BRPI0614183A2 - uso de dose única de moléculas de ligação especìficas para cd20 - Google Patents

Abstract

USO DE DOSE UNICA DE MOLéCULAS DE LIGAçXO ESPECìFICAS PARA CD2 O A presente invençào fornece materiais e métodos para tratamento de doenças que envolvem atividade aberrante de células B que usa uma dose única de uma molécula de ligação específica para CD2O.

Description

USO DE DOSE ÚNICA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICAS PARACD20

Este pedido reivindica o beneficio de prioridade dosPedidos Provisórios de Patente U.S. Nos 60/702.498,depositado em 25 de julho de 2005, e 60/702.875,cdepositado em 27 de julho 2006, cada um deles aquiincorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece materiais e métodos paratratamento de doenças que envolvem atividade aberrante decélulas B com o uso de uma dose única de uma molécula deligação especifica para CD20.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Em seu papel normal, o sistema imunológico humanoprotege o corpo de danos de substâncias estranhas epatógenos. Uma forma pela qual o sistema imunológicoprotege o corpo é através da produção de célulasespecializadas denominadas linfócitos B ou células B. Ascélulas B produzem anticorpos que se ligam a, e, em algunscasos, medeiam a destruição de uma substância estranha oupatógeno.

No entanto, em alguns casos, há uma alteração dosistema imunológico humano, e especificamente doslinfócitos B do sistema imunológico humano, surgindo umadoença. Há vários cânceres que envolvem a proliferaçãodescontrolada de células B. Há também diversas doençasauto-imunes que envolvem a produção de anticorpos porcélulas B, os quais, em vez de se ligarem às substânciasestranhas e patógenos, ligam-se a partes do corpo. Alémdisso, existem várias doenças auto-imunes e inflamatóriasque envolvem células B em sua patologia, por exemplo,através da apresentação inadequada de antigeno de célula Bàs células T ou através de outras vias que envolvem célulasB. Por exemplo, camundongos com tendência auto-imunedeficientes em células B não desenvolvem doença renal auto-imune, vasculite ou auto-anticorpos (Shlomchik e cols., J.Exp. Med. 1994, 180: 1.295-306). Curiosamente, esses mesmoscamundongos com tendência auto-imune que possuem células B,mas são deficientes na produção de imunoglobulinas,desenvolvem doenças auto-imunes quando induzidosexperimentalmente (Chan e cols., J. Exp. Med. 1999, 189:1.639-48), o que indica que as células B têm umaparticipação integral no desenvolvimento de doença auto-imune.

As células B podem ser identificadas por moléculas emsua superfície celular. CD20 foi a primeira molécula desuperfície específica para a linhagem de célula B humanaidentificada por um anticorpo monoclonal. Ela é umafosfoproteína transmembrana de célula B não glicosiladahidrofóbica de 35 kDa que tem tanto sua extremidade aminoquanto a sua extremidade carbóxi situadas dentro da célula.Einfeld e cols., EMBO J. 1988, 7: 711-17. CD20 é expressopor todas as células B maduras normais, mas não é expressopor células B precursoras ou por células plasmáticas. Nãoforam identificados ligantes naturais para CD20, e a funçãode CD20 na biologia das células B ainda não é completamentecompreendida.

Anticorpos monoclonais anti-CD20 afetam a viabilidadee o crescimento de células B (Clark e cols., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 1986, 83: 4.494-98). O intensoentrecruzamento de CD20 pode induzir apoptose em linhagensde linfoma de células B (Shan e cols., Blood 1998, 91:1.644-52), e foi relatado que o entrecruzamento de CD2 0 nasuperfície celular aumenta a magnitude e intensifica acinética de transdução de sinal, por exemplo, comodetectado medindo-se a fosforilação de tirosina desubstratos celulares (Deans e cols., J. Inmunol. 1993, 146:846-53). Portanto, além da eliminação celular porcomplemento e mecanismos de ADCC, a ligação ao receptor Fcpor anticorpos monoclonais de CD20 in vivo pode promoverapoptose de células B malignas por entrecruzamento de CD20,o que é consistente com a teoria de que a eficácia daterapia com CD2 0 do linfoma humano em um modelo decamundongo SCID pode ser dependente da ligação ao receptorFc pelo anticorpo monoclonal CD20 (Funakoshi e cols., J.Immunotherapy 1996, 19: 93-101). A presença de múltiplosdomínios que transpõem a membrana no polipeptídeo CD20(Einfeld e cols., EMBO J. 1988, 7: 711-17; Stamenkovic ecols., J .Exp. Med. 1988, 167: 1.975-80; Tedder e cols., J.Immunol. 1988, 141: 4.388-4.394) evita a internalização deCD20 após a ligação de anticorpo, e isso foi reconhecidocomo uma característica importante para a terapia demalignidades de células B quando um anticorpo monoclonalCD2 0 murídeo, 1F5, era injetado em pacientes com linfoma decélulas B, causando a eliminação significativa de célulasmalignas e respostas clínicas parciais (Press e cols.,BlOOd 1987, 69: 584-91).

Como as células B maduras normais também expressamCD37 e CD2 0, as células B normais são eliminadas pelaterapia com anticorpo anti-CD20 (Reff e cols., Blood, 1994,83: 435-445). Após o término do tratamento, no entanto, ascélulas B normais podem ser regeneradas a partir deprecursores de células B CD20-negativos; portanto, ospacientes tratados com terapia anti-CD2 0 não apresentamimunossupressão significativa.

CD2 O é expresso por células malignas originárias decélulas B, incluindo Iinfoma de células B e leucemiaIinfocítica crônica (CLL) . CD20 não é expresso pormalignidades de pré-células B, por exemplo, leucemialinfoblástica aguda. Portanto, CD20 é um bom alvo para aterapia de Iinfoma de células B, leucemia Iinfocíticacrônica (CLL) e outras doenças nas quais as células B estãoenvolvidas na etiologia da doença. Outros distúrbios decélulas B incluem doenças auto-imunes nas quais sãoproduzidos auto-anticorpos durante a diferenciação decélulas B em células plasmáticas.

Vários grupos investigaram o uso de anticorpos anti-CD20 para o tratamento de doenças relacionadas às células

B. Um tratamento consiste em anticorpos anti-CD20preparados na forma de radionuclídeos para tratamento delinfoma de células B (por exemplo, anticorpo anti-CD20marcado com 131I) , além de uma forma marcada com 89Sr para aatenuação de dor óssea causada por metástases de câncer depróstata e mama (Endo, Gan To Kagaku Ryoho 1999, 26: 744-748) .

Patentes e publicações de patentes relacionadas aosanticorpos de CD20 incluem as Patentes U.S. Nos 5.776.456,5.736.137, 6.399.061 e 5.843.439, bem como os pedidos depatente U.S. Nos US 2002/0197255 Al e US 2003/0021781 Al(Anderson e cols.); Patente U.S. N0 6.455.043 Bl e WO00/09160 (GriIlo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez eWhite); WO 00/27433 (Grillo-Lopez e Leonard); WO 00/44788(Braslawsky e cols.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter e White); WO 01/10460 (White e Grillo-Lopez); Pedido U.S. N0 US 2002/0006404 e WO 02/04021 (Hannae Hariharan) ; pedido U.S. N0 US 2002/0012665 Al e WO01/74388 (Hanna, N.); pedido U.S. N0 US 2002/0009444 Al eWO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO 01/97858 (White, C.);pedido U.S. N0 US 2002/0128488 Al e WO 02/34790 (Reff, M.);WO 02/060955 (Braslawsky e cols.); WO 02/096948 (Braslawskye cols.); WO 02/079255 (Reff e Davies); Patentes U.S. NoS6.171.586 Bl e WO 98/56418 (Lam e cols.); WO 98/58964(Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.);WO 99/51642, PatenteU.S. N0 6.194.551 BI, Patente U.S. N0 6.242.195 BI, PatenteU.S. N0 6.528.624 Bl e Patente U.S. N0 6.538.124 (Idusogiee cols.); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd ecols.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez e cols.); pedido U.S. N0US 2002/0004587 Al e WO 01/77342 (Miller e Presta); pedidoU.S. N0 US 200210197256 (Grewal, I.); Patentes U.S. Nos6.090.365 BI, 6.287.537 BI, 6.015.542, 5.843.398 e5.595.721, (Kaminski e cols.); Patentes U.S. Nos 5.500.362,5.677.180, 5.721.108 e 6.120.767 (Robinson e cols.);Patente U.S. N0 6.410.391 Bl (Raubitschek e cols.);Patentes U.S. NoS 6.224.866 Bl e WO 00/20864 (Barbera-Gui Hera, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); WO 00/74718 (Goldenberg e Hansen);WO 00/76542 (Golay e cols.); WO 01/72333 (Wolin eRosenblatt); Patente U.S. N0 6.368.596 Bl (Ghetie e cols.);Pedido U.S. N0 US 2002/0041847 Al, (Goldenberg, D.); PedidoU.S. N0 US 2003/0026801 Al (Weiner e Hartmann); WO02/102312 (Engleman, E.). Veja também Patente U.S. N05.849.898 e Pedido E.P. N0 330.191 (Seed e cola.); PatenteU.S. N° 4.861.579 e EP 332.865 A2 (Meyer e Weiss) ; e WO95/03770 (Bhat e cols.), cada um deles sendo expressamenteaqui incorporado por referência.

Um anticorpo monoclonal quimérico específico paraCD20, que consiste em regiões variáveis de cadeia pesada eleve originadas de camundongo fundidas à cadeia pesada deIgGl humana e regiões constantes da cadeia leve kappahumanas, supostamente manteve a ligação a CD20 e ahabilidade para mediar ADCC e fixar complemento (Liu ecols., J. Iwmunol. 1987, 139: 3.521-26). Ainda outroanticorpo quimérico anti-CD2 0 foi feito a partir dohibridoma IDEC C2B8 e foi denominado rituximab. Acredita-seque o mecanismo da atividade antitumoral de rituximab,discutido acima, seja uma combinação de várias atividades,incluindo citotoxicidade mediada por células dependente deanticorpos (ADCC), fixação de complemento e desencadeamentode sinais que promovem apoptose em células B malignas. ADCCé uma reação mediada por células na qual célulascitotóxicas inespecíficas que expressam receptores Fc(FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK) ,neutrófilos e macrófagos) reconhecem um anticorpo ligado emuma célula-alvo e, subseqüentemente, causam a Iise dacélula-alvo. A fixação de complemento, ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC) , é a habilidade de umamolécula para lisar um alvo na presença de complemento. Avia de ativação do complemento é iniciada pela ligação doprimeiro componente do sistema complemento (Clq) a umamolécula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com umantígeno cognato. 0 grande tamanho de rituximab impede adifusão ótima da molécula em tecidos linfóides que contêmcélulas B malignas, limitando, dessa forma, essasatividades antitumorais.

Rituximab, administrado tipicamente em 4 doses comoinfusões 4 vezes por semana de anticorpo (1 dose/semana x4), é usado atualmente para tratar Iinfoma de células B nãoHodgkin de grau baixo ou folicular (McLaughlin e cols.,Oncology 1998, 12: 1.763- 1.777; Leget e cols., Curr. Opin.Oncol. 1998,10: 548-551) e em recidivas de linfomafolicular no estágio III/IV (White e cols., Pharm. Sei.Technol. Today 1999, 2: 95-101). Outros distúrbiostratáveis com Rituximab incluem linfoma de células docentro folicular (FCC), linfoma de células do manto (MCL),linfoma difuso de células grandes (DLCL) e linfomaIinfocítico de células pequenas (SLL) (Nguyen e cols., Eur.J. Haematol. 1999, 62: 76-82)). Rituximab administrado eminfusões semanais também é usado para tratar CLL (Lin ecols., Sem. Oncol. 2003, 30: 483-92).

Anticorpos anti-CD20 também foram usados intensamentepara o tratamento de pacientes que sofrem de doenças auto-imunes associadas à produção de auto-anticorpos por célulasB. Por exemplo, rituximab demonstrou benefícios clínicossignificativos na eliminação de células B CD20+ empacientes com várias doenças auto-imunes/inflamatórias,incluindo artrite reumatóide (AR) (Edwards, N. Engl. J.Med. 2 004, 350: 2.546-8; Cambridge e cols., ArthritisRheum. 2003, 48: 2.146-54). Os pacientes com AR receberamdoses contínuas de metotrexato (MTX) e um esquema de 2doses de infusão de rituximab (Edwards e cols., supra).Esses pacientes apresentaram melhora das respostas da"American College of Rheumatology" (ACR), comparados comgrupos de controle.

Em um experimento para o tratamento de lúpuseritematoso sistêmico (LES) (Leandro e cols., ArthritisRheum. 2002, 46: 2.673-7), os pacientes receberam aadministração de duas infusões de rituximab em alta dose, edemonstraram eliminação de células B e melhora do estado dadoença. Em um segundo estudo de eliminação de células B noLES (Looney e cols., Arthritis Rheum. 2004, 50: 2.580-9),os pacientes receberam uma infusão única de 100 mg/m2 (dosebaixa), uma infusão única de 375 mg/m2 (dose intermediária)ou 4 infusões (com intervalo de 1 semana) de 375 mg/m2(dose alta). Esses pacientes demonstraram eliminação decélulas B e melhora das pontuações da doença, mas otratamento não alterou o nível de auto-anticorpos. Tambémforam realizados experimentos de rituximab namacroglobulinemia de Waldenstrom (Treon e cols.,Inununother. 2001, 24: 112-3), nos quais os pacientesapresentaram aumento do hematócrito (HCT) e das contagensde plaquetas (PLT) após 4 infusões de rituximab.

Relatos recentes de tratamento com rituximab empacientes que sofrem de esclerose múltipla, uma doençaauto-imune que afeta o sistema nervoso central, indicam queum esquema de tratamento elimina células B periféricas, mastem pouco efeito sobre células B no líquido cerebro-espinhal. (Monson e cols., Arch. Neurol., 2005, 62: 258-264).

Publicações adicionais em relação ao uso de rituximabincluem: Stashi e cols. "Rituximab chimeric anti-CD20monoclonal antibody treatment for adults with chronicidiophatic thrombocytopenic purpura" Blood 98: 952-957(2001); Matthews, R. "Medicai Heretics" New Scientist (7 deabril de 2001) ; Leandro e cols. "Clinicai outcome in 22patients with rheuraatoid arthritis treated with Blymphocyte depletion" Ann. Rheum. Dis. 2002, 61: 833-888;Leandro e cols. "Lymphocyte depletion in rheumatoidarthritis: early evidence for safety, efficacy and doseresponse". Arthritis and Rheumatisml 2001, 44: S370;Leandro e cols. "An open study of B lymphocyte depletion insystemic lupus erythematosus", Arthritis Rheum. 2002, 46:2.613-2.611; Edwards e cols., "Sustained improvement inrheumatoid arthritis following a protocol designed todeplete B lymphocytes" Rheumatology 2001, 40: 205-211;Edwards e cols. "B-lymphocyte depletion therapy inrheumatoid arthritis and other autoimmune disorders".Biochem. Soe. Trans. 2002, 30: 824-828; Edwards e cols."Efficacy and safety of rituximab, a B-cell targetedchimeric monoclonal antibody: A randomized, placebocontrolled trial in patients with rheumatoid arthritis".Arthritis Rheum. 2002, 46: S197; Levine e cols., "IgMantibody-related polyneuropathies: B-cell depletionchemotherapy using rituximab" Neurology 1999, 52: 1.701-1.704; DeVita e cols. "Efficacy of selective B-cellblockade in the treatment of rheumatoid arthritis"Arthritis Rheum. 2002, 46: 2.029-2.033; Hidashida e cols."Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis withrituximab", apresentado no "Annual Scientific Meeting ofthe American College of Rheumatology"; 24-29 de outubro;Nova Orleans, La. 2002; Tuscano, J. "Successful treatmentof Infliximab-refractory rheuraatoid arthritis withrituximab", apresentado no "Annual Scientific Meeting ofthe American College of Rheumatology" ; 24-29 de outubro;New Orleans, La. 2002.

Ainda persistem problemas associados à terapia comrituximab. Por exemplo, a maioria dos pacientes com câncertratados com rituximab apresenta recidiva, geralmente ematé cerca de 6-12 meses, e foram relatadas reações fatais àinfusão em até 24 horas após a infusão de rituximab. Essasreações fatais ocorreram após um complexo de reação àinfusão que incluía hipóxia, infiltrados pulmonares,síndrome do sofrimento respiratório agudo, infarto domiocárdio, fibrilação ventricular ou choque cardiogênico. Ainsuficiência renal aguda com necessidade de diálise comcasos de resultados fatais também foi relatada no quadro desíndrome de Iise tumoral após o tratamento com rituximab,bem como reações mucocutâneas graves, algumas comresultados fatais. Adicionalmente, são necessárias dosesaltas de rituximab para a injeção intravenosa, pois amolécula é grande, de aproximadamente 150 kDa e, comoobservado acima, a difusão nos tecidos linfóides, onderesidem muitas células tumorais reside, é limitada. Umadesvantagem adicional do tratamento com rituximab é quetipicamente são dadas várias doses de rituximab aospacientes em tratamento, normalmente uma dose alta porsemana por quatro semanas (Maloney e cols., Blood 1997, 90:2.188-2.195), mas um estudo de dose-resposta em sereshumanos que receberam uma dose única de anticorpo rituximabresultou em uma eliminação modesta de células B nosindivíduos que receberam doses altas do anticorpo (Maloneye COls., Blood 1994, 84: 2.457-2.466).

A tecnologia de anticorpo monoclonal e métodos deengenharia genética levaram ao desenvolvimento rápido demoléculas de imunoglobulina para diagnóstico e tratamentode doenças humanas. Foram criadas proteínas por engenhariagenética para aumentar a afinidade de um anticorpo por seuantígeno cognato, para reduzir os problemas relacionados àimunogenicidade, e para alterar as funções efetoras de umanticorpo. A estrutura do domínio de imunoglobulinas épassível de ser submetida à engenharia genética, uma vezque os domínios de ligação de antígeno e os domínios queconferem funções efetoras podem ser trocados entre classese subclasses de imunoglobulinas. A estrutura e a função dasimunoglobulinas são revisadas, por exemplo, em Harlow ecols., Eds., "Antibodies: A Laboratory Manual", Capítulo14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(1988). Uma introdução extensa, além de informaçõesdetalhadas sobre todos os aspectos da tecnologia deanticorpo recombinante, pode ser encontrada no livro-texto"Recombinant Antibodies" (John Wiley & Sons, NY, 1999). Umacoleção abrangente de protocolos de laboratório detalhadossobre o projeto de anticorpos por engenharia genética podeser encontrada em R. Kontermann e S. Dübel (eds.), "TheAntibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag,Heidelberg/Nova York, 2000).

Recentemente, foram construídas moléculas menores deimunoglobulina para superar problemas associados à terapiacom imunoglobulina inteira. Fv de cadeia única (scFv)compreende um domínio variável da cadeia pesada deanticorpo unido através de um peptídeo vinculador curto aum domínio variável da cadeia leve de anticorpo (Huston ecols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1988, 85: 5.879-83).Além de regiões variáveis, cada uma das cadeias doanticorpo tem uma ou mais regiões constantes. Cadeias levespossuem um único domínio da região constante. Dessa forma,cadeias leves possuem uma região variável e uma regiãoconstante. Cadeias pesadas possuem vários domínios daregião constante. As cadeias pesadas nos anticorpos IgG,IgA e IgD possuem três domínios da região constante, quesão designados CHI, CH2 e CH3, e as cadeias pesadas nosanticorpos IgM e IgE possuem quatro domínios da regiãoconstante, CHI, CH2, CH3 e CH4. Dessa forma, as cadeiaspesadas possuem uma região variável e três ou quatroregiões constantes.

as cadeias pesadas de imunoglobulinas também podem serdivididas em três regiões funcionais: a região Fd (umfragmento que compreende Vh e CHI, ou seja, os doisdomínios do terminal N da cadeia pesada), a região dedobradiça e a região Fc (a região do "fragmentocristalizável", derivada de regiões constantes e formadaapós digestão com pepsina). A região Fd em combinação com acadeia leve forma um Fab (o "fragmento de ligação deantígeno"). Como um antígeno reagirá estereoquimicamentecom a região de ligação de antígeno no terminal amino decada Fab, a molécula de IgG é divalente, ou seja, ela podese ligar a duas moléculas de antígeno. 0 Fc contém osdomínios que interagem com receptores de imunogIobuIina nascélulas e com os elementos iniciais da cascata docomplemento. Dessa forma, o fragmento Fc é geralmenteconsiderado responsável pelas funções efetoras de umaimunoglobulina, por exemplo, fixação de complemento eligação aos receptores Fc.

Por causa do pequeno tamanho das moléculas de scFv,elas exibem uma depuração muito rápida do plasma e dostecidos, e uma penetração mais eficaz em tecidos do que aimunoglobulina inteira. Um scFv antitumoral mostroupenetração tumoral mais rápida e uma distribuição maisequilibrada pela massa tumoral do que o anticorpo quiméricocorrespondente (Yokota e cols., Câncer Res. 1992, 52:3.402- 08). A fusão de um scFv com outra molécula, porexemplo, uma toxina, se beneficia da atividade específicade ligação de antígeno e do pequeno tamanho de um scFv paraliberar a toxina a um tecido-alvo (Chaudary e cols., Nature1989, 339: 394; Batra e cols., Mol. Cell. Biol. 1991, 11:2.200).

Apesar das vantagens que as moléculas de scFv trazempara a soroterapia, há várias desvantagens associadas aessa abordagem terapêutica. Embora a depuração rápida descFv possa reduzir seus efeitos tóxicos em células normais,essa depuração rápida pode impedir a liberação de uma doseeficaz mínima ao tecido-alvo. A fabricação de quantidadesadequadas de scFv para administração a pacientes foidesafiadora, em função das dificuldades na expressão e doisolamento de scFv que afetam de forma adversa orendimento. Durante a expressão, as moléculas de scFv nãopossuem estabilidade e freqüentemente se agregam por causado pareamento de regiões variáveis de moléculas diferentes.Além disso, os níveis de produção de moléculas de scFv emsistemas de expressão mamíferos são baixos, limitando opotencial para a fabricação eficiente de moléculas de scFvpara terapia (Davis e cols., J. Biol. Chem. 1990, 265:10.410-18); Traunecker e cols., EMBO J. 1991, 10: 3.655-59). Foram exploradas estratégias para aumento da produção,incluindo a adição de sítios de glicosilação nas regiõesvariáveis (Jost, C.R. Patente U.S. N0 5.888.773, Jost ecols.; J. Biol. Chem. 1994, 69: 26.267-73).

Outra desvantagem do uso de scFv para terapia é aausência de função efetora. Um scFv sem as funçõescitolíticas, ADCC e citotoxicidade dependente decomplemento (CDC) associadas à região constante de umaimunoglobulina, pode ser ineficaz para o tratamento dedoenças. Muito embora o desenvolvimento da tecnologia descFv tenha começado há mais de 12 anos, atualmente não háprodutos de scFv aprovados para terapia.

Alternativamente, foi proposto que a fusão de um scFva outra molécula, por exemplo, uma toxina, poderia sebeneficiar da atividade específica de ligação de antígeno edo pequeno tamanho de um scFv para liberar a toxina em umtecido-alvo. Chaudary e cols., Nature 339: 394; Batra ecols., Mol. Cell. Biol. 1991, 11: 2.200. A conjugação oufusão de toxinas a scFvs foi, desse modo, oferecida comouma estratégia alternativa para gerar moléculas potentes,com especificidade de antígeno, mas a dosagem com taisconjugados ou quimeras pode ser limitada por toxicidadeexcessiva e/ou inespecífica em função da porção de toxinade tais preparações. Os efeitos tóxicos podem incluirelevação suprafisiológica das enzimas hepáticas e síndromede vazamento vascular, e outros efeitos indesejados. Alémdisso, as próprias imunotoxinas são altamente imunogênicasquando administradas a um hospedeiro, e os anticorpos dohospedeiro gerados contra a imunotoxina limitam a utilidadepotencial para tratamentos terapêuticos repetidos de umindivíduo.

Outras proteínas de fusão projetadas, denominadaspequenos produtos imunofarmacêuticos modulares (SMIP™) ,são descritas nas Publicações de Patente U.S. de co-propriedade 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049, e nasPublicações de Patente Internacional de co-propriedade WO02/056910, WO 2005/037989 e WO 2005/017148, que são todasaqui incorporadas por referência. Os produtos SMIP sãoproteínas de fusão de domínio de ligação-imunoglobulinainéditas que apresentam um domínio de ligação para umaestrutura cognata, por exemplo, um antígeno, um contra-receptor ou outros mais; um polipeptídeo da região dedobradiça de IgGl, IGA ou IgE do tipo selvagem ou umpolipeptídeo da região de dobradiça de IgGl mutante quepossui zero, um ou dois resíduos de cisteína; e domíniosCH2 e CH3 de imunoglobulina. Os produtos SMIP são capazesde ADCC e/ou CDC.

Embora tenha sido realizada uma pesquisa intensa sobreterapias baseadas em anticorpos, ainda existe a necessidadena técnica de métodos aprimorados para o tratamento dedoenças associadas à atividade aberrante de células B. Osmétodos da presente invenção aqui descritos e reivindicadosfornecem esses métodos aprimorados, além de outrasvantagens.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada a métodos paramodulação dos níveis da população de células B em umadoença associada à atividade aberrante de células B.Em um aspecto, a invenção fornece um método detratamento de um indivíduo que possui ou suspeito de teruma doença associada à atividade aberrante de células B,que compreende a administração a um paciente de uma doseúnica de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umamolécula de ligação específica para CD20. Em umamodalidade, a molécula de ligação específica para CD2 0 é umpequeno produto imunofarmacêutico modular específico paraCD20 (SMIP).

"Atividade aberrante de células B" refere-se àatividade celular que se desvia da evolução normal,adequada ou esperada. Por exemplo, atividade celularaberrante pode incluir proliferação inadequada de célulascujo DNA ou outros componentes celulares se tornaramdanificados ou defeituosos. A atividade aberrante decélulas B pode incluir proliferação celular cujascaracterísticas estão associadas a uma doença causada,mediada ou que resulta em níveis inadequadamente elevadosde divisão celular, níveis inadequadamente baixos deapoptose, ou ambos. Tais doenças podem ser caracterizadas,por exemplo, por proliferações anormais locais únicas oumúltiplas de células, grupos de células ou tecido(s), sejamelas cancerosas ou não cancerosas, benignas ou malignas,descritas com mais detalhes abaixo. A atividade aberrantede células B também pode incluir a produção de anticorpoaberrante, por exemplo, a produção de auto-anticorpos ou asuperprodução de anticorpos tipicamente desejável em níveisnormais. Contempla-se que a atividade aberrante de célulasB pode ocorrer em certas subpopulações de células B, e nãoem outras subpopulações. A atividade aberrante de células Btambém pode incluir estimulação inadequada de células T1por exemplo, por apresentação inadequada de antígeno decélula B às células T ou por outras vias que envolvemcélulas B.

Uma "dose única" de uma molécula de ligação específicapara CD2 0 refere-se à administração de uma única infusãocontínua de uma dose de um SMIP específico para CD20 noinício do tratamento, em contraste com terapias de dosesmúltiplas que exigem a administração uma vez por semana ouuma vez a cada duas semanas de uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20. Em uma modalidade, uma única infusãocontínua pode ser uma infusão subcutânea prolongada, umainfusão intravenosa, ou outras mais. A infusão contínuaúnica pode ser administrada por um período de tempo, porexemplo, de cerca de 15 minutos até cerca de 1 hora, cercade 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11,horas, cerca de 12 horas, cerca de 24 horas, ou um ou maisdias ou semanas (por exemplo, uma liberação sustentada deum dispositivo implantado ou depósito de gel). A dose únicapode ser administrada junto com outras substânciasterapêuticas ou segundos agentes, e pode ser administradaconcomitantemente, antes ou depois da administração de umsegundo agente terapêutico aqui descrito. De acordo com apresente invenção, uma única infusão contínua pode englobarbreves interrupções da infusão, como for necessário deacordo com considerações práticas.

"Um indivíduo que possui, ou com suspeita de ter, umadoença associada à atividade aberrante de células B" é umindivíduo no qual uma doença ou um sintoma de um distúrbiopode ser causado por atividade aberrante de células B, podeser exacerbado por atividade aberrante de células B, oupode ser aliviado por regulação da atividade de células B.

Exemplos de tais doenças são cânceres de células B (porexemplo, Iinfoma de células B, uma leucemia de célula B ouum mieIoma de célula B) , uma doença caracterizada porprodução de auto-anticorpo ou uma doença caracterizada porestimulação inadequada de células T, por exemplo, porapresentação inadequada de antígeno de célula B às célulasT, ou causada por outras vias que envolvem células B.

Em um aspecto, um indivíduo tratado pelos métodos dainvenção demonstra uma resposta ao tratamento com umamolécula de ligação de CD20 aqui descrita que é melhor doque a resposta ao tratamento com rituximab e sem outramolécula de ligação de CD20. Uma resposta que é superior emrelação ao tratamento com rituximab sem outra molécula deligação de CD20 refere-se a uma resposta clínica em que otratamento pelo método da invenção resulta em uma respostaclínica em um paciente que é melhor do que uma respostaclínica em um paciente submetido à terapia com rituximab,por exemplo, rituximab isoladamente ou rituximab emcombinação com outros agentes, em que os outros agentes nãosão outras moléculas de ligação de CD20. Uma respostasuperior é avaliada por comparação de critérios clínicosbem conhecidos na técnica e aqui descritos. Critériosexemplares incluem, sem limitação, duração da eliminação decélulas B, redução dos números globais de células B,redução dos números de células B em uma amostra biológica,redução do tamanho do tumor, redução do número de tumoresexistentes e/ou que surgem após o tratamento, e melhora daresposta global, como avaliada pelos próprios pacientes epelos médicos, por exemplo, com o uso do índice PrognósticoInternacional. A melhora pode ser em um ou mais de um doscritérios clínicos. Uma resposta superior com o método dainvenção pode ser causada por uma resposta inadequada atratamento prévio ou concomitante com rituximab, porexemplo, por causa da toxicidade e/ou eficácia inadequadado tratamento com rituximab.

Em um aspecto relacionado, o indivíduo tratado pelosmétodos da invenção também recebe a administração derituximab. Em uma modalidade, rituximab pode ter sidoadministrado como uma primeira linha de tratamento, econtinua quando o tratamento com um método da invenção foiiniciado. Em outra modalidade, o tratamento com rituximab ésuspenso após o tratamento com um método da invenção tersido iniciado.

"Um indivíduo que possui ou com suspeita de ter umadoença reumática" é uma pessoa ou um indivíduo afetado poruma doença ou distúrbio de origem articular ou do sistemamusculoesquelético que afeta áreas como as articulações,cartilagens, músculos, nervos e tendões. Contempla-se aindaque o indivíduo que possui ou suspeito de ter uma doençareumática pode ter recebido previamente terapia paratratamento de uma doença reumática. Em uma modalidade, umadoença reumática inclui, sem limitação, artrite reumatóide,espondilite anquilosante, dermatomiosite, Púrpura de HenochSchonlein, artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática,Síndrome de Raynaud, Síndrome de Reiter, sarcoidose,espondiloartropatias, esclerose sistêmica progressiva emiosite.

"Um indivíduo que possui ou com suspeita de ter umadoença auto-imune do sistema nervoso central" ou "distúrbiodo sistema nervoso central" é uma pessoa ou um indivíduoafetado por uma doença ou um distúrbio que afeta o sistemanervoso central, incluindo o cérebro e a medula vertebral,ou áreas como o nervo óptico. Contempla-se ainda que oindivíduo que possui ou suspeito de ter um distúrbio dosistema nervoso central pode ter recebido previamenteterapia para o tratamento de um distúrbio do sistemanervoso central. Em uma modalidade, a doença auto-imune dosistema nervoso central inclui, sem limitação, esclerosemúltipla, encefalomielite alérgica, neuromielite ótica,mielite de lúpus e cerebrite de lúpus.

"Vasculite" refere-se a uma doença ou um distúrbioassociado à inflamação em um vaso sangüíneo. Distúrbios devasculite exemplares incluem, sem limitação, doença deBehcet, vasculite do sistema nervoso central, síndrome deChurg-Strauss, crioglobulinemia, arterite de célulagigante, púrpura de Henoch Schonlein, vasculite/angeíte dehipersensibilidade, doença de Kawasaki, vasculiteleucocitoclástica, poliantite, poliarterite nodosa,polimialgia, policondrite, vasculite reumatóide, arteritede Takayasu, granulomatose de Wegener, vasculite comoconseqüência de hepatite, febre mediterrânea familiar,poliangeíte microscópica, síndrome de Cogan, síndrome deWhiskott-Aldrich e tromboangeíte obliterante.

"Tratamento" ou "tratamento de" refere-se a umtratamento terapêutico ou a tratamentos profiláticos oupreventivos. Um tratamento terapêutico pode melhorar pelomenos um sintoma de uma doença em um indivíduo que recebe otratamento, ou pode retardar a piora de uma doençaprogressiva em um indivíduo, ou evitar o surgimento dedoenças adicionais associadas.

Uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz" deuma molécula de ligação específica para CD20 refere-seàquela quantidade do composto suficiente para resultar naatenuação de um ou mais sintomas da doença tratada. Quandoaplicada a um ingrediente ativo individual, administradoisoladamente, uma dose terapeuticamente eficaz refere-seàquele ingrediente isoladamente. Quando aplicada a umacombinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àsquantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultamno efeito terapêutico, sejam elas administradas serial ousimultaneamente. A invenção especificamente contempla queuma ou mais moléculas de ligação específicas podem seradministradas de acordo com métodos da invenção, cada umaem uma dose eficaz.

Métodos contemplados pela invenção são úteis para otratamento de doenças como cânceres de células B (porexemplo, Iinfornas de células B, leucemias de células B,linfomas de células B), doenças caracterizadas por produçãode auto-anticorpo ou doenças caracterizadas por estimulaçãoinadequada por células T de células T, por exemplo, porantígenos inadequados de células B para células T ou poroutras vias que envolvem células B.

Cânceres de células B incluem linfomas de células B[por exemplo, as várias formas de doença de Hodgkin,linfoma não Hodgkin (NHL) ou linfomas do sistema nervosocentral], leucemias [por exemplo, leucemia Iinfoblásticaaguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemiade células pilosas e leucemia mieloblástica crônica] emielomas (por exemplo, mieloma múltiplo). Cânceres decélulas B adicionais incluem linfoma linfocítico pequeno,leucemia prolinfocítica de células B, linfomalinfoplasmocitico, linfoma da zona marginal esplênica,mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma solitário dosossos, plasmocitoma extra-ósseo, linfoma de células Bextranodal da zona marginal de tecido linfóide associado àmucosa (MALT), linfoma de células B nodal da zona marginal,linfoma folicular, linfoma das células do manto, linfomadifuso de células B grandes, linfoma mediastinal de célulasB grandes (tímico), linfoma intravascular de células Bgrandes, linfoma de efusão primária, Iinfoma/leucemia deBurkitt, proliferações de células B de potencial malignoincerto, granulomatose linfomatóide e distúrbiolinfoproliferativo pós-transplante.

Distúrbios caracterizados por produção de auto-anticorpo são freqüentemente considerados doenças auto-imunes. Doenças auto-imunes incluem, sem limitação:artrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil,osteoartrite, policondrite, artrite psoriática, psoríase,dermatite, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpo deinclusão, miosite inflamatória, necrólise epidérmicatóxica, esclerodermia e esclerose sistêmicas, síndrome deCREST, respostas associadas à doença inf lamatória dointestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome dosofrimento respiratório, síndrome do sofrimentorespiratório do adulto (ARDS), meningite, encefalite,uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas,eczema, asma, condições que envolvem a infiltração decélulas T e respostas inflamatórias crônicas,aterosclerose, miocardite auto-imune, deficiência de adesãode leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (LES), lúpuseritematoso cutâneo subagudo, lúpus discóide, mielite delúpus, cerebrite de lúpus, diabetes de surgimento juvenil,esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, neuromieliteótica, febre reumática, coréia de Sydenham, respostasimunológicas associadas à hipersensibilidade aguda eretardada mediada por citocinas e linfócitos T,tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindogranulomatose de Wegener e doença de Churg-Strauss,agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite/angeíte dehipersensibilidade, ANCA e vasculite reumatóide), anemiaaplásica, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolíticaimune, incluindo anemia hemolítica auto-imune (AIHA),anemia perniciosa, aplasia pura de células vermelhas(PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropeniaauto-imune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvemdiapedese leucocitária, distúrbios inflamatórios do sistemanervoso central (SNC), síndrome de lesão de múltiplosórgãos, miastenia grave, doenças mediadas por complexoantígeno-anticorpo, doença da membrana basalantiglomerular, síndrome do anticorpo anti-fosfolipídeo,neurite alérgica, doença de Behcet, síndrome de Castleman,síndrome de Goodpasture, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjórgen, síndromede Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgãosólido, doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigóidebolhoso, pênfigo, poliendocrinopatias auto-imunes,espondiloartropatias soronegativas, doença de Reiter,síndrome da pessoa rígida (stiff-man), arterite de célulagigante, nefrite por complexo imune, nefropatia por IgA,polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM,púrpura trombocitopênica idiopática (PTI), púrpuratrombocitopênica trombótica (TTP), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia auto-imune, doença auto-imune dotestículo e do ovário, incluindo orquite e ooforite auto-imunes, hipotireoidismo primário; doenças endócrinas auto-imunes, incluindo tireoidite auto-imune, tireoidite crônica(tireoidite de Hashimoto), tireoidite subaguda,hipotireoidismo idiopático, doença de Addison, doença deGrave, síndromes poliglandulares auto-imunes (ou síndromesde endocrinopatia poliglandular), diabetes do Tipo I,também denominado diabetes melito insulino-dependente(IDDM) e síndrome de Sheehan; hepatite auto-imune,pneumonite intersticial linfóide (HIV), bronquioliteobliterante (não-transplante) vs. NSIP, síndrome deGuillain-Barré, vasculite de grandes vasos (incluindopolimialgia reumática e arterite de célula gigante (deTakayasu)), vasculite de vasos médios (incluindo doença deKawasaki e poliarterite nodosa), poliarterite nodosa (PAN),espondilite anquilosante, doença de Berger (nefropatia porIgA), glomerulonefrite rapidamente progressiva, cirrosebiliar primária, doença celíaca (enteropatia por glúten),crioglobulinemia, crioglobulinemia associada com hepatite,esclerose lateral amiotrófica (ALS) , doença arterialcoronariana, febre mediterrânea familiar, poliangeítemicroscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldrich e tromboangeíte obliterante.A artrite reumatóide (AR) é uma doença crônicacaracterizada por inflamação das articulações, causandoedema, dor e perda da função. Pacientes que possuem AR porum período prolongado normalmente exibem destruição,deformidade, incapacidade articular progressiva, e atémesmo morte prematura.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune causada por lesões recorrentes dos vasos sangüíneosem vários órgãos, incluindo o rim, a pele e asarticulações. Em pacientes com LES, uma interaçãodefeituosa entre células T e células B causa a produção deauto-anticorpos que atacam o núcleo das células. Há umaconcordância geral de que os auto-anticorpos sãoresponsáveis por pelo menos alguns aspectos do LES.

Contempla-se que novas terapias que eliminam a linhagem decélulas B, permitindo que o sistema imunológico sejareinicializado à medida que são geradas novas células B apartir de precursores, dariam esperança de benefíciosduradouros aos pacientes com LES.

A esclerose múltipla (EM) também é uma doença auto-imune. Caracteriza-se por inflamação do sistema nervosocentral e destruição de mielina, que isola as fibras dascélulas nervosas no cérebro, medula espinhal e no corpo.

Embora a causa da EM seja desconhecida, acredita-seamplamente que células T auto-imunes sejam os fatoresprimários para a patogênese da doença. No entanto, estãopresentes níveis elevados de anticorpos no líquidocefalorraquidiano de pacientes com EM, e algumas teoriasprevêem que a resposta de células B que leva à produção deanticorpos é importante para o desenvolvimento da doença.A doença de Crohn e uma doença relacionada, a coliteulcerativa, são as duas categorias principais de doençasque pertencem a um grupo de patologias denominado doençainflamatória do intestino (IBD). A doença de Crohn é umdistúrbio crônico que causa inflamação do trato digestivoou gastrointestinal (GI) . Embora possa envolver qualquerárea do trato GI, da boca ao ânus, afeta mais comumente ointestino delgado e/ou cólon. Na colite ulcerativa, oenvolvimento GI é limitado ao cólon.

A doença de Crohn pode ser caracterizada poranticorpos contra antígenos de neutrófilos, ou seja, o"anticorpo perinuclear anti-neutrófilos" (pANCA), eSaccharomyces cervisiae, ou seja, o "anticorpo anti-Saccharomyces cervisiae" (ASCA). Muitos pacientes comcolite ulcerativa possuem o anticorpo pANCA no sangue, masnão o anticorpo ASCA, enquanto muitos pacientes com doençade Crohn exibem anticorpos ASCA, mas não anticorpos pANCA.Um método de avaliação da doença de Crohn é a utilização doíndice da Atividade da Doença de Crohn (CDAI), baseado em18 pontuações variáveis indicadoras coletadas por médicos.Os valores CDAI de 150 ou menos estão associados à doençaquiescente; valores acima daquele indicam doença ativa, evalores acima 450 são observados na doença extremamentegrave (Best e eols., "Development of an Crohn7S diseaseactivity index", Gastroenterology 70: 439-444 (1976)). Noentanto, desde o estudo original, alguns pesquisadoresutilizam um "valor subjetivo" de 200 a 250 como umapontuação saudável.

A doença auto-imune da tireóide resulta da produção deauto-anticorpos que estimula a tireóide causandohipertireoidismo (doença de Graves) ou destrói a tireóidecausando hipotireoidismo (tireoidite de Hashimoto). Aestimulação da tireóide é causada por auto-anticorpos quese ligam e ativam o receptor do hormônio estimulante datireóide (TSH). A destruição da tireóide é causada porauto-anticorpos que reagem com outros antigenostireoidianos.

A síndrome de Sjógren é uma doença auto-imunecaracterizada por destruição das glândulas do corpoprodutoras de umidade.

A púrpura trombocitopênica imune (PTI) é causada porauto-anticorpos que se ligam às plaquetas sangüíneas ecausam sua destruição.

A miastenia grave (MG) é um distúrbio neuromuscularauto-imune crônico caracterizado por auto-anticorpos que seligam aos receptores de acetilcolina expressos nas junçõesneuromusculares causando fraqueza dos grupos muscularesvoluntários.

A psoríase é caracterizada por inflamação auto-imunena pele e também está associada à artrite em 30% dos casos.

Também é contemplado o tratamento de miopatiainflamatória idiopática (MII), incluindo dermatomiosite(DM) e polimiosite (PM) . As miopatias inflamatórias foramcaracterizadas com o uso de diversos esquemas declassificação. O esquema de classificação de Miller(Miller, Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994, 20: 811-826)identifica 2 miopatias inflamatórias idiopáticas (MII),polimiosite (PM) e dermatomiosite (DM).

A polimiosite e a dermatomiosite são doençasinflamatórias crônicas, debilitantes, que envolvem osmúsculos e, no caso de DMi a pele. Esses distúrbios sãoraros, com uma incidência anual relatada de aproximadamente5 a 10 casos por milhão de adultos, e de 0,6 a 3,2 casospor milhão de crianças por ano nos Estados Unidos (Targoff,Curr. Probl. Dermatol. 1991, 3: 131-180). A miopatiainflamatória idiopática está associada a morbidade emortalidade significativas, com até metade dos adultosafetados apresentando um grau de invalidez importante(Gottdiener e cols., Am. J. Cardiol. 1978, 41: 1.141-49).

Miller (Rheum. Dis. Clin. North Am. 1994, 20: 811-826 e"Arthritis and Allied Conditions", Capítulo 75, Eds.Koopman e Moreland, Lippincott Williams e Wilkins, 2005)define cinco grupos de critérios usados para o diagnósticode MII, ou seja, avaliação dos Critérios para Miopatia

Inflamatória Idiopática (IIMC), incluindo fraquezamuscular, evidências de degeneração na biópsia, elevaçãodos níveis séricos de enzimas associadas aos músculos,tríade eletromagnética de miopatia, evidências de erupçõesna dermatomiosite, e também inclui evidências de auto-anticorpos como critérios secundários.

Fatores associados à MII, incluindo enzimas associadasaos músculos e auto-anticorpos, incluem, sem limitação,creatina quinase (CK) , lactato desidrogenase, aldolase,proteína C-reativa, aspartato aminotransferase (AST),alanina aminotransferase (ALT) e auto-anticorpo antinuclear(ANA), anticorpos específicos para miosite (MSA) eanticorpo para antígenos nucleares extraíveis.

Uma "molécula de ligação", de acordo com a invenção,pode ser, por exemplo, uma proteína (uma "proteína" podeser um polipeptídeo ou um peptídeo), um ácido nucléico, umcarboidrato, um lipídeo ou ura composto de pequena moléculaque se liga a um alvo. Um tipo de molécula de ligaçãoproteinácea contemplada pela invenção é um anticorpo ou umfragmento de anticorpo que retém a atividade de ligação.

Uma molécula de ligação pode ser modificada de acordo commétodos padronizados na técnica para melhorar sua afinidadede ligação, diminuir sua imunogenicidade, alterar suasfunções efetoras e/ou aumentar sua disponibilidade no corpode um indivíduo. Tais modificações podem incluir, porexemplo, modificações da seqüência de aminoácidos ouexpressão como uma proteína de fusão. Essas proteínas defusão também são moléculas de ligação de acordo com ainvenção. Uma molécula de ligação exemplar da invenção é umpequeno produto imunofarmacêuticos modular (SMIP™) .

Uma molécula de ligação que é "específica" para umalvo se liga àquele alvo com uma afinidade maior do que aqualquer outro alvo. Por exemplo, uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20 se liga a CD20 com uma afinidade maiordo que a qualquer outro alvo. As moléculas de ligação dainvenção podem ter afinidades por seus alvos de um Ka maiorou igual a cerca de IO4 M"1, de preferência, maior ou iguala cerca de IO5 M"1, mais preferivelmente, maior ou igual acerca de IO6 M"1, e, ainda mais pref erivelmente, maior ouigual a cerca de IO7 M"1. Afinidades ainda maiores do quecerca de IO7 M"1 são ainda mais preferidas, por exemplo,afinidades iguais ou maiores do que cerca de IO7 M"1, cercade IO8 M"1 e cerca de IO9 M"1, e cerca de IO10 M"1. Asafinidades das moléculas de ligação de acordo com apresente invenção podem ser facilmente determinadas com ouso de técnicas convencionais, por exemplo, aquelasdescritas por Scatchard e cols. , Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660 (1949) . Em uma modalidade, a molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0 tem uma afinidade para CD2 0 na faixade 1 nM a 3 0 nM.

Em um aspecto adicional, a molécula de ligaçãoespecífica para CD20 tem uma meia-vida de 7 a 30 dias invivo.

Foram descritos previamente métodos para a produção depequenos produtos imunofarmacêuticos modulares (SMIPs) noPedido U.S. de co-propriedade N0 10/627.556 e Publicaçõesde Patente U.S. 2003/133939, 2003/0118592 e 2005/0136049,que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.SMIPs são proteínas de fusão inéditas de domínio deligação-imunoglobulina que apresentam um domínio de ligaçãopara uma estrutura cognata, por exemplo, um antígeno, umcontra-receptor ou outros mais; um polipeptídeo da regiãode dobradiça de IgGl, IgA ou IgE ou um polipeptídeo mutanteda região de dobradiça de IgGl que possuem zero, um ou doisresíduos de cisteína; e domínios CH 2 e CH 3 deimunoglobulina. Em uma modalidade, a molécula do domínio deligação possui um ou dois resíduos de cisteína. Em umamodalidade relacionada, contempla-se que, quando a moléculado domínio de ligação compreender dois resíduos decisteína, a primeira cisteína, que tipicamente estáenvolvida na ligação entre as regiões variáveis da cadeiapesada e da cadeia leve, não será eliminada ou substituídapor um aminoácido.

O domínio de ligação de moléculas úteis nos métodos dainvenção é contemplado como tendo uma ou mais regiões deligação, tais como regiões de ligação variáveis da cadeialeve e regiões de ligação variáveis da cadeia pesadaderivadas de um ou mais membros da superfamília dasimunoglobulinas, por exemplo, uma imunoglobulina. Alémdisso, essas regiões são tipicamente separadas porpeptídeos vinculadores, que podem ser qualquer peptideovinculador conhecido na técnica por ser compatível comjunção do domínio ou da região em uma molécula de ligação.Vinculadores exemplares são vinculadores que se baseiam momotivo vinculador Gly4Ser, por exemplo, (Gly4Ser)n, em que n= 3-5. As moléculas para uso nos métodos da invenção tambémcontêm seqüências de aminoácidos suficientes derivadas deuma região constante de uma imunoglobulina para forneceruma função efetora, de preferência, ADCC e/ou CDC. Dessaforma, as moléculas terão uma seqüência derivada de umdomínio CH2 de uma imunoglobulina ou domínios CH 2 e CH 3derivados de uma ou mais imunoglobulinas. SMIPs são capazesde ADCC e/ou CDC, mas têm sua habilidade para formarmultímeros ligados por dissulfeto comprometida.

SMIPs exemplares específicos para CD20 úteis nainvenção incluem SMIPs derivados do anticorpo monoclonalanti-CD2 0 2H7 descrito nas Publicações de Patente U.S.2003133939 e 20030118592. Os SMIPs incluem 2H7scFv-Ig ou umderivado deste. Derivados incluem CytoxB-MHWTGlC, que temum domínio Fc de IgGl humana, e um domínio de dobradiça deIgGl mutante; CytoxB-MHMGlC, que compreende um domínio Fcmutado; MG1H/MG1C, que compreende um receptor Fc com umresíduo de leucina mutado 234; CytoxB-IgAHWTHGlC, quecompreende uma porção da dobradiça de IgA humana fundida aodomínio Fc humano do tipo selvagem; 2H7 scFv-IgGl de lhama,que compreende a dobradiça de IgGl de lhama e regiõesCH2CH3; 2H7 scFv-IgG2 de lharaa, que compreende as regiõesde dobradiça e CH2CH3 de IgG2 de lhama; 2H7 scFv-IgG3 delhama, que compreende as regiões de dobradiça e CH2CH3 deIgG3 de lhama.

Derivados de 2H7scFv-Ig também incluem mutantes de 2H7scFv com mutações pontuais na região de dobradiça. 2H7 scFvMTH (SSS) WTCH2CH3, em que todos os três resíduos decisteína nas regiões de conexão ou de dobradiça são mutadospara resíduos de serina, e domínios CH2 e CH3 do tiposelvagem; 2H7 scFv MTH (SSC) , em que os dois primeirosresíduos de cisteína foram substituídos por resíduos deserina; 2H7 scFv MTH (SCS), em que a primeira e a terceiracisteínas foram substituídas por resíduos de serina; 2H7scFv MTH (CSS) WTCH2CH3, em que os resíduos de cisteínaforam substituídos na segunda e na terceira posições porserina; 2H7 scFv VH 11 SER IgG MTH (SSS) WTCH2CH3, em que aleucina na posição 11 na região variável da cadeia pesada ésubstituída por serina; 2H7 scFv IgA hinge-IgGl CH2-CH3,que compreende uma região de dobradiça de IgA e domínios WTde IgGl; 2H7 scFv IgA hinge-CH2-CH3, que compreende umadobradiça de IgA, regiões CH2-3; 2H7 IgAWH IgACH2-T4CH3,que compreende uma dobradiça de IgA, uma CH2 de IgA do tiposelvagem e um domínio CH3 de IgA truncado desprovido dos 4aminoácidos carbóxi GTCY.

Derivados com mutações na região CH3 de IgG incluem2H7 scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405, no qual O resíduo defenilalanina na posição 405 (numeração de acordo com Kabate cols. supra) foi substituído por tirosina; 2H7 scFv MTHWTCH2 MTCH3 A405, em que a fenilalanina na posição 405 foisubstituída por uma alanina; scFv MTH WTCH2 MTCH3 A4 07, emque o resíduo de tirosina na posição 4 07 foi substituídopor uma alanina; scFv MTH WTCH2 MTCH3 Y405A407, quecompreende as duas mutações; e scFv MTH WTCH2 MTCH3A4 05A4 07, que compreende duas mutações.

2H7 scFv MTH (CCS) WTCH2CH3 é uma construção com oterceiro resíduo de cisteína na região de dobradiça de IgGlsubstituído por um resíduo de serina. 0 SMIP 2H7 scFv IgGMTH (SSS) MTCH2WTCH3 compreende um domínio de dobradiçamutante (MT (SSS)) e um domínio CH 2 mutante, em que aprolina no resíduo 238 (de acordo com Ward e cols.) foisubstituída por uma serina.

Derivados 2H7scFv-Ig também incluem mutantes 2H7 scFvcom mutações pontuais na região variável da cadeia pesada.

Todas as construções a seguir compreendem mutações em que aleucina na posição 11 na região variável da cadeia pesada ésubstituída por serina; 2H7 scFv VHI ISER IgG MTH (SSS-S)WTCH2CH3, 2H7 scFv VHLllS (CSS-S) H WCH2 WCH3, quecompreende uma região de dobradiça mutada como apresentadaacima; 2H7scFv VHLllS (CSC-S) H WCH2 WCH3, que compreendeuma região de dobradiça mutada como apresentada acima; 2H7scFv VHLllS IgAH IgACH2 T4CH3, que compreende a dobradiçade IgA, WT IgA CH2 e CH3 truncada de IgA; 2H7 scFv VHLllSIgECH2 CH3 CH4, que compreende as regiões CH 2-4 de IgE;2H7 VHLllS scFv (SSS-S) IgECH3CH4, que compreende umaregião de dobradiça mutada como apresentada acima e regiõesCH3 e CH4 de IgE; 2H7 scFv VHLllS mlgE CH2 CH3 CH4, quecompreende regiões de IgE de camundongo; 2H7 scFv VHLllSmlgAH WIGACH2 T4CH3, que compreende as mutações descritasacima e uma região constante de IgA de camundongo queconsiste em uma região CH2 do tipo selvagem e uma regiãoCH3 mutada; 2H7 ScFv VHLllS (SSS-S) H K322S CH2 WCH3, quecompreende uma mutação na região CH 2 de IgGl humana noresíduo 322, em que lisina foi trocada por serina; 2H7 scFvVHLllS (CSS-S) H K322S CH2 WCH3, que compreende uma regiãode dobradiça mutada como descrito acima e uma região CH2mutada como descrito previamente; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) HP331S CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiçamutada como descrito acima, e uma região CH2 mutada em quea prolina no resíduo 331 foi trocada por uma serina; 2H7scFv VHLllS (CSS-S) H P331S CH2 WCH3, que compreende umaregião de dobradiça mutada e uma mutação de prolina porserina no resíduo 331 na região CH2; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H T256N CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiçamutada e uma mutação de treonina por asparagina no resíduo256 na região CH2; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H RTPE/QNAK(255-258) CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiçamutada e uma série de mutações nas quais os resíduos 255-258 foram mutados de arginina, treonina, prolina, ácidoglutâmico para glutamina, asparaginas, alanina e lisina,respectivamente; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H K290Q CH2 WCH3,que compreende regiões de dobradiça mutadas e uma troca delisina por glutamina na posição 290; 2H7 scFv VHLllS (SSS-S) H A339P CH2 WCH3, que compreende uma região de dobradiçamutada e uma troca de alanina por prolina na posição 339.

SMIP 2H7 scFv (SSS-S) H P238SCH2 WCH3, que compreendeuma região de dobradiça mutada e uma troca de prolina porserina na posição 23 8 em CH2, que é a mesma que 2H7 scFvIgG MTH (SSS) MTCH2WTCH3. 2H7 scFv IgAH IGAHCH2 T18CH3, quecompreende uma região de dobradiça de IgA do tipo selvageme uma região CH2 e uma região CH3 com uma truncamento de 18aminoácidos na extremidade carbóxi.

Contempla-se que uma molécula de ligação da invençãopode compreender um domínio extracelular nativo ouprojetado de outra proteína, o que aumenta a atividade damolécula de ligação. Em uma modalidade, o domínioextracelular é selecionado do grupo que consiste em CD154 eCTLA4.

Em um aspecto da invenção, a molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0 é administrada como uma composiçãofarmacêutica. Para administrar a molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0 a seres humanos ou a animais de teste,é preferível formular a molécula de ligação em umacomposição que compreende um ou mais veículosfarmaceuticamente aceitáveis. A frase "farmaceuticamente oufarmacologicamente aceitável" refere-se às entidadesmoleculares e composições que não produzem reaçõesalérgicas ou outras reações adversas quando administradascom a utilização de vias bem conhecidas na técnica, comodescrito abaixo. "Veículos farmaceuticamente aceitáveis"incluem qualquer um e todos os solventes, meios dedispersão, revestimentos, agentes antibacterianos eantifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorçãoclinicamente úteis, e semelhantes.

Além disso, os compostos podem formar solvatos comágua ou solventes orgânicos comuns. Esses solvatos tambémsão contemplados.

As composições de molécula de ligação específica paraCD2 0 podem ser administradas por via oral, tópica,transdérmica, parenteral, por spray de inalação, vaginal,retal ou por injeção intracraniana. O termo "parenteral",como aqui usado, inclui injeções subcutâneas, intravenosas,intramusculares, injeção intracisterna ou técnicas deinfusão. A administração por injeção intravenosa,intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal,intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantaçãocirúrgica em um local especifico também é contemplada.Geralmente, as composições são essencialmente livres depirogênios, além de outras impurezas que podem serprejudiciais ao paciente. Prefere-se a injeção,especialmente a injeção intravenosa.

As composições farmacêuticas da presente invençãocontendo uma molécula de ligação especifica para CD20usadas em um método da invenção podem conter veículos ouaditivos farmaceuticamente aceitáveis, dependendo da via deadministração. Exemplos desses veículos ou aditivos incluemágua, um solvente orgânico farmacêutico aceitável,colágeno, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, umpolímero de carboxivinil, carboximetilcelulose sódica,poliacrílico sódico, alginato de sódio, dextranahidrossolúvel, carboximetil amido sódico, pectina, metilcelulose, etil celulose, goma xantana, goma arábica,caseína, gelatina, ágar, diglicerina, glicerina, propilenoglicol, polietileno glicol, vaselina, parafina, álcoolestearílico, ácido esteárico, albumina sérica humana (HSA),manitol, sorbitol, lactose, um tensoativo farmaceuticamenteaceitável, e semelhantes. Os aditivos usados são escolhidosentre, sem limitação, os acima citados, ou combinaçõesdestes, como adequado, dependendo da forma de dosagem dapresente invenção.

A formulação da composição farmacêutica irá variar deacordo cora a via de administração selecionada (por exemplo,solução, emulsão). Uma composição apropriada que compreendeo anticorpo a ser administrado pode ser preparada em umveículo ou transportador fisiologicamente aceitável. Parasoluções ou emulsões, veículos adequados incluem, porexemplo, soluções aquosas ou alcoólicas/aquosas, emulsõesou suspensões, incluindo soro fisiológico, e meiostamponados. Veículos parenterais podem incluir solução decloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto desódio, Ringer lactato ou óleos fixos. Veículos intravenosospodem incluir vários aditivos, conservantes ou renovadoresde líquidos, nutrientes ou eletrólitos.

Diversos veículos aquosos, por exemplo, água, águatamponada, soro fisiológico 0,4%, glicina 0,3% oususpensões aquosas, podem conter o composto ativo misturadocom excipientes adequados para a fabricação de suspensõesaquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, porexemplo, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose,hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio,poliviniIpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia;agentes dispersantes ou umidificantes que podem ser usadosincluem uma fosfatida de ocorrência natural, por exemplo,lecitina, ou produtos de condensação de um óxido dealquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato depolioxietileno, ou produtos de condensação de óxido deetileno com alcoóis alifáticos de cadeia longa, porexemplo, heptadecaetil-eneoxicetanol, ou produtos decondensação de óxido de etileno com ésteres parciaisderivados de ácidos graxos e um hexitol, por exemplo,monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos decondensação de óxido de etileno com ésteres parciaisderivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, porexemplo, monooleato de polietileno sorbitano. As suspensõesaquosas também podem conter um ou mais conservantes, porexemplo, etil ou n-propil, p-hidroxibenzoato.

A composição de molécula de ligação específica paraCD20 pode ser liofilizada para estocagem e reconstituída emum veículo adequado antes de ser utilizada. Essa técnicademonstrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais.

Qualquer técnica de liofilização e reconstituição adequadapode ser empregada. Será observado por aqueles habilitadosna técnica que a liofilização e a reconstituição podemproduzir graus variáveis de perda de atividade doanticorpo, e os níveis de uso podem ser ajustados paracompensar essa perda.

Pós e grânulos dispersíveis adequados para apreparação de uma suspensão aquosa pela adição de águafornecem o composto ativo misturado com um agentedispersante ou umidificante, agente de suspensão, e um oumais conservantes. Agentes dispersantes ou umidificantes eagentes de suspensão adequados são exemplificados poraqueles já mencionados anteriormente.

A concentração de uma molécula de ligação específicapara CD20 nessas formulações pode variar amplamente, porexemplo, de menos de cerca de 0,5%, normalmente a, ou pelomenos, cerca de 1%, alcançando até 15 ou 20% por peso, eserá selecionada primariamente com base nos volumes delíquido, viscosidades etc., de acordo com o modo deadministração selecionado em particular. Dessa forma, umacomposição farmacêutica típica para injeção parenteralpoderia ser constituída para conter 1 ml de água tamponadaestéril e 50 mg de anticorpo. Uma composição típica parainfusão intravenosa poderia ser constituída para conter 250ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de anticorpo.

Métodos atuais para a preparação de composiçõesadministráveis por via parenteral são conhecidos ou ficarãoevidentes para aqueles habilitados na técnica, e sãodescritos com mais detalhes, por exemplo, em "Remington'sPharmaceutical Science", 15a ed. , Mack Publishing Company,Easton, Pa. (1980) . Uma dosagem eficaz de anticorpo estádentro da faixa de 0,01 mg a 1.000 mg por kg de pesocorporal por administração.

As composições farmacêuticas podem estar na forma deuma suspensão aquosa estéril injetável, uma suspensãooleaginosa, dispersões ou pós estéreis para a preparaçãoextemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis.

A suspensão pode ser formulada de acordo com a técnicaconhecida com o uso daqueles agentes dispersantes ouumidificantes e agentes de suspensão adequados que forammencionados anteriormente. A preparação injetável estériltambém pode ser uma solução ou suspensão injetável estérilem um diluente ou solvente atóxico parenteralmenteaceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol.

0 veículo pode ser um meio solvente ou de dispersãocontendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo,glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, esemelhantes), misturas adequadas destes, óleos vegetais,solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio.

Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmenteempregados como um meio solvente ou de suspensão. Para essafinalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado,incluindo mono- ou diglicerideos sintéticos. Além disso,ácidos graxos, por exemplo, ácido oléico, podem ser usadosna preparação de injetáveis.

Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve serfluida a ponto de permitir uma fácil introdução emseringas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo,pelo uso de um revestimento, por exemplo, lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula necessário, no caso dedispersão, e pelo uso de tensoativos. Ela deve ser estávelsob as condições de fabricação e estocagem, e deve serpreservada contra a ação contaminante de microorganismos,tais como bactérias e fungos. A prevenção da ação demicroorganismos pode ser feita através de vários agentesantibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos,clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal esemelhantes. Em muitos casos, será desejável incluiragentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto desódio. A absorção prolongada das composições injetáveispode ser feita através do uso, nas composições, de agentesque retardam a absorção, por exemplo, monoestearato dealumínio e gelatina.

Composições úteis para administração podem serformuladas com intensificadores da captação ou da absorçãopara aumentar sua eficácia. Esses intensificadores incluem,por exemplo, salicilato, glicocolato/linoleato, glicolato,aprotinina, bacitracina, SDS, caprato e semelhantes. Veja,por exemplo, Fix (J. Pharm. Sci., 85: 1.282-1.285, 1996) eOliyai e Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 521-544, 1993).Além disso, as propriedades de hidrofilicidade ehidrofobicidade das composições contemplados para uso nainvenção são bem equilibradas, aumentando, dessa forma, suautilidade para usos tanto in vitro quanto, especialmente,in vivo, enquanto outras composições que não possuem esseequilíbrio têm uma utilidade substancialmente menor.

Especificamente, as composições contempladas para uso nainvenção possuem um grau apropriado de solubilidade emmeios aquosos que permite a absorção e biodisponibilidadeno corpo, ao mesmo tempo em que também possuem um grau desolubilidade em lipideos que permite que os compostosatravessem a membrana celular até um suposto local de ação.

Dessa forma, as composições de anticorpo contempladas sãomaximamente eficazes quando podem ser liberadas no local daatividade antigênica-alvo.

Em um aspecto, os métodos da invenção incluem umaetapa de administração de uma composição farmacêutica.

Os métodos da invenção são realizados com a utilizaçãode qualquer meio da medicina aceito para a introdução deuma substância terapêutica direta ou indiretamente em umindivíduo mamífero, incluindo, sem limitação, injeções,ingestão oral, administração intranasal, tópica,transdérmica, parenteral, spray de inalação, administraçãovagina1 ou retal. 0 termo "parenteral", como aqui usado,inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramuscularese intracisterna, além de cateter ou técnicas de infusão. Aadministração por injeção intradérmica, intramamária,intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonare/ou implantação cirúrgica em um local específico também écontemplada.Em uma modalidade, a administração é realizada nolocal de um câncer ou tecido afetado que necessita detratamento por injeção direta no local ou por meio deliberação sustentada ou por um mecanismo de liberaçãosustentada que pode liberar a formulação internamente. Porexemplo, microesferas ou cápsulas biodegradáveis ou outrasconfigurações de polímero biodegradável capazes deliberação sustentada de uma composição (por exemplo, umpolipeptídeo, anticorpo ou pequena molécula solúvel) podemser incluídas nas formulações da invenção, implantadaspróximo ao câncer.

As composições terapêuticas também podem ser liberadasao paciente em múltiplos locais. As administraçõesmúltiplas podem ocorrer simultaneamente ou podem seradministradas ao longo do um período de tempo contínuo.

Também é contemplada na presente invenção aadministração de uma composição de molécula de ligaçãojunto com um segundo agente. Os segundos agentescontemplados pela invenção serão listados nos parágrafosabaixo.

Um segundo agente pode ser uma molécula associada àcélula B. Outras moléculas associadas às células Bcontempladas pela invenção incluem moléculas de ligação quese ligam às moléculas de superfície das células B que nãosejam CD20. Moléculas associadas às células B incluem, semlimitação, CD19 (antígeno de linfócito B CD19, tambémdenominado antígeno de superfície de linfócito B B4, ouLeu-12), CD21, CD22 (receptor de célula B CD22, tambémdenominado Leu-14, molécula de adesão celular de linfócitoB, OU BL-CAM) , CD23, CD37, CD40 (antígeno de superfície decélula B CD40, também denominado membro 5 da superfamíliado receptor do Fator de Necrose Tumoral, receptor CD4 0L, ouBp5 O), CD80 (antígeno de ativação de linfócito T CD80,também denominado antígeno de ativação B7-1, B7, B7-1 ouBBl), CD86 (antígeno de ativação de linfócito T CD86,também denominado antígeno de ativação B7-2, B7 0, FUN-I ouBU63), CD137 (também denominado membro 9 da superfamília doreceptor do Fator de Necrose Tumoral), CD152 (tambémdenominado proteína 4 de linfócito T citotóxico ou CTLA-4),L6 (antígeno associado a tumores L6, também denominadomembro 1 da superfamília Transmembrana 4, marcador docomponente de superfície da membrana 1, ou M3S1), CD3 0(antígeno de ativação de linfócitos CD30, também denominadomembro 8 da superfamília do receptor do Fator de NecroseTumoral, receptor CD30L, ou Ki-1), CD50 (também denominadomolécula de adesão intercelular-3 (ICAM3) ou ICAM-R), CD54(também denominado molécula de adesão intercelular-1(ICAMl) ou receptor de rinovírus do grupo principal), B7-H1(ligante para um receptor imunoinibidor expresso porcélulas T ativadas, células B e células mielóides, tambémdenominado PD-L1; veja Dong e cols. , "B7-H1, a third memberof the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation andinterleukin-10 secretion", Nat. Med. 1999, 5: 1.365-1.369),CD134 (também denominado membro 4 da superfamília doreceptor do Fator de Necrose Tumoral, 0X4O, receptor 0X4OL,antígeno ACT35, ou receptor de glicoproteína 1 ativado portranscrição por TAX) , 41BB (receptor de ligante 4-1BB,antígeno de célula T 4-IBB ou antígeno de célula T ILA) ,CDl53 (também denominado membro 8 da superfamília doligante do Fator de Necrose Tumoral, ligante CD3 0 ou CD3 0-L), CD154 (também denominado membro 5 da superfamília doligante do Fator de Necrose Tumoral, proteína de ativaçãorelacionada ao TNF, TRAP ou antígeno de célula T Gp3 9) ereceptores Toll. A lista acima de alvos de construção e/ouantígenos-alvo é apenas exemplar e não é definitiva.

Citocinas e fatores de crescimento contemplados pelainvenção como segundos agentes incluem, sem limitação, umou mais de TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL- 8, IL-9, IL-IO, IL-Il, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF,trombopoietina, fator de célula-tronco e eritropoietina.Composições farmacêuticas de acordo com a invenção tambémpodem incluir outras angiopoietinas conhecidas, porexemplo, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y e/ou o polipeptídeohumano angiopoietina-Iike e/ou fator de crescimentovascular endotelial (VEGF). Fatores de crescimento para usoem composições farmacêuticas da invenção incluemangiogenina, proteína óssea morfogênica-1, proteína ósseamorfogênica-2, proteína óssea morfogênica-3, proteína ósseamorfogênica-4, proteína óssea morfogênica-5, proteína ósseamorfogênica-6, proteína óssea morfogênica-7, proteína ósseamorfogênica-8, proteína óssea morfogênica-9, proteína ósseamorfogênica-10, proteína óssea morfogênica-11, proteínaóssea morfogênica-12, proteína óssea morfogênica-13,proteína óssea morfogênica-14, proteína óssea morfogênica-15, receptor IA da proteína óssea morfogênica, receptor IBda proteína óssea morfogênica, fator neurotrófico derivadodo cérebro, fator neurotrófico ciliar, receptor a do fatorneurotrófico ciliar, fator quimiotático de neutrófilosinduzido por citocina 1, fator quimiotático de neutrófilosinduzido por citocina 2a, fator quimiotático de neutrófilosinduzido por citocina 2J3, fator de crescimento de célulasendoteliais p, endotelina 1, fator de crescimentoepidérmico, atrativo de neutrófilos derivado de célulasepiteliais, fator de crescimento de fibroblastos 4, fatorde crescimento de fibroblastos 5, fator de crescimento defibroblastos 6, fator de crescimento de fibroblastos 7,fator de crescimento de fibroblastos 8, fator decrescimento de fibroblastos 8b, fator de crescimento defibroblastos 8c, fator de crescimento de fibroblastos 9,fator de crescimento de fibroblastos 10, fator decrescimento de fibroblastos ácido, fator de crescimento defibroblastos básico, receptor do fator neurotróficoderivado de linhagem de células gliais al, receptor dofator neurotrófico derivado de linhagem de células gliaisct2, proteína relacionada ao crescimento, proteínarelacionada ao crescimento a, proteína relacionada aocrescimento p, proteína relacionada ao crescimento y, fatorde crescimento epidérmico de ligação de heparina, fator decrescimento de hepatócitos, receptor do fator decrescimento de hepatócitos, fator de crescimento insulina-like I, receptor do fator de crescimento insulina-Iike,fator de crescimento insulina-Iike II, proteína de ligaçãodo fator de crescimento insulina-like, fator de crescimentode ceratinócitos, fator inibidor de leucemia, receptor dofator inibidor de leucemia a, fator de crescimento denervos, receptor do fator de crescimento de nervos,neurotrofina-3, neurotrofina-4, fator de crescimentoplacentário, fator de crescimento placentário 2, fator decrescimento de células endoteliais derivado de plaquetas,fator de crescimento derivado de plaquetas, cadeia de fatorde crescimento derivado de plaquetas A, fator decrescimento derivado de plaquetas AA, fator de crescimentoderivado de plaquetas AB, cadeia de fator de crescimentoderivado de plaquetas B, fator de crescimento derivado deplaquetas BB, receptor a de fator de crescimento derivadode plaquetas, receptor p de fator de crescimento derivadode plaquetas, fator estimulante do crescimento de pré-células B, fator de célula-tronco, receptor do fator decélula-tronco, fator de transformação de crescimento a,fator de transformação de crescimento p, fator detransformação de crescimento J31, fator de transformação decrescimento §1.2, fator de transformação de crescimento p2,fator de transformação de crescimento J33, fator detransformação de crescimento £5, fator de transformação decrescimento latente pi, proteína de ligação I do fator detransformação de crescimento p, proteína de ligação II dofator de transformação de crescimento p, proteína deligação III do fator de transformação de crescimento p,receptor do fator de necrose tumoral do tipo I, receptor dofator de necrose tumoral do tipo II, receptor do ativadorde plasminogênio do tipo uroquinase, fator de crescimentovascular endotelial, e proteínas quiméricas e fragmentosbiológica ou imunologicamente ativos destes.

Exemplos de agentes quimioterápicos contemplados comosegundo agentes incluem, sem limitação, agentesalquilantes, tais como mostardas nitrogenadas (por exemplo,mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan eclorambucil) ,- nitrosouréias (por exemplo, carmustina(BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU));etileniminas e metil-melaminas (por exemplo,trietilenomelamina (TEM), trietileno tiofosforamida(tiotepa) e hexametiImelamina (HMM, altretamina));sulfonatos de alquila (por exemplo, busifan); e triazinas(por exemplo, dacabazina (DTIC)); antimetabólitos, taiscomo análogos de ácido fólico (por exemplo, metotrexato,trimetrexato e pemetrexed (antifolato multidirecionado));análogos de pirimidina (por exemplo, 5-fluoruracil (5-FU),fluordesoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinosida(AraC, citarabina), 5-azacitidina e 2,2'-difluordesoxicitidina); e análogos de purina (por exemplo,6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 21-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina(EHNA), fosfato de fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina(cladribina, 2-CdA)); inibidores da topoisomerase do TipoI, por exemplo, camptotecina (CPT), topotecan e irinotecan;certos produtos naturais, tais como epipodofilotoxinas (porexemplo, etoposida e teniposida); e alcalóides da vinca(por exemplo, vinblastina, vincristina e vinorelbina);antibióticos antitumorais, tais como actinomicina D,doxorrubicina e bleomicina; certos radiossensibilizantes,tais como 5-bromodesoxiuridina, 5 -iododesoxiuridina ebromodesoxicitidina; complexos de coordenação de platina,tais como cisplatina, carboplatina e oxaliplatina; uréiassubstituídas, por exemplo, hidroxiuréia; e derivados demetilhidrazina, como, por exemplo, N-metilhidrazina (MIH) eprocarbazina.

Exemplos não limitantes de agentes quimioterápicos,agentes radioterápicos e outros agentes ativos e agentessecundários também são mostrados na Tabela 1.TABELA 1

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Os segundos agentes contemplados pela invenção paratratamento de doenças auto-imunes são denominados agentesimunossupressores, que atuam para suprimir ou mascarar osistema imunológico do indivíduo tratado. Agentesimunossupressores incluem, por exemplo, fármacosantiinflamatórios não esteróides (NSAIDs), analgésicos,glicocorticóides, fármacos anti-reumáticos modificadores dedoença (DMARDs) para o tratamento de artrite oumodificadores da resposta biológica. Composições nadescrição de DMARD também são úteis no tratamento de váriasoutras doenças auto-imunes além de AR.

NSAIDs exemplares são escolhidos do grupo que consisteem ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inibidores daCox-2, tais como Vioxx e Celebrex, e sialilatos.

Analgésicos exemplares são escolhidos do grupo que consisteem acetaminofeno, oxicodona, tramadol de cloridrato depropoxifeno. Glicocorticóides exemplares são escolhidos dogrupo que consiste em cortisona, dexametasona,hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona ouprednisona. Modificadores da resposta biológica exemplaresincluem, sem limitação, moléculas dirigidas contramarcadores da superfície celular (por exemplo, CD4, CD5,CTLA4 etc.), abatacept, inibidores de citocina, tais comoos antagonistas do TNF (por exemplo, etanercept (Enbrel),adalimumab (Humira) e infliximab (Remicade)), inibidores dequimiocina e inibidores de moléculas de adesão. Osmodificadores da resposta biológica incluem anticorposmonoclonais, bem como formas recombinantes de moléculas.DMARDs exemplares incluem, sem limitação, azatioprina,ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina,Ieflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, ouro [oral(auranofin) e intramuscular] e minociclina.

Contempla-se que a composição de molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0 e o segundo agente podem seradministrados simultaneamente na mesma formulação.

Alternativamente, os agentes são administrados em umaformulação separada e administrados concomitantemente, comconcomitantemente referindo-se aos agentes dados com umintervalo de até 3 0 minutos entre eles.

Em outro aspecto, o segundo agente é administradoantes da administração da composição de molécula de ligaçãoespecifica para CD20. Antes da administração refere-se àadministração do segundo agente em um intervalo de umasemana antes do tratamento com um anticorpo, até 3 0 minutosantes da administração do anticorpo. Contempla-se ainda queo segundo agente é administrado subseqüentemente àadministração da composição de SMIP. Administraçãosubseqüentemente visa a descrever a administração de 3 0minutos após o tratamento com anticorpo até uma semana apósa administração do anticorpo.

Contempla-se ainda que, quando a molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0 for administrada em combinação com umsegundo agente, em que o segundo agente é uma citocina ouum fator de crescimento ou um agente quimioterápico, aadministração também incluirá o uso de um agenteradioterapêutico ou radioterapia. A radioterapiaadministrada em combinação com uma composição de anticorpoé administrada da forma determinada pelo médico responsávelpelo tratamento, e nas doses tipicamente administradas apacientes em tratamento de câncer.

As quantidades da composição de molécula de ligaçãoespecífica para CD20 em certa dosagem irão variar de acordocom o tamanho do indivíduo ao qual terapia é administrada,bem como com as características do distúrbio tratado. Emtratamentos exemplares, pode ser necessário administrarcerca de 1 mg/dia, cerca de 5 mg/dia, cerca de 10 mg/dia,cerca de 20 mg/dia, cerca de 50 mg/dia, cerca de 75 mg/dia,cerca de 100 mg/dia, cerca de 150 mg/dia, cerca de 200mg/dia, cerca de 250 mg/dia, cerca de 400 mg/dia, cerca de500 mg/dia, cerca de 800 mg/dia, cerca de 1.000 mg/dia,cerca de 1.600 mg/dia ou cerca de 2.000 mg/dia. As dosestambém podem ser administradas com base no peso dopaciente, em uma dose de 0,01 a 50 mg/kg. Em uma modalidaderelacionada, a molécula de ligação específica para CD20pode ser administrada em uma faixa de dose de 0,015 a 30mg/kg. Em uma modalidade adicional, a molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0 é administrada em uma dose de cerca de0,015, cerca de 0,05, cerca de 0,15, cerca de 0,5, cerca de1,5, cerca de 5, cerca de 15 ou cerca de 3 0 mg/kg.

Estudos padronizados de dose-resposta, inicialmente emmodelos animais e depois em testes clínicos, revelamdosagens ótimas para estados de doença e populações depacientes específicos.

A administração da composição de molécula de ligaçãoespecífica para CD20 diminui ou reduz a população decélulas B em pelo menos cerca de 20% após uma dose única detratamento. Em uma modalidade, a população de células B édiminuída ou reduzida em pelo menos cerca de 20, cerca de30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70,cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100%. A eliminação decélulas B é definida como uma diminuição na contagemabsoluta de células B abaixo do limite inferior da faixanormal. A recuperação de células B é definida como oretorno da contagem absoluta de células B a um dosseguintes: 1) 70% do valor basal do indivíduo; ou 2) afaixa normal.

A administração de moléculas de ligação específicaspara CD2 0 também resulta em aumento da apoptose emsubconjuntos específicos de células B. Apoptose refere-se àintrodução da morte celular programada de uma célula,manifestada e avaliada por fragmentação de DNA,encolhimento da célula, fragmentação celular, formação devesículas na membrana ou alteração da composição lipídicada membrana, avaliada por coloração com anexina V.

Além disso, a administração de moléculas de ligaçãoespecíficas para CD20 resulta em efeitos clínicos desejadosem uma doença ou um distúrbio tratado. Por exemplo, empacientes que possuem artrite reumatóide, a administraçãode moléculas de CD20 melhora a condição do paciente emqualquer quantidade clinicamente significativa [porexemplo, alcança a "American College of RheumatologyPreliminary Detection of Improvement" (ACR20)] e/ou em umamelhora de 20% da sensibilidade e do edema articular e umamelhora de 20% nos 3/5 das medidas ACR restantes (Felson ecols., Arthritis Rheum. 1995, 38: 727-35). Medidasbiológicas para melhora em um paciente com AR após aadministração de uma molécula de ligação específica paraCD2 0 incluem a medida das alterações dos níveis decitocina, medidos através dos níveis de proteína ou RNA.Citocinas de interesse incluem, sem limitação, TNF-a, IL-1,interferons, Blys e APRIL. Alterações da citocina podem sercausadas por números reduzidos de células B ou diminuiçãode células T ativadas. Em pacientes com AR, marcadoresrelevantes para o turnover ósseo (reabsorção ou erosãoósseas) são medidos antes e depois da administração demoléculas de ligação específicas para CD20. Marcadoresrelevantes incluem, sem limitação, fosfatase alcalina,osteocalcina, fragmentos da degradação de colágeno,hidroxiprolina, fosfatase ácida resistente a tartarato eligante de RANK (RANKL). Outros indicadores relevantes paraa melhora da AR incluem a medida dos níveis de proteína-Creativa (CRP), velocidade de hemossedimentação (VHS), fatorreumatóide, anticorpos CCP (peptídeo cíclico citrulinado) eavaliação dos níveis sistêmicos de células B e contagem delinfócitos através de citometria de fluxo. Fatoresespecíficos também podem ser medidos a partir da sinóvia depacientes com AR, incluindo avaliação dos níveis de célulasB na sinóvia de biópsia sinovial, níveis de RANKL e outrosfatores ósseos e citocinas apresentados acima.

Em um aspecto relacionado, os efeitos da administraçãode uma molécula de ligação específica para CD2 0 sobreoutras doenças são medidos de acordo com padrões conhecidosna técnica. Por exemplo, contempla-se que pacientes comdoença de Crohn que recebem moléculas de ligaçãoespecíficas para CD20 obtêm uma melhora no índice deAtividade de Doença de Crohn (CDAI) na faixa de cerca de 50a cerca de 70 unidades, em que a remissão se situa em 150unidades (Simonis e cols., Scand. J. Gastroent. 1998, 33:283-8). Uma pontuação de 150 ou 200 é considerada normal,enquanto uma pontuação de 450 é considerada uma pontuaçãoda doença grave. Deseja-se ainda que a administração damolécula de ligação específica para CD20 resulte em umaredução no anticorpo perinuclear anti-neutrófilos (pANCA) eno anticorpo anti-Saccharomyces cervisiae (ASCA) emindivíduos afetados por doença inflamatória do intestino.

Contempla-se ainda que pacientes adultos e jovens commiosite que recebem moléculas de ligação específicas paraCD20 obtêm uma melhora no conjunto central de avaliações,por exemplo, 3 de 6 dos indicadores do conjunto centralmedidos melhoraram em aproximadamente 20%, com piora de nomáximo 2 dessas medidas de indicadores centrais emaproximadamente 25% (veja Rider e cola., Arthritis Rheum.2004, 50: 2.281-90).

Contempla-se ainda que pacientes com LES que recebemmoléculas de ligação específicas para CD20 obtêm umamelhora na pontuação da Medida de Atividade do LúpusSistêmico (SLAM) ou do índice de Atividade de Doença porLES (SLEDAI) de pelo menos 1 ponto (Gladman e cols., J.Rheumatol. 1994, 21: 1.468-71) (Tan e cols., ArthritisRheum. 1982, 25: 1.271-7). Uma pontuação SLAM >5, oupontuação SLEDAI >2, é considerada doença clinicamenteativa. Uma resposta ao tratamento pode ser definida comomelhora ou estabilização pelas 2 medidas de atividade dadoença (o índice de Atividade de Doença por LES [SLEDAI] ea Medida de Atividade do Lúpus Sistêmico) e 2 medidas daqualidade de vida (avaliação global do paciente e a Escalade Gravidade de Fadiga de Krupp) (Petri e cols., ArthritisRheum. 2004, 50: 2858-68). Deseja-se ainda que aadministração da molécula de ligação específica para CD20 apacientes com LES resulte em uma redução dos anticorposanti-DNA de fita dupla. Alternativamente, a melhora podeser estimada com a utilização dos Critérios do Grupo deAvaliação do Lúpus das Ilhas Britânicas (BILAG).

Contempla-se ainda que pacientes com esclerosemúltipla que recebem moléculas de ligação específicas paraCD2 0 obtêm uma melhora da pontuação clínica na escala doestado de Incapacidade Expandida de Kurtzke (EDSS)(Kurtzke, F., Neurology 1983, 33: 1.444-52) de pelo menos0,5, ou um retardo na piora da doença clínica de pelo menos1,0 na escala de Kurtzke (Rudick e cola., Neurology 1997,49: 358-63).

Contempla-se ainda que pacientes que sofrem de MII querecebem moléculas de ligação específicas para CD20 obtêmuma redução em pelo menos um de cinco critériosapresentados na avaliação dos Critérios para MiopatiaInflamatória Idiopática (IIMC) (Miller, F., supra).Contempla-se ainda que a administração da molécula deligação específica para CD20 a pacientes com MII resulta emuma redução nos fatores associados à MII selecionados dogrupo que consiste em creatina quinase (CK), lactatodesidrogenase, aldolase, proteína-C reativa, aspartatoaminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) eauto-anticorpo antinuclear (ANA), anticorpos específicospara miosite (MSA) e anticorpo para antígenos nuclearesextraíveis. Alternativamente, pacientes que obedecem 3 de 6dos critérios apresentados em Rider e cols., ArthritisRheum. 2004, 50: 2.281-90, podem ser submetidos aotratamento de acordo com a invenção, com piora em, nomáximo, 2 critérios.

Ainda em uma modalidade adicional, pacientes quesofrem de um câncer de células B recebem uma molécula deligação específica para CD20 e demonstram uma respostaglobal benéfica à molécula de ligação específica para CD20,com base em critérios clínicos bem conhecidos e comumenteusados na técnica e como descritos abaixo, por exemplo, umadiminuição do tamanho do tumor, diminuição do número detumores e/ou uma melhora dos sintomas da doença.

Por exemplo, 0 "U.S. National Câncer Institute" (NCI)dividiu algumas das classes de cânceres nas categoriasclínicas de linfomas "indolentes" e "agressivos". Linfomasindolentes incluem linfomas de célula folicular, separadosem "graus" citológicos, Iinfoma linfocítico difusopequeno/leucemia linfocitica crônica (CLL),macroglobulinemia Iinfoplasmocitóide/de Waldenstrom,linfoma de zona marginal e leucemia de células pilosas.Linfomas agressivos incluem linfoma difuso de célulasmistas e grandes, linfoma de Burkitt/linfoma difuso decélulas pequenas não clivadas, linfoma Iinfoblástico,linfoma de célula do manto e linfoma relacionado à AIDS. Emalguns casos, o índice Prognóstico Internacional (IPI) éusado nos casos de linfoma agressivo e folicular. Fatoresque devem ser considerados no IPI incluem a idade (<60 anosde idade versus >60 anos de idade), lactato desidrogenasesérica (níveis normais versus elevados), estado dodesempenho (0 ou 1 versus 2-4) (veja definição abaixo),estágio da doença (I ou II versus III ou IV) e oenvolvimento de local extranodal (0 ou 1 versus 2-4) .Pacientes com 2 ou mais fatores de risco possuem umaprobabilidade menor do que 5 0% de sobrevida sem recidivas eglobal em 5 anos.

O estado do desempenho no IPI agressivo é definido daseguinte forma: Descrição do Grau: 0 - Totalmente ativo,capaz de realizar todo o desempenho pré-doença semrestrições; 1 - Restrito em atividades fisicamenteextenuantes, mas ambulatório e capaz de realizar trabalhosde natureza leve ou sedentária, por exemplo, trabalhodoméstico leve, trabalho de escritório; 2 - Pode andar e écapaz de realizar os cuidados pessoais, mas incapaz derealizar quaisquer atividades de trabalho, até e em tornode 50% das horas de vigília; 3 - Capaz apenas de efetuar oscuidados pessoais, confinado ao leito ou à cadeira em maisde 50% das horas de vigília; 4 - Completamente incapaz,incapaz de realizar os cuidados pessoais, totalmenteconfinado ao leito ou à cadeira; e 5 - Morto (veja "TheInternational Non-Hodgkin1S Lymphoma Prognostic FactorsProject. A predictive model for aggressive Non-Hodgkin'sLymphoma". N. Engl. J. Med. 329: 987-94, 1993).

Tipicamente, o grau de Iinfoma é avaliado clinicamentecom o uso do critério de que o linfoma de grau baixonormalmente se apresenta como uma doença nodal, e éfreqüentemente indolente ou de crescimento lento. A doençade grau intermediário e elevado normalmente se apresentacomo uma doença bem mais agressiva, com grandes tumoresvolumosos extranodais.

O sistema de classificação de Ann Arbor também é usadopara medir a progressão de tumores, especialmente dolinfoma não Hodgkin. Nesse sistema, os estágios I, II, IIIe IV do linfoma não Hodgkin do adulto podem serclassificados nas categorias AeB, dependendo de se opaciente tem sintomas generalizados bem definidos (B) ounão (A). A designação B é dada a pacientes com os seguintessintomas: perda não explicada de mais de 10% do pesocorporal nos 6 meses antes do diagnóstico, febre nãoexplicada com temperaturas acima de 38°C, e suores noturnosabundantes. As definições dos estágios são as seguintes:Estágio I - envolvimento da região de um único linfonodo,ou envolvimento localizado de um único órgão ou localextralinfático. Estágio II - envolvimento de duas ou maisregiões de linfonodo do mesmo lado do diafragma, ouenvolvimento localizado de um único órgão ou localextralinfático associado e de seus linfonodos regionais,com ou sem outras regiões de linfonodos do mesmo lado dodiafragma. Estágio III - envolvimento de regiões delinfonodos em ambos os lados do diafragma, possivelmenteenvolvimento localizado associado de um órgão ou localextralinfático, envolvimento do baço, ou ambos. Estágio IV- envolvimento disseminado (multifocal) de um ou maislocais extralinfáticos, com ou sem envolvimento associadode linfonodos ou envolvimento isolado de órgãoextralinfático, com envolvimento nodal distante (nãoregional). Para mais detalhes, veja "The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project: A predictivemodel for aggressive non-Hodgkin's lymphoma", New EnglandJ. Med. (1993) 329: 987-994.

Em um aspecto, um efeito terapêutico da molécula deligação específica para CD20 é determinado pelo nível deresposta; por exemplo, uma resposta parcial é definida comoredução tumoral a menos da metade de seu tamanho original.Uma resposta completa é definida como a eliminação total dadoença, confirmada por avaliação clínica ou radiológica. Emuma modalidade, o indivíduo que recebe uma dose única deuma molécula de ligação específica para CD20 demonstra pelomenos uma resposta parcial ao tratamento.

De acordo com os critérios de Cheson para avaliação delinfoma não Hodgkin desenvolvidos em colaboração com o"National Câncer Institute" (Cheson e cols., J. Clin.Oncol. 1999, 17: 1.244; Grillo-Lopez e cols., Ann. Oncol.2000, 11: 399-408), uma resposta completa é obtida quandohá um desaparecimento completo de todas as evidênciasclínicas e radiográficas detectáveis de doença e desintomas relacionados à doença, todos linfonodos retornaramao tamanho normal, o baço regrediu de tamanho, e a medulaóssea não possui linfoma.

Uma resposta completa não confirmada é obtida quandoum paciente exibe desaparecimento completo da doença e obaço regride de tamanho, mas os linfonodos regridem mais de75% e a medula óssea é indeterminada. Uma resposta completanão confirmada preenche e excede os critérios para respostaparcial. Uma resposta global é definida como uma redução depelo menos 50 por cento da carga tumoral global.

Critérios similares foram desenvolvidos para váriasoutras formas de cânceres ou doenças hiperproliferativas, esão facilmente disponíveis por aqueles habilitados natécnica. Veja, por exemplo, Cheson e cols., Clin. Adv.Hematol. Oncol. 2006, 4:4 -5, que descrevem critérios paraavaliação de CLL; Cheson e cols., J. Clin. Oncol. 2003, 21:4.642-9, que descrevem critérios para AML; Cheson e cols.,Blood 2000, 96: 3.671-4, que descrevem critérios parasíndromes mielodisplásicas.

Em outro aspecto, uma resposta terapêutica empacientes que apresentam um câncer de células B manifesta-se como uma progressão mais lenta da doença, comparada coma de pacientes que não recebem a terapia. A medida daprogressão mais lenta da doença ou de qualquer um dosfatores acima pode ser realizada com o uso de metodologiasbem conhecidas na técnica, incluindo varredura óssea,varredura por TC, varredura com gálio, linfangiograma, RMN,varreduras PET, ultra-som e semelhantes.

Em um aspecto relacionado, para determinar a eficáciado tratamento com uma molécula de ligação de CD2 0, é medidoo número de células B em uma amostra biológica doindivíduo. Em uma modalidade, a amostra biológica éselecionada de sangue, biópsia do tumor, linfonodos,amígdalas, medula óssea, timo e outros tecidos ricos emlinfócitos. Um tecido rico em linfócitos é um tecidoparticularmente rico em células Iinfocitárias, incluindo,sem limitação, linfonodos e órgãos relacionados (baço,medula óssea, amígdalas, timo, tecido linfóide mucoso),tumores e áreas de inflamação.

Também ficará evidente que a dosagem pode sermodificada caso sejam administradas substânciasterapêuticas tradicionais em combinação com as substânciasterapêuticas da invenção.

Em um aspecto, um indivíduo tratado pelos métodos dainvenção demonstra uma resposta superior ao tratamento coma molécula de ligação de CD20 aqui descrita que é melhor doque a resposta ao tratamento com rituximab e sem outramolécula de ligação de CD20. Uma resposta superior éavaliada comparando-se critérios clínicos bem conhecidos natécnica e aqui descritos. Critérios exemplares incluem, semlimitação, duração da eliminação de células B, redução dosnúmeros globais de células B, redução dos números decélulas B em uma amostra biológica, redução do tamanho dotumor, redução do número de tumores que existem e/ou quesurgem após o tratamento, e melhora da resposta globalavaliada pelos próprios pacientes e pelos médicos, porexemplo, com o uso de um índice Prognóstico Internacional.

Contempla-se ainda que um indivíduo tratado por ummétodo da invenção pode ser re-tratado, por exemplo, se ossintomas da doença reaparecerem ou se a farmacocinéticae/ou a farmacodinâmica do agente terapêutico recomendar ore-tratamento. Em uma modalidade, o indivíduo tratado comuma dose única de uma molécula de ligação de CD20 recebe aadministração de outra dose única de uma molécula deligação específica para CD20. Com base em conhecimentoscomuns na técnica, um médico deve ser capaz de identificarquando o re-tratamento está indicado com base, por exemplo,no ressurgimento de sintomas da doença ou no retorno dascélulas B do indivíduo a um nível que necessite de re-tratamento. Exemplos de outras medidas ou marcadores decritérios clínicos e de resultados finais serão aquidescritos posteriormente. Um indivíduo tratado por ummétodo da invenção pode ser colocado em um esquema detratamento de manutenção, em que o indivíduo é re-tratadocom uma dose única de uma molécula de ligação específicapara CD2 0 com base nas propriedadesfarmacocinéticas/farmacodinâmicas da molécula de ligaçãoespecífica para CD20. Esse tratamento de manutenção éadministrado tipicamente em qualquer momento entre cerca detrês meses a cerca de dois anos após a dose única inicial.Dados farmacodinâmicos exemplares incluem, sem limitação,medidas biológicas de melhora da doença, como aquidescritas, tais como os níveis da molécula de ligaçãoespecífica para CD20 no soro, melhora da avaliação dadoença (por exemplo, por ACR, SLAM ou IPI) , alteração daexpressão de citocina ou de marcador de superfície, níveisde auto-anticorpos, e alteração do tamanho do tumor.Entende-se ainda, na técnica, que diferenças nas respostasindividuais ao tratamento por métodos da invenção podemnecessitar de diferenças no momento do re-tratamento comuma dose única da molécula de ligação específica para CD20.

Como aspecto adicional, a invenção inclui kits quecompreendem um ou mais compostos ou composições embaladosde forma a facilitar seu uso para a prática dos métodos dainvenção. Em uma modalidade, um kit como esse inclui umcomposto ou composição de molécula de ligação específicapara CD2 0 aqui descrito (por exemplo, uma composição quecompreende uma molécula de ligação específica para CD20isoladamente ou em combinação com um segundo agente),embalado em um recipiente, por exemplo, uma garrafa oufrasco lacrado, com um rótulo afixado ao recipiente ouincluído na embalagem que descreve o uso do composto ou dacomposição na prática do método. De preferência, o compostoou a composição é embalado em uma forma de dosagemunitária. O kit pode ainda incluir um dispositivo adequadoà administração da composição de acordo com uma via deadministração específica ou para a prática de um ensaio derastreamento. De preferência, o kit contém um rótulo quedescreve o uso da composição de anticorpo.

A presente invenção também compreende produtosmanufaturados. Esses produtos compreendem pelo menos umamolécula de ligação específica para CD20, opcionalmentejunto com um veículo ou diluente farmacêutico, e pelo menosum rótulo que descreve um método de uso do SMIP específicopara CD20 de acordo com a invenção. Esses produtosmanufaturados também podem opcionalmente compreender pelomenos um segundo agente para administração em conexão com oSMIP especifico para CD20.

A presente invenção também reivindica o uso de umacomposição que compreende pelo menos uma molécula deligação específica para CD20 na fabricação de ummedicamento para a inibição ou prevenção da atividadeaberrante de células B, ou para o tratamento ou aprofilaxia de uma doença, condição ou distúrbiocaracterizado ou mediado pela atividade aberrante decélulas B em um indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura IA ilustra a avaliação da eliminação decélulas B em um estudo de intervalo de doses de primatasnão humanos que receberam uma dose única da molécula deligação específica para CD20 TRU-015. A Figura IB é umaanálise adicional da eliminação de células B em experimentosimilar medida ao longo de um período de tempo maior emostrada como percentual de eliminação de células B.

A Figura 2 ilustra a avaliação da eliminação decélulas B em pacientes humanos como resultado daadministração de uma dose única da molécula de ligaçãoespecífica para CD20 TRU-015.

A Figura 3 mostra uma comparação de construções deTRU-015 e de outra molécula de ligação de CD2 0 em ensaiosda ADCC e da CDC.

A Figura 4 mostra a duração da eliminação de célulasB, medida pelo número de células CD19+ B, em pacientes comAR que receberam TRU-015 em um estudo de intervalo dedoses.

A Figura 5 mostra a eliminação de células B empacientes com AR que receberam uma dose única de 15 mg/kgde TRU-015 ou 2X uma dose de 7,5 mg/kg de TRU-015.

EXEMPLOS

Aspectos e detalhes adicionais da invenção ficarãoevidentes a partir dos exemplos seguintes, que visam ailustrar, e não limitar, a invenção. 0 Exemplo 1 descreve aprodução recombinante de um SMIP específico para CD20. 0Exemplo 2 descreve a atividade de um SMIP específico paraCD20 in vitro. O Exemplo 3 descreve os efeitos de umamolécula de ligação específica para CD20 em uma linhagem detumor de células B in vivo. O Exemplo 4 descreve aadministração de dose única de um SMIP específico para CD20a primatas não humanos. 0 Exemplo 5 descreve aadministração de um SMIP específico para CD20 a pacienteshumanos. 0 Exemplo 6 descreve a administração de um SMIPespecífico para CD20 para o tratamento de miopatiainflamatória idiopática. 0 Exemplo 7 descreve aadministração de um SMIP específico para CD2 0 para otratamento de pacientes com artrite reumatóide. Exemplo 8descreve os resultados clínicos da administração de um SMIPespecífico para CD20 a pacientes com artrite reumatóide.

EXEMPLO 1

PRODUÇÃO RECOMBINANTE DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICAPARA CD20

SMIPs específicos para CD20 são descritos nasPublicações de Patente U.S. de co-propriedade 2003/133939,2003/0118592 e 2005/0136049. Um SMIP exemplar, TRU-015, foiselecionado para estudo adicional, como descrito abaixo.TRU-015 é uma proteína recorabinante de cadeia única(muridea/humana) que se liga ao antigeno CD20. O domínio deligação foi baseado em uma seqüência de anticorpo CD20humano disponível publicamente. 0 domínio de ligação éconectado ao domínio efetor, os domínios CH2 e CH3 de IgGlhumana, através de uma região de dobradiça CSS modificada.TRU-015 existe como um dímero em solução, e o dímero tem umpeso molecular teórico de aproximadamente 106.000 dáltons.

TRU-015 compreende a seqüência de clonagem dopeptídeo-líder 2el2 dos aminoácidos 1-23 do ID. DE SEQ. N°:2; a região variável da cadeia leve de CD20 murídeo anti-humano 2H7 com uma substituição de aminoácido de lisinapara serina (VHLllS) no resíduo 11 na região variável, quese reflete na posição 34 no ID. DE SEQ. N°: 2; umvinculador asp-gly3 - ser- (gly4ser) 2, que começa no resíduo129 no ID. DE SEQ. N° : 2; a região variável da cadeiapesada CD20 murídeo anti-humano 2H7, que não possui umresíduo de serina na extremidade da região da cadeiapesada, ou seja, alterada de VTVSS para VTVS; um domínio Fcde IgGl humana, incluindo uma região de dobradiçamodificada que compreende uma seqüência (CSS) e domíniosCH2 e CH3 do tipo selvagem. As seqüências de nucleotídeos ede aminoácidos de TRU-015 são representadas nos IDS. DESEQ. N°: 1 e 2, respectivamente.

As células CHO que produzem TRU-015 foram cultivadasem um biorreator com o uso de meios proprietários. TRU-015foi purificado com a utilização de uma série de etapas decromatografia e filtração, incluindo um filtro de reduçãoviral. 0 material foi então concentrado e formulado com 2 0mM de fosfato de sódio e 24 0 mM de sacarose, com um pHresultante de 6,0. A composição é filtrada antes de serpreenchida em frascos de vidro em uma concentração de 10mg/ml. Cada frasco de vidro contém 5 ml de TRU-015 (50mg/frasco).

Forma de dosagem e Administração

TRU-015 é fornecido em frascos de vidro de uso únicocontendo 50 mg de TRU-015 (5 ml [10 mg/ml] ) em umaformulação líquida estéril, sem conservantes, contendo 20mM de fosfato de sódio e 24 0 mM de sacarose, com um pH de6,0. TRU-015 é administrado como uma infusão intravenosa(IV). A dosagem é feita por peso corporal (mg/kg) . Osfrascos de TRU-015 são estocados congelados a -20°C atéserem utilizados. Após o descongelamento, os frascos sãousados imediatamente, ou estocados a 2 a 80C.

EXEMPLO 2

ATIVIDADE DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA PARA IN VITRO

A fim de avaliar a eficácia do SMIP específico paraCD20 in vivo, foram medidos inicialmente os efeitos invitro da administração sobre a atividade célula-específica,por exemplo, Atividade de Citotoxicidade Celular Dependentede Anticorpo (ADCC), Atividade de Citotoxicidade Dependentede Complemento (CDC) e a atividade aptotótica.

Atividade de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo(ADCC)

A atividade de ADCC de TRU-015 foi avaliada contra umalvo de células B (linhagem de Iinfoma de células B BJAB)com o uso de doses variáveis de TRU-015 ou rituximab. 0efeito de TRU-015 sobre células mononucleares do sangueperiférico humano fresco (PBMC, que contêm células NK, massem neutrófilos) também foi medido. Células efetoras de 2doadores diferentes demonstraram aproximadamente 30% deIise tanto em 0,5 quanto em 2,5 pg/ml (Figura 3). Nesseensaio, TRU-015 foi comparável ao rituximab em suahabilidade para induzir a Iise de células-alvo CD20+ pormeio de ADCC. A molécula de ligação de CD2 0 similar a TRU-015, mas com uma mutação de prolina por serina no resíduo331 (Pro331Ser) na região efetora, demonstra atividade deADCC, enquanto a construção que possui uma mutação deprolina por serina no resíduo 238 (Pro238Ser) é nula paraatividade de ADCC.

Atividade de Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC)de TRU-015

A ativação de complemento foi relatada como estandoassociada às reações de infusão (van der Kolk, Br. JHaematol. 2001, 115: 807-11) com rituximab. Adicionalmente,a atividade da doença em doenças inflamatórias crônicascomo artrite reumatóide pode estar relacionada à ativaçãode complemento. Portanto, a atividade de CDC em TRU-015 foiatenuada para solucionar esses problemas. Para avaliar onível de atenuação da CDC de TRU-015, a atividade de CDCfoi avaliada e comparada à de rituximab.

A citotoxicidade dependente de complemento é iniciadapela ligação de Clq, um constituinte do primeiro componenteda cascata do complemento, ao domínio CH2 de TRU-015,quando TRU-015 está ligado ao CD20, o antígeno-alvo. Paraavaliar a atividade de CDC, TRU-015 foi incubado comcélulas WIL2-S na presença de complemento de coelho [DynalBiotech (Invitrogen), Brown Deer, WI] (Gazzano-Santoro, ecols., J. Immunol. Meth. 1997, 202: 163-71). Esseexperimento também foi realizado com o uso de soro humano ecomplemento humano (Clq) (Quidel Corporation, San Diego, CA).

TRU-015 mediou a morte de células WIL2-S de formadose-dependente, mostrando aproximadamente 30% de Iise a 1pg/ml, 50% de Iise a 10 pg/ml, e aproximadamente 65% deIise a 1 pg/ml, enquanto uma proteína de controle (IgGhumana) foi incapaz de mediar CDC nessas células. 0 efeitocitotóxico de TRU-015 sobre células WIL2-S dependia docomplemento, uma vez que TRU-015 na ausência de complemento(somente meio) não mostrou atividade citotóxica. Essesresultados mostram que o recrutamento da via do complementoé outro mecanismo pelo qual TRU-015 exibe citotoxicidade.

No entanto, comparado com rituximab, TRU-015 foi 10 a 100vezes menos ativo em sua eliminação relativa de células-alvo CD2 0+ por meio de CDC, indicando que TRU-015 éatenuado com sucesso em sua habilidade para lisar célulaspor CDC. Inversamente, a molécula de ligação de CD20similar a TRU-015, mas com uma mutação de prolina porserina no resíduo 331 (P331S) na região efetora, nãodemonstra atividade de CDC, enquanto a construção quepossui uma mutação de prolina para serina no resíduo 238(P238S) demonstra atividade de CDC comparável à construçãode TRU-015 (Figura 3).

Esses ensaios demonstram que a função efetora dasmoléculas de SMIP pode ser modulada alterando-se aseqüência da molécula para melhorar, manter ou eliminarcertas funções efetoras.

Atividade apoptótica de TRU-015

TRU-015 e rituximab foram testados quanto à suahabilidade para induzir apoptose em uma linhagem de Iinfomade células B CD2 0+ (células B Ramos). A indução de apoptosefoi quantificada por ligação de anexina V/iodeto depropídio fornecido com um kit de ensaio comercial(BD/Pharmingen) pelo uso de um ensaio de citometria defluxo seguindo o protocolo do fabricante. TRU-015 erituximab foram similares em sua atividade aptotótica,demonstrando aproximadamente 60% de Iise celular tanto a 10quanto a 20 pg/ml.

Especificidade de ligação

A especificidade de ligação de TRU-015 a esplenócitosde ratos, esplenócitos de camundongos, sangue periférico demacaco, e a linhagem celular de Iinfoma humano de células Bque expressam CD20, WIL2-S, foi avaliada com um citômetrode fluxo FACS Caliber (BD/Pharmingen). Foi observada altaafinidade de ligação com TRU-015 em células WIL2-S humanase no sangue periférico de macaco, enquanto não foidetectada ligação especifica de TRU-015 no caso deesplenócitos de ratos ou de camundongo. Anticorposconjugados diretamente por FITC aos marcadores de células Bhumanas, de camundongos e de ratos foram usados comocontroles para esse experimento. A ligação específica decélulas B foi observada em todas as 3 preparações decélulas quando coradas com anticorpos adquiridoscomercialmente às moléculas de superfície das células B. Osresultados são resumidos na Tabela 1 abaixo, e expressoscomo percentual de células com coloração positiva.

Tabela 1

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

Esses resultados mostram que TRU-015 demonstrou funçãoefetora significativa in vitro que é pelo menos equivalenteem sua habilidade para induzir Iise de células-alvo CD20 +por meio de ADCC, comparado com o anticorpo monoclonaldirigido a CD2 0, rituximab. Em contraste, TRU-015 foi 10 a100 vezes menos ativo em sua eliminação relativa decélulas-alvo CD20+ por meio de CDC, comparado comrituximab. Em um ensaio de citometria de fluxo, TRU-015 erituximab foram similares em sua atividade aptotótica.

EXEMPLO 3

EFEITO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA A CD2 0 SOBRE UMALINHAGEM DE TUMOR DE CÉLULAS B IN VIVO

Comparado com rituximab, TRU-015 demonstra funçãoefetora significativa in vitro que é pelo menos equivalenteem sua habilidade para induzir Iise de células-alvo CD20 +por meio de ADCC. TRU-015 é menos potente do que rituximabna morte de células-alvo CD20+ por meio de CDC, e é similarao rituximab em termos de atividade aptotótica. TRU-015 nãose liga ao CD2 0 de camundongo ou de rato; dessa forma, hánecessidade de que sejam realizados estudos da atividade deTRU-015 em camundongos com linhagens celulares humanas.

Para estabelecer ainda mais a atividade de TRU-015contra células humanas, foi examinada a habilidade de TRU-015 para inibir o crescimento de tumores estabelecidos queexpressam CD20 humano, usando a linhagem de células Ramos(uma linhagem de células B Iinfoblastóides humanas derivadade um Iinfoma de Burkitt).

Fêmeas de camundongos atímicos nude foram implantadascom tumores Ramos que expressam CD2 0 humano. Oito dias apósa implantação, os camundongos foram divididos em grupos (n= 6-8 por grupo) com volumes tumorais equivalentes, e foraminjetados por via intravenosa nos dias 0, 2, 4, 6 e 8 comIgG humana como controle (100 pg) ou com TRU-015 ourituximab (10 0 pg). O volume tumoral médio do grupo era de370 mm3. Os tumores foram medidos 3 vezes/semana, e osvolumes tumorais foram calculados.

A administração de TRU-015 aos camundongos comxenoenxertos de tumor Ramos estabelecidos resultou em umaredução nos volumes tumorais e aumento dos tempos desobrevida, comparado com animais tratados com rituximab ecom controle. Dos camundongos que receberam TRU-015, 50%obtiveram regressão completa de seus tumores, com sobrevidade 90 dias. Nenhum dos camundongos no grupo de rituximabfoi capaz de resolver completamente seus tumores. O tempomédio de sobrevida para os animais tratados com TRU-015 foide 64,5 dias, comparado com 11 dias e 8 dias para animaistratados com rituximab e com controle, respectivamente.

Experimentos adicionais com a utilização de um númeromaior de animais de teste forneceram resultados adicionaisestatisticamente significativos. Os números totais decamundongos usados por grupo foi elevado para η = 40-44animais, e a média aritmética do tempo de sobrevida e dealteração do tamanho do tumor foram calculados. As taxas desobrevida para o conjunto de dados aumentado aumentou para90 dias para animais tratados com TRU-015 e aproximadamente50 dias para camundongos tratados com rituximab. 0 tamanhobasal médio do tumor foi de 231 mm3. A análise da presençade tumores nesses animais mostrou que aproximadamente 50%dos camundongos tratados com TRU-015 permaneceram sem tumorpor 90 dias, enquanto os camundongos que receberamtratamento com rituximab ou de controle não ficaram livresde tumor.

Foram realizados experimentos adicionais com oimplante nos camundongos de linhagens de células B quedemonstraram resistência à morte por rituximab. Camundongosnude atímicos foram implantadas com 5 χ IO6 célulastumorais Daudi que são resistentes à morte por rituximab, efoi permitido que os camundongos desenvolvessem os tumores.

Sete dias após a implantação, os camundongos foramdivididos em grupos e receberam tratamento nos dias 0, 2,4, 6 e 8 com TRU-015 (100 pg) , rituximab (100 pg), controlede HuIgG (100 pg) ou PBS. Também foram feitos estudos dedose usando doses de 30, 300 e 1.000 pg/dose. Os tumoresforam medidos 3 vezes/semana, e os volumes tumorais foramcalculados.

A administração de TRU-015 aos camundongos comxenoenxertos tumorais Daudi estabelecidos resultou em umaredução nos volumes tumorais e aumento dos tempos desobrevida, comparado com animais tratados com rituximab ecom controle. Os camundongos que receberam TRU-015 na dosede 1.000 pg demonstraram a taxa de sobrevida deaproximadamente 85% 3 0 dias após a implantação, diminuindoaté aproximadamente 65% por volta do 40° dia. Oscamundongos que receberam 300 pg de TRU-015 por dosemostraram uma taxa de sobrevida de 85% no 40° dia, enquantoos animais que receberam 100 pg de TRU-015/dose tiveram umataxa de sobrevida de aproximadamente 65% por volta do 25°dia, diminuindo para 50% no 40° dia, e exibindo um tempomédio de sobrevida (MST) de aproximadamente 36 dias. 0 MSTnão pode ser calculado para os grupos que receberam 1.000 e300 pg de TRU-015, uma vez que mais de 50% dos membros dogrupo sobreviveram por mais tempo do que a duração dosensaios. Os camundongos que receberam 30 pg de TRU-015demonstraram uma taxa de sobrevida de aproximadamente 25%no 25° dia, demonstrando um MST de 23 dias.

Os animais tratados com rituximab demonstraram taxasde sobrevida menores, comparados com os animais quereceberam TRU-015. Animais que receberam rituximab a 1.000pg/dose tiveram uma taxa de sobrevida de aproximadamente65% no 20° dia, diminuindo para 25% no 40° dia, com um MSTde 24 dias. Os camundongos que receberam 300 pg derituximab/dose mostraram uma taxa de sobrevida de 50% no20° dia, diminuindo para 25% por volta do 40° dia, com umMST de 24 dias. Os camundongos que receberam 100 pg derituximab ou 3 0 pg de rituximab/dose demonstraram uma taxade sobrevida de 25% no 20° dia, que diminuiu paraaproximadamente 10% de sobrevida por volta do 40° dia,mostrando um tempo médio de sobrevida de 17 e 16 dias,respectivamente.Dessa forma, o SMIP de TRU-015 anti-CD20 é eficaz namorte de tumores de células B que são resistentes à mortepelo anticorpo quimérico anti-CD2 0 rituximab, prolongandosignificativamente o tempo de sobrevida de animais tratadoscom TRU-015.

Para determinar um mecanismo pelo qual CD20 possaexercer seu efeito, foram feitos experimentos sobre aeliminação de células natural killer (NK) em camundongosque receberam xenoenxertos de tumor Ramos. Os camundongosforam implantados com linhagens de tumor Ramos, comodescrito acima, e, nos dias 0, 4, 8 e 12, todos oscamundongos receberam anticorpo anti-Asialo GMl IV (WAKO,Dallas, TX) para eliminar as células NK. Os camundongosreceberam então TRU-015, rituximab ou HuIgGIV nos dias 1,3, 5, 7 e 9.

Os camundongos que receberam somente TRU-015demonstraram uma taxa de sobrevida de 50% no 15° dia,diminuindo até aproximadamente 3 0% no 35° dia, enquanto oscamundongos que receberam TRU-015 e anticorpo de eliminaçãode células NK demonstraram uma taxa de sobrevida deaproximadamente 4 0% no 15° dia, diminuindo atéaproximadamente 20% por volta do 25° dia. Animais quereceberam somente rituximab demonstraram uma taxa desobrevida de aproximadamente 50% no 15° dia, diminuindopara 10% por volta do 27° dia, enquanto os camundongos quereceberam rituximab mais anticorpo de eliminação de célulasNK mostraram uma taxa de sobrevida de 30% no 15° dia,diminuindo para 10% no 20° dia.

Esses resultados demonstram que as células NK podemter alguma participação no mecanismo de ação tanto de TRU-015 quanto de rituximab, uma vez que a eliminação decélulas NK diminui a eficácia do tratamento de eliminaçãode células B.

EXEMPLO 4

ADMINISTRAÇÃO DE DOSE ÚNICA DE MOLÉCULA DE LIGAÇÃOESPECÍFICA PARA CD2 0 A PRIMATAS NÃO HUMANOS

Os resultados descritos acima indicam que TRU-015 éeficaz na eliminação de células B in vitro. Para determinara eficácia de eliminação de células B in vivo, macacosCynomolgus receberam infusão de SMIP específico para CD20 ea farmacocinética e a farmacodinâmica do agente forammedidas.

Em um regime de tratamento inicial, os macacosCynomolgus (n = 2/grupo) receberam uma dose IV única de 10mg/kg de TRU-015 ou 2 outras versões pré-clinicas de TRU-015. A percentagem de células B no sangue periférico foideterminada utilizando-se um protocolo não otimizado decitometria de fluxo para acompanhar as células CD20+ eCD4 0+. Todos os 6 animais demonstraram eliminaçãosignificativa de células B periféricas e recuperaçãosubstancial por volta do 35° Dia.

Para medir a farmacocinética (PK) e a farmacodinâmica(PD) de TRU-015 in vivo, os macacos foram injetados IV comuma dose única de 10 mg/kg de TRU-015, outro pré-clinico deuma candidato dirigido a CD20, rituximab ou PBS (n =3/grupo). 0 sangue periférico foi coletado na linha debase, e depois após a dose no 1° e no 3° dias, semanalmentepor 12 semanas e a cada 2 semanas por mais 12 semanas, paraser analisado por citometria de fluxo. Nesse estudo, aeliminação rápida de subconjuntos de linfócitos B do sangueperiférico foi observada com TRU-015 e rituximab. Arecuperação de células B com TRU-015 foi comparável aorituximab, medida pelo retorno de células CD40+ ou CD20+.As células que retornaram, no entanto, tinham menosexpressão de CD2 0. Não ocorreram efeitos adversos desegurança relacionados à administração de TRU-015 durante otratamento.

Foi então feito um estudo de intervalo de doses, noqual 18 macacos Cynomolgus (n = 3/grupo) foram injetados IVcom uma dose única de TRU-015 (0,01, 0,1, 1,0 ou 10 mg/kg)ou rituximab (10 mg/kg) ou PBS. Foram coletadas amostras dosangue periférico em vários momentos e elas foramanalisadas por citometria de fluxo. CD19 e CD20 estavamentre os marcadores examinados para avaliar a resposta e arecuperação.

Após uma administração IV única, o grupo de rituximabe os grupos de dose alta de TRU-015 (1,0 e 10 mg/kg)tenderam a produzir respostas iniciais similares nascélulas B circulantes. Em geral, os subconjuntos delinfócitos B CDl9+ e CD20+ no sangue periférico forameliminados eficazmente em todos esses 3 grupos detratamento. Os resultados do estudo são mostrados na FiguraIA.

Uma análise posterior da evolução da eliminação decélulas B demonstrou que os indivíduos que receberam TRU-015 exibiram níveis de células B em aproximadamente 30% dosníveis basais até o 100° dia pós-infusão. A eliminação foimantida até aproximadamente 55% dos níveis basais por voltado 200° dia, enquanto os grupos tratados com rituximabexibiram eliminação de células B em aproximadamente 60% dosníveis basais no 200° dia (Figura 1B).

Os resultados desse experimento de intervalo de dosesdemonstram que a resposta ao TRU-015 é dose-dependente. 0grupo de rituximab e o grupo de TRU-015 a 10 mg/kgmostraram respostas similares nas células B circulantes,com o padrão de eliminação de células B no grupo de 10mg/kg replicando aquele observado no tratamento prévio. Emgeral, ambos foram igualmente eficazes na eliminação desubconjuntos de linfócitos B no sangue periférico. Dosesmenores de TRU-015 demonstraram uma resposta dose-dependente, com a dose de 1 mg/kg resultando na eliminaçãode células B após a dose, mas com uma recuperação maisrápida do que a dose maior, a dose de 0,1 mg/kg resultandoem uma eliminação apenas parcial, e a dose de 0,01 mg/kgnão tendo efeitos aparentes.

Para análise de PK e PD nos tratamentos dosados,amostras de soro de macacos Cynomolgus foram analisadasatravés de um ensaio baseado em citometria de fluxo paradeterminar as concentração plasmática após uma injeção IVúnica (injeção "em bolo" lenta ao longo de 5 minutos) derituximab a 10 mg/kg ou TRU-015 a 10, 1, 0,1 milhões degalões, representando a idéia de 0,01 mg/kg. Foramcoletadas amostras de soro antes da dosagem, com 5 e 30minutos pós-dose, com 4, 24, 72 e 168 horas pós-dose e nos10°, 14°, 21° e 28° dias do estudo. As concentraçõesplasmáticas de TRU-015 em doses de 10 mg/kg e 1 mg/kg vs.tempo foram comparadas com rituximab a 10 mg/kg. TRU-015 erituximab demonstraram níveis similares de concentraçãoplasmática, com o maior nível, TRU-015, a aproximadamente400 mg/ml no momento 0, enquanto rituximab foi deaproximadamente 450 mg/ml. A concentração plasmática dosdois compostos diminuíram similarmente até aproximadamente100 mg/ml em 72 horas após a administração. Tanto rituximabquanto TRU-015 (dose de 10 mg/kg) ainda eram detectáveis noplasma 168 horas após a administração. Na menor dose deTRU-015, o composto era detectável modestamente no plasma.

A Tabela 2 mostra os parâmetros de PK desse regime detratamento.

Tabela 2

<table>table see original document page 81</column></row><table>

AUC = área sob a curva de concentração-tempo, (pg-h/ml) ;

Cmax = concentração máxima; DO = desvio padrão; T^ = meia-vida

Dessa forma, este estudo demonstra que os efeitos deTRU-015 são dose-dependentes, reversíveis e reprodutíveis.

EXEMPLO 5

ADMINISTRAÇÃO DE TRU-015 A PACIENTES HUMANOS

Para avaliar a PK e a PD de TRU-015 em indivíduoshumanos, quarenta indivíduos com artrite reumatóide foramtratados com uma dose única de TRU-015, que variou de 0,015a 15 mg/kg. TRU-015 foi administrado a pacientes em umadose intravenosa única ao longo de um período de tempo quevariou de 15 minutos a 12 horas. Os pacientes receberam asdoses da seguinte forma: Grupo 1 - 0,015 mg/kg, Grupo 2 -0,05 mg/kg, Grupo 3 - 0,15 mg/kg, Grupo 4 - 0,5 mg/kg,Grupo 5-1,5 mg/kg, Grupo 6-5 mg/kg, Grupo 7-15 mg/kge Grupo 8-5 mg/kg. O impacto sobre as células Bcirculantes foi determinado pela medição das células CD19+no sangue periférico por citometria de fluxo em váriosmomentos após a infusão de TRU-015. A eliminação deIinfócitos B foi demonstrada nesses pacientes de uma formadose-dependente, expressa tanto pelo grau quanto peladuração da redução de linfócitos B (Figura 2) . Osresultados mostraram que os pacientes nos grupos 6 e 7 quereceberam uma dose única de 5 mg/kg e 15 mg/kg de TRU-015,respectivamente, demonstraram eliminação quase completa decélulas B por até 4 semanas pós-infusão. Os pacientes quereceberam 1,5 mg/kg de TRU-015 mostraram menos de 15% derecuperação de células B ao longo de um período de 4semanas, enquanto os pacientes que receberam 0,5 mg/kgexibiram células B em aproximadamente 45% dos níveis basaisao final de 4 semanas. Nenhum dado de PK foi disponível apartir desses estudos.

Esses resultados indicam que a administração de TRU-015 a indivíduos humanos em um intervalo de doses reduzeficazmente as populações de células B em pacientes quenecessitam de tal tratamento.

EXEMPLO 6

TRATAMENTO COM SMIP ESPECÍFICO PARA CD2 0 EM MIOPATIAINFLAMATÓRIA IDIOPÁTICA

A conduta atual diante da miopatia inflamatóriaidiopática (MII) envolve a terapia inicial com dose alta decorticosteróides, tipicamente em doses de pelo menos 1mg/kg/dia de prednisona. Metotrexato e azatioprina sãousados freqüentemente em combinação com corticosteróidespara os pacientes com fatores prognósticos ruins ou paraaqueles resistentes aos corticosteróides. Imunoglobulinaintravenosa, ciclofosfamida, ciclosporina, tacrolimus,micofenolato mofetil, antagonistas do fator de necrosetumoral (TNF), clorambucil e combinações destes foramusados. A maioria dos fármacos é usada sem o apoio de dadosde experimentos controlados (Miller, Arthritis and AlliedConditions: A Textbook of Rheumatology. 15 a ed. 1614,2005).

Recentemente, Levine (Arthritis Rheum. 2005, 52: 601-607) publicou dados que demonstram que o tratamento com umagente de eliminação de células B, rituximab, melhorou amiosite em um grupo de 6 pacientes com DM. Além disso, hárelatos informais de que pacientes com polimiositealtamente refratária melhoraram com a terapia de eliminaçãode células B.

Para determinar os efeitos de SMIPs específicos paraCD2 0 sobre a progressão de MII, pacientes humanos foramtratados com um SMIP exemplar, TRU-015, e acompanhadosquanto à evolução da doença, eliminação de células B,recuperação de células B, e outros efeitos do tratamentocom SMIP específico para CD20.

Os pacientes em um grupo de tratamento receberamplacebo ou TRU-015 em uma dose única de 5 mg/kg. Ospacientes em um segundo grupo de tratamento sãorandomizados para receber duas doses de placebo ou TRU-015a 5 mg/kg, a primeira dose administrada no nível de base ea segunda no 7o dia. Os pacientes em um terceiro grupo detratamento são randomizados para receber placebo ou TRU-015em uma dose única de 15 mg/kg. Pelo menos 6 indivíduos compolimiosite (PM) ou dermatomiosite (DM) ativa foramarrolados em cada grupo de tratamento. Cada grupo incluiaproximadamente 4 indivíduos tratados com agente ativo e 2tratados com placebo.

Os indivíduos foram avaliados por um mínimo de 12semanas. Os indivíduos com evidências de eliminação decélulas B foram avaliados a cada 4 semanas para monitorar aatividade da doença e a recuperação de células Β. Aeliminação de células B foi definida como uma diminuição nacontagem absoluta de células B abaixo do limite inferior dafaixa normal. A recuperação de células B foi definida comoo retorno da contagem absoluta de células B a um dosseguintes: 1) 70% do valor basal do indivíduo; ou 2) faixanormal.

Antes da administração do SMIP específico para CD-20,foram obtido valores de base da doença e de outrosparâmetros de saúde. As avaliações de base incluíram amedida da medicação usada concomitantemente, sinais vitais(pressão arterial, pulso, temperatura e freqüênciarespiratória), exame físico dirigido, teste muscularmanual, espirometria, avaliação global doindivíduo/avaliação física global, índice de incapacidadepor HAQ, Ferramentas de Avaliação da Doença na Miosite(MDAAT), citometria de fluxo, perfil hematológico (CBC comcontagem diferencial e de plaquetas), análise da urina,perfil químico (eletrólitos, uréia, creatinina, fosfatasealcalina, proteína total e albumina), testes da funçãohepática (AST, ALT, LDH), enzimas musculares (CPK,aldolase), imunoglobulinas quantitativas, amostra de sanguepara genotipagem, e amostra de soro para medida daconcentração do fármaco do estudo e teste para o anticorpocontra TRU-015.

Cada indivíduo foi pré-medicado com metilprednisolona(por exemplo, SOLUMEDROL® 100 mg IV) , acetaminofeno e umanti-histamínico (por exemplo, didenhidramina, loratadina,ou produto similar), antes da dosagem com TRU-015 ouplacebo. O médico avaliou cada indivíduo e determinou adose apropriada dessas pré-medicações. O indivíduo entãorecebia a dose apropriada de TRU-015 ou placebo por infusãoIV.

O indivíduo era avaliado em avaliações deacompanhamento nos Io, 7°, 14°, 28°, 47°, 56°, 70° e 84°dias. Os indivíduos continuaram a ser acompanhados além do84° dia em intervalos de 2 8 dias, como foi consideradoclinicamente apropriado. Os indivíduos foram acompanhadospelo menos até a recuperação de células B.

Foram administradas quantidades apropriadas de TRU-015aos indivíduos por infusão IV. A dosagem de TRU-015 foi porpeso corporal (mg/kg). Todos os indivíduos pesando 110 kgou mais, no entanto, foram considerados com um peso de 110kg para fins de cálculo de dose. TRU-015 foi preparado emfrascos IV de vidro com diluente (por exemplo, cloreto desódio 0,9%, USP). As infusões do composto eram iniciadas emuma taxa de 2 5 ml por hora. Após 3 0 minutos, caso não seobservasse toxicidade, a taxa podia ser aumentada até 50 mlpor hora. A taxa podia ser aumentada em 2 5 ml por hora acada 20-30 minutos, como tolerado (não excedeu 250 ml porhora).No Io Dia (18 - 24 horas pós-dose), os pacientes foramavaliados pelos seguintes procedimentos: medicaçõesconcomitantes, avaliação de efeitos adversos, sinais vitais(pressão arterial, pulso, temperatura e freqüênciarespiratória), exame físico dirigido, citometria de fluxo,e concentração sérica do fármaco do estudo.

No 7o Dia (1 semana), os pacientes foram avaliadospelos seguintes procedimentos: medicação concomitante,avaliação de efeitos adversos, sinais vitais, exame físicodirigido, citometria de fluxo, perfil hematológico (CBC comcontagem diferencial e de plaquetas), análise da urina,perfil químico (eletrólitos, uréia, creatinina, fosfatasealcalina, proteína total e albumina), testes da funçãohepática (AST, ALT, LDH), enzimas musculares (CPK,aldolase), e amostra de soro para medida da concentração dofármaco do estudo.

No 14° Dia (2 semanas), 28° Dia (4 semanas), 42° Dia(6 semanas), 56° Dia (8 semanas), 70° Dia (10 semanas), 84°Dia (12 semanas) , e posteriormente a cada 4 semanas, osindivíduos foram avaliados pelos seguintes procedimentos:medicação concomitante, avaliação de efeitos adversos,sinais vitais, exame físico dirigido, teste muscularmanual, espirometria (somente no 84° Dia), avaliação globaldo indivíduo/avaliação física global, índice deincapacidade por HAQ, Ferramentas de Avaliação da Doença naMiosite, e imunoglobulinas quantitativas (somente com 24semanas).

Cada uma das medidas de atividade da doença foiavaliada para efeito de tratamento: avaliação da atividadefísica global; avaliação da atividade global do indivíduo;força muscular: avaliação de 15 grupos musculares (flexoresdo pescoço, deltóides, bíceps, extensores do punho, glúteomáximo, glúteo médio, quadríceps, dorsiflexores dotornozelo), cada um pontuado em uma escala de Kendall de 10pontos; função física: índice de incapacidade peloQuestionário de Avaliação da Saúde (HAQ); enzimasassociadas aos músculos: CPK, aldolase, AST, ALT, LDH;avaliação da atividade extramuscular: composto por 6escalas visuais análogas às Ferramentas de Avaliação daDoença na Miosite que avaliam a atividade constitucional,cutânea, gastrointestinal, articular, cardíaca e pulmonar.

Além das medidas do resultado final do indivíduo, osindivíduos foram avaliados quanto a se obtiveram oscritérios compostos de resposta estabelecidos pelo grupo"International Myositis Assessment and Clinicai Studies"(IMACS) (Rider, Arthritis Rheum. 2004, 50: 2.281-90). Essescritérios preliminares de resposta definem um indivíduo queresponde como um indivíduo com 2 0% ou mais de melhora empelo menos 3 das 6 medidas do conjunto central (listadasacima), com no máximo 2 dos critérios piores em 25% oumais. Se a força muscular piorar em 25% ou mais, oindivíduo não poderá ser considerado um indivíduo queresponde ao tratamento.

Avaliações primárias da resposta clínica

A avaliação primária da resposta clínica é a melhorados níveis das enzimas musculares. A análise primária daeficácia é medida por uma comparação da melhora da CPK como uso da análise da área sob a curva (AUC) a partir dosníveis basais por 12 semanas, comparando os indivíduostratados com TRU-015 com aqueles que receberam placebo. Osníveis médios de CPK e aldolase, o percentual de diminuiçãode CPK e aldolase, e o tempo até uma melhora significativa(3 0% de declínio a partir do nível basal) também sãoavaliados.

Uma avaliação secundária se baseia na melhora da forçamuscular determinada pelo teste muscular manual de 15grupos musculares descrito acima, com base na melhora dapontuação do teste muscular manual usando uma análise AUC apartir dos níveis basais até 12 semanas, comparandoindivíduos tratados com TRU-015 com aqueles que receberamplacebo. Adicionalmente, a força muscular média, opercentual de alteração da força muscular e o tempo até umamelhora significativa (12% de melhora a partir dos níveisbasais) são avaliados. 0 tempo até uma melhora de 15%também é avaliado.

Cada uma dessas outras medidas de resposta doindivíduo também é avaliada. A melhora média, o percentualde alteração e o tempo até uma melhora significativa sãoavaliados usando avaliações globais do médico e doindivíduo, índice de incapacidade HAQ, enzimas musculares(diferentes de CPK e aldolase) e atividade extramuscular.

EXEMPLO 7

TRATAMENTO COM SMIP ESPECÍFICO PARA CD20 EM PACIENTES COMARTRITE REUMATÓIDE

Em pacientes com AR, as células B são submetidas àexpansão clonal antígeno-dependente, maturação da afinidadee diferenciação em células plasmáticas, e produzem fatorreumatóide, um fator prognóstico bem reconhecido daagressividade da AR. Acredita-se que a inflamação mediadapor complexo imune e a apresentação de antígeno sejampapéis adicionais das células B que participam dapatogênese da AR. Em estudos com quimera de camundongo SCIDde sinóvia humana com AR, a ativação de células T mostrouser dependente de célula B (Takemura e cols. , J. Immunol.2001, 167 : 1.072-80).

TRU-015 foi adaptado para uso em doenças inflamatóriasatravés da atenuação da morte celular por citotoxicidadedependente de complemento (CDC). A potente atividade deADCC, no entanto, foi mantida em TRU-015, e a resposta aoTRU-015 pode não ser tão sensível aos polimorf ismos deCD16.

Para avaliar os efeitos de SMIPs específicos para CD20em pacientes com artrite reumatóide, foram feitos doisestudos com o uso de um SMIP exemplar, TRU-015.

Em uma administração de dose única, os indivíduosreceberam uma única infusão intravenosa (IV) de TRU-015, emforma de uma dose escalada, em um dos seguintes níveis (> 4indivíduos por grupo): 0,015, 0,05, 0,15, 0,5, 1,5, 5, 15,e 30 mg/kg. Não era necessária AR ativa. 0 agente éadministrado por via intravenosa, com o descrito acima parao tratamento de MII, usando a mesma formulação e taxas deinfusão similares.

Foram realizadas avaliações pré-clínicas, com a coletados seguintes dados: medicação concomitante, eventosadversos, como descritos acima, exame físico dirigido,sinais vitais (pressão arterial, pulso, temperatura efreqüência respiratória), citometria de fluxo, perfilhematológico (CBC com contagem diferencial e de plaquetas),perfil de coagulação (PT/PTT), análise da urina, perfilquímico (eletrólitos, uréia, creatinina, AST, ALT,fosfatase alcalina, proteína total e albumina) ,imunoglobulinas quantitativas, fator reumatóide/anticorposCCP, genotipagem, amostra de soro para avaliar aconcentração do fármaco, e teste para o anticorpo contraTRU-015 e estocagem de soro, ou seja, estocagem de amostrasde soro em datas específicas para avaliação.

No 1° Dia (18 - 24 horas pós-dose), os pacientes foramavaliados quanto aos seguintes parâmetros: medicaçõesconcomitantes, avaliação de efeitos adversos, exame físicodirigido, sinais vitais, citometria de fluxo, perfilhematológico, perfil de coagulação (PT/PTT), análise daurina, perfil químico, soro para avaliar a concentração dofármaco.

No Dia 3 (72 horas), os pacientes foram avaliadosquanto aos seguintes parâmetros: medicações concomitantes,avaliação de efeitos adversos, exame físico dirigido,sinais vitais, citometria de fluxo, perfil hematológico(CBC com contagem diferencial e de plaquetas) , soro paraavaliar a concentração do fármaco.

No 7o Dia (1 semana), 14° Dia (2 semanas), 21° Dia (3semanas), 28° Dia (4 semanas), os indivíduos tiveram osseguintes procedimentos completados: medicaçãoconcomitante, avaliação de efeitos adversos, exame físicodirigido, sinais vitais, citometria de fluxo, perfilhematológico (CBC com contagem diferencial e de plaquetas),perfil de coagulação (PT/PTT) [7o Dia, 14° Dia e 28° Dia],análise da urina [7o Dia, 14° Dia e 28° Dia], perfilquímico [7° Dia, 14° Dia e 28° Dia] , imunoglobulinasquantitativas [somente no 28° Dia] , fatorreumatóide/anticorpos CCP [14° Dia e 28° Dia], amostra desoro para avaliar concentração do fármaco [e teste para oanticorpo contra TRU-015 no 28° Dia], estocagem de soro[somente no 28° Dia].

Os indivíduos com evidências de eliminação de célulasB continuaram a ser avaliados como descrito acima em 6semanas, 8 semanas, 10 semanas e 12 semanas, até que nãohouvesse evidências de recuperação de células B. Asavaliações incluíram as apresentadas acima e,adicionalmente, perfil de coagulação (PT/PTT) [8 semanas e12 semanas], análise da urina [8 semanas e 12 semanas] ,perfil químico [8 semanas e 12 semanas], imunoglobulinasquantitativas [8 semanas e 12 semanas], fatorreumatóide/anticorpos CCP [somente 8 e 12 semanas], amostrade soro para avaliar concentração do fármaco [somente 6 e 8semanas] e teste para o anticorpo contra TRU-015 [somente 8semanas] e estocagem de soro [somente 12 semanas].

Estudo da doença ativa: os pacientes no primeiro grupode tratamento foram randomizados para receber placebo ouTRU-015 em dose única de 5 mg/kg. Os pacientes no segundogrupo de tratamento foram randomizados para receber duasdoses de placebo ou TRU-015 a 2,5 mg/kg, a primeira doseadministrada no nível de base e a segunda no 7° Dia. Ospacientes no terceiro grupo de tratamento foramrandomizados para receber duas doses de placebo ou TRU-015a 7,5 mg/kg, a primeira dose administrada no nível de basee a segunda no 7 o Dia. Os pacientes no quarto grupo detratamento foram randomizados para receber placebo ou TRU-015 em uma dose única de 15 mg/kg. Pelo menos 6 indivíduoscom PM ou DM ativa foram arrolados em cada grupo detratamento. Cada grupo incluiu aproximadamente 10indivíduos tratados com agente ativo e 2 indivíduostratados com placebo.

Além da avaliação pré-clinica realizada acima, ospacientes nesse grupo de tratamento, que possuem AR ativa,foram avaliados quanto aos seguintes parâmetros: avaliaçãoarticular completa (articulações substituídas não foramavaliadas), avaliação global do indivíduo/avaliação globaldo médico, avaliação da dor pelo indivíduo, índice deincapacidade pelo Questionário de Avaliação da Saúde (HAQ),duração da rigidez matinal, CRP e VHS.

Cada paciente foi pré-medicado com metilprednisolona(por exemplo, SOLUMEDROL 10 0 mg IV) , acetaminofeno e umanti-histamínico, como descrito acima no Exemplo 3.

Os indivíduos foram monitorados por um mínimo de 4semanas. Os indivíduos com evidências de eliminação decélulas B foram avaliados posteriormente a cada 2 a 4semanas para monitorar a recuperação de células B.

EXEMPLO 8

AVALIAÇÃO CLÍNICA DE PACIENTES COM ARTRITE REUMATÓIDE APÓSTRATAMENTO COM TRU-015

O tratamento de pacientes com AR foi realizado comodescrito no Exemplo 7, e os efeitos do tratamento com TRU-015 foram avaliados em até 42 semanas pós-infusão. Pelomenos quatro pacientes por grupo receberam 0,015, 0,05,0,15, 0,5, 1,5, 5, 15 ou 3 0 mg/kg (15 mg/kg de tratamento2X semana) de TRU-015. Dados de farmacocinética (PK) foramobtidos para TRU-015 nesses grupos de pacientes. A Tabela 3mostra os dados relativos da PK para grupos que receberam 2doses de 0,5, 1,5, 5, 15 ou 15 mg/kg de TRU-015.

Tabela 3<table>table see original document page 93</column></row><table>

A meia-vida terminal de TRU-015 variou de 281-484horas, mostrando que TRU-015, mesmo em doses baixas, temuma meia-vida in vivo longa, que aumenta com um aumento dadosagem. Adicionalmente, nenhuma toxicidade que limitasse adose ou nenhum evento adverso sério foi associada àadministração de TRU-015. Foram relatados poucos efeitoscolaterais adversos ao tratamento com TRU-015, queincluíram dores de cabeça (13,5%), infecção do tratorespiratório superior (13,5%), bronquite (10,8%), edemaperiférico (13,5%), prurido (10%), dor nas costas (13,5%),artralgia (8,1%), tosse (8,1%), equimoses (8,1%), fadiga(8,1%), nasofaringite (8,1%) e infecção do trato urinário(8,1%). Foram observadas anormalidades de Grau 3 emindivíduos que receberam TRU-015, e essas incluíram AST/ALTde Grau 3 (n = 1) , baixa de leucócitos de Grau 3 (n = 2) ebaixa de neutrófilos de Grau 3 (n = 3) . Não foi observadonenhum evento adverso de Grau 4, e apenas três eventosadversos de Grau 3 durante o tratamento, incluindo erupçãocutânea/broncospasmo que se resolveram sem interrupção dotratamento, artralgia duas semanas após a infusão dofármaco, e hipertensão não associada à infusão. Foiobservado um evento adverso sério neste experimento, com umpaciente de TRU-015 desenvolvendo colecistite 6 meses apóso tratamento. Em um estudo subseqüente, um pacientedesenvolveu câncer de próstata e bacteremia/febre pós-biópsia de próstata 4 semanas após o tratamento, e umpaciente no grupo de placebo apresentou exacerbação deinsuficiência cardíaca congestiva diagnosticadapreviamente.

A extensão da eliminação de células B em pacientes comAR que receberam TRU-015 foi medida e comparada com osníveis basais médios dos pacientes, antes do início dotratamento. A Figura 4 mostra a duração da eliminação decélulas B, medida pelo número de células CD19+ B, empacientes com AR que receberam TRU-015. Pacientes quereceberam pelo menos 0,5 mg/kg de TRU-015 demonstrarameliminação quase completa de células B por volta doprimeiro dia pós-infusão. Pacientes que receberam uma doseúnica de 15 mg/kg de TRU-015 ou 2X uma dose de 15 mg/kgmostraram eliminação completa de células B no 84° dia pós-infusão, aumentando até aproximadamente 10-15% do valorbasal por volta do 168° dia. Pacientes que receberam umadose de 5 mg/kg exibiram aproximadamente 15-20% dos níveisbasais de células B no 84° dia pós-infusão, aumentando atéaproximadamente 3 5% por volta do 168° dia. Pacientes quereceberam uma dose única de 1,5 mg/kg de TRU-015demonstraram níveis de células B em aproximadamente 30% dovalor basal no 84° dia, que permaneceram naquele nível atéo 168° dia.

Em um segundo conjunto de regimes de tratamento, ospacientes receberam 5 mg/kg em 2 doses de 2,5 mg/kg ou 15mg/kg em 2 doses de 7,5 mg/kg, e a eliminação de células Bfoi medida ao longo do tempo. A eliminação média de célulasB em 2 doses de 2,5 mg/kg acompanhou a eliminação decélulas B de pacientes que receberam 5 mg/kg IX, caindo atéaproximadamente 10% do valor basal no 72° dia e aumentandoaté aproximadamente 3 0% dos níveis basais por volta do 172°dia. No entanto, a comparação dos pacientes que receberam 1dose de 15 mg/kg de TRU-015 ou 2X uma dose de 7,5 mg/kgmostrou que, no 84° dia, os níveis de células B de ambos osgrupos estavam quase completamente eliminados, enquanto, no168° dia, os pacientes que receberam a dose única tiveramum ligeiro aumento nos números de células B (atéaproximadamente 15%), comparado com um aumento de atéaproximadamente 35-40% dos níveis basais quando foramadministradas duas doses (Figura 5).

Todos os indivíduos foram avaliados quanto ã presençade anticorpos neutralizantes para TRU-015. Nenhuma amostrade soro apresentou resultado positivo para anticorposneutralizantes. 0 teste das amostras de soro de indivíduosno grupo de 5 mg/kg e de 15 mg/kg foi avaliado, e nãodemonstrou anticorpos neutralizantes. No entanto, TRU-015ainda estava presente no soro no momento da coleta.

Durante o tratamento, os pacientes também forammonitorados quanto aos níveis de anticorpos de FatorReumatóide (RF) e foram designados como pacientes RF+ ouRF-. A resposta clínica máxima obtida nesses grupos porvolta de 42 semanas após tratamento é apresentada na Tabela 4.

Tabela 4

<table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

Esses resultados demonstram que TRU-015 é eficaz notratamento de artrite reumatóide. A terapia com TRU-015fornece exposições a um fármaco que são geralmenteproporcionais à dose e que demonstram uma meia-vida similarsérica àquela observada com substâncias terapêuticas deproteínas maiores. Foi observada uma resposta à dose comtratamento com TRU-015; com a eliminação de células Bgeralmente aumentada em grau e em duração com dosescrescentes de TRU-015, mostrando 100% de eliminação decélulas por um período de tempo prolongado. Além disso, nãoforam detectados anticorpos neutralizantes para TRU-015 atéa presente data.

É esperada a ocorrência de várias modificações evariações na invenção apresentada nos exemplos ilustrativosacima para aqueles habilitados na técnica.

Conseqüentemente, somente as limitações decorrentes dasreivindicações em anexo devem ser aplicadas à invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Burge, Daniel J.

<120> USO DE DOSE ÚNICA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃOESPECÍFICAS PARA CD2 0

<130> 3112 6/41325PCT

<160> 2

<170> PatentIn versão 3.3

<210 > 1 <211> 1518 <212 > DNA <213> Seqüência artificial <220> <223 > TRU- 015 polinucleotídeo <400> 1 aagcttgccg cagtgcttca ccatggattt 60 tcaagtgcag attttcagct tcctgctaatgtcataatgt gtctgcatct ccagaggaca 120 aattgttctc tcccagtctc cagcaatcctccaggggaga catgcactgg aggtcacaat 180 gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagttataccagcaga caacctggct agccaggatc 240 ctcccccaaa ccctggattt atgccccatctctggagtcc tctcacaatc ctgctcgctt 300 cagtggcagt gggtctggga cctcttactcagcagagtgg ttttaaccca aggctgaaga 360 tgctgccact tattactgcc agcagtggagcccacgttcg gggcggtggt gtgctgggac 420 caagctggag ctgaaagatg gcggtggctcggatctggag tgagtcggtg gaggtgggag 480 ctctcaggct tatctacagc agtctggggcaggcctgggg taccagttac cctcagtgaa 540 gatgtcctgc aaggcttctg gctacacattaatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattggagctatttat 600

ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccacactgactgta 660

gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctgaagactctgcg 720

gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtacttcgatgtctgg 780

ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat caggagccca aatcttgtgacaaaactcac 840

acatctccac cgtgctcagc acctgaactc ctgggtggac cgtcagtcttcctcttcccc 900

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatgcgtggtggtg 960

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacggcgtggaggtg 1020

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccgtgtggtcagc 1080

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtgcaaggtctcc 1140

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagggcagccccga 1200

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaaccaggtcagc 1260

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca agcgacatcg ccgtggagtgggagagcaat 1320

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccgacggctccttc 1380

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaacgtcttctca 1440

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcctctccctgtct 1500

ccgggtaaat gatctaga1518<210> 2<211> 499<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> TRU-015 polinucleotideo<400> 2

Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser AlaSer

5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro AlaIle

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg AlaSer

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly SerSer

50 55 60

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly ValPro

65 70 75

80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu ThrIle

85 90 95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln GlnTrp

100 105 HO

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys

115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerSer

130 135 140

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro GlyAla

145 150 155

160

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr SerTyr

165 170 175

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu TrpIle

180 185 190

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln LysPhe

195 200 205

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr AlaTyr

210 215 220

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr PheCys

225 230 235

240

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp ValTrp

245 250 255

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys SerCys

260 265 270

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu LeuGly

275 280 285Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr LeuMet

290 295 300

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val SerHis

305 310 315

320

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val GluVal

325 330 335

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser ThrTyr

340 345 350

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu AsnGly

355 360 365

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala ProIle

370 375 380

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro GlnVal

385 390 395

400

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln ValSer

405 410 415

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala ValGlu

420 425 430

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr ProPro435 440 445

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu ThrVal

450 455 460

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser ValMet

465 470 475

480

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser LeuSer

485 490 495

Pro Gly Lys

Claims (55)

1. Método de tratamento de um indivíduo que tem oucom suspeita de ter uma doença associada com atividadeaberrante de células B caracterizado por compreender aadministração ao indivíduo de uma dose únicaterapeuticamente eficaz de uma molécula de ligaçãoespecífica para CD2 0.

2. Método de tratamento de um indivíduo que tem oucom suspeita de ter uma doença reumática, caracterizado porcompreender a administração ao indivíduo de uma dose únicaterapeuticamente eficaz de uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato da doença reumática ser selecionadado grupo que consiste em artrite reumatóide, espondiliteanquilosante, dermatomiosite, Púrpura de Henoch Schonlein,artrite reumatóide juvenil, artrite psoriática, síndrome deRaynaud, síndrome de Reiter, sarcoidose,espondiloartropatias, esclerose sistêmica progressiva emiosite.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a doença é artritereumatóide.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma pontuaçãoACR de 20.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o número de células B em umaamostra biológica do indivíduo é reduzido.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a expressão de ligante RANKem uma amostra biológica do indivíduo é reduzida.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7,caracterizado pelo fato de que a amostra biológica ésangue, fluido sinovial ou biópsia sinovial.

9. Método de tratamento um indivíduo que tem ou comsuspeita de ter uma doença inflamatória do intestinocaracterizado por compreender a administração ao indivíduode uma dose única terapeuticamente eficaz de uma moléculade ligação específica para CD20.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que a uma doença inflamatória dointestino é selecionada do grupo que consiste em coliteulcerativa e doença de Crohn.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a doença é doença de Crohn.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma melhoria napontuação do índice de Atividade de Doença de Crohn (CDAI)na faixa de cerca de 50 a cerca de 7 0 unidades.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma redução noanticorpo anti-neutrófilo perinuclear (pANCA) ou anticorpoanti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA).

14. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a doença é coliteulcerativa.

15. Método de tratamento de um indivíduo que tem oucom suspeita de ter uma doença auto-imune do sistemanervoso central caracterizado por compreender aadministração ao indivíduo de uma dose únicaterapeuticamente eficaz de molécula de ligação específicapara CD20.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a doença auto-imune dosistema nervoso central é selecionada do grupo que consisteem esclerose múltipla, encefalomielite alérgica,neuromielite ótica, mielite de lúpus e cerebrite de lúpus.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a doença é esclerosemúltipla.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma redução napontuação da Escala de Status de Deficiência Expandida(EDSS) de pelo menos 0,5.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a doença é encefalitealérgica.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a doença é neuromieliteótica.

21. Método de tratamento de um indivíduo que tem oucom suspeita de ter vasculite, caracterizado porcompreender a administração ao indivíduo de uma dose únicaterapeuticamente eficaz de uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21caracterizado pelo fato de que a vasculite é selecionada dogrupo que consiste em doença de Behcet, vasculite dosistema nervoso central, síndrome de Churg-Strauss,crioglobulinemia, arterite de célula gigante, púrpura deHenoch Schonlein, vasculite/angeite de hipersensibilidade,doença de Kawasaki, vasculite leucocitoclástica,poliantite, poliarterite nodosa, polimialgia, policondrite,vasculite reumatóide, arterite de Takayasu, granulamatosede Wegener, vasculite devido a hepatite, febre Mediterrâneafamiliar, poliangeíte microscópica, sindrome de Cogan,síndrome de Whiskott-Aldrich e tromboangeíte obliterante.

23. Método para o tratamento de um indivíduo que temou com suspeita de ter uma miopatia inflamatória idiopáticacaracterizado por compreende a administração ao indivíduode uma dose única terapeuticamente eficaz de uma moléculade ligação específica para CD20.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a miopatia inflamatória éselecionada do grupo que consiste em polimiosite edermatomiosite.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma redução empelo menos um de cinco critérios apresentados na avaliaçãodos Critérios de Miopatia Inflamatória Idiopática (IIMC).

26. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma redução emfatores associados com IIM selecionados do grupo queconsiste em creatina quinase (CK), lactato desidrogenase,aldolase, proteína-C reativa, aspartato aminotransferase(AST), alanina aminotransferase (ALT), e autoanticorpoantinuclear (ANA), anticorpos específicos para miosite(MSA) e anticorpo para antígenos nucleares extraíveis.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que a administração da moléculade ligação específica para CD20 resulta em uma redução nosníveis de creatina quinase (CK).

28. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2, 9, 15, 21 ou 23, caracterizado pelo fatode que a molécula de ligação é administrada junto com umsegundo agente.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que o segundo agente éselecionado do grupo que consiste em uma segunda moléculade ligação específica para células B, uma citocina, umaquimiocina, um fator de crescimento, e um agenteimunossupressor.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o segundo agente éselecionado do grupo que consiste em medicamentosantiinflamatórios não esteróides (NSAIDs), analgésicos,glicocorticóides, medicamentos anti-reumáticosmodificadores de doença (DMARDs) para o tratamento deartrite, e modificadores de resposta biológica.

31. Método de tratamento de um indivíduo que tem oucom suspeita de ter um câncer associado com atividadeaberrante de células B caracterizado por compreende aadministração ao indivíduo de uma dose únicaterapeuticamente eficaz de uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dogrupo que consiste em um Iinfoma de células B, uma leucemiade células B, e um mieloma de células B.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dogrupo que consiste em doença de Hodgkin, Iinfoma nãoHodgkin, Iinfoma do sistema nervoso central, leucemialinfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemiade células pilosas, leucemia mioblástica crônica, Iinfomalinfocítico pequeno, leucemia pró-linfocítica de células B,linfoma Iinfoplasmacítico, Iinfoma de zona marginalesplênica, mieloma de célula plasmática, plasmacitomasolitário do osso, plasmacitoma extra-ósseo, linfoma decélulas B de zona marginal extranodal de tecidos linfóideassociado à mucosa (MALT) , linfoma de células B de zonamarginal nodal, linfoma folicular, linfoma das células domanto, linfoma de grandes células B difuso, linfoma degrandes células B mediastínico (tímico), linfoma de grandescélulas B intravascular, linfoma de efusão primário,linfoma/leucemia de Burkitt, proliferações de células B depotencial maligno incerto, granulomatose linfomatóide, edistúrbios Iinfoproliferativo pós-transplante.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o número de células B noindivíduo é reduzido.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato de que uma amostra biológica doindivíduo selecionada do grupo que consiste em sangue,tumor biópsia, saliva, linfonodos, amígdalas, medula óssea,timo e outros tecidos ricos em linfócitos tem um númeroreduzido de células B.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligaçãoespecífica para CD20 é administrada junto com um segundoagente.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que o segundo agente éselecionado do grupo que consiste em uma segunda moléculade ligação específica para células B, uma citocina, umaquimiocina, um fator de crescimento, um agenteimunossupressor, um agente quimioterápico e um agenteradioterápico.

38. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o indivíduo demonstra pelomenos uma resposta parcial ao tratamento com a molécula deligação específica para CD20.

39. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o indivíduo demonstra umaresposta ao tratamento com uma molécula de ligação de CD2 0que é melhorada em comparação ao tratamento com rituximab enenhuma outra molécula de ligação de CD20.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato de que o indivíduo tambémadministrado com rituximab.

41. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2, 9,-15, 21, 22 ou 31, caracterizado pelo fato de que a moléculade ligação específica para CD20 é um produtoimunofarmacêutico modular, pequeno específico para CD20(SMIP) TRU-015.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que o SMIP específico para CD20é administrado em uma faixa de dose de cerca de 0,01 acerca de 50 mg/kg.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que o SMIP específico para CD20é administrado em uma faixa de dose de cerca de 0.015 acerca de 3 0 mg/kg.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o SMIP específico para CD2 0é administrado em uma dose de cerca de 0,015, cerca de 0,05, cerca de 0,15, cerca de 0,5, cerca de 1,5, cerca de 5,0, cerca de 15 ou cerca de 30 mg/kg.

45. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligaçãoespecífica para CD20 tem uma afinidade para CD20 na faixade cerca de 1 nM a cerca de 3 0 nM.

46. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que a molécula de ligaçãoespecífica para CD20 tem uma meia-vida de cerca de 7 acerca de 3 0 dias in vivo.

47. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 9, 15, 21, 22 ou 31, caracterizadopelo fato de que a administração da molécula de ligaçãoespecífica para CD20 resulta em redução no número decélulas B no indivíduo de pelo menos 20%.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47,caracterizado pelo fato de que o número de células B noindivíduo é reduzido em pelo menos cerca de 20%, cerca de-30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de-70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 100% como umresultado da administração de uma molécula de ligaçãoespecífica para CD20.

49. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 1.

50. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 2.

51. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 9.

52. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 15.

53. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 21.

54. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 23.

55. Artigo de manufatura caracterizado porcompreender uma molécula de ligação específica para CD20 eum rótulo que indica um método da reivindicação 31.