BRPI0614529A2 - polipeptìdeo isolado, composição farmacêutica, método para proteger, manter ou melhorar a viabilidade de uma célula, tecido ou órgão responsivos isolados do corpo do mamìfero, uso de um polipeptìdeo isolado, método para facilitar a transcitose de uma molécula, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, e, método para produzir recombinantemente o polipeptìdeo isolado - Google Patents

polipeptìdeo isolado, composição farmacêutica, método para proteger, manter ou melhorar a viabilidade de uma célula, tecido ou órgão responsivos isolados do corpo do mamìfero, uso de um polipeptìdeo isolado, método para facilitar a transcitose de uma molécula, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, e, método para produzir recombinantemente o polipeptìdeo isolado Download PDF

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BRPI0614529A2
BRPI0614529A2 BRPI0614529-9A BRPI0614529A BRPI0614529A2 BR PI0614529 A2 BRPI0614529 A2 BR PI0614529A2 BR PI0614529 A BRPI0614529 A BR PI0614529A BR PI0614529 A2 BRPI0614529 A2 BR PI0614529A2
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isolated polypeptide
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BRPI0614529-9A
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Michael Brines
Thomas Coleman
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Araim Pharmaceuticals Inc
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Abstract

<B>POLIPEPTìDEO ISOLADO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODO PARA PROTEGER, MANTER OU MELHORAR A VIABILIDADE DE UMA CéLULA, TECIDO OU óRGAO RESPONSIVOS ISOLADOS DO CORPO DO MAMìFERO, USO DE UM POLIPEPTìDEO ISOLADO, MéTODO PARA FACILITAR A TRANSCITOSE DE UMA MOLECULA, áCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, E, MéTODO PARA PRODUZIR RECOMBINANTEMENTE O POLIPEPTìDEO ISOLADO<D>A presente invenção é dirigida a novos peptídeos protetores de tecido. Os peptídeos protetores de tecido da invenção podem ligar a um complexo de receptor protetor de tecido. Particularmente, a presente invenção é dirigida a peptídeos protetores de tecido derivados de ou compartilhando seqúências de consenso com porções de ligandos de receptor de citocinas, incluindo eritropoietina (EPO), que não estão envolvidas na ligação do ligando ao complexo do receptor, por exemplo, ao homodímero do receptor de EPO. Conseqúentemente, os peptídeos protetores de tecido da invenção são derivados das seqúências de aminoácidos das regiões de ligandos de receptor de citocinas que estão geralmente localizadas em ou dentro da região da proteína de ligando que é oposta ao complexo do receptor, isto é, são geralmente derivadas de seqUências de aminoácidos de regiões da proteína de ligando que estão voltadas distantes do complexo do receptor enquanto o ligando é ligado ao receptor. A invenção é ainda dirigida às seqUências de consenso para uso em engenharia de um peptídeo protetor de tecido sintético. Estes peptídeos protetores de tecido também incluem fragmentos, quimeras, assim como peptídeos projetados para imitar a localização espacial de resíduos de aminoácidos chave dentro dos ligandos de receptor protetor de tecido, por exemplo EPO. A invenção ainda engloba métodos para o tratamento ou prevenção de doença ou distúrbio usando peptídeos protetores de tecido da presente invenção. A invenção também engloba métodos para melhorar a função de tecido excitável usando peptídeos protetores de tecido da presente invenção.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,MÉTODO PARA PROTEGER, MANTER OU MELHORAR AVIABILIDADE DE UMA CÉLULA, TECIDO OU ÓRGÃORESPONSIVOS ISOLADOS DO CORPO DO MAMÍFERO, USO DE UMPOLIPEPTÍDEO ISOLADO, MÉTODO PARA FACILITAR ATRANSCITOSE DE UMA MOLÉCULA, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO,VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODO PARA PRODUZIRRECOMBINANTEMENTE O POLIPEPTÍDEO ISOLADO"
1. INTRODUÇÃO
A presente invenção é dirigida a novos peptídeos protetores detecido. Os peptídeos protetores de tecido da invenção podem ligar a umcomplexo de receptor protetor de tecido. Particularmente, a presente invençãoé dirigida a peptídeos protetores de tecido derivados de ou compartilhandoseqüências de consenso com porções de ligandos de receptor de citocinaincluindo eritropoietina (EPO), que não estão envolvidos na ligação doligando ao complexo de receptor, por exemplo, para o homodímero doreceptor de EPO. Conseqüentemente, os peptídeos protetores de tecido dainvenção são derivados das seqüências de aminoácidos de regiões de ligandosde receptor de citocinas que estão geralmente localizados em ou dentro daregião da proteína do ligando que é oposta ao complexo do receptor, isto é,são geralmente derivados das seqüências de aminoácidos de regiões daproteína de ligando que se afastam do complexo enquanto o ligando é ligadoao receptor. A invenção é ainda dirigida às seqüências de consenso para usona engenharia de um peptídeo protetor de tecido sintético. Estes peptídeosprotetores de tecido também incluem fragmentos, quimeras, assim comopeptídeos projetados para imitar a localização espacial de resíduos deaminoácidos chaves dentro dos ligandos do receptor protetor de tecido, porexemplo EPO.
A invenção também engloba métodos para o tratamento,prevenção ou melhora de uma doença ou distúrbio e de tratamento,restauração ou melhora de um dano ao tecido usando peptídeos protetores detecido da presente invenção. A invenção também engloba métodos demelhorar a função de tecido excitável usando os peptídeos protetores detecido da presente invenção.
2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Eritropoietina ("EPO") é um hormônio de glicoproteínacomumente associado com a manutenção de hematócritos e, maisrecentemente, proteção de tecido. A proteína EPO humana maduracompreende 165 aminoácidos e tem um peso molecular de 34 kDa, comresíduos de glicosila contribuindo com cerca de 40 % em peso da molécula. Amolécula de EPO compreende quatro hélices que interagem com seusdomínios hidrofóbicos para formar uma estrutura predominantementeglobular dentro de um meio aquoso (Cheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol.5:861-866, incorporado aqui por referência em sua totalidade). A invençãoderiva da descoberta de que alguns aminoácidos faceando o meio aquoso (istoé, afastado do núcleo central globular, hidrofóbico) mediam a proteção detecido. Os peptídeos podem ser derivados ou projetados a partir dacompreensão das regiões de proteção de tecido que foram identificadas pelosrequerentes.
Como notado acima, EPO é pluripotente. Em seu papelhormonal, EPO regula os hematócritos através de seu papel na maturação decélulas progenitoras eritróides em eritrócitos. EPO atua como um agente anti-apoptótico durante . o processo de maturação das células progenitoraseritróides, permitindo que as células progenitoras amadureçam em eritrócitos.Os níveis diminuídos de oxigênio de tecido (hipoxia) disparam uma produçãoaumentada de eritropoietina no rim, o que resulta em eritropoiese aumentada.Dado que o rim normalmente produz a maior parte da eritropoietina no soro, aperda da função do rim, como uma falha renal crônica, resulta em produçãodiminuída de EPO e com freqüência anemia. Similarmente, anemia poderesultar de outras condições crônicas, como câncer, ou tratamentos associadoscom estas doenças, como quimioterapia, que diretamente suprime a produçãode EPO. A eritropoietina recombinante comercialmente disponível se tornoudisponível sob as marcas registradas de PROCRIT, disponível de OrthoBiotech Inc., Raritan, NJ, e EPOGEN, disponível de Amgen, Inc., ThousandOaks, CA, e tem sido usada para tratar anemia resultante da doença renal emestágio final, terapia com AZT (zidovudian) em pacientes infectados comHIV, pacientes de oncologia, e quimioterapia. Atualmente uma eritropoietinahiperglicosilada, ARANESP™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), é disponívelpara tratamento de anemia. Adicionalmente, estes compostos tem sido usadaspara aumentar os hematócritos de pacientes sofrendo cirurgia para reduzir anecessidade de transfusões de sangue alogênica.
Recentemente, várias linhas de evidências tem sugerido queEPO também funcional localmente em um modo parácrino- autócrino paraminimizar o dano ao tecido. Por exemplo, EPO melhora um microambientecelular hipóxico e diminuir a morte de células programada causada porestresse metabólico. Ambas as atividades são moderadas, em parte, através deinteração de EPO com um receptor de superfície de células específicocomposto, em parte, pela proteína de receptor de eritropoietina ("EPOR").EPOR é uma proteína de aproximadamente 66 kDa e é um membro da famíliade receptor de citocina tipo 1. Esta família compreende receptores que sãoagrupados juntos com base em homologia compartilhada de seus domíniosextracelulares e inclui receptores para interleucina IL-2, IL3, IL4, IL5, IL6,IL7, IL9, IL11, fator estimulante de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), fator inibidor deleucemia (LIF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), trombopoietina, hormôniode crescimento e prolactina. O domínio extracelular conservado destesreceptores tem um comprimento de aproximadamente 200 aminoácidos,compreende quatro resíduos de cisteína conservados posicionalmente naregião de amino-terminal (Cys 294, Cys 283, Cys 248, e Cys 238, queparecem ser críticos para a manutenção e integridade estrutural dos receptores(Murray, 1996, Harpers Biochemistry 24a" ed. pp. 524-526, Appilion &Lange, Ltd.; Caravella et al, 1996, Protein: Struct. Funct. Gen. 24:394-401,cada incorporada aqui por referência em sua totalidade e um motivo Trp-Ser-X-Trp-ser (SEQ ID NO: 58) localizado proximal ao domínio transmembrana.
Em conexão com eritropoiese, EPOR funciona em um modosimilar aos outros receptores dentro da família de receptores de citocina tipo1. Primeiro, o ligando do receptor, por exemplo EPO, liga ao dímero pré-formado de EPOR (EPOR)2. Foi determinado que EPO interage com odomínio extracelular do receptor de homodímero (EPOR)2 clássico via duasregiões distintas sobre a superfície do ligando; um sítio de ligação de receptorde alta afinidade (sítio 1) e um sítio de ligação de receptor de baixa afinidade(sítio 2). As seqüências de aminoácido de EPO associadas com sítio 1 sãoTKVNFY, SEQ ID NO:2, correspondendo aos aminoácidos 44-49 de SEQ IDNO:l, e SNFLRG, SEQ ID NO:3, correspondendo aos aminoácidos 146-151de SEQ ID NO: 1; as seqüências associadas com sítio 2 são VLERY, SEQ IDN0:4, correspondendo aos aminoácidos 11-15 de SEQ ID NO:l, e SGLRS,SEQ ID N0:5, correspondendo aos aminoácidos 100-104 de SEQ ID NO:l(Cheetham et al.,1998, Nature Structural Biology 5:861-866, incorporadosaqui por referência em sua totalidade). A ativação do homodímero de EPORleva à fosforilação de tirosina de proteínas de sinalização que são associadascom EPOR, por exemplo Jak2 tirosina cinases, que podem, por sua vez, ativarvárias vias diferentes incluindo, por exemplo a via fosfatidil inositol (PI) 3-cinase, a via Ras/ MAP cinase, e/ou a via STAT. Estas vias disparam asfunções anti-apoptóticas necessárias para eritropoiese que são mediadas poreritropoietina (Kirito et al, 2002, Blood 99:102-110; Livnah et al, 1999,Science 283:987-990; Naranda et al., 2002, Endocrinology 143:2293-2302;Remy et al, 1999, Science 283:990-993; e Yoshimura et al, 1996, TheOncologist 1:337-339, cada incorporada aqui por referência em suatotalidade).
Recentemente, os requerentes descobriram que propriedadesprotetoras de tecido de EPO são mediadas por um receptor que compreendenão somente EPOR mas também outra proteína do receptor, o receptor betacomum ("βο")· O receptor EPOR/ pc é, em contraste com o homodímero(EPOR)2, um heterocomplexo (ver infra) e é conhecido como desempenhandoum papel na proteção de tecidos excitáveis (ver, por exemplo, WO2004/096148 e PCT PCT7US01/49479, depositado em 28 de dezembro de2001, Pedidos de patente US Nos. 09/753,132, depositado em 29 de dezembrode 2000, e 10/188,905, depositado em 3 de maio de 2002. cada incorporadaaqui por referência em sua totalidade. Apesar dos requerentes teremestabelecido que o receptor βς é central para as vias de proteção de tecidonestes tecidos excitáveis, a estrutura dos ligandos de ativação para osreceptores ainda é desconhecida.
3. SUMÁRIO
A presente invenção é dirigida a polipeptídeos isolados quetem pelo menos uma atividade protetora celular em uma célula, tecido ouórgão responsivos, cujos polipeptídeos contém motivos de aminoácidoscompreendendo a seqüência de consenso: a) Hi-Nr(X)n-N2-H2, em que n é0, 1, 2, 3, 4 ou 5; (b) HrN1-(X)n-N2-L1, em que n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; (c) L1-Nr(X)n-N2-H1, em que n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; (d) H1-N1-(L)n-PrH2, em que n é0 ou 1; ou (e) H1-P1-(L)n-N1-H2, em que n é 0 ou 1, e em que H1 e H2 sãoaminoácidos hidrofóbicos, Ni e N2 são aminoácidos negativamentecarregados, X é qualquer aminoácido, e L1 é um aminoácido polar; e P1 é umaminoácido positivamente carregado. Em algumas formas de realização, ospeptídeos da invenção também faltam atividade eritropoiética, por exemplonão aumentam hemoglobina ou hematócritos em um recipiente. Em outrasformas de realização, os polipeptídeos isolados da invenção consistem de nãomais do que 10, não mais que 15, não mais que 20 ou não mais que 40aminoácidos. Em outras formas de realização, o peptídeo isolado tem menosque 90 %, menos que 85%, menos que 80 %, menos que 75 %, menos que70%, menos que 65%, menos que 60 %, menos que 55 %, menos que 50 %,menos que 45 %, menos que 40 %, menos que 35 %, menos que 30 ou menosque 20 por cento de identidade de seqüência com qualquer porção daseqüência de aminoácido de eritropoietina humana madura ("EPO")especificada na seqüência 1, em que referida porção de EPO contém o mesmonúmero resíduos de aminoácidos como referido peptídeo.
Em algumas formas de realização da invenção descrita acima,em que o polipeptídeo isolado compreende o motivo estrutural (a) HrNr(X)n-N2-H2, em que n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 ( corporificado pelos identificadoresde seqüência 6-11, respectivamente, discutido infra); (b) Hi-Nr(L)nPi- H2, emque n é 0 ou 1 ( corporificado pelos identificadores de seqüência 24-25,respectivamente, discutido infra); ou (e) H1-Pi-(L)n-Ni-H2, em que n é 0 ou 1,( corporificado pelos identificadores de seqüência 26-27, respectivamente,discutido infra), Hj e H2 podem ser aminoácidos hidrofóbicos iguais. Emoutras formas de realização da invenção descrita acima, em que opolipeptídeo isolado compreende os motivos estruturais a) HrNr(X)n-N2-H2,em que n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; (d) H1,N1 (L)n- P1,H2, em que n é 0 ou 1; ou (e)HrPr(L)n-NrH2, em que n é 0 ou 1, e H, e H2 podem ser aminoácidoshidrofóbicos diferentes. Em outras formas de realização, a invenção provê umpolipeptídeo isolado compreendendo o motivo de aminoácido (a) H1,N1,(X)n-N2-H2, em que n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; (b) HrNr(X)n-N2-Li, em que n é 0, 1,2,3, 4 ou 5; (c) L1,N1-(X)n-N2-H1, em que n é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; e em que Ni e N2podem ser iguais ou podem ser diferentes aminoácidos negativamentecarregados.
A invenção provê polipeptídeos isolados compreendendo osmotivos de aminoácidos descritos acima, em que referidos motivos sãoformados por aminoácidos consecutivos dentro da seqüência de aminoácidode referido polipeptídeo. Em exemplos específicos de acordo com esta formade realização, a invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo omotivo de aminoácido H1-NrN2-H2 (SEQ ID NO:6), HrNrX-N2-H2 (SEQID NO:7), H1-N1-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:8), H1-N1 X-X-X-N2-H2 (SEQ IDNO:9), H1-N1- X-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO: 10), H1- N1-X-X-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO: 11), H1-N1- N2-L1 (SEQ ID NO: 12), H1-N1-X-N2-L1 (SEQ IDNO: 13), H1-N1-X-X-N2- L1 (SEQ ID NO: 14), H1-N1 -X-X-X-N2- L1 (SEQID NO: 15), H1-N1-X-X-X-X-N2- L1 (SEQ ID NO: 16), H1-N1-X-X-X-X-X-N2- L1 (SEQ ID NO: 17), L1-N1-N2-H2 (SEQ ID NO:18), L1- N1-X-N2-H2(SEQ ID NO: 19), L1-N1-X-X-N2-H2 (SEQ ID N0:20), L1-N1-X-X-X-N2-H2(SEQ ID NO:21), L1-N1-X-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:22), L1-N1-X-X-X-X-X-N2-H2 (SEQ ID NO:23), H1-N1-P1-H2 (SEQ ID NO:24)5 H1-N1-L1-P1-H2(SEQ ID NO:25), H1- P1-N1-H2 (SEQ ID NO:26), ou H1-P1-LrN1-H2 (SEQID NO:27), em que Hje N1 são aminoácidos hidrofóbicos, N1 e N2 sãoaminoácidos negativamente carregados, X é qualquer aminoácido, L1 é umaminoácido polar, e P1 é um aminoácido positivamente carregado. Em algunsaspectos consistentes com esta forma de realização, em que o polipeptídeoisolado compreende um motivo tendo resíduos de aminoácidos H1 e H2, H1 eH2 podem ser iguais ou podem ser aminoácidos hidrofóbicos diferentes. Emoutros aspectos consistentes com esta forma de realização, em que opolipeptídeo isolado compreende um motivo tendo os resíduos deaminoácidos N1 e N2, N1 e N2 podem ser iguais ou podem ser aminoácidosnegativamente carregados diferentes.
Em outras formas de realização, a invenção provêpolipeptídeos isolados em que o motivo de aminoácido é formado devido àorganização espacial de aminoácidos dentro da estrutura terciária de umpolipeptídeo, isto é, os aminoácidos formando o motivo são espacialmenteadjacentes a um outro na estrutura tri-dimensional, isto é, estrutura terciária,do polipeptídeo mas pode ser separado por 1 ou mais aminoácidos dentro daseqüência de aminoácido primária da cadeia de polipeptídeo. Em um exemploespecífico de acordo com esta forma de realização, o motivo de aminoácidocompreendendo os resíduos de aminoácidos H1, N1, N2 e H2 análogos a SEQID NO: 6, discutido supra, pode formar como um resultado da estruturaterciária adotada por, isto é, duplicação de proteína de peptídeoscompreendendo, por exemplo SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, em que os resíduos de aminoácidos entreN1 e N2, por exemplo (X)n duplicam de modo que N1 e N2 se tornamlinearmente adjacentes. Assim, a invenção engloba peptídeos isoladoscompreendendo ) H1N1N2H2; H1N1N2L1; L1N1N2H1, H1N1(L)nP1H2, em que ηé 0 ou 1; ou H1P1(L)nN1H2, em que η é 0 ou 1, cujos motivos são formadoscomo um resultado da estrutura terciária do referido polipeptídeo. Em formasde realização relacionadas, em que o motivo de aminoácido compreende N1 eN2, as estruturas terciárias formam tais que a distância entre os carbonilcarbonos de N1 e N2 é de cerca de 3 Â a cerca de 5 Â, preferivelmente cercade 4 Â a cerca de 5 Â, e mais preferivelmente cerca de 4,4 Â a cerca de 4,8 Â.Em outras formas de realização, em que o motivo de aminoácido compreendeN1 e N2, as estruturas terciárias formam tais que a distância entre N1 e N2 sãoconfinadas espacialmente de modo que a separação de carga, por exemplo, ascadeias laterais carregadas, dos dois está entre cerca de 6,5 Â a cerca de 9 Â.Em uma forma de realização relacionada, Nj e N2 são assim espacialmenteconfirmadas como um resultado de estarem em seqüência de aminoácido queforma toda ou uma porção de uma hélice alfa, e podem se separados por 1, 2ou mais de 2 aminoácidos na seqüência de referidos aminoácidos formando areferida hélice. Em outras formas de realização relacionadas, em que o motivode aminoácido compreende N1 e P1, as estruturas terciárias formam tais que adistância entre os carbonil carbonos de N1 e P1 é cerca de 3 Â a cerca de 5 Â,preferivelmente cerca de 4 Â a cerca de 5 Â, e mais preferivelmente cerca de4,4 Â a cerca de 4,8 Â. Em outras formas de realização, em que o motivo deaminoácido compreende Nj e Pj, as estruturas terciárias formam tais que asdistâncias entre N1 e Pi são confinadas espacialmente de modo que aseparação de carga, por exemplo as cadeias laterais carregadas das duas estáentre cerca de 6,5 Â a cerca de 9 Â. Em uma forma de realização relacionada,Ni e Pi são espacialmente confinados como um resultado de estarem em umaseqüência de aminoácido que forma toda ou uma posição de uma hélice alfa, epode ser separado por 1, 2 ou mais de 2 aminoácidos na seqüência dereferidos aminoácidos formando a referida hélice. Em algumas formas derealização, os aminoácidos formando o motivo dentro da estrutura terciária dereferido polipeptídeo são separados um do outro por um número igual deresíduos de aminoácidos intervenientes na seqüência de aminoácido linear dereferido polipeptídeo. Em ainda outras formas de realização, os aminoácidosformando o motivo dentro da estrutura terciária de referido polipeptídeo sãoseparados um do outro por um número diferente de resíduos de aminoácidosintervenientes na seqüência de aminoácidos linear de referido polipeptídeo.Em algumas formas de realização, o polipeptídeo isolado da invenção formauma estrutura terciária regular, por exemplo uma α-hélice ou folha β-dobrada,de modo que a superfície de referida estrutura apresenta os aminoácidoscompreendendo referido motivo, e assim o próprio motivo, para a interface daestrutura de proteína e o meio aquoso, isto é, apresenta o motivo na superfíciede duplicação do polipeptídeo. Em formas de realização preferidas, asestruturas terciárias dos polipeptídeos da invenção formam em um meioaquoso em condições fisiológicas, por exemplo PBS (13 mM NaH2PC^, 137mMNaCl, pH 7.4) a 37 °C.
Em formas de realização específicas, a invenção provêpolipeptídeos isolados compreendendo os motivos de aminoácidos descritosaqui acima, por exemplo peptídeo A (APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE,SEQ ID NO:32), peptídeo C (NITVPDTKVNFYAWKRMEVG, SEQ IDNO:29), peptídeo D (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, SEQ IDNO:30), peptídeo E (GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:31),peptídeo F (RYLLUNITTGC, SEQ ID NO:33), peptídeo G (QEQLERALNSS, SEQ ID NO:40), peptídeo I (CSLNENIQEQLERALNSS,SEQ ID NO:43), peptídeo J (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, SEQ IDNO:41), peptídeo K (WEHVNAIQEARRLL, SEQ ID NO:35), ou peptídeo L(KIRSDLTALTESYVKH, SEQ ID NO:37).
Em algumas formas de realização, a invenção provê polipeptídeos isolados compreendendo 1 ou mais, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 oumais, 5 ou mais, 6 ou mais, ou mais do que 6 motivos de aminoácidosdescritos aqui. Em aspectos específicos da invenção de acordo com esta formade realização, em que o polipeptídeo isolado compreende pelo menos dois dosmotivos de aminoácidos descritos aqui acima, referidos pelo menos dois motivos podem ser o mesmo motivo ou podem ser motivos diferentes.
Em certos aspectos, a invenção provê polipeptídeos isoladosfaltando uma atividade eritropoiética, por exemplo, aumentando hemoglobinaem um recipiente. Preferivelmente, os polipeptídeos isolados desprovidos deoutras atividades incluindo, mas não limitadas a, ação vasoativa (por exemplo, vasoconstrição), plaquetas com hiperativação, atividades pró-coagulantes e estimulando a proliferação e/ou produção de trombócitos e/oucélulas dependentes eritropoiéticas (ver, Coleman et al., 2006, PNAS 103:5965-5970, incorporado aqui por referência em sua totalidade). Em outrosaspectos, a invenção provê polipeptídeos isolados que compreendem pelomenos uma atividade protetora celular. Esta atividade protetora celular inclui,mas não está limitada a proteger, manter, melhorar ou restaurar a função ouviabilidade de uma célula, tecido ou órgão de mamífero responsivo.Conseqüentemente, em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso deum polipeptídeo isolado descrito aqui para a preparação de composiçõesfarmacêuticas para proteger, manter, aumentar ou restaurar a função ouviabilidade de células de mamífero responsivas e suas células, tecidos eórgãos associados. Nas formas de realização descritas, as composições sãopara administração a um indivíduo em necessidade das mesmas. Nas formasde realização preferidas, referido indivíduo é um mamífero, e,preferivelmente, um humano.
Em outros aspectos, a presente invenção refere-se ao uso deum polipeptídeo isolado descrito aqui para a preparação de uma composiçãofarmacêutica para a proteção contra e/ou prevenção de um dano a tecidoresponsivo, para a restauração de, ou para o rejuvenescimento do tecidoresponsivo e/ou função do tecido responsivo em um indivíduo em necessidadeda mesma. Em um aspecto particular, as células de mamífero responsivos esuas células, tecidos ou órgãos associados são distais à vasculatura em virtudede uma barreira celular endotelial firme. Em um outro aspecto particular, ascélulas, tecidos, órgãos ou outras partes do corpo são isolados de um corpo demamífero, como os pretendidos para transplante. Por meio de exemplos nãolimitativos, uma célula ou tecido responsiva pode ser neuronal, do olho (porexemplo, retinal) adiposa conectiva, do cabelo, dentes, mucosal, do pâncreas,endócrina, do ouvido, epitelial, da pele, músculo, coração, pulmão, fígado,rim, intestino, adrenal (por exemplo, córtex adrenal, medula adrenal), capilar,endotelial, do testículo, ovário, osso, pele, ou endometrial. Além disso,exemplos não limitativos de células responsivas incluem célulasfotorreceptoras (bastões e cones), dos gânglios, bipolares, horizontais,amácrinas, de Müller, Purkinje, do miocárdio, marca-passo, nodo sinoatrial,nódulo do sino, tecido de união, nodo atrioventricular, feixe de His,hepatócitas, radiadas, de Kupfer, mensagiais, epiteliais renais, intersticiaistubulares, copo, glândulas intestinais (criptas), endócrinas enterais,glomerulosas, fasciculado, reticularis, cromafina, perícito, Leydig, Sertoli,esperma, folículo de Graffian, folículo primordial, ilhotas de Langerhans,células α, células β, células γ, células F, osteoprogenitor, osteoclastos,osteoblastos, estroma endometrial, endometrial, células tronco e endoteliais.Estes exemplos de células responsivas são meramente ilustrativos. Em umaspecto, a célula responsiva ou suas células, tecidos ou órgãos associados sãocélulas, tecidos ou órgãos excitáveis, ou predominantemente compreendemcélulas ou tecidos excitáveis. Em certo aspectos da invenção, o tecidoexcitável é tecido do sistema nervoso central, tecido do sistema nervosoperiférico, tecido cardíaco ou tecido renal. Em um outro aspecto, a célularesponsiva ou suas células, tecidos ou órgãos excitáveis, tampoucocompreendem predominantemente células ou tecidos excitáveis.
A atividade protetora eritropoiética e/ou celular dopolipeptídeo isolado da invenção em células responsivas pode ser avaliadae/ou determinada por qualquer método descrito aqui e ou conhecido na arte.Em certas formas de realização, a atividade protetora eritropoiética e/oucelular é determinada em um teste in vitro. Em outras formas de realização, aatividade protetora eritropoiética e/ou celular é determinada em um teste invivo. Em uma forma de realização relacionada, em que a atividade protetoracelular é neuroproteção, a invenção provê um método para avaliar referidaatividade in vitro (a) contatando uma cultura de teste de neurônios dehipocampos primários com N-metil-D-aspartato e referido peptídeo; e (b)determinando a viabilidade das células em 48 h após referido contato, demodo que se a viabilidade das células determinada na etapa (b) é maior doque a de uma cultura de controle na ausência de referido peptídeo, o peptídeopossui atividade protetora celular.
Em uma forma de realização particular, a célula, tecido ouórgão de mamífero para o qual um peptídeo isolado acima mencionado éusado são os que despendem ou despenderão um período de tempo em pelomenos uma condição adversa à viabilidade da célula, tecido ou órgão. Deacordo com esta forma de realização, os peptídeos isolados da invençãoprovêm proteção contra e/ou prevenção de um dano a tecido resultante destascondições, provêem a restauração de, ou provêem o rejuvenescimento detecido e/ou função de tecido em um indivíduo em necessidade dos mesmosantes, durante ou após estas condições surgirem. Estas condições incluemhipoxia in situ traumática ou disfunção metabólica, hipoxia in situ oudisfunção metabólica induzidas cirurgicamente, ou exposição a toxina in situ,a última pode ser associada com quimioterapia ou terapia de radiação. Emoutras formas de realização, os peptídeos isolados da invenção provêmproteção contra e/ou prevenção de um dano a tecido resultante de uma doençaou distúrbio, provêem a restauração de, ou provêem o rejuvenescimento detecido e/ou função de tecido em um indivíduo em necessidade dos mesmosantes, durante ou após estas condições surgirem. Nas formas de realizaçãoreferido dano é causado por um distúrbio que provoca um insulto, esclerosemúltipla, derrame, hipotensão, parada cardíaca, isquemia, infarto domiocárdio, inflamação, perda da função cognitiva relacionada à idade, danode radiação, paralisia cerebral, doença neurodegenerativa, mal de Alzheimer,mal de Parkinson, doença mitocondrial, demência por AEDS, perda dememória, esclerose lateral amiotrófica, alcoolismo, distúrbio do humor,distúrbio de ansiedade, distúrbio de déficit de atenção, autismo, doença deCreutzfeld-Jakob, trauma cerebral ou da medula espinhal ou isquemia, desviode tipo desvio coração-pulmão, falha cardíaca crônica, degeneração macular,neuropatia diabética, retinopatia diabética, hepatite, pancreatite, glaucoma,isquemia retinal, trauma retinal, doença cardiovascular, doençacardiopulmonar, doença respiratória, doença renal, doença do sistemaurinário, doença do sistema reprodutor, doença óssea, doença da pele, doençado tecido conectivo, doença gastrointestinal, anormalidade endócrina,anormalidade metabólica, ou uma doença ou distúrbio do sistema nervosocentral ou periférico. Em ainda uma outra forma de realização, as condiçõesadversas são um resultado de desvio cardio-pulmonar (máquina coração-pulmão), como é usado para certos procedimentos cirúrgicos. Em ainda emoutras formas de realização, referido dano é disfunção cognitiva. Em umaforma de realização particular, a célula, tecido ou órgão de mamífero, para oqual um peptídeo isolado acima mencionado é usado, expressam o receptorPc.
Em certas formas de realização, a invenção refere-se também acomposições farmacêuticas compreendendo os polipeptídeos isolados acimamencionados para administração a um indivíduo em necessidade dos mesmos.Em aspectos específicos de acordo com esta forma de realização, acomposição farmacêutica da invenção ainda compreende um veículofarmaceuticamente aceitável. Estas composições farmacêuticas podem serformuladas para administração oral, intranasal, ocular, por inalação,transdérmica, retal, sublingual, vaginal ou parenteral, ou na forma de umasolução de perfundido para manter a viabilidade de células, tecidos ou órgãosex vivo. Nas formas de realização relacionada da invenção o indivíduo é umanimal mamífero, preferivelmente um humano.
Em outros aspectos, a invenção provê um método para facilitara transcitose de uma molécula através de uma barreira celular endotelial emum indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração aoreferido indivíduo de uma composição compreendendo referida molécula emassociação com um peptídeo isolado da invenção descrito acima. Em umaforma de realização relacionada, a associação é uma ligação covalente lábil,uma ligação covalente estável ou associação não covalente com um sítio deligação para referida molécula.
De acordo com um outro aspecto da invenção, o peptídeoisolado da invenção, como descrito acima, é capaz de atravessar uma barreiracelular endotelial. Em uma forma de realização, a barreira celular endotelialcompreende a barreira sangue-cérebro, a barreira sangue-olho, a barreirasangue-testículos, a barreira sangue-ovário, sangue-placenta, sangue-coração,sangue-rim, sangue-nervo, ou barreira sangue- medula espinhal.
De acordo com um aspecto da invenção, é provida umamolécula de ácido nucleico isolada que compreende uma seqüência denucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeoisolado como descrito acima.
Em uma outra forma de realização da invenção, é provida umamolécula de ácido nucleico isolada que compreende uma seqüência denucleotídeos (isto é, um cDNA, uma seqüência de nucleotídeos interrompidapor introns, ou não interrompida por introns), que codifica um polipeptídeocompreendendo ou consistindo do polipeptídeo isolado da invenção comodescrito acima. Em uma forma de realização, a seqüência de nucleotídeos,codificando o polipeptídeo isolado da invenção, é sintetizada usando códonspreferidos que facilitam expressão ótima em uma célula hospedeira particular.
Estes códons preferidos podem ser ótimos para expressão em células de umaespécie de planta, bactéria, levedura, mamífero, fungo ou inseto.
A invenção também provê um vetor compreendendo amolécula de ácido nucleico. A invenção também provê um vetor de expressãocompreendendo a molécula de ácido nucleico e pelo menos uma regiãoregulatória operativamente ligada à molécula de ácido nucleico. Em umaoutra forma de realização, a invenção provê uma célula compreendendo ovetor de expressão. Em ainda uma outra forma de realização, é provida umacélula geneticamente engenheirada que compreende a molécula de ácidonucleico.
Em uma outra forma de realização, a invenção provê ummétodo para produzir recombinantemente o peptídeo isolado da invenção,descrito acima, compreendendo cultivar em um meio uma célula hospedeiracontendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência denucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção, em condiçõesapropriadas para a expressão de referido peptídeo, e recuperando e/ouisolando o polipeptídeo expressado de referido meio.
3.1 TERMINOLOGIA
Como usado aqui, o termo "cerca" ou "aproximadamente"quando usados em combinação com um número referem-se a qualquernúmero dentro de 1, 5 ou 10% do número referenciado.
O termo "administrado em combinação com" no contexto dosmétodos da invenção significa administrar um composto antes, ao mesmotempo como, e/ou subseqüente ao início de uma doença, distúrbio oucondição.
O termo "aminoácido" ou qualquer referência a umaminoácido específico se destina a incluir aminoácidos proteogênicosocorrendo naturalmente bem como aminoácidos ocorrendo não naturalmentecomo análogos de aminoácidos. Os versados na arte podem saber que estadefinição inclui, a menos que especificamente indicado ao contrário, (L)-aminoácidos protogênicos ocorrendo naturalmente, seus (D)-isômeros óticos,aminoácidos quimicamente modificados, incluindo análogos de aminoácidoscomo penicilamina (3-mercapto-D-valina), aminoácidos não proteogênicosocorrendo naturalmente como norleucina e proteínas quimicamentesintetizadas que têm propriedades conhecidas na arte como sendocaracterísticas de um aminoácido. Como usado aqui, os aminoácidos serãorepresentados ou por seu acrônimo de três letras ou um símbolo de letra comoa seguir = Ala ou A, arginina; Arg ou R, asparagina = Asn ou N, ácidoaspártico = Asp ou D, cisteína = Cys ou C, ácido glutâmico = Glu ou E,glutamina = Gln ou Q, glicina = Gly ou G, histidina = His ou H, isoleucina =Ile ou I, leucina = Leu ou L, lisina = Lys ou K, metionina = Met ou M,fenilalanina = Phe ou F, prolina = Pro ou P, serina = Ser ou S, treonina = Throu T, triptofano = Trp ou W, tirosina = Tyr ou Y, e valina = Val ou V. Alémdisso, o termo "equivalente a aminoácido" refere-se a compostos que saem daestrutura dos aminoácidos ocorrendo naturalmente, mas que têmsubstancialmente a estrutura de um aminoácido, de modo que eles podem sersubstituídos em um peptídeo, que retém sua atividade biológica a despeito dasubstituição. Assim, por exemplo, equivalentes de aminoácidos podem incluiraminoácidos tendo modificações ou substituições na cadeia lateral, e tambémincluem ácidos orgânicos relacionados, amidas ou outros. O termo"aminoácido" pretende incluir equivalentes de aminoácidos. O termo"resíduos" refere-se a ambos aminoácidos e equivalentes de aminoácidos. Osaminoácidos também podem ser classificados nos seguintes grupos como écomumente conhecido na arte: (1) aminoácidos hidrofóbicos> His, Trp, Tyr,Phe, Met, Leu, lie, Vai, Ala; (2) aminoácidos hidrofílicos neutros: Cys, Ser,Thr; (3) aminoácidos polares: Ser, Thr, Asn, Gln; (4) aminoácidos ácidos/negativamente carregados: Asp, Glu; (5) aminoácidos carregados: Asp, Glu,Arg, Lys, His; (6) aminoácidos positivamente carregados: Arg, Lys, His; e (7)aminoácidos básicos: His, Lys, Arg.
Como usado aqui, "tecido excitável" significa tecido quecontém células excitáveis. Células excitáveis são células que respondemativamente a um estímulo elétrico e têm um diferencial de carga elétricaatravés de suas membranas celulares. Células excitáveis são geralmentecapazes de sofrer um potencial de ação. Estas células expressam tipicamentecanais, como canais ligados por voltagem, ligados por ligando e canais deesticamento, que permitem fluxo de íons (potássio, sódio, cálcio, cloro, etc.)através da membrana. Tecido excitável inclui neuronal, tecido do músculo etecido glandular. O tecido excitável inclui, mas não está limitado a tecidosneuronais como tecido do sistema nervoso periférico (ouvido e retina) esistema nervoso central (cérebro e medula espinhal); tecido cardiovascularcomo as células do coração e nervos associados; e tecido glandular como opâncreas onde canais de cálcio do tipo T junto com junções de fendas célula-a-célula participam na secreção de insulina. Uma lista exemplar de tecidoexcitável inclui órgãos e tecidos que incluem nervos, músculo esqueletal,músculo liso, músculo cardíaco, útero, sistema nervoso central, medulaespinhal, retina, sistema olfativo, sistema auditivo, etc.
O termo "célula hospedeira", como usado aqui, refere-se àcélula de indivíduo particular transfectada com uma molécula de ácidonucleico e a progênie ou progênie potencial desta célula. A progênie destacélula não pode ser idêntica à célula parental transfectada com a molécula deácido nucleico devido a mutações ou influências ambientais que podemocorrer nas gerações seguintes ou integração da molécula de ácido nucleicono genoma da célula hospedeira.
Um polipeptídeo "isolado" ou purificado" é substancialmenteisento de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte da célulaou tecido do qual a proteína ou polipeptídeo é derivado, ou substancialmenteisento de precursores químicos ou outros produtos químicos quandoquimicamente sintetizado. A linguagem "substancialmente isento de materialcelular" inclui preparações de um polipeptídeo em que o polipeptídeo éseparado de componentes celulares das células do qual ele é isolado ourecombinantemente produzido. Assim, um polipeptídeo que ésubstancialmente isento de material celular inclui preparações depolipeptídeos tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10% ou 5% (em pesoseco) de proteína heteróloga (também referida aqui como uma "proteínacontaminante"). Quando o polipeptídeo é recombinantemente produzido, eletambém é substancialmente isento de meio de cultura, isto é, o meio decultura representa menos do que cerca de 20%, 10% ou 5% do volume dapreparação de proteína. Quando o polipeptídeo é produzido por síntesequímica, ele é preferivelmente substancialmente isento de precursoresquímicos ou outros produtos químicos, isto é, ele é separado de precursoresquímicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese daproteína. Conseqüentemente, tais preparações de polipeptídeo têm menos doque cerca de 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos oucompostos diferentes do anticorpo de interesse. Em uma forma de realizaçãopreferida, os polipeptídeos da invenção são isolados ou purificados.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é a que é separadade outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural damolécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico"isolada", como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente isenta deoutro material celular, ou meio de cultura quanto produzida por técnicasrecombinantes, ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outrosprodutos químicos quando quimicamente sintetizada. Em uma forma derealização específica, uma molécula(s) de ácido nucleico codificando umpolipeptídeo da invenção é isolada ou purificada.
Como usado aqui em referência a uma estrutura em umpolipeptídeo, o termo "motivo" refere-se tanto a um conjunto de aminoácidosconsecutivos na seqüência de aminoácidos da cadeia de polipeptídeo e/ou umconjunto de aminoácidos linearmente adjacentes na estrutura terciária dereferido polipeptídeo. Devido ao motivo poder ser formado todo ou em partecomo um resultado de duplicação de proteína, os aminoácidos que estãoadjacentes no motivo descrito podem ser separados por 0, 1 ou mais, 5 oumais, 10 ou mais, 15 ou mais ou 20 ou mais aminoácidos na seqüência deaminoácidos lineares do polipeptídeo.
Como usado aqui, os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e"proteína" são usados intercambiavelmente e em seu sentido mais amplo parareferir-se a seqüências de aminoácidos limitadas (isto é, tendo algumelemento da estrutura como, por exemplo, a presença de aminoácidos queiniciam uma rotação β ou folha β dobrada, ou, por exemplo, ciclizado pelapresença de resíduos Cys ligados a dissulfeto) ou não limitadas (por exemplo,lineares). Em certas formas de realização, o peptídeo da invenção consiste demenos do que 30 aminoácidos. No entanto, quando da leitura da presentedescrição, os versados na arte reconhecem que não é o comprimento de umpeptídeo particular mas sua capacidade de ligar um complexo de receptor doprotetor de tecido e/ou competir com a ligação de um peptídeo descrito aquique distingue o peptídeo da invenção. Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e"proteína" referem-se também a compostos contendo equivalentes deaminoácidos ou outros grupos não aminoácidos, enquanto ainda retendo aatividade funcional desejada de um peptídeo. Os equivalentes de peptídeopodem diferir de peptídeos convencionais pela substituição de um ou maisaminoácidos com ácidos orgânicos relacionados (como PABA), aminoácidosou semelhantes ou a substituição ou modificação de cadeias laterais ou gruposfuncionais.
O termo "prevenir uma doença, distúrbio, ou condição"significa retardar o início, impedir o aparecimento, proteção contra, inibir oueliminar a emergência, ou reduzir a incidência da doença, distúrbio, oucondição. O uso do termo "prevenção" não pretende implicar que todos ospacientes em uma população de pacientes administrados com uma terapiapreventiva nunca desenvolverão a doença, distúrbio, ou condição marcadapara a prevenção, mas, ao contrário, que a população de pacientesdemonstrará uma redução na incidência da doença, distúrbio, ou condição.Por exemplo, muitas vacinas de influenza não são 100% efetivas naprevenção de influenza nos administrados com a vacina. Um versado na artepode prontamente identificar pacientes e situações para os quais terapiapreventiva pode ser benéfica, como, mas não limitada a, indivíduos que estãopróximos a se engajar em atividades que podem levar a trauma e dano (porexemplo, soldados engajados em operações militares, motoristas de carros decorrida, etc.), pacientes para os quais cirurgia é planejada, pacientes em riscode doenças, distúrbios ou condições hereditárias, pacientes em risco dedoenças, distúrbios ou condições precipitadas por fatores ambientais, ouporções da população em risco de doenças, distúrbios ou condiçõesparticulares como idosos, crianças, ou os com sistemas imunológicosenfraquecidos, ou os pacientes com fatores genéticos ou outros fatores derisco para uma doença, distúrbio ou condição.
Como usado aqui, os termos "indivíduo" e "paciente" sãousados intercambiavelmente. Como usado aqui, os termos "indivíduo" e"indivíduos" refere-se a um animal, preferivelmente um mamífero incluindoum não primata (por exemplo, uma vaca, porco, cavalo, gato, cachorro, rato ecamundongo) e um não primata (por exemplo, um macaco ou um humano), emais preferivelmente um humano.
Como usado aqui, o termo "atividade protetora de tecido" ou"proteção de tecido" refere-se ao efeito de inibir ou retardar dano ou doençade uma célula, tecido ou órgão. A menos que indicado ao contrário, o"retardo" no dano ou doença de uma célula, tecido ou órgão é avaliado comrelação a uma condição de controle na ausência de um peptídeo da invenção.A atividade protetora de tecido é utilizável em várias condições, doenças, edano de célula, órgão e~/ou tecido, por exemplo, os descritos na seção 5.3.Esta atividade protetora de tecido é específica em tecido, células e/ou órgãosexpressando um complexo de receptor do protetor de tecido (isto é, um tecido,célula e/ou órgão, respectivamente), como, mas não limitados a tecidos dosistema nervoso central. Nas formas de realização específicas, as célulasresponsivas não são células progenitoras de eritrócitos.
O termo "complexo de receptor do protetor de tecido" comousado aqui significa um complexo compreendendo pelo menos umasubunidade de receptor de eritropoietina e pelo menos uma subunidade dereceptor comum beta. O complexo de receptor do protetor de tecido podeconter subunidades de receptor de eritropoietina múltiplas e/ou subunidadesde receptor comuns beta, bem como outros tipos de receptores ou proteínas.Ver WO 2004/096148, incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Para determinar a porcentagem de identidade de duasseqüências de aminoácidos, as seqüências são alinhadas para fins decomparação ótimos. Os resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácidocorrespondentes são então comparados. Quando uma posição na primeiraseqüência é ocupada pelo menos resíduo de aminoácidos como a posiçãocorrespondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticasnaquela posição. A porcentagem de identidade entre as duas seqüências é umafunção do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (istoé, % de identidade = número de posições de sobreposição idênticas/ númerototal de posições X 100%). Em uma forma de realização, as duas seqüênciastêm o mesmo comprimento. Em uma forma de realização alternativa, asseqüências são de comprimento diferente e, conseqüentemente, aporcentagem de identidade refere-se a uma comparação da seqüência maiscurta em uma porção da seqüência mais longa, em que referida porção tem omesmo comprimento como referida seqüência mais curta.
4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 descreve os resultados de um modelo de dano aonervo ciático in vivo para comparar a eficácia do peptídeo J (SEQ ID NO: 41)com EPO carbamilado na molécula protetora de tecido (CEPO), em que opeptídeo J, SEQ ID NO: 41, é um peptídeo quimérico consistindo deaminoácidos voltados para o exterior da hélice B de EPO (isto é, peptídeo G,SEQ ID NO: 40) combinada com uma hélice antipática de polipeptídeopancreático (LRRYINMLTRP, SEQ ID NO: 28)
Figura 2 descreve os efeitos protetores de tecido dos peptídeosda invenção como testado em um modelo de dano ao nervo ciático in vivo. Noteste, o nervo ciático direito de ratos (n=6 por grupo) foi danificado e oanimal imediatamente dosado com PBS, ou concentrações molares iguaiscontendo PBS de EPO carbamilado, peptídeo A de EPO (SEQ ID NO: 32,correspondendo a aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 1), peptídeo D (SEQ IDNO: 30, correspondendo a aminoácidos 58-82 de SEQ ID NO: 1), ou peptídeoG (SEQ ID NO: 40). O peptídeo G (SEQ ID NO: 40) é baseado nosaminoácidos na hélice B de EPO que faceia externamente do centro globularda molécula de EPO no ambiente hidrofílico, isto é, presente na superfície dopolipeptídeo. Além disso, uma construção de 20 meros de uma região de fatorderivado de epitélio do pigmento que é protetor, como se sabe, de tecido viaum outro receptor foi incluído como um controle negativo. A recuperação dodano durante os 4 dias seguintes demonstra que o peptídeo G, SEQ ID NO:40, e peptídeo D, SEQ ID NO: 30, demonstram um efeito protetor de tecidoneste teste em modelo in vivo que é equivalente a ou melhor do que EPOcarbamilado (CEPO.
Figura 3 descreve os efeitos eritropoiéticos do peptídeo D,SEQ ID NO: 30, e CEPO, que é desprovido, como se sabe, de atividadeeritropoiética, como testado em um teste UT-7 para atividade eritropoiética.Os resultados deste teste in vitro demonstra que nem o peptídeo D, SEQ IDNO: 30, nem CEPO demonstram atividade eritropoiético em doses de até10.000 pM.
Figura 4 descreve os resultados de um teste in vivo paradeterminar se o peptídeo F (SEQ ID NO: 33, correspondendo a aminoácidos14-29 de SEQ ID NO: 1) e peptídeo G (SEQ ID NO: 40) são eritropoiéticosou elicitam anticorpos neutralizantes contra EPO. Os resultados demonstramque nenhuma proteína aumentou os níveis de hemoglobina nos ratos quandoadministrada em 0,8 μg/kg, 3 dias/ semana subcutaneamente (s.c.) durante ocurso de 130 dias. Além disso, nenhum peptídeo elícita uma resposta deanticorpo, em contraste com a administração de EPO.
Figura 5 descreve os resultados de estudos in vitro quedemonstram que o peptídeo D, SEQ ID NO: 30, protege neurônios motorescontra morte induzida por kainate.
Figura 6 mostra que o peptídeo D, SEQ ID NO: 30, em dosesde 0,1 ng/ml e 1 ng/ml, protege as células P-19 contra apoptose associadacom privação de soro.Figuras 7 A-B descrevem os resultados de um teste de oclusãode artéria cerebral central em ratos. A figura 7A descreve um gráficodemonstrando que o peptídeo D (SEQ ID NO: 30, correspondente aaminoácidos 58-82 de SEQ ID NO: 1), em uma dose única de 4,4 μg/kg, écapaz de reduzir o volume do infarto cerebral tão fortemente como quatrodoses de 4,4 μg/kg administradas 2 horas separadamente. Figura 7B descreveos resultados de um teste de defeito no pé para determinar o déficitcomportamental causado pela oclusão da artéria cerebral central. Figura 7Bmostra que os ratos demonstraram melhoras comportamentais quandoadministrado o peptídeo D, SEQ ID NO: 30, em ambos um programa de doseúnica (1 x 4,4 μg/kg) e um programa de dose múltipla (4x4,4 μg/kg).
Figuras 8 A-B descrevem os resultados de um teste in vivo deum teste de neuropatia diabética. Diabetes é induzido em ratos usandoestreptozotocina. Após verificação do diabetes induzido, os ratos foramtratados com peptídeo D, SEQ ID NO: 30, ou PBC cinco vezes por semanaem uma dose de 4 μg/kg-peso corporal i.p. durante um período de duassemanas. Tanto a velocidade de condução do nervo como latência na placaquente dos ratos foram observadas. Figura 8A demonstra que os ratos tratadoscom o peptídeo D, SEQ ID NO: 30, demonstraram velocidades de conduçãomelhoradas em comparação com ratos não tratados. Figura 8B demonstra quea latência na placa quente para os ratos tratados foi reduzida com relação aosratos não tratados, demonstrando ainda a melhora na velocidade de condução.
Figuras 9 A-B descrevem os resultados de tratamento deneuropatia e nefropatia induzidas por cisplatina com quimera de hélice B deEPO. A figura 9A demonstra que os animais tratados com o peptídeo G (SEQID NO: 40, uma quimera de hélice B) demonstraram resultados melhoradosquando testados em um teste de latência com placa quente. Figura 9Bdemonstra que a produção de urina, uma medida da função renal, foi mantidacomo normal nos animais tratados com peptídeo G (SEQ ID NO: 40).Figura 10 descreve os efeitos do peptídeo D (SEQ ID NO: 30)na ligação retinal associada com retinopatia diabética. A figura demonstra queo peptídeo D (SEQ ID NO: 30) foi capaz de reduzir substancialmente ovazamento retinal nos animais tratados.
Figura 11 descreve os resultados do peptídeo F (SEQ ID NO:33) ou peptídeo G (SEQ ID NO: 40) em um modelo de isquemia-reperfusãorenal. A figura demonstra que ambos os peptídeos reduziram a classificaçãode danos resultantes de um dano por isquemia-reperfusão de 60 minutosquando avaliados após 72 horas.
Figura 12 ilustra que a administração do peptídeo F (SEQ IDNO: 33) protege camundongos de malária cerebral experimental.
Figura 13 Classificação clínica em modelo EAE de murinostratados com o peptídeo E, SEQ ID NO: 31. A figura 13 descreve a fonteclínica da função neurológica em camundongos com encefalomieliteautoimune experimental. 4,4 μg/kg de peptídeo E foram administrados i.p.diariamente. A administração do peptídeo E melhorou significativamente afunção neurológica com relação ao controle. Representação clínica; 1, caudaflácida; 2, ataxia e/ou paresia de membros traseiros, ou reflexo lento de seendireitar; 3, paralisia de membros traseiros e/ou paresia de membrosdianteiros; 4, paresia de membro dianteiro; 5, moribundo ou morto.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
5.1 PEPTÍDEOS PROTETORES DE TECIDO
A atividade eritropoiética de eritropoietina ("EPO") é bemcaracterizada na arte (ver, por exemplo, Cheetham et al., 1998, Nat. Struct.Biol. 5; 861-866, incorporado aqui por referência em sua totalidade). EPOinicia eritropoiese ligando-se à porção extracelular de um homodímeroreceptor de eritropoietina pré-formado (EPOR) (isto é, (EPOR)2) de um modoque se liga entre locais específicos nas subunidades de EPOR individuais.
Quando EPO liga-se a (EPOR)2, grandes porções de ligando globular estãodistantes de regiões de ligação e face externa, afastadas o complexo de EPO e(EPOR)2 no meio aquoso. Os requerentes determinam que a proteção detecido, como distinta de eritropoiese, é mediada através de um receptordiferente de (EPOR)2, que consiste de um monômero de EPOR em conjuntocom um outro receptor, CD131 (também conhecido como a subunidade dereceptor comum β (β0)). EPOR e βε interagem para formar o heterodímeroreceptor, EPOR-βς. Se outras proteínas estão envolvidas nesta interação éatualmente desconhecido. A presente invenção descreve peptídeos protetoresde tecido derivados da estrutura tridimensional de EPO, e, em particular, deporções de EPO voltadas afastadas dos sítios de ligação de EPO, isto é, nãointeragindo com, o homodímero de EPOR eritropoiético (EPOR)2 clássico.Não desejando ficar limitado por qualquer teoria particular, os requerentesacreditam que esta porção da molécula de EPO interage com o receptor doprotetor de tecido e, deste modo, media a proteção de tecido
A estrutura tridimensional de EPO é aceita como descrito porCheetham et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5; 861-866, incorporado aqui porreferência em sua totalidade, como descrito em SEQ ID NO: 1 (tambémdisponível como dados depositados em Protein Data Bank of the NationalCenter for Biotechnology Information como entrada "IBUY"). As porções damolécula de EPO voltadas afastadas da porção proximal da membrana dohomodímero de EPOR quando ligadas a referido receptor (isto é, afastadas damembrana celular quando o homodímero (EPOR)2 é expressado na superfíciede uma célula) consistem das seguintes estruturas secundárias: laço AB(correspondendo a aminoácidos 29-55 de SEQ ID NO: 1), hélice B(correspondendo a aminoácidos 56-82 de SEQ ID NO: 1), laço BC(correspondendo a aminoácidos 83-92 de SEQ ID NO: 1) e laço CD(correspondendo a aminoácidos 112-138 de SEQ ID NO: 1). Em uma formade realização da invenção, os peptídeos protetores de tecido consistem deseqüências de aminoácidos correspondentes a estas estruturas distintas damolécula de EPO.
Não desejando ficar limitados a qualquer teoria em particular,os requerentes acreditam que o receptor do protetor de tecido é pré-formado,isto é, que o EPOR e subunidades da proteína β0 são funcionalmenteassociados antes de sua interação com EPO. EPO é um membro dasuperfamília de citocina tipo 1. Membros de ramos da superfamília decitocina tipo 1 são caracterizados por quatro hélices que interagemhidrofobicamente para formar uma proteína globular cuja superfície exteriorinterfaceia com o meio aquoso e é denominado "como voltado para oexterior". Inesperadamente, os requerentes determinaram que mais do que umpeptídeo derivado da porção voltada para o exterior da molécula de EPO éprotetor de tecido. Uma outra descoberta surpreendente é que os peptídeosderivados de porções da molécula de EPO que são colocados no complexoEPO:(EPOR)2 e peptídeos que também podem conter porções de 1 ou 2 sítiosde ligação de eritropoiese também são altamente potentes na proteção detecido. Para calcular estas descobertas, os requerentes propõem que a ativaçãobem-sucedida do receptor do protetor de tecido é devido a uma configuraçãode carga espacialmente compacta apropriada no ligando de peptídeo. Alémdisso, esta configuração de carga compacta é corporificada por dois motivosestruturais distintos: (1) dois aminoácidos negativamente carregadosadjacentes um ao outro, e flanqueados por aminoácidos hidrofóbicos; ou (2)um aminoácido positivo e um negativo (isto é, básico e ácido) imediatamenteadjacente um ao outro, e flanqueados por resíduos de aminoácidoshidrofóbicos únicos ou polares. A proximidade destas cargas pode ocorrer viaa estrutura linear imposta pela ligação de peptídeo, isto é, a estrutura pode serformada por aminoácidos consecutivos em uma cadeia de polipeptídeo, oualternativamente, a proximidade pode ocorrer via uma relação espacial entrepartes diferentes da molécula de EPO (ou outras moléculas de citocina tipo 1relacionadas) conferidas pela estrutura terciária da proteína, isto é, estruturatridimensional. Não desejando ficar limitado a qualquer teoria específica, osrequerentes acreditam que, em geral, este requisito dita que um peptídeoprotetor de tecido terá uma estrutura terciária distinta (por exemplo, hélices oufolhas dobradas) que provê o local espacial requerido do par de aminoácidoscarregados (isto é, os dois aminoácidos negativamente carregados e/ou oaminoácido positivo e negativo). Uma única exceção é um peptídeo linear emque o par de aminoácidos é imediatamente adjacente um ao outro, com arigidez requerida conferida pela estrutura dorsal do peptídeo.Conseqüentemente, o motivo estrutural (1) é englobado por uma seqüêncialinear de resíduos de aminoácidos, por exemplo, H1-Ni-NrH2 (SEQ ID NO:6) ou por uma seqüência linear de resíduos de aminoácidos em que Ni e N2são separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais resíduos intervenientes, porexemplo, HrNrX-X-X-X-X-N1-H2 (SEQ ID NO: 11).
Para proteção de tecido, o par de aminoácidos carregados deveser espacialmente orientado de modo que os carbonos de carbonila sejamcerca de 3 angstroms (Â) a cerca de 5 Â afastados, preferivelmente cerca de 4Â a cerca de 5 Â afastados, e mais preferivelmente cerca de 4,4 Â a cerca de4,8 Â afastados. Isto pode ser realizado de vários modos, por exemplo, poraminoácidos carregados adjacentes em um peptídeo linear único (ver, porexemplo, exemplo 2 e peptídeo G, SEQ ID NO: 40, tabela 1) ou por peptídeosque podem formar uma hélice alfa, aminoácidos carregados separados por umresíduo de aminoácidos interveniente (ver, por exemplo, exemplo 2 e peptídeoF, SEQ ID NO: 33, tabela 1). Deve ser notado que a estrutura terciária (porexemplo, uma hélice alfa em peptídeos antipáticos) pode ser conferidaquando o peptídeo está em um microambiente específico, como na interfaceda membrana de superfície de células-extracelulares (ver, Segrest, 1990,Proetins 8: 103-117, incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Além disso, a atividade protetora de tecido é prevista parapeptídeos que contêm pares de aminoácidos carregados de modo que ascadeias laterais carregadas (tanto positiva como negativa, como duasnegativas) sejam confinadas espacialmente dentro de cerca de 6,5 Â a cercade 9 Â uma das outras. Isto pode ser provido em uma hélice alfa pelo parcarregado sendo separado por um ou dois aminoácidos, que proporcionaráque as cargas estejam mais ou menos do mesmo lado da hélice com aseparação requerida de cerca de 6,5 Â a 9 Â. Um exemplo não limitante dopeptídeo é encontrado no peptídeo F (ver, exemplo 2, SEQ ID NO: 33, tabela1). Um versado na arte pode divisar uma estrutura terciária para o peptídeoque é geralmente requerido para obter o local tridimensional apropriado dosaminoácidos carregados, bem como o projeto de moléculas pequenas paraimitar a separação de carga no peptídeo.
As distâncias espaciais entre os carbonil carbonos de quaisqueraminoácidos ou entre as cadeias laterais de quaisquer dois aminoácidospodem ser deduzidas por qualquer método conhecido na arte ou descrito aqui.Por exemplo, quando a estrutura tridimensional da proteína é conhecida, aseparação da carga de duas cadeias laterais ou a distância espacial entre doiscarbonil carbonos em uma porção de interesse de referida proteína pode sercalculada com base nas coordenadas tridimensionais publicadas, ou de outromodo aceitas na arte, dos resíduos de aminoácidos em referida porção deinteresse. Quando a estrutura tridimensional da proteína e, conseqüentemente,a porção de interesse é desconhecida, ou em que um peptídeo totalmentesintético é construído com base nos presentes ensinamentos, cuja estruturatridimensional é desconhecida, a separação da carga de duas cadeias lateraisou a distância espacial entre dois carbonil carbonos em referido peptídeo podeser estimada usando a estrutura tridimensional prevista pelo software demodelagem de proteína como é conhecido na arte. Exemplos não limitativosde referido software são MOE™ por Chemical Computing Group (Quebec,Canadá) e Modeler por Accelrys (San Diego, Califórnia). Similarmente, osoftware previsto disponível das companhias indicadas acima também édesconhecido também na arte para o projeto de moléculas pequenas assim e,conseqüentemente, um versado na arte, baseado nos presentes ensinamentos,pode ser capaz de produzir moléculas pequenas que emulam os motivosestruturais descritos.
Peptídeos não ocorrendo naturalmente ou quiméricos podemser projetados que imitam as proximidades espaciais críticas descritas acimavia uma seqüência linear de aminoácidos. A presente invenção refere-se,assim, a novos peptídeos protetores de tecido, incluindo os que demonstramos motivos estruturais que iniciam a proteção de tecido.
A presente invenção refere-se também ao uso de fragmentosprotetores de tecido de citocinas tipo 1, mas não limitados a fator de estímulode colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interleucina-3 (IL-3),trombopoietina (TPO), fator neurotrófico ciliar (CNTF) e fator inibitório deleucemia (LIF), que são estruturalmente homólogos com as seqüências deaminoácidos presentes externamente em EPO e/ou contêm os motivosestruturais descritos acima.
Além disso, os peptídeos protetores de tecido podem sercompostos quiméricos baseados nos motivos estruturais descritos acimacombinando elementos estruturais não adjacentes e aminoácidos presentes nasuperfície somente. Em particular, os requerentes determinam que a adição deuma hélice de peptídeo anfipático às seqüências indicadas acima aumenta apotência do peptídeo.
Além disso, os peptídeos protetores de tecido da presenteinvenção incluem peptídeos de fusão resultantes da combinação de dois oumais dos peptídeos acima indicados, ou com uma macromolécula relacionadaou não relacionada para transporte específico, como EPO nativo, insulina ouleptina.
5.1.1. Fragmentos
A. Fragmentos de peptídeos derivados de EPOA presente invenção refere-se a novos peptídeos protetores detecido que em uma forma de realização são compreendidos de fragmentos deseqüências de aminoácidos em EPO, derivadas da estrutura tridimensional daproteína de EPO, e, em particular, foram derivados das regiões voltadasafastadas de EPO dos sítios de ligação de ligando e/ou a porção interna dohomodímero de EPO. Estes fragmentos são derivados das seguintes estruturasde EPO: (1) laço AB e porção N-terminal da hélice B(MTWDTKVNFYAWKRMEVG,.SEQ ID NO: 29, correspondendo aaminoácidos 38-57 de SEQ ID NO: 1); (2) porção C-terminal da hélice B(QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, SEQ ID NO: 30, correspondendoa aminoácidos 58-82 de SEQ ID NO: 1), e (3) uma porção do laço A-Bconsistindo de uma] pequeno laço de cisteína e uma folha dobrada β(GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO: 31, correspondendo aaminoácidos 28-47 de SEQ ID NO: 1). Estes fragmentos de peptídeo tambémsão demonstrados no exemplo 2 (ver figura 1 e tabela 1) para demonstrarpropriedades de proteção de tecido.
Inesperadamente, alguns peptídeos derivados de outras regiõesda molécula de EPO que são colocados e outros peptídeos que incluemporções dos sítios de ligação em (EPOR)2 também são protetores de tecido.
Por exemplo, um peptídeo consistindo da porção N-terminal da hélice A(APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE, SEQ ID NO: 32, correspondendo aaminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 1) que contém uma porção do sítio 2 deligação de EPOR (sublinhado) é protetor de tecido (ver exemplo 2 e tabela 1).
No entanto, a presença de aminoácidos no sítio 2 não leva em conta aatividade protetora de tecido, como um peptídeo consistindo de aminoácidos14-19 de SEQ ID NO: 1 (RYLLEAKEAENITTGC, SEQ ID NO: 33) efaltando os aminoácidos 11-13 de SEQ ID NO: 1 (isto é, VLE; osaminoácidos do sítio 2, que são requeridos para ligação de EPO ao dímero deEPOR (EPOR)2, também são protetores de tecido (ver exemplo 2 e tabela 1,também Elliott et al., 1997, Blood 89: 493, incorporado aqui por referênciaem sua totalidade). Os requerentes mostraram anteriormente que mutaçõesnos sítios de ligação de eritropoiese que abolem eritropoiese não modificamas propriedades protetoras de tecido de EPO (Leist et al., Science (2004) 305:239, incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Os versados na arte irão reconhecer que os fragmentos decomprimentos variados podem formar um peptídeo protetor de tecido, emborao fragmento tenha preferivelmente menos do que 30 aminoácidos emcomprimento. Além disso, a seleção judiciosa de outras moléculas parainclusão, por exemplo, D-aminoácidos ou polietileno glicol, também iráconstituir peptídeos protetores de tecido, mas com meias-vidas biológicasmelhoradas.
A. Motivos estruturais
Especificamente, os seguintes motivos estruturais foramidentificados os quais iniciam o complexo de receptor do protetor de tecido.
(a) Uma configuração de carga negativa ("Motivo Estrutural A")Neste motivo estrutural, o peptídeo possui dois aminoácidosnegativamente carregados, que podem ser separados por até 5 aminoácidos,flanqueados por aminoácidos hidrofóbicos. Estruturalmente isto pode serrepresentado como:
(al) HNNH;(a2) HNXNH;(a3) HNXXNH;(a4) HNXXXNH;(a5) HNXXXXN H; ou(a6) HNXXXXXNH,
onde H representa aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, os aminoácidosmoderadamente hidrofóbicos: glicina, prolina, cisteína, tirosina e triptofano, epreferivelmente os aminoácidos altamente hidrofóbicos: alanina, valina,isoleucina, metionina, leucina, fenilalanina), N representa um aminoácidosnegativamente carregado como glutamato ou aspartato, e X representaqualquer aminoácidos, embora preferivelmente um hidrofílico. Em certasformas de realização, os aminoácidos hidrofóbicos de flanco são os mesmos.Em outra forma de realização, os aminoácidos de flanco são diferentes.
Uma variação deste motivo estrutural envolve um peptídeoonde um dos aminoácidos hidrofóbicos de flanco foi substituído com umaminoácido polar como serina, treonina, asparagina ou glutamina.
Como uma alternativa para ligações de peptídeosestabelecendo a proximidade mútua de duas cargas negativas em umaseqüência linear, a proximidade de carga necessária também pode serrealizada por uma estrutura tridimensional como discutido acima (Seção 5.1).Por exemplo, os aminoácidos negativamente carregados podem estarespacialmente imediatamente adjacentes sobre a superfície externa de umahélice, mas serão separados por aminoácidos adicionais na seqüência depeptídeos linear. Por exemplo, na hélice A de EPO (correspondendo aaminoácidos 10-28 de SEQ ID NO: 1), El8 e E21 estão adjacentes sobre aestrutura tridimensional, mas têm dois aminoácidos intervenientes entre osmesmos na seqüência de peptídeos linear. Como um outro exemplo, na héliceB (peptídeo D, SEQ ID NO: 30; correspondendo a aminoácidos 58-82 deSEQ ID NO: 1) E62 e E72 são separados por dois aminoácidos (Q65 e L69)na superfície da hélice, mas têm 9 aminoácidos entre os mesmos no peptídeolinear. Os peptídeos construídos da hélice A ou hélice B são protetores detecido (ver exemplo 2 e tabela 1, infra). Em contraste, o peptídeo B(NITTGCAEHCSLNE, SEQ ID NO: 34), um peptídeo com cargas negativasduplas (sublinhadas) na distância apropriada, mas faltando um aminoácidoshidrofóbico de flanco, não é protetor de tecido (ver exemplo 2 e tabela 1,infra).
(b) Configuração de aminoácidos negativos/ positivos ("Motivo Estrutural34
Β").
Neste motivo estrutural, o peptídeo tem um aminoácidopositivo próximo a um aminoácido negativo e ambos os aminoácidoscarregados são flanqueados por aminoácidos hidrofóbicos únicos.
Estruturalmente isto pode ser representado como:
(bl) HNPH; ou(b2) HPNH,
onde P representa aminoácidos positivamente carregados como arginina,
lisina ou histidina, e N representa os aminoácidos negativamente carregadosglutamato ou aspartato. Como com o primeiro motivo, a proximidade mútuadas duas cargas opostas pode ser realizada pela estrutura tridimensional. Porexemplo, um aminoácido positiva e negativamente carregado pode estarespacialmente adjacente sobre a superfície de uma hélice, mas será separadopor um ou mais aminoácidos na seqüência de peptídeos linear. Por exemplo,na hélice B (correspondendo a aminoácidos 58-82 de SEQ ID NO: 1) E72 eR76 estão imediatamente adjacentes um ao outro sobre a superfície externa dahélice e um peptídeo construído desta hélice é protetor de tecido (ver exemplo2 e tabela 1).
Em uma variação deste motivo particular, os aminoácidosnegativo e positivo podem ser separados por um aminoácido polar, porexemplo,
(b3) HNLPH;(b4) HPLNH,
em que L representa aminoácidos polares como serina, treonina, asparaginaou glutamina. Um exemplo deste motivo é peptídeo E(GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO: 34), que é protetor de tecido(ver exemplo 2 e tabela 1).
Dado que o núcleo do motivo estrutural acima são quatroaminoácidos de comprimento, um peptídeo deste motivo estrutural no núcleopode iniciar o receptor do protetor de tecido. Em certas formas de realização,os polipeptídeos da invenção compreendem 1 motivo estrutural. Em formasde realização alternativas, os polipeptídeos da invenção compreendem maisdo que 1, mais do que 2, mais do que 3 ou mais do que 4 dos motivosestruturais. Em certas formas de realização, em que o polipeptídeocompreende pelo menos dois motivos estruturais, os motivos são os mesmos.Em formas de realização alternativas, em que o polipeptídeo compreende pelomenos dois motivos estruturais, os motivos são diferentes. Preferivelmente, osmúltiplos peptídeos da presente invenção que um versado na arte pode gerarsão menos do que 30 aminoácidos em comprimento.
Os versados na arte irão reconhecer que são os motivosestruturais acima indicados, como oposto à seqüência de aminoácidos emEPO atual, que são importantes para a presente invenção. Assim, um versadona arte pode reconhecer que o peptídeo isolado pode ter menos do que 90%,menos do 85%, menos do que 80%, menos do que 75%, menos do que 70%,menos do que 65%, menos do que 60%, menos do que 55%, menos do que50%, menos do que 45%, menos do que 40%, menos do que 35%, menos doque 30% ou menos do que 20 por cento da seqüência de identidade comqualquer porção da seqüência de aminoácidos de eritropoietina madurahumana ("EPO") descrita em SEQ ID NO: 1, em que referida porção de EPOcontém o mesmo número de resíduos de aminoácidos como o referidopeptídeo.
Além disso, a patente US 5.700.909 para 0'Brien et al.,incorporada aqui por referência em sua totalidade, descreve uma seqüência depeptídeos em EPO de 17 aminoácidos (SEQ ID NO: 11 de 0'Brien) queinduz atividade biológica em células NS20Y, SK-N-MC, e PC12 incluindogerminação, diferenciação, neuroproteção e prevenção de morte de célulasneuronais. SEQ ID NO: 11 de 0'Brien (designado epopeptídeo AB), apesarde profeticamente descrita ter atividade eritropoiética, de fato é desprovidadesta atividade eritropoiética e verificou-se subseqüentemente desprovida deatividade in vivo. Quando o epopeptídeo AB foi injetado no músculo docamundongo, a freqüência de germinação na placa da extremidade motora nosmúsculos adjacentes aumentou de um modo similar ao induzido pelo fatorneurotrófíco ciliar. Estes dados são interpretados dentro do conceito de quecélulas neuronais (mas não hematológicas) respondem a uma seqüência depeptídeo em EPO e que EPO pode ter domínios separados para atividadeneurotrófica e hematotrófica (Campana et al., Int. J. Mol. Med. (1998) 1(1):235-241; J.S. 0'Brien na patente US 5.700.909, expedida em 23 de dezembrode 1997; J.S. 0'Brien na patente US 5.571.787, expedida em 5 de novembrode 1996; J.S. O'Brien na patente US 5.714.459, expedida em 3 de fevereiro de1998; e J.S. 0'Brien e Y. Kashimoto na patente US 5.696.080, expedida em 9de dezembro de 1997). No entanto, 0'Brien não apreciou os presentesmotivos estruturais com base na proximidade de aminoácidos carregados naestrutura terciária do peptídeo.
C. Fragmento de citocina tipo 1.
Dada a configuração de carga espacialmente compacta capazde ativar o receptor do protetor de tecido, os requerentes descobriram queespera-se que certos fragmentos de citocinas tipo 1 reajam de modo cruzadocom o receptor do protetor de tecido. Esta família de citocinas inclui, mas nãoestá limitada a, interleucina (IL)-I, IL-3, EL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10,IL-11. Fator de estímulo de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF),leptina, fator de estímulo de colônia de granulócitos (G-CSF), fator deinibição de leucemia (LIF), fator neurotrófíco ciliar (CNTF), trombopoietina(TPO), hormônio de crescimento, fator de estímulo de colônia de macrófagos(M-CSF), eritropoietina (EPO) e prolactina.
A consideração da estrutura secundária de EPO provêorientação para a preparação de um peptídeo protetor de tecido candidato viao arranjo espacial de aminoácidos derivados de aminoácidos homólogoslocalizados em estruturas secundárias homólogas em outros ligandosreceptores de citocina tipo 1: por exemplo, GM-CSF e IL-3 (Kannan, 2000,Neuroimmunomod. 8: 132-141, incorporado aqui por referência em suatotalidade), dentre outros, mostram possuir atividades neurotróficas eneuroprotetoras potentes, devido em grande parte, acreditam os requerentes,por estimularem um receptor do protetor de tecido. Por exemplo,considerando a hélice B destas citocinas tipo 1: Aminoácidos homólogos emtrombopoietina (TPO; Protein Data Bank (PDB) acesso IV7M) compreendemD62, G65, T68, L69, E72, A76 e Q80, em que estes aminoácidos estãoespacialmente adjacentes uns aos outros em um arranjo linear; aminoácidoshomólogos em fator inibitório de leucemia (LIF; PDB acesso IEMR)compreendem E61, R64, Y68, S72, N75 e D79; aminoácidos homólogos emfator neurotrófico ciliar (CNTF; PDB acesso ICNT) compreendem E71, E75.Todos estes são exemplos do Motivo A descrito acima (seção 5.1.1), em queos aminoácidos sublinhados são negativamente carregados.
Exemplos de peptídeos derivados de citocinas tipo 1 queexemplificam o Motivo B estrutural descrito acima (seção 5.1.1) incluem,mas não estão limitados a, fragmento de hélice A em GM-CSF,WEHVNAIQEARRLL (SEQ ID NO: 35); fragmento de hélice A em TPO,LSKLLRDSHVLH (SEQ ID NO: 36); fragmento de hélice B em TPO: E56,K59; fragmento de hélice A em CNTF, KIRSDLTALTESYVKH (SEQ IDNO: 37); fragmento de hélice B em CNTF: R89, E92. Fragmento de hélice Bem LIF, GTEKAKLVELYRIWYL (SEQ ID NO: 38); e fragmento de héliceA em interleucina 3 (IL-3), SIMIDEIIHHLKRPPNPL (SEQ ID NO: 39).
Os aminoácidos acima mencionados são meramenteexemplares de alguns membros da superfamília de citocina que sinalizamatravés de receptores de citocina tipo 1, e regiões homólogas em outrosmembros da superfamília de citocina serão prontamente identificadas pelosversados na arte.5.1.2 Quimeras
Seqüências de aminoácidos lineares de peptídeos protetores detecido "quiméricos" que incorporam elementos estruturais não lineares dosaminoácidos voltados para o exterior de molécula de EPO demonstram osmotivos estruturais indicados acima - também são contempladas pelapresente invenção. Os peptídeos protetores de tecido quiméricos da presenteinvenção podem consistir de elementos estruturais combinados de seqüênciasde aminoácidos separadas em um peptídeo único. Em outras palavras, umpeptídeo protetor de tecido quimérico pode ser compreendido de seqüênciasde aminoácidos derivadas de elementos estruturais não lineares masadjacentes como um fragmento derivado de seqüências de aminoácidos 1 ΙΟ-Ι 15, 133-136 e 160-165, de SEQ ID NO: 1, que pode dar os elementosestruturais da porção C-terminal da hélice C e porção N-terminal do laço C-D,a folha dobrada β no laço C-D, e a porção C-terminal de EPO estar contidaem um peptídeo único. Além disso, os peptídeos protetores de tecidoquiméricos podem ser usados para selecionar os aspectos importantes de umaestrutura particular, Por exemplo, os aminoácidos voltados para o exterior deuma estrutura terciária particular. Assim, um peptídeo protetor de tecidoquimérico pode consistir de um fragmento compreendido de aminoácidos dehélice B 58, 62, 65, 69, 72, 76, 79, 80, 83, 84 e 85 (por exemplo, peptídeo G,QEQLERALNSS, SEQ ID NO: 40) ou, em outras palavras, todos osaminoácidos presentes no exterior da hélice B de EPO. Este peptídeo émostrado ser protetor de tecido no exemplo 2, infra (ver tabela 1).
Além disso, a potência dos presentes peptídeos protetores detecido pode ser aumentada fixando uma hélice de peptídeo anfipática. Hélicesde peptídeo anfipáticas são bem conhecidas na arte, por exemplo, depeptídeos que sinalizam através de receptores copulados a proteína G classe B(por exemplo, Segrest et al, 1990, Proteins 8: 103, incorporado aqui porreferência em sua totalidade), servindo para localizar o ligando de peptídeo namembrana celular. Exemplos destas hélices incluem, mas não estão limitadosa regiões altamente hidrofóbicas de: calcitonina (ALSILVLLQAGS, SEQ IDNO: 48); hormônio liberando corticotropina (VALLPCPPCRA, SEQ ID NO:49); beta endorfma (NAIIKNAYKKG, SEQ ID NO: 50); glucagona(GSWQRSLQDTE, SEQ ID NO: 51); secretina (GGSAARPAPP, SEQ IDNO: 52); polipeptídeo vasointestinal (NALAENDTPYY5 SEQ ID NO: 53);neuropeptídeo Y (GALAEAYPSKP, SEQ ID NO: 54); hormônio de liberaçãode gonadotropina (GCSSQHWSYGL5 SEQ ID NO: 55); hormônio daparatireóide (VMIVMLAICFL, SEQ ID NO: 56); polipeptídeo pancreático(LRRYINMLTRP, SEQ ID NO: 28); e peptídeo relacionado ao gene decalcitonina (LALSILVLYQA, SEQ ID NO: 57) (descritos em Grace et al.,2004, PNAS 101: 12836, incorporado aqui por referência em sua totalidade).Por exemplo, um peptídeo quimérico feito de um peptídeo com o motivo decarga de superfície da hélice B de EPO (QEQLERALNSS, SEQ ID NO: 40)unido ao término carbóxi na hélice anfipática do polipeptídeo pancreático(LRRYINMLTRP, SEQ ID NO: 28) para um peptídeo quimérico. Outrasmodificações podem ser feitas no término carbóxi da hélice anfipática semafetar suas propriedades protetoras de tecido. Assim, um outro exemplo,substituição da prolina terminal do peptídeo quimérico acima com a seqüênciaTR (QEQLERALNSSLRRYINMLTRTR, SEQ ID NO: 41) gera umamolécula com atividade protetora de tecido potente como demonstrado noteste de nervo ciático (ver figura 1).
Além disso, em vez das hélices indicadas acima, outrasestruturas terciárias podem ser fixadas aos peptídeos protetores de tecido. Porexemplo, os aminoácidos presentes no exterior da hélice B podem ser ligadosà folha dobrada beta (CSLNENI, SEQ ID NO: 42) encontrada no laço AB deEPO para formar um peptídeo quimérico tendo a seqüênciaCSLNENIQEQLERALNSS (SEQ ID NO: 43), que é protetor de tecido (verexemplo 2 e tabela 1). Além disso, os aminoácidos presentes da porçãoterminal da hélice C (ALGKA, SEQ ID NO: 44, correspondendo aaminoácidos 111, 112, 113, 116 e 118 de SEQ ID NO: 1) podem sercombinados com todo ou parte do laço CD parcial(LGAQKEAISPPDAASAAPLRTI, SEQ ID NO: 45, compreendendo osaminoácidos 112-133 de SEQ ID NO: 1). Preferivelmente, um braço deligação estará presente entre os peptídeos fundidos para prover flexibilidadede modo que os peptídeos unidos podem assumir a orientação estruturalapropriada para ligar com o complexo de receptor do protetor de tecido. Ospeptídeos de fusão podem ter um efeito sinergístico, obtendo um efeitoprotetor de tecido maior juntamente como oposto a individualmentepossivelmente através de ligação melhorada com o complexo de receptor doprotetor de tecido ou meia vida biológica aumentada.
Os versados na arte irão reconhecer o benefício de combinarvários elementos estruturais desejados em um peptídeo único para maximizaros efeitos protetores de tecido destes compostos. Estas quimeras podemcompreender peptídeos de aminoácidos, e elementos não aminoácidos, comoligadores ou átomos de ligação ou porções.
5.1.3 Peptídeos de fusão
A presente invenção ainda contempla que dois ou mais dospeptídeos protetores de tecido indicados acima, fragmento derivado ouquimera, podem estar ligados a uma proteína relacionada ou não relacionadacomo eritropoietina, albumina, etc.
5.1.4 Fabricação dos peptídeos protetores de tecido
Os peptídeos protetores de tecido da presente invenção podemser produzidos usando técnicas recombinantes ou sintéticas bem conhecidasna arte. Em particular, a síntese de proteína em fase sólida é bem apropriadapara o comprimento relativamente curto dos peptídeos protetores de tecido epodem prover rendimentos maiores com resultados mais consistentes. Alémdisso, a síntese de proteína em fase sólida pode prover flexibilidade adicionalcom respeito à fabricação dos peptídeos protetores de tecido. Por exemplo, asmodificações químicas desejadas podem ser incorporadas no peptídeoprotetor de tecido no estágio de síntese: homocitrulina pode ser usada nasíntese de peptídeo como oposto a lisina, obviando assim a necessidade decarbamilar o peptídeo após síntese.
Síntese
Na síntese em fase sólida de um peptídeo, um aminoácido comambos o grupo α-amino e proteção de cadeia lateral é imobilizado em umaresina. Ver, por exemplo, Nilsson, B., Soellner, M., e Raines, R. ChemicalSynthesis of Proteins, Annu. Rev. Biomol. Struct. 2005, 34: 91-118; MeldalM. 1997. Property of solid supports. Methods Enzymol. 289: 83-104 eSongster MF, Barany G. 1997. Handles for solid-phase peptide synthesis.Methods Enzymol. 289: 126-74. Tipicamente, dois tipos de grupos deproteção α amino são usados: um grupo terc-butoxicarbonila (Boc) sensível aácido ou um grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc) sensível a base.Wellings DA, Atherton E. 1997. Standard Fmoc protocols. Methods Enzymol.289: 44-67. Após a remoção rápida e completa destes grupos de proteção ex-amino um outro aminoácido protegido com um grupo carboxila ativado podeentão ser copulado à amina ligada a resina não protegida. Usando um excessode aminoácido solúvel ativado, as reações de copulação são forçadas aterminarem. O ciclo de desproteção e copulação é repetido até concluir aseqüência. Com desproteção e clivagem da cadeia lateral, a resina dá opeptídeo desejado. Guy CA, Fields GB, 1997. Trifluoroacetic acid cleavageand deprotection of resin-bound peptides following synthesis by Fmocchemistry. Methods Enzymol 289: 67-83, e Stewart JM. 1997. Cleavagemethods flollowing Boc-bases solid-phase peptide synthesis. MethodsEnzymol. 289: 29-44. Outros métodos para realizar síntese de proteína emfase sólida são descritos em Bang, D. & Kent, S. 2004. A One-Pot TotalSynthesis of Crambin. Angew. Chem. Int. Ed. 43: 2534-2538; Bang, D.,Chopra, N., & Kent, S. 2004. Total Chemical Synthesis of Crambin. J. Am.Chem. Soe. 126: 1377-1383; Dawson, P. et al. 1994. Synthesis of Proteins byNative Chemical Ligation. Science. 266: 776-779; Kochendoerfer et al. 2003.Design and Chemical Synthesis of a Homogenous Polymer-ModifiedErythropoiesis Protein. Science. 299: 884-887. (Cada referência descrita nesteparágrafo é incorporada aqui por referência em sua totalidade).
Se necessário, peptídeos menores derivados da síntese depeptídeos de fase sólida podem ser combinados através de ligações depeptídeos como ligação química nativa. Neste processo, o tiolato de umresíduo de cisteína N-terminal de um peptídeo ataca o tioéster C-terminal deum segundo peptídeo para efetuar transtioesterificação. Uma ligação amida seforma após rápida transferência de S—>N acila. Ver Dawson, P. Et al. 1994.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science. 266: 776-779,incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Além disso, um dos versados na arte pode reconhecer que ospeptídeos protetores de tecido da presente invenção podem englobarpeptidomiméticos, peptídeos incluindo ambos os aminoácidos ocorrendonaturalmente e não ocorrendo naturalmente, como peptóides. Os peptóidessão oligômeros de glicinas N-substituídas, ácido glicólico, tiopronina,sarcosina e tiorfano. Estas estruturas tendem a ter uma estrutura geral de (-(C=0)-CH2-NR-)n com o grupo R agindo como a cadeia lateral. Estespeptóides podem ser sintetizados usando síntese de fase sólida de acordo comos protocolos de Simon et al., Peptoids: A molecular approach to drugDiscovery, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 9367-9371 (1992) e Li et al.,Photolithographic Synthesis of Peptoids, J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126,4088-4089, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em suatotalidade. Além disso, a presente invenção contempla o uso depeptidomiméticos ou miméticos de peptídeos, fármacos não peptídeos compropriedades análogas às do peptídeo gabarito. (Fauchere, J. (1986) Adv.Drug. Res. 15-29; Veber e Friedinger (1985) TINS ρ. 32; e Evans et al. (1987)J. Med. Chem. 30: 1229, que são incorporados por referência. A síntese devários tipos de peptidomiméticos foi estudada por exemplo em: Methods ofOrganic Chemistry (Houben-Weyl), Synthesis of Peptides and Peptidomimetics - Workbench Edition volume E22c (Editor-em-ChefeGoodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York,incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Técnicas Recombinantes
Uma variedade de sistemas de hospedeiros-vetores de expressão pode ser utilizada para produzir os peptídeos protetores de tecidoda invenção. Estes sistemas hospedeiros-expressão representam veículospelos quais o peptídeo protetor de tecido de interesse pode ser produzido esubseqüentemente purificado, mas também representam células que podem,quando transformadas ou transfectadas com as seqüências de codificação denucleotídeos apropriadas, demonstrar o produto do gene de eritropoietinamodificado in situ. Estes incluem mas não estão limitadas a bactérias, inseto,planta, mamífero, incluindo sistemas de hospedeiros humanos, como, mas nãolimitados a, sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressãode vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo seqüências de codificação de peptídeo protetor de tecido; sistemas de células de plantainfectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo,vírus do mosaico de couve-flor, CaMV; vírus do mosaico de tabaco, TNV) outransformados com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes (porexemplo, plasmídeo Ti) contendo seqüências de codificação de molécula relacionada a eritropoietina; ou sistemas de células de mamífero, incluindosistemas de células humanas, por exemplo, HTl080, COS, CHO, BHK, 292,3T3. abrigando construções de expressão recombinantes contendo promotoresderivados de genoma de células de mamífero, por exemplo, promotor demetalotioneína, ou de vírus de mamífero, por exemplo, o promotor tardio deadenovírus; o promotor 7.5K do vírus vacínia.
Além disso, a cepa de célula hospedeira pode ser escolhida, aqual modula a expressão de seqüências inseridas ou modifica e processa oproduto do gene no aspecto específico desejado. Estas modificações eprocessamento de produtos de proteína podem ser importantes para a funçãoda proteína. Como os versados na arte sabem, células hospedeiras diferentestêm mecanismos específicos para o processamento pós-translacional emodificação de proteínas e produtos do gene. Linhagens de células ousistemas de hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar amodificação e processamento corretos da proteína estrangeira expressada.
Para este fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquináriocelular para processamento apropriado do transcrito, glicosilação efosforilação primárias do produto do gene podem ser usadas. Estas célulashospedeiras de mamífero, incluindo células hospedeiras humanas, incluemmas não estão limitadas a HTl 080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK,293, 3T3 e WI38.
Para produção de peptídeos recombinantes com altorendimento a longo prazo, expressão estável é preferida. Por exemplo, aslinhagens de células que expressam estavelmente o produto do gene damolécula relacionada a citocina protetora de tecido recombinante pode serengenheirado. Em vez de usar os vetores de expressão que contêm origensvirais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas comDNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados, porexemplo, promotor, melhorador, seqüências, terminadores de transcrição,sítios de poliadenilação, e outros, e um marcador selecionável. Após aintrodução do DNA estrangeiro, as células engenheiradas podem ser deixadascultivar durante 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são comutadas emum meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinanteconfere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente oplasmídeo em seus cromossomos e cresçam para formar focos que por sua vezpodem ser clonados e expandidos em linhagens de células. Este método podevantajosamente ser usado para engenheirar linhagens de células queexpressam o produto protetor de tecido. As linhagens de célulasengenheiradas podem ser particularmente utilizáveis na triagem e avaliaçãode compostos que afetam a atividade endógena do produto do gene damolécula relacionada a EPO.
Outras Modificações
Outras modificações podem ser feitas nos peptídeos protetoresde tecido. Por exemplo, o peptídeo pode ser sintetizado com um ou mais (D)-aminoácidos. A escolha de incluir um (L)- ou (D)-aminoácido em umpeptídeo da presente invenção depende, em parte, das característicasdesejadas do peptídeo. Por exemplo, a incorporação de um ou mais (D)-aminoácidos pode conferir estabilidade aumentada no peptídeo in vitro ou invivo. A incorporação de um ou mais (D)-aminoácidos também pode aumentarou diminuir a atividade de ligação do peptídeo como determinado, porexemplo, usando os biotestes descritos aqui, ou outros métodos bemconhecidos na arte.
A substituição de toda ou parte de uma seqüência de (L)-aminoácidos pela respectiva seqüência de (D)-aminoácidos enantioméricos dáuma estrutura oticamente isomérica na parte respectiva da cadeia depolipeptídeo. A inversão da seqüência de toda ou parte de uma seqüência de(L)-aminoácidos dá os retro-análogos do peptídeo. A combinação dasubstituição (L em D, ou D em L) enantiomérica e inversão da seqüência dáanálogos retro-inversos do peptídeo. Como os versados na arte sabem, ospeptídeos enantioméricos, seus retro-análogos e seus análogos retro-inversosmantêm relação topológica significativa no peptídeo parental, e especialmentealto grau de semelhança é muitas vezes obtido para o parental e seus análogosretro-inversos. Esta relação e semelhança podem ser refletidas empropriedades bioquímicas dos peptídeos, especialmente alto grau de ligaçãodos peptídeos respectivos e análogos a uma proteína receptora. A síntese daspropriedades de análogos retro-inversos de peptídeos foi discutida porexemplo em Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyk), Synthesis ofPeptides and Peptidomimetics - Workbench Edition volume E22c (Editor-em-Chefe Goodman M.) 2004 (George Thieme Verlag Stuttgart, New York),e em referências citadas aqui, todas quais são incorporadas aqui por referênciaem sua totalidade
"Modificação" de aminoácidos refere-se à alteração de umaminoácido ocorrendo naturalmente para produzir um aminoácido nãoocorrendo naturalmente. Os derivados dos peptídeos da presente invençãocom aminoácidos não ocorrendo naturalmente podem ser criados por síntesequímica ou por incorporação específica do sítio de aminoácidos não naturaisem polipeptídeos durante biossíntese, como descrito em Christopher J. Noren,Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. GrifEth, Peter G. Schultz, 1989Science, 244: 182-188, incorporados aqui por referência em sua totalidade.
Miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares apeptídeos terapeuticamente utilizáveis podem ser usados para produzir umefeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, ospeptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma(isto é, um polipeptídeo que tem uma propriedade bioquímica ou atividadefarmacológica), mas tem uma ou mais ligações de peptídeo opcionalmentesubstituídas por uma ligação selecionada do grupo consistindo de: --CH2-NH-, -CH2S--, -CH2-CH2-; -CH=CH-(cis e trans), -COCH2--, -CH(OH)CH2--,e -CH2SO-, por métodos conhecidos na arte e ainda descritos nas seguintesreferências: Spatola, A.F. em "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides, and Proteins," B. Weinstein, eds., Mareei Dekker, New York, p. 267(1983); Spatola, A.F., Vega Data (março de 1983), vol. I. Publicação 3,"Peptide Backbone Modifications" (estudo geral); Morely, J.S., TrendsPharma Sci (1980) pp. 463-468 (estudo geral); Hudson, D. Et al., (1979) Int JPept Prot Re 14: 177-185 (--CH2-NH-, -CH2-CH2--); Spatola, A.F. et al.(1986) Life Sci 38: 1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M., (1982) J Chem SoePerkin Trans I 307-314 (-CH=CH-, eis e trans); Almquist, R. G. et al. (1980)J Med Chem 23: 1392 (-COCH2-); Jennings-White, C et al., (1982)Tetrahedron Lett 23: 2533 (-COCH2--); Szelke, M et al., European Appln. EP45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay, M.W. etal., (1983) Tetrahedron Lett 24: 4401-4404 (-C(OH)CH2-); e Hruby, V.J.,(1982) Life Sei 31: 189-199 (--CH2-S-); cada um dos quais é incorporadoaqui por referência.
Em uma outra forma de realização, uma ligação não peptídeoparticularmente preferida é -CH2NH-. Os peptídeos miméticos podem tervantagens significativas sobre as formas de realização dos polipeptídeos,incluindo, por exemplo: produção mais econômica, maior estabilidadequímica, propriedades farmacológicas melhoradas (meia-vida, absorção,potência, eficácia, etc.), especificidade alterada (por exemplo, um amploespectro de atividades biológicas), antigenicidade reduzida, e outros.
Uma variedade de projetos de peptídeos miméticos é possível.Por exemplo, peptídeos cíclicos, em que a conformação necessária éestabilizada por não peptídeos, são especificamente contemplados, patente US5.192.746 para Lobl, et al., patente US 5.576.423 para Aversa et al., patenteUS 5.051.448 para Shashoua, e patente US 5.559.103 para Gaeta et al., todasincorporadas aqui por referência, descrevem muitos métodos para criar estescompostos. A síntese de compostos não peptídeos que imitam seqüências depeptídeos também é conhecida na arte. Eldred et al., J. Med. Chem. 37: 3882(1994), incorporado aqui por referência em sua totalidade, descrevemantagonistas não peptídeos que imitam a seqüência de peptídeos. Do mesmomodo, Ku et al., J. Med. Chem. 38: 9 (1995) (incorporado aqui por referênciaem sua totalidade) ainda elucidam a síntese de uma série destes compostos.Outras modificações após a síntese podem ser implementadas.Por exemplo, os peptídeos protetores de tecido podem ser ainda modificadosquimicamente, isto é, carbamilados, acetilados, succinilados, etc., de acordocom o pedido de patente US 10/188.905, que foi publicada como20030072737-A1 em 17 de abril de 2003 e descreve EPO quimicamentemodificado, e de acordo com o pedido de patente US 10/612.665, depositadoem 1 de julho de 2003, e pedido de patente US 09/753.132, depositado em 29de dezembro de 2000, que são incorporados aqui por referência em suatotalidade.
Além disso, os peptídeos protetores de tecido podem consistirde peptídeos protetores de tecido recombinantes - muteínas. As mutaçõesdescritas podem incluir substituições, deleções, incluindo deleções internas,adições, adições dando proteínas de fusão, ou substituições conservativas deresíduos de aminoácidos em e/ou adjacente à seqüência de aminoácidos, masque resultam em uma troca "silenciosa", e trocas de aminoácidos nãoconservativas e inserções e deleções maiores, como previamente descrito emPCT/US03/20964 intitulado Recombinant Tissue Protective Cytokines andEncoding Nucleic Acids Thereof for Protection, Restoration, andEnhancement of Responsive Cells, Tissues, and Organs (incorporado aqui porreferência em sua totalidade).
Substituições de aminoácidos tanto conservativas como nãoconservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos.Ambas as substituições conservativas e não conservativas podem ser feitas.Substituições conservativas são as que se realizam em uma família deaminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Aminoácidosgeneticamente codificados podem ser divididos em quatro famílias: (1) ácidos= aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) não polares(hidrofóbicos) = cisteína, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano, glicina, tirosina; e (4) polares nãocarregados = asparagina, glutamina, serina, treonina. Os não polares podemser divididos em: fortemente hidrofóbicos = alanina, valina, leucina,isoleucina, metionina, fenilalanina e moderadamente hidrofóbicos = glicina,prolina, cisteína, tirosina, triptofano. Em um modo alternativo o repertório deaminoácidos pode ser agrupado como (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2)básicos = lisina, arginina, histidina, (3) alifáticos = glicina, alanina, valina,leucina, isoleucina, serina, treonina, com serina e treonina opcionalmente seragrupados separadamente como hidroxila alifática; (4) aromáticos =fenilalanina, tirosina, triptofano; (5) amida = asparagina, glutamina; e (6)contendo enxofre = cisteína e metionina. (Ver, por exemplo, Biochemistry, 4a.Ed., Ed. por L. Stryer, WH Freeman and Co., 1995, incorporado aqui porreferência em sua totalidade).
Além disso, mutações podem ser introduzidas aleatoriamentejunto a toda ou parte da seqüência de codificação de um peptídeo protetor detecido, como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podemser triados para atividade biológica para identificar mutantes que retêmatividade. Após mutagênese, o peptídeo codificado pode serrecombinantemente expressado e a atividade do peptídeo protetor de tecidorecombinante pode ser determinada.
Em uma outra forma de realização, o peptídeo protetor detecido pode ser ainda modificado através de adições de polímeros (comopolietileno glicol), açúcares, ou proteínas adicionais (como uma construção defusão) em um esforço para prolongar a meia-vida do peptídeo protetor detecido ou melhorar os efeitos do peptídeo protetor de tecido. Exemplos destasmodificações são descritos em W0/04022577 A3 e W0/05025606 Al, quesão incorporados aqui por referência.
5.2. TESTES PARA TESTAR PEPTÍDEOS PROTETORES DETECIDO
5.2.1 Triagens e testes BiológicosOs peptídeos protetores de tecido de acordo com a presenteinvenção podem ser testados para atividade protetora de tecido, por exemplo,proteger de células, tecidos ou órgãos. As atividades protetoras podem serainda testadas usando testes in vitro e in vivo. Testes in vitro que sãoindicativos de atividade protetora de tecido incluem, por exemplo, testes deproliferação de células, testes de diferenciação de células, ou de detectar apresença de proteínas ou ácidos nucleicos regulados de modo positivo pelocomplexo de receptor do protetor de tecido, atividade, por exemplo,neuroglobina, citoglobina ou frataxina. Neuroglobina, por exemplo, podeestar envolvida na facilitação de transporte ou armazenagem de oxigênio emcurto prazo. Assim, os testes de transporte ou armazenagem de oxigêniopodem ser usados como um teste para identificar ou triar compostos quemodulam a atividade protetora de tecido.
Neuroglobina é expressada em células e tecidos do sistemanervoso central em resposta a hipoxia ou isquemia e pode prover proteção dedano (Sun et al., 2001, PNAS 98: 15306-15311; Schmid et al., 2003, J. Biol.Chem. 276: 1932-1935, cada um dos quais é incorporado aqui por referênciaem sua totalidade). Citoglobina pode desempenhar um papel similar emproteção, mas é expressada em uma variedade de tecidos em níveis variados(Pesce et al., 2002, EMBO 3: 1146-1151, incorporado aqui por referência emsua totalidade). Em uma forma de realização da invenção, os níveis de umaproteína regulada de modo positivo em uma célula podem ser medidos antes eapós contatar o peptídeo protetor de tecido em uma célula. Em certas formasde realização, a presença de uma proteína regulada de modo positivoassociada com atividade protetora de tecido em uma célula pode ser usadapara confirmar as atividades protetoras de tecido de um peptídeo.
Nucleolina pode proteger células contra dano. Ela desempenhanumerosos papéis em células incluindo modulação de processos detranscrição, proteína de ligação de RNA específica da seqüência, citocinese,nucleogênese, transdução de sinal, apoptose induzida por células T,remodelagem de cromatina, ou replicação. Ela também pode funcionar comouma helicase de DNA/RNA de receptor de superfície de célula, ATPasedependente de DNA, transporte de proteína, componente de fator detranscrição, ou repressor transcripcional (Srivastava e Pollard, 1999, FASEBJ., 13: 1911-1922; e Ginisty et al., 1999, J. Cell Sci., 112: 761-772, cada umdos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Frataxina é uma proteína envolvida com o metabolismo deferro mitocondrial e mostrou anteriormente mostrada ser fortemente reguladade modo positivo por EPO tanto in vivo como in vitro (Sturm et al. (2005) EurJ Clin Invest 35: 711, incorporado aqui por referência em sua totalidade).
A expressão de uma proteína regulada de modo positivo podeser detectada detectando níveis de mRNA correspondendo à proteína em umacélula. O mRNA pode ser hibridizado em uma sonda que liga especificamenteum ácido nucleico codificando a proteína regulada de modo positivo. Ahibridização pode consistir de, por exemplo, Northern blot, Southern blot,hibridização de arranjo, cromatografia de afinidade, ou hibridização in situ.
A atividade protetora de tecido do polipeptídeo da invençãotambém pode ser detectada usando testes de neuroproteção in vitro. Porexemplo, culturas neuronais primárias de hipocampos de rato recém-nascidopor tripsinização, e cultivadas como por qualquer método conhecido na artee/ou descrito aqui, por exemplo, em meio de cultura MEM-II (Invitrogen), D-glicose 20 mM, L-glutamina 2 mM, 10% de soro Nu (bovino; BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ), 2% de suplemento B27 (Invitrogen),NaHCOs 26,2 mM, 100 U/ml de penicilina, e 1 mg/ml de estreptavidina (ver,por exemplo, Leist et al., 2004, Science 305: 239-242, incorporado aqui porreferência em sua totalidade). Um dia após semeadura, 1 μΜ decitosinoarabino-furanosídeo é adicionado. No dia 13 as culturas antigas sãoentão pré-incubadas com doses crescentes de EPO ou CEPO (3-3000 pM)durante 24 h. No dia 14, o meio é removido e as culturas desafiadas com 300μΜ de NMDA em PBS em temperatura ambiente. Após 5 min, o meio pré-condicionado é retornado às culturas que são então retornadas ao incubadordurante 24 h. As células são fixadas em paraformaldeído, coloridas porHoeschst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR) e os núcleos apoptóticoscondensados podem ser contabilizados. NGF (50 ng/ml) e MK801 (1 μΜ) sãoincluídos como controles positivos.
Os sistemas de modelo animal podem ser usados parademonstrar a atividade protetora de tecido de um composto ou parademonstrar a segurança ou eficácia dos compostos identificados pelosmétodos de triagem da invenção descritos acima. Os compostos identificadosnos testes podem então ser testados para atividade biológica usando modelosanimais para um tipo de dano a tecido, doença, condição, ou síndrome deinteresse. Estes incluem animais engenheirados para conter o complexo dereceptor do protetor de tecido copulado a um sistema de leitura funcional,como um camundongo transgênico.
Modelos animais que podem ser usados para testar a eficáciada atividade protetora de célula ou tecido de um composto identificadoincluem, por exemplo, proteção contra o início de encefalomielite alérgicaaguda (EAE; ver exemplo 12) em ratos Lewis, restauração ou proteção defunção cognitiva diminuída em camundongos após receberem traumacerebral, isquemia cerebral ("derrame", exemplo 5) ou insultos estimuladospor excitotoxinas (Brines et al., 2000, PNAS, 97: 10295-10672, que é aquiincorporado por referência em sua totalidade), proteção de isquemia retinalinduzida (Rosenbaum et al., 1997, Vis. Res. 37: 3443-51, incorporado aquipor referência em sua totalidade), proteção contra dano ao nervo ciático (verexemplo 2), e proteção contra dano de isquemia-reperfusão no coração(estudos de cardiomiócito in vitro e dano de isquemia-reperfusão in vivo, ver,por exemplo, Valcillo et al., 2003, PNAS 100: 4802-4806 e Fiordaliso et al.,2005, PNAS 102: 2046-2051, cada um dos quais é incorporado aqui porreferência em sua totalidade). Estes testes são descritos em mais detalhe emGrasso et al. (2004) Med Sci Monit 10: BRl-3 ou publicação PCT WO02/053580, cada dos quis é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Os métodos in vivo descritos aqui referem-se à administração de EPO, noentanto, as proteínas protetoras de tecido administradas em lugar de EPOforam também identificadas para demonstrar também atividade biológicasimilar, por exemplo, Leist et al. (2004) Science 305: 239-241, incorporadoaqui por referência em sua totalidade. Os peptídeos podem ser substituídospara teste também. Outros testes para determinar a atividade protetora detecido de um peptídeo são bem conhecidos dos versados na arte.5.2.2 Testes de Ligação de Células
Além disso, os testes de ligação de células podem ser paraavaliação dos polipeptídeos da invenção. Por exemplo, o peptídeo protetor detecido de interesse pode ser ligado a um marcador biológico como ummarcador fluorescente ou radiorrotulado para facilidade de detecção e testadopara ligação a células BaF3 transfectadas expressando EPOR e/ou o receptorβ0. Em uma placa de 96 cavidades, oito diluições em série 1:2 do peptídeoprotetor de tecido de interesse em meio de cultura (RPMI 1640, 10% de soro bovino fetal, piruvato de sódio 1 mM, L-glutamina 2 mM) são depositadas emplaca, de modo o volume final em cada cavidade é cerca de 100 μΐ. Alinhagem parental BaF3 e células BaF3 transfectadas com EPOR e/oureceptor β0 podem ser lavadas três vezes em meios de cultura (ver abaixo), aspelotas recolocadas em suspensão em meio de cultura, e as células contadas ediluídas em meios de cultura para 5.000 células/ 100 μΐ. 100 μΐ de célulasdiluídas são então adicionados a cada diluição de peptídeo. A placa de teste éentão incubada em um incubador a 37°C durante três a quatro dias. A placa/células são então lavadas e a placa é lida em uma leitora de placa fluorescenteou por outro método apropriado para detectar o nível de biomarcadorassociado com a atividade biológica do peptídeo protetor de tecido deinteresse.
Similarmente, um teste competitivo pode ser utilizado paradeterminar de um peptídeo protetor de tecido é protetor de tecido. No testecompetitivo, um composto s protetor de tecido, como bem conhecido,incluindo, mas não limitado a, citocinas protetoras de tecido como as descritasno pedidos de patente US n°s. 10/188.905 e 10/185.841 (cada um dos quais éincorporado aqui por referência em sua totalidade), pode ser fixado a umbiomarcador apropriado.
Em uma placa de 96 cavidades, oito diluições em série 1:2 deum composto protetor de tecido conhecido/ biomarcador em meio de culturaapropriado, e as mesmas séries de diluição do composto protetor de tecidoconhecido/ biomarcador e um excesso do peptídeo protetor de tecido deinteresse são depositadas. O volume final de cada diluição deve ser cerca de100 μl. Mais uma vez, as células BaF3 são semeadas nas placas como descritosupra e deixadas incubar. Após uma quantidade apropriada de tempo, ascélulas são lavadas e a placa é lida em uma leitora de placa fluorescente oupor qualquer outro método apropriado conhecido na arte para detectar obiomarcador. Se a leitura das placas e/ou cavidades contendo o compostoprotetor de tecido conhecido/ biomarcador e peptídeo protetor de tecido deinteresse é menor do que a leitura das placas contendo somente o compostoprotetor de tecido/ biomarcador, então o peptídeo protetor de tecido deinteresse é protetor de tecido.
5.2.3 Proliferação de citocinas e células/ Atividade de diferenciação
Muitos fatores de proteína descritos até agora, incluindo todasas citocinas conhecidas, demonstram atividade em um ou mais testes deproliferação de células dependentes de fator, e assim estes testes servem comouma confirmação conveniente de atividade de citocina. A atividade de umpeptídeo protetor de tecido pode ser evidenciada por qualquer um de umnúmero de testes de proliferação de células dependentes de fator de rotinapara linhagens de células incluindo, sem limitação, 32D, DA2, DA1G, TIO,B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DAI, 123, Tl 165, HT2,CTLL2, TF-1, Mo7e e CMK. Estes células são cultivadas na presença ouausência de um peptídeo protetor de tecido, e a proliferação de células édetectada, por exemplo, medindo a incorporação de timidina tritiada ou porteste colorimétrico com base na ruptura metabólica de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) Mosman, 1983, J. Immunol.Meth. 65: 55-63, incorporado aqui por referência em sua totalidade).5.2.4 Outros testes
Se um peptídeo protetor de tecido demonstra uma atividadeprotetora de tecido, um versado na arte pode reconhecer que pode serbenéfico verificar o resultado usando um dos testes neuroprotetores eprotetores de tecido conhecidos dos versados na arte, como, mas nãolimitados a, testes de células P-19 e PC-12. Além disso, vários modelos invivo como modelos de animal relacionados a dano à medula espinhal, derrameisquêmico, dano ao nervo periférico, coração, olhos, rins, etc., podem ser úteisainda caracterizando o peptídeo protetor de tecido, testes in vitro e in vivoapropriados são descritos nos pedidos de patente US n°s. 10/188.905 e10/185.841, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em suatotalidade.
5.3 USO TERAPÊUTICO
Um dos versados na arte pode reconhecer que os peptídeosprotetores de tecido da presente invenção são utilizáveis como terapêuticapara tratamento ou prevenção de várias doenças, distúrbios e condições. Umversado na arte também pode reconhecer que estes peptídeos podem serusados para obter modulação de um complexo de receptor do protetor detecido, por exemplo, complexo de citocina protetor de tecido. Ambas astécnicas in vitro e in vivo que podem ser usadas para avaliar as indicaçõesterapêuticas, por exemplo, dos compostos identificados pelos testes dainvenção descritos acima são descritas no pedido PCT PCT/USO1/49479,pedidos de patente nos 10/188.905 e 10/185.841, incorporados aqui porreferência.
Os peptídeos protetores de tecido da invenção mencionadosacima podem ser utilizáveis geralmente para a prevenção, tratamentoterapêutico, ou tratamento profilático de doenças e distúrbios humanos dosistema nervoso central ou sistema nervoso periférico que têm primeiramentesintomas neurológicos ou psiquiátricos, doenças oftálmicas, doençascardiovasculares, doenças cardiopulmonares, doenças respiratórias, doençasrenais, urinárias e reprodutivas, doenças dos ossos, doenças do tecidoconectivo, doenças gastrintestinais e anormalidades endócrinas e metabólicas.Exemplos de uso incluem, mas não estão limitados a proteção contra e reparode dano resultante de trauma e inflamação resultante no cérebro (derrameisquêmico, trauma de cegueira, hemorragia subaracnóide), medula espinhal(isquemia, trauma de força cega), nervos periféricos (dano ao nervo ciático,neuropatia diabética, síndrome do túnel do carpo), retinal (edema macular,retinopatia diabética, glaucoma), e coração (infarto do miocárdio, falhacardíaca crônica). Em particular, estas doenças, distúrbios e condiçõesincluem condições hipóxicas, que afetam adversamente os tecidosresponsivos, como os tecidos excitáveis no tecido do sistema nervoso central,tecido do sistema nervoso periférico, ou tecido cardíaco ou tecido retinal,como, por exemplo, cérebro, coração ou retina/olho. Assim, os peptídeosprotetores de tecido da invenção podem ser usados para tratar ou prevenirdano a tecido responsivo resultante de condições hipóxicas em uma variedadede condições e circunstâncias. Exemplos não limitativos destas condições ecircunstâncias são providos na tabela abaixo.
Os polipeptídeos protetores de tecido também são de interessena modulação da atividade de células-tronco. Foi estabelecido que citocinasdemonstrando atividade protetora de tecido, por exemplo, EPO, são capazesde mobilizar células-tronco, estimulando a migração em regiões de dano eajudando o processo de reparo, por exemplo, em um papel regenerativo. Porexemplo, no derrame experimental, EPO media a migração de neuroblastosem uma região de dano isquêmico para regenerar neurônios durante o períodode recuperação (Tsai et al., J. Neurosci (2006) 26: 1269-74, incorporado aquipor referência em sua totalidade). Como um outro exemplo, EPO e CEPOmobilizam células progenitoras endoteliais da medula óssea na circulação.Estas células então retornam para regiões distantes e são envolvidas naformação de novos vasos sangüíneos (para efeito de EPO, ver Bahlmann etal., 2003, Kidney Int. 64: 1648-1652, incorporado por referência aqui em suatotalidade). Apesar de não desejar ficar limitado a qualquer teoria particular,acredita-se que os polipeptídeos isolados descritos aqui têm um efeito similarsobre a migração de células-tronco.
No exemplo de proteção de tecido neuronal, patologiastratáveis e que podem ser prevenidas usando peptídeos protetores de tecido dainvenção, estas patologias incluem as que resultam de oxigenação reduzida detecidos neuronais. Qualquer condição que reduz a disponibilidade de oxigênioem tecido neuronal, resultando em tensão, dano, e, finalmente, morte decélulas neuronais, pode ser tratada usando os peptídeos protetores de tecido dapresente invenção. Geralmente referidas como hipoxia e/ou isquemia, estascondições aparecem ou incluem, mas não estão limitadas a, derrame, oclusãovascular, privação de oxigênio no pré-natal ou pós-natal, sufocação, engasgos,quase afogamento, envenenamento com monóxido de carbono, inalação defumaça, trauma, incluindo cirurgia e radioterapia, asfixia, epilepsia,hipoglicemia, doença pulmonar obstrutiva crônica, enfisema, síndrome daaflição respiratória em adultos, choque hipotensivo, choque séptico, choqueanafilático, choque de insulina, crise de células falciformes, parada cardíaca,disritmia, narcose de nitrogênio e déficits neurológicos causados porprocedimentos de desvio coração-pulmão.
Em uma forma de realização, por exemplo, exemplo, ospeptídeos protetores de tecido da presente invenção, identificados usando oteste da invenção, podem ser administrados sozinhos ou como parte de umacomposição para prevenir dano ou dano ao tecido resultante de risco de danoou dano ao tecido antes, durante ou após um procedimento cirúrgico ou umprocedimento médico. Por exemplo, os procedimentos cirúrgicos podemincluir ressecção de tumor ou reparo de aneurisma e os procedimentosmédicos podem incluir resistência ou liberação. Outras patologias causadas ouresultantes de hipoglicemia que são tratáveis usando peptídeos protetores detecido da presente invenção incluem superdose de insulina, também referidacomo hiperinsulinomia iatrogênica, insulinoma, deficiência de hormônio decrescimento, hipocortisolismo, superdose de fármacos, e certos tumores.
Outras patologias resultantes de dano ao tecido neuronalexcitável incluem distúrbios provocados por insultos, como epilepsia,convulsões, ou distúrbios de insultos crônicos. Outras condições e doençastratáveis incluem, mas não estão limitadas a doenças como derrame, esclerosemúltipla, hipotensão, parada cardíaca, mal de Alzheimer, mal de Parkinson,paralisia cerebral, trauma cerebral ou da medula espinhal, demência porAIDS, perda relacionada à idade da função cognitiva, perda de memória,esclerose lateral, distúrbios provocados por insultos, alcoolismo, isquemiaretinal, dano ao nervo ótico resultante de glaucoma, e perda neuronal.
Os peptídeos protetores de tecido específicos da presenteinvenção podem ser usados para tratar ou prevenir inflamação resultante decondições de doença ou vários traumas, como inflamação fisicamente ouquimicamente induzida. Os peptídeos protetores de tecido também sãocontemplados para o tratamento e prevenção de condições inflamatórias emum ou mais órgãos ou tecidos incluindo, mas não limitados ao cérebro,medula espinhal, tecido conectivo, coração, pulmão, rim e trato urinário,pâncreas, olhos e próstata. Exemplos não limitativos deste trauma incluemtendinite, angite, bronquite crônica, pancreatite, osteomielite, artritereumatóide, glomerulonefrite, neurite ótica, arterite temporal, encefalite,meningite, mielite transversa, dermatomiosite, polimiosite, fascilitenecrosante, hepatite, e enterocolite necrosante. Além disso, as citocinasprotetoras de tecido podem ser usadas para tratar ou prevenir inflamaçãoresultante de condições isquêmicas e não isquêmicas incluindo, mas nãolimitadas a alergias, doenças reumáticas, danos relacionados a esporte,infecções incluindo virais, fungicas, e bacterianas. A inflamação pode seraguda ou crônica. Outras aplicações no campo da inflamação estão indicadasem PCT/US2004/031789 depositado em 29 de setembro de 2004 e publicadocomo WO 2005/032467, incorporados aqui por referência em sua totalidade.
Os peptídeos protetores de tecido específicos da presenteinvenção podem ser usados para tratar doenças dos sistemas periférico enervoso central resultantes de desmielinação ou invólucro de mielina. Estasdoenças são definidas como principalmente envolvendo lesões do invólucrode mielina inflamatórias de origem desconhecida, com a exceção de doençasde deficiência de mielinação, como leucodistrofia, e doenças devido causasóbvias. Esclerose múltipla (MS) é uma doença típica entre doençasdesmielinantes, e, patologicamente, é caracterizada por trocas,principalmente, desmielinação inflamatória, e gliose. Uma vez que suaetiologia é desconhecida, seu diagnóstico é feito com base em seus aspectosclínicos, isto é, multiplicidade espacial e multiplicidade com o passar dotempo de lesões do sistema nervoso central. Além disso, encefalomielitedisseminada aguda (ADEM), esclerose difusa inflamatória, encefalomielitehemorrágica necrosante subaguda, e mielite transversa estão incluídas emdoenças desmielinantes. Também, tecidos nervosos periféricos incluindocélulas de Schwann para manter o invólucro de mielina, caso estas célulassejam prejudicadas, a doença desmielinante periférica é causada.Os peptídeos protetores de tecido da presente invenção podemser usados para tratar ou prevenir condições de, e dano ao coração incluindoqualquer evento patológico crônico ou agudo envolvendo o coração e/outecido associado (por exemplo, o pericárdio, aorta e outros vasos sangüíneosassociados), incluindo dano de isquemia-reperfiisão; falha cardíacacongestiva; parada cardíaca; infarto do miocárdio; aterosclerose, ligação daválvula mitral, palpitação atrial, cardiotoxicidade causada por compostoscomo fármacos (por exemplo, doxorrubicina, herceptina, tiorizadina ecisaprida); dano cardíaco devido a infecção parasítica (bactérias, fungos,rickéttsia, e vírus, por exemplo, sífilis, infecção por Trypanosoma crônica);amiloidose cardíaca fulminante; cirurgia cardíaca; transplante de coração;angioplastia; cirurgia laparoscópica, dano cardíaco traumático (por exemplo,dano cardíaco penetrante ou agudo, e ruptura da válvula aórtica), reparocirúrgico de um aneurisma aórtico torácico; um aneurisma aórtico da supra-renal; choque cardiogênico devido a infarto do miocárdio ou falha cardíaca;choque neurogênico e anafilaxia. Os peptídeos protetores de tecido dapresente invenção podem ser usados também para tratar os indivíduos emrisco de doença cardíaca como falha cardíaca (isto é, quando o coração não écapaz de bombear sangue em uma taxa requerida pelos tecidosmetabolizantes, ou quando o coração pode fazer isso somente com umaelevada pressão). Estes pacientes em risco podem incluir pacientes tendo ouestando em risco de ter infarto cardíaco, doença da artéria coronária,miocardite, quimioterapia, cardiomiopatia, hipertensão, doenças cardíacasvalvulares (mais freqüentemente insuficiência mitral e estenose aórtica) ecardiomiopatia induzida por toxinas (por exemplo, etanol, cocaína, etc.) eoutros.
Os peptídeos protetores de tecido da presente invenção podemser usados para tratar ou prevenir condições de dano aos olhos. Por exemplo,vazamento do tecido retinal. Estes distúrbios incluem, mas não estãolimitados a isquemia retinal, degeneração macular, descolamento retinal,retinite pigmentosa, retinopatia arteriosclerótica, retinopatia hipertensiva,bloqueio de artéria retinal, bloqueio de veia retinal, hipotensão e retinopatiadiabética.
Em outra forma de realização, os peptídeos protetores detecido da presente invenção e princípios da invenção podem ser usados paraprevenir ou tratar dano resultante de dano por radiação em tecido responsivo.Uma outra utilidade dos peptídeos protetores de tecido da presente invençãoestá no tratamento de envenenamento, como envenenamento com neurotoxina (por exemplo, envenenamento com mariscos com ácido domóico), toxinas(etanol, cocaína, etc.), como o resultado de agentes quimioterapêuticos deexposição a radiação, neurolatirismo; doença de Guam; esclerose lateralamiotrófica; e mal de Parkinson.
Como mencionado acima, a presente invenção refere-setambém a peptídeos protetores de tecido da presente invenção para uso nafunção de tecidos melhorada em células, tecidos e órgãos responsivos em ummamífero por administração periférica de uma citocina protetora de tecidocomo descrito acima. Várias doenças e condições são receptivas a tratamentousando este método. Por exemplo, este método é utilizável para melhorar afunção em tecidos excitáveis resultando em um aumento na função cognitivamesmo na ausência de qualquer condição ou doença. Além disso, as citocinasprotetoras de tecido são utilizáveis para melhorar a qualidade de cicatrizaçãode ferimentos, reduzindo o tempo requerido para cicatrizar, melhorando aqualidade dos tecidos cicatrizados e reduzindo a incidência de adesões resultantes do ferimento. Ver PCT/US2004/031789 depositado em 29 desetembro de 2004 e publicado como WO 2005/032467, incorporado aqui porreferência em sua totalidade. Estes usos da presente invenção são descritos emmais detalhe abaixo e incluem melhoria de aprendizagem e treinamento emambos os mamíferos humanos e não humanos.As condições e doenças tratáveis ou evitáveis usando ospeptídeos protetores de tecido da presente invenção referem-se ao sistemanervoso central incluem mas não estão limitadas aos distúrbios do humor,distúrbios de ansiedade, depressão, mutismo, déficit de atenção, distúrbio dehiperatividade, e disfunção cognitiva. Estas condições podem se beneficiar damelhora da função neuronal. Outros distúrbios tratáveis de acordo com osensinamentos da presente invenção incluem interrupção do sono, porexemplo, apnéia do sono e distúrbios relacionados a viagens, sangramentossubaracnóides e aneurismal, choque hipotensivo, dano concussivo, choqueséptico, choque anafilático e seqüelas de várias encefalites e meningites, porexemplo, cerebrites relacionadas a doenças do tecido conectivo como lupus.Outros usos incluem prevenção de ou proteção de envenenamento porneurotoxinas, como envenenamento com mariscos com ácido domóico,neurolatirismo, e doença de Guam, esclerose amiotrófica, mal de Parkinson;tratamento pós-operatório para dano embólico ou isquêmico; irradiação docérebro total; crise de células falciformes; e eclampsia.
Um outro grupo de condições tratáveis ou evitáveis usando ospeptídeos protetores de tecido da presente invenção inclui disfunçãomitocondrial, tanto hereditária como adquirida naturalmente, que é a causa deuma variedade de doenças neurológicas tipificadas por dano ou morteneuronal. Por exemplo, a doença de Leigh (encefalopatia necrosante aguda) écaracterizada pela perda visual progressiva e encefalopatia, devido adiminuição neuronal, e miopatia. Nestes casos, o metabolismo mitocondrialdefeituoso falha no fornecimento suficiente de substratos de alta energia paraabastecer o metabolismo de células excitáveis. Um peptídeo protetor de tecidootimiza a função deficiente em uma variedade de doenças mitocondriais.Como mencionado acima, as condições hipóxicas afetam adversamente ostecidos excitáveis. Os tecidos excitáveis incluem, mas não estão limitados a,tecido do sistema nervoso central, tecido do sistema nervoso periférico etecido do coração. Além das condições descritas acima, os peptídeosprotetores de tecido da presente invenção são utilizáveis no tratamento deenvenenamento por inalação como monóxido de carbono e inalação defumaça, asma severa, síndrome da aflição respiratória, e engasgos e quaseafogamento. Outras condições que criam condições hipóxicas ou por outrosmeios induzem o tecido responsivo, como dano ao tecido excitável incluemhipoglicemia que pode ocorrer na dosagem inadequada de insulina, ou comneoplasmas produzindo insulina (insulinoma).
Vários distúrbios neuropsicológicos que são descritos originár-se de dano ao tecido excitável são tratáveis usando os peptídeos protetores detecido da presente invenção. Distúrbios crônicos em que dano neuronal estáenvolvido e para os quais tratamento ou prevenção pela presente invenção éprovido incluem distúrbios relacionados ao sistema nervoso central e/ousistema nervoso periférico incluindo perda da função cognitiva relacionada àidade e demência senil, distúrbios de ataques crônicos, mal de Alzheimer, malde Parkinson, demência, perda de memória, esclerose lateral amiotrófica,esclerose múltipla, esclerose tuberosa, doença de Wilson, paralisiasupranuclear progressiva, doença de Guam, demência do corpo de Mewy,doenças de prion, como encefalopatites espongiformes, por exemplo, doençade Creutzfeldt-Jakob, doença de Huntington, distrofia miotônica, ataxia deFreidrich e outras ataxias, bem como síndrome de Gilles de Ia Tourette,distúrbios de ataques, como epilepsia e distúrbio de ataques crônicos,derrame, trauma cerebral ou da medula espinhal, demência de AIDS,alcoolismo, autismo, isquemia retinal, glaucoma, distúrbios da funçãoautonômica como hipertensão e distúrbios do sono, e distúrbiosneuropsiquiátricos que incluem, mas não estão limitados a esquizofrenia,distúrbio esquizo-afetivo, distúrbio do déficit da atenção, distúrbio distímico,distúrbio depressivo principal, manias, distúrbio obsessivo-compulsivo,distúrbios do uso de substâncias psicoativas, ansiedade, distúrbio do pânico,bem como distúrbios afetivos unipolares e bipolares. Outros distúrbiosneuropsiquiátricos e neurodegenerativos incluem, por exemplo, os listados emAmerican Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual ofMental Disorders (DSM), a versão mais atual do qual é incorporado aqui porreferência em sua totalidade.
Um outro grupo de condições tratáveis ou evitáveis usando ospeptídeos protetores de tecido da presente invenção inclui doenças dos rinscomo falha renal, aguda e crônica. O fornecimento de sangue aos rins podeser cortado devido a várias causas incluindo choque por infecções invadindo acorrente sangüínea (septicemia), hemorragia interna ou externa, perda defluido do corpo como um resultado de diarréia severa ou queimaduras,reações a transfusões, parada cardíaca ou arritmias, trauma cirúrgico etransplantes de rim. O fluxo reduzido de sangue aos rins resultante dascondições acima pode reduzir o fluxo de sangue a níveis perigosamentebaixos durante um período grande o suficiente para causar o desenvolvimentode falha renal aguda. O fluxo sangüíneo deprimido também resulta emnecrose, ou morte de tecido, no rim, danificando as células tubulares renais. Afalha renal também pode ser o resultado de doenças, síndromes nefróticas(intersticiais ou diabéticas), infecções, dano (induzido por CPB), toxinas(induzidas por contraste, induzidas por quimioterapia, ciclosporina),inflamação autoimune (por exemplo, lupus, eritrotose, etc.). Os peptídeosprotetores de tecido da presente invenção auxiliam no reparo ou prevençãodeste dano ajudando a melhorar a falha renal aguda.
A seguinte tabela relaciona outras indicações exemplares, nãolimitativas, como as várias condições e doenças receptivas a tratamento pelospeptídeos protetores de tecido mencionados acima.
<table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table>
Como mencionado acima, estas doenças, distúrbios oucondições são meramente ilustrativas da faixa de benefícios provida pelospeptídeos protetores de tecido da presente invenção. Conseqüentemente, estainvenção geralmente provê tratamento preventivo, terapêutico ou profiláticodas conseqüências de trauma mecânico ou de doenças humanas. O tratamentopreventivo ou terapêutico ou profilático para doenças, distúrbios ou condiçõesdo CNS e/ou sistema nervoso periférico é contemplado. O tratamentopreventivo ou terapêutico ou profilático para doenças, distúrbios ou condiçõesque têm um componente psiquiátrico é provido. O tratamento preventivo,terapêutico ou profilático para doenças, distúrbios ou condições incluindo,mas não limitados aos tendo um componente oftálmico, cardiovascular,cardiopulmonar, respiratório, renal, urinário, reprodutivo, gastrintestinal,endócrino ou metabólico é provido.
Em uma forma de realização, a composição farmacêuticacompreendendo o peptídeo protetor de tecido pode ser administradasistemicamente para proteger ou melhorar as células, tecido ou órgão alvo. Aadministração pode ser parenteralmente, via inalação, ou transmucosalmente,por exemplo, oralmente, nasalmente, intravaginalmente, sublingualmente,ocularmente, submucosamente ou transdermicamente. Preferivelmente, aadministração é parenteral, por exemplo, via injeção intravenosa ouintraperitoneal e também incluindo, mas não limitada a, administraçãointraarterial, intramuscularmente, intradermicamente e subcutaneamente,
Para outras vias de administração, como pelo uso de umperfundido, injeção em um órgão, ou outra administração local, umacomposição farmacêutica será provida, a qual resulta em níveis similares deum peptídeo protetor de tecido como descrito acima. Um nível de cerca de 15pM-30 nM é preferido.
As composições farmacêuticas da invenção podemcompreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, e umveículo farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização específica,o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agênciaregulatória do governo federal ou estadual ou listado na farmacopéia US ououtra farmacopéia estrangeira geralmente reconhecida para uso em animais e,mais particularmente, em humanos. O termo "veículo" refere-se a umdiluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o terapêutico éadministrado. Os veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, comosoluções salinas em água e óleos, incluindo as de origem em petróleo, animal,vegetal ou sintéticos, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral eoutros. Uma solução salina é um veículo preferido quando a composiçãofarmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e dextroseaquosa e soluções de glicerol também podem ser empregadas como veículoslíquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticosapropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz,farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco,cloreto de sódio, leite desnatado secado, glicerol, propileno glicol, água,etanol e outros. A composição, se desejado, também pode conter quantidadesmenores de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes detamponamento de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções,suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações deliberação sustentada e outros. A composição pode ser formulada como umsupositório, com aglutinantes tradicionais e veículos como triglicerídeos. Oscompostos da invenção podem ser formulados como formas neutras ou sais.Sais particularmente aceitáveis incluem os formados com grupos amino livrescomo os derivados de ácidos hidroclórico, fosfórico, acético, oxálico,tartárico, etc., e os formados com grupos carboxila livres como os derivadosde sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina,trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. Exemplos de veículosfarmacêuticos apropriados são descritos em "Remington's PharmaceuticalSciences" por E.W. Martin, incorporado aqui por referência em suatotalidade. As composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficazdo composto, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidadeapropriada de veículo de modo a prover a forma para administraçãoapropriada ao paciente. A formulação deve adequar o modo de administração.
Formulações para aumentar a adsorção transmucosal depeptídeos como peptídeo protetor de tecido de ação de redução da pressãointraocular prolongada também são contempladas pela presente invenção.Composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem serprovidas como cápsulas ou comprimidos, como pós ou grânulos, comosoluções, xaropes ou suspensões (em líquidos aquosos ou não aquosos); comocremes batidos ou espumas comestíveis; ou como emulsões. Comprimidos oucápsulas de gelatina duras podem compreender lactose, amido ou derivadosdos mesmos, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato demagnésio, ácido esteárico ou sais dos mesmos. As cápsulas de gelatina molespodem compreender óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis semi-sólidos ousólidos, etc. As soluções e xaropes podem compreender água, polióis eaçúcares.
Um agente ativo pretendido para administração oral pode serrevestido com ou misturado com um material que retarda a desintegração e/ouabsorção do agente ativo no trato gastrintestinal (por exemplo, monoestearatode glicerol ou diestearato de glicerila pode ser usado). Assim, a liberaçãosustentada de um agente ativo pode ser obtida durante muitas horas e, senecessário, o agente ativo pode ser protegido de ser degradado dentro doestômago. As composições farmacêuticas para administração oral podem serformuladas para facilitar a liberação de um agente ativo em um localgastrintestinal particular devido a condições de pH ou enzimáticas.
As composições farmacêuticas adaptadas para administraçãotransdérmica podem ser providas como curativos discretos que se destinam apermanecer em contato íntimo com a epiderme do paciente durante umperíodo prolongado de tempo. As composições farmacêuticas adaptadas paraadministração tópica podem ser providas como ungüentos, cremes,suspensões, loções, opôs, soluções, pastas, géis, pulverizações, aerossóis ouóleos. Para administração tópica à pele, boca, olho ou outros tecidos externos,um ungüento ou creme tópico é preferivelmente usado. Quando formulado emum ungüento, o ingrediente ativo pode ser empregado com uma base deungüento tanto parafínico como miscível em água. Alternativamente, oingrediente ativo pode ser formulado em um creme com uma base óleo-em-água ou uma base água-em-óleo. AS composições farmacêuticas adaptadaspara administração tópica ao olho incluem colírios. Nestas composições, oingrediente ativo pode ser dissolvido ou colocado em suspensão em umveículo apropriado, por exemplo, em um solvente aquoso. As composiçõesfarmacêuticas adaptadas para administração tópica na boca incluem losangos,pastilhas ou colutórios.
As composições farmacêuticas adaptadas para administraçãonasal e pulmonar podem compreender veículos sólidos como pós(preferivelmente tendo um tamanho de partícula na faixa de 20 a 500mícrons). Os pós podem ser administrados no modo em que a aspiração étomada, isto é, por inalação rápida através do nariz a partir de um recipientede pó mantido junto ao nariz. Alternativamente, as composições adotadas paraadministração nasal podem compreender veículos líquidos, por exemplo,pulverizações nasais ou gotas nasais. Além disso, a inalação dos compostosdiretamente nos pulmões pode ser realizada por inalação profundamente ouinstilação através de um bocal na orofaringe. Estas composições podemcompreender soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo. Ascomposições para administração por inalação podem ser fornecidas emdispositivos especialmente adaptados incluindo, mas não limitados a aerossóispressurizados, nebulizadores ou insufladores, que podem ser construídos demodo a prover dosagens predeterminadas do ingrediente ativo. Em uma formade realização preferida, as composições farmacêuticas da invenção sãoadministradas na cavidade nasal diretamente ou nos pulmões via a cavidadenasal ou orofaringe.
As composições farmacêuticas adaptadas para administraçãoretal podem ser providas como supositórios ou enemas. As composiçõesfarmacêuticas adaptadas para administração vaginal podem ser providas comocurativos, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações depulverização.
As composições farmacêuticas adaptadas para administraçãoparenteral incluem soluções ou suspensões injetáveis estéreis, aquosas e nãoaquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutosque tornam as composições substancialmente isotônicas com o sangue de umrecipiente. Outros componentes que podem estar presentes nestascomposições incluem água, álcoois, polióis, glicerina e óleos vegetais, porexemplo. As composições adaptadas para administração parenteral podem serapresentadas em recipientes de dose unitária ou múltiplas doses, por exemplo,ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condiçãosecada por congelamento (Iiofilizada) requerendo somente a adição de umveículo líquido estéril, por exemplo, solução salina estéril para injeções,imediatamente antes de usar. Soluções e suspensões de injeção extemporâneaspodem ser preparadas de pós estéreis, grânulos e comprimidos. Em umaforma de realização, um autoinjetor compreendendo uma solução injetável deum peptídeo protetor de tecido pode ser provido para uso emergencial porambulâncias, salas de emergência e situações de campos de batalha, e até paraauto-administração em um cenário doméstico, particularmente quando apossibilidade de amputação traumática pode ocorrer, como por usoimprudente de um cortador de grama. A possibilidade de que células e tecidosem um pé ou dedos do pé amputados irão sobreviver após sua nova uniãopode ser aumentada por administração de um peptídeo protetor de tecido nosmúltiplos sítios da parte amputada tão logo seja praticável, mesmo antes dachegada do pessoal médico ao local, ou chegada do indivíduo afetado com odedo amputado em um pano à sala de emergência.
Em uma forma de realização preferida, a composição éformulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composiçãofarmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos.Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções emtampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição tambémpode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como lidocaínapara amenizar a dor no sítio da injeção. Em geral, os ingredientes sãofornecidos tanto separadamente como misturados juntos na forma de dosagemunitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento deágua em um recipiente hermeticamente vedado como uma ampola ou sacheindicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição deve seradministrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusãocontendo água ou solução salina do tipo farmacêutico. Quando a composiçãoé administrada por injeção, uma ampola de solução salina estéril pode serprovida de modo que os ingredientes podem ser misturados antes daadministração.
Os supositórios contêm geralmente ingrediente ativo na faixade 0,5% a 10% em peso; as formulações orais contém, preferivelmente, 10%a 95% de ingrediente ativo.
Uma composição de perfundido pode ser provida para uso embanhos de órgãos transplantados, para perfusão in situ, ou para administraçãoà vasculatura de um doador de órgão antes da coleta do órgão. Estascomposições farmacêuticas podem compreender níveis de peptídeosprotetores de tecido, ou uma forma de peptídeos protetores de tecido nãoapropriados para administração aguda ou crônica, local ou sistêmica em umindivíduo, mas servirão para as funções pretendidas aqui em um cadáver,banho de órgão, perfundido do órgão, ou perfundido in situ antes de removerou reduzir os níveis de peptídeo protetor de tecido contidos nas mesmas antesde expor ou retornar o órgão ou tecido tratado a circulação regular.
A invenção também provê um pacote ou kit farmacêuticocompreendendo um ou mais recipientes carregados com um ou mais dosingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Opcionalmenteassociado com o(s) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita poruma agência governamental regulando a fabricação, uso ou venda de produtosfarmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência dafabricação, uso ou venda para administração a humanos.
Em uma outra forma de realização, por exemplo, um peptídeoprotetor de tecido pode ser liberado em um sistema de liberação controlada.Por exemplo, o peptídeo pode ser administrado usando infusão intravenosa,uma bomba osmótica implantável, um curativo transdérmico, lipossomas, ououtros modos de administração. Em uma forma de realização, uma bombapode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed.Eng. 14: 201; Buchwald et ai., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N.Engl. J. Med. 321: 574, cada um dos quais incorporado por referência aqui emsua totalidade). Em uma outra forma de realização, o composto pode serliberado em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, Science249: 1527-1533 (1990); Treat et al., em Liposomes in the Therapy ofInfections Disease and Câncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, NewYork, pp. 353-365 (1989); WO 91/04014; patente US 4.704.355; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver geralmente ibid.). Em uma outra forma derealização, materiais poliméricos podem ser usados (ver Medicai Applicationsof Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton,Flórida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design andPerformance, Smolen e Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger ePeppas. J. Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23: 61, 1953; ver tambémLevy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105, (cada um dos quaisincorporado por referência aqui em sua totalidade).
Em ainda uma outra forma de realização, um sistema deliberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico,isto é, as células, tecido ou órgão de alvo, requerendo, assim, somente umafração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, pp. 115-138 emMedicai Applications of Controlled Release, vol. 2, supra, 1984, que éincorporado aqui por referência em sua totalidade). Outros sistemas deliberação controlada são discutidos no estudo por Langer (1990, Science 249:1527-1533, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Em uma outra forma de realização, o peptídeo protetor detecido, como apropriadamente formulado, pode ser administrado poradministração nasal, oral, retal, vaginal, ocular, transdérmica, parenteral ousublingual.
Em uma forma de realização específica, pode ser desejáveladministrar um peptídeo protetor de tecido da invenção localmente à área emnecessidade de tratamento; isto pode ser obtido por, por exemplo, e não parafins de limitação, infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, porexemplo, em conjunto com uma bandagem de ferimento após cirurgia, porinjeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio deum plante, referido implante sendo um material poroso, não poroso ougelatinoso, incluindo membranas, como membranas silásticas, ou fibras. Umexemplo não limitativo desta forma de realização pode ser um stentcoronariano revestido com um peptídeo protetor de tecido da presenteinvenção.
A seleção da dose efetiva preferida será prontamentedeterminável por um versado na arte baseada na consideração de váriosfatores, que serão conhecidos de um versado na arte. Estes fatores incluem aforma particular do peptídeo protetor de tecido, e seus parâmetrosfarmacocinéticos como biodisponibilidade, metabolismo, meia-vida, etc., quedeverão ser estabelecidos durante os procedimentos de desenvolvimentousuais empregados tipicamente na obtenção da aprovação regulatória para umcomposto farmacêutico. Outros fatores em consideração à dose incluem acondição ou doença a ser tratada ou o benefício a ser obtido em um indivíduonormal, a massa corporal do paciente, a via de administração, se aadministração é aguda ou crônica, medicações concomitantes e outros fatoresbem conhecidos que afetam a eficácia dos agentes farmacêuticosadministrados. Assim, a dosagem exata deve ser decidida de acordo com ocritério do clínico e das circunstâncias de cada paciente, por exemplo,dependendo da condição e do estado imune do paciente individual, e deacordo com técnicas clínicas padrão.
Em um outro aspecto da presente invenção, uma composiçãofarmacêutica de acordo com a presente invenção pode incluir um peptídeoprotetor de tecido em uma formulação com pelo menos uma moléculapequena que demonstra funcionalidade protetora de tecido. Moléculaspequenas apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, esteróides (porexemplo, lazaróides e glucocorticóides), antioxidantes (por exemplo, co-enzima Qio, ácido alfa lipóico, e NADH), enzimas anticatabólicas (porexemplo, glutationa peroxidase, superóxido dimutase, catalase, removedorescatalíticos sintéticos, bem como miméticas), derivados de indol (pecindoleaminas, carbazóis e carbolinas), agentes neutralizantes de ácido nítrico,adenosina / agonistas de adenosina, fitoquímicos (flavanóides), extratos deervas (ginko biloba e turmérico), vitaminas (vitaminas A, E e C), inibidoresreceptores de elétron oxidase (por exemplo, inibidores de elétron oxidasexantina), minerais (por exemplo, cobre, zinco e magnésio), fármacosantiinflamatórios esteroidais (por exemplo, aspirina, naproxen e ibuprofen), ecombinações dos mesmos. Além disso, agentes incluindo, mas não limitadosa, agentes antiinflamatórios (por exemplo, corticoesteróides, prednisona ehidrocortisona), glucocorticóides, esteróides, fármacos antiinflamatórios nãoesteroidais (por exemplo, aspirina, ibuprofen, diclofenac e inibidores deCOX-2), agonistas beta, agentes anticolinérgicos e metil xantinas), agentesimunomodulatórios (por exemplo, moléculas orgânicas pequenas,moduladores do receptor de células T, moduladores do receptor de citocina,agentes de depleção de células T, antagonistas de citocina, antagonistas demonocina, inibidores de linfócitos, ou agentes anticâncer), injeções de ouro,sulfasalazina, penicilamina, agentes antiangiogênicos (por exemplo,angiostatina), antagonistas de TNF-α (por exemplo, anticorpos anti-TNFa), eendostatina), dapsona, psoralens (por exemplo, metoxaleno e trioxsaleno),agentes antimalária (por exemplo, hidrocloroquina), agentes antivirais, eantibióticos (por exemplo, eritromicina e penicilina) podem ser usados emconjunto com as presentes composições farmacêuticas. Em um outro aspecto da invenção, um perfundido ou soluçãode perfusão é provido para perfusão e armazenagem de órgãos paratransplante, a solução de perfusão inclui uma quantidade de um peptídeoprotetor de tecido efetivo para proteger células responsivas e células, tecidosou órgãos associados. O transplante inclui mas não está limitado aalotransplante, em que um órgão (incluindo células, tecido ou outra parte docorpo) é coletado de um doador e transplantado em um recipiente diferente,ambos sendo da mesma espécie; autotransplante, em que o órgão é tomado deuma parte de um corpo e substituído por outro, incluindo procedimentoscirúrgicos de bancada, em que um órgão pode ser removido, e enquanto exvivo, re-seccionado, reparado, ou de outro modo manipulado, como pararemoção de tumor e então retornado ao local original, ou xenotransplante, emque tecidos ou órgãos são transplantados entre espécies. Em uma forma derealização, a solução de perfusão é a solução da Universidade de Wisconsin(UW) (patente US 4.798.824, que é incorporada por referência aqui em suatotalidade) que contém de cerca de 1 a cerca de 25 U/ml (10 ng = 1U) depeptídeo protetor de tecido, 5% de hidroxietil amido (tendo um pesomolecular de cerca de 200.000 a cerca de 300.000 e substancialmente isentade etileno glicol, cloroidrin etileno, cloreto de sódio e acetona); KH2PO4 25mM; glutationa 3 mM; adenosina 5 mM; glicose 10 mM; tampão de HEPES10 mM; gluconato de magnésio 5 mM; CaCl2 1,5 mM; gluconato de sódio105 mM; 200.000 unidades de penicilina; 40 unidades de insulina; 16 mg dedexametasona; 12 mg de Vermelho fenol; e tem um pH de 7,4 - 7,5 e umaosmolalidade de cerca de 320 mOsm/1. A solução é usada para manter rins epâncreas cadavéricos antes do transplante. Usando a solução, a conservaçãopode ser prolongada além do limite de 30 horas recomendado paraconservação de rim cadavérico. Este perfimdido particular é meramenteilustrativo de um número destas soluções que pode ser adaptado para o usoatual por inclusão de uma quantidade efetiva de um peptídeo protetor detecido. Em uma outra forma de realização, a solução de perfundido contém decerca de 1 a cerca de 500 ng/ml de um peptídeo protetor de tecido, ou decerca de 40 a cerca de 320 ng/ml de peptídeo protetor de tecido. Comomencionado acima, qualquer forma de peptídeo protetor de tecido pode serusada neste aspecto da invenção.
Apesar de um recipiente preferido de um peptídeo protetor detecido para os presentes fins ser totalmente um humano, os presentes métodosaplicam-se igualmente a outros mamíferos, particularmente animaisdomesticados, de criação, de companhia, e animais do zôo. No entanto, ainvenção não é tão limitativa e os benefícios podem ser aplicados a qualquermamífero.
Em outros aspectos da invenção ex vivo, qualquer peptídeoprotetor de tecido como mas não limitado aos descritos acima pode serempregado.
Em um outro aspecto da invenção, métodos e composiçõespara melhorar a viabilidade de células, tecidos ou órgãos que não são isoladosda vasculatura por uma barreira de células endoteliais são providos expondoas células, tecidos ou órgãos diretamente a uma composição farmacêuticacompreendendo um peptídeo protetor de tecido, ou administrando oucontatando uma composição farmacêutica contendo um peptídeo protetor detecido à vasculatura do tecido ou órgão. A atividade melhorada de célulasresponsivas no tecido ou órgão tratado é responsável pelos efeitos positivosexercidos.
Similar a outros compostos protetores de tecido com base emeritropoietina, é possível que os peptídeos protetores de tecido da presenteinvenção possam ser transportados da superfície luminal para a superfície demembrana de base de células endoteliais de capilares de órgãos com junçõesfirmes de células endoteliais, incluindo, por exemplo, o cérebro, retina etestículos. Assim, as células responsivas através da barreira podem ser alvossuscetíveis para os efeitos benéficos de peptídeos protetores de tecido, eoutros tipos de células ou tecidos ou órgãos que contêm e dependem no todoou em parte de células responsivas nos mesmos podem ser alvos para osmétodos da invenção. Apesar de não desejar ficar limitado por qualquer teoriaparticular, após transcitose de peptídeo protetor de tecido pode interagir comum receptor do protetor de tecido em uma célula responsiva, por exemplo,neuronal, do olho (por exemplo, retinal), adipose, conectivo, do cabelo, dente,mucosal, pancreático, endócrino, aural, epitelial, da pele, músculo, coração,pulmão, fígado, rim, intestino delgado, adrenal (por exemplo, córtex adrenal,medula adrenal), capilar, endotelial, do testículo, ovário, ou célulaendometrial, e ligação de receptor pode iniciar uma cascata de transdução desinal resultando na ativação de um programa de expressão de gene dentro dacélula ou tecido responsivo, resultando na proteção da célula, tecido ou órgão,de dano, como por toxinas, agentes quimioterapêuticos, terapia de radiação,hipoxia, etc. Em uma outra forma de realização, o peptídeo protetor de tecidopode ser reticulado em um composto que pode cruzar a barreira, comoeritropoietina carbamilada, a ser transportado através da barreira de acordocom o ensinamento do pedido PCT PCT/USO1/49479, pedido de patente USn°s. 10/188.905 e 10/185.841, incorporado aqui por referência. Assim, osmétodos para proteger tecido contendo células responsivas de dano ou tensãohipóxica, e melhorar a função deste tecido são descritos em detalhe abaixo.
Na prática de uma forma de realização da invenção, umpaciente mamífero está passando por quimioterapia sistêmica para tratamentode câncer, incluindo terapia de radiação, que comumente tem efeitos adversoscomo dano aos nervos, pulmão, coração ovário ou testicular. A administraçãode uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo protetor detecido como descrito acima é realizada antes de e durante quimioterapia e/outerapia de radiação, para proteger vários tecidos e órgãos de dano pelo agentequimioterapêutico, como para proteger os testículos. O tratamento pode sercontinuado até os níveis de circulação do agente quimioterapêutico teremcaído abaixo de um nível de perigo potencial para o corpo do mamífero.
Na prática de uma outra forma de realização da invenção,vários órgãos são planejados para ser coletados de uma vítima de um acidenteautomobilístico para transplante em um número de recipientes, alguns dosquais requereram transporte para uma distância e período de tempoprolongados. Antes da coleta do órgão, o doador é infundido com umacomposição farmacêutica compreendendo peptídeos protetores de tecidocomo descrito aqui. Os órgãos coletados para embarque são perfundidos comum perfundido contendo peptídeos protetores de tecido como descrito aqui, earmazenados em um banho compreendendo peptídeos protetores de tecido.Certos órgãos são continuamente perfundidos com um dispositivo de perfusãopulsátil, utilizando um perfundido contendo peptídeos protetores de tecido deacordo com a presente invenção. Deterioração mínima da função do um órgãoocorre durante o transporte e quando do implante e reperfusão dos órgãos insitu.
Em uma outra forma de realização da presente invenção, umparticipante em uma atividade perigosa, pode tomar uma dose de umacomposição farmacêutica contendo um peptídeo protetor de tecido suficientetanto para prevenir (isto é, retardar o início de, inibição ou parada), protegercontra, ou mitigar o dano resultante de um dano a uma célula, tecido ou órgãoresponsivo. Em particular, este método de tratamento pode ter aplicação emvárias profissões suscetíveis a dano, mas não limitadas a, atletas profissionais(mergulhadores, motoristas de carros de corrida, jogadores de futebol, etc.),pessoal militar (soldados, pára-quedistas), pessoal de emergência (polícia,bombeiro, EMS, e pessoal de atendimento em desastres), auxiliares defilmagens e trabalhadores de construção. Além disso, o uso profilático depeptídeos protetores de tecido é contemplado em esforços recreacionaisincluindo, mas não limitados a alpinismo, rapei, sky diving, corredores,ciclistas, futebol, rugby, baseball e mergulhos que colocam um risco de dano.
Em uma outra forma de realização da invenção, umprocedimento cirúrgico para reparar uma válvula cardíaca requer cardioplegiae oclusão da artéria temporárias. Antes da cirurgia, o paciente é infundidocom um peptídeo protetor de tecido. Este tratamento evita dano celularisquêmico hipóxico, particularmente após reperfusão. Além disso, ascomposições farmacêuticas da presente invenção podem ser usadasprofilaticamente para preparar um indivíduo para cirurgia em um esforço paralimitar o trauma associado com o procedimento cirúrgico ou ajudar narecuperação do indivíduo do procedimento cirúrgico. Apesar do presentemétodo de tratamento usando composições farmacêuticas contendo peptídeosprotetores de tecido prover um uso profilático para procedimentos cirúrgicos,ele pode ser particularmente utilizável em procedimentos que induzemeventos isquêmicos temporários incluindo, mas não limitados aprocedimentos de desvios (desvio coronariano), procedimentos deangioplastia, amputações e transplantes, bem como os realizados diretamenteem células, tecidos ou órgãos responsivos como cirurgia do cérebro e damedula espinhal, e procedimentos de coração aberto. Estes procedimentospodem envolver o uso de desvio cardiopulmonar (coração pulmão).
Em uma outra forma de realização da invenção, em qualquerprocedimento cirúrgico, como em cirurgia de desvio cardiopulmonar, umpeptídeo protetor de tecido da invenção pode ser usado. Em uma forma derealização, a administração de uma composição farmacêutica compreendendoos peptídeos protetores de tecido como descrito acima é realizada antes de, durante e/ou após o procedimento de desvio, para proteger a função docérebro, coração e outros órgãos.
Nos exemplos acima em que o peptídeo protetor de tecido dainvenção é usado para aplicações ex vivo, ou para aplicações in vivo paratratar células responsivas como tecido neuronal, tecido retinal, coração,pulmão, fígado, rim, intestino delgado, córtex adrenal, medula adrenal,capilar, endotelial, testículo, ovário ou células ou tecidos, a invenção provêuma composição farmacêutica na forma de dosagem unitária adaptada paraproteção ou melhora de células, tecidos ou órgãos responsivos distais davasculatura que compreende uma quantidade na faixa de cerca de 0,01 pg a 7,5 mg, 0,5 pg a 6,5 mg, 500 pg a 5 mg, 500 ng a 5 mg, 1 μg a 5 mg, 500 μg a5 mg ou 1 mg a 5 mg de um peptídeo protetor de tecido, e um veículofarmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização preferida, aquantidade de peptídeo protetor de tecido está na faixa de cerca de 0,05 pg a 1mg. Em uma forma de realização preferida, a formulação contém peptídeos protetores de tecido que são não eritropoiéticas.
Em um outro aspecto da invenção, a administração depeptídeos protetores de tecido pode ser usada para restaurar a funçãocognitiva em mamíferos que sofreram trauma cerebral. Após um retardo tantode 5 dias como de 30 dias, a administração de peptídeos protetores de tecido deve ser capaz de restaurar a função como comparado a mamíferos tratadoscom placebo, indicando a capacidade do peptídeo protetor de tecido pararegenerar ou restaurar a atividade cerebral. Assim, a invenção também refere-se ao uso de peptídeos protetores de tecido para a preparação de umacomposição farmacêutica para o tratamento de trauma cerebral e outrasdisfunções cognitivas, incluindo tratamento bem após o dano (por exemplo,três dias, cinco dias, uma semana, um mês, ou mais). A invenção refere-setambém a um método para o tratamento de disfunção cognitiva após danoadministrando uma quantidade efetiva de peptídeos protetores de tecido.Qualquer peptídeo protetor de tecido como descrito aqui pode ser usado paraeste aspecto da invenção.
Além disso, este aspecto restaurativo da invenção refere-se aouso de quaisquer destes peptídeos protetores de tecido para a preparação deuma composição farmacêutica para a restauração da disfunção celular, detecido ou órgão, em que o tratamento é iniciado após, e bem após, o insultoinicial responsável pela disfunção. Além disso, tratamento usando ospeptídeos protetores de tecido da invenção pode transpor o curso da doençaou condição durante a fase aguda bem como uma fase crônica.
Um peptídeo protetor de tecido da invenção pode seradministrado sistemicamente em uma dosagem entre cerca de 1 ng e cerca de100 μg/ peso corporal, preferivelmente cerca de 5-50 μg/kg-peso corporal,mais preferivelmente cerca de 10-30 μg/kg-peso corporal, por administração.
Esta dose efetiva deve ser suficiente para obter níveis de soro de peptídeosprotetores de tecido maiores do que cerca de 80, 120 ou 160 ng/ml de soroapós administração. Os níveis de soro podem ser obtidos em cerca de 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 horas pós-administração. Estas dosagens podem serrepetidas como necessário. Por exemplo, a administração pode ser repetidadiariamente, tanto quanto necessário, ou após um intervalo apropriado, porexemplo, a cada 1 a 12 semanas, preferivelmente, a cada 1 a 3 semanas. Emuma forma de realização, a quantidade eficaz do peptídeo protetor de tecido eum veículo farmaceuticamente aceitável pode ser embalada em um frasco dedose única ou outro recipiente. Em uma outra forma de realização, ospeptídeos protetores de tecido, que são capazes de exercer as atividadesdescritas aqui mas não causando um aumento na concentração dehemoglobina ou hematócrito, são usados. Os peptídeos protetores de tecidosão preferidos nos casos em que os métodos da presente invenção sãopretendidos para ser providos cronicamente.
5.4 TRANSCITOSE
Molécula veículo e peptídeo protetor de tecido. A presenteinvenção refere-se ainda a um método para facilitar o transporte de umpeptídeo protetor de tecido através de uma barreira de células endoteliais emum mamífero administrando uma composição que compreende o tecidopeptídeo protetor de tecido em associação com um peptídeo veículo, umpeptídeo capaz de cruzar a barreira de células endoteliais, como eritropoietina,como descrito acima. Junções firmes entre células endoteliais em certosórgãos no corpo criam uma barreira para a entrada de certas moléculas. Para otratamento de várias condições no órgão com barreiras, meios para facilitar apassagem do peptídeo protetor de tecido podem ser desejados.
Peptídeo protetor de tecido como molécula veículo. Ospeptídeos protetores de tecido desta invenção podem ser utilizáveis comoveículos para liberar outras moléculas através das barreiras sangue-cérebro eoutras similares que podem deslocar-se através. Uma composiçãocompreendendo uma molécula que deseja cruzar a barreira com um peptídeoprotetor de tecido é preparada e a administração periférica da composiçãoresulta na transcitose da composição através da barreira. A associação entre amolécula a ser transportada através da barreira e o peptídeo protetor de tecidopode ser uma ligação covalente lábil, caso em que a molécula é liberada daassociação com o peptídeo protetor de tecido após cruzar a barreira. Se aatividade farmacológica desejada da molécula é mantida ou não afetada porassociação com peptídeos protetores de tecido, este complexo pode seradministrado.
O versado na arte estará ciente de vários meios para associarmoléculas com os peptídeos protetores de tecido da invenção e a outrosagentes descritos acima, por meios covalentes, não covalentes, e outros. Alémdisso, a avaliação da eficácia da composição pode ser prontamentedeterminada em um sistema experimental. A associação de moléculas com ospeptídeos protetores de tecido pode ser obtida por qualquer número de meios,incluindo ligação lábil, covalente, reticulação, etc. Interações biotina/ avidinapodem ser empregadas; por exemplo, peptídeos protetores de tecidobiotinilados da invenção podem ser complexados com um conjugado lábil deavidina e uma molécula desejavelmente transportada. Como mencionadoacima, uma molécula híbrida pode ser preparada por meios recombinantes ousintéticos, por exemplo, um polipeptídeo de fusão ou quimérico que incluiambos o domínio da molécula com atividade farmacológica e o domínioresponsável pela modulação da atividade do receptor de peptídeo protetor detecido. Sítios de clivagem de protease podem ser incluídos na molécula.
Uma molécula pode ser conjugada a um peptídeo protetor detecido da invenção através de uma molécula polifuncional, isto é, umreticulador polifuncional. Como usado aqui, o termo "molécula polifuncional"engloba moléculas tendo um grupo funcional que pode reagir mais do queuma vez em sucessão, como formaldeído, bem como moléculas com mais doque um grupo reativo. Como usado aqui, o termo "grupo reativo" refere-se aum grupo funcional no reticulador que reage com um grupo funcional em umamolécula (por exemplo, peptídeo, proteína, carboidrato, ácido nucleico,particularmente um hormônio, antibiótico, ou agente anticâncer a seremliberados através de uma barreira de células endoteliais) de modo a formaruma ligação covalente entre o reticulador e a molécula. O termo "grupofuncional" retém seu significado padrão em química orgânica. As moléculaspolifuncionais que podem ser usadas são preferivelmente ligadoresbiocompatíveis, isto é, elas são não carcinogênicas, não tóxicas, esubstancialmente não imunogênicas in vivo. Reticuladores polifuncionaiscomo os conhecidos na arte e descritos aqui podem ser prontamente testadosem modelos animais para determinar sua biocompatibilidade. A moléculapolifuncional é preferivelmente bifuncional. Como usado aqui, o termo"molécula bifuncional" refere-se a uma molécula com dois grupos reativos. Amolécula bifuncional pode ser heterofuncional ou homobifimcional. Umreticulador heterobifuncional permite uma conjugação vetorial. Eparticularmente preferido para a molécula polifuncional ser suficientementesolúvel em água para as reações de reticulação ocorrerem em soluçõesaquosas como em soluções aquosas tamponadas em pH 6 a 8, e para oconjugado resultante permanecer solúvel em água para bio-distribuição maisefetivo. Tipicamente, a molécula polifuncional liga-se covalentemente comum grupo funcional amino ou sulfidrila. No entanto, as moléculaspolifuncionais reativas com outros grupos funcionais, como ácidoscarboxílicos ou grupos hidroxila, são contempladas na presente invenção.
As moléculas homobifuncionais têm pelo menos dois gruposfuncionais reativos, que são iguais. Os grupos funcionais reativos em umamolécula homobifuncional incluem, por exemplo, grupos aldeído e gruposéster ativos. As moléculas homobifuncionais tendo grupos aldeído incluem,por exemplo, glutaraldeído e subaraldeído. O uso de glutaraldeído como umagente de reticulação foi descrito por Poznansky et al., Science 223, 1304-1306 (1984). Moléculas homobifuncionais tendo pelo menos duas unidadeséster ativas incluem ésteres de ácidos dicarboxílicos e N-hidroxissuccimida.Alguns exemplos de ésteres de N-succinimidila incluem suberato dedissuccinimidila e ditio-bis- (propionato de succinimidila), e seus ácidobissulfônico e sais de bissulfonato como seus sais de sódio e potássio. Estesreagentes homobifuncionais estão disponíveis de Pierce, Rockford, Illinois.
As moléculas heterobifuncionais têm pelo menos dois gruposreativos diferentes. Os grupos reativos reagem com grupos funcionaisdiferentes, por exemplo, presentes no peptídeo e na molécula. Estes doisgrupos funcionais diferentes que reagem com o grupo reativo no reticuladorheterobifuncional são geralmente um grupo amino, por exemplo, o grupoamino epsilon de lisina; um grupo sulfidrila, por exemplo, um grupo tiol decisteína; um ácido carboxílico, por exemplo, o carboxilado em ácidoaspártico; ou um grupo hidroxila, por exemplo, o grupo hidroxila em serina.
Naturalmente, alguns dos vários peptídeos protetores de tecidoda invenção podem não ter grupos reativos apropriados disponíveis para usocom certo agente de reticulação; no entanto, um versado na arte estaráamplamente ciente da escolha dos agentes de reticulação com base nos gruposdisponíveis para reticulação nos peptídeos protetores de tecido da invenção.
Quando um grupo reativo de uma molécula heterobifuncionalformar uma ligação covalente entre um grupo amino, a ligação covalente serágeralmente uma ligação amido ou imido. O grupo reativo que formar umaligação covalente com um grupo amino pode, por exemplo, ser um grupocarboxilato ativado, um grupo halocarbonila, ou um grupo éster. O grupohalocarbonila preferido é um grupo clorocarbonila. Os grupos éster sãopreferivelmente grupos éster reativos como, por exemplo, um grupo N-hidróxi-succinimida.
O outro grupo funcional é tipicamente tanto um grupo tiol, umgrupo capaz de ser convertido em um grupo tiol, como um grupo que formaruma ligação covalente com um grupo tiol. A ligação covalente serágeralmente uma ligação tioéter ou um dissulfeto. O grupo reativo que formaruma ligação covalente com um grupo tiol pode, por exemplo, ser uma ligaçãodupla que reage com grupos tiol ou um dissulfeto ativado. Um grupo reativocontendo uma ligação dupla capaz de reagir com um grupo tiol é o grupomaleimido, embora outros, como acrilonitrila, também sejam possíveis. Umgrupo dissulfeto reativo pode, por exemplo, ser um grupo 2-piridilditio ou umgrupo 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzóico). Alguns exemplos de reagentesheterobifuncionais contendo ligações de dissulfeto reativas incluempropionato de 3-(2-piridil-ditio) propionato de N-succinimidila (Carlsson etal., 1978, Biochem J., 173: 723-737), S-4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metilbenziltiossulfato de sódio e 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-(2-piridiltio) tolueno. 3-(2-piridiltio) propionato de N-succinimidila é preferido.Alguns exemplos de reagentes heterobifuncionais compreendendo gruposreativos tendo uma ligação dupla que reage com um grupo tiol incluem 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato de succinimidila e m-maleimidobenzoato de succinimidila.
Outras moléculas heterobifuncionais incluem 3-(maleimido)propionato de succinimidila, 4-(p-maleimido-fenil) butirato desulfossuccinimidila, 4-(N-meleimidometil-ciclohexano)-l-carboxilato desulfossuccinimidila, éster maleimidobenzoil-N-hidróxi-succinimida. O sal desulfonato de sódio de m-maleimidobenzoato de succinimidila é preferido.Muitos dos reagentes heterobifuncionais acima mencionados e seus sais desulfonato são disponíveis de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois US.
A necessidade para o conjugado acima descrito ser reversívelou lábil pode ser prontamente determinada pelo versado na arte. Umconjugado pode ser testado in vitro para atividade farmacológica desejável. Seo conjugado reter ambas as propriedades (as propriedades da moléculaconjugada e as propriedades do peptídeo protetor de tecido), suaapropriabilidade pode ser então testada in vivo. Se a molécula conjugadarequerer separação do peptídeo protetor de tecido para atividade, uma ligaçãolábil ou associação reversível com eritropoietina de aço longa ou citocinaprotetora de tecido de ação longa serão preferíveis. As características delabilidade também podem ser testadas usando procedimentos in vitro padrõesantes do teste in vivo.
A informação adicional com relação a como fazer e usar estesassim como outros reagentes polifiincionais pode ser obtida a partir dasseguintes publicações ou outros disponíveis na arte.Carlsson, J. et al, 1987, Biochem, J. 173: 723- 737Cumber, J.A. et al., 1985, Methods in Enzymology 112:207-224;Jue, R. et al., 1978, Biochem 17:5399-5405;Sun, T.T. et al., 1974, Biochem. 13:2334-2340;Blattler, W.A. et al., 1985, Biochem. 24:1517-152;Liu, F.T. et al., 1979, Biochem. 18:690-697;Youle, RJ. e Neville, D.M. Jr., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77:5483-5486;
Lerner, R.A. et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3403-3407;Jung, S.M. e Moroi, M., 1983, Biochem. Biophys. Acta 761:162;Caulfield, M.P. et al., 1984, Biochem. 81:7772-7776;Staros, J.V., 1982, Biochem. 21:3950-3955;Yoshitake, S. et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399;Yoshitake, S. et al., 1982, J. Biochem. 92:1413-1424;Pilch, P.F. e Czech, M.P., 1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381;Novick, D. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:8483-8487; Lomant, AJ. andFairbanks, G., 1976, J. MoI. Biol. 104:243-261;Hamada, H. e Tsuruo, T., 1987, Anal. Biochem. 160:483-488; ouHashida, S. et al., 1984, J. Applied Biochem. 6:56-63, cada incorporada aquipor referência em sua totalidade.
Adicionalmente, métodos de reticulação foram estudados porMeans e Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12, incorporado aqui porreferência em sua totalidade.
As barreiras que são cruzadas pelos métodos acimamencionados e composições da presente invenção incluem, mas não sãolimitadas a barreira sangue-cérebro, a barreira sangue-olho, a barreira sangue-testículos, a barreira sangue-ovário, barreira sangue- nervo, barreira sangue-medula espinhal, e barreira sangue-placenta.
As moléculas candidatas para transporte através de umabarreira de célula endotelial, incluem, por exemplo, hormônios, comohormônio de crescimento, fatores neurotróficos, antibióticos, antivirais, ouantifungicos, como os normalmente excluídos do cérebro e outros órgãos combarreira, radio-fármacos de peptídeos, fármacos anti-sentido, anticorpos eantivirais contra agentes biologicamente ativos, fármacos, e agentes anti-câncer. Os exemplos não limitativos destas moléculas incluem hormônios,como hormônio de crescimento, fator de crescimento de nervos (NGF), fatorneurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico ciliar (CNTF),fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento detransformação βΐ (TGF βΐ), fator de crescimento de transformação β2 (TGFβ2), fator de crescimento de transformação β 3 (TGF β3), interleucina 1,interleucina 2, interleucina 3, e interleucina 6, AZT, anticorpos contra fator denecrose de tumor, e agentes imunossupressivos como ciclosporina.Adicionalmente, corantes ou marcadores podem ser fixados aos peptídeosprotetores de tecido da presente invenção a fim de visualizar células, tecidosou órgãos dentro do cérebro e outros órgãos de barreira para fins diagnósticos.Como um exemplo, um marcador usado para visualizar placas dentro docérebro podem ser fixados a peptídeos protetores de tecido a fim dedeterminar a progressão do mal de Alzheimer em um paciente.
A presente invenção é também dirigida a uma composiçãocompreendendo uma molécula a ser transportada via transcitose através dabarreira da junção firme da célula endotelial e um peptídeo protetor de tecidocomo mencionado acima. A invenção é ainda dirigida ao uso de umconjugado entre uma molécula e uma citocina de peptídeo protetor de tecidocomo descrito acima para a preparação de uma composição farmacêutica paraa distribuição da molécula através de uma barreira como descrito acima.
Vários modelos de animal e testes in vitro para neuro-proteçãoe transcitose são providos em PCT / US 01/494979 (incorporado aqui porreferência em sua totalidade) para demonstrar a eficácia dos peptídeosprotetores de tecido da invenção. Para transcitose, proteínas de modeloconjugadas às eritropoietinas de ação longa da invenção são avaliadas paratransporte no cérebro após administração parenteral. Estes testes em modelosin vitro e modelos de animais são previsores da eficácia dos presentescompostos em outras espécies de mamíferos, incluindo humanos.
A presente invenção pode ser melhor compreendida porreferência aos seguintes exemplos não limitativos, que são providos comoexemplos da invenção. Os seguintes exemplos são apresentados a fim de maiscompletamente ilustrar as formas de realização preferidas da invenção. Elasnão devem de nenhum modo ser construídas, no entanto, como limitando oescopo amplo da invenção.
6. EXEMPLOSEXEMPLO 1 - MÉTODO DE SÍNTESE DE PEPTÍDEO
A. Síntese de peptídeo protetor de tecido A (SEQ ID NO:32,correspondendo a seqüência de aminoácido EPO 38-57) e peptídeo B (SEQID NO:34, correspondendo a seqüência de aminoácido EPO 58-82).
Peptídeo A, SEQ ID NO:32, e Peptídeo B, SEQ ID NO:34,fragmentos de EPO (ver tabela 1) foram sintetizados usando síntese depeptídeo em fase sólida em etapas Boc- Química de "neutralização in situ"como descrito em Band, D., Chopra, N e Kent, S., "Total Synthesis ofCrambin," J.AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 1377-1383 (incorporado porreferência aqui em sua totalidade). Brevemente dois fragmentoscorrespondendo a seqüência de aminoácido EPO 38-57 (peptídeo C,NITVPDTKVNFYAWKRMEYG, SEQ ID NO:29) e seqüência deaminoácido EPO 58-82 (peptídeo D,QQA VEVWQGLALLSEA VLRGQ ALLV, SEQ ID N0:30) foramsintetizados em resinas -OCHb-Pam- (peptídeos sem carboxila) ou em resinaHSCHkCH2CO-Leu-OCH2-Pam- (peptídeos tioéster). Durante a síntese dascadeias laterais de vários aminoácidos foram protegidos como a seguir:Arg(Tos), Asn(Xan), Asp(OcHex), Cys(4-CH3Bzl) ou Cys(ACM),Glu(OcHex), Lys(2-Cl-Z), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Tyr(Br-Z). Após a cadeia depeptídeo ser montada, os peptídeos foram desprotegidos e simultaneamenteclivados do suporte da resina por tratamento com HF anidro contendo p-cresol (90:10, v/v) durante 1 h a 0°C. Após evaporação do HF sob pressãoreduzida, produtos brutos foram precipitados e triturados com éter dietílicoresfriado, e os peptídeos foram dissolvidos em 50% acetonitrila aquosacontendo 0,1% TFA e purificados pelo sistema HPLC preparativo. Ascomposições de peptídeo foram confirmadas usando LC-MS.
EXEMPLO 2 - VALIDAÇÃO DE PROTEÇÃO DE TECIDO MEDIADA POR PEPTÍDEO
Os peptídeos protetores de tecido foram testados para qualqueratividade de proteção de tecido usando um teste de nervo ciático. RatosSprague - Dawley (250- 300 g) (seis por grupo, incluindo controle) foramanestesiados usando isoflurano (Baxter NPC 10019- 733-60) e um sistema deanestesia de laboratório TAble Top (medidor de fluxo a 2-3 litros/ min a 3,86kg/cm2 durante pelo menos 3 min. O rato foi então colocado em um lençolhomeotérmico para assegurar que a temperatura do núcleo do rato fossemantida a 35- 37°C durante a operação. A temperatura do núcleo foimonitorada com sonda retal. O nervo ciático direito do rato anestesiado foiexposto no quarto traseiro através de dissecação do músculo quadríceps; umaincisão de 2 cm com um escalpe de lâmina 15 através da pele paralela e sobreo músculo quadríceps e o músculo quadríceps foi cortado para expor o nervociático usando um par de tesouras de dissecação. O nervo ciático foi entãoisentado das membranas circundantes. Um fio de seda 2.0 (Ethicon, 685-G)foi passado sob o nervo e as extremidades da sutura passada através de umguia que foi mantido perpendicular ao nervo. A extremidade da sutura foientão amarrada a uma corda não elástica que foi então passada em torno deum sistema de polia (uma polia NYL contendo MTD 0,63 cm B (número PO04174-01) com estabilizador) e um peso de 100 g fixado à corda não elásticafoi lentamente liberado. O peso foi deixado pendurar durante 1 min antes dasutura de seda ser cortada para liberar o peso.
Uma dose de 289 pmol/kg de eritropoietina carbamilada, umadose de 289 pmol/kg de um peptídeo da série A-J (ver tabela 1), ou PBS foientão injetada na veia caudal usando uma seringa de insulina de 0,5 cm3. Umfragmento de 20 meros (correspondendo a aminoácidos 102- 121) de fator decrescimento derivado de epitélio de pigmento (PEDF) que não segue oensinamento acima foi usado como controle.
O músculo e a incisão cirúrgica foram então fechados e 5 mlde solução de Ringer lactada foram injetados subcutaneamente no rato. Atemperatura do rato foi mantida a 35- 37 0C usando um lençol térmico durantea recuperação.
Nos próximos quatro dias, o dedo do pé chanfrado dos ratosfoi determinado por colocação do rato em um tubo acrílico com um diâmetrode 30 cm na superfície de varredura digital. Após esperar 5 min para permitiraclimatação, uma varredura foi realizada dos pés de trás do rato quemostraram claramente todos os 5 dedos. Três varreduras aceitáveis de cadarato foram tomadas. A partir da varreduras, a distância entre os dedos (adistância entre a bola do primeiro dedo e a bola do quinto dedo) e a distânciados dedos intermediária (a distância entre a bola do segundo dedo e a bola doquarto dedo) foram medidas. O índice ciático estático foi então computado deacordo com S. Erbayrakatar et al, 2003, Proc. Natl. Ac. Sci USA 100, 6741-6746 (incorporado aqui por referência em sua totalidade) e a análiseestatística realizada.
Todos os peptídeos exceto B (SEQ ID NO: 34), H (SEQ IDNO: 47) e o derivado PEDF foram igualmente protetores, provendo um índiceciático estático ("SSI") de cerca de - 0,57 versus um SSI de cerca de -67 acerca de -68 para fragmento PBS/ PEDF (figura 2). A figura 2 também mostraque a eficácia dos peptídeos positivos foi pelo menos equivalente, se nãomelhorada, sobre a de eritropoietina carbamilada.
A tabela 1 também apresenta a distância aproximada entrecarbonil carbonos para os peptídeos testados. As distâncias foram calculadasusando as coordenadas tri-dimensionais de Cheetham et al, 1998, Nat. Struct.Biol. 5: 861- 866, incorporado aqui por referência. Os peptídeos que testarampositivo para atividade de proteção de tecido tinham, cada, uma distância /separação de carbonil carbono para carbonil carbono de entre cerca de 3 Â acerca de 5 Â.TABELA 1
<table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table>EXEMPLO 3 PEPTÍDEOS PROTETORES DE TECIDO NÃO SÃOERITROPOIÉTICOS
A. Avaliação in vitro
UT-7epo, uma linhagem de células de leucemia dependente deeritropoietina humana, foi usado para a determinação da potência deeritropoietina dos peptídeos. As células UT-7epo Deutsche Smmlung vonMikxoorganismen und Zellkulturen (DSMZ), cat. No. ACC 363) foramcultivadas em um meio RPMI 1640- completo com 10% FBS e 5 ng/mleritropoietina. A resposta de proliferação / sobrevivência (= aumento deviabilidade) das células expostas a eritropoietina é mediada pelo receptor deeritropoietina de tipo eritrócitos clássico e é uma medida quantitativa dacapacidade de variantes de eritropoietina para estimular o receptor deeritropoietina clássico.
As células UT-7epo foram transferidas para meio RPMI 1640completo novo contendo 10% de soro de bezerro doador, 4 mM L- glutamina,e suplementado com 5 ng/ml de eritropoietina humana recombinante. Ascélulas foram mantidas em frascos de 75 cm com 20 ml de meio/ frasco emum incubador umedecido com 5% CO2 a 37 0C durante 48 h. No dia dois doteste, isto é, em 48 h, as células foram transferidas do frasco com um tubocônico de 50 ml e centrifugadas a 1.000 rpm durante 5 min a temperaturaambiente. O sobrenadante foi descartado e as células lavadas duas vezes com10 ml de meio em inanição (3% soro bezerro doador, 4 mM L- glutamina). Ascélulas foram então recolocadas em suspensão em meio de inanição, usandoação de pipeta ascendente e descendente para obter uma suspensão de célulaúnica. As células re-suspensas foram diluídas com meio de inanição paraobter uma densidade de 4 χ IO5 células / ml, e colocadas em placas em umvolume de cultura total de 10 ml por 25 cm frasco. Após uma incubação de 4h, as células foram novamente transferidas para um tubo cônico de 50 ml. AScélulas de controle foram mantidas o tempo todo com 5 ng/ml de rhu-eritropoietina.
As células foram diluídas a 200.000 células / ml em meio deinanição, colocadas em 100 μ§/ cavidade em uma placa de 96 cavidades, eexpostas a variadas concentrações de eritropoietina, eritropoietinacarbamilada e peptídeo D, SEQ ID NO: 30. Uma série de diluições de 10vezes em meio RPMI 1640 contendo 3% soro foi usada para gerarconcentrações de compostos de teste de 0,2 pM a 20 nM. Após mais 48 h deincubação, uma solução de 15 ml de reagente de proliferação de células WST-1 (Roche) foi adicionada para cada cavidade, e incubada durante 1 h a 37 0Cem CO2. Após misturar 1 min, a placa foi lida em uma leitora (absorção a 450nm, subtraída da absorção de fundo a 650 nm).
O peptídeo D não mostrou atividade eritropoiética em dosestão elevadas como 10.000 pM (figura 3). Preferivelmente, o peptídeo não teráatividade eritropoiética para uma dose menor do que 1 μg/ml e maispreferivelmente para uma dose menor que 10 μg/ml.B. Avaliação in vivo
Para avaliar a atividade eritropoiética de peptídeo protetor detecido F (SEQ ID NO: 33) ou peptídeo G (SEQ ID NO: 40, como discutidosupra, um peptídeo construído dos resíduos apresentados de hélice B), ospeptídeos foram administrados 0,8 μg/ kg subcutaneamente três vezes porsemana a ratos machos Sprague Dawley. O esquema de dosagemcorrespondia à dose equivalente (em uma base molar) de EPO previamentedeterminado para elicitar uma eritropoiese máxima. A concentração dehemoglobina foi determinada periodicamente por uso de um analisadorautomatizado (Keska Corporation).
Nem peptídeo B nem peptídeo C mostraram qualquer aumentoem hematócritos no curso do estudo (figura 4, a resposta a uma dosagemequivalente de EPO é apresentada para comparação). A diminuição nahemoglobina notada por EPO após 3 semanas é devido à produção deanticorpos neutralizantes anti-EPO que causam aplasia de glóbulos vermelhospura. Em contraste, não foi observada resposta de anticorpo neutralizante paraou peptídeo G ou peptídeo F.
EXEMPLO 4 PEPTÍDEO É PROTETOR DE TECIDO EM TESTES INVITRO
Os peptídeos podem ser prontamente avaliados para proteçãode tecido usando qualquer número de testes in vitro. Por exemplo, proteção deexcitoxicidade pode ser determinada usando morte induzida por cainita demotoneurônios de camundongo. As medulas espinais foram obtidas deembriões de rato Sprague Dawley de 15 dias de idade, como previamentedescrito (Sirene et al, 2001, PNAS 98: 4044, incorporado aqui por referênciaem sua totalidade). O chifre ventral foi tripsinizado e centrifugado através deuma almofada de BSA a 4% durante 10 min a 300 X g. Células(representando cultura de neurônios- glica mista) foram semeadas a umadensidade de 2.000 células / cm em placas de cavidades de 24 mm pré-revestidas com poli-DL ornitina e laminina. Os moto-neurônios foram aindapurificados por imuno-bateia e as células semeadas em baixa densidade(20.000 células / cm ) sobre placas de cavidades de 24 mm com poli- DL-ornitina e laminina, e contendo meio de cultura completo (Neurobasal / L27(2%) ),5 mM L- glutamina, 2% soro de cavalo, 25 mM 2- mercaptoetanol, 25mM glutamato, 1% penicilina e estreptomicina, 2 ng/ ml BDNF). O meio(sem glutamato ) foi re-adicionado às culturas em dias 4 e 6.
A morte das células foi induzida em dia 6 em cultura porincubação durante 48 h com ácido caínico (5 mM para culturas de neurônio-glia mistas, 50 mM para culturas purificadas. Peptídeo D (5 ng/ mL) ouveículo foi adicionado às culturas 72 h antes de indução de morte celular, e otratamento continuou durante 48 h. O meio foi então descartado e as célulasfixadas com 4% (vol/vol) paraformaldeído em PBS durante 30 min,permeabilizados com 0,2% Triton X- 100, bloqueado com 10% (vol/vol) FCSem PBS5 incubado com anticorpos contra neuro-filamentos não fosforilados(SMI -32, 1: 9.000) durante a noite, e visualizados por uso do método avidina-biotina com diaminobenzimida. A viabilidade dos moto-neurônios foiavaliada morfologicamente por contagem de células positivas SMI- 32 atravésde quatro lados da cobertura e coloração para corpos apoptóticos foi feitausando H33258.
O peptídeo D (SEQ ID NO: 30, correspondendo a aminoácidos58- 82 de SEQ ID NO: 1) completamente protegeu os moto-neurônios dedano causado por cainato (figura 5).
Alternativamente, a proteção do tecido obtida pelos peptídeospode ser determinada usando um teste empregando células P19 decamundongo que são de tipo neuronal e morrem via apoptose quando daretirada de soro. A proteção de tecido de peptídeo D (SEQ ID NO: 30) foicomparada com a de EPO usando clone P19 PI19S1801A1 como previamentepublicado (Sirene t al, 2001, PNAS 98: 4044, incorporado aqui por referênciaem sua totalidade). As células foram mantidas não diferenciadas em DMEMsuplementado cm 2 mM L- glutamina, 100 unidades / ml penicilina G; 100mg/ml sulfato de estreptomicina (GIBCO), 10% (vol/vol) FBS (HyClone),contendo 1,2 g/ litro NaHC03 e 10 mM tampão Hepes, a seguir referidocomo meio completo. O meio isento de soro continha os mesmoscomponentes como acima com a deleção de soro e a adição de 5 mg/mol deinsulina, 100 mg/ml de transferrina, 20 nM de progesterona, 100 mMputrescina, 30 nM Na2Se03 (de Sigma). Para as experiências, 50% célulasconfluentes foram pretratadas durante a noite com EPO ou veículo,dissociadas com tripsina, lavadas em meio sem soro, e colocadas em placas defrascos de cultura de tecido de 25 cm a uma densidade final de 104 células /cm2 em meio sem soro sozinho ou com EPO adicionado. A viabilidade dascélulas foi determinada por exclusão de azul triptano e um hemacitômetro.
Peptídeo C, SEQ ID NO: 29 (correspondendo a aminoácidos38-57 de SEQ ID NO: 1) foi pelo menos 10 vezes mais potente em uma baseem peso do que EPO na prevenção de apoptose de células pl9 (figura 6).EXEMPLO 5 - Modelo de oclusâo de artéria cerebral do meio
Ratos machos Cri: CD(SD) BR pesando 250- 280 g foramobtidos de Charles River, Calco, Itália. A cirurgia foi realizada de acordo comos ensinamentos de Briens et al 2000, PNAS USA 97: 10526 -10531(incorporado aqui por referência em sua totalidade). Brevemente, os ratosforam anestesiados com hidrato cloral (400 mg/ kg-peso corporal, i.p.) asartérias carótidas foram visualizadas, e a carótida direita foi ocluída por suassuturas e costurada. Um furo cego adjacente e rostral à órbita direita permitiua visualização da artéria cerebral do meio ("MCA") que foi cauterizada distaià artéria rinal. Para produzir uma penumbra (zona de borda) circundando estalesão de MCA fixa, a artéria carótica contralateral foi ocluída durante 1 husando tração provida por um fórceps fino e então re-aberto.
Os ratos Sprague- Dawley (8 por grupo) foram submetidos aoprotocolo MCAO acima notado. Os ratos foram administrados com PBS,eritropoietina carbamilada (44 μg/ kg) ou peptídeo D (aa 58-82, 4,4 μg/ kg)quando da liberação da oclusão. Adicionalmente, peptídeo D (aa 58-82, 4,4μg/kg) foi administrado em quatro doses a intervalos de 2 h após oclusão emum grupo separado. Para avaliação de dano, ratos foram submetidos a teste decomportamento ou o volume da lesão foi determinado por coloração detetrazólio de seções do cérebro realizadas 24 h após a cirurgia de acordo como protocolo previamente notado.
Figura 7A apresenta um gráfico demonstrando o volume de lesões resultando de protocolo MCAO. O tratamento com peptídeo D (SEQID NO: 30) ou como uma dose simples ou múltiplas, reduziu o volume dalesão resultante da cirurgia MCAO em cerca de dois terços, estatisticamenteequivalente aos efeitos de proteção de tecido da eritropoietina carbamilada.(b) Janela terapêutica de citocinas protetoras de tecidoO protocolo MCAO como acima foi repetido para o presenteexemplo. Após o procedimento de oclusão, PBGS, eritropoietina carbamilada(44 ug/kg, i.v.) ou peptídeo D (SEQ ID NO: 30) (4,4 ug/kg) foramadministrados aos ratos imediatamente após re-circulação ser estabelecida na carótida (isto é, um hora do início da isquemia). Além disso, peptídeo D (SEQID NO: 30) foi administrado em quatro doses (cada 4,4 ug/kg -peso corporal)em 2 h de intervalos após a oclusão. (8 ratos por grupo),(c) Teste comportamental
Um grupo separado de ratos também foi testado em um protocolo comportamental de falta de pés. Os ratos foram testados em umpiso de grade de aço inoxidável elevado 30 cm χ 30 cm com tamanho degrade de 30 mm de acordo com o protocolo de Markgraf et al, 1992, BrainResearch 575: 238 - 246 (incorporado aqui por referência em sua totalidade).Quando colocado na grade, o rato deve tentar se movimentar em torno e ocasionalmente colocar um pé, em vez de sobre a grade, através da aberturada grade ("falta de pé"). O número de faltas de pés foi medido durante umperíodo de 1 min.
Os ratos tratados com peptídeo D (SEQ ID NO: 30) apósreperfusão sofreram de menos faltas de pés do que os tratados com PBS (figura 7B). Não foi observado benefício adicional significante após aadministração de doses múltiplas de peptídeo D (SEQ ID NO: 30). Apesar donúmero médio de faltas ser menor no grupo recebendo doses múltiplas depeptídeo, a diferença observada não foi diferente de modo significante dogrupo recebendo uma dose única.
EXEMPLO 6 - NEUROPATIA DIABÉTICA
Diabetes foi induzido em ratos machos Sprague Dawley(Charles River (Calco, IT) usando estreptozocina administrada em uma doseúnica de 60 mg/ kg ip em ratos em jejum como previamente descrito (Biachiet al, 2004, Proc Natl Acad Sci Usa 101, 823- 828, incorporado aqui porreferência em sua totalidade). Diabete foi confirmado por níveis de glicose nosoro aumentados a mais do que 300 mg por decilitro(mg %) (níveis normaissão <100 mg%). Os animais diabéticos foram então tratados com peptídeo D(SEQ ID NO: 30- 4 ug/kg) ou veículo 5 vezes por semanaintraperitonealmente. Duas semanas após indução do estado diabético, avelocidade de condução o nervo foi determinada usando o nervo caudal.
Como mostrado na figura 8A, os animais diabéticos mostraramuma redução em velocidade de condução de nervo caudal de cerca de 22 m/s(normal) a cerca de 19 m/s. A administração de peptídeo D (SEQ ID NO: 30)foi associada com um aumento na velocidade de condução para cerca de 23m/s.
Adicionalmente, o limiar nociceptivo térmico foi quantificadopor medida do tempo até a retirada da pata em um teste de "placa quente". Alatência de retirada foi definida como o tempo entre a colocação sobre a placaquente e o tempo de retirada e a lambida na pata traseira. Cada animal foitestado em separado por um intervalo de repouso de 30 min. O limiar térmicode pata traseira foi medido 4 semanas após indução de diabete. O peptídeo D(SEQ ID NO: 30) reduziu o tempo de latência gasto sobre a placa quente pelaanimal diabético (figura 8B).EXEMPLO 7 - Proteção de nervo ciático e rim de dano induzido porcisplatina
Cisplatina (CDDT) foi administrada intraperitonealmente aratos machos Sprague Dawley a 2 mg/kg duas vezes por semana durante 5semanas, como descrito em Bianchi et al, 2006, Clin Câncer Res. 12: 2607-2612, incorporado aqui por referência em sua totalidade. Os animais foramseparados em grupos de 6 cada. Durante a administração de CDDT de 5semanas, os animais também receberam ou peptídeo G (SEQ ID NO: 40) a0,4 μg/kg - peso corporal ou PBS i.p. três vezes por semana. Um grupo decontrole recebeu PBS em vez de CDDT. A latência de placa quente foideterminada como descrito no exemplo 6 acima.
Os animais que receberam CDDT e somente PBSdemonstraram um aumento na latência comparada a controles; isto é, CDDTfoi associado com sensibilidade térmica prejudicada. Em contraste, animaisque receberam o peptídeo demonstraram latência em chapa quente normal(figura 9A).
O tratamento com peptídeo também evitou a poliuria induzidapor CDDT (figura 9B). Especificamente, os animais que tinham recebido PBSdemonstraram um aumento significante em produção de urina diária de cercade 30 mL/dia a cerca de 47 mL/dia. Em contraste, animais tendo recebido opeptídeo protetor de tecido não diferem de modo significante de animais decontrole que receberam PBS em vez de CDDT.
EXEMPLO 8 - PROTEÇÃO DE VAZAMENTO VASCULARRETINAL INDUZIDA POR DIABETE
Os efeitos benéficos de peptídeos protetores de tecido emvazamento vascular retinal induzida por hiperglicemia podem serdeterminados usando um modelo de rato de retinopatia diabética. Nestemodelo, azul Evans é usado para determinar o vazamento de vaso sangüíneoem tecidos como descrito por Xu et al, 2001, Invest. Ophtal. Vis. Sei. 42: 789-794 (incorporado aqui por referência em sua totalidade). Azul Evans éfirmemente ligado a albumina e é, assim, retido dentro da circulação salvo seo vazamento da parede do vaso ocorrer, como causado por diabete melito nãocontrolado.
Neste modelo, ratos machos Sprague Dawley em jejumreceberam uma dose única de estreptozotocina (60 mg.kg ip). Dois diasdepois, após verificação do desenvolvimento de diabete melito (glicose nosoro em jejum maior do que 300 mg %, animais foram divididos em gruposde 6 animais cada assim como um grupo de controle que não recebeuestreptozotocina. Os dois grupos diabéticos foram administrados ou compeptídeo D (SEQ ID NO: 30) a 4 μg/kg intraperitonealmente 5 dias porsemana ou PBS no mesmo esquema. Após três semanas de diabete nãocontrolada, animais foram anestesiados e administrados com corante azulEvans (30 mg/kg) intravenosamente, que tinha deixado de circular durante 2h. Usando punção transcardíaca, os animais foram então perfundidos comPBS até o efluente ficar límpido, seguido por 4% paraformaldeído. Os olhosforam então removidos e as retinas cuidadosamente dissecadas do glóbulo. Oteor retinal de azul Evans foi determinado por incubação das retinas emformamida a 80 0C durante 18 h. O sobrenadante foi então removido eguardado para análise e as retinas completamente secadas e pesadas. Aconcentração de azul Evans no sobrenadante foi determinada por umespectrofotômetro e uma curva padrão de azul Evans dissolvida emformamida estabelecida.
Como visto na figura 10, animais que receberam administraçãode peptídeo D (SEQ ID NO: 30) não experimentaram aumento em coranteazul Evans dentro da retina, comparado com controle. Em contraste, animaisdiabéticos que receberam somente PBS demonstraram um aumento em teorde azul Evans retinal, indicando que o vazamento vascular tinha ocorrido.
EXEMPLO 9: PROTEÇÃO DE FALHA RENAL AGUDA
Os peptídeos protetores de tecido são também efetivos naprevenção de dano aos rins no conjunto de isquemia. Os ratos Wistar machosadultos foram anestesiados e uma incisão abdominal feita para visualizarambas as artérias renais. Usando um grampo vascular não traumático, ambasas artérias foram comprimidas durante 60 min, completamente parando ofluxo de sangue renal. Os grampos foram então removidos para restaurar acirculação e peptídeo F (SEQ ID NO: 33) ou peo G (SEQ ID NO: 40) foramadministrados a 290 pmol/kg - peso corporal intravenosamente. Um grupoadicional com isquemia recebeu somente PBS intravenosamente.
Setenta e duas horas após reperfusão, os animais foramanestesiados e sofreram uma fixação - perfiisão usando paraformaldeído. Osanimais fixados foram seccionados sagitalmente em metades e ainda fixadospor imersão em 10% formaldeído a temperatura ambiente durante um dia. Aavaliação histológica dos rins foi realizada de acordo com o protocolo deSharples et al, 2005, J Amerc Soe. Nephrol. 15: 2115 (incorporado aqui porreferência em sua totalidade). Brevemente, após desidratação usando etanolgraduado, peças do rim foram incrustadas em parafina, cortadas em seções de5 micrometros e montadas em lâminas de vidro. As seções nas lâminas foramdesparafinizadas com xileno, contra-coloridas com hexatoxilina e eosina, eexaminadas sob microscópio luminoso. Cem campos foram examinados paracada rim, e um escore de 0 a 3 foi dado para cada perfil tubular: 0, histologianormal; 1 intumescimento de célula tubular, perda de borda da escova, econdensação nuclear com até um terço de perda nuclear,; 2, como para escore1, mas maior do que um terço e menor do que dois terços de perfis tubularesmostrando perda nuclear; e 3, maior do que dois terços de perfil tubularmostrando perda nuclear. O escore histológico para cada rim foi calculado poradição de todos os escores, com um escore máximo de 300.
A administração de ou peptídeo F (SEQ ID NO: 33) oupeptídeo G (SEQ ID NO: 40) foi associada com uma redução significante emescore de dano (p < 0,05) comparado com controles.
EXEMPLO 11 - EFICÁCIA DE PEPTÍDEOS PROTETORES DETECIDO EM MALÁRIA CEREBRAL
Um modelo de roedor de malária cerebral foi desenvolvido deacordo com Kaiser et al, 2006, J. Infect. Dis. 193: 987 - 995 (incorporado aquipor referência em sua totalidade. Os camundongo CBA/J fêmeas, de 7semanas de idade, foram separados em grupos de 20 animais. Cada grupo foiinfectado com Plasmodium berghei Anka (PbA) administradointraperitonealmente como uma dose de IO6 eritrócitos infectados com PbA.Os camundongos receberam ou PBS ou peptídeo F (SEQ ID NO: 33) em dias4, 5 e 6 como injeção intraperitoneal a uma dose de 2,6 µg/kg O estadoclínico e dados do esfregaço de sangue foram reunidos durante oacompanhamento (ponto final D30). A sobrevivência a longo prazocumulativa foi calculada de acordo com o método de Kaplan - Méier e gruposforam comparados com o teste de fileira log. O tempo de sobrevivência foi avariável dependente. Um vapor ρ de < 0,05 foi considerado significante.
Como mostrado na figura 2, todos os camundongos no grupode controle (solução salina) morreram em dia 8. Em contraste, oscamundongos que receberam peptídeo F (SEQ ID NO: 33) demonstraramuma sobrevivência prolongada, diferente de modo significante do grupo decontrole (p < 0,005) usando um teste de faixa log.
EXEMPLO 12 - EFICÁCIA DE PEPTÍDEOS PROTETORES DETECIDO EM MODELO EAE DE MURINOS
Encefalomielite autoimune experimental ("AEA" foi induzidaem camundongos fêmeas C57BL/6 (6-8 semanas de idade) de acordo comSavino et al, 2006, J Neuroimmunol 172: 27-37, incorporado aqui porreferência em sua totalidade. EAE foi induzido por imunização subcutâneanos flancos com um total de 200 μg de MOG356- 55 (Multiple PeptideSystems, San Diego, CA USA) em adjuvante de Freund incompleto (Sigma StLouis, MO USA), suplementado com 8 mg/ml de Mycobacteriumtuberculosis (cepa H37RA, Difco, Detroit MI, USA). Os animais foramalojados em condições sem patógenos específicas, permitindo acesso aalimentos e água ad libitum. Os camundongos receberam 500 ng de toxinapertussina (Sigma) i.v. no momento da imunização e 48 h depois. Os escoresde peso e clínicos foram registrados diariamente (0 = saudável, 1 - raboflácido, 2 = ataxia, e/ou parese de membros de trás, ou reflexo de se endireitarlento, 28 C. 3 = paralisia de membros traseiros e/ou parese de membrosdianteiros, 4 = paraparese de membros dianteiros, 5 = moribundo ou morto).As pelotas de alimentos e a água de beber foram colocados em placas de Petrino piso da gaiola para permitir aos camundongos doentes comer e beber. Opeptídeo E (SEQ ID NO: 31) foi administrado diariamente subcutaneamente auma dose de 4,4 microgramas/ kg- peso corporal, em dia 4 após imunização.
A administração de peptídeo E (SEQ ID NO: 31) reduziu demodo significante tanto o curso do tempo como a severidade de apresentaçãoclinica de AEA nos animais tratados (p < 0,01 (figura 13).
A invenção não é limitada pelo escopo das formas derealização específicas descritas que se destinam como lustrações únicas deaspectos individuais da invenção, e métodos e componentes funcionalmenteequivalentes estão no escopo da invenção. De fato, várias modificações dainvenção, além das mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes para osversados na arte a partir da descrição acima e desenhos anexos. Estasmodificações se destinam a estar no escopo de acordo com a reivindicaçãoanexa.
Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui porreferência em sua totalidade para todos os fins.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Brines, Michael Cerami, Anthony Coleman, Thomas
<120> Peptideos protetores de tecido e usos dos mesmos
<130> 10165-032-228
<150> 60/705,741 <151> 2005-08-05
<150> 60/706,276 <151> 2005-08-08
<150> 60/831,737 <151> 2006-07-18
<160> 58
<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1
<211> 165 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Peptideo de eritropoietina
<4 00> 1
Ma Piro Arg Lsu lie Cys Asp Ser Ara Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10' 15Leu GliI Alá íys Sltt Ala élu Asis 11$ íhr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30Cys Ser Len Asn. Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Méfc Glu TTal Gly dia GlR Ala Val Gla Val Trp 50 55 <50 Gln Gly Leu Ala Lêu Lea Set GliJ Ala vai Leu Arg Gly Gln Ala Leu«5 70 7 S 80Leu vai Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glti fro Leu Gln Leu His Vsl Asp 85 30 SSLys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu LfiU Arg Ala Leu 100 105 110Gly <3in Lys Glu Ala 11® Ser Pro Pro Asp Ala JklLâ Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Lcu Arg Thr IIe Thr filã Asp Tht ?he Arg Lys Leu Ph® Arg Val 130 135 140 fyr Ser Asri Fhê Leu Arg Giy Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Gla Ala145 ISO 155 160
Cys ftrg fhr Gly Asp165
<210> 2<211> 6<212> FHf
<213> Seqüência artificial<220>
<223> aminoácidos 4 4-4 9 de EPO associados com um sitio 1 de ligação dereceptor de alta afinidade<400> 2
Thr Lys Val Asn Phe Tyr 1 5<210> 3 <211> 6 <212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> aminoácidos 14 6-151 de EPO associados com um sitio 1 de ligação dereceptor de alta afinidade<400> 3
Ser Asn Phe Leu Arg Gyl 5
<210> 4 <211> 5 <212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aminoácidos 11-15 de EPO interagindo com um sitio 2 de ligação dereceptor de baixa afinidade<400> 4
Val Leu Glu Arg Tyr1 5
<210> 5<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Aminoácidos 100-104 de EPO interagindo com um sitio 2 de ligação dereceptor de baixa afinidade<400> 5
Ser Gly Leu Arg Ser1 5
<210> 6<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Polipeptideos isolados compreendendo um motivo A estrutural de
aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,4
<223> Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 2,3
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<400> 6Xaa Xaa Xaa Xaa1
<210> 7<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,5
<223> Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
<222> 2 , 4
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa = Qualquer aminoácido<400> 7
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 8<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,6
<223> Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 2,5<223> Xaa = Qualquer aminoácido negativamente carregado (igual oudiferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3, 4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<400> 8
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 9
<211> 7
<212>
PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 1, 7
<223> Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 2,6
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou
diferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3,4,5
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<400> 9
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 10<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,8
<223> Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
<222> 2 , 7
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou
diferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3,4,5,6
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<400> 10
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 11<211> 9<212> PRT
<213> Artificial Seguence<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220><221> VARIANTE
<222> 1 , 9
<223> Xaa = qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
<222> 2 , 8
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual oudiferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3,4,5,6,7
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<400> 11
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 12<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivoestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE
<222> 2 , 3
<223> Xaa — Qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<4 00> 12
Xaa Xaa Xaa Xaa1
<210> 13<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Variante de polipeptideos de EPO isoladoscompreendendo motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE
<222> 2,4
<223> Xaa — Qualquer aminoácido negativamente carregado<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa = Qualquer aminoácido<220>
<221> VARIANTE<222> 5
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<400> 13
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 14<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE polipeptídeos isolados compreendendo motivo A estrutural deaminoácidos<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE
<2 2 2 > 2,5
<223> Xaa - Qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 3,4
<223> Xaa - Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 6
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<4 00> 14
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 15<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptídeos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 2 , 6
<223> Xaa - Qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 3,4,5
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 7
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<4 00> 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 16<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptídeos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE<222> 1<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220><221> VARIANTE<222> 2, 7<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220><221> VARIANTE<222> 3,4,5,6<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 8
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo A
estrutural de aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE
<222> 2, 8
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
<222> 3,4,5,6,7
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)220>
<221> VARIANTE<222> 9
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<400> 17
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 18<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo A
estrutural de aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<220>
<221> VARIANTE
<222> 2,3
<223> Xaa — Qualquer aminoácidos negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 4
<223> Xaa — Qualquer aminoácido hidrofóbico
<400> 18
Xaa Xaa Xaa Xaa<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos de EPO com'reendendo motivo A estrutural deaminpácidos
<220>
<221> VARIANTE
<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<220>
<221> VARIANTE
<222> 2,4
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3
<223> Xaa - Qualquer aminoácido
<220>
<221> VARIANTE
<222> 5
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico
<400> 19
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE
<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar
<220>
<221> VARIANTE
<222> 2, 5
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual oudiferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 3,4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)
<220>
<221> VARIANTE
<222> 6
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico
<400> 20
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE<222> 1<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<220><221> VARIANTE<222> 2,6
<223> Xaa — Qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
<222 3,4,5
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 7
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<400> 21
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 22<211> 8<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo A
estrutural de aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 2,7
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 3,4,5,6
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 8
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<400> 22
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivoestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE<222> 1
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<220>
<221> VARIANTE
< 2 2 2 > 2,8
<223> Xaa = qualquer aminoácido negativamente carregado (igual ou
diferente)
<220>
<221> VARIANTE< 2 2 2 > 3,4,5,6,7
<223> Xaa = Qualquer aminoácido (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 9
<223> Xaa - Qualquer aminoácido hidrofóbico<400> 23
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo A
estrutural de aminoácidos
<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,4
<223> Xaa - Qualquer aminoácido hidrofóbico (igual ou diferente)<220>
<221> VARIANTE<222> 2
<223> Xaa = Qualquer aminoácido negativamente carregado<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa = Qualquer aminoácido positivamente carregado<400> 24Xaa Xaa Xaa Xaa1
<210> 25<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,5
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE<222> 2
<223> Xaa = Qualquer aminoácido negativamente carregado<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa Qualquer aminoácido polar<220>
<221> VARIANTE<222> 4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido positivamente carregado<400> 25
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 26<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo A
estrutural de aminoácidos
<220><221> VARIANTE
<222> 1,4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE<222> 2
<223> Xaa = Qualquer aminoácido positivamente carregado<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa = Qualquer aminoácido negativamente carregado<400> 26Xaa Xaa Xaa Xaa1
<210> 27<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> VARIANTE de polipeptideos isolados de EPO compreendendo um motivo Aestrutural de aminoácidos<220>
<221> VARIANTE
<222> 1,5
<223> Xaa - Qualquer aminoácido hidrofóbico<220>
<221> VARIANTE<222> 2
<223> Xaa = Qualquer aminoácido positivamente carregado<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa = Qualquer aminoácido polar<220>
<221> VARIANTE<222> 4
<223> Xaa = Qualquer aminoácido negativamente carregado<400> 27
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210> 28<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Hélice anfifática de polipetideo pancreático<400> 28
Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro1 5 10
<210> 29 <211> 20 <212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo C - laço AB end porção N-terminal de hélice B correspondendo aaminoácidos 38-57 de EPO<400> 29
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg1 5 10 15
Met Glu Val Gly20
<210> 30<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<2 2 3> Peptideo D - a porção C-terminal de hélice correspondendo aaminoácidos 58-82 de EPO<400> 30
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
1 5 10 15
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val
20 25
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo E - uma porção do laço AB consistindo de um pequenolaço de cisteina e uma folha beta-dobrada correspondendo aosaminoácidos 28-47 de EPO<40D> 31
Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp1 5 10 15
Thr Lys Val Asn20
<210> 32 <211> 23 <212> PRT<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo A - consiste da porção N-terminal de hélice Acorrespondendo aos amino acids 1-23 de EPO<400> 32
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu20
<210> 33<211> 16<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo F - consiste de aminoácidos 14-19 de EPO<400> 33
Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys1 5 10 15
<210> 34<211> 14<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo H - consiste de aminoácidos 24-37 de EPO<400> 34
Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
1 5 10
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> GM-CSF helix A fragment<400> 35
Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220><223> Fragmento<400> 36Leu Ser Lys Leu1
Leu Arg Asp Ser His Val Leu Hisde hélice A de TPO
5
10
<210> 37<211> 16<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Fragmento de hélice A de CNTF<400> 37
Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His1 5 10 15
<210> 38<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> LIF helix B fragment<400> 38
Giy Thr Glu Lys Ala Lys Leu Vai Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr1 5 10 15
Leu
<210> 39<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Fragmento de hélice A de Interleucina 3 (IL-3)<400> 39
Ser Ile Met Ile Asp Glu Ile Ile His His Leu Lys Arg Pro Pro Asn1 5 10 15
<213> Seqüência artificial<2 2 0 >
<223> Peptideo G - todos os aminoácidos apresentando no exterior de héliceB de EPO<400> 40
Gln Glu Gln Leu Glu Arg Ala Leu Asn Ser Ser1 5 10
<210> 41<211> 23<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo J - um peptideo de quimera de peptideo G ligado a hélice depolipeptideo pancreático<400> 41
Gln Glu Gln Leu Glu Arg Ala Leu Asn Ser Ser Leu Arg Arg Tyr Ile1 5 10 15
Asn Met Leu Thr Arg Thr Arg20
<210> 42<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Folha beta-dobrada encontrada dentro do laço AB de EPO<400> 42
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile
Pro Leu<210> 40<211> 11<212> PRT<210> 43<211> 18<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo I - um peptídeo de quimera ligando os aminoácidosapresentando exterior de hélice B para a folha beta-dobrada encontradadentro do laço AB do EPO<400> 43
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Gln Glu Gln Leu Glu Arg Ala Leu Asn
15 10 15
Ser Ser
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Porção terminal de hélice C correspondendo a aminoácidos 111, 112,113, 116 e 118 de EPO<400> 44
Ala Leu Gly Lys Ala
1 5
<210> 45 <211> 22 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Laço CD parcial correspondendo a aminoácidos 112- 133 de EPO<400> 45
Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala15 10 15
Ala Pro Leu Arg Thr Ile20
<210> 46<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Fragmento de aminoácido do peptideo F<400> 46Glu Ala Lys Glu1
<210> 47<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Peptideo H - Consiste dos aminoácidos de EPO 61, 72, 75, 7 6,7 7
<400> 47
Ser Glu Leu Arg Gly Gln1 5
<210> 48<211> 12<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Calcitonina<400> 48
Ala Leu Ser Ile Leu Val Leu Leu Gln Ala Gly Ser15 10
<210> 49<211> 11<212> PRT=
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Hormônio de liberação de corticotrofina<400> 49
Vai Ala Leu Leu Pro Cys Pro Pro Cys Arg Ala1 5 10
<210> 50<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Beta Endorfina<400> 50
Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly1 5 10
<210> 51<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Glucagon<400> 51
Gly Ser Trp Gln Arg Ser Leu Gln Asp Thr Glu1 5 10
<210> 52<211> 10<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Secretina<400> 52
Gly Gly Ser Ala Ala Arg Pro Ala Pro Pro1 5 10
<210> 53<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220> <223> VIP<400> 53
Asn Ala Leu Ala Glu Asn Asp Thr Pro Tyr Tyr1 5 10
<210> 54<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> NP-Y<400> 54
Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys Pro1 5 10
<210> 55<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> GNRH<400> 55
Gly Cys Ser Ser Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu1 5 10
<210> 56<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Hormônio da paratiróide<400> 56
Val Met Ile Val Met Leu Ala Ile Cys Phe Leu1 5 10
<210> 57<211> 11<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> CGRP<400> 57
Leu Ala Leu Ser Ile Leu Val Leu Tyr Gln Ala1 5 10
<210> 58<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Um motivo localizado proximal para o domínio de transmembranaproteína do receptor de eritropoietina ("EPOR")<220>
<221> VARIANTE<222> 3
<223> Xaa = qualquer aminoácido<400> 58
Trp Ser Xaa Trp Ser1 5

Claims (57)

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de consistir deuma seqüência de não mais que 30 aminoácidos e compreendendo o motivode aminoácido:(a) H1-N1(X)n-N2-H2, em que n é 0-5;(b) H1-N1(X)n-N2-L1, em que n é 0-5; ou(c) L1N1(X)n-N2-H1, em que n é 0-5:e em que Hi e H2 são aminoácidos hidrofóbicos, N1 e N2 sãoaminoácidos negativamente carregados, X é qualquer aminoácido, e L1 é umaminoácido polar; e em que referido polipeptídeo tem atividade protetoracelular em uma célula, tecido ou órgão responsivo.
2. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de consistir deuma seqüência de não mais que 30 aminoácidos e compreendendo o motivode aminoácido:(a) H1N1(L)n-P1-H2, em que n é 0-1; ou(b) H1P1-(L)n-N1-H2, em que n é 0-1 ;e em que H1 e H2 são aminoácidos hidrofóbicos, N1 é umaminoácido negativamente carregado, L1 é um aminoácido polar, e P1 é umaminoácido positivamente carregado; e em que referido polipeptídeo tematividade protetora celular em uma célula, tecido ou órgão responsivo.
3. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de compreender:(i) uma seqüência de aminoácido tendo menos do que 90% deidentidade de seqüência com qualquer porção de SEQ ID NO:l tendo omesmo número de resíduos de aminoácidos como referido polipeptídeo; e(ii) o motivo de aminoácido:(a) H1N1(X)n-N2-H2, em que n é 0-5 ;(b) H1N1(X)n-N2-L1, em que n é 0-5; ou(c) L1N1(X)n-N2-H1, em que n é 0-5 ;e em que Hi e H2 são aminoácidos hidrofóbicos, N1 e N2 sãoaminoácidos negativamente carregados, X é qualquer aminoácido, e L1 é umaminoácido polar; e em que referido polipeptídeo tem atividade protetoracelular em uma célula, tecido ou órgão responsivo.
4. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato decompreender:(i) uma seqüência de aminoácido tendo menos do que 90% deidentidade de seqüência com qualquer porção de SEQ ID NO:l tendo omesmo número de resíduos de aminoácidos como referido polipeptídeo; e(ii) o motivo de aminoácido:(a) Hi-Nr(L)n-Pi-H2, em que n é 0-1 ; ou(b) Hi-Pr(L)n-N1-H2, em que „ é 0-1 ;e em que H1 e H2 são aminoácidos hidrofóbicos, N1 é umaminoácido negativamente carregado, L1 é um aminoácido polar, e P1 é umaminoácido positivamente carregado;e em que referido polipeptídeo tem atividade protetora celularem uma célula, tecido ou órgão responsivo.
5. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 3,caracterizado pelo fato de que a distância entre N1 e N2 como um resultado daestrutura terciária de referido polipeptídeo está entre cerca de 3 Â a cerca de 5Â.
6. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que referida distância está entre cerca de 4 Â acerca de 5 Â.
7. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que referida distância está entre cerca de 4,4 Â acerca de 4,8 A.
8. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2 ou 4,caracterizado pelo fato de que a distância entre Ni e P2 como um resultado daestrutura terciária de referido polipeptídeo está entre cerca de 3 Â a cerca de 5Á.
9. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que referida distância está entre cerca de 4 Â acerca de 5 Â.
10. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que referida distância está entre cerca de 4,4 Â acerca de 4,8 Â.
11. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de consistirde uma seqüência de não mais que 30 aminoácidos e compreendendo omotivo de aminoácido:(a) H1N1N2H2;(b) H1N1N2L1; ou(c) L1N1N2H1,que é formado como um resultado da estrutura terciária dereferido polipeptídeo de modo que a distância entre os carbonil carbonos deN1 e N2 é cerca de 3 Â a cerca de 5 Â, em que H1 e H2 são aminoácidoshidrofóbicos, N1 e N2 são aminoácidos negativamente carregados, e L1 é umaminoácido polar; e em que referido polipeptídeo tem atividade protetoracelular em uma célula, tecido ou órgão responsivo.
12. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de consistirde uma seqüência de não mais que 30 aminoácidos e compreendendo omotivo de aminoácido:(a) H1Ni(L)nP1H2, em que „ é 0-1; ou(b) H1P1(L)nN1H2, em que n é 0-1;que é formado como um resultado da estrutura terciária dereferido polipeptídeo de modo que a distância entre os carbonil carbonos deN1 e P2 é cerca de 3 Â a cerca de 5 Â, em que H1 e H2 são aminoácidoshidrofóbicos, N1 é um aminoácido negativamente carregado, L1 é umaminoácido polar, e P1 é um aminoácido positivamente carregado; e em quereferido polipeptídeo tem atividade protetora celular em uma célula, tecido ouórgão responsivo.
13. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato decompreender:(i) uma seqüência de aminoácido tendo menos do que 90% deidentidade de seqüência com qualquer porção de SEQ ID NO: 1 tendo omesmo número de resíduos de aminoácidos como referido polipeptídeo; e(ii) o motivo de aminoácido:(a) H1N1N2H2; 5 Â(b) H1N1N2L1; ou(c) L1N1N2H1,que é formado como um resultado da estrutura terciária dereferido polipeptídeo de modo que a distância entre os carbonil carbonos deN1 e N2 é cerca de 3 Â a cerca de 5 Â, em que H1 e H2 são aminoácidoshidrofóbicos, N1 e N2 são aminoácidos negativamente carregados, e L1 é umaminoácido polar; e em que referido polipeptídeo tem atividade protetoracelular em uma célula, tecido ou órgão responsivo.
14. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato decompreender:(i) uma seqüência de aminoácido tendo menos do que 90% deidentidade de seqüência com qualquer porção de SEQ ID NO:l tendo omesmo número de resíduos de aminoácidos como referido polipeptídeo; e(ii) o motivo de aminoácido: (a) H1N1(L)nP1H2, em que „ é 0-1 ; ou(b) H1P1(L)nN1H2, em que „ é 0-1;que é formado como um resultado da estrutura terciária dereferido polipeptídeo de modo que a distância entre os carbonil carbonos deN1 e P2 está entre cerca de 3 Â e cerca de 5 Â, em que H1 e H2 sãoaminoácidos hidrofóbicos, Nj é um aminoácido negativamente carregado, L1é um aminoácido polar, e Pi é um aminoácido positivamente carregado; e emque referido polipeptídeo tem atividade protetora celular em uma célula,tecido ou órgão responsivo.
15. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 3, e 5- 7, caracterizado pelo fato de que referido motivo deaminoácido é (a) e em que Hi e H2 são o mesmo aminoácido hidrofóbico.
16. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 11 ou 13, caracterizado pelo fato de que referido motivo de aminoácido é (a) e emque Hi e H2 são o mesmo aminoácido hidrofóbico.
17. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 3, e 5- 7, caracterizado pelo fato de que referido motivo deaminoácido é (a) e em que Hi e H2 são aminoácidos hidrofóbicos diferentes.
18. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 11 ou 15 13, caracterizado pelo fato de que referido motivo de aminoácido é (a) e emque H1 e H2 são aminoácidos hidrofóbicos diferentes.
19. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2, 4, e 8-10, caracterizado pelo fato de que referido motivo deaminoácido é (a) ou (b) e em que Hi e H2 são o mesmo aminoácidohidrofóbico.
20. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 12 ou 14, caracterizado pelo fato de que referido motivo de aminoácido é (a) ou (b)e em que Hi e H2 são o mesmo aminoácido hidrofóbico.
21. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2, 4, e 8-10, caracterizado pelo fato de que referido motivo deaminoácido é (a) ou (b) e em que H1 e H2 são aminoácidos hidrofóbicosdiferentes.
22. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 12 ou 14, caracterizado pelo fato de que referido motivo de aminoácido é (a) ou (b)e em que Hj e H2 são aminoácidos hidrofóbicos diferentes.
23. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 3, e 5-7, caracterizado pelo fato de que referido motivo deaminoácido é (a), (b), ou (c) e em que Ni e N2 são o mesmo aminoácidonegativamente carregado.
24. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 11 ou-13, caracterizado pelo fato de que referido motivo de aminoácido é (a), (b), ou(c) e em que N1 e N2 são o mesmo aminoácido negativamente carregado.
25. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 3, e 5-7, caracterizado pelo fato de que referido motivo deaminoácido é (a), (b), ou (c) e em que Ni e N2 são aminoácidos negativamentecarregados diferentes.
26. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 11 ou-13, caracterizado pelo fato de que referido motivo de aminoácido é (a), (b), ou(c) e em que Ni e N2 são aminoácidos negativamente carregados diferentes.
27. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-26, caracterizado pelo fato de que referido peptídeo éderivado de uma citocina tipo 1.
28. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a citocina tipo 1 é um fator estimulante decolônia de granulócitos - macrófagos, interleucina-3, Trombopoietina, fatorneurotrófico ciliar ou fator inibitório de leucemia.
29. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeoainda compreende pelo menos um outro dos seguintes motivos deaminoácidos:a) HrNr(X)n-N2-H2, em que n é 0-5;(b) HrN1-(X)n-N2-L1, em que n é 0-5;(c) L1-N1-(X)n-N2-H1, em que n é 0-5(d) H1-N1-(L)n-P1-H2, em que n é 0-1;(e) H1-P1-(L)n-N1-H2, em que n é 0-1(f) H1N1N2H2;(g) H1N1N2L1;(h) L1N1N2H1(i) H1N1(L)nP1H2, em que n é 0-1; ouj) H1P1(L)nN1H2, em que n é 0-1;em que motivo (f), (g), ou (h) é formado como um resultado daestrutura terciária de referido polipeptídeo de modo que a distância entre oscarbonil carbonos de N1 e N2 é cerca de 3 Â a cerca de 5 Â; em que o motivo(i) ou (j) é formado como um resultado da estrutura terciária de referidopolipeptídeo de modo que a distância entre os carbonil carbonos de N1 e P2 écerca de 3 Â a cerca de 5 Â; e em que Hi e H2 são aminoácidos hidrofóbicos,N1 e N2 são aminoácidos negativamente carregados, X é qualqueraminoácido, L1 é um aminoácido polar, e Pj é um aminoácido positivamentecarregado.
30. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que pelo menos dois dos referidos motivos deaminoácidos são diferentes.
31. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -29, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo épeptídeo quimérico, ainda compreendendo uma hélíce de peptídeo anfipática.
32. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que referida hélice de peptídeo anfipáticacompreende a seqüência de aminoácido ALSILVLLQAGS (SEQ ID NO:48);VALLPCPPCRA (SEQ ID NO:49); NAIIKNAYKKG (SEQ ID N0:50);GSWQRSLQDTE (SEQ ID NO:51); GGSAARPAPP (SEQ ID NO:52);NALAENDTPYY (SEQ ID NO:53); GALAEAYPSKP (SEQ ID NO.54);GCSSQHWSYGL (SEQ ID NO:55); VMIVMLAICFL (SEQ ID NO:56);LRRYINMLTRP (SEQ ID NO:28); ou LALSILVLYQA (SEQ ID NO:57).
33. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-30, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo nãoaumenta a hemoglobina no recipiente
34. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-31, caracterizado pelo fato de que a atividade protetoracelular é de proteção, manutenção, melhora ou restauração da função e/ouviabilidade de referidos célula, tecido ou órgão.
35. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo tematividade protetora celular em células ou tecidos neuronais, osso, olho,adiposo, conectivo, cabelo, dentes, mucosal, pâncreas, endócrino, orelha,epitelial, pele, músculo, coração, pulmão, fígado, rim, intestino, adrenal,capilar, endotelial, testículos, ovário, ou endometrial.
36. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo tematividade protetora celular em uma célula-tronco.
37. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicaçãoqualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizado pelo fato de que referidopolipeptídeo tem atividade protetora celular em tecido excitável.
38. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que referido tecido excitável é tecido do sistemanervoso central, tecido do sistema nervoso periférico, tecido cardíaco outecido retinal.
39. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -36, caracterizado pelo fato de que referido peptídeo é capazde atravessar a barreira de célula endotelial.
40. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a barreira de célula endotelial compreende abarreira sangue-cérebro, a barreira sangue-olho, a barreira sangue-testículos,barreira sangue-ovário, barreira sangue-nervos ou sangue- medula espinhal.
41. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender o polipeptídeo isolado como definido em qualquer dasreivindicações 1-38 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação39, caracterizada pelo fato de que referida composição é formulada paraadministração oral, intranasal, ocular, inalacional, transdérmica, retal,sublingual ou parenteral.
43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação39, caracterizada pelo fato de que referida composição é formulada como umasolução de perfundido.
44. Método para proteger, manter ou melhorar a viabilidade deuma célula, tecido ou órgão responsivos isolados do corpo do mamífero,caracterizado pelo fato de compreender a exposição da referida célula, tecidoou órgão a uma composição farmacêutica compreendendo expor referidacélula, tecido ou órgão à composição farmacêutica como definida nareivindicação 39, 40, ou 41.
45. Uso de um polipeptídeo isolado como definido emqualquer uma das reivindicações 1-38, caracterizado pelo fato de ser para apreparação de uma composição farmacêutica para a proteção contra e/ou aprevenção de um dano ao tecido, para a restauração de, ou para orejuvenescimento de tecido e/ou função de tecido em um indivíduo emnecessidade do mesmo.
46. Uso de um polipeptídeo isolado como definido emqualquer uma das reivindicações 1-38, caracterizado pelo fato de ser para apreparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, tratamentoterapêutico ou tratamento profilático em um indivíduo em necessidade domesmo de uma doença cardiovascular, doença cardiopulmonar, doençarespiratória, doença do rim, doença do sistema urinário, doença do sistemareprodutivo, doença dos ossos, doença da pele, doença gastrointestinal,anormalidade endócrina, anormalidade metabólica, disfunção cognitiva, ouuma doença ou distúrbios do sistema nervoso central ou periférico.
47. Uso de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é um mamífero.
48. Uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelofato de que o mamífero é um humano.
49. Método para facilitar a transcitose de uma moléculaatravés de uma barreira de célula endotelial em um indivíduo em necessidadedo mesmo, caracterizado pelo fato de compreender a administração aoreferido indivíduo de uma composição compreendendo referida molécula emassociação com um peptídeo isolado como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-38.
50. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que referida associação é uma ligação covalente lábil, umaligação covalente estável, ou uma associação não covalente com um sítio deligação para referida molécula.
51. Acido nucleico isolado, caracterizado pelo fato decompreender a seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo isolado comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-38.
52. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o ácidonucleico como definido em reivindicação 49.
53. Vetor de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelofato de ser um vetor de expressão.
54. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de conter o vetorde expressão da reivindicação 51.
55. Método para produzir recombinantemente o polipeptídeoisolado como definido em qualquer uma das reivindicações 1-38,caracterizado pelo fato de compreender i) cultivar em um meio a célulahospedeira da reivindicação 52, sob condições apropriadas para a expressãode referido peptídeo, e ii) recuperar e isolar referido peptídeo do referidomeio.
56. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo compreender a seqüênciade aminoácido de peptídeo A (APPRLICDSRVLERYLLEAKEAE, SEQ IDNO:32), peptídeo C (NITVPDTKVNFYAWKRMEVG, SEQ ID NO:29),peptídeo D (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV, SEQ ID N0:30),peptídeo E (GCAEHCSLNENITVPDTKVN, SEQ ID NO:31), peptídeo F(RYLLUNITTGC, SEQ ID NO:33), peptídeo G (QEQLERALNSS, SEQ IDN0:40), peptídeo I (CSLNENIQEQLERALNSS, SEQ ID NO:43), peptídeo J(QEQLERALNS SLRRYINMLTRTR, SEQ ID NO:41), peptídeo K(WEHVNAIQEARRLL, SEQ ID NO:35), ou peptídeo L(KIRSDLTALTESYVKH, SEQ ID NO:37).
57. Polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-38, caracterizado pelo fato de que referida pelo menos umaatividade protetora celular é neuroproteção, cuja atividade é avaliada in vitropor um método compreendendo:(a) contatar uma cultura de teste de neurônios hipocampaiscom N-metil-D- aspartato e referido peptídeo, e(b) determinar a viabilidade celular a 48 horas após referidocontato,de modo que se a viabilidade celular determinada na etapa (b)for maior do que a de uma cultura de controle na ausência de referidopeptídeo, o peptídeo possui atividade protetora celular.
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