracción con Trizol. La concentración de cada muestra se midió a A_{260}, y se confirmó la integridad del RNA mediante electroforesis en gel formaldehído-agarosa.
A continuación se realizó la síntesis de cDNA y PCR TaqMan. Para cada 100 \mul de reacción de transcripción reversa, se mezclaron 2 \mug de RNA humano con hexámeros random 2.5 \muM, buffer RT TaqMan 1x, 5.5 mM MgCl_{2}, 500 \muM de cada dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 0.4 U/\mul de inhibidor de RNasa y 1.25 U/pl de transcriptasa reversa MultiScribe (Applied Biosystems). Las reacciones se llevaron a cabo a 25ºC durante 10 minutos para maximizar la unión del RNA molde al cebador, seguido de 30 min. a 48ºC y después por incubación durante 5 min. a 95ºC para desactivar la transcriptasa reversa. Para comprobar el grado de contaminación por DNA genómico, se realizaron reacciones paralelas para cada muestra de RNA en ausencia de transcriptasa reversa MultiScribe.
La sonda TaqMan (Applied Biosystems) se une a la hebra de DNA molde entre los cebadores directo y reverso. La sonda contiene un colorante indicador que es liberado por la Taq polimerasa durante la amplificación, por lo que la fluorescencia originada será proporcional a la cantidad de producto acumulado.
Como controles internos se utilizaron la \beta-actina y la \beta-glucuronidasa (GUS). Los cebadores y las sondas fluorescentes específicas para Lamp-1, GUS y \beta-actina se adquirieron de Taq-Man Gene Expression Assays (Applied Biosystems).
Los ensayos TaqMan PCR para Lamp-1 y para los controles internos se realizaron por triplicado sobre muestras de cDNA en placas de 96 pocillos sobre un sistema ABI Prism 7700 Sequence Detection (PE Applied Biosystem). Por cada 20 \mul de reacción TaqMan, 9 \mul de cDNA (diluido 1/50, correspondiente aproximadamente a 4 ng de RNA) fue mezclado con 1 \mul 20x TaqMan Gene Expression Assays y 10 \mul de 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem). Se llevaron a cabo ensayos paralelos para cada muestra usando cebadores y sondas con \beta-actina y GUS para la normalización. La reacción fue llevada a cabo usando los siguientes parámetros: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos y 40 ciclos a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Las curvas estándar fueron preparadas para Lamp-1 y para cada control interno usando diluciones en serie de muestras control de RNA humano. Finalmente los datos TaqMan PCR fueron capturados usando el Sequence Detector Sotware (SDS versión 1.9; Applied Biosystem).
El incremento de los niveles de mRNA de Lamp-1 fueron confirmados mediante ensayos PCR TaqMan con las muestras de cerebro control y con EA. EL ABI 7700 mide la acumulación de fluorescencia de los productos PCR por monitorización continua del umbral del ciclo (Ct) que es un valor arbitrario asignado manualmente a un nivel por encima de la línea de base, en la fase exponencial de la PCR donde no hay ningún componente limitante. El valor Ct establece el punto en el que la amplificación de la muestra cruza el umbral (Figura 1A). Para cada muestra, la cantidad de diana y de controles internos se determinaron a partir de las curvas estándar que fueron trazadas mostrando el Ct (Y) frente al log de los ng de RNA control total. La cantidad de cada diana Lamp-1 fue dividida por la cantidad de los controles internos para obtener un valor de diana normalizado que permitió la determinación de los niveles relativos de mRNA de Lamp-1 en las muestras control y en las muestras patológicas. Los niveles de los controles internos usados para normalizar los valores de mRNA de Lamp-1 no estaban modificados en las muestras patológicas en comparación con los controles y además eran similares entre las distintas patologías.
Los resultados mostraron un incremento relativo de los niveles del mRNA de Lamp-1 en la corteza frontal en EA perteneciente a los estados V-VIC cuando se compararon con los controles: p<0.05, ANOVA con el test LSD (post-hoc Fisher's least significant difference) (Figura 2A). Los niveles de mRNA de Lamp-1 en la corteza frontal, no estaban modificados en los estadios tempranos de EA (Estados I-TIA/B) (Figura 2A) en comparación con los valores control.
Ejemplo 2 Gel de electroforesis y Western blotting
Las muestras congeladas de corteza frontal (área 8, 100 mg) fueron directamente homogeneizadas en 1 ml de tampón de Tisis (20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl_{2}, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mN DDT, 2 mM PMSF, 1 \mug/ml aprotinina, leupeptina y pepstatina) y sometidos a sonicación. Los lisados se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC y se determinó la concentración de proteínas mediante el método BCA (Pierce). 50 \mug de proteínas totales se sometieron a 95ºC y a continuación se cargaron en geles SDS-poliacrilamida con un tampón de elución Tris-glicina.
Las proteínas fueron sometidas a electroforesis usando un sistema Mini-Protean (Bio-Rad) y transferidas a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) con un Mini Trans Blot electrophoresis transfer cell (Bio-Rad) durante 1 hora a 100 V. Las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas con Tween 20 TBS (TBST), que contenía el 5% de leche desnatada, durante 30 minutos. A continuación las membranas se incubaron a 4ºC durante toda la noche con uno de los anticuerpos primarios en TBST con 3% de BSA. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-Lamp-1 (H-228, sc-5570, Santa Cruz) dilución 1:1000, anticuerpo anti-\beta-actina (clon AC-74, Sigma) dilución 1:5000. Después de la incubación con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron tres veces con TBST durante 5 minutos a temperatura ambiente y a continuación se incubaron con anticuerpos anti-IgG de conejo y de ratón marcados con peroxidasa de rábano (Dako) dilución 1:1000 (1:5000 para \beta-actina) durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente las membranas se lavaron 4 veces, 5 minutos cada vez con TBST a temperatura ambiente y reveladas con el sistema por quimioluminiscencia ECL Western blotting system (Amersham/Pharmacia) a continuación se expusieron las membranas a películas autorradiográficas (Hyperfilm ECL, Amersham).
La cuantificación densitométrica de las bandas de Western Blot se realizó mediante el software TotalLab v2.01. Para el análisis estadístico se utilizó el software Statgraphics Plus v5.
Los resultados mostraron que los niveles de proteína Lamp-1, al igual que los niveles de mRNA de Lamp-1, estaban aumentados en la corteza frontal en los estadios de EA V-VIC (p<0.001, ANOVA con el test LSD), pero no estaban aumentados en los estadios de EA tempranos I-IIA/B en comparación con las muestras control (Figura 3).
Ejemplo 3 Inmunohistoquímica
Las secciones sin cera de 5 \mum de espesor de la corteza frontal, hipocampo y corteza entorinal se procesaron para la inmunohistoquímica siguiendo el método estreptavidina-biotina peroxidasa (LSAB). Después de la incubación con metanol y H_{2}O_{2} en PBS y suero normal, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-Lamp-1 (Santa Cruz) en una dilución 1:100. Después de la incubación con el anticuerpo primario, las secciones se incubaron con LASB durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción peroxidasa se visualizó con diaminobenzidina y H_{2}O_{2}. El control de la inmunotinción incluyó la omisión del anticuerpo primario, no se obtuvo señal siguiendo la incubación con el anticuerpo secundario exclusivamente. Las secciones fueron ligeramente teñidas con hematoxilina.
La inmunorreactividad moderada de Lamp-1 caracterizada por pequeños gránulos citoplasmáticos, se encontró en neuronas y células microgliales en muestras control (Figura 4A, B), mientras que en neuronas corticales en EA, se encontró un incremento de la inmunorreactividad de Lamp-1 (Figura 4C). Curiosamente, este incremento no estaba asociado a la patología NFT en neuronas individuales, ya que no se encontró inmunorreactividad de Lamp-1 en los ovillos (Figura 4D, E). También se encontró un incremento de la inmunorreactividad Lamp-1 en neuronas con degeneración granulovacuolar en el hipocampo (Figura 4F), y una fuerte inmunorreactividad de Lamp-1 en las células de las placas neuríticas (Figura 5), siendo limitada en la corteza frontal de EA estadios I-IIB (caso 8), pero fue muy visible en la corteza frontal de EA estadios V/VIC.
Ejemplo 4 Inmunofluorescencia de doble marcaje y microscopio confocal
Las secciones sin cera de la corteza frontal fueron teñidas con una solución saturada de negro sudan B (Merck) durante 30 minutos para bloquear la autofluorescencia de los gránulos de lipofuscina presentes en los cuerpos de las neuronas, aclarados en etanol al 70% y lavados con agua destilada. Las secciones fueron incubadas a 4ºC durante toda la noche con un anticuerpo policlonal anti-Lamp-1 de ratón (Santa Cruz) usando una dilución 1:100 y el anticuerpo monoclonal \betaA-amiloide (Dako) dilución 1:50, anticuerpo anti-AT8 de ratón (Innogenetics, Gent) dilución 1:50, o CD68 (Dako) dilución 1:100. A continuación las secciones se lavaron en PBS, y se incubaron en oscuridad con el cóctel de anticuerpos secundarios y diluidos en la misma solución transportadora que los anticuerpos primarios durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios fueron: Alexa488 de conejo (verde) y Alexa 546 de ratón (rojo) (ambos de Molecular Probes, OR) en dilución 1:400. Después del lavado con PBS las secciones fueron montadas en medio Immuno Fluore mounting (ICN Biomedicals, Barcelona) selladas y secadas toda la noche. Las secciones fueron examinadas con el microscopio confocal Leica TCS-SL.
La ausencia de co-localización de la expresión de Lamp-1 y degeneración neurofibrilar, tal como se puso de manifiesto con el anticuerpo AT8, fue también demostrado con inmunofluorescencia de doble marcaje y microscopia confocal. Las neuronas que mostraban una inmunorreactividad fuerte Lamp-1, presentaban unos depósitos bajos de la proteína tau-fosforilada inmunoreactiva, mientras que las neuronas de las placas neurofibrilares mostraban una inmunorreactividad baja Lamp-1 (Figura 6).
La fuerte inmunorreactividad asociada a las placas estaba restringida al proceso celular que rodeaba las zonas centrales del amiloide, tal como fue revelado en las secciones inmunoteñidas con Lamp-1 y \betaA-amiloide. La inmunorreactividad de Lamp-1 fue raramente observada en asociación con las placas difusas, aunque aparece un poco de inmunorreactividad en procesos de condensación de la (3A-amiloide (Figura 7).
Inmunorreactividad de Lamp-1 en EA con encefalitis tras inmunización con \betaA.
Pacientes EA con encefalitis tras inmunización con \betaA mostraron una carga amiloide cerebral reducida comparados con enfermos EA convencionales, una reducida o ausente tau-fosforilada en el resto de las placas y una marcada activación de la microglia y en células gigantes multinucleadas con restos \betaA-amiloide (13). Los niveles de expresión en Western blot fueron similares en este caso a los EA convencionales (Figura 8A).
Sin embargo, en línea con las observaciones neuropatológicas, la inmunoreactividad lamp-1 se encontró en células microgliales que rodean las placas \betaA-amiloides densas y en células gigantes multinucleares (Figura 8B).
Las pruebas de expresión de Lamp-1 fueron comprobadas pro inmunofluorescencia de doble marcaje Lamp-1 y CD68, usado como marcador de microglia y células gigantes multinucleadas examinándolas con microscopio confocal (Figura 9).
Discusión
Los datos muestran un aumento de Lamp-1, en la corteza cerebral en los casos de EA, cuyo mRNA y niveles de proteína se incrementan con la progresión de dicha enfermedad. Técnicas inmunohistoquímicas, inmunofluorescencia de doble marcaje y microscopio confocal mostraron una localización de Lamp-1 predominantemente en neuritas que rodean las placas amiloides. Las hidrolasas lisosomales se localizaron en pericarion y dendritas proximales en neuronas corticales de cerebros EA, y en niveles altos en las placas seniles (8, 9).
Existen varios estudios que sugieren que las perturbaciones lisosomales promueven el depósito \betaA-amiloide en los cerebros EA (10, 15) y que las mutaciones en la presenilina están asociadas con una patología lisosomal neuronal acelerada (17). La expresión de Lamp-1 está más relacionada con las neuritas distróficas de las placas seniles que con los depósitos difusos amiloides, aunque el proceso de inmunorreactividad de Lamp-1 también ocurre en las placas corticales difusas, en cerebelo y placas difusas estriatales (9). En esta línea, hay que anotar que las dendritas y sinapsis en EA contienen el número de lisosomas incrementado (12).
La catepsina D se ha implicado también en la degradación de la proteína Tau, sugiriendo un papel de los lisosomas en la degradación del ovillo neurofibrilar en EA (13). En relación a esto, ratones transgénicos con triple mutación en la proteína Tau, muestran un incremento en el número de lisosomas que muestran una morfología aberrante, así como un depósito de Tau hiperfosforilada en neuronas corticales y del hipocampo (14). Estos datos sugieren que las anormalidades lisosomales pueden ser causa de la degeneración en neuronas con depósitos de Tau hiperfosforilada.
Los resultados muestran una relación inversa entre la expresión de Lamp-1 y el depósito de Tau hiperfosforilada en neuronas corticales con ovillos neurofibrilares en EA, aunque se encontró una inmunorreactividad marcada en las neuronas con degeneración granulovacuolar.
El estudio del caso de EA con encefalitis tras la inmunización con \betaA muestra datos relevantes. Estudios neuropatológicos en un limitado número de casos muestran una reducida carga amiloide y placas amiloides disminuidas junto con una activación de la microglia y con la presencia de células gigantes multinucleadas llenas de restos amiloides; la proteína Tau hiperfosforilada no se observó en placas colapsadas, aunque las neuronas con ovillos neurofibrilares no están afectadas (11, 16). La inmunoreactividad Lamp-1 no se encontró en el proceso neuronal tras la inmunización con \betaA, pero si se encofró en células microgliales activadas y en células gigantes multinuceladas que contenían restos amiloides y celulares.
TABLA I Principales datos clínicos y patológicos del estudio. Estadios de la EA según la clasificación de Braak and Braak, y controles; M: Hombres, F: mujeres; NFT: ovillos neurofibrilares
1
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Claims (18)

1. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA que comprende:
-
determinar el nivel de expresión de un gen que codifica un marcador lisosomal en una muestra biológica
-
comparar dicho nivel de expresión con un valor de referencia
donde la alteración de dicho nivel es indicativo de EA.
2. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según la reivindicación 1, donde el gen que codifica un marcador lisosomal es Lamp-1.
3. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según la reivindicación 1, donde el gen que codifica un marcador lisosomal es Lamp-2.
4. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la muestra biológica comprende un tejido.
5. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la muestra biológica es un fluido.
6. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según la reivindicación 5, donde el fluido comprende líquido cefalorraquídeo.
7. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosoma se realiza mediante el análisis de la cantidad de RNA codificado por dicho gen o fragmentos del mismo.
8. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según la reivindicación 7, donde el análisis de la cantidad de RNA se realiza mediante amplificación.
9. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según la reivindicación 7, donde el análisis de la cantidad de RNA se realiza mediante biochips de DNA.
10. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de la EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante el análisis de la cantidad de proteína codificada por dicho gen y/o fragmentos de la misma.
11. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de EA según la reivindicación 10, donde el análisis de la cantidad de proteína se realiza mediante Western Blot.
12. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de EA según la reivindicación 10, donde el análisis de la cantidad de proteína se realiza mediante chips de proteína.
13. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de EA según la reivindicación 10, donde el análisis de la cantidad de proteína se realiza mediante inmunohistoquímica.
14. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico de EA que comprende los reactivos necesarios para la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de EA según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la determinación del nivel de expresión del gen que codifica un marcador lisosomal se realiza mediante una sustancia indicadora que se une específicamente al RNA o a la proteína codificados por dicho gen.
16. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de EA según la reivindicación 15, donde el nivel de expresión del gen marcador lisosomal se determina mediante imagen.
17. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico de EA según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 que comprende una composición que contiene una sustancia indicadora que se une específicamente al RNA o a la proteína codificados por dicho gen, donde dicha sustancia indicadora está marcada con un marcador detectable, y un líquido portador fisiológicamente aceptable.
18. Uso de al menos un gen que codifica un marcador lisosomal seleccionado entre Lamp- 1 o Lamp-2 como marcador genético para el diagnóstico de EA.
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