ES2926813T3 - Vacuna contra el calicivirus felino - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva proteína de la cápside felina, a calicivirus felino vivo atenuado que comprende esa proteína de la cápside, a virus portadores recombinantes vivos y calicivirus felino híbrido atenuado vivo que comprende esa proteína de la cápside, a vacunas que comprenden dichos calicivirus felinos atenuados vivos, virus portadores recombinantes vivos y calicivirus felino híbrido atenuado vivo, ya métodos para la preparación de dichos virus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra el calicivirus felino
La presente invención se refiere a una nueva proteína de la cápside del calicivirus felino, a calicivirus felino vivo atenuado que comprende esa proteína de la cápside, a virus portadores recombinantes vivos y a calicivirus felinos híbridos vivos atenuados que comprenden esa proteína de la cápside, a vacunas que comprenden dichos calicivirus felinos vivos atenuados, virus portadores vivos recombinantes y calicivirus felinos híbridos vivos atenuados, y a métodos de preparación de dichos virus.
El calicivirus felino (FCV) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo que pertenece al género Vesivirus de la familia Calicivirus. El virus es muy contagioso y provoca enfermedad de las vías respiratorias superiores (VRS) y la ulceración oral en felinos. El virus también se asocia con la gingivitis crónica y la estomatitis. Más recientemente, surgió un calicivirus felino sistémico virulento, comúnmente denominado VS-FCV, que causa una elevada mortalidad, lesiones cutáneas edematosas y ulcerosas e ictericia. La transmisión del FCV se produce en gran medida por el contacto con las secreciones nasales u orales (Scherk, M. A. et al., Journal of Feline Medicine and Surgery (2013) 15, Archivo suplementario).
El genoma y la organización genómica de la familia de los calicivirus son bien conocidos en la técnica. Una visión general se publica, entre otros, por Clarke, J. et al. (Inf. Diseases 181 (Supl. 2): S309-316 (2000)). La primera secuencia completa del genoma de un calicivirus felino se publicó ya en 1992 (Carter, M. J. et al., Virology 190: 443­ 448 (1992)), y en años posteriores se han publicado las secuencias completas del genoma de muchos más calicivirus felinos (entre otros, por Oka, T. et al., GenomeA, mayo/junio de 2013, vol. 1, número 3, e00349-13, Genomea.asm.org) y están disponibles, entre otros, en Genbank.
El genoma del FCV comprende solo tres marcos de lectura abiertos; los ORF 1, 2 y 3. El ORF1 codifica una gran poliproteína no estructural. El ORF3, un ORF 3'-terminal corto, codifica una proteína menor que se cree que participa en la encapsulación del ARN genómico.
El ORF 2 es el marco de lectura abierto que codifica la proteína de la cápside del FCV. Se sabe que la proteína de la cápside es la que desencadena la respuesta inmunitaria protectora en el hospedador. Por tanto, la proteína de la cápside es la proteína diana para el desarrollo de vacunas para la protección de los felinos contra la infección por FCV.
Las cepas de FCV comprenden solo un serotipo y predominantemente un serogrupo en todo el mundo. Sin embargo, existe una considerable variación genética, y por tanto antigénica, entre las cepas. Este alto nivel de variación antigénica dificulta la obtención de una amplia protección en los felinos contra el FCV: aunque la vacunación con una cepa homóloga es muy eficaz, el nivel de protección cruzada de una cepa contra otra cepa es muy variable. (Coyne C.P. et al., J. Virol. 86: 11356-11367 (2012)).
En este momento, existen vacunas vivas e inactivadas modificadas que suelen administrarse por vía sistémica. Originalmente, las vacunas solían ser vacunas únicas, principalmente basado en la cepa FCV F9 o FCV 255. Sin embargo, todas padecen el problema identificado anteriormente: la falta de una amplia protección cruzada.
Actualmente, este problema se sortea en cierta medida, al menos parcialmente, mediante la administración de vacunas bivalentes que comprenden dos cepas diferentes de FCV, tales como FCV 431 y FCV G1.
Estas vacunas bivalentes (inactivadas) están actualmente disponibles en el mercado tanto en Estados Unidos como en Europa. (Poulet H, et al., Vaccine 26: 3647-3654 (2008), Chengjin Huang et al., Journal of Feline Medicine and Surgery Febrero 12:129-137 (2010)).
Una alternativa para las vacunas vivas atenuadas e inactivadas fue desarrollada por McCabe V. J. et al. quienes construyeron un virus portador recombinante vivo atenuado (LARCV), en este caso un mixomavirus, expresando la proteína de la cápside del FCV y administrando con éxito este mixomavirus recombinante como vacuna LARCV a felinos.
Estas vacunas basadas en el portador de mixoma recombinante tienen la ventaja de que el portador está atenuado, no se replica en felinos y solo porta el ORF de FCV que codifica la proteína de la cápside de FCV. Por tanto, no hay excreción de FCV o del virus portador en el medio ambiente después de la vacunación.
Otro ejemplo de virus portador vivo atenuado que expresa la proteína de la cápside del FCV es el portador del Herpesvirus felino descrito por Yokoyama, N. et al. (J. Vet. Med. Sci. 60: 717-723 (1998)). Este portador también se utilizó en la vacunación de felinos contra el FCV.
El documento WO91/01332 divulga una proteína de la cápside del calicivirus felino y vacunas de subunidades para el FCV.
Los documentos WO2005/080416 y WO2007012944 divulgan vacunas para inmunizar a un gato contra el calicivirus felino. Los documentos WO2005/080416 y WO2007012944 divulgan ácidos nucleicos que codifican una proteína de la cápside y están dirigidos a una vacuna viva o muerta que comprende un calicivirus felino aislado, una vacuna de subunidad que comprende una proteína de la cápside, una vacuna de ácido nucleico y una vacuna de vector viral recombinante.
El documento US6541458 divulga secuencias del gen de la cápside de una cepa dominante de FCV, FCV 431. El documento WO0076538 divulga un calicivirus felino aislado y mutantes del mismo. Se divulgan clones de ácido nucleico que codifican un antígeno de la cápside.
Sin embargo, todavía no se ha desarrollado una vacuna viva atenuada contra el FCV o una vacuna basada en un portador recombinante que sea segura y muestre un amplio nivel de protección cruzada.
Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar vacunas contra el FCV que sean seguras y que muestren un amplio nivel de protección cruzada.
Se descubrió sorprendentemente que existe una cepa de FCV hasta ahora desconocida cuya proteína de la cápside muestra un espectro notablemente amplio de protección cruzada contra muchas cepas de campo de FCV. Un ejemplo de la proteína de la cápside de un representante de esta cepa se muestra en el SEQ ID NO: 34. El representante de esta nueva cepa del FCV cuya secuencia de la proteína de la cápside se muestra en el SEQ ID NO: 34 se denomina además cepa del FCV Kalem Crouch.
La tabla 1 muestra las propiedades de neutralización cruzada del antisuero obtenido contra la nueva cepa de FCV de acuerdo con la invención con otras 31 cepas de FCV. Se muestra el log-io de la reducción del título del virus. Una reducción del título de >1,5 log-io se considera significativa.
Como se desprende de esta tabla, el antisuero generado contra la nueva cepa de FCV Kalem Crouch neutraliza sorprendentemente 26 de las 31 cepas de FCV analizadas. Se realizó una comparación con la cepa F9 comúnmente utilizada. Como puede observarse en la tabla 1, se observa que el antisuero generado contra f9 solo muestra una reducción significativa del título para 3 de las 22 cepas de FCV probadas.
La secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de esta nueva cepa del FCV se ha comparado con la secuencia de aminoácidos conocida de otras 24 proteínas de la cápside del FCV y se puede concluir que la secuencia difiere bastante de las proteínas conocidas de la cápside del FCV. Como puede verse en la figura 5, la identidad de secuencia global entre la proteína de la cápside de la nueva cepa y la de las cepas conocidas del FCV es de aproximadamente el 87 %. Además, se identifican varios aminoácidos únicos de la nueva proteína de la cápside K89, M90, M100, 1317, L390, A391, V392, Q396, S397, K398, N404, T426, T431, S438, S437, D440, E445, K447, L448, E451, N452, G484, G489, 1491, N516, S517, E518, 1524, S545, S634, F635, P636. Además, la secuencia KLEYEN del aminoácido 447-452, y GVISD del aminoácido 489-493 son también únicas.
Se entenderá que, para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y el ADN que codifica la proteína, pueden existir pequeñas variaciones naturales entre los representantes individuales de esta cepa. En primer lugar, a nivel de nucleótidos, existe el llamado "bamboleo en la segunda y tercera base" que explica que pueden producirse cambios de nucleótidos que pasan desapercibidos en la secuencia de aminoácidos que codifican: por ejemplo, los tripletes TTA, TTG, TCA, TCT, TCG y TCC codifican leucina. Además, puede haber pequeñas variaciones a nivel de nucleótidos entre los representantes del FCV que pueden dar lugar a pequeñas variaciones en la secuencia de aminoácidos. Estas variaciones pueden reflejarse en una diferencia de aminoácidos en la secuencia global o en supresiones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más aminoácidos en dicha secuencia. Se han descrito sustituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, por ejemplo, por Neurath et al. en "The Proteins" Academic Press New York (1979). Los reemplazos de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o los reemplazos que han ocurrido frecuentemente en la evolución son, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu.
Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 227, 1435-1441, 1985) y determinar la similitud funcional entre proteínas idénticas. Dichas sustituciones de aminoácidos de las realizaciones ilustrativas de la presente invención, así como las variaciones que tengan eliminaciones y/o inserciones están dentro del alcance de la invención siempre que las proteínas resultantes conserven su reactividad inmunológica. Esto explica por qué una proteína de la cápside del FCV de acuerdo con la invención, cuando se aísla a partir de diferentes aislados de campo, puede tener un nivel de identidad de alrededor del 90 %, sin dejar de representar una proteína con una reactividad cruzada inmunológica comparable.
Por tanto, una primera realización de la presente invención se refiere a una proteína de la cápside del calicivirus felino que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en el SEQ ID NO: 34.
Otra realización de la presente invención y/o sus variantes se refiere a un FCV vivo atenuado que comprende una proteína de cápside de acuerdo con la presente invención y/o cualquier realización de la misma.
Una proteína de la cápside o la región que codifica la proteína de la cápside de acuerdo con la invención, como el ORF2 o un fragmento del mismo, puede utilizarse de varias maneras en la preparación de vacunas para la protección de los felinos contra el FCV.
Un fragmento de ADN que comprende la región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma puede, por ejemplo, utilizarse para la preparación de virus portadores recombinantes distintos de FCV que comprenden la proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma. También puede utilizarse para la preparación de FCV híbridos, como se describe a continuación.
Por tanto, una tercera realización de la presente invención se refiere a un fragmento de ADN caracterizado porque comprende una región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo.
En los casos en los que se utiliza un portador recombinante como portador de un fragmento de ADN que comprende la región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo, la expresión de la proteína de la cápside se obtendría normalmente colocando el fragmento de ADN que comprende la región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o sus variantes bajo el control de un promotor heterólogo adecuado.
Un promotor adecuado es un promotor capaz de impulsar la transcripción de una región codificante que se encuentra cadena abajo del promotor en la célula hospedadora; en este caso un eucariota, más concretamente una célula de felino. Se conoce en la técnica un gran número de promotores adecuados para la expresión de la proteína de la cápside de FCV, que se reconocen por su nivel eficaz de expresión. Entre estos promotores se encuentran los clásicos, tal como el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (humano) (Sun-Young Lee et al, Journal of Biomedical Science 6: 8-17 (1999), Seed, B. et al., Nature 329, 840-842, 1987; Fynan, E.F. et al., PNAS 90, 11478­ 11482,1993; Ulmer, J.B. et al., Science 259, 1745-1748, 1993), el potenciador-promotor de citomegalovirus humano (Donofrio G., et al., Clinical and Vaccine Immunology 13: 1246-1254, (2006)), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus de ratón (MCMViel), el promotor temprano del citomegalovirus de ratón (MCMVel), el promotor temprano inmediato del sV40 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773,1983), el promotor del SV-40 (Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983), el promotor de metalotioneína (Brinster, R.L. et al., Nature 296, 39-42, 1982), el promotor de choque térmico (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985), el promotor principal tardío de Ad2, el promotor de p-actina (Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992) y el promotor CAG. (Miyazaki, J; Takaki, S.; Araki, K; Tashiro, F; Tominaga, A.; Takatsu, K; Yamamura, K., Gene 79 (2): 269-277 (1989), y Niwa, H; Yamamura, K; Miyazaki, J., Gene 108 (2): 193-199 (1991)).
Adecuadamente, la región codificante de la proteína de la cápside se sitúa bajo el control de un promotor adecuado. El fragmento de ADN que comprende una región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo puede ser, por ejemplo, un plásmido. Este plásmido puede estar en forma circular o lineal.
Dada la amplia protección proporcionada por la proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o las realizaciones de la misma, es atractivo utilizar la región que codifica la proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma en un virus portador recombinante vivo.
Estos virus portadores vivos atenuados (LARCV) son virus recombinantes capaces de infectar a un animal hospedador, en este caso una especie felina, y portadora de un gen exógeno, en este caso la región que codifica la proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma, bajo el control de un promotor adecuado.
Los LARCV y sus usos han sido revisados, entre otros, por Souza, A.P.D. et al., en Braz. J. Med. Biol. Res, 38: 509­ 522 (2005). Algunos ejemplos de estos virus portadores recombinantes vivos son: poxvirus (es decir, el virus vaccinia), adenovirus, herpesvirus, mixomavirus y, más recientemente, alfavirus.
Por tanto, una cuarta realización de la presente invención se refiere a virus portadores recombinantes vivos atenuados (LARCV) que comprenden la región codificante de la proteína de la cápside de acuerdo con la invención, bajo el control de un promotor.
Un ejemplo de este tipo de virus portador recombinante vivo atenuado es el proporcionado por McCabe et al, que describen el uso de mixomavirus como LARCV para la proteína de la cápside de la cepa F9 del FCV (véase más arriba).
Otro ejemplo de virus portador vivo atenuado que expresa la proteína de la cápside del FCV es el portador del herpesvirus felino que expresa la proteína de la cápside del FCV, como el descrito por Yokoyama, N. et al., (véase más arriba).
Es conveniente que el virus portador recombinante vivo atenuado sea un mixomavirus o un herpesvirus felino.
Otra realización de la presente invención y/o realizaciones de la misma se refiere a un virus portador recombinante vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo, para su uso en la protección de los felinos contra la infección por el FCV.
La proteína de la cápside y su región codificante también pueden permitir otra estrategia para la protección de los felinos contra el FCV. Esta estrategia está relacionada con un FCV híbrido.
Es conocido en la técnica que existen vacunas vivas atenuadas para la protección de los felinos contra la infección por el FCV. Un ejemplo de este tipo de FCV vivo atenuado es la cepa F9 de FCV, conocida por proporcionar una vacuna viva segura cuando se administra por vía sistémica. Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, las cepas de FCV en general y también la cepa F9 no proporcionan una amplia protección cruzada contra la infección de los felinos por otras cepas de FCV.
Sorprendentemente, se descubrió, que las cepas híbridas de FCV que comprenden una región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo y un ORF1 de un FCV atenuado proporcionan tanto un alto nivel de seguridad como una amplia protección cruzada.
Otra realización se refiere a un FCV híbrido vivo atenuado, caracterizado porque dicho FCV comprende una región que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo y comprende una región que codifica una atenuación del marco de lectura abierto 1 (ORF1) de un FCV atenuado.
De manera adecuada, el FCV híbrido vivo atenuado de la presente invención y/o realizaciones de la misma comprende un marco de lectura abierto 2 (ORF2) que codifica una proteína de la cápside de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma y comprende un marco de lectura abierto 1 (ORF1) de un FCV atenuado. Los métodos para la construcción de calicivirus híbridos son bien conocidos en la técnica. Para los calicivirus de felino, Neill et al. describieron intercambios de dominios de proteínas de la cápside entre distintas cepas del FCV (Neill, D. J. et al., J. Virol 74:1079-1084 (2000)). Otros métodos para la recuperación de virus recombinantes de células tras la transfección de construcciones de ARNc o ADNc ya fueron descritos en 2002 por Thumfart J. O. y Meyers G. (J. Virol. 76: 6398-6407 (2002)). Aubry, F. et al., han descrito recientemente métodos aún más rápidos para generar virus de ARN monocatenario de sentido positivo utilizando amplicones subgenómicos (J. Gen. Virol 95:2462-2467 (2014)).
Los virus atenuados pueden obtenerse, por ejemplo, cultivando los virus de acuerdo con la invención y/o realizaciones de los mismos en presencia de un agente mutagénico, seguido de la selección de los virus que muestren una disminución del nivel de progenie y/o de la velocidad de replicación. Se conocen en la técnica muchos de estos agentes.
Otro método de atenuación frecuentemente utilizado es el pase en serie in vitro. Durante este proceso, los virus se adaptan a la línea celular utilizada para el pase en serie. Como consecuencia, se comportan de forma atenuada cuando se administran posteriormente al hospedador natural de nuevo en forma de vacuna.
Otra forma de obtener virus atenuados es someterlos a un crecimiento a temperaturas diferentes a las de su hábitat natural. Los métodos de selección de mutantes sensibles a la temperatura (mutantes TS) son bien conocidos en la técnica. Dichos métodos comprenden el crecimiento de los virus en presencia de un mutágeno, seguido del crecimiento a una temperatura subóptima y a la temperatura óptima, valoración de la progenie del virus en las capas celulares y selección visual de las placas que proliferan más lentamente a la temperatura óptima. Estas pequeñas placas comprenden virus vivos atenuados de crecimiento lento y, por tanto, deseados.
Un método más directo y predecible para la generación de virus de ARN monocatenario atenuado de sentido positivo es, por ejemplo, el descrito por Weeks, S. A. et al., in J. of Biol. Chem., 287: 31618-31622 (2014).
Opcionalmente, el experto utilizaría una región que codifique una atenuación del marco abierto de lectura 1 (ORF1) o el ORF1 de cepas de FCV atenuadas ya disponibles. Un ejemplo bien conocido de este tipo de virus vivo atenuado es la cepa F9 del FCV.
Kalunda et al. AJVR (1975) 36:353-356 describieron las propiedades de la cepa FCV-F9 como vacuna. Véase también Bittle, et al., igual que la referencia anterior. (1976) 37:275-278.
De manera adecuada, la invención y/o realizaciones de la misma se refieren a un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención que comprende una región que codifica una atenuación del marco de lectura abierto 1 (ORF1) o un marco de lectura abierto 1 (ORF1) que se obtiene de la cepa F9 del FCV.
En la sección de ejemplos, se describe en detalle un método in vitro para la preparación de un FCV híbrido de acuerdo con la invención y/o las realizaciones del mismo descritas anteriormente.
De nuevo, otra realización de la presente invención se refiere a FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo, para su uso en la protección de los felinos contra la infección por el FCV. Las células de mamífero, adecuadas para el cultivo de virus portadores recombinantes vivos son conocidas en la técnica. Dichas células son las que sustentan el crecimiento de los conocidos LARCV, tales como poxvirus, adenovirus, herpesvirus, mixomavirus y, más recientemente, alfavirus.
El virus portador recombinante atenuado basado en el mixoma que expresa la proteína de la cápside del FCV puede, por ejemplo, cultivarse en células RK13. El virus portador recombinante basado en el herpesvirus felino atenuado que expresa la cápside del FCV puede, por ejemplo, cultivarse en células de riñón felino Crandell-Rees (CRFK).
Igualmente, las células adecuadas para el cultivo del FCV vivo atenuado y del FCV híbrido vivo atenuado son conocidas en la técnica. Las células más comunes para el cultivo de FCV son las células CRFK.
Por tanto, de nuevo, otra realización de la presente invención se refiere a un cultivo celular que comprende un FCV vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo, de acuerdo con la invención o un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención. LARCV
Como se ha indicado anteriormente, la proteína de la cápside del FCV de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma proporciona un amplio nivel de protección cruzada contra varias cepas de FCV diferentes.
Por este motivo, los FCV vivos atenuados de acuerdo con la invención y/o realizaciones de los mismos, los virus portadores recombinantes vivos de acuerdo con la invención y/o realizaciones de los mismos y los FCV híbridos vivos atenuados de acuerdo con la invención y/o realizaciones de los mismos proporcionan una base muy adecuada para las vacunas para la protección de los felinos contra el FCV.
Por tanto, otra realización más de la presente invención se refiere a las vacunas para la protección de los felinos contra el FCV, en donde dichas vacunas comprenden un FCV vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones de las mismas y un portador farmacéuticamente aceptable y/o un virus portador recombinante vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable y/o un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable.
La protección a este respecto debe interpretarse en sentido amplio: se considera que la protección de los felinos contra el FCV comprende la vacunación para prevenir la enfermedad, la vacunación para disminuir los signos de la enfermedad y la vacunación terapéutica tras el diagnóstico de la enfermedad.
Algunos ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables que son adecuados para su uso en una vacuna de acuerdo con la invención son el agua estéril, solución salina, tampones acuosos como PBS y similares. Además, una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender otros aditivos como estabilizantes y/o antioxidantes.
Como se ha mencionado anteriormente, la virulencia del FCV aislado en el campo es relativamente alta: la infección por calicivirus felino es una causa de infección de las vías respiratorias superiores y cuando se administra un FCV virulento por vía orofaríngea provoca pirexia, secreción oculonasal, gingivoestomatitis, glositis, pérdida de peso y mal estado físico. La forma sistémica virulenta del FCV provoca pirexia, vasculitis, edema, lesiones ulcerosas en las extremidades, ictericia y muerte. (Hay información esporádica de que incluso la cepa vacunal del FCV F9, cuando se administra por vía orofaríngea, causa gingivoestomatitis).
Un virus vivo atenuado, tal y como se define en el presente documento, es un virus que tiene un nivel de virulencia reducido en comparación con el virus aislado en el campo. La vacunación con un virus vivo atenuado, un virus híbrido vivo atenuado o de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo, al menos reduce la gravedad de la infección (reducción de los signos y síntomas clínicos) en términos de duración de la pirexia, úlceras orales, pérdida de peso y/o días de virus excretados, en comparación con la infección de animales no vacunados con un FCV de tipo silvestre.
LARCV Normalmente, las vacunas basadas en el FCV vivo atenuado y en el FCV híbrido vivo atenuado pueden utilizarse sin añadir adyuvantes. No obstante, si fuese necesario, se puede incluir un adyuvante en la vacuna.
Un adyuvante es una sustancia inmunoestimulante que potencia la respuesta inmunitaria del hospedador de forma inespecífica. El adyuvante puede ser un adyuvante hidrófilo, por ejemplo, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, o un adyuvante hidrófobo, por ejemplo, un adyuvante a base de aceite mineral.
LARCV Las vacunas a base de FCV vivo atenuado y de FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o sus variantes pueden comprender un estabilizante. Puede añadirse un estabilizante a una vacuna de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma, por ejemplo, para protegerla frente a la degradación, para potenciar el periodo de validez o para mejorar la eficacia de la liofilización. Los estabilizantes útiles son, entre otros, SPGA (Bovarnik et al., 1950, J. Bacteriology, vol. 59, p. 509), leche desnatada, gelatina, seroalbúmina bovina, carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, lactosa, proteínas, tales como la albúmina o la caseína o productos de degradación de las mismas, y tampones, tales como fosfatos de metales alcalinos. Para reconstituir una composición liofilizada, se suspende en un diluyente fisiológicamente aceptable. Dicho diluyente puede ser, por ejemplo, tan simple como agua estéril o una solución salina fisiológica. En una forma más compleja, la vacuna liofilizada puede estar suspendida en una emulsión, por ejemplo, como se describe en el documento EP 1.140.152.
La pauta posológica para la aplicación de una vacuna de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma al organismo diana puede ser la aplicación de dosis únicas o múltiples y en una cantidad tal que sea inmunológicamente eficaz.
Lo que representa una "cantidad inmunogénicamente eficaz" para una vacuna de acuerdo con la invención que se basa en un virus de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma depende del efecto deseado. El término "cantidad inmunológicamente eficaz", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad de FCV vivo atenuado, virus portador vivo atenuado o FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención que sea necesaria para inducir una respuesta inmunitaria en los felinos en la medida en que disminuya los efectos patológicos causados por la infección con un virus FCV de tipo silvestre, cuando se compara con los efectos patológicos causados por la infección con un FCV de tipo silvestre en felinos no inmunizados.
El experto puede determinar si un tratamiento es "inmunológicamente eficaz", por ejemplo, administrando una exposición experimental a la infección a animales vacunados y determinando a continuación los signos clínicos de la enfermedad en el animal diana, parámetros serológicos o midiendo el reaislamiento del patógeno, seguido de la comparación de estos resultados con los observados tras la exposición en felinos no vacunados.
La cantidad de virus administrada dependerá de la vía de administración, posiblemente la presencia de un adyuvante y el momento de la administración.
Una cantidad preferida de una vacuna viva que comprenda un FCV vivo atenuado o un virus híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o sus variantes se expresa, por ejemplo, como dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50 ). Por ejemplo, para dicho virus vivo atenuado, puede utilizarse ventajosamente una dosis en el intervalo entre 102 y 108 TCID50 por dosis para el animal; preferentemente se utiliza un intervalo entre 104 y 106 TCID50. Una cantidad preferida de un virus portador vivo recombinante basado en el mixomavirus en una vacuna estaría en el intervalo de 104 - 108 unidades formadoras de placas (UFP).
Una cantidad preferida de un virus portador vivo recombinante basado en el Herpesvirus felino en una vacuna también estaría en el intervalo de 104 - 108 unidades formadoras de placas (UFP).
Se pueden aplicar varias formas de administración, todas ellas conocidas en la técnica. Las vacunas de acuerdo con la invención se administran preferentemente a los felinos mediante inyección, preferentemente mediante inyección intramuscular. El protocolo de administración puede optimizarse de acuerdo con la práctica estándar de vacunación con FCV o virus portador vivo recombinante.
Los felinos domésticos suelen estar vacunados contra varias enfermedades. Por razones de facilidad de administración, y también por razones económicas, es conveniente administrar varias vacunas al mismo tiempo, preferentemente como vacuna combinada. Dichas vacunas combinadas comprenderían entonces un FCV vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo y/o un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo y/o un virus portador recombinante vivo de acuerdo con la invención y/o realizaciones del mismo, y además de esto, al menos otro microorganismo felino-patógeno o virus felino-patógeno y/o al menos otro componente inmunogénico y/o material genético que codifica dicho otro componente inmunogénico de dicho microorganismo felino-patógeno o virus felino-patógeno.
Por tanto, una forma preferida de esta realización se refiere a vacunas para la protección de los felinos contra el FCV, en donde dichas vacunas comprenden un FCV vivo atenuado de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable y/o un virus portador recombinante vivo de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable y/o un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable y al menos un microorganismo patógeno felino o virus patógeno felino y/o al menos un componente inmunogénico y/o material genético diferente que codifica dicho otro componente inmunogénico de dicho microorganismo patógeno felino o virus patógeno felino.
En una forma más preferida de esta realización, el al menos un microorganismo patógeno felino diferente o virus patógeno en gatos se selecciona entre el grupo que consiste en el virus de la panleucopenia felina, Chlamydia psittaci, Bordetella bronchiseptica, parvovirus felino, virus de la rabia y virus del herpes felino.
En la sección de ejemplos, se proporciona un ejemplo detallado de la construcción de un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención. Básicamente, el método in vitro comprende la etapa de ensamblar un primer y un segundo amplicón, cada uno de los cuales comprende una parte del genoma viral completo, preferiblemente utilizando la extensión del solapamiento, lo que da lugar a un amplicón que comprende el genoma viral de longitud completa.
De manera adecuada, el primer amplicón de FCV comprende la región ORF1 completa y una parte 5' adyacente a la región ORF2 de un FCV atenuado y el segundo amplicón de FCV comprende una parte 3' de la región ORF1 y la región ORF2//ORF3 completa adyacente, en donde el ORF2 es un ORF2 que codifica una proteína de la cápside de FCV de acuerdo con la invención y/o realizaciones de la misma.
Por lo tanto, existe una región superpuesta que abarca una parte 5' de la región ORF1 y una parte 3' de la región ORF2 que está presente en ambos amplicones. Esto permitiría el ensamblaje del primer y segundo amplicón a través de la extensión solapada.
Por tanto, otra realización más se refiere a métodos in vitro para obtener un FCV híbrido vivo atenuado de acuerdo con la invención, que comprenden las etapas de:
a. Preparación un primer amplicón del FCV que comprende la región completa del ORF1 y una parte adyacente 5' del ORF2 de un FCV atenuado,
b. Preparación de un segundo amplicón de FCV que comprenda una parte 3' de la región ORF1 y la región ORF2//ORF3 adyacente completa, en donde el ORF2 es un ORF2 de acuerdo con la invención,
c. Ensamblaje del primer y segundo amplicón mediante extensión solapada,
d. Generación de FCV infecciosos,
e. Infección de células susceptibles con el FCV infeccioso,
f. Recuperación de la progenie infecciosa de FCV
Leyenda de las figuras
Figura 1: los amplicones que cubren 5349 pb del extremo 5' del genoma del FCV, o 2422 y 2416 pb del extremo 3' de los genomas del FCV F9 y Kalem Crouch, respectivamente, se amplificaron mediante la PCR a partir del ADNc del FCV.
Figura 2: los conjuntos de extensión de solapamiento de longitud completa del FCV F9 (SEQ ID NO: 60), Kalem Crouch (SEQ ID NO: 59), FK (SEQ ID NO: 62) y KF (SEQ ID NO: 61) se generaron y resolvieron en un gel de agarosa al 1 %. FCV F9 y Kalem Crouch se prepararon a partir de sus respectivos amplicones 5' y 3' como controles para demostrar el correcto diseño del solapamiento.
Figura 3: el ADN recombinante de FK y KF FCV se amplificó mediante la PCR y se resolvió en un gel de agarosa al 1 %.
Figura 4: un ejemplo del típico CPE (efecto citopático) del FCV en células CrFK infectadas con el FCV Kalem Crouch.
Figura 5: alineación de la secuencia de la proteína de la cápside del FCV Kalem Crouch (SEQ ID NO: 34) y F9 (SEQ ID NO: 35) con las secuencias publicadas del FCV (SEQ ID NO: 36-58). La numeración de los aminoácidos es a nivel de nucleótidos.
Figura 6: alineación de secuencias de las cepas de FCV F9 (SEQ ID NO: 59) y Kalem Crouch (SEQ ID NO: 60) con las cepas recombinantes de FCV FK (SEQ ID NO: 61) y Kf . (SEQ ID NO: 62).
Figura 7: alineación de la secuencia de la proteína de la cápside del FCV Kalem Crouch (SEQ ID NO: 34) y F9 (SEQ ID NO: 35) con las secuencias publicadas del FCV (SEQ ID NO: 36-58). La numeración de los aminoácidos es a nivel de aminoácidos.
Figura 8: mapa del plásmido p22m-GFP con la mutación en el sitio NcoI del MCS indicada.
Figura 9: comparación de las construcciones p22m-GFP y p22m-4a derivadas del plásmido p22-GFP.
F ig u r a 10 : u n d ia g r a m a d e l g e n o m a c o m p le to d e l c lo n M R 24 - K a le m C r o u c h c o n u n in s e r to p M C P K r e s a l ta d o . Ejemplos:
Ejemplo 1:
S e u t i l iz a r o n s u e r o s h ip e r in m u n e s c r ia d o s e n g a to s a la s c e p a s d e F C V F 9 y K a le m C r o u c h p a r a d e t e r m in a r e l ín d ic e d e n e u t r a l iz a c ió n d e la s d is t in ta s c e p a s d e F C V . E l e x p e r im e n to s e r e a l iz a c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 8 a c o n t in u a c ió n . L o s d a to s s e m u e s t r a n e n la ta b la 1. D e la ta b la s e d e s p r e n d e q u e e l s u e r o c r ia d o c o n t r a K a le m C r o u c h t ie n e u n a a m p l ia p r o te c c ió n c r u z a d a c o n t r a m u c h a s o t r a s c e p a s d e l F C V . E n e l c a s o d e l s u e r o c o n t r a K a le m C r o u c h s e o b s e r v a u n a r e d u c c ió n L o g - i0 s ig n i f ic a t iv a ( e s d e c ir , > 1,5 ) c o n t r a 16 d e la s 31 c e p a s d e F C V . L a t a b la 1 t a m b ié n m u e s t r a q u e la p r o te c c ió n c r u z a d a d e la c e p a F 9 n o r m a lm e n te u t i l iz a d a e s m u c h o m e n o r . E l s u e r o g e n e r a d o c o n t r a f 9 m u e s t r a u n a r e d u c c ió n s ig n i f ic a t iv a d e L og -iü ( e s d e c ir , > 1,5 ) p a ra 3 d e la s 22 c e p a s d e F C V . C a b e d e s t a c a r q u e la s 2 c e p a s d e F C V q u e s o n n e u t r a l iz a d a s o a l m e n o s r e d u c id a s s ig n i f ic a t iv a m e n te p o r e l s u e r o F 9 , 3809 , 6420 , C V - 21, s o n v i r u s s im i la r e s a l F 9. D e e s te m o d o , K a le m C r o u c h n o s o lo o f r e c e p r o te c c ió n c r u z a d a p a r a m u c h a s m á s c e p a s d e F C V q u e F 9 , ta m b ié n p r o p o r c io n a p r o te c c ió n c r u z a d a p a r a la s c e p a s d is t in ta s d e F 9.
T l 1: R i n L i r l r
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Ejemplo 2
C o n s t r u c c ió n d e c lo n e s h íb r id o s d e F C V .
1. C u l t iv o c e lu la r
T o d a s la s l ín e a s c e lu la r e s s e m a n tu v ie r o n e n f r a s c o s d e c u lt iv o d e te j id o s a 37 ° C , C O 2 a l 5 % .
L a s c é lu la s d e r iñ ó n fe l in o d e C r a n d e l l - R e e s ( C r F K ) s e c u lt iv a r o n e n e l m e d io M 6 B 8 s u p le m e n ta d o c o n u n 5 % d e s u e r o b o v in o fe ta l , b ic a r b o n a to d e s o d io a l 0 , 15 % , L g lu ta m in a 2 m M , 100 U / m l d e p e n ic i l in a , 10 | jg / m l d e e s t r e p to m ic in a y 2 j g / m l d e fu n g iz o n a .
L a s c é lu la s B s R T 7 s e m a n tu v ie r o n e n m e d io D M E M s u p le m e n ta d o c o n u n 5 % d e s u e r o b o v in o fe ta l , L g lu ta m in a 2 m M , p ir u v a to d e s o d io 1 m M y 1 m g /m l d e g e n e t ic in a ( G 418 ) . L a g e n e t ic in a s e r e t i r ó e n e l m o m e n to d e la s ie m b r a a n te s d e la t r a n s fe c c ió n .
2. A is la m ie n t o d e l v i r u s
S e r e c o g ie r o n h is o p o s o r o f a r í n g e o s /n a s a le s d e g a to s y s e t r a n s p o r t a r o n e n m e d io M 6 B 8. L o s h is o p o s s e a g i ta r o n b r e v e m e n te e n u n v ó r t e x y s e in o c u ló la s u s p e n s ió n d e v i r u s s o b r e c é lu la s C r F K c o n f lu e n te s y s e in c u b a r o n a 37 °C c o n C O 2 a l 5 % h a s ta q u e s e o b s e r v ó C P E e s p e c í f ic o d e l F C V . L o s f r a s c o s in f e c ta d o s s e d e s c o n g e la r o n p a r a l is a r la s c é lu la s , s e c la r i f ic a r o n p a r a e l im in a r lo s r e s to s c e lu la r e s y a lm a c e n a d o e n a l í c u o ta s a - 70 °C .
3. P r o l i fe r a c ió n d e l F C V
S e a d s o r b ió u n a d i lu c ió n a d e c u a d a d e l v i r u s p a r a in f e c ta r u n a m o n o c a p a c o n f lu e n te d e C rF K . L a s c é lu la s s e in c u b a r o n a 37 °C , 5 % d e C O 2 h a s ta q u e s e o b s e r v ó C P E e s p e c í f ic o d e l F C V . L o s f r a s c o s in f e c ta d o s s e d e s c o n g e la r o n p a r a l is a r la s c é lu la s , s e c la r i f ic a r o n p a ra e l im in a r lo s r e s to s c e lu la r e s y a lm a c e n a d o e n a l í c u o ta s a -70 °C .
4. A is la m ie n t o d e A R N
L a s u s p e n s ió n v i r a l c la r i f ic a d a s e c e n t r i f u g ó a 131500 x g , a 4 ° C u t i l iz a n d o u n r o to r S W 28 d u r a n te a p r o x im a d a m e n te 16 h o r a s . E l A R N s e e x t r a jo d e l s e d im e n to r e s u l ta n te u t i l iz a n d o u n k i t R N e a s y ® M in ip r e p ( Q ia g e n , H ild e n , A le m a n ia ) . E l A R N s e e lu y ó e n 50 j l d e a g u a l ib r e d e R N a s a , s e s e p a r ó e n a l í c u o ta s y s e a lm a c e n ó a - 70 ° C h a s ta s u u s o . 5. S ín te s is d e A D N c
E l A R N d e l F C V s e u t i l iz ó c o m o m o ld e p a r a la s ín te s is d e l A D N c . E l A D N c s e s in t e t iz ó u t i l iz a n d o u n k i t IN V IT R O G E N S u p e r s c r ip t II® ( C a r ls b a d , C A ) y lo s c e b a d o r e s F r 2 F ( S E Q ID N O : 32 ) y F r 4 R ( S E Q ID N O : 33 ) .
6. V a lo r a c ió n d e l v i r u s
S e u t i l iz a r o n d i lu c io n e s s e r ia d a s d e fa c to r d ie z d e l v i r u s ( 100 j l / p o c i l l o , 5 p o c i l lo s p o r d i lu c ió n ) e n m e d io d e c r e c im ie n to p a ra in f e c ta r u n a m o n o c a p a c o n f lu e n te d e c é lu la s C r F K e n p la c a s d e 96 p o c i l lo s . L a s c é lu la s C r F K in f e c ta d a s s e in c u b a r o n a 37 °C , 5 % d e C O 2 d u r a n te u n m á x im o d e 5 d ía s y s e e x a m in ó p a r a d e t e c ta r e l C P E e s p e c í f ic o d e l F C V . S e r e g is t r ó e l n ú m e r o d e p o c i l lo s e n lo s q u e e s ta b a p r e s e n te e l C P E y s e c a lc u la r o n lo s t í t u lo s m e d ia n te e l m é to d o d e R e e d M u e n c h . L o s t í t u lo s s e e x p r e s a r o n c o m o T C ID 50 /m l.
7. P r e p a r a c ió n d e a n t ic u e r p o s c o n t r a e l F C V
S e g e n e r a r o n a n t ic u e r p o s c o n t r a la s c e p a s d e l F C V e n g a to s . C a d a g r u p o d e t r a ta m ie n to e s ta b a f o r m a d o p o r 3 g a to s a lo ja d o s p o r s e p a r a d o . L o s g a to s fu e r o n in f e c ta d o s p o r la v ía o r o fa r í n g e a o p o r in y e c c io n e s s u b c u tá n e a s . L o s g a to s fu e r o n h ip e r in m u n iz a d o s c o n u n a s e g u n d a d o s is d e l v i r u s p o r v í a o r o fa r í n g e a . S e r e c o g ió e l p la s m a d e lo s g a to s t r e s s e m a n a s d e s p u é s d e la s e g u n d a in o c u la c ió n .
8. E n s a y o d e n e u t r a l iz a c ió n d e l v i r u s
S e m e z c la r o n d i lu c io n e s s e r ia d a s d e lo s v i r u s c o n u n v o lu m e n ig u a l d e u n a c a n t id a d c o n s ta n te d e d i lu c ió n d e p la s m a o d e m e d io d e c r e c im ie n to y s e in c u b a r o n d u r a n te 1 h o ra a 37 ° C . L a m e z c la d e v i r u s o s u e r o v i r a l s e in o c u ló e n c é lu la s C r F K c o n f lu e n te s (5 p o c i l lo s p o r d i lu c ió n ) e n u n a p la c a d e 96 p o c i l lo s . L a s p la c a s s e in c u b a r o n a 37 ° C , 5 % d e C O 2 d u r a n te 5 d ía s . E l ín d ic e d e n e u t r a l iz a c ió n s e d e te r m in ó c a lc u la n d o la d i f e r e n c ia d e l t í t u lo o b s e r v a d o .
9. D is e ñ o d e c e b a d o r e s p a r a g e n e r a r a m p l ic o n e s d e A D N s u p e r p u e s to s a p a r t i r d e l A D N c d e l F C V
L a s r e a c c io n e s d e P C R p a r a g e n e r a r u n a m p l ic ó n q u e c u b r ie r a 5349 p b d e l 5 ' d e l g e n o m a d e l F C V s e r e a l iz a r o n u t i l iz a n d o la p o l im e r a s a P h u s io n ( N E B , Ip s w ic h , M A ) c o n e l p a r d e c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s F K P 1 F ( S E Q ID N O : 5 ) y F K P 1 R ( S E Q ID N O : 6 ) y la s c o n d ic io n e s d e P C R d e s c r i t a s e n la ta b la 4. D e fo r m a s im ila r , ta m b ié n s e r e a l iz a r o n r e a c c io n e s d e P C R p a r a g e n e r a r u n a m p l ic ó n q u e c u b r ie r a lo s 2422 p b d e l e x t r e m o 3 ' d e l F C V F 9 y lo s 2416 p b d e l e x t r e m o 3 ' d e l F C V K a le m C r o u c h , u t i l iz a n d o la p o l im e r a s a P h u s io n ( N E B , Ip s w ic h , M A ) c o n e l p a r d e c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s F K P 2 F ( S E Q ID N O : 7 ) y F K P 2 R ( S E Q ID N O : 8 ) u t i l iz a n d o la p o l im e r a s a P h u s io n ( N E B , Ip s w ic h , M A ) , y la s c o n d ic io n e s d e P C R d e s c r i t a s e n la t a b la 5.
10. P u r i f ic a c ió n d e l A D N d e la s r e a c c io n e s d e P C R
T o d o e l A D N a m p l i f ic a d o s e p u r i f ic ó u t i l iz a n d o e l k i t d e p u r i f ic a c ió n d e P C R Q IA q u ic k ® ( Q ia g e n , H ild e n , A le m a n ia ) u t i l i z a n d o d o s la v a d o s d e c o lu m n a . L a c o n c e n t r a c ió n y la p u r e z a d e l A D N e lu id o s e d e te r m in a r o n c o n u n in s t r u m e n to N a n o d r o p ( T h e r m o S c ie n t i f ic , W a l th a m , M A ) .
11. C o m b in a c ió n d e a m p l ic o n e s d e F C V p a r a g e n e r a r u n F C V d e lo n g i tu d c o m p le ta
S e h iz o u n a m e z c la e q u im o la r c o n 0 ,1, 0 ,25 o 0 ,5 p m o l d e c a d a a m p l ic ó n d e F C V g e n e r a d o c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 9 d e m é to d o s , y s e p u r i f ic ó c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 10 d e m é to d o s . S e u t i l iz ó u n a c a n t id a d s u f ic ie n te d e d ic h a m e z c la , n o r m a lm e n te 5 p l, c o m o p la n t i l la p a r a la P C R d e e x te n s ió n s o la p a d a d e s c r i ta e n la t a b la 6 , u t i l iz a n d o la p o l im e r a s a P h u s io n ( N E B , Ip s w ic h , M A ) .
12. G e n e r a c ió n d e A D N in f e c c io s o d e lo n g i tu d c o m p le ta d e l F C V
S e u t i l iz ó u n a c a n t id a d s u f ic ie n te d e r e a c c ió n d e A D N c , p r e p a r a d a c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 5 a n te r io r , o d e r e a c c ió n d e P C R d e e x te n s ió n s o la p a d a , p r e p a r a d a c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 11, n o r m a lm e n t e e n t r e 1 y 5 p l, c o m o p la n t i l la p a r a g e n e r a r A D N in f e c c io s o d e lo n g i tu d c o m p le ta d e l F C V . L a p o l im e r a s a P h u s io n (N E B , Ip s w ic h , M A ) s e u t i l iz ó ju n to c o n lo s p a r e s d e c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s M B L 446 ( S E Q ID N O : 1 ) y M B L 447 ( S E Q ID N O : 2 ) o F C V T 7 f ( S E Q ID N O : 3 ) y F C V p A r ( S E Q ID N O : 4 ) , y la s c o n d ic io n e s d e P C R d e s c r i t a s e n la s ta b la s 7 y 8 r e s p e c t iv a m e n te .
13. T r a n s fe c c ió n d e A D N in f e c c io s o d e lo n g i tu d c o m p le ta d e l F C V e n c é lu la s B s R T 7
L a s c é lu la s B s R T 7 , c u l t iv a d a s c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 1 h a s ta a p r o x im a d a m e n t e u n 50 - 70 % d e c o n f lu e n c ia e n p la c a s d e 24 p o c i l lo s , s e t r a n s fe c ta r o n c o n A D N in f e c c io s o d e F C V d e lo n g i tu d c o m p le ta g e n e r a d o c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 12 u t i l iz a n d o L ip o fe c ta m in e ® 3000 d e IN V IT R O G E N ® . N o r m a lm e n te s e u t i l iz a r o n 3 p g d e A D N p o r p o c i l lo . L a s c é lu la s s e in c u b a r o n c o n e l c o m p le jo d e A D N - l ip o fe c t a m in e d u r a n te u n m á x im o d e 72 h o ra s .
14. In fe c c ió n d e c é lu la s C r F K c o n l is a d o d e c é lu la s B s R T 7 t r a n s fe c ta d a s
L a s c é lu la s B s R T 7 t r a n s fe c ta d a s s e l is a r o n p o r c o n g e la c ió n - d e s c o n g e la c ió n . E l l is a d o c e lu la r s e u t i l iz ó p a ra in f e c ta r u n a m o n o c a p a c o n f lu e n te d e c é lu la s C rF K .
15. T in c ió n d e in m u n o f lu o r e s c e n c ia d e l F C V
L a s c é lu la s C r F K in f e c ta d a s c o n F C V s e f i ja r o n c o n m e ta n o l y s e la v a r o n c o n P B S . L a s c é lu la s f i ja d a s s e in c u b a r o n s e c u e n c ia lm e n t e c o n u n s u e r o p o l ic lo n a l a n t i F C V y u n c o n ju g a d o d e a n t ic u e r p o s F IT C a n t ig a to o c o n u n a n t ic u e r p o m o n o c lo n a l d e r a tó n N C L - 1 G 9 ( L e ic a M ic r o s y s te m s , R e in o U n id o ) y u n c o n ju g a d o d e a n t ic u e r p o s F IT C a n t ir r a tó n . L a f lu o r e s c e n c ia s e o b s e r v ó c o n u n m ic r o s c o p io D M 1 L ( L e ic a M ic r o s y s te m s , R e in o U n id o ) c o n e l f i l t r o I3.
16. A n á l is is d e la s e c u e n c ia d e l F C V
E l A D N d e l F C V d e lo n g i tu d c o m p le ta s e p r e p a r ó a p a r t i r d e l A D N c u t i l iz a n d o lo s c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s M B L 446 ( S E Q ID N O : 1 ) y M B L 447 ( S E Q ID N O : 2 ) ju n to c o n la p o l im e r a s a P h u s io n ( N E B , Ip s w ic h , M A ) y la s c o n d ic io n e s d e P C R d e s c r i t a s e n la t a b la 4. E l A D N d e l F C V r e s u l ta n te d e lo n g itu d c o m p le ta s e p u r i f ic ó c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 11 d e lo s m é to d o s y s e s e c u e n c ió u t i l iz a n d o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e c e b a d o r e s d e o l ig o n u c le ó t id o s d e la ta b la 3. L a s m u e s t r a s d e A D N fu e r o n s e c u e n c ia d a s p o r G A T C - b io te c h , R e in o U n id o . S e e n v ia r o n 30 - 100 n g /p l d e p lá s m id o o 10 - 50 n g /p l d e p r o d u c to d e P C R c o n 10 p m o l/p l d e c e b a d o r d e s e c u e n c ia c ió n .
T l 1 r P R r n r r A D N in f i l n i m l l F V .
Figure imgf000011_0001
n in i n
Figure imgf000012_0001
T l 2 r P R i l iz r n r r m l i n l F V .
Figure imgf000012_0002
T l r P R r l n i i n l l n i m l l n m r m in n l F V .
Figure imgf000012_0003
Tabla 4 C o n d ic io n e s d e P C R p a r a g e n e r a r u n a m p l ic ó n d e F C V q u e c u b r a 5349 p b d e s d e e l e x t r e m o 5 '.
Figure imgf000013_0001
T l n i i n P R r n r r n m l i n F V r h 2422 l x r m '.
Figure imgf000013_0002
Tabla 6 C o n d ic io n e s d e la P C R p a r a l le v a r a c a b o u n a P C R d e e x te n s ió n s o la p a d a q u e c o m b in e lo s a m p l ic o n e s d e l F V r n r r n l n i l l A D N l F V l n i m l .
Figure imgf000013_0003
Tabla 7 Condiciones de la PCR para amplificar el ADN del FCV de longitud completa a partir del ADNc y añadir un r m r T7 ' n r m li A '.
Figure imgf000014_0001
Tabla 8 Condiciones de la PCR para amplificar el ADN del FCV de longitud completa a partir de material de plantilla l P R x n i n l ñ ir n r m r T7 ' n r m li A '.
Figure imgf000014_0002
2. Preparación de la construcción Myxo-Kalem Crouch
Se clonó pMCPK (porción procesada de la proteína de la cápside mayor del aislado de FCV Kalem Crouch) utilizando los sitios BamHI y XhoI en el plásmido MCS (sitio de clonación múltiple) de p22m-GFP (un derivado de p22-GFP). Véase la figura 8.
Para evitar la adición de AA (aminoácidos) extra en el extremo C a pMCPK, la traducción del codón de inicio en el sitio NcoI del MCS en p22-GFP se eliminó introduciendo una mutación puntual (CCATGG->CCATCG, figura 1). Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para mutar el plásmido p22-GFP utilizando los siguientes cebadores: p22sdmF: 5'-CATCGATCGATGTCGACGGATCCA-3' SEQ ID NO: 63
p22sdmR: 5'-GTGCATCCGTCGACATCGATCGATG-3' SEQ ID NO: 64
Programa de la PCR: 30 s a 98 °C, 20x[10 s a 98 °C, 10 s a 58,3 °C, 2 min a 72 °C], 5 min a 72 °C, ~ a 4 °C, y la polimerasa Phusion (NEB, cat: M0530L).
El plásmido p22-GFP se eliminó de la reacción con digestión por Dpnl antes de la transformación en E. coli XL10 gold (cat: 200315). Se recogieron varias de las colonias de E. coli resultantes para establecer cultivos de minipreparación que se analizaron mediante la digestión del ADN plasmídico extraído (kit QiaPrep Spin Miniprep, cat: 27104) con NcoI. En un gel de agarosa al 1 %, una banda única correspondiente al plásmido linealizado indicaba una mutación exitosa (ya que el único sitio de NcoI que queda en el plásmido p22m-GFP está presente aguas arriba del gen GFP). Un fragmento de 342 pb, además del plásmido linealizado después de la digestión, indicó la presencia de dos sitios NcoI y, por tanto, de un plásmido p22-GFP intacto. Posteriormente se utilizó secuenciación para confirmar la mutación.
El inserto de pMCPK se preparó mediante PCR, con los cebadores:
(KApBamHIF:
5TCGAGGATCCGCCACCArGGCCGATGATGGATCGGTGACAACCCC-3', SEQ ID NO: 65
KpXhoInR:
5'-TCGACTCGAGTCATAATTTAGTCATAGAACTCCTAATATTAGAGGC-3' SEQ ID NO: 66,
que incluyen un codón de inicio en una secuencia Kozac en el extremo 5' de pMCPK. El programa de la PCR utilizado fue: 30 s a 98 °C, 35x[10 s a 98 °C, 10 s a 55 °C, 40 s a 72 °C], 5 min a 72 °C, ~ a 4 °C, mientras que el molde era ADNc preparado a partir de ARN total aislado de células CRFK infectadas con el FCV Kalem Crouch. Tras confirmar el tamaño correcto del amplicón en un gel de agarosa al 1 %, el ADN insertado en la reacción de PCR se purificó (kit de limpieza de PCR de Qiagen) y se digirió con BamHI y Xhol en paralelo con el plásmido p22m-GFP. Tras el ligamiento, este procedimiento da lugar a la sustitución del inserto de GFP y de los flancos de repetición 5' y 3' del RHDV por pMCPK (figura 2). El inserto digerido y el ADN plasmídico se cargaron en un gel de agarosa al 1 % y se extrajeron y purificaron bandas de 1664 pb (inserto) y 4031 pb (columna vertebral del plásmido) utilizando el kit de extracción de ADN en gel StrataPrep (cat: 400766). La cadena principal y el inserto se ligaron durante una noche a 4 °C y posteriormente se transformaron 2 ul de esta ligación en E. coli XL10 gold (cat: 200315). Se establecieron cultivos de minipreparación y el ADN extraído se analizó mediante la digestión con BamHI y Xhol. La identidad del inserto se confirmó utilizando la misma reacción de PCR que generó el inserto de pMCPK (véase más arriba), y posteriormente secuenciación. Se eligió la construcción p22m-4a para su uso en los pasos siguientes.
Se aplicaron 50 ul de material de MR24 diluido en 1 ml de medio M6B8 FBS al 5 % a una placa de 6 cm con ~80 % de células RK13 confluentes durante 5 h antes de lavar todo el virus MR-24 no absorbido, complementando con 3 ml adicionales del mismo medio, y transfectando con ~4,5 ug de plásmido p22m-4a utilizando Lipofectamine 3000. Después de ~17 h, parte de las células se cosecharon mediante un suave raspado y se guardaron junto con el medio. La mitad restante de las células de la placa se fijó (EtOH al 100 %) y se tiñó para la inmunofluorescencia con antisueros del FCV, seguida de un anticuerpo antigato marcado con FITC, para confirmar la expresión de pMCPK. Las células teñidas indicaron una mayor expresión de pMCPK y la posible recombinación entre p22m-4a y MR-24 para dar MR-24-Kalem Crouch, ya que las células de control transfectadas con p22m-4a solo, o infectadas con MR-24 solo, no se tiñó (véase en la figura 10 un diagrama del virus recombinante MR24-Kalem Crouch).
El enriquecimiento del virus del mixoma recombinante MR-24-Kalem Crouch se llevó a cabo mediante rondas sucesivas de titulación, detección por inmunofluorescencia de la pMCPK expresada, y dilución de las muestras enriquecidas. Brevemente, una serie de placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos sembradas con células RK-13 se infectaron con el virus de la infección/transfección en una serie de diluciones. Después de 3 días, todas las placas de 96 pocillos se congelaron y se conservaron como reservas de la primera ronda. A continuación, se infectó una segunda serie de placas de 96 pocillos sembradas con RK-13 con material procedente de las existencias de la primera ronda (5-10 pl de cada pocillo). Después de 2-3 días, estos platos duplicados se fijaron con metanol helado y se tiñeron primero con un antisuero policlonal anti-FCV de gato y luego con un segundo anticuerpo marcado con FITC IgG de cabra anti-felino. Se identificaron los pocillos que contenían focos de infección fluorescentes y se tomaron los pocillos correspondientes en las placas de la primera ronda, luego se diluyó y se utilizó para infectar una segunda serie de placas de 96 pocillos, que se convirtió en las acciones de la segunda ronda. Este procedimiento se repitió hasta que las existencias de virus contenían la mayoría de los virus recombinantes. La purificación final se logró mediante tres rondas de aislamiento de foco único. Se expandieron los tres mejores clones de tinción (es decir, B8, A9 y A10), y el clon A9 se utilizó en otros experimentos para determinar la pureza clonal (es decir, la ausencia de MR24 de tipo silvestre creciendo en el fondo) y la estabilidad de la secuencia del inserto (es decir, pMCPK). MR24-Kalem Crouch se pasó 5 veces en células RK13 inoculando cada vez a una MOI de 0,001.
Para determinar la estabilidad del inserto pMCPK, se comparó el ADN de MR24-Kalem Crouch del paso 1 y el ADN de MR24-Kalem Crouch del paso 5. No se detectaron mutaciones ni en p22m-4a frente a MR24-Kalem Crouch del pase 1, ni en MR24-Kalem Crouch del pase 1 frente a MR-24-Kalem Crouch del pase 5, indicando que pMCPK en p22m-4a se recombinó con éxito con MR24 y se mantuvo estable durante 5 pases del virus.
En conjunto, estos experimentos muestran que la proteína procesada de la cápside principal del FCV Kalem Crouch (pMCPK) se ha insertado en, y se expresa a partir de, el sitio MGF del clon A9 de MR24-Kalem Crouch.
Resultados
1. Aislamiento y proliferación del FCV Kalem Crouch
La cepa de calicivirus felino (FCV) Kalem Crouch se aisló de un hisopo tomado durante un brote de FCV en Jersey en diciembre de 2010. El hisopo procedía de un macho castrado, de 2 años y 6 meses, denominado Kalem Crouch y fue recogido por New Era Veterinary Surgery, San Salvador, Jersey. El hisopo se agitó brevemente en un vórtex y la s u s p e n s ió n d e v i r u s s e in o c u ló e n c é lu la s C r F K c o n f lu e n te s y s e in c u b ó a 37 ° C c o n u n 5 % d e C O 2 h a s ta q u e s e o b s e r v ó e l C P E e s p e c í f ic o d e l F C V . E l m a t r a z in f e c ta d o s e d e s c o n g e ló p a r a l is a r la s c é lu la s , s e c la r i f ic ó p a ra e l im in a r lo s r e s to s c e lu la r e s y a lm a c e n a d o a - 70 °C . E l t í t u lo d e l v i r u s fu e d e 10691 T C ID 50 /m l.
S e d e te r m in ó la s e c u e n c ia d e n u c le ó t id o s d e l a is la d o . L a s e c u e n c ia e s tá a n o ta d a e n e l S E Q ID N O : 60.
L a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la p r o te ín a d e la c á p s id e s e a l in e ó c o n o t r a s s e c u e n c ia s d e l F C V d is p o n ib le s e n e l d o m in io p ú b l ic o . L a a l in e a c ió n d e la s e c u e n c ia e s tá a n o ta d a e n la s f ig u r a s 5 y 7.
2. G e n e r a c ió n d e l v i r u s F C V r e c o m b in a n te
2.1. P r e p a r a c ió n d e a m p l ic o n e s d e F C V
E l A D N c d e F C V F 9 o K a le m C r o u c h , e la b o r a d o c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 5 d e m é to d o s , s e u t i l iz ó c o m o m o ld e e n la s r e a c c io n e s d e P C R c o n la p o l im e r a s a P h u s io n (N E B , Ip s w ic h , M A ) , e l p a r d e c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s F K P 1 F ( S E Q ID N O : 9 ) y F K P 1 R ( S E Q ID N O : 10 ), y la s c o n d ic io n e s d e s c r i ta s e n la ta b la 4 p a ra g e n e r a r u n a m p l ic ó n q u e c u b r a 5349 p b d e l e x t r e m o 5 ' d e l g e n o m a d e l F C V . D e fo r m a s im ila r , s e u t i l iz ó e l p a r d e c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s F K P 2 F ( S E Q ID N O : 11 ) y F K P 2 R ( S E Q ID N O : 12 ) y la s c o n d ic io n e s d e P C R d e s c r i ta s e n la ta b la 5 p a ra g e n e r a r a m p l ic o n e s q u e c u b r ía n 2422 p b d e l e x t r e m o 3 ' d e l F C V F 9 y 2416 p b d e l e x t r e m o 3 ' d e l F C V K a le m C r o u c h . E s to s a m p l ic o n e s y 5 p l d e G e n e R u le r 1 k b m á s e s c a le r a d e A D N ( T h e r m o S c ie n t i f ic , W a l th a m , M A ) s e r e s o lv ie r o n r e a l iz a n d o u n a e le c t r o f o r e s is e n ta m p ó n 1 x T B E ( S ig m a - A ld r ic h , S t. L o u is , M O ) a 120 V a lo la r g o d e 1 h. E n la f ig u r a 1 s e m u e s t r a n la s b a n d a s d e l ta m a ñ o e s p e r a d o .
2.2. E n s a m b la je d e a m p l ic o n e s d e l F C V m e d ia n te la P C R d e e x te n s ió n s o la p a d a
L o s a m p l ic o n e s d e l F C V g e n e r a d o s e n la s e c c ió n d e r e s u l ta d o s 2 s e p u r i f ic a r o n u t i l iz a n d o e l k i t d e p u r i f ic a c ió n d e P C R Q IA q u ic k ® ( Q ia g e n , H ild e n , A le m a n ia ) . E s to s a m p l ic o n e s s e u t i l iz a r o n p a ra f a b r ic a r v i r u s h íb r id o s : E l v i r u s h íb r id o F K c o m p r e n d e la c á p s id e d e K a le m C r o u c h e n e l f o n d o d e F 9 y e l v i r u s h íb r id o K F c o m p r e n d e la c á p s id e d e F 9 e n e l f o n d o d e K a le m C r o u c h .
P a r a p r o d u c i r e l m o ld e d e A D N d e F C V F K y K F , s e p r e p a r a r o n m e z c la s e q u im o la r e s q u e c o n te n ía n e n t r e 0 ,1 y 0 ,5 p m o l d e c a d a a m p l ic ó n c o n a m p l ic o n e s d e l e x t r e m o 5 ' d e l F C V F 9 y d e l e x t r e m o 3 ' d e l F C V K a le m C r o u c h , o c o n a m p l ic o n e s d e l e x t r e m o 5 ' d e l F C V K a le m C r o u c h y d e l e x t r e m o 3 ' d e l F C V F 9. E s ta s m e z c la s s e u t i l iz a r o n c o m o p la n t i l la s e n r e a c c io n e s d e P C R d e e x te n s ió n s o la p a d a c o n la s c o n d ic io n e s d e s c r i ta s e n la ta b la 6. L o s t a m a ñ o s e s p e r a d o s d e lo s a m p l ic o n e s d e A D N F K y K F e n s a m b la d o s e r a n d e 7685 y 7702 p b r e s p e c t iv a m e n te . E l A D N e n s a m b la d o e n e s ta s m u e s t r a s y 5 p l d e G e n e R u le r 1 k b m á s e s c a le r a d e A D N ( T h e r m o S c ie n t i f ic , W a l th a m , M A ) s e r e s o lv ie r o n m e d ia n te e le c t r o f o r e s is e n ta m p ó n T B E 1 x ( S ig m a - A ld r ic h , S t. L o u is , M O ) a 120 V a lo la r g o d e 1 h. E l A D N e n s a m b la d o r e s u l ta n te d e F 9 , K a le m C r o u c h , F K y K F s e m u e s t r a e n la f ig u r a 2.
2.3. G e n e r a c ió n d e v i r u s in fe c c io s o s d e F C V
E l A D N in f e c c io s o d e l F C V F K o K F s e p r e p a r ó u t i l iz a n d o la p o l im e r a s a P h u s io n ( N E B , Ip s w ic h , M A ) y e l p a r d e c e b a d o r e s o l ig o n u c le o t í d ic o s F C V T 7 f ( S E Q ID N O : 3 ) y F C V p A r ( S E Q ID N O : 4 ) c o n la s c o n d ic io n e s d e P C R d e s c r i t a s e n la t a b la 8. L o s ta m a ñ o s e s p e r a d o s d e l A D N in f e c c io s o d e l F C V F K y K F s o n 7728 y 7737 p b , r e s p e c t iv a m e n te . E l A D N d e l F C V in f e c c io s o e n e s ta s m u e s t r a s y 5 p l d e G e n e R u le r 1 k b m á s e s c a le r a d e A D N ( T h e r m o S c ie n t if ic , W a l th a m , M A ) s e r e s o lv ie r o n m e d ia n te e le c t r o f o r e s is e n ta m p ó n T B E 1 x ( S ig m a - A ld r ic h , S t. L o u is , M O ) a 120 V a lo la r g o d e 1 h. E l A D N in f e c c io s o d e lo n g i tu d c o m p le ta d e F K y K F s e m u e s t r a e n la f ig u r a 3 p a r te s A y B , r e s p e c t iv a m e n te .
2.4. R e c u p e r a c ió n d e l v i r u s in f e c c io s o d e l F C V
E l A D N in f e c c io s o d e l F C V F K y K F s e p u r i f ic ó a p a r t i r d e la s r e a c c io n e s d e P C R d e lo n g i tu d c o m p le ta u t i l iz a n d o e l k i t d e p u r i f ic a c ió n d e P C R Q IA q u ic k ® ( Q ia g e n , H ild e n , A le m a n ia ) , y s e t r a n s fe c tó e n c é lu la s B s R T 7 c o n f lu e n te s a l 50 ­ 90 % q u e c r e c ía n e n u n a p la c a d e 24 p o c i l lo s u t i l iz a n d o e l r e a c t iv o L ip o fe c ta m in e ® 3000 d e In v i t r o g e n ® ( C a r ls b a d , C A ) , ta l c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 13 d e m é to d o s . L a s c é lu la s B s R T 7 t r a n s fe c ta d a s s e in c u b a r o n c o n lo s c o m p le jo s d e t r a n s fe c c ió n e n c o n d ic io n e s n o r m a le s d e c r e c im ie n t o d u r a n te 24 - 72 h a n te s d e la l is is p o r c o n g e la c ió n -d e s c o n g e la c ió n . A c o n t in u a c ió n , e l l is a d o d e B s R T 7 d e c a d a p o c i l lo s e a p l ic ó a u n p o c i l lo e n e l q u e c r e c ía n la s c é lu la s C r F K h a s ta a lc a n z a r u n a c o n f lu e n c ia d e e n t r e e l 50 y e l 100 % . L a s c é lu la s C r F K c u l t iv a d a s e n p r e s e n c ia d e l l is a d o c e lu la r B s R T 7 s e in c u b a r o n e n c o n d ic io n e s n o r m a le s d e c r e c im ie n to , c o m o s e d e s c r ib e e n la s e c c ió n 1 d e m é to d o s . L a p r e s e n c ia d e u n v i r u s s e d e te c tó n o r m a lm e n te p o r la fo r m a c ió n d e p la c a s e n la m o n o c a p a d e c é lu la s C r F K , s im i la r e s a la s m o s t r a d a s e n la f ig u r a 4.
2.5. S e c u e n c ia d e lo s v i r u s F C V F K y K F .
S e s e c u e n c ia r o n lo s v i r u s F C V r e c o m b in a n te s .
E s ta s s e c u e n c ia s s e h a n c o m p a r a d o c o n la s d e F C V F 9 y K a le m C r o u c h e n la f ig u r a 6. E l v i r u s F K r e c o m b in a n te s e in d ic a c o m o S E Q ID N O : 61 y c o m p r e n d e la c á p s id e d e K a le m C r o u c h . E l v i r u s K F r e c o m b in a n te s e in d ic a c o m o S E Q ID N O : 62 y c o m p r e n d e la c á p s id e d e F 9.
2.6. E f ic a c ia d e la c o n s t r u c c ió n M y x o - K a le m C r o u c h e n g a to s
D is e ñ o e x p e r im e n ta l :
Q u in c e g a to s d o m é s t ic o s d e p e lo c o r to d e e n t r e 8 y 11 s e m a n a s d e e d a d fu e r o n d iv id id o s e n d o s g r u p o s . U n g r u p o d e 10 g a to s v a c u n a d o s p o r v ía s u b c u tá n e a , d o s v e c e s , c o n t r e s s e m a n a s d e d i f e r e n c ia c o n la c o n s t r u c c ió n r e c o m b in a n te M y x o - K a le m C r o u c h d e s c r i t o a n t e r io r m e n te ( p a s e 5 ) ( 10623 T C ID 50 p o r d o s is ) y u n g r u p o d e 5 g a to s d e c o n t r o l . C u a t r o s e m a n a s d e s p u é s d e la s e g u n d a v a c u n a c ió n , s e to m a r o n m u e s t r a s d e lo s g a to s y d o s d e lo s g a to s d e c o n t r o l n o v a c u n a d o s fu e r o n d e s a f ia d o s p o r v ía in t r a n a s a l c o n la c e p a v i r u le n ta d e F C V K a le m C r o u c h ( 1040 T C ID 50 p o r g a to ) y m e z c la d o s c o n e l r e s to d e lo s g a to s p a r a la e x p o s ic ió n d e c o n ta c to . T o d o s lo s g a to s fu e r o n s o m e t id o s a u n h is o p a d o d ia r io d e s d e e l d ía 1 h a s ta e l 17 d e l e n s a y o . S e r e g is t r a r o n la s o b s e r v a c io n e s c l ín ic a s , in c lu id o s lo s p e s o s y la s te m p e r a t u r a s c o r p o r a le s . L o s h a l la z g o s c l ín ic o s s e p u n tu a r o n c o m o s e in d ic a a c o n t in u a c ió n , v é a s e la ta b la 8. (S e a d m in is t r ó u n a n t ip i r é t ic o p a ra a l iv ia r la p ir e x ia y e l s u f r im ie n to . E n u n e x p e r im e n t o a n te r io r , s e d e m o s t r ó q u e la a d m in is t r a c ió n d e u n a n t i t é r m ic o n o t e n ía n in g ú n e fe c to s o b r e la e x c r e c ió n d e l v i r u s )
T l : R m n l n i n i n l ín i
Figure imgf000017_0002
R e s u l ta d o s :
L o s g a to s e s ta b a n d e s p r o v is to s d e a n t ic u e r p o s a n te s d e la v a c u n a c ió n (D ía -1 ) . N o s e o b s e r v ó u n a fu e r te s e r o c o n v e r s ió n e n lo s g a to s d e s p u é s d e la v a c u n a c ió n ( D ía 48 ) . S e o b s e r v ó u n a fu e r te s e r o c o n v e r s ió n e n lo s g a to s d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n ( D ía 66 ) .
T a b la 9 : T í tu lo d e lo s a n t ic u e r o s
Figure imgf000017_0001
n in i n
Figure imgf000018_0001
N o s e p u d o a is la r e l v i r u s d e lo s g a to s a l p r in c ip io d e l e x p e r im e n t o n i e l d ía a n t e r io r a la e x p o s ic ió n . S e p u d o a is la r e l v i r u s e n t o d o s lo s g a to s d e lo s g r u p o s 1 y 2 , s e o b s e r v a r o n s ig n o s c l ín ic o s a s o c ia d o s a l F C V e n g a to s p e r t e n e c ie n te s a a m b o s g r u p o s , lo q u e in d ic a u n a e x p o s ic ió n im p o r ta n te .
T a b la 10 : P u n tu a c io n e s c l ín ic a s
Figure imgf000018_0002
T l 11 : i n l ín i r r :
Figure imgf000018_0003
U n a p r u e b a n o p a r a m é t r ic a d e K r u s k a l - W a l l is s o b r e lo s d a to s m o s t r ó u n a d i f e r e n c ia e s ta d ís t ic a m e n te s ig n i f ic a t iv a e n t r e lo s g a to s v a c u n a d o s y lo s g a to s d e c o n t r o l e n c u a n to a la p u n tu a c ió n to ta l (P = 0 ,037 ) y la p u n tu a c ió n d e p ir e x ia (P = 0 ,020 ) , lo q u e in d ic a q u e la c o n s t r u c c ió n M y x o - K a le m C r o u c h fu e c a p a z d e in d u c i r in m u n id a d c o n t r a la in fe c c ió n p o r e x p o s ic ió n a l F C V ( r e d u c c ió n d e la s p u n tu a c io n e s c l ín ic a s e n lo s g a to s d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n ) . D is e ñ o e x p e r im e n ta l
2.7 E s tu d io p a r a g e n e r a r s u e r o h ip e r in m u n e c o n t r a lo s v i r u s h íb r id o s F K y K F d e l F C V .
E l e s tu d io in c lu y ó s e is g a to s d o m é s t ic o s d e p e lo c o r to d e e n t r e 229 y 432 d ía s d e e d a d . E s to s s e d iv id ie r o n e n d o s g r u p o s d e 3 g a to s c o n u n r e p a r to r e la t iv a m e n te e q u i ta t iv o d e to m s e n t r e lo s g r u p o s . C a d a g r u p o s e a lo jó p o r s e p a r a d o . D e s p u é s d e la a c l im a ta c ió n , lo s g a to s p e r t e n e c ie n te s a l g r u p o 1 fu e r o n in o c u la d o s p o r v ía s u b c u tá n e a c o n 1046 T C ID s o /d o s is d e c e p a F K d e F C V . L o s g a to s p e r t e n e c ie n te s a l g r u p o 2 fu e r o n in o c u la d o s p o r v ía s u b c u tá n e a c o n 1046 T C ID 50 / d o s is d e c e p a K F d e F C V .
T o d o s lo s g a to s r e c ib ie r o n u n a s e g u n d a d o s is d e l m is m o v i r u s a 105 T C ID 50 /d o s is p o r v ía in t r a n a s a l d o s s e m a n a s d e s p u é s ( d ía 14 ) . E l s u e r o s e r e c o g ió t r e s s e m a n a s d e s p u é s d e la s e g u n d a in o c u la c ió n .
E l s u e r o s e in a c t iv ó p o r c a lo r y s e r e a l iz ó u n a p r u e b a d e n e u t r a l iz a c ió n d e l v i r u s . L a n e u t r a l iz a c ió n d e l v i r u s s e e v a lu ó m e d ia n te la r e d u c c ió n d e l e fe c to c i to p á t ic o ( E C P ) in d u c id o p o r e l v i r u s e n la s c é lu la s C rF K . S e m e z c la r o n r é p l ic a s q u ín tu p le s d e 32 - 316 T C ID 50 d e v i r u s c o n u n v o lu m e n ig u a l d e d i lu c io n e s s e r ia d a s d e s u e r o s ( e m p e z a n d o p o r 1 :4 ) . A c o n t in u a c ió n , la s m e z c la s d e v i r u s / s u e r o s e in c u b a r o n d u r a n te a l m e n o s 60 m in u to s a 37 °C . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ie r o n 100 p l d e la s m e z c la s v i r u s - s u e r o a p la c a s d e c u lt iv o d e t e j id o s d e 96 p o c i l lo s s e m b r a d a s c o n c é lu la s C r F K e n 100 p l d e m e d io d e c r e c im ie n to . L a in c u b a c ió n s e c o n t in u ó d u r a n te 5 d ía s . E l t í t u lo d e V N s e e x p r e s a c o m o la in v e r s a d e la m a y o r d i lu c ió n d e s u e r o e n la q u e e l C P E in d u c id o p o r e l v i r u s e s tu v o c o m p le ta m e n te a u s e n te .
R e s u l ta d o s
T l 12 : T í l V N r l r im r in l i n . .
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000019_0001
L o s d a to s m u e s t r a n q u e lo s v i r u s r e c o m b in a n te s F K y K F s o n in m u n o g é n ic o s e n lo s g a to s . L o s a n t ic u e r p o s d e s a r r o l la d o s e n lo s g a to s e r a n fu n c io n a le s ( n e u t r a l iz a n te s ) . L a r e a c t iv id a d c r u z a d a d e lo s a n t ic u e r p o s m o s t r ó u n a je r a r q u ía s im i la r a la o b s e r v a d a e n t r e la c e p a F 9 d e l F C V y la c e p a K a le m C r o u c h d e l F C V , d e m o d o q u e la in o c u la c ió n d e g a to s c o n la c e p a h íb r id a K F ( c á p s id e d e F 9 ) in d u jo a n t ic u e r p o s n e u t r a l iz a n te s d e l v i r u s c o n t r a la c e p a F 9 , p e r o n o c o n t r a la c e p a K a le m C r o u c h , m ie n t r a s q u e la in o c u la c ió n c o n la c e p a h íb r id a F K ( c á p s id e d e K a le m C r o u c h ) d io lu g a r a la in d u c c ió n d e a n t ic u e r p o s n e u t r a l iz a n te s d e l v i r u s c o n t r a la s c e p a s F 9 y K a le m C r o u c h .
2.8. Ín d ic e d e n e u t r a l iz a c ió n
S e u t i l iz a r o n s u e r o s h ip e r in m u n e s g e n e r a d o s e n g a to s c o n t r a la s c e p a s F 9 y K a le m C r o u c h d e F C V p a r a d e t e r m in a r e l ín d ic e d e n e u t r a l iz a c ió n d e la s c e p a s r e c o m b in a n te s F K y K F d e F C V . L o s d a to s s e m u e s t r a n e n la ta b la 7. D e la t a b la s e d e s p r e n d e q u e la c e p a f K d e F C V s e n e u t r a l iz a f u e r te m e n te c o n e l s u e r o h ip e r in m u n e a n t i- F C V K a le m C r o u c h , m ie n t r a s q u e la c e p a K f d e l F C V s e n e u t r a l iz a f u e r te m e n te c o n e l s u e r o h ip e r in m u n e a n t i- F C V F 9.
Capacidad de neutralización Capacidad de neutralización
del suero hiperinmune anti- del suero hiperinmune anti- Título del virus Muestra de FCV FCV F9 FCV Kalem Crouch (log1ü/ml) FCV FK híbrido 0 ,34 6 ,67 6 ,67
FCV KF híbrido 3 ,33 2 ,67 7
FCV F9 X+2 3 ,17 1,83 7 ,5
FCV Kalem Crouch n.°
4063 1 5 ,5 5 ,5

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. U n a p r o te ín a d e la c á p s id e d e l c a l ic iv ir u s fe l in o ( F C V ) q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s c o m o la p r o p o r c io n a d a e n e l S E Q ID N O : 34.
2. U n F C V v iv o a te n u a d o q u e c o m p r e n d e u n a p r o te ín a d e la c á p s id e d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 1.
3. U n f r a g m e n to d e A D N caracterizado porque c o m p r e n d e u n a r e g ió n q u e c o d i f ic a u n a p r o te ín a d e la c á p s id e d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 1.
4. U n f r a g m e n to d e A D N d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 3 , caracterizado porque la r e g ió n c o d i f ic a n te d e la p r o te ín a d e la c á p s id e s e e n c u e n t r a b a jo e l c o n t r o l d e u n p r o m o to r a d e c u a d o .
5. U n v i r u s p o r t a d o r r e c o m b in a n te v iv o a te n u a d o ( L A R C V ) , caracterizado porque d ic h o v i r u s p o r t a d o r c o m p r e n d e u n a r e g ió n q u e c o d i f ic a u n a p r o te ín a d e la c á p s id e d e l c a l ic iv ir u s fe l in o ( F C V ) d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 1, b a jo e l c o n t r o l d e u n p r o m o to r a d e c u a d o .
6 . U n v i r u s p o r t a d o r r e c o m b in a n te v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 5 , caracterizado porque e l L A R C V e s u n m ix o m a v i r u s o u n h e r p e s v ir u s fe l in o .
7. U n v i r u s p o r t a d o r r e c o m b in a n te v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s 5 o 6 , p a r a s u u s o e n la p r o te c c ió n d e lo s fe l in o s c o n t r a e l F C V .
8 . U n F C V h íb r id o v iv o a te n u a d o , caracterizado porque d ic h o F C V c o m p r e n d e u n m a r c o d e le c tu r a a b ie r to 2 ( O R F 2 ) q u e c o d i f ic a u n a p r o te ín a d e la c á p s id e d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 1 o u n f r a g m e n to d e A D N d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 3 y c o m p r e n d e u n m a r c o d e le c tu r a a b ie r to 1 ( O R F 1 ) d e u n F C V a te n u a d o .
9. U n F C V h íb r id o v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 8 , caracterizado porque d ic h o F C V c o m p r e n d e u n O R F 1 d e la c e p a F 9 d e l F C V .
10. U n F C V h íb r id o v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s 8 o 9 , p a r a s u u s o e n la p r o te c c ió n d e lo s fe l in o s c o n t r a e l F C V .
11. U n c u lt iv o c e lu la r q u e c o m p r e n d e u n F C V v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 2 , u n L A R C V d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s 5 o 6 , o u n F C V h íb r id o v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s 8 o 9.
12. U n a v a c u n a p a ra la p r o te c c ió n d e lo s fe l in o s c o n t r a e l F C V , caracterizada porque d ic h a v a c u n a c o m p r e n d e u n F C V v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 2 y /o u n v i r u s p o r t a d o r r e c o m b in a n te v iv o d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s 5 o 6 y /o u n F C V h íb r id o v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la s r e iv in d ic a c io n e s 8 o 9 , y u n p o r t a d o r fa r m a c é u t ic a m e n t e a c e p ta b le .
13. U n a v a c u n a d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 12 , caracterizada porque d ic h a v a c u n a c o m p r e n d e a l m e n o s o t r o m ic r o o r g a n is m o p a tó g e n o fe l in o o v i r u s p a tó g e n o fe l in o y /o a l m e n o s o t r o c o m p o n e n te in m u n o g é n ic o y /o m a te r ia l g e n é t ic o q u e c o d i f ic a d ic h o o t r o c o m p o n e n te in m u n o g é n ic o d e d ic h o m ic r o o r g a n is m o p a tó g e n o fe l in o o v i r u s p a tó g e n o fe l in o .
14. U n a v a c u n a d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 13 , caracterizado porque d ic h o a l m e n o s o t r o m ic r o o r g a n is m o p a tó g e n o fe l in o o v i r u s p a tó g e n o fe l in o s e s e le c c io n a n e n t r e e l g r u p o q u e c o n s is te e n e l v i r u s d e la p a n le u c o p e n ia fe l in a , Chlamydia psittaci, Bordetella bronchiseptica, p a r v o v i r u s fe l in o , v i r u s d e la r a b ia y v i r u s d e l h e r p e s fe l in o .
15. M é to d o in vitro p a r a o b te n e r u n F C V h íb r id o v iv o a te n u a d o d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 8 , q u e c o m p r e n d e la s e ta p a s d e :
a . P r e p a r a c ió n d e u n p r im e r a m p l ic ó n d e l F C V q u e c o m p r e n d e la r e g ió n c o m p le ta d e l O R F 1 y u n a p a r te a d y a c e n te 5 ' d e l O R F 2 d e u n F C V a te n u a d o ,
b. P r e p a r a c ió n d e u n s e g u n d o a m p l ic ó n d e F C V q u e c o m p r e n d a u n a p a r te 3 ' d e la r e g ió n O R F 1 y la r e g ió n O R F 2 / /O R F 3 a d y a c e n te c o m p le ta , e n d o n d e e l O R F 2 e s u n O R F 2 q u e c o d i f ic a u n a p r o te ín a d e la c á p s id e d e F C V d e a c u e r d o c o n la r e iv in d ic a c ió n 1,
c . E n s a m b la je d e l p r im e r y s e g u n d o a m p l ic ó n m e d ia n te e x te n s ió n s o la p a d a ,
d . G e n e r a c ió n d e F C V in fe c c io s o s ,
e . In fe c c ió n d e c é lu la s s u s c e p t ib le s c o n e l F C V in fe c c io s o ,
f. R e c u p e r a c ió n d e la p r o g e n ie in f e c c io s a d e F C V .
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