BRPI0614998A2 - composições oftálmicas que contêm polissacarìdeos de mucoaderente com capacidade de promover a repitelização da córnea - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES OFTáLMICAS QUE CONTêM POLISSACARìDEOS DE MUCOADERENTE COM CAPACIDADE DE PROMOVER A REPITELIZAçãO DA CóRNEA A presente invenção refere-se a soluções oftálmicas que contêm arabinogalactanas com uma atividade de proteção do epitélio da córnea, particularmente apropriadas para o uso como lágrimas artificiais estimulando a recuperação de lesões da córnea e também particularmente úteis para usuários de lentes de contato, contendo de 1 % a 10% em peso de arabino-galactana em uma solução aquosa e outros excipientes possíveis, entre os quais agentes de ajuste da tonicidade, corretores do pH, tampões e conser- vantes, com exceção do cloreto de benzalcónio. As composições de acordo com a invenção têm uma viscosidade virtualmente insignificante, mas são suficientemente mucoaderentes para assegurar um tempo de permanência considerável na área de aplicação. Além de serem bem-toleradas, as composições acima mencionadas têm uma capacidade de repitelização considerável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "composi-ções oftálmicas que contêm polissacarídeos de mucoa-derente com capacidade de promover a repitelização dacórnea".

A presente invenção refere-se a composições oftálmicas quecontêm polissacarídeos mucoaderentes com capacidade de promover a repi-telização da córnea. Mais especificamente, a invenção refere-se a soluçõesoftálmicas que contêm arabinogalactanas que têm uma ação protetora noepitélio da córnea, as quais são particularmente recomendadas para seremusadas como lágrimas artificiais para estimular a recuperação de lesões dacórnea, e são particularmente úteis para as pessoas que usam lentes decontato.

Como é sabido, a córnea é a seção anterior da túnica fibrosa doglobo ocular, do qual constitui somente uma sexta parte, uma vez que a par-cela restante é composta por esclera - as duas estruturas ficam em continui-dade bem como em contigüidade. De fato, a córnea tem uma curvatura me-nor em comparação àquela do esclera, de modo que parece que se projetaligeiramente para a frente. Devido às suas características peculiares detransparência e de avascularidade, e devido ao seu formato, o qual a tornauma lente côncavo-convexa perfeita, a córnea constitui um elemento essen-cial do sistema dióptrico ocular.

A sua superfície anterior, convexa e elíptica, tem um diâmetrohorizontal ligeiramente mais alto do que o diâmetro vertical, e desse modotem uma curvatura diferente nessas duas direções. Essa diferença causa oastigmatismo fisiológico. A superfície posterior é côncava e circular, e tem depreferência o mesmo diâmetro e o mesmo raio em todas as direções. A es-pessura da córnea varia entre cerca de 0,5 mm na região central a cerca de0,7 mm na região periférica.

Histologicamente, a córnea é composta de cinco camadas, asquais são tal como segue de fora para dentro: o epitélio, a membrana deBowman, o estroma, a membrana de Descemet e o endotélio.

A córnea desempenha a sua função óptica graças a uma trans-parência perfeita e à uniformidade de sua superfície de contato com o ar.Esta última característica é devida à presença da película Iacrimal (películade lágrimas) que cobre o epitélio, o qual é ele mesmo áspero devido à pre-sença de uma trama de microcamadas na camada externa. A película delágrima torna o epitélio liso, uniforme e de alta qualidade óptica.

A película de lágrima, que também cobre a conjuntiva bulbar e aconjuntiva palpebral, é composta de três camadas sobrepostas, as quais sãotal como segue de fora para dentro: a camada de lipídio, a camada aquosa ea camada da mucosa. A mucina produzida pelas células de Goblet do epité-lio da conjuntiva torna toda a superfície do epitélio lisa, permitindo a distribu-ição uniforme do componente aquoso da película na mesma; a camada delipídio, secretada pelas glândulas meibomiana e de Zeis, tem a função deimpedir a evaporação da película de lágrima.

Tal como já foi observado, a transparência é a propriedade fun-damental da córnea. Ele se torna possível pela avascularidade absolutadesse tecido, pelas características estruturais do estroma e por determina-dos processos fisiológicos específicos que regulam o "turnover" aquoso e adeturgescência da própria córnea e impedem a sua absorção, mantendo ataxa de hidratação em um valor normal de cerca de 78%.

Outras características fisiológicas da córnea são a sua especula-ridade (reflexao da luz em sua superficie), qual e ligadad a integridado epi-telial, e permeabilidade - uma função essencial para o turnover aquoso e/oua penetração de substâncias estranhas tais como fármacos.

A sensibilidade considerável aos estímulos de vários tipos é Ii-gada, finalmente, à grande inervação da membrana, que diminui com o a-vanço da idade e na presença de algumas alterações degenerativas flogísti-cas e distróficas.

As alterações da córnea mais comumente encontradas podemrepresentar os sintomas iniciais dos processos de uma natureza flogística,distrófica ou degenerativa, ou de um estado evidente da doença. Entre asalterações de uma natureza mecânico-traumática há: abrasões da córneadevidas a um esfregar superficial do epitélio da córnea ou ao contato comcorpos estranhos, tais como partículas de metal, vidro ou plástico, resíduosde madeira ou de plantas; lacerações e perfurações devidas a objetos queentram no olho com uma força particular e que penetram em alguma profun-didade; erosões da córnea recorrentes, que consistem em episódios espon-tâneos de ruptura ou escamação das camadas epiteliais da córnea; queima-duras causadas por ácidos fracos ou bases fracas, por calor ou pela radia-ção ultravioleta.

A destruição do epitélio da córnea de qualquer maneira aumentao risco de invasão por parte de patógenos, com resultados potencialmentedevastadores. A conjuntiva é, de fato, um dos tecidos do corpo colonizadospor micróbios a partir dos primeiros momentos da vida extra-uterina, e deveser observado, que entre os microorganismos residentes habituais, tais co-mo streptococci (St. viridans), staphylococci (S. epidermidis, S. aureus), ha-emophiles, Propionibacterium acnes, há alguns que têm todas as caracterís-ticas a serem consideradas como patógenos verdadeiros.

O ecossistema da conjuntiva é um sistema que tende a ser ba-lanceado e biologicamente ativo, e permanece com tal contanto que micró-bios de tecido ou fatores ambientais não surjam, os quais rompem esse e-quilíbrio, tornando desse modo o habitat da conjuntiva um terreno favorávelpara micróbios ou para o hospedeiro. Os fatores do tecido são dependentesda estrutura histológica do tecido da conjuntiva e das secreções que com-põem a película lacrimal: esses fatores podem agir como co-causas na pa-togênese de várias infecções da córnea causadas por bactérias, vírus e mi-cetas. Estes podem invadir o tecido da córnea, em especial na presença delesões da córnea, e causam queratites até mesmo de um tipo muito grave eincapacitador que pode conduzir à úlcera da córnea. A queratoconjuntivitebacteriana é caracterizada pela dor aguda, ulceração do epitélio e, às vezes,o estroma da córnea, bem como a secreção da conjuntiva. Os agentes etio-lógicos desse tipo de lesões oculares são: S. aureus, St. pneumoniae, Ps.aeruginosa, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Mycobacterium chelonei eMycobacterium fortuitum podem causar lesões ulcerativas da córnea crôni-cas. No que refere-se a agentes etiológicos de um tipo micótico, a quierato-conjuntivite micótica é causada principalmente por micetas saprófitas fila-mentosos e leveduras que formam colônias nas lesões do epitélio da córnea.Finalmente,a queratoconjuntivite devida a Acanthamoeba é uma forma rarada queratoconjuntivite crônica causada por esse parasita - e que pode atémesmo ameaçar a visão - e é caracterizada por uma supuração multifocalem forma de anel do estroma da córnea nos indivíduos que apresentam ul-cerações prévias.

Todas as alterações da córnea (quer sejam do tipo traumático,flogístico ou então degenerativo) que causam a destruição do tecido ou aperda de substância são reparadas rapidamente através de mecanismosfisiológicos que diferem em parte daqueles de outros tecidos por causa daavascularidade dessa membrana. O processo de cura, que é influenciadopelas características da lesão e é certamente mais problemático na presen-ça de ulcerações sépticas, começa sempre no nível epitelial, não somenteno caso de anos superficiais limitados a essa camada, mas também nos ca-sos que afetam o parênquima. Isto é, há uma interação do epitélio na curada lesões estromais que pode ser exemplificada como a formação de uma"capa epitelial" necessária para regular o desenvolvimento dos fenômenossubseqüentes da regeneração do colágeno.

As simples feridas ou abrasões epiteliais são reparadas rapida-mente também graças à atividade mitótica marcante dos elementos das cé-lulas nessa região. Realmente, nesse momento do trauma, ocorre uma inter-rupção temporária do mecanismo fisiológico de escamação da superfície dacélula e um deslocamento e uma migração de células adjacentes intactaspara a área danificada. A interrupção cessa quando a área deficiente é co-berta completamente e a regeneração dos elementos epiteliais assegura arestauração das características estruturais normais.

Se a alteração for epitelial, a sua recuperação completa garantea restauração da especularidade e da transparência perfeitas da membrana.

Uma causa particular e não rara de abrasões da córnea são aslentes de contato. As causas da abrasão podem envolver fatores diferentesde um tipo fisiológico, tóxico ou mecânico, e as abrasões da córnea induzi-das por lentes de contato podem ser devidas, em particular, ao seu uso, adificuldades em sua inserção e remoção, a problemas de relações entre alente e a córnea, a lentes danificadas ou a corpos estranhos presos sob umalente. Essas abrasões podem derivar do uso de lentes tanto rígidas quantomoles, mas são mais comuns nos usuários de lentes rígidas. Um estudo rea-lizado em 500 usuários de lentes de contato moles mostrou que um terçodeles teve problemas bastante sérios com seus olhos que podiam resultarem infecções, e que quase 50% deles teve sinais de lesões moderadas empelo menos um olho (R.J. Derick et al., CLAO J., Oct-Dec 1989; 15(4):268-70).

As abrasões da córnea são, dessa maneira, um problema quepode afetar qualquer um, mas as lentes de contato causam indubitavelmenteatrito na córnea, e isso aumenta a probabilidade da ocorrência: os usuáriosde lentes de contato sofrem de lesões da córnea cerca de três vezes tantoquanto os não usuários de lentes.

O uso de lentes de contato também pode produzir uma série deoutros problemas que derivam de sua interferência com a fonte normal deoxigênio ao epitélio da córnea ou de condições patológicas, tais como a con-juntivite papilar gigante ou a vascularização da córnea, ou o caso mais co-mum da síndrome de olho seco. Esta última, também conhecida como "olhoseco" ou cheratoconjunctivitis sicca, é um distúrbio causado por uma diminu-ição na quantidade e na qualidade das lágrimas. Os sintomas típicos da pa-tologia são uma irritação e uma sensação de ardência dos olhos, uma sen-sação de grãos ou corpos estranhos, fotofobia, dor e turvação visual. A Ion-go prazo, podem ocorrer ulcerações que comprometam a própria visão.

Para tratar o olho seco ou para reduzir os seus sintomas correla-tos, muitas formulações de fluidos de lágrimas artificiais foram introduzidas,para serem aplicadas periodicamente pela instilação na córnea (ou no fórni-ce da conjuntiva) a fim de obter um substituto de fluido de lágrima e aliviar asensação de secura nos olhos. Para aumentar o tempo de permanência nasuperfície da córnea e também para ter uma boa tolerabilidade, esses prepa-rados geralmente se tornam viscosos mediante a adição de agentes de pesomolecular elevado - normalmente polímeros hidrossolúveis de origem sintéti-ca, semi-sintética ou natural. Na suposição que, a fim de ter um grande tem-po de permanência pré-corneal, um substituto de fluido de lágrima deve terpropriedades tão parecidas quanto possível daqueles de dispersões de mu-cina, isto é, ele deve se comportar tanto quanto possível como uma substân-cia mucomimética, e a preferência foi dada às composições à base de com-postos macromoleculares de origem natural tais como derivados da celulose(em particular, os ésteres de celulose tais como a carbóxi metil celulose, eos derivados de álcool de éteres da celulose tais como a hidróxi propil metilcelulose), glicosaminoglicanos (em particular, o ácido hialurônico, um polis-sacarídeo presente em muitos tecidos e fluidos humanos e animais, e usadoamplamente em preparados oftálmicos), polissacarídeos que têm proprieda-des reológicas apropriadas (tal como um polissacarídeo extraído da goma detamarindo, o TSP).

Além disso, a fim de poder apresentar as propriedades de Iubrifi-cação requeridas da superfície da córnea, esses substitutos de fluido de lá-grima têm sempre alguma viscosidade (mesmo se, em soluções preferidas,essa viscosidade diminui drasticamente quando o produto é sujeitado a umatensão de cisalhamento, tal como no caso do piscar), e podem envolver aturvação da visão, e também deixam resíduos na córnea ou na borda daspálpebras.

No caso dos problemas acima mencionados relacionados ao usode lentes de contato, de preferência, por outro lado, é extremamente impor-tante que um produto usado como um suplemento de fluido de lágrima tenhauma viscosidade baixa - além de bem ser tolerado e não ter nenhum efeitoirritante no olho - de modo a não borrar a visão ou não deixar resíduos nalente e nas bordas da pálpebra. Igualmente importante para tal produto, é acapacidade de assegurar a integridade epitelial da córnea e de impedirquaisquer interações e/ou reações negativas com o material da lente de contato.

De acordo com a presente invenção, foi verificado que as solu-ções oftálmicas que contêm polímeros naturais particulares de polissacarí-deos, arabinogalactanas, formuladas de modo a terem uma viscosidade vir-tualmente insignificante, possuem uma capacidade de mucoaderência sufi-ciente para evitar que sejam drenadas em um tempo curto da superfície dacórnea e, além de serem bem-toleradas, possuírem uma capacidade mar-cante de promover a repitelização. De fato, foi demonstrado, dentro do qua-dro dos estudos conectados com a presente invenção, que essas composi-ções - aplicadas nos olhos com um epitélio danificado - aceleram a recupe-ração. Em conseqüência disto, as composições propostas, associadas como uso da lente de contato, podem estimular a cura das abrasões da córneaque podem surgir, impedindo o agravamento dos danos epiteliais e dequaisquer complicações. Tal como já foi mencionado, uma outra característi-ca importante do produto, que o torna inovador e ideal para a finalidade, éque - embora possuindo propriedades mucoaderentes apropriadas - ele nãoaltera a viscosidade de soluções aquosas, e desse modo não interfere navisão nos indivíduos que usam lentes de contato e dentro não. Ao mesmotempo, as propriedades mucoaderentes permitem que o produto estabeleçaligações de vários tipos com a mucosa que forra a superfície da conjuntiva eda córnea do olho, e essas ligações permitem uma permanência maior doproduto na região pré-ocular, e desse modo a possibilidade de executar aatividade de reptelização e hidratação que caracteriza o produto.

As soluções oftálmicas para serem usadas como lágrimas artifi-ciais que contêm arabinogalactana como polímero de lubrificação da super-fície da córnea já são descritas na patente U.S. n9. 4039662 (Hecht et al.,cedida à Alcon Laboratories Inc.). Neste caso, no entanto, as propriedadesde repitelização do polissacarídeo não foram realçadas nem exploradas e,acima de tudo, a sua utilidade foi condicionada à presença necessária docloreto de benzalcônio na formulação. De acordo com a descrição dessedocumento, de fato, a incorporação do cloreto de benzalcônio - uma subs-tância já usada em composições oftálmicas como um biocida - é um elemen-to crítico para o preparado proposto, porque se acredita que esse composto,combinado, ou formando complexos, com o polissacarídeo, é a causa dapermanência do produto em um estado adsorvido na superfície da córnea,de modo a executar a sua função como um estabilizador de película pré-córnea. Em linha com essa observação, o documento citado propõe solu-ções oftálmicas à base de arabinogalactana e contendo cloreto de benzalcô-nio como um ingrediente necessário.

De acordo com os estudos realizados no quadro da presenteinvenção, por outro lado, as propriedades de repitelização e de proteção dasuperfície da córnea mostradas por arabinogalactanas, bem como as suaspropriedades mucoaderentes que lhes confere um grande tempo de perma-nência na película pré-córnea, até mesmo na ausência de qualquer viscosi-dade significativa, não são de nenhuma maneira condicionadas pela co-presença do cloreto de benzalcônio. Portanto, as composições de repiteliza-ção que contêm arabinogalactanas de acordo com a presente invenção re-gulam a presença do cloreto de benzalcônio, uma vez que elas podem em-pregar muitos outros produtos apropriados para a finalidade caso composi-ção requeira a inclusão de conservantes.

Tal como é sabido, as arabinogalactanas são uma classe de po-lissacarídeos densamente ramificados de cadeia longa com um peso mole-cular que varia entre 10.000 e 120.000 dáltons e uma estrutura central queconsiste em uma cadeia de unidades de galactopiranose. Na natureza, elassão encontradas em vários sistemas de micróbios, em especial micobacté-rias, onde são complexadas com peptidoglicano e ácido micólico para formara parede da célula. Muitas plantas comestíveis e não comestíveis são fontesricas em arabinogalactanas, principalmente em uma forma glicoprotéica.Muitas ervas com propriedades imunoestimulantes reconhecidas, tais comoEchinacea purpurea, Baptisia tintorea e Thuja occidentalis, contêm quanti-dades significativas de arabinogalactanas. Os tecidos do lenho das plantasdo gênero Larex são particularmente ricos em arabinogalactanas, em espe-cial Larex occidentalis, mas também Larex dahurica (original da Ásia cen-tral), por exemplo, Larex dicidua (europeu) e Larex leptolepis Qaponês). Defato, a madeira de lariço é a fonte industrial mais comum de arabinogalacta-na, de cuja fonte esse polissacarídeo é extraído para ser usado não somentepara finalidades industriais, tal como na indústria de cosméticos, mas tam-bém - e acima de tudo - na indústria de alimentos, como um ingrediente die-tético e nutritivo rico em fibras, nas bebidas e também como um agente deimunomodulação.

Portanto, a presente invenção apresenta especificamente umacomposição oftálmica para ser usada como um substituto de fluido de lágri-ma com uma atividade queratoprotetora e uma atividade de repitelização,contendo entre 1% e 10% em peso de arabinogalactana em uma soluçãoaquosa, caracterizada pelo fato de não conter cloreto de benzalcônio. Asconcentrações mais apropriadas de arabinogalactana para o uso propostode acordo com a presente invenção são, especificamente, as concentraçõesque variam entre 3% e 5% em peso de polissacarídeo, em uma solução aquosa.

De acordo com as modalidades preferidas da presente invenção,a arabinogalactana usada nas composições propostas é a arabinogalactanade lariço da classe farmaceuticamente aceitável. Em particular, a arabinoga-lactana usada de preferência nos preparados de acordo com a presente in-venção (arabinogalactana CAS N9 9036-66-2) tem o nome comercial Fibe-rAid® AG e é produzida pela empresa LAREX® (Cohasset, Mn, EUA) deacordo com a patente U.S. ne. 5.756.098. Essa arabinogalactana está naforma de um pó branco fino (peso molecular = 45 kdáltons), e é dispersávelmas não totalmente solúvel em água fria.

Todas as arabinogalactanas isolados do lariço são polissacarí-deos sem nitrogênio. Um terço da molécula é composto pela cadeia princi-pal, do tipo (1-»3)-p-D-galactopiranana, ao passo que o restante consiste emgrupos laterais ligados na posição (1 ->6) a cada unidade de galactose, cujotamanho varia de monossacarídeos a oligossacarídeos. A distribuição dosgrupos laterais não é uniforme. Normalmente, o grupo lateral é dissacarídeoP-D-Galp-(1 ->6)-p-D-Galp ou p-L-Arap-(1 ->3)-oc-L-Araf. Menos freqüente-mente, há o monômero β-D-Galp ou o monômero α-L-Araf. As unidades degalactose e arabinose estão em uma razão molar de cerca de 6:1.

Os estudos morfológicos sobre a arabinogalactana mostraramque esse polímero tem uma grande liberdade conformacional e pode assu-mir muitas formas distintas, mas a cadeia principal tem geralmente uma es-trutura em hélice de espiral tripla rígida, ao passo que os grupos lateraisformam ramificações flexíveis com muitos grupos hidróxi expostos (R. Chan-drasekaran, S. Janaswamy, 2002, Carbohydrate Research). Esta é conside-rada como a razão subjacente às características mucoaderentes do políme-ro, o que faz com que possa estabelecer ligações de hidrogênio com as mo-léculas de mucina do olho.

De acordo com algumas modalidades específicas da presenteinvenção, a composição oftálmica também contém - além da arabinogalac-tana - um ou mais agentes de ajuste da tonicidade que conferem à solução ovalor desejado de osmolaridade. Uma vez que a solução oftálmica propostapode ser isotônica ou ligeiramente hipotônica com respeito ao fluido de lá-grima, os agentes reguladores da tonicidade estarão presentes na composi-ção em uma quantidade tal que é obtida uma solução com uma osmolarida-de que varia entre 150 e 300 mOsm/l. De preferência, um ou mais ditos a-gentes reguladores da tonicidade são escolhidos do grupo que consiste em:manitol, cloreto de sódio, cloreto de potássio, dextrose, ácido bórico e sorbi-tol.

Uma vez que a arabinogalactana também ficou estável nas solu-ções aquosas protegidas a vários valores de pH, outros ingredientes quepodem ser adicionados, similarmente ao que já é conhecido no campo far-macêutico, incluem um ou mais ácidos ou bases oftalmicamente aceitos, taiscomo corretores do pH, e/ou um ou mais tampões. Em particular, os tam-pões utilizáveis podem ser escolhidos do grupo que consiste em: tampão defosfato, tampão de borato, tampão de citrato, tampão de bicarbonato, tam-pão de trizma (tri-hidroximetil-aminometano). Além disso, outros sistemas detampão podem ser vantajosamente usados nas composições de acordo coma invenção.

Quando o produto não é acondicionado em unidades de mono-dose, a composição também pode incluir conservantes e microbicidas, exce-to quanto ao cloreto de benzalcônio. Os conservantes possíveis que sãocompatíveis com o produto incluem, em particular, mertiolato de sódio outimerosal, nitrato ou acetato de fenila mercúrico, álcool fenil etílico, metil-,etil- e propil parabeno, acetato ou gloconato de clorhexidina, e clorobutanol.

Finalmente, até mesmo agentes de quelação tais como os ede-tatos ou EDTA podem ser adicionados, quando requerido, às composiçõesque contêm arabinogalactanas de acordo com a invenção.

De acordo com um outro seu aspecto, a presente invenção tam-bém apresenta o uso de uma solução oftálmicas que contêm entre 1% e10% em peso, e de preferência entre 3% e 5% em peso, de arabinogalacta-na na solução aquosa para a produção de uma composição oftálmica comuma atividade queratoprotetora e de repitelização. Tal como já foi observa-do, a formulação da dita composição oftálmica pode regular o uso do cloretode benzalcônio sem nenhum problema qualquer que seja.

Mais especificamente, a composição oftálmica obtida com o usode arabinogalactana de acordo com os preceitos da presente invenção é umsubstituto de fluido de lágrima indicado para usuários de lentes de contato.De acordo com algumas modalidades específicas, a dita composição oftál-mica é um substituto de fluido de lágrima indicado para o tratamento de le-sões e inflamações queratoconjutivais e, neste último caso, pode ser maisespecificamente uma composição oftálmica recomendada para o tratamentode abrasões da córnea causadas pelo uso de lentes de contato.

Alguns exemplos de composições que contêm arabinogalactanautilizáveis como substitutos de fluidos de lágrima com uma atividade quera-toprotetora e de repitelização de acordo com a invenção são apresentadosabaixo, a título de exemplos não limitadores.

Composição 1

<table>table see original document page 12</column></row><table><table>table see original document page 13</column></row><table>

Para a preparação das ditas composições acima, uma quantida-de de polímero pesada com precisão foi dispersada em água deionizada ouem tampão de fosfato e mantida sob agitação até ser dissolvida por comple-to. As quantidades apropriadas dos outros excipientes (manitol, NaCI e/ouconservante) foram adicionadas à solução obtida desse modo, ainda sobagitação, até serem dissolvidas por completo.

As composições obtidas desse modo podem ser esterilizadaspor meio de filtração através de uma membrana de 0,22 pm.

As características específicas da presente invenção, bem comoas suas vantagens, serão mais evidentes com referência a uma de suasmodalidades específicas descritas abaixo meramente para finalidades deexemplificação, junto com os resultados das experiências nelas executadase com os dados para as comparações com a técnica anterior. Alguns resul-tados experimentais também são ilustrados nas figuras dos desenhos emanexo, nos quais:

a Figura 1 mostra a variação na viscosidade das composiçõesque contêm arabinogalactana na solução aquosa de acordo com a presenteinvenção à medida que a concentração no polissacarídeo varia;a Figura 2 mostra a tendência do tempo de permanência pré-córnea de uma solução que contém arabinogalactana de acordo com a in-venção, avaliada através da determinação de um derivado fluorescente dearabinogalactana;

a Figura 3 mostra os resultados obtidos com o teste de SchirmerI realizado em coelhos tratados com sulfato de atropina (AS) a fim de induzirexperimentalmente o olho seco; em um olho dos ditos coelhos, uma compo-sição que contém arabinogalactana de acordo com a invenção (AG-Sol)também foi administrada, como tratamento;

a Figura 4 mostra um histograma dos resultados de um teste dealteração do epitélio da córnea realizado com fluoresceína e a observaçãopor lâmpada fendida realizado nos mesmos coelhos da Figura 3;

a Figura 5 ilustra graficamente os resultados de um teste de re-cuperação de uma lesão da córnea induzida experimentalmente nos coe-lhos, os quais foram então tratados com a composição de acordo com a in-venção (AG) ou, para fins de comparação, com o sacarídeo de goma de ta-marindo (TSP) ou com o ácido hialurônico (HA);

as Figuras 6 e 6a ilustram graficamente - em dois níveis de deta-lhes - os resultados de um teste de recuperação da lesão da córnea induzidaexperimentalmente tal como nos testes da Figura 5, em que a comparação éfeita entre a composição da presente invenção (AG-Sol) e uma solução simi-lar que também contém cloreto de benzalcônio (AG-Bz); e

a Figura 7 mostra os resultados dos testes de toxicidade de célu-la em termos da vitalidade da célula após a exposição a uma solução quecontém arabinogalactana de acordo com a invenção (AG-Sol), ou a uma so-lução similar que também contém cloreto de benzalcônio (AG-Bz).Testes de Viscosidade

As soluções de arabinogalactose (FiberAid® AG da LAREX®,Cohasset, Mn, EUA), em seguida denominadas AG, em várias concentra-ções (0,2, 0,5, 0,8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10% em peso) foram sujeitadasaos testes de viscosidade ao usar um viscosímetro rotativo Rheostress RS150 (Haake) com corpos de medição de cilindros coaxiais (Z40 e Z41), auma temperatura constante de 25°C. Os valores da viscosidade das solu-ções são indicados graficamente na Figura 1 dos desenhos em anexo.

Os reogramas foram executados para os valores de gradiente develocidade que variam entre O e 200 s"1 e, nos gráficos, a correlação entre atensão de cisalhamento (τ) e os gradientes de velocidade (γ) foi avaliada pormeio de processamento matemático ao empregar o software Rheowin. Foiverificado desse modo que as soluções do produto de AG têm um compor-tamento reológico newtoniano e não apresentam tixotropia.

O comportamento newtoniano das soluções de AG é devido àsua não viscosidade - uma característica desejável no caso das soluçõesserem aplicadas o olho quando se usa lentes de contato, de modo que olíquido que penetra no espaço entre a lente e o córnea não cause nenhumaturvação da visão.

Testes de Mucoaderência

1. Testes de mucoaderência em matriz sólida

As propriedades mucoaderentes da arabinogalactana de acordocom a invenção (FiberAid® AG, Larex®) foram avaliadas ao medir a forçarequerida para separar duas superfícies de mucosa entre as quais a amostrasendo examinada foi colocada. As superfícies de mucosa eram compostasde uma dispersão aquosa de mucina gástrico de porco a 25% (TCI, Tokyo)adsorvida em papel de filtro (Saettone et al., 1989, Int. J. Pharm., 51:203-212).

O equipamento usado consiste em uma balança micrométrica,uma plataforma móvel e um sistema computadorizado com capacidade degravar a força necessária para destacar as duas superfícies (a amostra sen-do examinada e a camada de mucosa) como uma função do alongamento(software TP 5008, TiePie Engineering, Leeuwarden, Holanda).

O trabalho de aderência foi medido para as matrizes sólidas queconsistem no polímero de polissacarídeo sendo examinado, com um diâme-tro de 13 mm e com 1 mm de espessura, as quais foram preparadas aocomprimir uma quantidade apropriada do material de polímero por meio deuma prensa hidráulica (Perkin-EImer) a uma pressão de 3.000 kg/cm2.Os resultados obtidos foram comparados com o trabalho de ade-rência medido pelas matrizes sólidas do mesmo tamanho com TS-polissacarídeo (TSP), já conhecidas na literatura como mucoaderentes, pre-paradas com o mesmo método. Os resultados obtidos são indicados na ta-bela a seguir.

TABELA 1

Trabalho de aderência para os polímeros sob o estudo (média ± S.E., η =20)

2. Avaliação reológica da resistência da ligação de aderência de mucina-polímero

Para examinar mais detalhadamente as propriedades mucoade-rentes da arabinogalactan (AG), foram seguidos o método de Saettone etal.(Saettone et al., 1994, Journal of Ocular Pharmacology, 10:83-92) e deHassan e Gallo (Hassan, Gallo, 1990, Pharm. Res., 7:491-495), os quaisconsistem na medição das variações da viscosidade causadas em uma dis-persão de mucina depois de ser adicionado o polímero. De acordo com essemétodo, o componente da viscosidade devido à bioaderência, r|b, foi calcu-lado pela equação rjb = r\\ - ηηι - ηρ, onde ηί, ηιτι e ηρ são coeficientes deviscosidade individuais do sistema, mucina e polímero, respectivamente. Ovalor de r|b foi normalizado subseqüentemente de acordo com a seguinteequação: Δη/η = η^ηρ.

A seguir, as medições das variações da viscosidade devida àinteração de mucina-polímero foram feitas nas soluções aquosas que con-têm: i) 15% de mucina apenas (ηηι); ii) AG e outros polímeros, usados comoreferência, em suas respectivas concentrações eficazes (ηρ); iii) misturas demucina-polímero, nas mesmas concentrações indicadas anteriormente (ηί).

As composições usadas eram tal como segue:

1. Solução aquosa de mucina gástrica de porco (MGS; TCI, Tok-yo), a 15% em peso/peso;

2. Solução aquosa de AG, a 5% em peso/peso (FiberAid® AG,LAREX®);

3. Solução aquosa de TSP, a 0,5% em peso/peso (Farmigea,Pisa);

4. Solução aquosa de ácido hialurônico, a 0,2% em peso/peso(Chemofin, Milano);

5. Dispersão aquosa de mucina, a 15% em peso/peso, e AG a5% em peso/peso;

6. Dispersão aquosa de mucina, a 15% em peso/peso, e TSP a0,5% em peso/peso;

7. Dispersão aquosa de mucina, a 15% em peso/peso, e ácidohialurônico a 0,2% em peso/peso.

As medidas viscosimétricas foram feitas por meio de um visco-símetro rotativo Rheostress RS 150 (Haake) com corpos de medição de ci-lindros axiais (Z40 e Z41), a uma temperatura constante de 32°C. Os reo-gramas foram obtidos para os valores de gradiente de velocidade que vari-am entre 0 e 500 s"1.

As soluções poliméricas exibem um comportamento newtoniano,e os gráficos obtidos foram usados a fim de avaliar a correlação linear entrea tensão de cisalhamento (τ) e os gradientes de velocidade (indicados comum γ ou D) por meio de processamento matemático executado com o soft-ware Rheowin.

O ácido hialurônico, a mucina e as dispersões de mucina-polímero exibem um comportamento pseudoplástico. A correlação matemá-tica dos gráficos obtidos, executada com o software Rheowin, é tal comosegue: τ= aDb. A viscosidade nas formulações newtonianas e a viscosidadeaparente das formulações pseudoplásticas foram calculadas ao escolher umdeterminado valor de D e então ao obter τ das respectivas equações (D =200 S"1).

Os valores da viscosidade para todas as composições foremindicados na Tabela 2 a seguir, ao passo que os valores de parâmetro Δη/ηpara os polímeros usados são indicados na Tabela 3.

TABELA 2

Viscosidade das composições sob estudo

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TABELA 3

Δη/η das composições sob estudo

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Tal como mostram os resultados, a solução aquosa de AG a 5%em peso/peso apresenta uma viscosidade muito mais baixa (1,38 mPa.s) doque os polímeros tomados como referência (9,16 mPa.s e 24,40 mPa.s paraTSP e para HA, respectivamente), ao passo que o valor normalizado Δη/ηde AG é da mesma magnitude que o valor de TSP. Isto indica que AG podeformar interações de vários tipos com a mucosa que cobre as superfícies daconjuntiva e da córnea do olho. Portanto, embora sendo um polímero nãoviscoso que não turva a visão e não interfere no uso de lente de contato, AGestabeleça interações permitindo uma permanência prolongada do produtona região pré-ocular, e desse modo uma proteção e uma hidratação prolon-gadas da superfície da córnea.

Estudos de interação de lente de contato-polímero

Para avaliar o grau de interação de lentes de contato com o po-límero sob estudo, um derivado fluorescente de arabinogalactana (FITC-AG)foi preparado, tal como relatado a seguir.

Uma quantidade pesada com precisão de arabinogalactana (Fi-berAid® AG, Larex®) igual a 1 g foi dissolvida em 10 ml de sulfóxido de di-metila contendo algumas gotas de piridina. A essa solução, foi adicionado0,1 g de isotiocianato de fluoresceína (Sigma-AIdrich, Alemnha) seguido por20 mg de dilaurato de dibutil estanho (Sigma-AIdrich, Alemanha). A misturaobtida desse modo foi aquecida por duas horas a 95°C. Depois da precipita-ção e de uma lavagem com etanol para remover os produtos que não reagi-ram, a FITC-AG foi filtrada e secada a 80°C (A.N. de Belder & K. Granath11973, Carbohydrate Research, 30:375-378).

As seguintes soluções em água deionizada foram preparadaspara o teste:

1. FITC-AG a 5% em peso/peso;

2. fluoresceína sódica (SF) (Sigma-AIdrich, St. Louis, EUA) a0,0223% em peso/peso.

A concentração da solução de SF foi escolhida para ter a mes-ma fluorescéncia que a solução de FITC-AG a 5% em peso/peso. Lentes decontato diárias moles (Focus Dailies®, Ciba Vision, Alemanha) foram usadaspara o teste.

As lentes de contato foram imersas em 1 ml de fluido de lágrimaartificial sem proteínas, ao qual tinham sido adicionados 50 μΙ de uma solu-ção de FITC-AG a 5% em peso/peso ou de SF a 0,0223% em peso/peso, ecolocadas em repouso por trinta minutos. As lentes foram então lavadas aoserem imersas em 100 ml de fluido de lágrima artificial fluido por quinze mi-nutos sob agitação lenta com um agitador magnético. As lentes tratadas fo-ram observadas então com uma lâmpada Wood a 365 nm em comparaçãocom as lentes de contato não tratadas como uma referência.

Nenhuma das lentes revelou qualquer traço visível de fluores-cência, demonstrando o fato que o polímero de AG não é retido na superfícieda lente nas condições empregadas.

O fluido de lágrima artificial teve a seguinte composição expres-sa em mg/100 ml de água deionizada: MgCI2 4,75; CaCl2 7,97; KHCO3260,00; NaCI 754,00 (Burgalassi et al., 1999).

Teste de Formação de Samambaia

A camada mais interna de fluido lacrimal é composta de glico-proteínas da mucosa, que, em condições normais, são produzidas por célu-las de Goblet da conjuntiva. Uma das características físicas mais importan-tes da mucosa é a sua capacidade de cristalizar em formas parecida comsamambaia quando ela é levada a evaporar à temperatura ambiente.

Os vários aspectos da cristalização da mucosa da lágrima po-dem acarretar indicações úteis nas condições de estabilidade da películalacrimal, e são classificados em quatro tipos:

Tipo I: a formação de samambaia está presente de uma maneirauniforme sem nenhum espaços entre as samambaias individuais. As sa-mambaias são grandes e densamente ramificadas.

Tipo II: a cristalização na forma de samambaias ainda é abun-dante mas as samambaias individuais são menores no tamanho e não sãotão amplamente ramificadas. Há espaços apreciáveis entre as samambaias.

Tipo III: a formação de samambaia está presente de uma manei-ra parcial, as samambaias são pequenas e muito pouco ramificadas; há es-paços consideráveis entre as samambaias.

Tipo IV: a formação de samambaia é ausente e há filamentos ouconglomerados que representam o material da mucosa degenerado mistura-do com células esfoliadas.

Os dois primeiros tipos de formação de samambaia são típicosdos olhos normais com boas condições da camada da mucosa e da películalacrimal. O tipo III parece ser uma forma de transição e indica um estadodifícil da mucosa em manter a sua integridade e funções. O tipo IV indicauma grande alteração dos componentes da mucosa de fluido lacrimal.

Todas as soluções oftálmicas que se cristalizam na forma desamambaias comparáveis ao tipo I e ao tipo Il são estruturalmente similaresàs glicoproteínas de mucosa produzidas pelas células de Goblet da conjunti-va.Desse modo, o teste de formação de samambaia foi realizado afim de avaliar a capacidade possível de AG se cristalizar com característicassimilares à mucosa presente na superfície do olho. O teste consiste na eva-poração à temperatura ambiente (25 ± 1°C), por 24 horas, em uma lâminade microscópio, uma mistura composta previamente preparada de 10 μΙ desolução a 2,5% em peso/peso de AG e 2 μΙ de fluido de lágrima artificial.

A solução a 2,5% de AG foi preparada ao dispersar, sob agita-ção, uma quantidade apropriada do polímero (FiberAid® AG, Larex®) emágua deionizada. Após a evaporação, o resíduo foi observado por meio deum microscópio de luz polarizada Reichert-Jung Microstar com uma lente deaumento de 10 vezes.

A cristalização da solução de AG produziu estruturas ramificadasparecidas com samambaias muito similares àquelas obtidas com o fluido delágrima humano. O resultado obtido, também confirmado pelos testes deinteração reológica, sustenta a hipótese que o polímero sob estudo é compa-tível com as estruturas de glicoproteína da mucosa ocular. Desse modo, po-de ser suposto que ela pode substituir o componente da mucosa naturalquando este último é deficiente devido a razões patológicas.

Testes biológicos

1. Avaliação do tempo de permanência pré-córnea

O estudo atual usou o derivado fluorescente de arabinogalacta-na (FITC-AG), preparado tal como já foi descrito na seção sobre os estudosda interação de lente de contato-polímero.

A determinação quantitativa da FITC-AG em amostras biológicasfoi feita através de análise fluorimétrica. O equipamento foi composto por umdetector de fluorescência Shimadzu Rf-551 com um software de integraçãoapropriado. A detecção foi executada a um comprimento de onda de excita-ção de 490 nm e a um comprimento de onda de emissão de 514 nm.

O teste foi realizado em coelhos albinos da Nova Zelândia quepesavam 2-2,5 kg. 50 μΙ da composição aquosa de FITC-AG a 5% em pe-so/peso foram administrados ao saco da conjuntiva inferior dos coelhos. Aintervalos de tempo apropriados após a instilação (1, 3, 5, 10, 20, 30, 45 e60 minutos), amostras de fluido de lágrima (1,0 μl) foram coletadas da partemarginal do saco da conjuntiva inferior por meio de microcapilar (Microcaps,Drummond Scientific, NJ, EUA), evitando qualquer contato com o epitélio dacórnea. As amostras de fluidos de lágrima foram transferidas a tubos de en-saio Eppendorf e então analisadas por meio de análise fluorimétrica após adiluição com 50 μΙ de água.

A Figura 2 em anexo mostra a diminuição da porcentagem nafluorescência de FITC-AG no fluido de lágrima com o passar do tempo, to-mado como 100% da fluorescência do produto após 1 minuto. A fluorescên-cia é sempre alta 10 minutos após a administração, diminui após 20 minutos,e ainda é apreciável depois de 60 minutos, realçando a permanência prolon-gada de AG na região pré-córnea.

2. Indução e tratamento da síndrome de olho seco

O estudo atual usou uma solução de arabinogalactana (Fibe-rAid® AG, Larex®) em água, em seguida denominada como AG-Sol, comuma concentração de AG de 5% em peso/peso, tornada isotônica mediantea adição de uma quantidade apropriada de manitol (4,41 % em peso/peso) ecom um pH igual a 6,46.

Para preparar a composição de AG-Sol, uma quantidade de po-límero pesada com precisão foi dispersada em água deionizada (Milli-Q, Mil-lipore) e a solução obtida desse modo foi aquecida a 80°C por 30 minutossob agitação com um agitador magnético. Após o resfriamento, foi adiciona-do manitol.

A solução obtida desse modo foi filtrada sob uma capa de fluxolaminar por meio de filtros estéreis de 0,22 μm (Minisart Sartorius) e acondi-cionada em frascos de vidro.

Para avaliar a influência da arabinogalactana na lacrimação, noscasos onde as lesões do epitélio da córnea são associados com a síndromede olho seco, foi realizada uma experiência in vivo.

Os testes foram realizados ao usar coelhos albino da Nova Ze-lândia que pesavam 2-2,5 kg.

Uma gota de uma solução aquosa de sulfato de atrofina a 1,0%(AS), três vezes ao dia (às 09:00 horas, 13:00 horas e às 17:00 horas) porcinco dias consecutivos, foi instilada em ambos os olhos dos animais a fimde diminuir a produção Iacrimal e de induzir o olho seco (S. Burgalassi et al.,1999, Ophthalm.Res., 31, 229-235). Depois de cinco minutos de cada admi-nistração de As, 50 μΙ da composição de AG-SoI que contém arabinogalac-tana só foi instilada em seu olho direito.

Os animais foram submetidos ao teste de Schirmer I no tempo 0(antes do tratamento) e no 2e, 3° 4e e 5e dias após o início do tratamento. Oteste analisa a medida, uma vez ao dia, da quantidade de fluido de lágrimasecretada. A determinação foi feita antes de cada administração das solu-ções (AS e AG-Sol) por meio de tiras de papel bibula (Alfa Intes) colocadasno fórnice da conjuntiva inferior do olho de cada coelho. A elevação do fluidode lágrima ao longo das tiras de papel bibula foi medida em milímetros. Osvalores obtidos para os olhos tratados só com sulfato de atropina foramcomparados com aqueles obtidos para os olhos tratados com a solução dearabinogalactana de acordo com a invenção.

O valor base da secreção Iacrimal foi medido em um grupo deanimais de controle em que nenhum tratamento farmacológico foi executado.

Os resultados obtidos são indicados graficamente na Figura 3dos desenhos em anexo. A figura mostra como a solução de AG-SoI tem umefeito de proteção contra a eclosão de olho seco.

Além disso, nos dias 3, 4 e 5 depois do início do tratamento, ograu de alteração do epitélio da córnea causado pelo olho seco foi avaliadopela observação com uma lâmpada fendida equipada com um filtro azul, de-pois de ser colorida a córnea com 10 μΙ de uma solução aquosa a 1% empeso/peso de fluoresceína. No caso de alterações epiteliais, as áreas emcores na superfície da córnea são observadas: olho fluopositivo.

A Tabela 4 abaixo indica os resultados obtidos, como uma por-centagem dos olhos fluopositivos do total dos olhos tratados. Os mesmosresultados são indicados no histograma da Figura 4 em anexo, a qual com-para graficamente a porcentagem dos olhos que resultam fluopositivos apóso tratamento com a solução de AG-SoI com respeito à porcentagem dos o-Ihos fluopositivos nos animais de controle tratados somente com AS.

TABELA 4

Resultados obtiveram através da observação pela lâmpada tendida

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Dos resultados mostrados na Tabela 4 e na Figura 4, é possível

observar como nos olhos não tratados a porcentagem de fluopositividade

aumenta dia a dia, e no 5g dia do tratamento alcança quase 60%, ao passo

que nos olhos tratados com a solução de AG-SoI a porcentagem de fluoposi-

tividade permanece constante entre o 4Q e 5g dia do tratamento, a um valor

muito mais baixo de cerca de 17%.

3. Avaliação da capacidade de repitelizacão

O teste indicado abaixo avalia o tempo de recuperação de uma

lesão produzida na córnea de coelho após a administração das seguintes

composições:

1. Solução de AG-SoI aquosa (5% de AG, 4,41% de manitol);

2. TS-polissacarídeo (TSP) solução aquosa a 0,04%;

3. Ácido hialurônico (HA) solução aquosa a 0,00144%.Deve ser observado que, uma vez que o objetivo dos produtosde acordo com a invenção é de obter suplementos Iacrimais que não sejamtão viscosos quanto as lágrimas artificiais da técnica anterior à base de po-lissacarídeos de modo que sejam particularmente úteis para usuários de Ien-tes de contato, a concentração das soluções da referência 2) e 3) contendoTSP e HA foi escolhida de modo que se tenha soluções com o mesmo com-portamento reológico (isto é, newtoniano) e o mesmo valor da viscosidadeque a solução de AG-Sol.

O teste foi realizado em coelhos albinos da Nova Zelândia quepesavam 2-2,5 kg. Os coelhos foram anestesiados por meio de injeção in-tramuscular (0,15 ml/kg) de Zoletil 100® (Virdac Laboratories, França) e oolho foi mantido aberto usando um blefarostato e anestesiado na superfíciemediante a instilação de 10 μΙ de cloridreto de oxibuprocaína (Novesina®,MiPharm, Itália).

A fim de causar a lesão da córnea, um disco de papel de micro-biologia com um diâmetro de 6 mm embebido com 10 μΙ de n-heptanol foicolocado na região central da córnea por 60 segundos. Depois de ter sidoremovido o disco, a superfície ocular foi lavada por completo com 1 ml deuma solução fisiológica (Burgalassi et al., 2000, Eur. J. Ophthalmol., 10, 7.1-76).

No tempo 0 (imediatamente depois da remoção do papel embe-bido e da lavagem) e 3, 7, 18, 24, 27, 29, 31, 34, 41, 44, 48 e 51 horas de-pois de ter sido produzida a lesão, a superfície ocular foi colorida com 10 μΙde uma solução aquosa de fluoresceína sódica a 1% em peso/peso, e o di-âmetro da lesão foi medido por meio de um micrômetro específico.

Os animais tratados receberam 100 μΙ das soluções examinadasno olho danificado cinco vezes ao dia (às 09:00 horas, 11:00 horas, 13:00horas, 15:00 horas e 17:00 horas).

Um grupo de animais, em que a lesão da córnea tinha sido for-mada, foi deixado para curar espontaneamente e usado como grupo de con-trole.

A Figura 5 dos desenhos em anexo mostra graficamente a ten-dência de recuperação da lesão da córnea dos grupos de animais com opassar do tempo. Os dados foram indicados como uma diminuição da por-centagem da área da lesão, tomados como 100% da área no tempo 0. Osmesmos dados são indicados numericamente na Tabela 5 abaixo.

TABELA 5

Teste de recuperação de lesão da córnea

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Na tabela acima, bem como na Figura 5, é possível observarque, a partir de 27 horas após a administração das composições, apenas acomposição de acordo com a presente invenção, AG-Sol, exibe uma taxa derecuperação significativamente diferente do que o valor de controle. De fato,embora AG-SoI apresente diferenças significativamente diferentes 27, 29,31, 34 e 41 horas depois do início do tratamento, para as outras composi-ções essa diferença é significativa somente com TSP depois de 29 horas.

4. Avaliação da capacidade de repitelizacão na presença de cloreto de ben-zalcônio

O teste avalia o tempo de recuperação de uma lesão produzidano córnea de coelho após a administração das seguintes composições:

1) Solução de AG-SoI aquosa (5% de Ag, 4,41% de manitol).2) Solução de AG-Bz aquosa (5% de Ag, 4,00% de manitol,0,01 % de cloreto de benzalcônio).

O teste foi realizado em coelhos albinos da Nova Zelândia quepesavam 2-2,5 kg. Os coelhos foram anestesiados por meio de injeção in-tramuscular (0,15 ml/kg) de Zoletil 100® (Virdac Laboratories, França), e oolho foi mantido aberto usando um blefarostato e anestesiado na superfíciemediante a instilação de 10 μΙ de cloridreto de oxibuprocaína (Novesina®,MiPharm1 Itália).

A fim de causar a lesão da córnea, um disco de papel de micro-biologia com um diâmetro de 6 mm embebido com 10 μΙ de n-heptanol foicolocado na região central dâ córnea por 60 segundos. Depois de ter sidoremovido o disco, a superfície ocular foi lavada por completo com 1 ml deuma solução fisiológica (Burgalassi et al., 2000, Eur. J. Ophthalmol., 10, 71-76).

No tempo 0 (imediatamente depois da remoção do papel embe-bido e da lavagem) e 3, 7, 18, 24, 27, 29, 31, 34, 41, 44, 48 e 51 horas de-pois de ter sido produzida a lesão, a superfície ocular foi colorida com 10 μΙde uma solução aquosa de fluoresceína sódica a 1% em peso/peso e o diâ-metro da lesão foi medido por meio de um micrômetro específico.

Os animais tratados receberam 100 μL das soluções examinadasno olho danificado cinco vezes ao dia (às 09:00 horas, 11:00 horas, 13:00horas, 15:00 horas e 17:00 horas).

Um grupo de animais, em que a lesão da córnea tinha sido for-mada, foi deixado para curar espontaneamente e usado como grupo de con-trole.

As Figuras 6 e 6a ilustram graficamente a tendência de recupe-ração da lesão da córnea, em dois níveis diferentes de detalhes, para osgrupos de animais com o passar do tempo. Os dados foram indicados comouma diminuição da porcentagem da área da lesão, tomados como 100% daárea no tempo 0.

É possível observar que a presença do cloreto de benzalcôniomodifica a taxa de recuperação de AG ao desacelerar a mesma: a recupera-ção completa nos animais tratados com a composição de AG-Bz ocorre de-pois de 51 horas, ao passo que nos animais tratados com AG-SoI ela ocorrelogo nas 44 horas a seguir. Isso ocorre porque o uso de ambos os produtosem uma composição com o objetivo de proteger a córnea é desvantajoso.

Avaliação histológica das córneas tratadas

Para avaliar se o processo de repitelização - além de propiciar acura completa das lesões experimentalmente induzidas - também produziu aestratificação apropriada de célula epitelial, de modo a reconstituir a estrutu-ra da córnea nativa, uma análise histológica foi feita.

As amostras das córneas coletadas 24 horas depois de ter sidoproduzida a lesão da córnea, após a recuperação completa (quando nenhu-ma detecção adicional de fluoresceína foi observada no epitélio) e 1 semanaapós a recuperação, foram fixadas em uma solução de paraformaldeído a10% em um tampão de fosfato 0,1 M a um pH 7,4. As amostras foram entãosujeitadas a diversas lavagens com um tampão por 12 horas, desidratadasem uma série de soluções de álcool etílico a uma concentração crescente, eembebidas a 4°C em uma resina específica para a microscopia óptica (JB-4,Embedding Kit, Polysciences Inc.). A amostra embebida foi secionada pormeio de microtomia e sujeitada à coloração de Nissl antes de ser observadasob um microscópio.

24 horas depois de ter sido produzida a lesão, o mecanismo re-parador fisiológico era evidente, uma vez que havia um deslocamento e umamigração das células epiteliais integrais adjacentes à área danificada, com aformação de uma monocamada. O epitélio, ao contrário, restabeleceu umaestrutura estratificada de espessura natural (55-60 pm na região central dacórnea) somente quando a recuperação completa ocorreu, quando a inter-rupção do mecanismo fisiológico de escamação da superfície da célula tinhacessado e a cobertura completa da região negativa e a regeneração dos e-Iementos epiteliais asseguraram a restauração de características estruturaisnormais. As condições permaneceram inalteradas uma semana após a re-cuperação, indicando que o processo de regeneração estava completo.

Os tratamentos executados após a produção da lesão da cór-nea, executados com os mesmos produtos indicados na seção precedente 3dos testes biológicos, conduziram a uma diminuição do tempo de recupera-ção da lesão a graus diferentes, dependendo do produto usado. Isto condu-ziu à suposição de uma influência diferente dos polímeros usados no meca-nismo de reparo. Desse modo, tornou-se necessário investigar as fases derepitelizacão a fim de realçar todas as diferenças no aspecto morfológico dotecido.

Para esta finalidade, o método de avaliação da capacidade derepitelização (seção 3, testes biológicos) foi repetido ao executar a lesão etratamentos com as composições poliméricas tal como relatado acima. Osanimais foram sacrificados imediatamente antes da recuperação completada lesão da córnea, isto é, quando esta última não era mais mensurável como equipamento usado, mas a captação de fluoresceína na superfície ocularainda era visível.

As amostras da córnea tratadas desse modo foram sujeitadas àanálise histológica com o mesmo procedimento que foi indicado acima, e aespessura do epitélio reconstituído foi medida em cada caso.

A medição foi feita na mesma distância cada vez a partir damargem de recrescimento, e das diferenças realçadas na espessura dosepitélios reformadas após os vários tratamentos. De fato, os seguintes resul-tados foram obtidos:

- Controle não tratado (recuperação espontânea), 6 μm;

- amostra tratada com AG-SoI (5% d AG, 4,41% de manitol), 18μm;

- amostra tratada com TS-polissacarídeo a 05%, 18 pm;

- amostra tratada com ácido hialurônico a 0,2%, 12 pm.

Esses resultados mostram que o epitélio que vai reconstituir aárea deficiente ainda não tem uma espessura fisiológica em qualquer umdos casos observados, mesmo se nas amostras tratadas com AG-SoI ecomposições de TS-polissacarídeo a espessura é consideravelmente maiordo que aquela do controle colocado para recuperar espontaneamente.

A observação das imagens respectivas (não mostradas) tambémdestacou a diversidade morfológica entre as amostras da córnea sendo e-xaminadas. Há, de fato, diferenças consideráveis no arranjo do neoepitélionos quatro casos examinados:

. A amostra que deriva do olho de controle exibiu uma estruturaainda não bem organizada, com pouca ou nenhuma estratificação.

. O epitélio tratado com a composição de AG-SoI exibiu uma si-milaridade próxima ao epitélio nativo, no que se refere ao arranjo do tecido.

. A amostra tratada com TS-polissacarídeo mostrou um neo-tecido fracamente estratificado, apesar do fato que a espessura desse epité-lio era a mesma que aquela da amostra tratada com AG-Sol; de fato, eranormalmente uma questão de algumas célula de tamanho grande, muitomaiores do que a norma.

. Finalmente, o tratamento com HA produziu uma estratificaçãodistinta do neoepitélio, mesmo se a espessura final obtida era inferior.

Esses resultados conduzem à conclusão que a taxa de recupe-ração maior de uma lesão da córnea determinada depois do tratamento coma composição contendo AG é devida à estimulação da regeneração dos e-lementos epiteliais que esse produto causa. A capacidade maior de replica-ção das células epiteliais conduz a uma estratificação antecipada do tecido,o que faz desse modo que se tenha um número maior de células para cobrira zona de déficit.

Estudos de toxicidade de célula

O citotoxicidade das soluções que contêm AG sozinho ou napresença de cloreto de benzalcônio (Bz) foi avaliada. As soluções mãe dopolímero foram preparadas (1. AG 5% em peso/peso; 2. AG 5% em pe-so/peso + Bz 0,01% em peso/peso) diretamente no meio Eagle modificadoda Dulbecco (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo1 EUA). Essas solu-ções foram diluídas então a 1:2, 1:5, 1:10, 1:100 e 1:1000 ainda usandoDMEM.

A linhagem de células usada consistiu em células epiteliais dacórnea de coelho (RCE SV40 transformado, N. 95081046, ECACC, G.B.). Alinhagem RCE foi criada pela infecção de culturas primárias de células epite-liais da córnea de coelho com um retrovírus recombinante Sv-40. As célulasmostram a morfologia pavimentada típica dos epitélios e uma capacidade deestratificação, bem como o desenvolvimento de desmossomas e microvilos.

O meio de crescimento de célula era o meio Eagle modificado daDulbecco (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, EUA) enriquecidocom a mistura nutriente F12 de Ham (1:1), L-glutamina (1% em v/v, 2 mM),penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), anfotericina B (0,25pg/ml), soro fetal de bovino desativado por calor (15% em v/v) (Gibco, GrãBretanha), insulina (5 Mg/ml), fator de crescimento de epiderme (10 ng/ml)(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo1 EUA). As células cresceram a 37°C emuma atmosfera saturada com umidade com 5% de CO2.

A avaliação do grau de toxicidade das soluções testadas nascélulas RCE foi feita por meio do método colorimétrico, usando o reagentede proliferação de células comercialmente disponível WST-1 (Roche Diag-nostics® S.p.A., Monza). O teste é baseado na separação, através da ativi-dade mitocondrial, do sal de tetrazólio WST-1 em um composto colorido so-lúvel (formazan). Uma vez que a transformação só pode ser feita por célulavivas, a quantidade de formazan produzida é correlacionada diretamente aonúmero de células vivas.

As células RCE foram colocadas em lâminas com 96 cavidades(Corning Costar® Italia, Milão) a uma concentração de 5 χ 103 células. De-pois de 24 horas, a uma afluência de 90%, o meio de crescimento foi remo-vido e substituído pela solução a ser testada (100 μΙ da solução). Depois de60 minutos de contato (a 37°C, em uma atmosfera umidificada e com 5% deCO2), o meio da reação foi removido e as células foram lavadas duas vezescom DMEM F12; 100 μΙ do meio de crescimento fresco e 10 μΙ do reagenteWST-1 foram adicionados então em cada cavidade. As células foram incu-badas outra vez por duas horas (a 37°C, em uma atmosfera umidificada ecom 5% de CO2) e as lâminas foram agitadas delicadamente por nove se-gundos; a absorvência do meio foi medida a 450 nm usando um espectrofo-tômetro apropriado (Leitor de microtítulo 550®, Bio-Rad Laboratories, Hercu-les, CA). O tempo ideal de incubação com o reagente WST-1 tinha sido de-terminado através de uma série de experiências preliminares.

A leitura espectrofotométrica foi feita contra uma cavidade "mo-delo" contendo uma mistura só do meio e de WST-1 (100 e 10 μΙ, respecti-vamente), sem células. Os resultados foram expressos como a porcentagemde absorvência das cavidades tratadas (Abstr) com respeito às cavidadesnão tratadas (controle, Absc), contendo as célula tratadas só com o meiosem nenhum produto farmacêutico, de acordo com a seguinte fórmula:

% de células vivas = Abstr χ 100

Absc

Os resultados são mostrados graficamente na Figura 7, em quea vitalidade da célula é expressa como uma porcentagem com respeito aologaritmo da concentração de AG1 quando as células foram tratadas com assoluções contendo apenas AG ou a mistura de AG+Bz. A AG não exibiu ne-nhuma citotoxicidade em todas as concentrações testadas. A adição de Bzcausou um aumento na toxicidade, acima de tudo nas concentrações maiselevadas. A presença do cloreto de benzalcônio envolve desse modo umacitotoxicidade significativa e, além disso, tal como demonstrado pelas expe-riências in vivo, também uma diminuição na atividade de repitelização deAG.

A presente invenção foi descrita com referência a algumas mo-dalidades específicas da mesma, mas deve ser compreendido que variaçõesou modificações podem ser feitas por elemento versados na técnica semque se desvie do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (18)

1. Composição oftálmica para ser usada como um substituto defluido de lágrima que tem uma atividade de proteção e repitelização, conten-do 1% a 10% em peso de arabinogalactana em uma solução aquosa, carac-terizada pelo fato de não conter cloreto de benzalcônio.

2. Composição oftálmica, de acordo com a reivindicação 1, con-tendo 3% a 5% em peso de arabinogalactana em uma solução aquosa.

3. Composição oftálmica, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que a dita arabinogalactana é arabinogalactana de lariço da classefarmaceuticamente aceitável.

4. Composição oftálmica, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 3, contendo adicionalmente um ou mais agentes de ajusteda tonicidade.

5. Composição oftálmica, de acordo com a reivindicação 4, emque um ou mais ditos agentes de ajuste da tonicidade estão presentes nasolução aquosa em uma quantidade tal que é formada uma solução com aosmolaridade entre 150 e 300 mOsm/l.

6. Composição oftálmica, de acordo com a reivindicação 5, emque um ou mais ditos agentes de ajuste da tonicidade são escolhidos dogrupo que consiste em: manitol, cloreto de sódio, cloreto de potássio, dex-trose, ácido bórico e sorbitol.

7. Composição oftálmica, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 6, contendo adicionalmente um ou mais ácidos ou basesfarmaceuticamente aceitáveis, como corretores do pH.

8. Composição oftálmica, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 7, contendo adicionalmente um ou mais tampões.

9. Composição oftálmica, de acordo com a reivindicação 8, emque os ditos tampões são escolhidos do grupo que consiste em: tampão defosfato, tampão de borato, tampão de citrato, tampão de bicarbonato, tam-pão de trizma (tri-hidroximetil-aminometano).

10. Composição oftálmica, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, contendo adicionalmente um ou mais conservantes,com exceção do cloreto de benzalcônio.

11. Composição oftálmica de acordo com a reivindicação 10, emque os ditos conservantes são escolhidos do grupo que consiste em: mertio-lato de sódio ou timerosal, nitrato ou acetato de fenilmercúrico, álcool feniletílico, metil -, etil - e propilparabeno, acetato ou gluconato de clorohexidinae clorobutanol.

12. Composição oftálmica, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11, contendo adicionalmente um ou mais agentes quelan-tes.

13. Composição oftálmica de acordo com a reivindicação 12, emque o dito agente quelante é o EDTA.

14. Uso de uma solução oftálmica contendo de 1% a 10% empeso de arabinogalactana em solução aquosa, não contendo cloreto de ben-zalcônio para a produção de um fluido substituto de lágrimas.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que a dita solu-ção oftálmica contém de 3% a 5% em peso de arabinogalactana.

16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, em que a dita solução oftálmica é um fluido substituto de lágrimas indi-cado para usuários de lentes de contato.

17.Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16,em que a dita composição oftálmica é um fluido substituto de lágrimas para otratamento de lesões e inflamações queratoconjuntivais.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, em que a dita solu-ção oftálmica é indicada para o tratamento de abrasão corneana causadapelo uso de lentes de contato.