BRPI0615066A2 - polinucleotìdeos que codificam enzimas do caminho biossintético de carotenóides e apocarotenóides em cafeeiro - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTìDEOS QUE CODIFICAM ENZIMAS DO CAMINHO BIOSSINTéTICO DE CAROTENOìDES E APOCAROTENOìDES EM CAFEEIRO. A presente invenção descreve polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que compreendem o caminho de biossíntese de carotenóides e apocarotenóides na planta de café. Também descritos são uma sequência de promotor de um gene para carotenóides em café e métodos para uso desses polinucleotídeos, polipeptídeos e sequências de promotor para regulação de genss e a manipulação de sabor, aroma e outras características de grãos de café, bem como a manipulação de fotossíntese na planta de café.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLINU-CLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM ENZIMAS DO CAMINHO BIOSSINTÉTI-CO DE CAROTENÓIDES E APOCAROTENÓIDES EM CAFEEIRO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de biotecnologia agrí-cola. Em particular, a invenção caracteriza polinucleotídeos de cafeeiro quecodificam enzimas responsáveis por síntese de carotenóide e apocarotenói-de, seqüências promotoras de genes de carotenóides do café, bem comométodos de utilizar esses polinucleotídeos, polipeptídeos, e promotores deregulação gênica e manipulação de sabor, aroma e outras características degrãos de café.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Várias publicações, incluindo patentes, pedidos publicados eartigos científicos, são citados em todo o relatório descritivo. Cada uma des-sas publicações é incorporada como referência neste relatório, em sua tota-lidade. Citações não totalmente apresentadas dentro do relatório descritivopoderão ser encontradas no final do relatório descritivo.

Aroma e sabor do café são componentes-chave na preferênciado consumidor de variedades e marcas de café. A característica de aroma esabor de caules de cafeeiro a partir de uma série complexa de reações quí-micas que envolvem precursores de sabor (reações de Maillard) que ocor-rem durante a torrefação do grão. Precursores de sabor incluem compostosquímicos e biomoléculas presentes nos grãos verdes. Até esta data, comple-tamente 800 produtos químicos e biomoléculas têm sido identificados comocontribuindo para sabor e aroma de café. (Flament, I., 2002 "Coffee FlavorChemistry" J. Wiley e outros U.K.). Porque consumidores de café estão setornando cada vez mais sofisticados, é desejável produzir café com aroma esabor aperfeiçoadps a fim de satisfazer preferências do consumidor. Tantoaroma e sabor poderão ser artificialmente proporcionados em produtos decafé através de meios químicos. Ver, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.072.761(aroma) e Pat. U.S. No. 3.962.321 (sabor). Entretanto, até esta data, há pou-ca informação envolvendo a influência de componentes naturais de grãos decafé tais como polissacarídeos, proteínas, pigmentos, e lipídeos, em aromae sabor do café. Uma abordagem é selecionar variedades do germoplasmaexistente que apresentam características superiores de sabor. Uma desvan-tagem para essa abordagem é que, freqüentemente, as variedades superio-res de qualidade também possuem características agronômicas negativassignificativas, tais como pobre rendimento e baixa resistência a doenças eestresses ambientais. É também possível selecionar novas variedades deensaios de reprodução em que variedades com diferentes característicasindustriais e agronômicas são cruzadas e suas descendências são selecio-nadas tanto de alta qualidade e bom desempenho agronômico. Entretanto,sua última abordagem é consumir muito tempo, com um experimento decruzamento e seleção por três períodos de crescimento levando um mínimode 7-8 anos. Desse modo, uma abordagem alternativa de acentuar qualida-de do café seria usar técnicas de biologia molecular para acentuar aqueleselementos responsáveis por sabor e aroma que são naturalmente encontra-dos no grão de café, ou adicionar elementos que acentuam aroma e saborque não ocorrem naturalmente em grãos de café. Engenharia genética éparticularmente adequada para obter essas finalidades. Por exemplo, proteí-nas do café de diferentes espécies de café poderão ser trocadas. Na alterna-tiva, a expressão de genes que codificam proteínas do café que ocorremnaturalmente que positivamente contribuem para sabor do café poderá seracentuada. Inversamente, a expressão de genes que codificam proteínas docafé que ocorrem naturalmente que negativamente contribuem para sabordo café poderá ser suprimida.

Cafés de diferentes variedades e origens exibem variações sig-nificativas de qualidade de sabor e aroma quando as amostras de grãos ver-des são torradas e processadas da mesma maneira. As diferenças de quali-dade são uma manifestação de variações químicas e físicas nas amostrasde grãos que resultam principalmente de diferenças em condições de cres-cimento e processamento, e também de diferenças no fundamento genéticotanto de planta maternal quanto do grão. Sob o nível de composição quími-ca, pelo menos parte da qualidade de sabor pode associar-se a variaçõesnos níveis de pequenos metabólitos, tais como açúcares, ácidos, fenólicos, ecafeína encontrados associados a grãos de diferentes variedades. Se aceitaque há outras moléculas de sabor e precursora de sabormenos bem caracterizadas. Além disso, é provável que varia-ções estruturais no grão também contribuem para diferenças na qualidadedo café. Uma abordagem para encontrar novos componentes no grão docafé ligados à qualidade dò café é estudar os genes e proteínas diferencial-mente expressas durante a maturação de amostras de grãos em diferentesvariedades que possuem diferentes características de qualidade. Similar-mente, genes e proteínas que participam na biossíntese de moléculas desabor e precursoras de sabor poderão ser estudadas.

Carotenóides é uma classe candidata de moléculas de sabor eprecursora de sabor. Carotenóides são identificados em todas as plantas,bem como em uma ampla faixa de algas, certos fungos e bactérias (Fraser eoutros, 1999). Sua estrutura de carbono 40 confere propriedades particula-res, permitindo-as absorver luz entre cerca de 400 e 500 nm. Carotenóidessão lipofílicos, uma característica que, juntamente com sua coloração torna-os sensíveis à degradação oxidativa, (Britton, 1988). Carotenóides represen-tam o grupo maior de pigmentos na natureza, com alguns 600 diferentescarotenóides identificados até a presente data (Cunningham e Grant, 1998).De fato, apocarotenóides derivados de carotenóides concebíveis constituemuma das mais amplas classes de moléculas na natureza. Alguns dos apoca-rotenóides são essenciais e constituintes valiosos de cor, sabor e aroma emplantas comestíveis (Winterhalter e Rouseff, 2002).

Em plantas, os pigmentos carotenóides são sintetizados nosplastídios. O caminho biossintético ocorre em membranas no compartimentoplastídio da célula, e os genes correspondentes são localizados no núcleo.Em cloroplastos, carotenóides acumulam-se principalmente nas membranasfotossintéticas em associação a complexos captadores de luz. Nos cromo-plastos de maturação (ripening) de frutas e pétalas menores e nos cloroplas-tos de folhas senescentes, os carotenóides poderão ser encontrados emmembranas ou em corpos oleosos tais como plastoglóbulos, ou em outrasestruturas no estroma.

O primeiro carotenóide verdadeiro é formado pela condensaçãode duas moléculas de difosfato de geranila para fitoeno (Figura 1A). Essareação é catalisada pela enzima fitoeno sintase (geranilgeranil-difosfato ge-ranililgeranil transferase PSY; EC 2.5.1.32). Fitoeno, que é não um pigmentoverdadeiro, uma vez que ele é incapaz de absorver luz sob comprimentos deondas visíveis, sofre quatro etapas de dessaturação consecutivas. As primei-ras duas etaps são realizadas pela enzima fitoene desaturase (PDS; EC1.3.99), resultando na formação de ζ-caroteno (Figura 1B) via o fitofluenointermediário (Bartley e outros, 1992; Hugueney e outros, 1992). As segun-das duas etapas são catalisadas pela enzima ζ-caroteno desaturase (ZDS;EC 1.14.99.30) para formar Iicopeno (Figura 1C) via o neurosporeno inter-mediário (Albrecht e outros, 1995). Essas etapas de desaturação exigem àpresença de uma oxidase de término plastídio (PTOX) como um co-fator(Carol e outros, 1999; Josse e outros, 2000; Josse e outros., 2003; para re-visão ver Kuntz, 2004).

PDS e ZDS produzem Iicopeno (Figura 1C), o pigmento principalencontrado em tomates vermelhos. Licopeno serve como o substrato para aformação tanto de a- e β-caroteno via duas reações de ciclização. β-caroteno (β,β-caroteno) (Figura 1D) é formado pela enzima Iicopeno β-ciclase (Ι_βΟΥ; Cunningham e outros, 1996), a qual introduz duas estruturasde anel β nas extremidades da cadeia de carbono. Essa reação também re-sulta na formação do intermediário γ-caroteno (β,ψ-caroteno) contendo umanel β e uma extremidade não-ciclizada, referida como psi (ψ). Alfa-caroteno(β,ε-caroteno) (Figura 1E) é formado pelas enzimas Iicopeno ε-ciclase(LeCY; Ronen e outros, 1999) e L^CY, as quais introduzem um anel ε e umanel β, respectivamente. A atividade de LeCY também resulta na formaçãodo intermediário δ-caroteno (ε,ψ-caroteno) que apresenta um anel ε e umaextremidade psi não-ciclizada. Em plantas tais como Lactuca sativa (alface),Le-CY introduz duas estruturas de anel ε nas extremidades da cadeia de car-bono, resultando na formação de ε-caroteno (ε,ε-caroteno; Cunningham eGantt 2001) (Figura 1F).Carotenóides oxigenados são formados por duas etapas de hi-droxilação sucessivas, β-caroteno (β,β-caroteno) é primeiro convertido emcriptoxantina e em seguida zeaxantina (3,3'-diidróxi-p,β-caroteno) (Figura1G) pela ação da enzima β-caroteno hidroxilase (βΟΗΥ; EC 1.14.13-; Sand-mann., 1994). Alfa-caroteno (β,ε-caroteno) é também duas vezes hidroxila-dos; primeiro o anel β é hidroxilado por βΟΗΥ para formar o intermediáriozienoxantina (Figura 1M), e em seguida o anel ε é hidroxilado por ε-carotenohidroxilase (εΟΗΥ) para formar luteína (diidróxi-β,ε-caroteno) (Figura 1H).εΟΗΥ foi apenas recentemente clonado (Tiân e outros, 2004; Tian e Della-Penna, 2004; para revisão ver Inoue, 2004), e um mutante deficiente de lute-ína (IutI) foi caracterizado (Pogson e outros, 1996; Tian e DeIIaPenna,2001).

Os anéis β de zeaxantina hidroxilados são epoxilados em duasetapas para fornecer anteraxantina (Figura 1J) e violaxantina (Figura 1K).Essa reação é catalisada pela enzima zeaxantina epoxidase (ZEP; Marin eoutros, 1996; Bouvier e outros, 1996). Durante estresse leve, violaxantinapode ser convertida novamente em anteraxantina e zeaxantina devido à ati-vidade de violaxantina de-epoxidase (VDE). ZEP e VDE participam no cicloxantofila, que está envolvido na adaptação de plastídios para alterar condi-ções ambientais de luz (para revisão, ver Hieber e outros, 2000).

Um outro carotenóide em plantas maiores é neoxantina (Figura1L). Neoxantina é sintetizada de violaxantina por meio de uma reação catali-sada por neoxantina sintase (NYS). NYS foi originalmente clonado de tomatee batata (Bouvier e outros, 2000; Al-Babili e outros, 2000).

Todos os substratos de carotenóide descritos acima são dispo-níveis de tanto de clivagem oxidativa quanto de enzimática resultando naformação de diversos apocarotenóides voláteis e não-voláteis. Compostosterpenóides voláteis de sabor estão geralmente presentes em plantas sobníveis relativamente baixos, mas possuem fortes efeitos sobre a apreciaçãototal humana do sabor, por exemplo, em tomates (Buttery e outros, 1971 e1987; Baldwin e outros, 1991 e 2000), cenouras (Kjeldsen e outros, 2003),marmelo (Lutz e Winterhalter, 1992), e Averrhoa carambola (Winterhalter eSchreier, 1995). Entre os compostos voláteis derivados de carotenóide maisimportantes são β-ionona, α-ionona, geranilacetona (6,10-dimetil-5,9-undecadien-2-ona), pseudoionona (6,10-dimetil-3,5,9-undecatrien-2-ona) eβ-damascenona. Alfa-ionona, β-ionona, β-ciclocitral, e β-damascenona mos-tram contribuir aproximadamente 8% da intensidade total de aroma e 78%da categoria total de aroma floral de suco de laranja Valência (Mahattanata-wee e outros, 2005). β-damascenona também contribui para o aroma de su-co de toranja (Lin e outros, 2002).

Níveis de pico de emissões de β-ionona e geranilacetona de fru-to de tomate maduro foram calculados ser 1,25 pg/g fw"1 h"1 e 40 pg/g fw"1 h,"respectivamente. Embora β-ionona e geranilacetona sejam encontradasem baixas concentrações quando comparadas com outros voláteis mais a-bundantes tais como cis-3-hexenal e hexenal, as quais são detectadas sobníveis de 10.000 vezes mais, β-ionona e geranilacetona apresentam limiaresde odor de 0,007 nlVL"1 e 60 η L/L"1, respectivamente (Baldwin e outros,2000). Esses limiares de odor são significativamente menores que observa-dos por muitos dos outros voláteis mais abundantes. Desse modo, voláteisderivados de carotenóide apresentam o potencial para grandiosamente im-pactar aroma e sabor sob baixas concentrações, β-ionona é considerada sero segundo contribuinte volátil mais importante para sabor do fruto de tomate(Baldwin e outros, 2000).

As vias biossintéticas que levam à formação de apocarotenóidepermanecem obscuras. Com base em suas estruturas químicas e estudosde produção volátil em variedades de tomates com acúmulo extraordináriode carotenóide, Buttery e outros (1988) predizem que esses compostos sãoprovavelmente derivados de clivagem oxidativa de carotenóide. Em anosrecentes, uma família dioxigenases de clivagem de carotenóide(CCDs) que cliva substratos de carotenóide sob uma variedadede ligações duplas é

identificada (para revisão ver Bouvier e outros, 2005). O primeiromembro da família a ser identificado foi VP14 de Arabidopsis thaliana, uma9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase envolvida na síntese de xantoxina (Figu-ra 1Ν), o precursor do ácido abscísico fito-hormônio (ABA; Tan e outros,1997). ABA controla crescimento embrionário potencial e enfraquecimentomecânico do endosperma durante germinação de sementes do café (da Sil-va e outros, 2004).

Outros membros da família dioxigenase, incluindo uma dioxige-nase de clivagem de carotenóide Arabidopsis, AtCCDI, que simetricamentecliva as ligações duplas 9,10(9', 10') de substratos múltiplos de carotenóidepara um Ci4 dialdeído e dois derivados de Ci3 cicloexona in vitro são identifi-cados (Schwartz e outros, 2001). Ortólogos de AtCCDI são encontrados emuma variedade de espécies, incluindo Phaseolus vulgaris (Schwartz e ou-tros, 2001), Capsicum annuum (Bouvier e outros, 2003a), Crocus sativus(Bouvier e outros, 2003a) e Petunia hybrida (Simkin e outros, 2004a). Maisrecentemente, Simkin e outros (2004b) demonstraram em plantas de tomatetransgênicas que enzimas CCD1 são responsáveis pela formação de umavariedade de Ci3 cicloexonas in vivo. As relações potenciais entre esses vo-láteis e seus precursores de carotenóides são mostradas na Figura 2. Caro-tenóide clivada na ligação 9,10(9', 10") resulta na formação do apocarotenói-de correspondente. Porque enzimas CCD1 apresentam especificidades declivagem 9,10(9', 10"), produtos específicos seriam gerados com base noprecursor de carotenóide que está presente. AtCCDI e seus ortólogos detomate são responsáveis pela formação de geranilacetona e α-ionona (Sch-wartz e outros, 2001; Simkin e outros, 2004a e 2004b) e provavelmente β-damascenona (Suzuki e outros, 2002). Schwartz e outros (2001) e Simkin eoutros (2004b) mostraram que CCDIs foram também capazes de formarvários outros voláteis derivados de carotenóides importantes.

Schwartz e outros (2001) e Simkin e outros (2004b) purificaramenzima AtCCDI e LeCCDIA recombinantes, respectivamente, e ensaiaramsubstratos múltiplos de carotenóide in vitro. Os produtos de ensaio foramcaracterizados por cromatografia de camada delgada e HPLC. Em ensaioscontendo β-caroteno, zeaxantina, luteína, violaxantina e neoxantina, o produ-to de clivagem central Ci4 dialdeído (4,9-dimetildodeca-2,4,6,8,10-pentaeno-1,12-dial; I) o composto principal resultante de clivagem simétrica nas posi-ções 9,10 e 9', 10' (ver Figura 2). Em ensaios contendo β-caroteno, zeaxanti-na e licopeno, β-ionona (9-apo-p-caroten-9-ona; II), 3-hidróxi-p-ionona (3-hidróxi-9-apo-p-caroten-9-ona; III) e pseudoionona (V) foram formados, res-pectivamente, visto que α-caroteno levou à produção tanto de β-ionona (II)quanto de α-ionona (VI), enquanto δ-caroteno levou a α-ionona (9-apo-a-caroten-9-ona; VI) e pseudoionona (6,10-dimetil-3,5,9-undecatrien-2-ona; V).Em ensaios contendo violaxantina ou neoxantína, formou-se

5'6-epóxi-3-hidróxi-p-ionona (5,6-epóxi-3-hidróxi-9-apo-p-caroten-9-ona; IV). Clivagem assimétrica também levou à formação de umC27 epóxi-apocarotenal com esses substratos. Diversos carotenóides linea-res, incluindo fitoeno e ζ-caroteno pensam-se ser os precursores de gerani-Iacetona (6,10-dimetil-5,9-undecatrien-2-ona; VII), um sabor importante volá-til em fruto de tomate, e precursores de um segundo Ci4 dialdeído (4,9-dimetildodeca-4,6,8-triendial; XI).

Em ensaios contendo neoxantína, a clivagem assimétrica tam-bém levou à formação de um C27 alênico-âpocarotenal e a cetona C13 gras-shopper (3,5-diidróxi-6,7-dideidro-9-apo-p-caroten-9-ona; VIII) (ver Figura3a). A cetona denominada grasshopper é postulada ser o precursor para aformação de β-damascenona (IX) e 3-hidróxi-p-damascenona (X; Suzuki eoutros, 2002). Em ensaios contendo luteína como substrato, clivagem simé-trica nas posições 9,10 e 9', 10' leva à formação tanto de 3-hidróxi-p-ionona(VI) quanto de 3-hidróxi-a-ionona.

Adicionalmente, Bouvier e outros (2003b) identificaram uma dio-xigenase de clivagem 7,8(7',8') específica a zeaxantina (CsZCD) de Crocussativus que codifica uma enzima capaz de formação de crocetina dialdeído(XII) e 3-hidróxi-p-ciclocitral in vitro (XIII; ver Figura 3b). Sabe-se que croce-tina dialdeído acumula nas flores de Jacquinia angustifolia (Eugster e outros,1969) e nas raízes de Coleus forskohlii (Tandon e outros, 1979). Acredita-seque 3-hidróxi-p-ciclocitral seja a primeira etapa comprometida na formaçãode safranal, um constituinte do açafrão de tempero (spice saffron) em C. sa-tivus (Bouvier e outros, 2003a). A clivagem de β-caroteno 7,8(7',8') por umortólogo de tomate ZCD é suspeito de ser responsável pela formação de β-ciclocitral, contribuindo para aroma de tomate. Bouvier e outros (2003b)também identificaram uma dioxigenase de clivagem 5,6(5',6') específica aIicopeno (BoLCD) de Bixa orellana (ver Figura 3c), responsável pela forma-ção de bixina dialdeído (XIV) e um produto de clivagem C7 anteriormenteidentificado como 6-metil-5-hepten-2-ona (MHO; XV; Fay e outros, 2003).Bixina dialdeído é o precursor para a formação do corante bixina/urucum.MHO foi identificado como um contribuidor importante para sabor de tomate(Buttery e outros, 1990; Baldwin e outros, 2000).

Apesar mesmo conhecimento extensivo, pouco trabalho tem si-do feito para caracterizar tais moléculas voláteis em café verde e torrado.Café torrado e não-torrado mostram conter dois componentes de sabor deri-vados de carotenóides, α-ionona e β-damascenona (Czerny e outros, 2000;Akiyama e outros, 2003; Variyar e outros, 2003). O último componente foiidentificado como um componente principal de café tanto antes quanto apóstorrefação (Ortiz e outros, 2004). Esses e outros compostos voláteis deriva-dos de carotenóide, devido a seu baixo limiar de odor, exigem apenas pe-quenas quantidades para causar uma alteração no aroma.

A partir da discussão precedente, entender-se-á que modularteor de carotenóide e apocarotenóide em grão de café geneticamente modu-lando a produção das proteínas responsáveis por biossíntese de carotenóidee apocarotenóide seria de grande utilidade para acentuar o aroma e saborde bebidas de café e produtos de café produzidos de tais grãos de café ge-neticamente enginheirados. Teor acentuado de carotenóide e apocarotenói-de no grão de café poderá também positivamente contribuir para a saúdetotal e bem-estar de consumidores de bebidas e produtos de café produzi-dos de tais grãos de café. Além disso, modulação de teor do carotenóide eapocarotenóide no cafeeiro tem implicações de otimizar fotossíntese emcondições de luz de sol em excesso ou insuficiente. Conseqüentemente,existe uma necessidade de identificar, isolar e utilizar genes e enzimas decafé que são envolvidas na biossíntese de carotenóides e apocarotenóides.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção descrita neste relatório caracteriza genes que codifi-cam enzimas responsáveis por biossíntese de carotenóide e apocarotenóideem cafeeiro, seus polipeptídeos codificados, seqüências de promotor de ge-nes de enzima de caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide, emétodos de usar esses polinucleotídeos, polipeptídeos e promotores de re-gulação e manipulação gênica de sabor, aroma e outras características degrãos de café.

Um aspecto da invenção caracteriza uma molécula de ácido nu-cléico isolada de café (Coffea spp.), apresentando uma seqüência de codifi-cação que codifica uma enzima de caminho biossintético de carotenóide ouapocarotenóide. Em uma modalidade, a enzima é uma fitoeno sintase que épelo menos 76% idêntica a ID SEQ NO: 13. Em uma outra modalidade, aenzima é uma fitoeno desaturase que é pelo menos 76% idêntica a ID SEQNO: 14. Em uma outra modalidade, a enzima é uma oxidase de término plas-tídio que é pelo menos 61% idêntica a ID SEQ NO:15. Em uma outra moda-lidade, a enzima é uma β-caroteno hidroxilase que é pelo menos 73% idênti-ca a ID SEQ NO: 16. Em uma outra modalidade, a enzima é uma Iicopeno ε-ciclase que é pelo menos 86% idêntica a ID SEQ NO: 17. Em uma outra mo-dalidade, a enzima é uma zeaxantina epoxidase que é pelo menos 26% i-dêntica a ID SEQ NO: 18. Em uma outra modalidade, a enzima é uma viola-xantina de-epoxidase que é pelo menos 74% idêntica a ID SEQ NO:19. Emuma outra modalidade, a enzima é uma 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenaseque é pelo menos 75% idêntica a ID SEQ N0:20. Em uma outra modalidade,a enzima é uma dioxigenase de clivagem de carotenóide que é pelo menos83% idêntica a ID SEQ NO:21. Em uma outra modalidade, a enzima é umafibrilina que é pelo menos 72% idêntica a ID SEQ NO:22. Em uma outra mo-dalidade, a enzima é uma enzima tal como fitoeno deidrogenase que é pelomenos 72% idêntica a ID SEQ NO:23. Em uma outra modalidade, a enzimaé uma zeta-caroteno desaturase que é pelo menos 82% idêntica a ID SEQNO:24.

Em certas modalidades, a molécula de ácido nucléico é um ge-ne que apresenta um quadro de leitura aberta que compreende a seqüênciade codificação. Alternativamente, ela poderá compreender uma molécula demRNA produzida por meio de transcrição desse gene, ou uma molécula decDNA produzida por transcrição inversa da molécula de mRNA. A invençãotambém caracteriza um oligonucleotídeo entre 8 e 100 bases no comprimen-to, que é complementar a um segmento da molécula de ácido nucléico aci-ma mencionada.

Um outro aspecto da invenção caracteriza um vetor que com-preende as moléculas de ácido nucléico que codificam a enzima de caminhobiossintético carotenóide ou apocarotenóide acima descrita. Em certas mo-dalidades, o vetor é um vetor de expressão selecionado do grupo de vetoresque consiste de plasmídeo, fagemídeo, cosmídeo, baculovírus, bacmídeo,bacteriano, lêvedo e vetores virais. Em certas modalidades, o vetor contém aseqüência de codificação da molécula de ácido nucléico operavelmente liga-da a um promotor constitutivo. Em outras modalidades, a seqüência de codi-ficação é operavelmente ligada a um promoter induzível (inducible). Em ou-tras modalidades, a seqüência de codificação da molécula de ácido nucléicoé operavelmente ligada a um tecido promotor específico, tal como um pro-motor específico à semente, preferencialmente um promotor específico àsemente de café. Em modalidades específicas, o promotor específico a teci-do é um promotor gênico de enzima de caminho biossintético de carotenóide20 ou apocarotenóide do café, tal como o promotor contido em ID SEQ NO:25.

De acordo com um outro aspecto da invenção, proporciona-seuma célula hospedeira transformada com o vetor acima mencionado. A célu-la hospedeira poderá ser

uma célula de planta, bacteriana, fúngica, de inseto ou de mamí-fero. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de plantaselecionada de qualquer um de: café, tabaco, Arabidopse, milho, trigo, arroz,cevada de soja, (soybean barley), centeio, aveia, sorgo, alfafa, trevo, canola,açafroa, girassol, amendoim, cacau, tomate tomatillo, batata, pimenta, berin-jela, beterraba sacarina, cenoura, pepino, alface, ervilha, áster, begônia, cri-sântemo, delfínio, zínia e turfgrasses. A invenção também caracteriza umaplanta transgênica fértil produzida por meio de regeneração dacélula planta transformada.Em uma modalidade específica, a planta transgênica fértil é umaespécie Coffea.

Um outro aspecto da invenção caracteriza um método de modu-lar sabor ou aroma de grãos de café. O método compreende conpreendemodular produção de uma ou mais enzimas de caminho biossintético de ca-rotenóide ou apocarotenóide em sementes de café. Em algumas modalida-des, o método compreende aumentar produção das uma ou mais enzimasde caminho biossintético carotenóide ou apocarotenóide, por exemplo, au-mentanto expressão de um ou mais genes endógenos que codificam enzi-mas de caminho biossintético carotenóide ou apocarotenóide nas sementesde café, ou introduzindo um transgene que codifica enzima de caminho bios-sintético carotenóide ou apocarotenóide para a planta. Em outras modalida-des, o método compreende diminuir produção das uma ou mais enzimas decaminho biossintético carotenóide ou apocarotenóide, por exemplo, introdu-zindo uma molécula de ácido nucléico no café que inibe a expressão de umou mais dos genes que codificam enzima de caminho biossintético carote-nóide ou apocarotenóide.

Um outro aspecto da invenção caracteriza um método de modu-lar fotossíntese em uma planta, especialmente em condições de luz em ex-cesso ou insuficiente, método este que compreende modular produção deum ou mais polipeptídeos que compreende o caminho biossintético carote-nóide ou apocarotenóide em sementes de café. Esse método compreendeaumentar produção de uma ou mais enzimas de caminho biossintético caro-tenóide ou apocarotenóide na planta, por exemplo, aumentando expressãode um ou mais genes endógenos que codificam enzima de caminho biossin-tético carotenóide ou apocarotenóide nas sementes de café, ou introduzindoum transgene que codifica enzima de caminho biossintético carotenóide ouapocarotenóide para a planta.

De acordo com um outro aspecto da invenção, proporciona-seum promotor isolado de um gene de cafeeiro que codifica enzima de cami-nho biossintético carotenóide ou apocarotenóide. Em certas modalidades, ogene de café que codifica enzima de caminho biossintético carotenóide ouapocarotenóide codifica uma enzima de caminho biossintético carotenóideou apocarotenóide que apresenta uma ou mais das características descritasacima. Em certas modalidades, o promotor compreende uma ou mais se-qüências reguladoras selecionadas do grupo que consiste de uma caixa(box) TATA, um elemento responsivo de ácido abscísico, uma repetição RY(CATGCA(T/a)(A/g) de uma caixa (box) de Ieguminina para regular expres-são de proteínas tipo leguminina, pelo menos um elemento responsivo dedesidraçãoImotif de seqüência de ação eis de repetição C (G/ACCGAC) epelo menos um motif de caixa E (E-box motif) (CANNTG). Em uma modali-dade específica, o promotor compreende ID SEQ NO: 25.

A invenção também caracteriza um gene quimérico que com-preende um promotor de um gene de café que codifica enzima de caminhobiossintético carotenóide ou apocarotenóide, operavelmente ligado a uma oumais seqüências de codificação. Um vetor para transformar uma célula, oqual compreende o gene quimérico, é também proporcionado, bem comocélulas transformadas com o vetor e plantas transgênicas férteis produzidaspor meio de regeneração de uma célula de planta transformada com o vetor.

Outras características e vantagens da presente invenção serãoentendidas a partir das figuras, descrição detalhada e exemplos que se-guem.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

Figura 1. Inspeção geral da biossíntese de isoprenóides em plastídios.

Diagrama esquemático do caminho biossintético para carotenóides de plan-tas. Abreviações usadas são como seguem: PSY: Fitoeno sintase. PDS: fi-toeno desaturase ZDS: ζ-caroteno desaturase. PTOX: oxidase de términoplastídio. LpCY: Iicopeno β-ciclase. LeCY: Iicopeno ε-ciclase. βΟΗΥ: β-caroteno hidroxilase. eCHY: ε-caroteno hidroxilase. ZEP: zeaxantino epoxi-dase. VDE: violaxantino de-epoxidase. NYS: neoxantino sintase. CCD1: dio-xigenase de clivagem de carotenóide 1. FIB: CCD4: dioxigenase de clivagemde carotenóide 4. Fibrilina. NCED3: 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase.PDHY: fitoeno tal como deidrogenase.

Figura 2. Esquema para as reações catalisadas por proteínas CCD1. Ossubstratos de carotenóide (esquerda) quando clivados nas posições 9,10 e9', 10' (indicadas por linha pontilhada) produziria dois monoaldeídos e umproduto central de dialdeído. I, 4,9-dimetildodeca-2,4,6,8,10-penteno-1,12-dial (Ci4 dialdeído). II, 9-apo-p-caroten-9-ona (β-ionona). III, 3-hidróxi-9-apo-p-caroten-9-ona (3-hidróxi-p-ionona). IV, 3-hidróxi-5,6-epoxi-9-apo-p-caroten-9-ona (3-hidróxi-5'6-epóxi-p-ionona). V, 6,10-dimetil-3,5,9-undecatrien-2-ona(pseudoionona).VI, 9-apo-a-caroten-9-ona (cnonona). VII, 6,10-dimetil-5,9-undecatrien-2-ona (geranilacetona).

Figura 3. Diagrama esquemático para formação de compostos aromáti-cos

catalisados por CCD. A) Neoxantina é clivada para formar VIII, (SS.õfí.ef?)-3,5-diidróxi-6,7-dideidro-5,6-diidro-9-apo-p-caroten-9-ona cetona grasshop-per, Schwartz e outros, 2001) através da 9,10(9'10) clivagem de dioxigenaseCCD1. A cetona grasshopper é a precursora para a formação de IX, β-damascenona e X, 3-hidróxi-p-damascenona (Suzuki e outros, 2002). B)CsZCD é uma 7,8(7'8) clivageem de dioxigenase resultante na formação de3-hidróxi-p-ciclocitral a partir de zeaxantina. C) BoLCD é um Iicopeno especí-fico 5,6(5'6) clivagem de dioxigenase resultante na formação do produto declivagem C7 anteriormente identificado como 6-metil-5-hepten-2-ona (MHO).

Figura 4. Alinhamento ótimo de seqüências de proteína Coffea cane-phora com

as seqüências mais próximas de banco de dados. A) CcPSY (ID SEQNO.:13) alinhada com AtPSY (ID SEQ NO.: 94), LePSYI (ID SEQ NO.: 95),e CaPSYl (ID SEQ NO.: 96); B) CcPDS (ID SEQ NO.: 14) alinhada comAtPDS (ID SEQ NO.: 97), LePDS (ID SEQ NO.: 98), e CaPDS (ID SEQ NO.:99); C) CcZDS (ID SEQ NO.: 24) alinhada com AtZDS (ID SEQ N0.:100),CaZDS (ID SEQ N0.:101), e LeZDS (ID SEQ N0.:102); D) CcPTOX (IDSEQ NO.: 15) alinhada com AtPTOX (ID SEQ N0.:103), CaPTOX (ID SEQNO.: 104), e CaPTOX (ID SEQ N0.:105); E) CcpCHY (ID SEQ N0.:16) ali-nhada com AtpCHY (ID SEQ N0.:106), e LepCHY (ID SEQ N0.:107); F)CcLeCY (ID SEQ N0.:17) alinhada com LsLeCY (ID SEQ N0.:108), e Te-LsCY (ID SEQ N0.:108); G) CcZEP (ID SEQ N0.:18) alinhada com LeZEP(ID SEQ Ν0.:109), PdZEP (ID SEQ Ν0.:110), OsZEP (ID SEQ Ν0.:111), eAtZEP (ID SEQ Ν0.:112); Η) CcVDE (ID SEQ Ν0.:19) alinhada com AtVDE(ID SEQ Ν0.:113), OsVDE (ID SEQ Ν0.:114), e NtVDE (ID SEQ Ν0.:115); I)CcNCED3 (ID SEQ Ν0.:20) alinhada com AtNCED3 (ID SEQ Ν0.:116),AtNCED5 (ID SEQ Ν0.:117), LeNCEDI (ID SEQ Ν0.:118), StNCEDI (IDSEQ ΝΟ.:119), e VvNCEDI (ID SEQ Ν0.:120);ϋ) CcCCDI (ID SEQ Ν0.:21)alinhada com PhCCDI (ID SEQ Ν0.:121), LeCCDIB (ID SEQ ΝΟ.:122),LeCCDIA (ID SEQ ΝΟ.:123), e AtCCDI (ID SEQ NO.:124); e Κ) CcFIB (IDSEQ ΝΟ.:22) alinhada com AtFIBIb (ID SEQ ΝΟ.:125), AtFIBIa (ID SEQΝΟ.:126), CaFIB (ID SEQ NO.: 127), e LeFIB (ID SEQ ΝΟ.:128). Os alinha-mentos foram gerados com o programa clustal\N no pacote de software La-sergene (DNASTAR) e em seguida ajustado manualmente para otimizar oalinhamento.

Figura 5. Expressão de genes biossintéticos de carotenóides e apoca-rotenóides durante maturação de sementes: Comparação entre Robus-ta FRT-05 e Arábica T2308. Níveis de transcritos para A) PSY, B) PDS, C)ZDS, D) PTOX, E) LeCY, F) βΟΗΥ, G) ZEP, H) VDE, J) CCD1, K) NCED3 eL) FIB1, no grão de C. canephora, (FRT05; barras escuras) e C. arabica(T2308; barras cinzas). Os níveis de expressão são determinados em rela-ção à expressão de transcritos do gene RPL39 constitutivamente expressosnas mesmas amostras. SG, grãos pequenos verdes; LG, grãos maiores; YG,grão amarelo; RG, grãos maduros.

Figura 6. Expressão de transcritos de CCD1 durante desen-volvimento de sementes e atividade de CcCCDI em E. Coli.

A) Níveis de transcritos de CCD1 no grão de três genótipos deC. canephora, (BP409, FRT05, FRT64; barras escuras) e C. arabica (T2308;barras cinzas) determinados por RCP quantitativa. Transcrição inversa foirealizada com quantidades iguais de RNA total. SG1 grãos pequenos verdes;LG, grãos maiores; YG, grãos amarelos; RG, grãos maduros.

B) Atividade de CCD1 após superexpressão em E. coli anterior-mente engenheirada para acumular licopeno, β-caroteno ou zeaxantina. NI,não-induzido; I, induzido.C) Caracterização por HPLC de linhagens Lyc1 β-C e Zea antese após indução. A seta indica que a perda do pico carotenóide após induçãode CCD1. Astaxantina (©) foi adicionada a amostras e usadas para normali-zar resultados.

Figura 7. Atividade de βΟΗΥ em E. coli anteriormente engenheirado pa-ra acumular β-caroteno ou zeaxantina. A) linhagens de E. coli engenhei-radas para acumular β-caroteno ou zeáxantina transformadas compDESTI 7-CcpCHY antes (NI); ou após (I), indução. B) Caracterização porHPLC de β-caroteno produzindo linhagens celulares antes e após indução.β-C, β-caroteno; zea, zeaxantina.

Figura 8. Análise por HPLC de grão verde e vermelho de Coffea can-phora e C. arabica. Perfis de absorvência em 450 nm. Picos são: (1) neo-xantina, (2) violaxantina, (3) luteína, (4) a-caroteno, (5) β-caroteno, (a) cloro-fila A, (b) clorofila B. Astaxantina (©) foi adicionada antes de extração e usa-da para normalizar resultados. Verde = grão de estágio amplo pericarpo ver-de (LG). Vermelho = grão de estágio pericarpo maduro vermelho (RG).

Figura 9. Análise por HPLC de folhas maduras de Coffea arabica, C. ca-nephora e Arabidopsis thaiiana. Absorvência foi monitorada sob 450nm.

Amostras de 60 mg foram extraídas conforme descritas em materiais e mé-todos. Picos são: (1) neoxantina, (2) violaxantina, (3) luteína, (4) a-caroteno,(5) β-caroteno, (a) clorofila A, (b) clorofila B. Astaxantina (©) foi adicionada aamostras de café antes de extração e usadas para normalizar resultados.Figura 10. Expressão de genes biossintéticos de carotenóide e genesdioxigenase de clivagem de carotenóide nas folhas dé Coffea arabica(catimor) sob estresse seco. Níveis transcritos de PSY, PDS, ZDS1 PTOX,LeCY, βΟΗΥ, ZEP, VDE, CCD1, NCED3 e FIB1 foram determinados por RT-RCP quantitativa. Expressão foi determinada em relação à expressão detranscritos do gene RPL39 constitutivamente expresso nas mesmas amos-tras. As barras escuras em cada caso representam os níveis médios detranscrição em dois controles hídricos. Níveis transcritos em duas plantasindependentes de estresse hídrico são mostrados em barras cinzas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVASDefinições:

Vários termos em relação às moléculas biológicas e outros as-pectos da presente invenção são usados em todo o relatório descritivo e rei-vindicações.

O termo "caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide" refere-se apolipeptídeos que participam em biossíntese de carotenóide ou apocarote-nóide em plantas, e mais especificamente, em cafeeiro. Esse termo abrangeo mecanismo de ação específico de cada respectiva proteína no caminho,incluindo a derivação mediada por enzima de apocarotenóides a partir decarotenóides. Os polipeptídeos incluem mas sem se limitar aos mesmos,fitoeno sintase, fitoeno desaturase, ζ-caroteno desaturase, oxidase de térmi-no plastídio, Iicopeno β-ciclase, Iicopeno ε-ciclase, β-caroteno hidroxilase, ε-caroteno hidroxilase, zeaxantino epoxidase, violaxantino de-epoxidase, neo-xantino sintase, dioxigenase de clivagem de carotenóide 1, dioxigenase declivagem de carotenóide 4, Fibrilina 9-cis-epoxiarotenóide dioxigenase, fitoe-no deidrogenase, e similares, conforme exemplificados neste relatório."Isolada" significa alterada "pela mão do homem" a partir do estado natural.Se uma composição ou substância ocorre na natureza, ela foi "isolada" seela foi alterada ou removida de seu ambiente original, ou ambos. Por exem-pio, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente na plantaou animal vivo não é "isolado," mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptí-deo separado dos materiais co-existentes de seu estado natural é "isolado",como o termo é empregado neste relatório.

"Polinucleotídeo," também se refere como a "molécula de ácidonucléico", geralmente refere-se a qualquer polirribonucleotídeo ou polideso-xirribonucleotídeo, o qual poderá ser RNA ou DNA não-modificado ou RNAou DNA modificado. "Polinucleotídeos" incluem, sem limitação DNA de fitaúnica e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita única e dupla, RNAde fita única e dupla, e RNA que é mistura de regiões de fita única e dupla,moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que poderão ser de fitaúnica ou, mais tipicamente, fita dupla ou uma mistura de regiões de fita únicae dupla. Além disso, "polinucleotídeo" refere-se a regiões de fita tríplice quecompreendem RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. O termo polinucleo-tídeo também inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modifica-das e DNAs ou RNAs com estruturas modificadas para estabilidade ou emrelação a outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, basestritiladas e bases incomuns tal como inosina. Uma variedade de modifica-ções pode ser feita para DNA e RNA; desse modo, "polinucleotídeo" abran-ge química, enzimatica ou metabolicamente formas modificadas de polinu-cleotídeos conforme tipicamente encontradas na natureza, bem como asformas químicas de características de DNA e RNA de vírus e células. "Poli-nucleotídeo" também abrange polinucleotídeos relativamente curtos, fre-qüentemente referidos como oligonucleotídeos.

"Polipeptídeo" refere-se a qualquer peptídeo ou proteína quecompreende dois ou mais aminoácidos unidos uns com os outros através deligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isostéres pep-tídicos. "Polipeptídeo" refere-se tanto a cadeias curtas, comumente referidascomo peptídeos, oligopeptídeos ou oligômeros, quanto a cadeias longas,geralmente referidas como proteínas. Polipeptídeos poderão conter aminoá-cidos de outra maneira os 20 aminoácidos codificados por gene. "Polipeptí-deos" incluem seqüências de aminoácidos modificados por processos natu-rais, tais como técnicas de processamento pós-translacional, ou modificaçãoquímica que são bem conhecidas no estado da técnica. Essas modificaçõessão bem descritas em textos básicos e em maiores detalhes monografias,bem como em uma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podemocorrer em qualquer parte em um polipeptídeo, incluindo a estrutura peptídi-ca, as cadeias laterais de aminoácidos e os términos amino ou carboxila.

Entender-se-á que o mesmo tipo de modificação poderá estar presente nosmesmos ou variáveis graus sob vários sítios em um dado polipeptídeo.Também, um dado polipeptídeo poderá conter muitos tipos de modificações.Polipeptídeos poderão ser ramificados como um resultado de ubiquitinação,e eles poderão ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicosramificados e ramificados cíclicos poderão resultar de processos pós-translacionais naturais ou poderão ser produzidos por métodos sintéticos.Modificações incluem acetilação, acilação, ribosilação ADP, amidação, liga-ção covalente de flavina, ligação covalente e uma metade heme, ligação co-valente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente deum lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinossitol,reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfeto, demetilação, forma-ção de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de pirogluta-mato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora deGPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamen-to proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatiza-ção, adição de aminoácidos mediados por transfer-RNA a proteínas tais co-mo arginilação e ubiquitinação. Ver, por exemplo, Proteins - Structure andMolecular Properties (Proteínas - Propriedades Estruturais e Moleculares),2-. Ed., Τ. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova Iorque, 1993 eWold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Pros-pects, páginas 1-12 em Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, 1983; Seifter e outros,Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors, Meth. Enzymol.(1990) 182:626-646 e Rattan e outros, Protein Synthesis: PosttranslationalModifications and Aging, Ann. NY Acad. Sei. (1992) 663:48-62."Variante" como o termo é usado neste relatório descritivo, é um polinucleo-tídeo ou polipeptídeo que difere de um polinucleotídeo ou polipeptídeo dereferência, respectivamente, mas retém propriedades essenciais. Um varian-te típico de um polinucleotídeo difere na seqüência de nucleotídeo um dooutro, polinucleotídeo de referência. Alterações nas seqüências de nucleotí-deos do variante poderão ou não alterar a seqüência de aminoácidos de umpolipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Alterações de nu-cleotídeos poderão resultar em substituições de aminoácidos, adições, dele-ções, fusões e truncações no polipeptídeo codificado pela seqüência de refe-rência, conforme discutido abaixo. Um variante típico de um polipeptídeodifere na seqüência de aminoácido um do outro, polipetídeo de referência.Geralmente, diferenças são limitadas de modo que as seqüências do polipe-tídeo de referência e o variante sejam estritamente similares a toda e, emmuitas regiões, idênticas. Um variante e polipeptídeo de referência poderãodiferir-se na seqüência de aminoácidos por uma ou mais substituições, adi-ções, deleções, fusões ou truncações em qualquer combinação. Um resíduoaminoácido substituído ou inserido poderá ou não poderá ser um codificadopelo código genético. Um variante de um polinucleotídeo ou polipeptídeopoderá ser que ocorre naturalmente, tal como um variante alélico, ou poderáser um variante que não é sabido ocorrer naturalmente. Variantes de polinu-cleotídeos e polipeptídeos que não ocorrem naturalmente poderão ser pro-duzidos por técnicas de mutagêneses ou por síntese direta.Em referência a plantas mutantes, os termos-"mutante nulo" ou "mutante deperda- de-função" são usados para designar uma seqüência de organismoou DNA genômico com uma mutação que motiva um produto gênico a sernão-funcional ou amplamente ausente. Tais mutações poderão ocorrer nasregiões de codificação e/ou reguladoras do gene, e poderão ser alteraçõesde resíduos individuais, ou inserções ou deleções de regiões de ácidos nu-cléicos. Essas mutações poderão também ocorrer nas regiões de codifica-ção e/ou reguladoras de outros genes, que poderão regular ou controlar umgene e/ou proteína codificada, a fim de motivar a proteína a ser não-funcional ou amplamente ausente.O termo "substancialmente as mesmas" refere-se a seqüências de ácidonucléico ou aminoácidos que apresentam variações na seqüência que nãomaterialmente afetam a natureza da proteína (isto é, a estrutura, caracterís-ticas de estabilidade, especificidade de substrato e/ou atividade biológica daproteína). Com referência particular a seqüências de ácidos nucléicos, otermo "substancialmente a mesma" pretende referir-se à região de codifica-ção e a seqüências conservadas que governam expressão, e refere-se prin-cipalmente a degenerar códons que codificam o mesmo aminoácido, ou al-ternar códons que codificam aminoácidos conservativos substitutos no poli-peptídeo codificado. Com referência a seqüências de aminoácidos, o termo"substancialmente as mesmas" refere-se geralmente a substituições conser-vativas e/ou variações em regiões do polipeptídeo não envolvidas na deter-minação de estrutura ou função.Os termos "percentagem idêntica" e "percentagem similar" são também usa-dos neste relatório em comparações entre seqüências de aminoácidos e á-cidos nucléicos. Quando se referindo a seqüências de aminoácidos, "identi-dade" ou "percentagem idêntica" refere-se à porcentagem dos aminoácidosda seqüência de aminoácidos em questão que são emparelhadas a aminoá-cidos idênticos na seqüência de aminoácidos compareda por um programade análise de seqüência. "Percentagem similar" refere-se à percentagemdos aminoácidos da seqüência de aminoácidos em questão que são empa-relhados a aminoácidos idênticos ou conservados. Aminoácidos conserva-dos são aqueles que diferem na estrutura mas são similares as propriedadesfísicas tal que a troca de um para outro não preciavelmente alteraria a estru-tura terciária da proteína resultante. Substituições conservativas são defini-das in Taylor (1986, J. Theor. BioL 119:205). Quando se refere a moléculasde ácidos nucléicos, "percentagem idêntica" refere-se à percentagem dosnucleotídeos da seqüência de ácidos nucléicos em questão que são empare-lhados a nucleotídeos idênticos por meio de um programa de análise de se-qüência.

"Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas por méto-dos conhecidos. Seqüências de ácidos nucléicos e seqüências de aminoáci-dos podem ser comparadas usando programas de computador que alinhamas seqüências similares dos ácidos nucléicos ou aminoácidos e assim defi-nem as diferenças. Em metodologias preferidas, os programas BLAST (NC-Bl) e parâmetros usados a esse respeito são empregados, e o sistemaDNAstar (Madison, Wl) é usado para alinhar fragmentos de seqüenciais deseqüências de DNA genômico. Entretanto, alinhamentos equivalentes e ava-liações de similaridade/identidade podem ser obtidos através do uso dequalquer software de alinhamento padrão. Por exemplo, o Pacote GCG Wis-consin versão 9.1, disponível do Genetics Computer Group in Madison, Wis-consin, dos parâmetros de falha usados (gap creation penalty= 12, gap ex-tension penalty = 4) por esse programa poderá também ser usado paracomparar identidade e similaridade de seqüências.

"Anticorpos" conforme usados nèste relatório incluem anticorpos policlonaise monoclonais, quiméricos, de cadeia simples e anticorpos humanizados,bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2 e Fv),incluindo os produtos de um Fab ou outras bibliotecas de expressão de imu-noglobulina. Com relação a anticorpos, o termo, "imunologicamente especí-fico" ou "específico" refere-se a anticorpos que se ligam a um ou mais epíto-pos de uma proteína de interesse, mas que não substancialmente reconhe-cem e se ligam a outras moléculas em uma ámostra contendo uma popula-ção mista de moléculas de moléculas biológicas antigênicas. Ensaios de tri-agem para determinar especificidade de ligação de um anticorpo são bemconhecidos e rotineiramente praticadas no estado da técnica. Para uma dis-cussão compreensiva desses ensaios, ver Harlow e outros (Eds.), Antibodi-es A Laboratory Manual-, Cold Spring Harbor Laiboratory, Cold Spring Har-bor, NY (1988), Capítulo 6.

O termo "substancialmente puro" refere-se a uma preparação que compre-ende pelo menos 50-60% em peso do composto de interesse (por exemplo,ácido nucléico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). Mais preferencialmente, apreparação compreende pelo menos 75% em peso, e mais preferencialmen-te 90-99% em peso, do composto de interesse. Pureza é medida através demétodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo, métodoscromatográficos, eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, análisepor HPLC, e similares).

Com relação a moléculas de ácidos nucléicos de fita única, o termo "especi-ficamente hibridizando" refere-se à associação entre duas moléculas de áci-dos nucléicos de fita única de seqüência suficientemente complementar parapermitir essa hibridização sob condições predeterminadas geralmente usa-das no estado da técnica (algumas vezes denominadas "substancialmentecomplementar"). Em particular, o termo refere-se à hibridização de um oligo-nucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contida emuma molécula de DNA ou RNA de fita única, para a exclusão substancial dehibridização do oligonucleotídeo com ácidos nucléicos de fita única de se-qüência não complementar.

Uma "seqüência de codificação" ou "região de codificação" refere-se a umamolécula de ácido nucléico que apresenta informação de seqüência neces-sária para produzir um produto gênico, quando a seqüência é expressa. Aseqüência de codificação poderá compreender seqüências não-traduzidas(por exemplo, íntrons) em regiões traduzidas, ou poderão faltar essas se-qüências não-traduzidas intervenientes (por exemplo, como em cDNA).

"Introns" refere-se a seqüências de polinucleotídeos em um ácido nucléicoque não codifica informação relacionada à síntese protéica. Tais seqüênciassão transcritas para mRNA, mas são removidas antes de tradução do mRNApara uma proteína.

O termo "operavelmente ligadas" ou "operavelmente inseridas" significa queas seqüências reguladoras necessárias para expressão da seqüência decodificação são colocadas em uma molécula de ácido nucléico nas posiçõesapropriadas em relação à seqüência de codificação a fim de permitir expres-são da seqüência de codificação. À guisa de exemplo, um promotor é opera-velmente ligado com uma seqüência de codificação quando o promotor écapaz de controlar a transcrição ou expressão dessa seqüência de codifica-ção. Seqüências de codificação podem ser operavelmente ligadas com pro-motores ou seqüências reguladoras em uma orientação sentido ou anti-sentido. O termo "operavelmente ligada" é algumas vezes aplicado ao arran-jo de outros elementos de controle de transcrição (por exemplo, acentuado-res) em um vetor de expressão.

Seqüências de controle transcricional e translacional são seqüências regula-doras de DNA, tais como promotores, acentuadores, sinais de poliadenila-ção, terminadores, e similares, que proporcionam a expressão de uma se-qüência de codificação em uma célula hospedeira.

Os termos "promotor", "região de promotor" ou "seqüência de promotor" re-ferem-se geralmente a regiões reguladoras transcricionais de um gene, asquais poderão ser encontradas no lado 5' ou 3' da região de codificação, ouna região de codificação, ou nos íntrons. Tipicamente, um promotor é umaregião reguladora de DNA capaz de ligação de RNA polimerase em umacélula e iniciação de transcrição de uma seqüência de codificação a jusante(direção 3'). A seqüência de promotor típicoa 5' é ligada em seu término 3'pelo sítio de iniciação de transcrição e se estende a montante (direção 5')para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para inici-ar transcrição sob níveis detectáveis acima da base. Dentro da seqüência depromotor está um sítio de iniciação de transcrição(convenientemente definido por mapeamento com nuclease S1), bem comodomínios de ligação a proteínas (seqüências de consenso) responsáveispara a ligação de RNA polimerase.

Um "vetor" é um réplicon, tais como plasmídeos, fagos, cosmídeos, ou vírusa que um outro segmento de ácido nucléico poderá ser operavelmente inse-rido a fim de efetuar a reprodução ou expressão do segmento.

O termo "constructo de ácido nucléico" ou "constructo de DNA" é algumasvezes usado para referir-se a uma seqüência ou seqüências de codificaçãooperavelmente ligadas a seqüências reguladoras apropriadas e inseridas aum vetor para transformação de uma célula. Esse termo poderá ser usadointercambiavelmente com o termo "transformação de DNA" ou "transgene".Tal constructo de ácido nucléico poderá conter uma seqüência de codifica-ção para um produto gênico de interesse, juntamente com um gene marca-dor selecionável e/ou um gene repórter.

Um "gene marcador" ou "gene marcador selecionável" é um gene cujo pro-duto gênico codificado confere uma característica que permite uma célulacontendo o gene ser selecionada dentre células não contendo o gene. Veto-res usados para engenharia genética tipicamente contêm um ou mais genesmarcadores selecionáveis. Tipos de gene

marcador selecionáveis incluem (1) genes de resistência a antibióticos, (2)genes de tolerância ou resistência a herbicida, e (3) genes marcadores me-tabólicos ou auxotróficos que permitem células transformadas sintetizar umcomponente essencial, usualmente um aminoácido, o qual as células nãopodem de outra maneira produzir.

Um "gene repórter" é também um tipo de gene marcador. Ele tipicamentecodifica um produto gênico que é ensaiável ou detectável por meios padrõesde laboratório (por exemplo, atividade enzimática, fluorescência).O termo "expresso," "expressado," ou "expressão" de um gene refere-se àbiossíntese de um produto gênico. O processo envolve transcrição do genepara mRNA e em seguida tradução do mRNA para um ou mais polipeptí-deos, e abrange todas asmodificações pós-translacionais que ocorrem naturalmente.

"Endógeno" refere-se a qualquer constituinte, por exemplo, um gene ou áci-do nucléico, ou polipeptídeo, que pode ser encontrado naturalmente no or-ganismo especificado.

Uma região "heteróloga" de um constructo de ácido nucléico é um segmento(ou segmentos) identificáveis da molécula de ácido nucléico em uma molé-cuia maior que não é encontrada em associação com a molécula maior nanatureza. Desse modo, quando a região heteróloga compreende um gene, ogene usualmente será flanqueado por DNA que não flanqueia o DNA genô-mico no genoma do organismo de fonte. Em um outro exemplo, uma regiãoheteróloga é um constructo onde a própria seqüência de codificação não éencontrada na natureza (por exemplo, um cDNA onde a seqüência de codifi-cação genômica contém íntrons, ou seqüências sintéticas que apresentamcódons diferentes do que o gene nativo). Variações alélicas ou eventos mu-tacionais que ocorrem naturalmente não originam uma região heteróloga deDNA conforme definida neste relatório. O termo "constructo de DNA", con-forme definido acima, é também usado para referir-se a uma região heteró-loga, particularmente uma construída para uso na transformação de umacélula.

Uma célula foi "transformada" ou "transfectada" por DNA exógeno ou heteró-logo quando esse DNA foi introduzido no interior da célula. O DNA de trans-formação poderá ou não ser integrado (covalentemente ligado) no genomada célula. Em células procarióticas, lêvedo e mamífero, por exemplo, o DNAde transformação poderá ser mantido em um elemento episomal tal comoum plasmídeo. Com relação a células eucarióticas, uma célula estavelmentetransformada é aquela em que o DNA transformante torna-se integrado emum cromossomo de modo que ele seja herdado por células filhas por meiode replicação cromossômica. Essa estabilidade é demonstrada pela capaci-dade da célula eucariótica estabelecer linhagens celulares ou clones com-preendidos de uma população de células filhas contendo o DNA transfor-mante. Um "clone" é uma população de células derivadas de uma única cé-lula ou ancestrais comuns por meio de mitose. Uma "linhagem celular" é umclone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitropara muitos gerações.

"Grão," "semente," ou "fava," refere-se a uma unidade de reprodução daplanta florescente, capaz de desenvolvimento em uma outra planta. Confor-me usado neste relatório descritivo, especialmente com relação a cafeeiro,os termos são usados sinônima e intercambiavelmente.Conforme usado neste relatório, o termo "planta" inclui referência a todas asplantas, órgãos da planta (por exemplo, folhas, caules, brotos, raízes), se-mentes, pólen, células da planta, organelas da célula planta, e progênie damesma. Partes de plantas transgênicas devem ser entendidas no escopo dainvenção para compreender, por exemplo, células planta, protoplastos, teci-dos, calos, embriões, bem como flores, caules, sementes, pólen, frutos, fo-lhas, ou raízes que originam em plantas transgênicas ou sua progênie.

Descrição:

Em um de seus aspectos, a presente invenção caracteriza molé-culas de ácido nucléico de café que codifica uma variedade de proteínasenvolvidas no caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide. Exem-plos representativos de moléculas de ácido nucléico que codificam proteínasque compreendem o caminho biossintético carotenóide e apocarotenóideforam identificados de bases de dados de sobre 47.000 tags de seqüênciaexpressa (ESTs) de diversas bibliotecas de cDNA Coffea cànephora (robus-ta) produzidas com RNA isolado de folhas novas e do grão e tecidos do peri-carpo de cerejas colhidas sob diferentes estágios de desenvolvimento. ESTsde sobreposição foram identificados e "agrupados" em unigênese (contigs)que compreendem seqüências de codificação completas. As seqüências decontigs foram anotadas por meio de realização de uma pesquisa BLAST decada seqüência individual contra os bancos de dados de proteínas não-redundantes NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Pesquisas BLAST dos bancos de dados EST de cafeeiro usandobioquimicamente seqüências de proteínas caracterizadas de bancos de da-dos públicos revelaram seqüências gênicas representando diversas enzimasimportantes do caminho biossintético carotenóide no cafeeiro, e codificaçãode seqüências de duas enzimas (NCED3 e CCD1) que participam na gera-ção de apocarotenóides. Os quadros de leitura aberta total (ORFs) de váriasdessas seqüências foram obtidos, e uma seqüência parcial de duas outrasenzimas biossintéticas carotenóide (PDS e ZDS) foi também clonada usandoiniciadores degenerados e iniciadores não-degenerados. Esses cDNAs esuas proteínas codificadas são referidas neste relatório como seguem:

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Um outro aspecto da invenção caracteriza seqüências promoto-ras e relata elementos que controlam expressão de genes de caminho bios-sintético carotenóide e apocarotenóide em cafeeiro. Conforme descrita emmaiores detalhes nos exemplos, uma seqüência promotora (contida em IDSEQ NO: 25), de CcNCED3 foi identificada por procedimento (walking) deiniciador auxiliado por RCP, conforme descrito nos exemplos.

Embora polinucleotídeos que codificam proteínas que catalisametapas-chave o caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide de Cof-fea canephora sejam descritos e exemplificados aqui, esta invenção preten-de abranger ácidos nucléicos e proteínas codificadas de outras espéciesCoffea que são suficientemente similares são usadas intercambiavelmentecom os polinucleotídeos C. canephora e proteínas para as finalidades descri-tas abaixo. Conseqüentemente, quando o termo polipeptídeos ou proteínasque "compreendem o caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide" éusado neste relatório, pretende-se abranger todas as proteínas Coffea queapresentam as características gerais físicas, bioquímicas e funcionais descri-tas neste relatório, bem como os polinucleotídeos que as codificam.

Considerados em termos de suas seqüências, os polinucleotí-deos da invenção que codificam proteínas que compreendem o caminhobiossintético carotenóide e apocarotenóide incluem variantes alélicos e mu·tantes naturais de ID SEQ NOs: 1-12, os quais são provavelmente encontra-dos em diferentes variedades de C. canephora, e homólogos de ID SEQNOs: 1-12 provavelmente são encontrados em diferentes espécies de café.Porque se espera que tais variantes e homólogos possuam certas diferençasna seqüência de nucleotídeos e aminoácidos, esta invenção proporcionapolinucleotídeos isolados que codificam proteínas que compreendem o ca-minho biossintético carotenóide e apocarotenóide que apresentam pelo me-nos cerca de 60%, preferencialmente pelo menos aproximadamente 61%,62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% ou 70%, mais preferencialmen-te pelo menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%.78%, 79%, ou 80%, ainda mais preferencialmente 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, e ainda mais preferencialmente 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, e mais preferencialmente 96%, 97%, 98% e 99% oumaior identidade com qualquer uma de ID SEQ NOs:13-24, e compreendemuma seqüência de nucleotídeos que apresenta faixas equivalentes de identi-dade para qualquer uma de ID SEQ NOs:1-12. Devido à variação natural deseqüência provável existir entre proteínas que compreendem o caminho bi-ossintético carotenóide e apocarotenóide, e os genes que as codificam emdiferentes variedades e espécies de café, aquele versado no estado da téc-nica esperaria encontrar esse nível de variação, enquanto ainda mantendoas propriedades únicas dos polipeptídeos e polinucleotídeos da presenteinvenção. Tal expectativa deve-se em parte à degeneração do código gené-tico, bem como ao sucesso evolucionário conhecido de variações de se-qüência conservativa de aminoácido, as quais não apreciavelmente alterama natureza da proteína codificada. Conseqüentemente, tais variantes e ho-mólogos são considerados substancialmente os mesmos como reciproca-mente e são incluídos no escopo da presente invenção.

As seqüências gênicas reguladoras associadas a genes que co-dificam proteínas que compreendem o caminho biossintético carotenóide eapocarotenóide são de utilidade prática e são considerados dentro do esco-po da presente invenção. O promotor C. canephora NCED3 é exemplificadoneste relatório. A região a montante da seqüência genômica C. canephoraNCED3 é apresentada neste relatório como ID SEQ NO: 25, e contém parteou todo de um promotor exemplar da invenção, embora outras partes dopromotor possam ser encontradas em outros locais no gene, conforme expli-cadas na definição de "promotor" apresentado acima neste relatório. Entre-tanto, promotores e outras seqüências gênicas reguladoras de genes quecodificam proteínas que compreendem o caminho biossintético carotenóidee apocarotenóide de qualquer espécie de café poderão ser obtidos pelosmétodos descritos abaixo, e poderão ser utilizados de acordo com a presen-te invenção. Promotores e elementos reguladores que governam especifici-dade de tecido e especificidade temporal da expressão de genes que codifi-cam proteínas que compreendem o caminho biossintético carotenóide e a-pocarotenóide poderão ser usados para ludibriar, alterar ou modificar a ex-pressão de proteínas que compreendem o caminho biossintético carotenóidee apocarotenóide no sentido da meta de intensificar o sabor e aroma de pro-dutos de café produzidos de grãos de café que compreendem tais modifica-ções, entre outras utilidades.

As seções seguintes apresentam os procedimentos gerais en-volvidos na prática da presente invenção. Na medida em que materiais es-pecíficos são mencionados, é meramente para o propósito de ilustração, enão se pretende limitar a invenção. A não ser que de outra maneira especifi-cados, procedimentos gerais bioquímicos e biológicos moleculares, tais co-mo aqueles apresentados in Sambrook e outros, Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory (1989) ou Ausubel e outros (eds.), Current Proto-cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2005) são usados.Moléculas de Ácido Nucléico, Proteínas e Anticorpos:

Moléculas de ácido nucléico da invenção poderão ser prepara-das por dois métodos gerais: (1) as moléculas poderão ser sintetizadas detrifosfatos de nucleotídeos apropriados, ou (2) poderão ser isoladas de fon-tes biológicas. Ambos os métodos utilizam protocolos bem conhecidos noestado da técnica.

A disponibilidade de informação de seqüência de nucleotídeos,tal como o cDNA que apresenta ID SEQ NOs:1-12, ou a seqüência regulado-ra de ID SEQ NO: 25, permite preparação de uma molécula de ácido nucléi-co isolado da invenção por meio de síntese de oligonucleotídeo. Oligonucle-otídeos sintéticos poderão ser preparados pelo método de fosforamidita em-pregado no Sintetizador de DNA Applied Biosystems 38A ou dispositivossimilares. O constructo resultante poderá ser purificado de acordo com mé-todos conhecidos no estado da técnica, tais como cromatografia líquida dealta eficiência (HPLC). Polinucleotídeos longos, dupla-fita, tal como uma mo-lécula de DNA da presente invenção, podem ser sintetizados em estágios,devido a limitações de tamanho inerente em métodos correntes de oligonu-cleotídeos sintéticos. Desse modo, por exemplo, uma molécula longa dupla-fita poderá ser sintetizada conforme diversos segmentos menores de com-plementaridade apropriada. Segmentos complementares desse modo pro-duzidos poderão ser pareados de tal modo que cada segmento possua tér-minos coesivos apropriados para ligação de um segmento adjacente. Seg-mentos adjacentes poderão ser ligados por meio de términos coesivos depareamento na presença de DNA Iigase para constructo de uma moléculainteira longa de dupla-fita. Uma molécula sintética de DNA assim construídapoderá em seguida ser clonada e amplificada em um vetor apropriado.

De acordo com a presente invenção, ácidos nucléicos que apre-sentam a homologia de seqüência de nível apropriado com parte ou todosdos genes de regiões de codificação e/ou reguladoras que codificam proteí-nas que compreendem o caminho biossintético carotenóide e apocarotenói-de poderão ser identificados usando condições de hibridização e lavagem deestringência apropriada. Entender-se-á aquele versado no estado da técnicaque a estratégia acima mencionada, quando aplicada a seqüências genômi-cas, além de permitir isolamento das seqüências de codificação de genesque codificam proteínas que compreendem o caminho biossintético carote-nóide e apocarotenóide, também permitirá isolamento de promotores e ou-tras seqüências gênicas reguladoras associadas a genes que codificam pro-teínas que compreendem o caminho biossintético carotenóide e apocarote-nóide, mesmo que as próprias seqüências reguladoras possam não compar-tilhar homologia suficiente para permitir hibridização adequada. Além disso,uma anotação de pelo menos uma seqüência de codificação parcial permiti-rá aquele versado no estado da técnica determinar a seqüência de codifica-ção restante, bem como o promotor ou outras seqüências gênicas regulado-ras associadas à proteína carotenóide ou apocarotenóide de interesse pelatécnica de caminho genoma a montante ou a jusante. Tais técnicas são es-tabelecidas no estado da técnica,

(Mishra RN e outros, 2002; Rishi AS e outros, 2004).Conforme uma ilustração típica, hibridizações poderão ser reali-zadas de acordo com o método de Sambrook e outros, usando uma soluçãode hibridização que compreende: 5X SSC, 5X de reagente de Denhardt,1,0% de SDS, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado frag-mentado, 0,05% de pirofosfato de sódio e até 50% de formamida. Hibridiza-ção é realizada sob 37-42°C por pelo menos seis horas. Após hibridização,filtros são lavados como seguem: (1) 5 minutos sob temperatura ambienteem 2X de SSC e 1% de SDS; (2) 15 minutos sob temperatura ambiente em2X de SSC e 0,1% de SDS; (3) 30

minutos-1 hora a 37°C em 2X de SSC e 0,1% de SDS; (4) 2 ho-ras a 45-55°C em 2X de SSC e 0,1 % de SDS, alterando a solução a cada 30minutos.

Uma fórmula comum de calcular as condições de estringênciaexigidas para obter hibridização entre moléculas de ácido nucléico a partir deuma homologia de seqüência especificada (Sambrook e outros, 1989):

Tm = 81,5°C + 16,6Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% de for-mamida) - 600/no.bp em dúplex (duplo).

Como uma ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368]e 50% de formamida, com teor de GC de 42% e um tamanho médio de son-da de 200 bases, a Tm é de 57°C. A Tm de um dúplex de DNA diminui em 1- 1,5°C com cada diminuição de 1% em homologia. Desse modo, alvos comidentidade de seqüência maior que aproximadamente 75% seriam observa-dos usando uma temperatura de hibridização de 42°C. Em uma modalidade,a hibridização é sob 37°C e a lavagem final é sob 42°C; em uma outra mo-dalidade a hibridização é sob 42°C e a lavagem final é sob 50°C; e em aindauma outra modalidade a hibridização é sob 42°C e lavagem final é sob 65°C,com a hibridização acima e soluções de lavagens. Condições de alta estrin-gência incluem hibridização sob 42°C na solução de hibridização acima euma lavagem final sob 65°C em 0,1 X de SSC e 0,1% de SDS por 10 minu-tos.

Ácidos nucléicos da presente invenção poderão ser mantidoscomo DNA em qualquer vetor de clonagem conveniente. Em uma modalida-de preferida, clones são mantidos em clonagem de plasmídeo/vetor de ex-pressão, tais como pGEM-T (Promega Biotech, Madison, Wl), pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA), pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) oupET28a + (Novagen, Madison, Wl), todos os quais podem ser propagadosem uma célula hospedeira E. coli adequada.

Moléculas de ácido nucléico da invenção incluem cDNA, DNAgenômico, RNA, e fragmentos mesmos, que poderão ser de fita única, dupla,ou mesmo tríplice. Desse modo, esta invenção proporciona oligonucleotí-deos (fitas de DNA ou RNA sentido ou anti-sentido apresentando seqüênciascapazes de hibridização com pelo menos uma seqüência de uma moléculade ácido nucléico da presente invenção. Tais oligonucleotídeos são úteiscomo sondas para detectar genes que codificam proteínas que compreen-dem o caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide ou mRNA emamostras de teste de tecido de planta, por exemplo, através de amplificaçãoem RCP, ou para a regulação positiva ou negativa de expressão de genesque codificam proteínas que compreendem o caminho biossintético carote-nóide e apocarotenóide sob ou antes de tradução do mRNA para proteínas.Métodos em que oligonucleotídeos ou polinucleotídeos

poderão ser utilizados como sondas para esses ensaios inclu-em, mas sem se limitar aos mesmos: (1) hibridização in situ; (2) HibridizaçãoSouthern (3) hibridização northerrr, e (4) reações de amplificação ordenadatais como reações em cadeia de polimerase (RCP) (incluindo RT-RCP) ereação em cadeia Iigase (RCL).

Polipeptídeos codificados por ácidos nucléicos da invenção po-derão ser preparados em uma variedade de meios, de acordo com métodosconhecidos. Se produzidos in situ os polipeptídeos poderão ser purificadosde fontes apropriadas, por exemplo, sementes, pericarpos, ou outras partesda planta.

Alternativamente, a disponibilidade de moléculas de ácidos nu-cléicos isoladas permite produção das proteínas usando métodos de expres-são in vitro conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um cDNA ou ge-ne poderá ser clonado para um vetor de transcrição in vitro apropriado, talcomo um pSP64 ou pSP65 de trancrição in vitro, seguido por tradução semcélula em um sistema de tradução livre de célula adequada, tal como gér-men de trigo ou reticulócitos de coelho. Sistemas de transcrição e traduçãoin vitro são comercialmente disponíveis, por exemplo, de Promega Biotech,Madison, Wl, BRL, fíockvilie, MD ou Invitrogen, Carlsbad, CA.

De acordo com uma modalidade preferida, quantidades maioresde polipeptídeos que compreendem o caminho biossintético carotenóide eapocarotenóide poderão ser produzidas por meio de expressão em um sis-tema procariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo, parte ou todo deuma molécula de DNA1 tais como os cDNAs que apresentam ID SEQ NOs:1-12, poderão ser inseridos em um vetor plasmídeo adaptado para expres-são em uma célula bacteriana (tal como E. coli) ou uma célula de lêvedo (talcomo Saccharomyces cerevisiaé), ou em um vetor baculovírus para expres-são em uma célula de inseto. Tais vetores compreendem os elementos regu-ladores necessários para expressão do DNA na célula hospedeira, posicio-nados em tal maneira como permitir expressão do DNA na célula hospedei-ra. Tais elementos reguladores exigidos para expressão incluem seqüênciaspromotoras, seqüências de iniciação de transcrição e, opcionalmente, se-qüências intensificadoras.

Os polipeptídeos que compreendem o caminho biossintético ca-rotènóide e apocarotenóide produzidos por expressão gênica em um sistemaprocariótico ou eucariótico recombinante poderá ser purificado de acordocom métodos conhecidos no estado da técnica. Em uma modalidade preferi-da, um sistema de expressão/secreção comercialmente disponível pode serusado, por meio do qual a proteína recombinante é expressa e por conse-guinte segregada da célula hospedeira, para ser facilmente purificada domeio circunvizinho. Se vetores de expressão/secreção não são usados, umaabordagem alternativa envolve purificação da proteína recombinante atravésde separação de afinidade, tal como por interação imunológica com anticor-pos que se ligam especificamente à proteína recombinante. Tais métodossão comumente usados por profissionais versados no estado da técnica.

Os polipeptídeos que compreendem o caminho biossintético ca-rotenóide e apocarotenóide da invenção, preparados pelos métodos acimamencionados, poderão ser analisados de acordo com procedimentos pa-drões.

Polipeptídeos que compreendem o caminho biossintético caro-tenóide e apocarotenóide purificados de café, ou produzidos recombinante-mente, poderão ser usados para gerar anticorpos policlonais ou monoclo-nais, fragmentos de anticorpos ou derivados conforme definidos neste relató-rio, de acordo com métodos conhecidos. Anticorpos que reconhecem e ligamfragmentos dos polipeptídeos que compreendem o caminho biossintéticocarotenóide e apocarotenóide da invenção são também considerados, pro-porcionou-se que os anticorpos são específicos de polipeptídeos que com-preendem o caminho biossintético carotenóide e apocarotenóide. Por exem-plo, se análises das proteínas ou análises Southern e clonagem (ver abaixo)indicam que os genes clonados pertencem a uma família multigênica, entãoanticorpos específicos a componentes produzidos para peptídeps sintéticosque correspondem a regiões da proteína não-conservadas podem ser gerados.

Estojo que compreendem um anticorpo da invenção para qual-quer um dos propósitos descritos neste relatório são também incluídos noescopo da invenção. Em geral, tal kit inclui um antígeno de controle do qualo anticorpo é imunoespecífico.

Carotenóides e apocarotenóides desempenham um papel emmuitos aspectos de saúde e bem-estar humano. Carotenóides têm demons-trado ser antioxidantes poderosos (DiMascio, P e outros, 1991), são eficien-tes na proteção de luz ultravioleta (Sies, H. e outros, 2004), apresentam pa-péis imunoprotetores e poderão facilitar proliferação celular imune (Watzl, B.e outros, 1999; Boelsma, E. e outros, 2001; Aust, O. e outros, 2005), pode-rão ser usados para tratar doenças de fotossensibilidade (Matthews-Roth, M.e outros, 1993), são protetores contra degeneração macular relacionadacom a idade (Seddon JM, e outros, 1994), são protetores contra cataratas(Taylor A. 1993), poderão prevenir contra doença cardiovascular (GazianoJM e outros, 1993), e demonstram um efeito preventivo e possível quimiote-rapêutico contra muitos cânceres humanos tais como cânceres de pulmão,orolaríngeo, colorretal, mama, próstata, e cervical, entre outros (Mayne, S.1996). Além disso, carotenóides tal como alfa e beta-caroteno desempe-nham um papel-chave na síntese de vitamina A. (Britton G., 1995). Essa listade benefícios da saúde atribuíveis a carotenóides e apocarotenóides enten-de-se ser ilustrativa e não exaustiva, e presume-se que há muitos outrosefeitos benéficos da saúde atribuíveis a carotenóides atualmente desconhe-cidos. Conseqüentemente, os polipeptídeos do café que compreendem ocaminho biossintético de carotenóides e apocarotenóides descritos e exem-plificados neste relatório são esperados encontrar utilidade em uma varieda-de de aplicações alimentícias, saúde, e bem-estar. Por exemplo, os polipep-tídeos do café que compreendem o caminho biossintético de carotenóides eapocarotenóides, ou seus respectivos produtos de carotenóide ou apocaro-tenóide, poderão ser utilizados como suplementos dietéticos. Além disso, aspropriedades antioxidantes e fotoprotetoras de carotenóides e apopcarote-nóides poderão mostrar-se vantajosos tanto em produtos alimentícios quantoem cosméticos.

Uma ou mais das aplicações acima mencionadas para os poli-peptídeos que compreendem o caminho biossintético de carotenóide e apo-carotenóide poderão ser prosseguidas explorando a disponibilidade dos po-linucleotídeos que codificam polipeptídeos que compreendem o caminhobiossintético de carotenóide e apocarotenóide descritos neste relatório paragerar quantidades significativas de proteína pura usando organismos recom-binantes (por exemplo, no lêvedo Picia pastoris ou nos Lactobacilos compa-tíveis com alimento, ou em células vegetais), e em seguida testando as pro-teínas em ensaios novos ou estabelecidos de antioxidante potencial, imuno-proliferativo potencial, quimioprotetor ou quimioterapêutico potencial, e simi-lares. Teste similar poderá ser realizado usando os carotenóides ou apoca-rotenóides produzidos por essas proteínas de acordo com meios adequadosestabelecidos ou desenvolvidos no estado da técnica. Se proteínas específi-cas purificadas, ou produtos de carotenóide ou apocarotenóide produzidospor essas proteínas são verificados ser particularmente úteis, versões natu-rais dessas proteínas e seus produtos de carotenóide ou apocarotenóidetambém poderão ser isolados de grãos de café ou outras partes da planta,ou de tecidos e órgãos de outras plantas enriquecidas nessas enzimas docaminho biossintético de carotenóide e apocarotenóide.Vetores, Células, Tecidos e Plantas:

Também caracterizado de acordo com a presente invenção sãovetores e estojo para produzir células hospedeiras transgênicas que contêmum polinucleotídeo que codifica polipeptídeos que compreendem o caminhobiossintético de carotenóide e apocarotenóide, ou um oligonucleotídeo, ouhomólogo, análogo ou variante mesmo em uma orientação

sentido (sense) ou anti-sentido, ou um gene repórter e outrosconstrutos sob controle de promotores específicos a célula ou tecido, parti-cularmente promotores de gene que codifica carotenóide ou apocarotenóideconforme descritos neste relatório, e outras seqüências reguladoras. Célulashospedeiras adequadas incluem, mas sem se limitar as mesmas, célulasvegetais, células bacterianas lêvedos e outras células fúngicas, células deinsetos e células de mamíferos. Vetores para transformar uma ampla varie-dade dessas células hospedeiras são bem conhecidos daqueles versadosno estado da técnica. Eles incluem, mas não se limitam aos mesmos, plas-mídeos, fagemídeos, cosmídeos, baculovírus, bacmídeos, cromossomosbacterianos artificiais (BACs), cromossomos de lêvedo artificiais (YACs),bem como outros vetores bacterianos, de lêvedo e virais. Tipicamente, esto-jo de produção de células hospedeiras transgênicas conterão um ou maisvetores apropriados e instruções de produção das células transgênicas u-sando o vetor. Estojo poderão adicionalmente incluir um ou mais componen-tes adicionais, tais como meios de cultura para cultivar as células, reagentespara efetuar transformação das células e reagentes para teste das célulastransgênicas de expressão gênica, para mencionar alguns.

A presente invenção inclui plantas transgênicas que compreen-dem uma ou mais cópias de um gene que codifica um polipeptídeo quecompreende o caminho biossintético de carotenóide e apocarotenóide, ouseqüências de ácido nucléico que inibem a produção ou função de um poli-peptídeo endógeno da planta que compreende o caminho biossintético decarotenóide e apocarotenóide. Isso é realizado transformando células deplanta com um transgene que compreende parte de toda uma seqüência decodificação de um polipeptídeo que compreende o caminho biossintético decarotenóide e apocarotenóide, ou mutante, anti-sentido ou variante mesmo,incluindo RNA, controlado por seqüências reguladora nativas ou recombi-nantes, conforme descritas abaixo. Espécies de plantas transgênicas de ca-feeiro são preferidas, incluindo, mas sem limitação, C. abeokutae, C. arabi-ca, C. arnoldiana, C. aruwemiensis, C. bengalensis, C. canephora, C. con-gensis C. dewevrei, C. excelsa, C. eugenioides, e C. heterocalyx, C. kapaka-ta, C. khasiana, C. liberica, C. moloundou, C. rasemosa, C. salvatrix,C.sessiflora, C. stenophylla, C. travencorensis, C. wightiana e C. zangueba-riae. Plantas de qualquer espécie são também incluídas na invenção; essasincluem, mas sem se limitar as mesmas, tabaco, Arabidopsis e outras espé-cies "amigavelmente de laboratório", colheitas de cereais tais como milho,trigo, arroz, soja, cevada, centeio, aveia, sorgo, alfafa, trevo (οίονβή e simila-res, plantas que produzem óleo tais como canola, açafroa, girassol, amendo-im, cacau e similares, colheitas vegetais tais como tomate tomatillo, batata,pimenta, berinjela, beterraba, cenoura, pepino, alface, ervilha e similares,plantas hortícolas tais como áster, begônia, crisântemo, delfínio, petúnia,zínia, grama e turfgrasses e similares.

Plantas transgênicas podem ser geradas usando métodos pa-drões de transformação dé plantas conhecidos daqueles versados no estadoda técnica. Esses incluem, mas sem se limitar as mesmas, vetores de Agro-bacterium, tratamento de protoplastos com polietileno glicol, transferênciabiolística de DNA, microfeixe de laser UV, vetores de vírus gemini ou outrosvetores virais de planta, tratamento de protoplastos com fosfato de cálcio,eletroporação de protoplastos isolados, agitação de suspensões celularesem solução com microcontas revestidas com o DNA transformante, agitaçãode suspensão celular em solução com fibras de silício revestidas com DNAtransformante, absorção direta de DNA, absorção de DNA mediada por Ii-possomos, e similares. Tais métodos têm

sido publicados no estado da técnica. Ver, por exemplo, Me-thods for Plant Molecular Biology (Weissbach & Weissbach, eds., 1988); Me-thods in Plant Molecular Biology (Schuler & Zielinski, eds., 1989); Plant Mo-Iecular Biology Manual {Gelvin, Schilperoort, Verma, eds., 1993); e Methodsin Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual (Maliga, Klessig, Cashmo-re, Gruissem & Varner, eds., 1994).O método de transformação depende da planta a ser transfor-mada. Vetores de Agrobacterium são freqüentemente usados para transfor-mar espécies dicotiledôneas em vetores binários de Agrobacterium incluem,mas sem se limitar aos mesmos, BIN19 e derivados mesmo, a série de vetorpBI, e vetores binários pGA482, pGA492, pLH7000 (Acesso GenBankAY234330) e qualquer um dos vetores pCAMBIA adequado (derivado dosvetores pPZP construídos por Hajdukiewicz, Svab & Maliga, (1994) PlantMol Biol. 25: 989-994, disponíveis de CAMBIA, GPO Box 3200, CanberraACT 2601, Austrália ou via a web mundial sob org. CAMBIA). Para transfor-mação de espécies monocotiledôneas, bombardeamento biolístico com par-tículas revestidas com DNA transformante e fibras de silício revestidas comDNA transformante são freqüentemente úteis para transformação nuclear.Alternativamente, vetores Agrobacterium "superbinários" são usados comêxito para a transformação de arroz, milho, e várias outras espécies mono-cotiledôneas.

Constructos de DNA para transformação de uma planta selecio-nada compreende uma seqüência de codificação de interesse operavelmen-te ligada a promotores 5' apropriados (por exemplo, seqüências promotorase reguladoras translacionais) e seqüências reguladoras 3' (por exemplo,terminadores). Em uma modalidade preferida, utiliza-se uma seqüência decodificação que codifica um polipeptídeo que compreende o caminho bios-sintético de carotenóide e apocarotenóide sob controle de seus elementosreguladores naturais 5' e 3'. Em outras modalidades, seqüências de codifica-ção e reguladoras são trocadas (por exemplo, seqüência de codificaçãoCcPSYI operavelmente ligada a promotor Ι_βΟΥ) para alterar o teor de pro-teína da semente da planta transformada para um aperfeiçoamento fenotípi-co, por exemplo, em sabor, aroma ou outra característica.

Em uma modalidade alternativa, a região de codificação do geneé colocada sob um promotor poderoso constitutivo, tal como o promotor 35Sde Vírus Mosaico da couve-flor (CaMV) ou o promotor 35S de vírus mosaicode plantas herbáceas (figwort mosaic vírus). Outros promotores constitutivosconsiderados para uso na presente invenção incluem, mas sem se limitaraos mesmos: promotores T-DNA manopina sintetase, nopalina sintase e oc-topina sintase. Em outras modalidades, usa-se um forte promotor de mono-cotiledôneas (monocot), por exemplo, o promotor de ubiquitina milho, o pro-motor de actina de arroz ou o promotor de tubulina de arroz (Jeon e outros,Plant Physiology. 123: 1005-14, 2000).

Plantas transgênicas com seqüências de codificação para ex-pressar polipeptídeos que compreendem o caminho biossintético de carote-nóide e apocarotenóide em um promotor induzível são também considera-dos estar dentro do escopo da presente invenção. Promotores de planta in-duzíveis incluem o promotor controlado por repressor/operador de tetracicli-na, os promotores gênicos de choque térmico, promotores induzidos por es-tresse (por exemplo, ferimento), promotores de gene de defesa responsivos(por exemplo, genes de fenilalanina amônia liase), promotores de gene indu-zidos por ferimento (por exemplo, genes de proteína de parede celular ricaem hidroxiprolina), promotores de gene induzíveis quimicamente (por exem-plo, genes de nitrato reductase, genes glucanase, genes quitinase, etc.) epromotores de gene induzíveis por escuridão (por exemplo, gene asparaginasintetase) para mencionar apenas alguns.

Promotores específicos a tecido e específicos a desenvolvimen-to são também considerados para uso na presente invenção, além disso ospromotores de proteína de carotenóide ou apocarotenóide da invenção. E-xemplos não-limitativos de promotores específicos à semente incluem Cim 1(mensagem induzida por citoquinina), zeína de milho 19 kDa (cZ19B1), milps(mio-inositol-1-fosfato sintase), e celA (celulose sintase) (Pedido U.S. No. deSérie 09/377.648), beta-faseolina fava (bean beta-phaseolin), napina, beta-conglicinina, Iecitina de soja, cruciferina, zeína de milho 15 kDa, zeína 22kDa, zeína 27 kDa, g-zeína, céreo, shrunken 1, shrunken 2, e globulina 1,soja 11S Iegumina (Bàumlein e outros, 1992), e C. canephora proteína dearmazenagem 11S de semente (Marraccini e outros, 1999, Plant Physiol.Biochem. 37: 273-282). Ver, também WO 00/12733, em que promotores desementes preferidos de genes end1 e end2 são descritos. Outros promoto-res específicos a semente de Coffea poderão também ser utilizados, incluin-do mas sem se limitar aos mesmos, promotor de gene oleosina descrito emPedido Provisório co-pendente comumente de propriedade, No. 60/696.445e o promotor gênico deidrina descrito em Pedido Provisório co-pendentecomumente de propriedade, No. 60/696.890. Exemplos de outros promoto-res específicos a tecido incluem, mas sem se limitar aos mesmos: os promo-tores gênicos de subunidade pequena ribulose bisfosfato carboxilase (Ru-BisCo) (por exemplo, o promotor de subunidade pequena de café conformedescrito por Marracini e outros, 2003) ou proteína de ligação à clorofila a/b(CAB) promotores gênicos de expressão em tecido fotossintético; e os pro-motores gênicos glutamina sintetase específicos a raiz em que expressãoem raiz é desejada.

A região de codificação é também operavelmente ligada a umaseqüência reguladora 3' apropriada. Em modalidades onde a seqüência re-guladora nativa 3' não é usada, a região de poliadenilação nopalina sintetasepoderá ser usada. Outras regiões reguladoras úteis 3' incluem, mas sem selimitar as mesmas, região de poliadenilação octopina sintase.

A região de codificação selecionada, sob controle de elementosreguladores apropriados, é operavelmente ligada a um marcador nuclear deresistência a droga, tal como resistência a canamicina. Outros sistemas demarcador selecionável útil incluem genes que conferem resistências a anti-bióticos ou herbicidas (por exemplo, resistência a higromicina, sulfoniluréia,fosfinotricina, ou glifosato) ou genes que conferem crescimento seletivo (porexemplo, fosfomanose isomerase, permitindo crescimento de células vege-tais em manose).

Genes marcadores selecionáveis incluem, sem limitação, genesque codificam resistência a antibiótico, tais como aqueles que codificam ne-omicina fosfotransferase Il (ΝΕΟ), diidrofolato reductase (DHFR) e higromi-cina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência acompostos herbicidas, tais como EPSPS resistente a glifosato e/ou glifosatooxidorreducatase (GOX), Bromoxynil nitrilase (BXN) de resistência a bromo-xinila, genes AHAS de resistência a imidazolinonas, genes de resistência asulfoniluréia, e genes de resistência a 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).Em certas modalidades, promotores e outras seqüências regu-ladoras de expressão abrangidos pela presente invenção são operavelmenteligados a genes repórter. Genes repórter considerados para uso na invençãoincluem, mas sem se limitar aos mesmos, genes que codificam proteína fluo-rescente verde (GFP)1 proteína fluorescente vermelha (DsRed), ProteínaFluorescente Ciano (CFP), Proteína Fluorescente Amarela (YFP), ProteínaFluorescente Cerianto Laranja (cOFP), alcalina fosfatase (AP), β-lactamase,cloranfenicol acetiItransferase (CAT), adenosina déaminase (ADA), amino-glicosídeo fosfotransferase (neor, G418r) diidrofolato reductase (DHFR), hi-gromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina quinase (TK), IacZ (que codifi-ca □-galactosidase), e xantina guanina fosforibosiltransferase (XGPRT), Be-ta-Glucuronidase (gus), Fosfatase Alcalina Placentária (PLAP), FosfataseAlcalina Embriônica Secretada (SEAP), ou Luciferase de Vaga-Lume ou Lu-ciferase Bacteriana (LUC). Como é o caso de muitos dos procedimentos pa-drões associados com a prática da invenção, aqueles versados no estado datécnica serão cientes de seqüências adicionais que podem servir como fun-ção de um marcador ou repórter.

Modificações de seqüência adicionais são conhecidas no estadoda ténica para intensificar expressão gênica em um hospedeiro celular. Es-sas modificações incluem eliminação de seqüências que codificam sinais depoliadenilação supérflua, sinais de sítio de entrelaçamento (splice) exon-íntron, repetições semelhantes a transposon, e outras tais seqüências bemcaracterizadas que poderão ser deletério a expressão gênica. Alternativa-mente, se necessário, o teor de G/C da seqüência de codificação poderá serajustado com níveis médios para um dado hospedeiro celular de cafeeiro,quando calculado por referência com genes conhecidos expressos em umacélula de cafeeiro. Também, quando possível, a seqüência de codificação émodificada para evitar estruturas secundárias de mRNA em forma preditagrampo de cabelo. Uma outra alternativa para intensificar expressão gênicaé usar seqüências líderes 5'. Seqüências líderes de tradução são bem co-nhecidas no estado da técnica, e incluem o derivado de ação eis (omega1) daseqüência líder 5' (omega) do vírus mosaico do tabaco, as seqüências lide-res 5' de vírus mosaico de bromo (brome mosaic vírus), vírus mosaico dealfafa, e vírus mosaico amarelo de nabo.

Plantas são transformadas e por conseguinte selecionadas emrelação a uma ou mais propriedades, incluindo a presença do produto trans-gênico, o mRNA que codifica transgene, ou um fenótipo alterado associadoà expressão do transgene. Deve-se reconhecer que a quantidade de ex-pressão, bem como o padrão de expressão dos transgenes específicos atecido e temporal em plantas transformadas podem variar dependendo daposição de sua inserção no genoma nuclear. Tais efeitos posicionais sãobem conhecidos no estado da técnica. Por essa razão, diversos transfor-mantes nucleares devem ser regenerados e testados para expressão dotransgene.Métodos:

Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da presente invenção po-dem ser usados em qualquer um de vários métodos por meio do qual osprodutos de proteína podem ser expressos em cafeeiro a fim de que as pro-teínas poderão desempenhar um papel na fotossíntese, e na acentuação desabor e/ou aroma da bebida de café ou produtos do café finalmente produzi-dos dos grãos do cafeeiro que expressa a proteína. Similarmente, õs poli-peptídeos da invenção podem ser usados em qualquer um de vários méto-dos por meio do qual os carotenóides, apocarotenóides, e outros tais produ-tos fitoquímicos sintetizados dos polipeptídeos poderão desempenhar umpapel na fotossíntese, e na acentuação de sabor e/ou aroma da bebida decafé ou produtos do café finalmente produzidos dos grãos do cafeeiro quecontêm os carotenóides e os apocarotenóides.

Com relação à fotossíntese, carotenóides desempenham umpapel na fotoproteção sob leve estresse, e na coleta noturna em ambientesescuros. De fato, muitas plantas alteram sua composição de carotenóide emresposta as condições escuras versus luz do sol total. (Demmig-Adams eoutros, 1996). Portanto, a capacidade de manipular produção de polipeptí-deos que compreende o caminho biossintético de carotenóides e apocarote-nóides em uma planta, ou ainda usar os polinucleotídeos e proteínas da in-venção para monitorar tal expressão gênica, permitirá estudo e manipulaçãoda resposta do cafeeiro para níveis variáveis de luz do sol. Esse entendi-mento permite a geração de cafeeiro modificado que são melhores equipa-das para fotossíntese em condições subótimas tais como luz em excesso,em que carotenóides protegem os pigmentos fotossintéticos, ou luz insufici-ente, onde uma diminuição nos pigmentos acessórios permite colhimento àluz mais eficiente.

Com relação a sabor e aroma do grão de café torrado, espera-seque os polipeptídeos que compreendem o caminho biossintético de carote-nóide e apocarotenóide exerça alguma influência na geração de sabores docafé via a reação de Maillard que ocorre durante a torrefação, por meio doteor das próprias proteínas, ou dos produtos tais como os carotenóides ouapocarotenóides que eles produzem. Proteínas, e particularmente produtosda degradação de proteína (peptídeos e aminoácidos), representam um im-portante grupo de precursores de sabor (Spanier e outros, 2004). Portanto,proteínas relativamente abundantes tais como aquelas que compreendem ocaminho biossintético de carotenóide e apocarotenóide podem-se esperarproduzir alguma contribuição para as reações que geram sabor que ocorremdurante a torrefação de café. Tal contribuição poderá originar-se da concen-tração das próprias proteínas no grão de café, ou a concentração de carote-nóides ou apocarotenóides finalmente produzidos das proteínas. A capaci-dade de monitorar (por exemplo, através de reprodução auxiliada por mar-cador) ou manipular perfis de expressão protéica de polipeptídios que com-preendem o caminho biossintético de carotenóide ou apocarotenóide é pro-porcionada pelos polinucleotídeos da presente invenção, de acordo com osmétodos descritos neste relatório.

Desse modo, um aspecto da presente invenção caracteriza mé-todos para alterar o perfil de polipeptídios que compreendem o caminho bi-ossintético de carotenóide ou apocarotenóide em uma planta, preferencial-mente café, os quais compreendem aumento ou diminuição de uma quanti-dade ou atividade de um ou mais polipeptídios que compreendem o caminhobiossintético de carotenóide ou apocarotenóide na planta. Por exemplo, emuma modalidade da invenção, um gene que codifica um polipeptídio quecompreende o caminho biossintético de carotenóide ou apocarotenóide sobcontrole de suas próprias seqüências de controle de expressão é usado paratransformar uma planta com a finalidade de aumentar produção desse poli-peptídio na planta. Alternativamente, uma região de codificação de um poli-peptídio que compreende o caminho biossintético de carotenóide ou apoca-rotenóide é operavelmente ligado a regiões que controlam expressão heteró-loga, tais como promotores constitutivos ou induzíveis.

Espera-se que o aumento da produção de carotenóide e apoca-rotenóide nas sementes de café apresente uma variedade de efeitos benéfi-cos. O café mostrou conter dois componentes de sabor derivados de carote-nóides, α-ionona e β-damascenona (Czerny e outros, 2000; Akiyama e ou-tros, 2003; Variyar e outros, 2003), o último sendo identificado como compo-nentes principais de café tanto antes quanto após torrefação (Ortiz e outros,2004). Czerny e outros (2000) identificaram um aumento de 800 vezes em β-damascenona após a torrefação. Devido a seu baixo limiar de odor, apenaspequenas quantidades desses e outros compostos voláteis derivados decarotenóide são necessárias para alterar o aroma de café torrado.

Aumento de teor de carotenóide nos grãos de café é, portanto,esperado levar a um aumento em voláteis derivados do carotenóide implica-dos em aroma durante o processo de torrefação. O aumento de 800 vezesem β-damascenona durante torrefação deve-se provavelmente a interrupçãotérmica do precursor de carotenóide. Aumento na produção de carotenóidespoderá levar a um aumento na β-damascenona, bem como a formação denovos apocarotenóides não anteriormente detectada no café, tais como a β-ionona, pseudoionona, geranilacetona, β-ciclocitral, citral e 6-metil-5-hepten-2-ona. Em outros sistemas, por exemplo, tomate, o aroma do mutante "altobeta", que acumula β-caroteno, é dominado pela β-ionona derivada do β-caroteno, visto que o mutante jubileu, que produz principalmente carotenosacíclicos tem sido mostrado produzir geranilacetona (Stevens, 1970). Caro-tenos acíclicos tais como ζ-caroteno foram mostrados ser precursores degeranilacetona (Simkin e outros, 2004b). Desse modo, modificações no teorde carotenóide ou de carotenóides específicos podem levar a alterações emvoláteis derivados do carotenóide correlato.

Os polinucleotídios e métodos proporcionados de acordo com apresente invenção também permitem a superprodução de novos cetocarote-nóides, tal como astaxantina (3,3'diidróxi-4,4'diceto-p,p-caroteno) formadode β-caroteno e zeaxantina, através da superexpressão de genes biossinté-ticos de cetocarotenóidé Adonis aestivalis (Cúnningham e Gantt, 2005). As-taxantina está envolvida na prevenção de câncer (Tanaka e outros, 1994) efoi descrita como um acentuador de sistema imune (Jyonouchi e outros,1993). Astaxantina é usada como um suplemento alimentício e na alimenta-ção de animais e peixes. Sua presença em café pode conferir um benefício asaúde e pode resultar na formação de novos apocarotenóides durante a tor-refação.

A superexpressão de fitoeno sintase (PSY) em metabólitos redi-recionados a tomates transgênicos do caminho de diterpenóide para a for-mação de carotenóides (Fray e outros, 1995). Todos os diterpenóides sãoderivados de difosfato de geranilgeranila, o precursor do primeiro carotenói-de - fitoeno (Richman e outros, 1998). Dois diterpenóides de interesse sãocafestol e kahweol, os quais são associados a impactos negativos na saúdede café expresso. Conseqüentemente, superexpressão de PSY específica asementes em sementes de café pode levar a uma diminuição nos diterpe-nóides indesejáveis (cafestol e kahweol) através de metabólitos divergentespara a formação de carotenóides benéficos a saúde.

A capacidade de coleta noturna em ambientes escuros de umaplanta tal como cafeeiro poderá ser aperfeiçoada diminuindo produção deum ou mais dos polipeptídios que compreendem os caminho biossintético decarotenóide ou apocarotenóide na planta, selecionando variantes que ocor-rem naturalmente de expressão reduzida de polipeptídios que compreendemo caminho biossintético de carotenóide ou apocarotenóide, ou selecionandovariantes que ocorrem naturalmente de níveis reduzidos dos vários carote-nóides ou apocarotenóides. Por exemplo, perda de função (nula) em plantasmutantes poderá ser criada ou selecionada de populações de mutantes deplantas atualmente disponíveis. Entender-se-á também aquele versado noestado da técnica que populações de planta mutante poderão ser tambémselecionadas de mutantes que superexpressam um polipeptídio particularque compreende o caminho biossintético de carotenóide ou apocarotenóide,utilizando um ou mais dos métodos descritos neste relatório. Populaçõesmutantes podem ser produzidas por mutagênese química, mutagênese deradiação e transposon ou inserções de T-DNA, ou direcionando lesões locaisinduzidas em genomas (TILLING, ver, por exemplo, Henikoff e outros, 2004,Plant Physiol. 135(2): 630-636; Gilchrist & Haughn, 2005, Curr. Opin. PlantBioi 8(2): 211-215). Os métodos para produzir populações mutantes sãobem conhecidos no estado da técnica.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser usados para identi-ficar polipeptídios mutantes que compreendem o caminho biossintético decarotenóide e apocarotenóide em várias espécies vegetais. Em espécies taiscomo milho ou Arabidopsis, em que linhagens de inserção transposon sãodisponíveis, iniciadores de oligonucleotídios podem ser projetados para se-lecionar linhagens de inserções nos genes que codificam polipeptídios quecompreendem o caminho biossintético de carotenóide e apocarotenóide.Através da reprodução, uma linhagem de planta poderá em seguida ser de-senvolvida que é heterozigota ou homozigota em relação a gene interrompi-do.

Uma planta também pode ser engenheirada para exibir um fenó-tipo similar àquele observado em mutantes nulos criados por técnicas muta-gênicas. Um mutante transgênico nulo pode ser criado por uma expressãode uma forma mutante de um polipeptídio selecionado que compreende ocaminho biossintético de carotenóide e apocarotenóide para criar um "efeitonegativo dominante". Embora não limitando a invenção com qualquer ummecanismo, esta proteína mutante competirá com proteínas do tipo-selvagem para interagir com proteínas ou outros fatores celulares. Exemplosmesmo tipo de efeito "negativo dominante" são bem conhecidos tanto emsistemas de insetos quanto de vertebrados. (Radke e outros, 1997, Genetics145: 163-171; Kolch e outros, 1991, Nature 349: 426-428).Uma outra espécie de mutante transgênico nulo pode ser criadainibindo a tradução de mRNA que codifica os polipeptídios que compreen-dem o caminho biossintético de carotenóide e apocarotenóide por "silencia-mento gênico pós-transcricional". O gene das espécies direcionadas pararepressão, ou um fragmento mesmo, pode ser utilizado para controlar a pro-dução da proteína codificada. As moléculas anti-sentido de comprimentototal podem ser usadas para essa finalidade. Alternativamente, oligonucleo-tídios anti-sentido direcionados a regiões específicas do mRNA que são crí-ticas para tradução poderão ser utilizados. O uso de moléculas anti-sentidopara diminuir níveis de expressão de um gene predeterminado é conhecidono estado da técnica. Moléculas anti-sentido poderão ser proporcionadas insitu transformando células planta com um constructo de DNA que, sobtranscrição, produz as seqüências de RNA anti-sentido. Tais constructospodem ser projetados para produzir seqüências anti-sentido de comprimentototal ou parcial. Esse efeito de silenciamento gênico pode ser acentuado portransgenicamente superproduzir tanto RNA sentido quanto anti-sentido daseqüência de codificação gênica de tal modo que uma alta quantidade dedsRNA seja produzida (por exemplo, ver Waterhouse e outros, 1998, PNAS95: 13959-13964). Neste sentido, dsRNA contendo seqüências que corres-pondem a parte ou todo de pelo menos um íntron mostrou ser particularmen-te eficaz. Em uma modalidade, parte ou todo da faixa anti-sentido de se-qüência de codificação é expressa por um transgene. Em uma outra modali-dade, faixas (strands) de hibridização sentido e anti-sentido de parte ou tododa seqüência de codificação de polipeptídios que compreendem o caminhobiossintético de carotenóide e apocarotenóide são transgenicamente ex-pressas.

Em outra modalidade, genes de carotenóide e apocarotenóidepoderão ser silenciados por meio do uso de uma variedade de outras técni-cas de silenciamento de genes pós-transcricional (silenciamento de RNA)que são atualmente disponíveis de sistemas vegetais. Silenciamento deRNA envolve o processamento de RNA dupla-fita (dsRNA) para pequenosfragmentos de 21-28 nucleotídeos por uma enzima à base de RNase H ("Di-cei" ou "semelhante a Dicei"). Os produtos de clivagem, que são siRNA (pe-queno RNA interferente) ou miRNA (micro-RNA) são incorporados em com-plexos efetuadores de proteína que regulam expressão gênica de uma ma-neira específica à seqüência (para revisões de silenciamento de RNA emplantas, ver Horiguchi, 2004, Differentiation 72: 65-73; Baulcombe, 2004,Nature 431: 356-363; Herr, 2004, Biochem. Soe. Trans. 32: 946-951).

Pequenos RNAs interferentes poderão ser quimicamente sinteti-zados ou transcritos e amplificados in vitro, e em seguida transferidos paraas células. Transferência poderá ser por meio de microinjeção (Tuschl T. eoutros, 2002), transfecção química (Agrawal N. e outros, 2003), eletropora-ção ou transfecção catiônica mediada por Iipossomo (Brummelkamp TR eoutros, 2002; Elbashir SM e outros, 2002), ou quaisquer outros meios dispo-níveis no estado da técnica, os quais serão entendidos por aqueles versadosno estado da técnica. Alternativamente, o siRNA poderá ser expresso intra-celularmente inserindo os modelos (templates) de DNA de siRNA nas célu-las de interesse, por exemplo, por meios de um plasmídeo, (Tuschl T e ou-tros, 2002), e poderão ser especificamente direcionados para selecionar cé-lulas. Pequenos RNAs interferentes são com êxito introduzidos em plantas.(Klahre U e outros, 2002).

Um método preferido de silenciamento de RNA na presente in-venção é o uso de pequenos RNAs com estrutura em forma de grampo decabelo (shRNA). Um vetor contendo uma seqüência de DNA que se codificade uma seqüência siRNA particular desejada é transferido para uma célula-alvo por quaisquer meios comuns. Uma vez que na célula, a seqüência deDNA é continuamente transcrita para moléculas de RNA que Ioop back so-bre si próprias e formam estruturas em forma de grampo de cabelo por meiode emparelhamento base intramolecular. Essas estruturas em forma degrampo de cabelo Essas estruturas em forma de grampo de cabelo, uma vezprocessadas pela célula, são equivalentes a moléculas de siRNA e são usa-das pela célula para mediar silenciamento de RNA da proteína desejada.Vários constructos de utilidade particular de silenciamento de RNA em plan-tas são descritos por Horiguchi, 2004, supra. Tipicamente, esse constructocompreende um promotor, uma seqüência do gene-alvo a ser silenciado naorientação "sentido", um espaçador, o anti-sentido da seqüência gênica-alvo,e um terminador.

Ainda um outro tipo de mutante sintético nulo pode também sercriado pela técnica de "co-supressão" (Vaucheret e outros, 1998, Plant J.16(6): 651-659). Células de planta são transformadas com uma cópia do ge-ne endógeno direcionado para repressão. Em muitos casos, isso resulta narepressão completa do gene nativo, bem como o transgene. Em uma moda-lidade, um gene que codifica um polipeptídeo que compreende o caminhobiossintético de carotenóide e apocarotenóide da espécie vegetal de interes-se é isolado e usado para transformar células dessa mesma espécie.

Mutante ou plantas transgênicas produzidas por qauisquer dosmétodos precedentes são também caracterizados de acordo com a presenteinvenção. Preferencialmente, as plantas são férteis, desse modo sendo útilpara propósitos de reprodução (breeding). Desse modo, mutante ou plantasque exibem um ou mais dos fenótipos desejáveis acima mencionados po-dem ser usados para reprodução de plantas, ou diretamente em aplicaçõesagrículas ou hortícolas. Eles também serão de utilidade como ferramentasde pesquisa para a elucidação adicional da participação de polipeptídeosque compreendem o caminho biossintético de carotenóide e apocarotenóideem sabor, aroma e outras características de sementes de café associadas apigmentos e fotossíntese. Plantas contendo um transgene ou uma mutaçãoespecificada poderão também ser cruzadas com plantas contendo um trans-gene ou genótipo complementar a fim de produzir plantas com fenótipos a-centuados ou combinados.

A presente invenção também caracteriza composições e méto-dos de produção de, em uma maneira preferida de semente ou específica asemente, qualquer produto gênico heterólogo selecionado em uma planta.Uma seqüência de codificação de interesse é colocada sob controle de umpromotor de café específico a semente tal como um promotor de gene quecodifica proteína de carotenóide ou apocarotenóide, e outras seqüênciasreguladoras apropriadas, para produzir um gene quimérico específico a se-mente. O gene quimérico é introduzido em uma célula vegetal por meio dequalquer dos métodos de transformação descritos neste relatório ou conhe-cido no estado da técnica. Esses genes quiméricos e métodos poderão serusados para produzir uma variedade de produtos gênicos de interesse naplanta, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos: (1) produtos gênicos de-tectáveis tais como GFP ou GUS1 conforme enumerados acima; (2) produtosgênicos que conferem um benefício agronômico ou hortícola, tais como a-queles cujas atividades enzimáticas resultam na produção de micronutrien-tes (por exemplo, pró-vitamina A, também conhecida como beta-caroteno)ou antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, ácidos graxos ômega, Iico-peno, isoprenos, terpenos); ou (3) produtos gênicos para controlar patóge-nos ou pragas, tais como descritos por Mourgues e outros, (1998), TibTech16: 203-210 ou outros conhecidos ser protetores para sementes de plantasou prejudiciais para patógenos.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar a in-venção em maiores detalhes. Os exemplos são pretendidos a ilustrar, nãolimitar, a invenção.

Exemplo 1

Materiais e Métodos para Exemplos Subseqüentes

Material de planta. Raízes recentemente colhidas, folhas novas, caules,flores e frutos sob diferentes estágios de desenvolvimento foram colhidos deCoffea arabica L. cv. Caturra T-2308 e Coffea canephora var. BP409 cresci-das sob condições de estufa (25°C, 70 UR) e também de Coffea canephoraBP-409 crescidas no campo em East Java, Indonésia. Os estágios de de-senvolvimento são definidos como seguem: frutos verdes pequenos (SG),frutos verdes grandes (LG), frutos amarelos (Y) e frutos vermelhos (R). Teci-dos frescos foram congelados imediatamente em nitrogênio líquido, em se-guida armazenados sob -80°C até usados para extração de RNA.Clonagem de seqüências de cDNA de comprimento total. A região amontante 5' de fitoeno sintase (PSY) de Coffea canephora foi recuperadausando o kit Genewalker (BD Biosciences) e os iniciadores GWPSY1 (5'-ACTTCACCGCAGCGATCATAAGCTTCAC-3') (ID SEQ NO.:26) seguido porRCP embutida (nested PCR) usando iniciador GWPSY2 (5'-TTCACGTCCCAATCTTCTCGAGATCTC-3') (ID SEQ NO.:27). Reações deRCP continham 1 χ tampão e 5 mM de MgCI2, 200 μΜ cada de dATP, dCTP,dGTP e dTTP, e 1 unidade de LA Taq polimerase (Takara, Combrex Bio,Bélgica) e 200 nM de iniciador GWPSY1 e 200 nM de iniciador AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; kit Genewa^ (ID SEQ NO.:28). Amistura reacional foi incubada por 10 minutos a 94°C, seguida por 7 ciclosde amplificação de 25 segundos a 94°C/4 minutos à 72°C e em seguida 32ciclos de amplificação de 25 segundos a 94°C/4 minutos a 67°C. A reaçãode RCP foi diluída 1/200 com água destilada estéril e em seguida usada pa-ra uma segunda reação de RCP usando 200 nM de iniciador embutido (nes-ted iniciadoή GWPSY2 e 200 nM de iniciador embutido AP2 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'; kit GenewaikeQ (ID SEQ NO.:29). RCPembutida foi incubada por 10 minutos a 94°C, seguido por 5 ciclos de ampli-ficação de 25 segundos a 94°C/4 minutos a 72°C e em seguida 22 ciclos deamplificação de 25 segundos a 94°C/4 minutos a 67°C. Uma banda de apro-ximadamente 1,8 kb foi recuperada após RCP e clonada em pCR4-TOPOpara produzir pCR4-GWPSY1, e a inserção desse plasmídeo foi seqüencia-da resultando na recuperação do ORF PSY de comprimento total após amontagem in siiico das seqüências.

Usando o kit Genewalker, a região 5' de violaxantina de-epoxidase foi recuperada a partir de Coffea canephora usando iniciadoresGWVDE1 (5'-ACATTTCTTTCGTGAGACTGCACACTC-3') (ID SEQ N0.:30),seguidos por RPC embutida (nested RCP) usando iniciador GWVDE2 (5'-ATCACCACATTTGATCTGGCATTCAGTC-3') (SEQ ID NO.:31). Uma bandade aproximadamente 2,3 kb foi recuperada e clonada em pCR4-TOPO paragerar pCR4-GWVDE, e a inserção desse clone foi seqüenciada resultandona geração do ORF de comprimento total de VDE. O ORF continha dois ín-trons de 128bp e 841 bp em posições 282 e 447, respectivamente, do ORF.Após a montagem in-silico das seqüências, o ORF 1248bp foi reclonado pormeio de RT-RCP usando os iniciadores VDEFWR (5'-CACCATGGCTTCTGCTTTGCATTCAGC-3') (ID SEQ NO.:32) e VDEREV(5'-ACTACCTTAGCTTCCTAATTGG-3') (ID SEQ NO.:33), e clonado empENTR/D (Invitrogen) para produzir pENTR-CcVDE. Esse clone foi em se-guida verificado por meio de seqüenciamento.

Usando o kit Genewalker, a região perdida 5' de CCD1 foi recu-perada usando iniciadores embutidos GWCCD11 (5'-AACAATCCGAACAGCCCCTTGAGATCCC-3') (ID SEQ NO.:34) eGWCCD12 (5'-GTTTAAGCCTTGATGTCTTCACGTACCG-3') (ID SEQNO.:35). Um fragmento 2475bp foi recuperado e clonado em pCR4-TOPOpara gerar pCR4-GWCCD1 no.1, e seqüenciou-se a inserção desse clone,resultando na geração de uma seqüência de codificação de comprimentoprolongado de CCD1 contendo três íntrons de 1604bp, 267bp e 605bp emposições 237, 309 e 324, respectivamente, do ORF. Porque essa etapa nãoproduziu uma seqüência de codificação de comprimento total, um segundociclo (round) de procedimento genômico (genome walking) foi realizado u-sando os iniciadores embutidos GWCCD13 (5'-TGCCAAGTTACTGTTCAATGACTAGGC-3') (ID SEQ NO.:36) e GWCCD14(5'-AAGCAATTTAATCCCGTCCTTAATCTGG-3') (ID SEQ NO.:37). Essaetapa de procedimento genômico (genome waiking) resultou em fragmento1045bp, o qual foi clonado em pCR4-TOPO para gerar pCR4-GWCCD1 no.2, e seqüenciou-se a inserção desse clone. A seqüência de codificação decomprimento total foi gerada a partir das duas seqüências de sobreposiçãogenewalker e da seqüência EST (cccwc22w2a6). Após a montagem in-silicodas seqüências, o ORF de 1647bp foi reclonado por meio de RT-RCP usan-do iniciadores CCD1FWR (5'-CACCATGGGTAGGCAAGAAGGAGAAG-3')(ID SEQ NO.:38) e CCD1REV (5'-ACTCTCCAGGACATGGTCCAGC-3') (IDSEQ NO.:39), e clonado para pENTR/D (Invitrogen) para gerar pENTR-CcCCDI. Esse clone foi em seguida seqüenciado.

Usando o kit Genewalker, obteve-se a seqüência de codificaçãototal de NCED3 usando iniciadores embutidos GWNCED3F (5'-AAGCAGAAGCAGTCAGGGACTTCTACC-3') (ID SEQ N0.:40) e GWN-CED3R (5'-TATCCAGTACACCGAATCTTGACACC-3') (ID SEQ NO.:41).Esta gerou um fragmento 2,5 kb, que foi clonado em pCR4-TOPO para gerarpCR4-GWNCED no.4. A inserção desse clone foi seqüenciada, resultandono quadro de leitura aberta de comprimento total de 1908bp e 1104bp amontante do ATG. Consistente com outros NCEDs, CcNCED3 relatados ne-nhum deles contêm íntrons.

A montagem in-silico do ORF será confirmada por meio de RT-RCP usando iniciadores NCED3FWR (5'-CACCATGATGGGCTTGGGTTTGGGTTGC-3f) (ID SEQ NO.:42) eNCED3REV (5'-TCACAAGTTTCTTTCaGTTCCAGGC-3') (ID SEQ NO.:43).O CcNCED3 será clonado em pENTR/D (Invitrogen) para gerar pENTR-CcNCED3, e esse clone em seguida será verificado por seqüenciamento.

O cDNA β-caroteno hidroxilase de comprimento total foi recupe-rado de grão por meio de RT-RCP usando iniciadores pCHYFWR (5'-CACCATGGCTGCCGGAATTGCCGTC-3') (ID SEQ NO.:44) e pCHYREV(5'-CAAGTTGCGTAAGGGTTCATAA-3') (ID SEQ NO.:45) e clonado empENTR/D (Invitrogen) para gerar pENTR-Cc3CHY. Esse clone foi verificadopor seqüenciamento.

Isolamento de cDNA Usando Iniciadores Degenerados:

Uma pesquisa do banco de dados EST de PDS revelou nenhu-ma seqüência correspondente. Contudo, um cDNA de comprimento parcialde 897bp foi recuperado de grão amarelo robusta por meio de RT-RCP u-sando iniciadores degenerados DegPDS2 FWR (5'-GGTGGAAAGRTAGCTGCATGGA-3') (ID SEQ NO.:46) e DegPDS4 REV(5'-TGTTACRGACATGTCAGCATACAC-3') (ID SEQ NO.:47), os quais cor-respondem às seqüências de peptídeos conservadas GGKVAAW (ID SEQNO.:48) e VYADMSVT (ID SEQ NO.:49) encontradas em ortólogos LePDS(CAA55078), CaPDS (CAA48195) e AtPDS (AAA20109). Para gerar o cD-NA, RCP foi realizada como segue: 3 minutos a 94°C, seguido por 10 ciclosde 1 min. a 94°C; 30 segundos a 60-50°C (diminuindo temperatura em 1°Cpor ciclo); 2 min. a 72°C, seguido por 25 ciclos adicionais de 1 min. a 94°C;30 segundos a 50°C; 2 min. a 72°C.

Usando o kit Genewalker, a seqüência de codificação parcial dePDS foi prolongada usando iniciadores embutidos GWPDS1 (5'-ATCATTGAATGCTCCTTCCACTGCAAC-3') (ID SEQ N0.:50) θ GWPDS2(5'-TCATTAATTCCTAGTTCTCCAAACAGG-3') (ID SEQ N0.:51). Esta ge-rada de um fragmento de 2066bp. Esse fragmento foi clonado em pCR4-TOPO para gerar pCR4-GWPDS no.5. A inserção desse clone foi seqüenci-ada, resultando em 225bp adicional da seqüência de codificação e um ORFparcial de 1077bp contendo 3 íntrons de 616bp, 373bp e 609bp em posições122bp, 215bp e 272bp do ORF parcial, respectivamente.

Nenhuma seqüência correspondente foi detectada no banco dedados EST de ZDS1 contudo, um clone cDNA parcial de 472 bp foi recupe-rado usando os iniciadores não-degenerados DegZDSI FWR (5'-TTGCAGGCATGTCGACTGCTG-3') (ID SEQ NO.:52) e DegZDS3 REV (5'-GTGGGATCCTGTTGCATATGCTCT-3') (ID SEQ N0.:50), os quais codifi-cam as seqüências de aminoácidos conservadas LAGMSTAV (ID SEQNO.:54) e MWDPVAYAL (ID SEQ NO.:55) nos ortólogos Zeta-caroteno de-saturase LeZDS (AF195507), CaZDS (X89897) e AtZDS (U38550). O cDNAde café usado para recuperar esse clone de cDNA parcial foi gerado de grãorobusta no estágio amarelo. As condições de RCP são as mesmas conformeusadas para clonagem do cDNA de PDS (descrito acima). O fragmento decDNA parcial obtido foi clonado em pCR4-T0P0 para gerar pCR4-CcZDSno.1.

Extração de RNA Total e Geração de cDNA:

Amostras armazenadas de tecido vegetal sob -80°C foram moí-das em um pó e RNA total foi extraído desse pó usando o método descritopor Lepelley e outros, (esse é a referência HQT/HCT). Para remover DNA,amostras foram tratadas com DNase usando o kit "Qiagen RNase-FreeDNase" de acordo com as instruções do fabricante. Todas as amostras deRNA foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose formalde-ído. Bandas de RNA ribossômico foram visualizadas com coloração de bro-meto de etídio.

Usando oligo (dT2o) como um iniciador; preparou-se cDNA deaproximadamente 4 pg de RNA total de acordo com o protocolo no kit Su-perscript Il Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para teste emrelação à presença de DNA genômico contaminante nas preparações decDNA, um par de iniciador foi projetado transpondo (spanning) um íntronconhecido de um cDNA de café específico ubiquoamente expresso, calconaisomerase (CHI). RT-RCP foi realizada usando 10 vezes diluição de cDNAcorrespondendo a 0,^g de RNA original. Reações convencionais de RCPcontinham 1x tampão e 5mM de MgCI2, 200 μΜ cada de dATP, dCTP, dGTPe dTTP, e 1 unidade de polimerase e 800 nM de cada iniciadores específicosa gene - FWD-CCCACCTGGAGCCTCTATTCTGTT (ID SEQ NO.:56) eREV-CCCCGTCGGCCTCAAGTTTC (ID SEQ NO.:57) de 35 ciclos. Umabanda de cDNA de 272 bp foi observada após RCP. Uma segunda bandaque corresponderia a cDNA + íntron em 750 bp não foi observada, indicandouma ausência de DNA genômico nas amostras (dados não mostrados). Es-sas amostras de RNA foram posteriormente usadas para gerar seqüênciasORF de comprimento total de acordo com os métodos descritos acima. Es-ses

ORFs foram subseqüentemente clonados em pENTR/D (Invitrogen).

RCP quantitativa TaqMan foi realizada com cDNA usando o pro-tocolo recomendado pelo fabricante (Applied Biosystems, Perkin-Elmefy To-das as reações continham 1x tampão TaqMan {ΡβΜη-ΕΙπίθή e 5 mM deMgCl2, 200 μΜ cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, e 0,625 unidades deAmpliTaq Gold polimerase. RCP foi realizada usando 800 nM de cada inicia-dores específicos a gene, avançados e inversos, e 200 nM da sonda Taq-Man e 1.000 vezes diluição de cDNA correspondendo a 0,001 μg de RNAoriginal. Iniciadores e sondas foram projetados usando software iniciadorexpress (Applied Biosystems: ver Tabela 1). A especificidade transversaldos iniciadores e de sondas é resumida na Tabela 4. A mistura reacional foiincubada por 2 minutos a 50°C, em seguida 10 minutos a 95°C, seguido por40 ciclos de amplificação de 15 segundos a 95°C/1 minuto a 60°C. Amostrasforam quantificadas no Sistema de Detecção de Seqüência GeneAmp 7500(Applied Biosystems). Níveis transcritos foram normalizados aos níveis dogene de controle rpl39.Tabela 1. Iniciadores e sondas usadas em RT-RCP quantitativa em temporeal. A coluna direita indica tamanho do amplicon.

<table>table see original document page 58</column></row><table>Reversa CAGCTGCACTGATGCCTCTAAT 86 Sonda1 CGCCATGACATTGG 87FIB1 Avançada CTGTCCAGGACACAGCATCCT 88 Reversa TCAGTG GTG GTC G GCTAG AAA 89 Sonda1 AGTCGCAAAGTCC 90RPL39 Avançada GAACAGGCCCATCCCTTATTG 91 Reversa CGGCGCTTGGCAATTGTA 92 Sonda2 ATGCGCACTGACAACA 93

Todas as seqüências são dadas 5' a 3'.

(1) Sondas MGB foram marcadas na extremidade 5' com corante repórterfluorescente 6-carbóxifluoresceína (FAM) e na extremidade 3' com coranteextintor (ηυβηοήθή 6-carbóxi-tetrametil-rodamina (TAMRA).

(2) Sondas RPL39 foram marcadas na extremidade 5' com corante repórterfluorescente VIC e na extremidade 3' com quencher TAMRA.Avaliação Funcional de cDNAs Selecionados em E. coli:

A funcionalidade de algumas proteínas codificadas foi testadapor meio de co-expressão do cDNA correspondente contendo seqüênciascompletas de ORF em cepas de E. coli que acumulam carotenóide. A CoffeaCCD1 de comprimento total foi recuperada do grão por meio de RT-RCPusando os iniciadores CCD1FWR (5'-

CACCATGGGTAGGCAAGAAGGAGAAG-3') (ID SEQ NO.:38) e CCD1REV(5'- ACTCTCCAGGACATGGTCCAGC-3') (ID SEQ NO.:39), e clonada novetor de entrada (gateway) pENTR/D (Invitrogen) para produzir pENTR-CcCCDI. A seqüência de clone pENTR-CcCCD1 foi idêntica àquela da se-qüência anterior in-silico. O ORF CCD1 foi transferido para o vetor de entra-da (gateway) de expressão bacteriana pDEST17 (Invitrogen) por meio derecombinação conforme descrita pelo fabricante (Invitrogen) para produzirpDEST17-CcCCD1.

Ao mesmo tempo, a Coffea pCHY de comprimento total foi recu-perada de grão por meio de RT-RPC usando iniciadores pCHYFWR (5'-CACCMGGCTGCCGGAATTGCCGTC-3') (ID SEQ NO.:44) e pCHYREV(5'-CAAGTTGCGTAAGGGTTCATAA-3') (ID SEQ NO.:45) e clonada empENTR/D (Invitrogen) para produzir pENTR-CcpCHY, e em seguida seqüen-ciada. O βΟΗΥ ORF foi transferido para o vetor de entrada (gateway) de ex-pressão bacteriana pDEST17 (Invitrogen) por meio de recombinação con-forme descrita pelo fabricante (Invitrogen) para produzir pDEST17-CcpCHY.

Plasmídeos pAC-LYC, pAC-BETA e pAC-ZEAX contendo con-juntos específicos de genes biossintéticos de carotenóide funcionais de Er-winia herbicola responsáveis por formação de licopeno, β-caroteno e zea-xantina, respectivamente (Cunningham e outros, 1994; Cunningham e ou-tros, 1996; Sun e outros, 1996; Cunningham e Gantt, 2001) foram co-transformados para cepa E. coli BL21-AI com os constructos pDEST17-CcCCDI ou pDEST17-CcpCHY descritos acima. Usou-se uma cultura de 3ml da noite para o dia de cada cepa, a qual é selecionada para conter ambosos conjuntos de plasmídeos por meio de adição de cloranfenicol (plasmídeospAC) e ampicilina (plasmídeo pDEST17), para inocular 50 ml de meio LBcontendo os antibióticos apropriados e 0,2% de glicose. As culturas foramcrescidas sob 28°C até uma densidade celular correspondente a uma absor-vência a 600 nm de 0,5 ser atingida. Expressão da proteína foi induzida poradição de 0,2% de arabinose e as culturas foram crescidas a 28°C da noitepara o dia. 2 ml da cultura de E. coli foram centrifugados, e o pellet celular foifotografado (Figura 6A e 7A). A cultura remanescente de E. coli foi centrifu-gada, e o pellet celular foi ressuspenso em um volume igual de formaldeído.Um volume igual de metanol foi então adicionado, seguido por dois volumesde acetato de etila. As fases foram separadas pela adição de água, e a faseacetato de etila foi retida para análise de HPLC. O acetato de etila foi evapo-rado sob vácuo e analisado por HPLC conforme descrito abaixo.

Análise de Carotenóide:

O método usado para analisar e quantificar carotenóides é deta-lhado in Fraser e outros (2000). Tipicamente, tecidos do grão foram moídosem um pó e foram secos por congelação e, alíquotas de 10-50 mg foramextraídas usando metanokclorofórmio (1:3 por volume) e particionadas con-tra 50 mM de Tris-HCI pH 7,0 (2 vols.).A fase aquosa foi reextraída duas ve-zes. Separações por HPLC foram realizadas em uma coluna de fase inversaC30 (250 χ 4,6 mm) adquirida de YMC, Wilmington, NC. As fases móveisusadas foram metanol (A), água/metanol (20/80 por vol.) contendo 0,2% deacetato de amônio (B) e éter terc-metil butílico (C). O gradiente usado foi95% de A/5% de B isocraticamente por 12 minutos, uma etapa a 80% deA/5% de B/ e 15% de C em 12 minutos, seguido por um gradiente linear a30% de A/5% de B/65% de C por 30 minutos (Fraser e outros, 2002).

Exemplo 2

Isolamento e Identificação de Genes de Coffea canephora Para o Cami-nho de Biossíntese de Carotenóides

ESTs que representam o cDNA mais longo disponível para ge-nes do caminho de biossíntese de carotenóides e aqueles envolvidos naformação dos apocarotenóides derivados de carotenóides foram isolados dabiblioteca apropriada e seqüenciados. Os cDNAs completamente seqüenci-ados foram então analisados em relação a homologias com seqüências co-nhecidas e nomeados como segue: fitoeno sintase (PSY) (cccs30w7e6), β-caroteno hidroxilase (BCH) (cccs46w21b8), Iicopeno ε-ciclase (LeCY)(cccp8f16), zeaxantina epoxidase (ZEP) (cccp129g15), violaxantina desepo-xidase (VDE) (cccp13a9) e dioxigenase 1de clivagem de carotenóides(CCD1) (cccwc22w2a6). ESTs adicionais que codificam a proteína estruturalFibrilina (FIB) implicada em estocagem de carotenóides (cccs16w15e14) eum ortólogo da oxidase com término plastídio, um co-factor para dessatura-ção de carotenóides (PTOX; cccl24o10) e uma Iicopeno ε-ciclase (LeCY)(cccp8f16) putativa foram também identificados. O número e distribuição dosESTs associados são mostrados na Tabela 2.

<table>table see original document page 61</column></row><table>PSY: Fitoeno sintase; PTOX: oxidase com término plastídio;βΟΗΥ: β-caroteno hidroxilase; LeCY: Iicopeno ε-ciclase; ZEP: zeaxantinaepoxidase; VDE: violaxantina desepoxidase; NCED3: 9-cis-epoxicarotenóides dioxigenase; CCD1: dioxigenase 1 de clivagem de caro-tenóides; FIB: Fibrilina; PDH: semelhante a fitoeno desidrogenase.A. Fitoeno sintase

O primeiro carotenóide verdadeiro é formado pela condensaçãode duas moléculas de difosfato de geranilgeranila em fitoeno e catalisadopela enzima fitoeno sintase (PSY; EC 2.5.1.32). Um clone de cDNA de com-primento parcial que codifica PSY (cccs30w7e6) foi identificado no banco dedados de ESTs de Coffea canephora da Cornell. Porque nesse clone estavafaltando a extremidade 5' do ORF, procedimento genômico (genome wal-king) foi empregado para recuperar a seqüência faltante 5' de 258 pb. Usan-do iniciadores embutidos GWPSY1 (5'-ACTTCACCGCAGCGATCATAAGCTTCAC-3') (ID SEQ NO.:26) e GWPSY2(5'-TTCACGTCCCAATCTTCTCGAGATCTC-3') (ID SEQ NO.:27), um frag-mento de aproximadamente 1800 pb de comprimento foi recuperado, clona-do em pCR4-TOPO para produzir pCR4-GWPSY1 e seqüenciado. Monta-gem "in silico" da seqüência revelou o ORF de comprimento complete dePSY. Como mostrado na Tabela 3, a seqüência de aminoácidos deduzida deCcPSY foi determinada como tendo 76% de identidade com Capsicum an-nuum PSY1 (X68017; Romer e outros, 1993), 74% de identidade com Lyco-persion esculentum PSY1 (X60441; Ray e outros, 1992) e 70% de identida-de com Amhirlnpw thaliana PSY (NM_1217?9)_

Tabela 3: Identidade com a seqüência de aminoácidos de fitoeno sintase deCoffea canephora com as seqüências mais homólogas de GenBank. NP=Não publicado.

<table>table see original document page 63</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com o ORF de comprimento completo.

2. NP = não publicado

A condensação de duas moléculas de difosfato de geranila emfitoeno por PSY verificou-se ser uma reação Iimitativa de taxa em diversasespécies e tecidos de plantas diferentes em diferentes estágios de desen-volvimento. Espera-se, assim, que a superexpressão de PSY em um grão demaneira específica seja útil para a superprodução de carotenóides e molécu-las de aroma derivadas de carotenóides no grão de café. Superexpressão dePSY específica a sementes foi realizada em outras espécies. Por exemplo, asuperexpressão de PSY específica a sementes em Arabidopsis levou a au-mento de carotenóides, aumento no teor de clorofila, um retardamento nagerminação e uma elevação de ABA (Lindgren e outros, 2003). Mostrou-seque a superexpressão de PSY específica a sementes e uma fitoeno dessatu-rase bacteriana (CRTI, de Erwinia uredovora) em endosperma de arroz diri-ge a síntese de β-caroteno, bem como a formação de xantofilas adicionais ajusante (Beyer e outros, 2002; Paine e outros, 2005). Superexpressão dePSY em sementes de canola levaram a um aumento de 50 vezes na produ-ção de carotenóides (Shewmaker e outros, 1999).

A Figura 4A mostra a seqüência de aminoácidos de Coffea ca-nephora (CcPSY) alinhada com a maior parte das seqüências homólogas nobanco de dados de proteínas não-redundantes de GenBank.

B. Fitoeno dessaturase, Ç-caroteno dessaturase e licopeno ciclases

Fitoeno pode sofrer quatro etapas consecutivas de dessaturaçãocatalizada pelas enzimas fitoeno dessaturase (PDS; EC 1.3.99) e ζ-carotenodessaturase (ZDS; EC 1.14.99.30) (Bartley e outros, 1992, Hugueney e ou-tros, 1992; Albrecht e outros, 1995). Essas etapas de dessaturação exigem apresença de uma oxidase com término plastídio (PTOX) como co-fator.

i) Fitoeno dessidrogenase

Nenhuma seqüência correspondente foi detectada no banco de dados deESTs para PDS ou ZDS. Entretanto, dois clones de comprimentos parciais(PDH, cccl31g22; PDH2, cccs46w13n19) que codificam proteínas semelhan-tes a fitoeno desidrogenase (PDH) foram detectados. O PDH1 de café foiverificado apresentar 72% de homologia com uma proteína semelhante aPDH de Arabidopsis e 23% de homologia com a proteína PDH de Phyeomy-ces blakesleeanus. A proteína PDH de Phycomyces blakesleeanus é capazde introduzir as quatro ligações duplas em fitoeno para formar licopeno,substituindo desse modo PDS e ZDS em Phyeomyees (Arrach e outros,2001; ver Figura 1). Acredita-se que essa proteína realize uma função similarem um ou mais tecidos de café.

ii) Fitoeno dessaturase

Porque clone para PDS foi encontrado nas bibliotecas de ESTs de café, ex-perimentos foram realizados para gerar um clone de cDNA de PDS de-novo.Os experimentos resultaram na geração de um cDNA parcial de PDS de 897pb usando RCP-TA com cDNA gerado de grão robusta amarelo. RCP-TA foirealizado usando os inieiadores degenerados DegPDS2 FWR (5'-GGTGGAAAGRTAGCTGCATGGA-3') (ID SEQ NO.: 46) e DegPDS4 REV(5'-TGTTACRGACATGTCAGCATACAC-3') (ID SEQ NO.: 47), que foramprojetados das seqüências de peptídeos conservadas GGKVAAW (ID SEQNO.: 48) e VYADMSVT (ID SEQ NO.:49) encontradas em LePDS (CA-A55078), CaPDS (CAA48195) e AtPDS (AAA20109). O produto de RCP de897 pb foi clonado em pCR4-T0P0 para gerar pCR4-PDS. Usando o kit Ge-newalker, a seqüência de codificação parcial de PDS foi estendida usandoinieiadores embutidos GWPDS1 (5'-ATCATTGAATGCTCCTTCCACTGCAAC-3') (ID SEQ NO.: 50) e GWPDS2(5'-TCATTAATTCCTAGTTCTCCAAACAGG-3') (ID SEQ NO.: 51), resultan-do na geração de um fragmento de 2066 pb. Esse fragmento foi clonado empCR4-T0P0 para gerar pCR4-GWPDS#5. O clone resultante foi seqüencia-do resultando em 225 pb adicionais da seqüência de codificação e um qua-dro de leitura aberta de 1077 pb contendo 3 íntrons de 616 pb, 373 pb e 609pb nas posições 122 pb, 215 pb e 272 pb do ORF parcial, respectivamente.

A Figura 4B mostra a seqüência parcial de aminoácidos de PDS de Coffeacanephora (CcPDS) deduzida de plasmídeos pCR4-CcPDS e pCR4-GWPDS#5. O ORF parcial foi alinhado com a maior parte das seqüênciashomólogas no banco de dados de proteínas não-redundantes de GenBank.

Tabela 4: Identidade da seqüência de aminoácidos de fitoeno dessaturasede Coffea canephora com as seqüências mais homólogas de GenBank.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com seqüência parcial de PDS de Coffea canephora eas regiões correspondentes de ortólogos.

2. NP = não publicadoiii) Zeta-caroteno dessaturase

Porque nenhum clone para ZDS foi encontrado nas bibliotecas de ESTs decafé, experimentos foram realizados para gerar um clone de cDNA de ZDScDNA de-novo. Esses experimentos resultaram na geração de um cDNAparcial de ZDS de 472 pb usando RCP-TA com cDNA gerado de grão derobusta amarelo. A RCP-TA foi realizada utilizando os iniciadores não-degenerados DegZDSI FWR (5'-TTGCAGGCATGTCGACTGCTG-3') (IDSEQ NO.: 52) e DegZDS3 REV (5'-GTGGGATCCTGTTGCATATGCTCT-3')(ID SEQ NO.: 53), que foram projetados das seqüências de peptídeos con-servadas LAGMSTAV (ID SEQ NO.: 54) e MWDPVAYAL (ID SEQ NO.: 55)de ortólogos LeZDS (AF195507), CaZDS (X89897) e AtZDS (U38550).

O produto de RCP de 472 pb foi clonado em pCR4-TOPO para gerar pCR4-ZDS#1. A Figura 4C mostra a seqüência parcial de aminoácidos de ZDS deCoffea canephora (CcZDS) deduzida do plasmídeo pCR4-CcZDS#1 em umalinhamento com a maior parte das seqüências homólogas no Banco de da-dos de proteínas não-redundantes de GenBank. A Tabela 5 mostra a % deidentidade das seqüências na Figura 4C nas regiões de superposição. Osaltos níveis de homologia são consistentes com a noção de que pCR4-CcZDS#1 codifica um cDNA parcial que codifica o gene CcZDS para ZDS deCoffea canephora . As regiões restantes de codificação de 5' e 3' desse ge-ne podem ser obtidas usando as técnicas bem conhecidas de RACE e wal-king auxiliado por iniciadores de 5' e 3'.

Tabela 5: Identidade da seqüência de aminoácidos de zeta-caroteno dessa-turase de Coffea canephora com as seqüências mais homólogas de Gen-Bank. NP= Não publicado.

<table>table see original document page 66</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com seqüência parcial de ZDS de Coffea canephora eas regiões correspondentes de ortólogos.

2. NP = não publicado

iv) Oxidase com Término Plastídio

Um clone de cDNA de comprimento completo que codifica PTOX (cc-cl24o10), um co-fator para dessaturação de fitoeno (Carol e outros, 1999;Josse e outros, 2000; para revisão, ver Kuntz, 2004), foi detectado no bancode dados de ESTs de C. canephora. Alinhamento de PTOX com as seqüên-cias mais homólogas de GenBank revelou 60% de homologia com o tomate(AF177980) e 61% de homologia com a pimenta (AF177981), e 46% de ho-mologia com as proteínas PTOX de Arabidopsis (AJ004881) (ver Tabela 6).

A seqüência de aminoácidos com término C foi alinhada com as três se-qüências mais próximas no bando de dados NCBI. Esse alinhamento é a-presentado na Figura 4D.

Tabela 6: Identidade da seqüência de aminoácidos de oxidase com términoplastídio de Coffea canephora com as seqüências mais homólogas de GenBank.

<table>table see original document page 67</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W ciustal usandoparâmetros padrões com o ORF de comprimento completo.

2. NP = não publicado

Licopeno é ele próprio o precursor de pseudoionona (Figura 2V) via umadioxigenase de clivagem 9Ί0 (CCD1; Simkin e outros, 2004b) e 6-metil-5-hepten-2-ona (MHO) via uma dioxigenase de clivagem 5'6 (CCD4; Bouvier eoutros, 2004a). Tanto MHO quanto pseudoionona são potentes contribuido-res para o aroma do fruto de tomate (Buttery e outros, 1990; Baldwin e ou-tros, 2000). Sem pretender estar ligado a qualquer teoria particular, acredita-se que embora nenhum dos dois tenha sido detectado em grão de café atéagora, esses produtos derivados de carotenóides poderão tornar-se não de-tectados porque eles co-eluem com outros voláteis mais abundantes no café.

β-caroteno forma-se pela enzima Iicopeno β-ciclase (LpCY; Cunningham eoutros, 1996), que introduz duas estruturas em anel β nas extremidades dacadeia de carbonos e α-caroteno forma-se pelas enzimas Iicopeno ε-ciclase(UCY; Ronen e outros, 1999) e ίβΟΥ, que introduzem um anel ε e um anelβ, respectivamente. Um cDNA correspondente para uma LeCY (cccp8f16) decafé putativa foi identificado no banco de dados de ESTs de C. canephorada Nestlé-Cornell.

C. β-caroteno hidroxilase

Carotenóides oxigenados são formados por duas etapas sucessivas de hi-droxilação. β-caroteno é convertido em zeaxantina pela ação da enzima β-caroteno hidroxilase (βΟΗΥ; EC 1.14.13-; Sandmann, 1994) e α-caroteno éconvertido em luteína pelas ações de βΟΗΥ e ε-caroteno hidroxilase (eCHY)juntamente. eCHY foi apenas recentemente clonado (Tian e outros, 2004;Tian e DeIIaPenna1 2004; para revisão, ver Inoue, 2004) e um mutante defi-ciente de luteína (IutI) foi caracterizado (Pogson e outros, 1996; Tian e Del-IaPenna, 2001).

Um clone de comprimento completo (cccs46w21b8) + íntron que codificamuma proteína com 73% de identidade com βΟΗΥ de L. esculentum (Y14809;Hirshberg e outros, 1998) e 67% de identidade com pCHY de A. thaliana(NM_124636) foi. identificado com o banco de dados de ESTs de C. cane-phora (ver Tabela 7).

Tabela 7: Identidade da seqüência completa de aminoácidos de β-carotenohidroxilase de Coffea canephora com as seqüências mais homólogas deGenBank. NP = Não publicado.

<table>table see original document page 68</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com o ORF de comprimento completo.

2. NP = não publicado

A Figura 4E mostra a seqüência de aminoácidos de ΟοβΟΗΥalinhada com a maior parte das seqüências homólogas no banco de dadosde proteínas não-redundantes de GenBank mostradas na Tabela 7.

D. Licopeno ε-ciclase

Licopeno é convertido em a-caroteno (β,ε-caroteno, Figura 1E) e β-carotenopela atividade de duas enzimas, Iicopeno ε-ciclase (Ι_εΟΥ; Ronen e outros,1999) e Iicopeno β-ciclase (LfiCY). UCY introduz um anel ε e LfiCY introduzum anel β para formar α-caroteno. A atividade de Ι_εΟΥ também resulta naformação do intermediário δ-caroteno (ε,ψ-caroteno) que apresenta um anelε e uma extremidade psi não ciclizada. Em plantas tal como Lactuca sativa(alface), LeCY introduz duas estruturas em anel ε nas extremidades da ca-deia de carbonos, resultando na formação de ε-caroteno (ε,ε-caroteno; Cun-ningham e Gantt 2001) (Figura 1F).

Um cDNA parcial (pcccp8f16) que representa o domínio de término C deuma proteína com 86% de identidade com β LeCY de T. erecta (AF251016;Moehs e outros, 2001) e 77% de identidade com LeCY de L. sativa(AF321538; Cunningham e outros, 2001) foi identificado no banco de dadosde ESTs de C. canephora (Tabela 8).

Tabela 8: Identidade da seqüência de aminoácidos com término C de Iico-peno ε-cyclase de Coffea canephora com as seqüências mais homólogas deGenBank. NP = Não publicado.

<table>table see original document page 69</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com seqüência parcial de LeCY de Coffea canephora eas regiões correspondentes de ortólogos.

2. NP = não publicado

A Figura 4F mostra a seqüência parcial de aminoácidos com término de C-cLeCY alinhada com a maior parte das seqüências homólogas no banco dedados de proteínas não-redundantes de GenBank.

E. Zeaxantina epoxidase e violaxantina desepoxidase

Os anéis β hidroxilados de zeaxantina são epoxilados pela enzima zeaxanti-na epoxidase (ZEP; Marin e outros, 1996; Bouvier e outros, 1996) e desepo-xilados pela atividade de violaxantina desepoxidase (VDE) em um ciclo re-versível implicado na adaptação de plastídios a condições de luz ambientealteráveis. Clones de cDNAs parciais tanto para VDE (cccp13a9) quanto pa-ra ZEP (cccl29g15) foram identificados no banco de dados de ESTs de C.canephora.

A seqüência de aminoácidos com término C de ZEP de Coffeacanephora (CcZEP) deduzida foi alinhada com as seqüências mais homólo-gas de GenBank e verificada codificar uma proteína com 72% de homologiacom a seqüência de aminoácidos com término C de ZEP de L esculentum(Z83835; Burbridge e outros, 1997), 71% de homologia com a seqüência deaminoácidos com término C de ZEP de Prunus armeniaca (AF159948; Mbe-guie-A-Mbeguie e Fils-Lycaon, 2000), 60% de homologia com a seqüênciade aminoácidos com término C de ZEP de Oryza sativa (AB050884; Agrawale outros, 2001) e 52% de homologia com a seqüência de aminoácidos comtérmino C de ZEP de Arabidopsis thaliana (NM_126103) (Tabela 9).Tabela 9: Identidade da seqüência de aminoácidos com término C de zea-xantina epoxidase de Coffea canephora com as seqüências mais homólogasde GenBank. NP = Não publicado.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com seqüência parcial de ZEP de Coffea canephora eas regiões correspondentes de ortólogos.

2. NP = não publicado

A Figura 4G mostra a seqüência parcial de aminoácidos com término N deCcZEP alinhada com a maior parte das seqüências homólogas no banco dedados de proteínas não-redundantes de GenBank.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

Um clone de cDNAs de comprimento parcial de VDE (cccl29g15, inserção de1132 pb) foi identificado no banco de dados de ESTs de C. canephora daNestlé-Cornell. A seqüência de codificação desse gene foi estendida usandoo kit GenomeWaIker. A parte restante do ORF de CcVDE foi obtido usandokit GenomeWaIker e iniciadores embutidos GWVD E1 (5'-ACATTTCTTTCGTGAGACTGCACACTC-3') (ID SEQ NO.: 30) e GWVDE2(5'-ATCACCACATTTGATCTGGCATTCAGTC-3') (ID SEQ NO.: 31). Essegenoma walk resultou na geração de um fragmento de 2,3 kb. Esse frag-mento foi clonado em pCR4-TOPO para gerar pCR4-GWVDE. A inserçãodesse clone foi seqüenciada resultando no ORF de comprimento completode 1248 pb após reconstrução in silico.

A seqüência de aminoácidos de comprimento completo de VDE de Coffeacanephora deduzida (CcVDEj foi alinhada com as seqüências mais homólo-gas de GenBank e verificada codificar uma proteína com 74% de homologiacom a seqüência de aminoácidos de VDE de Nicotiana tabacum (U34817;Bugos e outros, 1998), 67% de homologia com a seqüência de aminoácidosde VDE de Oryza sativa (AF411133) e 67% de homologia com VDE de Ara-bidopsis thaliana (AY063067) (Tabela 10).

Tabela 10: Identidade da seqüência de aminoácidos de violaxantina dese-poxidase de Coffea canephora com as seqüências mais homólogas de Gen-Bank. NP = Não publicado.

<table>table see original document page 71</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W ciustal usandoparâmetros padrões com o ORF de comprimento completo.

2. NP = não publicado

A Figura 4H mostra a seqüência de aminoácidos completa de CcVDE ali-nhada com as três seqüências mais homólogas no banco de dados de prote-ínas não-redundantes de GenBank.

F. 9-cis-epoxicarotenóides dioxigenase 1

Um clone parcial de uma 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase(NCED3; cccwc22w23o20), envolvido na síntese do ácido abscísico de fito-hormônio de neoxantina (Tan e outros, 1997) foi detectado no banco de da-dos de ESTs de C. canephora. Em Arabidopsis thaliana, 5 cDNAs são res-ponsáveis por essa reação de clivagem de 9-cis, NCED2 (NM117945),NCED3 (NM112304), NCED5 (NM102749), NCED6 (NM113327) e NCED9(NM106486). O cDNA de C. canephora identificado aqui mostrou a ortologiamais alta com AtNCED3 (NM112304) e foi assim denominado CcNCED3.ABA é um apocarotenóide derivado de carotenóide formado pela ação deNCED3 (Tan e outros, 1997). NCEDs são dioxigenases de clivagem de11,12-carotenóides, que clivam neoxantina, em uma reação similar à forma-ção de uma variedade de apocarotenóides derivados de carotenóides impli-cados em sabor e aroma de vários alimentos de origem vegetal, para formarxantoxina, o precursor de ABA .

Seqüência completa de codificação de CcNCED3 foi obtida u-sando o kit GenomeWaIker e iniciadores embutidos GWNCED3F (5'-AAGCAGAAGCAGTCAGGGACTTCTACC-3') (ID SEQ NO.: 40) e GWN-CED3R (5'-TATCCAGTACACCGAATCTTGACACC-3') (ID SEQ NO.: 41),gerando um fragmento de 2,5 kb. Esse fragmento foi clonado em pCR4-TOPO para gerar pCR4-GWNCED#4. A inserção desse clone foi seqüencia-da resultando no ORF de comprimento complete de 1908 pb e 1104 pb, amontante de ATG. Como todos os NCEDs relatados, CcNCED3 não contémíntrons. A seqüência de aminoácidos com término N de NCED3 de Coffeacanephora (CcNCED3) deduzida foi alinhada com as seqüências mais ho-mólogas de GenBank e verificadas codificar uma proteína com 75% de ho-mologia com a seqüência de aminoácidos de NCED1 de L. escülentum(CAD30202; Thompson e outros, 2004), 75% de homologia com NCED1 deSolanum tuberosum (AAT75151), 70% de homologia com NCED1 de Vitisvinifera (AF159948; Sato e outros, 2004) e 66% de homologia com NCED3de Arabidopsis thaliana (BAB01336) (Tabela 11).

Tabela 11: Identidade da seqüência de aminoácidos de 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase 1 de Coffea canephora com as seqüênciasmais homólogas de GenBank NP = Não publicado.

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustai usando5 parâmetros padrões com o ORF de comprimento completo.

2. NP = não publicado

A Figura 41 mostra a seqüência de aminoácidos completa deCcNCED3 alinhada com as quatro seqüências mais homólogas no banco dedados de proteínas não-redundantes de GenBank.

G. Dioxiqenase 1 de clivaqem de carotenóides

Mostrou-se que dioxigenase 1 de clivagem de carotenóides(CCD1) é envolvida na formação de β-ionona, α-iononogeranilacetona epseudoionona in vivo (Simkin e outros, 2004b; ver Figura 2). Esse gene é departicular interesse devido a seu papel na formação de Ci3 cetona de gafa-nhoto de Neoxantina (Figure 3). Sem estar ligado a qualquer teoria particularou mecanismo de ação, postula-se que a cetoria de gafanhoto seja o precur-sor da formação de β-damascenona e 3-hidróxi-p-damascenona (Suzuki eoutros, 2002) (Figura 2), que são importantes voláteis de aroma de café ver-de e torrado.

Uma seqüência parcial de cDNA (pcccwc22w2a6) para CCD1 deCoffea canephora (CcCCDI) foi identificada no banco de dados de ESTs deC. canephora. A seqüência faltante de 5' foi recuperada usando o kit Geno-me Walker e os iniciadores GWCCD11 (5'-AACAATCCGAACAGCCCCTTGAGATCCC -3') (ID SEQ NO.: 34) eGWCCD12 (5'- GTTTAAGCCTTGATGTCTTCACGTACCG-3') (ID SEQ NO.:35). Um fragmento de 2475 pb foi recuperado e clonado em pCR4-TOPOpara gerar pCR4-GWCCD1 #1, e a inserção desse clone foi seqüenciada.Porque essa etapa não produziu uma seqüência de codificação de compri-mento completo, uma segunda rodada de genome walking foi realizada, u-sando os iniciadores embutidos GWCCD13 (5'-TGCCAAGTTACTGTTCAATGACTAGGC-3') (ID SEQ NO.: 36) e GWCCD14(5'-AAGCAATTTAATCCCGTCCTTAATCTGG-3') (ID SEQ NO.: 37), e umfragmento de 1045 pb foi recuperado. Esse fragmento foi clonado em pCR4-TOPO para gerar pCR4-GWCCD1 #2. A inserção foi seqüenciada resultandono ORF de CCD1 de comprimento completo após montagem in silico dasseqüências apropriadas. CcCGDI foi então alinhado com as seqüênciasmais homólogas de GenBank e verificado codificar uma proteína com 83%de homologia com L. esculentum (AY576001) e 78% de homologia comCCDis de L. esculentum (AY576002; Simkin e outros, 2004b), 82% de ho-mologia com CCD1 de Petunia χ hybrida (AY576003; Simkin e outros,2004a) e 79% de homologia com CCD1 de Arabidopsis thaliana (AJ005813;Neill e outros, 1998) (Tabela 12).

Tabela 12: Identidade da seqüência de aminoácidos completa de dioxigena-se 1 de clivagem de carotenóides de Coffea canephora com as seqüênciasmais homólogas de GenBank.

<table>table see original document page 74</column></row><table>

1. As identidades foram individualmente calculadas com W clustal usandoparâmetros padrões com o ORF de comprimento completo.

2. NP = não publicado

A Figura 4J mostra a seqüência de aminoácidos completa de CcCCDI ali-nhada com as quatro seqüências mais homólogas no banco de dados deproteínas não-redundantes de GenBank.

H. Fibrilina

Proteínas referidas como fibrilinas vegetais ou proteínas associ-adas a lipídeos de plastídios estendem-se de cianobactérias a plantas supe-riores (Laizet e outros, 2004), e nesse último caso em diversos tecidos, emassociação com uma variedade de diferentes estruturas lipídicas. Sem estarligado a qualquer teoria particular ou mecanismo de ação, acredita-se queproteínas fibrilina são envolvidas na estabilização de estruturas lipídicas emum ambiente aquoso (Vishnevetsky e outros, 1999). Adicionalmente, verifi-cou-se que estruturas de lipoproteínas poderão conter carotenóides (emmaior ou menor quantidades). A superexpressão de fibrilina em cloroplastosde fumo foi relatada levar a um aumento no número de píastoglóbulos, estru-turas de lipoproteínas implicadas em seqüestro de carotenóides (Rey e ou-tros, 2000). Pode ser, portanto, que fibrilina possa Iever a modificações no"poço" de carotenóides. Isso é sustentado pelos resultados de Li e outros(2001) que relatam que superacumulaçãò de carotenóides poderia estar as-sociada à proliferação de estruturas de deposição em vez de alterações naexpressão dos genes carotenogênicos ou à abundância das enzimas no mu-tante Orde Brassica oleracea. Igualmente, superexpressão da proteína fibri-lina em grão de café poderá conduzir a estocagem de carotenóides durantedesenvolvimento dos grãos.

Um clone de cDNA de comprimento completo (cccs16w15e14)que mostra 70%, 61% e 60% de homologia com as proteínas de fibrilina deCapsicum annuum (S56633; Deruère e outros, 1994a) e Arabidopsis thaiiana(NM-118350 e NM-116640; Laizet e outros, 2004), respectivamente, foi iden-tificado no banco de dados de ESTs de C. canephora (Tabela 13).

Tabela 13: Identidade da seqüência de aminoácidos de fibrilina de Coffeacanephora com as seqüências mais homólogas de GenBank.

<table>table see original document page 75</column></row><table>phora alinhada com as três seqüências mais homólogas no banco de dadosde proteínas não-redundantes de GenBank.Exemplo 3

Expressão de transcrito em grão de café

Usando os ensaios TaqMan, quantidades relativas de transcritospara PSY1 PDS, ZDS, PTOX, LeCYl J3CHY, ZEP, VDE1 CCD1, NCED3 eFIB1 foram quantificadas em grão de café de Coffea canephora e C. arabica.

Os resultados mostrados na Figura 5 proporcionam uma compa-ração dos dados de expressão de QRT-PCR obtidos para C. canephora(FRT05) com aqueles de C. arabica (T2308). À parte algumas claras dife-renças de expressão para o pequeno estágio verde, as duas amostras derobusta mostraram padrões de expressão relativamente similares, mas mos-traram significativas diferenças em padrões de expressão com a única a-mostra de arabica analisada. Esses dados sugerem que diferenças potenci-almente significativas nos padrões de expressão dos genes para o caminhode carotenóides no grão de café das variedades arabica e robusta.

Além disso, como se pode ver na Figura 5, confirma-se que cadatranscrito exibe expressão no grão durante desenvolivmento. Baixa expres-são de PSY, a primeira exima biossintética, em grão de café poderá ser im-portante para acumulação de carotenóides em grão de café (Figura 5A). Acondensação de duas moléculas de difosfato de geranilgeranila em fitoenopor PSY verificou-se ser uma reação Iimitativa de taxa em diversas espéciese tecidos de plantas diferentes em diferentes estágios de desenvolvimento.Uma diferença significativa entre grãos arabica e robusta foi observada nonível de acumulação de transcritos para PTOX (Figura 5D). Transcritos paraPTOX são mostrados ser significativamente maiores em todos os estágiosde grãos arabica quando comparados com grãos robusta. Dada a importân-cia de PTOX na dessaturação de fitoeno, determinada no mutante de arbi-dopsis immutans (Carol e outros, 1999) e mutante fantasma de tomate (Jos-se e outros, 2000), acredita-se que PTOX poderá desempenhar um impor-tante papel em biossíntese de carotenóides durante o desenwolimento degrãos. Uma outra importante diferença entre grão arabica e grão robusta éobservada com níveis de transcritos para CCD1, que parecem aumentar emgrão arabica durante desenvolvimento em contraste com uma diminuiçãoobservada em robusta (Figura 5J). Dada a importância de CCD1 na forma-ção de voláteis de aroma, uma análise mais detalhada de níveis de transcri-tos para CCD1 no grão de três genótipos de C. canephora (BP409, FRT05,FRT64) e um genótipo de C. arabica (T2308) foi realizada. Em todos os trêsgenótipos de C. canephora, transcrito para ÓCD1 diminuiu ou permaneceubaixo durante o desenvolvimento (Figura 6A). Em contraste, transcrito paraCCD1 em C. arabica (T2308) aumentou 4 vezes antes de desenvolvimento epermaneceu alto durante desenvolvimento (Figura 6A). No fim do período dematuração, os níveis de transcritos para CCD1 foram aproximadamente 4vezes (BP409) a 20 vezes (FRT05) maiores em C. arabica quando compa-rados com C. canephora.

Exemplo 4

Atividade de CCD1 e βΟΗΥ in E. coli

Plasmídeos que expressam proteína recombinante CcCCDI(pDEST17-CcCCD1) foram introduzidos em cepas de E. coli previamenteengenheiradas para acumular diferentes compostos de carotenóides (Cun-ningham e outros, 1994; Cunningham e outros, 1996; Sun e outros, 1996).Os carotenóides que se acumulam nessas cepas conferem cor às células, euma mudança ou perda de cor indica que os carotenóides foram modificdospelo novo produto genético introduzido. Quando cada uma das duas proteí-nas recombinants foi expressa em células que produzem licopeno, β-caroteno ou zeaxantina, perda de cor foi observada (Figura 6B). Essas ob-servações são consistentes com os resultados anteriormente relatados porSimkin e outros (2004b). Esses resultados confirmam que a enzima de caféCCD1 pode catabolizar uma faixa de substratos de carotenóide lineares ecíclicos que resultam na formação de uma faixa de apocarotenóides que de-pendem do substrato de carotenóides proporcionado.

Plasmídeos que expressam proteína recombinante CcpCHY(pDESΤ17-CcβCΗΥ) foram introduzidos em cepas de E. coli previamenteengenheiradas para acumulaar β-caroteno ou zeaxantina. A perda de corobservada na Figura 6B foi confirmada por análise de HPLC-PDA (Figura6C). Para avaliar a perda de cor observada, carotenóides foram analisados equantificados como segue:

Análise e detecção de carotenóides de E. coli por HPLC-PDA. Método deFraser e outros (2002) foi utilizado para realizar análises de HPLC-PDA. Asseparações foram realizadas em uma coluna de C30 de fase inversa (250 χ4.6 mm) fabricada por YMC e adquirida de Interchim (França). As fases mó-veis usadas foram metanol (A), água/metanol (20/80 em vol.) contendo ace-tato de amônio 0,2% (B) e éter terc-metil butílico (C). O gradiente usado foi95% de A / 5% de B isocraticamente por 12 minutos, uma etapa a 80% de A/ 5% de B/15% de C por 12 minutos, seguido de um gradiente linear a 30%de A / 5% de B / 65% de C por 30 min. Fraser e outros (2000).Análise e detecção de carotenóides de Coffea por HPLC. O método utili-zado para analisar e quantificar carotenóides a partir de grãos de C. arabica(T2308) e C. canephora (FRT05) é detalhado in Senger e outros (1993). Emresumo, 8 a 9 grãos foram moídos em nitrogênio líquido e secados por con-gelamento. Uma quantidade conhecida de astaxantina dissolvida em meta-nol foi adicionada a um tubo vazio e liofilizada. Sessenta miligramas (60 mg)de material seco por congelamento foram adicionados ao tubo e extraídosusando metanol: clorofórmio (1:3 em vol.), e divididos contra 50 mM de Tris-HCI, pH 7,0 (2 vol). Separações por HPLC foram efetuadas em uma colunade C18 de fase inversa (Macherey-NageI). O solvente consistiu inicialmentede 85% de acetonitrila/metanol (75:25) e 15% de água, seguido de um gra-diente de teor de água decrescente 8% em 12 min, 5% nos 10 min seguintese, em seguida, 0% nos 3 min seguintes. 100% de acetonitrila/metanol foramem seguida mantidos até o fim da corrida.

Quantificação de carotenóides foi obtida a partir de curvas de respostaa doses e identificação de carotenóides foi obtida por co-cromatografiae propriedades espectrais comparativas adquiridas on-line. Uma mu-

dança de cor de amarelo-laranja intenso para amarelo brilhante foi observa-do na presença de β-caroteno devido à atividade de pCHY, que converte β-caroteno em zeaxantina via o intermediário β-criptoxantina (Figura 1D a 1G).Essas observações são consistentes com os resultados anteriormente rela-tados por Sun e outros (1996). Nenhuma mudança de cor desse tipo foi ob-servada em cepas que acumulam zeaxantina, que eram amarelo brilhanteantes e aopos indução (Figura 7A). Para confirmar a mudança de cor, caro-tenóides foram extraídos das células e analisadas por HPLC. A Figura 7Bconfirma a presença de β-caroteno como o principal carotenóide antes deindução de CcpCHY por pDEST17. Em seguida à indução, o pico que repre-senta β-caroteno foi reduzido e dois novos picos que representam zeaxanti-na e o intermediário β-criptoxantina são observados. Esses dados mostramque ΟοβΟΗΥ apresenta uma atividade de β-caroteno hidroxilase que resultana formação de β-criptoxantina e zeaxantina a partir de β-caroteno.Também, como se pode ver na Figura 6C, nas culturas não- induzidas (NI),picos que representam licopeno, β-caroteno e zeaxantina são observados.Após indução de CCD1, a acumulação de cada um desses carotenóides foisignificativamente reduzida (I), embora o pico de astaxantina adicionada aoextrato como como um controle de carga permaneça do mesmo tamanho.Esses dados indicam que a proteína de café CCD1 pode catabolizar substra-tos de carotenóides tanto lineares quanto cíclicos. Expressão significativa deCCD1 em grãos de café (particularmente grãos arabica) foi detectada indi-cando que essa enzima está provavelmente gerando produtos de degrada-ção de carotenóides no gão, moléculas que são tanto metabólitos celularesnormais quanto, em alguns casos, precursores potenciais de aro-ma/precursores de aroma no café.Exemplo 5

25 Análise dos Carotenóides em Grão de Café Verde Imaturo e Maduro

Mostrou-se recentemente que grão de café mature arabica erobusta contêm baixos níveis dos carotenóides luteína e zeaxantina (Dege-nhardt e outros, 2004). Como é sabido que os níveis de carotenóides emalgumas sementes diminuem à medida que a maturação progride (Bonham-30 Smith e outros, 2006), examinamos os níveis de carotenóides encontradosem grão imaturo arabica e robusta e comparamos estes com os níveis en-contrados em grão maduro das mesmas variedades. Os perfis de HPLC ob-tidos são apresentados na Figura 8 e os níveis quantificados são dados naTabela 14.

A presença de diversos carotenóides no grão de café foi mostra-da pela análise de HPLC. Como mostrado nas Figuras 8A e B, um cromato-grama tomado sob 450 nm mostra a presença de neoxantina (1), violaxanti-na (2), luteína (3), a-caroteno (4) e β-caroteno (5) no grão de café verde. Ní-veis significativos de clorofilas AeB (picos e a e b) foram também detecta-dos, o que é provavelmente responsável pela cor verde de grãos de cafénão-torrados. Licopeno não foi detectado em grão de café, possivelmentedevido ao rápido turnover desse intermediário no caminho. Um cromatogra-ma tomado sob 280nm mostra um pico que poderá representar fitoeno, oprimeiro carotenóide verdadeiro e um potencial precursor da formação degeranilacetona (VI) (dados não mostrados).

Como antecipado, níveis significativamente maiores de foramencontrados no grão imaturo versus o grão maduro. Interessantemente, osexperimentos apresentados aqui também detectaram diversos outros caro-tenóides no grão de café. No grão imaturo, baixos níveis de quatro outroscarotenóides podem ser claramente observados, neoxantina, violaxantina, a-caroteno e β-caroteno. Como observado anteriormente para folhas de café(abaixo), a presença de α-caroteno foi inesperada, mas a identidade dessepico foi confirmada quando seu espectro e tempo de retenção foram verifi-cados ser idênticos a um α-caroteno padrão extraído de raiz de cenoura(dados não mostrados).

Não observamos quantidades significativas de zeaxantina emamostras de grãos maduros tanto arabica quanto robusta usados em con-traste com o registro anterior (Degenhardt e outros, 2004). Para confirmar aobservação de que zeaxantina não está presente, amostras foram reanali-zadas em uma coluna de C30 como descrito por Fraser e outros (2000),proporcionando uma separação mais completa de luteína e zeaxantina.Mesmo usando esse método, zeaxantina não foi detectada nessas amostras(dados não mostrados).

ESTs para PSY e BCH foram detectados no grão em 30 sema-nas de desenvolvimento. Dada a presença dos carotenóides terminais luteí-na e neoxantina em grão de café (ver Figura 1 e Figura 8), acredita-se quetodas as enzimas envolvidas na biossintese de carotenóides são expressasem níveis suficientes para manter fluxo através do caminho. O transcritoCCD1 foi também detectado em grão em 30 semanas de desenvolvimento eé provavelmente responsável pela formação de D-ionona (VI) e β-damascenona (IX) in vivo.

Tabela 14. Teor de carotenóides (Mg/g dw) em grão de Coffea arabica(T2308) e de C. canephora (FRT05).

<table>table see original document page 81</column></row><table>

Números representam os picos na Figura 8. Valores são médias de 3 a 4 determinações.Desvios padrões são mostrados entre parênteses. Amostras de 60 mg foram extraídas con-forme descrito em materiais e métodos. ND = Não detectado

Os resultados apresentados aqui mostram que sementes de ca-fé verde contêm pelo menos cinco diferentes carotenóides. A presença doscarotenóides terminais - luteína e neoxantina - em grão de café (ver Figura 8e Tabela 14) indica que todas as enzimas envolvidas em biossíntese de ca-rotenóides são expressas em níveis suficientes para manter fluxo através docaminho. Grãos de café desenvolvem-se em pequenas cerejas circundadaspor um pericarpo delgado, sendo eles, assim, protegidos de luz solar direta.Entretanto, verificou-se que grãos de café contêm ambas as clorofilas a e b,que são provavelmente responsáveis pela cor verde de grãos de café não-torrados.

Detectamos também a presença de uma quantidade de. a-caroteno em uma concentração de 2-18% do total de carotenóides depen-dendendo da variedade. Geralmente, tecidos verdes tais como folhas acu-mulam quantidades significativas de β-caroteno e luteína (para revisão, verFrank e Cogdell, 1996, e referências encontradas nos mesmos), mas não a-caroteno. Contudol α-caroteno pode ser encontrada nas folhas de algumasplantas tal como cenoura (Kock e Goldman, 2005). A presença de a-caroteno grão de café verde maduro é consistente com o registro anterior deα-caroteno em folhas de café (Simkin e outros, submetido), com o grão ver-de maduro de C. arabica contendo um nível relativo maior do que C. cane-phora. Esses níveis maiores de α-caroteno no grão verde maduro de C. ara-bica poderão estar relacionados com os níveis maiores de transcrito LeCY,que verificamos ser significativamente maiores em C. arabica quando com-prados com C. canephora (ver Figura 5). LfCVjuntamente com ΙβΟΥ é res-ponsável pela formação de α-caroteno a partir de Iicopeno (Ronen e outros,1999). Deve-se mencionar que níveis relativos mais baixos de luteína em C.arabica versus C. canephora acompanham um teor relativo mais alto de a-caroteno de grão de C. arabica. Esse resultado é consistente com aqueleanteriormente observado em folhas de café (abaixo). Assim, embora outraspossibilidades existam, uma possibilidade poderá ser que a acumulação deα-caroteno à custa de luteína é devida a níveis menores de transcriro ou ati-vidade enzimática de ε-caroteno hidroxilase, que juntamente com βΟΗΥ éresponsável pela formação de luteína a partir de α-caroteno (Tian e outros,2004; Tian e DeIIaPenna, 2004).

Permanece possível que a diferença global do perfil de carote-nóides entre C. arabica versus C. canephora apresentado aqui poderia ser oresultado de variações específicas a espécie ou específicas a variedade. Étambém possível que algumas das differences observadas sejam pelo me-nos parcialmente o resultado das diferentes condições de crescimento sobas quais as árvores se desenvolveram.

Exemplo 6

Isolamento de Promotores e Construção de Vetores

A região a montante 5' de NCED3 de Coffea canephora foi recu-perada usando o kit Genomewalker (BD Biosciences). Resumidamente, 2,5pg de DNA de Coffea canephora BP409 foram cortados independentementecom Dral1 EcoRV, Pvul e Stul para formar bancos DL1, DL2, DL3 e DL4 deGenomeWaIk, respectivamente. Após purificação, 0,5pg de DNA foi ligadoaos adaptadores de GenomeWaIker (25 μΜ) seguindo o protocolo do fabri-cante. Reações RCP subseqüentes continham 1x tampão e 5 mM de MgCI2,200 μΜ cada um de d ATP, dCTP, dGTP e dTTP, e 1 unidade de LA Taq po-Iimerase (Takara, Combrex Bio, Bélgica), e 200 nM de iniciador GWNCED3F(5'-AAGCAGAAGCAGTCAGGGACTTCTACC-3') (ID SEQ NO.: 40) e 200nM do iniciador de adaptador de GenomeWaiker AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; kit Genomewalker) (ID SEQ NO.: 28).A mistura reacional foi incubada por 10 min a 94°C, seguida de 7 ciclos deamplificações de 25 s a 94°C/4 min a 72°C e, em seguida, 32 ciclos de am-plificações de 25 s a 94°C/4 min a 67°C. A reação RCP foi diluída 1/200 eusada para uma reação RCP de um segundo utilizando 200 nM de iniciadorembutido GWNCED3R (5'-TATCCAGTACACCGAATCTTGACACC-3') (IDSEQ NO.: 41) e 200 nM de iniciador de adaptador embutido de Genome-Walker AP2 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3'; kit Genomewalker) (IDSEQ NO.: 29). RCP embutido foi incubado por 10 min a 94°C, seguido de 5ciclos de amplificações de 25 s a 94°C/4 min a 72°C e, em seguida, 22 ciclosde amplificações de 25 s a 94°C/4 min a 67°C. Um fragmento genômico de1.075 pb foi recuperado de DL2 e clonado no vetor pCR4-TOPO (Invitrogen)para produzir pCR4-GWNCED#4. A inserção desse clone foi seqüenciadaresultando em uma seqüência de 1.104 pb a montante do códon de partidaATG de NCED3 (ID SEQ NO.: 25).Exemplo 7

Teor de Carotenóides em Folhas de Café

Análise de extratos de folhas de café por HPLC mostraram queC. canephora continha uma teor de carotenóides maior que C. arabica.Quantificação de cada carotenóide (Tabela 15) revelou que as duas espé-cies mostram distribuições relativas similares dos carotenóides neoxantina,violaxantina e β-caroteno (aproximadamente 12-13% de β-caroteno, 14-16%de violaxantina e 13-14% de neoxantina). Uma das observações mais notá-veis da Tabela 15 é a presença de uma quantidade significativa de a-caroteno (pico 4: Figura 9), um intermediário na síntese de luteína, que nor-malmente não se acumula em folhas da maior parte das espécies, incluindoArabidopsis (Figura 9C). Para confirmar a identidade do pico como a-caroteno, o espectro e o tempo de retenção foram comparados e verificadosser idênticos àqueles de um α-caroteno padrão extraído de raiz de cenoura.Uma comparação de níveis de α-caroteno em C. arabica e C. canephoramostrou que folhas de C. arabica continham níveis relativos maiores de a-caroteno (12% e 3,5% do total de carotenóides, respectivamente). Em con-traste, C. canephora apresentou níveis relativos maiores de luteína (54%,em comparação com 48% em C. arabica). Os níveis maiores de α-carotenopoderão estar relacionados com níveis mais altos de transcrito LeCY, que semostraram ser significativamente maiores em C. arabica do que em C. ca-25 nephora. Adicionalmente, uma vez que folhas de C. canephora apresenta-ram níveis relativos de luteína maiores do que aqueles de C. arabica, e umavez que α-caroteno é o precursor direto de luteína, poderá ser que o teormais alto de luteína em folhas de C. canephora possa estar diretamente re-lacionado com os níveis menores de α-caroteno e, contrariamente, o teor deluteína menor em folhas de C. arabica esteja relacionado com o maior teorde α-caroteno.<table>table see original document page </column></row><table>zando a minicoluna Qiagen. Concentração e pureza de RNA vegetal totalforam determinadas por análise espectrofotométrica. A quantificação foi veri-ficada para todas as amostras de RNA em cada experimento por meio deeletroforese em gel de formaldeído agarose e inspeção visual de bandas derRNA após coração com brometo de etídio. cDNA foi preparado a partir deaproximadamente 2 pg de RNA total usando iniciador poli-dT de acordo como protocolo em Superscript Il Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen, Carls-bad, CA).

O RNA foi então usado para análise quantitativa de expressãopor RCP-TA dos genes para carotenóides e FIB1 (Figura 10). Análise deexpressão mostrou que o nível de trasncritos FIB1, PSY, ZDS, PTOX, βΟΗΥe VDE aumentou cada um durante o período de seca. Em contraste, a quan-tidade de transcrito ZEP aumentou sob a tensão inicial antes de diminuir,considerando que o transcrito para LeCY diminuiu rapidamente até níveisindetectáveis em algumas amostras. Nenhum aumento significativo na quan-tidade de transcrito PDS foi observado durante as primeiras 5 semanas detensão por estiagem, e somente uma das duas plantas mostrando os sinto-mas mais severos de tensão apresentou um aumento em PDS após 6 se-manas pós-estiagem.

Avaliamos também as alterações na expressão de genes paradioxigenase na clivagem de carotenóides nas folhas causadas por estiagemprolongada. A quantidade de transcrito CCD1 aumentou sob condições dedéficit de água e aumentou lentamente durante o período de amostragem deseis semanas. Em contraste, transcrito para NCED3 aumentou significativa-mente cedo, antes de diminuir durante todo o período de amostragem restante.

Pequenas diferenças nos níveis de transcritos foram observadasnas amostras de controle coletadas em dias diferentes (embora as amostrastenham sido todas coletadas ao mesmo tempo cada dia). Essa observação éprovavelmente uma manifestação de que alterações menores nas condiçõesambientais entre as duas plantas podem afetar ligeiramente a expressão degenes para carotenóides. Similarmente, as diferenças nos níveis de transcri-tos produzidas em cada uma das plantas estressadas foram possivelmentedevidas a diferenças específicas a amostras na taxa de desidratação após aremoção de irrigação. A planta localizada à esquerda dos histogramas mos-trou os sintomas físicos mais severos de déficit de água no fim do período deteste (dados não mostrados).

Déficit de água pode resultar em um aumento de produção deespécie de oxigênio reativo. Carotenóides, sendo envolvidos na proteçãocontra tensões oxidantes, poderão ser submetidos em taxas mais alta deturnover sob tensão de estiagem. Isso sugere que taxas de síntese maiorespoderão ser necessaries para manter níveis adquados de pigmentos emplantas privadas de água (ver Simkin e outros, 2003b). Portanto, examina-mos a expressão de alguns genes para biossíntese de carotenóide em fo-lhas de café sob condições de déficit de água. Porque o gene FIB1/CDSP34é sabido responder a estressantes, tal como déficit de água, que afeta a fun-ção tilacóide (Manac'h e Kuntz, 1999; Langenkãmper e outros, 2001), exa-minamos os níveis de expressão de FIB1 nesse experimento como um clarocontrole de tensão por água. Como esperado, a expressão de FIB1 foi indu-zida fortemente em café por tensão devido a estiagem (Figura 10). Esse re-sultado confirmou que as condições experimentais usadas aqui levaram auma forte resposta a tensão no plastídio. Essa resposta a tensão é tambémdetectada em outras partes da célula porque experimentos adicionais utili-zando as mesmas amostras claramente demonstraram que o gene induzívelpor tensão por água deidrina CcDHIa (DQ323987) foi muito fortemente in-duzido nas amostras sob tensão por água e não nos controles irrigados (G.Pagny e J. McCarthy; resultados não-publicados).

Observamos que o nível de transcrito para Iicopeno épsilon ci-clase em folhas de café diminuíram sob condições de déficit de água paraníveis indetectáveis. Essa aparente repressão poderia redirecionar o fluxometabólico da ramificação luteína do caminho na ramificação xantofila (zea-xantina, anteraxantina e violaxantina) do caminho. As xantofilas contribuírampara a dissipação de excesso de energia de fotossíntese por meio de ummecanismo conhecido como ciclo de xantofila. Duas enzimas são envolvidasnesse ciclo, ZEP e VDE. ZEP catalisa a conversão de zeaxantina em ante-raxantina e em seguida em violaxantina. VDE catalisa a reação inversa. Sobcondições normais, atividade de ZEP resulta em um alto teor de violaxantinae baixo teor de zeaxantina, embora atividade de VDE (e acúmulo de zeaxan-tina) seja induzida sob condições de excesso de luz (Ruban e outros, 1994;Woitsch e Rõmer, 2003). Nossos resultados mostram que, sob condiçõesnormais de crescimento, a quantidade de transcrito para ZEP é aproxima-damente 10 vezes maior que a de transcrito para VDE em C. arabica. Inte-ressantemente, os dados obtidos usando as plantas estressadas por águaindicam que o nível de transcrito para ZEP primeiro aumenta durante a parteinicial da resposta a tensão, em seguida diminui à medida que o(s) sinal(ais)de tensão torna-se mais forte. A diminuição na quantidade de transcrito paraZEP é acompanhada por uma elevação concomitante constante na quanti-dade de transcrito para VDE em plantas estressadas por água. Pode ser queessa regulação de expressão de genes contribua para a operação ótima dociclo de xantofila sob tensão por água. De modo geral, esses resultados su-gerem que uma ou mais das seguintes estratégias poderiam ser usadas pa-ra aperfeiçoar a proteção de tecidos de plantas verdes, incluindo aquelas decafé, a partir de tensão por água: 1) aumento de síntese de carotenóides emgeral, por exemplo aumentando a expressão de PSYem café antes da res-posta a tensão (mais responsivo a sinal), 2) reduzir a expressão de LeCYantes da resposta a tensão para aperfeiçoar entrada de carotenóides no ca-minho de síntese de xantofila, ou 3) aperfeiçoar a capacidade funcional dociclo de xantofila (por exemplo, aumentando a expressão de VDE ). Esses eoutros aperfeiçoamentos potenciais na resposta a tensão em café são agoratornados possíveis pelo isolamento das seqüências de cDNA de comprimen-to total para as enzimas do caminho de biossíntese de carotenóides e apo-carotenóides em café apresentadas aqui.

A presente invenção não se limita às modalidades descritas eexemplificadas aqui, mas é capaz de variação e modificação no escopo dasreivindicações anexas.References:Agrawal, G.K., Yamazaki, M., Kobayashi1 M., Hiroehika, R., Miyao1 A.e Hiro-chika, H.

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A presente invenção não se limita às modalidades descritas e exemplifica-das acima, mas é capaz de variação e modificação dentro do escopo dasreivindicações anexas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<210> 1<211> 1320<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 1

atgtctgttg ctttgctatg ggttgtttta cctatctcag aggtcacgaa cagcattgca 60ttcctggaac cggtacggga aggaagccgg cttcttgatt cgtccaggtt cgtgggtcgg 120ggtaaaaact gcttgtgcaa tggcagactt gagaaaggca agcaacaaag gtggaattct 180ggttatctta atggagattc gagaaactgt tgcttgggag gctctaggtt gaagaaccga 240ggcaaatttt ctgtgattcc caatgtagtg gttagcccag ctggagaaat tgccatgtct 300tcagagcaaa aggtttatga tgtggttttg aagcaggcgg ccttggttaa tagacaattg 360agatctcgag aagattggga cgtgaagccc gatattgttc tcccaggaaa tttaaacata 420ttaagtgaag cttatgatcg ctgcggtgaa gtatgtgctg aatatgccca gactttttac 480ttgggaacaa tgctaatgac acctgagaga agaagagcta tttgggcgat atatgtttgg 540tgcaggagaa cagatgagct cgttgatggg cctaatgcat cacatataac tccaactgca 600ttggataggt gggaagcgcg attggaagat gtctttagag gtcatccttt tgatatgctt 660gatgctgctc tttcagatac tgtttccaag tttccagttg acatccagcc attcagagac 720atgattgaag gaatgagaat ggacctaaag aagtcaagat acaaaaactt tgatgagcta 780tacctctact gttactatgt ggccggtacc gttggattga tgagtgtccc agttatgggc 840attgcaccag aatcaaaagc aacagtagaa agtgtctata atgcagccct ggcattaggg 900attgctaacc agctgactaa catactaagg gatgttggag aagatgctac aagaggaagg 960atctacctac cccaagatga attag;cacag gcagggcttt cagatgagga tatatttgct 1020ggaaaggtca ctgaccaatg gaggaatttc atgaagcagc aaatgaaaag agcaaggaag 1080ttctttgatg aggcagagaa aggagtgacc gagctcaact ctgctagcag atggcctgta 1140tgggcatcgc tattgctgta tcgtcaaata ctcgacgaga ttgaagccaa tgactacaac 1200aattttgaca ggagagctta tgttagcaaa ccgaagaagt tacttgctct gccaatggca 1260tatgcaaagt ctcttgtacc tccaagaaca tcatctccgc tagcaaaagg catgagctga 1320<210> 2<211> 1077<212> DNA<213> Coffea canephora<220>

<221> misc_característica<222> (42) . . (43)

<223> Nucleotldeo desconhecido (N)<220>

<221> misc_característica<222> (825)..(827)

<223> Nucleotideo desconhecido (N)<400> 2

attgactatc caaggccaga gcttgaaaat gccgtcaact atttggaagc tgcttattta 60tcatcaacat tccgtacttc tcctcatcca aataaaccat tagaggtggt gatcgccggt 120gcaggtttgg ctggtttgtc tactgcaaag tatttggccg atgcaggtca taaacctata 180gtgttggaag ctagggatgt tctgggagga aaggttgctg catggaaaga tgatgatgga 240gactggtatg agactggcct gcacgtattc tttggggctt acccaaatat gcagaacctg 300tttggagaac taggaattaa tgatcggttg cagtggaagg agcattcaat gatatttgca 360atgccaaata agcctggaga gttcagtcga tttgattttc ctgaggtgct accagcacca 420ttaaatggaa tatgggccat cttgaagaat aatgacatgc ttacttggcc agagaaagtc 480aaatttgcaa ttggactctt gccagcaatt ctgggtggac aatcttatgt tgaggcacaa 540gatggtataa ctgtcaaaga ctggatgaga aagcaaggca taccagatcg ggtgactgat 600gaagtattct ttgccatgtc aaaggcactg aacttcataa atccagatga actttcaatg 660cagtgcattt taatagcttt gaaccgattt cttcaggaga agcatggatc caaaatggca 720tttttagatg gtaaccctcc agagagactt tgcatgccga ttgttgagca cattgagtca 780cgaggaggca gagtacacct taactcaaga attcagaaaa ttgagctcaa tgatgccgga 840agtgttgaaa acttcttgct gagtaatgga actgtgatta gaggagatgc ttatgtattt 900gccactccag ttgatatcct gaagcttctt ttgcctgagg attggaaaga gatgccatac 960ttcagaaagt tggagaaatt agttggagtt cctgttataa atgtgcacat atggtttgac 1020aggaagctca ggaacacata cgatcatctt ctttttagca gaagtccact tcttagt 1077<210> 3<211> 1056<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 3

atggcgacat caacgtcttc tgtggtgtttaaaataagga gttttagaaa tgtgcccactaatgttgtta cttcacctca tcataggcattcgtttagag tccaagcaac tgtgttgcaatcatttcaat cgaaaagtta ccctgaaaatgcttcatcct ctagtggttt ggagaaatggtttctcacgg actctgtgat aaagatacttaggttttttg ttctggaaac tattgcaaggcacttgtatg agagttttgg ttggtggagagagagctgga atgagatgca ccatctgctctggtttgacc ggtttctagc tcaacatattatgtatatgc tgagcccaag gatggcgtattttgaaacct atgacaaatt tatcaaggattcaaatgttg ctgtgaagta ttacacagagaccgcaagac cgcctacttc tcgaaggccaaacatcagag acgatgaagc cgagcattgcggccttcgct ctcctcactc atatacagatctaccccagg ctgattgtga agagctgacc<210> 4<211> 933<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 4

atggctgccg gaattgccgt cgcagccggctttctaaccc gaaaacccac ctccctagtccagcaattca gcacaactcg gaggcatcgactggaggatg aggaattgaa agcccagttggagaaagcga tggcgaagcg gatctctgatagatcggaga ggttcactta tctcgttgcgatggcagttc tggctgttta ctacagattttattcggaaa tgtttggcac atttgctctt

ggaatctctg tatcatcttc tacttctttg 60gtgttaaatt ctcatacccc ttctggttta 120actgctactc aacgtccact ctccaggaac 180gaggatgaac agaaagtggt ggtggaagaa 240ggaggaggag gaaacggaga gccacctgat 300gttgtaaaga ttgagcaatc cataaatatc 360gacactttgt atcatgatcg acattacgcg 420gttccctact ttgctttcat gtctgttctg 480agggcagatt tatctgaagt tcattttgca 540ataatggaag aactgggtgg aaattcttgg 600gcagtctttt actactttat gacagtcttt 660catttttctg agtgtgtgga aagtcatgcg 720caaggagagc aattgaagaa actaccagca 780gggaacttgt acttgtttga tgaatttcaa 840aagatagaga acatgtatga tgtgtttctg 900aagactatga aggcctgcca aactcatggg 960gatgcgtgtg aagaagatgc aggttatggc 1020cagtag 1056

gcccagacag tctgtttccg ggtcaactca 60gcagatagcc tgactctttc ccctttagcc 120aggaagccca ggttgacggt ttgttttgtg 180gtgacaagcg aggaggaagc gcgagagcgc 240gcaagaacgg cggagaaact agccaggaag 300gccgtcatgt ctagcttcgg aattacttcc 360gtttggcaaa tggagggcgg agaggtgcct 420tcagttggtg cagctgtggg aatggaattc 480tgggcgagat gggctcacaa agcgctgtggcaccatagac caagagaagg gcccttcgaggtccctgcca tagccctcct ttcttatggctgcttcggtg ccggccttgg gattatagtgggtctggtgc acaagagatt tccggttggtgttgcagctg cacatcagct gcatcattcgttcttagggc caaaggaact tgaaaaagtaaaccggagaa tcaagttgcg taagggttca<210> 5<211> 1413<212> DNA<213> Coffea canephora<400> 5

tgtgtggttg ataaagaaga aaagtttgcttctgagctcc tctacgttca aatgcaacagtcggataaga tgccggaaat atcagccggttgtggtcctg ctggacttgc ccttgccgcactaattggcc cagatgttcc tttcacaaatgatcttgggc ttgctggatg cattgágcatgataatgatc ccatcctcat cggtcgtgctgaggagctgc taagaaggtg tgtcgagtcaaggattgtcg aagctgctac cggtcacagtccctgcaggc ttgctactgt tgcatctggactgggaggtc ctagagtttc tgttcaaacaaatccatatg accccaatct gatggtcttcgttgaatctc tagaagcaga atttcccacaagagttttct ttgaggaaac ctgtttggctaagaaaaaac tgatgtcaag actggatactgaggaatggt cttatatacc agtcggtggagcatttggtg ctgctgccag catggtacatttgtcagagg ccccaaaata tgcttctgcaaaggacatga tgacccgaaa catatccgct

cacgcttcgt tatggcacat gcacgagtca 540cttaacgacg ttttcgccat aatcaacgcc 600ttcttccaca agggcctcat tcctggcctc 660tttggcatgg cgtacatgtt cgtccacgat 720cccattgcaa atgttcctta cttcagaaga 780gacaagttca acggcgtccc atttgggttg 840ggggggcttg aagagctgga aaaggaaatc 900taa 933

gatcaagaag attacatcaa ggctggtggg 60agaaagcaaa tggatcaaca gtctaaattt 120aatagcatac tggacttggt ggtgatcggc 180gagtcagcta agctaggtct gacggttggg 240aattatggtg tgtgggagga tgaatttaaa 300gtttggaggg acacagtcgt atatcttgat 360tatggacgat ttagtcgcca tttgctccat 420ggtgtgtcat atcttagctc ataggtggaa 480cttgtagagt gtgaaggcag cattgtgatt 540gcagcctctg gaaaactctt gcagtatgaa 600gcttatggtg tggaggttga ggtggaaaat 660atggattata gagactacat gaggggcaaa 720tttctttatg ctatgcccat gtctccaaca 780tcaaaagatg ccatgccatt tgaactatta 840ctaggagttc gaattatcaa aacttatgaa 900tctttgccaa atacagagca aaaaaatctt 960cctgccacag gctactcagt tgttagatca 1020atagcaaata tcttgaaaca aggtcaagct 1080caagcttgga acactctttg gccgcaagag 1140aggaaacgac agagagcatt cttcctttttgaggggataa ggacgttttt ccagactttctttcttggtt ctagtctttc ctcaacagacatagcaccaa atgacttaag aaagtgccttgcaaccatgg taagaacata tctcgctata<210> 6<211> 1032<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 6

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<210> 7<211> 1449<212> DNA

<213> Coffea canephora

ggattggcac ttattttgca gctggatatt 1200ttccgtttgc caaactggat gtcacaggga 1260ctcctgttat ttgcctttta tatgttcgta 1320atccagcatc ttttgtctga tccaaccggt 1380tag 1413

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<210> 8<211> 1551<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 8

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<213> Coffea canephora<400> 9

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gagaaaattg agggaaaaca agaagttgtg 60actgcaaagt tgatagattg ggtggaaaaa 120cagcctcttc attatctgag tgggaacttt 180gaccttcttg ttaagggtca tctaccggaa 240cccaatccca agttttctcc tgtggctgga 300catggtatac gcataaaaga tggaaaagca 360aggcttaaac aagaagaata ttttggggga 420gggctgttcg gattgttcat ggttaatatg 480gatatgactt atggaattgg aacagcaaat 540ctggcacttc aagaggctga taaaccatat 600caaactctag gcctgctgga ttacgacaaa 660aaggttgacc catttaccgg tgagatgttc 720atcacataca gagtaatatc caaggaggga 780tcagacccaa tcatgatgca cgattttgcc 840ctcccattgt acttcagacc gaaggaaatg 900gatccaacta agaaggctcg ttttggtgtt 960attaaatggt ttgagctgcc aaattgcttt 1020ggggatgagg ttattcttat cacttgccgt 1080ggcattgtga aaaagaagct tgaaaatttt 1140ctgaaaactg gtcttgcttc acagaagaaa 1200gtgaatgaga gctacactgg aaggaaacaa 1260attgccaagg tcacagggat tgccaaattt 1320acaaaaattg aagttggtgg taatgttcaa 1380ggttcggagg ctatctttgt tccacgccag 1440tacttgatat tcttcgtaca tgatgaatcg 1500gcaaaaacaa tgtcagctga tcctgttgcc 1560gggttccatg ctttctttgt gacagaggaa 1620caacttgaag aacaagcaaa actttga<210> 10<211> 963 -<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 10

atggcttcca tcacttcttt caatcaattccatcctcaat tcggcactaa agtttcaaataaaaagccgc tccaaagctc tatttcaatcgtagtactgg tggctgcagg cgatgattatgtggcggagg agccgccgcc aaaggagccggtggactcgt tttatggaac cgatagaggagtggtggaac tgatcaccca gctggaggctttgactctgc tcaatggcaa atggattcttttgttgtcga gaggcacact gcccttggtgtcagaggcct tctctgttga gaatgtcgtcattactacaa atgccaaatt tgaagtccgcgaaggtgtca ttggaactcc ccagttgacacttctgggac aaaagatcga tcttaaccccacagcatcct cagtcgcaaa gtccatttctaataggaatg ccgagtcgtg gcttctcaccaggggagatg gaggcagtat ttttgtgctttag 963

<210> 11<211> 1149<212> DNA

<213> Coffea canephora<400> 11

aaatctgcgt tttgggctca ttgcatgcgagtggatttta tggatctttt gctctctccaactgaagtcc tgaaggcaac acttgcaacacatacaccag gaactggcta tgttttgctttcatacacag taaagtctaa aacctttcaa 60tctgccgtga atttcaccga tttcggactg 120aaagaatcgt caaagaaaag gcctgggttt 180ggcccagagg aggaagcagc cggggttgcg 240agggagattg atatcttgaa gaaacggttg 300ttgaatgcca gcagcgagac gagggcggag 360aaaaacccaa ctccggctcc aactgaggcg 420gcgtacacgt cttttattgg attgtttcct 480aaggtggagg agatatcaca gaccattgac 540cagtttgctg ggccattggc tacgacgtcc 600agtcccaagc gcgtgcagat aaagtttgaa 660gactccattg agctgccaga aagtgtggag 720gttaagggct tgcttacttc tgtccaggac 780agccgaccac cactgaaatt ctctctttct 840acatacctgg atgatgagct tcggatttca 900atcaaggaag gctgccctct tctgaaacct 960

agagctgttt ccatgggcca aagàgagatg 60gcctcaaagg ttctaaataa ctggtttgag 120gatgcagtaa taggaaccac ggcaagtgtc 180catcacatca tgggagaaac tgatggtgat 240cgtggaattt ggtcatatgt tgaaggtgga atgggttccg tgtctttggc tgttggtagt 300gcagcacagg aggcgggtgc tacaatagtg actaaagctg aggtctcaaa attgctaatt 360ggtgattcag gaagagtaga cggggtgttg cttcctgatg gaactgaagt gcagtcttct 420gttgttttat caaatgctac tccatataaa acttttatgg aattagtgcc agaacatgtg 480cttcctgatg actttcttca ggcaatcaag tgttctgatt acagctctgc aactacaaaa 540attaacttgg ctgttgagcg agtgccacaa tttcagtgct gcaagattaa tcatcctaat 600gctggtcctc agcatatggg taccatccat attggttcag agaggatgga agaggttgat 660tcagcctgtc aagaagctgt aaatggtttt ccctctaaaa gacctatcat tgagatgaca 720atcccttctg tcttggacaa gactatctct ccccatggta agcatatcat caacttattt 780attcagtaca caccttataa acctttggat ggcagttggg aagaccctgc atatagggaa 840tcatttgcac aaagatgctt ctccttaatt gatgattatg cccctggctt tagctcgtca 900attcttggat atgacatgtt gactccacca gatcttgaga gagaaattgg tttgacagga 960ggaaatattt ttcacggtgc catggggttg gattctttgt tccttatgcg acctgttaaa 1020ggatggtcga attacaggac tccagtacaa ggtctatact tatgtggaag tggagctcat 1080cctgggggag gcgtgatggg tgctgccggt cgtaatgctg caggcacagt cattcaagac 1140tggaagtag 1149

<210> 12<211> 472<212> DNA<213> Coffea canephora<400> 12

tggagctttt ggatcaaggc catgaggtgg atatttatga atcacattct tttattggtg 60gtaaagtagg ttcttttgtt gataaacgag gaaatcacat tggaatggga ctgcatgtct 120tctttggttg ctacaacaac cttttccgcc tgatgaaaaa ggtaggtgct gataaaaatt 180tgctcgtgaa ggatcatact cacacatttg ttaacaaagg gggtgaaatt ggtgaacttg 240atttccgctt tccagttggg gcacctttac atggaattaa tgcattcttg tctaccaatc 300agctaaagat ttatgataag gcaagaaatg ccgtggctct cgcgcttggt ccagttgtac 360gggctctggt tgatcctgat ggagcgctga gggagatacg ggatttagac aggataagct 420tctcagattg gttcttatcc aaaggaggga ctcgcgcaag tatacagagg at 472<210> 13

<211> 439<212> PRT<213> Coffea canephora<400> 13

Met Ser Val Ala Leu Leu Trp Val Val Leu Pro Ile Ser Glu Val Thr15 10 15

Asn Ser Ile Ala Phe Leu Glu Pro Val Arg Glu Gly Ser Arg Leu Leu

20 25 30

Asp Ser Ser Arg Phe Val Gly Arg Gly Lys Asn Cys Leu Cys Asn Gly

35 40 45

Arg Leu Glu Lys Gly Lys Gln Gln Arg Trp Asn Ser Gly Tyr Leu Asn

50 55 60

Gly Asp Ser Arg Asn Cys Cys Leu Gly Gly Ser Arg Leu Lys Asn Arg65 70 75 80

Gly Lys Phe Ser Val Ile Pro Asn Val Val Val Ser Pro Ala Gly Glu

85 90 95

Ile Ala Met Ser Ser Glu Gln Lys Val Tyr Asp Val Val Leu Lys Gln

100 105 110

Ala Ala Leu Val Asn Arg Gln Leu Arg Ser Arg Glu Asp Trp Asp Val

115 120 125

Lys Pro Asp Ile Val Leu Pro Gly Asn Leu Asn Ile Leu Ser Glu Ala

130 135 140

Tyr Asp Arg Cys Gly Glu Val Cys Ala Glu Tyr Ala Gln Thr Phe Tyr145 150 155 160

Leu Gly Thr Met Leu Met Thr Pro Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp Ala

165 170 175

Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn

180 185 190

Ala Ser His Ile Thr Pro Thr Ala Leu Asp Arg Trp Glu Ala Arg Leu

195 200 205Glu Asp Val Phe Arg Gly His Pro Phe Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu

210 215 220Ser Asp Thr Val Ser Lys Phe Pro Val Asp Ile Gln Pro Phe Arg Asp225 230 235 240Met Ile Glu Gly Met Arg Met Asp Leu Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Asn

245 250 255

Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly

260 265 270

Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala Thr

275 280 285

Val Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ile Ala Asn Gln

290 295 300

Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Thr Arg Gly Arg305 310 315 320

Ile Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Ala Gly Leu Ser Asp Glu

325 330 335

Asp Ile Phe Ala Gly Lys Val Thr Asp Gln Trp Arg Asn Phe Met Lys

340 345 350

Gln Gln Met Lys Arg Ala Arg Lys Phe Phe Asp Glu Ala Glu Lys Gly

355 360 365

Val Thr Glu Leu Asn Ser Ala Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu

370 375 380

Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn385 390 395 400

Asn Phe Asp Arg Arg Ala Tyr Val Ser Lys Pro Lys Lys Leu Leu Ala

405 410 415

Leu Pro Met Ala Tyr Ala Lys Ser Leu Val Pro Pro Arg Thr Ser Ser

420 425 430

Pro Leu Ala Lys Gly Met Ser

435<210> 14<211> 359<212> PRT<213> Coffea canephora<400> 14

Ile Asp Tyr Pro Arg Pro Glu Leu Glu Asn Ala Val Asn Tyr Leu Glu1 5 10 15

Ala Ala Tyr Leu Ser Ser Thr Phe

20 25 30

Pro Leu Glu Val Val Ile Ala Gly

35 40 45

Ala Lys Tyr Leu Ãla Asp Ala Gly

50 55 60

Arg Asp Val Leu Gly Gly Lys Val

65 70 75 80

Asp Trp Tyr Glu Thr Gly Leu His

85 90 95

Met Gln Asn Leu Phe Gly Glu Leu

100 105 110

Lys Glu His Ser Met Ile Phe Ala

115 120 125

Ser Arg Phe Asp Phe Pro Glu Val

130 135 140

Trp Ala Ile Leu Lys Asn Asn Asp

145 150 155 160

Lys Phe Ala Ile Gly Leu Leu Pro

165 170 175

Val Glu Ala Gln Asp Gly Ile Thr

180 185 190

Gly Ile Pro Asp Arg Val Thr Asp

195 200 205Ala Leu Asn Phe Ile Asn Pro Asp210 215 220

Ile Ala Leu Asn Arg Phe Leu Gln225 230 235 240Phe Leu Asp Gly Asn Pro Pro Glu

245 250 255His Ile Glu Ser Arg Gly Gly Arg

Arg Thr Ser Pro His Pro Asn Lys

Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr

His Lys Pro Ile Val Leu Glu Ala;

Ala Ala Trp Lys Asp Asp Asp Gly

Val Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn

Gly Ile Asn Asp Arg Leu Gln Trp

Met Pro Asn Lys Pro Gly Glu Phe

Leu Pro Ala Pro Leu Asn Gly Ile

Met Leu Thr Trp Pro Glu Lys Val

Ala Ile Leu Gly Gly Gln Ser Tyr

Val Lys Asp Trp Met Arg Lys Gln

Glu Val Phe Phe Ala Met Ser Lys

Glu Leu Ser Met Gln Cys Ile Leu

Glu Lys His Gly Ser Lys Met Ala

Arg Leu Cys Met Pro Ile Val Glu

Val His Leu Asn Ser Arg Ile Gln260 265 270

Lys Ile Glu Leu Asn Asp Ala Gly Ser Val Glu Asn Phe Leu Leu Ser

275 280 285

Asn Gly Thr Val Ile Arg Gly Asp Ala Tyr Val Phe Ala Thr Pro Val

290 295 300

Asp Ile Leu Lys Leu Leu Leu Pro Glu Asp Trp Lys Glu Met Pro Tyr305 310 315 320

Phe Arg Lys Leu Glu Lys Leu Val Gly Val Pro Val Ile Asn Val His

325 330 335

Ile Trp Phe Asp Arg Lys Leu Arg Asn Thr Tyr Asp His Leu Leu Phe

340 345 350

Ser Arg Ser Pro Leu Leu Ser

355<210> 15<211> 351<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 15

Met Ala Thr Ser Thr Ser Ser Val Val Phe Gly Ile Ser Val Ser Ser1 5 10 15

Ser Thr Ser Leu Lys Ile Arg Ser Phe Arg Asn Val Pro Thr Val Leu

20 25 30

Asn Ser His Thr Pro Ser Gly Leu Asn Val Val Thr Ser Pro His His

35 40 45

Arg His Thr Ala Thr Gln Arg Pro Leu Ser Arg Asn Ser Phe Arg Val

50 55 60

Gln Ala Thr Val Leu Gln Glu Asp Glu Gln Lys Val Val Val Glu Glu65 70 75 80

Ser Phe Gln Ser Lys Ser Tyr Pro Glu Asn Gly Gly Gly Gly Asn Gly

85 90 95

Glu Pro Pro Asp Ala Ser Ser Ser Ser Gly Leu Glu Lys Trp Val Val100 105 110Lys Ile Glu Gln Ser Ile Asn Ile Phe Leu Thr Asp Ser Val Ile Lys

115 120 125

Ile Leu Asp Thr Leu Tyr His Asp Arg His Tyr Ala Arg Phe Phe Val

130 135 140Leu Glu Thr Ile Ala Arg Val Pro Tyr Phe Ala Phe Met Ser Val Leu145 150 155 160

His Leu Tyr Glu Ser Phe Gly Trp Trp Arg Arg Ala Asp Leu Ser Glu

165 170 175

Val His Phe Ala Glu Ser Trp Asn Glu Met His His Leu Leu Ile Met

180 185 190

Glu Glu Leu Gly Gly Asn Ser Trp Trp Phe Asp Arg Phe Leu Ala Gln

195 200 205

His Ile Ala Val Phe Tyr Tyr Phe Met Thr Val Phe Met Tyr Met Leu

210 215 220Ser Pro Arg Met Ala Tyr His Phe Ser Glu Cys Val Glu Ser His Ala225 230 235 240

Phe Glu Thr Tyr Asp Lys Phe Ile Lys Asp Gln Gly Glu Gln Leu Lys

245 250 255Lys Leu Pro Ala Ser Asn Val Ala Val Lys Tyr Tyr Thr Glu Gly Asn

260 265 270Leu Tyr Leu Phe Asp Glu Phe Gln Thr Ala Arg Pro Pro Thr Ser Arg

275 280 285

Arg Pro Lys Ile Glu Asn Met Tyr Asp Val Phe Leu Asn Ile Arg Asp

290 295 300

Asp Glu Ala Glu His Cys Lys Thr Met Lys Ala Cys Gln Thr His Gly305 310 315 320

Gly Leu Arg Ser Pro His Ser Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Glu Glu Asp

325 330 335Ala Gly Tyr Gly Leu Pro Gln Ala Asp Cys Glu Glu Leu Thr Gln

340 345 350<210> 16<211> 310<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 16

Met Ala Ala Gly Ile Ala Val Ala Ala Gly Ala Gln Thr Val Cys Phe1 5 10 15

Arg Val Asn Ser Phe Leu Thr Arg Lys Pro Thr Ser Leu Val Ala Asp

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Ser Pro Leu Ala Gln Gln Phe Ser Thr Thr Arg Arg

35 40 45His Arg Arg Lys Pro Arg Leu Thr Val Cys Phe Val Leu Glu Asp Glu

50 55 60

Glu Leu Lys Ala Gln Leu Val Thr Ser Glu Glu Glu Ala Arg Glu Arg.65 70 75 80

Glu Lys. Ala Met Ala Lys Arg Ile Ser Asp Ala Arg Thr Ala Glu Lys

85 90 95

Leu Ala Arg Lys Arg Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu Val Ala Ala Val

100 105 110

Met Ser Ser Phe Gly Ile Thr Ser Met Ala Val Leu Ala Val Tyr Tyr

115 120 125

Arg Phe Val Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro Tyr Ser Glu Met

130 135 140

Phe Gly Thr Phe Ala Leu Ser Val Gly Ala Ala Val Gly Met Glu Phe145 150 155 160

Trp Ala Arg Trp Ala His Lys Ala Leu Trp His Ala Ser Leu Trp His

165 170 175

Met His Glu Ser His His Arg Pro Arg Glu Gly Pro Phe Glu Leu Asn

180 185 190

Asp Val Phe Ala Ile Ile Asn Ala Val Pro Ala Ile Ala Leu Leu Ser

195 200 205

Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Leu Ile Pro Gly Leu Cys Phe Gly Ala

210 215 220

Gly Leu Gly Ile Ile Val Phe Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp225 230 235 240

Gly Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Ile Ala Asn Val Pro

245 250 255Tyr Phe Arg Arg Val Ala Ala Ala His Gln Leu His His Ser Asp Lys

260 265 270Phe Asn Gly Val Pro Phe Gly Leu Phe Leu Gly Pro Lys Glu Leu Glu

275 280 285Lys Val Gly Gly Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Ile Asn Arg Arg Ile

290 295 300

Lys Leu Arg Lys Gly Ser305 310

<210> 17<211> 469<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 17

Cys Val Val Asp Lys Glu Glu Lys Phe Ala Asp Gln Glu Asp Tyr Ile1 5 10 15

Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu Leu Tyr Val Gln Met Gln Gln Arg Lys

20 25 30Gln Met Asp Gln Gln Ser Lys Phe Ser Asp Lys Met Pro Glu Ile Ser

35 40 45Ala Gly Asn Ser Ile Leu Asp Leu Val Val Ile Gly Cys Gly Pro Ala

50 55 60

Gly Leu Ala Leu Ala Ala Glu Ser Ala Lys Leu Gly Leu Thr Val Gly65 70 75 80

Leu Ile Gly Pro Asp Val Pro Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu

85 90 95

Asp Glu Phe Lys Asp Leu Gly Leu Ala Gly Cys Ile Glu His Val Trp

100 105 110

Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu Asp Asp Asn Asp Pro Ile Leu Ile Gly115 120 125Arg Ala Tyr Gly Arg Phe Ser Arg

130 135 140

Arg Arg Cys Val Glu Ser Gly Val145 150 155 160

Ile Val Glu Ala Ala Thr Gly His

165 170 175

Ile Val Ile Pro Cys Arg Leu Ala

180 185 190

Gly Lys Leu Leu Gln Tyr Glu Leu

195 200 205Thr Ala Tyr Gly Val Glu Val Glu

210 215 220

Asn Leu Met Val Phe Met Asp Tyr225 230 235 240

Glu Ser Leu Glu Ala Glu Phe Pro

245 250 255

Ser Pro Thr Arg Val Phe Phe Glu

260 265 270

Ala Met Pro Phe Glu Leu Leu Lys

275 280 285

Thr Leu Gly Val Arg Ile Ile Lys

290 295 300

Ile Pro Val Gly Gly Ser Leu Pro305 310 315 320

Phe Gly Ala Ala Ala Ser Met Val

325 330 335

Val Arg Ser Leu Ser Glu Ala Pro

340 345 350

Ile Leu Lys Gln Gly Gln Ala Lys

355 360 365

Ala Gln Ala Trp Asn Thr Leu Trp370 375 380

117

His Leu Leu His Glu Glu Leu Leu

Ser Tyr Leu Ser Ser Val Glu Arg

Ser Leu Val Glu Cys Glu Gly Ser

Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser

Gly Gly Pro Arg Val Ser Val Gln

Val Glu Asn Asn Pro Tyr Asp Pro

Arg Asp Tyr Met Arg Gly Lys Val

Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Met

Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Asp

Lys Lys Leu Met Ser Arg Leu Asp

Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr

Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala

His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val

Lys Tyr Ala Ser Ala Ile Ala Asn

Asp Met Met Thr Arg Asn Ile Ser

Pro Gln Glu Arg Lys Arg Gln ArgAla Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Leu Gln Leu Asp Ile Glu385 390 395 400

Gly Ile Arg Thr Phe Phe Gln Thr Phe Phe Arg Leu Pro Asn Trp Met

405 410 415

Ser Gln Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asp Leu Leu Leu

420 425 430

Phe Ala Phe Tyr Met Phe Val Ile Ala Pro Asn Asp Leu Arg Lys Cys

435 440 445

Leu Ile Gln His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Ala Thr Met Val Arg

450 455 460

Thr Tyr Leu Ala Ile465<210> 18<211> 343<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 18

Gly Lys Lys Glu Arg Leu Leu Lys Ile Phe Asp Gly Trp Cys Asp Lys1 5 10 15

Val Met Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Glu Asp Ala Ile Leu Arg Arg

20 25 30

Asp Ile Tyr Asp Arg Thr Pro Ser Phe Ser Trp Gly Arg Gly Arg Val

35 40 45Thr Leu Leu Gly Asp Ser Ile His Ala Met Gln Pro Asn Leu Gly Gln

50 55 60

Gly Gly Cys Met Ala Ile Glu Asp Ser Tyr Gln Leu Ala Leu Glu Leu65 70 75 80

Asp Lys Ala Trp Glu Gln Ser Ile Lys Ser Gly Ser Pro Met Asp Val

85 90 95

Val Ser Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Ser Ala Arg Lys Leu Arg Val Ala

100 105 110Ile Ile His Gly Leu Ala Arg Leu Ala Ala Ile Met Ala Ser Thr Tyr115 120 125

Lys Pro Tyr Leu Gly Val Gly Leu Gly Pro Leu Ser Phe Leu Thr Lys

130 135 140

Phe Arg Ile Pro His Pro Gly Arg Val Gly Gly Arg Ile Phe Ile Asp145 150 155 160

Ile Gly Met Pro Leu Met Leu Ser Trp Val Leu Gly Gly Asn Gly Ser

165 170 175

Lys Leu Glu Gly Arg Pro Leu His Cys Arg Leu Thr Asp Lys Ala Ser

180 185 190

Asp Gln Leu Gln Lys Trp Phe Gln Asp Asp Asp Ser Leu Glu Arg Ala

195 200 205

Leu Asn Gly Glu Trp Phe Leu Phe Pro Ile Gly Gln Ala Asn Pro Asp.

210 215 220Pro Vai. Ala Ile Phe Leu Gly Arg Asp Glu Lys Asn Ile Cys Thr Ile225 230 235 240

Gly Ser Ala Ser His Pro Asp Ile Leu Gly Ala Ser Ile Ile Ile Asn

245 250 255

Ser Pro Gln Val Ser Lys Leu His Ala Gln Ile Ser Tyr Lys Asp Gly

260 265 270Leu Phe Phe Leu Thr Asp Leu Gln Ser Glu His Gly Thr Trp Ile Thr

275 280 285

Asp Asn Asp Gly Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Pro Asn Ser Pro Ala Arg

290 295 300

Phe His Pro Tyr Asp Ile Ile Glu Phe Gly Ser Asp Lys Ala Ala Phe305 310 315 320

Arg Val Lys Val Thr Asn Gln Pro Pro Phe Ser Gly Lys Lys Arg Glu

325 330 335

Thr Lys Val Leu Ser Ala Val

340<210> 19<211> 482<212> PRT<213> Coffea canephora<400> 19

Met Ala Ser Ala Leu His Ser Ala Phe His Ser Asn Asp Glu Gly Ile1 5 10 15

Arg Phe Tyr Ile Arg Ser Gln His Arg Ile Gly Gly Arg Cys Ser Asn

20 25 30

Gly Gly Ala Arg Pro Gln Asn Ala Leu Phe Ser Val Lys Met Trp Ser

35 40 45

Lys Arg Trp Gly Ser Arg Tyr Ile Gln Leu Gln Arg Ala Pro Arg Ile

50 55 60

Ser Leu Ser Leu Gly Ser Lys Cys Thr Arg Leu Phe Leu Asn Gly Ile65 70 75 80

Lys Val Ser Asn His Asn Thr Cys Arg Thr Met Pro Glu Val Lys Glu

85 90 95

Gly Ile Gly Ile Leu Lys Glu Ala Leu Leu Ile Thr Trp Lys Glu Trp

100 105 110Ser Gln Ser Thr Lys Val Ala Val Leu Leu Ile Phe Ala Leu Leu Ile

115 120 125

Ile Pro Lys Ala Asp Ala Val Asp Ala Leu Lys Thr Cys Thr Cys Leu

130 135 140Leu Lys Glu Cys Arg Ile Glu Leu Ala Lys Cys Ile Ala Asn Pro Ser145 150 155 160

Cys Ala Ala Asn Val Ala Cys Leu Gln Thr Cys Asn Asn Arg Pro Asp

165 170 175

Glu Thr Glu Cys Gln Ile Lys Cys Gly Asp Leu Phe Gln Asn Ser Val

180 185 190

Val Asp Glu Phe Asn Glu Cys Ala Val Ser Arg Lys Lys Cys Val Pro

195 200 205

Arg Lys Ser Asp Val Gly Glu Phe Pro Ala Pro Asp Pro Ala Val Leu

210 215 220Val Lys Asn Phe Asp Ile Lys Asp Phe Ser Gly Lys Trp Tyr Ile Ser225 230 235 240Ser Gly Leu Asn Pro Thr Phe Asp Thr Phe Asp Cys Gln Leu His Glu

245 250 255Phe His Thr Glu Ser Gly Lys Leu Val Gly Asn Leu Thr Trp Arg Ile

260 265 270

Arg Thr Pro Asp Thr Gly Phe Phe Thr Arg Ser Ala Leu Gln Arg Phe

275 280 285

Val Gln Asp Pro Lys Tyr Pro Gly Ile Leu Tyr Asn His Asp Asn Glu

290 295 300

Tyr Leu His Tyr Gln Asp Asp Trp Tyr Ile Leu Ser Ser Lys Ile Glu305 310 315 320

Asn Lys Pro Asp Asp Tyr Ala Phe Val Tyr Tyr Arg Gly Arg Asn Asp

325 330 335

Ala Trp Asp Gly Tyr Gly Gly Ala Val Val Tyr Thr Arg Ser Ala Val

340 345 350

Leu Pro Glu Ser Ile Val Pro Glu Leu Gln Arg Ala Ala Lys Ser Ile

355 360 365

Gly Arg Asp Phe Ser Lys Phe Ile Arg Thr Asp Asn Thr Cys Gly Pro

370 375 380

Glu Pro Pro Leu Val Glu Arg Leu Glu Lys Thr Val Glu Glu Gly Glu385 390 395 400

Arg Thr Ile Val Arg Glu Val Glu Glu Ile Glu Gly Glu Ile Glu Gly

405 410 415

Glu Val Glu Lys Val Lys Asp Thr Glu Met Thr Leu Phe Glu Arg Leu

420 425 430

Thr Glu Gly Phe Lys Glu Leu Lys Lys Asp Glu Glu Phe Phe Leu Arg

435 440 445Glu Leu Ser Lys Glu Glu Leu Asp Val Leu Asp -Ala Leu Lys Met Glu

450 455 460

Ala Ser Glu Val Glu Lys Leu Phe Gly Arg Ser Leu Pro Ile Arg Lys465 470 475 480Leu Arg122

<210> 20<211> 622<212> PRT

<213> Coffea canephora

MPMTMILPPS SREMMGLGLG CSPSSKTLAF RHPNTLPNYI NCSLQTPSIL HFPKQSSATT 60SSPPSSSSAK TAYPALFLPG SSAAIATPSK TPTGTATVPT PSPSISASPS PSRSPSTTPQ 120WNVLQRAAAM ALDAVETALT ARELEQPLPK TADPRIQISG NFAPVPEQPV RHALPVTGKI 180PNSIQGVYVR NGANPLFEPA AGHHFFDGDG MIHALQFQNG SASYACRFTE TQRLAQERSL 240GRPVFPKAIG ELHGHSGIAR LMLFYARGVF GLLDHSQGTG VANAGLVYFN NRLLAMSEDD 300LPYHVRITPS GDLKTVERYS FNGQLKSTMI AHPKLDPVTG ELFALSYDVI QKPYLKYFRF 360SKAGEKSKDI EIPVPEPTMM HDFAITDNFV VIPDQQWFK MSEMIRGGSP WYDKEKVSR 420FGVLDKYAED SSAIKWVEVP DCFCFHLWNA WEEPETDEIV VIGSCMTPPD SIFNECDEGL 480KSVLSEIRLN LKTGKSTRRA 11SNPEDQVN LEAGMVNRNK LGRKTRYAYL AIAEPWPKVS 540GFAKVDLFTG EVRKFIYGDE KYGGEPLFLP RDPNCEAEDD GYILAFVHDE KEWKSELRIV 600NAMTLELEAS VQLPSRVPYG FHGTFISAKD LASQA 635

<210> 21<211> 548

<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 21

Met Gly Arg Gln Glu Gly Glu Glu Val Val Glu Lys Ile Glu Gly Lys

1 5 10 15

Gln Glu Val Val Val Val Asn Pro Lys Pro Asn Asn Gly Phe Thr Ala

20 25 30

Lys Leu Ile Asp Trp Val Glu Lys Ala Val Val Lys Leu Met Tyr Asp35 40 45

Ser Lys Gln Pro Leu His Tyr Leu Ser Gly Asn Phe Ala Pro Val Asp50 55 60

Glu Thr Pro Pro Cys Lys Asp Leu Leu Val Lys Gly His Leu Pro Glu65 70 75 80

Cys Leu Asn Gly Glu Phe Val Arg

85 90 95

Pro Val Ala Gly Tyr His Trp Phe

100 105 110

Ile Arg Ile Lys Asp Gly Lys Ala

115 120 125

Thr Ser Arg Leu Lys Gln Glu Glu

130 135 140

Lys Val Gly Asp Leu Lys Gly Leu145 150 155 160

Gln Ile Leu Arg Ala Lys Leu Lys

165 170 175

Gly Thr Ala Asn Thr Ala Leu Ile

180 185 190

Leu Gln Glu Ala Asp Lys Pro Tyr

195 200 205

Asp Leu Gln Thr Leu Gly Leu Leu

210 215 220

Ser Phe Thr Ala His Pro Lys Val

225 230 235 240

Thr Phe Gly Tyr Ser His Thr Pro

245 250 255

Ser Lys Glu Gly Val Met Asp Asp

260 265 270

Pro Ile Met Met His Asp Phe Ala

275 280 285

Met Asp Leu Pro Leu Tyr Phe Arg

290 295 300

Lys Leu Ile Phe Thr Phe Asp Pro305 310 315 320

Leu Pro Arg Tyr Ser Lys Asn Asp

123

Val Gly Pro Asn Pro Lys Phe Ser

Asp Gly Asp Gly Met Ile His Gly

Thr Tyr Val Ser Arg Tyr Val Lys

Tyr Phe Gly Gly Ser Lys Phe Met

Phe Gly Leu Phe Met Val Asn Met

Val Leu Asp Met Thr Tyr Gly Ile

Tyr His His Gly Lys Leu Leu Ala

Val Leu Arg Val Leu Glu Asp Gly

Asp Tyr Asp Lys Arg Leu Thr His

Asp Pro Phe Thr Gly Glu Met Phe

Pro Tyr Ile Thr Tyr Arg Val Ile

Pro Val Pro Ile Thr Ile Ser Asp

Ile Thr Glu Asn Tyr Ala Ile Phe

Pro Lys Glu Met Val Lys Asp Lys

Thr Lys Lys Ala Arg Phe Gly Val

Ala Leu Ile Lys Trp Phe Glu Leu325 330 335

Pro Asn Cys Phe Ile Phe His Asn Ala Asn Ala Trp Glu Glu Gly Asp

340 345 350

Glu Val Ile Leu Ile Thr Cys Arg Leu Gln Asn Pro Asp Leu Asp Met

355 360 365Val Ser Gly Ile Val Lys Lys Lys Leu Glu Asn Phe Ser Asn Glu Leu

370 375 380Tyr Glu Met Arg Phe Asn Leu Lys Thr Gly Leu Ala Ser Gln Lys Lys385 390 395 400

Leu Ser Glu Ser Ala Val Asp Phe Pro Arg Val Asn Glu Ser Tyr Thr

405 410 415

Gly Arg Lys Gln Gln Tyr Val Tyr Gly Thr Ile Leu Asp Ser Ile Ala

420 425 430

Lys Val Thr Gly Ile Ala Lys Phe Asp Leu His Ala Glu Pro Glu Thr

435 440 445

Gly Lys Thr Lys Ile Glu Val Gly Gly Asn Val Gln Gly Val Phe Asp

450 455 460

Leu Gly Pro Gly Arg Phe Gly Ser Glu Ala Ile Phe Val Pro Arg Gln465 470 475 480

Pro Gly Ile Thr Ser Glu Glu Asp Asp Gly Tyr Leu Ile Phe Phe Val

485 490 495His Asp Glu Ser Thr Gly Lys Ser Ala Val Asn Val Ile Asp Ala Lys

500 505 510

Thr Met Ser Ala Asp Pro Val Ala Val Val Glu Leu Pro Asn Arg Val

515 520 525

Pro Tyr Gly Phe His Ala Phe Phe Val Thr Glu Glu Gln Leu Glu Glu. 530 535 540

Gln Ala Lys Leu545<210> 22<211> 320<212> PRT<213> Coffea canephora<400> 22

Met Ala Ser Ile Thr Ser Phe Asn Gln Phe Ser Tyr Thr Val Lys Ser1 5 10 15

Lys Thr Phe Gln His Pro Gln Phe Gly Thr Lys Val Ser Asn Ser Ala

20 25 30

Val Asn Phe Thr Asp Phe Gly Leu Lys Lys Pro Leu Gln Ser Ser Ile

35 40 45

Ser Ile Lys Glu Ser Ser Lys Lys Arg Pro Gly Phe Val Val Leu Val

50 55 60

Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Gly Pro Glu Glu Glu Ala Ala Gly Val Ala65 70 75 80

Val Ala Glu Glu Pro Pro Pro Lys Glu Pro Arg Glu Ile Asp Ile Leu

85 90 95

Lys Lys Arg Leu Val Asp Ser Phe Tyr Gly Thr Asp Arg Gly Leu Asn

100 105 110

Ala Ser Ser Glu Thr Arg Ala Glu Val Val Glu Leu Ile Thr Gln Leu

115 120 125

Glu Ala Lys Asn Pro Thr Pro Ala Pro Thr Glu Ala Leu Thr Leu Leu

130 135 140

Asn Gly Lys Trp lie Leu Ala Tyr Thr Ser Phe Ile Gly Leu Phe Pro145 150 155 160

Leu Leu Ser Arg Gly Thr Leu Pro Leu Val Lys Val Glu Glu Ile Ser

165 170 175

Gln Thr Ile Asp Ser Glu Ala Phe Ser Val Glu Asn Val Val Gln Phe

180 185 190

Ala Gly Pro Leu Ala Thr Thr Ser Ile Thr Thr Asn Ala Lys Phe Glu

195 200 205

Val Arg Ser Pro Lys Arg Val Gln Ile Lys Phe Glu Glu Gly Val Ile

210 215 220Gly Thr Pro Gln Leu Thr Asp Ser Ile Glu Leu Pro Glu Ser Val Glu225 230 235 240Leu Leu Gly Gln Lys Ile Asp Leu Asn Pro Val Lys Gly Leu Leu Thr

245 250 255

Ser Val Gln Asp Thr Ala Ser Ser Val Ala Lys Ser Ile Ser Ser Arg

260 265 270

Pro Pro Leu Lys Phe Ser Leu Ser Asn Arg Asn Ala Glu Ser Trp Leu

275 280 285

Leu Thr Thr Tyr Leu Asp Asp Glu Leu Arg Ile Ser Arg Gly Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ile Phe Val Leu Ile Lys Glu Gly Cys Pro Leu Leu Lys Pro305 310 315 . 320

<210> 23<211> 382<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 23

Lys Ser Ala Phe Trp Ala His Cys Met Arg Arg Ala Val Ser Met Gly1 5 10 15

Gln Arg Glu Met Val Asp Phe Met Asp Leu Leu Leu Ser Pro Ala Ser

20 25 30

Lys Val Leu Asn Asn Trp Phe Glu Thr Glu Val Leu Lys Ala Thr Leu

35 40 45

Ala Thr Asp Ala Val Ile Gly Thr Thr Ala Ser Val His Thr Pro Gly

50 55 60Thr Gly Tyr Val Leu Leu His His Ile Met Gly Glu Thr Asp Gly Asp65 70 75 80

Arg Gly Ile Trp Ser Tyr Val Glu Gly Gly Met Gly Ser Val Ser Leu

85 90 95

Ala Val Gly Ser Ala Ala Gln Glu Ala Gly Ala Thr Ile Val Thr Lys

100 105 110

Ala Glu Val Ser Lys Leu Leu Ile Gly Asp Ser Gly Arg Val Asp Gly

115 120 125

Val Leu Leu Pro Asp Gly Thr Glu Val Gln Ser Ser Val Val Leu Ser130 135 140

Asn Ala Thr Pro Tyr Lys Thr Phe Met Glu Leu Val Pro Glu His Val145 150 155 160

Leu Pro Asp Asp Phe Leu Gln Ala Ile Lys Cys Ser Asp Tyr Ser Ser

165 170 175

Ala Thr Thr Lys Ile Asn Leu Ala Val Glu Arg Val Pro Gln Phe Gln

180 185 190

Cys Cys Lys Ile Asn His Pro Asn Ala Gly Pro Gln His Met Gly Thr

195 200 205

Ile His Ile Gly Ser Glu Arg Met Glu Glu Val Asp Ser Ala Cys Gln

210 215 220

Glu Ala Val Asn Gly Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ile Ile Glu Met Thr225 230 235 240

Ile Pro Ser Val Leu Asp Lys Thr Ile Ser Pro His Gly Lys His Ile

245 250 255Ile Asn Leu Phe Ile Gln Tyr Thr Pro Tyr Lys Pro Leu Asp Gly Ser

260 265 270

Trp Glu Asp Pro Ala Tyr Arg Glu Ser Phe Ala Gln Arg Cys Phe Ser

275 280 285Leu Ile Asp Asp Tyr Ala Pro Gly Phe Ser Ser Ser Ile Leu Gly Tyr

290 295 300

Asp Met Leu Thr Pro Pro Asp Leu Glu Arg Glu Ile Gly Leu Thr Gly305 310 315 320

Gly Asn Ile Phe His Gly Ala Met Gly Leu Asp Ser Leu Phe Leu Met

325 330 335

Arg Pro Val Lys Gly Trp Ser Asn Tyr Arg Thr Pro Val Gln Gly Leu

340 345 350

Tyr Leu Cys Gly Ser Gly Ala His Pro Gly Gly Gly Val Met Gly Ala

355 360 365

Ala Gly Arg Asn Ala Ala Gly Thr Val Ile Gln Asp Trp Lys

370 375 380<210> 24<211> 153<212> PRT

<213> Coffea canephora<400> 24

LDQGHEVDIY ESHSFIGGKV GSFVDKRGNHKDHTHTFVNK GGEIGELDFR FPVGAPLHGIVDPDGALREI RDLDRISFSD WFLSKGGTRA

<210> 25<211> 1143<212> DNÀ

<213> Coffea canephora<400> 25

cccgggctgg taaagtaata gatgagataatggtctacaa gtacaagttt ttggataactctatgctcgt ccctaatact ttgtggtattttaaatacac atcataatgt ggaccattgaattaagaaaa ttaagccaaa gggcgatcctttttcatcca taacattttt tttttttttttcaacccaac ccaactcaac attttgctgacaaaaaattc atcggaaata attttggtcatcccgcgtcc aattggctga tggggtttggaagcgcgcta tattataggc tggggaaagaaaaggttgaa gaaaccatgt cccccgccccaatcctccct tcgagcttct ctcttcctctgggcttcacc tacacgttag aggtggcctcctctctcact cccttctttc cccccctcaacctctataac cctctctctc tcaaatctctaaaaaaaaaa aaaaaaaaac tccctactacctagtagtcc atattggaaa atcaatcaattccccccccc aaaaaaaaaa agccagtatgtcatgggtta atccaaaatc cccc

IGMGLHVFFG CYNNLFRLMK KVGADKNLLV 60NAFLSTNQLK IYDKARNAVA LALGPWRAL 120SIQ 153

ttagaaagta cagaggaata actcttcatc 60gtcttatcta ttatatcttg gcatgtatgc 120agtattagtt aggggggggg ggttcgaata 180caaaaggctc acttgcgtgc ctaaagtaaa 240agttaactta actaccttag tagcctcact 300ttataattcc tcccttgcac gatactcaac 360gttttaatta agtatttgaa agaacaaagg 420ggtgtgtgtg tgattgttga gtagaatgaa 480gcattatatt attattatta ttattatcta 540gagagaggtc gttggaggat gattcgtgtc 600ctacccccac aaggtcaatg ctaattggca 660tcccccaaat tttccattta tcaaacacgt 720catccccaca cttccctcta tatatactct 780ggcacacaca cactcaaatc ctctactact 840ctctctctca aaaactaaaa catttcaaaa 900tgccactgga cgacgacgac ttctàctaca 960cgcaccaacg cgataaagat agcgaaaaac 1020atccctgctt ccactcctac aaattcatat 1080

1104

Claims (86)

1. Molécula de ácido nucléico isolada de café (Coffea spp.), a-presentando uma seqüência de codificação que codifica uma enzima do ca-minho de biossíntese de carotenóides ou apocarotenóides selecionada defitoeno sintase, fitoeno dessaturase, oxidase com término plastídio, β-caroteno hidroxilase, Iicopeno ε-ciclase, zeaxantina epioxidase, violaxantinade-epoxidase, 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase, dioxigenase de clivagemde carotenóides, fibrilina, semelhante a fitoeno desidrogenase 1 e zeta caro-teno dessaturase.

2. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma fitoeno sintase.

3. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 2,na qual a fitoeno sintase apresenta uma seqüência de aminoácidos mais de-76% idêntica a ID SEQ NO.: 13.

4. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 3,na qual a fitoeno sintase apresenta uma seqüência de aminoácidos quecompreende ID SEQ N0.:13.

5. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 2,na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.: 1.

6. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma fitoeno dessaturase.

7. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 6,na qual a fitoeno dessaturase apresenta uma seqüência de aminoácidosmais de 76% idêntica a ID SEQ NO.: 14.

8. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 7,na qual a fitoeno dessaturase apresenta uma seqüência de aminoácidos quecompreende ID SEQ N0.:14.

9. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 6,na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ N0.:2.

10. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma oxidase com término plastídio.

11. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-10, na qual a oxidase com término plastídio apresenta uma seqüência deaminoácidos mais de 61% idêntica a ID SEQ NO.:15.

12. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-11, na qual a oxidase com término plastídio apresenta uma seqüência deaminoácidos que compreende ID SEQ NO.:15.

13. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-10, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.:3.

14. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,-10 na qual a seqüência de codificação codifica uma β-caroteno hidroxylase.

15. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-14, na qual a β-caroteno hidroxilase apresenta uma seqüência de aminoáci-dos mais de 73% idêntica a ID SEQ NO.:16.

16. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-15, na qual a oxidase com término plastídio apresenta uma seqüência deaminoácidos que compreende ID SEQ NO.: 16.

17. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-14, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.:4.

18. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma Iicopeno ε-ciclase.

19. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-18, na qual a Iicopeno ε-ciclase apresenta uma seqüência de aminoácidosmais de 86% idêntica a ID SEQ NO.: 17.

20. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-19, na qual a Iicopeno ε-ciclase apresenta uma seqüência de aminoácidosque compreende ID SEQ N0.:17.

21. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-18, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ N0.:5.

22. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma zeaxantina epioxidase.

23. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-22, na qual a zeaxantina epioxidase apresenta uma seqüência de aminoáci-dos mais de 72% idêntica a ID SEQ NO.: 18.

24. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-23, na qual a zeaxantina epioxidase apresenta uma seqüência de aminoáci-dos que compreende ID SEQ N0.:18.

25. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-22, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ N0.:6.

26. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma violaxantina de-epoxidase.

27. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-26, na qual a violaxantina de-epoxidase apresenta uma seqüência de ami-noácidos mais de 74% idêntica a ID SEQ NO.: 19.

28. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-27, na qual a violaxantina de-epoxidase apresenta uma seqüência de ami-noácidos que compreende ID SEQ NO.: 19.

29. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-26, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.:7.

30. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma 9-cis-epoxicarotenóide dio-xigenase.

31. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-30, na qual a 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase apresenta uma seqüênciade aminoácidos mais de 75% idêntica a ID SEQ NO.: 20.

32. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-31, na qual a 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase apresenta uma seqüênciade aminoácidos que compreende ID SEQ NO.: 20.

33. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-30, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.:8.

34. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma dioxigenase de clivagem decarotenóides.

35. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-34, na qual a dioxigenase de clivagem de carotenóides apresenta uma se-qüência de aminoácidos mais de 83% idêntica a ID SEQ NO.: 21.

36. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-35, na qual a dioxigenase de clivagem de carotenóides apresenta uma se-qüência de aminoácidos que compreende ID SEQ NO.: 21.

37. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-34, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.: 9.

38. Molécula de ácido nucléico, dé acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica a fibriliná.

39. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-38, na qual a fibriliná apresenta uma seqüência de aminoácidos mais de-72% idêntica a ID SEQ NO.: 22.

40. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-39, na qual the fibriliná apresenta uma seqüência de aminoácidos que com-preende ID SEQ NO.: 22.

41. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-38, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.: 10.

42. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma enzima semelhante a fitoe-no desidrogenase selecionada de semelhante a fitoeno desidrogenase 1.

43. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-42, na qual a enzima semelhante a fitoeno desidrogenase apresenta umaseqüência de aminoácidos mais de 72% idêntica a ID SEQ NO.: 23.

44. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-43, na qual a enzima semelhante a fitoeno desidrogenase apresenta umaseqüência de aminoácidos que compreende ID SEQ NO.: 23.

45. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-42, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.: 11.

46. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação codifica uma zeta caroteno desaturase.

47. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-46, na qual a zeta caroteno desaturase apresenta uma seqüência de amino-ácidos mais de 92% idêntica a ID SEQ NO.: 24.

48. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-47, na qual a zeta caroteno desaturase apresenta uma seqüência de amino-ácidos que compreende ID SEQ NO.: 24.

49. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação-46, na qual a seqüência de codificação compreende ID SEQ NO.: 12.

50. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 1,na qual a seqüência de codificação é um quadro de leitura aberta de um gene.

51. Molécula de mRNA produzida por transcrição do gene, deacordo com a reivindicação 50.

52. Molécula de cDNA produzida por transcrição inverse da mo-lécula de mRNA, de acordo com a reivindicação 51.

53. Oligonucleotídeo entre 8 e 100 bases de comprimento, oqual é complementar a um segmento da molécula de ácido nucléico de a-cordo com a reivindicação 1.

54. Vetor que compreende uma seqüência de codificação damolécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1.

55. Vetor, de acordo com a reivindicação 54, o qual é um vetorde expressão selecionado do grupo de vetores que consiste de plasmídeo,fagemídeo, cosmídeo, baculovírus, bacmídeo, vetores bacterianos, de lêve-do e virais.

56. Vetor, de acordo com a reivindicação 54, no qual a seqüên-cia de codificação da molécula de ácido nucléico liga-se operavelmente a umpromotor constitutivo.

57. Vetor, de acordo com a reivindicação 54, no qual a seqüên-cia de codificação da molécula de ácido nucléico liga-se operavelmente a umpromotor induzível.

58. Vetor, de acordo com a reivindicação 54, no qual a seqüên-cia de codificação da molécula de ácido nucléico liga-se operavelmente a umpromotor específico a tecido.

59. Vetor, de acordo com a reivindicação 58, no qual o promotorespecífico a tecido é um promotor específico a semente.

60. Vetor, de acordo com a reivindicação 59, no qual o promotorespecífico a semente de café é um promotor de genes para carotenóides ouapocarotenóides.

61. Vetor, de acordo com a reivindicação 60, no qual o promotorde genes para carotenóides ou apocarotenóides compreende ID SEQ NO.:-25.

62. Vetor, de acordo com a reivindicação 59, no qual o promotorespecífico a semente é um promotor específico a semente de café.

63. Célula hospedeira transformada com o vetor de acordo coma reivindicação 54.

64. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 63, sele-cionada do grupo que consiste de células vegetais, células bacterianas, célu-las fúngicas, células de insetos e células de mamíferos.

65. Células hospedeira, de acordo com a reivindicação 64, aqual é uma célula vegetal selecionada do grupo de plantas que consiste decafé, fumo, Arabidopsis, milho, trigo, arroz, soja, cevada, centeio, aveia, sor-go, alfalfa, trevo, canola, açafroa, girassol, amendoim, cacau, tomatillo, bata-ta, pimenta, berinjela, beterraba sacarina, cenoura, pepino, alface, ervilha,áster, begônia, crisântemo, delfínio, zínia e turfgrasses.

66. Planta fértil produzida da célula vegetal de acordo com a rei-vindicação 65.

67. Método de modulação de sabor ou aroma de grãos de café,método este que compreende modular produção ou atividade de uma oumais enzimas do caminho de biossíntese de carotenóides ou apocarotenói-des em sementes dé café, no qual as enzimas do caminho de biossíntese decarotenóides ou apocarotenóides são selecionadas de fitoeno sintase, fitoe-no dessaturase, oxidase com término plastídio, β-caroteno hidroxilase, Iico-peno ε-ciclase, zeaxantina epioxidase, violaxantina desepoxidase, 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase, dioxigenase de clivagem de carotenóides,fibrilina, semelhante a fitoeno desidrogenase-1 e zeta caroteno dessaturase.

68. Método, de acordo com a reivindicação 67, o qual compre-ende aumentar a produção ou atividade das uma ou mais enzimas do cami-mi-nho de biossíntese de carotenóides ou apocarotenóides.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68, o qual compre-ende aumentar a expressão de genes para uma ou mais enzimas do cami-nho de biossíntese de carotenóides ou apocarotenóides endógenos nas se-mentes de café.

70. Método, de acordo com a reivindicação 68, o qual compre-ende introduzir na planta um transgene que codifica enzimas do caminho debiossíntese de carotenóides ou apocarotenóides.

71. Método, de acordo com a reivindicação 67, o qual compre-ende diminuir a produção ou atividade das uma ou mais enzimas do cami-nho de biossíntese de carotenóides ou apocarotenóides.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, o qual compre-ende introduzir uma molécula de ácido nucléico no café a qual inibe a ex-pressão de genes que codificam uma ou mais enzimas do caminho de bios-síntese de carotenóides ou apocarotenóides endógenos nas sementes decafé.

73. Promotor isolado de um gene de planta de café que codificauma enzima do caminho de biossíntese de carotenóides ou apocarotenóides.

74. Promotor, de acordo com a reivindicação 73, no qual o genecodifica uma enzima do caminho de biossíntese de carotenóides ou apoca-rotenóides que apresenta uma seqüência de aminoácidos que é 50% oumais idêntica a qualquer uma de ID SEQs NOs.: 12-24.

75. Promotor, de acordo com a reivindicação 74, no qual o genecodifica uma enzima do caminho de biossíntese de carotenóides ou apoca-rotenóides que apresenta qualquer seqüência de aminoácidos de qualqueruma de ID SEQs NOs.: 12-24.

76. Promotor, de acordo com a reivindicação 73, no qual o genecompreende um quadro de leitura aberta que é 50% ou mais idêntica a qual-quer uma das seqüências apresentadas em ID SEQs NOs.: 1-12.

77. Promotor, de acordo com a reivindicação 76, no qual o genecompreende um quadro de leitura aberta que apresenta qualquer uma de IDSEQs NOs.: 1-12.

78. Promotor, de acordo com a reivindicação 73, o qual compre-ende uma ou mais seqüências reguladoras selecionadas do grupo que con-siste de uma caixa TATA, um elemento responsivo a ácido abscísico, umarepetição RY (CATGCA(T/a)(A/g) de uma caixa de Ieguminina para regularexpressão de proteínas do tipo leguminina, pelo menos um elementos res-ponsivo a desidrataçãoImotif de seqüência que atua como eis na repetiçãode C (G/ACCGAC e pelo menos um motif de caixa E (CANNTG).

79. Promotor, de acordo com a reivindicação 78, o qual compre-ende ID SEQ NO.:25.

80. Gene quimérico que compreende o promotor de acordo coma reivindicação 73, operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de codi-ficação.

81. Vetor para transformação de uma célula, o qual compreendeo gene quimérico de acordo com a reivindicação 79.

82. Célula transformada com o vetor de acordo com a reivindicação 81.

83. Célula transformada, de acordo com a reivindicação 82, aqual é uma célula vegetal.

84. Célula vegetal transformada, de acordo com a reivindicação-83, a qual é uma célula de Coffea spp.

85. Planta transgênica fértil produzida mediante regeneração dacélula vegetal transformada de acordo com a reivindicação 83.

86. Planta transgênica fértil de acordo com a reivindicação 85, aqual é Coffea spp.