JP5243041B2 - 安定化ポリマーチオール試薬 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマーから誘導された安定化ポリマーチオール試薬に関する。特に、本発明は、ポリマーチオール試薬、それらの複合体、および当該複合体を利用するための方法に関する。

（発明の背景）
バイオテクノロジーの最近の進歩により、今では治療用タンパク質および他の生体分子、例えば抗体および抗体断片をラージスケールで調製することが可能であり、当該生体分子がより広く利用可能になっている。残念なことに、未修飾形態の有望な治療用生体分子の臨床的有用性は、それらの急速なタンパク質分解、製造、保管または投与時の不安定性、またはそれらの免疫原性によってしばしば損なわれる。

これらの欠点は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の水溶性ポリマーの共有結合によってしばしば克服されうる。例えば、非特許文献１；非特許文献２を参照されたい。ＰＥＧ複合体またはＰＥＧ化タンパク質とも称するＰＥＧ修飾タンパク質の生物学的特性は、多くの場合において、非ＰＥＧ化タンパク質の生物学的特性に比べて著しく改善されていることが示された（非特許文献３）。ポリエチレングリコール修飾タンパク質は、タンパク質分解に対する抵抗が強いために、体内での循環時間がより長く、熱安定性も高いことが示された（非特許文献４）。他の生体分子、例えば抗体および抗体断片にも同様の生物学的効力の向上が認められる（非特許文献５）。

アミノ基との反応に好適な活性化末端基を有するポリエチレングリコールは、タンパク質の修飾に広く使用されている。当該活性化ＰＥＧまたは「ポリマー試薬」としては、ＰＥＧ−アルデヒド（非特許文献６）、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボニルイミダゾリルおよびクロロシアヌル酸塩（非特許文献３）が挙げられる。しかし、特定のリジン残基の誘導がタンパク質を不活性化する場合等は、タンパク質アミノ基を介するポリマー結合が望ましくない場合もありうる（非特許文献７）。したがって、システイン等の結合のための他の目標アミノ酸を使用してＰＥＧによるタンパク質の修飾を行うためのさらなる方法を有することが有利である。システインは、典型的には、タンパク質においてリジンより存在度が小さいため、これらのチオール含有アミノ酸に結合するとタンパク質を不活性化する確率を低下させるという点において、システイン上のタンパク質チオール基への結合は有利である。チオール選択的活性化ポリマーは、例えば、共有されている特許文献１に記載されている。

ポリマーチオール誘導体、特にＰＥＧチオールは、チオール選択的活性化ポリマーの一種である。しかし、多くの従来技術のポリマーチオールは、ジスルフィドを形成する酸化結合、すなわち活性成分を減少させ、除去困難な不純物を追加する分解プロセスを大いに受けやすい。後者は、これらの材料から生体複合体を調製する上で特に問題である。したがって、従来技術の試薬に比べて安定性が向上したポリマーチオール試薬を提供することが有利である。
国際公開第０４／０６３２５０号パンフレット Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２（１１）：３５７９ Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ，Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８１）４６：６４９−６５２ Ｈｅｒｍａｎ，Ｓ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．（１９９４）１９５：２０３−２０９ Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２：３５８２−３５８６ Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．（２００２）５４：５３１−５４５ Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．およびＨｅｒａｔｉ，Ｒ．Ｓ．、Ｐｏｌｙｍ Ｐｒｅｐｒ．（Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｄｉｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．）（１９９１）３２（１）：１５４−１５５ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（１９８４）７８８：２４８−２５５

（発明の要旨）
一態様において、本発明は、以下の構造式を有する「ポリマー試薬」とも称する水溶性活性化ポリマーを提供する。
ＰＯＬＹ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
（式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり、
Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を含有し、３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、
Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
ｘは、１から２５であり、
Ｓ−Ｗは、チオール、保護チオールまたはチオール反応性チオール誘導体である。）
一実施形態において、Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）等のチオール反応性誘導体である。

ｘが２である場合は、試薬は以下にさらに詳細に記載されるような二官能ポリマー試薬であり、本明細書に記載されている直鎖または「二股」形態を有することができる。ポリマー試薬は、特にｘが３以上である場合は、本明細書に記載されている「多腕」形態を有することもできる。選択された実施形態において、ｘは、１から８、１から６または１から４であり、さらなる実施形態において、ｘは、１または２、あるいはｘは、１である。開示されたポリマー試薬のＰＯＬＹ成分は、それ自体、本明細書にさらに詳細に記載されている直鎖、分枝、多腕およびそれらの組合せからなる群より選択される形態を有することが可能である。

特定の実施形態において、ＰＯＬＹが直鎖状ポリエチレングリコールであり、Ｙが直鎖状アルキル鎖である場合は、ＰＯＬＹは、少なくとも５００の分子量を有する。

さらなる実施形態において、ＰＯＬＹは、少なくとも１０００、または少なくとも２０００の分子量を有する。上限として、ＰＯＬＹは、３０００００Ｄａ以下の分子量を有する。

結合基Ｙの「炭化水素骨格」は、より詳細には、ＰＯＬＹとＳを結合する最短の連続炭素鎖と定義づけられる。Ｙの骨格が不飽和である場合は、一不飽和であること、すなわち二重または三重炭素−炭素結合を有することが好ましい。好ましくは、骨格および置換基を含むスペーサ基Ｙは、一不飽和であり、より好ましくは完全飽和である。他の実施形態において、骨格および置換基を含むスペーサ基Ｙは、飽和部および芳香族部からなる。

好ましくは、骨格は、飽和されている。例えば、Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる）を有することができる。選択された実施形態において、ｎは、３から６であり、ｎは、４から６であり、あるいはｎ＝４であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素および低級アルキルから独立に選択され、低級アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルである。

さらなる選択された実施形態において、Ｙは、いずれも１つまたは複数の非干渉性置換基を含むことができるＣ_４〜Ｃ_８アルキレン、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキレン、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

好ましくは、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、低級アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、好ましくはメトキシ、エトキシ、フルオロおよびクロロから選択されるせいぜい１または２の非干渉性置換基が含まれる。一実施形態において、ヘテロ原子含有置換基は存在しない。すなわち、結合基Ｙは、炭素および水素からなる。

１つの好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、−（ＣＲ^１Ｒ^２）−のｎ反復体に関しては水素である。他の好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、低級アルキル、好ましくはメチルまたはエチル（ａ−分枝）である。一実施形態において、ａ−分枝基は、メチルである。

Ｙは、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−であり、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合するＹの実施形態において、シクロアルキル基は、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシル基である。好ましくは、Ｓは、当該実施形態におけるＹのｓｐ^３混成非環式炭素に結合する。

上記のように、ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。当該ＰＥＧは、典型的には、１４８（例えば、三量体＋結合酸素原子）から約２００から約１０００００ダルトンの分子量を有する、選択された実施形態において、ポリエチレングリコールは、約２００から約４００００ダルトンの分子量を有する。代表的な分子量としては、例えば、５００、１０００、２０００、２５００、３５００、５０００、７５００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００および４００００ダルトンが挙げられる。開示された試薬のＰＥＧ成分は、それ自体、本明細書にさらに詳細に記載されている直鎖、分枝、多腕、およびそれらの組合せからなる群より選択される形態を有することが可能である。

よって、本発明は、以下の構造式を有する水溶性ポリマー試薬を提供する。
ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
（式中、
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールポリマーであり、
Ｙは、３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、
Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
ｘは、１から２５であり、
Ｓ−Ｗは、チオール、保護チオールまたはチオール反応性チオール誘導体であり、
ＰＥＧは、ＰＥＧが直鎖状であり、ｘが１であり、Ｙが直鎖状アルキル鎖である場合は少なくとも５００の分子量を有する。）
上述のように、ｘが２である場合は、試薬は、以下により詳細に記載するように二官能ポリマー試薬であり、本明細書に記載されている直鎖または「二股」形態を有することができる。ポリマー試薬は、特にｘが３以上である場合は、本明細書に記載されている「多腕」形態を有することもできる。選択された実施形態において、ｘは、１から８、１から６または１から４であり、さらなる実施形態において、ｘは、１または２、あるいはｘは、１である。開示されたポリマー試薬のＰＥＧ成分は、それ自体、本明細書にさらに詳細に記載されている直鎖、分枝、多腕およびそれらの組合せからなる群より選択される形態を有することが可能である。

好ましい実施形態において、ＰＥＧは、上記様々な範囲を含む少なくとも１４８、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも２０００から約１０００００ダルトンまでの分子量、ならびに直鎖、分枝、二股および多腕から選択される形態を有する。Ｓ−Ｗは、好ましくはチオール反応性チオール誘導体、より好ましくはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である。

結合基Ｙの「炭化水素骨格」は、より詳細には、ＰＥＧとＳを結合する最短の連続炭素鎖と定義づけられる。好ましくは、結合基Ｙの骨格は、Ｙが、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる）を有するように飽和している。選択された実施形態において、ｎは、３から６であり、ｎは、４から６であり、あるいはｎ＝４であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される。

さらなる選択された実施形態において、上述のように、Ｙは、いずれも１つまたは複数の非干渉性置換基を含むことができるＣ_３〜Ｃ_８アルキレン、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキレン、およびそれらの組合せからなる群より選択される。好ましくは、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、低級アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、好ましくはメトキシ、エトキシ、フルオロおよびクロロから選択されるせいぜい１つまたは２つの非干渉性置換基が含まれる。一実施形態において、ヘテロ原子含有置換基は存在しない。すなわち、結合基Ｙは、炭素および水素からなる。

上記のように、１つの好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、−（ＣＲ^１Ｒ^２）−のｎ反復体に関しては水素である。他の好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、低級アルキル、好ましくはメチルまたはエチル（ａ−分枝）である。一実施形態において、ａ−分枝基は、メチルである。

Ｙは、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−であり、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合するＹの実施形態において、シクロアルキル基は、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシル基である。好ましくは、Ｓは、当該実施形態におけるＹのｓｐ^３混成非環式炭素に結合する。

ＰＥＧ−Ｙ−Ｓ−Ｗ形態の例示的な試薬において、Ｙは、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素であり、ｎは、４である）であり、Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、ＰＥＧは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。ｍＰＥＧは、好ましくは、５０００から３００００Ｄａの範囲の分子量を有する。さらなる例示的な試薬において、ＰＥＧおよびＳＷは、同様に定義づけられ、ｎは、３または４であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、メチルである（すなわち、Ｙは−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）−または−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）−である）。

水溶性ポリマー試薬は、以下に示される多官能構造を有することができる。
ＰＯＬＹ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
（式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり、
ｘは、２から２５であり、
各Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を有し、３から１０個、好ましくは３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和の炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、
各Ｓは、隣接するＹのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
各Ｓ−Ｗは、独立に、チオール、保護チオール、またはチオール反応性チオール誘導体である。）
好ましくは、２つ以上のＹ基が同一であり、２つ以上のＷ基も典型的には同一である。あるいは、特に二官能試薬（ｘ＝２）において、例えば一方のＳＷが、チオールまたは保護チオールであるのに対して、他方が、チオール反応性誘導体であるか、または一方のＳＷがチオールまたはチオール反応性誘導体であるのに対して、他方が、保護チオールであるというように、２つのＳＷが異なっていてもよい。

上記のように、ｘが２である場合は、ポリマー試薬は、本明細書に記載されている直鎖または「二股」形態を有することができる。ポリマー試薬は、特にｘが３以上である場合は、本明細書に記載されている「多腕」形態を有することもできる。選択された実施形態において、ｘは、２から８、２から６、または２から４である。一実施形態において、ｘは２である。開示されたポリマー試薬のＰＯＬＹ成分は、それ自体、本明細書にさらに詳細に記載されている直鎖、分枝、多腕およびそれらの組合せからなる群より選択される形態を有することが可能である。

上記のように、Ｙの骨格は、好ましくは、各Ｙが、少なくとも４個の炭素原子を有し、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から１０、好ましくは３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる）を有するリンカーになるように飽和している。ＹおよびＰＯＬＹのさらなる好ましい実施形態は、一般には、モノマー試薬ＰＯＬＹ−Ｙ−Ｓ−Ｗについて以上に定められている通りである。

対応するＰＥＧ系多官能ポリマー試薬は、以下の構造を有する。
ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
（式中、
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールポリマーであり、
ｘは、２から２５であり、
各Ｙは、３から１０個、好ましくは３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に記載されている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、
各Ｓは、隣接するＹのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
各Ｓ−Ｗは、独立に、チオール、保護チオールまたはチオール反応性チオール誘導体である。）
好ましくは、多数のＹ基が同一であり、多数のＷ基も典型的には同一である。Ｙの骨格は、好ましくは、各Ｙが、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から１０、好ましくは３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる）を有するリンカーになるように飽和している。

ＹおよびＰＥＧのさらなる好ましい実施形態は、一般には、ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘについて以上に定められている通りである。Ｗ−Ｓ−Ｙ−ＰＥＧ−Ｙ−Ｓ−Ｗの形態の例示的な二官能試薬において、各Ｙは、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−である（式中、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素であり、ｎは、４であり、Ｓ−Ｗは、オルトーピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、各ＰＥＧは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である）。ｍＰＥＧは、好ましくは、１０００から５０００Ｄａ、例えば約２０００から約３４００Ｄａの範囲の分子量を有する。さらなる例示的な試薬において、ＰＥＧおよびＳＷは、同様に定められ、ｎは、３または４であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、メチルである。

関連する態様において、本発明は、以下の構造を有するポリマー複合体を提供する。
ＰＯＬＹ−［Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ａ］_ｘ
（式中、
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり、
ｘは、１から２５であり、
Ｙは、３から１０個、好ましくは３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和の炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、
Ｓ−Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合しているジスルフィド基であり、
Ａは、薬理学的に活性な分子の（本明細書に定められる）共有結合残基である。）
選択された実施形態において、ｘは、１から８、１から６、または１から４である。さらなる実施形態において、ｘは、１または２であり、あるいはｘは１である。ｘが２である場合は、複合体は、本明細書に記載されている直鎖または「二股」形態を有することができる。複合体は、特にｘが３以上である場合は、本明細書に記載されている「多腕」形態を有することもできる。複合体のＰＯＬＹ成分は、それ自体、本明細書に記載されている直鎖、分枝、多腕、およびそれらの組合せからなる群より選択される形態を有することが可能である。

好ましくは、多数のＹ基が同一である。Ｙの炭化水素骨格は、好ましくは飽和しており、Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から１０、好ましくは３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、アルキル、アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる）を有する。より好ましくは、Ｙは、いずれも１つまたは複数の非干渉性置換基を含むことができるＣ_３〜Ｃ_８アルキレン、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキレン、アリール、およびそれらの組合せからなる群より選択される。一実施形態において、Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を有する。

さらなる実施形態において、Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から１０であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択される）を有する直鎖または分枝のアルキレンである。より好ましくは、ｎは、３から８、または３から６であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される。選択された実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は水素である。他の好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記ジスルフィド結合に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、低級アルキル、例えばメチルまたはエチルである。

他の実施形態は、Ｙが式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から１０、好ましくは３から８であり、異なる炭素原子上の２つ基のＲ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシル基等のシクロアルキルを形成するように結合している）である実施形態を含む。

水溶性ポリマーＰＯＬＹは、好ましくは、少なくとも５００、または少なくとも１０００の分子量を有する。ＰＯＬＹの分子量は、典型的には、２００より大きく、約３００Ｋダルトン未満、好ましくは約２００Ｋダルトン未満、より好ましくは約１００Ｋダルトン未満である。一実施形態において、ＰＯＬＹは、好ましくは１４８から約２００から約１０００００ダルトンの分子量、および直鎖、分枝、二股および多腕から選択される形態を有するポリエチレングリコールである。選択された実施形態において、ポリエチレングリコールは、約２００から約４００００ダルトンの分子量を有する。代表的な分子量としては、例えば、５００、１０００、２５００、３５００、５０００、７５００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００および４００００ダルトンが挙げられる。

その結合形態においてＡで表される水溶性ポリマーに結合している分子は、その非結合形態において反応性チオール基を有し、好ましくは、タンパク質、ペプチドおよび小分子、典型的には小有機分子からなる群より選択される。

複合体は、好ましくは、それ自体が水溶性である。複合体を治療用の水性担体等の好適な医薬賦形剤で、または該医薬賦形剤とともに提供することができる。

関連態様において、本発明は、上述の複合体を薬学的に許容可能な担体で被検体に投与することによって、反応性チオール基を有する薬理学的に活性な分子を被検体に配達するための方法を提供する。複合体は、典型的には、該分子を本明細書に記載されている水溶性ポリマー試薬のいずれかと結合することによって調製される。

本質的に疎水性である、本発明の活性化ポリマー試薬における炭化水素をベースとした部分Ｙは、チオールが、例えば二炭素結合によってポリマー部（または結合成分）におけるヘテロ原子に結合される従来技術の試薬に比べて、これらの試薬の二量化に向かう傾向を低減するのに有効である。硫黄原子に隣接する炭素におけるＹの分枝（α分枝）は、二量化を低減するのにさらに有効である。炭化水素をベースとした部分Ｙは、開裂、例えばこれらの試薬を使用して形成された複合体における隣接ジスルフィド結合のインビボ酵素開裂をも低減する。

本明細書に開示されている試薬は、「無リンカー」試薬であることをさらに特徴とする。すなわち、水溶性ポリマー、好ましくはＰＥＧは、炭化水素をベースとしたスペーサ基Ｙに直接結合される。活性結合官能基、すなわちチオールまたは保護チオールとポリマーとの間にアミド、エステルまたはカルバマート等のヘテロ原子含有結合体が存在しないと、得られた複合体の分解の可能性が低減される。また、アミノ等のこれらの結合体が当該試薬内に存在すると、有害な免疫反応が誘発されうる。この可能性は、現行の「無リンカー」試薬を使用することによって、排除または著しく低減される。

本明細書の実施例２に示されているように、本発明のポリマーチオール試薬は、親水性ポリマー（ＰＥＧ）とチオール基の間に二炭素リンカーのみを有する対応する試薬より、合成条件下で安定していた。この安定性の向上は、実施例９および比較例１０にも示されている。本発明のポリマーチオール試薬の結合挙動は、実施例２にも示されているように、二量化しないことが知られているポリマー試薬（マレイミド末端ポリマー）について観察されたものと同様であった。

本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付の図面と併せて本発明の以下の詳細な説明を読めば、より明らかになるであろう。

（発明の詳細な説明）
定義
本明細書に用いられている以下の用語は、指定された意味を有する。明細書および添付の請求項に用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを規定していなければ、複数形を含む。

本明細書に用いられている「ＰＥＧ」または「ポリエチレングリコール」は、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包括することを意味する。典型的には、本発明に使用されるＰＥＧは、以下の２つの構造、すなわち−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−または−Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−（式中、ｍは、一般には、２から約６０００、より典型的には４または５から約２５００である）の一方を含む。広義には、「ＰＥＧ」は、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−であるサブユニットを大多数、すなわち５０％を上回る量含有するポリマーを意味することができる。好ましくは、７５％を上回る、９５％を上回る、または実質的にすべてのモノマーサブユニットが、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−である。ＰＥＧ全体の末端基および構造は、多様であってもよい。ＰＥＧの１つの末端は、一般には、１〜２０個の炭素からなる炭素含有基であり、好ましくは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロ、および先述の基のいずれかの置換形態から選択される末端被覆基を含有することができる。末端被覆基は、また、シランでありうる。末端被覆基は、典型的な合成反応条件下で容易に化学変換しない基である。最も好ましいのは、メチル、エチルまたはベンジル等のアルキル（アルコキシ）またはアラルキル（アラルコキシ）被覆基である。

末端被覆基は、リン脂質を有利に含むこともできる。ポリマーがリン脂質等の末端被覆基を有すると、（同様に末端被覆されたポリマーと有機構造を形成する能力等の）特異的な特性がポリマーに付与される。例示的なリン脂質としては、ホスファチジルコリンと呼ばれるリン脂質の類から選択されるリン脂質が挙げられるが、それらに限定されない。具体的なリン脂質としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルオスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリンおよびレシチンからなる群より選択されるリン脂質が挙げられるが、それらに限定されない。

末端被覆基は、検出可能標識を有利に含むこともできる。当該標識としては、蛍光剤、化学発光剤、酵素標識に使用される成分、着色剤（例えば染料）、金属イオンおよび放射性成分等が挙げられるが、それらに限定されない。

ＰＥＧを好ましくは保護形態の以下に記載される基等の官能基を末端とすることもできる。

本発明に使用される具体的なＰＥＧ形態としては、様々な分子量、構造または幾何学的形状（例えば分枝、直鎖、二股、多腕）を有するＰＥＧが挙げられる。

ポリマーの幾何学的形状または全体構造に関する「分枝」は、２つ以上のポリマー「腕」を有するポリマーを意味する。分枝ポリマーは、２つのポリマー腕、３つのポリマー腕、４つのポリマー腕、６つのポリマー腕、または８以上のポリマー腕を有することができる。１つの特定の種類の高度に分枝したポリマーは、本発明の目的に応じて、分枝ポリマーの構造と異なる構造を有するものと考えられる樹枝状ポリマーまたはデンドリマーである。「分枝点」は、ポリマーが直鎖構造から１つまたは複数のさらなるポリマー腕に分岐または分枝するところの１つまたは複数の原子を含む二分枝点を意味する。

「デンドリマー」は、すべての結合が、規則的な分枝パターン、およびそれぞれが分枝点を与える反復単位で中心の焦点または核から放射状に伸びる球状のサイズ単分散ポリマーである。デンドリマーは、核封入等の一定の樹枝状態特性を発揮して、他の種類のポリマーに対して特異的になっている。

本発明のポリマーの文脈における「水溶性」または「水溶性ポリマー部分」は、室温で水に可溶の任意の部分またはポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーまたは部分は、濾過後の同一溶液が透過する光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を透過する。重量的には、水溶性ポリマー、またはその部分は、好ましくは少なくとも約３５（重量）％の水溶性を有し、より好ましくは少なくとも約５０（重量）％の水溶性を有し、さらにより好ましくは少なくとも約７０（重量）％の水溶性を有し、さらにより好ましくは少なくとも約８５（重量）％の水溶性を有する。しかし、水溶性ポリマーまたは部分は、約９５（重量）％の水溶性を有し、または完全水溶性であることが最も好ましい。

ポリマーの「分子質量」または「分子量」は、特に指定がなければ、数平均分子量を意味する。数平均分子量（Ｍ_ｎ）は、ΣＮ_ｉＭ_ｉ／ΣＮ_ｉ（式中、Ｎ_ｉは、分子量Ｍ_ｉを有するポリマー分子の数（または、それらの分子のモル数）である）で定められる。ポリマーの数平均分子量を浸透圧測定法、末端基滴定および束一的性質によって求めることが可能である。重量平均分子量は、ΣＮ_ｉＭ_ｉ ^２／ΣＮ_ｉＭ_ｉ（式中、Ｎ_ｉは、やはり分子量Ｍ_ｉの分子の数である）で定められる。重量平均分子量を光散乱、小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）、Ｘ線散乱および沈降速度によって求めることが可能である。

本発明のポリマー、または本発明に採用されるポリマーは、多分散性であってもよい。すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量が等しくない。しかし、重量平均分子量（Ｍ_ｗ）の数平均分子量（Ｍ_ｎ）に対する比（Ｍ_ｗ／Ｍ_ｎ）で表される多分散性値は、一般には低く、約１．２未満、好ましくは約１．１５未満、より好ましくは約１．１０未満、さらにより好ましくは約１．０５未満、さらにより好ましくは約１．０３未満、最も好ましくは約１．０２５未満である。

「反応性」または「活性化」という用語は、すぐに、または従来の有機合成条件下で実用的な速度で反応する官能基を意味する。これは、反応しない、または反応するために強い触媒もしくは非実用的な反応条件を必要とする基（すなわち「非反応性」または「不活性」基）とは対照的である。

反応混合物における分子上に存在する官能基に関する「すぐに反応しない」または「不活性」とは、基が、反応混合物において所望の反応を生み出すのに有効な条件下でほとんど無変化状態を維持していることを示す。

「保護基」は、一定の反応条件下における分子中の特定の化学反応官能基の反応を防止または阻止する成分である。該用語は、官能基の保護形態を意味することもできる。保護基は、保護されている化学反応基の種類、ならびに採用される反応条件、および分子中のさらなる反応または保護基の存在に応じて異なる。保護できる官能基としては、例として、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボニル基等が挙げられる。当該官能基の代表的な保護形態としては、カルボン酸については、エステル（ｐ−メトキシベンジルエステル等）、アミドおよびヒドラジド；アミノ基については、カルバマート（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはフルオレニルメトキシカルボニル等）およびアミド；ヒドロキシル基については、エーテルおよびエステル；チオール基については、チオエーテルおよびチオエステル；およびカルボニル基については、アセタールおよびケタール等が挙げられる。当該保護基は、当業者によく知られており、例えば、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９、およびそこに引用されている参考文献に記載されている。

チオールの「チオール反応性誘導体」は、好ましくは中程度の温度、および中性または生理的ｐＨの条件下で、他のチオールと反応して、ジスルフィド結合体を形成することができるチオール誘導体を指す。好ましくは、反応は、安定した副産物のみを形成する。当該誘導体の典型的な例は、オルト−ピリジルジスルフィドおよびＴＮＢ−チオール誘導体（ＴＮＢは、５−チオ−２−ニトロ安息香酸である）。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６， ｐｐ １５０−１５２を参照されたい。

本明細書に用いられているように、「官能基」という用語、またはその任意の同義語は、その保護または誘導形態を包括するものである。同様に、「チオール試薬」または「ポリマーチオール」という用語は、保護または誘導チオール試薬、またはポリマー保護または誘導チオール（ポリマー−ＯＰＳＳ等）を包括する。

「生理的開裂性」または「加水分解性」または「分解性」結合は、生理的条件下で水と反応する（すなわち加水分解する）比較的弱い結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、２つの中心原子を結合する一般的な種類の結合体ばかりでなく、これらの中心原子に結合している置換基に依存する。適切な加水分解的に不安定または弱い結合体としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド、チオエステル、チオールエステルおよび炭酸塩が挙げられるが、限定されない。「酵素分解性結合体」は、１つまたは複数の酵素によって分解する結合体を意味する。

「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全面的または完全にということ、例えばある所定量の９５％または９９％以上を意味する。

「アルキル」とは、典型的には約１から２０原子長の範囲の炭化水素鎖を意味する。当該炭化水素鎖は、好ましくは飽和しているが、必ずしもそうではなく、分枝、または好ましくは直鎖状（枝なし）であってもよい。例示的なアルキル基としては、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、２−メチルブチル、２−メチルプロピル（イソブチル）および３−メチルペンチル等が挙げられる。本明細書に用いられているように、「アルキル」は、３つ以上の炭素原子が言及される場合はシクロアルキルを含む。「アルキレン」とは、二価のアルキル基、例えば−（ＣＨ_２）_ｘ−を意味する。

「低級アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、イソプロピルおよびｔ−ブチルで例示される、１から６の炭素原子、より好ましくは１から４の炭素原子を含有するアルキル基を意味する。

「シクロアルキル」とは、好ましくは３から約１２の炭素原子、より好ましくは３から約８の炭素原子で構成された架橋、融合またはスピロ環式化合物を含む飽和または不飽和環式炭化水素鎖を意味する。「シクロアルキレン」とは、二価のシクロアルキル基を意味する。

本明細書に用いられているように、「アルケニル」とは、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニルおよびテトラデセニル等の、２から１５の炭素原子を有し、少なくとも１つの二重結合を含有する分枝または枝なしの炭化水素基を意味する。

本明細書に用いられている「アルキニル」という用語は、エチニル、ｎ−プロピニル、イソペンチニル、ｎ−ブチニル、オクチニルおよびデシニル等の、２から１５の原子を有し、少なくとも１つの三重結合を含有する分枝または枝なしの炭化水素基を意味する。

「アルコキシ」とは、−ＯＲ基（式中、Ｒは、アルキルまたは置換アルキル、好ましくはＣ_１〜Ｃ_２０アルキル（例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ等）、より好ましくは低級アルキル（すなわちＣ_１〜Ｃ_６またはＣ_１〜Ｃ_４）である）を意味する。

「アリール」とは、単環（例えばフェニル）または２つの縮合または融合環（例えばナフチル）を有する置換または無置換の一価の芳香族ラジカルを意味する。多数のアリール環が未融合（例えばビフェニル）であってもよい。該用語は、フリル、ピロール、ピリジルおよびインドール等の、１つまたは複数の窒素、酸素または硫黄原子を環に有する芳香族環基であるヘテロアリール基を含む。

「アラルキル」とは、その置換基がアリール基でさらに置換されているアルキル、好ましくは低級（Ｃ_１〜Ｃ_４、より好ましくはＣ_１〜Ｃ_２）アルキルを意味する。例は、ベンジルおよびフェネチルである。「アラルコキシ」とは、−ＯＲ形態（式中、Ｒは、アラルキルである）の基を意味する。１つの例は、ベンジルオキシである。

「複素環」とは、環、好ましくは、環原子が、炭素、窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される５から７員環を意味する。好ましくは、環原子は、３から６の炭素原子を含む。芳香族複素環（ヘテロアリール）の例は、以上に示されており、非芳香族複素環としては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリンが挙げられる。

「置換」基または成分は、水素原子が、好ましくは非干渉性置換基である被水素原子または基で置換されたものである。

「非干渉性置換基」とは、分子中に存在すると、分子内に含有される他の官能基と典型的には反応しない置換基である。

これらの基としては、低級アルキル、アルケニルまたはアルキニル；低級アルコキシ；Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル；ハロ、例えばフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード；シアノ；オキソ（ケト）；ニトロ；およびフェニルが挙げられるが、それらに限定されない。

「残基」とは、１つまたは複数の分子との反応後に残留する分子の部分を意味する。例えば、本発明のポリマー複合体における生物活性分子残基は、典型的には、生物活性分子上の反応基のポリマー試薬上の反応基との反応から生じる共有結合体を除いた部分までの生物活性分子の部分に対応する。

「複合体」という用語は、分子、例えば生物活性分子の反応性ポリマー分子、好ましくはポリ（エチレングリコール）に対する共有結合の結果として形成された存在物を意味する。

「薬物」、「生物活性分子」、「生物活性成分」、「生物活性剤」「薬理学的活性剤」および「薬理学的活性分子」という用語の各々は、本明細書に用いられる場合は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物またはヒトから選択できる生体の任意の物理的または生化学的特性に影響しうる任意の物質を意味する。特に、本明細書に用いられているように、生物活性分子は、ヒトまたは他の動物における疾病の診断、治癒、緩和、治療または予防、あるいはヒトまたは動物の肉体的または精神的快適さの向上を目的とした任意の物質を含む。生物活性分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、染料、脂質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルが挙げられるが、それらに限定されない。本発明に対する使用に好適である生物活性剤の類としては、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心臓血管薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子およびステロイド剤等が挙げられるが、それらに限定されない。食品、補助食品、栄養剤、機能性食品、薬物、ワクチン、抗体、ビタミン、および他の有益な薬剤も含められる。

「薬学的に許容可能な賦形剤」または「薬学的に許容可能な担体」とは、本発明の組成物に含めることが可能であり、患者に対して有意な有害毒性効果をもたらさない賦形剤を意味する。

「薬理学的有効量」、「生理的有効量」および「治療有効量」は、血流または目標組織に所望のレベルの活性薬剤および／または複合体を供給するのに必要とされる医薬製剤に存在するポリマー活性剤複合体の量を意味するように本明細書に用いられている。厳密な量は、多くの要因、例えば特定の活性剤、医薬製剤の成分および物理特性、意図する患者集団、および患者の状況等に依存し、本明細書に提供され、関連文献で入手可能である情報に基づいて、当業者が容易に判断できる。

「患者」という用語は、生物活性剤またはその複合体の投与によって予防または治療できる状態にかかっている、またはかかりやすい生体を意味し、ヒトおよび動物の両方を含む。

ポリマーチオール試薬
本発明の水溶性ポリマー試薬は、以下の構造を有する。

ＰＯＬＹ−「Ｙ−Ｓ−Ｗ」_ｘ
（式中、ＰＯＬＹは、水溶性ポリマー部分であり、
ｘは、１から２５であり、
Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を含み、３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合でき、
Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
Ｓ−Ｗは、チオール（すなわち、ＷはＨである）、保護チオール、またはチオール反応性誘導体である。）
一実施形態において、Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）等のチオール反応性誘導体である。保護チオールとしては、例えば、Ｓ−ベンジルまたはＳ−トリチルエーテル等のチオエーテル、およびチオエステルが挙げられる。

硫黄原子Ｓは、アリール環または二重結合ではなく、上記のようにＹのｓｐ^３混成炭素に結合されている。一実施形態において、硫黄原子が結合されている炭素原子は、メチルまたはエチル（α分枝）等の低級アルキル置換基を有する。

スペーサ基Ｙの「骨格」は、より詳細には、ＰＯＬＹとＳを結合する最短の連続炭素鎖と定義づけられる。一実施形態において、Ｙの骨格は、飽和している。例えば、Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から８、好ましくは３から６であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−の異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができる）を有することができる。Ｙがシクロアルキル基を含有する場合は、好ましくは５または６員シクロアルキル基である。

選択された実施形態において、Ｙは、いずれも１つまたは複数の非干渉性置換基を含むことができるＣ_３〜Ｃ_８アルキレン、およびＣ_３〜Ｃ_８アルキレンとＣ_５〜Ｃ_８シクロアルキレンまたはアリールとの組合せからなる群より選択される。好ましくは、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、低級アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、好ましくはメトキシ、エトキシ、フルオロおよびクロロから選択されるせいぜい１または２の非干渉性置換基が含まれる。一実施形態において、ヘテロ原子含有置換基は存在しない。すなわち、Ｙは、炭素および水素からなる。

Ｙの骨格が不飽和である場合は、好ましくは一不飽和であり、すなわち単一の二重または三重炭素−炭素結合を有する。好ましくは、骨格および置換基を含むスペーサ基Ｙは、一不飽和、またはより好ましくは完全飽和である。本実施形態において、Ｙは、完全飽和炭化水素であってもよい。

他の実施形態において、骨格および置換基を含むスペーサ基Ｙは、飽和および芳香族部分、好ましくは飽和および芳香族炭化水素部分からなる。

ポリマー試薬において、Ｙが−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−である場合は、ポリマー部分ＰＯＬＹは、Ｒ^１およびＲ^２の各々が、−（ＣＲ^１Ｒ^２）−のｎ反復体に関しては水素である場合、特にＰＯＬＹが直鎖状ＰＥＧであり、上式においてｘ＝１である場合に、好ましくは少なくとも５００Ｄａの分子量を有する。ＰＯＬＹは、さらに、５００Ｄａを上回る、７５０Ｄａを上回る、または１０００Ｄａを上回る分子量を有することができる。上述のように、約３０００００Ｄａまで、より典型的には約１０００００Ｄａまでの様々なより大きい分子量の範囲を用いることが可能である。

ｘが２である場合は、試薬は、以下にさらに詳細に記載するような二官能ポリマー試薬であり、本明細書に記載されている直鎖または「二股」形態を有することができる。ポリマー試薬は、特にｘが３以上である場合は、本明細書に記載されている「多腕」形態を有することもできる。選択された実施形態において、ｘは、１から８、１から６または１から４である。さらなる実施形態において、ｘは、１または２であり、ｘは、１である。開示された試薬のＰＯＬＹ成分は、それ自体、本明細書にさらに詳細に記載されている直鎖、分枝、多腕、およびそれらの組合せからなる群より選択される形態を有することが可能である。

好ましい実施形態において、水溶性ポリマー部分は、試薬が以下の式を有するように、ポリエチレングリコールである。
ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
（式中、
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、
Ｙは、３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、
Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
ｘは、１から２５であり、
Ｓ−Ｗは、チオール（すなわち、ＷはＨである）、保護チオールまたはチオール反応性誘導体である。）
本発明者等は、水溶性ポリマー部分と水溶性ポリマーチオールにおけるチオール基との間に疎水性スペーサ基を含めることによって、当該分子が二量化して、ジスルフィドを形成する傾向が低減されることを見いだした。よって、以下に実証されるように、当該試薬の調製、および他の分子とのそれらの結合における収率が高められる。

本明細書に記載されているスペーサ基は、分枝炭素を含むことができる、好ましくは少なくとも４個の炭素原子を含有する３個以上の炭素の長さの炭化水素をベースとした基（例えばイソブチレンまたは１−メチルプロピレン、結合体）である。「炭化水素をベースとした」と記載されているが、スペーサ基は、本発明に定められている限られた数の非干渉性置換基を含むことができる。しかし、好ましくは、スペーサ基は、炭素および水素からなる。

ポリマー試薬の好ましい実施形態において、Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択される）を有する直鎖または分枝のアルキレンである。好ましくは０から２、より好ましくは０または１の当該非干渉性置換基が含まれる。

好ましくは、ｎは、４から８であり、より好ましくは４から６である。一実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される。好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、−（ＣＲ^１Ｒ^２）−のｎ反復体に関しては水素である。他の好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素（α−炭素）上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、低級アルキル、好ましくはメチルまたはエチル（ａ−分枝）である。一実施形態において、ａ−分枝基は、メチルである。

Ｙが−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−であり、ｎが４から８であり、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２が、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合しているＹの実施形態において、シクロアルキル基は、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシル基である。当該実施形態において、硫黄原子は、好ましくは、Ｙの非環式炭素に結合される。

飽和骨格を有する例示的なスペーサ基Ｙは、以下の式を有する（曲線は、第１の構造が、例えばｎ−ブチレンを表すように、ＰＯＬＹまたはＳに対する結合を示す）。

上記のように、スペーサ基の「骨格」は、ＰＯＬＹを硫黄原子に結合する最短の連続炭素鎖である。よって、上式の第２列における構造の各々は、五炭素骨格を有する。また、この定義により、最後の構造は、飽和骨格を示しているが、スペーサ基は、全体として不飽和である。

以下に示されている１つの例示的なポリマー試薬において、ＰＯＬＹは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）であり、Ｙは、−（ＣＨ_２）_４−であり、−Ｓ−Ｗは、以下に示されているオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）、またはＳＨである。ｍＰＥＧは、好ましくは、５０００または３００００Ｄａの範囲、例えば約５０００、約１００００、約２００００または約３００００Ｄａの分子量を有する。

さらなる実施形態において、ポリマー試薬は、Ｗ−Ｓ−Ｙ−ＰＯＬＹ−Ｙ−Ｓ−Ｗ（式中、ＰＯＬＹ、ＹおよびＳ−Ｗは以上に定められている通りである）で表される二官能構造である。典型的には、必ずしもそうではないが、ポリマー試薬は対称性である。以下に示されているこの構造の例示的なポリマー試薬は、ＰＯＬＹがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、各Ｙが−（ＣＨ_２）_４−であり、各−Ｓ−Ｗが、以下に示されているオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）、またはＳＨであるポリマー試薬である。ＰＥＧは、好ましくは、約１０００から５０００Ｄａの範囲、例えば２０００または３４００Ｄａの分子量を有する。

さらなる例示的なポリマー試薬としては、一般式ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ（式中、ｘは、１または２であり、Ｙは、−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−であり、Ｓ−Ｗは、ＳＨまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である）の試薬が挙げられる。ｘが１である場合は、ＰＥＧは、好ましくは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。当該試薬を以下に示す（「Ｍｅ」は、随所でメチルを表す）

さらなる例示的なポリマー試薬としては、一般式ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ（式中、ｘは、１または２であり、Ｙは、−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−であり、Ｓ−Ｗは、ＳＨまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である）の試薬が挙げられる。ｘが１である場合は、ＰＥＧは、好ましくはｍＰＥＧである。当該試薬を以下に示す。

ポリマー試薬の他の例示的な類は、一般式ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ（式中、ｘは、１であり、Ｙは、−（ＣＨ_２）_４−であり、Ｓ−Ｗは、ＳＨまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、ＰＥＧは、以下の構造を末端とする）のポリマー試薬である。

このような試薬は、一般に、下式で示される。

好ましくは、Ｙ−ＳＷに結合しているＰＥＧは、約５００Ｄａ以下、または約２００Ｄａ以下の分子量を有し、例えば、ｍ＝２から１０、好ましくは２から４である。一実施形態において、ｍ＝４である。示されている末端分枝構造における各ｍＰＥＧは、好ましくは、約５ＫＤａから約２０ＫＤａの分子量を有し、例えばｎ＝約１１０から約４５０である。各ｍＰＥＧは、分子量が例えば５、１０、１５または２０ＫＤａであってもよい。

本明細書に記載されている試薬は、「無リンカー」チオールであることを特徴とする。すなわち、水溶性ポリマーは、炭化水素をベースとしたスペーサ基Ｙに直接結合される。例えば、ＰＥＧにおける−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−等のポリ（アルキレン）グリコールの反復アルキレングリコール単位の酸素原子は、Ｙに直接結合される。特にエステル、カルバマートまたはアミド等の結合体におけるさらなるヘテロ原子が、活性結合官能基、すなわちチオールまたは保護チオールとポリマーとの間に存在しないと、結合ポリマーの分解の可能性が低減される。また、当該試薬にアミド等の当該ヘテロ原子含有結合体が存在すると、有害な免疫反応が誘発されうる。この可能性は、現行の「無リンカー」試薬によって排除または著しく低減される。

ポリマー試薬において、特にＰＯＬＹがＰＥＧである実施形態では、ポリマー部分ＰＯＬＹは、好ましくは少なくとも５００Ｄａの分子量を有する。ポリマー部分ＰＯＬＹの様々な好ましい実施形態を以下に詳細に説明する。好ましくは、ポリマー部分「ＰＯＬＹ」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコールは、上記規定の範囲内において、約８８から約１０００００ダルトンの様々な分子量を有することができる。選択された実施形態において、ポリエチレングリコールは、１４８（例えばトリマー＋結合酸素原子）から約２００から約４００００ダルトンの重量平均分子質量を有する。代表的な分子量としては、例えば、５００、１０００、２０００、３０００、３５００、５０００、７５００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００および４００００ダルトンが挙げられる。一般には、二官能または多官能試薬は、一官能試薬より低分子量のＰＯＬＹまたはＰＥＧ部分を採用することになる。

ポリマーは、本明細書にさらに詳細に記載されている直鎖、分枝、二股、多腕、およびそれらの組合せからなる群より選択される構造を有することができる。

ポリマー部分ＰＯＬＹ
本発明のポリマー試薬を調製するのに使用される代表的な水溶性ポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー等のポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オレフィン族アルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、多（糖類）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリンおよびポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）が挙げられる。ＰＯＬＹは、ホモポリマー、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互トリポリマー、ランダムトリポリマー、または上記のポリマーのいずれかのブロックトリポリマーでありうる。水溶性ポリマー部分は、好ましくは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、またはその誘導体である。

好ましくは、ポリマーは、親水性ポリマー、例えば、約２５未満のサブユニットのプロピレンオキシドまたは他の類似の疎水性ポリマー部分を含有するポリマーである。ポリマーは、代替的な実施形態において、プロピレンオキシドまたは類似の疎水性サブユニットを有していなくてもよい。一例において、ポリマーは、好ましくは、プルロニック型ポリマーではない。さらに他の特定の実施形態において、ポリマーは、好ましくは、固相支持体に結合されていない。

ポリマー部分は、任意の数の異なる幾何学的形状を有することができ、例えば、ＰＯＬＹは、直鎖、分枝または多腕状でありうる。最も典型的には、ＰＯＬＹは、直鎖状または分枝状であり、例えば２つのポリマー腕を有する。本明細書の説明の多くは、例示のＰＯＬＹとしてＰＥＧに集中しているが、本明細書に提示されている説明および構造を、上述の水溶性ポリマー部分のいずれかを包括するように容易に拡張することが可能である。

チオール官能基を１つまたは２つのみ有する水溶性ポリマーが、典型的には使用され、本明細書に例示されているが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２以上の当該官能基を有するポリマーを使用することが可能である。水溶性ポリマー部分に付随するチオール成分の数の上限の非限定的な例としては、約１から約５００、１から約１００、約１から約８０、約１から約４０、約１から約２０、および約１から約１０が挙げられる。

好ましい種類の水溶性ポリマー、すなわちＰＥＧは、以下により完全に記載される末端被覆ＰＥＧ、二股ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ、およびモノマーサブユニットを分離する１つまたは複数の分解性結合体を含有するＰＥＧを含む直鎖、分枝または多腕形態のいずれかのポリ（エチレングリコール）を包括する。ＰＥＧポリマー部分における反復エチレングリコール単位の数は、典型的には、約３から約４０００、または約１２から約３０００、またはより好ましくは約２０から約１０００の範囲である。

好ましい末端被覆ＰＥＧは、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケニルオキシ、置換アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、置換アルキニルオキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシ等の末端被覆成分を有するＰＥＧである。好ましい末端被覆基は、メトキシ、エトキシおよびベンジルオキシ等のＣ_１〜Ｃ_２０アルコキシである。末端被覆基は、リン脂質を有利に含むことも可能である。例示的なリン脂質としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン、およびレシチンが挙げられる。

チオール化されていないポリマーの末端は、被覆基の代替として、好ましくは保護形態である反応性成分を含むことができる。当該反応性成分としては、該当する場合はその活性化および保護形態を含むヒドロキシ、アミノ、エステル、炭酸塩、アルデヒド、アセタール、アルデヒド水和物、ケトン、ケタール、ケトン水和物、アルケニル、アクリル酸塩、メタクリル酸塩、アクリルアミド、スルホン、カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジド、尿素、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、アルコキシ、ベンジルオキシ、シラン、脂質、リン脂質、ビオチンおよびフルオレセインが挙げられる。好ましいのは、官能基であるＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、炭酸１−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、アミン、ビニルスルホン、マレイミド、炭酸Ｎ−スクシンイミジル、ヒドラジド、プロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、コハク酸スクシンイミジル、スクシンイミジルエステル、グリシジルエーテル、オキシカルボニルイミダゾール、炭酸ｐ−ニトロフェニル、アルデヒド、オルトピリジル−ジスルフィドおよびアクリロールである。

これらおよび他の官能基は、例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれている以下の参考文献に記載されている：炭酸Ｎ−スクシンイミジル（米国特許第５，２８１，６９８号および第５，４６８，４７８号）、アミン（Ｂｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １８２：１３７９ （１９８１）； Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｅｕｒ． Ｐｏｌｙｍ． Ｊ． １９：１１７７ （１９８３））、ヒドラジド（Ａｎｄｒｅｓｚら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １７９：３０１ （１９７８））、プロピオン酸スクシンイミジルおよびブタン酸スクシンイミジル（Ｏｌｓｏｎら、ｉｎ Ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． １７０−１８１， Ｈａｒｒｉｓ ＆ Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｅｄｓ．， ＡＣＳ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ （１９９７）； 米国特許第５，６７２，６６２号）、コハク酸スクシンイミジル（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ７：１７５ （１９８４） ａｎｄ Ｊｏｐｐｉｃｈら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １８０：１３８１ （１９７９））、スクシンイミジルエステル（米国特許第４，６７０，４１７号）、炭酸ベンゾトリアゾール（米国特許第５，６５０，２３４号）、グリシジルエーテル（Ｐｉｔｈａら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９４：１１ （１９７９）； Ｅｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３：３５４ （１９９１））、オキシカルボニルイミダゾール（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３１：２５ （１９８３）； Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １：２５１ （１９８５））、炭酸ｐ−ニトロフェニル（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １１：１４１ （１９８５）； Ｓａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２７：４５ （１９９１））、アルデヒド（Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｃｈｅｍ． Ｅｄ． ２２：３４１ （１９８４）；米国特許第５，８２４，７８４号；米国特許第５，２５２，７１４号）、マレイミド（Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：３４３ （１９９０）； Ｒｏｍａｎｉら、ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２：２９ （１９８４）； Ｋｏｇａｎ， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍ． ２２：２４１７ （１９９２））、オルトピリジル−ジスルフィド（Ｗｏｇｈｉｒｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ４：３１４ （１９９３））、アクリロール（Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２６：５８１ （１９９３））およびビニルスルホン（米国特許第５，９００，４６１号）。

記載されているＰＯＬＹ型は、直鎖状ポリマー部分ならびに分枝または多腕ポリマー部分を包括する。例としては、２つの腕、３つの腕、４つの腕、５つの腕、６つの腕、７つの腕または８つ以上の腕を有するＰＥＧ分子が挙げられる。本発明のチオール分子を調製するのに使用される分枝ポリマーは、２つから３００程度の反応性末端を有することができる。好ましいのは、２から８つのポリマー腕を有する分枝または多腕ＰＥＧである。本発明のポリマーチオールを調製するのに使用される分枝または多腕ポリマーとしては、式Ｒ（ＰＯＬＹ）_ｎ（式中、Ｒは、ＰＥＧ等の２つ以上のＰＯＬＹ腕がそこから伸びる中心または核分子である）でより広く表されるポリマーが挙げられる。変数ｎは、ＰＯＬＹ腕の数を表し、ポリマー腕の各々は、独立に末端被覆されるか、またはその末端にヒドロキシルまたは他の反応基を有することができ、少なくとも１つのポリマー腕が、当該反応基を有する。上記の式Ｒ（ＰＥＧ）_ｎで広く表されるＰＥＧ等の分枝ＰＥＧは、少なくとも２つのポリマー腕から約３００までのポリマー腕を有する（すなわち、ｎは２から約３００の範囲である）。好ましくは、当該分枝ＰＥＧは、２から約２５のポリマー腕、より好ましくは２から約２０のポリマー腕、さらにより好ましくは２から約１５以下のポリマー腕を有する。３、４、５、６、７または８つの腕を有する多腕ポリマーが最も好ましい。

上述の分枝ＰＥＧにおける好ましい核分子は、ポリオールである。当該ポリオールとしては、エチレングリコール、アルカンジオール、アルキルグリコール、アルキルジエンアルキルジオール、アルキルシクロアルカンジオール、１，５−デカリンジオール、４，８−ビス（ヒドロキシメチル）トリシクロデカン、シクロアルキルジエンジオール、ジヒドロキシアルカン、トリヒドロキシアルカンおよびテトラヒドロキシアルカン等を含む、１から１０個の炭素原子および１から１０個のヒドロキシル基を有する脂肪族ポリオールが挙げられる。また、前者の類のいくつかまたはすべては、ジペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトールおよびヘキサグリセロール等を含む核分子として機能することができる。マンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシロール、クエブラキトール、スリエトール、アラビトール、エリスリトール、アドニトール、ダシトール、ファコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、ソルボース、マンノース、ピラノース、アルトロース、タロース、タギトース、ピラノシド、スクロース、ラクトースおよびマルトース等の直鎖状または閉環状の糖および糖アルコールを含む脂環式ポリオールを採用することもできる。さらなる脂肪族ポリオールとしては、グリセルアルデヒド、グルコース、リボース、マンノース、ガラクトース誘導体および関連する立体異性体が挙げられる。使用できる他の核ポリオールとしては、クラウンエーテル、シクロデキストリン、デキストリン、およびデンプンおよびアミロース等の他の炭水化物が挙げられる。好ましいポリオールとしては、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトールおよびトリメチロールプロパンが挙げられる。

本発明のポリマーチオールに対応する多腕構造をＲ−（ＰＯＬＹ−Ｙ−Ｓ−Ｗ）ｘ（式中、ＰＯＬＹ、ＹおよびＳ−Ｗは、上記の通りであり、Ｒは、多腕構造の核分子を表し、ｘは、好ましくは３から約８である）で表すことが可能である。ポリマー腕の各々は、独立に末端被覆されるか、またはその末端にチオール基を有することが可能であり、少なくとも１つのポリマー腕が、チオール（または保護チオール）基を有する。当該構造体を調製するのに好適な多腕ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ所在）から入手可能である。

あるいは、ポリオール部分は、例えばＰＥＧ−（Ｙ−Ｓ−Ｗ）_２の全体的に二股構造を有することができる。この種のポリマー部分は、２つの活性剤との反応に有用であり、それら２つの活性剤は、Ｙの選択に応じて、厳密または所定の距離だけ離れて位置している。

本発明の複合体を調製するのに使用される直鎖または分枝構造を有する代表的なＰＥＧをＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ所在）から購入することができる。例示的な構造は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている「高度なＰＥＧ化のためのポリエチレングリコールおよび誘導体」という題名のＮｅｋｔａｒの２００４年カタログに記載されている。

本明細書に提示されている代表的な構造のいずれかにおいて、最初に投与された複合体より小さいＰＯＬＹ鎖を有する複合体のインビボ生成を可能にするために、１つまたは複数の分解性結合体をＰＯＬＹ部分に含有することが可能である。適切な生理的開裂性結合体としては、エステル、炭酸エステル、カルバマート、硫酸塩、リン酸塩、アシルオキシアルキルエーテル、アセタールおよびケタールが挙げられるが、それらに限定されない。当該結合体は、好ましくは、保管および初期投与に際して安定している。

ＰＯＬＹの分子量は、典型的には、約１００から約１０００００ダルトン、約５００から約８００００ダルトン、約１０００から約５００００ダルトン、約２０００から約２５０００ダルトン、および約５０００から約２００００ダルトンのいずれかである。例示的な分子量としては、約１０００、約５０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約２５０００、約３００００および約４００００ダルトンが挙げられる。低分子量のＰＯＬＹは、約２５０、５００、７５０、１０００、２０００または５０００ダルトンの分子量を有する。例示的なチオール化ポリマーは、５０００、２００００および４００００ダルトンからなる群より選択される分子量を有するＰＥＧを含む。

本発明の特定の実施形態において、本明細書に提示されているポリマーチオール試薬は、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、３００００および４００００ダルトンの分子量の１つを有するＰＥＧ部分を有する。

サブユニットの数の観点から、本発明に使用されるＰＥＧは、典型的には、１２から約４０００のサブユニット、約１５から約２０００のサブユニット、約２０から約１０００のサブユニット、約２５から約７５０のサブユニット、約３０から約５００のサブユニットの範囲のいずれかであるいくつかの（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−）サブユニットを含む。

試薬の調製
「無リンカー」ポリアルキレンオキシ−チオール試薬を調製する１つの方法をスキーム１に示す。示されている反応において、モノメトキシＰＥＧ等の、１つの末端に被覆基を有するポリアルキレングリコールをＮａＨ等の強塩基でアルコキシル化し、この試薬をジ（ハロアルキルスルフィド）と結合させて、ポリマージエーテルジスルフィドを形成する。次いで、この中間体をジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤で開裂させて、ポリアルキレンオキシ−チオール試薬を与えることができる。

スキーム２に示されている他の合成経路において、エチレンオキシドを重合するための核材料としてジ（ヒドロキシアルキルスルフィド）を使用して、ＰＥＧジエーテルジスルフィドを形成する。末端を、例えばメチル基で被覆する。次いで、ジスルフィドをジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤で開裂させて、ポリアルキレンオキシ−チオール試薬を得ることができる。

さらなる手法をスキーム３に例示する。この経路において、試薬ＰＯＬＹ−Ｙ−ＯＨ（式中、Ｙは以上に定められている通りである）が提供される。当該試薬を、例えば、ｍ−ＰＥＧ−ＯＨ等のＰＯＬＹ−ＯＨをＮａＨ等の強酸と反応させて、アルコキシド塩を形成し、次いで４−ブロモ−１−ブタノール等のハロアルカノールと反応させることによって調製することができる。末端ヒドロキシ基をトシレートまたはメシレート等の脱離基に変換し、次いでこの化合物をチオ尿素と反応させて、脱離基を転移させる、次いで、末端チオウロニウム塩を塩基で開裂させて、末端チオールを得る。以下の実施例１では、脱離基がハロゲン化物であるこのスキームの変形が採用されている。

これらの試薬のいずれかにおいて、トリチル、モノチオ、ジチオおよびアミノチオアセタールを含むアルキルおよびベンジルチオエーテルのようなチオエーテル、チオエステル、チオカーボネート、チオカルバマートおよびスルフェニル誘導体等のチオール保護成分を使用してチオールを保護することができる。保管時に保護基を使用すると、試薬が二量化する傾向がさらに低減される。チオールを、標準的な保管状結果で安定するスキーム３に示されるオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）に変換することもできる。実施例２に示されるように、適切な反応条件下で、ＯＰＳＳ基は、成分中のチオール基と円滑に反応して、水溶性ポリマーに結合される。

好ましくは、本発明のポリマー試薬は、アルゴンまたは窒素等の不活性雰囲気下で保管される。本発明のポリマーの水分への曝露を最小限に抑えることも好ましい。したがって、好ましい保管条件は、約−１５℃未満の温度の乾燥アルゴンまたは他の乾燥不活性ガス下で保管することである。より低温では望ましくない副反応が弱められるため、低温条件下での保管が好ましい。例えば、ポリマー部分がＰＥＧである場合は、ＰＥＧは、酸素と徐々に反応して、過酸化物を形成することで、究極的には、鎖の開裂をもたらし、ＰＥＧ試薬の多分酸性を高めることができる。上記に鑑みて、本発明のポリマーを暗所で保管することがさらに好ましい。

ポリマー複合体
本発明は、本明細書に記載されているポリマーチオール試薬のうちの任意の試薬の反応によって形成された複合体をも包括する。概して、本発明のポリマー試薬は、反応に利用可能な少なくとも１つのチオール基を有する活性剤に対する結合に有用である。

本発明の複合体は、典型的には、ＰＯＬＹ−［Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ａ］_ｘの構造（式中、ＰＯＬＹは、以上に定められている通りであり、好ましい実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ｘは、１から２５であり、「Ａ」は、結合後の活性剤の残基を表す）を有することになる。選択された実施形態において、ｘは、１から８、１から６または１から４である。さらなる実施形態において、ｘは、１であり、またはｘは２である。Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を有し、３から１０個、好ましくは３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、低級アルキル、低級アルケニル、および本明細書に定められている非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和の炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、該骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができる。

選択された実施形態において、Ｙは、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−の構造（式中、ｎは、３から１０、好ましくは３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択される）を有する。異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができる。チオール（または保護チオール）の硫黄原子は、アリール環または二重結合ではなく、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合されている。

Ｙの選択された実施形態において、Ｙは、いずれも以上に定められている１つまたは複数の非干渉性置換基を含むことができるＣ_３〜Ｃ_８アルキレン、またはＣ_３〜Ｃ_８アルキレンとＣ_５〜Ｃ_８シクロアルキレンまたはアリールとの組合せである。好ましくは、０から２、より好ましくは０または１の当該非干渉性置換基が含まれる。

さらなる実施形態において、Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、４から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、低級アルキル、低級アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択される）を有する直鎖または分枝のアルキレンである。好ましくは、ｎは、４から６であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される。一実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、−（ＣＲ^１Ｒ^２）−のｎ反復体に関しては水素である。他の好ましい実施形態において、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素（α炭素）上のＲ^１を除いて水素であり、前記Ｒ^１は、低級アルキル、好ましくはメチルまたはエチルである。

Ｙが−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−（式中、ｎは、４から８であり、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合している）であるＹの実施形態において、シクロアルキル基は、好ましくは、シクロペンチルまたはシクロヘキシル基である。

他の態様において、本発明の複合体は、ＰＯＬＹ_Ａ−Ｌ−ＳＳ−Ｙ−ＰＯＬＹ_Ｂ−Ｙ’−ＳＳ−Ａの構造を有することができる。各ＰＯＬＹは、以上に定められている水溶性ポリマー部分であり、ＰＯＬＹ_Ｂは、例えば１０ＫＤａ以下、好ましくは５ＫＤａ以下、より好ましくは２ＫＤａ以下の低分子量であり、ＰＯＬＹ_ＡとＰＯＬＹ_Ｂを合わせた分子量は、少なくとも３ＫＤａである。ＰＯＬＹ_Ａの分子量は、一般には、例えば約２ＫＤａを上回る、好ましくは５ＫＤａ以上、より好ましくは１０ＫＤａ以上の中乃至高分子量であるが、必ずしもそうであるとは限らない。

ＹおよびＹ’の各々は、Ｙについて以上に定められているスペーサ基であり、それらは、同一であっても異なっていてもよい。一般には、ＹおよびＹ’は、同一のスペーサ基である。Ｌは、ＰＯＬＹ_Ａと隣接するジスルフィド結合体との間のリンカーである。典型的には、当該リンカーは、直接結合、または好ましくは、アルキル（Ｃ−Ｃ）、アルケニル、エーテル、エステル、アミド、カルバマートおよびチオエステル結合体から選択される基を含有する約１０までの原子の長さの原子の鎖である。Ｌは、本明細書に記載されているＹの実施形態であるが、必ずしもそうであるとは限らない。

これらの複合体は、一般には、Ｗ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＰＯＬＹ_Ｂ−Ｙ’−Ｓ−Ｓ−Ｗ（式中、Ｓ−Ｗは、チオール、または好ましくはＯＰＳＳ等のチオール反応性誘導体である）の形態の低分子量試薬を、最初に生物活性分子、Ａ−ＳＨ、例えば遊離システイン残基を有する（または有するように修飾された）タンパク質と反応させて、Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＰＯＬＹ_Ｂ−Ｙ’−Ｓ−Ｓ−Ｗの中間体を形成する（以下の実施例８〜１１に例示される）反応連鎖の生成物である。次いで、この中間体をＰＯＬＹ_Ａ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｗの形態の（典型的には）高分子量試薬と反応させる。

特に封鎖チオール基を有する生体分子についての当該スキームの利点は、低分子量試薬が、より高分子量の試薬より当該封鎖チオール基と効率的に反応できることである。したがって、このスキームを介せば、封止チオールと直接反応させるよりも高収率でより高分子量のポリマーをＡに結合させることができる。

しかし、最初の試薬Ｗ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＰＯＬＹ_Ｂ−Ｙ’−Ｓ−Ｓ−Ｗが本明細書に記載されている親水性スペーサ基Ｙを欠いている場合は、該スキームは、結合工程における収率低収率により機能しないことになる。この違いは、以下の比較例９および１０に例示されている。

ポリマーチオール試薬を、活性チオール基を有する固体支持体または表面に結合させることができるが、概して、本明細書に提示される複合体は、好ましくは水溶性または水分散性である。

本発明の活性化ポリマーに結合するためのシステイン残基に存在するようなチオール基は、自然に存在していてもよいし（すなわち天然形態でタンパク質または他の分子中に存在していてもよいし）、例えば、標準的な遺伝子工学技術を用いて、自然に存在するアミノ酸の代わりにタンパク質の天然配列に挿入することによって導入されてもよい。

活性剤が、反応性チオール基をほとんどまたは１つしか含有しない場合は、得られた組成物は、単一のポリマー複合体種のみを有利に含有することができる。これは、典型的には、結合のために利用可能な（アミン等の他の活性基と比較して）比較的少数のスルフィドリル基を有するタンパク質に対する結合に有用である。したがって、チオール基を介する共有結合は、目標タンパク質のより選択的な修飾をもたらすことができる。よって、ポリマーチオールを使用すると、親タンパク質に結合されるポリマー誘導体の数およびポリマー結合の位置の双方において、得られた複合体に対するより高度な制御が可能になる。

結合のための候補分子
本発明の複合体を調製するのに使用される生物活性剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、多糖類、ステロイド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪、電解質および小分子（好ましくは不溶性小分子）等を含む（ただし、それらに限定されない）いくつかの構造体類の１つに含まれうる。好ましくは、本発明のポリマーに結合するための活性剤は、天然スルフィドリル基を有し、結合に好適な少なくとも１つの反応性スルフィドリル基を含有するように修飾される。

本発明のポリマーチオールに結合するための好ましいペプチドまたはタンパク質としては、ＥＰＯ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、共通ＩＦＮ、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ＩＬ−２、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）（インフリキシマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）（リツキシマブ）、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）（エタネルセプト）、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）（パリビツマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（商標）（アブシキマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラツジマブ）、ｔＰＡ、Ｃｅｒｉｚｙｍｅ（商標）（イミグルセラーゼ）、Ｂ型肝炎ワクチン、ｒＤＮＡｓｅ、アルファ−１プロテイナーゼ阻害剤、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、インシュリン、ＦＳＨおよびＰＴＨが挙げられる。選択された実施形態において、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦである。

上記の例示的な生物活性剤は、類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、異性体、およびそれらの薬学的に許容可能な塩の形態を適宜包括するように意図されている。ペプチドおよびタンパク質に関して、本発明は、合成形態、組換え形態、天然形態、グリコシル化形態および非グリコシル化形態、ならびにそれらの生物活性断片を包括するように意図されている。上記生物活性タンパク質は、さらに、得られた変形タンパク質が、親（天然）タンパク質の少なくとも一定の程度の活性を有するのであれば、１つまたは複数のアミノ酸が置換（例えばシステイン）または削除等された変形を包括するように意図されている。

好適な薬剤を、例えば、催眠剤および鎮静剤、精神賦活薬、精神安定剤、呼吸薬、抗痙攣薬、筋弛緩剤、抗パーキンソン病薬（ドーパミン拮抗薬）、鎮痛剤、抗炎症剤、抗不安薬（穏和安定薬）、食欲抑制薬、抗偏頭痛薬、筋肉収縮剤、抗感染薬（抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、ワクチン）、抗関節炎薬、抗マラリア薬、鎮吐薬、アネピレプティク（ａｎｅｐｉｌｅｐｔｉｃｓ）、気管支拡張薬、サイトカイン、成長因子、抗癌剤、血小板凝集阻止薬、抗高血圧薬、心臓血管薬、抗不整脈薬、酸化防止剤、抗喘息薬、避妊薬を含むホルモン剤、交感神経様作動薬、利尿薬、脂質調節薬、抗男性ホルモン薬、抗寄生虫薬、抗凝固剤、新生物薬、抗新生物薬、血糖低下薬、栄養剤および栄養補助食品、成長補助剤、抗腸炎薬、ワクチン、抗体、診断薬およびコントラスト増強剤から選択することができる。

活性剤の他の具体的な例としては、アスパラギナーゼ、アムドキソビル（ＤＡＰＤ）、抗鬱薬、ベカプレルミン、カルシトニン、シアノビリン、デニロイキンジフチトクス、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯアゴニスト（例えば、約１０〜４０のアミノ酸の長さを有し、ＷＯ９６／４０７４９に記載されている特定の核配列を含むペプチド）、ドルナーゼアルファ、赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、Ｖ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＸＩＩ因子、ＸＩＩＩ因子、フォンウィルブランド因子等の凝固因子、セレダーゼ、セレザイム、アルファ−グルコシダーゼ、コラーゲン、シクロスポリン、アルファデフェンシン、ベータデフェンシン、エキセンジン−４、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、アルファ−１プロテイナーゼ阻害剤、エルカトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、フィブリノゲン、フィルグラスチム、成長ホルモンヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ＧＲＯ−ベータ、ＧＲＯ−ベータ抗体、骨形態形成タンパク質−２、骨形態形成タンパク質−６、ＯＰ−１等の骨形態形成タンパク質、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性繊維芽細胞成長因子、ＣＤ−４０リガンド、ヘパリン、ヒト血清アルブミン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンオメガ、インターフェロンタウ、共通インターフェロン等のインターフェロン、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２、インターロイキン−２融合タンパク質、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−１７受容体等のインターロイキンおよびインターロイキン受容体、ラクトフェリンおよびラクトフェリン断片、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、インシュリン、プロインシュリン、インシュリン類似体（例えば、米国特許第５，９２２，６７５号に記載されている一アシル化インシュリン）、アミリン、Ｃ−ペプチド、ソマトスタチン、オクトレオチドを含むソマトスタチン類似体、バソプレシン、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インフルエンザワクチン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、インシュリントロピン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、アルテプラーゼ、ウロキナーゼ、レテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼおよびテネテプラーゼ等のプラスミノゲン活性剤、神経成長因子（ＮＧＦ）、オステオプロテゲリン、血小板由来成長因子、組織成長因子、形質転換成長因子−１、血管内皮細胞成長因子、白血病阻害因子、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、膠細胞成長因子（ＧＧＦ）、Ｔ細胞受容体、ＣＤ分子／抗原、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、単球化学誘引タンパク質−１、内皮成長因子、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）、グルカゴン様ペプチド、ソマトトロプチン、サイモシンアルファ１、サイモシンアルファ１ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、サイモシンベータ１０、サイモシンベータ９、サイモシンベータ４、アルファ−１抗トリプシン、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）化合物、ＶＬＡ−４（極遅発型抗原−４）、ＶＬＡ−４阻害剤、ビスホスポネート、呼吸器合胞体ウイルス抗体、嚢胞性線維症膜制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、デオキシレイボヌクレアーゼ（Ｄｎａｓｅ）、殺菌剤／透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）および抗ＣＭＶ抗体が挙げられるが、それらに限定されない。例示的なモノクロナル抗体としては、エタネルセプト（ＩｇＧ１のＦｃ部に結合しているヒト７５ｋＤ ＴＮＦ受容体の細胞外リガンド結合部からなるダイマー融合タンパク質）、アブシキシマブ、アフェリオモマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、インフリキシマブ、イブリツモマブチウエキセタン、ミツモマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ヨウ素１３１トシツモマブ複合体、オリズマブ、リツキシマブおよびトラツズマブ（ヘルセプチン）が挙げられる。

ポリマーに対する二重結合に好適なさらなる薬剤としては、アミフォスチン、アミオダロン、アミノカプロン酸、アミノ馬尿酸ナトリウム、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノサリチル酸、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、アントラシクリン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カベルゴリン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシン、シラスタチンナトリウム、シスプラチン、クラドルビン、クロドロネート、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、カムプトテシン、１３−シスレチノイン酸、全トランスレチノイン酸、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デフェロキサミン、デキサメタホン、ジクロフェナク、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エスセメスタン、フェキソフェナジン、フルダラビン、フルドロコルチソン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、エピネフリン、Ｌドーパ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イトラコナゾール、ゴセレリン、レトロゾール、ロイコボリン、レバミソール、リシノプリル、ロボチロキシンナトリウム、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、重酒石酸メタラミノール、メトトレキセート、メトクロプラミド、メキシレチン、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ナロキソン、ニコチン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミミドロネート、ペントスタチン、ピルカミシン、ポルフィメル、プレドニソン、プロカルバジン、プロクロルペラジン、オンダンセトロン、ラルチトレキシド、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリムス、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、テトラヒドロカナビノール、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ドラセトロン、グラニセトロン、フォルモテロール、フルチカソン、ロイプロリド、ミダゾラム、アルプラゾラム、アムフォテリシンＢ、ポドフィロトキシン、ヌクレオシド抗ウイルス剤、アロイルヒドラゾン、スマトリプタン；エリスロマイシン、オレアンドマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、ダベシン、アジスロマイシン、フルリスロマイシン、ジリスロマイシン、ジョサマイシン、スピロマイシン、ミデカマイシン、ロイコマイシン、ミオカマイシン、ロキタマイシン、アンダジスロマイシンおよびスウィノリドＡ等のマクロリド；シプロフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、トロバフロキサシン、アラトロフロキサシン、モキシフロキシシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、ペフロキサシン、アミフロキサシン、フレロキサシン、トスフロキサシン、プリフロキサシン、イルロキサシン、パズフロキサシン、クリナフロキサシンおよびシタフロキサシン等のフルオロキノロン；ゲンタミシン、ネチルミシン、パラメシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびストレプトマシン、バンコマイシン、テイコプラニン、ラムポラニン、ミデプラニン、コリスチン、ダプトマイシン、グラミシジン、コリスチメタン等のアミノグリコシド；ポリミキシンＢ等のポリミキシン、カプレオマイシン、バシトラシン、ペネム；ペニシリンＧ、ペニシリンＶのようなペニシリナーゼ感応剤を含むペニシリン；メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、ナフシリンのような抗ペニシリナーゼ剤；アンピシリン、アモキシシリンおよびヘタシリン、シリンおよびガラムピシリンのようなグラム陰性微生物活性剤；カルベニシリン、トカルシリン、アズロシリン、メズロシリンおよびピペラシリンのような抗シュードモナスペニシリン；セフポドキシム、セフプロジル、セフツブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラドリン、セフォキシン、セファマンドール、セファゾリン、セファロリジン、セファクロル、セファドロキシル、セファログリシン、セフロキシム、セフォラニド、セフォタキシム、セファトリジン、セファセトリル、セフェピム、セフィキシム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォテタン、セフメタゾール、セフタジジム、ロラカルベフおよびモキサラクタム、アズトレオナムのようなモノバクタムのようなセファロスポニン；およびイミペネム、メロペネム、イセチオ酸ペンタミジン、硫酸アルブテロール、リドカイン、硫酸メタプロテレノール、ジプレピオン酸ベクロメタソン、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニドアセトニド、フルチカソン、臭化イプラトロピウム、フルニソリド、クロモリンナトリウムおよび酒石酸エルゴタミン等のカルバペネム；パクリタクセル等のタキサン；ＳＮ−３８およびトリホスチンが挙げられるが、それらに限定されない。

結合方法
好適な結合条件は、ポリマーチオール試薬と活性剤との結合を行うのに十分な時間、温度、ｐＨ、試薬濃度および溶媒等の条件である。当該技術分野で知られているように、具体的な条件は、活性剤、所望の結合の種類、および反応混合物における他の材料の存在等に依存する。任意の場合において結合を行うための十分な条件は、本明細書の開示内容を読むことによって、関連文献を参照して、かつ／または慣例の実験を介して、当業者が決定できる。

例示的な結合条件は、約６から約１０のｐＨ、例えば約６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０のｐＨで結合反応を行うことを含む。反応は、約５分間から約７２時間、好ましくは約３０分間から約４８時間、より好ましくは約４時間から約２４時間以下にわたって進められる。結合反応の温度は、典型的には、約０℃から約４０℃の範囲であるが、必ずしもそうであるとは限らない。結合反応は、室温以下の温度でしばしば行われる。結合反応は、リン酸または酢酸緩衝剤または類似の系等の緩衝剤でしばしば行われる。

試薬濃度に関しては、ポリマー試薬の余剰物は、典型的には、活性剤と一緒にされる。しかし、場合によっては、ポリマー試薬上の反応基の数の活性剤の量に対する化学量論量を有することが好ましい。ポリマー試薬の活性剤に対する例示的な比率としては、約１：１（ポリマー試薬：活性剤）、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１または１０：１のモル比が挙げられる。結合反応は、さらなる結合が実質的に生じなくなるまで進められ、それは、一般には、反応の進行を経時的に監視することによって判断されうる。

様々な時点で一定分量を反応混合物から抜き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定または任意の他の好適な分析法によって反応混合物を分析することによって、反応の進行を監視することができる。形成された複合体の量、または残留する未結合ポリマーの量に関して安定状態に達すると、反応は、終了したと見なされる。典型的には、複合体反応は、数分間から数時間（例えば５分間から２４時間以上）行われる。得られた混合物を精製して、余剰の試薬、未結合反応物（例えば活性剤）、望ましくない多結合種、および遊離または未結合ポリマーを分離するが、必ずしもそうであるとは限らない。次いで、ＭＡＬＤＩ、キャピラリー電気誘導、ゲル電気泳動および／またはクロマトグラフィーを用いて、得られた複合体をさらに特徴づけることができる。

より好ましくは、本発明のポリマーチオールは、典型的には、約６〜９（例えば６、６．５、７、７．５、８、８．５または９）のｐＨ、より好ましくは約７〜９のｐＨ、さらにより好ましくは約７から８のｐＨでスルフィドリル含有活性剤に結合される。一般には、わずかなモル過剰、例えば１．５から１５倍のモル過剰、好ましくは２倍から１０倍のモル過剰のポリマー試薬が採用される。反応時間は、一般には、室温において約１５分間から数時間、例えば８時間以上である。立体的に阻害されたスルフィドリル基については、必要な反応時間は、それより有意に長くてもよい。

複合体の精製
場合によっては、本発明のポリマーチオールを生物活性剤と反応させることによって生成された複合体を精製して、異なる種、例えばＰＥＧ種を取得／単離するか、または望ましくない反応副産物を除去する。

望まれる場合は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、異なる分子量を有するＰＥＧ複合体を単離することができる。この手法を用いて、異なる分子量を有するＰＥＧ複合体を分離することができるが、この手法は、一般には、タンパク質内の異なるＰＥＧ化部位を有する位置異性体を分離するのに非効果的である。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、ＰＥＧモノマー、ダイマー、トリマー等の混合物を互いに分離することができるが、回収されたＰＥＧマー組成物の各々は、タンパク質内の異なる反応基に結合しているＰＥＧを含有することができる。

この種の分離を行うのに好適なゲル濾過カラムとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）およびＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、所望の分留範囲に依存することになる。一般には、リン酸塩または酢酸塩などの非アミン系緩衝剤を使用して溶出が行われる。回収された断片をいくつかの異なる方法、例えば（ｉ）タンパク質含有量に対する２８０ｎｍのＯＤ、（ｉｉ）ＢＳＡタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含有量に対するヨウ素試験（Ｓｉｍｓ， Ｇ．Ｅ．Ｃら、Ａｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ， １０７， ６０−６３， １９８０）、あるいは（ｉｖ）ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを流した後に、ヨウ化バリウムで染色する方法によって分析することができる。

例えばＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＶｙｄａｃ）を使用する逆相クロマトグラフィーによって、またはイオン交換カラム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）によって、位置異性体の分離を行うことができる。いずれも手法も同じ分子量を有するＰＥＧ生体分子異性体（位置異性体）を分離するのに用いることができる。

結合により得られたＰＥＧ複合体の使用目的、および場合によってさらなる分離工程に応じて、複合体混合物を濃縮し、滅菌濾過し、約−２０℃から約−８０℃の低温で保管することができる。あるいは、複合体を、残留緩衝剤とともにまたは残留緩衝剤を除外して凍結乾燥し、凍結乾燥粉末として保管することができる。場合によっては、凍結乾燥複合体粉末配合物に残留緩衝剤が存在しないように、結合に使用する酢酸ナトリウム等の緩衝剤を、凍結乾燥時に容易に除去できる炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウム等の揮発性緩衝剤に換えることが好ましい。あるいは、凍結乾燥複合体が、配合緩衝剤への復元、および究極的には哺乳類に対する投与に好適な形態になるように、配合緩衝剤を使用する緩衝剤交換工程を用いることができる。

医薬組成物
本発明は、本明細書に提示されている複合体と、医薬賦形剤との組合せを含む医薬製剤をも含む。一般には、複合体自体は、固体または液体形態でありうる好適な医薬賦形剤と組み合わせることができる固体形態（例えば沈殿または凍結乾燥物）または溶液である。

例示的な賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗微生物剤、酸化防止剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

糖、アルジトール糖の誘導糖、アルドン酸、エステル化糖および／または糖ポリマー等の炭水化物が、賦形剤として存在してもよい。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノースおよびソルボース等の単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロースおよびセロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストランおよびデンプン等の多糖類；およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシルトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトールおよびミオイノシトール等のアルジトールが挙げられる。

賦形剤は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの組合せ等の無機塩または緩衝剤を含むこともできる。

製剤は、微生物の成長を防止または抑制するための抗微生物剤を含むこともできる。本発明に好適な抗微生物剤の非限定的な例としては、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール、およびそれらの組合せが挙げられる。

製剤に酸化防止剤も存在することができる。酸化防止剤は、酸化を防止することによって、複合体、または製剤の他の成分の劣化を防止するために使用される。本発明に使用される好適な酸化防止剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、重亜硫酸ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組合せが挙げられる。

賦形剤として界面活性剤が存在してもよい。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ２０」および「Ｔｗｅｅｎ８０」等のポリソルベート、およびＦ６８およびＦ８８（いずれもＢＡＳＦ（ニュージャージ州Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ所在）から入手可能である）等のプルロニック；ソルビタンエステル；レシチンおよび他のホスファチジルコリン等のリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（ただし、リポソーム形態でないことが好ましい）、脂肪酸および脂肪酸エステル等の脂質；コレステロール等のステロイド；およびＥＤＴＡ、亜鉛および他の当該好適な陽イオン等のキレート化剤が挙げられる。

製剤における賦形剤として酸または塩基が存在してもよい。使用できる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組合せからなる群より選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組合せからなる群より選択される塩基が挙げられるが、それらに限定されない。

医薬製剤は、すべての種類の配合物、および特に注射に適する配合物、例えば復元できる粉末、ならびに懸濁液および溶液を包括する。組成物における複合体（すなわち、活性剤と本明細書に記載されているポリマーとの間に形成された複合体）の量は、いくつかの要因に応じて異なるが、組成物が単位投与容器（例えばバイアル）に収容される場合に最適に治療効果を有する。加えて、医薬製剤は、シリンジに収められる。どの量が臨床的に望ましい結果をもたらすかを判断するために、複合体の量を増加させながら繰り返し投与することによって、治療有効用量を実験的に求めることができる。

組成物における任意の個別的な賦形剤の量は、賦形剤の活性、および組成物の特定の必要性に応じて異なる。典型的には、任意の個別的な賦形剤の最適な量は、慣例の実験を通じて、すなわち異なる量（小から大）賦形剤を含有する組成物を調製し、安定性および他のパラメータを調査し、次いで大きな悪影響を伴わずに最適な性能が達成される範囲を求めることによって求められる。

しかし、一般には、賦形剤は、製剤中に約１から約９９重量％、好ましくは約５〜９８重量％、より好ましくは約１５〜９５重量％の量で存在し、３０重量％未満の濃度が最も好ましい。

これらの先述の医薬賦形剤は、他の賦形剤とともに、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」， １９^ｔｈ ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， （１９９５）， ｔｈｅ 「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」， ５２ｎｄ ｅｄ．， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ， Ｍｏｎｔｖａｌｅ， ＮＪ （１９９８）， ａｎｄ Ｋｉｂｂｅ， Ａ．Ｈ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ２０００．に記載されている。

本発明の医薬製剤は、必ずしもそうであるとは限らないが、典型的には注射を通じて投与されるため、投与直前は一般には溶液または懸濁液である。医薬製剤は、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤および粉末等の他の形態をとることも可能である。肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、鞘内、皮下および動脈内等の他の投与様式も含まれる。

先述したように、複合体を静脈内注射、またはより好ましくないが、筋肉内または皮下注射による非経口注射で投与することが可能である。非経口投与のための好適な配合物タイプとしては、注射即応溶液、使用前に溶媒と混合される乾燥粉末、注射即応懸濁液、使用前に媒体と混合される乾燥不溶性組成物、および投与前に希釈されるエマルジョンおよび液体濃縮物が挙げられる。

投与方法
本発明は、本明細書に提示されている複合体を、複合体による治療に応答する状態にかかっている患者に投与するための方法をも提供する。該方法は、治療有効量の複合体（好ましくは医薬製剤の一部として提供される）を一般には注射を介して投与することを含む。該投与方法を用いて、特定の複合体の投与によって治療または予防できる任意の状態を治療することができる。特定の複合体が効果的に治療できる状態はどれかを当業者は理解する。投与される実際の用量は、被験体の年齢、体重および全体的な状態、ならびに治療される状態の重度、医療専門家の判断、および投与される複合体に応じて異なる。治療有効量は、当業者に知られており、かつ／または関連参考資料および文献に記載されている。一般には、治療有効量は、約０．００１ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／日から７５ｍｇ／日の用量、より好ましくは０．１０ｍｇ／日から５０ｍｇ／日の用量の範囲になる。

所定の複合体（やはり好ましくは医薬製剤の一部として提供される）の単位投与物は、臨床家の判断、および患者のニーズに応じて様々な投与スケジュールで投与されうる。具体的な投与スケジュールは、当業者に把握され、慣例の方法を用いて実験的に決定されうる。例示的な投与スケジュールとしては、１日に５回、１日に４回、１日に３回、１日に２回、１日に１回、毎週３回、毎週２回、毎週１回、毎月２回、毎月１回、およびそれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。臨床成果が達成されると、組成物の投与が停止される。

インビボの複合体の水溶性ポリマー部の開裂は、望まれる場合は、ポリマー骨格におけるウレタン、アミド、炭酸塩、エステル含有結合体等の生理的開裂性および／または酵素分解性結合体の使用を通じて実施されうる。このように、（水溶性ポリマー部の開裂を介する）複合体のクリアランスを、所望のクリアランス特性を与えるポリマー分子サイズおよび官能基の種類を選択することによって調節することができる。当業者は、ポリマーの適正な分子サイズ、ならびに開裂性結合体を決定することができる。例えば、当業者は、慣例の実験を用いて、最初にポリマー重量および開裂結合体の異なる様々なポリマー誘導体を調製し、次いで、ポリマー誘導体を患者に投与し、定期的に血液および／または尿サンプルを採取することによってクリアランスプロファイルを得る（例えば、定期的な血液または尿サンプルの採取による）ことによって、適正な分子サイズおよび開裂性官能基を決定することができる。各試験複合体について一連のクリアランスプロフィルが得られると、好適な複合体を特定することができる。

以下の実施例は、本発明の範囲を例示するものであって、限定することを意図するものでは決してない。一態様において、それらの実施例は、本発明のポリマーチオール試薬の合成および結合時の安定性の向上を例示する。

Ｂｒｕｋｅｒ製の４００ＭＨｚ分光計を使用して、^１Ｈ ＮＭＲデータを得た。

言及されているＰＥＧ試薬は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ所在）から入手可能である。

（実施例１）
ｍＰＥＧ−（ＣＨ_２）_４オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ−４Ｃ−ＯＰＳＳ）の調製
Ｉ．ｍＰＥＧ_５０００−臭化ブチル
ｍＰＥＧ_５０００（２０．０ｇ、０．００４モル）（日本油脂株式会社）をトルエン（２００ｍｌ）に溶解させた溶液を、トルエン５０ｍｌを蒸留除去することによって共沸乾燥させた。水素化ナトリウム（０．８ｇ、鉱油に６０％分散、０．０２０モル）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で６０℃にて１時間攪拌した。１，４−ジブロモブタン（９．０ｇ、０．０４１７モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７５℃にて一晩攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣を８５０ｍｌの低温エチルエーテルと一緒にした。沈殿した生成物を濾別し、減圧下で乾燥させた。収量１７．４ｇ。

ＩＩ．ｍＰＥＧ_５０００−ブタンチオール
ｍＰＥＧ_５０００−臭化ブチル（２．０ｇ、０．０００４モル）を無水エチルアルコール（２０ｍｌ）に溶解させた溶液に対してチオ尿素（０．３１ｇ、０．００４１モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７８℃にて一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸留によって除去し、残渣を１％ＮａＯＨ水溶液（２１ｍｌ）に溶解させた。この溶液をアルゴン下で８５℃にて２．５時間加熱した。溶液を３５℃まで冷却した後に、ｐＨを１０％リン酸で３に調整した。ＮａＣｌ（６ｇ）を添加し、生成物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、生成物を低温エチルエーテルで沈殿させた。収量１．８ｇ。

ヨウ素分析により、生成物が９４％のチオール基を含有していることが示された。上記のＮＭＲデータは、生成物が、チオール基の酸化によって形成された非常に少量（ＮＭＲにより１．２モル％）のジスルフィド結合ダイマーを含有していることを示していた。チオールのさらなる精製を必要としなかった。

対照的に、同様にして実施された、ｍＰＥＧ_５０００−メシレートおよびチオ尿素からのｍＰＥＧ_５０００−エタンチオール（すなわち、ＰＥＧとチオール基の間に二炭素スペーサのみを含有する、対応する試薬）の類似の調製により、ジチオール基を含有する約１５モル％のジスルフィド結合ダイマーを含有する生成物が生成された（例えばＷＯ２００４／０６３２５０参照）。このレベルのダイマーは、ダイマーを所望のＰＥＧ−チオールに変換するために、さらなる精製またはさらなる化学処理を必要とする。

ＩＩＩ．ｍＰＥＧ_５０００−４Ｃ−ＯＰＳＳ
ｍＰＥＧ_５０００−ブタンチオール（２．０ｇ、０．０００４モル）を無水メチルアルコール（４０ｍｌ）に溶解させた溶液に対して２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．１８ｇ、０．０００８２モル）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて４時間攪拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解させ、生成物を５０ｍｌの低温エチルエーテルで沈殿させた。収量１．７ｇ。

（実施例２）
ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）（ＰＥＧ−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）、２ＫＤａ）の調製

ＰＥＧ_２０００−臭化ジブチル
ＰＥＧ_２０００（２０．０ｇ、０．０２０当量）（日本油脂株式会社）をトルエン（１５０ｍｌ）に溶解させた溶液を、５０ｍｌのトルエンを蒸留除去することによって共沸乾燥させた。水素化ナトリウム（６．０ｇ、鉱油に６０％分散、０．１５０モル）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で６０℃にて１時間攪拌した。１，４−ジブロモブタン（３４．５５ｇ、１．６００モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７５℃にて一晩攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣を８５０ｍｌの低温エチルエーテルと一緒にした。沈殿した生成物を濾別し、減圧下で乾燥させた。収量１７．０ｇ。

ＰＥＧ_２０００−ジ（ブタンチオール）
ＰＥＧ_２０００−ジ（臭化ブチル）（１０．０ｇ、０．０１００当量）を無水エチルアルコール（１００ｍｌ）に溶解させた溶液に対してチオ尿素（７．６８ｇ、９９％、０．１００モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７８℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣を３．３％のＮａＯＨ水溶液（１８０ｍｌ）に溶解させた。この溶液をアルゴン下で８５℃にて２．５時間加熱した。溶液を３５℃まで冷却した後に、６０ｍｌの脱イオン水を添加し、ｐＨを１０％リン酸で３に調整した。溶液を５０ｍｌの酢酸エチルで洗浄し、生成物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下の蒸留によって除去した。粗生成物をイソプロピルアルコールから再結晶させ、真空下で乾燥させた。収量７．８ｇ。

上記のＮＭＲデータは、生成物が、チオール基の酸化によって形成された比較的少量（ＮＭＲにより１．９モル％）のジスルフィド結合ダイマーを含有することを示していた。チオールのさらなる精製を必要としなかった。

対照的に、同様にして実施された、ＰＥＧ_２０００−ジメシレートおよびチオ尿素からのＰＥＧ_２０００−ジエタンチオール（すなわち、ＰＥＧとチオール基の間に二炭素スペーサのみを含有する、対応する試薬）の類似の調製により、ジチオール基を含有する約４１モル％のジスルフィド結合ダイマーを含有する生成物が生成された。

ＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）
２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．８９ｇ、０．００４０モル）を無水メチルアルコール（４０ｍｌ）に溶解させた溶液に対してＰＥＧ_２０００−ジブタンチオール（２．０ｇ、０．００２０当量）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて３時間攪拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解させ、生成物を５０ｍｌの低温のエチルエーテルで沈殿させた。沈殿を繰り返して、１．０ｇの白色の固体生成物を得た。

（実施例３）
ｍＰＥＧ_{１００００}−（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ−４Ｃ−ＯＰＳＳ、１０ＫＤａ）の調製
ｍＰＥＧ_{１００００}−臭化ブチル
ＰＥＧ_{１００００}（２０．０ｇ、０．００２モル）（日本油脂株式会社）をトルエン（２００ｍｌ）に溶解させた溶液を、５０ｍｌのトルエンを蒸留除去することによって共沸乾燥させた。水素化ナトリウム（０．８ｇ、鉱油に６０％分散、０．０２００モル）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で６０℃にて１時間攪拌した。１，４−ジブロモブタン（４．８ｇ、０．０２２２モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７５℃にて一晩攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣を８５０ｍｌの低温エチルエーテルと一緒にした。沈殿した生成物を濾別し、減圧下で乾燥させた。収量１８．５ｇ。

ｍＰＥＧ_{１００００}−ブタンチオール
ｍＰＥＧ_{１００００}−臭化ブチル（１０．０ｇ、０．００１０モル）を無水エチルアルコール（１００ｍｌ）に溶解させた溶液に対してチオ尿素（０．７７ｇ、９９％、０．０１００モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７８℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣を１．０％のＮａＯＨ水溶液（９０ｍｌ）に溶解した。この溶液をアルゴン下で８５℃にて３時間加熱した。溶液を室温まで冷却した後に、ＮａＣｌ（１０ｇ）を添加し、ｐＨを１０％リン酸で３に調整した。生成物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下の蒸留によって除去した。粗生成物を少量のジクロロメタンに溶解し、エチルエーテルで沈殿させ、真空下で乾燥させた。収量９．０ｇ。

上記のＮＭＲデータは、生成物が、チオール基の酸化によって形成された比較的少量（ＮＭＲにより４．８モル％）のジスルフィド結合ダイマーを含有することを示していた。チオールのさらなる精製を必要としなかった。

ｍＰＥＧ_{１００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ
２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．１０ｇ、０．０００４５モル）を無水メチルアルコール（４０ｍｌ）に溶解させた溶液に対してｍＰＥＧ_{１００００}−ブタンチオール（２．０ｇ、０．０００２０当量）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて３時間攪拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去した。粗生成物をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、５０ｍｌの低温エチルエーテルで沈殿させて、乾燥後に１．８ｇの白色の固体粉末を得た。

実施例４および５は、より高分子量の対応する試薬の調製を例示している。

（実施例４）
ｍＰＥＧ_{２００００}−（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ−４Ｃ−ＯＰＳＳ、２０ＫＤａ）の調製
ｍＰＥＧ_{２００００}−臭化ブチル
ＰＥＧ_{２００００}（２０．０ｇ、０．００１０モル）（日本油脂株式会社）をトルエン（２００ｍｌ）に溶解させた溶液を、５０ｍｌのトルエンを蒸留除去することによって共沸乾燥させた。水素化ナトリウム（０．４ｇ、鉱油に６０％分散、０．０１００モル）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で６０℃にて１時間攪拌した。１，４−ジブロモブタン（２．４ｇ、０．０１１１モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７５℃にて一晩攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣を８５０ｍｌの低温エチルエーテルと一緒にした。沈殿した生成物を濾別し、減圧下で乾燥させた。収量１８．２ｇ。

ｍＰＥＧ_{２００００}−ブタンチオール
ｍＰＥＧ_{２００００}−臭化ブチル（１０．０ｇ、０．５モル）を無水エチルアルコール（１００ｍｌ）に溶解させた溶液に対してチオ尿素（０．３９ｇ、９９％、０．００５１モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７８℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣を１．０％のＮａＯＨ水溶液（９０ｍｌ）に溶解した。この溶液をアルゴン下で８５℃にて３時間加熱した。溶液を室温まで冷却した後に、ＮａＣｌ（１０ｇ）を添加し、ｐＨを１０％リン酸で３に調整した。生成物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下の蒸留によって除去した、粗生成物を少量のジクロロメタンに溶解し、エチルエーテルで沈殿させ、真空下で乾燥させた。収量８．２ｇ。

上記のＮＭＲデータは、生成物が、チオール基の酸化によって形成された比較的少量（ＮＭＲにより３．４モル％）のジスルフィド結合ダイマーを含有することを示していた。チオールのさらなる精製を必要としなかった。

ｍＰＥＧ_{２００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ
２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．０５ｇ、０．０００２３モル）を無水メチルアルコール（４０ｍｌ）に溶解させた溶液に対してｍＰＥＧ_{２００００}−ブタンチオール（２．０ｇ、０．０００１０当量）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて３時間攪拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解し、生成物を５０ｍｌのエチルエーテルで沈殿させて、１．９ｇの白色の固体粉末を得た。

（実施例５）
ｍＰＥＧ_{３００００}−（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ−４Ｃ−ＯＰＳＳ、３０ＫＤａ）の調製
ｍＰＥＧ_{３００００}−臭化ブチル
ＰＥＧ_{３００００}（２０．０ｇ、０．０００６７モル）（日本油脂株式会社）をトルエン（１５０ｍｌ）に溶解させた溶液を、５０ｍｌのトルエンを蒸留除去することによって共沸乾燥させた。水素化ナトリウム（０．３ｇ、鉱油に６０％分散、０．００７５０モル）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下で６０℃にて１時間攪拌した。１，４−ジブロモブタン（２．１７ｇ、０．０１００モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７５℃にて一晩攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣を８５０ｍｌの低温エチルエーテルと一緒にした。沈殿した生成物を濾別し、減圧下で乾燥させた。収量１５．３ｇ。

ｍＰＥＧ_{３００００}−ブタンチオール
ｍＰＥＧ_{３００００}−臭化ブチル（１０．０ｇ、０．０００３３モル）を無水エチルアルコール（１００ｍｌ）に溶解させた溶液に対してチオ尿素（０．２６ｇ、９９％、０．００３３８モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７８℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣を１．０％のＮａＯＨ水溶液（９０ｍｌ）に溶解した。この溶液をアルゴン下で８５℃にて２．５時間加熱した。室温まで冷却した後に、ＮａＣｌ（１０ｇ）を添加し、ｐＨを１０％リン酸で３に調整した。生成物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下の蒸留によって除去した、粗生成物を少量のジクロロメタンに溶解し、エチルエーテルで沈殿させ、真空下で乾燥させた。収量９．４ｇ。

上記のＮＭＲデータは、生成物が、チオール基の酸化によって形成された比較的少量（ＮＭＲにより３．８モル％）のジスルフィド結合ダイマーを含有することを示していた。チオールのさらなる精製を必要としなかった。

ｍＰＥＧ_{３００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ
２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．０５ｇ、０．０００２３モル）を無水メチルアルコール（６０ｍｌ）に溶解させた溶液に対してｍＰＥＧ_{３００００}−ブタンチオール（３．０ｇ、０．０００１０当量）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて３時間攪拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣をジクロロメタン（８ｍｌ）に溶解し、生成物を６０ｍｌのエチルエーテルで沈殿させて、２．９ｇの白色の固体粉末を得た。

（実施例６）
ＢＳＡとｍＰＥＧ_５０００−４Ｃ−ＯＰＳＳおよびｍＰＥＧ_５０００−ＭＡＬ（ＭＡＬ＝マレイミド）（比較）との結合
ＢＳＡ（ジスルフィド結合体の開裂）の還元
３．１ｍｇのＢＳＡのサンプルを、３．１ｍＬの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を含有する５ｍＬのＲｅａｃｔｉＶｉａｌ（商標）に添加した。溶液を中程度の速度の攪拌板に仕込んだ。４．６２ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）のサンプルを溶液に添加して攪拌し、室温で２時間反応させて、サンプルを完全に還元させた。

ＤＴＴを除去するための１００００ＭＷのＰＥＳメンブレンを有する３５０ｍＬのＡｍｉｃｏｎ ＳｔｉｒＣｅｌｌに反応混合物を仕込んだ。緩衝剤（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．５））を３５０ｍＬの体積に対して添加し、攪拌して沈降を防止した。体積が１０ｍＬ未満に減少するまで、装置を加圧（６０ｐｓｉ）した。ＰＢＳを３５０ｍＬの体積に対して再び添加し、そのプロセスを２回繰り返した。１ｍＬの一定分量を標準（ゲル、ＨＰＬＣ等）に向けて凍結し、残りの体積を結合工程に使用した。

結合
中設定値に設定された攪拌板上の５ｍＬのＲｅａｃｔｉＶｉａｌ内で、工程Ａによる還元ＢＳＡ（４ｍＬ）を実施例１に記載されている２．３５ｍｇ（１０倍過剰量）のｍＰＥＧ_５Ｋ−４Ｃ−ＯＰＳＳと一緒にした。工程Ａによる還元ＢＳＡ（４ｍＬ）および２．３５ｍｇ（１０倍過剰量）のｍＰＥＧ_５Ｋ−ＭＡＬを使用して、同様の反応混合物を調製した（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（アラバマ州Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ所在）から入手可能なｍＰＥＧ−ＭＡＬでは、マレイミドが、環窒素を介して、ｍＰＥＧの末端−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−に結合されている）。バイアルを６０時間室温に放置した。

分析
以下の条件を用いて、反応混合物を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥ Ｇｅｌｓ（インビトロゲン）で処理した。

４×ＬＤＳサンプル緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １０μＬ／サンプル
反応サンプル ３０μＬ／サンプル
１×ＭＥＳ処理緩衝剤 ６００ｍＬ
マルチマークプロテインスタンダーズ（インビトロゲン） ７μＬ
シンプリーブルーセーフステイン ５０ｍＬ
充填サンプル（ａ＋ｂ） ３０μＬ
電圧 ２００Ｖ
アンプ ４００ｍＡ
時間 ３６分間
図１は、シンプリーブルーセーフステインで染色された製品ゲルを示す。図２は、ＰＥＧを検出するためにヨウ化バリウムでさらに染色された同じゲルを示す。

図２のゲルに示されている種の分子量および相対強度も以下の表２示す。

^ａ（ＰＥＧを検出するために）ＢａＩによって視覚化されている
ＰＥＧ_５Ｋ−ＭＡＬ−ＢＳＡ結合反応によって３９．８％のモノＰＥＧマー（５８４４０ＭＷ帯）が生成され、ｍＰＥＧ_５Ｋ−４Ｃ−ＯＰＳＳ−ＢＳＡ結合反応によって４２．２％のモノＰＥＧマーが生成された。よって、本発明のポリマーチオール試薬の結合挙動は、基準ポリマー試薬（マレイミド末端ポリマー）について観察された挙動より良好であったが、それは、ｍＰＥＧ−エタンチオールをベースとした対応する試薬に典型的なＰＥＧ−ＯＰＳＳの有意な二量化が生じなかったことを示している。

（実施例７）
ｍＰＥＧ_{１００００}−（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ_{１００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ）による顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のＰＥＧ化

ｍＰＥＧ_{１００００}−（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ_{１００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ）
実施例３で調製された、（Ｇ−ＣＳＦ原液の実測分量におけるＧ−ＣＳＦの量に対して）５０倍過剰量のｍＰＥＧ_{１００００}−（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ_{１００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して、１０％の試薬溶液を形成した。１０％の試薬溶液をＧ−ＣＳＦ原液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０）の一定分量に対して迅速に添加し、十分に混合した。ｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ試薬を遊離（すなわち、関与するタンパク質内ジスルフィド結合がない）システイン残基とＧ−ＣＳＦの１７位で結合させるために、反応溶液をＲｏｔｏＭｉｘ（型式４８２００、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ（アイオワ州Ｄｕｂｕｑｕｅ所在））に仕込んで、３７℃で結合を促進させた。３０分間後に、他の５０倍過剰量のｍＰＥＧ_{１００００}−４Ｃ−ＯＰＳＳ反応溶液に添加し、その後まず３７℃で３０分間混合し、次いで室温で２時間混合することによって、ｍＰＥＧ_{１００００}−Ｇ−ＣＳＦ複合体溶液を形成した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって、ｍＰＥＧ_{１００００}−Ｇ−ＣＳＦ複合体溶液の特徴を調べた。ＰＥＧ化反応は、収率３６％のｍＰＥＧ_{１００００}−Ｇ−ＣＳＦ複合体（Ｇ−ＣＳＦのシステイン残渣におけるモノＰＥＧ化複合体）を生成するものと判断された。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、複合体を精製した。

他の分子量を有するｍＰＥＧ−４Ｃ−ＯＰＳＳを使用して、他の複合体を調製するのに同じ手法を用いることができる。

以下の実施例８〜１０では、比較的低分子量を有するポリマー試薬（概略図におけるＰＥＧ_Ｂ）を結合対象の成分（Ａ）に最初に結合させ、その後、低分子量試薬の結合成分に対する結合により形成された複合体のポリマー部により高分子量のポリマー試薬（概略図におけるＰＥＧ_Ａ）を結合させる（以下に概略的に示される）手法が採用されている。この手法を用いると、阻害部位を効率的に修飾することが可能である。以下の実施例において、阻害部位は、Ｇ−ＣＳＦの部分埋設遊離チオール含有システイン残基である。

（実施例８ａ）
ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）およびｍＰＥＧ_{２００００}−ブタンチオールによるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化

ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）
（ＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）

ｍＰＥＧ_{２００００}−ブタンチオール
（ｍＰＥＧ_２０Ｋ−４Ｃ−ＳＨ）
本実施例では、ジスルフィド結合体を介して二官能ＰＥＧ−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）試薬を立体阻害遊離チオールに挿入し、その後さらなるジスルフィド結合体を介してｍＰＥＧ_２０Ｋ−ブタンチオールをＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）試薬の遊離残基に結合させる。

アルゴン下で−２０℃に保管された、実施例２で調製されたＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）を室温まで加温した。該試薬の（Ｇ−ＣＳＦ原液の実測一定量におけるＧ−ＣＳＦの量に対して）５０倍過剰量をＤＭＳＯに溶解して、１０％の溶液を形成した。１０％の試薬溶液をＧ−ＣＳＦ原液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０）の一定分量に対して迅速に添加し、十分に混合した。反応溶液をＲｏｔｏＭｉｘ（型式４８２００、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ（アイオワ州Ｄｕｂｕｑｕｅ所在））に仕込み、３７℃で１時間、次いで室温で２時間乾燥させた。反応が完了した後に、反応溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して、余剰の遊離ＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）を除去した。

次いで、実施例４Ｂで調製されたｍＰＥＧ_{２００００}−ブタンチオールの（Ｇ−ＣＳＦに対する）５０倍過剰量を中間複合体の透析溶液に添加し、その後室温で１時間、次いで４℃で一晩混合することによって、ｍＰＥＧ_{２００００}−ＰＥＧ_２０００−ＧＣＳＦ複合体を形成した。生成物の特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで調べた。

他の分子量を有するＰＥＧ−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）およびｍＰＥＧ−４Ｃ−ＳＨを使用して他の複合体を調製するのにこの手法を用いることができ、ここでもＰＥＧ−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）試薬は、好ましくは比較的低分子量である。

（実施例８ｂ）
ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）およびｍＰＥＧ_{３００００}−ブタンチオールによるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化
対応する量のＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）およびｍＰＥＧ_{３００００}−ブタンチオールを使用して、実施例８ａの手法を繰り返して、対応するｍＰＥＧ_{３００００}−ＰＥＧ_２０００−ＧＣＳＦ複合体を得た。

他の分子量を有するＰＥＧ−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）およびｍＰＥＧ−４Ｃ−ＳＨを使用して、他の複合体を同様に得ることができる。

以下の実施例９および１０は、実施例９の低分子量のＰＥＧ種が、本発明の四炭素親水性リンカーを含有するのに対して、実施例１０のそれは、二炭素リンカーを含有する点において互いに異なっている。本発明のリンカーは、複合体の収量を有意に高めることがわかる。

（実施例９）
ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）および分枝状ＰＥＧ２_{４００００}−チオールによるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化

ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_４−オルトピリジルジスルフィド）

ＰＥＧ２_{４００００}−チオール
ここでも、これらの実施例では、比較的低分子量を有するポリマー試薬（本実施例ではＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）をＧ−ＣＳＦ成分に最初に結合させ、その後、比較的高分子量のポリマー試薬（本実施例では、分枝状ＰＥＧ２_{４００００}−チオール）をＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）試薬の残基に他のジスルフィド結合体を介して結合させることを含む手法が採用されている。

アルゴン下で−２０℃に保管された、実施例２で調製されたＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）を室温まで加温した。加温されたＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）の（Ｇ−ＣＳＦ原液の実測一定量におけるＧ−ＣＳＦの量に対して）５０倍過剰量をＤＭＳＯに溶解して、１０％の試薬溶液を形成した。１０％の試薬溶液をＧ−ＣＳＦ原液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０）の一定分量に対して迅速に添加し、十分に混合した。溶液をＲｏｔｏＭｉｘ（型式４８２００、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ（アイオワ州Ｄｕｂｕｑｕｅ所在））に仕込み、３７℃で１時間、次いで室温で２時間乾燥させた。反応が完了した後に、反応溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して、余剰の遊離ＰＥＧ_２０００−ジ−（４Ｃ−ＯＰＳＳ）を除去した。

次いで、ＰＥＧ２_{４００００}−チオール（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の（Ｇ−ＣＳＦに対する）７５倍過剰量を透析複合体溶液に添加し、その後室温で３時間、次いで４℃で一晩混合して、ＰＥＧ２_{４００００}−ＰＥＧ_２０００−Ｇ−ＣＳＦ複合体を形成した。複合体の特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで調べた。得られた複合体の最終収量は、３５％であった。

（実施例１０（比較））
ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）−オルトピリジルジスルフィド）およびＰＥＧ２_{４００００}−チオールによるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化反応

ＰＥＧ_２０００−ジ−（（ＣＨ_２）_２−オルトピリジルジスルフィド）

ＰＥＧ２_{４００００}−チオール
四炭素リンカーではなく、二炭素リンカーを有する低分子量のＰＥＧチオール試薬を使用して、実施例１０の反応手順を実質的に繰り返した。

よって、アルゴン下で−２０℃に保管されたＮｅｋｔａｒ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＰＥＧ_２０００−ジ−（２Ｃ−ＯＰＳＳ）を室温まで加温した。該試薬の（Ｇ−ＣＳＦ原液の実測一定量におけるＧ−ＣＳＦの量に対して）５０倍過剰量をＤＭＳＯに溶解して、１０％の溶液を形成した。この溶液をＧ−ＣＳＦ原液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０）の一定分量に対して迅速に添加し、十分に混合した。反応溶液をＲｏｔｏＭｉｘ（型式４８２００、Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ（アイオワ州Ｄｕｂｕｑｕｅ所在））に仕込み、３７℃で１時間、次いで室温で２時間乾燥させた。反応が完了した後に、反応溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して、余剰の遊離ＰＥＧ_２０００−ジ−（２Ｃ−ＯＰＳＳ）を除去した。

（Ｇ−ＣＳＦに対して）７０倍過剰量の分枝状ＰＥＧ２_{４００００}−チオール（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を透析複合体溶液に添加し、その後室温で３時間、そして４℃で一晩混合した。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、検出可能な量の所望のＰＥＧ２_{４００００}−ＰＥＧ_２０００−Ｇ−ＣＳＦ複合体が示されなかった。

事実は、エチレン（Ｃ２）−結合ＰＥＧ−ＯＰＳＳ試薬は、還元性開裂されて、目標タンパク質と反応する前に試薬を効果的に破壊することを示唆している。ブチレン（Ｃ４）−結合試薬は、当該開裂に対してより安定しているため、存続して、より高収量の複合体を与える。

（実施例１１）
ｍＰＥＧ_５０００−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−オルトピリジルジスルフィド（ｍＰＥＧ−（α−メチル）４Ｃ−ＯＰＳＳ、５ＫＤａ）の調製

１−メチル−４−ブロモ−１−ブタノール

２−メチルテトラヒドロフラン（１０．１４ｇ、０．０８３４モル）をクロロホルム（７２ｍＬ）に溶解させ、臭化テトラエチルアンモニウム（１８．４ｇ、０．０８７６モル）を添加した。次いで、三フッ化ホウ素−ジエチルエーテラート（１１．１２ｍｌ、０．０８７６モル）一滴ずつ１５分間にわたって添加し、溶液を室温で一晩攪拌した。溶液を０〜５℃まで冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（８０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し、水（８０ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（８０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸留によって除去して、９．５ｇの淡黄色の粘性液体を得た。

１−ブロモ−４−メチル−４−ベンジルオキシブタン

１−メチル−４−ブロモ−１−ブタノール（９．０ｇ、０．０５３８４モル）およびベンジル２，２，２−トリクロロアセトイミダート（１６．３ｇ）を無水シクロヘキサン（１００ｍｌ）と無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）の混合物に溶解させた、０℃まで冷却した溶液に対して、トリフルオロメタンスルホン酸（１．０ｍｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて一晩撹拌した。混合物を濾過し、ＮａＨＣＯ_３の飽和溶液（２５０ｍｌ）および脱イオン水（２５０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を減圧下の蒸留によって除去した。粗生成物（９．２ｇ）を真空蒸留して、７．２ｇの無色の粘性液体を得た。

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ベンジルオキシブタン

ｍＰＥＧ_５０００（２０．０ｇ、０．００４モル）（日本油脂株式会社）を無水トルエン（２００ｍｌ）に溶解させた共沸乾燥溶液に対して、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドをｔｅｒｔ−ブタノール（１６．０ｍｌ、０．０１６０モル）に溶解させた１．０Ｍ溶液および１−ブロモ−４−メチル−４−ベンジルオキシブタン（３．１０ｇ、０．０１２モル）を添加した。反応混合物を窒素下で７０℃にて２０持間攪拌した。得られた混合物を濾過し、真空下で濃縮して、乾燥させた。粗生成物を３０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、０〜５℃にて５００ｍｌのイソプロパノールで沈殿させた。最終生成物を真空濾過により回収し、真空下で一晩乾燥させた。収量：１７．４ｇ。

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ブタノール

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ベンジルオキシブタン（１５．０ｇ、０．００３００モル）と、エチルアルコール（１５０ｍｌ）と、パラジウム（活性炭素上１０％、１．５ｇ）との混合物を４５ｐｓｉの水素化で一晩水素添加した。混合物を濾過し、溶媒を減圧下の蒸留によって除去した。粗生成物をジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶解し、０〜５℃にて４００ｍｌのイソプロピルアルコールで沈殿させた。生成物を濾別し、減圧下で乾燥させた。収量：１３．１ｇ。

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−メタンスルホニルブタン
ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ブタノール（１０．０ｇ、０．００２０モル）をトルエン（１００ｍｌ）に溶解させた溶液を、トルエンを減圧下で蒸留除去することによって乾燥させた。ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ブタノールを無水トルエン（１００ｍｌ）と無水ジクロロメタン（２０ｍｌ）の混合物に溶解させた。トリエチルアミン（０．９ｍｌ、０．００３０モル）および塩化メタンスルホニル（０．４５ｍｌ、０．００２６モル）を添加し、混合物を窒素下で室温にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去した。残渣をジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解し、２５０ｍｌのイソプロピルアルコールを添加した。沈殿生成物を濾過し、真空下で乾燥させて、８．９ｇの白色の固体粉末を得た。

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ブタンチオール

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−メタンスルホニルブタン（８．０ｇ、０．００１６モル）を無水エチルアルコール（８０ｍｌ）に溶解させた溶液に対してチオ尿素（１．２４ｇ、０．０１６３モル）を添加し、混合物をアルゴン下で７８℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣を１％のＮａＯＨ水溶液（８４ｍｌ）に溶解した。この溶液をアルゴン下で８５℃にて２．５時間加熱した。溶液を３５℃まで冷却した後に、ｐＨを１０％リン酸で３に調整した。ＮａＣｌ（２４ｇ）を添加し、生成物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、生成物を低温エチルエーテルで沈殿させた。収量７．３ｇ。

上記のＮＭＲデータは、生成物が、チオール基の酸化によって形成された非常に少量（ＮＭＲにより０．７モル％）のジスルフィド結合ダイマーを含有することを示していた。チオールのさらなる精製を必要としなかった。

ｍＰＥＧ_５０００−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＯＰＳＳ

ｍＰＥＧ_５０００−４−メチル−４−ブタンチオール（２．０ｇ、０．０００４モル）を無水メチルアルコール（４０ｍｌ）に溶解させた溶液に対して２，２’−ジピリジルジスルフィド（０．１８ｇ、０．０００８２モル）を添加し、混合物をアルゴン下で室温にて４時間攪拌した。溶媒を減圧下の蒸留によって除去し、残渣をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解させ、生成物を５０ｍｌの低温エチルエーテルで沈殿させた。収量１．７ｇ。

図１は、ＢＳＡが低減された実施例１〜２に記載のｍＰＥＧ_５０００−４Ｃ−ＯＰＳＳと呼ばれる本発明のポリマー試薬の間の結合反応、およびＢＳＡが低減されたポリマー試薬ｍＰＥＧ_５０００−マレイミドの対応する結合反応を示すＰＡＧＥ分析の図である（レーン１、標準；レーン２、ＢＳＡの低減；レーン３、ｍＰＥＧ−ＭＡＬとの結合；レーン４、ｍＰＥＧ−４Ｃ−ＯＰＳＳとの結合）。ゲルは、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅセーフステインで染色されている。 図２は、ＰＥＧを検出するためのヨウ化バリウムでさらに染色された図１のゲルである。

Claims (61)

1. 以下：
   ＰＯＬＹ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
   の構造を有する水溶性ポリマー試薬であって、ここで、
   ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり、ここで、ＰＯＬＹは、ポリ（アルキレングリコール）であり、
   Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を含有し、３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニル、および非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、該骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、該非干渉性置換基は、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、
   Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
   Ｓ−Ｗは、チオール、Ｓ−ベンジル、Ｓ−トリチルまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、
   ｘは、１〜２５であり、
   ＰＯＬＹは、ＰＯＬＹが直鎖状ポリエチレングリコールであり、ｘ＝１であり、Ｙが直鎖状アルキル鎖である場合は、少なくとも５００の分子量を有する、
   水溶性ポリマー試薬。
2. Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−を有し、ここで、ｎは、３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる、請求項１に記載の試薬。
3. ｘは、１または２である請求項１に記載の試薬。
4. ＰＯＬＹは、ポリエチレングリコールである請求項１に記載の試薬。
5. Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項１に記載の試薬。
6. 前記ポリエチレングリコールは、１４８から１０００００ダルトンの分子量、および直鎖、分枝、二股および多腕から選択される形態を有する請求項４に記載の試薬。
7. Ｙは、Ｃ_４〜Ｃ_８アルキレン、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキレン、およびそれらの組合せからなる群より選択される請求項１に記載の試薬。
8. ｎは、３から６であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される請求項２に記載の試薬。
9. Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、該Ｒ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである請求項２に記載の試薬。
10. 前記Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルは、メチルまたはエチルである請求項９に記載の試薬。
11. 前記Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルは、メチルである請求項１０に記載の試薬。
12. 異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合している請求項２に記載の試薬。
13. Ｙは、シクロペンチルまたはシクロヘキシル基を含む請求項１２に記載の試薬。
14. 以下：
    ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
    の構造を有する水溶性ポリマー試薬であって、ここで、
    Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を含有し、３から８個の炭素原子の長さを有し、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニル、および非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、該骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、該非干渉性置換基は、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、
    Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
    Ｓ−Ｗは、チオール、Ｓ−ベンジル、Ｓ−トリチルまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、
    ｘは、１〜２５であり、
    ＰＥＧは、ＰＥＧが直鎖状であり、ｘが１であり、Ｙが直鎖状アルキル鎖である場合は少なくとも５００の分子量を有し、
    ここで、ＰＥＧが、ポリエチレングリコールである、
    水溶性ポリマー試薬。
15. Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−を有し、ここで、ｎは、３から８であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニルおよび非干渉性置換基から独立に選択され、異なる炭素原子上の２つの基Ｒ^１およびＲ^２は、シクロアルキルまたはアリール基を形成するように結合することができる、請求項１４に記載の試薬。
16. ｘは、１または２である請求項１４に記載の試薬。
17. Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項１４に記載の試薬。
18. 前記ポリエチレングリコールは、１４８から１０００００ダルトンの分子量、および直鎖、分枝、二股および多腕から選択される形態を有する請求項１４に記載の試薬。
19. Ｙは、Ｃ_４〜Ｃ_８アルキレン、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキレン、およびそれらの組合せからなる群より選択される請求項１４に記載の試薬。
20. ｎは、３から６であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される請求項１５に記載の試薬。
21. Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、該Ｒ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである請求項１５に記載の試薬。
22. 前記Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルは、メチルまたはエチルである請求項２１に記載の試薬。
23. 前記Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルは、メチルである請求項２２に記載の試薬。
24. ｘは、１または２であり、ｎは、４であり、Ｓ−Ｗは、ＳＨまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項２３に記載の試薬。
25. ｘは、１であり、ＰＥＧは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である請求項２４に記載の試薬。
26. ｘは、２である請求項２４に記載の試薬。
27. Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項２５に記載の試薬。
28. Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項２６に記載の試薬。
29. Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素である請求項２０に記載の試薬。
30. ｘは、１または２であり、ｎは、４であり、Ｓ−Ｗは、ＳＨまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項２９に記載の試薬。
31. ｘは、１であり、ＰＥＧは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である請求項３０に記載の試薬。
32. ｘは、２である請求項３０に記載の試薬。
33. −Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項３１に記載の試薬。
34. −Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項３２に記載の試薬。
35. ｘは、１または２であり、Ｙは、−（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３））−であり、Ｓ−Ｗは、ＳＨ、またはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項１４に記載の試薬。
36. ｘは、１であり、ＰＥＧは、メトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である請求項３５に記載の試薬。
37. ｘは、２である請求項３５に記載の試薬。
38. −Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項３６に記載の試薬。
39. −Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項３７に記載の試薬。
40. 水溶性ポリマー試薬であって、
    以下：
    Ａ−ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］ _ｘ
    の構造を有し、ここで、
    ｘは、１であり、
    Ｙは、−（ＣＨ_２）_４−であり、
    Ｓは、Ｙのｓｐ ^３ 混成炭素に結合している硫黄原子であり、
    −Ｓ−Ｗは、ＳＨまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、
    Ａは、以下：
    

    

    の構造を有し、
    ここで、ＰＥＧが、ポリエチレングリコールであり、そしてＰＥＧが直鎖状である場合は少なくとも５００の分子量を有し、そしてｍＰＥＧは、メトキシ末端ポリエチレングリコールである、水溶性ポリマー試薬。
41. −Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項４０に記載の試薬。
42. ＰＥＧは、５００Ｄａ以下の分子量を有する請求項４０に記載の試薬。
43. ＰＥＧは、２００Ｄａ以下の分子量を有する請求項４２に記載の試薬。
44. 図示されている末端構造における各ｍＰＥＧは、５ＫＤａから２０ＫＤａの分子量を有する請求項４０に記載の試薬。
45. 以下：
    ＰＯＬＹ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
    の構造を有する水溶性ポリマー試薬であって、ここで、
    ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり、ここで、ＰＯＬＹは、ポリ（アルキレングリコール）であり、
    Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を含有し、３から１０の炭素原子の長さを有し、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニル、および非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、該骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、該非干渉性置換基は、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、
    Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
    ｘは、２〜２５であり、
    Ｓ−Ｗは、チオール、Ｓ−ベンジル、Ｓ−トリチルまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である、
    水溶性ポリマー試薬。
46. 各Ｙは、式−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−を有する直鎖または分枝状アルキレンであって、ここで、ｎは、３から１０であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびＣ_１〜Ｃ_６アルキルから独立に選択される、請求項４５に記載の試薬。
47. ｎは、３から８である請求項４６に記載の試薬。
48. Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素である請求項４６に記載の試薬。
49. 少なくとも１つのＹについて、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、該Ｒ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである請求項４６に記載の試薬。
50. ｘは、２である請求項４９に記載の試薬。
51. 以下：
    ＰＥＧ−［Ｙ−Ｓ−Ｗ］_ｘ
    の構造を有する水溶性ポリマー試薬であって、ここで、
    Ｙは、少なくとも４個の炭素原子を含有し、３から１０個の炭素原子の長さを有し、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アルケニル、および非干渉性置換基から独立に選択される置換基を有する飽和または不飽和炭化水素骨格からなる二価の結合基であり、該骨格の異なる炭素原子上の２つの当該アルキルおよび／またはアルケニル置換基は、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアリール基を形成するように結合することができ、該非干渉性置換基は、Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル、ハロ、シアノ、アルコキシおよびフェニルからなる群より選択され、
    Ｓは、Ｙのｓｐ^３混成炭素に結合している硫黄原子であり、
    ｘは、２〜２５であり、
    Ｓ−Ｗは、チオール、Ｓ−ベンジル、Ｓ−トリチルまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）であり、
    ここで、ＰＥＧが、ポリエチレングリコールである、
    水溶性ポリマー試薬。
52. ｘは、２である請求項５１に記載の試薬。
53. 各Ｙは、−（ＣＲ^１Ｒ^２）_ｎ−であって、ここで、ｎは、３から１０であり、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルおよびアルケニルから独立に選択される、請求項５１に記載の試薬。
54. ｎは、３から８である請求項５３に記載の試薬。
55. Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素およびメチルから独立に選択される請求項５４に記載の試薬。
56. Ｒ^１およびＲ^２の各々は、水素である請求項５５に記載の試薬。
57. 少なくとも１つのＹについて、Ｒ^１およびＲ^２の各々は、前記硫黄原子に隣接する炭素上のＲ^１を除いて水素であり、該Ｒ^１は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである請求項５３に記載の試薬。
58. 前記Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルは、メチルまたはエチルである請求項５７に記載の試薬。
59. ｎは、各Ｙについて４である請求項５６に記載の試薬。
60. 各−Ｓ−Ｗは、オルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＳＳ）である請求項５６に記載の試薬。
61. ＰＥＧは、１０００から５０００Ｄａの範囲の分子量を有する請求項６０に記載の試薬。

Images