PL185040B1

PL185040B1 - Peptyd wiążący się z receptorami erytropoetyny, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd i jego zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego

Info

Publication number: PL185040B1
Application number: PL96323858A
Authority: PL
Inventors: Wrighton┴Nicholas┴C.; Dower┴William┴J.; Chang┴Ray┴S.; Kashyap┴Arun┴K.; Jolliffe┴Linda┴K.; Johnson┴Dana; Mulcahy┴Linda
Original assignee: Affymax Tech Nv; Ortho Pharma Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2003-02-28
Also published as: NO975729L; JPH11507367A; ATE254138T1; JP2007277264A; EP0886648B1; EP1510524A2; KR19990022656A; PL323858A1; JP2009280616A; EP1510524A3; DE69630708D1; ES2210374T3; CZ391097A3; TR199701557T2; CN1192748A; CA2223833C; IL122417A0; CA2223833A1; BR9609006A; HUP9901069A2

Abstract

1. Peptyd wiazacy sie z receptorami erytropoetyny o dlugosci od 10 do 40 reszt aminokwa- sowych i zawierajacy nastepujaca sekwencje aminokwasów X3 X4 X5 GPX6 TWX7 X8 , gdzie kazdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; X6 jest niezaleznie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X4 jest R, H, L lub W; X5 jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; a X8 jest C. 12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze zawiera peptyd o dlugosci od 10 do 40 reszt aminokwasowych, wiazacy sie z receptorami erytropoetyny i zawierajacy nastepujaca sekwencje aminokwasów X3 X4 X5 GPX6 TWX7 X8 , w której kazdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; X6 jest niezaleznie wybranym, jednym z 20 genetycz- nie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X4 jest R, H, L lub W; X5 jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; a X8 jest C, w polaczeniu z akceptowanym farmaceutycznie nosnikiem. 13. Zastosowanie peptydu o dlugosci od 10 do 40 reszt aminokwasowych, wiazacego sie z receptorami erytropoetyny i zawierajacego nastepujaca sekwencje aminokwasów X3 X4 X5 GPX6 TWX7 X8 , przy czym kazdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; X6 jest niezaleznie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X4 jest R, H. L lub W: X5 jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; a X8 jest C, do wytwarzania srodka leczniczego przeznaczonego do leczenia pacjenta z zabu- rzeniem charakteryzujacym sie niedoborem erytropoety lub mala, jak równiez nieprawidlowa populacja czerwonych krwinek. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest peptyd o długości od 10 do 40 reszt aminokwasowych, wiążący się z receptorami erytropoetyny (EPO-R), kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd i jego zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego. Tak więc dotyczy on związków, które wiążą i aktywują receptor erytropoetyny albo działają jako agoniści EPO. Wynalazek ma zastosowanie w dziedzinie biochemii i chemii medycznej, a w szczególności w leczeniu chorób u ludzi.

Erytropoetyna (EPO) jest hormonem glikoproteinowym zbudowanym z 165 aminokwasów, 4 glikozylowanych miejsc na aminokwasach w pozycjach 24, 38, 83 i 126 i masie cząsteczkowej około 34 000. Początkowo jest produkowana jako białko prekursorowe z peptydem sygnałowym złozonym z 23 aminokwasów. EPO może występować w trzech formach: α. β i asialo. Formy α i β różnią się nieco komponentami węglowodanowymi, ale

185 040 mają tę samą siłę działania, aktywność biologiczną i masę cząsteczkową. Forma asialo jest formą α lub β pozbawioną końcowego węglowodanu (kwasu sialowego). Sekwencje DNA kodujące EPO są znane. (Patrz Lin, patent USA Nr 4,703, 008 (1987)).

EPO stymuluje podział mitotyczny i różnicowanie komórek prekursorowych erytrocytów i przez to warunkuje produkcję erytrocytów. Jest ona produkowana w nerkach w warunkach niedoboru tlenu (hipoksji). Podczas różnicowania komórek prekursorowych erytrocytów, indukowanego przez EPO, występuje indukcja syntezy globin i wzrost syntezy kompleksów hemu i liczby receptorów ferrytyny. Umożliwia to komórkom większy pobór żelaza i syntezę funkcjonalnej hemoglobiny. Hemoglobina w dojrzałych erytrocytach wiąże tlen. Dlatego też erytrocyty odgrywają kluczową rolę w dostarczaniu tlenu organizmowi. Złożone, opisane procesy są zapoczątkowane interakcją EPO z odpowiednim receptorem na powierzchni komórki prekursorowej erytrocytu. (Patrz np. Graber i Krantz (1978) Ann. Rev. Med. 29:51-66.)

EPO jest obecne w osoczu w bardzo niskim stężeniu gdy organizm jest zdrowy, a tkanki otrzymują wystarczającą ilość tlenu od istniejącej liczby erytrocytów. To prawidłowo niskie stężenie jest wystarczające do wymiany erytrocytów traconych na skutek ich starzenia.

Ilość EPO w krążeniu wzrasta w warunkach hipoksji, kiedy transport tlenu przez czerwone krwinki jest zmniejszony. Hipoksja może być spowodowana utratą dużej ilości krwi podczas krwawienia, niszczenia czerwonych krwinek na skutek nadmiernego napromieniowania, zmniejszenia ilości dostarczanego tlenu na dużych wysokościach lub na skutek długotrwałej utraty przytomności, lub różnych form anemii. W odpowiedzi na stres tkanek poddanych hipoksji, EPO zwiększa produkcję czerwonych krwinek poprzez stymulację proliferacji komórek prekursorowych erytrocytów. Kiedy liczba czerwonych krwinek w krążeniu jest wyższa niż potrzebna do normalnych wymagań tkanek, poziom EPO w krążeniu maleje.

Ponieważ EPO jest niezbędna w procesie tworzenia czerwonych krwinek, hormon ten może być przydatny zarówno w diagnostyce jak i w leczeniu chorób krwi, charakteryzujących się niską lub nieprawidłową produkcją czerwonych krwinek. Współczesne badania dają podstawę dla przewidywania skuteczności EPO w terapii w przypadkach chorób, dolegliwości i stanów zaburzeń hematologicznych obejmujących: beta-talasemię (patrz Vedovato (1984) Acta. Hematol. 71: 211-213); mukowiscydozę (patrz Vichinski et al. (1984) J. Pediatrie 105: 15-21); zaburzenia okresu ciąży i menstruacji (patrz Cotes et al. (193) Brit. J. Ostet. Gyneacol. 90: 304-311); wczesne anemie u wcześniaków (patrz Haga et al. (1983) Acta. Pediatr. Scand. 72: 827-831); uszkodzenia szpiku kostnego (patrz Claus-Walker et al. (1984) Arch. Phys. Med. Rehabil. 65: 370-374); loty kosmiczne (patrz Dunn et al. (1984) Eur. J. Appl. Physiol. 52: 178-182); ostrą utratę krwi (patrz Miller et al. (1982) Brit. J. Haematol. 52: 545-590); starzenie się (patrz Udupa et al. (1984) J. Lab. Clin. Med. 103: 574-580 i 581-588 i Lipschitz et al. (1983) Blood 63: 502-509); różne choroby nowotworowe z towarzyszącymi zaburzeniami erytropoezy (patrz Dainiak et al. (1983) Cancer 5: 1101-1106 i Schwartz et al. (1983) Otolaryngol. 109: 269-272); i niewydolność nerek (patrz Eschbach et al. (1987) N. Eng. J. Med. 316: 73-78).

Oczyszczona, homogeniczna EPO jest opisana. (Patrz Hewick, patent USA Nr 4,677,195). Sekwencja DNA kodująca EPO została zidentyfikowana, sklonowana i zastosowana do ekspresji syntetycznych polipeptydów o takich samych właściwościach biochemicznych i immunologicznych. Wyprodukowano również rekombinowaną cząsteczkę EPO z oligosacharydami identycznymi jak występujące w naturalnym materiale. (Patrz Sasaki et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059-12076). Opisano zastosowanie peptydowych fragmentów erytropoetyny do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciwko erytropoetynie. Patrz Fibi et al., patent USA Nr 5,106,954.

Pomimo dostępności oczyszczonego, rekombinowanego EPO niewiele wiadomo o mechanizmie indukcji proliferacji i różnicowania erytroblastów przez EPO. Specyficzne interakcje EPO z prekursorami niedojrzałych czerwonych krwinek, płytek, megakariocytów pozostają nieopisane. Zachodzą one, przynajmniej częściowo, na niewielkiej liczbie cząsteczek powierzchniowych receptorów EPO na prawidłowym erytroblaście i na komórkach linii erytroleukemicznej. Patrz Krantz i Goldwasser (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81;

185 040

7574-7578; Branch et al. (1987) Blood 69: 1782-1785; Mayeux et al. (1987) FEBS Letters 211: 229-233; Mufson i Gesner (1987) Blood 69: 1485-1490; Sakaguchi et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 7-12; Sawyer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3690-3694; Sawyer et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 5554-5562; i Todokoro et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4126-4130.

Krzyżowe kompleksy pomiędzy znakowaną jodem radioaktywnym EPO i powierzchniowymi proteinami komórki sugerują, że te ostatnie zawierają dwa polipeptydy o przybliżonej masie cząsteczkowej wynoszącej odpowiednio 85 000 i 100 000 daltonów. Niedawno dwa krzyżowo połączone kompleksy poddano działaniu V8 proteazy i odkryto, że mają identyczne fragmenty peptydowe, co sugeruje, że te dwa wiążące EPO polipeptydy mogą być produktami tych samych lub bardzo podobnych genów. Patrz Sawyer et al. (1988) supra. Jednakże większość badań poświęconych receptorom powierzchniowym komórki ujawniło jeden rodzaj miejsc wiążących, średnio od 300 do 600 na powierzchni komórki., z Kd w przybliżeniu 800 pM (pikomolarność). Patrz Sawyer et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3690-3694. Jednak EPO-zależne erytroblasty obecne w śledzionie, uzyskane od myszy, które zainfekowano szczepem FVA - Anemie Friend Leukemia Virus, demonstrowały miejsca wiązania o wysokim lub niskim powinowactwie o stałych dysocjacji odpowiednio 100 pM i 800 pM. Patrz Sawyer et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 5554 - 5562 i Landschulz (1989) Blood 73: 14761478. Opisano sekwencje DNA i zakodowane sekwencje peptydów dla protein receptora EPO myszy i człowieka. Patrz D'Andrea et al., publikacja zgłoszenia PCT Nr WO 90/08822 (opublikowane w 1990).

Dostępność klonowanych genów dla EPO-R ułatwia poszukiwania agonistów i antagonistów tego ważnego receptora. Dostępność rekombinowanego receptora białkowego pozwala na badanie interakcji receptor-ligand w różnorodnych przypadkowych i półprzypadkowych układach peptydów różnych generacji. Systemy te obejmują system „peptydy na plazmidach” opisany w zgłoszeniu patentowym USA Nr. 778,233, z 16 października 1991, system „peptydy na fagach”, opisany w zgłoszeniu patentowym USA Nr 718,577, z 20 czerwca 1991, oraz w Cwirla et al., Sierpień 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, system „kodowana biblioteka syntetyczna” (ESL), opisany w zgłoszeniu patentowym USA Nr 946,239, z 16 września 1992, która po części jest kontynuacja zgłoszenia z Serii nr 762,522, z 18 września 1991, oraz system „synteza immoblizowanych polimerów na dużą skalę”, opisany w zgłoszeniu patentowym USA Nr 492,462, z 7 marca 1990; publikacji zgłoszenia pCt Nr 90/15070, 13 grudnia 1990; zgłoszenie patentowe USA Nr 624,120, z 6 grudnia 1990; Fodor et al., luty 1991, Science 251: 767-773; Dower i Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26: 271-180; i zgłoszenie patentowe USA Nr 805,727, z 6 grudnia 1991.

Istnieje jednakże ciągłe zapotrzebowanie na związki, które wiążą się z EPO-R lub w inny sposób oddziaływują z EPO-R, zarówno w celu badań naukowych nad ważnymi aktywnościami biologicznymi regulowanymi przez ten receptor jak i leczenia chorób. Niniejsze zgłoszenie dostarcza takich związków.

Przedmiotem wynalazku jest peptyd, który wiąże się z i aktywuje EPO-R lub w inny sposób działa jako agonista EPO. Peptyd ten ma długość od 10 do 40 reszt aminokwasowych i zawiera sekwencję aminokwasów X₃X4X5GPX6TWX7X8, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; X₃ jest C; X4 jest R, H, L lub W; X5 jest M, F lub I; X(, jest niezależnie wybranym jednym z 20 genetycznie kodowanych I.-aminokwasów: X7 może być D, E, I, L lub V; a X₈ jest C.

Korzystnie peptyd według wynalazku zawiera sekwencję YX2X3X4XjGPX6TWX7X8, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; każdy z X2 i X6 jest niezależnie wybranym jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; Χ4 jest R, H, L lub W; Xs może być M, E lub I; Χ7 jest D, E, I, L lub V; a X8 jest C.

Korzystnie peptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów X₍ ΥΧ2Χ3Χ4Χ5GPX_bTWX7X8X9X 10X11, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; każdy z Xj, Χ2, X6, Χ9, Χ10 i Xu jest niezależnie wybranym jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X₃ jest C; Χ4 jest R, H, L lub W; Χ5 jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; X8 jest C.

185 040

Korzystnie w powyższej sekwencji peptydu według wynalazku Χ4 jest R lub Η; Χ5 jest F lub M; Xćjest I, L, T, Μ, E lub V; Χ7 jest D lub V; Χ9 jest G, K, L, Q, R, S, lub T; aXio jest A, G, P, R lub Y.

Korzystniej w powyższej sekwencji peptydu według wynalazku Xi jest D, E, L, N, S, T lub V; X₂ jest A, Η, K, L, M, S lub T; X₄ jest R lub H; X₉ jest K, R, S lub T; Χ10 jest P.

W bardziej korzystnej postaci zarówno Χ3 jak i Xg oznaczają C, a zatem peptyd będzie zawierał sekwencję aminokwasów XiYX₂CX4X₅GPX₆TWX₇CX9XioXn. Korzystnie peptyd ten zawiera sekwencję aminokwasów XiYX₂CX4X₅GPX6TWX7CX₉XioXii, gdzie Χ4 może być R lub H; X₅ może być M lub F; X₆ może być I, L, T, M lub V; X₇ jest D lub V; X₉ może być G, K, L, Q, R, S lub T; a Χ10 może być A, G, P, R lub Y. W najbardziej korzystnych formach peptyd będzie zawierał rdzeniową sekwencję aminokwasów XiYX₂CX4XsGPX6TWX₇CX₉XioXn, gdzie X] może być D, E, L, N, S, T lub V; X₂ może być K, R, S lub T; aXiojestP.

Korzystnie peptyd według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z:

GGNYMCHFGPITWVCRPGGG; GGVYACRMGPITWVCSPLGG;

VGNYMAHMGPITWVCRPGG ;

GGPHHWACKHGPLTWIC ;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG ; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA ;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGCRIGPITWVCGG;

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD ; GGTASCHFGPLTWVCKPQGG ; GGNYYCRFGPITFECHPTGG ; GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG ; GGLYTCRMGPITWVCLPAGG ; GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG ; GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG; GGTYSCHFGALTWVCKPQGG ; GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG ; GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG ; GGTYSCHFGPATWVCKFQGG ; GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG ; GGTYSCHFGPIiTFVCKPQGG ;

TYSCHFGPLTWVCKPQ ;

YSCHFGPLTWVCKP;

SCHFGPLTWVCK;

GGTYSCFGPLTWVCKPQGG ;

TYSCHFGPLTWVCKPQGG ;

YSCHFGPLTWVC;

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG .

Korzystnie peptyd według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z:

GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG; VGNYMCHFGPI TWCRPGGG ; GGVYACRMGPITWCSPLGG; VGNYMAHMGPXTWVCRPGG; GGPHHVYACRMGPLTWIC ; GGTYSCHFGPLTWVCKPQ; GGLYACHMGPMTWVCQPLRG; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA; YSCHFGPLTWCK; YCHFGPLTWYC,

185 040

W innej korzystnej postaci wykonania peptyd według wynalazku jest scyklizowany lub zdimeryzowany.

Nieograniczające przykłady peptydów opisanych w niniejszym zgłoszeniu mogą być zcyklizowane jako amidy C-końcowe.

Korzystnie przedmiotem wynalazku jest peptyd, w którym sekwencja aminokwasów jest cyklizowana. Korzystniej peptyd według wynalazku w którym sekwencja aminokwasów jest cyklizowana jest wybrany spośród:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA;

YSCHFGPLTWVCK?

YCHFGPLTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGCRIGPITWVCGG;

LGEKYSCHFGPLTWVCQPAKKD; GGTASCHFGPLTWVCKPQGG; GGNYYCRFGPITFECHPTGG; GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG ;

GGLYTCRMGPITWCLPAGG ;

GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTFSCHFGPLTWCKPQGG;

GGTYSCHFGALTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLAWCKPQGG;

GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPATWCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWCKPQ;

YSCHFGPLTWCKP;

YSCHFGALTWCK;

SCHFGPLTWCK?

GGTYSEHFGPLTWKKPQGG;

GGTYSCFGPLTWCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVCKPQGG;

YSCHFGPLTWC;

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG; i GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest peptyd, w którym wyżej wymieniona sekwencja aminokwasów jest zdimeryzowana.

Korzystniej peptyd według wynalazku jest zdimeryzowanym peptydem o następującej sekwencji aminokwasowej:

GGTYSCHFGPLTWCKPQGG

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.

Opisano również pewne warianty realizacji wynalazku, w których dwa lub więcej, a korzystnie od 2 do 6 reszt aminokwasowych, niezaleznie wybranych spośród 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów lub stereoizomerycznych D-aminokwasów będzie sprzęzone z jednym lub obu końcami rdzeniowej sekwencji aminokwasowej opisanej powyżej. Na przy10

185 040 kład, sekwencja GG będzie często dołączana do jednego lub obu końców sekwencji rdzeniowej w celu ułatwienia syntezy peptoyów.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna, zawierająca oeotyy według wynalazku w połączeniu z akceptowanym farmaceutycznie nośnikiem oraz zastosowanie onotydu według wynalazku do wytwarzania środka leczniczego przeznaczonego do leczenia pacjenta z zaburzeniem charakteryzującym się niedoborem erotrooontyny lub małą, jak również nieprawidłową populacją czerwonych krwinek, korzystnie do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej: schyłkową niewydolność nerek lub dializę; niedokrwistość towarzyszącą AIDS, chorobie autoimmunylogicznnJ lub złośliwej; beta-talaonmię; mukowiocoyozę; wczesną niedokrwistość u wcześniaków; niedokrwistość towarzyszącą przewlekłym chorobom zapalnym; uszkodzenie rdzenia kręgowego; ostrą utratę krwi; starzenie oraz choroby nowotworowe przebiegające z zaburzeniami nrotryoynzo.

Wynalazek ilustrują następujące figury:

Figura 1 przedstawia sekwencje oligomerów mutagenezy wykorzystanych w opisanych tutaj procedurach.

Figura 2 przedstawia sekwencje reprezentatywnych pnotoyów według wynalazku.

Figura 3 ilustruje nową mutagenna bibliotekę fagemidową powstałą przy użyciu systemu wykrywającego oVIII. W bibliotece tej reszty tyrozynow^ glicynowo-orollnown i treynino-tryotyfanywe (podkreślone), jak również dwie cysteiny występują na stałych pozycjach. Pozostałe pozycje pomiędzy resztami cysternowymi (zaznaczone obwódkową kursywą obecne w oryginalnym AF11154 peotoyzie) były mutowane przez oligo konstrukcje w taki sposób, że każda reszta aminokwasowa mogła być zamieniona na każdą inną z częstotliwością 50%. „X” oznacza pozycje przypadkowych aminokwasów.

Figury 4A-C ilustruje mutagenne biblioteki pili i oVIII, które są obecnie konstruowane i poddawane skriningowi. Reszty aminokwasywn zaznaczone tłustym drukiem występują na stałych pozycjach, pozostałe (oznaczone przez NNK) są przypadkowe. 4A (ON3007) i 4C (ON3017) przeznaczone do badań nad wkładem dodatkowych regionów flankujących odpowiednio N- i C-końcowych, do sekwencji rdzeniowej (tyrozyna do drugiej cysteiny). 4B (ON3016) opiera się na pnptoyzie Y-CHFGPLTWYC, gdzie reszta tyryzynowa jest umieszczona bezpośrednio za pierwszą cysteiną. Biblioteka ta dodaje dodatkowe, przypadkowe reszty do obu stron sekwencji rdzeniowej.

Figura 5 ilustruje bibliotekę mutagenną opartą na GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, skonstruowaną i poddaną skriningowi przy użyciu nowego Lac-I wektora („Hnaypiece Dimer”). Reszty aminokwasowe oznaczone przez X są przypadkowe (NNK), reszty podkreślone są w niewielkim stopniu zmutowane (91:3:3:3/91:3:3:3/K), natomiast reszty zaznaczone obwódką są bardziej zmutowane (70:10:10/70:10:10^).

Figura 6 ilustruje bibliotekę mutagenną opartą na TIAQYICYMGPETWECRPSPKA, skonstruowaną i poddaną skriningowi przy użyciu nowego Lac-I wektora („Headplecn Dimer”). Reszty aminokwaoywn oznaczone przez X są przypadkowe (NNK), reszty oznaczone obwódką występują na stałych pozycjach, a dwie reszty kwasu glutaminowego były w niewielkim stopniu zmutowane (91:3:3:3/91:3:3:3/K).

Figura 7 jest graficznym przedstawieniem wyników bioanalizy FDCP-1/hEPO-R wybranych pnotydów według wynalazku z następującymi oznaczeniami:

• odpowiada wynikom dla GGCRIGPiTwYCgG;

⁰ o-odpowiada. wynikom dla GGLYLCRFGPYTWDCGYKGG;

□ odpowiada wynikom dla GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

Δ odpowiada wynikom dla GGDYHCRMGPLTWYCKPLGG;

V odpowhda wynikom dla YGNYMCHFGPITWYCRPGGG;

| odpowiada wynikom dla GGYYACRMGPITWYCSPLGG;

+ odpowiada wynikom dla YGNYMAHMGPITWYCRPGG; i * odpowiada wynikom dla EPO.

Figura 8 jest graficzną interpretacją wyników bioanalizy TF-1 dla EPO (Δ i ♦ przedstawiają wyniki analizy przy użyciu EPO i odpowiednio ^aoÓx & %o oLkEA< EPO i popowiednio

185 040 a peptydu VGNYMCHFGPITWYCRPGGG (SEQ ID NO:) (□ i · przedstawiają wyniki analizy z użyciem peptydu i odpowiednio 10 000 lub 20 000 komórek).

Figura 9A (kontrola), 9B (poddany działaniu 500 pM EpO) i 9C (poddany działaniu 25 mm GGDYHCRMGPLTWYCKPLGG) są fotografiami wykonanymi przy 200 krotnym powiększeniu przedstawiającymi wyniki analizy proliferacji MTT reprezentacyjnej populacji komórek śledziony myszy poddanych działaniu fenylohydrazyny.

Figura 10 jest graficzną interpretacją wyników bioanalizy FDCP-1/hEPOR biotynylowanego peptydu (tj. GGTYsChFGPLTwVcKPQGGSSK (Ahx-biotyna)), przez oligomeryzację streptawidyną. Peptydy GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG i GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna) wykazują w przybliżeniu tę samą aktywność, ale ten ostatni posiada dużo większą siłę działania gdy przed badaniem zostaje skompleksowany przy użyciu streptawidyny (tj. kompleks GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna) - streptawidyną). W badaniu tym, mały spadek w aktywności jest obserwowany przy najmniejszym stężeniu (5 nM w odniesieniu do peptydu skompleksowanego). Sama streptawidyna wykazuje niewielką, możliwą do pominięcia aktywność przy dużych stężeniach.

Figura 11 jest graficzną interpretacją wyników bioanalizy FDCP-1/hEPOR ukazującej wzrost siły działania peptydu AF11505 regulowany poliklonalną kozią antybiotyną. Uprzednie skompleksowanie GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyny) z 5 kozimi przeciwciałami antybiotynowymi zwiększa siłę działania peptydu o jeden log w stosunku do wolnego peptydu. Same oczyszczone przeciwciała (G anti-B) nie wykazują efektu stymulującego.

Figura 12 ilustruje schemat syntezy prowadzącej do otrzymania dimerycznego peptydowego analogu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.

Figura 13 ilustruje IC50 wykres dimerycznego analogu peptydowego GGTYSCHFGPLTWYCKPQGG. Powinowactwo zostało określone przy użyciu testu kompetycyjnego wiązania radioligandu z EPO-R zakończonym PIG, immobilizowanym na mAB179.

Figura 14 ilustruje biologiczną aktywność in vitro dimerycznego analogu peptydowego GGTYSCHFGPLTWYCKPQGG przy użyciu testu komórkowej proliferacji FdCp-ITiEPOR. 20 Dimeryczny peptyd ma EC50 w przybliżeniu 20 nM, 20 krotny wzrost w sile działania w porównaniu do macierzystego peptydu.

Figura 15 ilustruje progresję cyklu komórkowego FDC-P1/ER.

Figura 16 ilustruje analizę równowagi wiązania specyficznej asocjacji [¹²⁵I]EPO z unieruchomionym na ziarnach agarozy EBP i wskazuje Kd wynoszącą 5 nM ± 2 na podstawie liniowej transformacji (Scatchard) izotermy wiązania.

Figury 17A, 17B i 17C ilustrują odpowiednio wyniki bioanalizy policytemii u myszy po przebytej hipoksji przy użyciu peptydów odpowiednio GGTYsCHfGPLTWVCKPQGG, GGTYSCHFGPLTWVCKPQ i LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD.

Figury 18A i 18B ilustrują odpowiednio wyniki bioanalizy policytemii u myszy po przebytej hipoksji przy użyciu odpowiednio peptydu TIAQYICYMGPETWECRPSpKA i dimerycznego peptydowego analogu GGTYSChFÓPLTWVCKPQGG zawierającego wiązania dwusiarczkowe (AF12080).

Figury 19A i 19B ilustrują odpowiednio wyniki analizy retikulocytów przy użyciu EPO i GGTYSCHFGPLTWVCKPqGg. Dla obydwu badanych grup n =10 zwierząt. EPO: 0.4, 4.0, 40.0 jednostek/mysz, całkowita dawka kontrolna podłoża; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: 2.0, 20.0, 200.0 pg/mysz, całkowita dawka kontrolna podłoża + DMSO (1-2%) 200 pg/mysz = 10 mg/kg. Wniosek: wyniki próby proliferacji in vitro sugerują: 2 pg GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG = 0.4 jednostki EPO.

Figury 20A i 20B ilustrują odpowiednio wyniki analizy retikulocytów przy użyciu EPO i GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Dla obydwu badanych grup n=10 zwierząt. EPO: 0.4, 4.0, 40.0 jednostek/mysz, całkowita dawka;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG: wzrost dawki do 1 mg/mysz, całkowita dawka = 50 mg/kg i do 2 mg/mysz, całkowita dawka = mg/kg.

W opisie tym wykorzystano terminologię o następującym znaczeniu:

Reszty aminokwasowe peptydów mają następujące skróty: Fenyloalanina - Phe lub F; Leucyna - Leu lub L; Izoleucyna -Ile lub I; Metionina - Met lub M; Walina - Val lub V;

185 040

Seryna Ser lub S; Prolina - Pro lub P; Treonina - Tre lub T; Alanina - Ala lub A; Tyrozyna Tyr lub Y; Histydyna - His lub H; Glutamina - Glu lub Q; Asparagina - Asp lub N; Lizyna Lys lub K; Kwas asparaginowy - Asp lub D; Kwas glutaminowy Glu lub E; Cysteina - Cys lub C; Tryptofan - Trp lub W; Arginina - Arg lub R i Glicyna - Gly lub G.

„Agonistą” nazywamy biologicznie aktywny ligand, który wiąże się ze swoim komplementarnym, biologicznie aktywnym receptorem i aktywuje go powodując biologiczną odpowiedź w receptorze, albo wzmacnia już istniejącą biologiczną aktywność receptora.

„Komórką gospodarza” nazywamy eukariotyczną lub prokariotyczną komórkę lub grupę komórek, która może być lub została już stransformowana rekombinacyjnym wektorem DNA. Dla potrzeb niniejszego wynalazku korzystne są prokariotyczne komórki gospodarza.

„Peptydem” lub „polipeptydem” nazywamy polimer w którym monomery są alfa aminokwasami połączonymi ze sobą wiązaniami amidowymi. Peptydy mają długość dwóch lub więcej monomerów aminokwasowych.

Przez „farmaceutycznie dopuszczalne sole” rozumiemy nietoksyczne sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych i sole amonowe, powszechnie używane w przemyśle farmaceutycznym, do których należą sole sodu, potasu, litu, wapnia, magnezu, baru, amonu i sole protaminowe cynku, które są przygotowywane przy użyciu metod powszechnie znanych w tej dziedzinie. Określenie to odnosi się także do nietoksycznych soli addycyjnych kwasów, które są otrzymywane głównie w reakcjach związków według wynalazku z odpowiednimi kwasami organicznymi lub nieorganicznymi. Przykładami takich soli są chlorki, bromki, siarczany, dwusiarczany, octany, szczawiany, walerianiany, oleiniany, lauryniany, borany, benzoesany, mleczany, fosforany, tosylany, cytryniany, maleiniany, fumarany, bursztyniany, winiany, napsylany i tym podobne.

„Farmaceutycznie lub terapeutycznie skuteczną dawką lub ilością” nazywamy poziom dawki wystarczający aby wywołać pożądany efekt biologiczny. Tym efektem może być złagodzenie objawów, symptomów lub przyczyn choroby, lub każda inna pożądana zmiana systemu biologicznego. Korzystna ta dawka lub ilość będzie wystarczającą do pobudzenia EPOR i zatem łagodzącą objawy towarzyszące niedoborowi EPO lub defektowi czy zmniejszeniu populacji czerwonych krwinek in vivo.

„Rekombinacyjnym wektorem klonowania lub wektorem ekspresyjnym DNA” nazywamy cząsteczkę DNA lub RNA kodującą funkcje użytkowe, która może być wykorzystana do transformacji komórki gospodarza. Dla celów wynalazku, wektor do klonowania służy w pierwszej kolejności jako produkt pośredni do konstrukcji wektora ekspresji; wektor ekspresji jest używany do transformacji lub transfekcji komórki gospodarza co oznacza, że stransformowana komórka gospodarza produkuje proteiny lub inne produkty kodowane przez wektor. Typowymi takimi wektorami są „plazmidy”, które według wynalazku mogą występować poza chromosomami w komórce gospodarza, ale mogą również być zintegrowane z genomem komórki gospodarza. Znawcy przedmiotu zdefiniowane tu „wektory do klonowania” nazywają „wektorami”, a „wektory ekspresyjne” „plazmidami.”

Wynalazek dostarcza związków, które wiążą i aktywują EPO-R albo w inny sposób działają jako agoniści EPO. Do związków tych należą „wiodące” związki peptydowe, ujawnione przy użyciu systemów przypadkowego generowania różnorodności peptydowej i „pochodne” związków o takiej samej lub podobnej strukturze molekularnej lub postaci jak „wiodące”, różniące się od nich podatnością na hydrolizę lub proteolizę i/lub innymi właściwościami biologicznymi, jak zwiększone powinowactwo do receptora, zwiększona aktywność in vitro lub in vivo.

Systemy przypadkowego generowania różnorodności peptydowej początkowo wykorzystywane zawierały system „peptydy na fagu” omówiony powyżej. Przypadkowe peptydy zaprojektowano w ten sposób by składały się z 8 reszt aminokwasowych, z usytuowanymi na obu końcach resztami cysternowymi (tak więc całkowita długość peptydu wyniesie 10 reszt aminokwasowych). W tych początkowych systemach, przypadkowe peptydy były prezentowane jako części białka fuzyjnego składającego się z pochodnej białka otoczkowego pVIII faga (peptydy na fagu). Białka fuzyjne wraz z kodującym je DNA były „rozdzielane” na immobilizowanym EPO-R. Proces rozdzielania składał się z wielu cykli inkubacji białek fu185 040 zyjnych z immobilizowanym receptorem, zebrania białek fuzyjnych związanych z receptorem (wraz z towarzyszącym DNA), i dalszej produkcji zebranych białek fuzyjnych.

Z reguły po trzech cyklach rozdzielania białka fuzyjne i towarzyszące DNA były izolowane i namnażane z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych do ELISA w celu określenia czy białko fuzyjne było związane specyficznie z receptorem. Badanie było przeprowadzone w podobny sposób do rozdzielania, z wyjątkiem tego, że po usunięciu niezwiązanych białek fuzyjnych, podziałano króliczym przeciwciałem antyfagowym (lub przeciwciałem anty-lac dla systemu peptydów na plazmidach), następnie fosfatazą alkaliczną skoniugowaną z kozim przeciwciałem przeciw immunoglobulinie króliczej, po czym ilość fosfatazy alkalicznej została określona przy użyciu metod standardowych w każdym z układów reakcyjnych. Przez porównanie badanych układów z kontrolnymi (bez receptora), można określić czy białko fuzyjne wiąże się specyficznie z receptorem.

Immobilizowany receptor użyty w procedurach rozdzielania i ELISA zawierał zewnątrzkomórkową domenę receptora EPO i był produkowany w rekombinowanych komórkach gospodarza. Ta molekuła receptorowa może być wytwarzana w wielu różnorodnych formach i komórkach gospodarza. Jedna z użytecznych form zawiera peptyd sygnałowy dla białka sekrecyjnego i dla miejsca wiążącego glikofosfolipidowej błony (ta forma miejsca wiążącego jest nazywana „PIG-tailing;” patrz Caras i Weddell, 3 marzec 1989, Science 243: 1196-1198; i Lin et al., 10 sierpień 1990, Science 249: 677-679). System ten pozwala na oddzielenie receptora od powierzchni komórek i uzyskanie w łatwy sposób receptora i zbioru oddzielonych receptorów. Korzystnie, miejsce działania proteazy, takie jak miejsce odszczepienia trombiny jest zawarte pomiędzy epitopem HPAP receptora „PIG-tailed” a samym receptorem.

Rekombinowane białko receptorowe zostało unieruchomione przy użyciu następującej metody. Płytki do mikromiareczkowania zostały pokryte przeciwciałem antyreceptorowym i studzienki, które miały zawierać immobilizowane receptory zostały poddane działaniu albuminy surowicy wołowej (BSA) w celu zablokowania niespecyficznych wiązań. Receptor „PIG-tailed,” posiadający miejsce odłączenia trombiny został dodany do pokrytych studzienek płytki do mikromianowań, które następnie przepłukano w celu usunięcia niezwiązanego receptora.

Stosując system przypadkowego generowania peptydów pozwalający na multiwalentne interakcje ligand-receptor, należy wziąć pod uwagę, że gęstość immobilizowanego receptora jest ważnym czynnikiem determinującym powinowactwo ligandów, które będą wiązać się z immobilizowanymi receptorami. Przy wyższych gęstościach receptora (tj. każda studzienka pokryta przeciwciałami antyreceptorowymi poddana działaniu od 0.25 do 0.5 mg receptora), występowanie multiwalentnego wiązania jest bardziej prawdopodobne (jeżeli w ogóle wystąpi) niz w przypadku niskich gęstości receptora (tj. każda studzienka pokryta przeciwciałami antyreceptorowymi poddana działaniu od 0.5 do 1 ng receptora). Jeżeli multiwalentne wiązanie występuje, to bardziej prawdopodobne staje się wyizolowanie ligandów o względnie niskim powinowactwie. Zazwyczaj, możliwa jest identyfikacja podstawowych związków przy użyciu wysokiej gęstości immobilizowanego receptora i wówczas zbadanie ich pochodnych przy niższej gęstości receptora w celu izolacji związków mających wyższe powinowactwo do receptora niż związek podstawowy.

Często receptor był dodany do co drugiego rzędu płytki do mikromiareczkowań; studzienki blokowane przez BSA w „pustych” rzędach stanowią negatywne kontrole, pozwalające określić czy obserwowany rezultat jest wynikiem specyficznej reakcji receptora. Preparaty białek fuzyjnych były dodawane do studzienek i inkubowane w celu umożliwienia związania się z receptorem; następnie studzienki były przemywane by usunąć niezwiązane białka fuzyjne.

Za pomocą wyżej wymienionych systemów został ujawniony peptyd wiążący się z EPO-R. DNA kodujące białko fuzyjne, które ulega związaniu z receptorem zostało zsekwencjonowane. Peptyd ten ma sekwencję: GGCRIGPITWYCGG (N-końcowe reszty GG pozwalające na odłączenie się od faga). Peptyd ten stale wykazuje niskie powinowactwa do BSA oraz do przeciwciała antyreceptorowego i wysokie powinowactwo do EPO-R w teście ELISA. Ponadto, klon fagemidu współzawodniczył z wolną EPO i pokrewnym wolnym peptydem. Co

185 040

EPO i radioligandem. Wreszcie, w przeprowadzonych testach wiązania wolny pnotyy nie współzawodniczył o wiązanie się z a- i δ- dlbo ntterleukmy©.

Przeprowadzono badania nad mutagenezą korzystnego peotodu. W celu uzyskania zbioru yligynuklnotyyów kodujących przypadkowe peptoyy, zostały orzygytowane oligomery pokazane na fig. 1, gdzie N był nuklnotyynm A, C, G lub T (równomylywo; zależnie od użytej metody można użyć inne nuklnytyyy) a K był G lub T (równomylowo) w kodonowej sekwencji (NNK). Znawcy przedmiotu wiedzą, że motyw NNK koduje wszystkie z aminokwasów, tylko jeden kodon stop i pomniejsza kodon bias. Istnieją 32 możliwe kodony wynikające z motywu NNK: 1 dla każdego z 12 aminokwasów, 2 dla każdego z 5 aminokwasów, 3 dla każdego z 3 aminokwasów, i tylko jeden z trzech kodonów stopu.

Mutagenne białka fuzyjne wraz z kodującymi je DNA zostały ponownie „rozdzielone” na immobilizowanych EPO-R. Białka fuzyjne i towarzyszące DNA były następnie izolowane i namnażane z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych do ELISA w celu określenia czy białko fuzyjne było związane soncyficznin z receptorem. Korzystne oeotydy otrzymane w tym badaniu pokazuje fig. 2. Pnotydy te są scharakteryzowane przez sekwencje „XaXaX5GPX6TWX7Xg”, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym jednoliterowym skrótem; X$ jest niezależnie wybranym jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów lub oternyizomnrocznym D-aminokwasem; X3 może być C, A, kwasem α-amino-γ-bromomasływym albo Hoc, gdzie Hoc jest hymycystniną; Xa może być R, H, L albo W; X5 może być M, F albo I; X' może być D, E, I, L albo V; a X» może być C, A, kwasem α-aminy-γ-bromomaołowym albo Hoc, gdzie Hoc jest homocystniną, pod warunkiem że albo X3 albo X» jest C lub Hoc.

W celu wstępnego ustalenia powinowactwa onptydów, biblioteki fagowe były również poddane skriningowi według protokołu selekcji powinowactwa, w którym to protokole onptydy współzawodniczyły z EPO (100 nM). Proces ten jest powtarzany przez dwa cykle rozdzielania. W kolejnych cyklach rozdzielania, temperatura kymontycji (4°C do temperatury otoczenia) i czas (od 15 do 30 minut) jak również temperatura (4°C do temperatury otoczenia) roztworów użytych do przemywania mogą wpłynąć na dalszą selekcję pnotydów z wysokim powinowactwem. Stosując procedurę selekcji powinowactwa, wyizolowano oeptydy o takiej samej wspólnej snkewencJi „X1YX2CXaX5GPX6TWX'CX9X 10X11”, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym jednoliterowym skrótem; każdy z X1, X2, Xó, X9,Xw i Xn jest niezależnie wybranym jednym z 20 genetycznie kodowanych L-a.minokwasów; X4 może być R, H, L albo W; Χ5 może być M, F albo I; Χ7 może być D, E, I, L albo V. W korzystniejszej postaci, oeotody będą zawierały sekwencję „X1YX2CX4X5GPX6TWX'CX9X 10X11”, gdzie X4 może być R lub H, Χ5 może być M lub F, X6 może być I, L, T, M lub V, X' jest albo D albo V, X9 może być G, K, L, Q, R, S lub T i Xd może być A, G, P, R lub Y. W szczególnie korzystnej formie, rdzeń onotydu będzie zawierał sekwencje aminokwasu X|YX₃CX4X5gPX6TWX7CX9Xh)Xi1, gdzie X1 może być D, E, L, N, S, T lub V; X2 może być A, H, K, L, M, S lub T; X4 jest albo R albo H; Χ9 może być K, R, S lub T; a Xie jest P.

Przykłady reprezentatywnych pnotyyów zawierających tę sekwencje i izolowanych w procesie selekcji powinowactwa ilustrują poniższe tabele.

Tabela 1

Pnotydy z protokołu selekcji powinowactwa

Komontycja z 100 nM EPO, 15 min, 4°C

GGWVTCRMGPITWVCGVHGG

GGQLLCGIGPITWVCRWVGG

GGLYLCRMGPVTWECQPRGG

GGKYSCFMGPTTWVCSPVGRGV

GGWVYCRIGPITWVCDTNGG

GGIYKCŁMGPLTWVCTPDGG

GGMYYCRMGPMTWVCKGAGG

185 040

Brak kompetycji

GGTTQCWIGPITWVCRARGG

GGPYHCRMGPITWVCGPVGG

GGEYLCRMGPITWVCERYGG

GGEYRCRMGPXSWVCSPQGG

GGNYTCRFGPLTWECTPQGGGA

GGNYVCRMGPITWICTPAGG

Tabela 2

Peptydy z protokołu selekcji powinowactwa

Druga kompetycja z 100 nM EPO, 15 min, 4°C

GGSWDCRIGPITWVCKWSGG GGDYTCRMGPMTWICTATRG GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG GGSYLCRMGPTTWLCTAQRG GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG VGNYMCHFGPITWVCRPGGG GGLYLCRMGPQTWMCQPGGG GGTYS CHFGPLTWVCKPQGG GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR GGLYECRMGPMTWVCRPGGG GGWYSCLMGPMTWVCKAHRG GGKYYCWMGPMTWVCSPAGG

Brak kompetycji

GGYVMCRIGPITWVCDIPGG

GSCLQCCIGPITWVCRHAGG

GGNYFCRMGPITWVCQRSVG

GGEYICKMGPLTWECKRTGG

GGLYACRMGPITWVCKYMAG

GGQYLCTFGPITWLCRGAGGGS

GGVYACRMGPITWVCSPLGG

GGYTTCRMGPITWVCSAHGG

185 040

Tabela 3

Peptydy z protokołu selekcji powinowactwa

Kompetycja z 100 nM EPO, 15 min, temperatura pokojowa

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG

GGTYKCWMGPMTWVCRPVGG

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG

GGNYYCRFGPITFECHPTGG

GGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGS

GGEYKCYMGPITWVCKPEGG

GGDYVCRMGPMTWVCAPYGRGGS

Brak kompetycji

GGNYVCRMGPITWICTPAGG

GGDYTCRMGPMTWICTATRG

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG

GGSYLCRMGPTTWLCTAQRGGGN

GGLYTCRMGPITWVCLPAGG

GGLYKCRMGPMTWVCSPFGG

Tabela 4

Peptydy z protokołu selekcji powinowactwa

Kompetycja z 100 nM EPO, 30 min, temperatura pokojowa

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG

VGNYMCHFGPITWVCRPGGG

Brak kompetycji

GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR

GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG

Przeprowadzono również przesiewanie innej biblioteki mutagennej, posiadającej sześć przypadkowych reszt aminokwasowych, sąsiadujących z przypadkowym 8-merem zawartym między dwoma resztami cysternowymi, w stosunku do immobilizowanego EPO-R. Mutagenne białka fuzyjne wraz z kodującym je DNA, ponownie były „rozdzielane” na immobilizowanym EPO-R. Białka fuzyjne i towarzyszący Dna były izolowane i namnażane z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych dla ELISA. aby ustalić czy białka fuzyjne wiążą receptor

185 040 w sposób specyficzny. Na podstawie wyników badań, korzystnie by peptyd miał sekwencje GGPHHYYACRMGPLTWIC i zawierał w sobie sekwencję rdzeniową „YX2X3X4X5GPX6TWX7X8”, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; każdy X2 i Xć jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów lub stereoizomerycznych D-aminokwasów; X3 może być C, A, kwasem α-amino-bromomasłowym lub Hoc, gdzie Hoc oznacza homocysteinę; Xą może być R, H, L lub W; X5 może być M, F lub I; X7 może być D, I, E, L lub V; a Xg może być C, A, kwasem a-amino-y-bromomasłowym lub Hoc, gdzie Hoc oznacza homocysteinę, pod warunkiem, ze albo X3 albo Χχ jest C lub Hoc, przy czym sekwencja rdzeniowa jest sprzężona swoim końcem aminowym z jednostką sześciu aminokwasów, gdzie każdy aminokwas jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów lub stereoizomerycznych D-aminokwasów.

Obliczono IC50 dla kilku z peptydów zgodnych z sekwencjami opisanymi powyżej. Wartości te zostały oznaczone przy użyciu wolnego peptydu i przedstawione w tabeli 5 (zamieszczonej poniżej). (Każdy z tych peptydów jest niezależnie syntetyzowany i C-końcowo amidowany, ale może być przygotowany prościej jako wolny karboksykwas lub jako ester lub inny karboksyamid).

Tabela 5 ^Pepty^dy GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG VGNYMCHFGPITWVCRPGGG GGVYACRMGPITWVCSPLGG VGNYMAHMGPITWVCRPGG

Ponadto inne mutagenne badania były prowadzone nad rodziną peptydów-agonistów EPO o wysokim powinowactwie, w warunkach sprzyjających wzrostowi powinowactwa peptydów. Jak opisano poprzednio, aby uzyskać peptydy o wyższym powinowactwie biblioteki poddano skryningowi przy użyciu protokołu selekcji powinowactwa, w którym peptydy współzawodniczą z EPO (100 nM). Proces ten jest powtarzany w dwóch cyklach rozdzielania. W kolejnych cyklach rozdzielania, temperatura kompetycji (4°C do temperatury otoczenia) i czas (15 do 30 minut) jak również temperatura roztworów użytych do przemywania (4°C do temperatury otoczenia) może wpływać na dalszą selekcję peptydów o wysokim powinowactwie. Za pomocą tych technik, mutagenowa biblioteka posiadająca trzy przypadkowe reszty aminokwasowe po każdej stronie sekwencji flankującej YxCRiGpITWvC była również poddana skriningowi w stosunku do immobilizowanego EPO-R (patrz fig. 3). Mutagenne białka fuzyjne wraz z kodującym je DNA, ponownie były „rozdzielone” na immobilizowanym EPOR. Białka fuzyjne i towarzyszący DNA były w ten sposób izolowane i namnażne z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych dla ELISA, aby ustalić czy białka fuzyjne wiążą receptor w sposób specyficzny. Na podstawie wyników badań, korzystne jest, gdy peptydy mają sekwencje podane w tabeli 6.

Tabela 6

GGEYICVMGPNTWVCSPTRGHGS

GGEYLCRMGPMTWVSPFTRKGG

GGQYICRFGPITWQSQPAGGGS

GREYSCRMGPITWVCMPRASLGS

GDYLCSMGPITWICVPERGGGS

ELWYSCRMGPVTWMCGRYQGGGS

185 040

W innych badaniach nad mutagenezą, mutagenna biblioteka, posiadająca silnie zakonserwowane reszty (tj. Y, C, G, P, T i W) stałe, inne przypadkowe reszty i 10 reszt dodanych na N-końcu przed tyrozyną, była również poddana skriningowi wobec immobilizowanego EPOR (patrz fig. 4A). Mutagenne białka fuzyjne wraz z kodującym je DNA, ponownie były „rozdzielone” na immobilizowanym EPO-R. Białka fuzyjne i towarzyszący DNA były w ten sposób izolowane inamnażane z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych dla ELISA, aby ustalić czy białka fuzyjne wiążą receptor w sposób specyficzny. Na podstawie wyników badań, korzystnie, gdy peptydy mają sekwencje podane w tabeli 7 poniżej.

Tabela 7

QICRADRKGIYQCWYGPETWICgg

QQGYSLWLPWYNCVLGPYTWVCgg

YGGSAAVPWKYGCSLGPVTWVCgg

QIVSWGLYSGYLCMVGPVTWLCgg

GSGALSAAGWYGCRVGPLTWVCgg

SWSHDAAGVYDCVIGPVTWICgg

IYSWTGILGSYVCWYGPDTWVCgg

SCIYVRFFYCYQCSEGPATWLCgg

TVAKGQSGVRYSCLRGPETWVCgg

VQPQYKWATMYQCWKGPSTWFCgg

KSGVWEMGSSYQCARGPRTWCCgg

CSVRRMDREYYRCCRGPPTWQCgg

KYQEEMFMGYQCLQGPKTQLCgg

VCPGSEFRVGYICAMGPYTWDCgg

SLCSSRCNSPYFCSIGPSTWRCgg

QASLGLPLKQYLCVLGPHTWLCgg

ACKPAALFVQYGCVLGPMTWICgg

SCERAGGRWEYVCQWGPDTWLCgg

RVARQVQQVSYWCAHGPATCYCgg

HKYDTLMLTNYVCQRGPLTQLCgg

W jeszcze innych badaniach nad mutagenezą, mutagenna biblioteka, posiadająca silnie zakonserwowane reszty (tj. Y, C, G, P, T i W) stałe, inne przypadkowe reszty i 10 reszt dodanych pomiędzy drugą cysteiną a łączącą (Gly)4-Ser, była również poddana skriningowi wobec immobilizowanego EPO-R (patrz fig. 4B). W bibliotece tej konserwowana reszta tyrozynowa była poprzedzona dwiema resztami glicynowymi, co umożliwia efektywne odszczepienie peptydu sygnałowego. Mutagenne białka fuzyjne wraz z kodującym je DNA, ponownie były „rozdzielone” na immobilizowanym EPO-R. Białka fuzyjne i towarzyszący DNA były w ten sposób izolowane i namnażane z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych dla ELISA, aby ustalić czy białka fuzyjne wiążą receptor w sposób specyficzny. Na podstawie wyników badań, korzystne jest, gdy peptydy mają sekwencje podane w tabeli 8.

185 040

Tabela 8 ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMgg ggYICDYGPLTWACKPAGATLLQPgg ggYTCRFGPVTWDCLPAINHNGVLgg ggYQ*FMGPETWVCAPEPRVERVSgg ggYLCRFGPETWTCAPERSWTQSgg ggYVCDFGPTTWICRGQVMEHINTgg ggYMCNMGPLTWDCSPVRSTSHAWgg ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMgg ggYNCTMGPNTWVCTPAAESPAVFgg ggYGCRIGPITWICDDVSRSPRA ggYTCRMGPQTWECLPMSEGV ggYNCKFGPQTWDCSSANLKEV gYLCEMGPETWMCRPEDAKLGV ggYGCKFGPVTWICEDLLLDPMY ggYNCKFGPQTWDCSSAHLKEVLV gYLCEMGPETWMCRPEDCEAW ggYGCGLAPVTWECPQVSIPYGLSgg ggYGCRIGPTTWICDSTVPQLREVgg ggYRCSWAPETWCDNHSA gYLCNFGPITWDCVSSAQSEMQIgg

W jeszcze innych badaniach nad mutagenezą, mutagenowa biblioteka, posiadająca silnie zakonserwowane reszty (tj. Y, C, G, P, T i W) stałe, z tyrozyną umiejscowioną bezpośrednio za pierwszą cysteiną i innymi aminokwasami przypadkowymi, w tym 4 resztami Nkońcowymi za tyrozyną i 5 resztami pomiędzy drugą cysteiną a łącznikiem, była również poddana skriningowi wobec immobilizowanego EPO-R (patrz fig. 4C). N-końcowe przypadkowe aminokwasy były ponownie poprzedzone dwiema resztami glicynowymi, umożliwiającymi efektywne i przetwarzanie. Mutagenne białka fuzyjne wraz z kodującym je DNA, ponownie były „rozdzielone” na immobilizowanym EPO-R. Białka fuzyjne i towarzyszący DNA były w ten sposób izolowane i namnażane z wytworzeniem preparatów białek fuzyjnych dla ELISA, aby ustalić czy białka fuzyjne wiążą receptor w sposób specyficzny. Na podstawie wyników badań, korzystne jest, gdy peptydy mają sekwencje podane w tabeli 9.

Tabela 9 ggAELQYCKIGPETWVCDWPHIgg ggPYEGYCSGGPVTWECCVSVCgg ggQPLPYCSPGPTTWFCINWLFgg ggCSYGYCPMGPFTWMCRQRRLgg ggVRGSYCQSGPPTWQCDLRFFgg ggRCARYCACGPGTWNCLGRCQgg ggLGRCYCVYGPLTWWCSQTSLgg ggLCVWYCSAGPWTWYCIYRSAgg ggKPGPYCSFGPETWVCTALGMgg ggRLGEYCEIGPITWICRLFLPgg ggPGLGYCDFGPLTWVCDGSVDgg ggLSSAYCRYGPETWICWAGTGgg

185 040 ggVLHLYCYYGPETWDCLPIKAgg ggGGGVYCLVGPVTWLCGPAAMgg ggLTRNYCRIGPETWICQEVAIgg ggWSERYCVLGPLTWECVHLFAgg ggMPLKYCGMGPVTWVCCEAVSgg ggSVMRYCHFGPETWICPYDMPgg ggALYPYCLIGPMTWVCQVGWIgg ggTYGNYCRGGPGTWHCEDTRGgg ggASYCYCSKGPATWKCVGSILgg ggSIAAYCLQGPKTWPCVRRRLgg ggTDSLYCKLGPLTWHCQLYQKgg gISQQYCWRGPATWVCLEWELgg

Oprócz powyższych badań mutagenezy, przeprowadzono również mutagenezę peptydu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, stosując zmodyfikowany system Lac-I, w którym wartościowość została zredukowana w celu identyfikacji prób o wyższym powinowactwie („Headpiece Dimer”). System Lac-I Headpiece Dimmer (HPD) jest bardziej szczegółowo opisany w patencie USA Nr 5,338,665. Istotnym jest, że reszty aminokwasowe, które były silnie konserwowane w poprzednich badaniach nad mutagenezą (tj. Y, C, G, P, T i W) były mutowane w niewielkim stopniu, podczas gdy słabiej konserwowane reszty aminokwasowe (tj. H, F, L i V) były przedmiotem mutacji w znacznym stopniu. Reszta tyrozynowa znajdowała się pomiędzy czterema poprzedzającymi ją przypadkowymi resztami a jedną przypadkową resztą. C-koniec schematu mutagenezy kończył się 6 przypadkowymi aminokwasami, następującymi po cysteinie.

Szczegóły dotyczące konstrukcji tej biblioteki przedstawia figura 5.

Biblioteka była poddana skriningowi przez cztery cykle na PIG-tailed EPO-R immobilizowanym na mAb179, przy użyciu elucji EPO od cyklu drugiego w celu wzbogacenia w klony o wyższym powinowactwie. Uzyskiwane inserty DNA klonowano następnie w wektora białka wiążącego maltozę (MBP) pozwalając na ich ekspresję jako C-końcowego białka fuzyjnego. Produkty lizy komórki z przypadkowo wybranych indywidualnych klonów fuzji z MBP poddawano testowi ELISA w celu zbadania ich wiązania z EPO-R. Korzystne peptydy uzyskane w tym badaniu przedstawia tabela 10 poniżej.

Tabela 10

RTKEYSCQMGPLTWICVPKS

SKARYMCHMGPLTWVCRPEV

GGKAYMCRXGPVTWVCSPRIKL

LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR

TIAQYICYMGPETWECRPSPKA

NGRTYSCQLGPVTWVCSRGVRR

LGRKYSCHEGPLTWVCQPAKKD

MKTKYKCYMGPLTWVCEGS

SKTKYRCEMGPLTWVCERW

LTRLYSCHMGPSTWVCSTALRK

RGQLYACHFGFVTWVCKRRKRV

SGILYECHMGPLTWVCTPSRRR

GSKTYSCQLGPVTWVCGRKR

ARGKYQCQFGPLTWECLPIRPR

VTRMYRCRMGPLTWVCER

KPSLYECHLGPLTWECRPRRRE

RGHMYSCQLGPVTWVCKPLSGR

ITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTK

GNRHYQCHMGPLTWVCQPTRIH

MKTKYKCYMGPLTWVCEG SRLK

HLGKYDCSFGPQTWVCKPRRSL

ERRVYECQMGPLTWECKPGVKG

185 040

ITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTK

LGRKYSCHFGPVTWVCQPAKKD

RGRGYSCQMGPVTWVCKRERYF

RLREYRCHMGPQTWVCNGHHSK

SGALYDCQMGPITWVCRANRQK

TNQVYGCKFGPKTWVCKPAPRI

TRGMYACHMGPQTWVCRPTQPR

VLSNYECTMGPKTWVCKPLRLK

Jedną z najbardziej uderzających właściwości peptydów otrzymanych przy użyciu Systemu Lac-I Headpiece Dimer jest akumulacja wielokrotnych dodatnich ładunków w regionach flankujących konserwowanych cystein, szczególnie w RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV, który ma C-końcowe przedłużenie z 5 takich reszt. Aminokwasy, które podlegały wymianie w niewielkim stopniu (tj. Y, C, G, P, T i W) zostały całkowicie zachowane, podczas gdy nowe sekwencje zostały wygenerowane w tych pozycjach, które były bardziej podatne na mutacje. Szczególnie ciekawa jest obecność dodatkowej reszty tyrozynowej w pewnej liczbie peptydów (patrz np. LLRGYECYMGPLTWYCRSSKPR) i obecność dwóch reszt kwasu glutaminowego między cysteinami w TIAQYICYMGPETWECRPSPKA.

Oprócz powyższych badań nad mutagenezą, przeprowadzono mutagenezę peptydu TIAQYICYMGPETWECRPSPKA przy użyciu systemu zmodyfikowanego C-końcowego Lac-I, podobnego do systemu opisanego poprzednio. Istotnym jest, że silnie konserwowane w poprzednich badaniach nad mutagenezą reszty aminokwasowe (tj. Y, C, G, P, T i W) pozostały niezmienione, podczas gdy reszty podlegające wymianie w większym stopniu (tj. H, F, L i V) były wymieniane losowo. Ponadto, dwie reszty kwasu glutaminowego były mutowane w niewielkim stopniu. Reszta tyrozynowa znajdowała się pomiędzy czterema poprzedzającymi ją przypadkowymi resztami a jedną przypadkową resztą. C-koniec schematu mutagenezy kończył się 6 przypadkowymi aminokwasami, następującymi po cysteinie. Szczegóły dotyczące konstrukcji tej biblioteki przedstawia fig. 6.

Biblioteka była poddana skriningowi przez trzy cykle na PIG-tailed EPO-R immobilizowanym na mAb179, przy użyciu elucji EPO od cyklu drugiego w celu wzbogacenia w klony o wyższym powinowactwie. Lifty kolonii zostały wykonane poprzez sondowanie kolejno ludzkim reagentem Fcy-EBP i kozim anty-ludzkim Fcy skoniugowanym z fosfatazą alkaliczną, który otrzymano z Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Następnie zidentyfikowane HPD plazmidy zostały zsekwencjonowane. Peptydy otrzymane w tym badaniu przedstawiono w tabeli 11 poniżej.

Tabela 11

ALKKYDCYFGPETWECLARRPH

ERRFYKCRFGPETWECTL

FGQEYRCHLGPETWQCSPVRVG

FRPEYMCRHGPETWECGGARP

GSRKYwCRMGPETWECMKPVRL

GLKAYGCRYGPETWDCRSVILI

IRQPYICHMGPETWECGRYPAG

KGASYHCIMGPETWECIPQRVW

MKQLYSCIMGPETWECRPGVER

ORHYYRCALGPETWECRPMSPE

TKRLYHCHMGPETWECHGPMRK

TRPS YRCAFGPVTWECIP AR

RHKSYvCTFGPETWECTGAIRR

185 040

RGRMYNCRMGPETWECKGQSKD

RRRYYRCWMGPETWECSPVSNK

VADNYDCPIGPVTWECIHVRAS

VQKKYLCHFGPETWECGPDRD

WQTWYICERGPETWECRWLVL

YRMPYRCKMGPETWECVGGRGR

YSREYSCRMGPETWECXRGFLR

Powyższy zbiór sekwencji peptydów klonowano następnie do wektora białka wiążącego maltozę (MBP) pozwalając na ich ekspresję jako C-końcowego białka fuzyjnego. Produkty lizy komórki z przypadkowo wybranych indywidualnych klonów MBP poddawano testowi ELISA w celu zbadania ich wiązania z EPO-R.

Korzystne peptydy uzyskane w tym badaniu przedstawia tabela 12 poniżej.

Tabela 12

RSMWYRCQMGPQTWVCGPRSAS

SRREYICHLGPQTWVCGPGGRK

GSPSYHCHLGPLTWVCKPHRMR

MVGRYQCHMGPRTWVCKPWHG

GTARYQCHFGPLTWVCKPSLKG

ELRGYICHFGPVTWVCKPNGSR

LKQGYQCQLGPQTWVCRPLRMP

KERKYECQFGPRTWVCQPTRAN

VRKVYACHMGPVTWVCVPGYKG

SGQRYVCRMGPETWVCRSYRGL

ERRSYSCQMGPVTWVCGRQMGQ

VKNNYRCQFGPVTWVCKAFR

SGASYDCQMGPITWVCRANRQK

Reprezentatywne peptydy, w przypadku których stwierdzono, że wiążą się specyficznie z receptorem EPO, zostały przetestowane w funkcjonalnych badaniach komórkowych. W jednym z badań wykorzystano FDCP-1, prekursorową linię multipotencjalnych prymitywnych komórek hemopoetycznych myszy zależnych od czynnika wzrostu (patrz np. Dexter at al. J. Exp. Med. 152: 1036-1046 (1980)), jako linię komórek macierzystych. Ta linia komórkowa może proliferować, ale nie może się różnicować, gdy jest suplementowana pożywką uwarunkowaną WEHI3 (pożywka zawierająca IL-3, ATCC numer T1B68). Macierzystą linię komórkową transfekowano ludzkim lub mysim EPO-R, jak zostało to opisane niżej, w celu otrzymania odpowiednio następujących linii komórkowych: FDCP-1 -hEPO-R lub FDCP-1 -mFPO-r. Uzyskane w ten sposób linie mogą proliferować, ale nie mogą się różnicować, w obecności ludzkiej lub mysiej EPO.

Pokrótce, komórki wzrastają do pół-stacjonarnej gęstości w obecności koniecznych czynników wzrostu. Komórki następnie przemywa się PBS i głodzi przez 16-24 godziny w pełnej pożywce pozbawionej czynników wzrostu. Po określeniu żywotności komórek, roztwory podstawowe (w pełnej pożywce pozbawionej czynników wzrostu) dopełnia się do około 10 komórek na 50 mikrolitrów. Seryjne rozcieńczenia związku (zwykle peptyd

185 040 w postaci wolnego roztworu w przeciwieństwie do peptydu związanego z fagiem lub immobilizowanego w jakikolwiek inny sposób), przeznaczone do przetestowania, wykonuje się na płytkach do kultur tkankowych zawierających po 96 studzienek każda, do objętości 50 mikrolitrów na studzienkę. Komórki (50 mikrolitrów) dodaje się do każdej ze studzienek i inkubuje przez 24-48 godzin, w którym to momencie negatywne kontrole powinny obumrzeć lub stać się nieaktywne. Następnie mierzy się proliferację komórkową za pomocą znanych technik, takich jak badanie MTT, które koreluje z inkorporacją 3H-tymidyny jako wskaźnikiem proliferacji komórkowej (patrz Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55 (1983)). Figura 7 ilustruje wyniki tego badania dla EPO i peptydów wymienionych w tabeli 5. Peptydy, które wiążą się z receptorem EPO i wykazują aktywność w bioanalizie opartej na komórce FDCP-1/hEPO-R są korzystnymi związkami według wynalazku.

W drugim tego typu badaniu wykorzystano linię komórkową TF-1 (patrz Kitamura et al., Blood 73: 375-380 (1989)). Reprezentatywne rezultaty pokazuje fig. 8. Przedstawia on skutki działania EPO i niezwiązanego peptydu YGNYMCHFGPITWYCRPGGG (SEQ ID NO:) na proliferację komórkową linii komórek TF-1.

Inne tego typu badanie, ilustrujące zdolność związków według wynalazku do działania jako agonistów EPO jest oparte na inkorporacji 3H-tymidyny w komórki śledziony myszy poddanej działaniu fenylohydrazyny. Wyniki tego badania przedstawiają fig. 9A-9C.

Dodatkowe próby biologiczne, które mogą być użyte do wykazania aktywności związków według wynalazku są ujawnione w Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931-2935 (1983) (linia hematopoetycznych komórek prekursorowych zależnych od EPO); Quelle i Wojchowski J. Biol. Chem. 266: 609-614 (1991) (tyrozynowa fosforylacja proteiny w komórkach B6SUt.EP); Dusanter-Fourt et al., J. Biol. Chem. 287: 10670-10678 (1992) (tyrozynowa fosforylacja receptora EPO w EPO czułych ludzkich komórkach); Quelle et al., J. Biol. Chem. 267: 17055-17060 (1992) (tyrozynowa fosforylacja proteiny cytozolowej (pp1Ó0) w komórkach FDC-ER); Worthington et al., Exp. Hematol. 15: 85-92 (1987) (badania kolorymetryczne hemoglobiny); Kaiho i Miuno, Anal. Biochem. 149: 117-120 (1985) (wykrywanie hemoglobiny przy użyciu 2,7-diaminofluorenu); Patel et. al., J. Biol. Chem. 267: 2130021302 (1992) (ekspresja c-myb); Witthuhn et. al., Cell 74: 227-236 (1993) (asocjacja i tyrozynowa fosforylacja JAK2); Leonard et. al., Blood 82: 1071-1079 (1993) (ekspresja czynników transkrypcji GATA); Ando et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9571-9575 (1993) (regulacja tranzycji Gj/3 poprzez zmieniające się cyklicznie D2 i D3); i przepływ wapnia.

Przyrząd skonstruowany przez Molecular Devices Corp., znany jako mikrofizjometr, był z powodzeniem użyty do pomiarów efektu agonistów i antagonistów na różne receptory. Podstawą działania tego przyrządu jest pomiar zmian szybkości zakwaszania środowiska zewnątrzkomórkowego w odpowiedzi na aktywację receptora.

Peptydy według wynalazku są dimeryzowane lub oligomeryzowane, przez co zwiększa się powinowactwo i/lub aktywność głównych związków tutaj przedstawionych. W celu zbadania efektu dimeryzacji/oligomeryzacji peptydu na mimetyczną siłę działania EPO w próbach proliferacji komórki, zsyntetyzowano biotynylowany analog GGTYSCHFGPLTWYCKPQGG (tj. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna)).

Peptyd ten inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej ze streptawidyną w PBS w stosunku molowym 4:1. Następnie, w celu oznaczenia IC50, kompleks wprowadzano do próby testującej wiązanie z PIG-tailed receptorem EPO. W takim samym eksperymencie zbadano także peptyd, który nie był skompleksowany streptawidyną. Wykazano, że skompleksowany peptyd ma IC50 równe 20 nM podczas gdy IC50 peptydu, który nie był inkubowany w obecności streptawidyny, wynosi 350 nM. Ten większy niż dziesięciokrotny wzrost powinowactwa pozornego jest przypuszczalnie spowodowany wielowartościowością kompleksu peptydu ze streptawidyną. Ponieważ porównanie to zostało wykonane przy użyciu stężeń wolnego peptydu, a nie efektywnego stężenia kompleksu (teoretycznie 4 razy mniejszego), wzrost powinowactwa będzie nawet większy.

Ponadto, peptyd ten preinkubowano ze streptawidyną w RPMI buforowanym przez HEPES, w nieobecności surowicy, w stosunku molowym 4:1, tak jak wyżej. Kompleks ten24

185 040 przetestowano w celu zbadania stymulacji proliferacji komórkowej wbiopróbie FDCP1/hEPO-R, razem z niezwiązanym GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna) i macierzystym peptydem niebiotynylowanym, tj. GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG. Figura 10 przedstawia wyniki badania gdzie EPO-ED50 dla wszystkich peptydów jest podobne (około 1 pM), ale EPO-ED50 wcześniej utworzonego kompleksu streptawidyny wynosiło mniej niż 10 nM, co oznacza jego zmniejszenie o dwa rzędy wielkości. Sama streptawidyna wykazywała małe efekty stymulujące przy dużych stężeniach, przypuszczalnie z powodu zanieczyszczenia bakteryjną endotoksyną.

Dodatkowo, wzrost w biologicznej sile działania zaobserwowano gdy peptyd był zdimeryzowany z kozią antybiotyną IgG. Figura 11 pokazuje, że zmniejszenie EPO-ED50 o jeden rząd wielkości może być osiągnięte poprzez preinkubację GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna) z oczyszczoną kozią antybiotyną IgG w stosunku molowym 2:1. Wzrost biologicznej siły działania jest przypuszczalnie spowodowany dimeryzacją peptydu przez przeciwciała. Same przeciwciała antybiotynowe nie mają żadnego wpływu na komórki. Ponadto, stokrotne obniżenie EPO-ED50 zaobserwowano dla kompleksu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna)-streptawidyna. Tak więc, poprzez dimeryzację lub oligomeryzację głównych peptydów według wynalazku, można zwiększyć ich powinowactwo i/lub aktywność.

W innym wykonaniu, sporządzono dimeryczny analog peptydu GGTYSCHFGPLTWYCKPQGG zawierający dwa wiązania dwusiarczkowe, stosując ogólnego schemat przedstawiony na fig. 12. W skrócie, pierwszy łańcuch peptydowy zestawiono na żywicy Tentagel. Fmoc-Lys(Alloc) sprzężono z łącznikiem Knorr, gdzie grupa Alloc została użyta jako ortogonalna grupa chroniąca. Cys(Acm) użyto dla pierwszego łańcucha peptydowego. Po zakończeniu pierwszego łańcucha peptydowego, Alloc usunięto i zbudowano drugi łańcuch peptydowy na bocznych grupach aminowych reszty lizynowej. W tym łańcuchu peptydowym użyto Cys(trt). Po zakończeniu syntezy peptyd oddzielano od żywicy i oczyszczono. Następnie cyklizowano go do związku zawierającego jedno wiązanie dwusiarczkowe. Następnie, tworzono drugie wiązanie dwusiarczkowe poprzez utlenianie jodem, co w rezultacie doprowadziło do powstania dwucyklicznego dimeru.

Figury 13 i 14 przedstawiają wiązanie się z receptorem EPO in vitro i biologiczną aktywność dimeru. Powinowactwo dimeru zbadano poprzez skrining wobec PIG-tailed EPO-R immobilizowanego na mAb179 w studzienkach płytek. Próba równowagowego wiązania kompetycyjnego, wykazała, ze wartość powinowactwa wyniosła około 2 nM, nastąpił dwustu krotny wzrost w stosunku do peptydu macierzystego, GGTYSCHFGPLTWYCKPQGG, (200nM), i pięciokrotny wzrost w stosunku do kompleku GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (Ahx-biotyna)-streptawidyna. Bioaktywność in vitro, mierzona poprzez proliferację komórki FDCP-1/hEPO-R, wzrosła około dwudziestokrotnie, ZEC50 równego 400 nM (dla macierzystego peptydu) do 20 nM. Tak więc przez dimeryzację i oligomeryzację można zwiększyć w znaczący sposób powinowactwo i/lub aktywność biologiczną głównych peptydów według wynalazku.

Opisano również peptydy lub ich pochodne, które mogą być koniugowane z innymi związkami zdolnymi do związania EPO-R, tworząc w ten sposób związki, których powinowactwo do receptora jest dużo większe niż któregokolwiek z osobna. Odkrycie tych peptydów ułatwia także identyfikację peptydów łączących się z tym samym miejscem aktywnym na EPO-R, ponieważ możliwe jest zawężenie biblioteki i procedury rozdzielania w celu wyeliminowania peptydów z komplementarnym „nieblokującym” motywem.

Sekwencja motywu dostarcza także środka do określenia minimalnej wielkości agonisty EPO według wynalazku. Użycie systemu „kodowanej syntetycznej biblioteki” (ESL) (opisanego w zgłoszeniu patentowym USA Nr 946,329 z 16 września 1992, będącego częściową kontynuacją zgłoszenia USA Nr 762.522 z 18 września 1991), lub systemu „syntezy immobilizowanego polimeru na dużą skalę” (opisanego w zgłoszeniu patentowym USA Nr 492,462 z 7 marca 1990; 642,120 z 6 grudnia 1990; i 805,727 z 6 grudnia 1991); pozwala nie tylko na określenie minimalnej wielkości peptydu z taką aktywnością ale również na wytworzenie wszystkich peptydów, które tworzą grupę peptydów różniących się od korzystnego motywu

185 040 (lub minimalnych jego rozmiarów) o jedną, dwie lub więcej reszt ammykwasowych. Ten zbiór oeotydθw może być również skriningowany w celu zbadania zdolności wiązania z receptorem EPO. System syntezy na immybilizywanym polimerze lub każda inna metoda może być użyta do syntezy analogów związków według wynalazku powstałych poprzez 4(1οcję zewnętrznych i wewnętrznych reszt, albo kombinację tych analogów.

Pnptody według wynalazku mogą być również syntetyzowane klasycznymi metodami, np. przez użycie standardowych technik fazy stałej. Do metod standardowych należą: synteza w wyłącznie w fazie stałej, synteza fazy częściowo stałej, kondensacja fragmentów, klasyczna synteza w roztworze, a nawet technologia rekombinacji DNA. (Patrz np. Merritield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963)). W odniesieniu do fazy stałej (stałego nośnika) syntezę zwykle zaczyna się od strony C-końcowej peptyyu, przy użyciu α-aminozabnzpinczonnJ żywicy. Odpowiedni materiał wyjściowy może być przygotowany na przykład poprzez dołączenie wymaganego α-aminokwasu do żywicy chloromntylywanej, żywicy hydroksymntylywej, lub żywicy bnnzhydryloaminownJ. Jedną z chlorometylywanych żywic jest żywica sprzedawana pod handlową nazwą BIO-BEADS SX-1 przez Bio Rad Laboratories, Richmond, CA. Przygotowanie żywicy hydroksymntolywej zostało opisane w Bydynszky et al., Chem. Ind. (London) 38: 1597 (1966). Żywica bnnzhydryloaminywa została opisana w Pietta i Marshail, Chem. Comm. 650 (1970), i jest do nabycia wBeckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, w formie chlorowodorkowej.

Zatem związki według wynalazku mogą być przygotowane przez sprzęganie α-amino blokowanego aminokwasu z żywicą chlorometylowaną. z pomocą np. katalizatora w postaci węglanu cezu, tak jak w metodzie opisanej w Gisin, Helv. Chim. Acta 56: 1467 (1973). Po początkowym sprzężeniu, grupa α-aminową grupę blokującą usuwa się jednym z wielu możliwych reagentów np. roztworem kwasu trifluoroyctowngo (TFA) lub kwasu solnego (HCl) w organicznych rozpuszczalnikach w temperaturze pokojowej.

Do blokowania grup α-aminowych stosuje się grupy znane w wieloetapowych syntezach oeotydów. Należą do nich blokujące grupy acylowe (np. formyl, acetyl, trifluoroacetyl), blokujące aromatyczne grupy metanowe (np. bnnzyloksokarbynyl (Cbz), podstawiony Cbz), blokujące alifatyczne grupy metanowe (np. t-butyloksokarbonyl (Boc), izopropylyksykarbynyl, cykloheksoloksykarbonyl) i blokujące grupy alkilowe (np. benzyl, ^^ο^^ροΙοΙ). Fmoc jest korzystną grupą blokującą. Grupy blokujące łańcuchy boczne (etery, estry, trityl (trifenylometyl), PMC, i tym podobne) pozostają nienaruszone podczas sprzęgania i nieodłączają się nawet podczas usuwania grupy blokującej koniec aminowy. Grupa blokująca łańcuch boczny powinna dać się usunąć po zakończeniu syntezy i nie zmieniać docelowego onptodu w warunkach reakcji.

Do grup blokujących łańcuchy boczne dla Tyr należą grupy tetrahydropiranylywa, tertbutylowa, tritylowa, benzylowa, Cbz, Z-Br-Cbz, i 2,5-dichlyrobenzylywa. Do grup blokujących łańcuchy boczne dla Asp należą grupy benzylowa, 2,6-dichlyrybnnzylywa, metylowa, etylowa i cykloheksylowa. Do grup blokujących łańcuchy boczne dla Thr i Ser należą grupy acetylowa, benzoilowi-a, tritylowa, tntrahydryoiranylywa, benzylowa, 2,6-dichlyrobenzylowa i Cbz. Grupami blokującymi łańcuchy boczne dla Thr i Ser są grupy benzylowe. Do grup blokujących łańcuchy boczne dla Arg należą grupy nitrowe, tosylywn (Tos), adamantylyksykarbonylowe, mnzytoilysulfonylywn (Mts), lub Boc. Do grup blokujących łańcuchy boczne dla Lys należą grupy Cbz, 2-chlyrobnnzylyksykarbynylywa (2-Cl-Cbz), 2-brymybnnzylyksykarbonylowa (2-Br-Cbz), Tos lub Boc.

Po usunięciu grupy blokującej, grupę α-aminywą, pozostałe zablokowane aminokwasy łączy się etapowo w pożądanej kolejności. Każdy z blokowanych aminokwasów poddaje się reakcji z trzykrotnym nadmiarem odpowiedniego aktywatora grupy karboksylowej np. heksafluoryfosfyran 2-(1H-bnnzotriazol-1-ily)-1,1,3,3-tetrametylourynlum lub dicyklyheksylykarbodiimidu (DDC) w roztworach, np. w mieszaninach chlorku metylenu (CH2CI2) i dimetyloformamidu (DMF).

Po zakończeniu pożądanej sekwencji aminokwasów, pylipeptod uwalnia się z żywicy przy użyciu reagenta takiego jak kwas trlfluyrooctywy (TFA) lub fluorowodoru, który nie tylko uwalnia peptyy z żywicy, ale także odblokowywaje wszystkie jego boczne łańcuchy.

185 040

Kiedy stosuje się żywicę chlorometylową, podziałanie fluorowodorem powoduje powstanie wolnego kwasu peptydowego. Kiedy stosuje się żywicę benzhydrylową, podziałanie fluorowodorem powoduje powstanie wolnego amidu peptydowego. Alternatywnie, jeśli stosuje się żywicę chlorometylowaną, peptyd z zabezpieczonym łańcuchem bocznym można odszczepić przez działanie na peptydo-żywicę amoniakiem z wytworzeniem żądanego amidu z zabezpieczonym łańcuchem bocznym, albo alkiloaminą z wytworzeniem alkiloamidu lub dialkiloamidu z zabezpieczonym łańcuchem bocznym. Blokada łańcuchów bocznych jest wówczas usunięta w normalny sposób poprzez działanie fluorowodoru, dzięki któremu otrzymane są wolne amidy, alkiloamidy i dialkiloamidy.

W przygotowaniu estrów peptydów według wynalazku, wykorzystywane są żywice służące do przygotowania kwasów peptydowych i peptyd z chronionymi łańcuchami bocznymi jest uwolniony przez użycie zasady i odpowiedniego alkoholu, np. metanolu. Grupy chroniące łańcuchy boczne są wówczas usunięte w zwykły sposób poprzez działanie fluorowodoru w celu otrzymania pożądanego estru. Sposób postępowania w syntezie metodą fazy stałej jest dobrze znany i dokładniej opisany w Stewart, Solid Phase Peptide Syntheses (Freeman and Co., San Francisco, 1969).

Postępowanie to może być również wykorzystane w syntezie peptydów, w których zawierają się aminokwasy inne niż 20 aminokwasów występujących naturalnie, genetycznie kodowane aminokwasy są zamienione w jednej, dwóch lub więcej pozycjach każdego ze związku według wynalazku. Na przykład, naftyloalanina może być podstawiona, dzięki ułatwieniom syntezy, za tryptofan. Inne syntetyczne aminokwasy takie jak L-hydroksypropyl, L-3,4-dihydroksyfenyloalanyl, δ-aminokwasy takie jak L-Ś-hydroksyli/yl i D-Ś-metyloalanyl, L-α-metyloalanyl, β-aminokwasy i izochinon mogą być podstawiane w peptydach według wynalazku. D-aminokwasy i nie występujące w przyrodzie syntetyczne aminokwasy mogą być także zawarte przez opisane tu peptydy.

Możliwa jest wymiana naturalnie występujących łańcuchów bocznych 20 genetycznie kodowanych aminokwasów (lub D-aminokwasów) innymi bocznymi łańcuchami zawierającymi, na przykład, grupy alkilowe, niższe grupy alkilowe, 4, 5, 6 do 7, członowe cykliczne grupy alkilowe, amidy, amidy niższych grup alkilowych, amidy dialkilowych niższych grup, niższe grupy alkoksy, hydroksy, karboksy lub ich niższe estrowe pochodne i 4, 5, 6 i 7 członowe heterocykle. W szczególności, mogą być wykorzystane analogi proliny, w których wielkość 5 członowego pierścienia reszty prolinowej jest zmieniona do 4, 6 lub 7 członowego pierścienia. Grupy cykliczne mogą być grupami nasyconymi lub nienasyconymi, jeżeli są nienasycone to mogą być aromatyczne lub też nie.

Grupy cykliczne mogą być grupami nasyconymi lub nienasyconymi, jeżeli są nienasycone to mogą aromatyczne lub też nie. Grupy heterocykliczne korzystnie zawierają jeden lub więcej heteroatom azotu, tlenu i/lub siarki. Przykładami takich grup są grupy furazanylowa, furylowa, imidazolidylowa, imidazolilowa, imidazolinylowa, izotiazolilowa, i izooksazolilowa, morfolinylowa, (np. morfolino), oksazolilowa, piperazynylowa (np. 1-piperazynyl), piperydylowa (np. 1-piperydyl, piperidino), piranylowa, pirazynylowa, pirazolidynylowa, pirazolinylowa, pirazolilowa, pirydazynylowa, pirydylowa, pirymidynylowa, pirrolidynylowa, (np. 1-pirrolidynyl), pirrolinylowa, pirrolilowa, tiadiazolilowa, tiazolilowa, tienylowa, tiomorfolinylowa, (np. tiomorfolino) i triazolilowa. Wyżej wymienione grupy heterocykliczne mogą być podstawione lub niepodstawione. Jeżeli grupa jest podstawiona, podstawnikiem może być alkil, alkoksy, halogen, tlen, podstawiony lub niepodstawiony fenyl.

Możliwa jest również szybka modyfikacja peptydów według wynalazku, poprzez fosforylację i inne metody otrzymywania pochodnych peptydów związków według wynalazku opisanych w Hruby et al. Dlatego też związki peptydowe według wynalazku mogą służyć za podstawę w przygotowaniu mimetyków peptydowych o podobnej aktywności biologicznej.

Związki peptydowe według wynalazku, wraz z peptydomimetykami, mogą być zmodyfikowane kowalentnie poprzez jeden lub więcej różnorodnych polimerów niebiałkowych, np. glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy lub polioksyalkeny, tak jak jest to przedstawione w następujących zgłoszeniach: patent USA Nr 4,640,835; patent USA Nr 4,496,689; patent USA Nr 4,301.144; patent USA Nr 4,670,417; patent USA 4,179,337.

185 040

Rzeczoznawcy uznają różnorodność technik, służących do konstrukcji mimetyków peptydowych o takiej samej lub podobnej, pożądanej biologicznej aktywności odpowiadającego związku peptydowego, ale o bardziej korzystnych aktywnościach w odniesieniu do rozpuszczalności, stabilności, podatności na hydrolizę i proteolizę. (Patrz, na przykład, Morgan i Gainor; Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252 (1989)). Poniżej są opisane metody przygotowania mimetyków peptydowych zmodyfikowanych na N-końcowej grupie aminowej, C-końcowej grupie karboksylowej, i/lub zmiany jednego lub więcej wiązania amidowego na wiązanie nieamidowe. Zrozumiałym jest, że dwie lub więcej modyfikacje tego typu mogą mieć miejsce równocześnie w jednej mimetycznej strukturze (np. modyfikacja C-końcowej grupy karboksylowej i wkomponowanie wiązania -CI2-karbaminianowego pomiędzy dwoma aminokwasami w peptydzie).

Peptydy są najczęściej syntetyzowane w postaci wolnych kwasów, ale jak wspomniano wyżej mogą być bez większych trudności przygotowane w postaci amidów lub estrów. Możliwe jest także zmodyfikowanie amino- i/lub karboksy- końców związków peptydowych według wynalazku w celu wyprodukowania innych związków według wynalazku. Do modyfikacji amino - końca należą metylowanie (tj. -NHCH3 lub -NH(CH3)2), acetylowanie, addycja grupy karbobenzoilowej lub blokowanie końca aminowego jakąkolwiek grupą zawierającą grupę karboksylową (grupa funkcyjna) zdefiniowaną przez RCOO-, gdzie R jest wybrane z grupy zawierającej naftyl, akrydynyl, steroidyl, i inne podobne grupy. Do modyfikacji zakończenia karboksy należą wymiana wolnego kwasu na grupę karboksyamidową lub powstanie pierścienia laktamowego w celu wprowadzenia ograniczeń strukturalnych.

Do modyfikacji amino końca tak jak przytoczono wyżej należą alkilowanie, acylowanie, addycja grupy karbobenzoilowej, tworzenie grupy sukcynoimidowej itd. N-końcowa amino grupa może reagować bardzo specyficznie w następujących reakcjach:

a) tworzenia grupy amidowej o wzorze RC(0)NH, gdzie R pozostaje zdefiniowane tak jak powyżej, w reakcji z halogenkiem (np. RC(O)Cl) lub bezwodnikiem kwasowym. Reakcja może być przeprowadzona przez skontaktowanie w przybliżeniu ilości równomolowych lub ilości nadmiarowych (np. około 5 ekwiwalentów) halogenku kwasowego w stosunku do peptydu w środowisku inertnego rozpuszczalnika (np. dichlorometanu) korzystnie zawierającego nadmiar (np. około 10 ekwiwalentów) aminy trzeciorzędowej, takiej jak diizopropyloetyloamina, w celu wiązania kwasu generowanego podczas reakcji. Warunki reakcji są skądinąd konwencjonalne (tj. temperatura pokojowa przez 10 minut). Alkilowanie końcowej grupy aminowej w celu dostarczenia N-substytucji niższych alkili, po której następuje opisana powyżej reakcja z halogenkiem kwasowym dostarcza N-alkiloamidowych grup o wzorze RC(O)NR-;

b) tworzenia grupy sukcynoimidowej w reakcji z bezwodnikiem kwasu bursztynowego. Jak uprzednio, w przybliżeniu równomolowe ilości lub nadmiar bezwodnika (tj. około 5 ekwiwalentów) są wykorzystane i amino grupa jest przekształcona w sukcynoimid powszechnie znanymi metodami zakładającymi nadmiar (tj. 10 ekwiwalentów) trzeciorzędowej aminy takiej jak diizopropyloetyloaminy w stosownym inertnym rozpuszczalniku (np. dichlorometan). (Patrz, na przykład, Wollenberg, et al., patent USA nr 4,612,132). Zrozumiałe jest, że grupa sukcynoimidowa, może ulec podstawieniu alkilem o 2 do 6 atomach węgla lub podstawnikiem -SR, które są przygotowane w sposób konwencjonalny w celu dostarczenia podstawionego sukcyimidu w N-końcu peptydu. Tego typu podstawniki alkilowe są przygotowane w reakcji niższych olefin (C2-C6) z bezwodnikiem maleinowym w sposób opisany przez Wollenberga, et al., supra. i SR substytuty są przygotowane w reakcji RSH z bezwodnikiem maleinowym, gdzie R jest zdefiniowane jak powyżej;

c) tworzenia grupy benzyloksykarbonylo-NH lub podstawionego bezyloksykarbonyloNH w reakcji około ekwiwalentnej ilości lub nadmiaru CBZ-Cl (tj. chlorku benzyloksykarbonylu) lub podstawionego CBZ-Cl w odpowiednim, inertnym rozpuszczalniku (np. dichlorometan) korzystnie zawierającym trzeciorzędową aminę w celu wiązania kwasu generowanego podczas reakcji;

d) tworzenia grupy sulfonamidowej w reakcji ekwiwalentnej ilości lub nadmiaru (tj. 5 ekwiwalentów) R-S(O)2Cl w odpowiednim inertnym rozpuszczalniku (np. dichlorometan)

185 040 w celu przeprowadzenia końcowej grupy aminowej w sulfoimidową, gdzie R jest zdefiniowane jak uprzednio. Korzystnie inertny rozpuszczalnik zawiera nadmiar trzeciorzędowej aminy (tj. 10 ekwiwalentów) takiej jak diizopropyloetyloamina, przeznaczonej do wiązania kwasu generowanego podczas reakcji. Warunki reakcji są skądinąd konwencjonalne (tj. temperatura pokojowa przez 30 minut);

e) tworzenia grupy karbaminianowej w reakcji z ekwiwalentną ilością lub nadmiarem (tj. 5 ekwiwalentów) R-OC(O)Cl lub R-OC(O)OC_bH4-p-NO2 w odpowiednim inertnym rozpuszczalniku (np. dichlorometan) w celu zamiany końcowej aminy w karbaminian gdzie R jest zdefiniowane jak uprzednio. Korzystnie, inertny roztwór zawiera nadmiar (np. około 10 ekwiwalentów) trzeciorzędowej aminy, takiej jak diizopropyloetyloamina przeznaczonej do wiązania kwasu generowanego podczas reakcji. Warunki reakcji są skądinąd konwencjonalne (tj. temperatura pokojowa przez 30 minut); i

f) tworzenia grupy mocznikowej w reakcji z ekwiwalentną ilością lub nadmiarem (np. 5 ekwiwalentów) R-N=C=O w odpowiednim inertnym rozpuszczalniku (np. dichlorometan) w celu zamiany końcowej aminy w grupę mocznikową (tj. RNHC(O)NH-) gdzie R jest zdefiniowane jak uprzednio. Korzystnie, inertny roztwór zawiera nadmiar (np. około 10 ekwiwalentów) trzeciorzędowej aminy, takiej jak diizopropyloetyloamina. Warunki reakcji są skądinąd konwencjonalne (tj. temperatura pokojowa przez około 30 minut);

Dodatkowo lub alternatywnie, C-koniec może być modyfikowany. W przygotowaniu mimetyków peptydowych, w których C-końcowa grupa karboksylowa jest zastąpiona przez ester (tj. -C(O)OR gdzie R jest zdefiniowane jak uprzednio), żywice używane do przygotowania kwasów peptydowych są wykorzystywane i peptyd o chronionym bocznym łańcuchu jest uwolniony przez zasadę i odpowiedni alkohol np. metanol. Grupy chroniące łańcuchy boczne są usunięte poprzez dodanie fluorowodoru w celu uzyskania pożądanego estru.

W przygotowaniu mimetyków peptydowych w których C-końcowa grupa karboksylowa jest zastąpiona przez amid C(O)NR3R⁴, żywica benzhydryloaminowa jest użyta jako stała faza w syntezie peptydów. Przy końcu syntezy, fluorowodór jest użyty w celu uwolnienia peptydu z żywicy co bezpośrednio prowadzi do powstania wolnego amidu peptydowego (tj. C-koniec jest -C(O)NH2). Alternatywnie, użycie żywicy chlorometylowanej podczas syntezy peptydu w reakcji z amoniakiem w celu uwolnienia chronionego, bocznego łańcucha peptydu powoduje powstanie wolnego amidu peptydowego i reakcje z alkiloaminą lub dialkiloaminą prowadzą do powstania alkiloamidu lub dialkiloamidu o chronionym bocznym łańcuchu (tj. C-koniec jest -C(O)NRR* gdzie R i R¹ są zdefinowane jak powyżej). Ochrona bocznego łańcucha jest usunięta przez dodanie fluorowodoru w celu uzyskania wolnych amidów, alkiloamidów lub dialkiloamidów.

W innej alternatywnej formie, C-końcowa grupa karboksylowa lub C-końcowy ester może być poddany cyklizacji przez wewnętrzne przemieszczenie -OH lub estru (-OR) grupy karboksylowej lub estru odpowiednio, na N-końcową amino grupę z utworzeniem cyklicznego peptydu. Na przykład, po syntezie i uwolnieniu prowadzącym do otrzymania kwasu peptydowego, wolny kwas jest przekształcany w aktywowany ester przez odpowiedni aktywator grupy karboksylowej, taki jak dicykloheksylokarbodiimid (DCC) w roztworze, na przykład w mieszaninach chlorku metylenu (CH2O2), dimetyloformamidu (DMF). Cykliczny peptyd jest tworzony przez wewnętrzne przemieszczenie aktywowanego estru na N-końcową aminę. Wewnętrzna cyklizacja w przeciwieństwie do polimeryzacji może być wzmocniona przez użycie bardzo rozcieńczonych roztworów. Metody te są powszechnie znane.

Możliwa jest cyklizacja peptydów według wynalazku, lub inkorporacja reszt deamino i dekarboksy na końcach peptydów, tak więc nie ma amino lub karboksylo końcowych grup, zmniejszająca podatność na działanie proteaz lub ograniczających konformację peptydu. C-końcowe funkcyjne grupy związków według wynalazku zawierają amid, niższy alkiloamid, amid di(niższego alkilu), niższy alkoksy, hydroksy i karboksy oraz nizsze estrowe pochodne tychże i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Inne metody tworzenia peptydowych pochodnych związków według wynalazku są opisane w Hruby, et al., Biochem J. 268 (2): 249-262 (1990). Związki peptydowe według wynalazku służą za strukturalne modele niepeptydowych związków o podobnej aktywności biolo185 040 gicznej. Znawcy przedmiotu dysponują różnorodnością technik pozwalających konstruować związki o identycznej lub zbliżonej do pożądanej aktywności biologicznej głównego związku peptydowego, ale z korzystniejszymi od niego właściwościami z zakresu rozpuszczalności, stabilności i podatności na hydrolizę i proteolizę. (Patrz, Morgan i Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243-252 (1989)). Techniki te polegają na zastąpieniu głównego łańcucha peptydowego innym, złożonym z fosfonianów, amidianów, karbaminianów, sulfonamidów, amin drugorzędowych i N-metyloaminokwasów.

Peptydowe mimetyki, w których jedno lub więcej wiązań peptydowych [-C(O)NH-] jest zastąpione przez wiązania takie jak -CH₂-karbaminianowe, fosfonianowe, -CH₂-sulfonoamidowe, mocznikowe, drugorzędowo aminowe (-CH₂NH-) i alkilowane peptydowe [-C(O)NR⁶ gdzie R⁶ jest niższym alkilem] są produkowane podczas konwencjonalnej syntezy peptydowej tylko przez zastąpienie aminokwasowego reagenta analogiem odpowiednio chronionego aminokwasu na odpowiednim etapie syntezy.

Odpowiednie reagenty zawierają, na przykład, analogi aminokwasów, w których grupa karboksylowa aminokwasu była zastąpiona inną, odpowiednią do utworzenia jednego z powyższych wiązań. Na przykład, zastąpienie -C(O)NR- w peptydzie innym -CH2karbaminianowym (-CH20C(O)NR-) gdzie grupa karboksylowa (-COOH) odpowiednio chronionego aminokwasu jest najpierw redukowana do grupy -CH2OH, która jest następnie przekształcona metodami konwencjonalnymi w grupę funkcyjną -OC(O)Cl lub grupę funkcyjną -OC(O)O-C6H4-p-NO2. Reakcja jednej z dwóch wyżej wymienionych grup funkcyjnych z wolną aminą lub alkiloaminą na N-końcu częściowo wyprodukowanego peptydu znajdującego się na stałym nośniku prowadzi do utworzenia wiązania -CH₂OC(O)NR-. Bardziej szczegółowy opis dotyczący powstawania wiązań typu -CH2-karbaminianowych, patrz Cho et al., Science, 261: 1303-1305 (1993).

Podobnie zastąpienie wiązania amidowego w peptydzie wiązaniem fosfonianowym może być osiągnięte metodą ze zgłoszenia patentowego USA Nr 07/943,805, 09/081,577 i 08/119,700.

Zastąpienie wiązania amidowego w peptydzie wiązaniem -CH₂-sulfonamidowym może być osiągnięte przez redukcję grupy karboksylowej (-COOH) odpowiednio chronionego aminokwasu do grupy -CH2ÓH i grupy hydroksylowej, które są następnie przekształcone w odpowiednio opuszczające grupy takie jak tosylowa, przy użyciu metod konwencjonalnych. Reakcja tosylowanej pochodnej z, na przykład, kwasem tiooctowym, a następnie hydroliza i chlorowanie oksydacyjne grupy funkcyjnej -CH₂-S(O)2Cl, która zastępuje grupę karboksylową odpowiednio chronionego aminokwasu. Użycie analogu tego odpowiednio chronionego kwasu w syntezie peptydu prowadzi do powstania wiązania -CH2S(O)2NR, które zastępuje wiązanie amidowe w peptydzie co z kolei prowadzi do powstania mimetyku peptydowego. Bardziej szczegółowy opis konwersji grupy karboksylowej aminokwasu w grupę -CH2S(O)2Cl, patrz, na przykład, Weinstein, Boris, Chemistry and Biochemistyry of Amino Acids, Peptides and Proteins, 7: 267-357, Marcel Dekker, Inc, New York (1983).

Zastąpienie wiązania amidowego w peptydzie wiązaniem mocznikowym może być osiągnięte metodą ze zgłoszenia patentowego USA nr 08/147,805.

Drugorzędowoaminowe wiązania, w których wiązanie -CH2NH- zastępuje wiązanie amidowe w peptydzie mogą być przygotowane przy użyciu np. odpowiednio chronionego dipeptydowego analogu, w których wiązanie karbonylowe wiązania amidowego zostało zredukowane, przy użyciu metod konwencjonalnych, do grupy CH2. Na przykład, w przypadku diglicyny, redukcja amidu do aminy doprowadzi, po uprzednim uwolnieniu grup chroniących, do powstania H₂NCH₂CH₂NHCH₂COOh, który jest użyty w N-chronionej formie do następnej reakcji sprzęgania. Przygotowanie takich analogów przez redukcją grupy karbonylowej w wiązaniu amidowym dipeptydu jest powszechnie znane.

Analog odpowiednio chronionego aminokwasu jest używany w konwencjonalnej syntezie peptydu w ten sam sposób w jaki mógłby być użyty odpowiedni aminokwas. Na przykład, około 3 ekwiwalenty analogu blokowanego aminokwasu są wykorzystane w tej reakcji. Użyty jest inertny, organiczny rozpuszczalnik taki jak chlorek metylenowy lub DMF, kiedy kwas powstaje jako produkt uboczny zachodzącej reakcji, reakcyjny rozpuszczalnik będzie zawierał

185 040 nadmiar amin trzeciorzędowych w celu jego usunięcia. Jedną ze szczególnie korzystnych amin trzeciorzędowych jest diizoetylopropyloamina używana w około 10-krotnym nadmiarze. Wynikiem reakcji jest inkorporacja w mimetyku peptydowym analogu aminokwasu posiadającego niepeptydowe wiązanie. Taka substytucja może być powtarzana w razie potrzeby, aż do zastąpienia wszystkich wiązań amidowych przez wiązania nieamidowe.

Można również cyklizować peptydy według wynalazku lub inkorporować resztę deamino lub dekarboksy na końcach peptydów, tak więc pozbawiać końcowych grup aminowych lub karboksylowych by zmniejszyć podatność na działanie proteaz lub ograniczyć konformację peptydu. C-końcowe grupy funkcyjne związków według wynalazku zawierają amid, niższy alkiloamid, amid di(niższego alkilu), niższy alkoksy, hydroksy i karboksy oraz niższe estrowe pochodne tychże i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Zgodnie z inną korzystną formą, X3 i Χχ będą niezależnie wybrane z grupy C i Hoc. Tak więc związki według wynalazku mogą istnieć w cyklizowanych formach z wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym. Alternatywnie, międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe powstaje przy tworzeniu związku dimerycznego. Te wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe pochodne dwusiarczkowe mogą być przedstawione schematycznie:

w którym m lub n są niezależnie 1 lub 2.

Dodatkowo obok wyżej przedstawionych metod cyklizacji mogą być zastosowane inne metody cyklizacji niedwusiarczkowych peptydów. Alternatywne metody cyklizacji obejmują, na przykład, metody cyklizacji amidów, jak również metody cyklizacji związane z tworzeniem wiązań tioeterowych. Tak więc, związki według wynalazku mogą istnieć w formach cyklizowanych przy użyciu albo amidowego wiązania międzycząsteczkowego, albo tioestrowego wiązania międzycząsteczkowego. Żeby zilustrować wykonalność metody cyklizacji amidowej, peptyd oparty na ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg był syntetyzowany przez zastąpienie pierwszej cysteiny lizyną, drugiej cysteiny kwasem glutaminowym, a cykliczny monomer został utworzony przez wiązanie amidowe, pomiędzy łańcuchami bocznymi tych dwóch reszt. Ponadto żeby zilustrować wykonalność metody cyklizacji tioeterowej, peptyd oparty na ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg był syntetyzowany przez zastąpienie pierwszej cysteiny lizyną a cykliczny monomer został utworzony przez wiązanie tioeterowe pomiędzy łańcuchami bocznymi reszty lizynowej i C-końcowej cysteiny. Zarówno metody dwusiarczkowej cyklizacji, jak i metody amidowej i tioeterowej cyklizacji mogą być użyte w stosunku do związku według wynalazku.

Alternatywnie, N-koniec peptydu może być zastąpiony alfa-podstawionym kwasem octowym w którym alfa-podstawnik należy do opuszczającej grupy takiej jak grupa kwasu α halogenooctowego, na przykład, kwasu α-chlorooctowego, α-bromooctowego lub αjodooctowego. Związki według wynalazku, w których X3 jest C lub Hoc mogą być cyklizowane przez podstawienie opuszczającej grupy siarką reszty X;,. (Patrz, na przykład, Barker at el., J. Med. Chem. 35: 2040/2048 (1992) i Or et. al., J. Org. Chem. 56: 3146-3149 (1991).

Związki według wynalazku mają zastosowanie in vitro jako unikalne narzędzia do zrozumienia biologicznej roli EPO, oceny wielu czynników wpływających na i będących pod wpływem produkcji EPO oraz wiązania EPO z EPO-R. (Na przykład mechanizm, sygnałowa transdukcja EPO/aktywacja receptora. Przedstawione związki mają również zastosowanie w wytwarzaniu innych innych związków wiążących się z EPO-R, ponieważ przedstawione związki dostarczają ważnych informacji, dotyczących struktury i aktywności (SAR--structureactivity relationship).

185 040

Ponadto w oparciu o ich zdolność wiązania się z receptorem EPO, peptydy według wynalazku mogą być użyte jako reagenty wykrywające receptory EPO na żywych komórkach, unieruchomionych komórkach, w płynach biologicznych, w homogenatach tkankowych, oczyszczonych, naturalnych materiałach biologicznych itp. Na przykład, przez oznaczenie takich peptydów można identyfikować komórki posiadające na swojej powierzchni EPO-R. Ponadto w oparciu o ich zdolności do wiązania receptora EPO, peptydy według wynalazku mogą być użyte do znakowania in situ, fACS - fluorescence-activated cell sorting, Western blotting, ELISA, (enzyme-linked immunoadsoptive essay), itp. W dodatku opierając się na ich zdolności do wiązania się z recerptorem EPO, peptydy według wynalazku mogą być użyte przy receptorowym oczyszczaniu lub wyodrębnianiu komórek z ekspresją receptora EPO na ich powierzchni (lub we wnętrzu przepuszczalnych komórek).

Związki według wynalazku mogą być również używane jako handlowe odczynniki badawcze dla różnorodnych medycznych prac badawczych i procedur diagnostycznych. Przykłady nieograniczające zastosowań: (1) jako wzorca do kalibracji do obliczania aktywności kandydatów na agonistów EPO w różnorodnych badaniach funkcjonalnych; (2) jako reagenty blokujące w statystycznym skriningu peptydów, tj. w poszukiwaniu nowych rodzin peptydowych ligandów receptora EPO, peptydy mogą być użyte do blokowania odzyskiwania peptydów EPO według wynalazku; (3) w ko-krystalizacji z receptorem EPO, tj. peptydy według wynalazku pozwalają na tworzenie kryształów związanych z receptorem EPO, umożliwiając oznaczenie struktury receptora/peptydu przy użyciu krystalografii rentgenowskiej; (4) do pomiaru zdolności komórek prekursorowych erytrocyta do różnicowania, pobudzania syntezy globin i zwiększania syntezy kompleksu hemu oraz liczby receptorów ferrytyny; (5) do utrzymania proliferacji i wzrostu linii komórkowych zależnych od EPO, takich jak FDCP-1mEPO-R i TF-1; oraz (6) inne zastosowania badawcze i diagnostyczne, w których receptor EPO jest korzystnie aktywowany lub aktywacja jego jest bez trudu skalowana względem znanych ilości agonisty EPO, i tym podobne.

Związki według wynalazku mogą być również stosowane u zwierząt stałocieplnych, w tym u człowieka, w celu stymulacji wiązania EPO z receptorem EPO in vivo, zatem nadają się do leczenia zaburzeń związanych z niedoborem EPO, przez podawanie ich w ilościach powodujących pobudzenie EPO-R, łagodząc w ten sposób objawy związane z niedoborem EPO in vivo. Przykładowo, związki według wynalazku znajdą zastosowanie w leczeniu schyłkowej niewydolności nerek/dializach, niedokrwistości w przebiegu AIDS, niedokrwistości w przebiegu przewlekłych chorób zapalnych (tj. reumatoidalnego zapalenia stawów, przewlekłego zapalenia jelit), chorób autoimmunologicznych, złośliwych; w celu zwiększenia liczby czerwonych krwinek u pacjentów przygotowywanych do zabiegów chirurgicznych.

Związki według wynalazku mogą być podawane w leczeniu zaburzeń, których istota nie polega na zmniejszeniu liczby (deficytu) erytrocytów, np. jako leczenie poprzedzające transfuzje. Ponadto podawanie związków według wynalazku może powodować skrócenie czasu krwawienia, dzięki czemu mogą być podane pacjentom w przygotowaniu do zabiegów operacyjnych lub tym, u których przewiduje się możliwość krwawienia. Dodatkowo, związki według wynalazku znajdą zastosowanie w aktywacji megakariocytów.

Ponieważ wykazano, że EPO ma działanie mitogenne i hemotaktyczne w stosunku do komórek śródbłonka naczyń, jak i oddziałuje na neurony cholinergiczne (patrz, np. Amagnostou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5978-5982 (1990) i Konishi et al., Brain res. 609: 29-35 (1993)), związki według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu różnych zaburzeń naczyniowych, sprzyjając gojeniu się ran, powodując rozwój krążenia obocznego naczyń wieńcowych (co może wystąpić po zawale mięśnia sercowego), urazów, stanów po przeszczepach naczyniowych i różnorodnych zaburzeń neurologicznych, charakteryzujących się bezwzględnie niskim poziomem acetylocholiny lub względnie niskim w stosunku do innych substancji neuroaktywnych (np. neurotransmiterów) poziomem acetylocholiny.

Kompozycje farmaceutyczne, według wynalazku, zawierają jako aktywny składnik przynajmniej jeden z peptydów według wynalazku wraz z nośnikiem lub rozcieńczalnikiem farmaceutycznym. Związki według wynalazku mogą być podawane doustnie, parenteralnie (iniekcje domięśniowe, dootrzewnowe, dożylne (iv) i podskórne), przezskómie (biernie lub

185 040 przy zastosowaniu jontoforezy lub elektroforezy), prznzśluzówkowo (droga donosowa, Sopochwowa, doodbytnicza lub podjęzykowa) i lub przy użyciu wstawek podlegających bioerozji i mogą być formułowane w formy oSoywieSnin do każdej drogi podania.

Postaci stałe do stosowania doustnego to kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W każdej ze stałych postaci aktywny związek jest zmieszany z co najmniej jednym obojętnym, farmaceutycznie akceptowanym nośnikiem, takim jak sacharoza, laktoza lub skrobia. Postaci te mogą zawierać również dodatkowe substancje, inne niż obojętne rozpuszczalniki, przykładowo środki smarne, jak stearynian magnezowy. Kapsułki, tabletki i pigułki mogą zawierać również czynniki buforujące. Tabletki i pigułki w formach dojelitowych są dodatkowo pokrywane warstwą chroniąca przed działaniem soku żołądkowego.

Płynne formy przeznaczone do stosowania doustnego obejmują farmaceutycznie akceptowane emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy, oraz eliksiry zawierające obojętne, powszechnie używane rozpuszczalniki, takie jak woda. Oprócz obojętnych rozpuszczalników kompozycje mogą zawierać również adiuwanty, takie jak środki zwilżające, emulgujące, zawieszające oraz środki słodzące, smakowe i zapachowe.

Preparatami według wynalazku do użycia oarentnralnngo są sterylne wodne i bezwodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Przykładami bezwodnych roztworów lub podłoży są: glikol propylenowy, glikol oylintylnnywy, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i olej kukurydziany, żelatyna oraz nadające się do iniekcji estry organiczne takie jak oleinian etylowy. Takie formy dozowania mogą również zawierać adiuwanty, takie jak środki konserwujące, nawilżające, emulgujące i dyspergujące. Sterylizacja odbywa się na przykład poprzez filtrację przy użyciu filtrów bakteryjnych, poprzez dodanie do kompozycji środków sterylizujących, poprzez napromienianie lub ogrzewanie kompozycji. Mogą być również sporządzane przy użycie sterylnej wody lub innych sterylnych podłoży bezpośrednio przed użyciem.

Kompozycje do stosowania doodbytniczego lub dyoychwowngo są czopkami zawierającymi prócz substancji aktywnych rozczynniki, takie jak masło kakaowe lub parafina.

Kompozycje 4o użycia yynosywngo lub podjęzykowego są również przygotowywane ze znanymi, standardowymi rozczynnikami.

Dawkowanie aktywnych składników kompozycji według wynalazku może być zróżnicowane, jednakże ważne jest by ilość aktywnego związku stanowiła odpowiednią dawkę. Wybór dawki zależy od oczekiwanego efektu terapeutycznego, drogi podania i wymaganego okresu podawania. Generalnie dobowa dawka stosowana u ssaków zawiera się między 0,001 mg/kg masy ciała a 10 mg/kg masy ciała.

Z powyzszego wynika, że niniejszy wynalazek posiada wielką różnorodność zastosowań. Poniższe przykłady zostały podane ninygraniczaJący w celu zilustrowania różnorodności zastosowań.

Przykład 1

Synteza peotydów z użyciem fazy stałej

Peotydy według wynalazku syntezowano sposobami podanymi przez Memfidya z użyciem fazy stałej (patrz, Steward, J.M. i Yang, J.D., Solid Phase Peptide Syntesis, 2-gie wydanie (Pierce Chemical, Rockford, IL, 1984)) w automatycznym aparacie typu Milligan/Blysnarch 9600. Jako żywicę stosowano PAL (Millignn/Blosnrch), która jest polistyrenem usinclowanym kwasem 5-(a'-Fmoc-amlnometylo-3,5'-Simetoksyfenoksy)walnrianywym i działa jako czynnik sieciujący. Stosowanie żywicy PAL pozwala uzyskać funkcję amidową na terminalnej grupie karboksylowej po odszcznpleniu pnptydu od żywicy. Początkowe zabezpieczenie oierwszyrzęyownj grupy aminowej w aminokwasie przeprowadza się za pomocą F-moc, a grupami zabezpieczającymi dla łańcuchów bocznych są grupa tert-butylowa dla grup hydroksylowych seryny i tyrozyny, trityl 4la amidów glutaminowych i Pmc (sulfonian 2,2,5,7,8-pentamntylychrymanu) dla grupy guanidynowej argininy. Każde sprzęganie prowadzi się przez jedną lub dwie godziny stosując BOP (heksafluorofosforan bnnzytriazollly N-okostrisdlmetylo-ammofosfynlywy) i HOBt (1-hydroksybnnzotriazyl).

W syntezie oeptydów z terminalną grupą amidową gotowy peptyS odszczepia się za pomocą mieszaniny złożonej z 90% kwasu trlfluyroyctowngy, 5% etanoSitiolu i 5% wody, początkowo w temperaturze początkowej 4°C, zwiększając ją stopniowo do temperatury

185 040 pokojowej przez 1,5 godziny. Produkty z usuniętym zabezpieczeniem odsącza się od żywicy i wytrąca eterem etylowym. Po dokładnym wysuszeniu produkt oczyszcza się metodą wysoko wydajnej chromatografii cieczowej w odwróconej fazie C18, zmieniając stosunek akrylonitryl/woda w 0,1% kwasie trifluorooctowym.

Przykład 2

Próby biologiczne

A. FDCP-1/mEPO-R

Komórki FDCP-1/mEPO-R hodowano w obecności czynników wzrostu (2,5 nm EPO) aż do uzyskania połowy gęstości stanu stacjonarnego. Po dwukrotnym przemyciu PBS komórki głodzono przez 24 godziny w pełnej pożywce minus czynnik wzrostu.

Żywotność komórek oznaczono w próbie barwienia za pomocą błękitu trypanowego. Przygotowana zawiesina w pełnej pożywce minus czynnik wzrostu pozwalała otrzymywać pożądaną liczbę komórek w 50 μΐ. Testowane związki rozcieńczano 2-krotnie na płytce do kultury tkankowej w której znajdowały się 96 wgłębienia (docelowo 50 μl na jedno wgłębienie).

Komórki (50 μΐ na wgłębienie) po wprowadzeniu do każdego wgłębienia poddano inkubacji przez 24 do 48 godzin (w tym czasie powinny zginąć komórki kontrolne).

Rozmnożenie komórek oznaczono na podstawie próby MTT.

B. TF-1

Procedurę Kitamura i innych (Blood 73, 375-380, 1989) stosowaną do hodowli komórek TF-1, których wzrost zależy od EPO, wykorzystano także do oznaczenia aktywności związków według wynalazku jako agonistów EPO. Wyniki reprezentatywne przedstawiono na fig. 8. Figura 8 odzwierciedla efekt EPO i peptydu YGNYMCHFGPITWYCRPGGG na proliferację komórkową linii komórek TF-1.

C. Proliferacja komórek śledziony

Zastosowano procedurę podaną przez Krystal (Exp. Hematol. 11, 649-660 (1983)) do mikrotestu, który polega na inkorporacji 3H-tymidyny do komórek śledziony w celu wykazania, że związki według wynalazku mogą być EPO agonistami. Sposób postępowania był następujący: myszom B6C3F] wstrzykiwano codziennie przez dwa dni fenylohydrazynę (60 mg/kg). Trzeciego dnia pobrano im komórki śledziony i potwierdzono na podstawie próby MTT zdolność tych komórek do proliferacji przez 24 godziny. Fotografie (200-krotne powiększenie) przedstawiające rozmnazanie reprezentatywnych populacji komórek śledziony pokazano na fig. 9A (komórki kontrolne), 9B (komórki traktowane 500 pM EPO) i 9C (komórki traktowane 25 μm GGDYHCRmGpLtWvCKPLGG).

D. Proliferacja komórkowa: wpływ peptydu na wzrost kultury komórek zależnych od

EPO

1. Materiały i sposoby

a) Przygotowanie próbki: peptydy zawieszono ponownie w DMSO i otrzymano 1x10'2 molowy roztwór bazowy, który kolejno rozcieńczano 10-krot.nie, otrzymując roztwory 100X o następujących stężeniach:

1x10/ 1x10-\ 1x10*5, 1x10/ 1x10*7, 1x10'⁸.

Dwa mikrolitry każdego rozcieńczonego roztworu bazowego rozcieńczono do 200 ul otrzymując następujące stężenia końcowe: 1x10*5, 1x10-6, 1x10/ 1x10'⁸, 1x10'⁹, 1x10^fo, i takie roztwory wprowadzano do zagłębień komórkowych w płytce.

b. Próba proliferacji komórek

i. Źródło komórek: FDC-P1/ER (Dexter i inni, J.Exp.Med. (1980) 152, 1036-1047) jest dobrze scharakteryzowaną nietransformowaną linią komórek szpiku kostnego myszy, do której trwale transfekowano receptor erytropoety. Komórki wykazują proliferację EPO-zależną.

c. Protokół doświadczalny. Komórki przetrzymywane w mieszaninie złożonej z RPMI 1640, 10% wołowej surowicy płodowej, antybiotyków i 10 jednostek/ml erytropoetyny hodowano aż do otrzymania fazy stacjonarnej. Wówczas komórki zebrano i powtórnie zawieszono w świeżej pożywce bez czynnika wzrostu (erytropoetyna) na okres 24 godzin. Komórki policzono i ponownie zawieszono, uzyskując stężenie 800000 komórek w mililitrze. W przybliżeniu 40 tysięcy komórek (50 μθ wprowadzono do każdego wgłębienia w płytce z 96 wgłę34

185 040 bieniami i do każdego wgłębienia dodano peptydu, przy czym stosowano próby potrójne. Dla każdej serii peptydów oznaczono ich zależność dawka/odpowiedź. Po 42 godzinach inkubacji (około 2 dublowania) do każdego wgłębienia wstrzyknięto po 1 pCi tymidyny na jedno wgłębienie. Komórki poddano inkubacji przez dodatkowe 6 godzin, po czym komórki zebrano i policzono aby ocenić inkorporację tymidyny jako wskaźnik proliferacji komórek.

d. Wyniku Pepiydy oceniano zarówno na linii komórkowej receptora chytro poetynyjak i macierzystej linii komórkowej bez receptora. W większości przypadków peptyd oceniano na linii komórkowej obciętego ludzkiego receptora erkarypyetkny. Wyniki wyrażano jako ilość peptydu, niezbędna dla uzyskania połowy maksymalnej aktywności uzyskiwanej z erytrycyetyną ^kombinacyjną. Wyniki reprezentatywne przedstawiono w formie tabelarycznej, podając także dane odnośnie wiązania względnego (patrz tabele od 17 do 22).

E. Fosforylowanie tyrozyną: indukowane peptydem fosforklowonie tyrozyną receptora eryarocyptkny i białek wewnątrzkomórkowych.

1. Materiały i sposób

a. Przygotowanie próbki: przygotowano 1x10’“ molowy roztwór peptydu zawieszonego powtórnie w DMSO.

b. Protokół doświadczalny: Komórki FDC-P1/muER przetrzymywane w mieszaninie złożonej z RPMI 1640, 10% wołowej surowicy płodowej, antybiotyków i 10 jednostek/ml ρrkaropyptkny hodowano aż do otrzymania fazy stacjonarnej. Wówczas komórki zebrano i powtórnie zawieszono w świeżej pożywce bez czynnika wzrostu (prkaropoetkną) na okres 24 godzin. Komórki policzono i ponownie zawieszono aż do uzyskania stężenia 500000 komórek w mililitrze. 1 ml komórek (500000) umieszczono w probówce Eppendorfa, dodano do nich 1 mikrolitr 1x10'³ M roztworu peptydowego (stężenie końcowe 1x10’⁵M) i poddano inkubacji w 37°C przez 10 minut. Dla każdej próbki wykonano próbę kontrolną z erktrocoetkną (stężenie końcowe 10 jednostek na mililitr). Komórki zebrano przez wirowanie z szybkością 14000 obrotów na minutę w temperaturze 4°C. Następnie komórki ponownie zawieszono w 100 pl buforu do SDS lizy i poddano elektroforezie żelowej na żelu poliakrkloamidowym SDS. Żel przeniesiono do nitrycρlulony i sondowano przeciwciałem antk-fysfotkronkóywkm (Upstate Biy-apahóolygk Inayrporated) rozcieńczonym w stosunku 1: 1000 przez 1 godzinę. Membranę przemyto solanką buforowaną Tris’em i powtórnie sondowano przeciwciałem anty-mysim znakowanym peroksydazą. Białka wizualizowano za pomocą reagentów do testu Western Blotting firmy Amersham.

c. Wyniki: Wiązanie erkaropyeakóy do jej receptora w linii komórek eryarocoetkóozależnych wywołuje fysforklowaóie tyrozyną zarówno receptora jak i licznych białek wewnątrzkomórkowych, w tym takich jak Shc, vav i JAK2 kinasa. Liczne peptydy, włączając GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG, analizowano w celu ocenienia ich zdolności dawania takiej odpowiedzi jaką daje ρrktropyptkna. Peptydy aktywne według kryterium wiązania i proliferacji, dawały identyczny wzorzec fosfyrklowaóio jak prytropoptkna w komórkach erytrypoptkóo-zależókch. Otrzymane wyniki wskazują, że peptydy aktywne dają odpowiedź na drodze przetwarzania sygnału indukowanego prytrypoeakóą. Otrzymane wyniki przedstawiono w formie tabelarycznej wraz z danymi dotyczącymi wiązania i proliferacji (patrz, tabele od nr 17 do 22, poniżej).

F. Kinetyka odpowiedzi komórkowej: Inicjacja cyklu komórkowego indukowana peptkdem, mierzona zawartością DNA.

1. Protokór aorwiadcaal.nd: Komórko FDkP-l/muER hodowaoo ćiz óo otrzomanik fia^ stacjonarnej (około 3.0 x 106 komórek w mililiaozρ). Komórki zebrano i ponownie zawieszono w świeżej pożywce w nieobecności czynnika i pozostawiono na 18 godzin do dalszego wzrostu. Wtedy komórki rozdzielono do trzech kolb o równej gęstości komórek: - czynnik, + EPO i + peptyd. Następnie komórki pobudzono przez dodanie 10 jednostek na mililitr EPO lub 10 pM peptydu. Zebrano trzy miliony komórek po 0, 6, 8, 10 i 12 godzinach (patrz. fig. 15). Komórki przemyto dwukrotnie zimnym PBS i ustalono przez ponowne zawieszenie w 100 pl zimnego PBS i dodanie 900 pl zimnego 70%-owego etanolu. Komórki barwiono 50 pl/ml propidium iodine i zmierzono floyrpsapóaję na skanningowym cytymettnp przepływowym

185 040

Stwierdzono, że erytropoetyna (10 jednostek/ml) i peptyd GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (1x10’⁵M) są równie skuteczne w stymulacji .rozwoju komórek wcafym cyklu komórkowym. Po 10 godzinnym pobudzeniu erytropoetyną lub peptydem około 45% komórek znajdowało się w fazie S w porównaniu do 15% komórek w pożywce kontrolnej. Wynik ten wskazuje, ze kinetyka dawania odpowiedzi przez peptyd jest taka sama jak dla rekombinowanej erytropoetyny.

G. Próba kolonizacji zomórek: pre')ba kolonizlcji komórek szpiku kostneos mgszy oraz obwodowej krwi ludzkiej.

1. Materiały i sposoby:

10-cio mililitrową próbkę krwi obwodowej pobrano od zdrowego osobnika do standardowej sterylnej heparynewonpj probówki. Zaatakowany szpik kostny pobrany z kości udowych około 10 myszy na jedno doświadczenie. Wszystkie odczynniki otrzymano z firmy Stem Cell Technologies Inc. (Vonceuvrr, Canada).

2. Protokół doświadczalny.

Policzono komórki jądrzaste w celu ustalenia liczby i stężenia komórek jądrzastych w oryginalnej próbce. W przypadku krwi obwodowej próbkę wirowano w gradiencie FicollHykaqur (1,077 g na mililtr) przy 400 G, przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki menojądrkoutr znajdujące się na granicy faz roztworu Ficoll-Hypaqur ostrożnie zdjęto i rozcieńczono do objętości około 10 ml. Komórki ze szpiku kostnego myszy lub ludzkiej krwi obwodowej zebrano przez odwirowanie i roztwór znad osadu zdekantowano. Granulki komórki ponownie zawieszono w świeżej pożywce i zebrano sposobem jak wyżej. Komórki przemyte rozcieńczono w pożywce kocyka z 2%-ową płodową surowicą wdową i otrzymano w ten sposób preparaty do wysiewania na płytkach, o ponizszych stężeniach:

Szpik normalny: 1x10 'mała gęstość komórek

Krew normalna: 4x10⁵ mała gęstość komórek

Komórki dodano do metylocelulozy zgodnie ze wskazówkami wytwórcy. Do prób używano peptydów o stężeniach końcowych: 1x10^ i 1x10'⁵ M w pożywce mrtylocrlulozewej „minus EPO”. Równoważną ilość komórek umieszczono także w pożywce „kompletna” metolocrluloza aby oszacować największą kolonizację. Przeprowadzono testy na płytce kontrolnej z każdą próbką bez EPO i peptydu w celu określenia tła kolonizacji. Kolonie zliczano po 10 i 18 dniach inkubacji.

b. Wyniki:

Dane przedstawione w tabelach od nr 13 do 15 wskazują, że GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG sprzyja kolonizacji, aczkolwiek w znacznie niższych ilościach w porównaniu do otrzymanych na pożywce „kompletna” metyloceluloza z rrytrepoetyną (3 jednostki,''ml), zarówne w szpiku kostnym myszy jak w ludzkiej krwi obwodowej.

Tabela 13

Tworzenie kelenii - test na próbce ludzkiej krwi obwodowej (dawca: męski) (data zebrania danych: 2/10/94)

Data	Próbka	CFU-E	MBFU-E	PBFU-E	CFU-GM
2/23/94	ZERO	X	X	X	X
	DMSO	X	X	X	X
	EPO(METHOCULT)	11	25	X	X
	EPO (3 j /ml)	7	7	X	X
	AFFY 244 10‘⁵M	10	5	X	X
3/4/94	AFFY 244 10‘⁶M	11	5	X	X
	ZERO	X	X	X	X
	DMSO	X	X	X	X
	EPO(METHOCULT)	1	11	13	9
	EPO (3 j /ml)	4	7	7	3
	AFFY 244 10’⁵M	7	9	2	4
	AFFY 244 10'6M	6	1 1	1	2

185 040

CFU-E Jednostki kolonizujące - erytroid (1-2 klastery)

MBFU-E: Dojrzałe jednostki tworzące wykwity - erytroid (3-8 klasterów)

PBRU-E' Prymitywne jednostki tworzące wykwity - erytroid (9 lub więcej klasterów) CFU-GM: Jednostki kolonizujące granulocyty/monocyty/makrofagi

Tabela 14.

Liczba komórek tworzących kolonię (szpik kostny myszy) 1 /28/94

2/10/94 Przodek	Kontrola	AFFY 11157 EPO 10’⁵M	/ AFFY244 10’⁶M
CFU-E	0	23	2	3
BFU-E	0	5	0	0
CFU-GM	0	3	0	0
2/21/94			AFFY11157	/ AFFY244
Przodek	Kontrola		EPO 10‘⁵M	10-6M
CFU-E	0	0	0	0
BFU-E	0	30	2	4
CFU-GM	0		0	0

AFFY11157 = ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg

Tabela 15. Liczba komórek tworzących kolonię (szpik kostny myszy). 2/21/94
3/1/94			AFFY11157/	AFFY244
Przodek	Kontrola	EPO	10’⁵M	10-6M
CFU-E	0	3	9	0
BFU-E	0	3	12	0
CFU-GM	0	>10	0	0
3/14/94			AFFY 1157/	AFFY244
Przodek	Kontrola	EPO	10’⁵M	10-6M
CFU-E	0	0	1	0
PBFU-E	0	10	8	0
MBFU-E	0	0	4	0
CFU-GM	0	26	0	0

H. Proliferacja indukowana peptydem: zależny od peptydu wzrost linii komórek nie wrażliwych na erytropoetynę

a. Protokół doświadczalny: peptydy stosowane do prób opisano w rozdziale D, powyżej. Badanie krzywej wzrostu przeprowadzono dla każdej linii komórek stosując odpowiedni mitogen/czynnik wzrostu dla każdej linii komórek w celu oceny potencjału wzrostowego.

b. Wyniki: Dane przedstawione w tabeli 16 wskazują, że GGTYSCHFGPLWVCKPQGG nie stymulował wzrostu kultury linii komórkowych erytropoetynoniezależnych i to zarówno linii komórek krwiotwórczych jak i nie krwiotwórczych.

Tabela 16.

Próby proliferacji komórek z 61232
Typ komórki	Gatunek	EPO	61233	Odpowiedź na czynnik wzrostu
1	2	3	4	5
Krwiotwórcze TF-1	ludzka		+	GM-CSF, IL3

(erytroid)

GM-CSF, IL3 (megakarioblastyczne)

M-07E ludzka

185 040 cd tabeli 16

1	2	3	4	5
AMLI93	ludzka	-	-	GM-CSF, G-CSF,
Klon komórek T	ludzka	ND		IL3 (monocytowe) IL2
Kościotwórcze TE85	ludzka			osocze
MC3T3	myszy	-	-	osocze
Komórka piersi T47D	ludzka	ND		progestyna

ND - nie oznaczono

9 S

I. Test kompetycyjnego wiązania [ I]EPO z immobilizowanym EBP

Pozakomórkową domeną erytropoetynowego receptora ludzkiego poddano ekspresji i nadprodukcji w E. coli. Jak z wieloma innymi rekombinantami białek eukaryotycznych stosowanymi w E. coli, białko uzyskano jako nierozpuszczalny produkt fermentacji w skali laboratoryjnej, poddano ponownemu zwinięciu i oczyszczano, otrzymując białko aktywne. EBP otrzymany w ten sposób zawiera jedną wolną grupę sulfhydrylową, którą można modyfikować, nie wpływając na wiązanie ligandu w fazie roztworu. W celu unieruchomienia EBP dla analizy równowagi wiązania i uzyskania bazy dla próby wiązania kompetycyjnego, powyższą obserwację rozciągnięto na kowalencyjne przyłączanie EBP do ziaren agarozy. Chemia jodoacetylowego aktywowania ziaren Sulfolink (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) jest specyficzna dla wolnych tioli i daje pewność, że połączenie nie jest łatwo odwracalne. Ziarna EBPSulfolink otrzymano w sposób następujący: zawiesinę żelową SulfoLink (10 ml) zmieszano z buforem sprzęgającym (40 ml, 50M Tris, pH 8,3 i 5 mM EDTA) i pozostawiono do opadnięcia żelu. Supematant usunięto i EBP (0,3-1 mg/ml w buforze sprzęgającym) przeznaczony do przyłączenia dodano bezpośrednio do przemytych ziaren żelu. Mieszaninę wstrząsano delikatnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej i pozostawiono do opadnięcia ziaren zelu w temperaturze pokojowej na okres 1 godziny. Supematant usunięto i zachowano a ziarna żelu przemyto dwukrotnie 20 ml buforu sprzęgającego. Roztwory z przemywania również zachowano do dalszego przerobu. Następnie ziarna żelu traktowano 20 ml 0,05 M cysteiny przez 30 minut w temperaturze pokojowej aby zablokować miejsca nie związane. Wreszcie, ziarna żelu przemyto 50 ml 1M NaCl, następnie 30 ml PBS i powtórnie zawieszono w 20 ml PBS. Otrzymany materiał przechowywano w temperaturze 4°C do późniejszego użycia. Ilość EBP związaną kowalencyjnie z ziarnami oznaczono przez porównanie OD280 oryginalnego roztworu EBP z całkowitym OD280 odzyskanym w cieczy reakcyjnej sklarowanej nad ziarnami żelu i w dwóch 20-mililitrowych roztworach z przemywania. Zwykle 40-60% użytego EBP zostaje połączonych z ziarnami żelu.

Próby wiązania były inicjowane przez dodanie ziaren EBP (50 pl) do poszczególnych probówek reakcyjnych. Wielkość całkowitego wiązania mierzono w probówkach zawierających 0,3-30 nM'²⁵ I-EPO (NEN Research Products, Boston MA, 100 pCi/pg). Dla oznaczenia wiązania niespecyficznego dodano EPO nie znaczonego jodem promieniotwórczym w 1000krotnym nadmiarze w stosunku do odpowiedniego stężenia [^lz5I]EPO. Objętość każdej próbki reakcyjnej zwiększono do 500 pl dodając buforu sprzęgającego (PBS/0,2% BSA). Probówki poddano inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 godzin (okres czasu określony doświadczalnie jako adekwatny do ustalenia się stanu równowagi), stosując delikatne mieszanie. Po 5 godzinach każdą mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez pipetkę w której znajdował się korek z waty szklanej. Probówki przemyto buforem (PBS/5% BSA) i tą objętość, jak również dwie dodatkowe 1-mililitrowe objętości cieczy z przemywania przepuszczono przez pipetkę z korkiem z waty szklanej dla oznaczenia stężenia wolnej EPO. Zebrane ciecze zachowano do oznaczenia w nich stężenia wolnego EPO. Analiza równowagi wiązania dla tego specyficznego połączenia [1²³I]EPO z EBP unieruchomionym na ziarnach agarozy daje Kd 5 nM ± 2 w oparciu o transformację liniową (Scatchard) izotermy wiązania (patrz. fig. 16).

Poniżej opisano sposób przeprowadzania testów wiązania kompetycyjnego peptydów. Poszczególne peptydy rozpuszczono w DMSO i otrzymano 1 mM roztwór wyjściowy. We

185 040 wszystkich probówkach reakcyjnych (duplikaty) 50 μl ziarenek EBP, 0,5 nM [^l25l]EPO i 0-500 μΜ peptydu umieszczono w 500 μl buforu wiążącego. Ustalono 2,5%-owe stężenie końcowe DMSO w każdej probówce, to jest wielkość nie dającą wykrywalnego efektu na wiązanie, co sprawdzono na próbkach zawierających DMSO w stężeniach aż do 25% (obj./obj.). W każdej próbie indywidualnej mierzono wiązanie niespecyficzne w probówkach zawierających duży nadmiar EPO nieznaczonego (1000 nM). W celu określenia wiązania całkowitego przeprowadzono także próby bez dodawania peptydu. Mieszaniny wiążące inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej stosując delikatne wytrząsanie. Następnie ziarenka zebrano, używając mikrokolumn (Isolab, Inc., Akron, Ohio) i przemyto 3 ml buforu myjącego. Kolumny z przemytymi ziarenkami umieszczono w szklanych rurkach o wymiarach 12 x 75 mm i zmierzono stopień radioaktywności za pomocą licznika promieni gamma. Ilość związanego radioaktywnego |^I25I ]EPO wyrażono jako procent wiązania w próbce kontrolnej (całkowity =100%) i sporządzono wykres w funkcji stężenia peptydu po korekcji dla wiązania niespecyficznego. Wskaźnik IC50 zdefiniowano jako stężenie peptydu, które zmniejsza wiązanie [¹²³I]EPO do ziarenek EBP o 50%. Wszystkie dane przedstawiono w odniesieniu do GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (RWJ61233) dla którego IC50 określono na 5 μΜ (patrz, tabele od nr 17 do 22, poniżej).

Tabela 17.

Serie substytucji GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

SEK. NR ID	Sekwencja	Wiązanie względne #	EPO-ED50 μ m)	Fosforylowanie1
61233#	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	+
61231	GGTASCHFGPLTWVCKPQGG	24	IA	-
61520	GGTTSCHFGPLTWVCKPOGG	24	IA	-
61598	GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG	12	IA	-
61277	GGTYSCHFGALTWVCKPQGG	2	0 1	+
61278	GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG	18	IA	-
61313	GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG	16	IA	-
61314	GGTYSCHFGPATWVCKPQGG	1	0.2	+
61395	GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG	>100	IA	-
62145	GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG	6	0.25
61530	GGTYSC-FGPLTWVCKPQGG	40	IA	-

# Ilość potrzebna do osiągnięcia połowy maksymalnego poziomu proliferacji zależnego od EPO (11 pM) ¹ próba przy 10 JJ.M

IA - nieaktywny # Wiązanie względem RWJ-61233 # oznacza ze wszystkie peptydy są cykliczne (z wyjątkiem 61394) i były analizowane jako amidy terminalne (-CONH₂)

61233 = AFFY11157 = AFFY 244

185 040

Tabela 18.

Serie ze skróconym GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

RWJ No	Sekwencja	Wiązanie względne #	EPO-ED50 ^M)	Fosforylowanie1
61233#	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	+
61596	GGTYSCHFGPLTWVCKPQ	1.6	0.08	+
61597	TYSCHFGPLTWVCKPQGG	8	2
61230	TYSCHFGPLTWVCKPQ	6	2	+
61232	YSCHFGPLTWVCKP	9	20	+/-
61279	YSCHFGPLTWVCK	14	3	+/-
61477	YSCHFGPLTWVC	50	IA	-
61895	YSCHFGALTWVCK	32	IA
61513	Y-CHFGPLTWVC	12	2	+
61177	SCHFGPLTWVCK	18	IA	-
AF11154	GGCRIGPITWVCGG	13	IA	-
61394	HFGPLTWV	>100	IA	-

* Ilość potrzebna do osiągnięcia połowy maksymalnego poziomu proliferacji zależnego od EPO (11 pM) próba przy 10 μΜ ² IA - nieaktywny * Wiązanie odnoszące się do RWJ-61233 * oznacza że wszystkie peptydy są cykliczne (z wyjątkiem 61394) i były analizowane jako amidy terminalne (-CONH2)_______

61233 = AFFY11157 = AFFY 244

Tabela 19.

Peptydy o częściowo analogicznej sekwencji

RWJ No.	Sekwencja	Wiązanie względne #	EPO-ED50 (μM)	Fosforylowanie^{* 1}
61233#	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	+
61721	GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG	>100	IA²
61718	GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	06	0 1
61719	GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG	8	9
61720	GGLYTCRMGPITWVCLPAGG	ND	-
61717	GGNYYCRFGPITFECHPTGG	>10(0 (S1)	IA

# Ilość potrzebna do osiągnięcia połowy maksymalnego poziomu proliferacji zaleznej od EPO (11 pM) ¹ próba przy 10 μM ND - nie oznaczono

IA - nieaktywny # Wiązanie odnoszące się do RWJ-61233 # oznacza ze wszystkie peptydy są cykliczne (z wyjątkiem 61394) 1 były analizowane jako amidy terminalne (-CONH2)_

61233 = AFFY11157 = AFFY 244

185 040

O a

ω p

o >1

P

Ή £

Π3

O

Λί

G >4

§. θ C· o Ό ^θ H u? x Q ra ω

Λ Η o o

P4 ij w Λ o u <u E

El

O

4-1 -H aX (U N U P <1) 0 El i—I (U α

o

N •H r—I <0 G <ϋ •H

4fc a?

r—ł

Cn >,

N

CO ε

CM o

El ft ε

o •H

N

O a

O

Cn ra fi >4

HH >1

Λ

CJ>

m r^-i co ε

ra

-Η

X

4-) nr

Tabela 20.Serie podstawione w pozycji #4 n5

-r~i

O fi <D

X ra cn o

rM O a

(0 •H O οχ -H η g o cn o nr •H m o o P (0 fi Λ Θ N Ε -U O a

Ό '(O o

£ =Ł >,

N

El a

(0

X '0

El a

>4 fi >1 n

X (0

4)

-H fi

Γ9 η

CM r4

Ό

I

P

X

O

P

O· •H co

O υ

nr

N cn o

fi p

o o fi N o -H i—i x

s u

nr ra >7

P s

4-1 a

<D a

fi

Π3

N nr o

•H

X

4-J m

S

N

Cd

X x

X o

u o

fi i—I (ΰ

G

-H ε

El

1)

4-)

61233 = AFFY11157 = AFFY 244

185 040

Tabela 21.

Serie podstawione w pozycji #17

Nr sekwencji	Sekwencja	Wiązanie względne**	EPO-ED₅o (μΜ)
			receptor myszy	skrócony receptor ludzki	receptor ludzki
65876	GGTYSCHFGPLTWVCKAQGG	> 20 *	10	0.3	10

** wiązanie odnoszące się do 61233 = AFFY11157 = AFFY244 * ograniczona rozpuszczalność

Tabela 22.

Serie aktywności różnicowej - peptyd bazowy GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

RWJ No.	Sekwencja	Wiązanie względne #	EPO-ED50 (μΜ)*
receptor myszy	skrócony receptor ludzki
61233#	GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	1	0.1	0.1
61596	GGTYSCHFG PLTW VCKPQ	1.6	0 08	0.02
61718	GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	0.6	0.1	0.08
AF 11288	GGLYACHMGPMTWVCQPLRG	0.2	0.15	ND'
61757 (H22)	LGRKVSCHFGPLTWVCQPAKKD	1	0.11	0.15
AF 11654	TIAQYCYMGPETWECRPSPKA	1	0.2	0.02
62145	GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG	6	0.25	0.5
62146	Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG	4	0.03	0.06
61894	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG p-NO₂-Ph	17	IA²	0.8
62019	GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG p-NH2-Ph	18	IA	3.0
62020	GGTKSCHFGPLTWVCKPQGG p-F-Ph	8	1.0	0.1

* Ilość potrzebna do osiągnięcia połowy maksymalnego poziomu proliferacji zależnej od EPO (11 pM)

ND - nie określono

IA - nieaktywny # Wiązanie odnoszące się do RWJ-61233 _Wszystkie peptydy są cykliczne i były analizowane jako amidy terminalne (-CON^)_

61233 = AFFY11157 = AFFY244J.

Próba na myszach z policytomicznym niedotlenieniem krwi

Samce myszy BDF1 (o wadze 18-20 g) trzymano w warunkach klimatyzowanych (w komorach niskociśnieniowych) w cyklach - 18 godzin pod ciśnieniem 0,40 ± 0,02 atm i 6 godzin pod ciśnieniem normalnym, przez okres 14 dni.

Myszy trzymano pod ciśnieniem normalnym przez 72 godziny przed podaniem r-HuEPO lub testowanych próbek. Testowane próbki lub wzorcowy r-HuEpO rozcieńczono przed wstrzyknięciem myszom trzymanym w komorach klimatyzacyjnych. Jako vehiculum stosowano PBS zawierający 0,1% BSA (wag./obj.). Dla każdego z rozcieńczeń każdej z 10 myszy podano podskórnie po 0,5 ml roztworu. Po 48 godzinach podano 59Fe. Próbki krwi pobrano po 48 godzinach po podaniu '^Fe. W każdej próbce zmierzono hematokryt

185 040 i radioaktywność. Zakres stosowanych dawek i otrzymane wyniki (z dwóch różnych prób) podano w tabeli 23 i fig. od 17A do 17C, poniżej.

Tabela 23.

	Dawka	n	Średni log
EPO St.	0.000 jednostek	10	0.26
	0.025	10	1.65
	0.050	10	2.74
	0.100	10	3.28
DMSO	1 .40%	7	0.58
	0.35%	5	0.60
244-1	0.25 pg	7	0.62
	0.50	8	0.76
	1.00	9	0.92
244-2	2 00	9	1.38
	4.00	10	1.81
	8.00	9	2.26
244-3	14.0	10	2.44
	28.0	10	3.15
	56 0	9	3.16

0,1 mg AFFY244 « 1 jednostce r-HuEPO (8,3 ng)

Ponadto, w próbie na żywych myszach z policytomicznym niedotlenieniem krwi testowaniu poddano TlAQYICYMGPETWECRPSpKA i dimeryczny analog peptydu GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG zawierający dwa wiązania disiarczkowe (AF12080). Wyniki próby na myszach z policytomicznym niedotlenieniem krwi przedstawiono na fig. 8 A - 18B. Dodatkowo, w tabeli 24, poniżej, podano wyniki porównania EPO z różnymi peptydami mimetycznymi.

Tabela 24

Peptyd Ilość peptydu równoważna 0,025 jednostkom EPO (nmol)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 3,8 (RWJ 61233/AFFY11157)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ (RWJ 61596) 0,5

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD (RWJ 61757) 3,1

TIAQY1CYMGPETWECRPSPK (AAFY11654) 11-21

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG dimer 0,035 (AFFY 12080)

K. Próba z retikulocytami

Normalnym, nieleczonym samicom mysz BDF1 podawano (0,5 ml, s.c.) EPO lub związek doświadczalny przez trzy kolejne dni. Do wehikulum o składzie: PBS, 10% PEG 8000, 0,025% BSA dodano DMSO. Trzeciego dnia myszom podano (0,1 ml, i. p.) dekstran zelazowy (100 mg/ml). Piątego dnia, myszę uśpiono CO2 i upuszczono im krew przez nakłucie serca. Procentową zawartość retikulocytów określono na podstawie próby barwnej z oranżem tiazolowym oraz na podstawie przepływowej analizy cytometrycznej (program retic-count).

185 040

Hρmatykryty oznaczono manualnie. Skorygowaną, procentową zawartość tpaikulockanw oznaczono na podstawie następującego wzoru:

% Opaikolyakańw (skorygowany) ⁼ % 0Paikolyakańw (obserwowany) X Hpmoaykoya (pojedynczy) (normalny)

Wyniki otrzymane w powyższej próbie z rptikulyakaami przedstawiono na fig. 18A do 18B i fig. 19A-19B.

L. Test kolonizacji: wytwarzanie kolonii etyaryidolnyah

1. Materiały i metody

Ludzkie komórki jądrzaste ze szpiku kostnego otrzymane od normalnych dawców posiano na płytkach w półstałej metylocelulozie (0,9% metylocelulozy, 30% płodowej surowicy wołowej, 1% wołowej albuminy surowiczej, 10”'* 2-mprkoptyptonolu, 2 mM L-glutaminy). Komórki zebrano i komórki czerwone roztwyrnyóy przez dodanie buforowanego chlorku amonowego. Następnie, komórki powtórnie zawieszono w pożywce zawierającej 2% płodowej surowicy cielęcej i pysiaóy na płytkach w ilości 2 x 10⁶ komórek na płytkę (robiąc duplikaty). Utworzone w kulturze, po 12 dniach, kolonie etytryidów i goonulyayanw-ma.kryfogów (G-M) oceniono według barwy i morfologii. Do badań użyto także płytkę kontrolną zawierającą rekombinacyjny ludzki czynnik wzrostu IL-3, GM-CSF i SCF (3/gM/S) dla potwierdzenia tworzenia się kolonii G-M w próbce.

Czynnik wzrostu (nM)	Liczba kolonii na 2 x 10⁵ komórek jądra-stych Eokaoyid G-M
Płytka 1	Płytka 2	Płytka 1	Płytka 2
Próbka kontrolna (bez czynników wzrostu)	0	0	0	0
EPO (0.24)	113	106	12	9
RWJ 61233 (1000)	29	23	1	2
RWJ 61233 (10000)	80	75	2	0
3/GM/S (0.7/0.7 /2.7)	0	0	176	212

2. Wyniki

Wyniki podane powyżej wskazują, że GGTYSCHFGóLTWVCKUQGG (RWJ 61233/AFFY11157) jest zdolny do pobudzania tworzenia kolonii erytroidów w nieobecności dodatkowych cytok^. Ponadto peptyd wykazuje ścisłą specyficzność do szczepów ρr·yatoidnw dzięki brakowi zdolności do pobudzania tworcenia kolonii szczepu GM.

Należy rozumieć, że opis powyższy ma cel ilustracyjny, bez zamiaru ograniczania wynalazku. Wiele sposobów realizacji wynalazku będzie oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z powyższym opisem. Zakres wynalazku określają załączone zastrzeżenia a nie powyższy opis. Ujawnione artykuły i publikacje, włączając publikacje patentowe, stanowią odnośniki.

185 040

MUTAGENEZA OLIGO RIGPITWV | | 70/10/10/10

C TGT CAC TCC GGA GGC NNK NNK NNK TGT cgK atK ggK ccK atK acK tgK gtK TGT NNK NNK NNK GGA GGC GGG GGT AGC ACT GTT GAA AGT TGT

FIG. 1.

GGTYRCSMGPMTWVCLPMGG

GGMYSCRMGPMTWVCGPSGG

GGWAWCRMGPITWVCSAHGG

GGM YSCRMG PMTWVCIPYGG

GGEYKCYMGPITWVCKPEGG

GGDYTCRMGPMTWICTATGG

GGNYLCRFGPGTWDCTGFRG

GGNWCRMGPITWICTPAGG

GGKDVCRMGPITWDCRSTGG

GGSYLCRMGPTTWLCTAORGGGN

GGNYLCRMGPATWVCGRMGG

GGEYKCRMGPLTWVCQYAGG

GGDYTCRMGPMTWICTATRG

GGVYVCRMGPLTWECTASGG

GGEYSCRMGPMTWVCSPTGG

GGEYLCRMGPITWVCERYGG

GGNYICRMGPMTWVCTAHGG

GGDYLCRMGPATWVCGRMGG

GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG

GGLYSCRMGPITWVCTKAGG

GGGYHCRMGPMTWVCRPVGG

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

GGIYKCLMGPLTWVCTPDGG

GGLYSCLMGPITWLCKPKGG

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG

GGDYSCRMGPTTWVCTPPGG

GGDYWCRMGPSTWECNAHGG

GG KYLCS FG PITWVCARYGG

GGLYKCRLGPITWVCSPLGG

GGSYTCRFGPETWVCRPNGG

GGSYSCRMGPITWVCKPGGG

GGSYTCRMGPITWVCLPAGG

GGLYECRMGPMTWVCRPGGG

FIG. 2-1.

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

185 040

GGDYTCRMGPITWICTKAGG

GGVYSCRMGPTTWECNRYVG

GGAYLCHMGPITWVCRPQGGG

GGEYSCRMGPNTWVCRPVGG

GGLYLCRMGPVTWECQPRGG

GGLYTCRMGPITWVCLLPGG

GGLYTCRMG PVTWVCTGAGG

GGVYKCRMGPLTWECRPTGG

GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG

GGSYLCRFGPTTWLCSSAGG

GGSYLCRMGPTTWVCTRMGG

GGSYLCRFGPTTWLCTORGG

GG WVTCRMG PITWVCGVHGG

GGQLLCGIGPITWVCRWVGG

GGKYSCFMGPTTWVCSPVGRGV

GGWVYCRIGPITWVCDTNGG

GGMYYCRMGPMTWVCKGAGG

GGTTQCWIGPITWVCRARGG

GGPYHCRMGPITWVCGPVGG

GGEYRCRMGPISWVCSPQGG

GGNYTCRFGPLTWECTPOGGGA

GGSWDCRIGPITWVCKWSGG

VGNYM C H FG PITW VC R PGGG

GGLYLCRMGPOTWMCOPGGG

GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR

GGWYSCLMGPMTWVCKAHRG

GGKYYCWMGPMTWVCSPAGG

GGYVMCRIGPITWVCDIPGG

GSCLQCCIGPITWVCRHAGG

GGNYFCRMGPITWVCQRSVG

GGEYICRMGPLTWECKRTGG

GGLYACRMGPITWVCKYMAG

GGOYLCTFGPITWLCRGAGG

GGVYACRMGPTTWVCSPLGG

GGYTTCRMGPITWVCSAHGG

GGTYKCWMGPMTWVCRPVGG

GGNYYCRFGPITRECHPTGG

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG

GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG

GG LYTC RMG P ITW VCLPAGG

GGLYTCRMG PITWVCLPAGG

FIG. 2-2.

SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:

185 040

MUTAGENEZĄ BIBLIOTEKI ON2598

GGXXXXYXCR 8GP8TWVCXXXXXX (G4S) 4 - plIIV

FIG. 3.

ON 3007 (NNK)₁₀Tyr (NNK) Cys (NNK)₂Gly Pro (NNK) Thr Trp (NNK) Cys (Gly)₄ Ser-plll/pVIII

FIG. 4A.

ON 3016

Gly Gly (NNK)₄Tyr Cys (NNK)₂Gly Pro (NNK) Thr Trp (NNK) Cys (NNK)₅(Gly)₄Ser - plll/pVIII

FIG. 4B.

ON 3017

Gly Gly Tyr (NNK) Cys (NNK)₂ Gly Pro (NNK) Thr Trp (NNK) Cys (NNK)₁₀_(Gly)₄ Ser - plll/pVIII

NNK=PRZYPADKOWA RESZTA AMINOKWASOWA

RESZTY TŁUSTYM DRUKIEM SĄ STAŁE

FIG. 4C.

AF11157 ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg -X₄YXCH FGPLTWVCX₆ (C-KONIEC)

FIG. 5.

185 040

ΟΝ3236

- x₄yxcxxgpetwecx₆ (C- koĄ/ec.

Y-C-G-P-T-W-C

Ę 91:3:3:3/91:3:3:3/K

X NNK

FIG. 6

185 040

BIOANALIZA ΡΌ^ - 1/ hEPOR

Cd

UJ o

o i

UJ o

σ>	oo	r—	co	ir>
UJ	UJ	UJ	UJ	1 UJ
o		o	o	O
o	o	o	o	O

fr-300'l

STĘŻ. EPO/PEPTYD

GGCRIGPITWCGG -o- GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG -- GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG

VGNYMGHFGPITWVCRPGGG — GGVYACRMGPITWVCSPLGG

VGNYMAHMGPITWVCRPGG

EPO

FIG 7

185 040

I.OOE-4

O D. 570

FIG. 8

FIG. 10

185 040

FIG. 9C

185 040

AFII505+S.A.

AFII505 + G ANTI-B

G ANTI-B

FIG. 11

185 040

SCHEMAT SYNTEZY OTRZYMYWANIA DIMERU

Alloc

Acm Acm

Boc-Gly-Gly— v^_y.._|T.Cj,_s._rrCv_{s rT}Acm Acm

NHj

Gly-Gly- β Ala-Lys—Knorr/Tcntagcl

Boc-Gly-Gly

SYNTEZA KROK PO KROKU

-_I.._r-C|-s-₁__T-Cp-._[.._[...Gly-Gly-CO-NH-CH2-CH2-CH2-CH2

Tn Trt ęH-Knorr-OentageJ

Boc-Gly-Gly..	•n7^ŁTT'	T
	Acm	Acm
NH₂-Gly-Gly..	.......Cys— .	„Cys-
	1h	SH
NHj-Gly-Gly...	.......Cys______ \|	T
	Acm	Acm
NHj-Gly-Gly..	____Cvs_____	-T
NHj-Gly-Gly-
	Acm	Acm
NH₂-Gly-Gly..	........Cys..— 1	..Cys... 1
NHj-Gly-Gly.-	----Cys---- 1	Cys. _1

ODSZCZEPIENIE TFA

-CjHi

CH-CO-NHj

J,

-Gly-Gly-CO-NH-GĘ-GĘ-CO—NH

CYKLIZACJA 1

- Gly-Gly-CO-NH-CHj-CFĘ-CO

-CJlj .X :-co-nh₂

CYKLIZACJA 2 CO-NH-CH₂-CH₂-CH2-a|2

CH-CO-NH2

-Jh

FIG. 12

185 040

AF12080 IC50

42162 WKŁAD CPM

2608 CAŁKOWICIE ZWIĄZANE CPM

AMERSHAM LOT # 9452 SPECYFICZNA AKTYWNOŚĆ

FIG. 13

185 040 ozs αο

FIG. 14

185 040

0	% 60/61
□	%S
□	%62/M

FIG. 15

185 040

FIG. 16A

FIG. 16B

185 040

FIG 17A

FIG 17B

185 040

WZGLĘDNA RADIOAKTYWNOŚĆ

FIG 17C

185 040

FIG. 18A

EKSHIPOKSJA 3/6/95 RARITAN, 11654

54.0 27.0 14.0 8.0 4.0 2.0 1.2 Ufl DMSO 1%

Τ' i r

EPO U 11654 ug

0.20	77777777777777777777777^ '
0.10	Α///ΑΑΛ£ΑΑΑΑΑΑΑ/Λ ·
o.os	ΆΑ/Α/ΑΑ/Λ -
0.025	7/77* -
nośnik

O 5 10* 1 1O⁴ 2 10⁴ 2 10* 3 10*

WŁĄCZONA RADIOAKTYWNOŚĆ (cpm)

185 040

FIG. 18B

EKSHIPOKSJA 3/6/95 RARITAN, AF12080

2.25

1.125

EPO U „ AF12080 nmol

0.56

0.28

0.14

0.7

0.035

Χ5Ο 1% 0.20 0.10 0.05 0.025

NOŚNIK

SIO¹ 110* 2io⁴ 2 1 0* 3 1 0⁴ 3 1 0⁴ 4 10⁴

WŁĄCZONA RADIOAKTYWNOŚĆ (cpm)

185 040

EPO (JEDNOSTKI/MYSZ)

FIG. 19A

FIG. 19B

185 040

FIG 20A

AF1115 7/244 (pg/MYSZ) , , ⁷ lmg/mysz, n=8

2mg/mysz, n=8

FIG 20B

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Peptyd wiązący się z receptorami erytropoetyny o długości od 10 do 40 reszt aminokwasowych i zawierający następującą sekwencję aminokwasów X3X4XsGPX6TWX7X₈, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; Xó jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; Χ3 jest C; Χ4 jest R, H, L lub W; Χ5 jest M, F lub I; Χ7 jest D, Ε, I, L lub V; a X₈ jest C.
2. Peptyd według zastrz. 1, zawierający sekwencję aminokwasów ΥΧ2Χ3Χ4Χ5GPX6TWX₇X₈, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; każdy z Χ2 i Xć jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X₃ jest C; Χ4 jest R, H, L lub W; X₅ jest M, F łub I; X₇ jest D, Ε, I, L lub V; a X₈ jest C.
3. Peptyd według zastrz. 2, zawierający sekwencję aminokwasów Χ1ΥΧ2Χ3Χ4Χ5GPX6TWX₇X₈X9X|oXn, gdzie każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; każdy z Χι, Χ2, Xć, Χ9, Χ10 i Χ11 jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; Χ3 jest C; Χ4 jest R, H, L lub W; X₅ jest M, F lub I; X₇ jest D, Ε, I, L lub V; a X₈ jest C.
4. Peptyd według zastrz. 3, w którym X₄ jest R lub Η; X₅ jest F lub M; X₆ jest I, L, T, Μ, E lub V; X₇ jest D lub V; X₉ jest G, K, L, Q, R, S lub T; a X₁₀ jest A, G, P, R lub Y.
5. Peptyd według zastrz. 4, w którym Xi jest D, E, L, N, S, T lub V; Χ2 jest A, Η, K, L, M, S lub T; Χ4 jest R lub H; X₉ jest K, R, S lub T; X₍₀ jest P.
6. Peptyd według zastrz. 1, wybrany z pośród:

GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; GGTY SCHFGPLTWVCKPQ ; GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG ; VGNYMCHFGPITWVCRPGGG ; GGNYMCHFGPITHVCRPGGG ; GGVYACRMGPITWVCSPLGG ; VGNYMAHMGPITHVCRPGG ; GGPHHVYACRHGPLTWIC ; GGTYSCHFGPLTWVCKPQ ; GGLYACHMGPMTWVCQPLRG ; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA ; YSCHFGPLTWVCK; YCHFGPŁTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG ;

GGCRIGPITWVCGG; _

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD ; GGTASCHFGPLTWVCKPQGG ; GGNYYCRFGPITFECHPTGG ; GGEYLCRMGPHTWVCTPVGG ; GGLYTCRMGPITWVCLPAGG ; GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG ; GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG ; GGTYSCHFGALTWVCKPQGG; GGTiSCIlFGPIj&WVCKPQGG; GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG ; GGTYSCHFGPATWVCKPQGG ; GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG ; GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG ; TYSCHFGPLTWVCKPQ; YSCHFGPLTWVCKP; SCHFGPLTWVCK;

GGTYSCFGPLTWVCKPQGG ; TYSCHFGPLTWVCKPQGG ; YSCHFGPLTWVC; GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG .

185 040
7. Peptyd według zastrz. 1, jest wybrany z pośród:

GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG; VGNYMCHFGPITWVCRPGGG; GGVYACRMGPITWVCSPLGG; VGNYMAHMGPITWVCRPGG; GGPHHVYACRMGPLTWIC; GGTYSCHFGPLTWVCKPQ; GGLYACHMGPMTWVCQPLRG; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA; YSCHFGPLTWVCK; YCHFGPLTWVC„
8. Peptyd według zastrz. 1, w którym wyżej wymieniona sekwencja aminokwasów jest cyklizowana.
9. Peptyd według zastrz. 8, wybrany z pośród

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; GGTYSCHFGPLTWVCKPQ; GGLYACHMGPMTWVCQPLRG; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA; YSCHFGPLTWVCK; YCHFGPLTWVC;

Ac—GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG; GGCRIGPITWVCGG; LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD ; GGTASCHFGPLTWVCKPQGG ; GGNYYCRFGPITFECHPTGG ; GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG ; GGLYTCRMGPITWVCLPAGG; GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG; GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG; GGTYSCHFGALTWVCKPQGG; GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG; GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG; GGTYSCHFGPATWVCKPQGG; GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG; GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG; TYSCHFGPLTWVCKPQ; YSCHFGPLTWVCKP; YSCHFGALTWVCK; SCHFGPLTWCK; GGTYSEHFGPLTWKKPQGG; GGTYSCFGPLTWCKPQGG; TYSCHFGPLTWCKPQGG/ YSCHFGPLTWC; GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG; GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG

185 040
10. Peptyd według zastrz. 1, w którym wyżej wymieniona sekwencja aminokwasów jest zdimeryzowana.
11. Peptyd według zastrz. 10, zawierający następującą sekwencję aminokwasową:

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG

I I

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera peptyd o długości od 10 do 40 reszt aminokwasowych, wiążący się z receptorami erytropoetyny i zawierający następującą sekwencję aminokwasów X3X4XsGPX6TWX7X8, w której każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; X_e jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X.-i jest R, H, L lub W; Xs jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; aXg jest C, w połączeniu z akceptowanym farmaceutycznie nośnikiem.
13. Zastosowanie peptydu o długości od 10 do 40 reszt aminokwasowych, wiążącego się z receptorami erytropoetyny i zawierającego następującą sekwencję aminokwasów X^3X4X^5GP^6TW^7^s, przy czym każdy aminokwas jest oznaczony standardowym skrótem jednoliterowym; X6 jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X4 jest R, H, L lub W; X5 jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; a X8 jest C, do wytwarzania środka leczniczego przeznaczonego do leczenia pacjenta z zaburzeniem charakteryzującym się niedoborem erytropoety lub małą, jak również nieprawidłową populacją czerwonych krwinek.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że zaburzenie jest wybrane z grupy obejmującej: schyłkową niewydolność nerek lub dializę; niedokrwistość towarzyszącą AIDS, chorobie autoimmunologicznej lub złośliwej; beta-talasemię; mukowiscydozę; wczesną niedokrwistość u wcześniaków; niedokrwistość towarzyszącą przewlekłym chorobom zapalnym; uszkodzenie rdzenia kręgowego; ostrą utratę krwi; starzenie oraz choroby nowotworowe przebiegające z zaburzeniami erytropoezy.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że peptyd zawiera sekwencje aminokwasów ¥X2X3X.|X5GPX6TWXtX8, przy czym każdy aminokwas jest oznaczony przez standardowy skrót jednoliterowy; każdy XX i X6 jest niezaleznie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X4 jest R, H, L lub W; X5 jest M, F lub I; X? jest D, E, I, L lub V; a X8 jest C.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że peptyd zawiera sekwencje aminokwasów XiYX₂X3X4X5GPX6TWX7X8X9XioXii, przy czym każdy aminokwas jest oznaczony przez standardowy skrót jednoliterowy; każdy Xi, X2, Xe, Χ9, Xio i Xii jest niezależnie wybranym, jednym z 20 genetycznie kodowanych L-aminokwasów; X3 jest C; X4 jest R, H, L lub W; X5 jest M, F lub I; X7 jest D, E, I, L lub V; a X8jest C.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że X4 jest R lub H; X5 jest F lub M; X6jest I, L, T, M lub V; X₂jest D lub V; X9jest G, K, L, Q, R, S lub T; aXiojest A, G, P, R lub Y.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, ze Xi jest D, E, L, N, S, T łub V; X2 jest A, H, K, L, M, S lub T; X4 jest R lub H; X9 jest K, R, S lub T; a Xo jest P.

185 040
19. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że peptyd jest wybrany z pośród:

GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG; GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGDYHCEMGPLTWVCKPLGG; VGNYMCHFGPITWVCRPGGG; GGNYMCHFGPITWVCRPGGG; GGVYACRMGPITWVCSPLGG; VGNYMAHMGPITWVCRPGG;

GGPHHVYACRMGPLTWIC;

GGTYSCHFGPLTWVCKPQ;

GGLYACHMGPMTWVCQPLRG; TIAQYICYMGPETWECRPSPKA;

YSCHFGPLTWVCK;

YCHFGPLTWVC;

Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG;

GGCRIGPITWVCGG;

LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD; GGTASCHFGPLTWVCKPQGG ; GGNYYCRFGPITFECHPTGG; GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG; GGLYTCRMGPITWVCLPAGG ; GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG ; GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG ; GGTYSCHFGALTWVCKPQGG; GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG; GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG; GGTYSCHFGPATWVCKPQGG; GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG; GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVCKPQ;

YSCHFGPLTWVCKP;

SCHFGPLTWVCK;

GGTYSCFGPLTWVCKPQGG;

TYSCHFGPLTWVCKPQGG;

YSCHFGPLTWVC;

GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG.
20. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że peptyd jest scyklizowany.
21. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że peptyd jest zdimeryzowany.