BRPI0614119A2 - métodos de administração de vacina, caliciviroses de felino, e tratamentos para imunizar animais contra paraovìrus felino e herpes vìrus de felino - Google Patents

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Sing Rong
Paul Mark Guimond
Paula Munns Clare
Cassius Mcallister Tucker
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Abstract

MéTODOS DE ADMINISTRAçãO DE VACINA, CALICIVIROSES DE FELINO, E TRATAMENTOS PARA IMUNIZAR ANIMAIS CONTRA PARAOVìRUS FELINO E HERPES VìRUS DE FELINO. A presente invenção refere-se a uma vacina para imunizar gatos contra vírus de felinos. A presente invenção também refere-se a um clone de ácido nucléico que codifica a proteína de capsídeo do calicivírus de felino isolado. A presente invenção também refere-se a uma vacina viva ou morta que compreende o calicivírus de felino isolado, uma vacina de subunidade que compreende a proteína de capsídeo do calicivírus de felino isolado, uma vacina de ácido nucléico que compreende um clone de ácido nucléico do calicivírus de felino isolado, e uma vacina de vetor de vírus recombinante que compreende ácido nucléico que codifica a proteína de capsídeo do calicivírus de felino isolado. A presente invenção também refere-se a um méto- do para identificar um calicivirus de felino útil para produzir uma composição de vacina e a ensaios para diagnosticar gatos infectados com calicivírus de felino. Também descrito é um método para imunizar animais, especialmente gatos, contra doença, em particular contra calicivírus de felino (FCV). O mé- todo inclui administrar a um gato quantidades terapeuticamente eficazes da primeira e segunda vacina de FCV. A primeira vacina é administrada oralmente ou parenteralmente (por exemplo, subcutaneamente, intramuscularmente, e outros). A segunda vacina é administrada oralmente ou oronasalmente N dias seguinte à administração da primeira vacina, onde N é um número inteiro de 3 a 120, inclusive. Uma terceira administração de vacina também pode ser dada. A presente invenção também descreve métodos e materiais para tratar e imunizar animais com vacina, e em particular gatos contra ambos FPV ou Parvovírus de Felino que também foi chamado Panleucopenia ou FPL e contra outra doença, FHV ou HERPES VìRUS de Felino que também foi chamado Vírus de Rinotraqueite de Felino.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSDE ADMINISTRAÇÃO DE VACINA, CALICIVIROSES DE FELINO, E TRA-TAMENTOS PARA IMUNIZAR ANIMAIS CONTRA PARAOVÍRUS FELINOE HERPES VÍRUS DE FELINO".
CAMPO DE INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao fornecimento de modos paraadministrar várias vacinas a vários animais. Descrevem-se vários calicivírusde felino isolados (FCV). Descrevem-se métodos de apresentar vacinas deFCV para gatos. A presente invenção também refere-se aos clones de ácidonucléico que codificam calicivírus de felino. Refere-se às proteínas de capsí-deo de FCV, vacinas mortas ou vivas, uma vacina de subunidade que com-preende a proteína de capsídeo, uma vacina de ácido nucléico, e uma vaci-na de vetor de vírus recombinante que compreendem ácidos nucléicos quecodificam a proteína de capsídeo do calicivírus de felino isolado. A presenteinvenção também refere-se a um método para identificar um calicivírus defelino útil para produzir uma composição de vacina e ensaios para diagnosti-car gatos infectados com calicivírus de felino. A presente invenção tambémfornece modos para administrar vacinas de FCV novas e velhas a felinos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Calicivírus são reportados ser uma causa importante de doençaem gatos. Uma ampla variedade de sintomas é observada tal como febre,rinite, espirro, conjuntivite branda, escorrimento ocular, vesículas nas narinasexternas, mucosa oral ou sobre a língua, pneumonia, bronquite traqueal,diarréia, sensibilidade muscular, stiff gate, e hiperestesia. As infecções bac-terianas oportunistas acompanham freqüentemente infecções de FCV, o quecomplica o tratamento e a recuperação. As infecções de FCV severas po-dem levar à morte, especialmente em gatos juvenis. Deve-se notar que taissinais, embora reportadamente comuns em casos naturais, nem sempre sãoproeminentes em infecções experimentais. Parece que várias cepas decampo de calicivírus de felino (FCV) ou diferem em seu potencial causadorda doença, ou que a infecção concomitante com outros agentes influencia ossintomas da doença.As vacinas contra calicivírus de felino estiveram disponíveis du-rante mais de duas décadas. Embora numerosos sorotipos de FCV existam,descobriu-se que certas cepas, tal como F9, induzem anticorpos contra umaampla faixa de cepas de FCV. Veja J. L. Bittle & W. J. Rubic, Am. J. Vet.Res. 37:275-78 (1976). Como resultado, as vacinas mais antigas contra cali-civírus de felino empregaram uma versão modificada ou atenuada da cepade FCV-F9. Veja Patente dos Estados Unidos Ne 3.937.812 por J. L. Bittle &W. J. Rubic, que está aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Ao mesmo tempo onde as vacinas de FCV-F9 e outras vacinascomercialmente disponíveis fornecem proteção de muitos isolados de cam-po, não é verdade que estas vacinas previnem infecção de todas as cepas.Além disso, como FCV continua evoluindo, a vacina com base em FCV-F9fornece proteção contra cada vez menos isolados de campo (Lauritzen eoutros, 1997, Vet. Microbiology, 56:55-63). Além disso, médicos veterináriosexpressaram preocupações sobre a eficácia de vacinas com base em umúnico sorotipo. Na realidade, estudos de campo sugerem vacinas derivadasda cepa de FCV-F9 fornecem imunidade insuficiente contra muitas cepas decalicivírus de felino. Veja, por exemplo, N. C. Pederson e outros, FelinePract. 13(1):26-35 (1983); S. Dawson e outros, Vet. Rec. 132:346-50 (1993).Os médicos também aumentaram as preocupações sobre a administraçãode um vírus vivo modificado que pode, em algumas circunstâncias, causardoença em animais de outro modo saudáveis. Os pesquisadores reportaramque a dosagem oral inadvertida de uma vacina de FCV subcutaneamenteadministrada resultou em doença aguda. Veja, R. C. Povey, Feline Pract.7(5):12-16 (1977). Há, portanto, interesse contínuo em desenvolver uma va-cina que sozinha ou em combinação com outras vacinas, forneça a proteçãodesejada em vacinação de um gato. Foram descritos vários isolados queforam isolados de gatos e fornecem um meio de fornecer ampla proteção emgatos imunizados.
DESCRIÇÃO DE INFORMAÇÃO
DOCUMENTOS DE PATENTE DOS ESTADOS UNIDOS3937812 Fev./1976 Bittle e outros, 3944469 Mar./1976 Bittle e outros,4486530 Dez./1984 David e outros, 4786589 Nov./1988 Rounds e outros ,5169789 Dez./1992 Bernstein e outros, 5229293 Jul./1993 Matsuura e ou-tros, 5266313 Nov./1993 Esposito e outros, 5338683 Ago./1994 Paoletti eoutros, 5494807 Fev./1996 Paoletti e outros, 5559041 Set./1996 Kang e ou-tros, 5561064 Out./1996 Marquet e outros, 5580859 Dez./1996 Felgner,5585100 Dez./1996 Mond e outros, 5589384 Dez./1996 Liscombe 5589466,Dez./1996 Felgner, 5620845 Ab./1997 Gould e outros, 5656448 Ago./1997Kang e outros, 5693761 Dez./1997 Queen e outros, 5693762 Dez./1997Queen e outros, 5695928 Dez./1997 Stewart e outros, 5703055 Dez./1997Felgner, 5716784 Fev./1998 DiCesare, 5716822 Fev./1998 Wardley,5718901 Fev./1998 Wardley, 5725863 Mar./1998 Daniels e outros, 5728587Mar./1998 Kang e outros, 5800821 Set./1998 Acheson e outros, 5977322Nov./1999 Marks e outros, 6010703 Jan./2000 Maes e outros, 6355246Mar/2002 Kruger e outros, 6.534.066 B1 Mar/2003 Poul e outros.
DOCUMENTOS DE PATENTE ESTRANGEIRA0484382 Mar./1995 EP, W02004/083390.
OUTRAS PUBLICAÇÕES
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SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece cepas e refere-se aos vários calici-vírus de felino isolados (FCV). Também descreve métodos para apresentarvacinas a animais e particularmente, vacinas de FCV a gatos. A presenteinvenção também refere-se aos clones de ácido nucléico que codificam cali-civírus de felino. Refere-se às proteínas de capsídeo de FCV, vacinas vivase mortas, uma vacina de subunidade que compreende a proteína de capsí-deo, uma vacina de ácido nucléico, e uma vacina de vetor de vírus recombi-nante que compreende ácidos nucléicos que codificam a proteína de capsí-deo do calicivírus de felino isolada. A presente invenção também refere-se aum método para identificar um calicivírus de felino útil para produzir umacomposição de vacina e ensaios para diagnosticar gatos infectados com ca-licivírus de felino. A presente invenção também fornece modos para adminis-trar vacinas de FCV novas e velhas a felinos. Também descritos aqui sãométodos e materiais para tratar e imunizar animais com vacina, e em particu-lar gatos, contra ambos o FPV ou Parvovírus Felino que também foi chama-do Panleukopenia ou FPL e contra outras doenças, FHV ou HERPES VÍRUSde Felino que também foram chamados Vírus de Rinotraqueíte de Felino.Descritas abaixo são as novas combinações de vacinas, que quando apre-sentadas a um felino da maneira descrita permite liberação oral/oral esubq/oral eficaz de ambos FPV e ou vacinas de FHV.
Em particular, a presente invenção descreve as seguintes vaci-nas para imunizar gatos contra calicivírus de felino. Uma proteína de capsí-deo de FCV-21 ou uma proteína de capsídeo de FCV-21 isolada, (SEQ ID13) e seqüências que têm pelo menos cerca de 91,2%, 95% e 99% de iden-tidade. Uma vacina de DNA que compreende seqüências de ácido nucléicoque codificam para uma proteína de capsídeo de FCV-21 ou uma proteínade capsídeo de FCV-21 isolada onde o referido DNA compreende uma se-qüência (SEQ. ID 12) e seqüências que têm pelo menos cerca de 78,7%, e79,2% de identidade de seqüência e permitindo substituições conservado-ras.
Uma vacina que compreende uma proteína de capsídeo deFCV-49 ou uma proteína de capsídeo de FCV-49 isolada onde a referidaproteína de capsídeo compreende uma seqüência de proteína de cepa FCV-49 (SEQ ID 15) e seqüências que têm pelo menos cerca de 92,7%, 95% e99% de identidade; onde a referida proteína de capsídeo é fornecida emuma quantidade eficaz. Uma vacina de DNA que compreende seqüências deácido nucléico que codificam para uma proteína de capsídeo de FCV-49 ouuma proteína de capsídeo de FCV-49 isolada onde o referido DNA compre-ende uma seqüência (SEQ. ID 14) e seqüências que têm pelo menos cercade 78,9%, isto é, 79,4% (78,9 + 0,5) identidade de seqüência e permitindosubstituições conservadoras.
Uma vacina que compreende uma proteína de capsídeo deFCV-26391-4, ou uma proteína de capsídeo de FCV-26391-4 isolada, ondea referida proteína de capsídeo compreende seqüências de proteína de cepaFCV-26391-4. Uma vacina que compreende uma proteína de capsídeo deFCV-26391-4 onde a referida proteína de capsídeo compreende a seqüênciade proteína (SEQ ID 17) e seqüências que têm pelo menos cerca de 91,8%,95% e 99% de identidade. Uma vacina de DNA que compreende seqüênciasde ácido nucléico que codificam para uma proteína de capsídeo de FCV-26391-4 ou uma proteína de capsídeo de FCV-26391-4 isolada onde o refe-rido DNA compreende uma seqüência (SEQ. ID 16) e seqüências que têmpelo menos cerca de 78,4%, isto é, 78,9% (78,4 + 0,5) de identidade de se-qüência.
Uma vacina onde o polinucleotídeo é selecionado do grupo queconsiste essencialmente em SEQ ID NOs. 12, 14, 16. As vacinas ou podemestar sozinhas ou em qualquer combinação das seguintes: onde contém umadjuvante, onde o componente de FCV está vivo, onde o componente deFCV é atenuado, onde o componente de FCV é inativado, que pode incluirpelo menos uma outra cepa de calicivírus de felino selecionada do grupoque consiste em FCV-F9, FCV-LLK, FCV-M8, FCV-255, e FCV-2280.
Uma vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino quecompreende uma seqüência de nucleotídeo de uma proteína de capsídeo deFCV selecionada do grupo que consiste em um polipeptídeo que tem 93%ou mais de identidade com SEQ ID NO. 13, 15, ou 17, onde o isolado deFCV não é cepa de 213-95, e onde a seqüência de ácido nucléico é opera-velmente ligada a uma seqüência promotora heteróloga, em uma quantidadeeficaz para produzir uma resposta imune, e um veículo farmaceuticamenteaceitável. Uma vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino quecompreende uma seqüência de nucleotídeo de uma proteína de capsídeo deFCV selecionada do grupo selecionado do grupo que consiste essencial-mente em SEQ ID NOS. 12, 14 e 16. Uma vacina onde a seqüência de nu-cleotídeo está em qualquer dos seguintes: um plasmídeo, um vetor de vírusrecombinante, ou qualquer outro vetor de nucleotídeo.
Uma vacina onde o vetor de vírus recombinante é selecionadodo grupo que consiste em vírus de herpes de felino, poxvírus de guaxinim,poxvírus de canário, adenovírus, vírus de Semliki Forest, vírus de Sindbis, evírus de vacínia.
Também há descrições de uma composição imunogênica quecompreende um veículo veterinariamente aceitável de excipiente e uma ce-pa isolada de FCV que se liga a um anticorpo monoclonal selecionado dosanticorpos monoclonais descritos aqui como 23, 26, 41, 44 e 56. Em algu-mas versões da invenção, a composição imunogênica que compreende umveículo veterinariamente aceitável de excipiente e uma cepa isolada de FCVseletivamente de liga a um anticorpo monoclonal selecionado dos anticorposmonoclonais descritos aqui como 23, 26, 41, 44 e 56. Estas composiçõesimunogênicas incluem composições onde a cepa de FCV é inativada, onde areferida cepa de FCV é uma vacina, e onde a composição compreende umadjuvante.
As vacinas descritas aqui podem incluir pelo menos um outropatógeno de felino, selecionado do grupo que consiste em vírus de herpesde felino, vírus de leucemia de felino, vírus de imunodeficiência de felino,Chlamydia pssittaci, e parvovírus de felino, vírus de raivas e Bordetella bron-chiseptica. A vacina pode também compreender adicionalmente ou ser ad-ministrada com um adjuvante.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece um regime de vacinação que signi-ficantemente reduz a mortalidade associada com calicivírus de felino (FCV)e realça o perfil de segurança de vacinas de FCV. Além disso, o regime devacinação reivindicado induz um perfil de neutralização cruzada de soromais amplo do que os protocolos de vacina de FCV-F9 existentes, que deve-riam fornecer imunidade melhor através de cepas diferentes do calicivírus defelino.
Um aspecto da presente invenção fornece um método para imu-nizar animais com vacinas, em particular, um gato contra calicivírus de feli-no. Duas outras doenças de felino, FPV e FHV também têm novos tratamen-tos descritos aqui. O método compreende administrar ao gato quantidadesterapeuticamente eficazes de uma primeira vacina, uma segunda vacina, e,opcionalmente a administração de uma terceira de vacina também pode serdada ou dentro de 120 dias como acima, ou mais freqüentemente, depois decerca de um ano como um reforço anual. A primeira vacina é administradaparenteralmente (por exemplo, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.).
A segunda vacina é administrada oralmente ou oronasalmente cerca de Ndias seguinte a administração da primeira vacina, e a terceira vacina é admi-nistrada parenteralmente, oralmente, ou oronasalmente cerca de M dias se-guinte a administração da primeira ou segunda vacina. Aqui, NeM são in-dependentemente números inteiros de 3 a 120, inclusive. Também preferidoé onde N é cerca de 3 semanas e cerca de 2-4 semanas. Além disso, foiapresentado um aspecto da invenção onde certas vacinas identificadas po-dem ser administradas como duas doses orais, sem necessidade de umaprimeira administração de parenteral. Reforços anuais também são aconse-lhados.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
SEQ ID NO. 1:
Iniciador de oligonucleotídeo, DEL-653SEQ ID NO. 2:Iniciador de oligonucleotídeo, DEL-651SEQ ID NO. 3:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR N2,SEQ ID NO. 4:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR N3,SEQ ID NO. 5:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR N4,SEQ ID NO. 6:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR N5,SEQ ID NO. 7:
Iniciadorde oligonucleotídeo, FCV-SR N6,SEQ ID NO. 8:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR N9,SEQ ID NO. 9:
Iniciador de oligonucleotídeo, iniciador 2,SEQ ID NO. 10:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR C4,SEQ ID NO. 11:
Iniciador de oligonucleotídeo, FCV-SR C8,SEQ ID NO. 12:
Seqüência de DNA de gene de capsídeo de FCV-21SEQ ID NO. 13:
Seqüência de aminoácido codificada de gene de capsídeo de FCV-21SEQ ID NO. 14:
Seqüência de DNA de gene de capsídeo de FCV-49SEQ ID NO. 15:
Seqüência de aminoácido codificada de gene de capsídeo de FCV-49SEQ ID NO. 16:
Seqüência de DNA de gene de capsídeo de FCV-26391-4SEQ ID NO. 17:
Seqüência de aminoácido codificada de gene de capsídeo de FCV-26391-4
DEFINIÇÕES E ABREVIAÇÕES"Cerca de", quando empregado com relação a uma variável nu-mérica mensurável, refere-se ao valor indicado da variável e a todos os valo-res da variável que estão dentro do erro experimental do valor indicado (porexemplo, dentro do intervalo de confidência de 95% pela média) ou dentrode 10 por cento do valor indicado, qualquer que seja o maior, a menos queaproximadamente seja empregado em referência aos intervalos de tempoem semanas onde "cerca de 3 semanas", é 17-25 dias, e cerca de 2-4 se-manas é 10-40 dias.
"Imunidade ativa" inclui tanto imunidade humoral e/ou imunidademediada por célula contra vírus de felino induzido por vacinação de um gatocom a vacina da presente invenção.
"Anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que po-de se ligar a um antígeno específico como o resultado de uma resposta imu-ne àquele antígeno. As imunoglobulinas são proteínas de soro compostas decadeias de polipeptídeo "leves" e "pesadas" tendo regiões "constantes" e"variáveis", e são divididas em classes (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, eIgM) com base na composição das regiões constantes. Um anticorpo que é"específico" para um determinado antígeno indica que as regiões variáveisdo anticorpo reconhecem e ligam um antígeno específico exclusivamente -por exemplo, o anticorpo pode distinguir uma proteína de capsídeo particularde outras proteínas conhecidas em virtude de diferenças mensuráveis emafinidade de ligação, apesar da existência de identidade de seqüência locali-zada, homologia, ou similaridade entre proteínas de capsídeo e outros poli-peptídeos. Os anticorpos específicos também podem interagir com outrasproteínas (por exemplo, proteína A de Staphylococcus aureus, ou outros an-ticorpos em técnicas de ELISA) por interações com seqüências fora da regi-ão variável dos anticorpos, e, em particular, nas regiões constantes da molé-cula. Os ensaios de avaliação para determinar a especificidade de ligaçãode um anticorpo são bem conhecidos. Para uma discussão inclusiva de taisensaios, veja Harlow e outros (ed.), Antibodies: A Laboratory Mannual Capí-tulo 6 (1988). Os anticorpos também podem reconhecer e ligar fragmentosde proteínas de capsídeo de FCVs, contanto que os anticorpos sejam espe-cíficos para proteína de capsídeo de FCVs. Os anticorpos podem ser produ-zidos empregando métodos conhecidos na técnica.
"Antígeno" ou "imunógeno", refere-sem a uma molécula que con-tém um ou mais epítopos (linear, conformacional ou ambos) que em exposi-ção a um indivíduo induzirá uma resposta imune que é específica para aque-le antígeno. Um epítopo é o sítio específico do antígeno que se liga a umreceptor de célula T ou anticorpo específico, e tipicamente compreende cer-ca de 3 resíduos de aminoácido a cerca de 20 resíduos de aminoácido. Otermo antígeno refere-se aos antígenos de subunidade - antígenos separa-dos e discretos de um organismo inteiro com o qual o antígeno é associadoem natura - bem como bactérias, vírus, fungos, parasitas ou outros micró-bios mortos, atenuados ou inativados. O termo antígeno também refere-seaos anticorpos, tal como anticorpos de antiidiótipo ou fragmentos destes, eaos mimótopos de peptídeo sintéticos que podem imitar um antígeno ou de-terminante antigênico (epítopo). O termo antígeno também refere-se a umoligonucleotídeo ou polinucleotídeo que expressa um antígeno ou determi-nante antigênico in vivo, tal como em aplicações de imunização de DNA.
"Excipiente" refere-se a qualquer componente de uma vacinaque não seja um antígeno.
FELOCELL 3 é FELOCELL 4 sem Chlamydia psittaci.
FELOCELL 4 contém vírus de riotraqueíte de felino vivo modifi-cado [FHV], calicivírus [FCV-F9], vírus de panleucopênia [FPV] e Chlamydiapsittaci [FCp]. FELOCELL 4 A contém vírus de riotraqueíte de felino vivo mo-dificado [FHV], calicivírus [FCV-21], vírus de panleucopênia [FPV] e Chlamy-dia psittaci [FCP]. FELOCELL 4 A é FELOCELL 4 sem FCV-F9, porém comFCV-21. FELOCELL 3 A é FELOCELL 3 sem FCV-F9, porém com FCV-21.Felocell® 4, Felocell 4, ou FELOCELL 4 ou aquelas palavras seguidas pelonúmero "3" ou "4" são vacinas onde qualquer variação do nome Felocell épossuído por Pfizer.
"Primeira vacina, "segunda vacina", "terceira vacina", e similares,referem-se às vacinas separadamente administráveis que podem ser iguaisou diferentes, e que em geral podem ser administradas em qualquer ordem.Desse modo, uma terceira vacina pode ser administrada a um indivíduo an-tes ou depois de uma segunda vacina.
"Identidade" com respeito ao percentual de "identidade" de se-qüência de aminoácido com respeito aos polipeptídeos, é aqui definida comoo percentual de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que sãoidênticas com os resíduos nas seqüências alvos após alinhar tanto as se-qüências quanto as entradas de introdução, se necessário, para obter o per-centual máximo de identidade de seqüência. O percentual de identidade deseqüência é determinado através de métodos convencionais. Brevemente,as duas seqüências de aminoácido são alinhadas para otimizar as classifi-cações de alinhamento empregando o algoritmo de Clustal W (Thompson eoutros; Nuc. Ac. Res. 22:4673-4680; 1994) e matriz de peso PAM250 (Da-yhoff e outros, "Atlas of Protein Sequence and Structure." National Biomedi-cal Research Foundation. Washington, DC 5:345-358 (1978) e parâmetrosdefault quando fornecidos pelo programa MegAIign (DNASTAR, Inc.; Madi-son, Wl). A tabela de matriz de peso de PAM250 é apresentada como TA-BELA 1-1 (os aminoácidos são indicados pelos códigos de uma letra pa-drões).
TABELA 1-1
<table>table see original document page 12</column></row><table><table>table see original document page 13</column></row><table>imunidade protetora concedida por uma vacina pode ser avaliada medindo,por exemplo, a redução nos sinais clínicos tal como mortalidade, morbidez,número de temperatura e condição física total e saúde total e desempenhodo indivíduo. A resposta imune pode compreender, sem limitação, induçãode imunidade celular e/ou humoral. A quantidade de uma vacina que é tera-peuticamente eficaz pode variar dependendo do vírus particular empregado,ou da condição do gato, e pode ser determinada por um médico veterinário.
A administração de "intranasal" refere-se à introdução de umasubstância, tal como uma vacina, no corpo de um indivíduo através de oupor via do nariz e envolve o transporte da substância principalmente pelamucosa nasal.
"Isolado", quando empregado para descrever qualquer substân-cia particularmente definida, tal como um polinucleotídeo ou um polipeptí-deo, refere-se à substância que é separada do ambiente celular original noqual a substância tal como um polipeptídeo ou ácido nucléico normalmente éencontrada. Como empregado aqui então, por via de exemplo somente, umacepa de célula recombinante construída com um polinucleotídeo da invençãofaz uso do ácido nucléico "isolado". Alternativamente, a proteína de capsídeode FCV ou um fragmento imunogênico específico pode ser empregado comouma vacina, desse modo seria considerada ser isolada porque foi identifica-da, separada e até certo ponto purificada quando comparada a como elapode existir em natura. Se a proteína de capsídeo ou um fragmento imuno-gênico específico desta é produzido em uma bactéria recombinante ou vetorde expressão de eucariota que produz o antígeno, ela é considerada existircomo uma proteína isolada ou como um ácido nucléico. Por exemplo, umacepa de célula recombinante construída com um polinucleotídeo faz uso deum ácido nucléico "isolado".
"Anticorpo monoclonal" refere-se aos anticorpos produzidos poruma única cepa de células de hibridoma, todos voltados a um epítopo emum antígeno particular. O antígeno empregado para preparar o anticorpomonoclonal pode ser fornecido como uma proteína isolada do patógeno ou opatógeno inteiro. Um hibridoma é uma cepa de célula clonal que consiste emcélulas híbridas formadas pela fusão de uma célula de mieloma e uma célulaprodutora de anticorpo específica. Em geral, os anticorpos monoclonais sãode origem de camundongos; entretanto, o anticorpo monoclonal tambémrefere-se a uma população clonal de um anticorpo feito contra um epítopoparticular de um antígeno produzido por tecnologia de exibição de fago oumétodo que seja equivalente a exibição de fago ou células híbridas de ori-gem de não camundongos.
"Dia N", período ou intervalo "N" de tempo ou "M dias" seguinteum evento refere-sem, respectivamente, a qualquer hora no Ns ou Ms diaapós o evento. Por exemplo, a vacinação de um indivíduo com uma segundavacina 3 dias seguinte a administração de uma primeira vacina significa quea segunda vacina é administrada qualquer em qualquer hora a no 3e dia a-pós a primeira vacina. Esta descrição é freqüentemente aplicada ao intervaloentre uma primeira e segunda vacinação. Tipicamente, o intervalo N preferi-do é cerca de 3 semanas, ou 17-25 dias, porém também comum é de cercade 2, 4 semanas ou 10-40 dias, e as invenções aqui são eficazes com perío-do "N" de tempo dentre 3 e 120 dias.
Administração "oral" ou "peroral" refere-se à introdução de umasubstância, tal como uma vacina, no corpo de um indivíduo através de oupor via da boca e envolve engolir ou transportar pela mucosa oral (por e-xemplo, absorção bucal ou sublingual) ou ambos.
Administração "oronasal" refere-se à introdução de uma subs-tância, tal como uma vacina, no corpo de um indivíduo através de ou por viado nariz e da boca, como ocorreria, por exemplo, colocando-se uma ou maisgotinhas no nariz. A administração oronasal envolve processos de transporteassociados com administração oral e intranasal.
A "administração parenteral" refere-se à introdução de umasubstância, tal como uma vacina, no corpo de um indivíduo através de oupor via de uma via que não inclua o trato digestivo. A administração parente-ral inclui administração subcutânea, administração intramuscular, adminis-tração transcutânea, administração intradérmica, administração intraperito-neal, administração intra-ocular, e administração intravenosa. Com a finali-dade desta descrição, a administração de parenteral exclui vias de adminis-tração que principalmente envolvam o transporte da substância por tecidomucoso na boca, nariz, traquéia, e pulmões.
"Imunidade passiva" refere-se à proteção contra calicivírus defelino fornecido a um gato como um resultado de vacinar o gato com umavacina que compreende anticorpos contra a cepa de FCV ou um componen-te imunogênico ou fragmento de um componente deste.
"Farmaceuticamente aceitável" refere-se às substâncias, queincluem-se no escopo do julgamento médico preciso, adequadas para usoem contato com os tecidos de indivíduos sem toxicidade, irritação, respostaalérgica imprópria, e outros, comensuráveis com uma relação risco para be-nefício razoável, e eficazes para seu uso pretendido.
"Anticorpo policlonal" refere-se a uma população misturada deanticorpos feita contra um patógeno ou antígeno particular. Em geral, a po-pulação contém uma variedade de grupos de anticorpo, cada grupo voltadoa um epítopo particular do patógeno ou antígeno. Para preparar anticorpospoliclonais, o patógeno inteiro ou um antígeno isolado é introduzido por ino-culação ou infecção em um hospedeiro o que induz o hospedeiro a prepararanticorpos contra o patógeno ou antígeno.
A administração "respiratória" refere-se à introdução de umasubstância, tal como uma vacina, no corpo de um indivíduo através de oupor via de inalação de uma substância nebulizada (atomizada). Em adminis-tração respiratória, o mecanismo de transporte primário envolve absorção dasubstância atomizada pela mucosa na traquéia, brônquios, e pulmões e éentão diferente daquela administração intranasal ou peroral.
"Dosagem única administrativa" significa administrar em ou cer-ca do mesmo dia, isto é, todos os componentes administrados dentro decerca de 1 dia. Os componentes podem ou não estar em um único recipiente.
"Específico para", quando empregado para descrever anticorposda invenção, indica que as regiões variáveis dos anticorpos da invenção re-conhecem e ligam uma cepa de vírus específica exclusivamente (isto é, sãocapazes de distinguir uma proteína de capsídeo de FCV particular de outrasproteínas conhecidas em virtude de diferenças mensuráveis na afinidade deligação, apesar da existência de identidade, homologia, ou similaridade deseqüência localizada entre a proteína de capsídeo de FCVs e tais polipeptí-deos). Será entendido que anticorpos específicos também podem interagircom outras proteínas (por exemplo, proteína A S. aureus ou outros anticor-pos em técnicas de ELISA) por interações com seqüências fora da regiãovariável dos anticorpos, e, em particular, na região constante da molécula.
Os ensaios de avaliação para determinar especificidade de ligação de umanticorpo da invenção são bem conhecidos e habitualmente praticados natécnica. Para uma discussão inclusiva de tal ensaio, veja Harlow e outros(Eds.), Antibodies: A Laboratorv Manual: Cold Spring Harbor Laboratory;Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. Os anticorpos que reconhecem eligam fragmentos das proteínas de capsídeo de FCVs da invenção tambémsão contemplados, contanto que os anticorpos sejam específicos para prote-ína de capsídeo de FCVs. Os anticorpos da invenção podem ser produzidosempregando qualquer método bem conhecido e habitualmente praticados natécnica.
O "fragmento imunogênico específico" é significado uma porçãode uma seqüência que é reconhecível por um anticorpo que é específicopara a seqüência, como definido em detalhes abaixo.
"Indivíduo" refere-se a qualquer animal tendo um sistema imune,que inclui mamífero tal como gatos.
"Vacina de subunidade" refere-se a um tipo de vacina que incluium ou mais antígenos, porém nem todos os antígenos, que são derivadosde ou homólogos a, antígenos de um patógeno de interesse, tal como umvírus, bactéria, parasita ou fungo. Uma tal composição é substancialmentelivre de células de patógeno intactas ou partículas patogênicas, ou o Iisadode tais células ou partículas. Desse modo, uma vacina de subunidade podeser preparada de polipeptídeos pelo menos parcialmente purificados, ousubstancialmente purificados, imunogênicos do patógeno ou seus análogos.
Os métodos para obter um antígeno ou antígenos na vacina de subunidadeincluem técnicas de purificação padrão, produção recombinante, ou síntesequímica.
"TCID50" refere-se à "dose infecciosa de cultura de tecido" e édefinido como aquela diluição de um vírus requerido para infectar 50% deuma determinada batelada de culturas de célula inoculadas. Vários métodospodem ser empregados para calcular TCID50, incluindo o método de Spear-man-Karber que é utilizado ao longo desta especificação. Para uma descri-ção do método de Spearman-Karber, veja B. W. Mahy & H. O. Kangro, Viro-logy Methods Mannual 25-46 (1996).
"Quantidade terapeuticamente eficaz", no contexto desta descri-ção, refere-se a uma quantidade de um antígeno ou vacina que induziriamuma resposta imune em um indivíduo (por exemplo, gato) recebendo o antí-geno ou vacina que seja adequado para prevenir ou melhorar os sinais ousintomas da doença, incluindo efeitos de saúde adversos ou complicaçõesdestes, causados por infecção com um patógeno, tal como um vírus (porexemplo, FCV), bactéria, parasita ou fungo. Imunidade humoral ou imunida-de mediada por célula ou tanto imunidade humoral quanto mediada por célu-la pode ser induzida. A resposta imunogênica de um animal a uma vacinapode ser avaliada, por exemplo, indiretamente através da medição de títulosde anticorpo, em saios de proliferação de linfócito, ou diretamente através domonitoramento dos sinais e sintomas após o desafio com cepa tipo silvestre.A imunidade protetora concedida por uma vacina pode ser avaliada medin-do-se, por exemplo, a redução nos sinais clínicos tal como mortalidade,morbidez, número de temperatura e condição física total e desempenho esaúde total do indivíduo. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamen-te eficaz pode variar dependendo do vírus particular empregado, ou da con-dição do indivíduo, e pode ser determinada por um médico.
"Tratar" refere-se à reverter, aliviar, inibir o progresso de, ou pre-venir um distúrbio, condição ou doença às quais tal termo se aplica, ou aprevenir um ou mais sintomas de tal distúrbio, condição ou doença.
"Tratamento" refere-se ao ato de "tratar" como definido imedia-tamente acima."Vacina" refere-se a uma composição que inclui um antígeno eabrange as então chamadas "vacinas de subunidades" como definido abai-xo. A administração da vacina a um indivíduo resulta em uma resposta imu-ne. A vacina pode ser introduzida diretamente no indivíduo por qualquer viaconhecida de administração, incluindo parenteralmente, peroralmente, e ou-tras.
PARTE 1
VACINAS, LINHAGENS DE VÍRUS, PROTEÍNAS DE CAPSÍDEO, E ANTI-CORPOS DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece vacinas que são com base em ce-pas de FCV vivas ou mortas selecionadas do grupo que consiste em FCV-21, FCV-49 e FCV26391-4. A invenção adicionalmente fornece vacinas deácido nucléico que codificam uma proteína de capsídeo de FCV da cepa deFCV da invenção ou fragmentos imunogênicos específicos desta. A inven-ção adicionalmente fornece proteína de capsídeo isolada derivada das ce-pas de FCV da invenção ou fragmentos imunogênicos específicos destas.
Para cepas de FCV, uma boa resposta imune é induzida por e-levação de determinante antigênico da proteína de capsídeo. Aqui são des-critas e reivindicadas várias cepas de FCV que incluem proteínas de capsí-deo intimamente relacionadas e variantes destes. Especificamente, são des-critas a cepa FCV-21 e seqüência de proteína (SEQ ID 13) e seqüências quetenham 91,2%, 95% e 99% ou mais de identidade; cepa FCV-49 e seqüên-cia de proteína (SEQ ID 15) e seqüências que têm 92,7%, 95% e 99% oumais de identidade; cepa FCV-26391-4 e seqüência de proteína (SEQ ID 17)e seqüências que têm 91,8%, 95% e 99% ou mais de identidade.
A vacina da presente invenção é geralmente pretendida ser umtratamento profilático que imuniza gatos contra doença causada por cepasvirulentas de calicivírus de felino. Entretanto, a vacina é também pretendidapara o tratamento terapêutico de gatos infectados com uma cepa virulentade calicivírus de felino. Por exemplo, uma vacina que compreende anticor-pos, produzida imunizando-se um hospedeiro heterólogo deste com capsí-deo de FCV ou componente imunogênico deste, é empregada para o trata-mento terapêutico de um gato infectado com calicivírus de felino.
Entretanto, ainda vacinas que fornecem imunidade ativa, isto é,vacinas que compreendem cepas de FCV selecionadas do grupo que con-siste em FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4, ou mutantes destes, ou proteínasde capsídeo derivadas das cepas de FCV da invenção, ou um fragmentoimunogênico específico de suas proteínas de capsídeo, seriam esperadasserem eficazes quando determinadas como um tratamento terapêutico con-tra várias doenças. Desse modo, a imunidade que é fornecida pela presenteinvenção pode ser imunidade ativa ou imunidade passiva, e o uso pretendidoda vacina pode ser profiláctico ou terapêutico.
A via de administração para qualquer uma das modalidades davacina da presente invenção inclui, porém não está limitada a, oronasal, in-tramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intra-ocular, e oral como também transdérmica ou por inalação ousupositório. As vias preferidas de administração incluem oronasal, intramus-cular, intraperitoneal, intradérmica, e injeção subcutânea. A vacina pode seradministrada por qualquer meio que inclua, porém que não esteja limitado a,seringas, nebulizadores, mister, dispositivos de injeção sem agulha, ou pisto-las de gene de bombardeio de microprojétil (bombardeio Biolistic).
A vacina para qualquer uma das modalidades da presente in-venção é formulada em um veículo farmaceuticamente aceito o de acordocom o modo de administração a ser empregado. Alguém versado na técnicapode facilmente formular uma vacina que compreenda um FCV-21, FCV-49ou FCV 26391-4 vivo ou morto, uma proteína de capsídeo derivada dequaisquer das cepas de FCV da invenção, ou um fragmento imunogênicodestes, um vetor de vírus recombinante que codifica a proteína de capsídeode FCV-21, FCV-49 ou FCV-26391-4 ou um fragmento imunogênico especí-fico desta, ou uma molécula de DNA que codifica a proteína de capsídeoderivada de FCV-21, FCV-49 ou FCV 26391-4 ou um fragmento imunogêni-co específico deste. Em casos onde a injeção intramuscular é preferida, umaformulação isotônica é preferida. Geralmente, os aditivos para isotonicidadepodem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose. Em ca-sos particulares, as soluções isotônicas tal como salina tamponada de fosfa-to são preferidas. As formulações podem também fornecer estabilizadores,tal como gelatina e albumina. Em algumas modalidades, um agente vaso-constritivo é adicionado à formulação. As preparações farmacêuticas de a-cordo com a presente invenção são fornecidas estéreis e livres de pirogênio.Entretanto, é bem conhecido por aqueles versados na técnica que as formu-lações preferidas para o veículo farmaceuticamente aceito que compreen-dem as vacinas da presente invenção são aqueles veículos farmacêuticosaprovados nos regulamentos promulgados pelo Departamento de EstadosUnidos de Agricultura, ou agência de governo equivalente em um país es-trangeiro tal como Canadá ou México ou qualquer uma das nações européi-as, para vacinas de calicivírus de felino vivo, vacinas de calicivírus de felinomortas, vacinas de subunidade de polipeptídeo (antígeno), vacina de vetorde vírus recombinante, vacinas de anticorpo, e vacinas de DNA. Portanto, oveículo farmaceuticamente aceito para produção comercial da vacina dapresente invenção é um veículo que já é aprovado ou será aprovado pelaagência de governo apropriada nos Estados Unidos da América ou país es-trangeiro. A vacina pode também ser misturada com um adjuvante que éfarmaceuticamente aceitável. Em certas formulações da vacina da presenteinvenção, a vacina é combinada com outras vacinas de felino para produzirum produto de vacina polivalente que pode proteger gatos contra uma amplavariedade de doenças causadas por outros patógenos de felinos. Realmen-te, os fabricantes comerciais de vacinas de felino, como também usuáriosfinais preferem produtos de vacina polivalente. Portanto, em uma modalida-de preferida, a presente invenção fornece uma vacina polivalente que imuni-za gatos contra calicivírus de felino e pelo menos um outro patógeno de feli-no, preferivelmente selecionada do grupo que consiste em vírus de herpesfelino, vírus de leucemia de felino, vírus de imunodeficiência de felino, Cla-mídia de felino, e vírus de panleucopenia de felino.
A inoculação de um gato é preferivelmente por uma única vaci-nação que produz uma resposta imunogênica completa, ampla. Em outramodalidade da presente invenção, o gato é submetido a uma série de vaci-nações para produzir uma resposta imune completa, ampla. Quando as va-cinações são fornecidas em uma série, as vacinações podem ser fornecidasentre cerca de um dia a quatro semanas ou por mais tempo separadamente.Em modalidades particulares, o gato é vacinado em diferentes sítios simul-taneamente. Os detalhes adicionais sobre a via e administração são encon-trados abaixo na seção intitulada "Métodos de Imunizar Gatos contra Calici-vírus".
As composições de vacina opcionalmente podem incluir líquido,semi-sólido, ou diluentes sólidos (isto é, estéril e não tóxico) farmaceutica-mente aceitáveis compatíveis com vacina que servem como veículos farma-cêuticos, excipientes, ou meios. Os diluentes podem incluir água, solução,salina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Os agentes isotônicos podemincluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Osestabilizadores incluem albumina, entre outros. Qualquer adjuvante conheci-do na técnica pode ser empregado na composição de vacina, incluindo adju-vantes com base em óleo tal como o Adjuvante Completo de Freund e o Ad-juvant Incompleto de Freund, adjuvantes com base em micolato (por exem-plo, dimicolato de trealose), lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), peptido-glicanos (isto é, muteínas, mucopeptídeos, ou glicoproteínas, tal como N-Opaca, dipeptídeo de muramila [MDP], ou análogos de MDP), proteoglica-nos (por exemplo, extraídos de Klebsiella pneumoniae), preparações estrep-tocócicas (por exemplo, OK432), Biostim® (por exemplo, 01K2), o "Iscoms"de EP 109 942, EP 180 564 e EP 231 039, hidróxido de alumínio, saponina,DEAE-dextrana, óleos neutros (tal como, migliol), óleos vegetais (tal como,óleos de amendoim), lipossomas, polióis de Pluronic®. Os adjuvantes inclu-em, porém não estão limitados ao, sistema de adjuvante RIBI (Ribi Inc.), a-lume, gel de hidróxido de alumínio, colesterol, emulsões de óleo em água,emulsões de água em óleo tal como, por exemplo, adjuvantes completos eincompletos de Freund, co-polímero de bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), adjuvante de AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuti-cals, Inc., Birmingham, AL) ou outras frações de saponina, lipídio A de mo-nofosforila, adjuvante de lipídio-amina Avridine, enterotoxina lábil ao calor deE. coli (recombinante ou caso contrário), toxina de cólera, ou dipeptídeo demuramila, entre muitos outros. As composições imunogênicas podem tam-bém incluir um ou mais outros agentes imunomoduladores tal como, por e-xemplo, interleucinas, interferons, ou outras citocinas. As composições imu-nogênicas também podem incluir gentamicina e Mertiolato. Ao mesmo tempoonde as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no con-texto da presente invenção podem facilmente ser determinadas pelo técnicoversado, a presente invenção contempla composições que compreendem decerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante preferivelmente de cerca de500 pg/2 ml de dose da composição de vacina. Em outra modalidade prefe-rida, a presente invenção contempla composições de vacina que compreen-dem de cerca de 1 pg/ml a cerca de 60 pg/ml de antibiótico, e mais preferi-velmente menos do que cerca de 30 pg/ml de antibiótico.
As composições imunogênicas da presente invenção podem serfeitas em várias formas dependendo da via de administração. Por exemplo,as composições imunogênicas podem ser feitas na forma de soluções oudispersões aquosas estéreis adequadas para uso injetável, ou feitas emformas Iiofilizadas empregando técnicas de liofilização. As composições i-munogênicas Iiofilizadas são mantidas tipicamente a cerca de 4°C, e podemser reconstituídas em uma solução estabilizante, por exemplo, salina e/ouHEPES, com ou sem adjuvante.
Além disso, as composições de vacina e imunogênicas da pre-sente invenção podem incluir um ou mais veículos farmaceuticamente acei-táveis. Como empregado aqui, "um veículo farmaceuticamente aceitável"inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, ad-juvantes, agentes estabilizantes, diluentes, preservativos, agentes antibacte-rianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardamento de ad-sorção, e similares. O veículo(s) deve ser "aceitável" no sentido de ser com-patível com os componentes da invenção e não danoso para o indivíduo aser imunizado. Tipicamente, os veículos serão estéreis e livres de pirogênio.
VACINAS VIVASEm uma modalidade da vacina da presente invenção, a vacinacompreende uma vacina de FCV viva, onde o componente de FCV é sele-cionado do grupo que consiste em FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4. Porqueestas cepas foram isoladas em uma forma não virulenta, elas são particu-larmente preferidas para a preparação de uma vacina viva que estimula osistema imune do gato sem causar doença.
Os métodos para atenuar os vírus também são bem conhecidosna técnica e incluem tais métodos como passagem consecutiva em culturade célula em uma cepa de célula adequada, ou mutagênese ultravioleta ouquímica.
VACINAS INATIVADAS
Em outra modalidade da presente invenção, a vacina compreen-de um vacina de FCV inativada ou morta que compreende uma cepa de FCVselecionada do grupo que consiste em FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4. Avacina de inativada é feita por métodos bem conhecidos na técnica. Por e-xemplo, uma vez o vírus é propagado a títulos elevados, seria facilmenteevidente por aquele versado na técnica que a massa antigênica do vírus po-de ser obtida por métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a mas-sa antigênica do vírus pode ser obtida por diluição, concentração, ou extra-ção. Todos estes métodos foram empregados para obter massa antigênicavirótica apropriada para produzir vacinas. O calicivírus é inativado através detratamento com formalina, betapropriolactona (BPL), ou com etileneiminabinária (BEI)1 ou outros métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
A inativação através de formalina é realizada misturando-se asuspensão de calicivírus com 37% de formaldeído a uma concentração deformaldeído final de 0,05%. A mistura de calicivírus-formaldeído é misturadapor agitação constante durante cerca de 24 horas a temperatura ambiente. Amistura de calicivírus inativado é então testada quanto ao vírus vivo residualensaiando-se para crescimento em uma cepa de célula de felino adequadatal como células de CRFK.
A inativação por BEI é realizada misturando a suspensão de ca-licivírus da presente invenção com 0,1 M de BEI (2-bromo-etilamina entre0,175 N de NaOH) a uma concentração de BEI final de 1 mM. A mistura decalicivírus-BEI é misturada por agitação constante durante cerca de 48 horasa temperatura ambiente, seguido pela adição de 1,0 M de tiossulfato de só-dio a uma concentração final de 0,1 mM. A mistura é continuada duranteumas duas horas adicionais. A mistura de calicivírus inativada é testadaquanto ao calicivírus vivo residual ensaiando-se para crescimento em umacepa de célula de felino adequada tal como células de NLFK.
O calicivírus inativado acima mencionado da presente invençãoé misturado com qualquer um dos veículos farmaceuticamente para formularvacinas de vírus inativado para o nível de dosagem apropriado. A vacinainativada também pode incluir, além de um componente de FCV selecionadodo grupo que consiste em FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4 pelo menos umaoutra cepa de calicivírus de felino, preferivelmente selecionada do grupo queconsiste em FCV-F9, FCV-M8, FCV-255, e FCV-2280. Em uma modalidadepreferida, a vacina também inclui uma vacina para imunizar um gato contraum ou mais outros patógenos de felino, preferivelmente selecionados dogrupo que consiste em vírus de herpes de felino, vírus de leucemia de felino,vírus de imunodeficiência de felino, Clam ídia de felino, e vírus de panleuco-penia de felino.
VACINAS RECOMBINANTES
Em uma outra modalidade da presente invenção, a vacina com-preende um vetor de vírus de recombinante que contém um ácido nucléicoque codifica uma proteína de capsídeo de FCV descrita aqui ou um fragmen-to imunogênico específico desta.
Em uma modalidade particular, o vetor de vírus recombinante éum vírus de herpes de felino que imuniza um gato contra tanto calicivírus defelino quanto vírus de herpes de felino. Em outra modalidade, o vetor de ví-rus recombinante compreende um ou mais antígenos preferivelmente sele-cionados do grupo que consiste em vírus de herpes felino, vírus de leucemiade felino, vírus de imunodeficiência de felino, Clamídia de felino, e vírus depanleucopenia de felino, vírus de raivas e Bordetella bronchiseptica.Para preparar um vetor de vírus recombinante que expressauma proteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específicodesta, um cDNA que codifica a proteína de capsídeo ou um fragmento imu-nogênico específico desta é inserido no genoma de um vetor de vírus talcomo vírus de herpes, poxvírus, ou adenovírus. A Patente U.S. N9 5.716.822por Wardley e outros descreve um método para inserir DNA que codifica aproteína de capsídeo de CFI-68 FIV de cepa de calicivírus de felino no genede timidina cinase de vírus de herpes de felino. Outras vacinas de vetor devírus recombinantes abrangidas pela presente invenção, incluem, porém nãoestão limitadas aos adenovírus, vírus adenoassociado, parvovírus, e váriosvetores de poxvírus para expressar a proteína de capsídeo de FCV ou umfragmento imunogênico específico desta. Em particular, a presente invençãoinclui vacinas de vetor de poxvírus recombinante que expressam a proteínade capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico desta feita deacordo com os métodos ensinados em qualquer uma das Patentes dos Es-tados Unidos Ns 5.338.683 e 5.494.807 por Paoletti e outros, que ensinamvacinas de vírus recombinante que consistem em vírus de vacínia ou poxví-rus de canário que expressam antígenos estrangeiros; Patente dos EstadosUnidos Ns 5.266.313 por Esposito e outros, que ensina vetores de poxvírusde guaxinim recombinantes que expressam antígenos de vírus de raivas; e aPatente dos Estados Unidos Ne 6. 010.703 por Maes e outros, que ensinavetores de poxivírus racoon recombinantes que expressam o gD de vírus deherpes de felino ou antígenos de gB.
Para quaisquer dos vetores de vírus recombinante acima men-cionados, o cDNA que codifica a proteína de capsídeo de FCV ou um frag-mento imunogênico específico desta é operavelmente ligado a um promotorde eucariota na terminação 5' do cDNA que codifica o antígeno e um sinalde terminação de eucariota e sinal poli (A) na terminação 3' do cDNA quecodifica o antígeno. Como empregado aqui, o termo "operavelmente ligado"significa que o polinucleotídeo da presente invenção (tal como uma moléculade cDNA) e um polinucleotídeo (DNA) contendo uma seqüência de controlede expressão, por exemplo, seqüência de terminação e promotora de trans-crição, são adequados em um vetor ou célula tal que a expressão do antíge-no codificado pelo cDNA seja regulada pela seqüência de controle de ex-pressão. Os métodos para clonar DNA1 tal como o cDNA que codifica a pro-teína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico desta, eoperavelmente ligar o DNA que contém seqüências de controle de expres-são a este, são bem conhecidos na técnica. Os exemplos de promotoresadequados para expressar a proteína de capsídeo de FCV ou um fragmentoimunogênico específico desta, nos vetores de vírus recombinantes, são ospromotores imediatamente precoces de citomegalovírus (CMV), o promotorde repetição terminal longa de vírus de sarcoma de Rous (RSV-LTR), opromotor imediatamente precoce de vírus símio 40 (SV40), e promotoresinduzíveis tal como o promotor de metalotioneína. Um exemplo de um DNAque tem uma terminação e sinal poli (A) é a região poli (A) tardia de SV40.Outro exemplo de um sistema de expressão viral adequado para produzir oantígeno é o Sistema de Expressão Sindbis disponível de Invitrogen. O usodestes vetores e sistemas de expressão comercialmente disponíveis é bemconhecido na técnica.
VACINA DE MOLÉCULA DE DNA OU ÁCIDO NUCLÉICO
Em uma modalidade adicional ainda da presente invenção, avacina é fornecida como uma vacina de molécula de DNA ou ácido nucléicoque extraem uma resposta imune ativa no gato. A vacina de molécula deDNA consiste em DNA que tem uma seqüência de ácido nucléico que codifi-ca a proteína de capsídeo ou um fragmento imunogênico específico desta deuma proteína de capsídeo de FCV descrita aqui.
Em uma modalidade preferida, a vacina de molécula de DNAcompreende a seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NOs: 12, 14, ou 16,ou um fragmento desta que codifica SEQ ID NOs: 13, 15 ou 17, ou um frag-mento imunogênico específico de SEQ ID NOS: 13, 15 ou 17. O ácido nu-cléico que codifica a proteína de capsídeo ou um fragmento imunogênicoespecífico desta, é operavelmente ligado a ou está próximo de um promotortranscricional. Isto permite a transcrição da proteína de capsídeo, ou umfragmento imunogênico específico desta, do ácido nucléico quando o ácidonucléico é inoculado nas células do gato. Preferivelmente, a molécula deDNA é um plasmídeo. Os promotores que são úteis para vacinas de DNAsão bem conhecidos na técnica e incluem, porém não estão limitados, opromotor de RSV LTR1 o promotor imediatamente precoce de CMV1 e opromotor de antígeno de SV40 T. É também preferido que o ácido nucléicoseja operavelmente ligado, a ou próximo do códon de terminação da se-qüência que codifica a proteína de capsídeo ou um fragmento imunogênicoespecífico desta, para um fragmento de ácido nucléico que compreende umsinal de terminação de transcrição e sinal de reconhecimento poli (A). A va-cina de DNA é fornecida ao gato em um veículo farmacêutico aceito ou emum lipídio ou veículo de Iipossoma similar àquele descrito na Patente dosEstados Unidos Ns 5.703.055 por Felgner. A vacina de DNA pode ser forne-cida ao gato por uma variedade de métodos tal como injeção intramuscular,injeção por pistola de pressão, ou bombardeio de biolístico. A preparação deDNA e métodos para seu uso são fornecidos na Patente dos Estados UnidosN— 5.589. 466 e 5.580.859, ambas por Felgner. Finalmente, um método pa-ra produzir DNA de plasmídeo de grau farmacêutico é ensinado na Patentedos Estados Unidos Ne 5.561.064 por Marquet e outros.
Entretanto, ao usar os métodos supramencionados, as vacinasde DNA que expressam a proteína de capsídeo de FCV ou um fragmentoimunogênico específico desta, são empregadas para imunizar gatos contracalicivírus de felino virulento. A vantagem da vacina de DNA é que a molécu-la de DNA é propagada convenientemente como um plasmídeo que é ummeio simples e econômico de produzir uma vacina, e desde que a vacinanão esteja viva, muitas das questões reguladoras associadas com vacinasde vetor de vírus recombinante vivas não são uma questão com as vacinasde DNA. Alguém versado na técnica apreciaria que a vacina de DNA da pre-sente invenção pudesse compreender ácidos nucléicos sinteticamente pro-duzidos que fossem feitos por métodos de síntese química bem conhecidosna técnica.
PROTEÍNA DE CAPSÍDEO DE FCV ISOLADA E PURIFICADA
Em uma modalidade ainda adicional da presente invenção, avacina consiste na proteína de capsídeo de FCV isolada e purificada ou umfragmento imunogênico específico desta. Em particular, uma vacina onde aproteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico des-ta compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, 15, 17. Prefe-rivelmente, a proteína de capsídeo ou um fragmento imunogênico específicodesta, é produzida em um vetor de expressão de eucariota ou bactéria re-combinante, que produz o antígeno que pode ser isolado e pode ser purifi-cado para preparar a vacina. Por exemplo, a proteína de capsídeo de FCVou um fragmento imunogênico específico desta, é produzida em um micro-organismo tal como bactéria, levedura, ou fungos, em uma célula eucariotatal como uma célula de mamífero ou uma célula de inseto, ou por um vetorde vírus recombinante tal como adenovírus, poxivírus, vírus de herpes, vírusde Semliki Forest, baculovírus, bacteriófago, vírus de Sindbis, ou vírus deSendai. As bactérias adequadas para produzir a proteína de capsídeo deFCV ou um fragmento imunogênico específico desta, inclui Escherichia coli.,Bacillus subtilis, ou qualquer outra bactéria que seja capaz de expressar po-lipeptídeos heterólogos. Os tipos de levedura adequados para expressar aproteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico des-ta, incluem Saccharomyces eerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Can-dida, ou qualquer outra levedura capaz de expressar polipeptídeos heterólo-gos. Os métodos para usar as bactérias acima mencionadas, células eucari-óticas ou vetores de vírus recombinante para produzir os antígenos para asvacinas, são bem conhecidos na técnica.
Para produzir a vacina que consiste na proteína de capsídeo ouum fragmento imunogênico específico desta, o ácido nucléico que codifica aproteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico des-ta, é clonado em um plasmídeo, e o ácido nucléico é operavelmente ligado aum promotor que efetua a expressão da proteína de capsídeo ou um frag-mento imunogênico específico desta em um microorganismo. Os promotoresadequados incluem, porém não estão limitados, promotor de fago T7, pro-motor de fago T3, promotor de β-galactosidase, e o promotor de fago Sp6. Aexpressão da proteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênicoespecífico desta, em um microorganismo permite a proteína de capsídeo serproduzida empregando tecnologias de fermentação que são comercialmenteempregadas para produzir quantidades grandes de polipeptídeos antigêni-cos recombinantes. Os métodos para isolar e purificar os antígenos são bemconhecidos na técnica e incluem métodos tal como filtração de gel, cromato-grafia de afinidade, cromatografia de permuta de íons, ou centrifugação.
Para facilitar o isolamento da proteína de capsídeo de FCV ouum fragmento imunogênico específico desta, é feito um polipeptídeo de fu-são onde a proteína de capsídeo ou um fragmento imunogênico específicodesta é ligada a outro polipeptídeo que permite o isolamento através decromatografia de afinidade. Preferivelmente, um polipeptídeo de fusão e feitoempregando sistemas infra de expressão. Por exemplo, a seqüência de áci-do nucléico de cDNA que codifica a proteína de capsídeo de FCV ou umfragmento imunogênico específico desta, é ligada na terminação 5' ou termi-nação 3' a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo. Os ácidos nu-cléicos são ligados na própria estrutura de leitura de códon para permitir aprodução de um polipeptídeo de fusão onde a terminação carboxila e/ou a-mino da proteína de capsídeo ou porção desta é fundida a um polipeptídeoque permite a recuperação simplificada do antígeno como um polipeptídeode fusão. O polipeptídeo de fusão também pode prevenir o antígeno de serdegradado durante a purificação. Ao mesmo tempo onde uma vacina quecompreende o polipeptídeo de fusão é eficaz, em alguns exemplos pode serdesejável remover o segundo polipeptídeo após a purificação. Portanto,também é contemplado que o polipeptídeo de fusão contenha um sítio declivagem na junção entre o antígeno e o polipeptídeo. O sítio de clivagemconsiste em uma seqüência de aminoácido que é clivada com uma enzimaespecífica para a seqüência de aminoácido no sítio. Os exemplos de taissítios de clivagem que são contemplados incluem o sítio de clivagem de en-terocinase que é clivado por enterocinase, o sítio de clivagem do fator Xaque é clivado pelo fator Xa, e o sítio de clivagem de GENENASE que é cli-vado por GENENASE (GENENASE é uma marca registrada de New En-gland Biolabs, Beverly, Massa). A seguir são métodos para produzir a prote-ína de capsídeo ou um fragmento imunogênico específico desta como umpolipeptídeo de fusão ou como um antígeno isolado livre do polipeptídeo.
Um exemplo de um sistema de expressão de procariota paraproduzir a proteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico es-pecífico desta como um polipeptídeo de fusão para uso em vacinas é o Sis-tema de Fusão de Gene de S-transferase de Glutationa (GST) disponibiliza-do por Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J. que usa o plasmídeode vetor de expressão pGEX-4T-1. O cDNA que codifica a proteína de cap-sídeo ou um fragmento imunogênico específico desta, é fundido na própriaestrutura de leitura de códon com o DNA que codifica GST. A parte do GSTdo polipeptídeo de fusão permite a purificação rápida do polipeptídeo de fu-são empregando cromatografia de afinidade glutationa Sefarose 4B. Após apurificação, a porção de GST do polipeptídeo de fusão pode ser removidapor clivagem com uma protease de sítio específico, tal como trombina oufator Xa para produzir um antígeno livre do polipeptídeo de GST. A proteínade capsídeo ou um fragmento imunogênico específico desra, livre do poli-peptídeo de GST, é produzida por uma segunda rodada de cromatografia deafinidade de glutathione Sefarose 4B.
Outro método para produzir uma vacina que compreende a pro-teína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico desta, éum método que liga na estrutura o cDNA que codifica o antígeno e os có-dons de DNA que codificam poli-histidina. A poli-histidina preferivelmentecompreende seis resíduos de histidina que permitem purificação do polipep-tídeo de fusão através de cromatografia de afinidade de metal, preferivel-mente cromatografia de afinidade de níquel. Para produzir a proteína decapsídeo ou um fragmento imunogênico específico desta livre da poli-histidina, um sítio de clivagem tal como um sítio de clivagem de enterocinaseé fundido na própria estrutura de leitura entre os códons que codificam a po-li-histidina e os códons que codificam o antígeno. O antígeno é livrado dapoli-histidina através de clivagem com enterocinase, seguido por uma se-gunda rodada de cromatografia de afinidade de metal que liga a poli-histidinalivre. Este método foi mostrado ser útil para preparar o antígeno LcrV de Y.pestis que foi descrito em Motin e outros (Infecte. Immun. 64: 4313-4318(1996)). O Sistema de Xpress, disponibilizado por Invitrogen, Carlsbad, Cali-fórnia, é um exemplo de um equipamento comercial que está disponível parapreparar e então isolar a poli-histidina - proteína de fusão de polipeptídeo.
Ainda um outro método para produzir uma vacina que compre-ende a proteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico especí-fico desta, usa um método descrito por Motin e outros, Infecte. Immun. 64:3021-3029 (1995). Motin e outros descrevem um DNA que codifica um poli-peptídeo de fusão que consiste no DNA que codifica um antígeno ligado aoDNA que codifica uma porção de proteína A onde o DNA que codifica umsítio de clivagem de enterocinase é interposto na própria estrutura de leiturade códon entre o DNA que codifica a proteína Aeo antígeno. A proteína Apermite o polipeptídeo de fusão ser isolado através de cromatografia de afi-nidade de IgG, e a proteína de capsídeo livre da proteína A, é produzida a-través de clivagem com enterocinase. A proteína A é então removida poruma segunda rodada de cromatografia de afinidade de IgG.
Outro método para produzir uma vacina que compreende a pro-teína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico desta écom base nos métodos descritos na Patente dos Estados Unidos Ns5.725.863 por Daniels e outros que está aqui incorporada através de refe-rência em sua totalidade. Daniels e outros, método pode ser usado parapreparar a Vacina de capsídeo de FCV que consiste em molécula de entero-toxina onde cada molécula tem inserido nela acima de 100 resíduos de ami-noácido da proteína de capsídeo de FCV. Outros métodos para a prepara-ção de vacinas de polipeptídeo de fusão que podem ser empregados paraprepara as vacinas da presente invenção são descritos na Patente dos Es-tados Unidos Ns 5.585.100 por Mond e outros e na Patente dos Estados U-nidos Ns 5.589.384 por Liscombe. Finalmente, o Sistema de Purificação eFusão de pMAL disponível de New England Biolabs é outro exemplo de ummétodo para a preparação de um polipeptídeo de fusão onde uma proteínade ligação de maltose é fundida à proteína de capsídeo ou um fragmentoimunogênico específico desta. A proteína de ligação de maltose facilita oisolamento do polipeptídeo de fusão através de cromatografia de afinidadede amilose. A proteína de ligação de maltose pode ser ligada ao antígenopor um dos sítios de clivagem supracitados que possibilitam o antígeno serfeito livre da proteína de ligação de maltose.
Embora métodos bacterianos sejam empregados para produzir aproteína de capsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico des-ta para vacinas, pode ser desejável produzir a proteína de capsídeo ou umfragmento imunogênico específico desta em um sistema de expressão deeucariota. Um sistema particularmente útil é o sistema de expressão de ba-culovírus que é descrito na Patente dos Estados Unidos N9 5.229.293 porMatsuura e outros, que está aqui incorporado por referência em sua totalida-de. Os vetores de expressão de baculovírus adequados para produzir a pro-teína de capsídeo ou um fragmento imunogênico específico desta são osvetores de pPbac e pMbac de Stratagene; e o vetor de Bac-N-Blue1 o vetorde pBlueBac4.5, pBlueBacHis2-A,B,C, e o pMeIBac disponível de Invitrogen,Carlsbad, Calif.
Outro sistema de eucariota útil para expressar a proteína decapsídeo de FCV ou um fragmento imunogênico específico desta para vaci-nas é um sistema de expressão de levedura tal como a Expressão de Prote-ína de Levedura ESP e Sistema de Purificação disponibilizado por Stratage-ne. Outro sistema de expressão de levedura é qualquer um dos sistemas deexpressão com base em Pichia de Invitrogen. Os sistemas de expressão demamífero também são abrangidos pela presente invenção. Os exemplos desistemas de expressão mamífero são o sistema LacSwitch II, pBK Phage-mid, sistema de vetor pXT1, e o sistema de vetor de pSG5 de Stratagene; osistema de vetor de expressão de mamífero pTargeT, vetor de expressãomamífero pSI, vetor de expressão mamífero pCI, e vetores de pAdVantagedisponibilizados por Promega Corporation, Madison, Wis.; e o Sistema deExpressão Mamífero Induzível por Ecdysone-, pCDM8, pcDNA1.1, e pcD-NA1.1/Amp disponibilizado por Invitrogen.
A presente invenção também inclui uma modalidade que consis-te em vacinas que compreendem a proteína de capsídeo de FCV ou epíto-pos particulares da proteína de capsídeo como componentes de um sistemade liberação de esporo estável ao calor feito de acordo com o método ensi-nado na Patente dos Estados Unidos Ne 5. 800.821 por Acheson e outros,que está aqui incorporada por referência em sua totalidade. Portanto, a pre-sente invenção fornece uma célula bacteriana geneticamente criada quecontém um ácido nucléico que codifica a proteína de capsídeo de FCV ouum fragmento imunogênico específico desta. Quando a vacina de esporobacteriana recombinante é administrada oralmente ao gato, os esporos ger-minam no trato gastrointestinal do gato e as bactérias expressam a proteínade capsídeo ou um fragmento imunogênico específico desta que entra emcontato com o sistema imune do gato e elicia uma resposta imune. A vacinatem a vantagem de ser estável ao calor; portanto, pode ser armazenada atemperatura ambiente durante um período indefinido de tempo.
VACINAS DE IMUNIDADE PASSIVA
Embora as modalidades anteriores da presente invenção forne-cem imunidade ativa contra calicivírus de felino, a presente invenção tam-bém compreende vacinas que fornecem imunidade passiva a calicivírus defelino. Uma vacina que elicia imunidade passiva contra calicivírus de felinoconsiste em anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais que são contraa proteína de capsídeo de FCV1 um fragmento imunogênico específico des-ta, ou o vírus de FCV inteiro.
Para preparar uma vacina de imunidade passiva que compreen-de anticorpos de policlonais, a proteína de capsídeo de FCV desta, ou umfragmento imunogênico específico desta é injetada em um hospedeiro ade-quado para preparar os anticorpos, preferivelmente o hospedeiro é um cava-lo, porco, coelho, ovelha, ou cabra. Os métodos para produzir as vacinas deanticorpo policlonal destes hospedeiros são bem conhecidos na técnica. Porvia de exemplo, a proteína de capsídeo ou um fragmento imunogênico espe-cífico desta ou capsídeo de FCV de calicivírus inteiro é misturado com umadjuvante, tal como completo de Freund ou o TiterMax menos tóxico dispo-nibilizado por CytRx Corp., Norcross, Ga., que foi administrado então aohospedeiro por métodos bem conhecidos na técnica. A produção de anticor-po é monitorada e quando anticorpo suficiente foi produzido, o soro é remo-vido do hospedeiro e preferivelmente o anticorpo é recuperado do soro.
A vacina de imunidade passiva pode compreender um ou maisanticorpos monoclonais contra um ou mais epítopos da proteína de capsídeode FCV ou vírus de FCV inteiro. Os métodos e hibridomas para produzir an-ticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica. Ao mesmo tempo on-de os anticorpos monoclonais podem ser feitos empregando tecnologias dehibridoma bem conhecidas na técnica, os anticorpos monoclonais contra oantígeno também podem ser feitos de acordo com os métodos de exibiçãode fago como descrito na Patente dos Estados Unidos Ns 5.977.322 porMarks e outros, que está aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Os anticorpos felinizados contra a proteína de capsídeo ou porção desta po-dem ser feitos de acordo com os métodos que foram empregados para hu-manizar anticorpos como aqueles descritos nas Patentes dos Estados Uni-dos N—5.693.762 e 5.693.761 ambas por Quenn e outros, que estão aquiincorporadas por referência em sua totalidade. Um kit de exibição de fagoque é útil para reparar anticorpos monoclonais é o Sistema de Anticorpo Fa-go Recombinante disponibilizado por Amersham Pharmacia Biotech.
ANTICORPOS. POLICLONAIS E MONOCLONAIS
Esta invenção também compreende, descreve e reivindica váriosanticorpos monoclonais muito importantes. Estes anticorpos foram desen-volvidos aqui para identificar rapidamente e em alguns casos definir as ce-pas virais descritas aqui. Exemplos particulares de anticorpos monoclonais esuas descrições, podem ser encontrados nos seguintes exemplos. Em parti-cular, veja EXEMPLO 1-2 e TABELA 1-2, e especialmente EXEMPLO 1-8,TABELA 1-4.
Os seguintes exemplos são pretendidos promover, porém nãolimitar um entendimento adicional da presente invenção
EXEMPLOS PARTE 1
EXEMPLO 1-1
ISOLAMENTO E CRESCIMENTO DE FCV-21
A cepa 21 de calicivírus de felino (FCV) (FCV-21) foi coletadaem junho de 1993 de uma exibição de gato Ann Arbor, Michigan. Foi diluídoem microtubos de 96 cavidades contendo 1% de meio e diluições de 1:10foram feitas. 100 ul da amostra diluída foram adicionados a 100 ul de célulasde CRFK em uma placa de 96 cavidades.
O vírus de FCV-21 foi purificado três vezes por diluição limitadaem placas de 96 cavidades. O sobrenadante viral da purificação final foi re-movido e empregado para infectar células de CRFK crescidas a 75% de con-fluência em um frasco T25. Quando 100% de CPE foram observados, a sus-pensão era congelada/descongelada três vezes e aliquotada em frascos fri-os (1 ml/frasco). O título desta matéria-prima viral foi determinado ser 1,5 χ10® de TCID5o/ml.
FCV-21 foi depositado com a American Type Culture Collection(ATCC)1 10801 Blvd. University, Manassas, VA, 20110, E.U.A., e número deacessão de ATCC designado PTA
EXEMPL01-2
IMUNOFLUORESCÊNCIA E ELISA DE FCV-21 USANDO VÁRIOS ANTI-CORPOS MONOCLONAIS PREEXISTENTES OU COMERCIAIS
Para o ensaio de imunofluorescência (IFA), uma matéria-primaviral de FCV-21 foi empregada para infectar uma placa de 24 cavidades se-meada com células NLFK crescidas a aproximadamente 90% de confluên-cia. Em aproximadamente 20 horas após a infecção, a placa foi lavada duasvezes com 1x PBS, e fixada com 80% de acetona. Vários anticorpos mono-clonais foram diluídos a cerca de 2 ug/ul e adicioados às cavidades individu-ais da placa (0,2 ml/cavidade). Após uma incubação de 1 hora em tempera-tura ambiente (RT) com agitação, cada cavidade foi lavada duas vezes com1x de PBS, e anticorpo secundário (anticamundongos FITC, 10 ug/ml) foiadicionado. Após cobrir a placa com folha de alumínio e incubar durante 30minutos a RT com agitação, cada cavidade foi lavada duas vezes com 1x dePBS, e secada em ar. Cada cavidade foi observada então sob um microscó-pio de fluorescência quanto à sua intensidade de manchamento com FITC.
Para o ensaio de ELISA, uma placa de ELISA de 96 cavidadesfoi coberta com 200 ul de um anticorpo policlonal de coelho anti-FCV (PfizerNo.16), diluída 1:1500 em tampão de carbonato de sódio (1,59 g de Na2C03e 2,93 g de NaHC03 dissolvidos em 1 litro de água). A placa foi incubadadurante a noite a 4°C. A placa foi lavada três vezes com 1x de PBS (pH 7,4)contendo 0,05% de Tween-20 (PBST), então bloqueada com 200 ul de 1%de Caseína em PBST durante 1 hora a 37°C. Vários anticorpos monoclonaisforam diluídos a cerca de 0,1 ug/ml e adicionados às cavidades individuais(100 ul/cavidade). Cada amostra foi feita em triplicata. Após a incubação a37°C durante 1 hr, cada cavidade foi lavado 3 vezes com PBST, e incubadacom 100 ul de IgG anticamundongo de Cabra AffiniPure conjugado por pero-xidase diluído em 1:200 (H+L) (Jackson ImmunoResearch, cat. No.715-035-150) durante 1 hora a 37°C. Cada cavidade foi então lavada 3 vezes comPBST, seguido pela adição de 100 ul de substrate de peroxidase ABTS (K-PL, Gaithersburg, Maryland, cat. N9 50-66-18) a cada cavidade. Após apro-ximadamente 10 minutos a RT a placa foi lida a 405-490 nm (comprimentode onda dual) com um leitor de ELISA. A atividade específica foi calculadacom base na relação de sinal/ruído.
Os conjuntos de dados dos ensaios de IFA e ELISA se correla-cionaram bem entre si (TABELA 1-2), e indicou que FCV-21 é imunologica-mente distinto de F9, uma cepa de vacina de FCV geralmente empregada.Dois anticorpos monoclonais (FCV 1-43 e MAB791P) reagiram com F9, po-rém não com FCV-21 (TABELA 1-2).TABELA 1-2
SUMÁRIO DAS AFINIDADES DE VÁRIOS ANTICORPOS MONOCLONAISPARA FILAMENTOS DE FCV F9 E FCV-21
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EXEMPLO 1-3. ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DE CAPSÍDEO DE FCV-21
RNA total foi isolado do sobrenadante de uma cultura e célulainfectada com FCV-21 empregando reagente TRIzoI (Invitrogen; Carlsbad1CA). Uma preparação de cDNA da "primeira cepa" foi sintetizada empregan-do iniciadores aleatórios e transcriptase inversa Superscript Il (Invitrogen). Areação de PCR foi realizada empregando polimerase XL rTth (Applied Bi-osystem; Foster City, CA) e iniciadores de oligonucleotídeo DEL-653 (SEQID NO. 1) e DEL-651 (SEQ ID NO. 2). O produto de PCR resultante foi se-qüenciado empregando substância química de BigDye e um Analisador Ge-nético ABI377. A seqüência de capsídeo completa é listada como SEQ IDNO. 12 para seqüência de nucleotídeo e SEQ ID NO. 13 para seqüência deaminoácido codificada.
EXEMPLO 1-4. ISOLAMENTO E CRESCIMENTO DE FCV - 49
A cepa 49 de calicivírus de felino (FCV) (FCV-49, também cha-mado PHA-49) foi coletada em 1993 de uma amostra de gato da Filadélfia,PA. O espécime foi diluído em microtubos de 96 cavidades contendo 1% demídia, e foram feitas 1:10 diluições. 100 ul da amostra diluída foram adicio-nados a 100 ul de células CRFK em uma placa de 96 cavidades. O vírus deFCV-49 foi purificado três vezes por diluição limitada em placas de 96 cavi-dades. O sobrenadante viral da purificação final foi removido e empregadopara infectar células de CRFK crescidas a 75% de confluência em um frascoT25. Quando 100% de CPE foram observados, a suspensão foi congela-da/descongelada três vezes e aliquotada em frascos frios (1 ml/frasco). Otítulo desta matéria-prima viral foi determinado ser 6,8 χ 107 TCID5o/ml.FCV-49 foi depositado com a American Type Culture Collection(ATCC), 10801 Blvd. University, Manassas, VA, 20110, E.U.A., e númeroacessão ATCC designado PTA.
EXEMPLO 1-5. ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DE CAPSÍDEO DE FCV-49
RNA total foi isolado do sobrenadante de uma cultura de célulainfectada por FCV-49 empregando reagente TRIzoI (Invitrogen; Carlsbad,CA). Uma preparação de cDNA da "primeira cepa" foi sintetizada empregan-do iniciadores aleatórios e transcriptase reversa Superscript Il (Invitrogen). Areação de PCR foi realizada empregando a polimerase XL rTth (Applied Bi-osystem; Foster City, CA) e iniciadores de oligonucleotídeo DEL-653 (SEQID NO:1) e DEL-651 (SEQ ID NO:2). O produto de PCR resultante foi se-qüenciado empregando substância química de BigDye e um Analisador Ge-nético ABI377. A seqüência de capsídeo completa é mostrada como SEQ IDNO. 14 para seqüência de nucleotídeo e SEQ ID NO. 15 para seqüência deaminoácido codificada.
EXEMPLO 1-6. ISOLAMENTO E CRESCIMENTO DE FCV -26391-4
A cepa de calicivírus de felino (FCV) 26391-4 (FCV-26391-4) foicoletada em 2003 da Sociedade Humanitária de Município de Baía (Cidadede Panamá, Flórida). Foi purificada uma vez por diluição limitada em umaplaca de 96 cavidades contendo meio de DMEM (Invitrogen) com 2% de so-ro bovino fetal. O vírus purificado foi então empregado para infectar um fras-co de T150 contendo células NLFK (Norden Lab Feline Kidney). Uma vezque 100% de CPE foi alcançado, a suspensão foi congelada/descongelada ealiquotada em frascos frios (0,85 ml/frasco). O título viral desta matéria-primafoi determinado ser 5,6 χ 107 TCID50/ml.
FCV-26391-4 foi depositado com a American Type Culture Col-lection(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, USA,e númerode acessão ATCC designado PTA_.
EXEMPLO 1-7. ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DE CAPSÍDEO DE FCV 26391 -4
RNA total foi isolado do sobrenadante de uma cultura de célulainfectada por FCV 26391-4 empregando um Kit de Isolamento de RNA ViralQIAamp (Qiagen; Valencia, CA). Aproximadamente 1 ug de RNA viral foiempregado em RT-PCR (SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq;de Invitrogen). As condições de reação foram: 30 minutos a 50°C; 2 minutosa 94°C; seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C,e 2 min a 70°C; seguido por uma incubação final a 72°C durante 10 min, earmazenamento a 4°C. Os iniciadores empregados foram FCV-N2 (SEQ IDNO. 3) e iniciador 2 FCV (SEQ ID NO. 9). O produto de PCR foi então se-qüenciado empregando vários iniciadores de oligonucleotídeo (SEQ ID NO.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 11). A seqüência do capsídeo inteira para FCV26391-4 é mostrada como SEQ ID NO. 16 para seqüência de nucleotídeo eSEQ ID NO. 17 para seqüência de aminoácido codificada.
As seqüências de aminoácido dos genes de capsídeo de FCV-21, FCV-49 e FCV-26391-4 foram alinhadas com todas as seqüências decapsídeo FCV de tamanho natural disponíveis em GenBank. O alinhamentofoi criado empregando o algoritmo de CIustaIW (Thompson e outros, 1994),a matriz de peso PAM250 (Dayhoff e outros, 1978), e parâmetros de pro-grama default (MegAlign; DNASTAR, lnc; Madison, Wl). A identidade entreas seqüências de proteína de capsídeo de FCV-21 e FCV 213-95, a maiselevada entre todas as entradas em GenBank, é 90,7%. As seqüências decápside FCV-49 e FCV 213-95 são 92,2% idênticas. As seqüências de cap-sídeo FCV 26391-4 e FCV CFI-68 são 91,3% idênticas a cada outra.
Uma única seqüência de capsídeo é apresentada para FCV-21,FCV-49, e FCV 26391-4, e é com base no seqüenciamento direto dos produ-tos de PCR obtidos. Entretanto, cada uma destas seqüências representa amédia, ou seqüência de consenso, entre uma população de quasispeciesvirais, que é conhecida por existir dentro das populações virais RNA (parauma revisão, veja Domingo e outros, Virus Res. 82:39-44; 2002). As quasis-pecies são um resultado direto de erros que ocorrem durante a reproduçãode genoma de RNA, gerando progênie que tem mutações dentro de seu ge-noma. Portanto, é esperado que variantes menores das seqüências de cap-sídeo para estas e outras seqüências de gene de capsídeo de FCV existamnaturalmente. Entretanto, a distribuição de mutações dentro de cada é talque elas tenham pouco/nenhum efetuar sobre a identidade total entre ascepas, incluindo FCV-21, FCV-49, e FCV 26391 -4 .
EXEMPLOS 1-8. GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ESPECÍ-FICOS PARA FCV-21.
A. Purificação de FCV-21. Cerca de 200 ml de sobrenadante de cultura decélula de células de NLFK infectadas com FCV-21, foram centrifugadosa 3.000 rpm durante 30 minutos a 10°C. 25 ml do sobrenadante foramtransferidos em tubos centrífugos Beckman Ultraclear, e 10 ml de umasolução de sacarose a 10% foram revestidos no fundo do tubo. Os tu-bos foram então centrifugados a 27.000 rpm durante 2 horas a 15°C.Seguinte a centrifugação, os sobrenadantes foram removidos e descar-tados, e os péletes foram ressuspensos em 250 ul de água estéril. Aconcentração de proteína foi determinada ser 7 mg/ml empregando oKit de Ensaio de Proteína Micro BCA (Pierce Chemical Cia., Rockford,IL).
IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS E GERAÇÃO DE CLONES DE CÉLU-LA DE HIBRIDOMA
Cerca de 100 ug de proteína de vírus FCV-21 purificada foraminjetados em cada camundongo junto com o adjuvante de Freund. Oito ca-mundongos foram vacinados. Duas imunizações de reforço foram realizadascom 100 ug de FCV-21 purificado com adjuvante de RIBI em intervalo de 4semanas. As respostas imunes para esses oito camundongos foram deter-minadas ter título de 31250 ou acima de ELISA empregando FCV-21 purifi-cado. A fusão de célula foi realizada para criar clones de hibridoma. Sessen-ta e oito de tais clones de célula foram crescidos e o sobrenadante testadoquanto a sua reatividade com FCV-21.
Para este ELISA, uma placa de 96 cavidades de ELISA foi re-vestida com 100 ul de FCV purificado a uma concentração de 5 ug/ml, diluí-da em 1xPBS. A placa foi secada durante a noite a 37°C descoberta em umaincubadora não umedecida. O vírus na placa foi fixo aplicando-se 0,1 ml demetanol e incubando a temperatura ambiente durante 5 minutos. A placa foientão lavada 8 vezes com água destilada, em seguida bloqueada com 200 ulde 10% de soro caseiro em 1x PBS durante a noite a 4°C. A placa foi lavadanovamente por 8 vezes com água destilada. Várias diluições de amostras desoro de camundongos foram adicionadas às cavidades individuais (100ul/cavidade). Cada amostra foi feita em triplicata. Após incubação a 37°Cdurante 1 hr, cada cavidade foi lavado 3 vezes com PBST, e incubada com100 ul de IgG anticamundongos de Cabra AffiniPure conjugado por peroxi-dase diluído 1:200 (H+L) (Jackson ImmunoResearch, cat. Ns 715-035-150)durante 1 hora a 37°C. Cada cavidade foi então lavada 3 vezes com PBST,seguido pela adição de 100 ul de substrato de peroxidase ABTS (KPL, Gai-thersburg, Maryland, cat. Ns 50-66-18) a cada cavidade. Após aproximada-mente 10 min a RY, a placa foi lida a 405-490 nm (comprimento de ondadual) com um leitor de ELISA. Atividade específica foi calculada com basena relação de sinal/ruído.
REATIVIDADE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ESPECÍFICOS DEFCV-21
Os sobrenadantes dos clones de célula de hibridoma acima fo-ram empregados para testar quanto à sua reatividade a FCV-21 como tam-bém F9 em ensaio de ELISA sanduíche. Brevemente, uma placa ELISA de96 cavidades foi coberta com 200 ul de um anticorpo policlonal de coelhoanti-FCV (Pfizer No.16), diluído 1:1500 em tampão de carbonato de sódio(1,59 g de Na2CO3 e 2,93 g de NaHCO3 dissolvido em 1 litro de água). Aplaca foi incubada durante a noite a 4°C. A placa foi lavada três vezes com1x PBS (pH 7,4) contendo 0,05% de Tween-20 (PBST), em seguida bloque-ada com 200 ul de 1% de Caseína em PBST durante 1 hora a 37°C. Os so-brenadantes F-9 e FCV-21 e foram adicionados a cada cavidade em diluiçãode 1:10. Após incubação a 37°C durante 1 hora, as placas foram lavadas evários sobrenadantes de hibridoma e sua várias diluições foram adicionadasàs cavidades individuais (100 ul/cavidade) em triplicata. As placas foram en-tão incubados a 37°C durante 1 hr, lavadas 3 vezes com PBST, e incubadascom 100 ul de IgG anticamundongo de Cabra AffiniPure conjugado por pero-xidase diluído 1:200 (H+L) (Jackson ImmunoResearch, cat. Ns 715-035-150)durante 1 hora a 37°C. Após lavagem, 100 ul de substrato de peroxidaseABTS (KPL, Gaithersburg, Maryland, cat. Ne 50-66-18) foram adicionados acada cavidade. Após aproximadamente 10 min a RT a placa foi lida a 405-490 nm (comprimento de onda dual) com um leitor de ELISA. Atividade es-pecífica foi calculada com base na relação de sinal/ruído.
TABELA 1-3.
AVALIAÇÃO DE ELISA DE VÁRIOS SOBRENADANTES DE CÉLULAS PEHIBRIDOMA QUANTO À SUA REATIVIDADE ESPECÍFICA PARA FCV-21VS. F9.
<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>
Β. Anticorpos monoclonais específicos para FCV-21 e não outras cepasde FCV. Dezoito clones de célula de hibridoma (3, 7, 17, 23, 27, 29, 30,36, 37, 40, 41, 42, 44, 53, 56, 59, 60 e 61) foram escolhidos para se-rem também testado quanto à sua especificidade para FCV-21. Onzevírus de FCV foram empregados no ensaio (FCV-21, 49, 26391-4,F9, CFI-68, 33585, 89391, 255, J-1, 2280 e H). Novamente, ELISAsanduíche foi empregado, como descrito acima. Os resultados sãoresumidos na TABELA 1 -4.
TABELA 1-4.
REATIVIDADE DE SOBRENADANTES MONOCLONAIS CONTRA VÁRIASLINHAGENS DE FCV.
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Como demonstrado acima, as cepas de célula de hibridoma 23,41, 44 e 56 são específicas para FCV-21, e não qualquer outro FCV testado.
Portanto, esses anticorpos monoclonais podem ser empregados como umaferramenta diagnostica para FCV-21. Além disso, hibridoma 36 parece reagircom cepa de FCV de vacina somente (FCV-21, 49, 26391-4) e não qualqueroutra cepa de FCV.
As cepas de célula de hibridoma 23, 36, 41, 44 e 56 foram todasdepositadas com a American Type Culture Collection (ATCC), 10801 Blvd.University, Manassas, VA, 20110, E.U.A., e números de acessão ATCC de-signado:
PTA-7349 (23)PTA-7350 (36)PTA-7353 (41)PTA-7351 (44)PTA-7352 (56)
EXEMPLO 1-9.
ANÁLISE DA NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE SORO DE SOROS DEFCV-21 E FCV-49 CONTRA VÍRUS DE FCV ISOLADOS EM 1993.
A. Titulação de anti-soro homólogo. Anti-soro convalescente contra dozeisolados de FCV foi elevado em gatos livres de patógeno específico(SPF), e coletado após uma inoculação primária e secundária. O inócu-Io de vírus variou de acordo com os títulos de matéria-prima, variandode 104 a 108 TCID50/gato. Os gatos foram inoculados inicialmente, re-forçados 3 semanas depois, e então foram sangrados para soro que 2semanas após o reforço. Os doze isolados incluíram F9, CFI-68,LS012, JOK63, JOK92, e isolados de campo 18, 21, 49, 50, 54, 27, e11. Os isolados de campo foram selecionados com base em uma aná-
Iise filogenética das seqüências da região hipervariável de cada se-qüência de proteína de capsídeo da cepa. O isolados mais divergentesforam escolhidos para o estudo.
Os soros foram inativados por calor a 56°C durante 30 minutos,e titulados contra seu vírus homólogo empregando um vírus constante stan-dard - técnica de soro variante (Griest 1979, Mahy 1996). Brevemente, osmeios (100-150 μΙ) foram adicionados a cada cavidade de uma placa de cul-tura de tecido de 96 cavidades. O soro (100-150 μΙ) foi adicionado a cadacavidade da fila de topo (1:2 ou 1:4 diluição de soro inicial; F9 e LS012 em1:4), e 100 μΙ foram transferidos para placa após a misturar (1:2 diluições)com um pipetador de multicanal. O último em 100 μΙ foi descartado. 50 μΙ devírus homólogo titulado (diluído a 200 TCID50/50 μΙ) foi adicionado a cadacavidade, e as placas foram incubadas durante 2 h a 37°C em uma incuba-dora de CO2. Após incubação, 50 μΙ de uma diluição de 1:10 de célulasCRFK em suspensão foram adicionados a cada cavidade. Uma placa detítulo de vírus foi montada empregando o vírus diluído para garantir que uminóculo apropriado foi adicionado a cada cavidade. 50 μΙ de vírus foram em-pregados na fila de topo contendo 150 μΙ de meio; o resto da placa conteve180 μΙ/cavidade, e diluições de 10-dobras foram realizadas abaixo da placacom 20 μΙ. As placas foram incubadas durante 4 dias, e a fórmula de Kãrberfoi empregada para calcular o soro e títulos virais (no caso de títulos de soro,a proporção de cavidades protegidas para desprotegidas foi empregada naequação).
Quando titulando o soro, o TCID50 foi definido como os 50% dediluição de finalidade neutralizante (Griest 1979). Uma unidade de anticorpo(AU) foi definida como a diluição mais elevada daquele anti-soro capaz deneutralizar 32-320 TCID50 do vírus homólogo em 50% das culturas de teste.Portanto, o TCID5O obtido é igual a 1 AU. As neutralizações cruzadas de ví-rus foram realizadas contra as concentrações de soro de 2,5, 5, 10 e 20 AU.
B. Ensaio de neutralização cruzada de vírus.
Cada campo viral isolado, como também cepas F9, LS012,JOK63, JOK92, SA113 e CFI-68, foi testado contra cada dos doze anti-sorosde FCV em um ensaio de neutralização cruzada. Cada vírus requereu cincoplacas de 96 cavidades. Cada soro foi diluído a 2,5, 5, 10 e 20 AU e semea-do em réplicas de oito abaixo da placa (três seros/placa para um total dequatro placas), e uma placa de título de vírus (ajustada do mesmo modocomo para titulações de soro). As diluições de anti-soros foram preparadasem DMÉM primeiro diluindo-se o soro a 20 AU, e em seguida realizando di-luições de 2 dobras até 2,5 AU. Uma alíquota de cada diluição (100 μΙ) foientão adicionada a cada coluna de cavidades na placa. Os vírus foram rapi-damente descongelados a 37°C, colocados em gelo, e então diluídos a 200TCID50/cavidadel (mantidos no gelo). Para manter a consistência, um pro-cesso de diluição de três etapas foi usado para a maioria das matérias-primas virais, nunca indo mais elevado do que uns 1:100 em qualquer etapa.A matéria-prima de vírus diluída (50 μΙ) foi adicionada a todas as cavidadesdas placas de soro e tituladas como descrito previamente. As placas foramincubadas a 37°C em uma incubadora de CO2 durante 2 hr após o que 50 μΙde diluição 1:10 de uma suspensão de célula CRFK previamente crescidapara confluência foram adicionados a cada cavidade. As extremidades daspipetas e cubas do reservatório foram alteradas após cada série de cincoplacas. As placas foram classificadas após 4 dias. Em alguns casos, o víruspré-titulado, pré-diluído foi empregado.
TABELA 1-5.
RESULTADOS DA NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE SORO
<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>
* 2,5, 5, 10, 20 unidades de anticorpo empregadas em SN N= 8/8 cavida-des protegidas
n= 4-7/8 cavidades protegidas = 0-3/8 cavidades protegidasvazio= soro insuficiente/não feito
TABELA 1-5 (CONTINUAÇÃO)
<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>
* 2„ 5,10, 20 unidades de anticorpo empregadas em SNN= 8/8 cavidades protegidasn= 4-7/8 cavidades protegidas-= 0-3/8 cavidades protegidasvazio = soro insuficiente/não feito
Os dados de neutralização cruzada são resumidos na TABELA1-5. Cada ponto de dados representa oito cavidades de réplica ensaiadas."N", "n", ou " -" represente a proporção de cavidades protegidas para nãoprotegidas, que é uma indicação da extensão de neutralização cruzada. Osresultados da neutralização de soro correspondendo a cada soro monoes-pecífico testado contra seu vírus homólogo é realçado na TABELA. Estessoros deveriam neutralizar completamente; a maior parte deles neutraliza.
As poucas exceções, notavelmente JOK63, JOK92 e 11, mostram neutrali-zação completa a valores AU mais altos, porém não a 2,5 AU. Isto é prová-vel devido a erros de diluição. O resultado mais significante desta série dedados é o grau elevado de neutralização cruzada exibida por soros FCV-21e FCV-49, particularmente o último. Os padrões de neutralização cruzadadestes soros parecem ser semelhantes àqueles de F9. (Deveria ser notadoque a série de dados para F9, e para FCV-21 e FCV-49 a 20 AU, é incom-pleto devido a quantidades insuficientes de soros). Embora existam algumasdiferenças em padrões de neutralização entre os três soros (FCV-21, FCV-49, e F9), os isolados 11, 38 e 39 não foram neutralizados consistentementepor quaisquer dos três.EXEMPLO 1-10.
ANÁLISE DE NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE ANTI-SOROS FCV-21 E EFCV-49 CONTRA VÍRUS DE FCV ISOLADOS EM 2003.
Os anti-soros de FCV neste estudo foram gerados inoculando105 a 106 dCID50/ml de FCV intranasalmente em gatos (4-5 gatos/grupo).Uma inoculação de reforço foi realizada 3 semanas após empregar a mesmaquantidade de vírus. Os soros foram coletados 2 semanas pós-reforço e tra-tados com calor a 56°C durante 30 minutos.
As amostras de soro de cada dos gatos vacinados foram empre-gadas no ensaio de neutralização de soro contra cada das 26 cepas de FCV(TABELA 1 -6). As amostras de soro foram diluídas a 1:8 e seguidas por dilu-ições seriais de 2 dobras consecutivas para 1:16384 (total de 12 diluições)em 600 ul de volume. FCV com faixa de título entre 50-500 TCID50/ml em600 ul foram misturados com amostras de soro diluídas juntas e incubados atemperatura ambiente durante 45 minutos. Em seguida, 200 ul de amostraforam transferidos em cada cavidade da placa de 96 cavidades semeadacom células de CRFK em quadruplicação. As placas foram incubadas a37°C, 5% de CO2 durante 6 dias e o título de neutralização de finalidade foideterminado/Tanto o título de neutralização de soro (SN) quanto o título-reverso de vírus de desafio foram calculados pelo método de Spearman-Karber (Spearman C, 1908, Brit J Psychol 2:227-242; Karber G, 1931, Archexp Path Pharmak 162: 480-487).
Os dados de neutralização de soro foram analisados com títulosde corte de >23 e >15 e >10. Os resultados são mostrados na TABELA 1-7.Os dados sugerem FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4 tenham perfis de neu-tralização cruzada mais amplos, e são então melhores candidatos de vacinado que a cepa de vacina de FCV real, F9.
TABELA 1-6.
26 LINHAGENS DE FCV EMPREGADAS NOS ESTUDOS DE NEUTRALI-ZACÂO CRUZADA
<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>TABELA 1-7.
ANÁLISE DE NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE FCV-21. FCV-49. E FCV26391-4 COMPARADO COM F9
<table>table see original document page 56</column></row><table>
EXEMPLO 1-11.
CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA E MORTALIDADE PARA GATOS VACINADOSCOM COMPONENTES DE FELOCELL 4 COM E SEM FCV-21.
Gatos de pêlo curto domésticos, cerca de 8 semanas de idade,foram vacinados com componentes de FELOCELL® 4 que contêm vírus derinotraqueíte de felino vivo modificado [FHV], calicivírus [FCV-F9], vírus depanleucopenia [FP] e Chlamydia psittaci, com ou sem outra cepa de FCV,FCV-21. Os regimes de vacinação avaliados incluíram: uma vacinação sub-cutânea inicial seguida por reforços subcutâneos no dia 21 (SQ/SQ); umavacinação subcutânea inicial seguida por uma imunização de reforço oral nodia 21 (SQ/Oral); ou uma vacinação oral inicial seguida por uma segundavacinação oral no dia 21. A vacinação oral foi obtida por administração davacina na boca. No dia 42, todos os gatos foram desafiados com aproxima-damente 1 mL de FCV-33585 sistêmico virulento (3 Iog de TCID50/mL). To-dos os gatos foram monitorados para sinais clínicos (temperatura, escorri-mento soroso de conjuntivite, escorrimento mucopurulenta de conjuntivite,escorrimento soroso de rinite, escorrimento mucopurulenta de rinite, espirro,ronqueiras audíveis, respiração de boca aberta com tosse, anorexia, desi-dratação, uma úlcera oral < 4 mm, úlceras orais múltiplas, úlceras orais > 4mm, salivação, úlcera externa sem sangramento, úlceras externas com san-gramento) da doença durante 14 dias após o desafio. Os gatos que exibemsinais clínicos severos pós-desafio que foram consistentes com patogênesede calicivírus foram eutanizados.
Como mostrado na TABELA 1-8, a adição da nova cepa FCV-21significantemente aumenta a eficácia de FELOCELL 4, com ou sem a pre-sença de FCV-F9. A vacinação de SQ/SQ e vacinação de SQ/Oral pareceser eficaz para prevenir infecção de FCV. Além disso, é demonstrada a efi-cácia até mesmo contra infecção de FCV com vacinação Oral/Oral com adi-ção de FCV-21 e ausência de F9 em FELOCELL 4 e FELOCELL 3 (FELO-CELL 3 é FELOCELL 4 sem Chlamydia psittací).
Para TABELA 1-9, os regimes de vacinação avaliados incluíramuma vacinação subcutânea inicial seguida por duas imunizações de reforçoorais no dia 21 e dia 42 (SQ/Oral/Oral). É demonstrado que a adição deFCV-21, com ou sem FCV-F9 em FELOCELL 4, significantemente diminuiuas classificações clínicas e mortalidade.<table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table>EXEMPLO 1-12.
ANÁLISE DE NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE SOROS DE GATOS VACI-NADOS COM COMPONENTES DE FELOCELL 4 COM E SEM FCV-21
As amostras de soro de cada gato no estudo descritas em E-XEMPLO 1-11, foram coletadas seguinte a segunda vacinação, porém antesde 85 desafios. As amostras foram tratadas com aquecimento a 56°C duran-te 30 minutos, e avaliados no ensaio de neutralização de soro contra cadadas 26 cepas de FCV como previamente descrito no EXEMPLO 1-10 (TA-BELA 1-6).
Os dados de neutralização de soro foram analisados com títulosde corte de >23 e >15, e uma média dos dois títulos de corte foi calculada(Ave.). Os resultados são mostrados na TABELA 1-10. Os dados indicamque todas as formulações de vacina que contêm FCV-21 tiveram perfis deneutralização cruzada mais amplos do que as vacinas contendo a cepa deFCV-F9 tradicional (-60% vs. 40%). Isto resultou em um aumento aproxima-do de 50% no número das cepas de FCV neutralizadas.<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>Como também mostrado na TABELA 1-10, a adição das novascepas de FCV-21 significantemente aumentou o perfil de neutralização cru-zada de FELOCELL 4, com ou sem a presença de FCV-F9. Os perfis deneutralização cruzada mais amplos foram observados com vacinação deSQ/SQ e vacinação de SQ/Oral. Além disso, são demonstrados os perfis deneutralização cruzada realçados com vacinação de Oral/Oral com a presen-ça de FCV-21, porém não F9, em FELOCELL 4 e FELOCELL 3.
Na TABELA 1-11, os regimes de vacinação avaliados incluíramuma vacinação subcutânea inicial seguida por duas imunizações de reforçoorais no dia 21 e dia 42 (SQ/Oral/Oral). Os resultados indicam que a adiçãode FCV-21, com ou sem FCV-F9 em FELOCELL 4, resultou em perfis deneutralização cruzada significantemente mais amplos (40% de aumento a-proximado).<table>table see original document page 64</column></row><table>Descrição numerada da invenção. Descrição adicional das in-venções e exemplos. 1. Uma vacina para imunizar gatos contra calicivírus defelino que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-21 ou uma proteí-na de capsídeo de FCV-21 isolada. 2. Uma vacina para imunizar gatos con-tra calicivírus de felino que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-21 ou uma proteína de capsídeo de FCV-21 isolada onde a referida proteínade capsídeo compreende seqüência de proteína (SEQ ID 13) e seqüênciasque têm pelo menos cerca de 91,2%, 95% e 99% de identidade; onde a refe-rida proteína de capsídeo é fornecida em uma quantidade eficaz para produ-zir uma resposta imune, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 3. Umavacina de DNA por imunizar gatos contra calicivírus de felino que compreen-de seqüências de ácido nucléico que codificam para uma proteína de capsí-deo de FCV-21 ou uma proteína de capsídeo de FCV-21 isolada onde o re-ferido DNA compreende uma seqüência (SEQ. ID 12) e seqüências que têmpelo menos cerca de 78,7%, e 79,2% de identidade de seqüência e permi-tindo substituições conservadoras. 4. Uma vacina para imunizar gatos contracalicivírus de felino que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-49ou uma proteína de capsídeo de FCV-49 isolada, onde a referida proteína decapsídeo compreende uma seqüência de proteína de cepa FCV-49. 5. Umavacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino que compreende umaproteína de capsídeo de FCV-49, ou uma proteína de capsídeo de FCV-49isolada, onde a referida proteína de capsídeo compreende seqüência de pro-teína (SEQ ID 15) e seqüências que têm pelo menos cerca de 92,7%, 95% e99% de identidade; onde a referida proteína de capsídeo é fornecida emuma quantidade eficaz para produzir uma resposta imune, e um veículo far-maceuticamente aceitável. 6. Uma vacina de DNA para imunizar gatos con-tra calicivírus de felino que compreende seqüências de ácido nucléico quecodificam para uma proteína de capsídeo de FCV-49 ou uma proteína decapsídeo de FCV-49 isolada, onde o referido ADN compreende uma se-qüência (SEQ. ID 14) e seqüências que têm pelo menos cerca de 78,9%,isto é, 79,4% (78,9 + 0,5) de identidade de seqüência e permitindo substitui-ções conservadoras. 7. Uma vacina para imunizar gatos contra calicivírus defelino que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-26391-4, ou umaproteína de capsídeo de FCV-26391-4 isolada, onde a referida proteína decapsídeo compreende seqüências de proteína de cepa FCV-26391-4. 8.Uma vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino que compreendeuma proteína de capsídeo de FCV-26391-4 onde a referida proteína de cap-sídeo compreende seqüência de proteína (SEQ ID 17) e seqüências que têmpelo menos cerca de 91,8%, 95% e 99% de identidade onde a referida prote-ína de capsídeo é fornecida em uma quantidade eficaz para produzir umaresposta imune, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 9. Uma vacinade DNA para imunizar gatos contra calicivírus de felino que compreende se-qüências de ácido nucléico que codificam para uma proteína de capsídeo deFCV-26391-4 ou uma proteína de capsídeo de FCV-26391-4 isolada, onde oreferido DNA compreende uma seqüência (SEQ. ID 16) e seqüências quetêm pelo menos cerca de 78,4%, isto é, 78,9% (78,4 + 0,5) de identidade deseqüência. 10. A vacina de quaisquer das reivindicações 1-3, onde o polinu-cleotídeo é selecionado do grupo que consiste essencialmente em SEQ IDNOS. 12, 14, 16. 11. A vacina de quaisquer das reivindicações 1-3, tambémcompreendendo ou sozinho ou em qualquer combinação os seguintes: ondecontém um adjuvante, onde o componente de FCV está vivo, onde o com-ponente de FCV é inativado, onde o componente de FCV é inativado, quepode incluir pelo menos uma outra cepa de calicivírus de felino selecionadado grupo que consiste em FCV-F9, FCV-LLK, FCV-M8, FCV-255, e FCV-2280. 12. A vacina das reivindicações, 1, 4, e 7, onde a vacina inclui pelomenos um outro patógeno de felino, selecionado do grupo que consiste emvírus de herpes felino, vírus de leucemia felino, vírus de imunodeficiênciafelino, Chlamydia pssittaci, e parvovírus de felino, vírus de raiva e Bordetellabronchiseptica. 13. Uma vacina para imunizar gatos contra calicivírus de feli-no que compreende uma seqüência de nucleotídeo de uma proteína de cap-sídeo de FCV selecionada do grupo que consiste em um polipeptídeo quetem 93% ou mais de identidade com SEQ ID NO. 13, 15, ou 17, onde o isola-do de FCV não é a cepa 213-95, e onde a seqüência de ácido nucléico éoperavelmente ligada a uma seqüência promotora heteróloga, em umaquantidade eficaz para produzir uma resposta imune, e um veículo farma-ceuticamente aceitável. 14. A vacina da reivindicação 13, onde a seqüênciade nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste essencialmente emSEQ ID NOS. 12, 14 e 16. 15. A vacina da reivindicação 13, onde a seqüên-cia de nucleotídeo está em qualquer dos seguintes: um plasmídeo, um vetorde vírus recombinante. 16. A vacina da reivindicação 13, onde o vetor devírus recombinante é selecionado do grupo que consiste em vírus de herpesfelino, poxivírus de guaxinim, poxivírus de canário, adenovírus, vírus de Se-mliki Forest, vírus de Sindbis, e vírus de vacínia. 17. Uma composição imu-nogênica que compreende um veículo veterinariamente aceitável de excipi-ente e uma cepa isolada de FCV que se liga a um anticorpo monoclonal se-lecionado dos anticorpos monoclonais descritos aqui, tal como 23, 26, 41, 44e 56. 18. Uma composição imunogênica que compreende um veículo veteri-nariamente aceitável de excipiente e uma cepa isolada de FCV que seleti-vãmente se liga a um anticorpo monoclonal selecionado dos anticorpos mo-noclonais descritos aqui, tal como 23, 26, 41, 44 e 56. 19. As composiçõesimunogênicas da reivindicação 17 e 18, onde a cepa de FCV é inativada,onde a referida cepa de FCV é uma vacina, e onde a composição compre-ende um adjuvante. 20. Um método por imunizar um gato contra calicivírusde felino que compreende: administrar ao gato uma dose eficaz de uma va-cina de quaisquer das reivindicações 1-14, onde a vacina adicionalmentecompreende um adjuvante.
PARTE 2
ESTA SEÇÃO ABAIXO FORNECE INFORMAÇÃO DETALHADA SOBREOS MÉTODOS DE IMUNIZAR ANIMAIS CONTRA VÍRUS E EM PARTICU-LAR GATOS CONTRA CALICIVÍRUS
A menos que de outro modo indicado, as descrições abaixo u-sam as definições fornecidas acima e abaixo.
Descritos aqui são métodos e materiais para tratar e imunizaranimais com vacina e em particular gatos contra calicivírus de felino (FCV).O método inclui administrar ao gato, quantidades terapeuticamente eficazesde primeiras e segundas vacinas que são capazes de induzir uma respostaimune, e em particular no gato contra FCV. A primeira vacina é tipicamenteadministrada parenteralmente, porém em algumas situações pode ser admi-nistrada oralmente, ao mesmo tempo onde a segunda vacina é administradaoralmente ou oronasalmente N dias seguinte à administração da primeiravacina. Estas vacinas são tipicamente administradas parenteralmente pri-meiro porque elas tipicamente causam lesões orais se inicialmente adminis-tradas oralmente. Surpreendentemente, são descritas cepas FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4 que são tão seguras e eficazes que elas podem ser ad-ministradas como uma primeira administração oral seguida por uma segundaadministração oral. Aqui, N é um número inteiro de 3 a 120, inclusive, porémé tipicamente um número inteiro de 7 a 42, inclusive, ou de 14 a 28, inclusi-ve, preferido é cerca de 3 semanas e também cerca de 2-4 semanas. Alter-nativamente, a segunda vacina pode ser administrada após o gato ter de-senvolvido um título de neutralização de soro de FCV de cerca de 1:6,1:9,1:12, 1:15, 1:18, ou maior.
O método também pode incluir uma ou mais administrações pa-renterais, orais ou oronasais adicionais de uma vacina de FCV M dias deadministração seguinte a primeira vacina ou a segunda vacina onde M é umnúmero inteiro de 1 a 120, inclusive. Desse modo, os regimes de vacinaçãorepresentativos incluem (1) administração subcutânea de uma primeira vaci-na de FCV, seguido por administração oral de uma segunda vacina de FCV;
(2) administrações subcutâneas sucessivas de primeiras e terceiras vacinasde FCV, seguido por administração oral de uma segunda vacina de FCV; e
(3) administração subcutânea de uma primeira vacina de FCV, seguida poradministrações orais sucessivas das segundas e terceiras vacinas de FCV.
Como descrito acima, a primeira vacina é administrada parente-ralmente (por exemplo, subcutaneamente), a Segunda vacina é administradaoralmente ou oronasalmente, e uma terceira vacina opcional pode ser admi-nistrada parenteralmente, oralmente ou oronasalmente. Qualquer dispositivopode ser empregado para administrar as vacinas, incluindo seringas, conta-gotas, dispositivos de injeção sem agulha, e outros. Para administração oro-nasal, uma seringa carregada com uma cânula pode ser empregada paracolocar gotas da vacina no nariz e boca do gato.
O método pode empregar qualquer vacina que seja capaz deinduzir uma resposta imune no gato contra FCV, contanto que a primeiravacina seja adaptada para ser administrada parenteralmente e a segundavacina seja adaptada para ser administrada oralmente ou oronasalmente.Como notado acima, a terceira vacina opcional é adaptada para ser adminis-trada parenteralmente, peroralmente, ou oronasalmente. As primeira, se-gunda, e terceira vacinas opcionais podem ser iguais ou diferentes e cadacompreende, independentemente, um antígeno ou antígenos derivados deuma ou mais cepas de FCV. As vacinas úteis desse modo incluem vacinasde vírus vivo, vacinas de vírus vivo modificado, e vacinas de vírus inativado.As vacinas de FCV vivo e vivo modificado contêm cepas de FCV que nãocausam doença em gatos e foram isolados na forma não virulenta ou foramatenuadas empregando métodos bem conhecidos, incluindo passagem emsérie em uma cepa de célula adequada ou exposição a luz ultravioleta ou ummutágeno químico. As vacinas de FCV inativado ou morto contêm cepa deFCV que foi inativada através de métodos conhecidos, incluindo tratamentocom formalina, betapropriolactona, etilenoimina binário, e outros. As vacinasexemplares incluem aquelas contendo cepas não virulentas selecionadas deFCV-F9, FCV-M8, FCV-255, FCV-2280, FCV-21, FCV-49, FCV 26391-4,etc., ou sozinha ou em combinação.
Outras vacinas úteis derivadas de uma ou mais cepas de FCVincluem vacinas recombinantes e vacinas DNA (isto é, vacinas de subunida-de). As vacinas recombinantes incluem vetores de vírus recombinante, cadacontendo um ácido nucléico que codifica um antígeno derivado de uma cepade FCV. Tais vetores podem ser preparados inserindo um cDNA que codificaum antígeno derivado de uma cepa de FCV (por exemplo, uma proteína decapsídeo) no genoma de um vírus não virulento, incluindo cepas de vírus deherpes, poxivírus, adenovírus, e similares. Para vetores de vírus, o cDNA éoperavelmente ligado a um promotor de transcrição de eucariota na termina-ção 5' do antígeno que codifica a seqüência e é operavelmente ligado a umsinal de terminação de eucariota e sinal de poli(A) na terminação 3' do antí-geno que codifica a seqüência, de forma que o promotor de transcrição eseqüências de terminação regulem a expressão do antígeno. Os promotoresde transcrição úteis incluem promotor de repetição terminal longa de vírus deRous sarcoma (RSV-LTR), promotor de imediatamente precoce Citomegalo-vírus (CMV), promotor de antígeno T dò vírus vacuolizante dos símios 40(SV40), e promotores induzíveis, tal como promotor de metalotioneína. Parauma descrição de vacinas recombinantes de FCV, veja Patente dos EstadosUnidos Nq 5.716.822 por Wardley e outros, que está aqui incorporada porreferência em sua totalidade.
As vacinas de DNA incluem moléculas de DNA (por exemplo,plasmídeos) tendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um antíge-no de FCV, tal como uma proteína de capsídeo de FCV ou um fragmentoimunogênico específico desta, que elicia uma resposta imune no gato contraFCV. O ácido nucléico que codifica seqüência é operavelmente ligado a umpromotor transcriptional que permite a expressão do DNA quando é inocula-do nas células do gato. Os promotores úteis incluem o promotor de RSV-LTR, o promotor imediatamente precoce principal de CMV, e o promotor deantígeno T de SV40. Adicionalmente, o ácido nucléico pode ser operavel-mente ligado, em ou próximo do códon de terminação da seqüência que co-difica o antígeno de FCV, a um fragmento de ácido nucléico que compreen-de um sinal de terminação de transcrição e sinal de reconhecimento de po-Ii(A). Para uma descrição das vacinas de DNA, a Patente dos Estados Uni-dos Ns 5.580.859, Patente dos Estados Unidos Nq 5.589.466, e Patente dosEstados Unidos N9 5.703.055, por Felgner e outros
Outras vacinas úteis incluem aquelas contendo um ou mais antí-genos de subunidade, tal como uma proteína de capsídeo de FCV ou umfragmento imunogênico da proteína de capsídeo, que foi isolada e purificada.
O antígeno de subunidade pode ser produzido em um vetor de expressãorecombinante que produz o antígeno in vitro empregando os métodos descri-tos acima. Ό antígeno resultante é subseqüentemente isolado e purificado.Os vetores de expressão úteis incluem vários microorganismos, incluindobactérias, leveduras e fungos, como também eucariotas, tal como células deinseto e mamífero. Outros vetores de expressão úteis incluem vírus, tal co-mo adenovírus, poxivírus, vírus de herpes, vírus de Semliki Forest, baculoví-rus, bacteriófagos, vírus de Sindbis, vírus de Sendai, e similares. A expres-são do antígeno de subunidade de FCV em um microorganismo permite aprodução da proteína antigênica que usa tecnologias de fermentação de es-cala comercial. Vários métodos podem ser empregados para isolar e purifi-car os antígenos, incluindo filtração de gel, cromatografia de afinidade, cro-matografia de permuta de íons, centrifugação, e similares.
Uma ou mais das vacinas também pode conter antígenos paraimunizar gatos contra um ou mais patógenos, além de FCV, incluindo vírusde herpes de felino, vírus de leucemia de felino, vírus de imunodeficiência defelino, vírus de panleucopenia de felino, e Clamídia de felino.
Outros componentes de vacinas podem incluir excipientes far-maceuticamente aceitáveis, incluindo veículos, solventes, e diluentes, agen-tes isotônicos, agentes de proteção, estabilizadores, conservantes, os agen-tes imunomoduladores (por exemplo, interleucinas, interferons, e outras cito-cinas), agentes vaso-construtores, agentes antibacterianos, agentes antifún-gicos, e outros. Os veículos, solventes, e diluentes típicos incluem água, sa-lina, dextrose, etanol, glicerol, e similares. Os agentes isotônicos representa-tivos incluem cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, lactose, e outros.Os estabilizadores úteis incluem gelatina, albumina, e similares.
As vacinas também podem incluir um ou mais adjuvantes queaumentam a resposta imune ao antígeno. Os adjuvantes representativosincluem adjuvantes com base em óleo, tal como o Adjuvante Completo deFreund e o Adjuvante Incompleto de Freund, adjuvantes com base em mico-lato (por exemplo, dimicolato de trealose), lipopolissacarídeos bacterianos(LPS), peptidoglicanos (isto é, mureínas, mucopeptídeos, ou glicoproteínas,tal como N-Opaca, dipeptídeo de muramila, ou análogos deste), proteoglica-nos (por exemplo, extraídos de Klebsiella pneumoniae), preparações estrep-tocócicas (por exemplo, OK432), Biostim® (por exemplo, 01K2), Iscoms (porexemplo, veja Pedido de Patente Europeu N- EP 109942, EP 180564 e EP231039), hidróxido de alumínio, saponina, dietilaminoetil-dextrana, óleosneutros (por exemplo, migliol), óleos vegetais (por exemplo, óleos de amen-doim), lipossomas, polióis de Pluronic®. Outros adjuvantes incluem, porémnão estão limitados ao, sistema de adjuvante RIBI (Ribi Inc.), alume, gel dehidróxido de alumínio, colesterol, emulsões de óleo em água, emulsões deágua em óleo, co-polímero de bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron,Emeryville CA), adjuvante de AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cam-bridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals,Inc., Birmingham, AL) ou outras frações de saponina, lipídio A de monofosfo-rila, adjuvante de lipídio-amina Avridine, enterotoxina lábil ao calor de E. coli(recombinante ou caso contrário), toxina de cólera, ou dipeptídeo de murami-la, entre outros.
Os tamanhos de dose das vacinas de FCV tipicamente variamde cerca de VmLa cerca de 2 mL, inclusive. Cada dose contém uma quan-tidade terapeuticamente eficaz do antígeno de FCV ou antígenos que podemvariar, dependendo da idade e condição geral do gato, da via de administra-ção, da natureza do antígeno de FCV, e outros fatores. Para vacinas quecontêm vírus vivo modificado ou vírus atenuados, uma dose terapeuticamen-te eficaz geralmente varia de cerca de 106 TCID50 a cerca de 108 TCID50,inclusive. Para vacinas que contêm antígenos de subunidade, tal como pro-teína de capsídeo de FCVs, uma dose terapeuticamente eficaz geralmentevaria de cerca de 10 pg a cerca de 100 μ g, inclusive. Os outros componen-tes das vacinas podem ser ajustados para modificar as propriedades físicase químicas das vacinas. Por exemplo, os adjuvantes compreendem tipica-mente de cerca de 25 pg a cerca de 1000 pg, inclusive, de uma dose de1 mL. Similarmente, os antibióticos compreendem tipicamente de cerca de 1pg a cerca de 60 pg, inclusive, de uma dose de 1 mL.
As vacinas de FCV são fornecidas em várias formas que depen-dem da via de administração, exigências de armazenamento, e outros. Porexemplo, as vacinas podem ser preparadas como soluções ou dispersõesaquosas adequadas para uso em seringas, conta-gotas, etc. ou podem serpreparadas como pós Iiofilizados que são reconstituídos em salina, tampãode HEPES, e outros, antes do uso.PARTE 2
EXEMPLOS E TABELAS
Os seguintes exemplos são pretendidos serem ilustrativos e nãolimitantes, e representam algumas modalidades específicas da presente in-venção.
EXEMPLO 2-1. REGIME DE VACINAÇÃO SUBCUTÂNEA/ORAL COM FE-LOCELL® 4 E FEL-O-VAX®
Gatos pêlo curto domésticos, 4-5 meses de idade, foram vacina-dos com FEL0CELL®4 (Pfizer Inc.; vírus de rinotraqueíte de felino vivo mo-dificado [FHV], calicivírus [FCV], vírus de panleucopenia [FP] e Chlamydiapsittaci), com FEL-O-VAX® (Fort Dodge; FHV morto, FCV, FP, e C. psittaci),ou com diluente estéril (grupo de controle). Os regimes de vacinação avalia-dos incluíram: uma vacinação subcutânea inicial seguida por reforços subcu-tâneos nos dias 21 e 42 (SQ/SQ/SQ); uma vacinação subcutânea inicial se-guida por duas imunizações de reforço orais nos dias 21 e 42(SQ/Oral/Oral); ou uma vacinação subcutânea inicial seguida por uma se-gunda vacinação subcutânea no dia 21, e um aumento oral no dia 42. Todasas doses foram 1 mL. A vacinação oral foi obtida por administração da vaci-na na boca. No dia 99, todos os gatos foram desafiados com aproximada-mente 3,5 mL de FCV-33585 sistêmico virulento (4,8 Iog de TCID50/mL). Odesafio foi realizado administrando-se aproximadamente 3 mL da dose emcomida de gato enlatada, e 0,05 mL por instilação nasal. Todos os gatos fo-ram monitorados quanto aos sinais clínicos da doença durante 14 dias pós-desafio. Os gatos que exibem sinais clínicos severos pós-desafio que esta-vam de acordo com a patogênese de calicivírus foram eutanizados.
Como mostrado na TABELA 2-1, o grupo vacinado pelo regimeSQ/Oral/Oral teve uma taxa de mortalidade de somente 10%, ao mesmotempo onde o grupo de controle teve uma taxa de mortalidade de 90%. Ogrupo vacinado pelo regime SQ/SQ/SQ teve uma taxa de mortalidade de50%, ao mesmo tempo onde o grupo vacinado pelo regime SQ/SQ/Oral tevetaxa de mortalidade de 20%. Estes resultados sugerem que vacinação deSQ seguida por um reforço Oral significantemente aumenta a efetividade davacinação de FELOCELL® 4 contra desafio de FCV virulento. Não somenteas taxas de mortalidade diminuem de 50% (SQ/SQ/SQ) para 10%(SQ/Oral/Oral) ou 20% (SQ/SQ/Oral) quando a vacinação oral foi uma partedo regime, porém como mostrado na TABELA 2-2, a severidade dos sinaisclínicos, tal como lesões de pele (SL), inâpetência (IA), depressão (DP), úl-ceras orais (OU), deficiência física (LN), espirro (SZ), escorrimento nasal(ND) e olhos aguados (WE), diminuiu também.
TABELA 2-1.
MORTALIDADE DE GATOS DESAFIADOS COM FCV-33585 VIRULENTOSEGUINTE A VACINAÇÃO (EXEMPLO 2-1)
TABELA 2-1
<table>table see original document page 74</column></row><table>
TABELA 2-2.
SINTOMAS CLÍNICOS (% DE ANIMAIS) SEGUINTE A VACINAÇÃO ESUBSEQÜENTE AO DESAFIO DE FCV-33585 (EXEMPLO 2-1)
TABELA 2-2
<table>table see original document page 74</column></row><table>TABELA 2-2
<table>table see original document page 75</column></row><table>
EXEMPLO 2-2.
TÍTULOS DE NEUTRALIZAÇÃO DE SORO DE FCV MÉDIOS SEGUINTE ÀVACINAÇÃO SQ/ORAL
As amostras de sangue tomadas dos gatos do EXEMPLO 2-1,foram coletadas nos dias de estudo 0, 21, 42, 63, 98 e 113, e avaliadas emum ensaio de neutralização de soro (SN) quanto a sua capacidade de neu-tralizar FCV. As amostras de soro foram diluídas 1:8, seguido por 2 vezes dediluições em séries para 1:16384 (total de 12 diluições) em 600 μί de volu-mes. O calicivírus de felino com um título de 50-500 TCID5o/mL em 600 μίfoi misturado com as amostras de soro diluídas e incubado à temperaturaambiente durante 45 minutos. Em seguida, 200 μί de cada amostra diluídaforam transferidos em cavidades separadas de placas de 96 cavidades se-meadas com células de Rim Felino Crandel (CrFK) em quadruplicação. Asplacas foram incubadas a 37°C, sob 5% de CO2 durante 6 dias em cujo tem-po os títulos de neutralização de finalidade foram determinados. Tanto o títu-lo de neutralização de soro (SN) quanto ao título reverso de vírus de desafioforam calculados empregando o método de Spearman-Karber. Veja, C.,Spearman, Brit. J. Psychol. 2:227-242 (1908) e G. Karber, Arco. Exp.Path.Pharmak. 162:480-487 (1931). Como mostrado na TABELA 2-3, FELO-CELL®4 administrado através dos regimes de vacinação SQ/Oral/Oral ouSQ/SQ/Oral, teve títulos de SN de FCV significantemente mais elevados.Estes dados se correlacionam com a redução significante nas taxas de mor-talidade descritas no EXEMPLO 2-1TABELA 2-3.
TÍTULOS DE SN DE FCV MÉDIOS (NEUTRALIZAÇÃO DE SORO) EM VÁ-RIOS DIAS DE ESTUDO (EXEMPLO 2-2)
TABELA 2-3
<table>table see original document page 76</column></row><table>
* Medido no dia 0, dia 21, dia 42, dia 63, dia 98, e dia 133 pós-vacinação.
EXEMPLO 2-3.
EFETIVIDADE DA ADMINISTRAÇÃO SQ/ORAL DE FELOCELL® 4 E FEL-O-VAX® CONTRA VÍRUS DE PANLEUCOPENIA DE FELINO
As amostras de soro dos gatos do EXEMPLO 2-1 também foramanalisadas quanto aos seus títulos de FP médios. Como mostrado na TA-BELA 2-4, todos os gatos eram soronegativos no começo do estudo. Subse-qüentemente, os títulos médios do grupo de controle permaneceram em 1durante a duração dos intervalos da amostragem (dias 21 e 42). Entretanto,os títulos médios dos outros quatro grupos de vacinação aumentaram signi-ficantemente.
TABELA 2-4.
TÍTULOS MÉDIOS DE ANTICORPO DE SORO PARA VÍRUS DE PANLEU-COPENIA DE FELINO (EXEMPLO 2-3)
TABELA 2-4
<table>table see original document page 76</column></row><table>TABELA 2-4
<table>table see original document page 77</column></row><table>
• Medido no dia 0, dia 21, e dia 42 pós-vacinação.
EXEMPLO 2-4.
SINTOMAS CLÍNICOS PARA GATOS VACINADOS COM FELOCELL® 4POR VÁRIAS ROTINAS DE ADMINISTRAÇÃO
A administração oronasal (ON) de FELOCELL® 4 foi obtida porinstilação de gotas nas narinas do animal. Como indicado na TABELA 2-5,grupos de 10 gatos (T1, T2, T3), 6-7 meses de idade, foram vacinados e re-forçados no dia 21 de acordo com os regimes mostrados na TABELA 2-5:vacinação subcutânea e reforço (SQ/SQ); vacinação subcutânea e reforçooronasal (SQ/ON); ou vacinação oronasal e reforço (ON/ON). A vacina foisubcutaneamente administrada no lado direito do pescoço (1 mL); a adminis-tração oronasal·foi liberada por 0,5 mL de vacina em cada narina. Começan-do no dia 1, todos os gatos foram observados diariamente para condições desaúde gerais.
TABELA 2-5.
SINTOMAS CLÍNICOS PARA GATOS VACINADOS COM FELOCELL® 4POR ROTINAS DIFERENTES DE ADMINISTRAÇÃO (EXEMPLO 2-4)
TABELA 2-5
<table>table see original document page 77</column></row><table>
Como mostrado na TABELA 2-5, os gatos que receberam am-bas vacinações oronasalmente tiveram níveis elevados de sintomas clínicos,incluindo úlceras nasais (NU), úlceras orais (OU), espirros persistentes (SZ)1escorrimento nasal (o ND), olhos aguados (WE) e inapetência passageira(IA). Os gatos vacinaram pelo regime SQ/ON, entretanto, exibiram menossintomas clínicos do que gatos vacinados com ON/ON-, sem indicação deúlceras nasais, úlceras orais, escorrimento nasal, ou olhos aguados. Alémdisso, os indivíduos no grupo SQ/ON exibiram menos espirros do que osgatos no grupo de ON/ON. O perfil de segurança do grupo de SQ/ON foi si-milar àquele do grupo de SQ/SQ.
EXEMPLO 2-5.
O EFEITO DE ROTINAS DE VACINAÇÃO DIFERENTES EM RESPOSTASSOROLÓGICAS AOS ANTÍGENOS DE FELOCELL® 4
As amostras de soro de gatos matriculados no estudo descritosno EXEMPLO 2-4, foram ensaiadas quanto à reatividade sorológica aos vá-rios antígenos virais presentes na vacina de FELOCELL® 4. Os títulos deanticorpos de neutralização de soro médios para FCV, FHV e FP foram de-terminados para os dias de estudo O, 21 e 42. Como mostrado na TABELA2-6, todos os três regimes de vacinação resultaram em uma resposta imuneforte a FP. A resposta imune a FHV foi apenas detectavelmente devido àsdificuldades com o ensaio. Entretanto, os títulos de neutralização de sorocontra FCV foram significantemente mais elevados nos grupos ON/ON eSQ/ON, quando comparado ao grupo de SQ/SQ. Estes resultados sugeremque os gatos nos grupos ON/ON e SQ/ON fossem protegidos contra um de-safio de FCV virulento, porém que o grupo de SQ/SQ pode não ser.TABELA 2-6.
RESPOSTAS SOROLÓGICAS DE GATOS VACINADOS COM FELO-CELL® 4 POR ROTINAS DIFERENTES (EXEMPLO 2-5)
TABELA 2-6
<table>table see original document page 78</column></row><table>
* Medido no dia 0, dia 21, e dia 42 pós-vacinação.EXEMPLO 2-6.
TÍTULOS DE NEUTRALIZAÇÃO DE SORO CONTRA FCV-F9 ADMINIS-TRADO POR UMA ROTINA SQ OU ON
Seis gatos por grupo foram vacinados com o antígeno de FCV-F9 presente na vacina de FELOCELL® 4, SQ ou ON. Três semanas seguin-tes à vacinação inicial, todos os gatos foram reforçados com o mesmo antí-geno pela mesma via como previamente. Todas as doses eram de 1 mL. Asamostras de soro foram coletadas três semanas após a imunização do refor-ço. Como mostrado na TABELA 2-7, os títulos de neutralização de soro fo-ram determinados para estas amostras contra um painel de 26 cepas deFCV. As cepas de FCV escolhidas para o painel foram selecionadas combase na diversidade genética (como determinado pela seqüência da sua re-gião hipervariável de capsídeo), como também distribuição geográfica. Alémdisso, o fenótipo de virulência de cada cepa também foi considerado. Asamostras de soro de gatos vacinados ON com F9 neutralizaram mais cepasde FCV nos 26 painéis do membro, quando comparadas com as amostrasde gatos vacinados com SQ. Ao empregar 23 como o valor de corte paratítulos de neutralização, a vacinação ON resultou em títulos em ou acima docorte para 26% dos membros do painel, ao mesmo tempo onde a vacinaçãoSQ resultou em somente 16% atendendo aos critérios. Para um corte detítulo de 15, a vacinação ON produziu 32% de membros de painel em ouacima do corte, SQ produziu somente 17%.
TABELA 2-7.
TÍTULOS DE NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE SORO PARA SORO GE-RADO SQ VS. ON PARA FCV-F9 CONTRA 26 PAINÉIS VIRAIS DE FCV(EXEMPLO 2-6)
TABELA 2-7
<table>table see original document page 79</column></row><table>* Título de neutralização > 23 como valor de corte; ou título de neutralizaçãode >15 como valor de corte.
EXEMPLO 2-7.
CLASSIFICAÇÕES CLÍNICAS E MORTALIDADE PARA GATOS VACINA-DOS COM DUAS DOSES DE FELOCELL® 4 OU COMPONENTES DE FE-LOCELL® 3 E FCV-21 VIVO MODIFICADO.
Gatos pêlo curto domésticos, cerca de 8 semanas de idade, fo-ram administrados com vacinas contendo vírus de rinotraqueíte de felinovivo modificado (FHV), vírus de panleucopenia (FP), Chlamydia psittaci, e (1)FCV-F9 (FELOCELL® 4 ou FELOCELL® 3), (2) FCV-F9 e FCV-21 (FELO-CELL® 4 mais FCV-21, ou FELOCELL® 3 mais FCV-21), ou (3) FCV-21 (FE-LOCELL® 4A ou FELOCELL®3A). Os regimes de vacinação incluíram: umavacinação subcutânea inicial seguida por reforços subcutâneos no dia 21(SQ/SQ); uma vacinação subcutânea inicial seguida por uma imunização dereforço oral em dia 21 (SQ/Oral); ou uma vacinação oral inicial seguida poruma segunda vacinação oral no dia 21 (Oral/Oral). Cada gato dentro dosregimes dosando diferentes (grupos T1 a T10, 10 gatos por grupo) recebeu1 mL de vacina. A vacinação oral foi obtida por administração da vacina naboca. No dia 42, todos os gatos foram desafiados com aproximadamente1 mL de FCV-33585 sistêmico virulento (3 Iong de TCID50/mL). Durante 14dias pós-desafio, todos os gatos foram monitorados quanto aos sinais clíni-cos da doença, incluindo temperatura elevada, escorrimento soroso de con-juntivite, escorrimento mucopurulenta de conjuntivite, escorrimento sorosode rinite, escorrimento mucopurulenta de rinite, espirro, ronqueiras audíveis,tosse, respiração de boca aberta, anorexia, desidratação, úlcera oral única <4 mm, úlceras orais múltiplas, úlceras orais > 4 mm, salivamento, úlcera ex-terna sem sangramento, e externas úlceras com sangramento. Os gatos queexibem sinais clínicos severos pós-desafio que estavam de acordo com pa-togênese de calicivírus, foram eutanizados.
Como mostrado na TABELA 2-8, quando comparado com a va-cinação SQ/SQ, um regime de vacinação SQ/Oral diminuiu a mortalidade de44% para 10% e melhorou a classificação clínica média de 12 para 5,5 paragatos vacinados com FELOCELL®4. Além disso, a adição da cepa de FCV-21 ao FELLOCELL® 3 e ao FELLOCELL®4, resultou em nenhuma mortalida-de pós-desafio. A substituição da cepa de FCV-F9 de FELLOCELL® 3 eFELLOCELL®4 com cepa de FCV-21 resultou na eficácia similar às vacinasque contêm FCV-F9 e FCV-21, até mesmo para um regime de vacinaçãoOral/Oral.
TABELA 2-8.
MORTALIDADE DE GATOS DESAFIADOS COM FCV-33585 VIRULENTOSEGUINTE A VACINAÇÃO DE 2 DOSES COM FELOCELL 3 OU 4, COMOU SEM FCV-F9 E/OU FCV-F21 (EXEMPLO 2-7)
TABELA 2-8
<table>table see original document page 81</column></row><table>
FELOCELL 4A: FELOCELL 4 sem FCV-F9, porém com FCV-21FELOCELL 3A: FELOCELL 3 sem FCV-F9, porém com FCV-21EXEMPLO 2-8. MORTALIDADE E CLASSIFICAÇÃO CLÍNICA PARA GA-TOS VACINADOS COM TRÊS DOSES DE COMPONENTES DE FELO-CELL® 4 E FCV-21 VIVO MODIFICADOAos gatos pêlo curto domésticos, aproximadamente 8 semanasde idade, foram administradas vacinas que contêm vírus de rinotraqueíte defelino vivo modificado (FHV), vírus de panleucopenia (FP), Chlamydia psitta-ci, e (1) FGV-F9 (FELOCELL® 4), (2) FCV-F9 e FCV-21 (FELOCELL® 4A),ou (3) FCV-21 (FELOCELL® 4B). Em cada caso, os gatos foram administra-dos com uma vacinação subcutânea inicial seguida por administrações oraissucessivas no dia 21 e dia 42 (SQ/Oral/Oral). Cada gato dentro dos regimesde dosagem diferentes (grupos T1 a T4, 10 gatos por grupo) recebeu1 mL de vacina. A vacinação oral foi obtida por administração da vacina naboca. No dia 63, todos os gatos foram desafiados com aproximadamente1 mL de FCV-33585 sistêmico virulento (3 Iog de TCID50/mL). Durante 14dias pós-desafio, todos os gatos foram monitorados quanto aos sinais clíni-cos da doença como no EXEMPLO 2-7. Os gatos que exibem sinais clínicosseveros pós-desafio de estavam de acordo com a patogênese de calicivírusforam eutanizados. Como mostrado na TABLE 2-9, a eficácia do regime dedose tripla, como medido por mortalidade pós-desafio e classificações clíni-cas, é comparável com a eficácia do regime de dosagem dupla descrito noEXEMPLO 2-7.
TABELA 2-9.
MORTALIDADE DE GATOS DESAFIADOS COM FCV-33585 VIRULENTOSEGUINTE À VACINAÇÃO DE 3 DOSES COM FCV-F9 E/OU FCV-F21 (E-XEMPLO 2-8)
TABELA 2-9
<table>table see original document page 82</column></row><table>
FELOCELL 4A: FELOCELL 4 sem FCV-F9, porém com FCV-21EXEMPLO 2-9.ANÁLISE DE NEUTRALIZAÇÃO CRUZADA DE SOROS DE GATOS VACI-NADOS COM COMPONENTES DE FELOCELL 4 COM E SEM FCV-21
As amostras de soro de cada gato no estudo descrito no EXEM-PLO 2-7 foram coletadas seguinte à segunda vacinação, porém antes dodesafio. As amostras foram tratadas com calor a 56°C durante 30 minutos, eavaliadas no ensaio de neutralização de soro contra cada das 26 cepas deFCV como previamente descrito no EXEMPLO 1-10 (TABELA 1-6).
Os dados de neutralização de soro foram analisados com títulosde corte de >23 e >15, e uma média do dois títulos de corte foi calculada(Ave). Os resultados são mostrados na TABELA 2-10. Os dados indicam queo perfil de neutralização cruzada de FELOCELL 4 (contendo FCV-F9) per-manece constante se a via de administração for SQ/SQ ou SQ/Oral. Com aadição de FCV-21, entratento-, o perfil de neutralização cruzada é grande-mente realçado quando a vacina é administrada SQ/SQ ou SQ/Oral. Alémdisso, para FELOCELL 4A (contendo FCV-21, porém nenhum FCV-F9), operfil de neutralização cruzada é realçado para vias de vacinação SQ/SQ,SQ/Oral e ainda Oral/Oral.
TABELA 2-10 <table>table see original document page 83</column></row><table>TABELA 2-10
<table>table see original document page 84</column></row><table>
tFELOCELL 4Α: FELOCELL 4 sem FCV-F9, porémcom FCV-21
"FELOCELL 3A: FELOCELL 3 sem FCV-F9, po-rém com FCV-21
Na TABELA 2-11, os regimes de vacinação avaliados incluíramuma vacinação subcutânea inicial seguida por duas imunizações de reforçoorais no dia 21 e dia 42 (SQ/Oral/Oral). Os resultados indicam que a adiçãode FCV-21, com ou sem FCV-F9 em FELOCELL 4, resultou em perfis deneutralização cruzada significantemente mais amplos (40% de aumento a-proximado).
TABELA 2-11 <table>table see original document page 84</column></row><table>TABELA 2-11 <table>table see original document page 85</column></row><table>
* FELOCELL 4Α: FELOCELL 4 sem FCV-F9, porém com FCV-21
Também foram descritas descobertas que com as vacinas des-critas aqui como peptídeos, proteínas, e DNA relacionados com as cepas deFCV, a administração de FCV-21, FCV-49 e FCV 26391-4, oral ou oronasal(ON) pode ser realizada no primeiro caso seguido por uma segunda adminis-tração oral ou oronasal sem os efeitos colaterais previamente descritosmencionados acima no EXEMPLO 2-4 e TABELA 2-5.
Deveria ser notado que, como empregado neste relatório e nasreivindicações anexas, os artigos singulares tal como "um", "uma", e "o", "a"podem se referir a um objeto ou a uma pluralidade de objetos a menos que ocontexto indique claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, referên-cia a uma composição que contém "um composto" pode incluir um únicocomposto ou dois ou mais compostos.
Será entendido que os exemplos e descrições acima são pre-tendidos serem ilustrativos e não restritivos. Muitas modalidades serão evi-dentes àqueles versados na técnica ao ler a descrição acima. O escopo dainvenção deve, portanto, ser determinado com referência às reivindicaçõesanexas, junto com o escopo total de equivalentes aos quais são intituladastais reivindicações. As descrições de todos os artigos e referências, incluindopatentes, pedidos de patente e publicações, estão aqui incorporadas porreferência em sua totalidade e para todos os propósitos.
Nas TABELAS 2-1 até 2-9, Felocell® 4, Felocell 4, ou FELOCELL4 ou aquelas palavras seguidas pelo número "3" são vacinas onde qualquervariação do nome Felocell é possuída por Pfizer. Referência a Felocell 4 A éFelocell 4 sem FCV-F9, referência a Felocell 3 A é Felocell 3 sem FCV-F9.Note, antígenos atuais empregados nestes estudos não eram do produtocomercial, de preferência os antígenos foram preparados em bateladas pe-quenas para propósitos de pesquisa somente, porém da mesma maneiracomo o produto comercial.
Todos os métodos e/ou composições descritos e reivindicadosaqui podem ser feito e realizado sem experimentação imprópria levando emconta a presente descrição. Ao mesmo tempo onde as composições e méto-dos desta invenção foram descritos em termos de modalidades preferidas,será evidente para aqueles de experiência na técnica que variações podemser aplicadas aos métodos e/ou composições e nas etapas ou nas seqüên-cias de etapas do método descrito aqui sem afastar-se do conceito, espíritoe escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agen-tes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados podemser substituídos pelos agentes descritos aqui ao mesmo tempo onde resul-tados iguais ou similares seriam obtidos. Todos tais substitutos e modifica-ções similares evidentes para aqueles versados na técnica, são julgadosestar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelasreivindicações anexas.
Descrição Numerada da Invenção. Descrições adicionais e e-xemplos. 1. Um método para imunizar gatos contra calicivírus de felino(FCV), o método compreendendo administrar a um gato quantidades tera-peuticamente eficazes de primeiras e segundas vacinas, onde as primeiras esegundas vacinas são adaptadas para induzir uma resposta imune no gatocontra FCV, a primeira vacina é administrada parenteralmente e a segundavacina é administrada oralmente ou oronasalmente, e a segunda vacina éadministrada durante N dias seguinte a administração da primeira vacina,onde N é um número inteiro de 3 a 120 dias, inclusive, também descrito é Nde cerca de 3 semanas e cerca de 2-4 semanas. 2. O método de reivindica-ção 1, onde as vacinas compreendem uma vacina de vírus vivo, uma vacinade vírus vivo modificado, uma vacina de vírus inativado, uma vacina recom-binante, uma vacina de DNA, ou uma vacina de antígeno de subunidade, ousozinhas ou em combinação. 3. O método de reivindicação 1, onde pelo me-nos uma das vacinas inclui uma ou mais cepas de FCVi 4. O método de rei-vindicação 3, onde a uma ou mais cepas de FCV compreende F9 ou FCV-21ou F9 e FCV-21. 5. O método de reivindicação 1, onde as vacinas são asmesmas. 6. O método de reivindicação 1, onde pelo menos uma das vacinastambém é adaptada para induzir uma resposta imune contra um ou maispatógenos selecionados de vírus de herpes felino, vírus de leucemia felino,vírus de imunodeficiência felino, vírus de panleucopenia de felino, e Clamídiafelina. 7. O método de reivindicação 1, onde a primeira vacina é administra-da subcutaneamente. 8. O método de reivindicação 1, onde a segunda vaci-na é administrada peroralmente ou oronasalmente. 9. O método de reivindi-cação 1, onde a segunda vacina ou uma vacina subseqüente é administradaapós o gato ter desenvolvido um título de neutralização de soro de FCV decerca de 1:6 ou maior. 10. Um método como em quaisquer das reivindica-ções 1 a 9, também compreendendo administrar ao gato uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma terceira vacina, onde a terceira vacina éadaptada para induzir uma resposta imune no gato contra FCV e é adminis-trada parenteralmente, oralmente, ou oronasalmente, M dias seguinte à ad-ministração da primeira ou segunda vacina, onde M é um número inteiro de1 a 120, inclusive. 11.0 método de reivindicação 10, onde a terceira vacinaé administrada subcutaneamente. 12. Um método para imunizar gatos con-tra calicivírus de felino (FCV), o método compreendendo administrar a umgato quantidades terapeuticamente eficazes das primeiras e segundas vaci-nas, onde as primeiras e segundas vacinas são adaptadas para induzir umaresposta imune no gato contra FCV, onde a primeira vacina é administradaoralmente ou oronasalmente, e a segunda vacina é administrada oralmenteou oronasalmente, e a segunda vacina é administrada durante N dias se-guinte a administração da primeira vacina, onde N é um número inteiro de 3a 120, inclusive, também especificado é N cerca de 3 semanas e cerca de 2-4 semanas. 13. O método de reivindicação 12 onde a cepa de FCV é sele-cionada do grupo que consiste em FCV-21, FCV-49, FCV 26391-4. 14. Ummétodo para imunizar animais compreendendo administrar a um animal umaquantidade terapeuticamente eficaz de primeiro e segunda vacina, com umaterceira vacina opcional, onde as primeira e segunda e terceira opcional va-cinas são adaptadas para induzir uma resposta imune e a primeira vacina éadministrada parenteralmente ou oralmente, a segunda vacina é administra-da oralmente ou oronasalmente, e a segunda e terceira vacina opcional éadministrada N dias seguinte à administração da primeira vacina, onde N éum número inteiro de 3 a 120, inclusive, também especificado é N cerca de 3semanas é cerca de 2-4 semanas, e o método pode incluir administraçõesde reforço anuais opcionais da vacina, incluindo um M período de cerca deum ano.
PARTE 3
ESTA PARTE FORNECE MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA IMUNIZARANIMAIS CONTRA PARVOVÍRUS DE FELINO (FPV) E HERPES VÍRUS DEFELINO (FHV)
Descritos aqui são métodos e materiais para tratar e imunizaranimais com vacina, e em particular gatos contra doença das vias respirató-rias de felino, causadas por calicivírus de felino (FCV), panleucopenia defelino causado por Parvovírus de Felino (FPV), rinotraqueíte vial de felinocausada por vírus de hepes de felino (FHV) que também foi chamado Vírusde Rinotraqueíte de Felino. Descritas abaixo são combinações de vacinas,que quando apresentadas a um felino da maneira descrita, permite libera-ções eficazes orais únicas e oral/oral e subq/oral de ambas vacinas FPV eFHV.
Oral única significa uma liberação oral única que concede prote-ção eficaz a um animal vacinado. Por oral/oral é entendida uma liberaçãooral dada duas vezes, semelhante à descrição acima na parte 2, isto é,qualquer oral seguida por algum período de tempo e em seguida outra doseé dada pela via oral, e subq/oral é uma primeira dose dada subq seguido poralgum período de tempo e então outra dose é dada por via oral.
O que é descrito aqui é a liberação da combinação de FPV vivomodificado e/ou FHV vivo modificado em combinação com vacina de Clam í-dia viva modificada, ou qualquer componente de vacina de Clamídia vivamodificada, por exemplo, meio de crescimento, Iisado de célula, ou célulasinteiras, qualquer componente de Clamídia propriamente dita. Clamídia tam-bém é chamada Clamídia de Felino, ou Chlamydia psittacide Felino ou FCp.
Quando FPV vivo modificado é dado sozinho ou em combinaçãocom FCV vivo modificado, ou vacinas de FHV ao vivo modificado, o FPV nãoé efetivo quando liberado de uma maneira oral/oral, e mostra um título de SNdiminuído com via SQ/oral de administração. Similarmente, quando FHV vivomodificado é dado sozinho ou em combinação com FCV vivo modificado, oucom vacina de FPV vivo modificado, FHV não é efetivo quando liberado deuma maneira oral/oral, e com sinais de uma eficácia diminuída com viaSQ/oral de administração. Somente quando ou FPV e/ou FHV é dado emcombinação com uma vacina de Clamídia viva modificada, uma proteçãoadequada contra FPV e/ou FHV é fornecida, quando a liberação das vacinasde combinação é ou por uma via subq/oral ou via oral/oral.
De acordo com o anterior os seguintes Exemplos são fornecidos.Os seguintes exemplos são pretendidos serem ilustrativos e não limitantes, erepresentam algumas modalidades específicas da presente invenção.
EXEMPLO 3-1 (teórico).
REGIME DE VACINAÇÃO SUBQ/ORAL COM FPV E CLAMÍDIA. FPV eClamídia (ou qualquer componente de vacina de Chlamyida viva modificada)são fornecidos em uma vacina de combinação com ou sem outros compo-nentes. As vacinas vivas modificadas podem ser liberadas subq/oral.
EXEMPLO 3-2 (teórico).
REGIME DE VACINAÇÃO ORAL/ORAL COM FPV E CLAMÍDIA. FPV eClamídia (ou qualquer componente de vacina de Clamídia viva modificada)são fornecidos em uma vacina de combinação com ou sem outros compo-nentes. As vacinas vivas modificadas podem ser liberadas oral/oral.
EXEMPLO 3-3 (teórico).
REGIME DE VACINAÇÃO SUBQ/ORAL COM FPV, FHV E CLAMÍDIA. FPV,FHV e Clamídia (ou qualquer componente de vacina de Clamídia viva modi-ficada) são fornecidos em uma vacina de combinação com ou sem outroscomponentes. As vacinas vivas modificadas podem ser liberadas subq/oral.
EXEMPLO 3-4 (teórico).
REGIME DE VACINAÇÃO ORAL/ORAL COM FPV, FHV E CLAMÍDIA. FPV,FHV e Clamídia (ou qualquer componente de vacina de Clamídia viva modi-ficada) são fornecidos em uma vacina de combinação com ou sem outroscomponentes. As vacinas vivas modificadas podem ser liberadas oral/oral.
EXEMPLO 3-5 (real).
REGIME DE VACINAÇÃO SUBQ/ORAL COM FPV, FHV, FCV E CLAMÍDIA.FPV, FHV, FCV e Clamídia (ou qualquer componente de vacina de Clamídiaviva modificada) são fornecidos em uma vacina de combinação com ou semoutros componentes. As vacinas vivas modificadas podem ser liberadas o-ral/oral (Tabela 3-1).
EXEMPLO 3-6 (real).
REGIME DE VACINAÇÃO ORAL/ORAL COM FPV, FHV, FCV E CLAMÍDIA.FPV, FHV, FCV e Clamídia (ou qualquer componente de vacina de Clamídiaviva modificada) são fornecidos em uma vacina de combinação com ou semoutros componentes. As vacinas vivas modificadas podem ser liberadas o-ral/oral. Veja Tabela 3-1.
Gatos pêlo curto domésticos, aproximadamente 8 semanas deidade, foram vacinados com componentes de FELOCELL 4A e 3A que con-têm vírus de riotraqueíte de felino vivo modificado [FHV], calicivírus [FCV-21], vírus de panleucopenia [FPV] e Chlamydia psittaci [FCp]. Os regimes devacinação avaliados incluíram: uma vacinação subcutânea inicial seguidapor reforços subcutâneos nos dias 21 (SQ/SQ); uma vacinação subcutâneainicial seguida por uma imunização de reforço oral no dia 21 (SQ/Oral); ouuma vacinação oral inicial seguida por uma segunda vacinação oral no dia21. A vacinação oral foi obtida por administração da vacina na boca. As a-mostras de soro de cada gato foram coletadas após a segunda vacinação, etratadas com calor a 56°C durante 30 minutos. As amostras foram avaliadasno ensaio de neutralização de soro contra FPV.TABELA 3-1 <table>table see original document page 91</column></row><table>
Os resultados da TABELA 3-1 sugerem que gatos responderamminimamente ao antígeno de FPV1 como previamente reportado na Iiteratu-ra. (Ausência de uma resposta imune após a administração oral de vírus depanleucopenia de felino atenuado. Schults RD, Scott FW1 Infect Immun.1973, 7 de abril (4): 547-9). Com a presença de Clamídia, entretanto, ouqualquer componente associado com uma vacina de Clamídia, os títulos deFPV SN foram muito mais elevados, sugerindo eficácia in vivo contra desafiode FPV. Além disso, é observada a imunigenicidade de FPV realçada comSQ/SQ, SQ/Oral, porém também com grupo Oral/Oral.
EXEMPLO 3-7 (real).
REGIME DE VACINAÇÃO ORAL/ORAL COM FPV, FHV, FCV.
São fornecidos FPV, FHV e FCV em uma vacina de combinaçãocom ou sem outros componentes. As vacinas vivas modificadas podem serliberadas oral/oral. Veja Tabela 3-2.
Gatos pêlo curto domésticos, aproximadamente 8 semanas deidade, foram vacinados com FELOCELL 3A, que contém vírus de riotraqueí-te de felino vivo modificado [FHV], calicivírus [FCV-21] e vírus de panleuco-penia [FPV]. Os regimes de vacinação avaliados incluíram: uma vacinaçãosubcutânea inicial seguida por reforços subcutâneos nos dias 21 (SQ/SQ);uma vacinação subcutânea inicial seguida por uma imunização de reforçooral no dia 21 (SQ/Oral); ou uma vacinação oral inicial seguida por uma se-gunda vacinação oral no dia 21. A vacinação oral foi obtida por administra-ção da vacina na boca. As amostras de soro de cada gato foram coletadasapós a primeira e segunda vacinação e tratadas com calor a 56°C durante30 minutos. As amostras foram analisadas no ensaio de neutralização desoro contra FPV.
TABELA 3-2
<table>table see original document page 92</column></row><table>
Os resultados da TABELA 3-2 sugerem que o antígeno de FPVpresente na vacina de FELOCELL 3A induziu resposta imune mínima quan-do dado Oral/Oral (de acordo com os resultados da TABELA 3-1). Quando— as vacinas foram dadas SQ/SQ ou SQ/Oral, entretanto, títulos de FPV SNelevados foram observados, uma indicação de eficácia in vivo.
Descrição numerada da invenção. Descrições adicionais e e-xemplos. Nota-se abaixo, FCV é Calicivírus de felino, FPV é Parvovírus deFelino que também foi chamado Panleucopenia ou FPL e finalmente, FHV éHERPES VÍRUS de Felinol. Uma composição imunogênica, compreenden-do FPV vivo modificado e Clamídia viva modificada administradas em umaúnica dosagem administrativa. 2. Uma vacina, compreendendo FPV vivomodificado e Clamídia viva modificada liberados a um felino em duas dosa-gens administrativas únicas separadas, as dosagens administrativas únicasambas liberadas por vias orais ou oralnasais e separadas em tempo por 3 a120 dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2 semanas. 3. Um métodopara imunizar gatos contra FPV, o método compreendendo administrar a umgato quantidades terapeuticamente eficazes de primeira e segunda vacinas,onde as primeira e segunda vacinas são adaptadas para induzir uma respos-ta imune no gato contra FPV, a primeira vacina é administrada oralmente ouoronasalmente e a segunda vacina é administrada oralmente ou oronasal-mente, a segunda vacina é administrada durante N dias seguintes à adminis-tração da primeira vacina, onde N é um número inteiro de 3 a 120, inclusive,ou onde N é cerca de 3 semanas ou onde N é cerca de 2 semanas. Onde asreferida primeira e segunda vacinas são compreendidas de um FPV vivomodificado e Clamídia viva modificada. 4. Uma composição imunogênica,compreendendo FHV vivo modificado e Clam ídia viva modificada, adminis-trada em uma dosagem única administrativa. 5. Uma vacina, compreenden-do FHV vivo modificado e Clamídia viva modificada liberada a um felino emduas dosagens administrativas únicas separadas, as dosagens administrati-vas únicas ambas liberadas por via oral ou oralnasal e separadas em tempopor 3 a 120 dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2 semanas. 6. Um mé-todo para imunizar gatos FHV o método compreendendo administrar a umgato quantidades terapeuticamente eficazes da primeira e segunda vacinas,onde as primeira e segunda vacinas são adaptadas para induzir uma respos-ta imune no gato contra FHV, a primeira vacina é administrada oralmente ouoronasalmente e a segunda vacina é administrada oralmente ou oronasal-mente, a segunda vacina é administrada durante N dias seguinte a adminis-tração da primeira vacina, onde N é um número inteiro de 3 a 120, inclusive,ou onde N é cerca de 3 semanas ou onde N é cerca de 2 semanas, onde asreferidas primeira e segunda vacinas são compreendidas de um FHV vivomodificado e Clamídia viva modificada. 7. Uma composição imunogênica,compreendendo FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada, adminis-trada em uma dosagem administrativa única. 8. Uma vacina, compreenden-do FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada liberados a um felino emduas dosagens únicas administrativas separadas, as dosagens únicas admi-nistrativas ambas liberadas por via oral ou oralnasal e separadas em tempopor 3 a 120 dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2 semanas. 9. Um mé-todo para imunizar gatos contra FCV o método compreendendo administrara um gato quantidades terapeuticamente eficazes de primeira e segundavacinas, onde as primeira e segunda vacinas são adaptadas para induziruma resposta imune no gato contra FCV, a primeira vacina é administradaoralmente ou oronasalmente e a segunda vacina é administrada oralmenteou oronasalmente, a segunda vacina é administrada durante N dias de ad-ministração seguinte a primeira vacina, onde N é um número inteiro de 3 a120, inclusive, ou onde N é cerca de 3 semanas ou onde N é cerca de 2 se-manas, onde as referida primeira e segunda vacinas são compreendidas deum FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada. 10. Uma composiçãoimunogênica, compreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado eClamídia viva modificada administrados em uma dosagem única administra-tiva. 11. Uma vacina, compreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modi-ficado e Clamídia viva modificada liberados a um felino em duas dosagensúnicas administrativas separadas, as dosagens administrativas únicas am-bas liberadas por via oral ou oralnasal e separadas em tempo por 3 a 120dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2 semanas. 12. Um método paraimunizar gatos simultaneamente contra FPV e FHV, o método compreen-dendo administrar a um gato quantidades terapeuticamente eficazes da pri-meira e segunda vacinas, onde as primeira e segunda vacinas são adapta-das para induzir uma resposta imune no gato contra FPV e FHV, a primeiravacina é administrada oralmente ou oronasalmente e a segunda vacina éadministrada oralmente ou oronasalmente, a segunda vacina é administradadurante N dias seguinte a administração da primeira vacina, onde N é umnúmero inteiro de 3 a 120, inclusive, ou onde N é cerca de 3 semanas ouonde N é cerca de 2 semanas, onde as referida primeira e segunda vacinacompreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado e Clamídia vivamodificada. 13. Uma composição imunogênica, compreendendo FPV vivomodificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada administradaem uma dosagem única administrativa.
14. Uma vacina, compreendendo FPV vivo modificado, FCV vivomodificado e Clamídia viva modificada liberados a um felino em duas dosa-gens únicas administrativas separadas, as dosagens únicas administrativasambas liberadas por via oral ou oralnasal e separadas em tempo por 3 a 120dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2 semanas. 15. Um método paraimunizar gatos simultaneamente contra FPV e FCV, o método compreen-dendo administrar a um gato quantidades terapeuticamente eficazes dasprimeira e segunda vacinas, onde as primeira e segunda vacina são adapta-das para induzir uma resposta imune no gato contra FPV e FHV, a primeiravacina é administrada oralmente ou oronasalmente e a segunda vacina éadministrada oralmente ou oronasalmente, a segunda vacina é administradadurante N dias seguinte a administração da primeira vacina, onde N é umnúmero inteiro de 3 a 120, inclusive, ou onde N é cerca de 3 semanas ouonde N é cerca de 2 semanas, onde as referidas primeira e segunda vacinascompreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado e Clamídia vivamodificada. 16. Uma composição imunogênica, compreendendo FHV vivomodificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada administrada,em uma dosagem única administrativa. 17. Uma vacina, compreendendoFHV vivo modificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada Iibe-rada a um felino em duas dosagens únicas administrativas separadas, asdosagens únicas administrativas ambas liberadas por via oral ou oralnasal eseparadas em tempo por 3 a 120 dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2semanas. 18. Um método para imunizar gatos simultaneamente contra FHVe FCV, o método compreendendo administrar a um gato quantidades tera-peuticamente eficazes das primeira e segunda vacinas, onde as primeira esegunda vacinas são adaptadas para induzir uma resposta imune no gatocontra FHV e FCV, a primeira vacina é administrada oralmente ou oronasal-mente e a segunda vacina é administrada oralmente ou oronasalmente, asegunda vacina é administrada durante N dias seguinte a administração daprimeira vacina, onde N é um número inteiro de 3 a 120, inclusive, ou ondeN é cerca de 3 semanas ou onde N é cerca de 2 semanas, onde as referidaprimeira e segunda vacina compreendem FHV vivo modificado, FCV vivomodificado e Clamídia viva modificada. 19. Uma composição imunogênica,compreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modi-ficado e Clamídia viva modificada administrada em uma dosagem única ad-ministrativa. 20. Uma vacina, compreendendo FPV vivo modificado, FHVvivo modificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada liberada aum felino em duas dosagens únicas administrativas separadas, as dosagensúnicas administrativas ambas liberadas por via oral ou oralnasal e separadaem tempo por 3 a 120 dias, ou cerca de 3 semanas ou cerca de 2 semanas.21. Um método para imunizar gatos simultaneamente contra FPV, FHV eFCV, o método compreendendo administrar a um gato quantidades terapeu-ticamente eficazes da primeira e segunda vacinas, onde as primeira e se-gunda vacinas são adaptadas para induzir uma resposta imune no gato con-tra FPV1 a primeira vacina é administrada oralmente ou oronasalmente e asegunda vacina é administrada oralmente ou oronasalmente, a segunda va-cina é administrada durante N dias seguinte a administração da primeira va-cina, onde N é um número inteiro de 1 a 120, inclusive, ou onde N é cercade 3 semanas ou onde N é cerca de 2 semanas, onde as referida primeira esegunda vacina compreende FPV vivo modificado, FHV vivo modificado,FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada.

Claims (15)

1. Vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino, carac-terizada pelo fato de que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-21ou uma proteína de capsídeo de FCV-21 isolada.
2. Vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino, carac-terizada pelo fato de que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-21ou uma proteína de capsídeo de FCV-21 isolada, onde a referida proteína decapsídeo compreende seqüência de proteína (SEQ ID 13) e seqüências quetêm pelo menos cerca de 91,2%, 95% e 99% de identidade; onde a referidaproteína de capsídeo é fornecida em uma quantidade eficaz para produziruma resposta imune, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
3. Vacina de DNA para imunizar gatos contra calicivírus de feli-no, caracterizada pelo fato de que compreende seqüências de ácido nucléi-co que codificam para uma proteína de capsídeo de FCV-21 ou uma proteí-na de capsídeo de FCV-21 isolada onde o referido DN Acompreende umaseqüência (SEQ. ID 12) e seqüências que têm pelo menos cerca de 78,7%,e 79,2% de identidade de seqüência e permitindo substituições conservadoras.
4. Vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino, carac-terizada pelo fato de que compreende uma Proteína de capsídeo de FCV-49ou uma Proteína de capsídeo de FCV-49 isolada onde a referida proteína decapsídeo compreende uma seqüência de proteína de tensão FCV-49.
5. Vacina para imunizar gatos contra calicivírus de felino, carac-terizada pelo fato de que compreende uma proteína de capsídeo de FCV-49,ou uma proteína de capsídeo de FCV-49 isolada, onde a referida proteína decapsídeo compreende seqüência de proteína (SEQ ID 15) e seqüências quetêm pelo menos cerca de 92,7%, 95% e 99% de identidade; onde a referidaproteína de capsídeo é fornecida em uma quantidade eficaz para produziruma resposta imune, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Vacina de DNA, para imunizar gatos contra calicivírus de feli-no, caracterizada pelo fato de que compreende seqüências de ácido nucléi-co que codificam para uma proteína de capsídeo de FCV-49 ou uma proteína de capsídeo de FCV-49 isolada onde o referido DNA compreende umaseqüência (SEQ. ID 14) e seqüências que têm pelo menos cerca de 78,9%,isto é, 79,4% (78,9 + 0,5) de identidade de seqüência e permitindo substitui-ções conservadoras.
7. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende ou sozinho ouem combinação, o seguinte: em que contém um adjuvante, em que o com-ponente de FCV está vivo, em que o componente de FCV é atenuado, ondeo componente de FCV é inativado, pode incluir pelo menos uma outra cepade calicivírus de felino selecionado do grupo que consiste em FCV-F9, FCV-LLK, FCV-M8, FCV-255, e FCV-2280.
8. Método para imunizar gatos contra calicivírus de felino (FCV),caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um gato quantida-des terapeuticamente eficazes das primeira e segundas vacinas, onde asprimeira e segunda vacinas são adaptadas para induzir uma resposta imuneno gato contra FCV, a primeira vacina é administrada parenteralmente e asegunda vacina é administrada oralmente ou oronasalmente, e a segundavacina é administrada durante N dias seguinte a administração da primeiravacina, onde N é um número inteiro de 3 a 120, inclusive.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que as vacinas independentemente compreendem uma vacina devírus vivo, uma vacina de vírus modificado vivo, uma vacina de vírus inativa-do, uma vacina recombinante, uma vacina de DNA, ou uma vacina de antí-geno de subunidade, ou sozinha ou em combinação.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que pelo menos uma das vacinas inclui uma ou mais cepas de FCV.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe-lo fato de que a uma ou mais cepas de FCV compreende F9 ou FCV-21 ouF9 e FCV-21.
12. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de quecompreende FPV vivo modificado e Clamídia viva modificada, e ou compre-endendo ambos FHV vivo modificado e Clam ídia viva modificada e ou com-preendendo FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada e ou compre-endendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado e Clam ídia viva modifi-cada e ou compreendendo FPV vivo modificado, FCV vivo modificado eClamídia viva modificada e ou compreendendo FHV vivo modificado, FCVvivo modificado e Clamídia viva modificada e ou compreendendo FPV vivomodificado, FHV vivo modificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modi-ficada administrados em uma dosagem única administrativa.
13. Vacina, caracterizado pelo fato de que compreende FPV vivomodificado e Clamídia viva modificada, e ou compreendendo FHV vivo modi-ficado e Clamídia viva modificada e ou compreendendo FCV vivo modificadoe Clamídia viva modificada e ou compreendendo FPV vivo modificado, FHVvivo modificado e Clamídia viva modificada e ou compreendendo FPV vivomodificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada e ou compre-endendo FHV vivo modificado, FCV vivo modificado e Clamídia viva modifi-cada e ou compreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado, FCVvivo modificado e Clamídia viva modificada liberados a um felino em duasdosagens únicas administrativas separadas, as dosagens únicas administra-tivas ambas liberadas por via oral ou oralnasal e separadas em tempo por 3a 120 dias.
14. Método para imunizar gatos contra FPV, FCV e ou FHV, ca-racterizado pelo fato de que compreende administrar a um gato quantidadeste rape uticamente eficazes das primeira e segunda vacinas, onde as primeirae segunda vacinas são adaptadas para induzir uma resposta imune no gatocontra FPV, e ou FCV e ou FHV, a primeira vacina é administrada oralmenteou oronasalmente e a segunda vacina é administrada oralmente ou orona-salmente, a segunda vacina é administrada durante N dias seguinte a admi-nistração da primeira vacina, onde N é um número inteiro de 3 a 120, inclu-sive, onde se as referidas primeira e segunda vacinas é compreendida deuma composição:a) compreendendo ambos FPV vivo modificado e Clamídia vivamodificada; e oub) compreendendo ambos FHV vivo modificado e Clamídia vivamodificada; e ouc) compreendendo ambos FCV vivo modificado e Clamídia vivomodificada; e oud) compreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado eClamídia viva modificada; e oue) compreendendo FPV vivo modificado, FCV vivo modificado eClamídia viva modificada; e ouf) compreendendo FHV vivo modificado, FCV vivo modificado eClamídia viva modificada; e oug) compreendendo FPV vivo modificado, FHV vivo modificado,FCV vivo modificado e Clamídia viva modificada, ou qualquer combinaçãodestes.
15. Composição imunogênica, vacina, e métodos para tratar a-nimais, especialmente gatos, caracterizados pelo fato de que são como des-critos aqui.
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