BRPI0614992A2 - efeitos sistêmicos e intratecais de uma série de inibidores de fosfolipase a2 na hiperalgesia e liberação espinal de pge2 - Google Patents

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BRPI0614992A2 BRPI0614992-8A BRPI0614992A BRPI0614992A2 BR PI0614992 A2 BRPI0614992 A2 BR PI0614992A2 BR PI0614992 A BRPI0614992 A BR PI0614992A BR PI0614992 A2 BRPI0614992 A2 BR PI0614992A2
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Karin Killerman Lucas
Camilla Svensson
David A Six
George Kokotos
Violetta Constantinou-Kokotou
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Univ California
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Abstract

EFEITOS SISTEMICOS E INTRATECAIS DE UMA SéRIE DE INIBIDORES DE FOSFOLIPASE A~2~ NA HIPERALGESIA E LI- BERAçãO ESPINAL DE PGE~2~. A presente invenção refere-se a fosfolipase A2 (PLA2) formas são expressas na medula espinal, cuja inibição induz uma potente anti- hiperalgesia. São proporcionados compostos de inibidores de PLA2 que in- cluem um motivo comum consistindo em uma 2-oxoamida com uma cauda de hidrocarboneto e uma ligação de 4 carbonos. Os compostos bloqueiam PLA2 dependente de cálcio (cPLA~2~) do Grupo IVA e/ou PLA~2~ independente de cálcio (iPLA~2~) do Grupo VIA e/ou PLA~2~ secretado (sPLA~2~) do Grupo V.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EFEITOSSISTÊMICOS E INTRATECAIS DE UMA SÉRIE DE INIBIDORES DE FOS-FOLIPASE A2 NA HIPERALGESIA E LIBERAÇÃO ESPINAL DE PGE2".
DECLARAÇÃO DE PATROCÍNIO GOVERNAMENTAL
Esta invenção foi patrocinada, total ou inteiramente, com fundosdos United States National Institutes of Health NIH Concessão N0 GM 20505e GM 064611. O governo norte-americano pode ter certos direitos sobre ainvenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a lesão e inflamação teciduaisque levam ao desenvolvimento de uma facilitação evidente da sensibilidadea estímulos moderadamente aversivos, por exemplo, hiperalgesia. É há mui-to tempo apreciado que este fenômeno é diminuído por agentes que blo-queiam a atividade da ciclooxigenase (COX) (Vane, Λ/aí. New Biol., 231:232-235, 1971). Embora trabalho anterior tenha sugerido que essa ação resultoude um efeito periférico (Ferreira, Nat. New. Biol., 240:200-203, 1972), foisubseqüentemente verificado que inibição de COX espinal também levou àreversão do estado facilitado (Yaksh et ai, "Acetylsalicilic Acid: New Uses foran OIdDrug", pp.137-152 (Barnet et al., editores) Raven Press, 1982; Taiwoe Levine, J. Neurosci, 8:1346-1349, 1988). Consistente com esta ação, elamostrou que pequena entrada aferente persistente, conforme se origina dalesão tecidual, evoca uma significante liberação espinal de prostanóides invivo de um modo que era bloqueada por inibidores de COX distribuídos es-pinalmente (Ramwell, et al., Am. J. Physiol, 211:998- 1004, 1966; Yaksh,acima, 1982; Malmberg e Yaksh, Science, 257:1276-1279, 1992; Malmberge Yaksh, J. Neurosci, 15:2768-2776, 1995; Ebersberger, et al., 1999, Samadet al., Nature, 410:471-475, 2001, e Yaksh,, et al., J. Neurosci, 21 :5847-5853, 2001). Um importante elemento da síntese da prostaglandina (PG) é afosfolipase A2 (PLA2), pois é requerida para gerar ácido araquidônico, que éo substrato para a formação de prostanóide mediada por COX.
A fosfolipase A2 (PLA2) constitui uma superfamília de enzimasque catalisam a hidrólise do éster de ácido graxo da posição sn-2 de fosfoli-pídios de membrana, rendendo um ácido graxo livre e um lisofosfolipídio.Dentre as PLA2S intracelulares está a PLA2 citosólica do grupo IVA (GIVAPLA2, também aqui referida como CPLA2), que é geralmente consideradauma enzima pró-inflamatória; a PLA2 do Grupo VIA independente de cálcio(GVIA PLA2, também referida aqui como iPLA2); e a PLA2 secretada do gru-po V (sPLA2). GVIA PLA2 é realmente um grupo de enzimas citosólicas vari-ando de 85 a 88 kDa e expressas como distintas variantes splice, somenteduas das quais mostraram ser cataliticamente ativas (PLA2 do Grupo VIA-1 eVIA-2). (Larsson, et al., J. Biol. Chem. 273: 207-214, 1998). O papel da GVIAPLA2 no processo inflamatório não está claro, mas parece que esta enzima éa PLA2 primária para as funções metabólicas basais dentro de célula, inclu-indo, reportadamente, homeostasia de membrana (Balsinde et al., Proc. Na-tl. Acad. Sci U.S.A., 02:8527-8531, 1995; Balsinde et al., J. Biol. Chem., 272:29317-29321, 1997; Balsinde et al., J. Biol. Chem., 272:16069-16072, 1997;Ramanadham et al., J. Biol. Chem., 274:13915- 13927, 1999; Birbes et al.,.Eur. J. Biochem., 267:7118-7127, 2000; e Ma et al., Lipids, 36:689-700,2001), sinalizador de receptor de insulina (Ramanadham, et al., J. Biol.Chem., 274:13915-13927, 1999; Ma et al., J. Biol. Chem., 276: 13198-13208,2001) e regulação de canais de cálcio. (Guo et al., J Biol. Chem., 277:32807-32814, 2002; Cummings et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol, 283: F492-498,2002). GVIA, GIVA e GV PLA2 estão todas presentes, e desempenham pa-péis ativos nos processos inflamatórios do sistema nervoso central (vide, porexemplo, Sun, et al., J.Lipid Res., 45 :205-213, 2004).
As enzimas GVIA PLA2 contêm, todas elas, um motivo de Iipasede consenso, Gly-Thr-Ser*-Thr-Glv, com a serina catalítica confirmada pelamutagênese 'sítio-di rígida (Larsson et al., J. Biol. Chem., 273:207-14, 1998;Tang et al., J. Biol. Chem., 272:8567-8575, 2002). Outros resíduos críticospara a catálise precisam ser ainda confirmados, e enquanto o mecanismopelo qual cliva a ligação sn-2 não tiver sido estabelecido, GVIA PLA2 é pro-vavelmente uma hidrolase com uma díade catalítica Ser/Asp similar à PLA2do Grupo IVA (Dessen et al., Cell 1999, 97: 349-360, 1999; Dessen, Bio-chim. Biophys. Acta, 1488:40-47 ,2000; Phillips et al., J. Biol. Chem., 278:41326-41332, 2003). mRNA constitutivo e proteína foram detectados na me-dula espinal para a PLA2 dependente de cálcio do Grupo IVA (cPLA2 doGrupo IVA) e iPLA2 independente de cálcio do Grupo VIA (iPLA2 do GrupoVIA) e as formas secretadoras SPLA2 dos Grupos Il e V (Lucas et al., Br. J.
Pharmacol., 144:940-952, 2005, Svensson et al., Annu. Rev. PharmacoLToxicol., 42:553-555, 2005).
A descoberta de uma nova série de 2-oxamidas que inibem c-PLA2 do Grupo IVA in vitro e in vivo (Kokotos, et al., J. Med.Chem., 45:2891-2893, 2002; Kokotos, et al., J. Med.Chem., 47:3615-3628, 2004) foi recen-temente reportada. Nesse trabalho inicial, foi observado que 2-oxoamidasinibem a inflamação no ensaio de edema induzido por carragenina da patado rato (Kokoto et al., acima, 2004).
Com base na similaridade dos substratos, classes de inibidorescomuns, homologia de seqüência limitada na região da serina catalítica, esimilaridades nos sítios ativos da GIVA e GVIA PLA2, GIVA PLA2 podemmostrar reatividade cruzada com GVIA PLA2. Portanto, tem sido difícil proje-tar inibidores seletivos de GIVA e GVIA PLA2 que podem se distinguir entreas moléculas in vivo. Ainda, inibidores seletivos para GV PLA2 têm sido difí-ceis de planejar.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção proporciona inibidores potentes de 2-oxoamida defosfolipase A2 (PLA2), incluindo aqueles seletivos para CPLA2 do Grupo IVAe/ou JPLA2 do Grupo iPLA2 e/ou SPLA2, bem como métodos para uso doscompostos inibidores. Os compostos são especialmente úteis na inibição daatividade PLA2 cje medula espinal, que é causativamente relacionada aosprocessos inflamatórios mediados espinalmente levando as condições tais *como, hiperalgesia (dor sofrida através de hipersensibilidade a estímulo). Oscompostos inibidores da invenção agem, cada uma, especificamente sobrePLA2, para a exclusão das enzimas de ciclooxigenase também envolvidasna inflamação.
Os inibidores de PLA2 da invenção são compostos de 2-oxoamida que exibem um alto grau de especificidade para isoformas citosó-Iicas (CPLA2) e/ou independentes de cálcio (iPLA2) e/ou secretadas (sPLA2).Compostos representativos da invenção são cinco análogos de 2-oxoamidarelacionados AX006, AX010, AX048, AX057 e AX015 (o último é somenteinibidor de SPLA2)- Destes compostos, a ordem de classificação de potênciaque inibe a atividade de CPLA2 era de AX048 > AX006 > AX057 > AX010 epara inibir atividade de iPLA2 era AX048 > AX057 > AX006 >AX010. ParaSPLA2, AX048 demonstrou atividade inibidora comparável àquela exibidapara CPLA2 enquanto AX015 inibiu SpLA2 sem efeito significante sobre asduas outras isoformas de PLA2. No total, a faixa de potências inibidoras deSPLA2 dentre esses cinco compostos era AX057 > AX048 > AX015 > AX010(AX006 não foi testado contra SPLA2).
Mais particularmente, em um aspecto da invenção, são propor-cionados os compostos tendo a fórmula (I):
R1 é um grupo C2-C8 alcóxi, em que o dito grupo alcóxi é linearou ramificado; R2 é ausente, qualquer grupo aromático, heterocíclico, oucarbocíclico, ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramifica-da, saturada ou insaturada, em que a dita alquila, alquenila ou alquinila éopcionalmente substituída; R3 é grupo aromático, heterocíclico ou carbocícli-co, ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificada, satu-rada ou insaturada; η >0, m >0, k >0; e quaisquer de seus isômeros geomé-tricos, formas enantioméricas, sais farmacologicamente ou imunologicamen-te aceitáveis ou pró-fármacos destes. Em uma modalidade, ?n é 0, η é 2 e R1é etóxi (por exemplo, AX048). Em uma outra modalidade, méO, η é 3 e R1 ét-butóxi (por exemplo, AX057). Em uma modalidade, m é 2, η é 4, e R1 é e-tóxi (por exemplo, AX065). Em uma outra modalidade, m é 0, η é 4 e R1 t-butóxi (por exemplo, AX105). Em modalidades com cerca de 95 a 100% depotência contra SPLA2, m é 0, η é 1 e R1 é t-butóxi (por exemplo, AX113), oum é 0, η é 0 e R1 é etióxi (AX114), ou m é 0, η é 1 e R1 é t-butóxi (por exem-plo, AX111).Em um outro aspecto da invenção, o composto da fórmula (Ia) éproporcionado
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que R1 é qualquer um grupo CrC8 alcóxi, em que o dito grupo alcóxi élinear ou ramificado; R2 é ausente, qualquer grupo aromático, heterocíclico,ou carbocíclico, ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou rami-ficada, saturada ou insaturada, em que a dita alquila, alquenila ou alquinila éopcionalmente substituída; R3 é grupo aromático, heterocíclico ou carbocícli-co, ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificada, satu-rada ou insaturada; m >0, k >0; e quaisquer isômeros geométricos, formasenantioméricas, sais farmacológica ou imunologicamente aceitáveis ou pró-fármacos destes. Em uma modalidade R1 é um metóxi, R2 é metila, e m é 2.Em uma outra modalidade, R1 é uma C2-C4 alcóxi, R2 é metila, e m é 2. Emainda uma outra modalidade, R1 é etóxi, R2 está ausente, e m é 2 (por e-xemplo, AX093).
Em um outro aspecto da invenção, o composto da fórmula (II) éproporcionado
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que R é uma cadeia C2-C8 alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramifi-cada, saturada ou insaturada; R3 é qualquer grupo aromático, heterocíclico,ou carbocíclico opcionalmente substituído^ uma cadeia alquila, alquenila,ou alquinila linear ou ramificada, saturada ou insaturada opcionalmentesubstituída; k >0; e todos os isômeros geométricos, formas enantioméricas,sais ou pró-fármacos farmacológica ou imunologicamente aceitáveis destes.Em modalidades com especificidades para SPLA2, R é t-butóxi e k é 7 (porexemplo, AX055) e, em uma modalidade com atividade preferencial (emborafraca) contra SPLA2, R é NH2 (por exemplo, AX015).
De acordo com outros aspectos da invenção, as composiçõesfarmacêuticas são proporcionadas por combinação de um veículo farmaceu-ticamente aceitável com quaisquer dos compostos de Fórmulas l, la ou II.São também proporcionadas composições adicionais como a seguir.
Por exemplo, uma composição farmacêutica para uso na inibi-ção da atividade enzimática de fosfolipase A2 em uma célula ou organismo,compreendendo o composto de fórmula (III),
<formula>formula see original document page 7</formula>
e um veículo farmaceuticamente aceitável.
A título de outro exemplo, uma composição farmacêutica parauso na inibição da atividade enzimática de fosfolipase A2 em uma célula ouorganismo, compreendendo o composto de fórmula (IV),
<formula>formula see original document page 7</formula>
e um veículo farmaceuticamente aceitável.
A título de outro exemplo, uma composição farmacêutica parauso em inibir a atividade enzimática de fosfolipase A2 em uma célula ou or-ganismo, compreendendo o composto de fórmula (V),
<formula>formula see original document page 7</formula>
e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em um outro exemplo, uma composição farmacêutica para usona inibição da atividad%-enzimática de fosfolipase A2 do Grupo IVA e GrupoVIA em uma célula ou organismo, compreendendo o composto de fórmula(VI),
<formula>formula see original document page 7</formula>
e um veículo farmaceuticamente aceitável.
E em um outro exemplo, uma composição farmacêutica para usona inibição da atividade enzimática da fosfolipase A2 de Grupo IVA e doGrupo VIA em uma célula ou organismo, compreendendo o composto defórmula (VII),
<formula>formula see original document page 8</formula>
e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em um outro aspecto da invenção, é proporcionado um métodopara modular os efeitos dos processos inflamatórios em um mamífero, com-preendendo administrar uma quantidade inibidora eficaz de fosfolipase A2 doGrupo IVA e do Grupo VIA, e/ou uma quantidade inibidora eficaz de fosfoli-pase A2 do Grupo V, de um ou mais dos compostos da invenção. Em umamodalidade, um dos efeitos dos processos inflamatórios modulados é infla-mação do sistema nervoso central. Em uma outra modalidade, os processosinflamatórios modulados são espinalmente mediados. Em outras modalida-des, um dos processos inflamatórios mediados espinalmente pode ser hipe-ralgesia. Em certas outras modalidades, o inibidor de fosfolipase A2 adminis-trado é específico para SPLA2 (isto é, sem efeito estatístico sobre CPLA2 ouiPLA2), ou para SPLA2 e iPLA2 (isto é sém efeito estatístico SobrecPLA2).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 consiste em um esquema indicando a seqüência sin-tética para os compostos AX da invenção.
A Figura 1A ilustra as estruturas dos compostos AX048 eAX057.
A Figura 1B ilustra as estruturas dos compostos AX035 atéAX041 e AX073-AX074.
A Figura 1C Gráficos ilustrando (A) a ligação dependente deTempo de AX010 (barras transparentes) e AX073 (barras escuras), (b) re-versibilidade de inibição (controle = sem inibidor). ID. Curvas de resposta adose para inibição de PLA2 por AX010 (·), AX041 (o) e AX073 (T).
A Figura 2 Gráfico ilustrando as curvas de inibição de resposta adose in vitro de AX006 (círculos o), AX010 (quadrados ■) AX048 (triângulospara cima A), AX057 (triângulos para baixo T) para CPLA2 do Grupo CPLA2.As curvas representam um ajuste para uma função logarítmica.
A Figura 3 Gráfico ilustrando as curvas de inibição resposta adose in vitro de AX010 (quadrados ■). AX048 (triângulos para cima A),AX057 (triângulos para baixo T) para iPLA2 do grupo iVI. As curvas repre-sentam um ajuste da função logarítmica.
A Figura 4 Gráfico ilustrando os efeitos dos compostos da inven-ção sobre a atividade da ciclooxigenase in vitro expressa como inibição empercentagem. A Figura representa a média ± SD para amostras tratadascom fármaco versus controle. Como indicado, a indometacina (Indo, 50 μΜ),mas não AX006 (50 μΜ), AX010 (50 μΜ), AX048 (50 μΜ) ou AX057 (50 μΜ),serviu para inibir a atividade da ciclooxigenase nas doses empregadas.
A Figura 5 Gráfico ilustrando os efeitos de AX006, AX010,AX048 e AX057 (3 mg/kg, IP) na hiperalgesia térmica evocada por injeçãode carragenina unilateral da pata traseira. O fármaco ou veículo foi distribuí-do aos 30 minutos antes da injeção intraplantar de carragenina e latênciatérmica de escape foi medida imediatamente antes e nos intervalos depoisde até 180 minutos. Cada conjunto de gráficos mostra a média ± SEM dalatência de resposta (s) por tempo para a pata Iesionada (inj.) e não Iesiona-da (não inj.) para animais tratados com fármaco e veículo. Em grupos trata-dos com controle, a pata com carragenina exibiu um declínio significante dalatência da linha base (ANOVA de 1 caminho). Esse declínio foi impedidopor AX048. O suplemento de histograma exibe a diferença cumulativa dogrupo médio em latências de resposta entre a pata não Iesionada e a patalesionada sobre o intervalo de teste (90-180 minutos). Cqmo indicado, essamedição de hiperalgesia foi significantemente reduzida por AX048 (teste temparelhado).
A Figura 6 Gráfico ilustrando a curva de resposta a dose para osefeitos anti-hiperalgésicos de AX048 na hiperalgesia térmica evocada porinjeção de carragenina unilateral na pata traseira. Cada ponto apresenta amédia e SEM (N = 5) da diferença somada em latências de resposta entre apata Iesionada e a pata não Iesionada (*lnclinação: p<0,0004). A linha hori-zontal sólida e tracejada apresenta a média ± SEM dos animais de controletratados com veículo. Os estudos foram efetuados conforme descrição naFigura 4. O gráfico apresenta a média ± SEM da diferença cumulativa dogrupo em latências de resposta entre a pata não Iesionada e Iesionada (90-180 minutos) como função da dose. As linhas sólidas horizontais e traceja-das apresentam a média ± SEM da hiperalgesia térmica observada nos ratostratados com veículo depois da carragenina. A dose de ED50 de AX048 re-presenta redução de 50% da latência de escape térmico.
A Figura 7 Gráfico ilustrando os efeitos dos intervalos de pré-tratamento sobre os efeitos anti-hiperalgésicos de AX048 (3 mg/kg, IP) sobrehiperalgesia térmica evocada por carragenina. O fármaco foi distribuído aos15, 30, 180 ou 360 minutos antes da distribuição da carragenina intraplantar,e o escape térmico foi medido imediatamente antes da carragenina e emintervalos depois de até três horas. Os dados são expressos como a diferen-ça de latência cumulativa entre a pata Iesionada e a não lesionada. Os efei-tos máximos foram observados aos 30 minutos e persistiram até 3 horas.ANOVA de 1 caminho (p = 0,0006) seguido pelo teste de Comparação Múlti-pla de Bonferroni post hoc (n = 4-12/grupo de tratamento). ** p<0,05 emcomparação com o Controle.
A Figura 8 Gráficos ilustram os efeitos de AX006, AX010, AX048e AX057 (IT 30 μg/10 μΙ) sobre hiperalgesia térmica evocada por injeção decarragenina unilateral na pata traseira. O fármaco ou veículo foi distribuídoaos 15 minutos antes da injeção intraplantar de carragenina, e o escapetérmico foi medido imediatamente antes e nos intervalos depois de até 180minutos. Cada conjunto de gráficos mostra a média ± SEM da latência déresposta (s) sobre tempo para a parta lesionada (Inj.) e não lesionada (nãoinj.) para os animais tratados com fármaco ou veículo. Como indicado, nosgrupos tratados com controle, a pata com carragenina exibiu um declínio dalatência a partir da linha base (ANOVA de 1 caminho). Esse declínio foi im-pedido por AX048. O suplemento de histograma exibe a diferença cumulati-va média do grupo em latências de resposta entre a pata não lesionada elesionada sobre o intervalo de teste (90-180 minutos). Como indicado, essamedição de hiperalgesia foi significantemente reduzida por AX048 (teste tnão emparelhado).
A Figura 9 Gráfico ilustrando os efeitos de AX006, AX010,AX048 e AX057 (3 mg/kg, IP) na hiperalgesia térmica evoca por SP intrate-cal. Fármaco ou veículo foi distribuído em 30 antes da distribuição intratecalda substância P (IT-SP: 30 nmol) e escape térmico foi medido imediatamen-te antes de IT SP e em intervalos depois de até 60 minutos. Os dados sãoexpressos como a latência de resposta por tempo (s). Como indicado, ANO-VA de 1 caminho mostrou reversão de hiperalgesia térmica significante apartir de veículo para AX048.
A Figura 10. Gráficos ilustrando as respostas de ratos não anes-tesiados preparados com cateteres de diálise espinal, que receberam inje-ções IP de veículo ou de AX006, AX010, AX048 e AX057 (3 mg/kg, IP) se-guido 20 minutos mais tarde por injeções intratecais da substância P (IT-SP:20 nmols). (Topo) O curso de tempo de liberação de PGE2 foi determinadoem amostras em 15 minutos a 45 minutos depois de IT SP em animais pré-tratados com veículo IP ou AX048 (3 mg/kg) IP. IT SP evocou um aumentodependente de tempo na liberação seguinte ao veículo IP, mas não seguinteao AX048 IP (*p < 05). (Fundo) Área sob a curva de efeito de tempo para aliberação de PGE2 de 0-45 minutos em ratos que estavam recebendo veícu-lo, AX006, AX010, AX048 ou AX057. Como indicado, depois de IP AX006,AX010 ou AX057, IT SP evocou um aumento significante em comparaçãocom somente o veículo. (Kruskall Wallace p< 0,008. * p< 0,05; ** p< 0,01,Comparação Múltipla de Dunns versus veículo (VEH). Em contraste, seguin-te ao AX048 IP, não houve diferença entre liberação em comparação com oveículo IP sozinho (p> 0,05).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O conteúdo do Pedido de Patente de Utilidade, co-pendente, emco-titularidade, US 10/506.509, depositado em 7 de março de 2003, é aquiincorporado a título de referência. A invenção é ainda descrita em detalhesabaixo.
Todas as patentes e outras referências citadas no relatório des-critivo são indicativas do nível de conhecimento daqueles versados na técni-ca à qual a invenção pertence, e são aqui incorporadas a título de referênciaém sua totalidade, incluindo quaisquer tabelas e figuras, na mesma extensãocomo se cada referência tivesse sido incorporada, individualmente, a títulode referência em sua totalidade.
Aquele versado na técnica apreciaria prontamente que a presen-te invenção está bem-adaptada para obter as finalidades e vantagens men-cionadas, bem como aquelas inerentes a ela. Os métodos, variações e com-posições descritas aqui, como presentemente representativos das modalida-des preferidas, são exemplificativos e não têm o objetivo de limitar o escopoda invenção. Alterações na mesma e outros usos ocorrerão àqueles versa-dos na técnica, que estão incluídas no espírito da invenção, e são definidaspelo escopo das reivindicações.
As definições dadas aqui não têm a intenção de serem Iimitati-vas do significado comumente entendido por aquele versado na técnica, amenos que de outro modo indicado.A. Revisão das Estruturas dos Compostos da Invenção
Os compostos da invenção são construídos com base em uma2-oxoamida com uma cauda de hidrocarboneto e quatro ligações de carbo-nos. Uma importante consideração na funcionalidade desses agentes dizrespeito aos seus altos valores de cLog P, na faixa de 6-8. É amplamenteconsiderado que agentes com valores de Iog P maiores que 5 não podemser "farmaconizáveis" (Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 46:3-26, 2001).É importante notar que nos presentes sistemas, o alvo da ação do fármacoestá dentro do çitosol. Isso requer que a molécula tenha uma Iipofilicidadeque permita que^ele cruze prontamente a membrana celular para interagircom PLA2-
As atividades in vitro e in vivo que esses agentes exibem podemser bem-dependentes da complexa questão de distribuição que essas molé-culas confrontam; e AX048, em particular, pode estar agindo como um pró-fármaco.
Um grupo carbóxi parece ser necessário para inibir CPLA2, quepresumivelmente age como um mimético do grupo de topo do fosfato de umfosfolipídio de substrato natural. Notavelmente, o espaçamento em um fosfo-lipídio de substrato natural entre a ligação de éster sn-2 cindível e o grupo detopo do fosfato é análogo a uma 2-oxoamida com base em ácido γ-aminobutírico ou uma 2-oxoamida com base em γ-norleucina. O grupo carbóxi dosinibidores de 2-oxoamida da invenção pode, portanto, interagir com algumaespecificidade no sítio ativo da CPLA2- Embora não haja o nucleófilo serinaem SPLA2, a similaridade dos inibidores de PLA2 de 2-oxamida da invençãocom atividade contra SPLA2 a um substrato de fosfolipídio presumivelmentepermite que estes se liguem ao sítio ativo de SPLA2. Assim, é presumido queum grupo carbóxi livre na posição R2 é necessário na invenção. Ainda, dadaa especificidade do composto AX015 para SPLA2 para a exclusão de outrasisoformas (embora com atividade inibidora fraca), a presença de uma amidaprimária e de baixa hidrofobicidade na molécula poderia desempenhar umpapel na sua atividade e assim podem ser desejáveis os atributos de inibido-res de SPLA2.
B. Efeitos múltiplos de Inibição de PLAp.
Terapeuticamente, os presentes estudos que mostram os agen-tes seletivos de PLA2, sistemicamente biodisponíveis em desenvolvimentopodem ser relevantes para alvos terapêuticos que não a dor. Assim, umavariedade de processos neuroinflamatórios pode ser também mediada atra-vés de sua ativação de isoformas de PLA2 neuraxiais.
Para explicar, é evidente que diante da inflamação periférica elesão tecidual resulta um processamento exagerado de estímulos nocicepti-vos e que esta faciljtação reflete em parte uma iniciação evocada por,aferen-te de uma cascata a jusante levando a um processamento nociceptivo identi-ficado do nível espinal. Evidência corrente sugere que um componente im-portante dessa cascata está associado às ações de prostanóides liberadosespinalmente. Fundamento para essa tese está amplamente na observaçãoque a distribuição espinal das prostaglandinas induzirá hiperalgesia e queestes ácidos lipídicos são liberados para o espaço extracelular espinal de-pois da lesão tecidual. Além disso, a distribuição espinal de inibidores deCOX reduz a liberação de prostaglandinas, bem como ò estado facilitado porlesão periférica ou pela ativação direta desses circuitos por injeção IT depequenos neurotransmissores aferentes tais como SP e/ou glutamato (videSvensson e Yaksh, acima, 2002). Essa cascata foi suficiente para sugerir arelevância de buscar as ligações a jusante que precedem aquelas mediadaspor ciclooxigenase; logo, o interesse em iPLA2, CPLA2 e SPLA2 espinais.
Há também uma substancial evidência que outros produtos deatividade de PLA2 são importantes no processamento nociceptivo, como aseguir: i) Ácido araquidônico gerado por PLA2 pode aumentar diretamentefunção do ionóforo NMDA (Richards et al., Eur. J. Neurosci., 17:2323-2328,2003). Acredita-se que o receptor de NMDA desempenhar um papel impor-tante na facilitação pré- e pós-sináptica no nível espinal (UHirondel et al.,Eur. J. Neurosci., 11:1292-1300, 1999; Richards et al., acima, 2003); ii) Áci-do araquidônico formado pela ação de PLA2S proporciona também o subs-trato essencial necessário para a síntese independente de ciclooxigenase deisoprostanos. Estudos com isoprostanos espinais mostraram que eles inici-am a liberação de transmissor e descarga neuronal facilitadas, e sua distri-buição espinal levará à hiperalgesia (Evans et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,293:912-920, 2000); iii) Fator ativador de plaquetas (PAF), um alquil-fosfolipídio, surge da hidrólise de Iipfdio da membrana por PLA2. PAF produzuma alodinia proeminente depois da distribuição espinal (Morita et al., Pain,111:351-359, 2004). Esse mediador de lipídio está presente na medula espi-nal e foi reportado que este é liberado a partir de células micróglias estimu-ladas (Jaranowska etal., Mol. Chem. Neuropathol., 24:95-106, 1995). Essesagentes têm um perfil fisiológico similar àquele dos prostanóides; iv) PLA2levará à formação de lisofosfatos. Esses produtos têm sido também recen-temente implicados nos estados facilitados do processamento da dor (Inoueet al., Nat. Med., 10:712-718, 2004; Seung Lee et al., Brain Res., 1035:100-104, 2005). Em resumo, dados os componentes acima, é razoável formular ahipótese que um efeito mais pronunciado sobre o processamento nocicepti-vo espinal pode surgir por bloqueio de ligações a montante da COX, taiscomo aquelas representadas por PLA2.A inibição de PLA2 exerce um efeito significante sobre ambasuma hiperalgesia iniciada centralmente (IT-SP) e perifericamente (carrageni-na intraplantar). Os compostos da invenção obtêm tal inibição bloqueandoreversivelmente a CPLA2 do Grupo IVA e/ou iPLA2 do Grupo VIA e/ou SPLA2do grupo V, e fazer depois tanto da distribuição espinal como da sistêmica.Por exemplo, AX010 exerce um efeito fraco, AX006 é uma PLA2 do GrupoIVA preferivelmente, enquanto AX048 e AX057 são CPLA2 do Grupo IVA eiPLA2 do Grupo VIA preferivelmente, e AX015 é SPLA2 preferivelmente (em-bora com fraca atividade inibidora).
Além disso, os compostos inventivos administrados sistemica-mente bloqueiam a hiperalgesia evocada por IT-SP na ausência de qualquerlesão periférica. Isso sugere que a atividade anti-hiperalgésica dos compos-tos distribuídos sistemicamente é mediada por uma ação central.C. Síntese e Estrutura dos Inibidores de Pia? da Invenção.
Os compostos da invenção são estruturalmente projetados combase no princípio que o inibidor deve consistir em dois componentes: (a) umgrupo eletrofílico que é capaz de reagir com o resíduo de serina sítio-ativo, e(b) um segmento lipofílico que contém motivos químicos necessários paraambas as interações específicas e uma orientação própria na ligação dosubstrato clivado da enzima (Kokotos, J. Moi Catai. B. Enzym. 2003,22:255-269). Essa estratégia tem sido aplicada com sucesso no desenvolvi-mento de 2-oxoamidas lipofílicas (Chiou et al., Lipids 2001, 36:535-542; Chi-ou et al., Org Lett. 2000, 2:347-350), 2-oxoamida e análogos de bis-2-oxoamida triacilgliceróis, (Kotsovolou et al., J. Org. Chem. 2001, 66:962-967;Kokotos et al., Chemistry - A European Journal 2000, 6:4211-4217) bemcomo aldeídos lipofílicos (Kotsovolou et al., Òrg. Lett. 2002, 4:2625-2628) etrifIuormetil cetonas (Kokotos et al., ChemBioChem 2003, 4: 90-95) comoinibidores eficazes de Iipases pancreáticas e gástricas.
Por conseguinte, a invenção proporciona uma nova classe de 2-oxoamidas que inibe GIV PIA2 (Kokotos, et al., J. Med. Chem. 2002,45:2891-2893; Kokotos et al., J. Med. Chem. 2004, 47:3615-3628). A esserespeito, foi determinado que GVIA PLA2 usa uma serina como o resíduonucleofílico (Tang et al., J. Biol Chem., 272:8567-8575, 1997). As 2-oxoamidas da invenção compartilham uma estrutura genérica conformemostrada no Esquema 1 abaixo:
Esquema 1
É ilustrada na Figura 1, a síntese dos inibidores de 2-oxoamidacontendo ou um grupo carboxila livre ou um grupo éster carboximetílico eresíduos 2-oxacila com base em ácido oléico ou grupos fenila. Além disso,no mesmo esquema, é mostrada a síntese de inibidores com base em umácido γ-aminoácido α,β-insaturado.
Para esses estudos, AX006 e AX010 foram preparados comodescritos previamente (Kokotos et al., acima, 2002; Kokotos et al., acima,2004). A síntese e a caracterização de agentes AX048 e AX057 são descri-tas aqui como síntese representativa dos compostos da invenção, e a Figura1 sumariza o Esquema da síntese, que é ainda detalhado abaixo:1. Acoplamento do ácido 2-hidróxi-hexadecanóico com ésteres de 4-amino-butanoato
A uma solução agitada do ácido 2-hidróxi-hexadecanóico (2,0mmols) e o éster de 4-amino-butanoato (2,0 mmols) em CH2CI2 (20 mL),Et3N (6,2 mL, 4,4 mmols) e subseqüentemente WSCI (0,42 g, 2,2 mmols) eHOBt (0,32 g, 2,0 mmols) foram adicionados a O0C. A mistura reacional foiagitada por 1 h a O0C e durante a noite, à temperatura ambiente. O solventefoi evaporado sob pressão reduzida e EtOAc (20 mL) foi adicionado. A ca-mada orgânica foi lavada consêcutivamente com salmoura, HCL 1N, sal-moura, NaHCO3 a 5%, e salmoura, secada sobre Na2SO4, e evaporada sobpressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna u-sando CHCI3-MeOH (95:5) como o eluente.
4-[(2-Hidroxiexadecanoil)amino]butanoato de etila Rendimentode 72%; RMN 1H: RMN: δ 6,68 (1H, t, J = 7 Hz, NH), 4,13 (3H, m, CH, CO-OCH2CH3), 3,34 (2H, m, CH2NH), 2,68 (1H, b, OH), 2,32 (2H, t, J = 7 Hz,CH2COO), 1,80-1,58 (4H, m, CH2CH2COO, CH2CH), 1,45-1,23 (27H, m,12xCH2, COOCH2CH3), 0,85 (3H, t, J = 7 Hz, CH3); 13C RMN: δ 174,0, 173,8,72.2, 60,6, 38,5, 34,9, 31,9, 31,7, 31,4, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 25,0,24,6, 22,7, 14,1, Análise calculada para C22H43NO4 (385,58): C, 68,53; H,Í1,24; N, 3,63, Encontrada: C, 68,12; H, 11,32; N, 3,48.
4-[(2-Hidroxiexadecanoil)amino]butanoato de terc-butila Rendi-mento de 64%; RMN 1H: δ 6,49 (1H, t, J = 7 Hz, NH), 4,12 (1H, m, CH), 3,34(2H, m, CH2NH), 2,73 (1H, b, OH), 2,27 (2H, t, J = 7 Hz, CH2COO), 1,82-1,49 (4H, m, CH2CH2COO, CH2CH), 1,45 [9H, s, C(CH3)3], 1,38-1,15 (24H,m, 12xCH2), 0,89 (3H, t, J = 7 Hz, CH3); 13C RMN: δ 173,9, 173,7, 80,1, 72,3,38.3, 35,4, 31,9, 31,8, 31,4, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 28,7, 25,1, 24,5,22,8, 14,1, Análise calculada para C24H47NO4 (413,63): C, 69,69; H, 11,45;N, 3,39, Encontrada: C, 69,42; H, 11,61; N, 3,27.
2. Oxidacão de 2-hidróxi-amida
A uma solução de uma 2-hidróxi-amida (1,00 mmol) em umamistura de tolueno-EtOAc (15 mL), uma solução de NaBr (0,11 g, 1,05mmol) em água (1,3 mL) foi adicionada, seguida por AcNH-TEMPO (2 mg,0,01 mmol). Ao sistema bifásico resultante, que foi resfriado a -5°C, uma so-lução aquosa de NaOCI 0,35M (3,1 mL, 1,10 mmol) contendo NaHCO3 (0,25g, 3 mmols) foi adicionada, gota-a-gota, com agitação vigorosa a -5°C porum período de 1 h. Depois da mistura ter sido agitada por mais 15 minutos, aO0C, EtOAc (15 mL) e H2O (5 mL) foram adicionados. A camada aquosa foiseparada e lavada com EtOAc (10 mL). As camadas orgânicas combinadasforam lavadas consecutivamente com ácido cítrico aquoso a 5% (15 mL)contendo Kl (0,04 g), Na2S2O3 aquoso a 10% (6 mL), e salmoura e secadassobre Na2SO4.' Os solventes foram evaporados sob pressão^ reduzida, e oresíduo foi purificado por cromatografia em coluna [EtOAc-éter de petróleo1:9 (ponto de ebulição de 40-60°C).
4-[(2-oxoexadecanoil)amino]butanoato de etila (AX048) Rendi-mento de 86%: sólido branco; p.f. 63-64°C; 1H RMN: δ 7,16 (1H, m, NH),4,12 (2H, q, J = 7 Hz, COOCH2CH3), 3,33 (2H, m, CH2NH), 2,89 (2H, t, J= 7Hz, CH2COCO), 2,34 (2H, t, J= 7 Hz, CH2COO), 1,87 (2H, m, CH2CH2COO),1,57 (2H, m, CH2CH2COCO), 1,40-1,15 (25H, m, HxCH2, COOCH2CH3),0,85 (3Η, t, J = 7 Hz1 CH3); 13C RMN: δ 199,0, 172,7, 160,2, 60,4, 38,5, 36,5,31,7, 31,4, 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 28,9, 24,2, 23,0, 22,5, 14,0, 13,9; MS(FAB) m/z (%) 384 (100) [M++ Η], Análise calculada para C22H4INO4(383,57): C1 68,89; Η, 10,77; Ν, 3,65, Encontrada: C, 68,71; Η, 10,88; Ν,3,54.
4-[(2-oxoexadecanoil)amino]butanoato de terc-butila (AX057)Rendimento de 95%; sólido branco; p.f. 61-62°C; 1H RMN: δ 7,11 (1H, m,NH), 3,33 (2H, m, CH2NH), 2,91 (2H, t, J = 7 Hz, CH2CO), 2,28 (2H, t, J = 7Hz, CH2COO), 1,84 (2H, m, CH2CH2COO), 1,60 (2H, m, CH2CH2COCO),1,45 [9H, s, C(CH3)3], 1,38-1,23 (22H, m, HxCH2), 0,89 (3H, t, J = 7 Hz,CH3); 13C RMN: δ 198,6, 171,6, 159,7, 80,0, 38,1, 36,1, 32,2, 31,3, 29,0,28,9, 28,8, 28,7, 28,4, 27,4, 23,8, 22,5, 22,0, 13,5; MS (FAB) m/z (%) 412(17) [M++ H], 356 (100), Análise calculada para C24H45NO4 (411,62): C,70,03; H, 11,02; N, 3,40, Encontrada: C, 69,89; H, 11,32; N, 3,47.
3. Síntese de Inibidores de 2-Oxoamida
a. Acoplamento de 2-hidróxi-ácidos com componentes amino. Auma solução agitada de 2-hidróxi-ácido (2,0 mmols) e cloridrato de γ-aminobutirato de metila (2,0 mmols) em CH2CI2 (20 mL), Et3N (6,2 mL, 4,4mmols) e, subseqüentemente 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida(WSCI) (0,42 g, 2,2 mmols) e 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0,32 g, 2,0mmols) foram adicionados a 0°C. A mistura reacional foi agitada, por 1 hora,a 0°C e durante a noite à temperatura ambiente. O solvente foi evaporadosob pressão reduzida e EtOAc (20 mL) foi adicionado. A camada orgânica foilavada consecutivamente com salmoura, HC11N, salmoura, NaHCO3 a 5% esalmoura, secada sobre Na2SO4 e evaporada sob pressão reduzida. O resí-duo foi purificado por cromatografia em coluna usando CHCI3 como eluente.
Éster metílico do ácido 4-(2-hidróxi-5-fenil-pentanoilamino)-butírico (2a). Rendimento de 82%. Sólido branco; p.f. 34-35°C; RMN 1H: δ7,24-7,11 (5H, m, C6H5), 6,82 (1H, m, NHCO), 4,06 (1H, m, CH), 3,62 (3H, s,CH3O), 3,53 (1H, d, J= 5,2 Hz, OH), 3,26 (2H, m, CHpNH), 2,59 (2H, t, J =7,8 Hz, CH2C6H5), 2,30 (2H, t, J = 6,8 Hz, CH2COO), 1,82-1,70 (6H, m,3xCH2); 13C RMN: δ 174,2, 173,8 142,0, 128,3, 128,2, 125,7, 71,7, 51,7,38,3,35,5,34,3,31,3,26,8,24,6.
Éster metílico do ácido 4-(2-hidróxi-6-fenil-hexanoilamino)-butírico (2b). Rendimento de 85%. Sólido branco; p.f. 50-51°C; 1H RMN: δ7,31-7,15 (5H, m, C6H5), 6,76 (1H, m, NHCO), 4,08 (1H, m, CH), 3,68 (3H, s,CH3O), 3,32 (2H, m, CH2NH), 3,10 (1H, d, J = 4,8 Hz, OH), 2,62 (2H, t, J =7,8 Hz, CH2C6H5), 2,36 (2H, t,J = 7,4 Hz1 CH2COO), 1,91-1,49 (8H, m,4xCH2); 13C RMN: £174,0, 142,3, 128,3, 128,2, 125,7, 72,0, 51,7, 38,4, 35,7,34,7,31,4,31,1,24,6.
Éster metílico do ácido 4-(2-hidróxi-5-nonadec^0-eno\\am\no)-butírico (2c). Rendimento de 82%. Sólido branco; p.f. 55-57°C; 1H RMN: δ6,80 (1 Η, m, NHCO), 5,33 (2H, m, CH=CH), 4,07 (1H, m, CH), 3,67 (3H, s,CH3O), 3,30 (2H, m, CH2NH), 2,37 (2H, t, J= 7,2 Hz, CH2COO), 1,98 (4H,m, 2xCH2CH=CH), 1,85 (2H, m, CH2CH2NH), 1,26 (24H, br s, 12xCH2), 0,87(3H, t, J= 6,6 Hz, CH3); 13C RMN: £174,2, 173,8, 129,9, 129,7, 72,1, 51,7,38,4, 34,8, 31,8, 31,3, 29,7, 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 27,2, 25,0, 24,6, 22,6, 14,1.
b. Oxidação de 2-hidróxi-amidas contendo um grupo metil éster(Método A). A uma solução de 2-hidróxi-amida (5,00 mmols) em uma misturade tolueno-EtOAc 1:1 (30 mL), uma solução de NaBr (0,54 g, 5,25 mmols)em água (2,5 mL) foi adicionada seguida por TEMPO (11 mg, 0,050 mmol).
Ao sistema bifásico resultante, que foi resfriado a -5°C, uma solução aquosade NaOCI 0,35M (15,7 mL, 5,50 mmols) contendo NaHCO3 (1,26g, 15mmols) foi adicionada, gota-a-gota, sob agitação vigorosa, a -5°C por umperíodo de 1 hora. Depois da mistura ter sido agitada por mais 15 minutos, aO0C1 EtOAc (30 mL) e H2O (10 mL) foram adicionados. A camada aquosa foiseparada e lavada com EtOAc (20 mL). As camadas orgânicas combinadasforam lavadas consecutivamente com ácido cítrico aquoso a 5% (30 mL)contendo Kl (0,18 g), Na2S2O3 (30 mL), e salmoura e secadas sobreNa2SO4. Os solventes foram evaporados sob pressão reduzida e o resíduofoi purificado por cromatográfica em coluna [EtOAc-éter de petróleo (pontode ebulição de 40-60°C), 1:9].
Éster metílico do ácido 4-(2-oxo-5-fenil-pentanoilamino)-butírico(ΑΧ037). Rendimento de 67%; Sólido branco; p.f. 30-310C; 1H RMN: δ7,19-7.15 (6H, m, C6H5, NHCO), 3,67 (3H, s, CH3O), 3,35 (2H, m, CH2NH), 2,94(2H, t, J= 7,4 Hz, CH2COCO), 2,65 (2H, t, J = 7,8 Hz, CH2C6H5), 2,36 (2H, t,J= 7,0 Hz, CH2COO), 1,91 (4H, m, 2xCH2); 13C RMN: £198,7, 173,2, 160,0,141,1, 128,3, 128,2, 125,8,51,6,38,5,35,9,34,8,31,1,24,6,24,1.
Éster metflico do ácido 4-(2-oxo-6-fenil-hexanoilamino)-butírico(AX038). Rendimento de 75%; Sólido branco; p.f. 52-54°C; 1H RMN: δ7,29-7.16 (6H, m, C6H5, NHCO), 3,69 (3H, s, CH3O), 3,37 (2H, m, CH2NH), 2,95(2H, t, J = 7,0 Hz, CH2COCO), 2,64 (2H, t,J= 7,0 Hz, CH2C6H5), 2,38 (2H, t,J= 7,0 Hz, CH2COO), 1,89-1,66 (6H, m, 3xCH2); 13C RMN: δ 198,8, 173,2,160,1, 141,9, 128,21, 128,15, 125,6, 51,6, 38,5, 36,4, 35,4, 31,1, 30,6, 24,2, 22,6.
c. Oxidação de 2-hidróxi-amidas contendo um grupo éster metíli-co (Método Β). A uma solução de 2-hidróxi-amida (1 mmol) em CH2CI2 seco(20 mL), periodinano de Dess-Martin foi adicionado (0,64 g, 1,5 mmol) e amistura foi agitada por 2 horas, à temperatura ambiente. A solução orgânicafoi lavada com NaHCO3 aquoso a 10%, secada sobre Na2SO4 e o solventeorgânico foi evaporado sobre pressão reduzida. O resíduo foi purificado porrecristalização [EtOAc/éter de petróleo (ponte de ebulição de 40-60°C)].
Éster metflico do ácido 4-(2-oxo-nonadec-10-enoilamino)-butíríco(AX041). Rendimento de 82%; Sólido oleoso; 1H RMN: J 7,13 (1H, m, NH-COCO), 5,33 (2H, m, CH=CH), 3,67 (3H, s, CH3O), 3,33 (2H, m, CH2NH),2,91 (2H, t, J= 7,2 Hz, CH2COCO), 2,38 (2H, t, J= 7,4 Hz, CH2COO), 1,98(4H, m, 2 XCH2CH=CH), 1,88 (2H, m, CH2CH2NH), 1,59 (2H, m,CH2CH2COCO), 1,26 (20H, br s, IOxCH2), 0,87 (3H, t, J = 6,6 Hz, CH3); 13CRMN: δ 199,2, 173,3, 160,3, 129,9, 129,7, 51,7, 38,0, 36,7, 31,8, 31,3, 29,7,29,6, 29,5, 29,3, 29,2, 29,0, 28,98, 27,2, 27,1, 24,3, 23,1, 22,6, 14,1; MS(FAB): m/z (%): 410 (100) [M++H].
c. Saponificação de ésteres metílicos. A uma solução agitada docomposto 2a ou 2b (2,00 mmols) em uma mistura de dioxano-H20 (9:1, 20mL) foi adicionado NaOH 1N (2,2 mL, 2,2 mmols) e a mistura foi agitada por12 horas, à temperatura ambiente. O solvente orgânico foi evaporado sobpressão reduzida e H2O (10 mL) foi adicionado. A camada aquosa foi lavadacom EtOAc1 acidificada com HCI 1N, e extraída com EtOAc (3x12 mL). Ascamadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas so-bre Na2SO4, e evaporadas sob pressão reduzida. O" resíduo foi purificadopor recristalização [EtOAc-éter de petróleo (ponte de ebulição de 40-60°C)].
Ácido 4-(2-hidróxi-5-fenil-pentanoilamino)-butfrico (3a). Rendi-mento de 79%; Sólido branco; p.f. 63-65°C; 1H RMN: £7,26-7,12 (6H, m,C6H5, NHCO), 4,09 (1H, m, CH), 3,27 (2H, m, CH2NH), 2,59 (2H, t, J= 6,6Hz, CH2C6H5), 2,31 (2H, t, J = 6,6 Hz, CH2COOH), 1,78 (6H, m, 3xCH2); 13CRMN: £177,3, 175,5, 142,0, 128,3, 125,8, 71,8, 38,4, 35,5, 34,1, 31,3, 26,8, 24,3.
Ácido 4-(2-hidróxi-6-fenil-hexanoilamino)-butírico (3a). Rendi-mento de 86%; Sólido branco; p.f. 78-80°C; 1H RMN: £7,30-7,13 (6H, m,C6H5, NHCO), 4,11 (1H, m, CH), 3,30 (2H, m, CH2NH), 2,60 (2H, t, J = 7,8Hz, CH2C6H5), 2,35 (2H, t,J = 6,6 Hz, CH2COOH), 1,81-1,47 (8H, m,4xCH2); 13C RMN: £177,4, 175,5, 142,4, 128,3, 128,2, 125,7, 71,9, 38,4,35,7,34,3,31,4,31,1,24,7,24,4.
d. Oxidação de 2-hidróxi-amidas contendo um grupo carboxílicolivre (Método C). O procedimento é o mesmo que aquele seguido no MétodoA descrito acima, com a diferença que neste caso a camada aquosa foi aci-dificada antes da preparação, e então extraída com EtOAc, e as camadasorgânicas combinadas foram lavadas com ácido cítrico aquoso a 5% con-tendo Kl, e Na2S2O3 aquoso a 10% (30 mL). O resíduo foi purificado porcromatografia em coluna. [EtOAc-éter de petróleo (ponte de ebulição de 40-60°C)].
Ácido 4-(2-oxo-5-fenil-pentanoilamino)-butírico (AX036). Rendi-mento de 48%; Sólido branco; p.f. 65-67°C; 1H RMN: δ 7,25-7,11 (6H, m,C6H5, NHCOCO), 3,33 (2H, m, CH2NH), 2,86 (2H, t, J= 7,4 Hz, CH2COCO),2,60 (2H, m, CH2), 2,36 (2H, m, CH2), 1,86 (4H, m, 2xCH2); 13C RMN: δ198,8, 178,5, 160,3, 141,2, 128,41, 128,37, 126,0, 38,5, 36,1, 34,9, 31,2,24,7, 24,0; MS (FAB) : m/z (%): 278 (10) [M++H],
Ácido 4-(2-oxo-6-fenil-hexanoiiamino)-butírico (AX035). Rendi-mento de 47%; Sólido branco; p.f. 60-62°C; 1H RMN:" δ 7,27-7,15 (6H, m,C6H5, NHCOCO), 3,35 (2H, m, CH2NH), 2,94 (2H, t, J= 7,4 Hz, CH2COCO),2,60 (2H, m, CH2), 2,38 (2H, m, CH2), 1,86 (2H, m, CH2), 1,64 (4H, m,2xCH2); 13C RMN: δ 198,8, 178,8, 160,3, 142,0, 128,33, 128,27, 125,7, 38,6,36,5, 35,5, 31,4, 30,7, 24,2, 22,6; MS (FAB) : m/z (%): 292 (100) [M++H].
Ácido 4-(2-oxo-5-nonadec-10-enilamino)-butírico (AX040). Ren-dimento de 69%; Sólido branco; p.f. 57-59°C; 1H RMN: δ 10,05 (1H, br, CO-OH), 7,23 (1H, m, NHCOCO), 5,33 (2H, m, CH=CH), 3,38 (2H, m, CH2NH),2,90 (2H, t, J = 7,2 Hz, CH2COCO), 2,41 (2H, t, J = 6,8 Hz, CH2COOH), 1,98(4H, m, 2xCH2CH=CH), 1,89 (2H, m, CH2CH2NH), 1,58 (2H, m,CH2CH2COCO), 1,26 (24H, br s, 12xCH2), 0,87 (3H, t, J= 6,6 Hz, CH3); 13CRMN: δ 199,1, 178,4, 160,4, 129,9, 129,7, 38,5, 36,7, 32,7, 31,8, 31,2, 29,7,29,6, 29,5, 29,3, 29,2, 29,02, 28,96, 27,1, 24,1, 23,1, 22,6, 14,1.
O composto 5 foi preparado como anteriormente descrito (Koko-tos, G., Kotsovolou, S. Six, D.A., Constantinou-Kokotu, V. Beltzner, C.C., eDennis, E.A., J. Med. Chem., 45:2891-2893, 2002). Os compostos AX073 eAX074 foram preparados de acordo com os procedimentos acima.
Éster metílico do ácido 4-(2-oxo-hexadecanoilamino)-oct-2-enóico (AX073). Sólido branco; p.f. 48-50°C; [a]D-12,1 (c 0,95 CHCI3); 1HRMN: δ 7,21 (1 Η, d, J = 8 Hz, NHCO), 6,85 (1H, dd, J1 = 6 Hz, J2 = 16 Hz,CHCH=CH), 5,87 (1H, d, J = 16 Hz, CH=CHCOOCH3), 4,58 (1H, m, CH),3,73 (3H, s, COOCH3), 2,91 (2H, t, J = 7 Hz, CH2COCO), 1,61 (4H, m,2xCH2), 1,30 (26H, m, 13xCH2), 0,88 (6H, t, J = 7 Hz, 2xCH3); 13C RMN: δ199,3, 166,7, 159,8, 146,9, 121,4, 51,9, 50,4, 37,0, 34,1, 32,1, 29,9, 29,8,29,6, 29,5, 29,3, 27,9, 23,4, 22,9, 22,5, 14,3, 14,0.
Ácido 4-(2-oxo-hexadecanoilamino)-oct-2-enóico (AXG74). Sólidobranco; p.f. 45-67°C; [<x]D-7,7 (c0,84 CHCI3); 1H RMN: δ 7,0 (1H, m, NHCO),6,82 (1H, dd, J1 = 6 Hz, J2 = 16 Hz, CHCH=CH), 5,87 (1H, d, J = 16 Hz,CH=CHCOOCH3), 4,6 (1H, m, CH), 2,91 (2H, t, J = 7 Hz, CH2COCO), 1,61(4H, m, 2xCH2), 1,25-1,44 (26H, m, 13xCH2), 0,88 (6H, t, J = 7 Hz, 2xCH3);13C RMN: δ 199,0, 170,8, 159,6, 149,0, 120,8, 50,2, 36,7, 33,7, 31,9, 29,6,29,4,29,3,29,0,27,7,23,1,22,7,22,3,14,1,13,8.Os inibidores AX001, AX002, AX006, AX009, AX010 e AX015foram preparados conforme descrição anterior (Kokotos et al., (2002) J. Med.Chem. 45, 2891-2893; Kokotos et al., (2004) J. Med. Chem. 47, 3615-3628).
4-Amirio-butanoatos de etila e terc-butila foram acoplados comácido 2-hidróxi-hexadecanóico usando 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbo-diimida (WSCI) como agente de condensação em presença de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt). As 2-hidroxiamidas sintetizadas foram oxidadascom NaOCI em presença de uma quantidade catalítica do radical livre 4-acetamido-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-ilóxi (AcNH-TEMPO) para produziros compostos AX048 e AX057 (Figura 1A). Os compostos AX035-AX041 eAX073-AC074 foram sintetizados de acordo com o esquema estabelecido naFigura 1B.
D. Inibicão Seletiva de GIVA e GVIA PLAp por Inibidores de 2-Oxoamida daInvenção.
Várias 2-oxoamidas foram testadas quanto à inibição de PLA2Sem sistemas de ensaio in vitro. Os dados, sumarizados nas Tabelas 1a, 1 b e2, são representados como valores de X|(50) a menos que de outro modoindicado. Xi(50) é definido como a concentração de inibidor que produziu50% de inibição. X|(50) é usado em oposição a IC50 mais comum porque Gl-VA e GVIA PLA2 são ativas em uma interface lipídica bidimensional em vezde na solução tridimensional (Deems, Anal. Biochem., 287:1-16, 2000). Osinibidores de 2-oxoamida provavelmente se particionam para a interface demicela e, portanto, devem ser representados como percentagem da concen-tração da superfície (fração molar) em oposição à concentração volúmica(unidades molares). (Kokotos et al., 4, Med: Chem., 45:2891-2893, 2002).
Dos quatorze compostos listados ná Tabela 1 a, cinco mostrampelo menos inibição parcial de GVIA PLA2, nas concentrações mais altastestadas. Dos sete compostos adicionais mostrados na Tabela 1 b, três mos-tram pelo menos inibição parcial de GVIA PLA2 bem como de GIVA PLA2 eGV PLA2.Tabela 1a. Estruturas de Inibidores de 2-Oxoamida e seus Efeitos sobre Gl-VA e GIVA PLA9.
<table>table see original document page 24</column></row><table>
aND: inibição desprezível (0-25%) na dose mais alta. bLD: inibição limitada(25-50%) na dose mais alta. cDados tirados da Ref. 22.Tabela 1b. Estruturas de Inibidores de 2-Oxoamida e seus Efeitos sobre Gl-VA e GVIA PLAp
<image>image see original document page 25</image>
N.D. denota inibição a 25% ou menor em fração molar de 0,091, L.D. indicaentre 25% e 50% de inibição em fração molar de 0,091. A X|(50) é a fraçãomolar de inibidor na interface do substrato total requerida para inibir a enzi-ma de 50%. O motivo pelo qual Xi(50) é usado no lugar da IC50 mais comumé que PLA2 é ativa somente nas superfícies dos fosfolipídios tais comomembranas celulares, vesículas de fosfolipídios, ou micelas de fosfolipídios,onde seus fosfolipídios de substratos residem.
Dentre as 2-oxoamidas primárias AX001 e AX015, nenhuma de-las exibe inibição significante de GIVA ou GVIA PLA2. As 2-oxoamidas se-cundárias, AX002 e AX009, com cadeias de carbono longas tanto na posi-ção R1 como na posição R2 apresentam inibição limitada de GVIA PLA2, massem inibição detectável de GIVA PLA2. Quatro 2-oxoamidas contendo umacadeia fenila substituída na posição R1 (AX035-AX038) não inibiram GVIAPLA2. Isso é inesperado em vista do que foi relatado anteriormente sobre aseletividade de fluorcetonas contendo fenila ou fluorfosfonatos. Nenhumadas 2-oxoamidas contendo fenila inibe GIVA PLA2.
As 2-oxamidas contendo um grupo carboxila livre (AX006, A-XO40, AX074) inibem GIVA PLA2, mas não limitam GVIA PLA2, mas nãoinibem GVIA PLA2. De fato, em todos os casos esses compostos intensifi-cam a atividade enzimática. A atividade aumentada de GIVA PLA2 pode sertambém devida à carga negativa aumentada na superfície da micela devidoà adição de inibidores com um grupo carboxila livre. Diferentemente dos ini-bidores de GIVA PLA2, os inibidores de GVIA PLA2 (AX010, AX010, AX073)estão descarregados. O efeito da carga é realçado quando AX006 e AX010são comparados, onde AX010 possui um éster carboximetílico no lugar dogrupo carboxila livre. AX010 exibe inibição limitada de GVIA PLA2, mas nãoinibe significantemente GIVA PLA2. AX006 não inibe significantemente GVIAPLA2 nas concentrações até 0,091 de fração molar, mas é um potente inibi-dor de GIVA PLA2 com um valor de X|(50) de 0,017 de fração molar. (Koko-tos et al., J. Med. Chem., 45:2891-2893, 2002). AX041 é um inibidor deGVIA PLA2 com um valor de X((50) de 0,067 de fração molar; interessante-mente, ele também inibe GIVA PLA2 com um valor de Xi(50) de 0,012 defração molar. AX040, a variante carregada de AX041, não inibe GVIA PLA2,mas é um inibidor de GIVA PLA2 com um valor de Ai(50) de 0,011 de fraçãomolar. Resultados consistentes foram vistos com os compostos AX073 eAX074. Esses compostos são também variantes que contêm ou um éstercarboximetílico livre (AX073) ou uma carboxila livre (AX074).
Ao observar a tendência de inibição de GVIA PLA2 por AX010,AX041, e AX073, parece que uma cadeia insaturada em R1 ou R2 é preferí-vel a uma saturada. Isso é consistente com a presença de ácidos graxosinsaturados na posição sn-2 de muitos fosfolipídios.
A Tabela 2 abaixo demonstra a atividade das moléculas que ini-bem um ou mais dos isômeros CPLA2, iPLA2 ou SPLA2:<table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>Quase todos os inibidores das PLA2S particionam pelo menosem alguma extensão na superfície de fosfolipídio, porque eles têm usual-mente uma porção hidrofóbica que complementa o sítio ativo hidrofóbico daPLA2· Quando esses inibidores particionam na superfície, um efeito físicoimportante chamado diluição de superfície entra em função. Nesse caso, aafinidade da PLA2 para o inibidor não depende da concentração tridimensio-nal (volúmica) do inibidor em unidades molares, mas da concentração bidi-mensional (superfície) do inibidor em unidades de fração molar. Como indi-cado (vide Figuras 2 e 3, e Tabela 1b), AX048 e AX057 eram potentes con-tra o PLA2 do Grupo IVA e PLA2 do Grupo VIA, AX006 era potente contraPLA2 do GRUPO IVA, e AX010 era menos eficaz contra ambos.
Interessantemente, AX015 contendo fenila era um inibidor fracocontra SPLA2, com eficácia de 45,3% na fração molar de 0,091, mas não ti-nha atividade significante contra CPLA2 ou iPLA2. Em contraste, AX048 eAX057 eram ativos contra todos os três PLA2S de interesse, com eficáciasde 61,5% e 76,7%, respectivamente, contra SPLA2 em uma fração molar de0,091 (CIogPs foram 7,6 e 8,3, respectivamente). AX073 também exibiu75,3% de eficácia contra SPLA2 com um CIogP de 8,95.
Outros compostos mostraram eficácia contra CPLA2 e iPLA2,mas eram também mais potentes contra SPLA2, tais como AX105, AX110,AX111, AX113 e AX114, com AX113 atingindo cerca de 100% de inibiçãoem uma fração molar de 0,091. Todos eram mais potentes contra CPLA2 eSPLA2 que iPLA2.
E. Reversibilidade de Inibicão de GVIA PLAp por Inibidores de 2-oxoamida eEfeito em PGE e Cox-2.
AX010 e AX073 foram testados para determinar se esses inibi-dores mostraram ou inibição dependente de tempo ou irreversível de GVIAPLA2. GVIA PLA2 (25 ng) foi pré-incubada ou com AX010 ou com AX0073 (5μΜ) por 0, 5, 10 ou 30 minutos, e então ensaiados na mistura de ensaio deGVIA PLA2 padrão contendo 5 μΜ de inibidor. A concentração final dos inibi-dores na mistura de ensaio era de 0,01 de fração molar, e as amostras fo-ram incubadas por 30 minutos a 40°C. Ambos AX010 e AX073 não mostrampotência aumentada com incubação prolongada, demonstrando uma ligaçãorápida (Figura 1C(A)) e modo reversível de inibição (Figura 1C(B)). Comrespeito ao último, 25 ng de GVIA PLA2 foram pré-incubados com 10μΜ deAX010 ou de AX073, por 10 minutos, antes de diluir a enzima 1:50 para amistura de ensaio de GVIA PLA2 padrão carecendo de inibidor, e incubaçãopor 30 minutos a 40°C. A concentração de inibidor final nesses ensaios erade 0,0004 de fração molar, bem abaixo das concentrações de superfície queou AX010 ou AX073 inibem a enzima. GVIA PLA2 mostrou atividade inteiranesse sistema, demonstrando que ambos AX010 e AX073 são inibidoreslivremente reversíveis (Figura 1 C(B)).
Várias 2-oxoamidas foram testadas na via de estimulação delipopolissacarídeo de longo prazo (LPS) na linhagem de célula macrófago-símile RAW 264.7 de murino. (Raschke et al., Cell, 1978, 15, 261-267). Essavia requer atividade de GIVA PLA2 e resulta na liberação extracelular de mui-tos compostos eicosanóides incluindo a prostaglandina PGE2. (Gijon et al.,Ieukoc. Biol., 1999, 65, 330-336). AX010, que não inibe significantementeGIVA PLA2, não inibiu a liberação de PGE2. Na faixa baixa de μΜ, AX041 eAX07 reduziram a liberação de PGE2 por cerca de 40% (Figura 1 (D)). Emconcentrações de 1μΜ e 5μΜ, pequenas ativações foram freqüentementevistas. Os resultados in vitro e celulares juntos são consistentes com os pa-péis conhecidos de GVIA PLA2 supondo que AX010, um inibidor de GVIAseletivo, não tivesse efeito celular. Inibidores de 2-oxoamida específicos pa-ra GVIA PLA2 devem aperfeiçoar significantemente as investigações sobre opapel de GVIA PLA2 em sistemas celulares. Os inibidores seletivos para Gl-VA PLA2 ou inibidores com especificidade dúal reduzem os níveis de PGt2,também consistente com o papel conhecido de GÍVA PLA2 na produção dePGE2.
Como mostrado na Figura 4, a incubação com indometacinaproduziu uma inibição quase completa da atividade de COX no ensaio. Emcontraste, a incubação com os compostos AX em concentrações com efeitossignificantes sobre PLA2 não exibiram efeitos inibidores sobre a atividade deCOX.EXEMPLO I
MODELO ANIMAL PARA HIPERPLASIA E MÉTODOS DE ENSAIO
Animais
Ratos machos Holtzman Sprague-Dawley (300-350 g; HarlanIndustries) estavam alojados individualmente e mantidos em um ciclo de cla-ro/escuro de 12 horas com acesso livre a alimento e água.Implantação de cateter intratecal
Para injeções espinais de fármacos, cateteres lombares foramimplantados em ratos sob anestesia com isoflurano de acordo com uma mo-dificação do procedimento descrito por Yaksh (Yaksh e Rudy, acima, 1976).Um cateter de polietileno (PE-5; Sepctranetics, 0,0355 cm (0,014 pol) de di-âmetro externo) foi inserido no espaço intratecal e avançou para a bordarostral do alargamento lombar através de uma incisão na membrana atlanto-occipital. Cinco dias depois da implantação, os ratos entraram para o estudo.Em experimentos separados para avaliar a liberação espinal de prostaglan-dinas, os ratos foram preparados com cateteres de diálise de alça lombarcom três lumens, conforme descrição prévia (vide Yaksh et al, acima, 2001).
Em resumo, os dois lúmens externos foram conectados a umaextensão de tubo de diálise (aparas de 10 Kda). O cateter foi então implan-tando através de intratecal usando a mesma técnica conforme descrita aci-ma para o cateter intratecal. Foi deixado passar um intervalo de três diasantes de incluir o animal no estudo. Em todos os casos, os critérios de ex-clusão foram: i) presença de quaisquer seqüelas neurológicas, ii) 20% deperda de peso depois da implantação, ou iií) oclusão de cateter.
Análise Comportamental
Hiperalgesia térmica. Duas abordagens foram empregadas parainiciar um estado hiperalgésico. Hiperalgesia térmica evocada por inflama-ção foi induzida por injeção subcutânea de 2 mg de carragenina (Sigma, St.Louis, MO, 100 μl de solução a 20% (p/v) em solução salina fisiológica) nasuperfície plantar da pata traseira esquerda. Para avaliar a resposta de reti-rada da pata evocada termicamente, um dispositivo comercialmente mode-lado de acordo com aquele descrito por Hargreaves e colegas (Hargreaves,Pain, 32:77-88, 1988) foi usado (vide Dirig e Yaksh, Néurosci. Lett., 220:93-96, 1996; Dirige et al., J. Neurosci. Methods, 76:183-191, 1997).
Em resumo, o dispositivo consistiu em uma superfície de vidro(mantida a 25°C), sobre a qual os ratos foram colocados, individüalmente,em cubículos de Plexiglas (9 χ 22 χ 25 cm). O estímulo nociceptivo térmicooriginou-se de um bulbo com projeção focalizada posicionado embaixo dasuperfície de vidro. O estímulo foi distribuído separadamente para qualquerpata traseira de cada paciente em teste com a ajuda de um espelho angula-do montado sobre a fonte de estímulo.
Um cronômetro foi acionado com a fonte de luz, e a latência foidefinida como o tempo requerido para a pata mostrar uma retirada enérgicaconforme detectada pelos sensores de movimentação de fotodiodo que pa-ram o cronômetro e interrompem o estímulo. Latências de retirada da pata(PWL) foram avaliadas antes de qualquer tratamento (controle) e em interva-los depois do tratamento. Latências de retiradas da pá esquerda (Iesionada)e da pá direita (não lesionada) foram avaliadas e plotadas versus tempo.Além disso, os escores de latências de diferença (não lesionada-lesionada)foram calculadas e a latência de retirada média sobre os intervalos de pós-injeção são calculados por comparação entre os grupos de tratamento.
Além do uso de uma inflamação periférica, uma hiperalgesiatérmica também iniciada pela injeção intratecal de SP (20 nmols/10 μί). APWL média das patas direitas e esquerdas foi avaliada em cada ponto detempo. A diferença média entre os escores de latência média de resposta aPré-IT SP e a Pós-IT SP foi calculada para análise.
Diálise Intratecal e ensaio de PGEg
Experimentos de diálise espinal para definir a liberação espinalde PGE2 foram conduzidos em ratos não anestesiados 3 dias depois da im-plantação de cateter de diálise. Uma bomba de seringa (Harvard, Natick,MA) foi conectada e o tubo de diálise foi perfundido com fluido cerebroespi-nal artificial (ACSF), em uma vazão de 10 μΙ_Λπΐη. O ACSF continha (emmM) 151,1 de Na+, 2,6 de K+, 0,9 de Mg2+, 1,3 de Ca2+, 122,7 de Cl", 21,0 deHCO3, 21,0 HPO4 e 3,5 de dextrose e foi borbulhado com 95% de 02/5%deCO2, antes que cada experimento fosse ajustado para o pH final de 7,2. Oefluxo (20 minutos por fração) foi coletado em um coletor de fração automá-tico (Eicom, Kyoto, Japão) a 4°C. Duas amostras da linha de base foram co-letadas seguintes a uma lavagem de 30 minutos, e três frações adicionaisdepois da injeção IT de NMDA (0,6 μg). A concentração de PGE2 em diali-sado espinal foi medida por ELISA usando um kit comercialmente disponível(Assay Designs 90001, Assay Designs, Ann Arbor, Ml). O anticorpo é seleti-vo para PGE2 com menos que 2,0% de reatividade cruzada para PGF1,PGF2, 6-cetoPGFi PGA2 ou PGB2, mas reage de forma cruzada com PGE1 ePGE3.
Distribuição de Fármaco
Os fármacos foram distribuídos sistêmica (IP) ou espinalmente(IT). Fármacos intraperitoneais foram distribuídos uniformemente em dosespreparadas em volumes de 0,5 mL/kg. Os fármacos injetados IT foram ad-ministrados em um volume total de 10 μΙ_ seguido por um jato de 10 μΙ_ u-sando veículo.
Ensaios de enzimas
Os ensaios, in vitro, de CPLA2 do Grupo IV e de iPLA2 do GrupoVl foram feitos como previamente descritos (Kokotos et al., acima, 2002).Em resumo, 100μΜ de substrato de lipídio e 100.000 cpm de análogo ra-diomarcado foram secados sob N2 e dissolvidos em tampão de ensaio con-tendo 400μΜ de Triton X-100 para produzir uma solução mista de substratode micela. Inibidores dissolvidos em DMSO foram adicionados aos tubos dereação e deixados em incubação com substrato por cinco minutos, a 40°C.
Enzima pura foi adicionada para render um volume final de 500 \iL· e a di-gestão foi efetuada a 40°C, por 30 minutos. As reações foram finalizadas eextraídas usando o método Dole e os produtos foram quantificados por con-tagem de cintilação líquida. Inibição percentual foi determinada em uma faixade concentrações de fração molar de inibidor para cálculos de X/(50).
A atividade de GV SPLA2 foi medida de um modo similar. O tam-pão de ensaio final era composto de 50mM de Tris-HCI (pH 8,0) e 5mM deCaCI2. Cada ensaio foi realizado em 500 μί de volume total feito de 100 μίde 5x solução de substrato (20 μΙ_ de 10mM de Triton X-100 e 80 μΙ_ de tam-pão de ensaio), 390 μί de tampão de ensaio, 10 μί de solução de GV SPLA2(1 μΙ_ de 40 ng/μΙ. de estoque e 9 μΙ_ de tampão de ensaio), e 5 μΙ_ de DMSOou 2-oxoamida em DMSO. A solução de substrato 5 χ foi preparada por se-cagem dos fosfolipídios (em solvente orgânico) com N2. O volume apropria-do de 10mM de Triton X-100 foi adicionado, aquecido e turbilhonado até ficartransparente. Então o tampão de ensaio foi adicionado para preparar umasolução de substrato 5 x. As micelas mistas finais estavam em 400μΜ deTriton X-100 e 100μΜ de DPPC (dos qual 100.000 com de 14C-DPPC).
Inibição de ciclooxigenase-1 e ciclooxigenase-2 foi testada invitro usando o kit de Ensaio de Atividade de COX (catálogo 760151) daCayman Chemical. Os ensaios foram realizados em placas de 96 cavidadesusando 10 μί de padrão de COX fornecido (catálogo 760152) que continhaproteínas COX-1 e COX-2. A atividade foi detectada colorimetricamente em595 nm pela aparência de Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametilfenilenodiamina oxidada(TMPD), que tem uma absorção máxima de 611 nm (Kulmacz e Lands,Prostaglandins, 25:531-540, 1983). Os inibidores dissolvidos em DMSO(compostos do estudo) ou etanol (indometacina) foram adicionados paraconcentração final de 50μΜ e deixados em incubação com a mistura de en-saio incluindo enzima por 5 minutos. Depois da adição de TMPD e ácido a-raquidônico, as amostras foram misturadas e deixadas em incubação por 5minutos, à temperatura ambiente antes da leitura de absorbância em 595 nmpara determinação dos resultados. Os resultados foram calculados e os va-lores de inibição em percentagem derivados.
Fármacos
Inibidores de PLA2 empregados nesses estudos fbram sintetiza-dos conforme descrição abaixo. Esses agentes foram preparados em umveículo de 5% de Tween 80. Outros agentes usados nesses estudos incluí-ram o agonista de canabinóide anandamida, o antagonista de CB1(SR141716A, suprido por cortesia de Benjamin Cravatt, Scripps lnstitute, LaJolla, CA). A anandamida foi preparada em DMSO a 100% e SR141716Aem etanol Emulphor e solução salina (1:1:18). Estudos de controle foramefetuados com veículos respectivos.EXEMPLO II
TRATAMENTO DE HIPERALGESIA TÉRMICA INDUZIDA POR CARRA-GENINA DEPOIS DA DISTRIBUIÇÃO INTRAPERITONEAL
Controle. Antes a indução da hiperalgesia, latências térmicas deescape na linha base eram da ordem de 10-12 segundos em todos os gru-pos. A injeção intraplantar de carragenina induziu a inflamação da pata tra-seira injetada, bem como hiperalgesia térmica correspondente que foi detec-tada depois de 60 minutos de duração de todo o estudo. Como mostrado naFigura 5, a latência térmica de escape nos animais tratados com veículo IPou IT foi significantemente reduzida para aproximadamente 3-5 segundosdentro de 90-120 minutos (vide ambas as Figuras 5 e 6).
Distribuição lntraoeritoneal. Pré-tratamento (30 min) com 3mg/kg (IP) dos quatro agentes antes da injeção de carragenina revelou queAX048, mas não AX006, AX010, ou AX057, reduziu a hiperalgesia térmicade outro modo observada na pata inflamada (Figura 5). Importantemente,não houve alteração na latência térmica de escape da pá não Iesionada tan-to no animal tratado com veículo como no tratado com fármaco, por exem-plo, o agente teve um comportamento funcional como um agente anti-hiperalgésico. Comparação da diferença média do grupo entre latências deresposta de patas não Iesionadas e Iesionadas revelou uma redução signifi-cante no grupo tratado com o grupo tratado com AX048 em comparaçãocom o grupo tratado com veículo.
Dependência de Dose. Foi observado que os efeitos de IPAX048 eram dependentes de dose na faixa de 0,2-3 mg/kg. (Inclinação; p<0,0004) (vide Figura 6). A ED50 foi definida Como a dose que reduziu a hipe-ralgesia observada em um animal tratado com veículo de 50%. Nessa base,o valor de IP ED50 estimado para IP AX048 era de 1,2 mg/kg (95% de Cl:-0,5572 a 0,7713).
Curso de Tempo de ação. Para determinar o curso de tempo daação de fármaco, distribuição IP de AX048 (3 mg/kg) foi efetuada de em -15min, -30 min e -180min (Figura 7). Como indicado, efeitos de pico foram ob-servados aos 30 minutos e efeitos mínimos foram observados aos 15 minu-tos. Os efeitos persistiram através de 180 minutos, mas não foram diferentesdo controle por 360 minutos.EXEMPLO Ill
TRATAMENTO DE HIPERALGESIA TÉRMICA INDUZIDA POR CARRA-GENINA DEPOIS DA DISTRIBUIÇÃO INTRATECAL
Controle. Em animais que estavam recebendo injeções intrate-cais de veículo, a injeção intraplantar de carragenina resultou em uma hipe-ralgesia térmica unilateral significante em comparação com a pata não Iesio-nada (Figura 8).
Efeito do Fármaco. Pré-tratamento com 30 μg/10 μΙ_ dos quatroagentes 15 minutos antes da distribuição de carragenina revelou que AX048,mas não AX006, AX010, ou AX057, atenuou a hiperalgesia térmica (videFigura 8). Novamente, depois da distribuição intratecal, não houve alteraçãona latência térmica de escape da pata não Iesionada nem no animal tratadocom veículo nem com fármaco. A comparação da diferença de grupo médiaentre as latências de resposta das patas não Iesionadas e Iesionadas tam-bém revelou um redução significante no grupo tratado com AX048 em com-paração com o grupo tratado com veículo.
EXEMPLO IV
TRATAMENTO DE HIPERALGESIA TÉRMICA INDUZIDA POR SUBSTÂN-CIA P INTRATECAL
Controle. Latências térmicas de escape na linha base eram daordem de 10 a 12 segundos. Em animais tratados com veículos sistêmicos,a injeção intratecal de SP (20 nmols/10 μί) evopou uma redução significantede latência térmica de escape o mais cedo quanto 15 minutos depois da in-jeção, que persistiu através dos 45 minutos de intervalo de teste, retornandopara a linha base por 60 minutos (vide Figura 9).
Efeito do fármaco. Pré-tratamento com 3 mg/kg (IP) dos quatroagentes, 30 minutos antes da distribuição intratecal de SP revelou queAX048, mas não AX010,ou AX057, preveniu completamente a hiperalgesiatérmica evocada espinalmente (Figura 9). Como no estudo da carragenina,não houve evidência que AX048 tivesse aumentado a latência de pós-tratamento para valores maiores que a linha base, por exemplo, o agenteestava se comportando funcionalmente como um agente anti-hiperalgésico.
EXEMPLO V
PERFIL DO EFEITO COLATERAL
Depois da distribuição da dose sistêmica mais alta (3 mg/kg) oudose intratecal (20 μg) de quaisquer dos compostos, não houve alteraçõesem quaisquer dos pontos de extremidades de reflexo, incluindo piscamentodo olho, das orelhas, de "placinçf ou de "stepp/ng". Os animais mostraramque não houve alteração na resposta de endireitamento, ambulação simétri-ca ou atividade espontânea.
EXEMPLO Vl
INIBICÂO DA LIBERAÇÃO DE PROSTAGLANDINA
Controle. As concentrações totais de dialisado de linha depoisda lavagem inicial e antes do tratamento com fármaco foram determinadascomo sendo de 555±75 pg/100 μl de perfusado. Injeção intratecal de SP (20ug). mas sem veículo (solução salina, não mostrada) resultou em um au-mento estatisticamente significante das concentrações de PGE2 em dialisa-do espinal em comparação com controle tratado com veículo (Figura 10).
Efeito do fármaco. Pré-tratamento com os quatro agentes 15 mi-nutos antes da distribuição de IT SP (20 μg/10 μl) revelou que a liberaçãoevocada de PGE2 foi reduzida somente no grupo tratado com AX048. Assim,dos quatros agentes somente AX048 exerceu um efeito inibidor significantena síntese e liberação de PGE2 (vide Figura 10).
As invenções descritas ilustrativamente aqui podem ser adequa-damente'praticadas em ausência de qualquer elemento ou elementos, limi-tação ou limitações não descritas especificamente aqui. Por exemplo, ostermos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidos deforma ampla e sem limitação. Além disso, os termos e expressões emprega-dos aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e nãohá intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equiva-lentes das características mostradas e descritas ou porções destas, mas éreconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da in-venção reivindicada. Assim, deve ser entendido que embora a presente in-venção tenha sido especificamente descrita pelas modalidades preferidas ecaracterísticas opcionais, modificação e variação das invenções englobadasnela e aqui descritas podem ser utilizadas por aqueles versados na técnica,e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentrodo escopo desta invenção.
A invenção foi aqui descrita de modo amplo e geral. Cada umadas espécies mais estritas e grupamentos subgenéricos que se enquadramna descrição genérica também formam parte da invenção. Isso inclui a des-crição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa de reti-rar qualquer matéria do gênero, independente se ou não o material excisadoesteja especificamente citado aqui.
Outras modalidades estão dentro das seguintes reivindicações.Além disso, onde as características ou aspectos da invenção estiverem des-critas em termos dos grupos Markush, aqueles versados na técnica reco-nhecerão que a invenção é também aqui descrita em termos de qualquerelemento individual ou subgrupo de elementos do grupo Markush.

Claims (58)

1. Composto tendo a fórmula (I) <formula>formula see original document page 41</formula> em queR1 é um grupo C2-C8 alcóxi, em que o dito grupo alcóxi é linearou ramificado;R2 é ausente, qualquer grupo aromático, heterocíclico, ou carbo-cíclico, ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificada,saturada ou insaturada, em que a dita alquila, alquenila ou alquinila é opcio-nalmente substituída;R3 é um grupo aromático, heterocíclico ou carbocíclico, ou umacadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificada, saturada ou insa-turada;η >0, m >0, k >0; eseus isômeros geométricos, formas enantioméricas, sais farmacológica ouimunologicamente aceitáveis ou pró-fármacos destes.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, em que k é > 0 eum de m é e η é > 0.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, em que k é 2 a 22.
4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, em que R3 é metila.
5. Composto, de acordo com qualquer úmidas reivindicações 1a 4, em que m é 0 e η é 1 a 12.
6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, em que méO, né2eR1é (-OCH2CH3).
7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, em que méO, né3eR1é t-butóxi(-OC(CH3)3).
8. Composto, de acordo com a reivindicação 1, em que k é 7, mé 0, R1 é metila, R2 está ausente e R3 é uma cadeia alquenila.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 1,. em que m é 2, ηé 4, e R1 é (-OCH2CH3).
10. Composto, de acordo com a reivindicação 1, em que m é 0,η é 4 e R1 é (-OCH2CH3).
11. Composto, de acordo com a reivindicação 1, em que m é 0,η é 4 e R1 é t-butóxi(-OC(CH3)3).
12. Composto, de acordo com a reivindicação 1, em que m é 0,η é 2 e R1 é t-butóxi(-OC(CH3)3).
13. Composto, de acordo de acordo com a reivindicação 1, emque méO, η é 2 e R1 é (-OCH2CH3).
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que m é 0, η é 1 e R1 é t-butóxi(-OC(CH3)3).
15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que k é 13.
16. Composto tendo a fórmula l(a)<formula>formula see original document page 42</formula>em queR1 é qualquer grupo C1-C8, em que o dito grupo alcóxi é linearou ramificado;R2 e ausente, qualquer grupo aromático, heterocíclico, ou carbo-cíclico, ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificada,saturada ou insaturada, em que a dita cadeia alquila, alquenila ou alquinila éopcionalmente substituída; R3 é grupo aromático, heterocíclico ou carbocíclico, ou uma ca-deia alquila, alquenila, ou alquinila linear ou ramificada, saturada ou insatu-rada;n >0, m >0, k >0; eseus isômeros geométricos, formas enantioméricas, sais farmacologicamen-te ou imunologicamente aceitáveis ou pró-fármacos destes.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 15, em que R1 éetóxi, R2 está ausente, e m é 2.
18. Composto, de acordo com a reivindicação 16, em que k é 13.
19. Composto da fórmula (II)<formula>formula see original document page 43</formula>em queR é uma cadeia C2-C8 alquila, alquenila ou alquinila linear ouramificada, saturada ou insaturada;R3 é qualquer grupo aromático, heterocíclico, ou carbocíclicoopcionalmente substituído ou uma cadeia alquila, alquenila, ou alquinila, op-cionalmente substituída, linear ou ramificada, saturada ou insaturada;k ≥ 0; eseus isômeros geométricos, formas enantioméricas, sais farmacologicamen-te ou imunologicamente aceitáveis ou pró-fármacos destes.
20. Composto, de acordo com a reivindicação 19, em que R3 éuma C10-C20 alquenila.
21. Composto, de acordo cóm a reivindicação 19 ou 20, em queRé etila.
22. Composto, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em queRé t-butila.
23. Composto, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em queR é isopropila.
24. Composto, de acordo com a reivindicação 22, em que k é 7.
25. Co/ífiposto, de acordo com a reivindicação 22, em que k é 12.
26. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática de fosfolipase A2 em uma célula ou organismo, compreendendoum veículo farmaceuticamente aceitável e um composto de fórmula (I) comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-26, em que a atividade enzimática é de fosfolipase CPLA2, iPLA2 e SPLA2.
28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX048.
29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX057.
30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX113.
31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX111.
32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX114.
33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX110.
34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-27, em que o composto é AX105.
35. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática de fosfolipase A2 em uma célula ou organismo, compreendendoum veículo farmaceuticamente aceitável e um composto de fórmula (Ia) co-mo definido na reivindicação 16 ou 17.
36. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática de fosfolipase A2 em uma célula ou organismo, compreendendoum veículo farmaceuticamente aceitável e um composto de fórmula (II) comodefinido em qualquer uma das reivindicações 18 a 25.
37. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática de fosfolipase A2 secretada (SPLA2) em uma célula ou organis-mo, compreendendo urrí veículo farmaceuticamente aceitável e um compos-to como definido na reivindicação 24 ou 25.
38. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática de fosfolipase A2 secretada (SPLA2) em uma célula ou organis-mo, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um compos-to como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 15.
39. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática de fosfolipase A2 secretada (sPLA2) em uma célula ou organis-mo, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um compos-to como definido na reivindicação 17.
40. Composição farmacêutica para uso específico na inibição daatividade enzimática de fosfolipase A2 secretada (SPLA2) em uma célula ouorganismo, compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e ocomposto AX015.
41. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática da fosfolipase A2 em uma célula ou organismo, compreendendoo composto de fórmula (III),e um veículo farmaceuticamente aceitável deste.
42. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática-da fosfolipase A2 em uma célula ou organismo, compreendendoo composto de fórmula (IV),e um veículo farmaceuticamente aceitável.
43. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática da fosfolipase A2 em uma célula ou organismo, compreendendoo composto de fórmula (V),e um veículo farmaceuticamente aceitável.
44. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática da fosfolipase A2 do Grupo IVA e Grupo VIA em uma célula ouorganismo, compreendendo o composto de fórmula (VI),e um veículo farmaceuticamente aceitável.
45. Composição farmacêutica para uso na inibição da atividadeenzimática da fosfolipase A2 do Grupo IVA e Grupo VIA em uma célula ouorganismo, compreendendo o composto de fórmula (VI), <formula>formula see original document page 46</formula> e uma célula farmaceuticamente aceitável.
46. Método para modular os efeitos de processos inflamatóriosem um mamífero, compreendendo administrar uma quantidade inibidora efi-caz de fosfolipase A2 do Grupo IVA e Grupo VIA de um ou mais dos com-postos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 34.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que os com-postos são ainda administrados em uma quantidade inibidora eficaz de fos-folipase A2 do Grupo V.
48. Método para modular os efeitos de processos inflamatóriosem um mamífero, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uminibidor específico de fosfolipase do Grupo V.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que o inibidornão exerce um efeito inibidor estatisticamente significante em fosfolipase A2do Grupo IVA ou do Grupo VIA.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, em que o inibidoré AX015.
51. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que o inibidornão exerce um efeito inibidor estatisticamente ó-ignificante na fosfolipase A2do Grupo IVA.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, em que o inibidoré AX093 ou AX081.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46a 52, em que um dos efeitos dos processos inflamatórios modulados é infla-mação do sistema nervoso central.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46a 52, em que os processos inflamatórios modulados são espinalmente medi-ados.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que um dosprocessos inflamatórios especialmente mediados é hiperalgesia.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, em que a hipe-ralgesia é hiperalgesia térmica.
57. Método, de acordo com a reivindicação 46, em que o mamí-fero é um ser humano.
58. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que o mamí-fero é um ser humano.
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