BRPI0615073A2 - molÉcula de Ácido nuclÉico isolada, vetor, cÉlula hospedeira, polipeptÍdeo isolado, planta transgÊnica e mÉtodo de aumento da tolerÂncia ao calor em plantas - Google Patents

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Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, PLANTA TRANSGÊNICA E MÉTODO DE AUMENTO DA TOLERÂNCIA AO CALOR EM PLANTAS. A presente invenção provê polipeptídeos termoestáveis relacionados com os polipetídeos de RuBisCO activase de Arabidopsis. A presente invenção refere-se ainda a ácidos nuclélcos que codificam os polipeptídeos da invenção. São também objetos da presente invenção os métodos de utilização dos polipeptídeos e ácidos nuclélcos da invenção, para aumentar a resistência de plantas aos problemas causados pelo calor.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR, CÉLULAHOSPEDEIRA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, PLANTA TRANSGÊNICA EMÉTODO DE AUMENTO DA TOLERÂNCIA AO CALOR EM PLANTAS
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se, em geral, a aumentar osníveis de fotossíntese em plantas cultivadas sobtemperaturas aumentadas. Mais particularmente, a presenteinvenção refere-se a melhorar a termoestabilidade da enzimafotossintética RuBisCo Ativase.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Ribulose-I,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase(Rubisco) é uma importante enzima no processofotossintético. Essa enzima incorpora CO2 em plantasdurante a fotossíntese. O oxigênio atmosférico compete comCO2 como um substrato para RuBisCo, dando início àfotorrespiração e fazendo da Rubisco a etapa limitante nataxa de fotossíntese.
RuBisCo Ativase (RCA) é uma proteína que catalisa aativação da Rubisco, que, por outro lado, regula afotossíntese iniciando a redução fotossintética de carbonoe oxidação fotorrespiratória de carbono. A enzima RuBisCoAtivase catalisa a liberação de ribulose-1,5-bisfosfato(RuBP) a partir da Rubisco. Esse sítio recém desocupado naRubisco está agora livre para se ligar aos ativadores CO2 eMg2+ para ocorrer fotossintese. RuBisCo Ativase é tambémresponsável por liberar inibidores de açúcar fosfato daRubisco e restaura a atividade catalitica da Rubisco.
Assim, se RuBisCo Ativase está danificada, Rubiscopermanece inativa e a fotossintese se torna mais lenta.
A RuBisCo Ativase é termolábil e, assim, possuiatividade decrescente com temperaturas aumentadas. Comoresultado, o processo fotossintético se torna mais lentodevido à falta de ativação da Rubisco. A enzima RuBisCoAtivase se desnatura sob temperaturas aumentadas, deixando,assim, a enzima incapaz de converter Rubisco inativa para aforma ativa. Arabidopsis contém duas isoformas de RCA, umaforma curta termolábil (RCAl) e a longa, relativamentetermoestável (RCA2), que são geradas por splicingalternativo de pré-RNAm (Werneke, et al., 1989, Plant Cell1:815-825).
Plantas de cultivo cultivadas em climas quentespoderiam se beneficiar de níveis fotossintéticos elevados.
Conseqüentemente, se a etapa limitante de taxa pudesse serfeita mais tolerante ao calor, as plantas de cultivopoderiam crescer mais facilmente nesses climas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a polipeptídeosderivados da RuBisCo Ativase que são mais termoestáveis doque a RuBisCo Ativase naturalmente ocorrente. Ospolipeptideos derivados da RuBisCo Ativase da invençãosubstancialmente retêm a atividade em plantas cultivadassob condições de temperatura aumentada. Moléculas deácidos nucléicos codificando os polipeptideos da invençãosão também englobadas.
Além dos polipeptideos derivados da RuBisCo Ativase dainvenção, será colocado que a invenção também englobavariantes desses, incluindo, mas não se limitando a,qualquer seqüência substancialmente similar, qualquerfragmento de polipeptideo, análogo, homólogo, mutante, oumodificado dessa. As variantes englobadas pela invençãosão pelo menos parcialmente funcionalmente ativos (i.e.,são capazes de apresentar uma ou mais atividades funcionaisconhecidas associadas com RuBisCo Ativase de tipo selvagem)sob condições aquecidas. Moléculas de ácidos nucléicoscodificando os polipeptideos variantes são tambémenglobadas.
Vetores compreendendo um ou mais ácidos nucléicos dainvenção são também englobados.
Células compreendendo um polipeptideo, molécula deácido nucléico, e/ou vetor da invenção são tambémenglobadas.
A presente invenção também está relacionada a plantastransgênicas compreendendo um polipeptideo, molécula deácido nucléico, e/ou vetor da invenção. As plantastransgênicas podem expressar o transgene por qualquer meioconhecido na arte incluindo, mas não se limitando a,expressão - constitutiva, expressão regulada pordesenvolvimento, expressão tecido-especifica, etc. Sementesobtidas de uma planta transgênica da invenção são tambémenglobadas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
FIGS. 1A-1C: Caracterização de RCA do tipo selvagem (RCAl)e variantes termoestáveis (183H12, 301C7 e 382D8). (A)Atividade da RuBisCo após a ativação por ativase apóstratamento a 25°C (branco), 40°C (cinza) e 45°C (preto).Proteínas ativase foram incubadas nas temperaturasindicadas por 15 min antes do teste a 25°C. (B) Ativaçãoda RuBisCo sob condições catalíticas a 25°C (branco) e 40°C(cinza). (C) Atividade ATPase de proteínas ativaseincubadas nas temperaturas indicadas por 15 min. antes doteste a 25°C.
FIGS. 2A-2D: Caracterização do mutante de RuBisCo Ativase(Arca) em CO2 ambiente. (A) Análise de imuno-blot defolhas de plantas Arabidopsis do tipo selvagem (RCA/RCA),heterozigotas (RCA/Arca) e homozigotas [Arca/Arca). O blotfoi imunodecorado com anticorpos policlonais criados contraRCAl recombinante de Arabidopsis. (B) Desempenhofotossintético de plantas de três semanas de idade de tiposelvagem (acima) e Arca (abaixo) medido usando análise defluorescência de imagem. (C) Área foliar das plantasdescritas em (B) (50 plantas por fenótipo) na idadeindicada. (D) Fotografia de plantas de oito semanas deidade de tipo selvagem (acima) e Arca (abaixo).
FIGS. 3A-3C: Caracterização molecular do mutante Arca.(A) Mapa esquemático de alelos de tipo selvagem (RCA) e dedeleção (Arca). Os números indicam os éxons RCA. Osprimers forward e reversos para amplificação dos produtosde PCR de l,4kb PCR de alelos RCA (RCAf e RCAr) e Arca(rcaf e rcar) são indicados. (B) Análise de PCR (primersRCA -painel superior; primers rca - painel inferior) deplantas Tl expressando 183H12. Número de linhagens (acima)e base genética (abaixo) são indicados. (C) Análise deWestern blot de proteína total (5 yg/faixa) de folhas daslinhagens descritas em (B). O blot foi sondado comanticorpos policlonais criados contra RCAl recombinante.
FIGS. 4A-4D: Complementação funcional de mutantes Arcaexpressando RCAl e variantes termoestáveis 183H12, 301C7 e382D8 sob condições normais de cultivo (22°C). Os númerosindicam as designações de linhagens de eventos detransformação independentes. (A) Análise de Imuno-blot deproteína total de folhas de três semanas de idade. (B)Fotografias representando o tamanho similar de todas asplantas descritas acima quando cultivadas sob condiçõesnormais. (C) Desempenho fotossintético das plantas(plantas 8 a 10 / linhagem independente) descritas acimamonitorada por análise de fluorescência de imagem. (D)Efeito de tratamento de estresse por calor moderadotemporário (1 hr) em taxas fotossintéticas de linhagensArca transgênicas expressando RCAl e variantestermoestáveis. A fotossintese liquida de quatro plantasindependentes por linhagem foi monitorada usando umanalisador de gás infravermelho a 22°C (branco) e 30°C(cinza).
FIGS. 5A-5F: Efeito de estresse de calor moderado (30°Cpor 4 hr por dia) em plantas do tipo selvagem e mutantesArca expressando RCAl ou variantes termoestáveis 183H12,301C7 e 382D8. (A) Fotografia das plantas apresentandotaxas de crescimento diferencial mediadas por variante RCA.(B) Área foliar de 8-10 plantas independentes por linhagem,analisadas usando um sistema de análise de fluorescência deimagem. Médias seguidas por letras comuns não sãosignificativamente diferentes a P=O, 05 usando um LSDprotegido. (C) Fotossintese liquida de quatro plantasindependentes de linhagens selecionadas, monitorada poranálise de troca gasosa após 2hr a 30°C. (D) Fotografia deplantas maduras (8-semanas de idade) descrita em (C). (E)Número de siliquas por planta. Oito a dez plantasindependentes por linhagem foram analisadas. (F) Peso deSemente/1000 sementes de sementes colhidas das linhagensselecionadas (5 plantas independentes por linhagem).
FIGS. 6A-6D: Efeito de estresse por calor de 26°C nodesenvolvimento e rendimento de plantas de tipo selvagem elinhagens mutantes Arca expressando RCAl e variantetermoestável 183H12. (A) Número de siliquas por planta.Dez a doze plantas independentes por linhagem foramanalisadas. (B) Fotografia de siliquas das linhagensselecionadas cultivadas na temperatura indicadaapresentando variação em tamanho de siliqua e disposição desementes. Barra = 0,5 cm (C) Peso de semente /1000sementes para sementes colhidas a partir das plantasdescritas em (A). (D) Taxas de germinação (a 22°C) desementes (250 sementes por linhagem) colhidas de plantas deArabidopsis que foram cultivadas a 22°C (em branco) ou 26°C(cinza).
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção provê polipeptideos derivados daRuBisCo Ativase. Moléculas de ácidos nucléicos codificandoos polipeptideos da invenção são também providas. Métodospara usar os polipeptideos e ácidos nucléicos da invençãopara aumentar a tolerância de plantas ao calor,compreendendo intensificar a termoestabilidade de RuBisCoAtivase são englobados.
Polipeptideos da invenção
A presente invenção é relacionada à polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase que são mais termoestáveis doque a RuBisCo Ativase naturalmente ocorrente. Em avançospreferidos, o polipeptideo derivado da Rubisco Ativase équalquer das SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e22. Polipeptideos da invenção também englobam aquelespolipeptideos que são codificados por qualquer ácidonucléico derivado de RuBisCo Ativase da invenção.
Além dos polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase dainvenção, será colocado que invenção também englobavariantes desses, incluindo, mas não se limitando a,qualquer seqüência substancialmente similar, qualquerpolipeptideo de fusão, qualquer fragmento, análogo,homólogo, mutante, ou polipeptideo modificado desses. Asvariantes englobadas pela invenção são ao menosparcialmente funcionalmente ativas (i.e., são capazes deapresentar uma ou mais atividades funcionais associadas comRuBisCo Ativase de tipo selvagem) sob condições aquecidas.
Tais atividades funcionais incluem, mas não são limitadasa, atividades biológicas, tais como ativação de Rubisco;antigenicidade, i.e., uma habilidade de se ligar oucompetir com RuBisCo Ativase de tipo selvagem (incluindo,mas não se limitando a, SEQ ID NO: 2) para se ligar a umanticorpo anti-RuBisCo Ativase; imunogenicidade, i.e., umahabilidade de gerar anticorpo que se liga a um polipeptideode RuBisCo Ativase de tipo selvagem. Em avançospreferidos, as variantes possuem ao menos uma atividadefuncional que é substancialmente similar a, ou melhor doque seu polipeptideo parental (i.e., o polipeptideoderivado de rubisco ativase inalterado). Como aqui usado,a atividade funcional da variante será considerada"substancialmente similar" ao seu polipeptideo parental seestiver dentro do desvio padrão do mesmo.Em um avanço, polipeptídeos que possuem ao menos umaatividade funcional de RuBisCo Ativase (e.g., ativação deRubisco) sob condições aquecidas e são ao menos 85%, 90%,95%, 97%, 98% ou 99% idênticos à seqüência de polipeptídeosde qualquer de SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20e 22 são englobados pela invenção. Em avanços específicos,tais polipeptídeos da invenção são alterados em um ou mais,dois ou mais, cinco ou mais, ou sete ou mais posiçõescorrespondentes aos resíduos 42, 130, 131, 168, 257, 274,293 e 310 de SEQ ID NO: 2 com alinhamento ótimo daseqüência de polipeptídeos com SEQ ID NO: 2. Com respeitoa uma seqüência de aminoácidos que é alinhada de formaótima com uma seqüência referência, um aminoácido"corresponde" à posição na seqüência referência com a qualo resíduo é pareado no alinhamento.
Como aqui usado, onde uma seqüência é definida comosendo "ao menos X% idêntica" a uma seqüência referência,e.g., "um polipeptídeo ao menos 95% idêntico a SEQ ID NO:4", será entendido que "X% idêntico" refere-se à identidadepercentual absoluta, a menos que indicado ao contrário. 0termo "identidade percentual absoluta" refere-se a umaporcentagem de identidade de seqüência determinadapontuando-se aminoácidos ou ácidos nucléicos idênticos comoum e qualquer substituição como zero, independente dasimilaridade de aminoácidos ou ácidos nucléicos semcorrespondência. Em um alinhamento de seqüências típico, a"identidade percentual absoluta" de duas seqüências éapresentada como uma porcentagem de "identidades" deaminoácidos ou ácidos nucléicos. Em casos onde umalinhamento ótimo de duas seqüências requer a inserção deum espaço em uma ou ambas seqüências, um resíduo deaminoácido em uma seqüência que se alinha com um espaço naoutra seqüência é contado como uma falta de correspondênciapara propósitos de determinar a identidade percentual.Espaços podem ser internos ou externos, i.e., umatruncação. A identidade percentual absoluta pode serprontamente determinada usando, por exemplo, o programaClustal W, version 1.8, June 1999, usando parâmetros padrão(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22:4673-4680).
Em outro avanço, polipeptídeos de fusão compreendendoum polipeptídeo derivado de rubisco ativase ou variantedesses são englobados pela invenção. Em um avançoespecífico, um peptídeo (tais como aqueles descritos emU.S. Patent Application Serial No. 11/150,054) é adicionadoem um polipeptídeo da invenção, através do qual o peptídeodireciona a localização do polipeptídeo anexado aosplastídios vegetais ou aos órgãos fotossintéticos daplanta.
Em outro avanço, fragmentos de polipeptídeos derivadosde RuBisCo Ativase são englobados pela invenção.Polipeptídeos são englobados tendo ao menos uma atividadefuncional (e.g., ativação de Rubisco) de RuBisCo Ativasesob condições aquecidas e são de, ao menos, 25, 50, 75,100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375ou 380 aminoácidos contíguos em comprimento de qualquer deSEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22. Emavanços preferidos, o polinucleotideo, que codifica opolipeptídeo fragmento, hibridiza sob condições rigorosasao ácido nucléico que codifica qualquer de SEQ ID NOS: 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, e 22.
Em um avanço específico, um fragmento da invençãocorresponde a um domínio funcional de RuBisCo Ativaseincluindo, mas não se limitando a, o domínio de ligação deATP e o domínio de interação com substrato (ver, e.g., Li,et al. (2005) J Biol Chem 280:24864-24869; Salvucci, etal., (1994) Biochemistry 33:14879-14886; e van de Loo, etal., (1996) Biochemistry 35:8143-8148).
Em outro avanço, polipeptídeos análogos são englobadospela invenção. Polipeptídeos análogos podem possuirresíduos que foram modificados, i.e., pela anexaçãocovalente de qualquer tipo de molécula aos polipeptídeosderivados de RuBisCo Ativase. Por exemplo, mas não pormeio de limitação, um polipeptídeo análogo da invenção podeser modificado, e.g., por glicosilação, acetilação,conjugação a polietileno glicol, fosforilação, amidação,derivação por grupos protetores/bloqueadores conhecidos,clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ououtra proteína, etc. Um polipeptídeo análogo da invençãopode ser modificado por modificações químicas usandotécnicas conhecidas daqueles especialistas na arte,incluindo, mas não se limitando a clivagem químicaespecifica, acetilação, formilação, síntese metabólica detunicamicina, etc. Adicionalmente, um análogo de umpolipeptideo da invenção pode conter um ou mais aminoácidosnão clássicos.
Em outro avanço da invenção, um polipeptideo derivadode rubisco ativase não é SEQ ID NO: 2. Ainda em outroavanço da invenção, um polipeptideo derivado de rubiscoativase não é um polipeptideo de tipo selvagem naturalmenteocorrente.
Métodos de produção dos polipeptídeos da invenção,e.g., por meios recombinantes, são também providos.
Moléculas de ácidos nucléicos da invenção
A presente invenção também está relacionada com asmoléculas de ácidos nucléicos codificando polipeptídeosderivados de RuBisCo Ativase. Em avanços preferidos, amolécula de ácido nucléico derivada de RuBisCo Ativase équalquer de SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e21. Moléculas de ácidos nucléicos da invenção tambémenglobam aquelas moléculas de ácidos nucléicos quecodificam quaisquer polipeptídeos derivados de RuBisCoAtivase da invenção.
Além das moléculas de ácidos nucléicos codificandopolipeptídeos derivados de RuBisCo Ativase, será colocadoque moléculas de ácidos nucléicos da invenção tambémenglobam aqueles polipeptideos codificadores que sãovariantes de polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase,incluindo, mas não se limitando a, qualquer seqüênciasubstancialmente similar, qualquer polipeptideo de fusão,qualquer fragmento, análogo, homólogo, mutante, oupolipeptideo modificado desse. As variantes de molécula deácido nucléico englobadas pela invenção codificampolipeptideos que são ao menos parcialmente funcionalmenteativos (i.e., são capazes de apresentar uma ou maisatividades funcionais conhecidas associadas com RuBisCoAtivase de tipo selvagem) sob condições aquecidas.
Em um avanço, moléculas de ácidos nucléicos que são aomenos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99%idênticas a qualquer das moléculas de ácidos nucléicos deSEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 sãoenglobadas pela invenção. Em avanços específicos, taismoléculas de ácidos nucléicos da invenção codificampolipeptideos que são alterados em um ou mais, dois oumais, cinco ou mais, ou sete ou mais posiçõescorrespondentes aos resíduos 42, 130, 131, 168, 257, 274,293 e 310 de SEQ ID NO: 2 com alinhamento ótimo daseqüência de nucleotídeos com SEQ ID NO: 2.
Para determinar a identidade percentual de duasmoléculas de ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadaspara propósitos de comparação ótima (e.g., espaços podemser introduzidos na seqüência de uma primeira molécula deácido nucléico para alinhamento ótimo com uma segunda oumolécula de ácido nucléico). Os nucleotídeos nas posiçõesde nucleotideo correspondentes são, então, comparados.Quando uma posição na primeira seqüência é ocupada pelomesmo nucleotideo da posição correspondente na segundaseqüência, então, as moléculas são idênticas naquelaposição. A identidade percentual entre duas seqüências éuma função do número de posições idênticas compartilhadaspelas seqüências (i.e., % identidade = número de posiçõesidênticas se sobrepondo / número total de posições χ 100%).Em um avanço, as duas seqüências são do mesmo tamanho.
A determinação da identidade percentual entre duasseqüências pode ser também conseguida usando um algoritmomatemático. Um exemplo não limitante de um algoritmomatemático utilizado para a comparação de duas seqüências éo algoritmo de Karlin and Altschul (Karlin and Altschul,(1990) Proc. Natl. Acad. Sei. 87:2264-2268, modificado comoem Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei.90:5873-5877). Tal algoritmo é incorporado nos programasNBLAST e XBLAST (Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol.215:403 e Altschul, et al., (1997) Nucleic Acid Res.25:3389-3402). 0 software para efetuar análises BLAST estápublicamente disponível, e.g., através do National Centerfor Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve,primeiro, identificar pares de seqüência de alta pontuação(HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W naseqüência pesquisada, o que tanto corresponde ou satisfazalguma pontuação T limite positiva valorada quando alinhadacom uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência dabase de dados. T é referido como o limite de pontuação depalavra de vizinhança (Altschul, et al. , supra). Essapalavra de vizinhança inicial serve como ponto de partidapara iniciar buscas para encontrar HSPs mais longascontendo-as. As correspondências entre palavras são,então, estendidas em ambas as direções para cada seqüênciapara o máximo que a pontuação de alinhamento cumulativopuder ser aumentada. Pontuações cumulativas são calculadasusando, para seqüências de nucleotideos, os parâmetros M(pontuação de recompensa para um par de resíduos comcorrespondência; sempre> 0) e N (pontuação de penalidadepara resíduos sem correspondência; sempre < 0). Parapolipeptídeos, uma matriz de pontuação é usada paracalcular a pontuação cumulativa. A extensão decorrespondências de palavra em cada direção é paradaquando: a pontuação cumulativa de alinhamento cai pelaquantidade X a partir de ser máximo valor alcançado; apontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido àacumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos depontuação negativa; ou a extremidade de qualquer dasseqüências é alcançada. Os parâmetros do algoritmo BLASTW, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade doalinhamento. 0 programa BLASTN (para seqüências denucleotideos) usa como padrões, um comprimento de palavra(W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M =5, N = "4, e uma comparação de ambas as fitas. Parapolipeptídeos, o programa BLASTP usa como padrões umcomprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10,e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver, Henikoff & Henikoff,(1989) PNAS 89:10915).
O método de alinhamento Clustal V pode ser tambémusado para determinar a identidade percentual (Higgins andSharp, (198 9) CABIOS 5:151-153) e é encontrado no programaMegalign da suite computacional LASERGENE bioinformaticscomputíng suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). Os"parâmetros padrão" são os parâmetros pré-estabelecidospelo fabricante do programa e para múltiplos alinhamentoseles correspondem a PENALIDADE de espaço (GAP)=IO ePENALIDADE DE COMPRIMENTO DE ESPAÇO (GAP LENGTH)=10,enquanto que para alinhamentos par a par, eles são KTUPLE1, PENALIDADE DE ESPAÇO (GAP)=3, JANELA=5 E DIAGONAISGRAVADAS=5. Após o alinhamento das seqüências, usando oprograma Clustal V, é possível obter uma "identidadepercentual" visualizando a tabela de "distâncias deseqüência" no mesmo programa.
A identidade percentual entre duas seqüências pode serdeterminada usando técnicas similares àquelas descritasacima, com ou sem espaços permitidos. No cálculo daidentidade percentual, tipicamente apenas correspondênciasexatas são contadas.
Em outro avanço, fragmentos de moléculas de ácidosnucléicos derivadas de RuBisCo Ativase são englobados pelainvenção. São englobadas moléculas de ácidos nucléicos quepossuem ao menos uma atividade funcional de RuBisCo Ativase(e.g., ativação de Rubisco) sob condições aquecidas e sãode ao menos 100, 250, 500, 750, 950, 1000 ou 1100nucleotideos contíguos em comprimento de qualquer de SEQ IDNOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21.
Em um avanço específico, um fragmento da invençãocorresponde a uma molécula de ácido nucléico que codificaum domínio funcional de RuBisCo Ativase incluindo, mas nãose limitando a, o domínio de ligação de ATP e o domínio deinteração de substrato (ver, e.g., Li, et al., (2005) JBiol Chem 280:24864-24869; Salvucci, et al., (1994)Biochemistry 33:14879-14886; e van de Loo, et al., (1996)Biochemistry 35:8143-8148).
Em outro avanço, uma molécula de ácido nucléico quehibridiza sob condições rigorosas a qualquer uma de SEQ IDNOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 é englobada pelainvenção. A expressão "condições rigorosas" refere-se acondições de hibridização sob as quais um ácido nucléicohibridizará ao seu ácido nucléico alvo, tipicamente em umamistura complexa de ácido nucléico, mas para essencialmentenenhum outro ácido nucléico. Condições rigorosas sãodependentes de seqüência e serão diferentes emcircunstâncias diferentes. Ácidos nucléicos mais longoshibridizam especificamente em maiores temperaturas. Guiasextensivos para a hibridização de ácidos nucléicos podemser encontrados na arte (e.g., Tijssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization withNucleic Probes, "Overview of principies of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays" (1993)).Geralmente, condições altamente rigorosas são selecionadaspara serem cerca de 5-10°C menores que o ponto térmico defusão (Tm) para o ácido nucléico especifico em uma forçaiônica e pH definidos. Condições de baixo rigor sãogeralmente selecionadas para estarem cerca de 15-30°Cabaixo da Tm. A Tm é a temperatura (sob força iônica, pH econcentração de ácido nucléico definidos) na qual 50% dassondas complementares ao alvo hibridizam ao ácido nucléicoalvo em equilíbrio (como os ácidos nucléicos alvo sãopresentes em excesso, na Tm, 50% das sondas são ocupadas noequilíbrio). Condições de hibridização são tipicamenteaquelas nas quais a concentração de sais é menor do quecerca de 1,0 M de íons de sódio, tipicamente cerca de 0,01a 1,0 M de concentração de íons de sódio (ou outros sais)em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é ao menos cerca de 30°Cpara sondas curtas (e.g., 10 a 50 nucleotídeos) e ao menoscerca de 60°C para sondas longas (e.g., maiores do que 50nucleotídeos). Condições rigorosas podem ser tambémalcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, taiscomo formamida. Para hibridização seletiva ou específica,um sinal positivo é ao menos duas vezes a base, epreferivelmente 10 vezes a hibridização base. A expressão"hibridiza especificamente" refere-se à ligação,duplicação, ou hibridização de uma molécula apenas para umaseqüência de nucleotídeos em particular sob condições dehibridização rigorosas quando aquela seqüência estápresente em uma mistura complexa (e.g., total celular ouDNA ou RNA de biblioteca).Em outro avanço da invenção, uma molécula de ácidonucléico derivada de RuBisCo Ativase não é SEQ ID NO: 1.Ainda em outro avanço da invenção, uma molécula de ácidonucléico derivada RuBisCo Ativase não é uma molécula deácido nucléico de tipo selvagem naturalmente ocorrente.
Vetores compreendendo moléculas de ácidos nucléicos dainvenção são também englobados. Células ou plantascompreendendo os vetores da invenção são também englobadas.
0 termo "molécula de ácido nucléico" refere-se aqui aum polímero de fita simples ou dupla de bases dedesoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lido daextremidade 5' para a extremidade 3'. Isto inclui DNAcromossômico, plasmídio auto-replicantes e DNA ou RNA queefetua um papel primariamente estrutural.
Seqüências derivadas da RuBisCo Ativase
Polipeptideos e moléculas de ácidos nucléicosderivados de RuBisCo Ativase da invenção podem ser criadosintroduzindo-se uma ou mais substituições, adições e/oudeleções de resíduos em uma RuBisCo Ativase de tiposelvagem (wt) (incluindo, mas não se limitando a, RuBisCoAtivase de Arabidopsis (SEQ ID NO: 2)). Geralmente,polipeptídeos derivados de RuBisCo Ativase são criados paraacentuar uma característica desejável ou reduzir umacaracterística indesejável de um polipeptídeo de RuBisCoAtivase de tipo selvagem. Em um avanço, polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase melhoraram a termoestabilidadesobre RuBisCo Ativase de tipo selvagem. Em outro avanço,polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase possuematividade enzimática sob condições aquecidas (e.g., 40°C)que é similar a ou maior que a atividade da enzima deRuBisCo Ativase de tipo selvagem sob condições normais(e.g., 25 °C).
Em um avanço, uma molécula de ácido nucléico deRuBisCo Ativase de tipo selvagem (e.g., SEQ ID NO: 1) éusada como um modelo para criar moléculas de ácidosnucléicos derivadas de RuBisCo Ativase. Em alguns avanços,resíduos de ácidos nucléicos que codificam um ou maisresíduos de aminoácido, correspondendo aos resíduos 42,130, 131, 168, 257, 274, 293 e 310 de SEQ ID NO: 2, comalinhamento ótimo da seqüência de nucleotídeos com SEQ IDNO: 2, são alterados de forma que o aminoácido codificado éalterado.
Alterações de seqüência podem ser introduzidas portécnicas padrão, tais como técnicas de evolução moleculardirecionada e.g., métodos de embaralhamento de DNA (ver,e.g., Christians, et al., (1999) Nature Biotechnology17:259-264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291Crameri, et al., (1997) Nature Biotechnology 15:436-438Crameri, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:315-319Stemmer, (1994) Nature 370:389-391; Stemmer, et al., (1994)Proc. Natl. Acad. Sei. 91:10747-10751; United States PatentNos. 5.605.793; 6.117.679; 6.132.970; 5.939.250; 5.965.408;6.171.820; International Publication Nos. WO 95/22625; WO97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; e WO01/75767); mutagênese sitio direcionada (ver, e.g., Kunkel,(1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:488-492; Oliphant, et al.f(1986) Gene 44:177-183); mutagênese oligonucleotídeo-direcionada (ver, e.g., Reidhaar-Olson, et al., (1988)Science 241:53-57); mutagênese química (ver, e.g., Eckert,et al., (1987) Mutat. Res. 178:1-10); error prone PCR (ver,e.g., Caldwell & Joyce, (1992) PCR Methods Applíc. 2:28-33); e mutagênese de cassete (ver, e.g., Arkin, et al.,(1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89:7871-7815); (vergeralmente, e.g., Arnold, (1993) Curr. Opinion Biotechnol.4:450-455; Ling, et al., (1997) Anal. Biochem., 254(2) :157-78; Dale, et al., (1996) Methods Mol. Biol. 57:369-74;Smith, (1985) Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein, etal., (1985) Science, 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem.J. 237:1-7; Kramer, et al., (1984) Cell 38:879-887; Wells,et al., (1985) Gene 34:315-323; Minshull, et al., (1999)Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290).
Em um avanço, embaralhamento de DNA é usado para criarmoléculas de ácidos nucléicos derivadas de RuBisCo Ativase.Embaralhamento de DNA pode ser conseguido in vitro, invivo, in silico, ou através de uma combinação desses.Métodos in silico de recombinação podem ser efetuados nosquais algoritmos genéticos são usados em um computador pararecombinar trechos de seqüência que correspondem a ácidosnucléicos homólogos (ou mesmo não homólogos). Os trechosde seqüência recombinados resultantes são opcionalmenteconvertidos em ácidos nucléicos pela síntese de ácidosnucléicos que correspondem às seqüências recombinadas,e.g., em harmonia com técnicas de reunião de gene comsíntese de oligonucleotídeo. Essa abordagem pode geraralterações randômicas, parcialmente randômicas ouprojetadas. Vários detalhes em relação à recombinação insilíco, incluindo o uso de algoritmos genéticos, operadoresgenéticos e similares em sistemas de computador, combinadoscom a geração de ácidos nucléicos correspondentes, assimcomo combinações de ácidos nucléicos projetados (e.g.,baseado em seleção de sítio de cross-over) assim comoprojetadas, métodos de recombinação pseudo-randômicos ourandômicos, são descritos na arte (ver, e.g., InternationalPublication Nos. WO 00/42560 e WO 00/42559).
Em outro avanço, mutagênese direcionada é usada paracriar moléculas de ácidos nucléicos derivadas de RuBisCoAtivase escolhendo seqüências de nucleotídeos ou posiçõesda RuBisCo Ativase de tipo selvagem em particular paraalteração. Tais mutações direcionadas podem serintroduzidas em qualquer posição no ácido nucléico e podemser conservadas ou não conservadas.
Uma "substituição de aminoácido não conservada" é umana qual o resíduo de aminoácido é substituído com umresíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral diferente.Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias lateraissimilares foram definidas na arte. Essas famílias incluemaminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina,arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácidoaspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina), cadeiaslaterais polares não carregadas (e.g., glicina, serina,treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais apolares(e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias lateraisβ-ramifiçadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) ecadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina,triptofano, histidina).
Alternativamente ou adicionalmente a substituições deresíduos de aminoácido não conservadas, tais mutações podemser conservadas. Uma "substituição de aminoácidoconservada" é uma na qual o resíduo de aminoácido ésubstituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeialateral similar. Após a mutagênese, a proteína codificadapode ser expressa de forma recombinante e a atividade daproteína pode ser determinada.
Em alguns avanços, substituições podem ser feitas deforma que o aminoácido, na posição 42, possua uma cadeialateral polar não carregada ou uma cadeia lateralβ-ramifiçada, na posição 130, possua uma cadeia lateralbásica, na posição 131, possua uma cadeia lateral apoiar ouuma cadeia lateral β-ramifiçada, na posição 168, possua umacadeia lateral básica, na posição 257, possua uma cadeialateral apoiar ou uma cadeia lateral β-ramifiçada, naposição 274, possua uma cadeia lateral básica, na posição293, possua uma cadeia lateral básica, e/ou na posição 310,possua uma cadeia lateral ácida. As posições deaminoácidos podem ser determinadas alinhando otimamente asseqüências de aminoácidos do polipeptideo derivado derubisco ativase codificado com SEQ ID NO: 2.
Em outro avanço, mutagênese aleatória é usada paracriar moléculas de ácidos nucléicos derivadas de RuBisCoAtivase. Mutações podem ser introduzidas randomicamente aolongo de toda ou parte da seqüência codificadora (e.g., pormutagênese de saturação). Em certos avanços, seqüências denucleotideos codificando outros polipeptideos relacionadosque possuem domínios similares, motivos estruturais, sítiosativos, ou que se alinham com uma porção de RuBisCo Ativasede tipo selvagem com faltas de correspondência oucorrespondências imperfeitas, podem ser usadas no processode mutagênese para gerar diversidade de seqüências.
Deveria ser entendido que, para cada etapa demutagênese em algumas das técnicas acima mencionadas, umnúmero de ciclos interativos de quaisquer ou de todas asetapas, podem ser efetuados para otimizar a diversidade deseqüências. Os métodos acima descritos podem ser usados emcombinação em qualquer ordem desejada. Em váriasinstâncias, os métodos resultam em um pool de seqüências deácidos nucléicos alteradas ou um pool de célulashospedeiras recombinantes compreendendo seqüências deácidos nucléicos alteradas. As seqüências de ácidosnucléicos ou células hospedeiras alteradas, expressando umaseqüência de ácidos nucléicos alterada com ascaracterísticas desejadas, podem ser identificadas porrastreamento com um ou mais testes conhecidos na arte. Ostestes podem ser conduzidos sob condições que selecionampolipeptídeos possuindo as caracter!sticas físicas ouquímicas desejadas. As alterações na seqüência de ácidosnucléicos podem ser determinadas seqüenciando-se a moléculade ácido nucléico codificando o polipeptídeo alterado nosclones.
Adicionalmente, moléculas de ácidos nucléicosderivadas de RuBisCo Ativase podem ser códon otimizadas,tanto completamente ou em parte. Como qualquer aminoácido(exceto metionina) é codificado por um número de códons(Tabela 1), a seqüência da molécula de ácido nucléico podeser modificada sem mudar o aminoácido codificado.Otimização de códon é quando um ou mais códons sãoalterados no nível de ácido nucléico para coincidir com ouse aproximar melhor do uso de códon de um hospedeiro emparticular. A freqüência de uso de códon preferida exibidapor uma célula hospedeira pode ser calculada fazendo amédia da freqüência de uso de códon preferido em um númerogrande de genes expressos pela célula hospedeira. Essaanálise pode ser limitada a genes que são altamenteexpressos pela célula hospedeira. U.S. Patent No.5.824.864, por exemplo, provê a freqüência de uso de códonpor genes altamente expressos exibida por plantasdicotiledôneas e plantas monocotiledôneas. Aqueles deconhecimento ordinário na arte reconhecerão que estãodisponíveis na arte tabelas e outras referências provendoinformações de preferência para uma ampla gama deorganismos.
Métodos de ensaio de atividade da RuBisCo Ativase
A presente invenção é direcionada para polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase com termoestabilidademelhorada, se comparados a RuBisCo Ativase de tiposelvagem. Como aqui usado, o termo "termoestabilidademelhorada" refere-se à habilidade aumentada de RuBisCoAtivase ativar a Rubisco sob condições aquecidas, secomparado com RuBisCo Ativase do tipo selvagem. Em umavanço, polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase têmatividade enzimática sob condições aquecidas (e.g., 35°C oumais) que é maior que a atividade enzimática de RuBisCoAtivase de tipo selvagem sob condições aquecidas. Em outroavanço, polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase têmatividade enzimática sob condições aquecidas (e.g., 26°C oumais, mais preferivelmente 40°C para testes in vitro) que ésubstancialmente similar a ou maior do que a atividade deenzima de RuBisCo Ativase de tipo selvagem sob condiçõesnormais (e.g., 20-25°C, mais preferivelmente 25°C paratestes in vitro e 22°C para testes in vivo) . Como aquiusado, o termo "substancialmente similar" refere-se àatividade enzimática de um polipeptídeo derivado de rubiscoativase que está dentro de um desvio padrão daquela deRubisco de tipo selvagem.Qualquer método conhecido na arte pode ser usado paratestar a atividade de polipeptideos derivados de RuBisCoAtivase (incluindo, mas não se limitando a, ativação deRubisco e hidrólise de ATP) sob condições aquecidas.
Em alguns avanços, a atividade do polipeptideoderivado de rubisco ativase é testada in vitro. Em umavanço, polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase podemser testados para sua habilidade de ativar a Rubisco quandoincubados em solução compreendendo Rubisco desativada,RuBP, ATP, e uma fonte de carbono marcado (e.g.,[C14JNaHCO3). A incorporação de carbono marcado em ácido 3-fosfoglicérico (GPA) pode ser monitorada como uma indicaçãode ativação de Rubisco. Em outro avanço, polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase podem ser testados para suahabilidade de hidrolisar ATP quando incubados em umasolução compreendendo ATP. Os testes podem ser conduzidossob condições aquecidas ou sob condições normais, após ospolipeptideos derivados de RuBisCo Ativase serem aquecidosantes da realização do teste. Componentes purificadospodem ser usados, assim como células compreendendo oscomponentes para ativação de Rubisco.
Em outros avanços, a atividade de polipeptideoderivado de rubisco ativase é testada in vivo. Plantas quenão expressam RuBisCo Ativase de tipo selvagem (e.g.,mutantes de deleção) são feitas para expressar um ou maispolipeptideos derivados de RuBisCo Ativase e podem seranalisadas para taxas de fotossintese, biomassa, taxas decrescimento, e produção de sementes sob condições aquecidasde cultivo. As plantas podem ser cultivadas totalmente sobcondições aquecidas ou por períodos de tempo mais curtossob condições aquecidas. Em um avanço, taxas defotossíntese são medidas analisando as plantas para fixaçãode CO2. Em outro avanço, taxas de crescimento são medidasanalisando a área foliar das plantas. Em outro avanço, aprodução de sementes é analisada determinando-se o peso desementes de plantas maduras secas. Em outro avanço, aprodução de sementes é analisada determinando-se a taxa degerminação de semente.
Métodos de intensificar a tolerância ao calor em Plantas
RuBisCo Ativase ativa Rubisco em plantas. A Rubiscoativada está envolvida na fotossíntese e é a etapalimitante de taxa do processo fotossintético. Com aatividade de RuBisCo Ativase diminuída, a Rubisco permaneceinativa e a fotossíntese se torna mais lenta ou para.Temperaturas aumentadas desestabilizam e/ou desnaturam aRuBisCo Ativase, deixando, dessa forma, a enzima menoscapaz ou incapaz de converter Rubisco inativa para a formaativa. A presente invenção é direcionada parapolipeptídeos derivados de RuBisCo Ativase comtermoestabilidade melhorada, se comparados com RuBisCoAtivase de tipo selvagem. Sendo assim, o processofotossintético pode se tornar mais tolerante ao calor com oenvolvimento de polipeptídeos derivados de RuBisCo Ativasecom termoestabilidade melhorada.Qualquer método conhecido na arte pode ser usado parafazer plantas expressarem um ou mais dos polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase da invenção. Em um avanço,plantas transgênicas podem ser feitas para expressar um oumais polipeptideos da invenção. A planta transgênica podeexpressar um ou mais polipeptideos da invenção em todos ostecidos (e.g., expressão global). Alternativamente, um oumais polipeptideos da invenção podem ser expressos apenasem um subgrupo de tecidos (e.g., expressão especifica detecido), preferencialmente aqueles tecidos ou organelasenvolvidas na fotossintese (e.g., os plastidios).Polipeptideos da invenção podem ser expressosconstitutivamente na planta ou estar sob o controle de umpromotor induzido. Em alguns avanços, a expressão e/ouatividade da RuBisCo Ativase endógena da planta é reduzidaou eliminada.
Expressão Recombinante
Moléculas de ácidos nucléicos e polipeptideos dainvenção podem ser expressos de forma recombinante usandoDNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecularque são bem conhecidas na arte (e.g., Sambrook, Fritsch,and Maniatis, Molecular Cloning; A Laboratory Manual; ColdSpring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,(1989)). Adicionalmente, técnicas de DNA recombinantepodem ser usadas para criar construções de ácidos nucléicosadequados para uso na produção de plantas transgênicas.Conseqüentemente, um aspecto da invenção pertence avetores, preferencialmente vetores de expressão,compreendendo uma molécula de ácido nucléico da invenção,ou uma variante desses. Como aqui usado, o termo "vetor"refere-se a um polinucleotideo capaz de transportar outroácido nucléico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um"plasmidio", que se refere a um Ioop de DNA de dupla-fitacircular no qual segmentos de DNA adicionais podem serintroduzidos. Outro tipo de vetor é um vetor viral,caracterizado pelo fato de que segmentos de DNA adicionaispodem ser introduzidos no genoma viral.
Certos vetores são capazes de replicação autônoma emuma célula hospedeira na qual são introduzidos (e.g.,vetores bacterianos tendo uma origem de replicaçãobacteriana e vetores epissomais). Outros vetores (e.g.,vetores não epissomais) são integrados no genoma de umacélula hospedeira com a introdução na célula hospedeira, e,dessa forma, são replicados junto com o genoma dohospedeiro. Em geral, vetores de expressão de utilidade emtécnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na formade plasmidios (vetores). Contudo, a invenção deve incluirtais outras formas de vetores de expressão, tais comovetores virais (e.g., retrovirus de replicação defeituosa).
Os vetores de expressão recombinantes da invençãocompreendem uma molécula de ácido nucléico da invenção emuma forma adequada para expressão da molécula de ácidonucléico e uma célula hospedeira. Isso significa que osvetores de expressão recombinantes incluem uma ou maisseqüências reguladoras, selecionadas com base nas célulashospedeiras a serem usadas para expressão, que sãooperacionalmente associadas com o polinucleotideo a serexpresso. Em um vetor de expressão recombinante,"operacionalmente associado" deve significar que aseqüência de nucleotideos de interesse está ligada à(s)seqüência(s) reguladora(s) de uma maneira que permite aexpressão da seqüência de nucleotideos (e.g., em um sistemade transcrição/tradução in vitro ou em uma célulahospedeira quando o vetor é introduzido na célulahospedeira). O termo "seqüência reguladora" deve incluirpromotores, intensificadores e outros elementos de controlede expressão (e.g., sinais de poliadenilação). Taisseqüências reguladoras estão descritas na arte (e.g.,Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology,(1990) Academic Press, San Diego, CA). Seqüênciasreguladoras incluem aquelas que direcionam a expressãoconstitutiva de uma seqüência de nucleotideos em váriostipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam aexpressão da seqüência de nucleotideos apenas em certascélulas hospedeiras (e.g., seqüências reguladorasespecificas de tecido). Será ponderado por aquelesespecialistas na arte que o projeto do vetor de expressãopode depender de tais fatores, como, a escolha da célulahospedeira a ser transformada, o nivel de expressão deproteína desejado, a área do organismo no qual a expressãoé desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podemser introduzidos em células hospedeiras para, dessa forma,produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas oupeptídeos de fusão, codificados por moléculas de ácidosnucléicos como aqui descrito.
Em alguns avanços, ácidos nucléicos isolados, queservem como elementos promotores ou intensificadores, podemser introduzidos na posição apropriada (geralmente acima)de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo dapresente invenção, de forma a regular positiva ounegativamente a expressão de um polinucleotídeo da presenteinvenção. Por exemplo, promotores endógenos podem seralterados in vivo por mutação, deleção, e/ou substituição(ver, U.S. Patent No. 5.565.350; International PatentApplication No. PCT/US93/03868), ou promotores isoladospodem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientaçãoe distância correta de um gene cognato de umpolinucleotídeo da presente invenção, de forma a controlara expressão do gene. A expressão gênica pode ser moduladasob condições adequadas para crescimento vegetal, de formaa alterar a concentração total e/ou alterar a composiçãodos polipeptídeos da presente invenção em células vegetais.Assim, a presente invenção provê composições, e métodospara fazer promotores e/ou intensificadores heterólogosoperacionalmente ligados a uma forma nativa, endógena(i.e., não heteróloga) de um polinucleotídeo da presenteinvenção.Se a expressão de polipeptídeo é desejada, égeralmente desejável incluir uma região de poliadenilaçãona extremidade 3' de uma região codificadora depolinucleotideo. A região de poliadenilação pode serderivada do gene natural, de uma variedade de outros genesvegetais, ou de T-DNA. A seqüência da extremidade 3' a seradicionada pode ser derivada de, por exemplo, genes denopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamentede outro gene vegetal ou, menos preferencialmente, de outrogene eucarionte.
Os vetores de expressão recombinantes da invençãopodem ser projetados para expressão de um polipeptídeo dainvenção em células procarióticas (e.g.,Enterobacteriaceaef tais como Escherichia; Baeillaeeae;Rhizoboeeae, tais como Rhizobium e Rhizobaeter;Spirillaeeaef tais como fotobactérias; Zymomonas; Serratia;Aeromonas; Vibrio; Desulfovibrio; Spirillum;Laetobaeillaeeae; Pseudomonadaceae, tais como Pseudomonas eAeetobaeter; Azotobacteraeeae e Nitrobaeteraeeae) oucélulas eucarióticas (e.g., células de insetos usandovetores de expressão de bacilovírus, células de leveduras,células vegetais, ou células de mamíferos) (ver, Goeddel,supra. para uma discussão sobre células hospedeirasadequadas). Alternativamente, o vetor de expressãorecombinante pode ser transcrito ou traduzido in vitro,usando, por exemplo, seqüências reguladoras promotoras T7 eT7 polimerase.A expressão de proteínas em procariontes é maisfreqüentemente conduzida em E. coli com vetorescompreendendo promotores constitutivos ou induzidosdirecionando a expressão tanto de proteínas de fusão ou nãode fusão. Vetores de fusão adicionam um número deaminoácidos a uma proteína aí codificada, usualmente aoterminal amino da proteína recombinante. Tais vetores defusão tipicamente servem ao menos para três propósitos: 1)para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) paraaumentar a solubilidade da proteína recombinante; e/ou 3)para adicionar na purificação da proteína recombinanteatuando como um ligante em purificação de afinidade.
Freqüentemente, em vetores de expressão de fusão, um sítiode clivagem proteolítica é introduzido na junção da porçãode fusão com a proteína recombinante para permitir aseparação da proteína recombinante a partir da porção defusão subseqüente à purificação da proteína de fusão. Taisenzimas, e suas seqüências de reconhecimento cognatas,incluem Factor Xa, trombina e enteroquinase. Vetores deexpressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia BiotechInc; Smith and Johnson, (1988) Gene 67:31-40), pMAL (NewEngland Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia,Piscataway, NJ) que fundem glutationa S-transferase (GST),proteína E de ligação a maltose, ou proteína A,respectivamente, para a proteína recombinante alvo.
Em outro avanço, o vetor de expressão é um vetor deexpressão de leveduras. Exemplos de vetores para expressãona levedura S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari, etal., (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan andHerskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz, etal., (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corp., SanDiego, CA), e pPicZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA).
Alternativamente, o vetor de expressão é um vetor deexpressão bacilovírus. Vetores de bacilovirus disponíveispara expressão de proteínas em células de insetoscultivadas (e.g., células Sf 9) incluem a série pAc (Smith,et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pVL(Lucklow and Summers, (1989) Virology 170:31-39).
Ainda em outro avanço, uma molécula de ácido nucléicoda invenção é expressa em células vegetais usando um vetorde expressão vegetal incluindo, mas não limitado a, vetoresde expressão de vírus de mosaico de tabaco e vírus debatata.
Outros sistemas de expressão adequados para ambascélulas procariontes e eucariontes são conhecidos na arte(ver, e.g., capítulos 16 e 17 de Sambrook, et al. (1990)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Um número de promotores pode ser usado na prática dainvenção. Os promotores podem ser selecionados baseados noresultado desejado. Os ácidos nucléicos podem sercombinados com promotores constitutivos, tecido-específicos, induzidos, ou outros promotores para expressãono organismo hospedeiro.
Um "promotor tecido-específico" pode direcionar aexpressão de ácidos nucléicos da presente invenção em umtecido específico, órgão ou tipo de célula específicos.Promotores tecido-específicos podem ser induzidos.
Similarmente, promotores tecido-específicos podem apenaspromover a transcrição em um certo período de tempo ouestágio de desenvolvimento naquele tecido. Outrospromotores tecido-específicos podem ser ativados ao longodo ciclo de vida de um tecido em particular. Alguém deconhecimento ordinário na arte reconhecerá que um promotorespecífico de tecido pode dirigir a expressão de seqüênciasoperacionalmente ligadas em tecidos que não o tecido alvo.
Assim, como aqui usado, um promotor específico de tecido éum que dirige a expressão preferencialmente no tecido outipo de célula alvo, mas pode também levar a algumaexpressão em outros tecidos também. Um número depromotores tecido-específicos pode ser usado na presenteinvenção. Com o promotor apropriado, qualquer órgão podeser visado, tal como órgãos/estruturas vegetativas (e.g.,folhas, caules e tubérculos), raízes, flores eórgãos/estruturas florais (e.g., brácteas, sépalas,pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes(incluindo embriões, endosperma, e cobertura de semente) efruto. Por exemplo, promotores que direcionam a expressãode moléculas de ácidos nucléicos em promotores específicosde folhas e/ou órgãos fotossintéticos (tais como promotorRBCS descrito em Khoudi, et al., (1997) Gene 197:343) sãoúteis para intensificar a fotossintese. Adicionalmente,expressão tecido-especifica pode ser obtida adicionando-seum peptideo em um polipeptideo da invenção, que direciona alocalização do polipeptideo anexado aos órgãosfotossintéticos (tais como aqueles descritos em U.S. PatentApplication Serial No. 11/150.054).
Um "promotor constitutivo" é definido como um promotorque irá direcionar a expressão de um gene em todos ostecidos e são ativos sob a maioria das condições ambientaise estados de desenvolvimento ou de diferenciação celular.Exemplos de promotores constitutivos incluem a região deiniciação de transcrição de virus de mosaico de couve-flor(CaMV) 35S, o promotor 1'- ou 2'- derivado de T-DNA deAgrobacterium tumafaciens, e outras regiões de iniciação detranscrição de vários genes vegetais conhecidos daqueles deconhecimento ordinário na arte. Tais genes incluem, porexemplo, ACTll de Arabidopsis (Huang, et al., (1996) PlantMol. Biol. 33:125-139), Cat3 de Arabidopsis (GenBankAccession No. U43147, Zhong, et al., (1996) Mol. Gen.Genet. 251:196-203), o gene codificando proteína desaturasecarregadora de estearoil-acil de Brassica napus (GenbankAccession No. X74782, Solocombe, et al., (1994) PlantPhysiol. 104:1167-1176), GPcl de milho (GenBank AccessionNo. X15596, Martinez, et al., (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565), e Gpc2 de milho (GenBank Accession No. U45855,Manj unath, et al., (1997) 1Plant Mol. Biol. 33:97-112).Qualquer promotor constitutivo forte, tal como o promotorCaMV 35S, pode ser usado para a expressão depolinucleotideos da presente invenção pela planta.
O termo "promotor induzido" refere-se a um promotorque está sob preciso controle ambiental ou pordesenvolvimento. Exemplos de condições ambientais quepodem afetar a transcrição por promotores induzidos incluemcondições anaeróbicas, temperatura elevada, a presença deluz, ou borrifamento com químicos/hormônios.
Promotores constitutivos adequados para uso em umacélula vegetal hospedeira incluem, por exemplo, o promotornúcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivosrelacionados (International Publication No. WO 99/43838 andU.S. Patent No. 6.072.050); o promotor núcleo CaMV 35S(Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz(McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina(Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632and Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet.81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (U.S. Patent No. 5.659.026), esimilares (e.g., U.S. Patent Nos. 5.608.149; 5.608.144;5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463;5.608.142; e 6.177.611).
Outro aspecto da invenção refere-se a célulashospedeiras nas quais um vetor de expressão recombinante dainvenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e"célula hospedeira recombinante" são aqui usadosintercambiavelmente. É entendido que tais termos referem-se não apenas à célula objeto em particular, mas à progênieou progênie potencial de tal célula. Como certasmodificações podem ocorrer em gerações sucessivas devidotanto a mutação ou influências ambientais, tal progêniepode, na verdade, não ser idêntica à célula parental, masainda é incluída no escopo do termo, como aqui usado.
Conseqüentemente, a presente invenção provê uma célulahospedeira tendo um vetor de expressão compreendendo umamolécula de ácido nucléico da invenção, ou um variantedesse. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célulaprocariótica (e.g., E. coli, Bacillus thuringiensis) oueucariótica (e.g., células de insetos, leveduras ou célulasvegetais). A invenção também provê um método paraexpressar uma molécula de ácido nucléico da invenção,fazendo, assim, o polipeptídeo codificado compreendendo asetapas de i) cultivar uma célula compreendendo uma moléculade ácido nucléico da invenção sob condições que permitem aprodução do polipeptídeo codificado; e ii) isolar opolipeptídeo expresso.
0 DNA do vetor pode ser introduzido em célulasprocarióticas ou eucarióticas via técnicas de transformaçãoou transfecção convencionais. Como aqui usado, os termos"transformação" e "transfecção" devem referir-se a umavariedade de técnicas reconhecidas na arte para introduzirmoléculas de ácidos nucléicos estrangeiras em uma célulahospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcioou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran,lipofecção, eletroporação, Agrobacterium tumefaciens, einfiltração a vácuo. Métodos adequados para transformar outransfectar células hospedeiras podem ser encontrados naarte (e.g., Sambrook, et al., supra.).
Produção de Plantas transgênicas
Qualquer método conhecido na arte pode ser usado paratransformar uma planta ou célula vegetal com uma moléculade ácido nucléico da presente invenção. Moléculas deácidos nucléicos podem ser incorporadas em DNA vegetal(e.g., DNA genômico ou DNA de cloroplasto) ou ser mantidassem inserção no DNA vegetal (e.g., através do uso decromossomos artificiais). Métodos adequados de introduzirmoléculas de ácidos nucléicos em células vegetais incluemmicroinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334); eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl.Acad. Sei. 83:5602-5606; D1Halluin, et al., (1992) PlantCell 4:14 95-1505); transformação mediada por Agrobacterium(U.S. Patent Nos. 5.563.055 e 5.981.840, Osjoda, et al.,(1996) Nature Bioteehnology 14:745-750; Horsch, et al.,(1984) Science 233:496-498; Fraley, et al., (1983) Proc.Natl. Acad. Sei. 80:4803; e Gene Transfer to Plants,Potrykus, ed., Springer-Verlag, Berlin 1995); transferênciade gene direta (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J.3:2717-2722); aceleração balística de partículas (U.S.Patent Nos. 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782;Tomes, et al., (1995) "Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment, in Plant Cell,Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborgand Phillips, Springer-Verlag, Berlin; e McCabe, et al.,(1988) Biotechnology 6:923-926); transformação mediada porvirus (U.S. Patent Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785,5.589.367 and 5.316.931); transformação de pólen (De Wet,et al., (1985) in The Experimental Manipulation of OvuleTissues, ed. Chapman, et al., Longman, New York, pp. 197-209); transformação Lec 1 (U.S. Patent Application Ser. No.09/435.054; International Publication No. WO 00/28058);transformação mediada por fios de carbeto de silício(Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418;Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566); etecnologia de transformação de cloroplasto (Bogorad, (2000)Trends in Biotechnology 18:257-263; Ramesh, et al., (2004)Methods Mol Biol. 274:301-7; Hou, et al., (2003) TransgenicRes. 12:111-4; Kindle, et al., (1991) Proc. Natl. Acad.Sei. 88:1721-5; Bateman and Purton, (2000) Mol Gen Genet.263:404-10; Sidorov, et al., (1999) Plant J. 19:209-216).
A escolha de protocolos de transformação usados paragerar plantas transgênicas e células vegetais transgênicaspode variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal,i.e., monocotiledônea ou dicotiledônea, visada paratransformação. Exemplos de protocolos de transformaçãoparticularmente adequados para um tipo de planta emparticular incluem aqueles para: batata (Tu, et al., (1998)Plant Molecular Biology 37:829-838; Chong, et al., (2000)Transgenic Research 9:71-78); soja (Christou, et al.r(1988) Plant Physiol. 87:671-674; McCabe, et al.r (1988)BioTechnology 6:923-926; Finer and McMullen, (1991) InVitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; Singh, et al., (1998)Theor. Appl. Genet. 96:319-324); milho (Klein, et al.,(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:4305-4309; Klein, et al.,(1988) Biotechnology 6:559-563; Klein, et al., (1988) PlantPhysiol. 91:440-444; Fromm, et al., (1990) Biotechnology8:833-839; Tomes, et al., (1995) "Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," inPlant Cellf Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods,ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)); cereais (Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature 311:763-764; U.S.Patent No. 5.736.369).
Em alguns avanços, mais de uma construção é usada paratransformação na geração de plantas e células vegetaistransgênicas. Múltiplas construções podem ser incluídasnas posições eis ou trans. Em avanços preferidos, cadaconstrução possui um promotor e outras seqüênciasreguladoras.
As plantas transgênicas podem expressar o transgene dequalquer meio conhecido na arte incluindo, mas não selimitando a, expressão constitutiva, expressão regulada pordesenvolvimento, e expressão específica de tecido. Em umavanço específico, promotores que direcionam a expressão demoléculas de ácidos nucléicos em folhas e/ou órgãosfotossintéticos (tais como o promotor RBCS descrito emKhoudi, et al., Gene 197:343) são usados para expressar asmoléculas de ácidos nucléicos e/ou polipeptideos dainvenção.
Células vegetais transformadas, que são derivadas porqualquer das técnicas de transformação acima, podem sercultivadas para gerar uma planta inteira que possui ogenótipo transformado e, assim, o fenótipo desejado. Taistécnicas de regeneração confiam na manipulação de certosfito-hormônios em um meio de crescimento de cultura detecidos, tipicamente confiando em um marcador de biocidae/ou herbicida que foi introduzido junto com as seqüênciasde nucleotideos desejadas. A regeneração de plantas apartir de protoplastos cultivados é descrita na arte (e.g.,Evans, et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbookof Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan PublishingCompany, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants,Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985).A regeneração pode ser também obtida a partir de calosvegetais, explantes vegetais, órgãos vegetais, ou partesdesses. Tais técnicas de regeneração são também descritasna arte (e.g., Klee, et al., (1987) Ann. Rev. of Plant Phys38:467-486).
O termo "planta" inclui plantas inteiras,órgãos/estruturas de brotos vegetativos (e.g. folhas,caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturasflorais (e.g. brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelosanteras e óvulos), sementes (incluindo embriões,endosperma, e cobertura de semente) e fruto (o ováriomaduro), tecido vegetal (e.g. tecido vascular, tecido desolo, e similares) e células (e.g. células de guarda,células de ovos, tricomas e similares), e progênie dasmesmas. A classe de plantas que pode ser usada em métodosda presente invenção inclui a classe de plantas superiorese inferiores passíveis de técnicas de transformação,incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas edicotiledôneas), gimnospermas, samambaias, e algasmulticelulares. Plantas de uma variedade de níveis deploidia, incluindo aneuplóides, poliplóides, diplóides,haplóide e plantas hemizigóticas são também incluídas.
As moléculas de ácidos nucléicos da invenção podem serusadas para conferir traços desejados essencialmente emqualquer planta. Assim, a invenção possui uso sobre umaampla gama de plantas, incluindo espécies dos gênerosAgrotisf Allium, Ananas, Anacardium, Apiumr Arachis,Asparagus, Athamantha, Atropa, Avenar Bambusa, Beta,Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, CariearCeratonia. Cicer, Chenopodiumf Chicorium, Citrus,Citrullus, Capsicumf Carthamus, Cocos, Coffear Coix,Cucumis, Cueurbita, Cynodonr Daetylis r Daturar DaueusrDianthusr Digitalis, Dioseorea r Elaeisr EliusinerEuphorbia, Festuear Fieusr Fragaria, Geraniumr GlyeinerGraminae r Gossypiumr Helianthus, Heteroeallis, HevearHibiseus, Hordeumr Hyoseyamus, Ipomoear Laetuear LathyrusrLensr Liliumr Linumr Loliumr Lotusr Lupinusr Lyeopersieon,Maeadamia r Maerophylla r Malusr Mangi fera, ManihotrMajorana, Medicagor Musa, Narcissus, Nemesiaf Nicotiana,Onobryehis, Olea, Olyreae, Oryza, Panicum, Panieum,Panieum, Pannisetum, Pennisetum, Petunia, Pelargonium,Persea, Pharoideae, Phaseolus, Phleum, Pieea, Poa, Pinus,Pistaehia, Pisumr Populusr Pseudotsuga, Pyrusr Prunus,Pseutotsugar Psidium, Quereusr Ranunculus, Raphanus, RibesrRieinusr Rhododendron, Rosa, Saccharumr Salpiglossis,Seealer Seneeior Setariar Sequoiar Sinapisr SolanumrSorghumr Stenotaphrum, Theobromusr Trigonellar TrifoliumrTrigonellar Tritieumr Tsuga, Tulipa, Vieiar Vitisr Vignar eZea.
Em avanços específicos, plantas transgênicas sãoplantas de milho, tomate, batata, arroz, soja, algodão,girassol, alfafa, alface, canola, sorgo, ou plantas detabaco.
Plantas transgênicas podem ser cultivadas epolinizadas tanto com a mesma linhagem transformada oulinhagens diferentes. Duas ou mais gerações das plantaspodem ser cultivadas para garantir que a expressão damolécula de ácido nucléico desejada, polipeptídeo e/oucaracterística fenotípica esteja estavelmente mantida eherdada. Alguém de conhecimento ordinário na artereconhecerá que, após a molécula de ácido nucléico dapresente invenção ser estavelmente incorporada em plantastransgênicas e confirmada por ser operacional, ela pode serintroduzida em outras plantas por cruzamento sexuado.Qualquer de um número de técnicas de cruzamento padrão podeser usada, dependendo da espécie a ser cruzada.
Determinação de Expressão em Plantas transgênicas
Qualquer método conhecido na arte pode ser usado paradeterminar o nivel de expressão em uma planta de umamolécula de ácido nucléico da invenção ou polipeptideocodificado a partir dai. Por exemplo, o nivel de expressãode um polipeptideo codificado por uma molécula de ácidonucléico da invenção em uma planta pode ser determinadousando técnicas moleculares incluindo, mas não se limitandoa, teste imuno, imunoprecipitação, eletroforese de gel, eeletroforese de gel quantitativa.
Adicionalmente, o nivel de expressão em uma planta deum polipeptideo codificado por uma molécula de ácidonucléico da invenção pode ser determinado pelo grau ao qualo fenótipo vegetal (incluindo, mas não se limitando a,taxas de fotossintese, taxas de crescimento, e produção desementes) é alterado sob condições aquecidas, comparado aplantas expressando RuBisCo Ativase de tipo selvagem.
Adicionalmente, extratos ou polipeptideos isolados deplantas transgênicas, tecidos dessas, ou células dessaspodem ser usados em testes in vitro.
Os conteúdos de todos artigos, livros, manuais dereferência e resumos publicados aqui citados, são, por meiodeste, incorporados por referência em sua integridade paradescrever mais completamente o estado da arte a qual ainvenção pertence.
Como várias mudanças podem ser feitas na matéria acimadescrita sem sair do escopo e espirito da presenteinvenção, pretende-se que todo assunto contido na descriçãoacima, e/ou definido nas reivindicações em anexo, sejainterpretado como descritivo ilustrativo da presenteinvenção. Modificações e variações da presente invençãosão possíveis à luz dos ensinamentos acima.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Isolando polipeptideos derivados de RuBisCoAtivase
Bibliotecas de RuBisCo Ativase foram geradas a partir de umúnico embaralhamento de genes (ver, e.g., Crameri, et al.,(1998) Nature. 391 (6664):288-91; Chang, et al., (1999) NatBiotechnol. 17(8):793-7; Ness, et al., (1999) NatBiotechnol. 17(9):893-6; Christians, et al., (1999) NatBiotechnol. .17 (3) :259-64 e US Patent Nos. 6.605.430;6.117.679; e 5.605.793) e embaralhamento sintético (ver,e.g., US Patent No. 6.436.675 e International PublicationNos. WO 00/42561; WO 01/23401; WO 00/42560; e WO 00/42559)usando RuBisCo Ativase de tipo selvagem de SEQ ID NO: 1como modelo.Resumidamente, Arabidopsis RNA foi isolada a partir defolhas verdes usando reagente Trizol® de acordo com oprotocolo do fabricante (Invitrogen). DNAc de RCA (GenBankaccession number NM 179990) foi clonado por PCR em vetorTOPO® (Invitrogen) usando o kit de PCR RT-PCR Kit TITANIUM™de uma etapa (BD Biosciences-Clontech). Paraembaralhamento de gene único na primeira rodada, a formaRCA curta madura (região codificadora V59 para K438) foiamplificada por PCR (Qiagen Taq DNA polimerase ouStratagene Mutazyme DNA polimerase) , fragmentada, ereagrupada em uma reação de PCR sem primer nos genesembaralhados foram, então, resgatados com os primersflanqueando que contêm um sitio NcoI (5') e um sitio BamHI,região codificadora 6x-His e um códon de parada (3'). Abiblioteca de variantes foi clonada em um vetor deexpressão de E. coli (pET16b, Novagen) digerido com NcoI eBamHI. Para aumentar o pool genético na primeira rodada,embaralhamento sintético foi conduzido usando a diversidadede trigo, arroz, algodão, espinafre e pepino (ver, Ness, etal., (2002) Nat Biotechnol. 20:1251-1255). Uma segundarodada de embaralhamento de genes, usando os variantes daprimeira rodada como pais, foi realizada como previamentedescrito por Crameri, et al., (1998) Nature 15:288-291.Polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase comtermoestabilidade melhorada foram isolados pela seguintemetodologia de rastreamento.
Primeira bancada: Teste de ativação de Rubisco. Culturasde E. coli expressando um polipeptídeo derivado de rubiscoativase foram empelotadas a 4°C, 3.500 rpm por 15 minutos earmazenadas em uma placa de PCR de 96 poços com fundo em Va -80°C. Lisado de células de E. coli foi preparadodescongelando as culturas em temperatura ambiente por 5minutos, adicionando 75μ1 de tampão de sonicação (IOOmMTricina KOH pH 8,0; 20mM ascorbato; 3mM Mg-ATP; IOmM MgCl2;10% v/v glicerol; IOmM Bme; x3,33 inibidor de protease; 1μΐ/ml benzonase; 1 mg/ml lisosima) para cada poço, eagitando a placa por 60 minutos a 4 0C até que a pelotatenha sido lisada. As placas foram sonicadas com sonicadorde microplacas MISONIX por 1 minuto e, então, resfriadaspor 1 minuto. Esse processo foi repetido quatro vezes. Asculturas foram centrifugadas a 4.000 rpm por 20 minutos a4°C. 0 sobrenadante que continha proteína solúvel foiusado nos testes de ativação de Rubisco.
Vinte e dois μΐ do sobrenadante de E. coli foitransferido para uma placa de cintilação de 96 poços comfundo em U e incubado a temperatura ambiente por 15 minutos(e usado como o lisado para "condições normais" nostestes). 0 tratamento por calor do lisado foi efetuadotransferindo 35 μΐ do sobrenadante de E. coli para umaplaca de PCR de 96 poços de fundo em V e incubando a 40°Cpor 15 minutos. O sobrenadante tratado com calor foi,então, transferido para uma placa de cintilação de 96 poçoscom fundo em U (e usado como o lisado para "condiçõesaquecidas" nos testes) . Ambas as placas foram incubadaspor 5 minutos a 40C antes da realização do teste.A ativação de Rubisco foi testada incubando-se olisado de células contendo RuBisCo Ativase ou umpolipeptideo derivado de rubisco ativase com RubiscoArabidopsis desativada purificada (15 μς) no tampão dereação (IOOmM Tricina KOH pH 8,0; IOmM MgCl2; 10 mM[14CJNaHCO3; Mg-AT P; 4mM RuBP; ImM PEP; 40 ug/ml piruvatoquinase) a temperatura ambiente por 15 minutos (ver, Shen,et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:8963-8968). A ativaçãode Rubisco por lisado de células expressando polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase foi terminada pela adição de 1N HCl, e a incorporação de 14CO2 determinada porespectroscopia de cintilação liquida.
A Rubisco usada no teste acima descrito foi purificadaa partir de folhas de Arabidopsis. As folhas foramhomogeneizadas e congeladas em nitrogênio liquido antes daressuspensão em tampão de extração (IOOmM Hepes-KOH pH 8,0;ImM EDTA pH 8,0; 3mM DDT; 0,5 mM PMSF; IOmM MgCl2; IOmMNaHCO3). A suspensão foi centrifugada a 12.000 rpm por20min a 40C e o sobrenadante foi coletado. 0 sobrenadantefoi mantido em gelo sob agitação continua enquanto sulfatode amônio era adicionado a uma concentração final de 35% desaturação e centrifugado a 12.000 rpm por 20 min a 4°C. 0sobrenadante foi agitado por 30 min adicionais. Com sulfatode amônio a uma concentração final de 55% de saturaçãoantes da centrifugação a 12.000 rpm por 20min a 4°C. Apelota foi dissolvida em tampão de extração e depoisprecipitada com polietileno glicol a 18% e centrifugação.
A pelota foi ressuspendida em tampão de extração (cerca de1 ml/ 40ml de sobrenadante original) e centrifugada a13.000 rpm por 30 min a 4 °C. A Rubisco purificada foi nosobrenadante e glicerol adicionada a uma concentração finalde 10%.
A Rubisco purificada foi desativada pelo seguinteprotocolo (ver, Wang, et al., (1992) Plant Physiol.100:1858-1862). Dez mM de DTT foram adicionados à Rubiscopurificada e incubados a 45°C por 10 min. Um ml da misturafoi adicionado a uma coluna de 20ml de Sephadex G-50equilibrada com tampão de equilíbrio (50 mM Tricina-KOH pH8,0 e 0,5 mM EDTA pH 8,0). A Rubisco desativada foi eluídaa partir da coluna pela adição de tampão de equilíbrio. ARubisco desativada eluída foi coletada e incubada atemperatura ambiente por 1 hora antes da incubação em gelopor uma hora na presença de 4 mM RuBp.
Segunda bancada: perfil de temperatura HTP de ativação deRubisco por lisado de células de clones ativos. Clones deinteresse identificados no rastreamento da primeira bancadaforam ainda caracterizados na segunda bancada derastreamento. 0 lisado de células de cada clone ativo foitestado novamente como descrito acima exceto que otratamento de temperatura foi conduzido em quatrotemperaturas diferentes (16°C, 25°C, 40°C, e 45°C) antes doteste. Clones que possuíam perfil de termoestabilidaderelativamente melhorado comparado a RuBisCo Ativase de tiposelvagem (SEQ ID NO: 2) foram selecionados para a 3abancada de rastreamento.Terceira bancada: Perfil de temperatura de ativação deRubisco por variantes purificados de RuBisCo Ativase. Paradeterminar a atividade especifica dos polipeptideosderivados identificados pelas primeiras duas bancadas derastreamento, polipeptideos purificados por afinidade forampré-incubados em diferentes temperaturas e, então,analisados para sua habilidade de ativa Rubisco a 25°C.Como a RuBisCo Ativase catalisa a Rubisco desativada de umamaneira dependente de tempo, cada reação foi monitorada por15 minutos em intervalos de 3 minutos. A razão de RuBisCoAtivase: Rubisco foi estabelecida a 1:40 similarmente àrazão em folhas de plantas. A termoestabilidade de RuBisCoAtivase de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2) e polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase é apresentada na Tabela 2. Atermoestabilidade percentual representa a quantidade deRubisco que foi ativada pela RuBisCo Ativase a 40°C como umpercentual da quantidade de Rubisco que foi ativada porRuBisCo Ativase a 25°C.
Exemplo 2: Caracterização In vitro de polipeptideosderivados de RuBisCo Ativase
Os polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase isoladosno Exemplo 6.1 foram testados in vitro em três diferentestestes para determinar a atividade especifica a 25°C e 40°Ce sua termoestabilidade (t.s.). Em todos os casos, osresultados obtidos com RuBisCo Ativase de tipo selvagem a25°C foram estabelecidos a 100%.Ativação de Rubisco desativada. Polipeptideos derivados deRuBisCo Ativase purificados foram testados como descrito noteste da primeira bancada do Exemplo 1, à exceção de que ospolipeptideos derivados foram incubados a 40°C ou 45 0C por15, 30, 45 ou 60 minutos antes da realização do teste deativação de Rubisco. Os resultados são apresentados nascolunas 2-4 da Tabela 3. A coluna 2 da Tabela 3 representaa quantidade de Rubisco ativada que é obtida após aincubação de Rubisco desativada com RuBisCo Ativase a 25°C.
Não foram usadas condições aquecidas. A coluna 3 da Tabela3 representa a quantidade de Rubisco que foi ativada porRuBisCo Ativase após um tratamento de aquecimento de 15 mina 40°C como um percentual da quantidade de Rubisco que foiativada por RuBisCo Ativase a 25°C. A coluna 4 da Tabela 3representa a quantidade de Rubisco que foi ativada porRuBisCo Ativase com um tratamento de calor de 45 min a 40°Ccomo um percentual da quantidade de Rubisco que foi ativadapela RuBisCo Ativase sem tratamento de calor (a 25°C).
A ativação de Rubisco por polipeptideos derivados deRuBisCo Ativase 301C7 e 382D8 exibe alta termoestabilidadenos tratamentos a 40°C e 45°C (FIG. IA) . A atividade de382D8 após o tratamento a 45°C foi 80% maior do que RCAl nomesmo tratamento de temperatura e apenas 10% menor do que aatividade de RCAl incubada a 25°C.
Ativação de Rubisco sob condições cataliticas.
Polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase purificadosforam testados como descrito no teste da primeira bancadado Exemplo 1, com exceção de que o teste foi realizado sobcondições aquecidas (i.e., 40°C) (Crafts-Brandner andSalvucci, (2000) PNAS 97:13430-13435). Os resultados sãoapresentados nas colunas 5-6 da Tabela 3. A coluna 5 daTabela 3 representa a quantidade de Rubisco ativada que éobtida após a incubação de Rubisco desativada com RuBisCoAtivase a 25°C. Condições aquecidas não foram usadas. Acoluna 6 da Tabela 3 representa a quantidade de Rubisco quefoi ativada por RuBisCo Ativase quando o teste é conduzidoa 40°C como um percentual da quantidade de Rubisco que foiativada por RuBisCo Ativase quando o teste é conduzido a25 °C.
RCA de tipo selvagem manteve um estado de ativação deRubisco de 0,5 a 40°C, enquanto polipeptideos derivados deRuBisCo Ativase 183H12, 301C7, e 382D8 foram capazes demanter os estados de ativação de 0,62-0,72 sob as mesmascondições (FIG. 1B). Em relação às reações a 25°C, oestado de ativação de Rubisco mantido pelos variantestermoestáveis a 40°C esteve na faixa de 78-98%, versus 70%para a enzima de tipo selvagem. A proteína apresentando aatividade específica mais alta a tanto 25°C ou 40°C foi omelhor variante isolado na primeira rodada, 183H12.
Atividade de ATPase. Como a RuBisCo Ativase é uma ATPase(o polipeptídeo contém o domínio AAA+) que requer que ATPse solte da ligação de Rubisco para açúcares de fosfato, oefeito da temperatura na hidrólise de ATP por RuBisCoAtivase foi testado. O teste de ATPase que monitorou aatividade intrínseca do complexo de ativase, independentede sua interação com Rubisco é comumente usado paracaracterização de RuBisCo Ativase. O teste de ATPase foiefetuado como descrito por Salvucci ((1992) Arch. Biochem.Biophys. 298:688-696). Os resultados são apresentados nascolunas 7-8 da Tabela 3. A coluna 7 da Tabela 3 representaa quantidade de ATP hidrolisado que está presente após aincubação de RuBisCo Ativase com ATP a 25°C. Condiçõesaquecidas não foram usadas. A coluna 8 da Tabela 3representa a quantidade de ATP hidrolisado que estápresente após a incubação com RuBisCo Ativase que foitratada por calor a 40°C como um percentual da quantidadede ATP hidrolisado que está presente após incubação comRuBisCo Ativase que não foi tratada.
A FIG. IC mostra que a estabilidade de polipeptídeosderivados de RuBisCo Ativase 301C7 e 382D8 a 35°C e 40°Cfoi melhorada mais do que 10 vezes comparado a RCAl,enquanto 183H12 exibiu 20% e 30% de melhoramento a 25°C e40°C, respectivamente.
Exemplo 3: Complementação de Mutante de Deleção de RuBisCoAtivase
Para expressar variantes embaralhados em uma basehomozigota para a deleção (Arca/. Arca) (ver, Li, et al.,(2001) Plant J. 27:235-242) a seguinte cascata decomplementação foi desenvolvida: 1) Seleção de plantasheterozigotas para a deleção por HTP-PCR usando método deextração de DNA de folha simples de 96 poços (Xin, et al. ,(2003) BioTechniques 34:820-826), com primers específicospara os alelos de tipo selvagem e deletados. 2)
Transformação com o gene de interesse. 3) Seleção TO pararesistência a antibióticos e análise de PCR parahomozigosidade. 4) Auto polinização das plantashomozigotas resultantes para obter linhagens transgênicasTI.
A análise de imunoblot de plantas de tipo selvagemheterozigotas e homozigotas (base genética RCA/RCA,RCA/Arca and Arca /Arca respectivamente) revelou que osprodutos gênicos (formas longas e curtas) foram expressosem níveis similares nas plantas de tipo selvagem eheterozigotas (FIG. 2A). A ausência das isoformas curtas elongas em plantas homozigotas para a deleção confirmou quea mutação anula a expressão de ambas as plantas RCAl eRCA2. Plantas Arca cultivadas em CO2 ambiente exibirambaixo desempenho fotossintético (valores Fq'/Fm') comparadoàs de tipo selvagem (0,185± 0, 038 e 0, 332+ 0, 033respectivamente) (FIG. 2B) e área foliar significativamentemenor após 3 semanas em solo (2,93± 0,49 e 395, 4± 8,75mm2respectivamente) (FIG. 2C). Homozigotos Arca de dois mesesde idade estavam severamente abalados e cloróticos porcomparação com plantas de tipo selvagem (FIG. 2D).
Baseado na análise de seqüência e mapeamento dofragmento deletado, dois grupos de primers foramdesignados: primers RCA (forward 5'-CAGACAATGTTGGCCTC-3'(SEQ ID NO: 23) e reverso 5' -ACGAGTAACGATGGTAGG-3' (SEQ IDNO: 24)) específicos para o alelo de tipo selvagem quefornecem o produto de 1,5 kb, e primers rca (forward 5'-GTCTATACCTTGAGC-3' (SEQ ID NO: 25) e reverso 5'-TCAGTCATACTCGG-3' (SEQ ID NO: 26)) que fornecem o produtode 1,5 kb no alelo deletado e 4,9 kb no alelo de tiposelvagem (FIG. 3A) . Para amplificar o produto de 1,5 kbcom os primers rca, mas não o de 4,9 kb, o ciclo deamplificação por PCR foi estabelecido a 1,5 min. Aquelesgrupos de primers foram utilizados para caracterizar a basegenética das plantas TI. Como o hospedeiro detransformação foi heterozigoto para deleção do lócus rcaendógeno, as plantas Tl expressando os transgenes deRuBisCo Ativase são uma mistura de (RCA/RCA) heterozigotos(RCA/Arca) e homozigotos (Arca /Arca) de tipo selvagem.Linhagens transgênicas expressando a variante embaralhada183H12 em diferentes bases genéticas foram identificadasusando rastreamento por PCR (FIG. 3B) e análise deimmunoblot (FIG. 3C) . Plantas que expressam 183H12 embases genéticas contendo ao menos um alelo de tipo selvagem(#13; wt, #12; heterozigoto para a deleção) possuem ambasformas longas e curtas da proteína. Na linhagem #2(homozigoto para deleção) apenas a forma curta foidetectada porque o transgene foi projetado para expressarapenas a forma curta da proteína.
Exemplo 4: Caracterização de polipeptídeos derivados deRuBisCo Ativase In plantaPara determinar o efeito da RuBisCo Ativase melhoradasob temperaturas normais e aumentadas, o mutante de deleçãode RuBisCo Ativase de Arabidopsis {Arca) (ver Exemplo 3) .Arca foi funcionalmente complementado com RuBisCo Ativasede tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) , polipeptideo derivado derubisco ativase 183H12 da Ia rodada (SEQ ID NO: 7) e doispolipeptideos derivados de RuBisCo Ativase 382D8 (SEQ IDNO: 15) e 301C7 (SEQ ID NO: 19) da 2a rodada.
Para expressar a RuBisCo Ativase de tipo selvagem e ospolipeptideos derivados de RuBisCo Ativase em plantasArabidopsis transgênicas (Arca), os transgenes codificandoo peptideo trânsito de cloroplasto e a região codificadorade real ou, os polipeptideos derivados, foram clonados empMAXY4384 que contém o promotor de Caulimovirus de Mosaicode Mirabilis (MMV) com um domínio intensificador duplo (Day& Maiti, (1999) Transgenics 3:61-70), o terminador de UBQ3e o gene de resistência a canamicina nptII. Mutantes RCADeleteagene™ heterozigotos foram transformados porAgrobacterium tumefaciens linhagem GV3101 usando o métodode imersão floral (Clough, et al., (1998) Plant J. 16:735-743). Para confirmar expressão, proteína foi extraída detecido vegetal (2-3 g peso fresco) em N2 líquido e 1 ml detampão de extração (100 mM de Tricina-KOH pH 8, EDTA pH 8,10 mM 2-mercaptoetanol, e coquetel inibidor de Protease SetV) . 0 extrato cru foi clarificado por centrifugaçãosucessiva por 5 min a 3000 g, e 20 min a 12.000 g. Dezmicrogramas de extrato de proteína solúvel foram separadasem géis de 10% SDS-poliacrilamida e transferidos para umamembrana de nitrocelulose (de acordo com as instruçõesfornecidas pela Invitrogen). 0 blot foi imunodecorado comos anticorpos policlonais criados contra a Arabidopsis RCAlrecombinante e as proteínas foram detectadas usando o kitde substrato conjugado Ap (Bio-Rad).
Como mostrado na FIG. 4A, plantas de tipo selvagem(RCA/RCA) expressaram isoformas curtas e longas de ativase,enquanto linhagens transgênicas Arca complementadas pelostransgenes expressaram apenas a isoforma curta de 43kDa.Sob condições de cultura de 22 0C (plantas cultivadas em 16horas de luz (ciclos de 225 μιηοΐ fótons m~2 s"1) / 8 horas noescuro), as linhagens transgênicas exibiram taxas decrescimento similar às plantas não transformadas de tiposelvagem (FIG. 4B) . 0 desempenho fotossintético (eficiênciade operação de fotossistema II Fq'/Fm') e taxas decrescimento foram analisados usando o sistema de imagem defluorescência de clorofila a (Fluorlmager, Qubit Systems)como previamente descrito (Baker, et al.r (2001) J Exp.Bot. 52:615-621). Os valores de Fq'/Fm' de linhagens dedeleção transgênicas expressando RCAl ou polipeptídeosderivados de RuBisCo Ativase 183H12, 301C7, ou 382D8(ArcaRCAl, Z\rcal83H12, Arca301Cl e Z\rca382D8,respectivamente) foram similares a plantas nãotransformadas de tipo selvagem, indicando que a expressãoda forma curta é suficiente para a complementação funcionalde Arca sob condições de crescimento normais (FIG. 4C) .Sob essas condições, a atividade fotossintética medida peloanalisador de gás infravermelho portátil (LI6400, Li-Cor)sob 150 pmol fótons m~2 s"1 e 350 μbar CO2. de ZircaRCAl-I foisimilar a Zircal83H12-3, Z\rca301C7-3 e Zirca382D8-l (FIG.4D). A exposição temporária a 30°C por Ihr resultou em 12%fotossintese decrescida em ZircaRCAl-1. Conseqüentemente,as linhagens Zircal83H12-3, Arca301Cl-3 e Zirca382D8-lapresentaram fotossintese aumentada em 16, 22 e 16% após 1hr a 30°C.
Como a exposição de plantas Arabidopsis a 30°C causapouca indução de proteínas de choque de calor (tipicamenteinduzidas a 32°C e acima) e efeitos menores na abertura deestômatos (Salvucci, et al., (2001) Plant Physiol.127:1053-1064), o crescimento sob tratamento de calorprolongado foi conduzido com plantas Arabidopsisexpressando RuBisCo Ativase de tipo selvagem outermoestável. Linhagens transgênicas de quatro semanas deidade expostas por duas semanas a estresse de calormoderado. As condições de crescimento foram de 16 horas deluz a 225 μπιοί fótons m~2 s_1 e 8 horas de escuro. Duranteo ciclo de luz, as plantas foram cultivadas a 22°C por 6horas, e então, rapidamente aumentado para 30°C (2°C pormin) por 4 horas e, então, retornaram a 220C para ocomplemento do ciclo luminoso. Durando o ciclo escuro, asplantas permaneceram a 22°C. A caracterização decrescimento, biomassa, e produção foi efetuada comopreviamente descrito (Barth, et al., (2003) Heredity.91:36-42). As plantas apresentaram fenótipo e coloração defolha normal, mas variaram em tamanho (FIG. 5A) . ZircaRCAl(linhagens 1, 8 e 9) foram abaladas em comparação a plantasnão transformadas de tipo selvagem e às linhagens Arca queexpressam os polipeptideos derivados de RuBisCo Ativase(FIG. 5B) . Arabidopsis transgênica expressando 183H12-3que possui a mais alta atividade especifica in vitro foramas maiores plantas. As linhagens que expressaram 301C7 e382D8 foram maiores do que as linhagens ZircaRCAl, mas nãoalcançaram os níveis de área foliar das linhagens 183H12.Enquanto as linhagens Arca expressando apenas a forma curtado gene (RCAl) de tipo selvagem foram menores do que aslinhagens não transformadas de tipo selvagem (expressandoambas as formas, curta e longa), a maioria das linhagenstransgênicas expressando os polipeptideos derivados deRuBisCo Ativase exibiram maior área foliar do que asplantas não transformadas de tipo selvagem (FIG. 5B) , etodas as linhagens expressando os polipeptideos derivadosde RuBisCo Ativase foram significativamente maiores(P=O.01) do que transformantes Arca expressando RCAl.
As plantas de quatro semanas de idade expostas a duassemanas de estresse de calor moderado também apresentaramdiferenças em taxas de desenvolvimento vegetal. Ao finaldo período de tratamento 74, 44 e 33% de 4rcal83H12,Arca301Cl e Arca382D8, respectivamente, possuíaminflorescências maduras com flores abertas, enquanto 100%das plantas de tipo selvagem não transformadas e 88% daslinhagens ZircaRCAl possuíam inf lorescências imaturasemergentes sem flores abertas (dados não apresentados).Adicionalmente, 12% das linhagens ZJrcaRCAl estavam noestágio vegetativo sem inflorescências visíveis. Sobcondições de crescimento normais, as plantas Arabidopsisfloresceram após quatro semanas. Portanto, a porcentagemrelativamente alta das linhagens ^rcal83H12, Z\rca301C7 eArca382D8 apresentando desenvolvimento normal é prováveldevido à termoestabilidade melhorada de RCA que minimizou ainibição da fotossintese e crescimento sob condições deestresse de calor moderadas.
A melhor linhagem de cada variante foi melhoranalisada para atividade fotossintética durante o ciclo deestresse de calor moderado (após 2hr a 30°C). As linhagenstransgênicas apresentaram um padrão de fixação de CO2 que secorrelacionou com a área foliar. As taxas de fixação deCO2 nas linhagens Z\rcal83H12-3, Arca301Cl-3 e Z\rca382D8-lforam 30, 25 e 23% maiores, respectivamente, do que nalinhagem ZircaRCAl-l. Esses resultados demonstraram que aRuBisCo Ativase é um fator limitante na fotossintese sobcondições experimentais.
Plantas maduras (10 semanas de idade) expostas por 8semanas a estresse de calor moderado foram similares emaparência. Um efeito positivo leve na altura de planta foidetectado nas linhagens Arcal83H12-3, Arca301C7-3 eArca382D8-l (116, 121 e 119% respectivamente) comparado aArcaRCAl-I (FIG. 5D) . Uma diferença dramática foiobservada no número de siliquas por planta, que foi de130,8± 48,2, 84,3± 19,6 e 100,8± 26,9 para Arcal83H12-3,Arca301C7-3 e Arca382D8-l (respectivamente) comparado com4 0,2± 16,3 e 47,5± 15,8 para ArcaRCAl-I e a de tiposelvagem, respectivamente (FIG. 5E).
Para confirmar que a formação relativamente melhoradade siliquas em transformantes expressando RCA melhorada nãofoi por conta do tamanho individual de semente, os pesos delotes de 1000 sementes foram comparados. Como mostrado naFIG. 5F, Arcal83H12-3, e Arca382D8-l produziram sementeslevemente maiores (18 e 32% respectivamente) do queArcaRCAl-l, enquanto o peso de sementes de plantasArca301C7-3 e plantas de tipo selvagem foi similar àquelede ArcaRCAl-I.
Para analisar melhor o efeito de RCA melhorada nocrescimento sob estresse de temperatura moderado, linhagensT3 expressando o clone mais ativo a 25°C (in vitro) ,183H12, foram cultivadas continuamente a 26°C sob maiorintensidade de luminosidade e umidade do que no experimentoprévio. As condições de crescimento foram de 16 horas deluz a 300 pmol fótons m~2 s"1 e 8 horas de escuro a 26°C e85% de umidade. As linhagens de tipo selvagem e ZircaRCAlcultivadas a 26°C produziram biomassa total levementediminuída e exibiram taxas mais lentas de desenvolvimentovegetal do que sob condições de crescimento normais,enquanto que a biomassa e o processo de desenvolvimento delinhagens de Z\rcal83Hl2 foi inalterado (não apresentado) .Em contraste, o número de siliquas por planta produzido porplantas Arca cultivadas a 26°C foi dramaticamente afetadopelo polipeptídeo derivado de rubisco ativase queexpressaram (FIG. 6A) . As linhagens Arca183H12 possuíramde 50 a 100 mais síliquas por planta do que as linhagensZircaRCAl e 40 a 80 mais síliquas por planta do que asplantas de tipo selvagem. Além disso, as síliquas deZireal83H12 foram maiores do que aquelas de plantas de tiposelvagem e das linhagens ZircaRCAl e produziram maissementes (FIG. 6B) . Síliquas de Z\rcal83H12 a 26°C exibiramum fenótipo similar às cultivadas de tipo selvagem sobcondições de crescimento normais, mas produziram menossementes. Sob condições de crescimento normais umdecréscimo pequeno em peso de semente foi observado emlinhagens Arca expressando RCAl e 183H12 comparado aplantas de tipo selvagem (FIG. 6C; barras brancas).Contudo, sob exposição contínua a 26°C, foi observado emlinhagens de Arca 183H12 um peso de sementes de 50% a 150%maior do que tanto em plantas de tipo selvagem ou linhagensde ZircaRCAl. Comparando o peso de sementes para cadalinhagem cultivada a 26°C àquele da mesma linhagemcultivada a 22°C, as linhagens Zireal83H12-2, Zircal83H12-3 eZircal83H12-20 foram surpreendentemente menos afetadas pelamaior temperatura de cultivo do que as linhagens ZireaRCAldo tipo selvagem.
Como a exposição a 26°C resultou em síliquas pequenascontendo poucas sementes de pequeno peso de semente, aviabilidade de semente foi analisada usando um teste degerminação. As sementes de plantas de tipo selvagem,ZireaRCAl-I e Zireal83H12-3 foram coletadas de plantascultivadas em condições de crescimento normais e 26°C e,então, germinadas a 22°C. As sementes de linhagensparentais ZircaRCAl-I e Z\rcal83H12-3 cultivadas a 22°C,apresentaram a mesma taxa de germinação (86%), que foilevemente menor do que aquela de plantas de tipo selvagem(94%) (FIG. 6C) . A inibição completa de germinação (4%)foi observada em sementes ZircaRCAl-I coletadas de paiscultivados a 26°C e inibição significativa nas sementes detipo selvagem (26%). Conseqüentemente, as sementesZircal83H12-3 coletadas de pais cultivados a 26°C exibiramtaxas de germinação de 70%, relativamente maiores.
Adicionalmente, plantas foram analisadas para taxas defotossintese, taxas de crescimento e produção de sementessob as seguintes condições de crescimento:
Normais: Plantas foram cultivadas sob regime de 16 horas deluz (225 ymol fótons rtf2 s"1) e 8 horas de escuro a 22°C.
Temperaturas aumentadas: Plantas foram cultivadas sobcondições de crescimento normais por duas semanas e, então,transferidas para a câmara de crescimento e cultivadas sobregime de 16 horas de luz (225 ymol fótons rrf2 s-1) e 8horas de escuro. Durando o ciclo de luz, a temperatura foiestabelecida em 22 0C por seis horas e, então, rapidamenteaumentada para 30°C (2°C por minuto) por quatro horas.Após o tratamento de calor, a temperatura foi novamenteestabelecida em 22°C.Temperaturas continuamente aumentadas: Plantas foramcultivadas sob condições de crescimento normais por duassemanas e, então, transferidas à sala de crescimento ecultivadas sob regime de dezesseis horas de luz intensa(300 μιηοΐ fótons m~2 s-1) e oito horas de escuro. Durante ociclo luz/escuro, a temperatura foi estabelecida em 26°C ea umidade em 80%.
Os resultados dos testes in planta de atividade depolipeptideo derivado de rubisco ativase nas condiçõesidentificadas supra são sumarizados abaixo.
Taxas de crescimento. A área foliar foi medida usando umsistema de imagem de fluorescência de clorofila a(FluorImager, Qubit System Inc.). A área foliar observadanas plantas de tipo selvagem não transformadas sob asdiferentes condições de crescimento foi estabelecida como100%. Os dados na Tabela 4 demonstram que plantasexpressando qualquer dos três polipeptideos derivados deRuBisCo Ativase tiveram taxas de crescimento aumentadas sobtemperaturas aumentadas, se comparado tanto a plantas detipo selvagem como plantas expressando uma RuBisCo Ativasede tipo selvagem transgênica.
Taxas de fotossintese. Plantas foram analisadas parafixação de CO2 usando o analisador de gás infravermelhoportátil (LI6400, Li-Cor) por 15 minutos. A fonte de luzfoi estabelecida em 225 pmol fótons rrf2 s_1 e o nível de CO2fornecido à folha pelo sistema construído de injeção de CO2foi de 350 μπιοί m~2 s-1. Os dados na Tabela 5 mostram queplantas expressando qualquer dos três polipeptídeosderivados de RuBisCo Ativase tiveram taxas fotossintéticasaumentadas sub temperaturas aumentadas, se comparado tantocom plantas de tipo selvagem como plantas expressando umaRuBisCo Ativase de tipo selvagem transgênica (ver coluna3) .
Produção de sementes. 0 peso de semente (mg) foideterminado a partir de plantas secas maduras. A taxa degerminação de sementes foi determinada pelo número deplantas que germinaram na placa MS, suplementada comcanamicina. Os dados na Tabela 5 mostram que plantasexpressando qualquer dos três polipeptídeos derivados deRuBisCo Ativase tiveram produção de semente aumentada sobtemperaturas aumentadas se comparado tanto com plantas detipo selvagem como plantas expressando uma RuBisCo Ativasede tipo selvagem transgênica (ver coluna 4). A produção desementes aumentada foi também presente em plantasexpressando qualquer dos três polipeptídeos derivados deRuBisCo Ativase sob condições de temperaturas continuamenteaumentadas (ver Tabela 6) . As taxas de germinação desementes foram aumentadas sob condições de temperaturascontinuamente aumentadas em plantas expressando opolipeptídeo derivado de rubisco ativase 183H12 (SEQ ID NO:7) se comparado tanto com plantas de tipo selvagem comoplantas expressando uma RuBisCo Ativase de tipo selvagemtransgênica (ver Tabela 7).<table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>Tabela 3: Atividade relativa (%) de polipeptideos derivadosde RuBisCo Ativase.
<table>table see original document page 71</column></row><table>Tabela 4: Área foliar sob condições de temperaturas normaise aumentadas.
<table>table see original document page 72</column></row><table>
*A área foliar de Arabidopsis de tipo selvagem nãotransformada foi estabelecida como 100%.Tabela 5: Taxas de fotossíntese e produção de sementes sobcondições de temperaturas normais e aumentadas.
<table>table see original document page 73</column></row><table>
*A fotossíntese líquida foi monitorada após 2 horas a 30°C#Percentual de peso de 1000 sementes de plantas cultivadassob temperaturas aumentadas, comparado com o peso de 1000sementes de plantas cultivadas sob condições normais.Tabela 6: Produção de sementes sob condições detemperaturas normais e continuamente aumentadas.
<table>table see original document page 74</column></row><table>Tabela 7: Taxas de germinação de sementes colhidas deplantas cultivadas sob condições de temperaturas normais econtinuamente aumentadas.
<table>table see original document page 75</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
<120> Titulo: MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA,POLIPEPTíDEO ISOLADO, PLANTA TRANSGÊNICA E MÉTODO DE AUMENTO DATOLERÂNCIA AO CALOR EM PLANTAS
<130> Referência do Documento: V0136-PCT
<150> No. do Pedido de Prioridade: 60/711,449
<151> Data de depósito do Pedido de Prioridade: 24-08-2005
<160> Quantidade de SEQ ID Nos.: 26
<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> SEQ ID No 1<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 1
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtgt ctgcaagggt 780atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca cacttgttga tcagttccct 840ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900aagttcgttg agagccttgg agttgagaag atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020atgcttgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080caggctgctt tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 2<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 2
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15 Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His 35 40 45 Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr50 55 60
Asn 3U Leu Asp Asn Met Met DO Asp Gly Phe Tyr Ile OU Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Met Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Val Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Thr Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Lys Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met 325 330 335 Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val 340 345 350 Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn 355 360 365 Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys 370 375 380 Glu Pro Ser Lys Leu Glu
385 390
<210> SEQ ID No 3<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 3
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcagg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaacaagggaaagaggtactactcgataacccaacccatcatttcgtatggagaatcttcagaaggtcaatctaaagttcgttgggacctcccgatgcttgtgacaggctgcttacagaggaaa
ccgcaaagcttgtgttgtctagtacactgtccaacgtccagcactggtaaagttctactgctgacaagattcgatttcttagagccttggtgttcgagcatggaacaagatgggagacgcaggagcccag
tatccgtcagcttcatcaaccaacaaccaggctcccaggacgatttctccggccccgacccaaggacgaacggtgctttgagttgagaagacccgagatggaatgtcaagaaacgctgaccaagctcgag
aggtaccgtggatcttgacgatggttaacgatgtacaacaaccctatacgcgtgaagaccgacattgtcaagggcgagagatcggaaagaacttatgagaagagtccaacgccatcggcctaa
aggcagctgactggtgcgggcaacactcataggaagagaactcctctcatgtatcggtgtcacttgttgatgtacgatgaggctggttaaagcttatggattgccgagacgcggaacttt
cttgatcaagtcgtatgggtgaacattgctcgcacgtgtcccgtgatggactgcaagggttcagttcccttgaagtgaggctcaagggaaatacggaaacctacctcagcctacggtaaa
4805406006607207808409009601020108011401173
<210> SEQ ID No 4<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: : 4 Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15 Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His 35 40 45 Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr 50 55 60 Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Arg Met Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Val Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Thr Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300Ser Leu Gly Val Glu Lys Ile Gly305 310
Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro325
Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met340
Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser355 360
Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr
370 375
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330 335
Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val345 350
Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn365
Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys380
<210> SEQ ID No 5<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 5
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg ataagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtgt ctgcaagggt 780atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca cacttgttga tcagttccct 840ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900aagttcgttg agagccttgg agttgagaag atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020atgcttgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080caggctgctt tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 6<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 6
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu
1 5 10 15
Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly
20 25 30
Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His
35 40 45
Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr50 55 60Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Ile Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Val Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Thr Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Lys Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met 325 330 335 Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val 340 345 350 Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn 355 360 365 Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys 370 375 380 Glu Pro Ser Lys Leu Glu 385 390
<210> SEQ ID No 7<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 7
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga tttgatcaag 480aagggaaagaggtactactcgataacccaacccatcatttcgtatggagaatcttcagaaggtcaatctaaagttcgttgggacctcccgatgcttgtgacaggctgctcacagaggaaa
tgtgttgtctagtacactgtccaacgtccagcactggtaaagttctactgctgacaagattcgatttcttagagccttggtgttcgagcatggaacaagatgggagacgcaggagcccag
cttcatcaaccaacaaccaggctcccaggacgatttctccggccccgacccaaggacgaacggtgctttgagttgagaagacccgagatggaatgtcaagaaacgctgaccaagctcgag
gatcttgacgatggttaacgatgtacaacaaccctatacgcgtgaagaccgacattgtcaagggcgagagatcggaaagaacttatgagaagagtccaacgccatcggcctaa
ctggtgcgggcaacactcataggaagagaactcctctcatgtatcggtgtgacttgttgatgtacgatgaggctggttaaagcttatggattgccgagacgcggaacttt
tcgtatgggtgaacattgctcgcacgtgtcccgtgatggactgcaagggttcagttcccttgaagtgaggctcaagggaaatacggaaacctacctcagcctacggtaaa
5406006607207808409009601020108011401173
<210> SEQ ID No 8
<211> Comprimento: 390
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: : 8 Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15 Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His 35 40 45 Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr 50 55 60 Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Met Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Val Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Arg Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Lys Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320
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355 360 365
Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys
370 375 380
Glu Pro Ser Lys Leu Glu385 390
<210> SEQ ID No 9<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 9
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatggga 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtgt ctgcaagggt 780atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca cacttgttga tcagttccct 840ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900aagttcgttg agagccttgg agttgagaat atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020atgcttgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080caggctgctt tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 10<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 10
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu
15 10 15
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Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His
35 40 45
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50 55 60
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<210> SEQ ID No 11<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 11
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctacgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg ataagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactcgataacccaacccatcatttcgtatggagaatcttcagaaggtcaatctaaagttcgttgggacctcccgatgctcgtgacaggctgcttacagaggaaa
agtacactgtccaacgtccagcactggtaaagttctactgctgacaagattcgatttcttagagccttggtgttcgagcatggaacaagatgggagacgcaggagcccag
caacaaccaggctcccaggacgatttctccggccccgacccaaggacgaacggtgctttgagttgagaagacccgagatggaatgtcaagaaacgctgaccaagctcgag
atggttaacgatgtacaacaaccctatacgcgtgaagaccgacattgtcaagggcgaaagatcggaaagaacttatgagaagagtccaacgccatcggcctaa
caacactcataggaagagaactcctctcatgtatcggtgtcacttgttgatgtacgatgaggctggttaaagcttatggattgccgagacgcggaacttt
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1080
1140
1173
<210> SEQ ID No 12<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 12
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15 Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Thr Gly Thr Gly Thr His His 35 40 45 Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr 50 55 60 Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Ile Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Val Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Thr Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Lys Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Lys Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met
325 330 335
Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val
340 345 350
Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn
355 360 365
Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys
370 375 380
Glu Pro Ser Lys Leu Glu385 390
<210> SEQ ID No 13<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 13
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctacgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga tttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720cgtatggága agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtgt ctgcaagggt 780atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca gacttgttga tcagttccct 840ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900aagttcgttg agagccttgg agttgagaag atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020atgctcgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080caggctgctt tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 14<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 14
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15
Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly20 25 30
Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Thr Gly Thr Gly Thr His His35 40 45
Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr50 55 60
Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val 85 His Ile Thr Lys Asn 90 Phe Leu Thr Leu Pro 95 AsnIle Lys Val Pro 100 Leu Ile Leu Gly Ile 105 Trp Gly Gly Lys Gly 110 Gln GlyLys Ser Phe 115 Gln Cys Glu Leu Val 120 Met Ala Lys Met Gly 125 Ile Asn ProIle Met 130 Met Ser Ala Gly Glu 135 Leu Glu Ser Gly Asn 140 Ala Gly Glu ProAla Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys 165 Cys Leu Phe Ile Asn 170 Asp Leu Asp Ala Gly 175 AlaGly Arg Met Gly 180 Gly Thr Thr Gln Tyr 185 Thr Val Asn Asn Gln 190 Met ValAsn Ala Thr 195 Leu Met Asn Ile Ala 200 Asp Asn Pro Thr Asn 205 Val Gln LeuPro Gly 210 Met Tyr Asn Lys Glu 215 Glu Asn Ala Arg Val 220 Pro Ile Ile CysThr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe 245 Tyr Trp Ala Pro Thr 250 Arg Glu Asp Arg Ile 255 GlyVal Cys Lys Gly 260 Ile Phe Arg Thr Asp 265 Lys Ile Lys Asp Glu 270 Asp IleVal Arg Leu 275 Val Asp Gln Phe Pro 280 Gly Gln Ser Ile Asp 285 Phe Phe GlyAla Leu 290 Arg Ala Arg Val Tyr 295 Asp Asp Glu Val Arg 300 Lys Phe Val GluSer Leu Gly Val Glu Lys Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe 325 Glu Gln Pro Glu Met 330 Thr Tyr Glu Lys Leu 335 MetGlu Tyr Gly Asn 340 Met Leu Val Met Glu 345 Gln Glu Asn Val Lys 350 Arg ValGln Leu Ala 355 Glu Thr Tyr Leu Ser 360 Gln Ala Ala Leu Gly 365 Asp Ala AsnAla Asp 370 Ala Ile Gly Arg Gly 375 Thr Phe Tyr Gly Lys 380 Thr Glu Glu LysGlu Pro Ser Lys Leu Glu
385 390
<210> SEQ ID No 15<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 15
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg gtgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga tttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660
cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720
cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtat atgcaagggt 780
atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca cacttgttga tcagttccct 840
ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900
aagttcgttg agagccttgg agttgagaat atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960
ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020
atgcttgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080
caggctgctt tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140
acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 16<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: : 16 Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15 Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His 35 40 45 Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr 50 55 60 Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Val Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Ile Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Thr Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Asn Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro325
Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met340
Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser355 360
Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr
370 375
Glu Pro Ser Lys Leu Glu385 390
Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met
330 335
Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val345 350
Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn365
Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys380
<210> SEQ ID No 17<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 17
atggtgaaag aagacaaaca aaccgatgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60
tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120
cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180
cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240
gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300
cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360
atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420
gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480
aagggaaaga tgtgttgtct cctcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540
ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600
gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660
cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720
cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtat atgcaagggt 780
atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca gacttgttga tcagttccct 840
ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900
aagttcgttg agagccttgg agttgagaat atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960
ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020
atgcttgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080
caggctgctc tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140
acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 18<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: 18
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu
15 10 15
Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly
20 25 30
Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His
35 40 45
Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr
50 55 60
Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Met Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Leu Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Ile Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Arg Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Asn Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met 325 330 335 Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val 340 345 350 Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn 355 360 365 Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys 370 375 380 Glu Pro Ser Lys Leu Glu 385 390
<210> SEQ ID No 19<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 19
atggtgaaag aagacaaaca aaccgacgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cctcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660
cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720
cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtat atgcaagggt 780
atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca cacttgttga tcagttccct 840
ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900
aagttcgttg agagccttgg agttgagaat atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960
ggacctcccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020
atgctcgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080
caggctgctt tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140
acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 20<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana
<400> Seqüência: : 20 Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu1 5 10 15 Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly 20 25 30 Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His 35 40 45 Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr 50 55 60 Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn 85 90 95 Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro 115 120 125 Ile Met Met Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro 130 135 140 Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Leu Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala 165 170 175 Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val 180 185 190 Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu 195 200 205 Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys 210 215 220 Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly 245 250 255 Ile Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile 260 265 270 Val Thr Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu 290 295 300 Ser Leu Gly Val Glu Asn Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met
325 330 335
Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val
340 345 350
Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn
355 360 365
Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys
370 375 380
Glu Pro Ser Lys Leu Glu385 390
<210> SEQ ID No 21<211> Comprimento: 1173<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 21
atggtgaaag aagacaaaca aaccgacgga gacagatgga gaggtcttgc ctacgacact 60tctgatgatc aacaagacat caccagaggc aagggtatgg ttgactctgt cttccaagct 120cctatgggaa ccggaactca ccacgctgtc cttagctcat acgaatacgt tagccaaggc 180cttaggcagt acaacttgga caacatgatg gatgggtttt acattgctcc tgctttcatg 240gacaagcttg ttgttcacat caccaagaac ttcttgactc tgcctaacat caaggttcca 300cttattttgg gtatatgggg aggcaaaggt caaggtaaat ccttccagtg tgagcttgtc 360atggccaaga tgggtatcaa cccaatcatg atgagtgctg gagagcttga gagtggaaac 420gcaggagaac ccgcaaagct tatccgtcag aggtaccgtg aggcagctga cttgatcaag 480aagggaaaga tgtgttgtct cttcatcaac gatcttgacg ctggtgcggg tcgtatgggt 540ggtactactc agtacactgt caacaaccag atggttaacg caacactcat gaacattgct 600gataacccaa ccaacgtcca gctcccagga atgtacaaca aggaagagaa cgcacgtgtc 660cccatcattt gcactggtaa cgatttctcc accctatacg ctcctctcat ccgtgatgga 720cgtatggaga agttctactg ggccccgacc cgtgaagacc gtatcggtat atgcaagggt 780atcttcagaa ctgacaagat caaggacgaa gacattgtca gacttgttga tcagttccct 840ggtcaatcta tcgatttctt cggtgctttg agggcgagag tgtacgatga tgaagtgagg 900aagttcgttg agagccttgg agttgagaat atcggaaaga ggctggttaa ctcaagggaa 960ggaccccccg tgttcgagca acccgagatg acttatgaga agcttatgga atacggaaac 1020atgcttgtga tggaacaaga gaatgtcaag agagtccaac ttgccgagac ctacctcagc 1080caggctgctc tgggagacgc aaacgctgac gccatcggcc gcggaacttt ctacggtaaa 1140acagaggaaa aggagcccag caagctcgag taa 1173
<210> SEQ ID No 22<211> Comprimento: 390<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: Baseada na seqüência de Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 22
Met Val Lys Glu Asp Lys Gln Thr Asp Gly Asp Arg Trp Arg Gly Leu
15 10 15
Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Asp Gln Gln Asp Ile Thr Arg Gly Lys Gly
20 25 30
Met Val Asp Ser Val Phe Gln Ala Pro Met Gly Thr Gly Thr His His
35 40 45
Ala Val Leu Ser Ser Tyr Glu Tyr Val Ser Gln Gly Leu Arg Gln Tyr
50 55 60
Asn Leu Asp Asn Met Met Asp Gly Phe Tyr Ile Ala Pro Ala Phe Met65 70 75 80Asp Lys Leu Val Val His Ile Thr Lys Asn Phe Leu Thr Leu Pro Asn
85 90 95
Ile Lys Val Pro Leu Ile Leu Gly Ile Trp Gly Gly Lys Gly Gln Gly
100 105 110
Lys Ser Phe Gln Cys Glu Leu Val Met Ala Lys Met Gly Ile Asn Pro
115 120 125
Ile Met Met Ser Ala Gly Glu Leu Glu Ser Gly Asn Ala Gly Glu Pro
130 135 140
Ala Lys Leu Ile Arg Gln Arg Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Leu Ile Lys145 150 155 160
Lys Gly Lys Met Cys Cys Leu Phe Ile Asn Asp Leu Asp Ala Gly Ala
165 170 175
Gly Arg Met Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Thr Val Asn Asn Gln Met Val
180 185 190
Asn Ala Thr Leu Met Asn Ile Ala Asp Asn Pro Thr Asn Val Gln Leu
195 200 205
Pro Gly Met Tyr Asn Lys Glu Glu Asn Ala Arg Val Pro Ile Ile Cys
210 215 220
Thr Gly Asn Asp Phe Ser Thr Leu Tyr Ala Pro Leu Ile Arg Asp Gly225 230 235 240
Arg Met Glu Lys Phe Tyr Trp Ala Pro Thr Arg Glu Asp Arg Ile Gly
245 250 255
Ile Cys Lys Gly Ile Phe Arg Thr Asp Lys Ile Lys Asp Glu Asp Ile
260 265 270
Val Arg Leu Val Asp Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ile Asp Phe Phe Gly
275 280 285
Ala Leu Arg Ala Arg Val Tyr Asp Asp Glu Val Arg Lys Phe Val Glu
290 295 300
Ser Leu Gly Val Glu Asn Ile Gly Lys Arg Leu Val Asn Ser Arg Glu305 310 315 320
Gly Pro Pro Val Phe Glu Gln Pro Glu Met Thr Tyr Glu Lys Leu Met
325 330 335
Glu Tyr Gly Asn Met Leu Val Met Glu Gln Glu Asn Val Lys Arg Val
340 345 350
Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly Asp Ala Asn
355 360 365
Ala Asp Ala Ile Gly Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Lys Thr Glu Glu Lys
370 375 380
Glu Pro Ser Lys Leu Glu385 390
<210> SEQ ID No 23<211> Comprimento: 17<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: primer
<400> Seqüência: 23cagacaatgt tggcctc<210> SEQ ID No 24<211> Comprimento: 18<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: primer
<400> Seqüência: 24
acgagtaacg atggtagg 18
<210> SEQ ID No 25<211> Comprimento: 15<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: primer
<400> Seqüência: 25
gtctatacct tgagc 15
<210> SEQ ID No 26<211> Comprimento: 14<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras informações: primer
<400> Seqüência: 26tcagtcatac tcgg
14

Claims (20)

1. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelofato de que compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5,-7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 ou um complemento das mesmas.
2. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelofato de que é selecionada do grupo consistindo de:a. molécula de ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotideos, a qual é pelo menos-95% idêntica à seqüência de nucleotideos dequalquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13,-15, 17, 19 e 21 ou um complemento das mesmas;b. molécula de ácido nucléico que codifica umpolipeptideo compreendendo a seqüência deaminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6,-8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22; ec. molécula de ácido nucléico que hibridiza, sobcondições severas, com uma sonda de ácidonucléico consistindo da seqüência de nucleotideosde qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11,-13, 15, 17, 19 e 21 ou um complemento das mesmas.
3. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico codifica um polipeptideo comtermoestabilidade aumentada, quando comparado com umpolipeptideo da SEQ ID NO: 2.
4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende amolécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1ou 2 .
5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que é um vetor de expressão.
6. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de quecompreende o vetor como definido na reivindicação 4.
7. Polipeptideo isolado, caracterizado pleo fato de quecompreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12,- 14, 16, 18, 20 e 22.
8. Polipeptideo isolado, caracterizado pleo fato de que éselecionado do grupo consistindo de:a. polipeptideo que é pelo menos 95% idêntico àseqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22;b. polipeptideo que é codificado por uma molécula deácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotideos, a qual é pelo menos 95% idêntica aqualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13,- 15, 17, 19 e 21 ou um complemento das mesmas;c. polipeptideo codificado por uma molécula de ácidonucléico que hibridiza, sob condições severas,com uma sonda de ácido nucléico consistindo daseqüência de nucleotideos de qualquer uma das SEQID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 ou umcomplemento das mesmas.
9. Polipeptideo isolado de acordo com a reivindicação 7ou 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptideoapresenta termoestabilidade aumentada, quando comparado comum polipeptideo da SEQ ID NO: 2.
10. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de quecompreende um transgênie que expressa:a. o polipeptideo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4,-6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 22; oub. a molécula de ácido nucléico de qualquer uma das-SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21.
11. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada dogrupo consistindo de plantas de milho, tomate, batata,arroz, soja, algodão, girassol, alfalfa, alface, canola,sorgo ou tabaco.
12. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que a planta transgênicaapresenta tolerância ao calor aumentada, quando comparada auma planta que não é transgênica.
13. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de quecompreende um transgênie que expressa:c. o polipeptideo como definido na reivindicação 8oud. a molécula de ácido nucléico como definida nareivindicação 2 .
14. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada dogrupo consistindo de plantas de milho, tomate, batata,arroz, soja, algodão, girassol, alfalfa, alface, canola,sorgo ou tabaco.
15. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a planta transgênicaapresenta tolerância ao calor aumentada, quando comparada auma planta que não é transgênica.
16. Método de aumento da tolerância ao calor em plantas,caracterizado pelo fato de que compreende expressar umpolipeptideo de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10,- 12, 14, 16, 18, 20 e 22 em uma planta.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o polipeptideo é expresso no um ou maisplastideos da planta.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a expressão do referido polipeptideoresulta em um aumento na taxa de fotossintese, sobcondições aquecidas.
19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a expressão ou a atividadeda RuBisCO activase endógena da planta é reguladanegativamente.
20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a expressão ou a atividadeda RuBisCO activase endógena da planta é eliminada.
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