BRPI0614257A2 - conjugados de uma porção de g-csf e um polìmero - Google Patents

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Abstract

CONJUGADOS DE UMA PORçãO DE G-CSF E UM POLìMERO. Conjugados de uma porção de G-CSF e um ou mais polímeros não-peptídicos solúveis em água são apresentados. Tipicamente, o polímero não-peptídico solúvel em água é um poli(etileno glicol) ou um derivado desse. Também são apresentados, entre outras coisas, as composições que compõem os conjugados, os métodos de fazer os conjugados, e métodos de administrar composições compostas por conjugados a um paciente.

Description

CONJUGADOS DE UMA PORÇÃO DE G-CSF E UM POLÍMERO
CAMPO DA INVENÇÃO
Entre outros aspectos, uma ou mais modalidades dapresente invenção geralmente se relacionam a conjugados queconsistem em uma porção de G-CSF (isto é, uma porção quetenha pelo menos alguma atividade do fator estimulador decolônia de granulócitos) e um polímero. Além disso, ainvenção se relaciona (entre outras coisas) as composiçõesformadas por conjugados, métodos de sintetização deconjugados e métodos de administração de uma composição.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Uma função importante do sistema hematopoiético humanoé a substituição de uma variedade de células de glóbulosbrancos (incluindo células macrófagas, neutrófilas ebasófilas/mastócios), células de glóbulos vermelhos(eritrócitos) e células trombócitas(megacariócitos/plaquetas). Cada uma dessas célulasespecializadas é formada a partir de células precursorashematopoiéticas localizadas na medula óssea. Glicoproteínasespecificas similares a hormônios, chamadas de "fatoresestimuladores de colônias", controlam a diferenciação ematuração das células precursoras hematopoiéticas dentro dequalquer uma das células sangüíneas especializadas.
Um desses fatores estimuladores de colônia é o fatorestimulador de colônia de granulócitos ou "G-CSF." Comosugere o nome, este fator estimulador de colônia promove aproliferação e diferenciação de granulócitos, embora o G-CSF possa promover também a formação de outros tipos decélula. 0 G-CSF é produzido por diversos tipos de célula(entre as quais, células T ativadas, células B, macrófagos,células mastócitas, células endoteliais e fibroblastos) emresposta à citoquina, estímulos imunológicos e/ouinflamatórios. 0 G-CSF nativo humano é uma glicoproteína de174 aminoácidos e pode ter diversos pesos molecularesdiferentes dependendo da extensão da glicosilação. 0 pesomolecular do G-CSF humano é aproximadamente 19.000.
Farmacologicamente, o G-CSF tem sido administrado apacientes de câncer recebendo tratamentos de quimioterapia,para que as células de glóbulos brancos mortas durante otratamento sejam substituídas mais rapidamente. Com ointuito semelhante de acelerar a substituição de células deglóbulos brancos, usa-se a administração de G-CSF notratamento de pacientes de leucemia que passaram portransplante de medula óssea. Outros usos do G-CSF, taiscomo a ação curativa acelerada de feridas, já forampropostos. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N0 6.689.351.
Uma desvantagem associada à terapia com G-CSF é afreqüência das doses. Como a terapia com G-CSF exigeaplicação de injeções diárias, os pacientes rejeitam ainconveniência e o desconforto associado com esse regime.
Combinado ao fato de que os pacientes necessitam de examesde sangue freqüentes para determinar as contagens dascélulas de glóbulos brancos (o que requer viagens aoconsultório ou centro médico), muitos pacientes preferemuma alternativa menos incômoda e/ou que envolva a reduçãodo número de injeções.
Uma solução proposta para esses problemas é prover umaliberação prolongada do G-CSF. Por exemplo, a Patente U.S.N° 5.942.253 descreve microesferas de poli(ácido lático-ácido co-glicólico) ou outros polímeros biodegradáveis deG-CSF. A formação de microesferas, entretanto, pode ser umprocesso complexo, que exige várias etapas sintéticas.
Portanto, essa abordagem de liberação prolongada apresentacomplexidades sintéticas que deveriam ser evitadas em umasituação ideal.
A PEGuilação, ou a ligação de um derivado depoli(etilenoglicol) a uma proteína, foi descrita como ummeio de prolongar a meia-vida in vivo da proteína, dessaforma resultando em atividade farmacológica prolongada. Porexemplo, a Patente U.S. N0 5.880.255 descreve um conjugadode G-CSF e poli(etilenoglicol) formado a partir da reaçãocom monometõxi poli(etilenoglicol) linear derivatizado com2,2,2-sulfonato de trifluoroetano com peso molecular de5.000 Daltons.
A Patente U.S. N0 6.646.110 descreve certos conjugadosonde a proteína G-CSF é alterada por 1 a 15 resíduos deaminoácidos, consistindo em um grupo de ligação para umaporção não-polipeptídea, e tendo no mínimo uma porção não-polipeptídea ligada a um grupo de ligação da proteína.
A Patente U.S. N0 6.166.183 descreve conjugadosformados a partir da reação de G-CSF e certos reagentespoliméricos (por exemplo, proprionato de mPEG-succinimidile certos derivados de triazina mPEG). A Patente U.S. N06.027.720 também descreve conjugados formados a partir dareação de G-CSF e certos derivados de triazina mPEG.
Duas publicações discutem a ligação de certosreagentes poliméricos a um resíduo interno de cisteína emG-CSF. Embora os métodos de conjugação descritos nessesmétodos sejam diferentes, cada método possui umadesvantagem significativa. 0 Pedido de Patente U.S. N02005/0143563 impõe condições relativamente severas quepodem causar a precipitação de agregados. A PublicaçãoInternacional de Patentes N0 05/099769 descreve um processoque exige a indução de desnaturação reversível do G-CSF.
Um produto comercial de G-CSF PEGuilado foidisponibilizado pela Amgen Inc. (Thousand Oaks CA) sob onome de NEULASTA® e é um conjugado covalente de metionilrecombinante de G-CSF humana (Filgrastim) e monometóxi-polietilenoglicol.
Apesar da existência desses conjugados, a necessidadede outros conjugados de G-CSF que tenham estruturasdiferentes persiste.
Entre outras coisas, uma ou mais modalidades dapresente invenção são conseqüentemente direcionadas a taisconjugados, bem como as composições que consistam osconjugados e métodos relacionados, conforme descritos aqui,as quais acreditam ser novas e completamente não sugeridasnesse campo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Da mesma forma, é fornecido um conjugado, o conjugadocomposto de uma porção de G-CSF ligada de forma covalente,seja diretamente ou através de uma porção espaçadora, a umpolímero não-peptídico solúvel em água. 0 conjugado étipicamente fornecido como parte de uma composição.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um resíduo de umaporção precursora de G-CSF ligada de forma covalente, sejadiretamente ou através de uma porção espaçadora formada porum ou mais átomos, a um polímero solúvel em água. 0 localde ligação do polímero pode estar localizado em qualquerponto na porção precursora de G-CSF, e pode ser no ponto doqual se espera atividade após a clivagem in vivo da formaprecursora. 0 local de ligação do polímero pode estarlocalizado em qualquer ponto que não tenha nenhumaatividade de G-CSF após a clivagem da forma precursora.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um polímero solúvelem água ligado de forma covalente à porção de G-CSF,através de um resíduo de cisteína da porção de G-CSF.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um resíduo de umaporção de G-CSF, contendo uma cadeia lateral de resíduo decisteína, onde a cadeia lateral de resíduo de cisteína éligada, seja diretamente ou através de uma porçãoespaçadora formada por um ou mais átomos, a um polímerosolúvel em água.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um resíduo da porçãode G-CSF, contendo uma cadeia lateral de resíduo decisteína, que não esteja envolvida em uma ligaçãodissulfeto em forma não conjugada, à qual a cadeia lateralde resíduo de cisteína é ligada, seja diretamente ouatravés de uma porção espaçadora formada por um ou maisátomos, a um polímero solúvel em água.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um resíduo da porçãode G-CSF, contendo uma cadeia lateral de resíduo decisteína, correspondente ao aminoácido da posição 17 do hG-CSF, onde a cadeia lateral de resíduo de cisteína é ligada,seja diretamente ou através de uma porção espaçadoraformada por um ou mais átomos, a um polímero solúvel emágua.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um resíduo da porçãode G-CSF ligada através de uma amida ou ligação de aminasecundária a um polímero ramificado solúvel em água, onde(i) uma porção espaçadora opcional formada por um ou maisátomos esteja localizada entre a amida ou ligação da aminasecundária e o polímero ramificado solúvel em água, e (ii)o polímero ramificado solúvel em água não contenha resíduode lisina.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste em um resíduo da porçãode G-CSF ligada de forma covalente através de uma ligaçãodegradável, seja diretamente ou através de uma porçãoespaçadora formada por um ou mais átomos, a um polímerosolúvel em água. Preferivelmente, a ligação degradável éuma ligação degradável clivável e é "tagless", ou seja, nomomento da degradação e clivagem de um polímero a partir daporção de G-CSF, a porção original ou nativa do G-CSF égerada, sem nenhum átomo ou resíduo adicional (isto é, um" fcagr") do reagente polimérico ligado à porção de G-CSF.
Em uma ou mais modalidades da invenção é fornecida umacomposição, a composição que consiste em uma pluralidade deconjugados, cada conjugado formado por um resíduo de umaporção de G-CSF ligada, seja diretamente ou através de umaporção espaçadora formada por um ou mais átomos, a umpolímero solúvel em água, onde menos de 50% de todos osconjugados na composição sejam N-teminalmente mono-PEGuilados.Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido umconjugado, o conjugado que consiste na seguinte estrutura:
POLY"- (X2)b-POLY' - (X1)a- (G-CSF)
onde:
POLY" é um segundo polímero solúvel em água(preferivelmente ramificado ou linear);
POLY1 é um primeiro polímero solúvel em água(preferivelmente linear);
X1, quando presente, é a primeira porção espaçadoraformada por um ou mais átomos;
X2, quando presente, é a segunda porção espaçadoraformada por um ou mais átomos;
(b) pode ser zero ou um;
(a) pode ser zero ou um; e
G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido ummétodo de preparação de conjugado, o método que consiste emadicionar uma composição de reagente polimérico a umacomposição de porção de G-CSF sob condições suficientespara resultar em uma composição de conjugado que consistaem um resíduo de uma porção de G-CSF ligada de formacovalente, seja diretamente ou através de uma porçãoespaçadora formada de um ou mais átomos, a um polímerosolúvel em água.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido ummétodo de preparação de conjugado, o método que consiste emadicionar uma primeira composição de reagente polimérico auma composição da porção de G-CSF sob condições suficientespara resultar em uma primeira composição de conjugado, queconsiste em um primeiro conjugado formado de um resíduo deuma porção de G-CSF ligada de forma covalente, sejadiretamente ou através de uma primeira porção espaçadoraformada de um ou mais átomos, a um primeiro polímerosolúvel em água, e adição de uma segunda composição dereagente polimérico à primeira composição do conjugado pararesultar em uma segunda composição de conjugado queconsiste em um segundo polímero solúvel em água ligado,seja diretamente ou através de uma segunda porçãoespaçadora formada de um ou mais átomos, ao primeiropolímero solúvel em água do conjugado.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido ummétodo de preparação de conjugado, o método que consiste emcombinar um reagente polimérico e uma porção de G-CSF sobcondições suficientes para resultar na formação de umconjugado que consiste em um resíduo de uma porção de G-CSFligada de forma covalente, seja diretamente ou através deuma porção espaçadora formada de um ou mais átomos, a umpolímero solúvel em água, onde a porção de G-CSF é ligadade forma covalente a uma cadeia lateral de um resíduo decisteína, e além disso, em que o método (a) não possua umaetapa que introduza condições de desnaturação, e (b) sejaexecutado a um pH inferior a 8,5 ou careça de uma etapa deadição de um detergente.
Em uma ou mais modalidades da invenção, é fornecido ummétodo de entrega de um conjugado a um paciente, o métodoque consiste em uma etapa de administração ao paciente deuma composição, que consiste em um conjugado conformedescrito aqui, em que a composição contenha uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um ou mais dos conjugados. Aetapa de administração do conjugado pode ser efetuada viainjeção (por exemplo, injeção intramuscular, injeçãointravenosa, injeção subcutânea, e outras).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A FIG. 1 é um esquema que corresponde a uma composiçãopreparada no Exemplo IA.
A FIG. 2 é uma cópia de um gel resultante da análiseSDS-PAGE da composição preparada no Exemplo IA.
A FIG. 3 é um esquema que corresponde a uma composiçãopreparada no Exemplo IA.
A FIG. 4 é um esquema que corresponde a uma composiçãopreparada no Exemplo IB.
A FIG. 5 é uma cópia de um gel resultante da análiseSDS-PAGE da composição preparada no Exemplo IB.
A FIG. 6 é um esquema que corresponde a uma composiçãopreparada no Exemplo IC.
A FIG. 7 é um esquema que corresponde a uma composiçãopreparada no Exemplo ID.
A FIG. 8 é uma cópia de um gel resultante da análiseSDS-PAGE da composição preparada no Exemplo 2A.
A FIG. 9 é um esquema que corresponde a uma composiçãopreparada no Exemplo 2A.
A FIG. 10 é um esquema que corresponde a umacomposição preparada no Exemplo 2B.
A FIG. 11 e a FIG. 12 são esquemas correspondentes àsamostras preparadas no Exemplo 3A.
A FIG. 13 é um esquema que corresponde a uma amostrapreparada no Exemplo 3B.
A FIG. 14 é uma cópia de um gel resultante da análiseSDS-PAGE de composições preparadas nos Exemplos 4 e 5.
A FIG. 15 é um esquema que mostra o perfil deliberação de ura conjugado conforme descrito no Exemplo 4.
A FIG. 16 é um esquema que mostra a taxa de hidrólisede um conjugado conforme descrito no Exemplo 4.
A FIG. 17 é um esquema que mostra a liberação de umconjugado conforme descrito no Exemplo 5.
A FIG. 18 é um esquema que mostra a taxa de hidrólisede um conjugado conforme descrito no Exemplo 5.
A FIG. 19 é um esquema que corresponde a umacomposição preparada no Exemplo 6.
A FIG. 20 e a FIG. 21 são esquemas mostrando aatividade de vários conjugados PEG-G-CSF após 4 8 horas e 72horas respectivamente, conforme descrito no Exemplo 9.
As FIG. 22, FIG. 23, FIG. 24, FIG. 25, FIG. 26, FIG.27, FIG. 28 e FIG. 29 são, cada uma, um esquema mostrando aresposta de neutrófilos ou a contagem de células deglóbulos brancos de vários conjugados PEG-G-CSF, conformedescrito no Exemplo 9.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Antes de descrever detalhadamente uma ou maismodalidades da presente invenção, deve ser entendido queesta invenção não está limitada a polímeros específicos,técnicas sintéticas, porções de G-CSF, e similares, já queestes podem variar.
Deve-se notar que, conforme usado nesta especificaçãoe reivindicações pretendidas, as formas singulares "um","uma", "e" "o", "a" incluem referências plurais, a menosque o contexto exija o contrário. Assim sendo, por exemplo,a referência a "um polímero" inclui um único polímero,assim como dois ou mais iguais, ou polímeros diferentes;referência a "um excipiente opcional" refere-se a um únicoexcipiente opcional, assim como a dois ou mais iguais, ouexcipientes opcionais diferentes e similares.
Ao descrever e declarar uma ou mais modalidades dapresente invenção, a seguinte terminologia será usada deacordo com as definições descritas abaixo.
"PEG," "polietilenoglicol" e "poli(etileno glicol)",conforme usados aqui, são intercambiãveis e incluempoli(óxido de etileno) não-peptídico, solúvel em água.
Tipicamente, PEGs para uso de acordo com a invenção sãocompostos pela seguinte estrutura "-(OCH2CH2)n-"/ onde (n) é2 a 4000. Conforme usado aqui, PEG também inclui"-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" e "-(OCH2CH2)nO-," dependendo dese os oxigênios terminais foram deslocados ou não. Em todaa especificação e reivindicações, deve-se lembrar que otermo "PEG" inclui estruturas que contêm vários gruposterminais ou "capeamento na extremidade" e assim pordiante. 0 termo "PEG" significa também um polímero quecontém uma maioria, o que quer dizer, mais que 50%, desubunidades repetidas -OCH2CH2-. Em relação a fórmulasespecíficas, o PEG pode assumir qualquer número de umavariedade de pesos moleculares, assim como estruturas ougeometrias tais como "ramificado", "linear","aforquilhado", "multifuncional" e similares, a seremdescritas mais detalhadamente abaixo.
Os termos "capeado na extremidade" e "capeado de formaterminal" são usados aqui de forma intercambiável parareferir-se a um terminal ou endpoint de um polímero quepossua uma porção de capeamento na extremidade.
Tipicamente, embora não necessariamente, a porção decapeamento na extremidade consiste em um grupo hidróxi oualcóxi C1-20/ mais pref erivelmente um grupo alcóxi Cx-io, eainda mais pref erivelmente um grupo alcóxi C1-S. Assimsendo, exemplos de porções de capeamento na extremidadeincluem alcóxi (por exemplo, metóxi, etóxi e benzilóxi) ,assim como arila, heteroarila, ciclo, heterociclo, esimilares. Deve-se lembrar que a porção de capeamento naextremidade pode incluir um ou mais átomos do monômeroterminal no polímero [por exemplo, a porção de capeamentona extremidade "metóxi" em CH3O(CH2CH2O)n- e CH3(OCH2CH2)n-].
Além disso, formas saturadas, insaturadas, substituídas enão substituídas de cada um dos anteriores são previstas.
Sobretudo, o grupo de capeamento na extremidade também podeser um silano. 0 grupo de capeamento na extremidade tambémpode conter, de forma proveitosa, um marcador detectável.
Quando um polímero contém um grupo de capeamento naextremidade que contém um marcador detectável, a quantidadeou localização do polímero e/ou a porção (por exemplo,agente ativo) à qual o polímero está acoplado pode serdeterminada usando-se um detector adequado. Tais marcadoresincluem, sem limitação, agentes fluorescentes,quimioluminescentes, porções usadas na marcação de enzimas,porções colorimétricas (por exemplo, corantes), íons demetais, porções radioativas, e similares. Detectoresadequados incluem fotômetros, filmes, espectrômetros, esimilares. 0 grupo de capeamento na extremidade também podeconter, de forma proveitosa, um fosfolipídeo. Quando umpolímero contém um grupo de capeamento na extremidade queconsiste em um fosfolipídeo, propriedades singulares sãoadquiridas pelo polímero e conjugado resultante.
Fosfolipídeos exemplares incluem, sem limitação, aquelesselecionados a partir da classe de fosfolipídeos chamadosfosfatidilcolinas. Fosfolipídeos específicos incluem, semlimitação, aqueles selecionados a partir do grupo formadopor dilauroil-fosfatidilcolina, dioleil-fosfatidilcolina,dipalmitoil-fosfatidilcolina, disteroil-fosfatidilcolina,behenoil-fosfatidilcolina, arachidoil-fosfatidilcolina elecitina.
Em relação ao polímero, conforme descrito aqui, "semocorrência natural" significa um polímero que em suatotalidade não é encontrado na natureza. Porém, um polímeroda invenção, sem ocorrência natural, pode conter um ou maismonômeros ou segmentos de monômeros que ocorramnaturalmente, desde que a estrutura total do polímero nãoseja encontrada na natureza.
A expressão "solúvel em água", conforme usada em"polímero solúvel em água", refere-se a qualquer polímeroque seja solúvel em água na temperatura ambiente.
Tipicamente, um polímero solúvel em água transmitirá nomínimo mais ou menos 75%, mais preferivelmente no mínimomais ou menos 95% de luz transmitida pela mesma soluçãoapós filtragem. Em se tratando de peso, um polímero solúvelem água será pref erivelmente no mínimo mais ou menos 35%(emr peso) solúvel em água, mais preferivelmente mais oumenos 50% (em peso) solúvel em água, ainda maispreferivelmente mais ou menos 70% (em peso) solúvel emágua, ainda mais preferivelmente mais ou menos 85% (empeso) solúvel em água. 0 mais preferível, entretanto, é queo polímero solúvel em água seja mais ou menos 95% (em peso)solúvel em água ou completamente solúvel em água.
0 peso molecular de um polímero solúvel em água nocontexto da invenção, tal como o PEG, pode ser expressotanto como um peso molecular médio numérico como pesomolecular ponderai médio. A menos que indicado de formacontrária, todas as referências a peso molecular aqui sãofeitas a peso molecular ponderai médio. Ambas asdeterminações de peso molecular, média numérica e ponderaimédia, podem ser medidas usando-se cromatografia depermeação em gel ou outras técnicas de cromatografia alíquido. Outros métodos para medir valores de pesomolecular também podem ser usados, tais como o uso deanálise de grupo terminal ou a medição de propriedadescoligativas (por exemplo, depressão do ponto decongelamento, elevação do ponto de ebulição, ou pressãoosmótica) para determinar o peso molecular médio numéricoou o uso de técnicas de espalhamento de luz,ultracentrifugação ou viscometria para determinar o pesomolecular ponderai médio. Os polímeros da invenção sãotipicamente polidispersos (isto é, o peso molecular médionumérico e o peso molecular ponderai médio dos polímerosnão são iguais), possuindo valores baixos de polidispersão,preferivelmente inferiores a mais ou menos 1,2, maispreferivelmente inferiores a mais ou menos 1,15, ainda maispreferivelmente inferiores a mais ou menos 1,10, ainda maispreferivelmente inferiores a mais ou menos 1,05, e maispreferivelmente inferiores a 1,03.
Os termos "ativo" ou "ativado", quando usados emligação com um grupo funcional particular, referem-se a umgrupo funcional reativo que reage prontamente com umeletrófilo ou um nucleófilo em outra molécula. Isto é umcontraste àqueles grupos que requerem catalisadores fortesou condições de reação altamente imparciais para reagir (ouseja, um grupo "não-reativo" ou "inerte").
Conforme usado aqui, o termo "grupo funcional" ouqualquer sinônimo desse termo compreende formas protegidasdo mesmo, assim como formas não protegidas.
Os termos "porção espaçadora", "ligação" e "ligante"são usados aqui como referência a um átomo ou conjunto deátomos opcionalmente usados para ligar porçõesinterconectadas tais como um t erminus de um segmento depolímero e uma porção de G-CSF ou um eletrófilo ounucleófilo de uma porção de G-CSF. A porção espaçadora podeser hidroliticamente estável ou incluir uma ligaçãofisiologicamente hidrolisável ou enzimaticamentedegradável.
"Alquila" refere-se a uma cadeia de hidrocarbonetos,tipicamente abrangendo mais ou menos de 1 a 15 átomos nocomprimento. Tais cadeias de hidrocarbonetos sãopreferivelmente, mas não necessariamente, saturadas e podemser cadeias ramificadas ou retas, embora tipicamente umacadeia reta seja preferida. Grupos alquil exemplaresincluem metil, etil, propil, butil, pentil, 1-metilbutil,1-etilpropil, 3-metilpentil, e similares. Conforme usadoaqui, "alquila" inclui cicloalquila e cicloalquilenocontendo alquila.
"Alquila inferior" refere-se a um grupo contendo de 1a 6 átomos de carbono, e pode ser de cadeia reta ouramificada, conforme exemplificado por metila, etila, n-butila, i-butila, e t-butila.
"Cicloalquila" refere-se a uma cadeia cíclica dehidrocarbonetos saturados ou insaturados, incluindocompostos com pontes, fundidos ou espirocíclicos,preferivelmente constituídos de 3 até mais ou menos 12átomos de carbono, mais pref erivelmente de 3 até mais oumenos 8 átomos de carbono. "Cicloalquileno" refere-se a umgrupo cicloalquila que é inserido em uma cadeia de alquilapor ligação da cadeia a qualquer dois carbonos do sistemade anel cíclico.
"Alcóxi" refere-se a um grupo -0-R, no qual R éalquila ou alquila substituída, preferivelmente Ci-6 alquila(por exemplo, metóxi, etóxi, propilóxi, e assim pordiante).
0 termo "substituído(a)" como em, por exemplo,"alquila substituída", refere-se a uma porção (por exemplo,um grupo alquila) substituída por um ou mais substituintesnão-interferentes, tais como, mas sem limitação a: alquila,C3-S cicloalquila, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, esimilares; halo, por exemplo, flúor, cloro, bromo, e iodo;ciano; alcóxi, fenil inferior; fenil substituído; esimilares. "Arila substituída" é arila contendo um ou maisgrupos não-interferentes como um substituinte. Parasubstituições no anel fenílico, os substituintes podem terqualquer orientação (ou seja, orto, meta, ou para).
"Substituintes não-interf erentes11 são aqueles gruposque, quando presentes em uma molécula, são tipicamente nãoreativos com outros grupos funcionais contidos na molécula.
"Arila" significa um ou mais anéis aromáticos, cada umdos 5 ou 6 átomos de carbono centrais. Arila incluimúltiplos anéis de arila que podem ser fundidos, como emnaftil, ou não fundidos, como em bifenil. Anéis de arilatambém podem ser fundidos ou não fundidos com um ou maishidrocarbonetos cíclicos, heteroarila, ou anéisheterocíclicos. Conforme usado aqui, "arila" incluiheteroarila.
"Heteroarila" é um grupo arila contendo de 1 a 4heteroátomos, preferivelmente enxofre, oxigênio ounitrogênio, ou uma combinação destes. Anéis de heteroarilatambém podem ser fundidos com um ou mais hidrocarbonetoscíclicos, arila, ou anéis de heteroarila.
"Heterociclo" ou "heterocíclico" significa um ou maisanéis de 5-12 átomos, pref erivelmente 5-7 átomos, com ousem insaturação ou caráter aromático e contendo no mínimoum átomo no anel que não seja carbono. Os heteroátomospreferidos são enxofre, oxigênio e nitrogênio.
"Heteroarila substituída" é heteroarila contendo um oumais grupos não-interferentes como substituintes.
"Heterociclo substituído" é um heterocilco contendouma ou mais cadeias laterais formadas a partir desubstituintes não-interferentes.
"Eletrófilo" e "grupo eletrofílico" referem-se a umíon ou átomo ou conjunto de átomos, que podem ser iônicos,possuindo um centro eletrofílico, ou seja, um centro quebusque elétrons, capaz de reagir com um nucleófilo.
"Nucleófilo" e "grupo nucleofílico" referem-se a umíon ou átomo ou conjunto de átomos que podem ser iônicos,possuindo um centro nucleofílico, ou seja, um centro quebusque um centro eletrofílico com um eletrófilo.
Uma ligação "fisiologicamente clivável" ou"hidrolisável" ou "degradável" é uma ligação que reage comágua (ou seja, hidrolisada) sob certas condiçõesfisiológicas. A tendência de uma ligação a hidrolisar-se naágua dependerá não apenas do tipo geral de ligaçãoconectando dois átomos centrais, mas também dossubstituintes ligados a esses átomos centrais. Ligaçõeshidroliticamente instáveis ou fracas apropriadas incluem,mas não se limitam a éster de carboxilado, éster defosfato, anidridos, acetais, quetais, éter aciloxialquil,iminas, ortoésteres, peptídeos e oligonucleotídeos.
Uma "ligação enzimaticamente degradável" significa umaligação que está sujeita à degradação por uma ou maisenzimas.
Uma ligação "hidroliticamente estável" refere-se a umaligação química, tipicamente uma ligação covalente, que ésubstancialmente estável em água, ou seja, não sofrehidrólise sob condições fisiológicas em nenhum grauperceptível durante um período extenso de tempo. Exemplosde ligações hidroliticamente estáveis incluem, mas não selimitam às seguintes: ligações carbono-carbono (porexemplo, em cadeias alifáticas) , éteres, amidas, uretanos,e similares. Geralmente, uma ligação hidroliticamenteestável é aquela que exibe uma taxa de hidrólise inferior amais ou menos 1-2% por dia sob condições fisiológicas.
Taxas de hidrólise de ligações químicas podem serencontradas na maioria dos livros de química conceituados.
"Excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável"refere-se a um excipiente que pode ser opcionalmenteincluído em composições da invenção e que não causa efeitostoxicológicos adversos ao paciente. As expressões"quantidade farmacologicamente eficaz", "quantidadefisiologicamente eficaz" e "quantidade terapeuticamenteeficaz" são usadas aqui de forma intercambiável paradefinir a quantidade de um polímero conjugado com porção de(G-CSF) que é necessário para fornecer um nível desejado doconjugado (ou porção de G-CSF correspondente não conjugada)na corrente sangüínea ou no tecido alvo. A quantidade exatadependerá de inúmeros fatores, por exemplo, porção de G-CSFespecífica, os componentes e as características físicas dacomposição terapêutica, a população de pacientes a que sedestina, considerações individuais sobre pacientes, esimilares, e pode ser rapidamente determinada por umespecialista na técnica com base nas informações fornecidasaqui.
"Multifuncional" significa um polímero que tenha trêsou mais grupos funcionais contidos aqui, onde os gruposfuncionais podem ser iguais ou diferentes. Reagentespoliméricos multifuncionais da invenção conterãotipicamente diversos grupos funcionais que satisfaçam um oumais dos seguintes critérios: de mais ou menos 3-100 gruposfuncionais; de 3 a 50 grupos funcionais; de 3 a 25 gruposfuncionais; de 3 a 15 grupos funcionais; e de 3 a 10 gruposfuncionais; números que exemplificam grupos funcionaisincluem 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9el0 grupos funcionais dentrodo reagente polimérico.
O termo "porção de G-CSF", conforme usado aqui,refere-se a uma porção contendo atividade de G-CSF, e amenos que o contexto claramente diga o oposto, refere-setambém a uma porção precursora de G-CSF (uma seqüênciaexemplar da qual é fornecida em SEQ ID NO: 3). A porção deG-CSF conterá também no mínimo um grupo eletrofílico ougrupo nucleofílico apropriado para reagir com um reagentepolimérico. Além disso, o termo "porção de G-CSF"compreende tanto a porção de G-CSF antes da conjugação,como o resíduo da porção de G-CSF após a conjugação.
Conforme será explicado abaixo, uma das qualidades dosversados na técnica pode determinar se qualquer porçãoapresenta atividade G-CSF. Proteínas que consistem em umaseqüência de aminoácidos correspondente a qualquer uma emSEQ ID NOS: 1 até 2 é a porção de G-CSF, assim comoqualquer proteína ou polipeptídeo substancialmente homólogoa esta, cujas propriedades biológicas resultam emestimulação de crescimento e/ou número de neutrófilos e/ouatividade similar ao G-CSF. Conforme usado aqui, o termo"porção de G-CSF" inclui essa proteína modificadadeliberadamente, como por exemplo, por mutagênesedirecionada no local ou acidentalmente através de mutações.
Esses termos também incluem análogos contendo de 1 a 6locais de glicosilação adicionais, análogos contendo nomínimo um aminoácido adicional na extremidade terminalcarbóxi da proteína, onde o(s) aminoácido(s) adicional(is)inclui(em) no mínimo um local de glicosilação, e análogoscontendo uma seqüência de aminoácidos que inclui no mínimoum local de glicosilação. Esses termos incluem G-CSF tantonatural como produzido por recombinação.
O termo "substancialmente homólogo" significa que umaseqüência objeto particular, por exemplo, uma seqüênciamutante, varia a partir da seqüência de referência por umaou mais substituições, deleções ou adições, cujo efeitofinal não resulta em uma dissimilaridade funcional adversaentre as seqüências de referência e objeto. Para afinalidade da presente invenção, seqüências contendo maisque 95 % de homologia, propriedades biológicas equivalentese características de expressão equivalentes sãoconsideradas substancialmente homólogas. Para a finalidadede determinação da homologia, um truncamento da seqüênciamadura deve ser desconsiderado. Seqüências contendo menoresgraus de homologia, bioatividade comparável ecaracterísticas de expressão equivalentes são consideradasequivalentes substanciais. Porções exemplares de G-CSF parauso aqui incluem aquelas seqüências que sãosubstancialmente homólogas SEQ ID NO: 1.
O termo "fragmento" da proteína G-CSF significaqualquer proteína ou polipeptídeo contendo as seqüências deaminoácidos de uma porção ou fragmento de uma proteína G-CSF, e que apresenta a atividade biológica do G-CSF.Fragmentos incluem proteínas ou polipeptídeos produzidospor degradação proteolítica da proteína G-CSF ou produzidospor síntese química por métodos rotineiros na técnica. Umaproteína G-CSF ou seu fragmento é biologicamente ativoquando a administração da proteína ou fragmento em sereshumanos resulta em algum grau de atividade do G-CSF. Adeterminação dessa atividade biológica da proteína G-CSFpode realizar testes convencionais bem conhecidosutilizados para tais finalidades em uma ou mais espécies demamíferos. Um teste apropriado que pode ser utilizado parademonstrar essa atividade biológica é descrito aqui.
O termo "paciente," refere-se a um organismo vivosofrendo ou propenso a sofrer de uma condição que pode serprevenida ou tratada pela administração de um agente ativo(por exemplo, conjugado), e inclui tanto seres humanos comoanimais.
"Opcional" ou "opcionalmente" significa que acircunstância descrita subseqüentemente pode ou nãoocorrer, de forma que a descrição inclui situações em que acircunstância ocorre e situações em que circunstância nãoocorre.
"Substancialmente" significa quase totalmente oucompletamente, por exemplo, satisfazendo uma ou mais dasseguintes condições: superior a 50%, 51% ou superior, 75%ou superior, 80% ou superior, 90% ou superior, e 95% ousuperior à condição.
A menos que o contexto expresse claramente o oposto,quando o termo "mais ou menos" preceder um valor numérico,o valor numérico é entendido como ± 10% do valor numéricodeclarado.
Resíduos de aminoácido em peptídeos são abreviadosconforme se segue: Fenilalanina é Fe or F; Leucina é Leu ouL; Isoleucina é Ile ou I; Metionina é Met ou M; Valina éVal ou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Pro ou P; Treonina éTr ou T; Alanina é Ala ou A; Tirosina é Tir ou Y; Histidinaé His ou H; Glutarnina é Gln ou Q; Asparagina é Asn ou N;Lisina é Lis ou K; Ácido Aspártico é Asp ou D; ÁcidoGlutâmico é Glu ou E; Cisteína é Cis ou C; Triptofano é Trpou W; Arginina é Arg ou R; and Glicina é Gli ou G.
Ao nos voltarmos para uma ou mais modalidades dainvenção, é fornecido um conjugado, o conjugado queconsiste em uma porção de G-CSF ligada de forma covalente,seja diretamente ou através de uma porção espaçadora, a umpolímero não-peptídico solúvel em água. Os conjugados dainvenção terão uma ou mais das seguintes características.
A porção de G-CSF.
Conforme declarado anteriormente, o conjugadogenericamente se compõe de uma porção de G-CSF ligada deforma covalente, seja diretamente ou através de uma porçãoespaçadora, a um polímero não-peptídico solúvel em água.
Conforme usado aqui, o termo "porção de G-CSF" deverá sereferir à porção de G-CSF antes da conjugação, assim como àporção de G-CSF após a ligação a um polímero não-peptídicosolúvel em água. Fica entendido, entretanto, que quando aporção de G-CSF é ligada a um polímero não-peptídicosolúvel em água, a porção de G-CSF é ligeiramente alteradadevido à presença de uma ou mais ligações covalentesassociadas com a ligação ao polímero. Freqüentemente, estaforma ligeiramente alterada da porção de G-CSF ligada a umaoutra molécula é referenciada a um "resíduo" da porção deG-CSF. A porção de G-CSF no conjugado pode ser qualquerporção que forneça um efeito de fator estimulador decolônia de granulócitos.
A porção de G-CSF pode ser derivada tanto de métodosnão recombinantes, como métodos recombinantes e a invençãonão se limita a esse respeito. Além disso, a porção de G-CSF pode ser derivada de fontes humanas ou de fontesanimais.
A porção de G-CSF pode ser derivada de forma nãorecombinante. Por exemplo, conforme descrito na PatenteU.S. N0 4.810.643 é possível coletar G-CSF a partir do meiode cultura de uma linhagem de células de carcinoma humanodenominada 5637 e depositada sob condições restritivas coma American Type Culture Collection, Rockville MD comoA.T.C.C. N°. de Depósito N0 HTB-9.
A porção de G-CSF pode ser derivada de métodosrecombinantes e ser expressa em sistemas de expressãobacterianos (por exemplo, Ε. coli), de mamíferos (porexemplo, células de ovários de hamster chinês), e levedura(por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) . A expressão podeocorrer via expressão exógena ou via expressão endógena.
Por exemplo, Nagata et al. (1986) Nature 319:415 fornece ocDNA para o G-CSF humano ("hG-CSF") isolado a partir de umalinhagem de células de carcinoma de células escamosashumanas CHU-II além de descrever um processo de expressãoda proteína em células COS (células de macaco-verdeafricano). Souza et al. descreve um processo para expressaro G-CSF em células E. coli. A Patente U.S. N0 4.810.643descreve métodos baseados em recombinantes para apreparação de metionil G-CSF (ou seja, G-CSF ao qual N-terminus possui o aminoácido metionina conectado). Alémdisso, a Patente U.S. N0 5.633.352 descreve métodosrecombinantes para preparação do G-CSF.
A seqüência de aminoácido para G-CSF humano éfornecida em SEQ ID NO: 1. Conforme fornecido aqui, umaforma contendo resíduo de metionina (onde n' 1 ' = 1) étambém contemplada para tal, e todas as outras seqüênciasaqui descritas. SEQ ID NO: 2 corresponde à porção de G-CSFcontendo seqüências diferentes de SEQ ID NO: 1.
Embora métodos baseados em recombinantes parapreparação de proteínas possam diferir, métodosrecombinantes tipicamente envolvem a construção de ácidonucléico codificando o polipeptídeo ou fragmento desejado,clonando o ácido nucléico em vetor de expressão,transformando a célula hospedeira (por exemplo, planta,bactéria, levedura, célula transgênica animal, ou célula demamífero, tal como célula de ovário de hamster chinês oucélulas dos rins de filhotes de hamster), e expressando oácido nucléico para produzir o polipeptídeo ou fragmentodesejado. Métodos para produzir e expressar polipeptídeosrecombinantes in vitro e em células hospedeirasprocarióticas e eucarióticas são conhecidos por aquelesespecialistas na técnica.
Para facilitar a identificação e purificação dopolipeptídeo recombinante, seqüências de ácido nucléico quecodificam a marcação de um epítopo ou outras seqüênciasligantes de afinidade podem ser inseridas ou acrescentadasna estrutura com as seqüências codificadoras, produzindoassim uma proteína de fusão do polipeptídeo desejado e umpolipeptídeo adequado à ligação. Proteínas de fusão podemser identificadas e purificadas primeiramente através dapassagem de uma mistura contendo a proteína de fusãoatravés de uma coluna de afinidade que possua porçõesligantes (por exemplo, anticorpos) direcionadas contra amarcação do epítopo ou outras seqüências ligantes nasproteínas de fusão, ligando dessa forma a proteína de fusãodentro da coluna. A partir daí, a proteína de fusão podeser recuperada lavando-se a coluna com a solução apropriada(por exemplo, ácido) para liberar a proteína de fusãoligada. O polipeptídeo recombinante também pode seridentificado e purificado através de Iise das célulashospedeiras, separando os polipeptídeos, por exemplo, porcromatografia de exclusão por tamanho, e coletando opolipeptídeo. Esses e outros métodos de identificação epurificação de polipeptídeos recombinantes são conhecidospor aqueles especialistas na técnica. Em uma ou maismodalidades da invenção, no entanto, prefere-se que aporção de G-CSF não se apresente na forma de uma proteínade fusão.
Dependendo do sistema usado para expressar proteínaque apresente atividade G-CSF, a porção de G-CSF pode serdesglicosilada ou glicosilada e qualquer uma entre as duasformas pode ser usada. Ou seja, a porção de G-CSF pode serdesglicosilada ou a porção de G-CSF pode ser glicosilada.
Em uma ou mais modalidades da invenção, no entanto,prefere-se que a porção de G-CSF não seja glicosilada.
A porção de G-CSF pode ser modificada proveitosamentepara incluir um ou mais resíduos de aminoácidos tais como,por exemplo, lisina, cisteína e/ou arginina, a fim defacilitar a ligação de um polímero a um átomo dentro dacadeia lateral do aminoácido. Além disso, a porção de G-CSFpode ser modificada para incluir um resíduo de aminoácidosem ocorrência natural. Técnicas de adição de resíduos deaminoácido e resíduos de aminoácido sem ocorrência naturalsão bem conhecidos por aqueles especialistas na técnica.
Referência é feita a J. March, Advanced Organic Chemistry:Reactions Mechanisms and Structure, 4 th Ed. (New York:Wiley-Interscience, 1992) . Em uma ou mais modalidades dainvenção, prefere-se que a porção de G-CSF não sejamodificada para incluir um ou mais resíduos de aminoácidos.
Porções exemplares de G-CSF contendo no mínimo umasubstituição relativa a hG-CSF são fornecidas na PatenteU.S. N0 6.64 6.110 e são adequadas ao uso como uma porção deG-CSF aqui. Além disso, porções de G-CSF exemplarescontendo no mínimo uma substituição relativa a hG-CSF sãofornecidas nas Patentes U.S. Nos 6.004.548 e 5.580.755, esão adequadas para uso como uma porção de G-CSF aqui.Além disso, a porção de G-CSF pode ser modificadaproveitosamente para anexar um grupo funcional (de formadiversa do que através da adição de um resíduo deaminoácido contendo grupo funcional). Por exemplo, a porçãode G-CSF pode ser modificada para incluir um grupo tiol.
Além disso, a porção de G-CSF pode ser modificada paraincluir um alfa-carbono N-terminal. Além disso, a porção deG-CSF pode ser modificada para incluir uma ou mais porçõesde carboidrato. Em algumas modalidades da invenção,prefere-se que a porção de G-CSF não seja modificada paraincluir um grupo tiol e/ou um alfa-carbono N-terminal.Porções de G-CSF contendo um aminóxi, aldeído ou algumoutro grupo funcional podem ser usadas.
Uma porção de G-CSF preferida contém uma seqüência deaminoácidos selecionada de um grupo composto de SEQ IDNO: Ie SEQ ID NO: 2. A menos que especificamente indicado,todas as designações de uma localização numérica de umresíduo de aminoácido conforme previsto aqui são baseadasem SEQ ID NO: 1 (ignorando qualquer resíduo de metionilprincipal). Seqüências úteis para servir como porções de G-CSF incluem as seqüências da proteína encontrada em versõescomercialmente disponíveis de formulações que contêm G-CSF,tais como NEUPOGEN® G-CSF (Amgen, Thousand Oaks, CA) eGRASTIM® G-CSF (Dr. Reddy's, Hyderabad, índia).
A porção de hG-CSF (conforme previsto em SEQ ID NO: 1)pode ser usada também como versões truncadas, varianteshíbridas, e peptídeos miméticos da seqüência. Fragmentosbiologicamente ativos, variantes de deleção, variantes desubstituição ou variantes de adição de um dos anterioresque mantenham no mínimo algum grau de atividade G-CSFtambém podem servir como uma porção de G-CSF.
Para qualquer porção de peptídeo ou proteína, épossível determinar se aquela porção possui atividade G-CSF. Por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N05.580.755, é possível administrar uma porção de G-CSF deinteresse com tampão na corrente sangüínea de um hamster econtar os granulócitos. A porção de G-CSF de interesse podeservir como uma porção de G-CSF de acordo com a presenteinvenção, se o hamster injetado com a porção de G-CSFproposta exibir um aumento significativo em granulócitosquando comparado a um hamster de controle não injetado coma porção de G-CSF proposta (por exemplo, simplesmentetampão).
O Polímero Solúvel em Água (por exemplo, POLY", POLY',POLY1, POLY2, e assim por diante)
Conforme discutido anteriormente, cada conjugado écomposto por uma porção de G-CSF ligada a um polímerosolúvel em água. Em relação ao polímero solúvel em água, opolímero solúvel em água é não-peptídico, atóxico, nãoocorre naturalmente e ê biocompatível. Em relação àbiocompatibilidade, uma substância é consideradabiocompatível se os efeitos benéficos associados ao uso dasubstância isoladamente ou com outra substância (porexemplo, um agente ativo tal como uma porção de G-CSF )relacionados a tecidos vivos (por exemplo, administração aum paciente) supera qualquer efeito prejudicial naavaliação de um clínico, por exemplo, um clínico geral. Emrelação a não imunogenicidade, uma substância é consideradanão imunogênica, se o uso pretendido da substância in vivonão produzir uma resposta imune indesejada (por exemplo, aformação de anticorpos) ou, se uma resposta imune éproduzida que não seja considerada clinicamentesignificativa ou importante na avaliação de um clínico.
Particularmente prefere-se que o polímero não-peptídicosolúvel em água seja biocompatível e não imunogênico.
Além disso, o polímero é tipicamente caracterizadocomo contendo de 2 a mais ou menos 300 termini. Exemplos detais polímeros incluem, mas não se limitam a,poli(alquileno glicóis) tais como polietileno glicol (PEG),poli(propileno glicol) ("PPG"), copolímeros de etilenoglicol e propileno glicol e similares, poli(polioloxietilado), poli(álcool olefínico),poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquil-metacrilamida) ,poli(hidroxialquil-metacrilado), poli(sacarídeos),poli(ácido α-hidróxi), poli(vinil álcool), polifosfazeno,polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina) , e combinações dequaisquer dos anteriores.
O polímero não é limitado a uma estrutura particular epode ser linear (por exemplo, alcóxi PEG ou PEGbifuncional), ramificado ou com diversos braços (porexemplo, PEG aforquilhado, ou PEG ligado a um núcleopoliol), e/ou dendrítico, onde cada um dos anteriores podeincluir ligações não degradáveis ou degradáveis. Sobretudo,a estrutura interna do polímero pode ser organizada emqualquer dos inúmeros padrões diferentes e pode serselecionada do grupo formado por homopolímero, copolímeroalternante, copolímero aleatório, copolímero em bloco,tripolímero alternante, tripolímero aleatório e tripolímeroem bloco.
Tipicamente, PEG ativado e outros polímeros solúveisem água ativados (ou seja, reagentes poliméricos) sãoativados com um grupo de ativação apropriado paraacoplamento ao local desejado na porção de G-CSF. Assimsendo, um reagente polimérico possuirá um grupo reativopara reação com a porção de G-CSF. Reagentes poliméricosrepresentativos e métodos de conjugação desses polímeros auma porção ativa são conhecidos na técnica e descritos emdetalhe em Zalipsky, S., et al. , "Use of FunctionalizedPoly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" inQuímica do Polietilenoglicol: Biotechnical and BiomedicalApplications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992),and in Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182.
Tipicamente, peso molecular ponderai do polímerosolúvel em água no conjugado é de mais ou menos 10 0 Daltonsa cerca de 150.000 Daltons. As faixas exemplares, noentanto, incluem pesos moleculares ponderais na faixasuperior a 5.000 Daltons a cerca de 100.000 Daltons, afaixa de cerca de 6.000 Daltons a cerca de 90.000 Daltons,na faixa de cerca de 10.000 Daltons a cerca de 85.000Daltons, na faixa superior a 10.000 Daltons a cerca de85.000 Daltons, na faixa de cerca de 20.000 Daltons a cercade 85,000 Daltons, na faixa de cerca de 53.000 Daltons acerca de 85.000 Daltons, na faixa de cerca de 25.000Daltons a cerca de 120.000 Daltons, na faixa de 29,000Daltons a cerca de 120.000 Daltons, na faixa de mais oumenos 35.000 Daltons a mais ou menos 120.000 Daltons, e nafaixa de cerca de 40.000 Daltons a cerca de 120.000Daltons. Para qualquer polímero solúvel em água, PEGscontendo um peso molecular em uma dessas faixas sãopreferidos.Pesos moleculares ponderais exemplares para o polímerosolúvel em água incluem cerca de 100 Daltons, cerca de 200Daltons, cerca de 300 Daltons, cerca de 400 Daltons, cercade 500 Daltons7 cerca de 600 Daltons, cerca de 700 Daltons,cerca de 750 Daltons, cerca de 800 Daltons, cerca de 900Daltons, cerca de 1.000 Daltons, cerca de 1.500 Daltons,cerca de 2.000 Daltons, cerca de 2.200 Daltons, cerca de2.500 Daltons, cerca de 3.000 Daltons, cerca de 4.000Daltons, cerca de 4.400 Daltons, cerca de 4.500 Daltons,cerca de 5.000 Daltons, cerca de 5.500 Daltons, cerca de6.000 Daltons, cerca de 7.000 Daltons, cerca de 7.500Daltons, cerca de 8.000 Daltons, cerca de 9.000 Daltons,cerca de 10.000 Daltons, cerca de 11.000 Daltons, cerca de12.000 Daltons, cerca de 13.000 Daltons, cerca de 14.000Daltons, cerca de 15.000 Daltons, cerca de 20.000 Daltons,cerca de 22.500 Daltons, cerca de 25.000 Daltons, cerca de30.000 Daltons, cerca de 35.000 Daltons, cerca de 40.000Daltons, cerca de 45.000 Daltons, cerca de 50.000 Daltons,cerca de 55.000 Daltons, cerca de 60.000 Daltons, cerca de65.000 Daltons, cerca de 70.000 Daltons, e cerca de 75.000Daltons. Versões ramificadas do polímero solúvel em água(por exemplo, um polímero solúvel em água de 40.000 Daltonscomposto de dois polímeros de 20.000 Daltons) contendo umpeso molecular total entre qualquer um dos pesos acima podetambém ser usado. Em uma ou mais modalidades, o conjugadonão possuirá nenhuma porção de PEG ligada, seja diretamenteou indiretamente, com um PEG de peso molecular ponderaimédio inferior a cerca de 6.000 Daltons.
Quando usado como o polímero, PEGs tipicamente serãocompostos de um número de monômeros (OCH2CH2) [ou monômeros(CH2CH2O) , dependendo de como o PEG seja definido] .Conforme usado em toda a descrição, o número de unidadesque se repetem é identificado pelo caractere subscrito "n"em "(OCH2CH2)n." Assim sendo, o valor de (n) tipicamentefica entre uma ou mais das seguintes faixas: de 2 a mais oumenos 3400, de mais ou menos 100 a mais ou menos 2300, demais ou menos 100 a mais ou menos 2270, de mais ou menos136 a mais ou menos 2050, de mais ou menos 225 a mais oumenos 193 0, de mais ou menos 450 a mais ou menos 193 0, demais ou menos 1200 a mais ou menos 1930, de mais ou menos568 a mais ou menos 2727, de mais ou menos 660 a mais oumenos 2730, de mais ou menos 795 a mais ou menos 2730, demais ou menos 795 a mais ou menos 2730, de mais ou menos909 a mais ou menos 2730, e de mais ou menos 1.200 a maisou menos 1.900. Para qualquer polímero do qual o pesomolecular seja conhecido, é possível determinar o número deunidades repetidas (isto é, "n") dividindo-se o pesomolecular ponderai total do polímero pelo peso molecular domonômero repetido.
Quando polímeros capeados na extremidade sãorequeridos, um polímero com ao menos um terminal capeadocom um grupo relativamente inerte, tal como um grupo alkóxiCi-6 inferior (embora um grupo hidroxila) pode ser usado.
Quando o polímero é PEG, por exemplo, é preferível usar ummetõxi-PEG (comumente referido como mPEG), que é uma formalinear de PEG na qual um terminal do polímero possui umgrupo metóxi (-OCH3), enquanto o outro terminal é umahidroxila ou outro grupo funcional que pode seropcionalmente quimicamente modificado.
Em uma forma útil em uma ou mais modalidades dapresente invenção, PEG livre ou não ligado é um polímerolinear terminado em cada extremidade com grupos hidroxila:
HO-CH2CH2O- (CH2CH2O) n-CH2CH2-OH,
onde (n) tipicamente varia de zero a aproximadamente 4.000.
0 polímero acima, alfa-, ômega-dihidroxilpoli(etilenoglicol), pode ser representado na forma breve como HO-PEG-OH, na qual se entende que o símbolo -PEG- pode representara seguinte unidade estrutural:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,
na qual (n) é como definido acima.
Um outro tipo de PEG útil em uma ou mais modalidadesda presente invenção é metóxi-PEG-0H ou mPEG de maneiraabreviada, no qual um terminal é o grupo metóxirelativamente inerte, enquanto o outro terminal é um grupohidroxila. A estrutura do mPEG é dada abaixo.
CH3O-CH2CH2O- (CH2CH2O) n-CH2CH2-OH
no qual (n) é como descrito acima.
Moléculas PEG com múltiplos braços ou ramificadas,tais como aquelas descritas na Patente U.S. N0 5.932.462,podem também ser usadas como polímero PEG. Por exemplo, PEGpode ter a estrutura: polya;—P
<formula>formula see original document page 34</formula>
na qual:
polya e polyb são a estrutura principal de PEG (tantoiguais quanto diferentes), tais como metóxi poli(etilenoglicol);
R" é uma porção não reativa, tal como H, metil ou umaestrutura principal de PEG; e
PeQ são ligações não reativas. Em algumascircunstâncias, o polímero PEG ramificado é lisinadissubstituída por metóxi poli(etileno glicol) (porexemplo, um polímero que englobe a seguinte estrutura,
<formula>formula see original document page 35</formula>
na qual cada η é um número inteiro de 3 a 4.000). Veja, porexemplo, a Patente U.S. N° 5.932.462. Dependendo da porçãode G-CSF específica usada, o grupo funcional éster reativoda lisina dissubstituída pode ser mais tarde modificadopara formar um grupo funcional adequado para reação com ogrupo alvo dentro da porção de G-CSF.
Adicionalmente, PEG pode conter uma PEG em forquilha.
Um exemplo de PEG em forquilha está representado pelaseguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 35</formula>
na qual: X é uma porção espaçadora de um ou mais átomos ecada Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por umacadeia de átomos de comprimento definido.A Patente U.S. N06.362.254 relata várias estruturas de PEG em forquilhacapazes de uso em uma ou mais modalidades da presenteinvenção. A cadeia de átomos que liga os grupos funcionaisZ ao átomo de carbono ramificado serve como um grupo defixação e pode incluir, por exemplo, cadeias alquil,cadeias éter, cadeias éster, cadeias amida e combinaçõesdas mesmas.
0 polímero PEG pode incluir uma molécula PEG pendentecom grupos reativos, tal como carboxil, ligadocovalentemente ao longo do comprimento da PEG ao invés deno final da cadeia PEG. Os grupos reativos pendentes podemser anexados à PEG diretamente ou através de uma porçãoespaçadora, como um grupo alquileno.
Em adição às formas de PEG acima descritas, o polímerotambém pode ser preparado com uma ou mais ligações fracasou degradáveis no polímero, incluindo quaisquer dospolímeros acima descritos. Por exemplo, a PEG pode serpreparada com ligações éster no polímero que são sujeitas àhidrólise. Como mostrado abaixo, esta hidrólise resulta emquebra do polímero em fragmentos de menor peso molecular:
-PEG-CO2-PEG- + H2O -► -PEG-CO2H + HO-PEG-
Outras ligações hidroliticamente degradáveis, úteiscomo uma ligação degradável na estrutura principal dopolímero, incluem: ligações carbonato; ligações imineresultantes de, por exemplo, reação de uma amina e umaldeído (veja, por exemplo, Ouchi et al. (1997) PolymerPreprints 3j3 (1) : 582 - 3 ) ; ligações fosfato éster formadas,por exemplo, reagindo um álcool com um grupo fosfato;ligações hidrazona que são tipicamente formadas pela reaçãode uma hidrazida e um aldeído; ligações acetais que sãotipicamente formadas pela reação entre um aldeído e umálcool; ligações orto-éster que são, por exemplo, formadaspela reação entre um aldeído e um álcool; ligaçõesortoéster que são, por exemplo, formadas pela reação entreum formiato e álcool; ligações amida formadas por um grupoamina, por exemplo, no final de um polímero como PEG e umgrupo carboxil de outra cadeia PEG; ligações uretanaformadas pela reação de, por exemplo, uma PEG com um grupoterminal isocianato e um álcool PEG; ligações peptídicasformadas por um grupo amina, por exemplo, no final de umpolímero como PEG e um grupo carboxil de um peptídeo eligações oligonucleotídicas formadas por, por exemplo, umgrupo fosforamidita, por exemplo, no final de um polímero eum grupo 5' hidroxil de um oligonucleotídeo.
Tais recursos opcionais do conjugado, por exemplo, aintrodução de uma ou mais ligações degradáveis na cadeia dopolímero pode fornecer controle adicional sobre aspropriedades farmacológicas desejadas do conjugado apósadministração. Por exemplo, um conjugado grande erelativamente inerte (por exemplo, que possua uma ou maiscadeias PEG de alto peso molecular anexadas, por exemplo,uma ou mais cadeias PEG que tenham peso molecular maior quecerca de 10.000, nas quais o conjugado essencialmente nãopossua bioatividade) pode ser administrado, sendohidrolisado para gerar um conjugado bioativo que possua umaporção da cadeia PEG original. Desta forma, as propriedadesdo conjugado podem ser mais efetivamente montadas paraequilibrar a bioatividade do conjugado ao longo do tempo.
O polímero solúvel em água associado com o conjugadopode ter uma ligação degradável para fornecer um efeito de"clivagem". Isto é, o polímero solúvel em água é clivado(através de hidrólise, processos enzimáticos ou outros),resultando, então, na porção não-conjugada de G-CSF. Emalguns casos, polímeros cliváveis separam-se da porção deG-CSF in vivo sem deixar nenhum fragmento do polímerosolúvel em água. Em outros casos, polímeros cliváveisseparam-se da porção de G-CSF in vivo deixando um fragmentorelativamente pequeno (por exemplo, tag succinato) dopolímero solúvel em água. Em ambos os casos, o resultado éum conjugado que pode fornecer um perfil de liberaçãosustentada ao longo do tempo após administração aopaciente. Um conjugado exemplar que fornece tal liberaçãosustentada é um preparado com um polímero que é anexado àporção de G-CSF via ligação carbonato ou ligação uretana.
Naqueles casos em que uma ligação degradável é do tipoclivável de ligação degradável, os conjugados da invençãopodem ser considerados pró-fármacos (embora o conjugadopossa reter atividade mesmo na forma de conjugado).
Ligações degradáveis e cliváveis exemplares incluemcarboxilato éster, fosfato éster, tioléster, anidridos,acetais, cetais, aciloxialquil éter, iminas, orto-ésteres,peptídeos e oligonucleotideos. Tais ligações podem serprontamente preparadas através de modificação apropriada daporção de G-CSF (por exemplo, o terminal C do grupocarboxil da proteína ou um grupo hidroxil de cadeia lateralde um aminoácido como serina ou treonina contido em umaproteína) e/ou do reagente polimérico usando métodos deacoplamento comumente empregados na técnica. Maispreferivelmente, entretanto, são as ligações hidrolizáveisque são prontamente formadas pela reação de um polímeroadequadamente ativado com um grupo funcional não-modifiçadocontido em uma porção que possua atividade G-CSF.
Alternativamente, uma ligação hidroliticamenteestável, como uma ligação amida, uretana (também conhecidacomo carbamato), amina, tioéter (também conhecida comosulfeto), ou uréia (também conhecida como carbamida) tambémpode ser empregada como ligação para acoplamento da porçãode G-CSF. Novamente, uma ligação hidroliticamente estávelde preferência é uma amida. Em uma abordagem, um polímerosolúvel em água que carregue um éster ativado pode reagircom um grupo amina na porção de G-CSF para, então, resultarem uma ligação amida. Em algumas modalidades, é preferívelque a ligação (e, portanto, o conjugado correspondente) nãoque a ligação (e, portanto, o conjugado correspondente) nãotenha a ligação produzida pela reação de um reagentepolimérico terminado em fenil glioxal e a porção de G-CSF.
Em algumas modalidades, é preferível que a ligação nãotenha a ligação produzida pela reação de um reagentepolimérico terminado em haloacetamida e a porção de G-CSF.
Os conjugados (de maneira oposta a uma porção de G-CSFnão conjugada) podem ou não possuir um grau mensurável deatividade G-CSF. Isto quer dizer que um conjugado polímero-porção de G-CSF de acordo com a invenção possuirá qualquervalor entre cerca de 0,1% e cerca de 100% da bioatividadeda porção de G-CSF parental não-modifiçada. Em algunscasos, os conjugados polímero-porção de G-CSF podem possuirmais do que 100% da bioatividade da porção de G-CSFparental não-modifiçada. Preferivelmente, conjugados quepossuam pouca ou nenhuma atividade G-CSF contêm uma ligaçãohidrolizável conectando o polímero à porção, de modo queapesar da falta (ou relativa falta) de atividade doconjugado, a molécula ativa parental (ou derivada de) éliberada com a degradação induzida por água da ligaçãohidrolizável. Tal atividade pode ser determinada usando ummodelo in vivo ou in vitro adequado, dependendo daatividade conhecida da porção particular que tenhaatividade G-CSF empregada.
Para conjugados que possuam uma ligaçãohidroliticamente estável que ligue a porção com atividadeG-CSF ao polímero, o conjugado tipicamente possuirá um graumensurável de bioatividade. Por exemplo, tais conjugadossão tipicamente caracterizados como tendo uma bioatividadeque satisfaça uma ou mais das seguintes porcentagensrelativas àquela da porção de G-CSF não-conjugada: ao menoscerca de 2%, ao menos cerca de 5%, ao menos cerca de 10%,ao menos cerca de 15%, ao menos cerca de 25%, ao menoscerca de 30%, ao menos cerca de 40%, ao menos cerca de 50%,ao menos cerca de 60%, ao menos cerca de 80%, ao menoscerca de 85%, ao menos cerca de 90%, ao menos cerca de 95%,ao menos cerca de 97%, ao menos cerca de 100% e mais que105% (quando medido em um modelo adequado, tal como aquelesbem conhecidos na técnica). Preferivelmente, conjugados quepossuam uma ligação hidroliticamente estável (por exemplo,uma ligação amida) possuirão ao menos algum grau dabioatividade da porção parental não-modifiçada que possuaatividade G-CSF.
Aqueles especialistas na técnica reconhecerão que adiscussão seguinte sobre polímeros não-peptídicos esolúveis em água não é de forma alguma exaustiva e émeramente ilustrativa e que todos os materiais poliméricoscom qualidades descritas acima são contemplados. Como usadoaqui, o termo "reagente polimérico" refere-se a umamolécula inteira, o que pode incluir um segmento depolímero solúvel em água e um grupo funcional.
Como descrito acima, um conjugado da invenção contémum polímero solúvel em água covalentemente ligado à porçãode G-CSF. Tipicamente, para qualquer conjugado, haverá um atrês polímeros solúveis em água covalentemente anexados auma ou mais porções com atividade G-CSF. Em alguns casos,entretanto, o conjugado pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oumais polímeros solúveis em água individualmente anexados àporção de G-CSF.
Conjugados exemplares de acordo com a invenção serãodescritos agora. Ao descrever os conjugados, referênciaspodem ser feitas a certos aminoácidos. Tais referências sãorelativas ao G-CSF humano como fornecido em SEQ ID NO: Iesão para conveniência apenas. Alguém especialista natécnica será capaz de determinar prontamente o local ouátomo correspondente em outras porções com atividade G-CSF.
Particularmente, a descrição fornecida aqui para G-CSFhumano nativo é geralmente aplicável a fragmentos,variantes de deleção, variantes de substituição ouvariantes de adição de qualquer um dos previamente citados.
Como mostrado acima, a ligação particular na porçãocom atividade G-CSF e o polímero depende de uma série defatores. Tais fatores incluem, por exemplo, a química deligação particular empregada, a porção de G-CSF particular,os grupos funcionais disponíveis na porção de G-CSF (tantopara ligação a um polímero quanto para conversão para umlocal de ligação adequado), a presença de grupos funcionaisreativos adicionais na porção de G-CSF e similares.
Grupos amino nas porções de G-CSF fornecem um ponto deligação entre a porção de G-CSF e o polímero solúvel emágua. Em uma modalidade, o conjugado tem um conjugadosolúvel em água anexado ao terminal N da porção de G-CSF,em alguns casos, entretanto, a composição conterá menos doque 5 0% dos conjugados monoPEGuilados com terminais N. Emconjugados exemplares, a porção de G-CSF terminada em N nãocontém um resíduo de metionina como aminoácido terminal. G-CSF humano contém quatro resíduos de lisina contendo aminae um terminal amino (veja SEQ ID NO: 1) . Assim, pontos deligação exemplares deste G-CSF incluem ligação à cadeialateral amina associada à lisina em qualquer uma dasposições 16, 23, 34 e 40.
Há uma série de exemplos de reagentes poliméricosadequados úteis para formar ligações covalentes com aminasde uma porção de G-CSF disponível. Exemplos específicos,junto com o conjugado correspondente, são fornecidos naTabela 1 abaixo. Na tabela, a variável (n) representa onúmero de unidades monoméricas de repetição e "-NH-(G-CSF)"representa o resíduo da porção de G-CSF depois daconjugação ao reagente polimérico. Enquanto cada porçãopolimérica [por exemplo, (OCH2CH2)n ou (CH2CH2O)n]apresentada na Tabela 1 termina em um grupo "CH3", outrosgrupos (tais como H e benzil) podem ser substituídos.
Tabela 1
Reagentes poliméricos amina-específicos e o conjugado daporção de G-CSF formada a partir deles
<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>uma série de técnicas. Em uma abordagem, uma porção de G-CSF pode ser conjugada a um reagente poliméricofuncionalizado com um derivado de succinimidil (ou outrogrupo éster ativado). Nesta abordagem, o polímero quecarrega um grupo succinimidil (ou outro grupo ésterativado) pode ser anexado à porção de G-CSF em um meioaquoso em pH de 7 a 9,0, embora usar diferentes condiçõesde reação (por exemplo, um pH mais baixo como 6 a 7 outemperaturas diferentes e/ou mais baixas que 15°C) poderesultar em ligação ao polímero em um local diferente naporção de G-CSF. Adicionalmente, uma ligação amida pode serformada reagindo um polímero solúvel em água não-peptídicoterminado em amina com uma porção de G-CSF que carregue umgrupo ácido carboxílico ativador.
Um conjugado exemplar da invenção contém um resíduo deuma porção de G-CSF anexada através de uma ligação amida ouamina secundária a um polímero ramificado solúvel em água,no qual (i) uma porção espaçadora opcional formada por umou mais átomos está localizada entre a ligação amida ouamina secundária e o polímero ramificado solúvel em água, e(ii) o polímero ramificado solúvel em água não contém umresíduo de lisina.
Adicionalmente, em relação aos conjugados modificadosterminados em N, uma composição exemplar engloba umapluralidade de conjugados, cada conjugado contendo umresíduo de uma porção de G-CSF anexada, tanto diretamentequanto através de uma porção espaçadora formada por um oumais átomos a um polímero solúvel em água, na qual menos de50% de todos os conjugados na composição não sãomonoPEGuilados terminados em N.Conjugados exemplares de acordo com a invenção possuema seguinte estrutura
<formula>formula see original document page 51</formula>
na qual:
(n) é um número inteiro com valor de 3 a 4 000;
X é uma porção espaçadora formada por um ou maisátomos;
R1 é um radical orgânico que contém 1 a 3 átomos decarbono selecionados do grupo que consiste em metil, etil,propil e isopropil; e
G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.Conjugados exemplares da presente invenção possuem aseguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 51</formula>
na qual (n) é um número inteiro com valor de 3 a 4000 e G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
Típico de outra abordagem útil para conjugar a porçãode G-CSF a um reagente polimérico é o uso de uma aminaçãoredutora para conjugar uma amina primária de uma porção deG-CSF com um reagente polimérico funcionalizado com umacetona, aldeído ou uma forma hidratada destes (por exemplo,uma cetona hidratada ou um aldeído hidratado). Nestaabordagem, a amina primária da porção de G-CSF reage com ogrupo carbonil do aldeído ou cetona (ou do grupo comhidroxil correspondente de um aldeído ou cetona hidratada),formando, assim, uma base Schif f. A base Schiff, por suavez, pode ser convertida por redução a um conjugado estávelatravés do uso de um agente redutor como boro-hidreto desódio. Reações seletivas (por exemplo, no terminal N) sãopossíveis, particularmente com um polímero funcionalizadocom uma cetona ou um aldeído ramificado alfa-metil e/ou sobcondições de reação específicas (por exemplo, pH reduzido).
Conjugados exemplares da invenção em que o polímerosolúvel em água está na forma ramificada, terão a formaramificada do polímero solúvel em água com a seguinte
<formula>formula see original document page 52</formula>
na qual cada (n) é independentemente um número inteiro devalor de 3 a 4000.
Conjugados exemplares da invenção possuem a seguinteestrutura:
<formula>formula see original document page 52</formula>
na qual:
cada (n) é independentemente um número inteiro devalor de 3 a 4 000;
X é uma porção espaçadora formada por um ou maisátomos;
(b) é 2 através de 6;
(c) é 2 através de 6;
R2, em cada ocorrência, é independentemente H oualquil inferior; e
G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
Conjugados exemplares da invenção possuem a seguinteestrutura:
<formula>formula see original document page 52</formula>na qual:
cada (n) é independentemente um número inteiro devalor de 3 a 4000; e
G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.Conjugados exemplares da invenção possuem a seguinteestrutura:
<formula>formula see original document page 53</formula>
na qual:
cada (n) é independentemente um número inteiro devalor de 3 a 4000;
(a) é zero ou um;
X, quando presente, é uma porção espaçadora formadapor um ou mais átomos;
(b1) é zero ou um número inteiro com valor de um a dez ;
(c) é um número inteiro com valor de um a dez;
R2, em cada ocorrência, é independentemente H ou umradical orgânico;
R3, em cada ocorrência, é independentemente H ou umradical orgânico; e
G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
Conjugados exemplares da invenção possuem a seguinteestrutura:
<formula>formula see original document page 53</formula>
na qual:
<formula>formula see original document page 53</formula>
cada (n) é independentemente um número inteiro devalor de 3 a 4 000; eG-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.Conjugados exemplares da invenção possuem a seguinteestrutura:
<formula>formula see original document page 54</formula>
na qual:
POLY1 é um primeiro polímero solúvel em água;
POLY2 é um segundo polímero solúvel em água;
X1 é uma primeira porção espaçadora;
X2 é uma segunda porção espaçadora;
Ha é um átomo de hidrogênio ionizável;
R1 é H ou um radical orgânico;
R2 é H ou um radical orgânico;
(a) é zero ou um;
(b) é zero ou um;
Rel, quando presente, é um primeiro grupo alterador deelétron;
Re2, quando presente, é um segundo grupo alterador deelétron;
Y1 é 0 ou S ;
Y2 é 0 ou S; e
G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
Estes conjugados (que são "baseados em fulveno") incluemuma ligação clivável na qual uma porção de G-CSF é liberadain vivo após administração seguinte. Vantajosamente, taisconjugados "baseados em fulveno" incluem casos nos quaisapenas um polímero solúvel em água está presente (porexemplo, POLY2 e X2 estão ausentes) e são formados onde oreagente polimérico correspondente (descrito no parágrafoimediatamente abaixo) não possui POLY2 e X2.
Tais conjugados baseados em fulveno podem serpreparados combinando, sob conjugações de conjugação, umaporção de G-CSF com um reagente polimérico baseado emfulveno com a seguinte estrutura:
<formula>formula see original document page 55</formula>
na qual:
POLY1 é um primeiro polímero solúvel em água;
POLY2 é um segundo polímero solúvel em água;
X1 é uma primeira porção espaçadora;
X2 é uma segunda porção espaçadora;
Hn é um átomo de hidrogênio ionizável;
R1 é H ou um radical orgânico;
R2 é H ou um radical orgânico;
(a) é zero ou um;
(b) é zero ou um;
Rel, quando presente, é um primeiro grupo alterador deelétron; e
Re2, quando presente, é um segundo grupo alterador deelétron.
A síntese de tais reagentes poliméricos baseados emfulveno é descrita na co-propriedade e co-pendência doPedido de Patente U.S. N0 de Série 11/454.971. Comodescrito aqui, reagentes poliméricos baseados em fulvenopodem ser preparados em um sem-número de maneiras. Porexemplo, um método para preparar um reagente baseado emfulveno engloba: (a) fornecer uma porção aromática quecarregue um primeiro local de ligação, um segundo local deligação e um terceiro local de ligação opcional; (b)reagindo um reagente de grupo funcional com o primeirolocal de ligação para ter como resultado o primeiro localde ligação com um grupo funcional capaz de reagir com umgrupo amino de um agente ativo e resultar em uma ligaçãodegradável, tal como um carbamato; e (c) reagindo umpolímero solúvel em água que carregue um grupo reativo nosegundo local de ligação e, quando presente, o terceirolocal de ligação opcional para ter como resultado (i) osegundo local de ligação carregando um polímero solúvel emágua através de uma porção espaçadora e (ii) o terceirolocal de ligação opcional, quando presente, carregando umsegundo polímero solúvel em água através de uma porçãoespaçadora. Em alguns casos, (b) é realizado antes da etapa(c) , ao passo que, em outros, (c) é realizado antes daetapa (b).
Assim, neste método de preparar um reagente poliméricobaseado em fulveno, uma etapa necessária é (a) fornecer umaporção aromática que carregue um primeiro local de ligação,um segundo local de ligação e um terceiro local de ligaçãoopcional. No contexto de uma preparação sintética, entende-se que "fornecer" um material significa obter o material(por exemplo, sintetizando-o ou obtendo-o comercialmente).
Uma porção aromática exemplar, para fins de ilustração, é o9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno, como mostrado abaixo.
<formula>formula see original document page 56</formula>
Esta porção aromática contendo, 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno, é um exemplo de uma porção aromática comtrês locais de ligação: um grupo hidroxil na posição 9 egrupos amino nas posições 2 e 7. Esta porção aromática podeser fornecida em uma forma de base ou sal. Sobre o 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno, é possível usar a formade dicloridrato.
Tendo fornecida a porção aromática, outra etapa nométodo para fornecer um reagente polimérico baseado emfulveno, de maneira abrangente, inclui a etapa de reagir umpolímero solúvel em água que carregue um grupo reativo como(s) local(is) de ligação na porção aromática. Aqui,qualquer abordagem conhecida na especialidade para anexarum polímero solúvel em água a um ou mais locais de ligaçãona porção aromática pode ser usada e o método não élimitado à abordagem específica. Por exemplo, uma PEGreativa a amina (tal como, uma mPEG terminada em éster N-succinimidil, formada, por exemplo, a partir da reação deN-hidroxissuccinimida e CH3O-CH2CH2-(OCH2CH2)-OCH2CH2-OCH2COOH com diciclohexil carbodiimida (DCC) ou diisopropilcarbodiimida (DIC) como agente condensador e opcionalmentena presença de uma base) pode reagir com uma porçãoaromática que carregue amina tal como 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno.
Em alguns casos, a reação de polímero solúvel em águaque carrega um grupo reativo com a porção aromáticaresultará em todos os locais de ligação possíveis compolímeros solúveis em água anexados. Em taiscircunstâncias, é necessário remover ao menos um polímerosolúvel em água para que um local de ligação fiquedisponível para reação com um reagente de grupo funcional.
Assim, por exemplo, a reação da mPEG terminada em éster N-succinimidil discutida no parágrafo anterior com resultadosde 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno em uma mistura queengloba (a) um espécime que carrega dois polímeros solúveisem água, um em cada um dos dois locais de amina e (b) umespécime que carrega três polímeros solúveis em água, um emcada um dos dois locais de amina e um no local hidroxil.
Aqui, é possível remover e coletar espécies de pesomolecular mais alto usando cromatografia de exclusão portamanho. Em adição, é possível tratar a mistura em pH alto[tratando, por exemplo, a mistura com hidróxido de lítio,(LiOH), hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de potássio(KOH)], seguido por cromatografia de troca de íon (IEC). Dequalquer modo, o resultado é uma composição contendo, namaior parte, 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno carregandodois polímeros solúveis em água, um em cada um dos doislocais de amina. Um terceiro local hidroxil está, portanto,disponível para reação com um reagente de grupo funcional.
A etapa final é reagir um local reativo da porçãoaromática com um reagente de grupo funcional. Uma abordagempreferida é reagir o 9-hidroximetil-2,7-diaminofluoreno quecontém hidroxil e carrega dois polímeros solúveis em água,um em cada um dos dois locais de amina, com trifosgenoseguido por um tratamento com N-hidroxissuccinimida. Destaforma, um grupo funcional capaz de reagir com um grupoamino de um agente ativo para formar uma ligaçãodegradável, tal como uma ligação carbamato (neste caso, um"carbonato ativado"), é formado no local reativo que contémhidroxil.
As etapas do método para fornecer os reagentespoliméricos baseados em fulveno ocorrem em um solventeapropriado. Um especialista na técnica pode determinar sequalquer solvente especifico é apropriado para qualquerreação. Tipicamente, entretanto, o solvente épreferivelmente um solvente não-polar ou um solventeaprótico polar. Exemplos não-limitantes de solventes não-polares incluem benzeno, xileno, dioxano, tetrahidrofurano(THF), álcool t-butil e tolueno. Solventes não-polaresparticularmente preferidos incluem tolueno, xileno,dioxano, tetrahidrofurano e álcool t-butil. Solventespolares apróticos exemplares incluem, mas não são limitadosa, DMSO (dimetil sulfóxido), HMPA (hexametilfosforamida),DMF (dimetilformamida), DMA (dimetilacetamida) , NMP {N-metilpirrolidinona).
Grupos amina preferidos em G-CSF que podem servir comolocal para ligação de um polímero incluem aqueles gruposamina encontrados no resíduo de lisina, tais como Lys 16,Lys 34 e Lys 40. Em adição, o terminal N de qualquer porçãode G-CSF que é uma proteína pode servir como um local deligação polimérica.
Grupos carboxil representam outro grupo funcional quepode servir como um ponto de ligação de uma porçãode G-CSF.
Estruturalmente, o conjugado englobará o seguinte:
<formula>formula see original document page 59</formula>
na qual (G-CSF) e o grupo carbonil adjacente corresponde àporção de G-CSF contendo carboxil, X é uma porçãoespaçadora, preferivelmente, neste caso, um heteroátomoselecionado de O, N(H) e S, e POLY é um polímero solúvel emágua como PEG, opcionalmente terminando em uma porção decapeamento na extremidade.A ligação C(O)-X resulta da reação entre um derivadopolimérico que carrega um grupo funcional terminal e umaporção de G-CSF que contém carboxil. Como discutido acima,a ligação específica dependerá do tipo de grupo funcionalutilizado. Se o polímero é funcionalizado na extremidade ou"ativado" com um grupo hidroxil, a ligação resultante seráum éster de ácido carboxílico e X será O. Se a estruturaprincipal do polímero é funcionalizada com um grupo tiol, aligação resultante será um tioéster e X será S. Quandocertos polímeros com múltiplos braços, ramificados ou emforquilha são empregados, a porção C(O)X e, em particular,a porção X, pode ser relativamente mais complexa e podeincluir uma estrutura de ligação mais longa.
Derivados solúveis em água que contêm uma porçãohidrazida são também úteis para conjugação em um carbonil.Na medida em que a porção de G-CSF não contém uma porçãocarbonil, uma porção carbonil pode ser introduzidareduzindo quaisquer ácidos carboxílicos (por exemplo, oácido carboxílico C-terminal) e/ou fornecendo versõesglicosiladas ou glicadas (nas quais os açúcares adicionadospossuem uma porção carbonil) da porção de G-CSF. Exemplosespecíficos de derivados solúveis em água com uma porçãohidrazida, junto com os conjugados correspondentes, sãofornecidos na Tabela 2 abaixo. Em adição, qualquer derivadosolúvel em água que contém um éster ativado (por exemplo,um grupo succinimidil) pode ser convertido para conter umaporção hidrazida reagindo o derivado do polímero solúvel emágua que contém o éster ativado com hidrazina (NH2-NH2) oucarbazato tert-butil [NH2NHCO2C(CH3)3] . Na tabela, avariável (n) representa o número de unidades monoméricasrepetidas e "=C-(G-CSF)" representa o resíduo da porção deG-CSF após conjugação com reagente polimérico.Opcionalmente, a ligação hidrazona pode ser reduzida usandoum agente de redução adequado. Enquanto cada porçãopolimérica [por exemplo, (OCH2CH2)n ou (CH2CH2O)n]apresentada na Tabela 1 termina em um grupo 11CH3", outrosgrupos (tais como, H e benzil) podem ser substituídos poreles.
Tabela 2
<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>
Grupos tiol contidos na porção de G-CSF podem servircomo locais efetivos de ligação para polímero solúvel emágua. Em particular, resíduos de cisteína na porção de G-CSF fornecem grupos tiol quando a porção de G-CSF é umaproteína. Os grupos tiol em tais resíduos de cisteínapodem, então, reagir com uma PEG ativada que é específicapara reação com grupos tiol, por exemplo, um polímero N-maleimidil ou outro derivado, como descrito na Patente U.S.N0 5.739.208 e na Publicação de Patente Internacional N0 WO01/62827.
Sobre SEQ ID NOs. 1 a 3, há cinco resíduos de cisteínaque contêm tiol. Assim, locais de ligação preferenciais detiol são associados com um dos cinco resíduos de cisteína.
Embora seja preferível não perturbar quaisquer ligaçõesdissulfeto, pode ser possível anexar um polímero à cadeialateral de um ou mais destes resíduos de cisteína e reterum grau de atividade. Ainda que qualquer porção de G-CSFparticular não possua um grupo tiol ou o distúrbio deligações dissulfeto deva ser evitado, é possível adicionarum resíduo de cisteína à porção de G-CSF usando técnicassintéticas convencionais. Veja, por exemplo, o procedimentodescrito em WO 90/12874 para adicionar resíduos decisteína, no qual este procedimento pode ser adaptado parauma porçãode G-CSF. Em adição, processos de engenhariagenética convencionais também podem ser usados paraintroduzir um resíduo de cisteína na porção de G-CSF. Emalgumas modalidades, entretanto, é preferível nãointroduzir um resíduo adicional de cisteína e/ou grupotiol.
Exemplos específicos, junto com o conjugadocorrespondente, são fornecidos na Tabela 3 abaixo. Natabela, a variável (n) representa o número de unidadesmonoméricas repetidas e "-S-(G-CSF)" representa o resíduoda porção de G-CSF após conjugação com o polímero solúvelem água. Enquanto cada porção polimérica [por exemplo,(OCH2CH2)n ou (CH2CH2O)n] apresentada na Tabela 3 termina emum grupo "CH3", outros grupos (como H e benzil) podem sersubstituídos.
Tabela 3
Reagentes poliméricos específicos de tiol e o conjugado demetade G-CSF formado a partir deles
<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table>
A respeito de conjugados formados a partir depolímeros solúveis em água que carregam um ou mais gruposfuncionais maleimida (sem contar se a maleimida reage comum grupo amina ou tiol na porção de G-CSF) , a(s) forma(s)de ácido maleâmico correspondente do polímero solúvel emágua també(m) pode(m) reagir com a porção de G-CSF. Sobcertas condições (por exemplo, um pH de cerca de 7 a 9 e napresença de água), o anel maleimida "abrirá" para formar oácido maleâmico correspondente. 0 ácido maleâmico, por suavez, pode reagir com o grupo amina ou tiol de uma porção deG-CSF. Reações exemplares baseadas em ácido maleâmico sãoesquematicamente mostradas abaixo. POLY representa opolímero solúvel em água e (G-CSF) representa a porção deG-CSF.
<formula>formula see original document page 66</formula>Reagentes poliméricos adequados para serem usados paraformar conjugados G-CSF da invenção são formados pelaestrutura
POLY-[Y-S-W]x
na qual:
POLY é um segmento do polímero solúvel em água;
x é 1 para 25;
Y é um grupo de ligação bivalente formado por ao menosquatro átomos de carbono e consistido em uma estruturaprincipal de hidrocarbonetos saturada ou insaturada, a qualpossui três a oito átomos de carbono de comprimento epossui substituintes que são independentemente selecionadosde hidrogênio, alquil inferior, alquenil inferior esubstituintes não-interferentes como definidos aqui, ondedois dos substituintes alquil e/ou alquenil em diferentesátomos de carbono da estrutura principal podem ser ligadosde forma que formem um grupo cicloalquil, cicloalquenil ouaril ;
S é um átomo de enxofre anexado a um carbonohibridizado sp3de Y;
e S-W é um tiol (por exemplo, W é H) , tiol protegidoou derivado de tiol reativo, como orto-piridil dissulfeto(OPSS). Tióis protegidos incluem, por exemplo, tioéteres,como S-benzil ou S-tritil éteres e tioésteres. Taisreagentes poliméricos são descritos na Publicação de Pedidode Patente U.S. N0 2006/0135586.
Um conjugado representativo de acordo com a invençãopode ter a seguinte estrutura:
POLY-L0,i"C(O) Z-Y-S-S- (G-CSF)
na qual POLY é um polímero solúvel em água, L é um liganteopcional, Z é um heteroátomo selecionado a partir do grupoconsistindo em O, NH e S e Y é selecionado a partir dogrupo consistindo em C2-io alquil, C2-io alquil substituído,aril e aril substituído, e (G-CSF) é um resíduo de umaporção de G-CSF. Reagentes poliméricos que podem reagir comuma porção de G-CSF e resultam neste tipo de conjugado sãodescritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N°2005/0014903.
Conjugados podem ser formados usando reagentespoliméricos específicos de tiol em uma série de maneiras ea invenção não está limitada neste respeito. Por exemplo, aporção de G-CSF, opcionalmente em um tampão adequado(incluindo tampões com amina, se desejado), é colocada emum meio aquoso a um pH de cerca de 7 a 8 e o reagentepolimérico específico de tiol é adicionado em excessomolar. Permite-se que a reação prossiga por aproximadamente0,5 a 2 horas, embora tempos de reação maiores que 2 horas(por exemplo, 5 horas, 10 horas, 12 horas e 24 horas)possam ser úteis se a produção de PEGuilação forrelativamente baixa. Reagentes poliméricos exemplares quepodem ser usados nesta abordagem são reagentes poliméricosque carregam um grupo reativo selecionado a partir do grupoconsistindo em maleimida, sulfona (por exemplo, vinilsulfona), e tiol (por exemplo, tióis protegidos como ortopirimidil ou "OPSS").
Grupos tiol preferidos em uma porção de G-CSF que podeservir como um local para ligação de um reagente poliméricoincluem aqueles grupos tiol encontrados nos resíduos decisteína. Um grupo tiol particularmente preferido é o grupotiol associado à cadeia lateral da cisteína de resíduo deaminoácido localizada na posição 17.
Assim, um conjugado exemplar da invenção contém umresíduo de uma porção de G-CSF que possui uma cadeialateral de resíduo de cisteína correspondente à posição 17de aminoácido de hG-CSF, na qual a cadeia lateral deresíduo da cisteína é ligada, tanto diretamente quantoatravés de uma porção espaçadora formada por um ou maisátomos, a um polímero solúvel em água.
Como descrito previamente, a produção de PEGuilação deconjugação baseada em tiol de algumas porções de G-CSF podeser relativamente baixa. Mesmo permitindo tempos de reaçãoestendidos, tais produções de PEGuilação podem, de qualquermaneira, ainda ser insatisfatórias. Nestes casos, aindapode ser possível fornecer modificação baseada em tiol emprodução relativamente alta empregando um método parapreparar um conjugado, sendo o método composto de: (a)adicionar um primeiro composto de reagente polimérico (porexemplo, um composto que contenha um primeiro reagentepolimérico) a uma composição de porção de G-CSF sobcondições suficientes para resultar em uma primeiracomposição conjugada (por exemplo, uma composição quecontenha um primeiro conjugado) que englobe um primeiroconjugado com uma porção de G-CSF anexada covalentemente,diretamente ou através de uma primeira porção espaçadoraformada por um ou mais átomos, a um primeiro polímerosolúvel em água; e (b) adicionar uma segunda composição dereagente polimérico (por exemplo, uma composição quecontenha um segundo reagente polimérico) ã primeiracomposição conjugada para resultar em uma segundacomposição conjugada (por exemplo, uma composição quecontenha um segundo conjugado) que englobe um segundopolímero solúvel em água anexado, tanto diretamente quantoatravés de uma segunda porção espaçadora formada por um oumais átomos, ao primeiro polímero solúvel em água doconjugado.
De acordo com o método, um reagente polimérico quepossua uma média de peso molecular relativamente baixa podeser usado para ligação inicial à porção de G-CSF. Apósisso, um reagente polimérico que possua uma média de pesomolecular relativamente alta pode ser usado. Apesar de nãodesejar se limitar pela teoria, acredita-se que, ao usaresta abordagem, o reagente polimérico com média de pesomolecular relativamente baixa possa reagir maiscompletamente com um local estericamente limitado da porçãode G-CSF do que um reagente polimérico de média de pesomolecular relativamente alta. Deste modo, é possívelpreparar mais eficientemente os conjugados desejados.
A modificação baseada em tiol de acordo com estemétodo utiliza reagentes poliméricos que carreguem um oumais grupos funcionais que são capazes de reagir com acadeia lateral que contém o grupo tiol de um resíduo decisteína. Tais reagentes PEG incluem, sem limitação,reagentes PEG ortopiridil dissulfeto, reagentes PEGvinilsulfona, reagentes PEG maleimida e reagentes PEGiodoacetimida. Estes e outros reagentes poliméricos sãofornecidos na Tabela 3.
Os reagentes poliméricos usados de acordo com estemétodo podem ser heterobifuncional ou homobifuncional nanatureza.
0 reagente polimérico com média de peso molecularrelativamente baixa terá uma média de peso molecular nointervalo de cerca de 100 Daltons a cerca de 5.000 Daltons.
Como exemplo, médias de peso molecular neste intervaloincluem: cerca de 100 Daltons, cerca de 150 Daltons, cercade 200 Daltons, cerca de 250 Daltons, cerca de 300 Daltons,cerca de 300 Daltons, cerca de 350 Daltons, cerca de 400Daltons, cerca de 450 Daltons, cerca de 500 Daltons, cercade 600 Daltons, cerca de 700 Daltons, cerca de 800 Daltons,cerca de 900 Daltons, cerca de 1000 Daltons, cerca de 1.500Daltons, cerca de 2.000 Daltons, cerca de 2.500 Daltons,cerca de 3.000 Daltons, cerca de 3.500 Daltons, cerca de4.000 Daltons, cerca de 4.500 Daltons e cerca de 5.000Daltons. Um reagente polimérico exemplar com média de pesomolecular relativamente baixa possui a seguinte estrutura:
Y'-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-Y1 ' Fórmula I
na qual Y' é um grupo eletrofilico ou nucleofilico e Y'' umgrupo reativo adequado para reagir com um grupo funcionalassociado à porção de G-CSF (por exemplo, Y'' pode ser umamaleimida, sulfona ou tiol para reação com um grupo tiolassociado com uma porção de G-CSF, um aldeido, cetona ousuccinimidil para reação com um grupo amina associado a umaporção de G-CSF, e assim por diante) , e (n) é um númerointeiro com valor de 2 a aproximadamente 114,preferivelmente com valor de aproximadamente 3 aaproximadamente 6 (por exemplo, qualquer um dentre 3, 4, 5 e 6).
0 reagente polimérico com uma média de peso molecularrelativamente baixa pode opcionalmente ser monodisperso(embora a monodispersão não seja um requisito). Ao usar umreagente polimérico que é monodisperso, é possível prepararcomposições que contenham conjugados formados por um oumais polímeros solúveis em água ligados covalentemente auma porção de G-CSF, na qual cada polímero solúvel em águapossui (n) monômeros de repetição, e (ii) cada (n) de um oumais polímeros solúveis em água ligados covalentemente àporção de G-CSF em todo conjugado na composição é o mesmo.
0 reagente polimérico com média de peso molecularrelativamente alta terá uma média de peso molecular nointervalo de cerca de 100 Daltons a cerca de 150.000Daltons. Intervalos exemplares, entretanto, incluem médiasde peso molecular no intervalo entre cerca de 5.000 Daltonsa cerca de 100.000 Daltons, no intervalo entre cerca de6.000 Daltons a cerca de 90.000 Daltons, no intervalo entrecerca de 10.000 Daltons a cerca de 85.000 Daltons, nointervalo entre cerca de 10.000 Daltons a cerca de 85.000Daltons, no intervalo entre cerca de 20.000 Daltons a cercade 85.000 Daltons, no intervalo entre cerca de 53.000Daltons a cerca de 85.000 Daltons, no intervalo entre cercade 25.000 Daltons a cerca de 120.000 Daltons, no intervaloentre cerca de 29.000 Daltons a cerca de 120.000 Daltons,no intervalo entre cerca de 35.000 Daltons a cerca de120.000 Daltons e no intervalo entre cerca de 40.000Daltons a cerca de 120.000 Daltons. Um reagente poliméricoexemplar com média de peso molecular relativamente altapossui a seguinte estrutura:
Z1-CH2CH2O(CH2CH2O)nlCH2CH2-Z' ■ (Fórmula II)
na qual Z1' é reativo a Y1 do reagente polimérico com médiade peso molecular relativamente baixa (Fórmula I), Z1 é umgrupo de capeamento na extremidade de um grupo funcional, e(n1) é um número inteiro com valor entre 2 e cerca de3.400. A respeito do reagente polimérico com média de pesomolecular relativamente alta, formas exemplares incluemreagentes poliméricos lineares e ramificados.
Um diagrama para tal abordagem é fornecido abaixo (noqual G-CSF representa um resíduo de uma porção de G-CSF):
Diagrama para preparação de conjugados em uma porção detiol de uma porção de G-CSF
<formula>formula see original document page 73</formula>
Reconhece-se que o diagrama acima é apenas para finsilustrativos e, que (por exemplo) outros reagentespoliméricos podem ser usados de acordo com o método. Assim,por exemplo, reagentes poliméricos podem ser usados deacordo com o diagrama acima para resultar na seguinteestrutura:
<formula>formula see original document page 73</formula>
na qual (n) é um número inteiro de 2 a cerca de 114, n1 éum número inteiro de 2 a cerca de 3.400 e G-CSF é umresíduo de uma porção de G-CSF.
Em um método alternativo para ligação a um resíduo deaminoácido interno, como um resíduo de cisteína (porexemplo, cisteína 17), é possível conduzir a PEGuilação viauma etapa única na qual o grupo reativo (por exemplo, umgrupo tiol reativo como maleimida) é opcionalmentefornecido em um grupo de ligação relativamente longo [porexemplo, um polímero de óxido de etileno, um polímerobiocompatível que contenha, por exemplo, poliaminoácidos(por exemplo, um polímero do mesmo ou diferentesaminoácidos), policarboidratos (por exemplo, um polímero domesmo ou diferentes carboidratos) como polimonossacarídeos,polilactiácidos, e assim por diante e combinações dequaisquer dos mencionados anteriormente]. Opcionalmente, opolímero ligado à porção de G-CSF pode, por sua vez, seranexado a um segundo polímero (por exemplo, um polímeroramificado). Tais reagentes são descritos na literatura,bem como na Patente U.S. N0 6.774.180 e no Pedido dePatente U.S. N0 de Série 10/734.858.
Não importa qual método usado, é preferível realizar ométodo de anexar um polímero solúvel em água à porção de G-CSF em um pH abaixo de 10, mais preferivelmente abaixo de8,5 e ainda mais preferivelmente abaixo de 8,25, ainda queainda mais pref erivelmente abaixo de 8,0, e maispreferivelmente abaixo de 7,5.
Naqueles casos em que um método que usa doisresultados de reagentes poliméricos, um conjugado com aseguinte estrutura é formado:
POLY"- (X2)b-POLY' - (X1)a- (G-CSF)na qual:
POLY" é um segundo polímero solúvel em água(preferivelmente ramificado ou reto);
POLY1 é um primeiro polímero solúvel em água ou umpolímero biocompatível;
X1, quando presente, é uma primeira porção espaçadoraformada por um ou mais átomos;
X2, quando presente, é uma segunda porção espaçadoraformada por um ou mais átomos;
(b) é zero ou um;
(a) é zero ou um; eG-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
A respeito de reagentes poliméricos, aqueles descritosaqui e em outras partes podem ser adquiridos de fontescomerciais (por exemplo, Nektar Therapeutics, Huntsville,AL). Em adição, métodos para preparar os reagentespoliméricos são descritos na literatura.
A ligação entre a porção de G-CSF e o polímero não-peptídico solúvel em água (bem como outras ligações entrediferentes partes dos conjugados descritos aqui, tal comoligação entre dois polímeros solúveis em água) pode serdireta (por exemplo, na qual nenhum átomo de intervençãoestá localizado entre a porção de G-CSF e o polímero), ouindireta (por exemplo, na qual um ou mais átomos estãolocalizados entre a porção de G-CSF e o polímero). Comrelação à ligação indireta, um ou mais átomos(convencionalmente referidos como uma "porção espaçadora"(e identificados como X1, X2 e assim por diante aqui) quepode incluir um ou mais átomos de carbono, átomos denitrogênio, átomos de enxofre, átomos de oxigênio ecombinações dos anteriores) é usado para ligar átomosadjacentes, fornecendo, assim, ligação indireta. A porçãoespaçadora pode conter uma amida, amina secundária,carbamato, tioéter ou grupo dissulfeto. Exemplos não-limitantes de porções espaçadoras específicas incluemaquelas selecionadas a partir do grupo que consiste em -O-,-S-, -S-S-, -CH2-S-S-CH2-, -CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-,-CH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CH2- ,-CH2-CH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CH2-CH2- ,-C (O) -NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CH2-CH2- ,-CH2-CH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH-C(0)-, -C(O)-, -C(O)-NH-,-NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-,-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-,-O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-,-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-,-O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-,-CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-,-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-,-C (0) -NH-CH2-CH2-CH2- , -CH2-C (0) -NH-CH2-CH2- ,-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-,-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-,-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-,-CH2-CH2-CH2-C (0) -NH-CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-CH2-C (0) -NH- ,-C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-,-C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O) -CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-,-CH2-CH2-NH-C(O) -CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-,-CH2-NH-C(O) -CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O) -CH2-CH2-,-C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-,-O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-,-CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-,-CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-,-CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-NH- ,-CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-NH-C(O) -,-CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-NH-C(O) -CH2- ,-CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-NH-C(O) -CH2-CH2-,-O-C (0)-NH-[CH2] h-(OCH2CH2) j-, grupo cicloalquil bivalente,-O-, -S-, um aminoácido, -N(R6)- e combinações de duas oumais de quaisquer anteriores, nas quais R6 é H ou umradical orgânico selecionado a partir do grupo formado poralquil, alquil substituído, alquenil, alquenil substituído,alquinil, alquinil substituído, aril e aril substituído,(h) é zero a seis e (j) é zero a 20. Outras porçõesespaçadoras específicas possuem as seguintes estruturas:-C(O) -NH- (CH2) 1-6-NH-C (O)-NH-C (O) -NH- (CH2) i-6-NH-C (0) - e-O-C (O) -NH- (CH2) 1-6-NH-C (O) - , nas quais os valoressubscritos depois de cada metileno indicam o número demetilenos contido na estrutura, por exemplo, (CH2) ^6significa que a estrutura pode conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6metilenos. Adicionalmente, qualquer uma das porçõesespaçadoras acima podem adicionalmente incluir uma cadeiade oligômero de óxido de etileno composta de 1 a 2 0unidades de monômero de óxido de etileno [por exemplo, -(CH2CH2O) i_20] . Isto é, a cadeia de oligômero de óxido deetileno pode ocorrer antes ou depois da porção espaçadora eopcionalmente entre quaisquer dois átomos de uma porçãoespaçadora composta por dois ou mais átomos. Além disso, acadeia de oligômero não seria considerada parte da porçãoespaçadora se o oligômero estiver adjacente a um segmentodo polímero e meramente representar uma extensão dosegmento do polímero. Em alguns casos, é preferível que aporção espaçadora não inclua dois ou mais resíduos deaminoácidos (por exemplo, a porção espaçadora não inclui-Gly-Gly-).
Composições
Os conjugados são tipicamente parte de uma composição.Geralmente, a composição é formada por uma variedade deconjugados, preferivelmente, embora não necessariamente,cada conjugado é formado pela mesma porção de G-CSF (porexemplo, em uma composição inteira, apenas um tipo deporção G-CSF é encontrado). Em adição, a composição podeser formada por uma variedade de conjugados nos quaisqualquer dado conjugado é formado por uma porçãoselecionada a partir de um grupo de duas ou mais porções deG-CSF diferentes (por exemplo, na composição inteira, duasou mais porções de G-CSF diferentes são encontradas). Demaneira ótima, entretanto, substancialmente todos osconjugados na composição (por exemplo, 85% ou mais davariedade de conjugados na composição) são formados pelamesma porção de G-CSF.
A composição pode englobar uma única espécie deconjugado (por exemplo, um conjugado monoPEGuilado no qualo polímero único é anexado no mesmo local parasubstancialmente todos os conjugados na composição) ou umamistura de espécies de conjugado (por exemplo, uma misturade conjugados monoPEGuilados nos quais a ligação dopolímero ocorre em locais diferentes e/ou uma mistura deconjugados monoPEGuilados, diPEGuilados e triPEGuilados).
As composições também podem englobar outros conjugados comquatro, cinco, seis, sete, oito ou mais polímeros anexadosa qualquer dada porção com atividade G-CSF. Em adição, ainvenção inclui casos em que a composição é formada por umavariedade de conjugados, cada conjugado formado por umpolímero solúvel em água ligado covalentemente a uma porçãode G-CSF, bem como as composições formadas por dois, três,quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais polímeros solúveisem água ligados covalentemente a uma porção de G-CSF.
A respeito dos conjugados na composição, a composiçãosatisfará uma ou mais das seguintes características: aomenos cerca de 85% dos conjugados na composição terão de uma quatro polímeros anexados à porção de G-CSF; ao menoscerca de 85% dos conjugados na composição terão de um atrês polímeros anexados à porção de G-CSF; ao menos cercade 85% dos conjugados na composição terão de um a doispolímeros anexados à porção de G-CSF; ao menos cerca de 85%dos conjugados na composição terão um polímero anexado àporção de G-CSF; ao menos cerca de 95% dos conjugados nacomposição terão de um a quatro polímeros anexados à porçãode G-CSF; ao menos cerca de 95% dos conjugados nacomposição terão de um a três polímeros anexados à porçãode G-CSF; ao menos cerca de 95% dos conjugados nacomposição terão de um a dois polímeros anexados à porçãode G-CSF; ao menos cerca de 95% dos conjugados nacomposição terão um polímero anexado à porção de G-CSF; aomenos cerca de 99% dos conjugados na composição terão de uma quatro polímeros anexados à porção de G-CSF; ao menoscerca de 99% dos conjugados na composição terão de um atrês polímeros anexados à porção de G-CSF; ao menos cercade 99% dos conjugados na composição terão de um a doispolímeros anexados à porção de G-CSF; ao menos cerca de 99%dos conjugados na composição terão um polímero anexado àporção de G-CSF.
Em um ou mais modalidades, é preferível que acomposição que contém o conjugado seja livre ousubstancialmente livre de albumina. Também é preferível quea composição seja livre ou substancialmente livre deproteínas que não possuem atividade G-CSF. Assim, épreferível que a composição seja 85%, mais preferivelmente95% e ainda mais preferivelmente 99% livre de albumina.
Adicionalmente, é preferível que a composição seja 85%,mais preferivelmente 95% e ainda mais preferivelmente 99%livre de qualquer proteína que não tenha atividade G-CSF.Na medida em que a albumina estiver presente na composição,composições exemplares da invenção serão substancialmentelivres de conjugados formados por um polímero poli(etilenoglicol) ligando um resíduo de uma porção de G-CSF àalbumina.
Controle do número desejado de polímeros para qualquerdada porção pode ser alcançado selecionando-se o reagentepolimérico apropriado, a proporção de reagente poliméricopara a porção de G-CSF, temperatura, condições de pH eoutros aspectos da reação de conjugação. Em adição, reduçãoou eliminação dos conjugados indesejados (por exemplo,aqueles conjugados com quatro ou mais polímeros anexados)pode ser conseguida através de meios de purificação.
Por exemplo, os conjugados polímero-porção de G-CSFpodem ser purificados para obter/isolar diferentes espéciesde conjugados. Especificamente, a mistura do produto podeser purificada para obter uma média de qualquer númerodentre uma, duas, três, quatro, cinco ou mais PEGs porporção de G-CSF, tipicamente uma, duas ou três PEGs porporção de G-CSF. A estratégia para purificação da misturade reação de conjugado final dependerá de uma série defatores, incluindo, por exemplo, o peso molecular doreagente polimérico empregado, a porção de G-CSFparticular, o regime de dosagem desejado e a atividaderesidual e propriedades in vivo do(s) conjugaodo(s)individual(is).
Se desejado, conjugados com diferentes pesosmoleculares poderão ser isolados usando cromatografia defiltração de gel e/ou cromatograf ia de troca de íon. Istoquer dizer que a cromatografia de filtração de gel é usadapara fracionar razões de polímero para porção de G-CSFdiferentemente numeradas (por exemplo, 1-mer, 2-mer, 3-mere assim por diante, em que "1-mer" indica 1 polímeroanexado a uma porção de G-CSF, "2-mer" indica doispolímeros anexados a um porção de G-CSF e assim por diante)com base em seus diferentes pesos moleculares (onde adiferença corresponde essencialmente ao peso molecularmédio da porção de polímero solúvel em água). Por exemplo,em uma reação exemplar na qual uma proteína de 35.000Daltons é aleatoriamente conjugada a um reagente poliméricocom peso molecular de cerca de 20.000 Daltons, a mistura dereação resultante pode conter proteína não-modificada (compeso molecular de cerca de 35.000 Daltons), proteínamonoPEGilada (com peso molecular de cerca de 55.000Daltons), proteína diPEGilada (com peso molecular de cercade 75.000 Daltons) e assim por diante.
Embora esta abordagem possa ser usada para separar PEGe outros conjugados polímero-porção de G-CSF com diferentespesos moleculares, esta abordagem é geralmente ineficazpara separar isoformas posicionais com diferentes locais deligação de polímero dentro da porção de G-CSF. Por exemplo,a cromatografia de filtração de gel pode ser usada paraseparar mutuamente misturas de 1-mers, 2-mers, 3-mers eassim por diante, embora cada uma das composições deconjugados recuperadas possa conter PEG(s) anexados adiferentes grupos reativos (por exemplo, resíduos delisina) dentro da porção de G-CSF.
Colunas de filtração de gel adequadas para realizareste tipo de separação incluem colunas Superdex™ eSephadex™ disponíveis na Amersham Biosciences (Piscataway,NJ). A seleção de uma coluna particular dependerá dointervalo de fracionamento desejado. A eluição é geralmenterealizada usando um tampão adequado, como fosfato, acetatoou semelhante. As frações coletadas podem ser analisadaspor uma série de métodos diferentes, por exemplo, (i)absorvância a 280 nm para conteúdo de proteína, (ii)análise de proteína baseada em coloração usando albumina desoro bovino (BSA) como padrão, (iii) teste de iodo paraconteúdo de PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfatododecil sódio (SDS PAGE), seguida por coloração com iodetode bário e (v) cromatografia líquida de alta performance(HPLC).
A separação de isoformas posicionais é realizada porcromatografia de fase reversa usando cromatografia líquidade alta performance e fase reversa (RP-HPLC) com uma colunaadequada (por exemplo, uma coluna C18 ou C3, disponívelcomercialmente de empresas como a Amersham Biosciences ouVydac) ou por cromatograf ia de troca de íon usando umacoluna de troca de íon, por exemplo, uma coluna de troca deíon Sepharose™ disponível de Amersham Biosciences. Tantouma quanto a outra abordagem pode ser usada para separarisômeros de agente ativos em polímeros com o mesmo pesomolecular (por exemplo, isoformas posicionais).
As composições são preferivelmente substancialmentelivres de proteínas que não tenham atividade G-CSF. Emadição, as composições são preferivelmente substancialmentelivres de todos os outros polímeros solúveis em água nãocovalentemente ligados. Em algumas circunstâncias,entretanto, a composição pode conter uma mistura deconjugados polímero-porção G-CSF e porção G-CSF nãoconjugada.
Em contraste às composições formadas pelos métodosdescritos no Pedido de Patente US Número de Publicação2005/0143563, as composições de conjugado presentementedescritas são livres ou substancialmente livres deagregados. Conseqüentemente, as composições da invenção sãolivres ou substancialmente livres (por exemplo, menos decerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de15%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10%,ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 9%, aindamais preferivelmente menos do que cerca de 8%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de / o , ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 6 %, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 5%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 4%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 3%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 2%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 1% e com menos do quecerca de 0,5% sendo o mais preferível) de agregados.
Uma abordagem para tratar da formação de agregadoinativo é descrita no Pedido de Patente US Número dePublicação 2005/0143563. Esta referência descrevetratamento com uma pequena quantidade de detergente SDS,Tween2 0, Tween8 0 necessário para evitar que agregados sejamformados. Vantajosamente, as composições e os conjugados dapresente invenção podem ser preparados sem realizar o passode adicionar SDS, Tween20 e Tween80. Em adição, composiçõese conjugados da presente invenção podem ser preparados semrealizar o passo de adicionar um detergente. Além disso, ascomposições da presente invenção são livres ousubstancialmente livres (por exemplo, menos de cerca de20%, mais preferivelmente menos do que cerca de 15%, aindamais preferivelmente menos do que cerca de 10%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 9% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 8% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 7% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 6% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 5% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 4% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 3% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 2% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 1% ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 0,5 %, com menos do que cerca de 0,001% sendo o mais preferível) de detergentescomo SDS, Tween20 e Tween80. Em adição, as composições e osconjugados da presente invenção podem ser preparados semrealizar o passo de remoção (através de, por exemplo,ultra-filtração) de detergentes como SDS, Tween20 eTween80. Além disso, as composições e os conjugados dapresente invenção podem ser preparados sem realizar o passode remoção (através de, por exemplo, ultra-filtração) de umdetergente.
Em contraste à abordagem para formar conjugados noPedido de Patente Internacional Número de Publicação WO05/099769, a abordagem para preparar conjugados ecomposições da invenção não inclui o passo de denaturar G-CSF para expor o grupo tiol de Cis-17. Preferivelmente, ospresentes métodos para formar conjugados e composições nãoincluem o passo de adicionar (e não são realizados napresença de) um agente de denaturação como, por exemplo,agentes de denaturação selecionados a partir do grupoformado por uréia, cloreto de guanidina ou isotiocianato,dimetiluréia, altas concentrações de sal neutro e solventes(como por exemplo, acetonitrila, álcoois, ésteresorgânicos, dimetilsulfóxido). Como mostrado nos
Experimentos, nenhum passo de denaturação é necessário paraobter conjugados de G-CSF no resíduo de Cis-17.
Além do mais, as composições da presente invenção sãolivres ou substancialmente livres (por exemplo, menos decerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de15%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10%,ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 9%, aindamais preferivelmente menos do que cerca de 8%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 7 Sr / O , ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 6%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 5%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 4%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 3%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 2%, ainda maispreferivelmente menos do que cerca de 1% e com menos do quecerca de 0,5% sendo o mais preferível) de agente dedenaturação. Em adição, as composições e os conjugados dapresente invenção podem ser preparados sem realizar o passode expor o conjugado a condições de renaturação (tais como,por exemplo, ultra-filtração ou métodos cromatográficos).
Opcionalmente, a composição da invenção aindacompreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Sedesejado, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode seradicionado a um conjugado para formar uma composição.Excipientes exemplares incluem, sem limitação, aquelesselecionados do grupo formado por carboidratos, saisinorgânicos, agentes antimicrobianos, antioxidantes,surfactantes, tampões, ácidos, bases e combinações dosmesmos.
Um carboidrato como um açúcar, um açúcar derivado comoum alditol, ácido aldônico, um açúcar esterifiçado e/ou umpolímero de açúcar pode estar presente como um excipiente.
Excipientes de carboidratos específicos incluem, porexemplo, monossacarídeos como frutose, maltose, galactose,glicose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeoscomo lactose, sacarose, trealose, celobiose e semelhantes;polissacarídeos como rafinose, melezitose, maltodextrinas,dextranas, amidos e semelhantes e alditóis como manitol,xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol),piranosil sorbitol, mioinositol e semelhantes.
O excipiente também pode incluir um sal inorgânico outampão como ácido cítricô, cloreto de sódio, cloreto depotássio, sulfato de sódio, nitrato de potássio, fosfato desódio monobásico, fosfato de sódio dibásico e combinaçõesdos mesmos.
A composição também pode incluir um agenteantimicrobiano para prevenir ou impedir o crescimentomicrobiano. Exemplos não limitantes de agentesantimicrobianos adequados para uma ou mais modalidades dapresente invenção incluem cloreto de benzalcônio, cloretode benzetônio, benzil álcool, cloreto de cetilpiridínio,clorobutanol, fenol, feniletil álcool, nitratofenilmercúrico, timersol e combinações dos mesmos.
Um antioxidante pode estar presente na composiçãotambém. Antioxidantes são usados para evitar a oxidação,evitando, assim, a deterioração do conjugado ou outroscomponentes da preparação. Antioxidantes adequados para usoem uma ou mais modalidades da presente invenção incluem,por exemplo, palmitato de ascorbila, hidroxianisolabutilada, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso,monotioglicerol, propil gaiato, bissulfito de sódio,sulfoxilato de formaldeido de sódio, metabissulfito desódio e combinações dos mesmos.
Em algumas situações, um surfactante pode estarpresente como um excipiente. Surfactantes exemplaresincluem: polisorbatos como "Tween 20" e "Tween 80" epluronicos como F68 e F88 (ambos disponíveis de BASF, MountOlive, New Jersey); ésteres de sorbitano; lipidios comofosfolipidios tais como lecitina e outrasfosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (emborapreferivelmente não em forma lipossomal), ácidos graxos eésteres graxos; esteróides como colesterol e agentesquelantes como EDTA, zinco e outros cátions adequados.
Ácidos ou bases podem estar presentes como umexcipiente na composição. Exemplos não limitantes de ácidosque podem ser usados incluem aqueles ácidos selecionados dogrupo formado de ácido clorídrico, ácido acético, ácidofosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico,ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácidoperclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácidofumárico e combinações dos mesmos. Exemplos de basesadequadas incluem, sem limitação, bases selecionadas apartir do grupo formado por hidróxido de sódio, acetato desódio, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, acetatode amônio, acetato de potássio, fosfato de sódio, fosfatode potássio, citrato de sódio, formiato de sódio, sulfatode sódio, sulfato de potássio, furaarato de potássio ecombinações dos mesmos.
A quantidade do conjugado (por exemplo, o conjugadoformado entre o agente ativo e o reagente polimérico) nacomposição variará dependendo de numerosos fatores, masserá otimamente uma dose terapeuticamente eficaz quando acomposição for armazenada em um recipiente de dose unitária(por exemplo, um frasco). Em adição, a preparaçãofarmacêutica pode ser colocada em uma seringa. Uma doseterapeuticamente eficaz pode ser determinadaexperimentalmente através da administração repetida dequantidades crescentes do conjugado para determinar qualquantidade produz um desfecho clínico desejável.
A quantidade de qualquer excipiente individual nacomposição variará dependendo da atividade do excipiente enecessidades particulares da composição. Tipicamente, aquantidade ótima de qualquer excipiente individual édeterminada através de experimentação de rotina, isto é,preparando composições contendo quantidades variadas doexcipiente (variando de baixa a alta), examinando aestabilidade e outros parâmetros e, então, determinando ointervalo no qual a performance ótima é atingida semefeitos adversos significantes.
Geralmente, entretanto, o excipiente estará presenteno composto em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 99%por peso, preferivelmente de cerca de 5% a cerca de 98% porpeso, mais pref erivelmente de cerca de 15% a cerca de 95%por peso do excipiente, com concentrações menores que 30%por peso sendo as mais preferíveis.
Estes excipientes farmacêuticos citados, junto comoutros excipientes, estão descritos em "Remington: TheScience & Practice of Pharmacy", 19a ed. , Williams &Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52a ed.,Medicai Economics, Montvale, NJ (1998) e Kibbe, A.H.,Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Edition, AmericanPharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
As composições englobam todos os tipos de formulaçõese, em particular, aquelas que são adequadas para injeção,por exemplo, pós ou liofilizados que podem serreconstituídos, bem como líquidos. Exemplos de diluentesadequados para reconstituir composições sólidas antes dainjeção incluem água bacteriostática para injeção, dextrosea 5% em água, salina tamponada com fosfato, solução deRinger, salina, água esterilizada, água deionizada ecombinações das mesmas. A respeito das composiçõesfarmacêuticas líquidas, soluções e suspensões sãoimaginadas.
As composições de uma ou mais modalidades da presenteinvenção são tipicamente, embora não necessariamente,administrados via injeção e são, portanto, geralmentesoluções ou suspensões líquidas imediatamente antes daadministração. A preparação farmacêutica também pode tomaroutras formas como xaropes, cremes, ungüentos, comprimidos,pós e semelhantes. Outros modos de administração tambémestão incluídos, tais como pulmonar, retal, transdérmico,transmucosa, oral, intratecal, subcutâneo, intra-arterial eassim por diante.
A invenção também fornece um método para administrarum conjugado como fornecido aqui a um paciente que sofre deuma condição que é responsiva a tratamento com um conjugadocomo fornecido aqui. 0 método inclui administrar a umpaciente, geralmente via injeção, uma quantidadeterapeuticamente eficaz do conjugado (preferivelmentefornecido como parte de uma composição farmacêutica). Comodescrito antes, os conjugados podem ser administrados porvia parenteral através de injeção intravenosa ou menospreferivelmente através de injeção intramuscular ousubcutânea. Os tipos de formulação adequados paraadministração parenteral incluem soluções prontas parainjeção, pós secos para combinação com um solvente antes douso, suspensões prontas para injeção, composições secasinsolúveis para combinação com um veiculo antes do uso eemulsões e concentrados líquidos para diluição antes daadministração, entre outros.
0 método de administração pode ser usado para tratarqualquer condição que possa ser remediada ou prevenida pelaadministração do conjugado. Aqueles com habilidades comunsna especialidade reconhecem quais condições os conjugadosda invenção podem efetivamente tratar. Por exemplo, osconjugados podem ser usados para tratar pacientes recebendoquimioterapia mielossupressiva, um transplante de medulaóssea, neutropenia crônica severa, síndrome daimunodeficiência adquirida (AIDS), anemia aplástica,leucemia de células pilosas, mielodisplasia, agranulocitose(por exemplo, agranulocitose induzida por medicamento,agranulocitose congênita e neutropenia neonatal aloimune).
Em adição, os conjugados podem ser usados em pacientes comnecessidade de coleção de célula progenitora de sangueperiférico. Vantajosamente, um conjugado pode seradministrado ao paciente antes da, simultaneamente com ouapós administração de outro agente ativo.
A dose real a ser administrada irá variar dependendoda idade, peso, e condição geral do indivíduo bem como daseveridade da condição que está sendo tratada, dojulgamento do profissional de saúde, e do conjugado queestá sendo administrado. Quantidades eficazes do ponto devista terapêutico são conhecidas daqueles que têmhabilidade na especialidade e/ou estão descritas nos textosde referência e na literatura pertinentes. Geralmente, aquantidade terapeuticamente eficaz irá variar de 0,001 mg a100 mg, preferivelmente em doses de 0,01 mg/dia a 75 mg/diae mais preferivelmente em doses de 0,10 mg/dia a 50 mg/dia.
Uma determinada dose pode ser administrada periodicamenteaté que, por exemplo, uma contagem desejada (por ex. ,saudável) de glóbulos brancos do sangue seja alcançada.
A dosagem unitária de qualquer conjugado(preferivelmente fornecida como parte de uma preparaçãofarmacêutica) pode ser administrada em uma variedade deesquemas de dosagem dependendo do julgamento do médico, dasnecessidades do paciente, e assim por diante. 0 esquema dedosagem específico será conhecido para aqueles comhabilidade comum na especialidade ou pode ser determinadaexperimentalmente pelo uso de métodos de rotina. Esquemasde dosagem exemplares incluem, sem limitação, aadministração uma vez ao dia, três vezes por semana, duasvezes por semana, uma vez por semana, duas vezes por mês,uma vez por mês e qualquer combinação dos mesmos. Uma vezque o desfecho clínico seja alcançado, a dosagem dacomposição é interrompida.
Uma vantagem de administrar certos conjugados aquidescritos é que porções individuais de polímeros solúveisem água podem ser clivadas. Esse resultado é vantajosoquando a liberação do corpo é um problema potencial porcausa do tamanho do polímero. De modo ótimo, a clivagem decada porção de polímero solúvel em água é facilitada pelouso de ligações fisiologicamente cliváveis e/ouenzimaticamente degradáveis tal como amido, carbonato ouligações contendo ésteres. Desse modo, a liberação doconjugado (via clivagem de porções de polímero individuaissolúveis em água) pode ser modulada pela escolha do tamanhomolecular do polímero e do tipo de grupo funcional quefornece as propriedades de liberação desejadas. Aqueles comhabilidades comuns na especialidade podem determinar otamanho molecular apropriado do polímero bem como o grupofuncional clivável. Por exemplo, aqueles com habilidadescomuns na especialidade usando experimentação de rotinapodem determinar um tamanho molecular apropriado e grupofuncional clivável preparando primeiro uma variedade dederivados de polímero com diferentes pesos de polímero egrupos funcionais cliváveis e, então, obtendo o perfil deliberação (por exemplo, através de amostragem periódica desangue ou urina) pela administração do derivado de polímeroa um paciente e obtendo amostras periódicas de sangue e/ouurina. Uma vez que uma série de perfis de liberação sejaobtida para cada conjugado testado, um conjugado adequadopode ser identificado.
Deve ser entendido que embora a invenção tenha sidodescrita em conjunto com as suas modalidades específicaspreferidas, a descrição precedente bem como os exemplos queseguem pretendem ilustrar e não limitar o escopo dainvenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentrodo escopo da invenção serão aparentes àqueles capacitadosna técnica à qual a invenção pertence.
EXPERIMENTAL
A prática da invenção empregará, a menos que sejaindicado de outra forma, técnicas convencionais de sínteseorgânica, bioquímica, purificação de proteína e similaresque estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicassão explicadas completamente na literatura. Veja, porexemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: ReactionsMechanisms and Structure, 4a Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992), supra.
Nos exemplos a seguir, foram feitos esforços paraassegurar a exatidão em relação aos números usados (porexemplo, quantidades, temperaturas, etc.) mas deve serlevada em consideração a ocorrência de algum erro e desvioexperimental. A menos que seja indicado de outra forma, atemperatura é em graus Cea pressão é a atmosférica aonível do mar ou próximo a ela. Cada um dos seguintesexemplos é considerado como sendo instrutivo para aquelesversados na técnica levarem a cabo uma ou mais dasmodalidades descritas aqui.
O fator estimulador da colônia de granulócitos humanosmetionil recombinante (G-CSF) é uma proteína nãoglicosilada produzida pela E. coli e foi usada nos Exemplosde 1 a 5. A proteína recombinante consiste em 175aminoácidos com uma cisteína livre na posição 17 (ignorandoo resíduo de metionina principal). A seqüência completa doaminoácido é a seguinte:
MTPLGPASSL PQSFLLKCLE QVRKIQGDGA ALQEKLCATY KLCHPEELVLLGHSLGIPWA PLSSCPSQAL QLAGCLSQLH SGLFLYQGLL QALEGISPELGPTLDTLQLD VADFATTIWQ QMEELGMAPA LQPTQGAMPA FASAFQRRAGGVLVASHLQS FLEVSYRVLR HLAQP,e corresponde a SEQ ID N0: 1, onde n'11 é 1.
Análise SDS-PAGE
Quando a análise SDS-PAGE foi conduzida, amostrasforam analisadas por eletroforese de gel de sódio dodecilsulfato - poliacrilamida (SDS-PAGE) usando o sistema Bio-Rad (Mini-PROTEAN III Precast Gel Electrophoresis System) eo sistema Invitrogen (XCell SureLock Mini-Cell). Asamostras foram misturadas com o tampão da amostra. Então,as amostras preparadas foram carregadas sobre um gel erodadas por aproximadamente trinta minutos.
Análise RP-HPLC
Quando a análise RP-HPLC foi conduzida para osExemplos IA, 2B, 3A e 6, foi realizada uma cromatograf ialíquida de alta performance em fase reversa (RP-HPLC) sobreum sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent) . As amostras foramanalisadas usando uma coluna PRP-3 (tamanho de partícula de3pm, 75 x 4,6 mm, Hamilton) e fases móveis consistindo em0,1% de ácido trifluoroacético em água (tampão A) e 0,1% deácido trifluoroacético em acetonitrila (tampão B) . A taxade fluxo para a coluna foi de 0,5 ml/min. Os conjugados deproteína e PEG-proteína foram eluídos com um gradientelinear durante 4 0 minutos, e foram visualizados usando-sedetecção de UV a 280 nm.
Quando a análise RP-HPLC foi conduzida para osExemplos 1B, IC e 1D, a cromatograf ia líquida de altaperformance em fase reversa (RP-HPLC) foi realizada sobreum sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent) . As amostras foramanalisadas usando uma coluna Zorbax 3 00SB-C3 (tamanho departícula de 3,5 pm, 150 mm x 3,0 mm, Agilent) , e fasesmóveis consistindo em 0,1% de ácido trifluoroacético emágua (tampão A) e 0,1% de ácido trif luoroacético emacetonitrila (tampão B). A taxa de fluxo para a coluna foide 0,3 ml/min. Os conjugados de proteína e PEG-proteínaforam eluídos com um gradiente linear durante 3 5 minutos eforam detectados usando UV a 28 0 nm.
Quando presentes, os dímeros identificados através deRP-HPLC indicam agregados de dímero de proteína (e falta dequalquer componente polimérico).
Cromatografia de Troca de Cátion
Quando a cromatografia de troca de cátion foiconduzida, uma coluna de troca de cátion HiTrap SPSepharose HP (Amersham Biosciences) foi usada com o sistemaAKTAprime (Amersham Biosciences) para purificar osconjugados PEG-G-CSF. Para cada solução de conjugadopreparada, a solução de conjugado foi carregada em umacoluna que foi pré-equilibrada em tampão NaOAc 2 0 mM, pH4,0 (tampão A) e, então, lavada com dez volumes de colunade tampão A para remover qualquer reagente PEG não reagido.Subseqüentemente, um gradiente do tampão A com 0-100% detampão B (NaOAc 20mM com tampão NaCl 1,0 M, pH 4,0) foielevado. 0 eluente foi monitorado por detector de UV a 280nm. As frações foram reunidas e a pureza do conjugadoindividual foi determinada por RP-HPLC ou SDS-PAGE.
Rendimentos Percentuais e Soluções de Conjugado
Os rendimentos percentuais de PEGuilação referem-se arendimento de espécies monoPEGiladas. Os termos "solução deconjugado" e "mistura de reação" são os sinônimos e ambosrepresentam a composição resultante do processo ou reaçãodescrito.
Exemplo IA
PEGuilação de G-CSF com um Reagente mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear (mPEG-OPSS), IOkDa
Reagente mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear ("mPEG-OPSS"),IOkDa
0 mPEG-OPSS, IOkDa, armazenado a -20° C sob argônio,foi aquecido à temperatura ambiente. Um excesso decinqüenta vezes (relativo ao teor de G-CSF em uma alíquotamedida do estoque de solução G-CSF) do mPEG-OPSS aquecidofoi dissolvido em dimetilsulfoxido ("DMSO") para formar umasolução de reagente a 10%. A solução de reagente a 10% foirapidamente adicionada à alíquota da solução G-CSF deestoque (0,4 mg/ml em tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) emisturada bem. Para permitir o acoplamento do mPEG-OPSS aoresíduo de cisteína livre (i.e., não participando daligação intraproteína-dissulfeto) na posição 17 de G-CSFvia ligação dissulfeto, a solução de reação foi colocada emum RotoMix (Type 4 82 00, Thermolyne, Dubuque IA) parafacilitar a conjugação à 37° C. Após trinta minutos, outroexcesso de cinqüenta vezes de mPEG-OPSS, IOkDa, foiadicionado à solução de reação, seguido de mistura primeiropor trinta minutos a 37° C e, então, por duas horas emtemperatura ambiente para, desse modo, formar uma soluçãode conjugado de mPEGlOkDa-G-CSF. A solução de conjugadomPEGlOkDa-G-CSF foi caracterizada por SDS-PAGE e RP-HPLC.
A FIG. 1 mostra o cromatograma seguinte a análise RP-HPLC da solução de conjugado mPEGlOkDa-G-CSF. A reação dePEGuilação rendeu 3 6% do conjugado mPEGlOkDa-G-CSF (umconjugado monoPEGuilado em um resíduo de cisteína de G-CSF). A FIG. 2 mostra a análise SDS-PAGE da solução deconjugado mPEGlOkDa-G-CSF. A cromatografia de troca decátion foi usada para purificar o conjugado. A FIG. 3mostra o cromatograma depois da purificação de troca decátion.
Usando essa mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando mPEG-OPSS com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo IB
PEGuilação de G-CSF com um Reagente mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear (mPEG-OPSS), IOkDa
Reagente mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear ("mPEG-OPSS"),IOkDa
mPEG-OPSS, IOkDa, armazenado a -2 0° C sob argônio foiaquecido à temperatura ambiente. Um excesso de cinqüentavezes (relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquotamedida da solução de G-CSF em estoque) de mPEG-OPSSaquecido foi dissolvido em DMSO a 50% para formar umasolução de reagente a 10%. A solução de reagente a 10% foirapidamente adicionada à alíquota da solução G-CSF deestoque (3,0 mg/ml em tampão de fosfato de sódio IOmM, 1%(peso/volume) de sucrose, pH 6,7) e misturada bem. Parapermitir o acoplamento do mPEG-OPSS ao resíduo de cisteínalivre (i.e., não participando da ligação intraproteína-dissulfeto) na posição 17 de G-CSF via uma ligaçãodissulfeto, a solução de reação foi colocada era um RotoMix(Type 4 82 00, Thermolyne, Dubuque IA) para facilitar aconjugação por uma hora à 37° C e, então, durante a noite àtemperatura ambiente para, desse modo, formar uma soluçãode conjugado mPEGlOkDa-G-CSF. A solução de conjugadomPEGlOkDa-G-CSF foi caracterizada por SDS-PAGE e RP-HPLC.
A FIG. 4 mostra o cromatograma seguinte a análise RP-HPLC da solução de conjugado. A reação de PEGuilação rendeu34% de conjugado mPEGlOK-G-CSF.
A FIG. 5 mostra a análise SDS-PAGE da solução deconjugado.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando raPEG-OPSS com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo IC
PEGuilação de G-CSF com Reagente
mPEG-OrtopiridiI-Dissulfeto Linear (mPEG-OPSS), IOkDa
Reagente mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear ("mPEG-OPSS"),IOkDa
mPEG-OPSS, IOkDa, armazenado a -20° C sob argônio, foiaquecido à temperatura ambiente. 0 mPEG-OPSS (3 7mg)aquecido foi dissolvido em acetonitrila para formar umasolução de reagente. A solução de reagente foi rapidamenteadicionada a 1 ml de solução de G-CSF (0,5 mg/ml em tampãode fosfato de sódio, pH 6,9) e misturada bem. Para permitiro acoplamento do mPEG-OPSS ao resíduo de cisteína livre(i.e., não participando da ligação intraproteína-dissulfeto) na posição 17 de G-CSF via uma ligaçãodissulfeto, a solução de reação foi colocada em um RotoMix(Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) para facilitar aconjugação por 3 0 minutos à 37° C e, então, por duas horasa temperatura ambiente para, desse modo, formar uma soluçãode conjugado mPEGlOkDa-G-CSF. A solução de conjugadomPEGlOkDa-G-CSF foi caracterizada por RP-HPLC.
A FIG. 6 mostra o cromatograma depois da análise deRP-HPLC da solução de conjugado mPEGlOkDa-G-CSF. A reaçãode PEGuilação rendeu 56% de conjugado mPEGlOK-G-CSF.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando mPEG-OPSS com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo ID
PEGuilação de G-CSF com um Reagente
mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear (mPEG-OPSS), IOkDa
Reagente mPEG-Ortopiridil-Dissulfeto Linear, IOkDa ("mPEG-OPSSm)
mPEG-OPSS, IOkDa, armazenado a -20° C sob argônio, foiaquecido à temperatura ambiente. 0 mPEG-OPSS (17 mg)aquecido foi dissolvido em acetonitrila para formar umasolução de reagente. A solução de reagente foi rapidamenteadicionada a 0,2 ml de solução de G-CSF (0,3 mg/ml emtampão fosfato de sódio IOmM, 1% (peso/volume) de sucrose,pH 7,0) e misturada bem. Para permitir o acoplamento domPEG-OPSS ao resíduo de cisteína livre (i.e., nãoparticipando da ligação intraproteína-dissulfeto) naposição 17 de G-CSF via ligação dissulfeto, a solução dereação foi colocada em um RotoMix (Type 48200, Thermolyne,Dubuque IA) para facilitar a conjugação por uma hora à 37°C e, então, por duas horas à temperatura ambiente para,desse modo, formar um mPEGlOkDa-G-CSF. A solução deconjugado mPEGlOkDa-G-CSF foi caracterizada por RP-HPLC.
A FIG. 7 mostra o cromatograma depois da análise deRP-HPLC da solução de conjugado mPEGlOkDa-G-CSF. A reaçãode PEGuilação rendeu 73% de conjugado mPEGlOK-G-CSF.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando mPEG-OPSS com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo 2A
PEGuilação de G-CSF com um Reagente PEG-Diortopiridyl-Dissulfeto Linear, 2kDa,
e um Reagente mPEG-Tiol Linear, 20kDa
Reagente PEG-Diortopiridil-Dissulfeto Linear, 2kDa ("PEG-DiOPSS")
Reagente mPEG-Tiol Linear, 20kDa ("mPEG-SH")
Este exemplo (bem como o Exemplo 2B) recorreu a umaabordagem que envolve a anexação inicial de um reagentepolimérico, com um peso molecular médio ponderadorelativamente pequeno, a uma porção de G-CSF seguida pelaanexação de um reagente polimérico de peso molecular médioponderado relativamente grande à porção polimérica doconjugado formado a partir da anexação do reagentepolimérico de peso molecular médio ponderado relativamentepequeno à porção de G-CSF. Ao usar essa abordagem, foipossível modificar o resíduo de cisteína contendo tiollivre parecialmente enterrado do G-CSF. 0 PEG-DiOPSS, 2kDa,bifuncional, foi essencialmente inserido no tiol livreestericamente obstruído através de uma ligação dissulfeto,seguida pelo acoplamento de um PEG com terminação tiol aoresíduo exposto do reagente PEG-OPSS, 2kDa por meio deoutra ligação dissulfeto.
Esquematicamente, a abordagem é mostrada abaixo [ondeo reagente polimérico com um peso molecular médio ponderadorelativamente baixo "PEGB" é inicialmente anexado a umaporção a ser conjugada (A) , seguido de anexação de umreagente polimérico de peso molecular médio ponderado maisalto (PEGa no esquema) à porção polimérica do conjugadoformado a partir da anexação do reagente de peso molecularmédio ponderado baixo à porção de conjugado] . Observe queas estruturas apresentadas abaixo são meramenteilustrativas e reagentes poliméricos de estruturas variadaspodem ser usados.
<formula>formula see original document page 101</formula>
PEG-DiOPSS, 2kDa, armazenado a -20° C sob argônio, foiaquecido à temperatura ambiente. Um excesso de cinqüentavezes (relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquotamedida da solução de G-CSF de estoque) do PEG-DiOPSSaquecido foi dissolvido em DMSO para formar uma solução dereagente a 10%. A solução de reagente a 10% foi rapidamenteadicionada ã alíquota da solução de G-CSF de estoque (0,4mg/ml em tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) e misturadabem. Para facilitar a conjugação do PEG-DiOPSS ao resíduode cisteína livre (i.e., não participando da ligaçãointraproteína-dissulf eto) na posição 17 de G-CSF via umaligação dissulfeto, a solução de reação foi colocada em umRotoMix (Type 4 82 00, Thermolyne, Dubuque IA) e deixadamisturar por uma hora a 37° C e, então, por duas horas àtemperatura ambiente para, desse modo, resultar em umamistura de reação PEG2kDa-G-CSF. Depois de a reação estarcompleta, a solução de reação foi dializada contra umtampão de fosfato de sódio, pH 7,0, para remover o excessode PEG-DiOPSS livre. Um excesso de cinqüenta vezes de mPEG-SH, 20kDa (relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquotamedida da solução de G-CSF de estoque) foi, então,adicionado à solução de conjugado dializada, seguida demistura por uma hora ã temperatura ambiente e, então,durante a noite a 4o C para, desse modo, formar uma soluçãode conjugado mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF. A solução deconjugado mPEG2 OkDa-PEG2kDa-G-CSF foi caracterizada porSDS-PAGE e RP-HPLC.
A FIG. 8 mostra a análise SDS-PAGE da solução deconjugado mPEG2OkDa-PEG2kDa-G-CSF. 0 primeiro passo daPEGuilação com PEG-diOPSS rendeu 58% de conjugado PEG2kDa-G-CSF, enquanto o segundo passo da reação com mPEG-SHrendeu 42% de conjugado mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF.
A cromatografia de troca de cátion foi usada parapurificar o conjugado final. A FIG. 9 mostra o cromatogramadepois de purificação por troca de cátion.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando PEG-OPSS e mPEG-SH com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo 2B
PEGuilação de G-CSF com iam Reagente PEG-Diortopiridil-Dissulfeto Linear, 2kDa,
e um Reagente mPEG-Tiol Linear, 20kDa
Reagente mPEG-Tiol Linear, 20kDa ("mPEG-SH")
PEG-DiOPSS, 2kDa, armazenado a -20° C sob argônio, foiaquecido à temperatura ambiente. Um excesso de cem vezes(relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquota medida dasolução de G-CSF de estoque) do PEG-DiOPSS aquecido foidissolvido em DMSO para formar uma solução de reagente a10%. A solução de reagente a 10% foi rapidamente adicionadaà alíquota da solução de G-CSF de estoque (0,5 mg/ml emtampão de fosfato de sódio, pH 7,0) e misturada bem. Parafacilitar a conjugação do PEG-DiOPSS ao resíduo de cisteínalivre (i.e., não participando da ligação intraproteína-dissulfeto) na posição 17 de G-CSF via uma ligaçãodissulfeto, a solução de reação foi colocada em um RotoMix(Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) e deixada misturar poruma hora a 37° C e, então, por três horas e meia atemperatura ambiente. Depois de a reação estar completa, asolução de reação foi dializada contra um tampão de fosfatode sódio, pH 7,0 para remover o excesso de PEG-DiOPSSlivre. Depois, um excesso de cem vezes de mPEG-SH, 20kDa(relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquota medida dasolução de G-CSF de estoque) foi, então, adicionado àsolução de conjugado dializada, seguida de mistura durantea noite à temperatura ambiente para, desse modo, formar umasolução de conjugado mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF. A solução deconjugado mPEG2 OkDa-PEG2kDa-G-CSF foi caracterizada porSDS-PAGE e RP-HPLC.
A FIG. 10 mostra o cromatograma depois da análise RP-HPLC da solução de conjugado. A reação de PEGuilação rendeu25% de conjugado mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF.
Um método de cromatografia por troca de cátion usandomeios de troca SP Sepharose High Performance (AmershamBiosciences, Uppsala Sweden) e tampão NaOAc foi usado parapurificar o conjugado mPEG20kDa-PEG2kDa-G-CSF.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando PEG-DiOPSS e mPEG-SH com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo 3A
PEGuilação de G-CSF com Reagente PEG-Diortopiridil-Dissulfeto Linear, 2kDa,
e um Reaaente mPEG-Tiol Linear- 3OkDaReagente PEG-Diortopiridil-Dissulfeto Linear, 2kDa ("PEG-DiOPSS")
Reagente mPEG-Tiol Linear, 30kDa ("mPEG-SH")
Este exemplo (bem como o Exemplo 3B) recorreu a umaabordagem que envolve a anexação inicial de um reagentepolimérico com um peso molecular médio ponderadorelativamente pequeno, a uma porção de G-CSF seguida pelaanexação de um reagente polimérico de peso molecular médioponderado relativamente grande à porção polimérica doconjugado formado a partir da anexação do reagentepolimérico de peso molecular médio ponderado relativamentepequeno à porção de G-CSF. Ao usar esta abordagem, foipossível modificar o resíduo de cisteína contendo tiollivre paracialmente enterrado de G-CSF. 0 PEG-DiOPSS,2kDa, bifuncional, foi essencialmente inserido no tiollivre estericamente obstruído através de uma ligaçãodissulfeto, seguida pelo acoplamento de um PEG comterminação tiol ao resíduo do reagente PEG-OPSS, 2kDa pormeio de outra ligação dissulfeto.
PEG-DiOPSS, 2kDa, armazenado a -20° C sob argônio foiaquecido à temperatura ambiente. Um excesso de cinqüentavezes (relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquotamedida da solução de estoque de G-CSF) do PEG-DiOPSSaquecido foi dissolvido em DMSO para formar uma solução dereagente a 10%. A solução de reagente a 10% foi rapidamenteadicionada à alíquota da solução de G-CSF de estoque (0,4mg/ml em tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) e misturadabem. Para facilitar a conjugação de PEG-DiOPSS ao resíduode cisteína livre (i.e., não participando da ligaçãointraproteína-dissulfeto) na posição 17 de G-CSF via umaligação dissulfeto, a solução de reação foi colocada em umRotoMix (Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) e deixadamisturar por uma hora a 37° C e, então, por duas horas àtemperatura ambiente para, desse modo, resultar em umamistura de reação PEG2kDa-G-CSF. Depois de a reação estarcompleta, a solução de reação foi dializada contra umtampão de fosfato de sódio, pH 7,0 para remover o excessode PEG-DiOPSS livre. Um excesso de cinqüenta vezes demPEG-SH, 3OkDa (relativo à quantidade de G-CSF em umaalíquota medida da solução de G-CSF de estoque) foi, então,adicionado à solução de conjugado dializada, seguida demistura por uma hora à temperatura ambiente e, então,durante a noite a 4o C para, desse modo, formar uma soluçãode conjugado mPEG3 0kDa-PEG2kDa-G-CSF. A solução deconjugado mPEG3OkDa-PEG2kDa-G-CSF foi caracterizada porSDS-PAGE e RP-HPLC.
A FIG. 11 mostra o cromatograma depois da análise RP-HPLC da solução de conjugado mPEG3 OkDa-PEG2kDa-G-CSF. Areação de PEGuilação rendeu 20% de conjugado mPEG3OkDa-PEG2kDa-G-CSF.
A cromatografia de troca de cátion foi usada parapurificar o conjugado mPEG30kDa-PEG2kDa-G-CSF. A FIG. 12mostra o cromatograma depois de purificação por troca decátion.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando PEG-OPSS e mPEG-SH com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo 3BPEGuilação de G-CSF com um Reagente PEG-Diortopiridil-Dissulfeto Linear, 2kDa,
e um Reagente mPEG-Tiol Linear, 30kDaDiOPSS11)
Derivado mPEG-Tiol Linear, 3OkDa ("mPEG-SH")
PEG-DiOPSS, 2kDa, armazenado a -20° C sob argônio, foiaquecido ã temperatura ambiente. Um excesso de cem vezes(relativo à quantidade de G-CSF em uma alíquota medida dasolução de G-CSF de estoque) do PEG-DiOPSS, 2kDa aquecidofoi dissolvido em DMSO para formar uma solução de reagentea 10%. A solução de reagente a 10% foi rapidamenteadicionada à alíquota da solução de G-CSF de estoque (0,5mg/ml em tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) e misturadabem. Para facilitar a conjugação de PEG-DiOPSS ao resíduode cisteína livre (i.e., não participando da ligaçãointraproteína-dissulfeto) na posição 17 de G-CSF via umaligação dissulfeto, a solução de reação foi colocada em umRotoMix (Type 4 8200, Thermolyne, Dubuque IA) e deixadamisturar por uma hora a 37° C e, então, por três horas emeia à temperatura ambiente. Depois de a reação estarcompleta, a solução de reação foi dializada contra umtampão de fosfato de sódio, pH 7,0 para remover o excessode PEG-DiOPSS livre. Um excesso de cento e cinqüenta vezesde mPEG-SH, 30kDa (relativo à quantidade de G-CSF em umaalíquota medida da solução de G-CSF de estoque) foi, então,adicionado à solução de conjugado dializada, seguida demistura durante a noite à temperatura ambiente para, dessemodo, formar uma solução de conjugado mPEG3OkDa-PEG2kDa-G-CSF. A solução de conjugado foi caracterizada por SDS-PAGEe RP-HPLC.
A reação de PEGuilação rendeu 21% de conjugadomPEG3 OkDa-PEG2kDa-G-CSF.
Um método de cromatografia por troca de cátion usandomeios de troca SP Sepharose High Performance (AmershamBiosciences, Uppsala Sweden) e tampão NaOAc foi usado parapurificar o conjugado mPEG30K-PEG2K-G-CSF. (Ver FIG. 13) .
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando PEG-DiOPSS e mPEG-SH com outros pesosmoleculares médios ponderados.
Exemplo 4
PEGuilação Degradável de G-CSF com Reagente 9-Hidroximetil-2 , 7-Di[mPEG(20.000)-Amidoglutárico Amida] Fluorene-N-Hidroxisuccinimida (um Reagente "Ramificado")/ 40kDa
Reagente 9-Hidroximetil-2,7-Di[mPEG(20.000)-AmidoglutáricoAmida] Fluoreno-N-Hidroxisuccinimida, 40kDa
ou "Reagente mPEG-FMOC-N-Hidroxisuccinimida Ramificado",4OkDa
ou "G2-PEG2- FMOC-NHS", 4 0 kDa
G2-PEG2-FMOC-NHS, 4OkDa, armazenado a -2 0° C sob
<formula>formula see original document page 108</formula>argônio, foi aquecido a temperatura ambiente. Um excessode cinco vezes (relativo à quantidade de G-CSF em umaalíquota medida da solução de G-CSF de estoque) do G2-PEG2-FMOC-NHS aquecido foi dissolvido em HCl 2mM para formar umasolução de reagente a 10%. A solução de reagente a 10% foirapidamente adicionada à alíquota da solução de G-CSF deestoque (0,4 mg/ml em tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) emisturada bem. Depois da adição do reagente PEG, o pH damistura da reação foi determinado e ajustado para 7,0usando técnicas convencionais. Para permitir o acoplamentodo G2-PEG2-FMOC-NHS ao G-CSF via uma ligação amida, asolução de reação foi colocada em um Slow Speed Lab Rotatorpor três horas para facilitar a conjugação à temperaturaambiente para, então, formar uma solução de conjugação G2-PEG2-FMOC-G-CSF. A reação foi resfriada pela adição deácido acético IM para abaixar o pH para 4,0. A solução deconjugado G2-PEG2-FMOC-G-CSF foi caracterizada por SDS-PAGE. Veja a faixa 4 dos resultados SDS-PAGE apresentadosna FIG. 14.
A reação de PEGuilação rendeu 52% de espécies 1-mer(mono-conjugado ou um PEG anexado ao G-CSF) e 15% 2-mer(di-conjugado ou dois PEGs anexados ao G-CSF). Um métodode cromatografia por troca de cátion usando meios de trocaSP Sepharose High Performance e tampão NaOAc (acetato desódio) foi usado para purificar os conjugados.
Devido à ligação degradável na estrutura PEG, espera-se que o G-CSF seja liberado a uma taxa lenta a partir dosconjugados sob condições fisiológicas. A evidência paraisso é mostrada no perfil de liberação do mono-conjugadoG2-PEG2-FMOC-4 OK-G-CSF (ver FIG. 15) mediante incubação apH 7,4, 37° C expresso pela área de pico HPLC do conjugadoque permaneceu em função do tempo. A meia-vida do mono-conjugado G 2-PEG2-FMOC-40K-G-CSF foi calculada em 98 horasa partir do gráfico linear de taxa de hidrólise (ver FIG. 16).
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando reagentes G2-PEG2-FMOC-NHS com outrospesos moleculares médios ponderados.
Exemplo 5
PEGuilação Degradável de G-CSF com Reagente 9-Hidroximetil-[4-Carboxiamido mPEG(10.000)-7-Amidoglutárico Amida
mPEG(10.000)] Fluoreno-N-Hidroxisuccinimida, 20kDa
<formula>formula see original document page 110</formula>
Reagente 9-Hidroximetil-[4-Carboxamido mPEG(10.000)- 7 -Amidoglutárico Amida mPEG(10,000)] Fluoreno-N-Hidroxisuccinimida, 20kDa
ou "Reagente mPEG-FMOC-N-Hidroxisuccinimida Ramificado",2OkDa,
ou 11CG-PEG2-FMOC-NHS" , 20kDa
CG-PEG2-FMOC-NHS, 2OkDa, armazenado a -20° C sobargônio, foi aquecido a temperatura ambiente. Um excessode sete vezes (relativo à quantidade de G-CSF em umaalíquota medida da solução de G-CSF de estoque) do CG-PEG2-FMOC-NHS aquecido foi dissolvido em HCl 2mM para formar umasolução de reagente a 10%. A solução de reagente a 10% foirapidamente adicionada à alíquota da solução de G-CSF deestoque (0,4 mg/ml em tampão de fosfato de sódio, pH 7,0) emisturada bem. Depois da adição do reagente PEG, o pH damistura da reação foi determinado e ajustado para 7,0usando técnicas convencionais. Para permitir o acoplamentodo CG-PEG2-FMOC-NHS ao G-CSF via uma ligação amida, asolução de reação foi colocada em um Slow Speed Lab Rotatorpor três horas para facilitar a conjugação à temperaturaambiente para, dessa forma, formar a solução de conjugadoCG-PEG2-FM0C-G-CSF. A reação foi esfriada pela adição deácido acético IM para abaixar o pH para 4,0. A solução deconjugado CG-PEG2-FMOC-G-CSF foi caracterizada por SDS-PAGE. Veja faixa 2 dos resultados SDS-PAGE apresentados naFIG. 14.
A reação de PEGuilação rendeu 45% de espécies 1-mer(mono-conjugado ou um PEG anexado ao G-CSF) e 26% 2-mer(di-conjugado ou dois PEGs anexados a G-CSF). Um método decromatografia por troca de cátion usando meios de troca SPSepharose High Performance e tampão NaOAc foi usado parapurificar os conjugados.
Devido à ligação degradável na estrutura PEG, espera-se que o G-CSF seja liberado lentamente dos conjugados PEG-G-CSF sob condições fisiológicas. A evidência para isso émostrada no perfil de liberação do mono-conjugado CG-PEG2-FMOC-2OK-G-CSF (ver FIG. 17) mediante incubação a pH 7,4,37° C expresso pela área de pico HPLC do conjugado quepermaneceu em função do tempo. A meia-vida do mono-conjugado CG-PEG2-FMOC-2OK-G-CSF foi calculada em 60 horasa partir do gráfico linear de taxa de hidrólise (ver FIG. 18).
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando reagentes CG-PEG2-FMOC-NHS cora outrospesos moleculares médios ponderados.
Exemplo 6
PEGuilação de G-CSF com PEG20oo-di-( (CH2) 4-ortopiridildissulfeto) e PEG240,ooo-tiol Ramificado
<formula>formula see original document page 112</formula>
PEG2,ooo(4C-0PSS) (conforme preparado no Exemplo 2do Pedido de Patente US Publicação Número 2006/0135586)armazenado a -2 0° C sob argônio, foi aquecido à temperaturaambiente. Um excesso de cinqüenta vezes (relativo àquantidade de G-CSF em uma alíquota medida da solução de G-CSF de estoque) do PEG2,0oo-di-(4C-0PSS) aquecido foidissolvido em DMSO para formar uma solução de reagente a10%. A solução de reagente a 10% foi rapidamente adicionadaà alíquota da solução de G-CSF de estoque (0,4 mg/ml eratampão de fosfato de sódio, pH 7,0) e misturada bem. Asolução de reação foi colocada em um RotoMix (Type 48200,Thermolyne, Dubuque IA) e deixada misturar por duas horas a37° C e, então, por duas horas à temperatura ambiente.Depois de a reação estar completa, a solução de reação foidializada contra tampão de fosfato de sódio, pH 7,0 pararemover o excesso de PEG2,0oo-di-(4C-0PSS) .
Um excesso de setenta e cinco vezes (relativo ao G-CSF) de PEG240,ooo-tiol (Nektar Therapeutics, Huntsville AL)foi, então, adicionado à solução de conjugado dializada e aseguir misturada por três horas à temperatura ambiente e,então, durante a noite a 4° C para formar um conjugadoPEG240, OOO-PEG2, ooo-G-CSF. O conjugado foi caracterizado porSDS-PAGE e RP-HPLC. Conforme mostrado na FIG. 19, orendimento final de conjugado obtido foi de 35%.
Exemplo 7 (comparativo)
Reação de PEGuilação de G-CSF com PEG20oo-di-( (CH2) _ortopiridil dissulfeto) e PEG240,ooo-tiol
PEG240,ooo-tiol
0 procedimento de reação do Exemplo 6 foi basicamenteduplicado usando um reagente PEG tiol de baixo pesomolecular com um ligante de dois carbonos em vez de quatrocarbonos.
Conseqüentemente, PEG2,00o-di-(2C-OPSS) da NektarTherapeutics, Huntsville AL, armazenado a -2 0° C sobargônio, foi aquecido à temperatura ambiente. Um excessode cinqüenta vezes (relativo à quantidade de G-CSF em umaalíquota medida da solução de G-CSF de estoque) do reagentefoi dissolvido em DMSO para formar uma solução a 10%. Estasolução foi rapidamente adicionada à alíquota da solução deG-CSF de estoque (0,4 mg/ml em tampão de fosfato de sódio,pH 7,0) e misturada bem. A solução de reação foi colocada
PEG2ooo-di- ( (CH2)2-OrtOpiridil dissulfeto)em um RotoMix (Type 4 82 00, Thermolyne, Dubuque IA) edeixada misturar por duas horas a 37° C e, então, por trêshoras ã temperatura ambiente. Depois de a reação estarcompleta, a solução de reação foi dializada contra tampãode fosfato de sódio, pH 7,0 para remover o excesso dePEG2/0oo-di- (2C-0PSS).
Um excesso de setenta e cinco vezes (relativo ao G-CSF) PEG240,ooo"tiol ramificado (Nektar Therapeutics,Huntsville AL) foi adicionado à solução de conjugadodializada e depois misturada por três horas à temperaturaambiente e durante a noite a 4 o C. No entanto, a análiseSDS-PAGE e RP-HPLC não mostrou quantidade alguma detectáveldo conjugado PEG240,ooo-PEG2,ooo-G-CSF desejado.
A evidência sugere que o reagente PEG-OPSS ligado aoetileno (C2) sofre uma clivagem redutora para destruirefetivamente o reagente antes de depois que ele reage com aproteína alvo. 0 reagente ligado ao butileno (C4) é maisestável a tal clivagem e, dessa forma, sobrevive para darum rendimento muito mais alto de conjugado.
Exemplo 8
PEGuilação em Série de rhG-CSF
G-CSF é dissolvido em um tampão de acetato de sódio,pH 6,8, para formar uma solução de estoque. Um excesso decerca de quarenta molar (relativo ao G-CSF) de OPSS-PEG2,oooDaiton-hidrazida em água é adicionado à solução de estoquepara formar a solução de reação.
<formula>formula see original document page 114</formula>
Reagente OPSS-PEG2,ooo Daiton-Hidrazida
Para permitir a reação de uma cisteína com o grupoortopiridil dissulfeto reativo a sulfidril ("OPSS"), asolução de reação é misturada por três horas à temperaturaambiente. A solução de reação passa, então, por uma colunade cromatografia por exclusão de tamanho e o pico associadocom o conjugado monoPEGuilado ("l-mer") [com uma estruturade (G-CSF)-S-S-PEG2,ooo DaitonC(O)-NH-NH2] é coletado paraformar uma composição monoPEGilada.
A composição monoPEGilada é, então, tratada com umexcesso vinte molar de um derivativo de mPEG30,oooDaitonpropionaldeído para formar uma segunda solução dereação.
<formula>formula see original document page 115</formula>
Reagente mPEG Propionaldeido
Para permitir a reação entre os grupos funcionaishidrazida e aldeido, uma segunda solução de reação émisturada por três horas à temperatura ambiente com pHajustado para 3,8. A análise da mistura de reação revela aconjugação bem sucedida de G-CSF com a seguinte estrutura:
(rG-CSF)-S-S-PEG2iOoo DaitonC(O)-NH-N=CHCH2CH2O(CH2CH2O)CH3.
Usando esta mesma abordagem, outros conjugados podemser preparados usando reagentes PEG-OPSS e mPEG-propionaldeído com outros pesos moleculares médiosponderados.
Exemplo 9
Atividade de Conjugados
0 objetivo do Exemplo 9 foi avaliar a eficácia dosconjugados de fator estimulador de colônia de granulócitosrecombinantes humanos identificados na Tabela 4.
Tabela 4Resumo dos Conjugados PEG-G-CSF Preparados para AvaliaçãoIn-vitro e In-vivo
<table>table see original document page 116</column></row><table>
* A Pegfilgrastima é um conjugado covalente de G-CSF humanometionil recombinante (filgrastima) e monometoxipolietilenoglicol e é comercialmente disponível de Amgen Inc.,Thousand Oaks CA. Quando administrado por via subcutânea emhumanos a 3,45-11,5 mcg/kg, tem sido relatado que afilgrastima tem uma meia-vida de 3,5 horas, uma liberaçãode 0,5-0,7 mL/min/kg e um volume de distribuição del50mL/kg. Para a Pegfilgrastima, contudo, foi relatado que ameia-vida é de 15-80 horas.
Células de mieloma de camundongo M-NFS-60 (ATCC #CRL-1838) foram obtidas e mantidas em RPMI-1640 (ATCC #30-2001)suplementado com 10% de FBS (HyClone) , 5 0μΜ2-mercaptoetanol (Gibco) e 62ng/ml de fator estimulador decolônias de macrófagos recombinante humano (rhM-CSF, Sigma#M6518) . As células foram subcultivadas a cada 2-3 dias,ou 3 vezes por semana. A densidade da semeadura foi de2,5E4 células/mL. As células não são dependentes deancoragem. Antes de testar os compostos PEG-GCSF, ascélulas foram apenas lavadas três vezes com tampão PBS pararemover o rhM-CSF. O procedimento é mostrado na Tabela 5 aseguir.
Tabela 5
Procedimento
<table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>
A atividade de cada conjugado foi determinadafarmacodinamicamente em ratos machos Sprague-Dawley normais(Harlan, Indianapolis IN) . Os animais foram ordenadosdentro de uma variação de peso de 150-200 g e as idadesaproximadas eram de 6 semanas. Eles foram aclimatados embiotérios por no mínimo 3 dias após a transferência, antesde começar a investigação do estudo.
Houve 10 grupos de tratamento, com 4 ratos por grupo.A cada grupo de tratamento foi dada uma letra (A-J) e osratos foram alocados arbitrariamente para cada grupo detratamento, conforme é mostrado na Tabela 6.
Tabela 6
Grupos de Tratamento<table>table see original document page 119</column></row><table>
O volume da dose para a substância veículo e teste foideterminado pela concentração de cada solução de dosagem.Cada rato recebeu uma dose simples da substância de teste,controle positivo ou veículo, por injeção subcutânea.
Dez grupos de animais (n = 8 por grupo (n = 4 para 5vezes a amostra de tratamento)) receberam uma dosesubcutânea, por injeção, de substância de teste, veículo oucontrole positivo para permitir a retirada de amostras desangue para análise. As alocações são apresentadas na10 Tabela 7.
Tabela 7
Alocações
<table>table see original document page 119</column></row><table><table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table>
Para as amostras iniciais, aproximadamente 0,5 mL desangue total foi tirado da veia da cauda. Da quinta amostraaté a amostra final, os animais foram anestesiados comdióxido de carbono e amostras sangüíneas de volume máximoforam tiradas por punção cardíaca. Os pontos no tempo paraa amostragem cardíaca foram de 144 e 168 horas pós dose. Asamostras foram colocadas em frascos de coleta cobertos comEDTA, misturadas imediatamente e, então, armazenadas emgelo. Os animais foram mortos por deslocamento cervical emseguida ao ponto no tempo da amostragem final de sangue. 0tempo real da amostragem sangüínea foi documentado. Asamostras sangüíneas foram colocadas imediatamente em gelo earmazenadas em refrigerador a aproximadamente 4o C antes daanálise. As amostras sangüíneas foram analisadas dentre de48 horas da amostragem. EDTA foi usado como anticoagulantepara as amostras hematológicas.
Os parâmetros medidos e a metodologia para ahematologia são apresentados na Tabela 8.
Tabela 8
Parâmetros Medidos e Metodologia Para Hematologia
<table>table see original document page 122</column></row><table>
A atividade de cada composto testado é ilustrada naFIG. 20 e FIG 21 a seguir. Cada gráfico representa aporcentagem de crescimento em células NFS em função daconcentração. As diferenças nas duas figuras são a duraçãoda incubação, isto é, 4 8 horas na a FIG. 2 0 versus 72 horasna FIG 21.
Os resultados sugerem que o GCSF é ativo emconcentrações mais baixas quando comparado a cada um dosconjugados PEG-GCSF testados. Para se obter uma melhorcomparação dos resultados nos gráficos, os dados foramnormalizados e comparados diretamente ao GCSF nativo. Aatividade em EC50 (ng/mL) foi calculada. A tabela seguintefaz as comparações.
Tabela 9
Comparação de Atividade entre G-CSF (ID# 1) e os CompostosTestados
<table>table see original document page 123</column></row><table>
Os resultados sugerem que a pegfilgrastima (ID# 2) é 8vezes menos potente do que o GCSF nativo (ID# 1) , oconjugado preparado no Exemplo IA (ID# 7) é 16 vezes menospotente, e cada um dos conjugados preparados nos Exemplos2A, 2B, 3A, e 3B são 32 vezes menos potente, i.e., umaredução logarítmica de 1,5. Os conjugados liberáveis nãoforam tão potentes porque acredita-se que a PEGuilação énão seletiva. Espera-se que os conjugados liberáveis, noentanto, liberem a molécula GCSF ativa, que por sua vezteria atividade completa como o composto nativo. Comoesperado, o controle de reagente polimérico (ID# 8) nãoteve qualquer atividade.
Também foi observado que o GCSF nativo (ID# 1) e apegfilgrastima tiveram melhor atividade do que os compostosconjugados em concentrações abaixo de 0,097 ng/mL. Emconcentrações acima de 0,097 ng/mL, no entanto, o opostofoi observado (i.e., a atividade de proliferação de célulasdo GCSF nativo e da pegfilgrastima foi baixa, enquanto queas amostras de PEG-GCSF mostraram crescimento contínuo.
Em relação à atividade in vivo, as contagens deneutrófilos e glóbulos brancos foram contados e comparados.
Em cada um dos gráficos abaixo, as contagens foramrepresentadas graficamente (para ambas as doses) ecomparadas contra a pegfilgrastima (GCSF PEGuilado N-terminal). Em todos os gráficos, uma pequena, mas visívelresposta de dose foi observada entre as doses de 4 0 pg/kg e100 pg/kg.
As conclusões mostram que os conjugados de GCSFbaseados em cisteína mostraram uma atividade positiva tantoin-vitro como in-vivo. O conjugado do Exemplo IA apareceucom a atividade mais próxima à da pegf ilgrastima. Nãohouve diferença significativa entre as atividades medidaspara os conjugados dos Exemplos 2A, 2B, 3A e 3B. Osconjugados liberáveis também demonstraram atividadepositiva.LISTAGEM DE SEQUENCIA
SEQ ID NO: 1
(Met) η' 1 1
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu LeuLys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala LeuGln
20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu LeuVal
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser SerCys
50 55 60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu HisSer
65 70 75
80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly IleSer
85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val AlaAsp
100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met AlaPro
115 120 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser AlaPhe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln SerPhe
145 150 155
160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170
(n· ' ' = 0 ou 1)SEQ ID NO: 2
(Met)n·''
Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu LeuLys
15 10 15Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala LeuGln
20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu LeuVal
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser SerCys
50 55 60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu HisSer
65 70 75
80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly IleSer
85 90 95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val AlaAsp
100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met AlaPro
115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser AlaPhe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln SerPhe
145 150 155
160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170
(n' ' 1 = 0 ou 1)SEQ ID NO: 3(Met) n' 1 1
Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln15 10 15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala ThrPro
20 25 30
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys CysLeu
35 40 45
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln GluLys
50 55 60
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val LeuLeu
65 70 75
80
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys ProSer
85 90 95
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser GlyLeu
100 105 110
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser ProGlu
115 120 125
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp PheAla
130 135 140
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro AlaLeu
145 150 155
160
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe GlnArg
165 170 175
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe LeuGlu
180 185 190
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro(n1'* = 0 ou 1)

Claims (20)

1. Conjugado caracterizado por conter um resíduo deuma porção de G-CSF covalentemente anexada via uma ligaçãodegradável, seja diretamente ou através de uma porçãoespaçadora composta de um ou mais átomos, a um polímerosolúvel em água.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a ligação degradável é umaligação clivável.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que um grupo amino da porção deG-CSF serve como um local para a anexação covalente.
4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por possuir a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 131</formula> em que:POLY1 é o primeiro polímero solúvel em água;POLY2 é o segundo polímero solúvel em água;X1 é a primeira porção espaçadora;X2 é a segunda porção espaçadora;Ha é um átomo de hidrogênio ionizável;R1 é H ou um radical orgânico;R2 é H ou um radical orgânico;(a) é zero ou um;(b) é zero ou um;Rel, quando presente, é o primeiro grupo alterado porelétron;Re2, quando presente, é o segundo grupo alterado porelétron;Y1 é O ou S ;Y2 é 0 ou S; eG-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em: <formula>formula see original document page 132</formula><formula>formula see original document page 133</formula> em que (η) é 3 a 4.000 e G-CSF é um resíduo de uma porçãode G-CSF.
6. Conjugado, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato deque a porção de G-CSF é G-CSF recombinante humano ou é umG-CSF recombinante humano com um resíduo metionil N-terminal.
7. Conjugado caracterizado por possuir a seguinteestrutura: <formula>formula see original document page 133</formula> em que:POLY" é um segundo polímero solúvel em água;POLY' é um primeiro polímero solúvel em água;X1, quando presente, é uma porção espaçadora opcionalcomposta de um ou mais átomos;X2 é uma porção espaçadora composta de um ou maisátomos;(b) é ura;(a) é zero ou um; eG-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que POLY" é um polímeroramificado.
9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o polímero ramificado contémuma estrutura selecionada do grupo que consiste em : <formula>formula see original document page 134</formula> em que cada (n) é independentemente um número inteiro comvalor de 3 a 4 000; e <formula>formula see original document page 134</formula> em que cada (n) é independentemente um número inteiro comvalor de 3 a 4000.
10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que POLY" é um polímero linear.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o grupo tiol da porção de G-CSF serve como local para uma anexação covalente doprimeiro polímero solúvel em água ou, quando presente, aporção espaçadora opcional.
12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado por possuir a seguinte estrutura:CH3-0(CH2CH20)n.-[CH2]2-8-S-S-[CH2]2.8-0(CH2CH20)n-[CH2]2.8-S-S—(G-CSF)em que (n) é um número inteiro de 2 a aproximadamente 114,η1 é um número inteiro de 2 a aproximadamente 3.400, e G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado por possuir a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 135</formula> em que (n) é um número inteiro de 2 a aproximadamente-114, n' é um número inteiro de 2a aproximadamente 3.400,e G-CSF é um resíduo de uma porção de G-CSF.
14. Conjugado, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou 13, caracterizadopelo fato da porção de G-CSF ser G-CSF recombinante humanoou ser um G-CSF recombinante humano com um resíduo metionilN-terminal.
15. Método para preparar um conjugado, o métodocaracterizado por consistir em combinar um reagentepolimérico e uma porção de G-CSF sob condições suficientespara resultar na formação de um conjugado composto de umresíduo de uma porção de G-CSF covalentemente anexada, sejadiretamente ou através de uma porção espaçadora composta deum ou mais átomos, a um polímero solúvel em água, onde o aporção de G-CSF é covalentemente anexada à cadeia lateralde um resíduo de cisteína, e ainda onde o método (a) édesprovido de uma etapa que introduza condiçõesdesnaturantes, e (b) é realizado em um pH de menos de 8,5ou é desprovido de uma etapa de adição de um detergente.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato do resíduo de cisteína corresponderà cisteína 17 do hG-CSF.
17. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato da porçãode G-CSF ser G-CSF recombinante humano ou ser G-CSFrecombinante humano com um resíduo de metionil N-terminal.
18. Método para preparação de um conjugado éapresentado, o método caracterizado por consistir na adiçãoda composição de um primeiro reagente polimérico a umacomposição de uma porção G-CSF sob condições suficientespara resultar em uma primeira composição de conjugadocomposta de um primeiro conjugado composto de um resíduo deuma porção de G-CSF covalentemente anexada, sejadiretamente ou através de uma primeira porção espaçadoracomposta de um ou mais átomos, a um primeiro polímerosolúvel em água, e adição de uma segunda composição de umreagente polimérico à primeira composição de conjugado pararesultar em uma segunda composição de conjugado composta deum segundo polímero solúvel em água anexado, sejadiretamente ou através de uma segunda porção espaçadoracomposta de um ou mais átomos, ao primeiro polímero solúvelem água do conjugado.
19. Composição, caracterizada por ser preparada deacordo com o método da reivindicação 15.
20. Composição, caracterizada por ser preparada deacordo com o método da reivindicação 18.
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