BRPI0615462A2 - peptìdeos associados a tumor que se ligam de forma promìscua a moléculas hla classe ii - Google Patents

Abstract

PEPTIDEOS ASSOCIADOS A TUMOR QUE SE LIGAM DE FORMA PROMìSCUA A MOLéCULAS HLA CLASSE II. A presente invenção refere-se a métodos imunoterapêuticos e a moléculas e células a serem usadas nestes métodos. A presente invenção refere-se, particularmente, à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se ainda aos epítopos de peptídeos de células 1-helper associados a tumor, individualmente ou em combinação com outros peptídeos associados a tumor, que servem como ingredientes farmacêuticos ativos das composições de vacina que estimulam respostas imunológicas antitumorais. Em particular, a presente invenção refere-se a 49 novas seqüências de peptídeos, derivadas das moléculas HLA de classe II de linhagens de células humanas de tumores, que poderão ser utilizadas em composições de vacinas para a obtenção de respostas imunológicas antitumorais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEOSASSOCIADOS A TUMOR QUE SE LIGAM DE FORMA PROMÍSCUA AMOLÉCULAS HLA CLASSE 11".

A presente invenção refere-se a métodos imunoterapêuticos e amoléculas e células a serem utilizadas nestes métodos. Em particular, a pre-sente invenção refere-se à imunoterapia do câncer, em particular do câncerrenal e do câncer do cólon. A presente invenção refere-se ainda aos epíto-pos de peptídeos de células T-helper associados ao tumor, individualmenteou em combinação com outros peptídeos associados ao tumor, que servemcomo ingredientes farmacêuticos ativos das composições de vacina que es-timulam as respostas imunológicas antitumorais. Em particular, a presenteinvenção refere-se a 49 novas seqüências de peptídeos, derivadas das mo-léculas HLA de classe Il de linhagens de células humanas de tumores, quepoderão ser utilizadas em composições de vacinas para obter respostas i-munológicas antitumorais.

Para os propósitos da presente invenção, todas as referênciascitadas são aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A estimulação de uma resposta imunológica depende da pre-sença de antígenos reconhecidos como estranhos pelo sistema imunitárioanfitrião. A descoberta da existência de antígenos associados ao tumor criaa possibilidade de utilizar um sistema imunitário anfitrião para intervir nocrescimento do tumor. Vários mecanismos de utilização dos braços humorale celular do sistema imunitário estão a ser atualmente explorados para imu-noterapia do câncer.

Elementos específicos da resposta imunológica celular são ca-pazes de reconhecer e destruir especificamente células tumorais. O isola-mento de células T citotóxicas (CTL) de populações de células infiltradas notumor ou do sangue periférico sugere que tais células desempenham umafunção importante na defesa imunológica natural contra o câncer {Cheeveret al.., Annals N.Y. Acad. Sei. 1993 690:101-112). As células TCD8+, em par-ticular, que reconhecem as moléculas de classe I dos peptídeos associadosao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de geralmente 8 a 10resíduos derivados de proteínas localizadas nos citossóis, desempenhamuma função importante nesta resposta. As moléculas MHC dos seres huma-nos são também designadas por antígenos de leucócitos humanos (HLA).

Existem duas classes de moléculas MHC: as moléculas MHC I,que poderão ser encontradas na maioria das células com núcleos que apre-sentam peptídeos que resultam da clivagem proteolítica de proteínas endó-genas e peptídeos maiores. As moléculas MHC Il apenas podem ser encon-tradas em células profissionais apresentadoras de antígenos (APC) e apre-sentam peptídeos de proteínas exógenas que são absorvidas pelas APCsdurante a endocitose e subseqüentemente processadas. Os complexos depeptídeos e MHC I são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos CD8+, com-plexos de peptídeos e MHC Il sendo reconhecidos por células T-helperCD4+.

As células T-helper CD4+ desempenham um papel importantena regulação das funções efetoras de respostas de células T antitumorais e,por este motivo, a identificação dos epítopos de células T CD4+, derivadosde antígenos associados ao tumor (TAA)1 pode ser de grande importânciapara o desenvolvimento de produtos farmacêuticos com vista ao desenca-deamento de respostas imunológicas antitumorais (Kobayashi.H., R. Omiya,M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto,F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitopefor helper T Iymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Câncer Res.8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jãger, M. Matsuo, A. Selvaku-mar, N.K. Altorki, R.G. Maki1 B. Dupont, G. Ritterj Y.T. Chen, A. Knuth, andL.J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses againstNY-ESO-1 in câncer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Na-tl. Acad. Sci.U.S.A. 100(15):8862-7). 100(15):8862-7).

Foi comprovado em modelos animais mamíferos que, por e-xemplo, ratos, mesmo na ausência de células efetoras de linfócitos T citotó-xicos (CTL) (isto é, linfócitos T CD8+), as células T CD4+ são suficientespara inibir a visualização de tumores através da inibição da angiogênese porsecreção de interferon gama (IFNy) (Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000.CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis thatis dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells.Immunity. 12:677-686). Além disso, foi comprovado que as células T CD4+,que reconhecem peptídeos a partir de antígenos associados ao tumor apre-sentados pelas moléculas HLA de classe II, podem contrariar a progressãodo tumor através da indução de respostas de anticorpos (Ab) (Kennedy,R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T Iymphocytesplay a criticai role in antibody production and tumor immunity against simianvirus 40 Iarge tumor antigen. Câncer Res. 63:1040-1045). Em contraste comos peptídeos associados ao tumor que se ligam às moléculas HLA de classeI, apenas um pequeno número de Iigantes de classe Il dos TAA foi descritoaté ao momento (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Uma vez quea expressão constitutiva das moléculas HLA de classe Il está normalmentelimitada às células do sistema imunitário (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class Il genes: Iessons from adisease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), a possibilidade de isolamentodos peptídeos de classe II, diretamente a partir dos tumores primários, nãofoi considerada possível. Deste modo, foram descritas várias estratégias pa-ra antígenos-alvo na rota de processamento de classe Il das células apre-sentadoras de antígenos (APCs), por exemplo, a incubação de APCs com oantígeno de interesse para permitir a sua absorção, processamento e apre-sentação (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Cor-thals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999.Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules toCD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med, 189:767-778) ou a transfecção de célu-las com genes ou minigenes que codificam o antígeno de interesse e fundi-dos na cadeia invariante, que é intermediária da translocação de antígenospara o processamento e junção dos compartimentos (MIIC) de MHC de clas-se II lisossomal.

Para que um peptídeo desencadeie (obtenha) uma respostaimunológica celular, este precisará ligar-se a uma molécula MHC. Este pro-cesso está dependente do alelo da molécula MHC e dos polimorfismos es-pecíficos da seqüência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos ligados aMHC de classe I são normalmente 8-10 resíduos em comprimento e contêmdois resíduos conservados ("âncora") na sua seqüência que interagem como sulco de ligação correspondente da molécula MHC.

Na ausência de uma inflamação, a expressão das moléculasMHC de classe Il é principalmente restringida às células do sistema imunitá-rio, especialmente as células apresentadoras de antígenos (APC) profissio-nais, por exemplo, monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos,células dendríticas.

Os antígenos que são reconhecidos pelos linfócitos T citotóxi-cos específicos do tumor, ou seja, pelos respectivos epítopos, podem sermoléculas derivadas de todas as classes de proteínas, tais como, enzimas,receptores, fatores de transcrição, etc. Além disso, os antígenos associadosao tumor, por exemplo, também podem estar presentes apenas nas célulastumorais, por exemplo, como produtos de genes que sofreram mutação, apartir de grelhas de leitura aberta alternativas (ORFs) ou a partir da ligaçãode proteínas (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G,Morei S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. An antigenic pepti-de produced by peptide splicing in the proteasome. Science. 2004 Apr23;304 (5670):587-90.). Outra classe importante de antígenos associados atumores consiste nas estruturas específicas de tecido, tais como os antíge-nos CT ("câncer testis") expressos em diferentes tipos de tumores e no teci-do saudável do testículo.

Foram identificados vários antígenos associados a tumores.

Além disso, está a ser realizado muito trabalho de pesquisa para identificaroutros antígenos associados a tumores. Alguns grupos de antígenos associ-ados a tumores, também chamados de antígenos específicos de tumores,são específicos do tecido. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, tiro-sinase para melanoma, PSA e PSMA para cross-overs de câncer da prósta-ta e de cromossomas, como, bcr/abl em linfomas. No entanto, muitos antí-genos associados a tumores identificados ocorrem em vários tipos de turno-res e alguns, tais como proteínas oncogênicas e/ou genes supressores detumor (genes supressores de tumor são, por exemplo, revistos para câncerrenal em Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of câncer ofthe kidney. J Urol. 2003 Dec;170(6 Pt 1):2163-72) que provocam realmente oevento de transformação, ocorrem em quase todos os tipos de tumores. Porexemplo, as proteínas celulares normais que controlam o crescimento e dife-renciação celulares, tais como p53 (um exemplo de gene supressor do tu-mor), ras, c-met, myc, pRB, VHL e HER-2/neu, podem acumular mutaçõesresultantes da regulação por excesso da expressão destes produtos de ge-nes, tornando-os assim oncogênicos (McCartey et aL Câncer Research1998 15:58 2601-5; Disis et aL Ciba Found. Symp. 1994 187:198-211). Es-tas proteínas mutantes podem ser alvo de uma resposta imunológica especí-fica de um tumor em vários tipos de câncer.

Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos Tci-totóxicos como antígenos específicos de tumores e para que elas sejam u-sadas em terapia, certos pré-requisitos precisam ser satisfeitos. O antígenodeve ser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidossaudáveis normais ou em quantidades muito pequenas. É ainda desejávelque o respectivo antígeno esteja presente não apenas em um tipo de tumor,mas também em elevadas concentrações (por exemplo, número de cópiaspor célula). É essencial a presença de epítopos na seqüência de aminoáci-dos do antígeno, uma vez que tal peptídeo ("peptídeo imunogênico") que éderivado de um antígeno associado a um tumor desencadeia uma respostain vitro ou in vivo de células T.

Até agora, foram descritas várias estratégias direcionadas aosantígenos na rota de processamento da classe II. É possível incubar célulasapresentadoras de antígenos (APCs) com o antígeno de interesse, para queeste seja absorvido e processado (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V.,Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & vander, Β. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Outras estratégias utilizam pro-teínas de fusão que contêm seqüências provenientes de lisossomas.Expressas nas APCs, estas proteínas de fusão direcionam os antígenos pa-ra o compartimento de processamento de classe Il (Marks, M. S., Roche, P.A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters1 P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J.Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pere-da, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).

As células T-helper desempenham um papel importante na re-gulação das funções efetoras de CTLs na imunidade antitumoral. Os epíto-pos das células T-helper que desencadeiam uma resposta das células T-helper do tipo TH1 suportam as funções efetoras das células T Killer CD8+,que incluem funções citotóxicas direcionadas contra as células tumorais queapresentam um peptídeo associado ao tumor/complexos MHC nas respecti-vas superfícies da célula. Deste modo, os epítopos de peptídeos de célulasT-helper associados ao tumor, individualmente ou em combinação com ou-tros peptídeos associados ao tumor, podem servir como ingredientes farma-cêuticos ativos de composições de vacinas que estimulam as respostas i-munológicas antitumorais.

A principal tarefa no desenvolvimento de uma vacina para umtumor é, portanto, identificar e caracterizar os novos antígenos associadosao tumor e os epítopos de T-helper imunogênicos derivados dos mesmos,que poderão ser reconhecidos pelos CTLs CD4+. Existe, portanto, um objetoda presente invenção que visa fornecer novas seqüências de aminoácidospara esse peptídeo que tem a capacidade de se ligar a uma molécula docomplexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano de classe II.

De acordo com a presente invenção, este objeto é resolvido a-través do fornecimento de um peptídeo associado a tumor selecionado dogrupo de peptídeos que compreende ao menos uma seqüência de acordocom a Seq. id no. 1 à Seq. id no. 49 da lista de seqüências anexa, sendoque o peptídeo tem a capacidade de se ligar a uma molécula do complexoprincipal de histocompatibilidade (MHC) humano de classe II, desde que opeptídeo não seja o polipeptídeo associado ao tumor humano intacto.

Na presente invenção, os inventores demonstram que é possí-vel isolar e caracterizar os peptídeos, que ligam as moléculas HLA de classeIl diretamente a partir de tumores de mamíferos, preferencialmente tumoreshumanos, preferencialmente tumores sólidos, por exemplo, a partir de carci-nomas de células renais e carcinomas do cólon. Os monócitos infiltradosexpressaram moléculas MHC de classe II, bem como células tumorais e,além disso, as células tumorais revelaram uma regulação por excesso devários produtos dos genes induzidos por citocinas ou quimoquinas, por e-xemplo, produtos do gene induzidos por interferon gama.

A presente invenção fornece os peptídeos provenientes dosantígenos associados à tumorigênese e a capacidade de se ligar suficiente-mente às moléculas HLA de classe Il para desencadear uma resposta imu-nológica de leucócitos humanos, especialmente linfócitos, especialmentelinfócitos T, especialmente linfócitos T CD4+, especialmente linfócitos TCD4+ intermediários de respostas imunológicas de tipo TH1. Os pep-tídeos provêm dos antígenos associados ao tumor, especialmente antígenosassociados ao tumor com funções em, por exemplo, proteólise, angiogêne-se, crescimento celular, regulação do ciclo celular, divisão celular, regulaçãoda transcrição, regulação da tradução, invasão dos tecidos, incluindo, porexemplo, peptídeos associados a tumor a partir da metaloproteinase 7 dematriz (MMP7; Seq. id no. 1) e a proteína de ligação 3 de fator de crescimen-to tipo insulina (IGFBP3; Seq. id no. 25).

Na presente invenção, os inventores também fornecem provasconclusivas de que os peptídeos associados ao tumor, que se ligam de for-ma suficiente e promíscua às moléculas HLA de classe II, especialmente aosalelos de HLA de classe Il geneticamente codificados pelos Ioci HLA DR dogenoma humano, são capazes de obter respostas imunológicas mediadaspor células T CD4+ humanas. As células T CD4+ foram isoladas a partir desangue periférico humano, demonstrando que os referidos peptídeos sãoadequados para desencadear as respostas de células T do sistema imunitá-rio humano face aos peptídeos selecionados do peptidoma das células dotumor. Uma vez que os peptídeos podem ser quimicamente sintetizados epodem ser utilizados como ingredientes farmacêuticos ativos de preparaçõesfarmacêuticas, os peptídeos fornecidos pela invenção dos inventores podemser utilizados para imunoterapia, preferencialmente imunoterapia do câncer.De modo a identificar os Iigantes HLA de classe Il dos TAA pa-ra o desenvolvimento da imunoterapia baseada em peptídeos, os inventorestentaram isolar os peptídeos que apresentaram HLA-DR diretamente a partirde tumores sólidos dissecados, em particular, a partir de um carcinoma decélulas renais (RCC), capaz de expressar as moléculas de classe Il (Gastl,G., T. Ebert, C.L. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W. Aulitzky, and N.H.Bander. 1996. Major histocompatibility complex class I and class Il expres-sion in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma. J. Urol.155:361-367). Mesmo que a maioria das células tumorais seja negativa declasse II, os espectrômetros de massa de topo de gama deverão proporcio-nar a sensibilidade necessária para a identificação dos peptídeos de classeIl de um número mínimo de células tumorais ou de leucócitos infiltrados quepoderão apresentar de forma cruzada os TAA ou de células estromais noperímetro do tumor em crescimento.

Os motivos para se concentrar nos RCC, a fim de demonstrarprovas técnicas do conceito, são os seguintes: Cerca de 150 000 pessoasem todo o mundo são diagnosticadas com RCC todos os anos, estando adoença associada a uma elevada taxa de mortalidade, resultando em apro-ximadamente 78 000 mortes por ano (Pavlovich, C.P. and L.S. Schmidt.2004. Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma. Nat. Rev.Câncer 4:381-393). If metastases are diagnosed, the one-year survival ratedecreases to approximately 60 % (Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Gha-foor, A. Samuels, E. Ward, E.J. Feuer, and M.J. Thun. 2004. Câncer statis-tics, 2004. CA Câncer J. Clin. 54:8-29), reforçando a elevada necessidademédica não satisfeita neste sentido. Uma vez que o RCC parece ser um tu-mor imunogênico (Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A phase 2 study of sur-veillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment ofresponse of such patients to therapy on progression. Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, et aL Interferon gamma-1b comparedwith placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl J Med.1998;338:1265), conforme indicado pela existência de CTL que reagem aotumor e que estão infiltrados no tumor (Finke, J.H., P. Rayman, J. Alexander,Μ. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990.Characterization of the cytolytic activity of CD4-positive and CD8-positivetumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Câncer Res.50:2363-2370), clinicai trials have been initiated to develop peptide-basedanti-tumor vaccinations (Wierecky J, Mueller M, Brossart P. Dendritic cell-based câncer immunotherapy targeting MUC-1. Câncer Immunol Immuno-ther. 2005 Apr 28). No entanto, devido à falta de epítopos de células T-helper dos TAA, as vacinas definidas de forma molecular incluem normal-mente o funcionamento dos peptídeos apenas como ligantes de classe I.

No trabalho científico que levou à presente invenção, os inven-tores foram capazes de isolar os Iigantes de classe II a partir de dez amos-tras de RCC, três carcinomas colorretais (CCA) e um carcinoma de célula detransição (TCC, carcinoma urotelial). Apenas os ligantes selecionados dosTAA identificados nesta abordagem têm a capacidade unificadora de:

1. Derivar dos antígenos com uma associação ao tumor conhecida;

2. Ligar-se ao alelo HLA-DR de classe II, HLA DRB1*0101 e

3. Ter características que os afastem da maioria dos ligantesHLA de classe II, cumprindo critérios relativos à respectiva seqüência primá-ria de aminoácidos, permitindo-lhes ligar-se de forma promíscua às molécu-las HLA-DR a partir de, pelo menos, dois alelos diferentes.

Conforme exemplificado abaixo com um peptídeo MMP7 (Seq.id no. 1), estes peptídeos associados ao tumor com ligações promíscuasHLA-DR foram reconhecidos por células T CD4+.

Um primeiro aspecto da invenção apresenta um peptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácidos de acordo com qualquer dasseqüências SEQ ID ne 1 à SEQ ID n- 49, ou uma variante destas, desde queo peptídeo não seja o polipeptídeo humano intacto a partir do qual a se-qüência de aminoácidos é derivada (isto é, uma das seqüências completasmostradas nos IDs do link do locus (números de acesso, vide a tabela 1 a -nexa, abaixo).

Conforme descrito abaixo, os peptídeos que formam a base dapresente invenção foram todos identificados como tendo sido apresentadospelas células portadoras de MHC de classe Il (RCC). Assim, estes peptídeosem particular, bem como outros peptídeos que contêm a seqüência (isto é,peptídeos derivados) irão todos obter uma resposta específica de células T,embora a dimensão dessa resposta possa variar de peptídeo para peptídeo.As diferenças, por exemplo, podem ser provocadas pelas mutações nos re-feridos peptídeos (ver abaixo). O versado na presente técnica está bem cien-te dos métodos que podem ser aplicados, de modo a determinar a dimensãona qual a resposta será induzida por um peptídeo individual, em particular,relativamente aos exemplos aqui descritos e à respectiva literatura.

De preferência, um peptídeo de acordo com a presente inven-ção consiste essencialmente em uma seqüência de aminoácidos de acordocom qualquer Seq. id no. 1 a Seq. id no. 49, ou uma variante das mesmas.

"Consistir essencialmente em" significa que um peptídeo deacordo com a presente invenção, juntamente com a seqüência de acordocom qualquer seqüência de Seq. id no. 1 a Seq. id no. 49 ou uma variantedas mesmas, contém extensões adicionais N-terminal e/ou C-terminal deaminoácidos que não são necessariamente parte do peptídeo que funcionacomo seqüência principal do peptídeo que compreende o motivo de ligaçãoe como um epítopo T-helper imunogênico.

No entanto, estas extensões podem ser importantes para for-necer uma introdução eficiente do peptídeo de acordo com a presente in-venção nas células. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeoda mesma inclui 80 aminoácidos N-terminal da cadeia invariante associadado antígeno HLA-DR (p33, nos seguintes "li"), conforme derivado do NCBI,GenBank número de acesso X00497 (Strubin, M., Mach, B. e Long, E.O. Aseqüência completa de mRNA para a cadeia invariante associada do HLA-DR revela um polipeptídeo com uma polaridade transmembrana invulgarEMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)).

Por "variante" da seqüência de aminoácidos apresentada, osinventores entendem que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou doisresíduos de aminoácidos são alteradas (por exemplo, ao substituí-las pelacadeia lateral de outro resíduo de aminoácidos que ocorra naturalmente oupor qualquer outra cadeia lateral), de modo que o peptídeo ainda seja capazde se ligar a uma molécula HLA da mesma forma substancial que um peptí-deo que tem a seqüência de aminoácidos apresentada. Por exemplo, umpeptídeo pode ser modificado de modo a, pelo menos, manter, se não me-lhorar, a capacidade de interagir e de se ligar com a molécula MHC adequa-da, como HLA-A, e de modo a, pelo menos, manter, se não melhorar, a ca-pacidade de criar CTL ativados que possam reconhecer e eliminar célulasque expressam polipeptídeos que contêm a seqüência de aminoácidos defi-nida nos aspectos da invenção. Como derivado da base de dados e confor-me descrito em seguida, determinadas posições de peptídeos de ligaçãoHLA-A são tipicamente resíduos em âncora que formam uma seqüênciaprincipal que se ajusta ao motivo de ligação do sulco de ligação HLA.

Esses resíduos de aminoácidos, que não são essenciais parainteragir com o receptor de células T, podem ser modificados pela substitui-ção de outros aminoácidos cuja incorporação não tem um efeito substancialna reatividade das células T e não elimina a ligação a MHC relevante. As-sim, exceto na condição apresentada, o peptídeo da invenção poderá serqualquer peptídeo (termo no qual os inventores incluem oligopeptídeos oupolipeptídeos) que inclua as seqüências de aminoácidos ou uma porção ouvariante das mesmas, conforme apresentado.

Além disso, é sabido que os peptídeos apresentados paraMHC de classe Il são compostos por uma "seqüência de núcleo" com umdeterminado motivo de aminoácidos específico HLA e, opcionalmente, ex-tensões N- e/ou C-terminal que não interfiram com a função da seqüêncianúcleo (isto é, sejam considerados irrelevantes para a interação do peptídeoe da célula T). As extensões N- e/ou C-terminal podem ter entre 1 a 10 ami-noácidos de comprimento, respectivamente. Assim, um peptídeo preferencialda presente invenção tem um comprimento total entre 9 e 100, de preferên-cia entre 9 e 30, aminoácidos. Este peptídeo pode ser utilizado diretamente,de modo a carregar moléculas MHC de classe Il ou a seqüência pode serclonada para os vetores de acordo com a descrição abaixo. Uma vez queestes peptídeos formam o produto final do processamento de peptídeosmaiores no interior da célula, também podem ser usados peptídeos maiores.Os peptídeos da invenção podem ter qualquer tamanho, mas tipicamenteeles devem ter peso molecular menor que 100.000, de preferência menorque 50.000, com mais preferência menor que 10.000 e tipicamente cerca de5.000. Em termos de número de resíduos de aminoácidos, os peptídeos dainvenção podem ter menos que 1.000 resíduos, de preferência menos que500 resíduos, com mais preferência menos que 100 resíduos.

Se um peptídeo maior do que cerca de 12 resíduos de aminoá-cidos for utilizado diretamente para se ligar a uma molécula MHC, é preferí-vel que os resíduos que ladeiam a região de ligação HLA núcleo sejam a-queles que não afetam substancialmente a capacidade de o peptídeo se li-gar especificamente ao sulco de ligação da molécula MHC ou apresentar opeptídeo aos CTL. No entanto, como acima indicado, será apreciado quepossam ser usados peptídeos maiores, especialmente quando codificadospor um polinucleotídeo, uma vez que estes peptídeos maiores podem serfragmentados por células apresentadoras de antígeno adequadas.

Exemplos de peptídeos de ligantes, motivos, variantes MHC,bem como certos exemplos de extensões N- e/ou C-terminal podem ser, porexemplo, derivados da base de dados SYFPEITHI (Rammensee H, Bach-mann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database forMHC Iigands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9.)em http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ e as referências citadas neste documento.

Como exemplos não limitadores, determinados peptídeos paraHLA-DR na base de dados são KHKVYACEVTHQGLSS derivadosda cadeia Ig kappa 188-203 (Kovats et al.. Eur J Immunol. 1997 A-pr;27(4): 1014-21); KVQWKVDNALQSGNS derivados da cadeia Igkappa 145-159 (Kovats et al.. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4):1014-21), L PR L I A F T S E H S H F derivados de GAD65 270-283 (Endl et al.. J Clin In-vest. 1997 May 15;99(10):2405-15) ouFFRMVISNPAATHQDIDFL I derivados de GAD65 556-575 (Endl et al.. J Clin Invest. 1997 May15;99(10):2405-15). Para além disso, os peptídeos também podem ser deri-vados de seqüência de antígenos que sofreram mutação, como no caso deATGFKQSSKALQRPVAS derivados de proteína de fusão bcr-abl210 kD (ten Bosch et al.. Blood. 1996 Nov 1;88(9):3522-7), GYKVLVLNPSVAAT derivados de HCV-1 NS3 28-41 Diepolder et al.. J Virol. 1997Aug;71(8):6011-9) ouFRKQNPDIVIQYMDDLYVG derivados deHIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg et al.. J Immunol. 1999 Jan1;162(1 ):152-60). Todos os aminoácidos "âncora" (ver Friede et al.., BiochimBiophys Acta. 1996 Jun 7;1316(2):85-101; Sette et al.. J Immunol. 1993 Sep15;151(6):3163-70.; Hammer et al.. Cell. 1993 Jul 16;74(1):197-203., andHammer et al.. J Exp Med. 1995 May 1;181 (5): 1847-55. As examples forHLA-DR4) foram indicados em negrito, sendo as principais seqüências puta-tivas sublinhadas.

Todos os peptídeos acima descritos são incluídos no termo"variantes" de determinada seqüência de aminoácidos.

Por "peptídeos" os inventores incluem não apenas moléculasem que os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações de peptídeo (-CO-NH-) mas também por moléculas em que a ligação de peptídeos é inver-tida. Esta peptidomimética retro-invertida pode ser efetuada utilizando méto-dos conhecidos na técnica, por exemplo, os descritos em Meziere et al.(1997) J. Immunol. 159,3230-3237, incorporados no presente para referên-cia. Esta abordagem envolve a criação de pseudopeptídeos que contêm al-terações que envolvam a estrutura e não a orientação de cadeias laterais.Meziere et al. (1997) mostram que, pelo menos nas respostas de células T-helper e MHC de classe II, estes pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeosretro-invertidos, que contêm ligações NH-CO em vez de ligações de peptí-deos CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise.

Tipicamente, o peptídeo da invenção pode, se expresso emuma célula que apresente antígeno, ser processado de forma a que umfragmento seja produzido possibilitando a ligação a uma molécula MHC a-propriada e pode ser apresentado por uma célula adequada e obter umaresposta de célula T adequada. Será apreciado se um fragmento produzidodo peptídeo também poder ser um peptídeo da invenção. De forma adequa-da, o peptídeo da invenção contém uma porção que compreende a seqüên-cia de aminoácidos ou porção ou variante determinada da mesma e umaporção adicional que confere alguma propriedade desejável. Por exemplo,uma porção adicional pode incluir um epítopo de célula T adicional (quer se-ja ou não derivado do mesmo polipeptídeo como a primeira porção que con-tém epítopo de célula T) ou poderá incluir uma proteína ou peptídeo detransporte. Desta forma, em uma modalidade o peptídeo da invenção é umaproteína humana truncada ou uma proteína de fusão de um fragmento deproteína e outra porção de polipeptídeo desde que a porção humana incluauma ou mais seqüências de aminoácidos de invenção.

Em uma modalidade particularmente preferida, o peptídeo dainvenção inclui a seqüência de aminoácidos da invenção e1 pelo menos umepítopo de célula T adicional quando o epítopo de célula T adicional puderfacilitar a produção de uma resposta de célula T dirigida ao tipo de tumorque expressa de forma aberrante um antígeno associado ao tumor. Destaforma, os peptídeos da invenção incluem os chamados polipeptídeos "beadson a string" que também podem ser utilizados como vacinas.

Será apreciado, do que se segue, que algumas aplicações ospeptídeos da invenção possam ser utilizados diretamente (isto é, que nãosejam produzidos pela expressão de um polinucleotídeo em uma célula deum paciente ou em uma célula colocada em um paciente); nessas aplica-ções é preferível que o peptídeo tenha menos de 100 ou 50 resíduos. Umpeptídeo preferido da presente invenção apresenta um comprimento totalentre 9 e 30 aminoácidos.

É preferível que os peptídeos da invenção possam ligar a HLA-DR. É particularmente preferível que os peptídeos liguem seletivamente aHLA-DRBrOI 01.

Em outro aspecto da presente invenção, de forma similar à si-tuação apresentada acima para as moléculas MHC de classe II, os peptí-deos da invenção podem ser utilizados para desencadear uma resposta decélula T específica MHC de classe I. Um peptídeo específico MHC de classeI preferencial da presente invenção tem um comprimento total entre 9 e 16,de preferência entre 9 e 12 aminoácidos. Deve ser compreendido que essespeptídeos podem ser utilizados (por exemplo, em uma vacina) como peptí-deos mais longos, da mesma forma que os peptídeos MHC de classe II. Osmétodos de identificação das "principais seqüências" específicas MHC declasse I com um determinado motivo de aminoácido específico HLA paramoléculas HLA de classe I são conhecidos da pessoa habilitada e podemser previstos, por exemplo, pelos programas de computador PAProC(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) e SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de).

Os peptídeos da invenção são particularmente úteis em méto-dos imunoterapêuticos para encontrar e eliminar células que expressam deforma aberrante os polipeptídeos que formam a base da presente invençãode peptídeos. Uma vez que estes peptídeos específicos que compreendemas seqüências de aminoácidos indicadas se ligam a HLA-DR, é preferívelque os peptídeos da invenção se liguem a HLA-DR e, quando ligados, ocomplexo de peptídeos HLA-DR, se estiver presente na superfície de umacélula que apresente um antígeno adequado, será capaz de produzir CTLsque reconhecem uma célula que expresse de forma aberrante um polipeptí-deo que compreendem a seqüência de aminoácidos indicada.

Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo damesma inclui òs 80 aminoácidos N-terminal da cadeia invariante associadado antígeno HLA-DR (p33, no "li" seguinte) como derivado de NCBI, Gen-Bank número de acesso X00497 (ver também abaixo).

Por "expresso de forma aberrante" inclui-se o significado de opolipeptídeo ser sobre-expresso em comparação com os níveis normais deexpressão ou de o gene ser silencioso no tecido de onde o tumor é derivado,mas no tumor ser expresso. Por "sobre-expresso" pretende-se significar queo polipeptídeo está presente a um nível pelo menos 1,2 χ do presente notecido normal; preferivelmente pelo menos 2 χ e mais preferivelmente pelomenos 5 χ ou 10 χ o nível presente no tecido normal.

Os peptídeos (pelo menos os contidos nas ligações de peptí-deos entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizados pelo modo po-Iiamida Fmoc de síntese de peptídeo de fase sólida como descrito por Lu etal. (1981) J. Org. Chem. 46,3433 e referências no presente. A proteção tem-porária do grupo N-amino é proporcionada pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Uma clivagem repetitiva deste grupo deproteção base altamente lábil é efetuada utilizando 20 % piperidina em N, N-dimetilformamida. As funcionalidades de cadeia lateral podem ser protegidascomo os seus éteres de butila (no caso da serina treonina e tirosina), éteresde butila (no caso de ácido glutâmico e ácido aspártico), derivado de butilo-xicarbonil (no caso de Iisina e histidina), derivado de tritila (no caso de cisteí-na) e derivado de 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonila (no caso de argi-nina). Quando a glutamina ou asparagina forem resíduos C-terminal, é feitaa utilização do grupo 4,4,-dimetoxibenzidrila para proteção das funcionalida-des amido da cadeia lateral. O apoio de fase sólida é baseado em um polí-mero polidimetil-acrilamida constituído a partir dos três monômeros dimetila-crilamida (monômero principal), bisacriloiletileno diamina (reticulador) e éstermetil acriloilsarcosina (agente de funcionalização). O agente ligado clivávelpeptídeo-a-resina utilizado é o ácido lábil derivado de ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético. Todos os derivados de aminoácidos são adicionados comoseus derivados de anidrido simétricos pré-formados, com excepção da aspa-ragina e glutamina, que são adicionadas utilizando um procedimento de a-coplamento reverso mediado N, N-diciclohexil-carbodiimida/lhidroxibenzotriazol. Todos os acoplamentos e reações dedesproteção são monitorizados utilizando procedimentos de teste ninhidrina,ácido trissulfônico trinitrobenzeno ou isotina. Após conclusão da síntese, ospeptídeos são clivados do suporte de resina com remoção concomitante dosgrupos de proteção de cadeia lateral através do tratamento com 95 % deácido trifluoroacético contendo uma mistura seqüestrante de 50 %. Os se-qüestrantes comumente utilizados são o etanditiol, fenol, anisol e água, de-pendo a escolha exata dos aminoácidos constituintes do peptídeo sintetiza-do. Também é possível uma combinação de metodologias de fase sólida efase de solução para a síntese de peptídeos (ver, por exemplo, BruckdorferT, Marder O, Albericio F. From production of peptides in milligram amountsfor research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biote-chnol. 2004 Feb;5(1):29-43 e as referências citadas no presente).

O ácido trifluoroacético é removido por evaporação em vácuo,com a subseqüente trituração com éter dietila proporcionando o peptídeobruto. Quaisquer seqüestrantes presentes são removidos por um processode simples extração que em liofilização da fase aquosa proporciona o peptí-deo bruto de seqüestrantes. Os reagentes de síntese de peptídeo estãonormalmente disponíveis na Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, NottinghamNG7 2QJ, RU.

A purificação pode ser efetuada por qualquer pessoa ou poruma combinação de técnicas como a cromatografia de exclusão de dimen-são, cromatografia de troca de íons, cromatografia de interação hidrofóbica e(normalmente) cromatografia líquida de elevado desempenho de fase rever-tida utilizando a separação de gradiente acetonitrila/água.

A análise de peptídeos pode ser realizada utilizando cromato-grafia de camada fina, cromatografia líquida de elevado desempenho de fa-se revertida, análise de aminoácidos depois de hidrólise de ácido e por aná-lise espectral de massa de rápido bombardeamento de átomos (FAB), bemcomo análise espectral de massa MALDI e ESI-Q-TOF.

Um outro aspecto da invenção proporciona um ácido nucléico(por exemplo, polinucleotídeo) codificando um peptídeo da invenção. O poli-nucleotídeo pode ser DNA1 cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações destese pode ou não conter íntrons desde que ele codifique o peptídeo. É claro queapenas se aplica a peptídeos que contêm resíduos de aminoácidos que o-correm naturalmente ligados através de ligações de peptídeos que ocorremnaturalmente, codificáveis por um polinucleotídeo. Um outro aspecto da in-venção proporciona um vetor de expressão capaz de expressar um polipep-tídeo de acordo com a invenção.

Foi desenvolvida uma variedade de métodos para ligar de for-ma operativa polinucleótidos, especialmente DNA, a vetores através, porexemplo, de termos coesivos complementares. Por exemplo, podem ser adi-cionados tractos homopolímeros complementares ao segmento DNA a inse-rir no vetor DNA. O vetor e segmento DNA são então unidos por ligações dehidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formarmoléculas DNA recombinantes.

As ligações sintéticas contendo um ou mais locais de restriçãoproporcionam um método alternativo de ligação do segmento DNA a vetores.O segmento de DNA gerado por digestão de restrição de endonuclease, co-mo anteriormente descrito, é tratado por bacteriófago de polimerase de DNAde T4 ou polimerase de DNA de E. coli, enzimas que removem protuberân-cias, termos isolados 3' com as respectivas atividades 3'-5'-exonucleóticas epreenchendo 3'-pontas suspensas com as suas atividades de polimerização.

A combinação destas atividades gerais, portanto, segmentosDNA de pontas embotadas. Os segmentos de pontas embotadas são, então,incubados com um grande excesso molar de moléculas de ligação na pre-sença de uma enzima capaz de catalisar a ligação das moléculas DNA depontas embotadas, como o bacteriófago T4 de DNA ligase. Desta forma, osprodutos da reação são segmentos DNA que transportam seqüências deligação poliméricas nas suas pontas. Estes segmentos DNA são, então, cli-vados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vetor de expres-são que foi clivado com uma enzima que produz termos compatíveis com osdo segmento DNA.

As ligações sintéticas que contêm uma variedade de locais derestrição de endonuclease estão comercialmente disponíveis junto a um nú-mero de fontes que incluem a International Biotechnologies lnc, New Haven,CN, EUA.

Uma forma desejável de modificar a codificação do DNA quecodifica o polipeptídeo da invenção é utilizar a reação em cadeia da polime-rase, como revelado por Saiki et al. (1988) Science 239,487-491. Este méto-do pode ser utilizado para introdução de DNA em um vetor adequado, porexemplo, trabalhando em locais de restrição adequados, ou pode ser utiliza-do para alterar o DNA de outras formas úteis, como é conhecido na técnica.Neste método o DNA a ser enzimaticamente amplificado é ladeado por doisiniciadores específicos que se tornam incorporados no DNA amplificado. Osreferidos iniciadores específicos podem conter locais de reconhecimentoendonuclease de restrição que podem ser utilizados para clonagem em veto-res de expressão utilizando métodos conhecidos na técnica.

O DNA (ou no caso de vetores retrovirais, RNA) é, desta forma,expresso em um hospedeiro adequado para produzir um polipeptídeo queabranja o composto da invenção. Desta forma, o DNA que codifica o polipep-tídeo que constitui o composto da invenção pode ser utilizado de acordo comas técnicas conhecidas, adequadamente modificado face aos presentes en-sinamentos para construção de um vetor de expressão que é, então, utiliza-do para transformar uma célula hospedeira apropriada para expressão eprodução do polipeptídeo da invenção. Essas técnicas incluem as descritasnas patentes dos EUA 4.440.859 publicada em 3 de abril de 1984 pela Rut-ter et al., 4.530.901 publicada em 23 de julho de 1985 pela Weissman,4.582.800 publicada em 15 de abril de 1986 pela Crowl, 4.677.063 publicadaem 30 de junho de 1987 pela Mark et al., 4.678.751 publicada em 7 de julhode 1987 pela Goeddel, 4.704.362 publicada em 3 de novembro de 1987 pelaItakura et al., 4.710.463 publicada em 1 de dezembro de 1987 pela Murray,4.757.006 publicada em 12 de julho de 1988 pela Toole, Jr. et al., 4.766.075publicada em 23 de agosto de 1988 pela Goeddel et al. e 4.810.648 publica-da em 7 de março de 1989 pela Stalker, todas aqui incorporadas a título dereferência.

O DNA (ou no caso dos vetores retrovirais, RNA) que codifica opolipeptídeo constitui o composto da invenção pode ser ligado a uma vastavariedade de outras seqüências de DNA para introdução em um hospedeiroapropriado. O DNA parceiro irá depender da natureza do hospedeiro, daforma de introdução do DNA no hospedeiro e de se a manutenção ou inte-gração epissomal é desejada.

Geralmente, o DNA é inserido em um vetor de expressão, co-mo um plasmida, na orientação devida e estrutura de leitura correta paraexpressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às seqüências de nucleó-tido apropriadas de controle regulatório transcripcional e translacional reco-nhecidas pelo hospedeiro desejado, embora esses controles estejam geral-mente disponíveis no vetor de expressão. O vetor é, então, introduzido nohospedeiro através de técnicas padrão. Geralmente, nem todos os hospedei-ros são transformados pelo vetor. Por isso, será necessário selecionar ascélulas hospedeiras transformadas. Uma técnica de seleção envolve a in-corporação no vetor de expressão de uma seqüência DNA, com quaisquerelementos de controle necessários, que codifica um traço selecionável nacélula transformada, como uma resistência antibiótica.

Alternativamente, o gene desse traço selecionável pode ser ou-tro vetor, utilizado para co-transformar a célula hospedeira desejada.

As células hospedeiras transformadas pelo DNA recombinanteda invenção são, então, cultivadas por um período de tempo suficiente e sobcondições adequadas reconhecidas pelos versados na técnica, sob o pontode vista dos ensinamentos descritos na presente invenção, permitindo a ex-pressão do polipeptídeo que pode ser, então, recuperado.

Muitos sistemas de expressão são conhecidos, incluindo bacté-rias (por exemplo E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccha-romyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo Aspergillus), célulasde plantas, células de animais e células de insetos. Preferivelmente, o sis-tema pode ser RCC ou células Awells.

Um promotor é um elemento de controle de expressão formadopor uma seqüência DNA que permite a ocorrência de transcrição e de poli-merase de RNA de ligação. As seqüências de promotor compatíveis comhospedeiros exemplarmente bacterianos são tipicamente fornecidas em ve-tores plasmida que contêm locais de restrição convenientes para inserção deum segmento DNA da presente invenção. Os plasmidas de vetor tipicamenteprocariótico são pUC18, pUC19, pBR322 e pBR329 disponíveis na BioradLaboratories, (Richmond, CA, EUA) e pTrc99A e pKK223-3 disponíveis naPharmacia, Piscataway, NJ, EUA.

Um plasmida de vetor de célula tipicamente mamífero, o pSVL,está disponível na Pharmacia, Piscataway, NJ1 EUA. Este vetor utiliza o últi-mo promotor SV40 para orientar a expressão de genes clonados, sendo omais elevado nível de expressão encontrado nas células de produção deantígeno Τ, como as células COS-1. Um exemplo de vetor induzido de ex-pressão mamífera é o pMSG, também disponível na farmácia. Este vetorutiliza o promotor induzido por glicocorticóide de repetição terminal longa dovírus do tumor mamário do rato para orientar a expressão do gene clonado.

Os vetores plasmida de levedura úteis são pRS403-406 e pRS413-416 eestão geralmente disponíveis na Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, EUA. Os plasmidas pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plas-midas integrativos de leveduras (YIps) e incorporam os marcadores de leve-dura selecionáveis HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmidas pRS413-416são plasmidas centrômero de levedura (Ycps). Outros vetores e sistemas deexpressão são bem-conhecidos na técnica para uso com uma variedade decélulas hospedeiras.

A presente invenção também se relaciona com uma célulahospedeira transformada com a construção de um vetor polinucleotídeo dapresente invenção. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica.As células bacterianas podem ser preferidas às células hospedeiras procari-óticas em determinadas circunstâncias e têm tipicamente uma estirpe de E.Coli, como por exemplo, a E. coli com estirpe DH5, disponível na BethesdaResearch Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA e RR1 disponível na Ameri-can Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, EUA (No ATCC31343). As células hospedeiras eucarióticas preferidas incluem as céíulas delevedura, insetos e mamíferos, preferivelmente células vertebradas como aslinhagens de células de rim e fibroblásticas humanas ou de macacos, rata-zanas, ratos. As células hospedeiras de levedura incluem YPH499, YPH500e YPH501 normalmente disponíveis na Stratagene Cloning Systems, La Jol-la, CA 92037, EUA. As células hospedeiras mamíferas preferidas incluemcélulas de ovário de hamster chinês (CHO) disponíveis na ATCC como C-CL61, células NIH/3T3 de embrião de rato suíço NIH disponíveis na ATCCcomo CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco disponíveis naATCC como CRL 1650 e células 293 que são células de rim embrionáriashumanas. As células de insetos preferidas são células Sf9 que podem sertransfectadas com vetores de expressão baculovírus.A transformação de células hospedeiras apropriadas com cons-trução DNA da presente invenção é obtida através de métodos reconhecidosque dependem tipicamente do tipo de vetor utilizado. No que se refere àtransformação de células procarióticas, consulte, por exemplo, Cohen et al.

(1972) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 69,2110 e Sambrook et al. (1989) Molecu-lar Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S-pring Harbor, NY. A transformação de células de levedura é descrita emSherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, NY. O método de Beggs (1978) Nature 275,104-109também é útil. No que se refere a células vertebradas, os reagentes úteis natransfecção dessas células, por exemplo, formulações de fosfato de cálcio eDEAE-dextrano ou lipossoma, estão disponíveis na Stratagene Cloning Sys-tems, or Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA. A electropo-ração também é útil na transformação e/ou transfecção de células e é bem-conhecida na técnica por transformar a células de levedura, células bacteri-anas, células de insetos e células de vertebrados.

De forma bem-sucedida, as células transformadas, isto é, célu-las que contêm uma construção DNA da presente invenção, podem ser iden-tificadas por técnicas reconhecidas. Por exemplo, células resultantes da in-trodução de uma expressão de construção da presente invenção podem sercriadas para produzir o polipeptídeo da invenção. As células podem ser co-lhidas e Iisadas e o seu conteúdo de DNA examinado quanto à presença deDNA utilizando um método como o descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol.98,503 ou Berent et al. (1985) Biotech. 3,208. Alternativamente, a presençade proteína no sobrenadante pode ser detectada utilizando anticorpos, comoabaixo descrito.

Para além de analisar diretamente a presença de DNA recom-binante, a transformação bem-sucedida pode ser confirmada através de re-conhecidos métodos imunológicos quando o DNA recombinante for capaz dedirigir a expressão da proteína. Por exemplo, células transformadas com su-cesso com um vetor de expressão produzem proteínas que apresentam an-tigenicidade adequada. Amostras de células suspeitas de serem transforma-das são colhidas e analisadas quanto à proteína utilizando anticorpos ade-quados. Desta forma, para além das próprias células hospedeiras transfor-madas, a presente invenção também contempla uma cultura dessas células,preferivelmente uma cultura monoclonal (clonalmente homogênea) ou umacultura derivada de uma cultura monoclonal, em um meio de nutriente.

Será apreciado que determinadas células hospedeiras da in-venção sejam úteis na preparação dos peptídeos da invenção, por exemplo,células bacterianas, de levedura e de insetos. No entanto, outras célulashospedeiras podem ser úteis em determinados métodos terapêuticos. Porexemplo, as células apresentadoras de antígeno, como as células dendríti-cas, podem ser vantajosamente usadas para expressar os peptídeos da in-venção, de forma que possam ser carregadas nas moléculas MHC adequa-das.

Um outro aspecto da invenção fornece um método de produçãode um peptídeo para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.),injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular(i.m.). As formas preferidas de injeção de peptídeo são s.c., i.d., i.p., i.m. ei.v. As formas preferidas de injeção de DNA são i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Po-dem ser administradas doses de 1 a 500 mg de peptídeo ou DNA.

Um outro aspecto da invenção relaciona o uso de um peptídeoassociado a tumor de acordo com a invenção, um ácido nucléico de acordocom a invenção ou um vetor de expressão de acordo com a invenção namedicina.

Um outro aspecto da invenção fornece um método de elimina-ção de células-alvo em um paciente cujas células-alvo expressam de formaaberrante um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidosda invenção, sendo que o método compreende a administração, ao paciente,de uma quantidade eficaz de um peptídeo de acordo com a invenção ouuma quantidade eficaz de um polinucleotídeo ou um vetor de expressão quecodifique um referido peptídeo, sendo que a quantidade do referido peptídeoou do referido polinucleotídeo ou do referido vetor de expressão é eficaz pa-ra provocar uma resposta imunológica anti células-alvo no referido paciente.A célula-alvo é tipicamente uma célula tumoral ou cancerígena.

O peptídeo ou o ácido nucléico codificador de peptídeos consti-tui um tumor ou uma vacina para o câncer. Pode ser administrado direta-mente no paciente, no órgão afetado ou sistemicamente ou aplicado ex vivoàs células que derivam do paciente ou de uma linhagem de célula humanaque são subseqüentemente administradas ao paciente ou utilizadas in vitropara selecionar uma subpopulação de células imunológicas derivadas dopaciente, que, em seguida, são re-administradas no mesmo. Se o ácido nu-cléico for administrado às células in vitro, este pode ser útil para as célulasserem transfectadas de forma a co-expressarem citocinas estimuladoras deresposta imunológica, como a interleucina 2. O peptídeo pode ser substanci-almente puro ou combinado com adjuvantes estimuladores de resposta imu-nológica, como o Detox ou utilizado em combinação com citocinas estimula-tórias de resposta imunológica ou ser aplicado através de um sistema ade-quado, por exemplo, lipossomas. O peptídeo também pode ser conjugadocom um veículo adequado como KLH ou mannan (ver WO 95/18145 e Lon-genecker et al. (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). O peptídeo tambémpode ser direcionado ou ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida.Espera-se que os peptídeos cuja seqüência é fornecida na presente inven-ção estimulem CTL CD4. Contudo, a estimulação é mais eficaz com a ajudade células T CD4+. Assim, os parceiros ou seções de fusão de uma molécu-la híbrida fornecem adequadamente epítopos que estimulam as células TCD4+. Os epítopos estimuladores de CD4+ são bem-conhecidos na técnicae incluem os que se encontram identificados no toxóide tetânico. O polinu-cleotídeo pode ser substancialmente puro ou estar contido em um vetor ouem um sistema de aplicação adequado.

Os vetores e sistemas de aplicação adequados incluem o viral,tais como sistemas baseados em adenovírus, vírus vaccinia, retrovírus, vírusda herpes, vírus adenoassociado ou vírus híbridos que contenham elemen-tos de mais de um vírus. Os sistemas de aplicação não virais incluem lipídioscatiônicos e polímeros catiônicos, como é bem-conhecidos na técnica deaplicação de DNA. A aplicação física, por exemplo, através do método "ge-ne-gun" também pode ser usada. O peptídeo ou peptídeo codificado peloácido nucléico pode ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epíto-po que estimula ás células T CD4+.

O peptídeo utilizado em uma vacina para o câncer pode serqualquer peptídeo adequado. Particularmente, pode ser um peptídeo 9 me-ros adequado ou um peptídeo 7 meros ou 8 meros ou 10 meros ou 11 merosadequado ou 12 meros. Os peptídeos mais longos também podem ser ade-quados, mas preferem-se os peptídeos 9 meros ou 10 meros, como descritona tabela 1 anexa.

Apropriadamente, qualquer ácido nucléico administrado ao pa-ciente é estéril e isento de pirogênio. O DNA nú pode ser administrado porvia intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Os peptídeos podem ser ad-ministrados por via intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intravenosaou subcutânea (ver também acima o método de produção de um peptídeo).Preferencialmente, os peptídeos como componentes farmacêuticos ativossão administrados em conjunto com um adjuvante como, por exemplo, o IL-2, o IL-12, o GM-CSF, o adjuvante incompleto de Freund, o adjuvante com-pleto de Freund ou as formulações lipossomais. Os adjuvantes de maior pre-ferência podem ser encontrados em, por exemplo, Brinkman JA, Fausch SC,Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for câncer immunotherapy.Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb;4(2):181 -98.

Os resultados de vacinação nas respostas de CTL estimuladospor células que apresentam antígenos profissionais; uma vez que os CTLsão preparados, estes podem ser uma vantagem no aumento da expressãode MHC nas células tumorais.

Também pode ser útil direcionar a vacina para populações decélulas específicas, por exemplo, células que apresentem antígenos, queratravés de injeção, utilizando vetores de direcionamento e sistemas de apli-cação ou purificação seletiva de uma determinada população de células dopaciente e a administração ex vivo de peptídeos ou ácido nucléico (por e-xemplo, as células dendríticas podem ser classificadas como descrito emZhou et al. (1995) Blood 86,3295-3301; Roth et al. (1996) Scand. J. Immuno-Iogy 43,646-651). Por exemplo, os vetores de direcionamento podem incluirum promotor específico de tumor ou de tecido que dirige a expressão do an-tígeno em um local adequado.

Um outro aspecto da invenção proporciona, portanto, uma va-cina eficaz contra o câncer ou células tumorais ou cancerígenas, incluindouma quantidade eficaz de um peptídeo de acordo com a invenção ou inclu-indo um ácido nucléico que codifica esse peptídeo. Também é preferível quea vacina seja uma vacina de ácido nucléico. Sabe-se que a inoculação comuma vacina de ácido nucléico, como uma vacina de DNA, que codifica umpolipeptídeo leva a uma resposta de célula T. É ainda preferível uma vacinaque inclua um peptídeo ou peptídeos (sintético(s)) (isto é, quer sozinho ouem combinações de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, 11 ou ainda mais peptídeos, ver tam-bém mais abaixo).

Convenientemente, a vacina de ácido nucléico pode incluirqualquer meio adequado de aplicação de ácido nucléico. O ácido nucléico,preferivelmente DNA, pode estar nú (isto é, substancialmente sem outroscomponentes a serem administrados) ou pode ser administrado em um Ii-possoma ou como parte de um sistema de aplicação de vetor viral.

Acredita-se que a absorção do ácido nucléico e a expressão dopolipeptídeo codificado pelas células dendríticas pode ser o mecanismo depreparação da resposta imunológica; contudo as células dendríticas não po-dem ser transfectadas sendo, ainda assim, importantes uma vez que detec-tam os peptídeos expressos a partir das células transfectadas no tecido.

É preferível que a vacina, como a vacina de DNA, seja adminis-trada no músculo. Também é preferível que a vacina seja administrada napele. A vacina de ácido nucléico pode ser administrada sem adjuvantes. Avacina de ácido nucléico também pode ser administrada com um adjuvantecomo BCG ou alúmen. Outros adjuvantes adequados incluem um estímulode QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA) derivado de sapo-nina, extratos micobacterianos e mímicos de parede celular bacteriana sinté-tica e adjuvantes de propriedade como Detox da Ribi. Quil A, outro adjuvantederivado de saponina, também pode ser utilizado (Superfos, Dinamarca). Épreferível que a vacina de ácido nucléico seja administrada sem adjuvantes.Outros adjuvantes como os de Freud também podem ser úteis. Tambémpode ser útil fornecer o peptídeo conjugado com KLH, de preferência tam-bém com um adjuvante.

A terapia de imunização do câncer mediada por polinucleótidosé descrita em Conry et al. (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condonet al. (1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al. (1997) Nature Medi-cine 3,558-561; Zhai et al. (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al.(1996) Int J. Câncer 65,664-670; and Burchell et al. (1996) pp 309-313 em:Breast Câncer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al. (eds),John Libbey Eurotext, todos incorporados no presente para referência narespectiva integralidade.

Um outro aspecto da presente invenção proporciona a utiliza-ção de um peptídeo de acordo com a invenção, de um vetor polinucleotídeoou de expressão que codifica um peptídeo semelhante, na produção de ummedicamento para eliminar células-alvo em um paciente cujas células-alvoexpressam de forma aberrante um polipeptídeo que compreende uma se-qüência de aminoácidos da invenção.

Um outro aspecto da invenção presente proporciona a utiliza-ção de um peptídeo de acordo com a invenção, ou de um vetor polinucleotl·deo ou de expressão que codifica esse peptídeo, para a produção de ummedicamento para indução de uma resposta imunológica face a células detumores sólidos cujas células expressam uma molécula MHC de classe Ilhumana na respectiva superfície e apresentam um polipeptídeo que com-preende uma seqüência de aminoácidos da invenção. Foi surpreendente-mente descoberto, no contexto da presente invenção, que as células tumo-rais de tumores sólidos, ao contrário das células saudáveis do mesmo teci-do, expressam a molécula HLA de classe Il humana na respectiva superfície.

Um outro aspecto da invenção proporciona um método para aprodução de linfócitos T citotóxicos ativados (CTL) in vivo ou in vitro, sendoque o método inclui o contato in vitro de CTL com moléculas MHC humanasde classe Il carregadas com antígeno expressas na superfície de célulasapresentadoras de antígeno adequadas durante um período de tempo sufi-ciente para ativar, de uma forma específica do antígeno, as ditas CTL onde oantígeno é um peptídeo de acordo com a presente invenção.

Adequadamente, os CTL são compostos por células helperCD4+, preferencialmente de tipo TH1. As moléculas MHC de classe Il po-dem ser expressas na superfície de qualquer célula adequada e é preferívelque a célula não expresse naturalmente moléculas MHC de classe Il (casoem que a célula é transfectada para expressar tal molécula) ou, se ela ex-pressar, ela será imperfeita nas rotas de processamento de antígeno ou a-presentadoras de antígeno. Desta forma, é possibilitado à célula expressar amolécula MHC de classe Il a ser preparada substancial e completamentecom um determinado antígeno de peptídeo antes de ativar os CTL.

A célula apresentadora de antígeno (ou célula estimuladora)tem, tipicamente, uma molécula MHC de classe Il na sua superfície e, prefe-rencialmente, é substancialmente incapaz de carregar por si mesma umamolécula MHC de classe Il com o antígeno selecionado. Como é descritomais pormenorizadamente abaixo, a molécula MHC de classe Il pode sercarregada imediatamente com o antígeno selecionado in vitro.

Preferencialmente, a célula mamífera não tem ou apresenta umnível reduzido ou tem uma função reduzida do transportador de peptídeosTAP. As células adequadas que não têm um transportador de peptídeo TAPincluem células T2, RMA-S e Drosophila. TAP é o transportador associadocom processamento de antígeno.

A linhagem de células T2 humana deficiente de carregamentode peptídeos humanos está disponível a partir da American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA no Catá-logo nQ CRL 1992; a linhagem 2 Schneider de linhagem de célula Drosophilaestá disponível a partir da ATCC no Catálogo ns CRL 19863; a linhagem decélulas RMA-S de rato está descrita em Karre e Ljunggren (1985) J. Exp.Med. 162,1745.

A célula hospedeira convenientemente mencionada antes datransfecção expressa substancialmente a inexistência de quaisquer molécu-las MHC de classe I. Também é preferível se a célula estimuladora expres-sar uma molécula importante para co-estimulação de célula T, como B7.1,B7.2, ICAM-1 e LFA 3.

As seqüências ácidas nucleicas de numerosas moléculas MHCde classe II e de outras moléculas co-estimuladoras estão publicamente dis-poníveis a partir das bases de dados GenBank e EMBL.

Em uma outra modalidade, as combinações de moléculas HLAtambém podem ser utilizadas, tais como, por exemplo, moléculas MHC declasse Il como descrito nas tabelas AeB incorporadas no presente. A utili-zação de vacinas poliepítopos recombinantes para a aplicação de múltiplosepítopos CD8+ CTL como descrito em Thomson et al. (1996) J. Immunol.157, 822-826 e WO 96/03144, ambos incorporados no presente para refe-rência. Relativamente à presente invenção, poderá ser desejável incluir emuma única vacina um peptídeo (ou ácido nucléico de codificação de peptí-deo) em que o peptídeo inclui, por qualquer ordem, uma seqüência de ami-noácidos da presente invenção e outro epítopo de estimulação de células TCD8+. Uma vacina deste tipo seria particularmente útil no tratamento decâncer. Este tipo de vacinas "bead-on-a-string" são tipicamente vacinas deDNA. O desencadeamento simultâneo de uma resposta imunológica depen-dente de MHC de classe Il juntamente com uma resposta imunológica de-pendente de MHC de classe I tem a vantagem de conduzir a uma reação decélulas T de tipo TH1 local de células T CD4+, em que as células T CD8+dependentes de MHC de classe I são suportadas.

Podem ser utilizados vários outros métodos para criação deCTL in vitro. Por exemplo, os métodos descritos em Peoples et al. (1995)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92,432-436 e Kawakami et al. (1992) J. Immunol.148,638643 utilizam linfócitos autólogos de infiltração de tumor na criação deCTL. Plebanski et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25,1783-1787 utiliza linfócitosautólogos do sangue periférico (PLBs) na preparação de CTL. Jochmus etal. (1997) J. Gen. Virol. 78,1689-1695 descreve a produção de CTL autólo-gos por utilização de células dendríticas por impulsos com peptídeos ou po-lipeptídeos, ou através de infecção com vírus recombinante. Hill et al. (1995)J. Exp. Med. 181,2221-2228 e Jerome et al. (1993) J. Immunol. 151,1654-1662 utilizam células B na produção de CTL autólogos. Para além disso, osmacrófagos pulsados com peptídeos ou polipeptídeos ou infectados comvírus recombinante podem ser utilizados na preparação de CTL autólogos.

S. Walter et al.. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, BuhringHJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity ofhuman CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated micros-pheres. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8) descreve a preparação invitro de células T utilizando células que apresentem antígeno artificial, umaforma também adequada para gerar células T contra o peptídeo de escolha.

As células alogênicas também podem ser utilizadas na prepa-ração de CTL e este método é descrito detalhadamente no WO 97/26328incorporado no presente para referência. Por exemplo, para além das célu-las Drosophila e T2, podem ser utilizadas outras células nos antígenos apre-sentados como células CHO, células de insetos infectados com baculovírus,bactérias, levedura, células-alvo infectadas com vacina. Para além disso,podem ser utilizados vírus de plantas (ver, por exemplo, Porta et al. (1994)Virologia 202, 449-955 que descreve o desenvolvimento de vírus do mosaicodo feijão-frade como um sistema de elevada submissão para a apresentaçãode peptídeos estrangeiros.

Os CTL ativados que estão direcionados contra os peptídeosda invenção são úteis durante a terapia. Por conseguinte, um outro aspectoda invenção proporciona CTL ativados passíveis de serem obtidos atravésdos métodos precedentes da invenção.

Um outro aspecto da invenção proporciona CTLs ativados quereconhecem seletivamente uma célula que expressa de forma aberrante umpolipeptídeo que inclua uma seqüência de aminoácidos da invenção. Prefe-rencialmente, os CTL reconhecem a célula mencionada interagindo com ocomplexo HLA/peptídeo (por exemplo, ligação). Os CTL são úteis em ummétodo de eliminação de células-alvo em um paciente cujas células-alvoexpressam de forma aberrante um polipeptídeo que compreende uma se-qüência de aminoácidos da invenção em que é administrado ao paciente umnúmero eficaz de CTL ativados. Os CTL administrados ao paciente podemderivar do paciente e ser ativados como descrito abaixo (isto é, são CTL au-tólogos). Em alternativa, os CTL não são do paciente mas de outro indivíduo.Claro que é preferível que o indivíduo seja saudável. Por "indivíduo saudá-vel" os inventores entendem que o indivíduo está normalmente de boa saú-de, que tem um sistema imunitário competente e, preferencialmente, nãosofre de qualquer doença que possa ser rapidamente examinada e detectada.

Os CTL ativados expressam um receptor de célula T (TCR) en-volvido no reconhecimento de células que expressam o polipeptídeo anor-mal. É útil no caso do cDNA que codifica o TCR ter sido clonado a partir dosCTL ativados e transferido para outros CTL para expressão.

In vivo, as células-alvo para os CTL CD4+ de acordo com a in-venção presente podem ser células do tumor (que expressam algumas ve-zes MHC de classe II) e/ou células estromais que circundam o tumor (célulastumorais) (que também exprimem algumas vezes MHC de classe II).

Os TCRs de clones CTL da invenção específica para os peptí-deos da invenção são clonados. A utilização de TCR em clones de CTL édeterminada através de (i) anticorpos monoclonais específicos de região va-riável TCR (ii) RT PCR com iniciadores específicos para famílias de genesVa e Vp. É preparada uma biblioteca cDNA a partir de poli-A mRNA extraídode clones de CTL. São utilizados os iniciadores específicos da porção C-terminal do TCR a e as cadeias P e para a porção N-terminal dos segmentosVa e P identificados. O cDNA completo para o TCR a e cadeia é amplificadopor uma polimerase de DNA de alta fidelidade e os produtos amplificadossão clonados para um vetor de clonagem adequado. Os genes de cadeia a eP podem ser reunidos em uma única cadeia TCR pelo método descrito porChung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 12654-12658. Nestaconstruto de cadeia única, o segmento VaJ é seguido pelo segmento V DJ,seguido do segmento Cp, seguido do segmento transmembrano e citoplas-mático da cadeia CD3. Esta única cadeia TCR é, em seguida, introduzidaem um vetor de expressão retroviral (pode ser utilizado um painel de vetorestendo em consideração a respectiva capacidade para infectar linfócitos TCD8+ humanos desenvolvidos e para mediar a expressão de genes: o sis-tema de vetor retroviral Kat é umas das possibilidades preferidas (ver Fineret al. (1994) Blood 83,43). São utilizados retrovírus de elevada titragem anfo-trófica para infectar linfócitos T purificados CD8+ ou CD4+ T isolados dosangue periférico de pacientes com tumor (segundo um protocolo publicadopor Roberts et al. (1994) Blood 84,2878-2889, incorporado no presente parareferência). Os anticorpos anti-CD3 são utilizados para desencadear umaproliferação de células CD8+ T purificadas, que facilitam a integração retrovi-ral e a expressão estável de uma única cadeia de TCRs. A eficiência detransdução retroviral é determinada pela marcação das células T CD8+ in-fectadas com anticorpos específicos para o TCR de cadeia única. A análisein vitro de células T CD8+ convertidas estabelece o mesmo nível de elimina-ção específico de tumor como demonstrado pelo clone CTL de alo restrito apartir do qual as cadeias TCR foram clonadas. As populações de células TCD8+ convertidas com a especificidade esperadas podem ser utilizadas pa-ra imunoterapia adotiva dos pacientes com tumor. Os pacientes podem sertratados com CTL entre 108 a 1011 autólogos e convertidos. Analogamenteàs células CD8+, podem ser criadas células T-helper CD4+ convertidas comconstruções relacionadas.

Outros sistemas adequados de introdução de genes nos CTLsão descritos em Moritz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 4318-4322, incorporados no presente para referência. Eshhar et al. (1993) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90, 720-724 e Hwu et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 também descrevem a transfecção dos CTL. Assim, um outro aspecto dainvenção proporciona um TCR que reconhece uma célula que expressa deforma aberrante um polipeptídeo incluindo uma seqüência de aminoácidosda invenção, sendo o TCR obtido através de CTL ativados.

Para além do TCR, estão incluídas na invenção moléculas fun-cionalmente equivalentes ao TCR. Estas incluem qualquer molécula que éfuncionalmente equivalente a um TCR, que pode desempenhar a mesmafunção que um TCR. Em particular, estas moléculas incluem três domínios,concebidos geneticamente, de cadeias únicas de TCRs, concebidas pelométodo descrito por Chung et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91,12654-12658, incorporado no presente para referência e mencionado acima.A invenção também inclui um polinucleotídeo que codifica o TCR ou a molé-cuia funcionalmente equivalente e um vetor de expressão que codifica oTCR ou a molécula funcionalmente equivalente ao mesmo. Os vetores deexpressão que são adequados para expressar o TCR da invenção incluemaqueles que foram descritos acima, referentes à expressão dos peptídeos dainvenção.

Contudo, é preferível que os vetores de expressão sejam aque-les que estão disponíveis para expressar o TCR em uma próxima transfec-ção de CTL.

Um outro aspecto da invenção proporciona um método de eli-minação de células-alvo em um paciente cujas células-alvo expressam deforma aberrante um polipeptídeo incluindo uma seqüência de aminoácidosda invenção, o método inclui as etapas de (1) obtenção de CTL do paciente;(2) introdução nas células mencionadas de um polinucleotídeo que codificaum TCR ou uma molécula funcionalmente equivalente, como definido acima;e de (3) introdução no paciente das células produzidas no passo (2).

Ainda um outro aspecto da invenção proporciona um métodode eliminação de células-alvo èm um paciente cujas células-alvo expressamde forma aberrante um polipeptídeo, incluindo uma seqüência de aminoáci-dos como definida no primeiro, segundo ou terceiro aspecto da invenção, ométodo inclui as etapas de (1) obtenção de células que apresentam antíge-nos, como as células dendríticas, do paciente mencionado; (2) contato comas referidas células que apresentam os antígenos com um peptídeo comodefinido no primeiro, segundo ou terceiro aspecto da invenção ou com umpolinucleotídeo que codifica um peptídeo, ex vivo; e (3) reintrodução no pa-ciente das assim designadas células que apresentam antígenos.

Preferencialmente, as células que apresentam antígenos sãoas células dendríticas. Adequadamente, as células dendríticas são célulasdendríticas pulsadas com um peptídeo antigênico. O peptídeo antigênicopode ser qualquer peptídeo antigênico adequável que origina uma respostaapropriada das células Τ. A terapia de células T que utilizam células dendrí-ticas autólogas pulsadas com peptídeos a partir de um antígeno associado aum tumor está revelada em (1996) The Prostate 29,371-380 and Tjua et al.(1997) The Prostate 32, 272-278.

Em uma outra modalidade, as células que apresentam antíge-nos, tais como células dendríticas, são postas em contato com um polinucle-otídeo que codifica um peptídeo da invenção. O polinucleotídeo pode serqualquer polinucleotídeo adequado e é preferível que seja capaz de conver-ter as células dendríticas resultando, desta forma, na apresentação de umpeptídeo e indução de imunidade.

Convenientemente, o polinucleotídeo pode ser compreendidoem um vírus ou polinucleotídeo viral. Por exemplo, as células dendríticas deconversão de adenovírus têm sido apresentadas para induzir imunidade anti-tumoral específica de antígeno em relação a MUC1 (ver Gong et al. (1997)Gene Ther. 4,1023-1028). Da mesma forma, podem ser utilizados sistemascom base em adenovírus (ver, por exemplo, Wan et al. (1997) Hum. GeneTher. 8, 1355-1363); podem ser utilizados sistemas retrovirais (Specht et al.(1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 and Szabolcs et al. (1997) A transferên-cia de partículas mediadas de sangue para células dendríticas também pode- ser utilizada (Tuting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707) e RNAtambém pode ser utilizado (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 11771182).

Será apreciado que, relativamente aos métodos de eliminaçãode células-alvo em um paciente, é particularmente preferível que as células-alvo sejam células cancerígenas, preferencialmente células renais ou decâncer do cólon.

É particularmente preferido se os pacientes que são tratadosatravés de métodos de invenção têm o haplótipo HLA-DR. Por conseguinte,em uma modalidade preferida, o haplótipo HLA do paciente é determinadopreviamente ao tratamento. O haplótipo de HLA pode ser realizado, utilizan-do qualquer método adequável; tais métodos são bem-conhecidos na técni-ca.

A invenção inclui, particularmente, a utilização de peptídeos dainvenção (ou os polinucleótidos que os codificam) para vacinação ativa invivo; para manipulação de células dendríticas autólogas in vitro seguidas deintrodução das células dendríticas manipuladas in vivo para ativar respostasdos CTL; para ativar CTL autólogos in vitro seguido de terapia adotiva (istoé, os CTL manipulados são introduzidos no paciente); e para ativar os CTLde doadores saudáveis (correspondentes MHC ou não) ill vitro seguido deterapia adotiva.

- Em uma modalidade preferida, as vacinas da presente inven-ção são administradas em um hospedeiro individualmente ou em combina-ção com outra terapia de câncer para inibir ou suprimir a formação de tumores.

A vacina de peptídeos pode ser administrada sem adjuvantes.A vacina de peptídeos também pode ser administrada com um adjuvantecomo BCG ou alúmen. Outros adjuvantes adequados incluem um estímulode QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA) derivado de sapo-nina, extratos micobacterianos e mímicos de parede celular bacteriana sinté-tica e adjuvantes de propriedade como Detox da Ribi. Quil A, outro adjuvantederivado de saponina, também pode ser utilizado (Superfos, Dinamarca).Também podem ser úteis outros adjuvantes como os oligonucleotídeos CpG,RNA estabilizados, Imiquimod (comercialmente disponíveis sob o nome Al-dara® da 3M Pharma, EUA), adjuvante de Freund incompleto (comercial-mente disponível como Montanide ISA-51 da Seppic S.A., Paris, França),formulações Iipossomais ou GM-CSF. Também pode ser útil fornecer o pep-tídeo conjugado com KLH, de preferência também com um adjuvante.

Os peptídeos de acordo com a invenção também podem serusados como reagentes de diagnóstico. Ao utilizar peptídeos, pode ser ana-lisado se em uma população CTL, os CTLs estão presentes, estando especi-ficamente direcionados contra um peptídeo ou sendo induzidos por uma te-rapia. Além disso, o aumento das células T precursoras pode ser testadocom esses peptídeos que têm reatividade contra o peptídeo definido. Alémdisso, o peptídeo pode ser utilizado como marcador para controlar a pro-gressão da doença de um tumor que expresse o referido antígeno do qual opeptídeo é derivado.

Na tabela 1 anexa, os peptídeos são listados e identificados.

Além disso, na tabela são designadas as proteínas a partir das quais o pep-tídeo é derivado e a respectiva posição do peptídeo na respectiva proteína.Além disso, são fornecidos os respectivos números de acesso ao Genbankdo "Centro nacional de informação biotecnológica" do Instituto nacional desaúde (ver http: www.ncbi.nlm.nih.gov).

Em outra modalidade preferencial, os peptídeos são usadospara marcar leucócitos, em particular linfócitos T. Este tipo de utilização temvantagens se for comprovado que em uma população CTL estão presentesCTLs específicos que são direcionados contra um peptídeo. Além disso, opeptídeo pode ser utilizado como marcador para determinar a progressão deuma terapia em uma doença ou distúrbio tumoral.

Em outra modalidade preferida, os peptídeos são usados paraa produção de anticorpos. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos deforma padrão por imunização de animais através da injeção do peptídeo esubseqüente purificação da globulina imunológica. Os anticorpos monoclo-nais podem ser produzidos de acordo com os protocolos padrão, conformedescrito, por exemplo, em Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma tech-nology and monoclonal antibodies.

A invenção em um outro aspecto refere-se a uma composiçãofarmacêutica que contém um ou mais dos peptídeos mencionados de acordocom a invenção. Esta composição é usada para administração parenteral,como a administração subcutânea, intradérmica, intramuscular ou oral. Paratal, os peptídeos são dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuti-camente aceitável, de preferência aquoso. Além disso, a composição podeconter excipientes, tais como tampões, agentes de ligação, agentes blasto-gênicos, diluentes, aromatizantes, lubrificantes, etc. Os peptídeos tambémpodem ser administrados juntamente com substâncias estimulantes imuno-lógicas, tais como citocinas. Pode encontrar uma extensa lista de excipien-tes, que pode ser usada nesta composição, em, por exemplo, A. Kibbe,Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3§ ed., 2000, American Pharmaceu-tieal Association e imprensa farmacêutica. A composição pode ser usadapara prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças tumorais.

A preparação farmacêutica que contém, pelo menos, um dospeptídeos da presente invenção e que compreende qualquer uma das se-qüências entre Seq. id no. 1 e Seq. id no. 49 é administrada a um pacienteque sofre de uma doença tumoral associada ao respectivo peptídeo ou antí-geno. Através deste procedimento, pode ser desencadeada uma respostaimunológica específica de CTL.

Em outro aspecto da presente invenção, pode ser usada comovacina uma combinação de dois ou vários peptídeos de acordo com a pre-sente invenção, em combinação direta ou no mesmo regime de tratamento.

Além disso, podem ser usadas combinações com outros peptídeos, por e-xemplo, peptídeos específicos MHC de classe II. A pessoa versada na técni-ca poderá selecionar as combinações preferidas de peptídeos imunogênicosatravés da realização de testes, por exemplo, à criação de células T in vitro erespectiva eficácia e presença geral, à proliferação, afinidade e expansão dedeterminadas células T para determinados peptídeos e à funcionalidade dascélulas T, por exemplo, analisando a produção de IFN-γ (ver também os e-xemplos abaixo), IL-12 ou perforina. Geralmente, os peptídeos mais eficien-tes são então combinados como uma vacina para a finalidade descrita emcima.

Uma vacina adequada irá conter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14 ou 15 peptídeos diferentes, de preferência 4, 5, 6 ou 7 peptídeosdiferentes, e com mais preferência 6 peptídeos diferentes.

Finalmente, a vacina pode ser dependente do tipo específicode câncer que o paciente a ser tratado está a sofrer, assim como do estadodas doenças, os tipos de tratamento anteriores, o estado imunitário do paci-ente e, claro, o haplótipo HLA do paciente.

Foi demonstrado que os 80 aminoácidos de Li de N-terminalsão suficientes para direcionar as proteínas para a rota de processamentoda classe Il (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl.Acad. Sei. U. S. A 92, 7217-7221, Wang1 R. F., Wang1 X., Atwood, A. C., To-palian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354).

A identificação dos epítopos de células T-helper dos antígenosassociados ao tumor permanece uma tarefa importante na imunoterapia anti-tumoral. Aqui os inventores apresentam um método geralmente aplicável eos peptídeos que derivaram de análises diferenciais de peptídeos efetuadaspor MS para identificar Iigantes MHC de classe Il de antígenos associadosao tumor, naturalmente processados e apresentados. Esta abordagem com-bina pela primeira vez um passo de transfecção das APC com um vetor queefetua a codificação para uma proteína de fusão entre a cadeia Ii e o Ag deinteresse, a purificação dos peptídeos com ligação aos HLA e a identificaçãopor MS dos peptídeos derivados do Ag apresentados pelo transfectante a-través da comparação com células não transfectadas. Além disso, os inven-tores podem validar o método ao apresentarem as células T induzidas contrao peptídeo identificado, reconhece especialmente transfectantes que ex-pressam em demasia o AG da mesma origem. Apesar dos peptídeos identi-ficados ainda terem de ser testados quanto à sua imunogenicidade in vivo, anossa abordagem conduz à caracterização exata dos Iigantes MHC de clas-se Il naturalmente processados. Assim, os inventores evitam testar, quer ospeptídeos sobrepostos sintéticos dos antígenos associados ao tumor, quer aextensa variedade de peptídeos selecionados pela predição dos epítopos,que é menos precisa quando comparada com a predição dos epítopos clas-se I. Em oposição aos árduos ensaios de células T, que podem conduzir àidentificação de epítopos crípticos de células T incapazes de induzir a ativa-ção in vivo de células T {ADDIN}, o estudo pode ser direcionado para ospoucos peptídeos que são encontrados, de modo a serem apresentados.Além disso, a utilização deste método não é necessário para produzir o Agrecombinante ou para controlar as linhagens de células de tumores de ex-pressão do Ag, de modo a provar que os peptídeos são naturalmente pro-cessados.

Os inventores utilizaram o N-terminal de Γ para direcionar ostumores associados a antígenos, para o compartimento de processamentode classe II de células B transformadas por EBV. Para alcançar isto, os in-ventores construíram um vetor versátil com o qual podemos expressar qual-quer antígeno, como uma proteína de fusão com II e a qual nos ajuda a de-terminar o nível de expressão da proteína nas células transfectadas por aná-lise Western blot. Já foi demonstrado que o N-terminal de II é suficiente paradirecionar proteínas para o compartimento de processamento de classe II.Mas até agora, isto só foi descrito em um modelo que utilizava ovalbumina(Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A 92, 7217-7221), de modo a identificar o Ag desconhecido, utilizando biblio-tecas de cDNA da codificação de proteínas de fusão (Sanderson, S., Frau-wirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 92, 7217-7221)ou para confirmar a especificidade dos clones das células T conhecidas(Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S.A 92, 7217-7221). Segundo o conhecimento dos inventores este métodonunca havia sido utilizado para identificar peptídeos de ligação de MHC declasse II de antígenos associados a tumores conhecidos, naturalmente apre-sentados. A análise diferencial de ligantes classe II de células transfectadase não transfectadas por MALDI-MS e a caracterização adicional de peptí-deos expressos de forma diferente pelos resultados ESI-MS em um métodoobjetivo para identificação de Iigantes dè classe II de antígenos de interesse.A transfecção de células com proteínas de fusão de queratina 18 provou queo método dos inventores é geralmente aplicável a antígenos de interesse,mais uma vez, os inventores foram capazes de descrever um peptídeo exis-tente em HLA-DR a partir de um transgene modelo, a queratina 18.

A identificação dos epítopos de células T-helper dos TAA per-manece uma tarefa importante na imunoterapia antitumoral. Até ao momen-to, foram aplicadas várias estratégias para identificação de peptídeos TAAde classe II, variando desde a incubação de APCs com o antígeno de inte-resse para permitir a sua absorção e processamento (Chaux, P., V. Van-tomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont,T. Boon, and B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopespresented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med.189:767-778), a várias estratégias de transfecção com proteínas de fusão(DengjeI1J., P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend1 T. Weinschenk, H.G.Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processedcyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class Il targetingand differential mass spectrometry. Eur.J.lmmunol. 34:3644-3651). Todosestes métodos são demorados e, muitas vezes, permanece a dúvida, se osIigantes dos HLA são realmente apresentados in vivo pelo tecido humano.

Os inventores podem mostrar pela primeira vez, que é possível isolar Iigan-tes de HLA de classe Il diretamente a partir de tumores sólidos dissecados,identificando, assim, os peptídeos que são apresentados pelos tumores epelo tecido in vivo circundante, que podem, deste modo, ser reconhecidospelas células T ao conterem o receptor da célula T adequado e o qual ex-pressa simultaneamente o Iigantes CD4 co-estimulador na superfície da cé-lula respectiva. Entre o funcionamento das proteínas como uma fonte de Ii-gantes HLA de classe Il processados de forma endógena, foram identifica-das muitas proteínas de manutenção (housekeeping) e relevantes a nívelimunitário. Contudo, os peptídeos dos TAA também podem ser detectados,conduzindo a uma abordagem objetiva de modo a identificar Iigantes in vivoTAA de classe Il relevantes.

Os inventores identificaram três Iigantes responsáveis por umaseqüência central do IGFBP3 e de um Iigante de MMP7. Os inventores des-cobriram que estas proteínas se encontravam sobreexpressas em carcino-mas de células renais, para além disso, foram descritas como associadas atumores (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh,K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteina-se-7 facilitates insulin-like growth fator bioavailability through its proteinaseactivity on insulin-like growth fator binding protein 3. Câncer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E.Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression ofmatrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol.Rep. 10:567-570; Cheung, C.W., D.A. Vesey, D.L. Nicol, and D.W. Johnson.2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule,and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65:1272-1279). Estespeptídeos ligam-se promiscuamente a moléculas HLA de classe Il e conse-guem ativar células T, CD4+ de diferentes doadores saudáveis. Assim, aabordagem dos inventores será útil na identificação de novos candidatos depeptídeos TAA de classe Il para utilização em protocolos de vacinação clíni-ca.

A invenção em uma perspectiva mais avançada refere-se a ummétodo de eliminação de células-alvo em um paciente, as quais expressamum polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos comodescrito neste documento, sendo que o método compreende a administra-ção no paciente de uma quantidade eficaz de um peptídeo ou de um ácidonucléico ou de um vetor de expressão de acordo com a presente invenção,onde a quantidade do peptídeo ou do ácido nucléico ou do vetor de expres-são mencionados provoca, no dito paciente, uma resposta imunológica daanticélula alvo.

A invenção, em uma perspectiva mais avançada, refere-se aum método de eliminação de células-alvo em um paciente, cujas células-alvoexpressam um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoáci-dos de acordo com a presente invenção, sendo que o método engloba aadministração de um número eficaz de linfócitos T citotóxicos (CTL) comodefinido na presente invenção.

A invenção, em uma perspectiva mais avançada, refere-se aum método de eliminação de células-alvo em um paciente, as quais expres-sam um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos emconformidade com a presente invenção, sendo que o método engloba asetapas de: (1) obtenção de linfócitos T citotóxicos (CTL) do paciente, (2) in-trodução nas ditas células de um ácido nucléico que codifica um receptor decélulas T (TCR), ou uma molécula que tenha a mesma função, como defini-do em concordância com a presente invenção e (3) introdução no pacientedas células produzidas no passo (2).

As células-alvo são, de preferência, células cancerígenas. Maisconcretamente, diga-se que o câncer é leucemia ou um Iinfoma que expres-sa o polipeptídeo que contém uma seqüência de aminoácidos fornecida deacordo com a presente invenção.

Foi surpreendentemente descoberto, no contexto da presenteinvenção, que as células tumorais de tumores sólidos, ao contrário das célu-las saudáveis do mesmo tecido, expressam a molécula HLA de classe Ilhumana na respectiva superfície. Este fato foi descrito apenas uma vez porBrasanac et al. (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, MullerGA1 Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class Il antigens andtumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation withclinicai and histopathological data. Neoplasma. 1999;46(3): 173-8.), onde asseções de criostato de 37 carcinomas de células renais (RCC) - 25 tipos decélulas claras, 10 granulares e 2 cromofóbicas—foram estudadas através dométodo de imunoperoxidase indireto aplicando-se anticorpos monoclonais(MoAb) a antígenos HLA-DR, -DP e -DQ para análise de antígenos HLA declasse Il e anti-CD14, -CD3, -CD4 e -CD8 MoAb para células mononuclearesde infiltração tumoral (TIM). O número de células positivas foi estimado se-miquantitativamente e os resultados da investigação imuno-histoquímica fo-ram correlacionados com as características clínicas (idade e sexo do pacien-te, dimensão do tumor e estágio TNM) e histopatológicas (citologia, histolo-gia, grau) de RCC. Todos os RCC expressaram antígenos HLA-DR, 92 % -DQ e 73 % -DP com um nível de expressão na hierarquia DR>-DQ>-DP,mas não pôde ser estabelecida qualquer correlação estatisticamente impor-tante com nenhum dos parâmetros clínicos e histopatológicos analisados.Os monócitos eram mais abundantes do que os linfócitos T e as células TCD4+ eram em maior número do que as CD8+, considerando que os tumo-res com predominância de linfócitos T e um número aproximadamente igualde células T CD4+ e CD8+ tiveram um diâmetro médio maior. A ativaçãoinadequada de linfócitos T por células tumorais (apesar da capacidade deapresentação de antígenos) pode ser a razão para a associação de parâme-tros que indica um comportamento mais agressivo do tumor com uma ex-pressão anormal do antígeno HLA de classe Il em RCC.É necessário entender que as características da invenção co-mo reveladas e descritas neste documento podem ser utilizadas não só narespectiva combinação indicada, como também de um modo diferente, sempartir do objetivo pretendido pela presente invenção.

A invenção será agora descrita mais pormenorizadamente a-través da referência às seguintes figuras, lista de seqüências e exemplos.Os exemplos seguintes têm objetivos meramente ilustrativos, não havendo aintenção de limitar a invenção.

As Seq. id no. 1 até à SEQ ID nQ 49 mostram seqüências depeptídeos dos epítopos de células T, contendo peptídeos que são apresen-tados pela MHC de classe Il de acordo com a presente invenção.

As Seq. id no. 50 até à Seq. id no. 79 mostram seqüências depeptídeos da tabela 3.

A figura 1 apresenta a expressão das moléculas HLA de classeIl nos RCC de três pacientes. Enquanto que no tumor do paciente RCC132as células positivas dos HLA se encontravam preferencialmente na margem(A,B), os padrões de expressão de HLA de classe Il dos tumores dos pacien-tes RCC190 e RCC211 tinham um desenvolvimento mais uniforme (C,E,G)revelando uma estrutura mais papilária. A visualização dos macrófagosCD68+ (B1D1F) em seções de tecido em série ilustra uma relação regionalpróxima das células imunológicas e mononucleares de infiltração do tumor eos HLA Il que apresentam células tumorais. A incubação com IgG de ratoem vez de anticorpos específicos revelou consistente mente resultados nega-tivos de marcação (Η). A letra T assinala o tumor.

A figura 2 apresenta uma análise FACS de células T CD4+ es-pecíficas para IGFBP3169-181, MMP7247-262 e CCND1198-212. São mos-trados dot blots representativos de marcação intracelular de IFNy em oposi-ção às CD4-FITC.

A figura 3 apresenta uma ilustração esquemática de células TCD4+ produtoras de IFNy específico de antígenos detectadas em cada doa-dor e para cada um dos peptídeos. É mostrada a percentagem de células TCD4+ produtoras de IFNy para cada um dos doadores e peptídeos utilizadospara estimulação. As células foram incubadas em placas de 96 cavidades -7 cavidades por doador e por peptídeo. Os valores da caixa são os valoresconsiderados positivos: a percentagem de células T CD4+ produtoras deIFNy foi mais de duas vezes superior à do controle negativo sem o peptídeo.

Percentagens de células T CD4+ produtoras de IFNy após a estimulaçãocom peptídeos irrelevantes correlacionados com valores após a estimulaçãosem peptídeos, com exceção do doador 1 após a 3ã estimulação comIGFBP3169-181. Contudo, este efeito deixou de ser observado após a 4§estimulação.

A figura 4 apresenta a expressão de moléculas HLA de classeIl no CCA165 (adenocarcinoma do cólon moderadamente diferente). Na lâ-mina própria de áreas com mucosa colônica normal (quadro c e lado es-querdo do quadro a, assinalados com asterisco) são tipicamente observadosalguns macrófagos positivos de HLA de classe II, mas as células epiteliaisforam consistentemente negativas quanto à expressão de HLA de classe II.Contudo, nas células epiteliais de diferentes áreas do tumor foi verificadauma expressão acentuada de HLA Il como indicado no lado direito do qua-dro a e nos quadros b e d.

As figuras 5a e 5a apresentam a identificação da seqüência depeptídeos, de peptídeos eluídos das moléculas HLA de classe Il isoladas dotecido tumoral humano primário pela espectroscopia da massa. Figura 5a: osfragmentos derivaram da fragmentação do Iigante de HLA de classe Il natu-ralmente processados e apresentados a partir do MMP7 correspondendo àseqüência de peptídeos com a Seq. id no. 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS). Osfragmentos anotados são representados na tabela 5. Figura 5b: fragmentosderivados da fragmentação de peptídeos sintéticos que têm a seqüência depeptídeos da Seq. id no. 1. As fragmentações de ambos os peptídeos sinté-ticos e naturalmente processados produzem padrões de fragmentação equi-valentes e permitem a dedução e a confirmação da seqüência de aminoáci-dos primários da seqüência de peptídeos descaracterizados anteriormente(Seq. id no. 1) do Iigante de HLA de classe Il do MMP7 humano.<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>EXEMPLOS

MATERIAL E MÉTODOS

Imunohistologia das MHC de classe II: os tumores foram fixa-dos em uma solução de formaldeído a 4 % com solução tampão fosfato,embebidos em parafina, corados com hematoxilina e eosina e examinadosatravés de microscopia de luz. O diagnóstico do RCC foi realizado de acordocom o processo das investigações histopatológicas e imunohistológicas(Fleming, S. and M. O1DonneII. 2000. Surgical pathology of renal epithelialneoplasms: recent advances and current status. Histopathology 36:195-202).

Para a detecção imunohistológica das moléculas MHC de clas-se II ou das moléculas CD68, respectivamente, 5 μm seções de tecido em-bebidas em parafina foram previamente tratadas em solução tampão de ci-trato 10 mM, pH 6, seguido de incubação ou com um camundongo anti-HLA-DR cadeia alfa mAb (clone TAL.1B5, 1:50) ou CD68 Ab (Clone PGM1, 1:50)(DAKO, Hamburgo, Alemanha) ou camundongos IgG1 (2 pg/ml, BD Biosci-ences Pharmingen, São Diego, USA) e visualizados utilizando o kit de de-tecção iView DAB Ventana (Nexes System, Ventana Medicai Systems, Illkir-ch, França). As seções de tecido foram contra coradas com hematoxilina e,finalmente, embebidas em Entellan.

A análise molecular e da elução dos peptídeos com ligação aosHLA: as amostras de tumor congeladas foram processadas, como anterior-mente descrito (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr,S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Ste-vanovic, and H.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics appro-ach for the design of patient-individual antitumor vaccines. Câncer Res.62:5818-5827) e os peptídeos foram isolados de acordo com os protocolosnormais (Dengjel, J., H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2005. Glycanside chains on naturally presented MHC class Il ligands. J. Mass Spectrom.40:100-104) using the HLA-DR specific mAb L243 (Lampson, L.A. and R.Levy. 1980. Two populations of Ia-Iike molecules on a human B cell line. J.Immunol. 125:293-299).

As misturas de peptídeos naturais foram analisadas por um sis-tema HPLC Ultimate de fase reversa (Dionex, Amesterda1 Holanda) ligado aum espectrômetro de massa Q-TOF I (Waters, Eschborn, Alemanha) ou porum sistema HPLC CapLC de fase reversa ligado a um Q-TOF Ultima API(Waters), como anteriormente descrito (Lemmel, C., S. Weik, U. Eberle, J.Dengjel1 T. Kratt, H.D. Beckerl H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004.Differential quantitative analysis of MHC Iigands by mass spectrometry usingstable isotope labeling. Nat.Biotechnol. 22:450-454). Os espectros de frag-mentos foram analisados manualmente e automaticamente.

Análise de expressão de genes por microarrays oligonucleotí-deos de alta densidade: O isolamento do RNA do tumor e dos espécimes derins normais autólogos bem como a análise de expressão de genes por mi-croarrays de oligonucleotídeos Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) foram feitos como descrito anteriormente(Krüger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T.Weinschenk1 M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S.Stevanovic. 2004. Lessons to be Iearned from primary renal cell carcinomas:novel tumor antigens and HLA Iigands for immunotherapy. Câncer Immunol.Immunother). Os dados foram analisados com o software GCOS (Affyme-trix). As comparações em par entre o tumor e os rins normais autólogos fo-ram calculadas utilizando-se o respectivo arranjo normal como linha de par-tida. Não estavam disponíveis dados de arranjo de rins normais autólogospara RCC149 e RCC211. Deste modo, o RNA do rim humano saudável par-tilhado foi obtido comercialmente (Clontech, Heidelberg, Alemanha) e utiliza-do como linha de partida para estes tumores.

Maturação de DCs: Os DCs foram preparados utilizando san-gue de doadores saudáveis. Em resumo, os PBMCs foram isolados usando-se centrifugação por gradiente (Lymphocyte Separation Médium, PAA Labo-ratories GmbH1 Pasching, Áustria) e plaqueados a uma densidade de 7 χ 106células/ml em meio X-Vivo. Após 2 horas a 37°C, as células não aderentesforam removidas e os monócitos aderentes foram cultivados por 6 dias emmeio X-Vivo com 100 ng/ml de GM-CSF e 40 ng/ml de IL-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe1 Alemanha). No dia 7, os DCs imaturos foram ati-vados com 10ng/ml de TNF-α (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha) e20 pg/ml de poli(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha) durante 3 dias.

Geração de células T CD4+ específicas de antígeno. 106PBMCs por cavidade foram estimulados com 2 χ 105 DCs autólogos pulsa-dos por peptídeo (5 pg/ml). As células foram incubadas em placas de 96 ca-vidades (7 cavidades por doador e por peptídeo) com meio de célula T: RP-Ml 1640 adicionado na presença de 10ng/ml IL-12 (Promocell, Heidelberg,Alemanha). Após 3 a 4 dias de co-incubação a 37 cC1 foi adicionado meiofresco com 80 U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, U-SA) e 5 ng/ml IL-7 (Promocell). As reestimulações foram realizadas comPBMCs e peptídeos todos os 6 a 8 dias.

Marcação de IFNy intracelular: Após 3 e 4 rodadas de estimu-lação, os PBMCs foram descongelados, lavados duas vezes com meio X-Vivo 15, suspendidos a 107 células/ml em meio de células T e cultivados deum dia para o outro. No dia seguinte, os PBMCs, pulsados com peptídeos5 Mg/ml, foram incubados com células efetoras em uma relação de 1:1 du-rante 6 h. Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) foi adiciona-do para as últimas 4 horas de incubação.

As células foram analisadas usando-se um kit Cytofix/CytopermPlus (Becton Dickinson) e CD4-FITC- (lmmunotools), IFNy-PE- e anticorposSK1 CD8-PerCP clone (Becton Dickinson). Para os controles negativos, cé-lulas de sete cavidades foram adicionadas e incubadas com peptídeo irrele-vante ou sem peptídeo, respectivamente. Foi utilizada estimulação comPMA/lonomicina para controle positivo. As células foram analisadas em umFACSCaIibur de três cores (Becton Dickinson).

EXEMPLOS

EXPRESSÃO DE HLA DE CLASSE Il POR RCC

Sob condições normais e não inflamatórias, as moléculas HLAde classe Il só devem ser expressas por células do sistema hematopoiéticoe pelo epitélio tímico (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith.1996. Regulation of MHC class Il genes: Iessons from a disease. An-nu.Rev.lmmunol. 14:301-331). A situação altera-se durante a inflamação. Aexpressão de HLA de classe Il pode ser induzida na maioria dos tipos decélulas e de tecidos por IFNy (Leib und Gut-Landmann, S., J. M. Waldburger,M. Krawczyk, L. A. Otten, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea, and W. Rei-th. 2004. Mini-review: Specificity and expression of CIITA, the master regula-tor of MHC class Il genes. Eur.J.lmmunol. 34:1513-1525). Como a incidênciade RCC é freqüentemente acompanhada por casos de inflamação (Blay, J.Y., J. F. Rossi, J. Wijdenes, C. Menetrier-Caux1 S. Schemann, S. Negrier, T.Philip, and M. Favrot. 1997. Role of interleukin-6 in the paraneoplastic in-flammatory syndrome associated with renal-cell carcinoma. Int. J. Câncer72:424-430; Elsâsser-Beile, U., M. Rindsfuser1 T. Grussenmeyer, W. Schult-ze-Seemann, and U. Wetterauer. 2000. Enhanced expression of IFN-gammamRNA in CD4(+)or CD8(+)tumour-infiltrating Iymphocytes compared to peri-pheral Iymphocytes in patients with renal cell câncer. Br. J. Câncer 83:637-641), as moléculas de classe Il são, na verdade, expressas nas proximida-des dos tumores ou nos próprios tumores, como tem sido reportado.

A MARCAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE MOLÉCULAS HLA DE CLASSE II

Os inventores analisaram a expressão de HLA classe Il de dezespécimes de RCC, incluindo células claras histológicas e carcinomas renaispapilares por marcação imunohistoquímica e descobriram que todas as a-mostras investigadas revelaram células tumorais positivas de classe II. Co-mo exemplificado na figura 1A, foi freqüentemente detectada na margem dotumor uma expressão pronunciada de HLA de classe II. Nestas áreas os in-ventores observaram uma correlação espacial próxima entre células tumo-rais HLA+ e células imunológicas de infiltração tumoral, como ilustrado pelapresença dos macrófagos CD68+ em uma seção serial de tecido (figura 1B).No RCC que revela uma arquitetura mais papilária, a expressão de molécu-las HLA de classe Il foi mais uniformemente distribuída no tumor (figuras 1C, E, G). A comparação dos padrões de marcação de HLA de classe Il eCD68 imunohistoquímicos em seções de tecido em série demonstram cla-ramente que, para além de macrófagos, as células tumorais também ex-pressam HLA de classe Il (figura 1C,D e E1F). Foi demonstrado que as célu-las CD4+ TH1 produtoras de IFNy, bem como as células Natural Killer (NK),se infiltram no RCC (Cozar, J.M., J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Ca-brera, F. Garrido, and O.F. Ruiz-Cabello. 2005. Analysis of NK cells andchemokine receptors in tumor infiltrating CD4 T Iymphocytes in human renalcarcinomas. Câncer Immunol. ΙιτιηιυηοΜβή. Uma vez que as células tumo-rais positivas de classe Il foram descobertas predominantemente em partesexternas de tumores dissecados, pode-se especular que os leucócitos atraí-dos pelo tumor produzem IFNy que age nas células malignas das redonde-zas. A expressão anormal de moléculas HLA de classe Il no tecido neoplás-tico não está restrita ao RCC, também pode ser detectada no TCC e noCCA. A figura 4 apresenta a marcação imunohistoquímica de tecido de a-mostra de um adenocarcinoma de cólon humano.

ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE IFNf E DE TRANSCRITOS DE GENES IN-DUZIDOS POR IFNf

Adicionalmente, os inventores investigaram a expressão deHLA de classe Il através da análise comparativa de expressão de genes uti-lizando microarrays de oligonucleotídeos. Com esta técnica, os inventorespuderam aceder à expressão global de HLA de classe Il nos tumores disse-cados, independentemente dos tipos de célula expressos. Os inventores a-nalisaram expressões diferentes em quatro tumores, RCC149, RCC180,RCC190 e RCC211, em comparação com o rim de referência normal. Nosquatro tumores, os genes que codificam moléculas de HLA de classe Il fo-ram sobre-expressos (tabela 2). Uma possível razão para esta situação é aexpressão induzida por IFNy e, porisso, os inventores procuraram outrosgenes que sabidamente sofreram proliferação causada por interferons (Kol-chanov, N.A., E.V. Ignatieva, E.A. Ananko, O.A. Podkolodnaya, I.L. Stepa-nenko, T.l. Merkulova, M.A. Pozdnyakov, N.L. Podkolodny, A.N. Naumoch-kin, and A.G. Romashchenko. 2002. Transcription Regulatory Regions Data-base (TRRD): its status in 2002. Nucleic Acids Res. 30:312-317). Curiosa-mente, um número considerável destes genes foi encontrado sobre-expresso em uma ou mais amostras de tumores. A tabela 2 apresenta genesínduzíveis por interferon e cuja capacidade de reprodução foi ampliada emtodas as quatro amostras, de acordo com as descobertas prévias dos inven-tores (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter,O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, andH.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for thedesign of patient-individual antitumor vaccines. Câncer Res. 62:5818-5827).Entre eles encontram-se as LMP2, LMP7 e MECL1 - proteínas que sãosubstituídas por subunidades constitutivas das grandes holoenzimas proteo-líticas que se encontram no citossol, o proteassoma, para formar o imuno-proteassoma. A substituição de subunidades proteolíticas normalmente ex-pressas do proteassoma por subunidades induzíveis de IFNy é um processomarcante em um ambiente rico em interferon. Adicionalmente, o IFNy foi a-valiado diretamente por PCR quantitativo de tempo real (RT) (TaqMan). Ostumores apresentados na tabela 2 mostram uma sobreexpressão de 5 a 60vezes de mRNA IFNy quando comparados com as amostras de RNA nor-mais autólogas do mesmo doador (dados não mostrados). Assim, os resul-tados dos inventores indicam que o IFNy pode desempenhar um papel im-portante no RCC e pode ser a razão da expressão abundante de classe II.

TABELA 2: EXPRESSÃO DE MRNA DOS GENES INDUZIDOS POR IN-TERFERON.

A expressão em amostras de tumores foi comparada com umrim normal autólogo (RCC180, RCC190) ou com um rim saudável transplan-tado (RCC149, RCC211). Todos os genes apresentaram um "aumento" noalgoritmo de chamada de mudança do software GCOS dos quatro tumores eforam descritos como induzidos por interferon.

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LIGANTES HLA-DR ISOLADOS DO TECIDO CANCERÍGENO

De acordo com os dados publicamente disponíveis, a ligaçãodos peptídeos através das moléculas HLA de classe Il expressa no tecidotumoral sólido ainda não foi, até agora, isolada ou identificada por outros. Osinventores analisaram dez RCC diferentes, três CCA e um TCC e consegui-ram isolar Iigante HLA-DR de todas as amostras, atingindo um total de 453peptídeos (dados não apresentados). As seqüências de peptídeos foramdeterminadas pelo acoplamento de separação cromatográfica e pela análiseespectrométrica da massa tandem (LC-MS/MS), como anteriormente descri-to (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas1 M. Schirle1 F. Obermayr, S. Walter, O.Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, andH.G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for thedesign of patient-individual antitumor vaccines. Câncer Res. 62:5818-582;Schirle M, Keilhoiz W, Weber B1 Gouttefangeas C, Dumrese T, Becker HD,Stevanovic S, Rammensee HG. Identification of tumor-jassociated MHC classI ligands by a novel T-cell-independent approach. Eur J Immunol. 2000;30(8):2216-25). Um exemplo da nova seqüência de peptídeos através deLC-MS/MS é apresentado nas figuras 5a e 5b. As seqüências primárias deaminoácidos deduzidas da colisão de fragmentos anotadas nas figuras 5a e5b são incluídas na tabela 5. As amostras tumorais diferem nos seus genóti-pos HLA1 em peso e número total de Iigantes HLA identificados. A tabela 3apresenta uma lista representativa de peptídeos e proteínas de fonte corres-pondentes identificadas a partir de uma amostra exemplar tumoral, RCC190.Os peptídeos foram isolados das moléculas HLA de classe Il de células, co-mo anteriormente descrito (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenbe-rend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identifica-tion of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combina-tion of HLA class Il targeting and differential mass spectrometry.Eur.J.Immunol. 34:3644-3651).

TABELA 3: LISTA DE EXEMPLOS DE LIGANTES HLA-DR ISOLADOS DERCC190.

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Não há nenhuma correlação entre o peso do tumor e o númerode Iigantes HLA identificados. As proteínas de fonte peptídica podem serdivididas em dois grupos. Por um lado, foram encontrados Iigantes que de-verão ser apresentados pelos leucócitos, tais como peptídeos a partir decomponentes de complementos, por exemplo, proteína alfa de ligação C3,C4A, C4 e outras proteínas relacionadas com funções específicas de célulasdo sistema imunitário, por exemplo, CD14 e fragmento Fc da proteína deligação IgG. Por outro lado, os inventores conseguiram revelar a natureza eas características de peptídeos previamente desconhecidos apresentadospelas células tumorais dos TAA sobre-expressos, por exemplo de vimentina,metaloproteinase 7 de matriz, alfa 1 do fator 1 de alongamento da traduçãode eucariótico e nicotinamida N-metiltransferase. Esta observação está deacordo com os dados imunohistoquímicos (figuras 1 e 4) e demonstra que ascélulas tumorais positivas HLA de classe II e os leucócitos de infiltração esti-veram presentes em amostras analisadas e que os peptídeos eluídos pro-vêm de antígenos sobre-expressos nestes tipos de células distintas.

Para identificar os peptídeos dos TAA, os inventores compara-ram as proteínas de fonte para os Iigantes individuais com genes sobre-expressos detectados por análise microarray de tumores (Weinschenk, T., C.Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W.Loeser, K.H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H.G. Rammensee. 2002.Integrated functional genomics approach for the design of patient-individualantitumor vaccines. Câncer Res. 62:5818-5827; Krüger, T., O. Schoor, C.Lemmel, B. Kraemer1 C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J.Hennenlotter, A. Stenzl, H.G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Les-sons to be Iearned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigensand HLA Iigands for immunotherapy. Câncer Imunnol.Immunother. Os in-ventores identificaram um peptídeo a partir da proteína 3 de ligação de fatorde crescimento tipo insulina, IGFBP3i66-i8i, em RCC190. Além disso, foramencontradas em TCC108 duas variantes deste peptídeo, IGFBP3169-181 eIGFBP3169-184, que contêm o mesmo motivo de núcleo de seqüência ne-cessário e suficiente para permitir uma ligação com HLA-DRB1*0101 (parareferência, ver a tabela 1). A partir do mesmo tumor, um peptídeo de meta-loproteinase 7 de matriz, MMP7247-262 pode ser isolado (tabela 1). Ao nível demRNA, o MMP7 foi sobre-expresso em 13 e IGFBP3 em 22 de 23 RCC ana-lisados (dados não apresentados). No total, das 453 seqüências peptídicasinicialmente identificadas (não apresentadas), os antígenos subjacentes para49 peptídeos (Seq. id nQs. 1 - 49) foram identificados como associados aotumor, seja através de experiências dos inventores (dados incluídos nestedocumento) ou por outros (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T.Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Ma-trix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth fator bioavailability t-hrough its proteinase activity on insulin-like growth fator binding protein 3.Câncer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida1 Y. Hyun, T. Ya-sui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishi-ko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renalcell carcinoma. Oncol. Rep. 10:567-570; Cheung1 C.W., D.A. Vesey, D.L.Nicol1 and D.W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regu-Iation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. KidneyInt. 65:1272-1279; Hao1 X., B. Sun, L. Hu, H. Lahdesmaki1 V. Dunmire, Y.Feng, S.W. Zhang, H. Wang, C. Wu, H. Wang, G.N. Fuller, W.F. Symmans11.Shmulevich, and W. Zhang. 2004. Differential gene and protein expression inprimary breast malignancies and their Iymph node metastases as revealedby combined cDNA microarray and tissue microarray analysis. Câncer100:1110-1122; Helmke, B.M., M. Polychronidis, A. Benner, M. Thome, J.Arribas, and M. Deichmann. 2004. Melanoma metastasis is associated withenhanced expression of the syntenin gene. Oncol. Rep. 12:221-228; Hof-mann, H.S., G. Hansen, G. Richter, C. Taege, A. Simm, R.E. Silber, and S.Burdach. 2005. Matrix metalloproteinase-12 expression correlates with localrecurrence and metastatic disease in non-small cell Iung câncer patients.Clin. Câncer Res. 11:1086-1092; Kamai, T., T. Yamanishi, H. Shirataki, K.Takagi, H. Asami, Y. Ito, and K. Yoshida. 2004. Overexpression of RhoA,Racl, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cân-cer. Clin. Câncer Res. 10:4799-4805; Koninger, J., N.A. Giese, F.F. di Mola,P. Berberat, T. Giese, I. Esposito, M.G. Bachem, M.W. Buchler, and H. Fri-ess. 2004. Overexpressed decorin in pancreatic câncer: potential tumorgrowth inhibition and attenuation of chemotherapeutic action. Clin. CâncerRes. 10:4776-4783; Mori, M., H. Shimada, Y. Gunji, H. Matsubara, H. Haya-shi, Y.Nimura, M.Kato, M. Takiguchi, T. Ochiai, and N. Seki. 2004. S100A11gene identified by in-house cDNA microarray as an accurate predictor ofIymph node metastases of gastric câncer. Oncol. Rep. 11:1287-1293; Nagler,D.K., S. Kruger, A. Kellner, E. Ziomek, R. Menard, P. Buhtz1 M. Krams, A.Roessner, and U. Kellner. 2004. Up-regulation of cathepsin X in prostatecâncer and prostatic intraepithelial neoplasia. Prostate 60:109-119; Nanda1Α., Ρ. Buckhaults, S. Seaman1 Ν. Agrawal, Ρ. Boutin, S. Shankara1 Μ. Nacht1Β. Teicher, J. Stampfl, S. Singh, Β. Vogelstein, K.W. Kinzler1 and C.B. St.2004. Identification of a binding partner for the endothelial cell surface prote-ins TEM7 and TEM7R. CancerRes. 64:8507-8511; Patel, I.S., P. Madan, S.Getsios, M.A. Bertrand, and C.D. MacCaIman. 2003. Cadherin switching inovarian câncer progression. Int. J. Câncer 106:172-177; Santelli, G., D. Cali-fano, G. Chiappetta, M.T. Vento, P.C. Bartoli, F. Zullo, F. Trapasso, G. Vigli-etto, and A. Fusco. 1999. Thymosin beta-10 gene overexpression is a gene-ral event in human carcinogenesis. Am. J. Pathol. 155:799-804; Schneider,D., J. Kleeff, P.O. Berberat, Z. Zhu, M. Korc1 H. Friess1 and M.W. Buchler.2002. Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic câncer cells. Bio-chim. Biophys. Acta 1588:1-6; Welsh, J.B., L.M. Sapinoso, S.G. Kern,D.A.Brown, T. Liu1 A.R. Bauskin1 R.L. Ward1 N.J. Hawkins1 D.l. Quinn1 P.J.Russell, R.L. Sutherland, S.N. Breit, C.A. Moskaluk, H.F. Frierson, Jr., andG.M. Hampton. 2003. Large-scale delineation of secreted protein biomarkersoverexpressed in câncer tissue and serum. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A100:3410-3415; Xie, D., J.S. Sham1 W.F. Zeng, L.H. Che1 M. Zhang, H.X.Wu, H.L. Lin, J.M. Wen, S.H. Lau, L.Hu, and X.Y. Guan. 2005. Oncogenicrole of clusterin overexpression in multistage colorectal tumorigenesis andprogression. World J. GastroenteroL 11:3285-3289). A análise exemplar dopotencial imunoestimulador de peptídeos de ligação com alelos HLA-DRcomuns revela a existência de células T CD4+ específicas de antígenos facea IGFBP3169-181 e MMP7247-262:

A ligação promíscua da Seq. id no. 1 exemplar a vários alelosHLA-DR pode ser revelada através de vários métodos independentes: osIigantes de determinadas moléculas MHC/HLA transportam aminoácidosrelacionados com químicos em determinadas posições da respectiva se-qüência primária que permitem a definição de um motivo peptídeo para cadaalelo MHC/HLA (Falk K, Rotzschke O1 Stevanovic S, Jung G, RammenseeHG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides elutedfrom MHC molecules. Nature. 1991; 351(6324):290-6). SYFPEITHI utilizamatrizes de motivo deduzidas a partir de motivos refinados baseados exclu-sivamente em análise de Iigantes natural por degradação de Edman e es-pectrometria de massa tandem. Estas matrizes permitem a predição dospeptídeos a partir de uma seqüência de proteínas indicada em moléculasMHC de classe I ou Il (Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, WaldenP, Rammensee HG. Exact prediction of a natural T-cell epitope. Eur J Immu-nol. 1991; 21(11 ):2891 -4).

Ao aplicar os princípios das predições realizadas pelo algoritmoSYFPEITHI (Rammensee, H.G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997.MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag1 Heidelberg, Germany;Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S.SYFPEITHI: database for MHC Iigands and peptide motifs. Immunogenetics.1999; 50(3-4):213-9) à seqüência peptídica exemplar mencionada (Seq. idno. 1), foi classificada a ligação da SEQ ID ns 1 a vários alelos HLA-DR co-muns (ver a tabela 7). O algoritmo foi utilizado com sucesso para prever epí-topos de classe I e classe Il de vários antígenos, por exemplo, a partir doTAA TRP2 humano (predição de um Iigante HLA de classe I) (34) e SSX2(predição de um Iigante HLA de classe II) (Neumann F, Wagner C, Stevano-vic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, Pfre-undschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with apromiscuous binding pattem derived from the câncer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int J Câncer. 2004; 112(4):661-8). O limite de resultado de 18ou superior para ligação significativa foi definido tendo em conta a análise deresultados de ligação para Iigantes de peptídeos HLA-DR de ligação promís-cua publicados anteriormente. A ligação promíscua é definida como ligaçãode um peptídeo com uma boa força de ligação, como indicado por um resul-tado de 18 no teste SYFPEITHI ou superior em dois ou mais alelos HLA-DRcomuns diferentes. Os alelos HLA DR mais comuns estão representados natabela 7. Os Ioci de HLA-A e HLA-DR estão em combinações de submissãode desequilíbrio em ligação de HLA-A2 e HLA-DRs específicos favorecidosrelativamente a outros. Os genótipos HLA-DR dos tumores de fonte HLA-DRB1 *11 e DRB1 *15 foram analisados e confirmados como sendo DRB1 *11e DRB1*15 em ambos os casos. Os resíduos de aminoácidos âncora prefe-ridos para os alelos HLA de classe Il mais comuns (DRB1*0101,DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101 e DRB1*1501) estãorepresentados na tabela 4. Por exemplo, o alelo HLA de classe IlDRB1*0301 liga preferencialmente peptídeos no respectivo sulco de ligaçãoque apresenta resíduos de aminoácidos específicos nas posições 1, 4, 6 e 9no final do N-terminal a C-terminal da seqüência núcleo de qualquer peptí-deo determinado. Especificamente, DRB1*0301 exibetuma boa ligação, se aseqüência núcleo de um peptídeo tiver um resíduo Giutamato (D) na posição4, assim como L, I, F, M ou V na posição 1, assim como K, R, E1 Q ou N naposição 6, assim como Y, L ou F na posição 9.

TABELA 4: MOTIVOS PEPTÍDEOS DE ALELOS HLA-DR COMUNS.

Estão representados aminoácidos âncora em um código de letrade código nos bolsos de ligação correspondentes.

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Os resultados da análise in silico baseada em algoritmos decomputador para a predição de interação entre moléculas HLA e seqüênciaspeptídicas disponibilizados através da página www.syfpeithi.de indicam queo peptídeo MMP7247-262 Seq. id no. 1 apresenta uma ligação promíscua comvários alelos HLA-DR. De acordo com resultados da análise preditiva, o pep-tídeo com Seq. id no. 1 recebe uma classificação de ligação alta para intera-ção com DRB1*1101, DRB1*1501, DRB1*0401, DRB1*0301 e DRB1*0101(Tabela 7). Os alelos HLA-DR analisados neste testei para interação com aseqüência de aminoácidos peptídeos/força de ligação cobrem pelo menos69,6 % da população caucasiana HLA-A2 positivo (Mori M, Beatty PG, Gra-ves M, Boucher KM, Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in theNorth American population: the National Marrow Donor Program Donor Re-gistry. Transplantation. 1997; 64(7): 1017-27). Uma vez que não existem da-dos de freqüência disponíveis para HLA-DR15, o alelo não foi consideradopara cálculo da cobertura resultante da população caucasiana HLA-A2 posi-tivo. Por conseguinte, será altamente provável que com a Seq. id no. 1, acobertura da população seja superior a 69,6 %, indicando que o peptídeoapresenta uma excelente perspectiva para servir de candidato ao desenvol-vimento de preparações farmacêuticas na maior parte dos pacientes comcâncer.

No entanto, a aplicação de algoritmos de predição conduz ape-nas a resultados conclusivos, se os resultados de análise in silico foremcombinados com confirmação experimental para ligação promíscua, comoapresentado anteriormente por outros, que não conseguiram demonstrarquaisquer respostas imunológicas desencadeadas por seqüências peptídi-cas previstas como bons aglutinantes (Bohm CM, Hanski ML, Stefanovic S.Rammensee HG, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken EO, Hanski C.Identification of HLA-A2-restricted epitopes of the tumor-associated antigenMUC2 recognized by human cytotoxic T-cells. Int J Câncer. 1998; 75(5):688-93). A predição de artefatos, como no caso mencionado anteriormente, nãopode ser suprimida, uma vez que os algoritmos utilizados para predição nãoconsideram que uma seqüência peptídica não é necessariamente gerada emuma situação in vivo (dentro de célula vivas). A confirmação experimentalpode ser obtida através da recolha de dados in vitro de testes biológicos, porexemplo, demonstrando a presença ou falta de imunogenicidade de um pep-tídeo. Daí que, para uma confirmação experimental de uma ligação promís-cua de Seq. id no. 1 foram obtidos através de recolha esses dados in vitro.Para testar os peptídeos relativamente à respectiva capacidade imunoesti-muladora através de experiências preparatória de células T in vitro, foramutilizadas as variantes mais curtas ("seqüência central") dos peptídeosIGFBP3, IGFBP3 169-181 e do peptídeo MMP7, MMP7 247-262.

Para gerar células T CD4+ específicas de antígenos e para tes-tar os peptídeos quanto a ligação promíscua, os PBMCs de 4 doadores sau-dáveis com alelos HLA-DR diferentes (Figura 2), um deles com DRB1*1101,foram estimulados através de DCs autólogos pulsados por peptídeo. Alémdisso, o peptídeo CCND1 198-212, um conhecido epítopo de célula T (Dengjel,J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee,and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class Il targeting and differen-tial mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), foi utilizado comocontrole positivo. Como um sistema de leitura para a geração de células TCD4+ específicas de antígeno, os níveis de IFNy foram determinados porcitometria de fluxo. As células T foram analisadas após as terceira e quartaestimulações semanais por marcação intracelular de IFNy juntamente commarcação de CD4-FITC e CD8-PerCP para determinar a percentagem decélulas produtoras de IFNy em subpopulações específicas de células T. Emtodas as experiências, as estimulações com peptídeos irrelevantes e sempeptídeos foram realizadas como controles negativos. A resposta ao IFNy foiconsiderada como positiva se a percentagem de células T CD4+ produtorasde IFNy tiver sido duas vezes maior que a dos controles negativos (Horton,H., N. Russell, E. Moore, I. Frank, R. Baydo, C. Havenar-Daughton, D. Lee,M. Deers, M. Hudgens, K. Weinhold, and M.J. Mc Elrath. 2004. Correlationbetween interferon- gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific me-mory T-cells. J. Infect. Dis. 190:1692-1696).

Em três dos quatro doadores, os inventores conseguiram gerarcélulas T CD4+ específicas para ambos os peptídeos (Figura 2). As respos-tas de célula T não puderam ser observadas no doador 4 após qualquer es-timulação. No doador 1, foram detectadas 0,05 % a 0,1 % (Figura 3) de célu-las T CD4+ produtoras de IFNy na totalidade das sete tentativas de estimu-lação após a terceira estimulação com o peptídeo IGFBP3i69 -181. Estas célu-las T foram expandidas, na maior parte dos casos, para 0,09 % a 0,13% poruma rodada adicional de estimulação. As células T CD4+ produtoras deIFNy específicas para o peptídeo IGFBP3i69-i8i foram igualmente observa-das no doador 2 e no doador 3, com freqüências máximas de 0,05 % e0,07 % de células T CD4+ produtoras de IFNy.

Os doadores 1, 2 e 3 também apresentaram células T CD4+reativas ao peptídeo MMP7247-262- As maiores freqüências de células T CD4+produtoras de IFNy específicas para o peptídeo MMP7 foram encontradas,respectivamente, nos doadores 1 e 2. Os doadores 1, 2 e 3 mostraram res-postas de IFNy ao peptídeo CCND1198-212, que já tinham sido descritas comoepítopos de células T de MHC restritas à classe Il (Dengjel, J., P. Decker, O.Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, and S. Stevano-vic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitopeby a novel combination of HLA class Il targeting and differential mass spec-trometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651).

Por conseguinte, os peptídeos IGFBP3, MMP7 e CCND1 sãoaglutinantes promíscuos HLA de classe Il capazes de obter respostas emcélulas T CD4+ em três de quatro doadores saudáveis com alelos HLA DRdiferentes. Se os alelos HLA dos dois pacientes com tumores dos quais deri-varam os peptídeos IGFBP3 e MMP7 forem comparados com os alelos dosquatro doadores saudáveis, é óbvio que os peptídeos são apresentados porHLA-DRB1*01, HLA-DRB1*04 e HLA-DRB1*11. Os três tipos de alótiposHLA DR têm um resíduo aminoácido glicina na posição 86 e um resíduo áci-do aspártico na posição 57 das cadeias β, respectivamente (verwww.anthonynolan.com/HIG). Por conseguinte, têm características de liga-ção muito similares para os bolsos de ligação P1 e P9 (Rammensee, H.G., J.Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. S-pringer-Verlag, Heidelberg, Germany). Para o peptídeo CCND1198.212, umepítopo de célula T conhecido como HLA-DRB1*0401 e HLA-DRB1*0408(Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor1 F. Altenberend, T. Weínschenk, H.G.Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processedcyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class Il targetingand differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651), confir-ma-se o mesmo. O doador 4 apresenta HLA-DRB1*0318 e HLA-DRBri401,alelos com motivos peptídeos que diferem na seqüência de aminoácido pri-mária das cadeias beta a partir do supramencionado. Este fato pode explicarporque não é possível obter respostas da célula T face aos dois peptídeosque utilizam células deste doador.

Curiosamente, as células T killer CD8+ produtoras de IFNy fo-ram detectadas em dois doadores após estimulações com os três peptídeos,principalmente no doador 3, mas em menor número no doador 1 (dados nãomostrados).

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Tabela 6: Freqüências haplótipo da população caucasiana norte-americana. São indicados os haplótipos serológicos. "n.a." significa não atri-buído.

TABELA 7: RESULTADOS DE LIGAÇÃO DA SEQ. ID NO. 1 PARA ALELOSHLA-DR COMUNS

São mostrados os resultados de ligação da Seq. id no. 1 e Seq.id no. 25 SYFPEITHI para os alelos HLA-DRB1 mais comuns em populaçõescaucasianas. As freqüências dos haplótipos serológicos correspondentes decaucasianos HLA-A2 positivos são apresentadas em parêntesis. Considera-se que os peptídeos têm uma ligação suficientemente boa com uma molécu-Ia HLA de classe II, se o resultado for igual ou superior a 18._

<table>table see original document page 71</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Immatics biotechnologies GmbH

<120> Peptideos associados a tumor que se ligam de

forma promiscua a moléculas HLA Classe II<130> I30551PCT<160> 79

<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1

Asn Pro Gly Glu Tyr Arg Val Thr Ala His Ala Glu Gly Tyr Thr Pro1 5 10 15

Ser<210> 2<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2

Asn Lys Gln Lys Pro lie Thr Pro Glu Thr Ala Glu Lys Leu Ala Arg1 5 10 15

Asp

<210> 3<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3

Asp Asp Pro ser Thr lie Glu Lys Leu Ala Lys Asn Lys Gln Lys Pro1 5 10 15

<210> 4<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asn Pro Leu Lys Ile Phe Pro Ser Lys Arg Ile Leu Arg Arg His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Thr Gly Trp Leu Leu Leu Asn Lys Pro Leu Asp Arg1 5 10

<210> 6<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 6

Asp Asn Glu Leu Gln Glu Met Ser Asn Gln Gly Ser Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ala Ala Gly Leu Leu Ser Thr Tyr Arg Ala Phe Leu Ser Ser His1 5 10 15

<210> 8<211> 21<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 8

Ala Pro Ser Leu Arg Pro Lys Asp Tyr Glu Val Asp Ala Thr Leu1 5 10 15

Ser Leu Asn Asn Gln20

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gly Pro vai Asp Glu Val Arg Glu Leu Gln Lys Ala Ile Gly Ala Val1 5 10 15

Pro

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Ile Asn His vai vai Ser Val Ala Gly Trp Gly Ile Ser Asp Gly1 5 10 15

<210> 11<211> 18<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 11

Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys Pro1 5 10 15

Phe Arg<210> 12<211> 20<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 12

Leu Pro Gln Ser lie Val Tyr Lys Tyr Met Ser lie Arg ser Asp Arg1 5 10 15

Ser vai Pro ser20

<210> 13<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 13

lie Val His Arg Tyr Met Thr Ile Thr Ser Glu Arg Ser Val Pro Ala1 5 10 15

<210> 14<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 14

Lys Asn Gly Phe vai Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys1 5 10

<210> 15<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 15

Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro1 5 10 15

<210> 16<211> 14<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 16

Gly Ala Thr Tyr Asn Ile Ile Val Glu Ala Leu Lys Asp Gln1 5 10

<210> 17<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 17

Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro15 10 15

<210> 18<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 18

Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys Pro Gly1 5 10 15

<210> 19<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 19

Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu1 5 10

<210> 20<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 20

Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro15 10 15

Glu

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 21

Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn

1 5 10

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

vai Lys Glu Pro Val Ala Val Leu Lys Ala Asn Arg vai Trp Gly Ala

1 5 10 15

Leu

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Thr Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

His Pro Leu His ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys

1 5 10 ' 15

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

His ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys Asp Ser Gln

15 10 15<210> 26<211> 18<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 26

Arg Pro Lys His Thr Arg Ile Ser Glu Leu Lys Ala Glu Ala Val Lys15 10 15

Lys Asp<210> 27<211> 18<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 27

Gly Pro Glu Asp Asn Val Val Ile Ile Tyr Leu Ser Arg Ala Gly Asn15 10 15

Pro Glu<210> 28<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 28

Ser Arg Pro Val Ile Asn Ile Gln Lys Thr Ile Thr Val Thr Pro Asn

1 5 10 15

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Leu Asp Leu Ser Phe Asn Gln Ile Ala Arg Leu Pro Ser Gly Leu Pro15 10 15

vai

<210> 30<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 30

Lys Leu Pro Ser Val Glu Gly Leu His Ala Ile Val Val Ser Asp Arg

1 5 10 15

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Asp Thr Ser Thr Leu Glu Met Met His Ala Pro Arg Cys Gly

1 5 10

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Asp Gln Asn Thr Ile Glu Thr Met Arg Lys Pro Arg Cys Gly Asn Pro15 10 15

ASp

<210> 33<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 33

Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser

15 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 34

Leu Asp Phe Leu Lys Ala vai Asp Thr Asn Arg Ala ser vai Gly15 10 15

<210> 35<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 35

His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His vai Ile Asp Arg10 1 5 10 15

<210> 36<211> 14<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 36

Arg Ala Ile Glu Ala Leu His Gly His Glu Leu Arg Pro Gly1 5 10

<210> 37<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 37

Asp Pro Gly vai Leu Asp Arg Met Met Lys Lys Leu Asp Thr Asn Ser15 10 15Asp

<210> 38<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 38

Asn Glu Glu Glu lie Arg Ala Asn vai Ala Val Val ser Gly Ala Pro15 10 15<210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Pro Ala Ile Leu Ser Glu Ala Ser Ala Pro Ile Pro His

1 5 10

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Lys Val Ile Gln Ala Gln Thr Ala Phe Ser Ala Asn Pro Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro

1 5 10 15

Ser

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala

15 10 15

<210> 43

<211> 16

<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 43

Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu1 5 10 15

<210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 44 Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly1 5 10 15<210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 45 Met Gly Glu Ile Ala Ser Phe Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Thr1 c1 5 10 15<210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 46 Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys1 5 10<210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens<400> 47 vai Val Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys1 5 10 15<210> 48<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 48

His Ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys1 5 10

<210> 49<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 49

Asn Pro Pro Ser Met Val Ala Ala Gly Ser Val Val Ala Ala Val15 10 15

<210> 50<211> 20<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 50

Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His1 5 10 15

Arg Lys Cys Phe20

<210> 51<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 51

Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro1 5 10

<210> 52<211> 13<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly1 5 10

<210> 53<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 53

Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser1 5 10 15 <210> 54<211> 21<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 54

Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly Thr1 5 10 15

Glu Leu Val Asn Phe 20

<210> 55<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 55

Tyr Pro Lys Ser Leu His Met Tyr Ala Asn Arg Leu Leu Asp His Arg

1 5 10 15

<210> 56

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 56

Glu Pro Tyr Tyr Lys Met Gln Thr Arg Ala Gly Ser Arg Glu1 5 10

<210> 57<211> 20<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 57

Ala Pro Pro Ser Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp1 5 10 15

Ser Arg Pro Pro20

<210> 58<211> 14<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 58

Phe Gly Pro Ile Tyr Asn Tyr Lys Asp Thr Ile Val Phe Lys1 5 10

<210> 59<211> 12<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 59

ser Pro Asp Pro ser Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe15 10

<210> 60<211> 23<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 60

Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Gly Glu Trp Lys Pro1 5 10 15

Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp20

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Gly vai Ile Lys Val Phe Asn Asp Met Lys Val Arg Lys15 10

<210> 62<211> 15<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 62

Ala Pro Gly Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Lys Val Ala Val Pro Tyr15 10 15

<210> 63<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 63

Ala Ser Val Asp Leu Lys Asn Thr Gly Arg Glu Glu Phe Leu Thr Al1 5 10 15

<210> 64<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 64

Gly Asn His Gln Phe Ala Lys Tyr Lys Ser Phe Lys Val Ala Asp Gl15 10 15

<210> 65<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly

15 10 15

<210> 66

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys

1 5 10

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Phe Val Met Gly Val Asn His Glu Lys Tyr Asp Asn

1 5 10

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

Thr Gly vai Phe Thr Thr Met Glu Lys Ala Gly Ala His

1 5 10

<210> 69

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69Ile Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Ser Asn Arg Val Val Asp1 5 10 15

Leu Met Ala His Met Ala Ser Lys Glu20 25

<210> 70<211> 22<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 70

Gly Thr Gly Ala Ser Gly ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala Ala Ser1 5 10 15

Gly Glu Ala Lys Pro Lys20

<210> 71<211> 15<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 71

Asp Val Gly Val Tyr Arg Ala Val Thr Pro Gln Gly Arg Pro Asp1 5 10 15

<210> 72<211> 15<212> PRT<21B> Homo sapiens<400> 72

Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala vai Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp1 5 10 15

<210> 73<211> 16<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 73His Pro Leu His ser Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys Gly His Ala Lys

1 5 10 15

<210> 74

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Asp Lys Asp Leu Phe Lys Ala Val Asp Ala Ala Leu Lys Lys

1 5 10

<210> 75

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Lys Asp Lys Thr Tyr ser Tyr Leu Asn Lys Leu Pro Val Lys

1 5 10

<210> 76

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Val Ile Lys Met Gly Val Ala Ala His Lys Lys ser His Glu Glu Ser15 10 15

His Lys Glu<210> 77<211> 21<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 77

Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val15 10 15

Asn Pro Thr Gln Lys20

<210> 78<211> 15<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 78

Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys1 5 10 15

<210> 79<211> 16<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 79

Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser1 5 10 15

Claims (32)

1. Peptídeo associado a tumor que é selecionado do grupode peptídeos que compreendem ao menos uma seqüência de acordo comqualquer das seqüências Seq. id n9 33, Seq. id ne 42, Seq. id n9 43, Seq. idn9 31, Seq. id ne 1 a Seq. id n9 32, Seq. id n9 34 a Seq. id n9 41, e Seq. id n9-44 a Seq. id n9 49, ou uma variante das mesmas, desde que o peptídeo nãoseja o polipeptídeo associado ao tumor humano intacto.

2. Peptídeo associado a tumor, de acordo com a reivindicação-1, em que o peptídeo consistir essencialmente em uma seqüência de ami-noácidos de acordo com qualquer Seq. id n9 1 a Seq. id n9 49, ou uma vari-ante das mesmas.

3. Peptídeo associado a tumor, de acordo com a reivindicação-1 ou 2, em que o dito peptídeo exibe um comprimento total dentre 9 e 100,de preferência entre 9 e 30 aminoácidos.

4. Peptídeo associado a tumor, de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 3, consistindo em uma seqüência de aminoácidos de a-cordo com qualquer das Seq. id n9 1 a Seq. id n9 49.

5. Peptídeo associado a tumor, de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 4, tendo a capacidade de se ligar a uma molécula do com-plexo principal de histocompatibilidade humano (MHC) de classe II, em parti-cular a HLA-DRB1 *0101.

6. Peptídeo associado a tumor, de acordo com a reivindicação-5, tendo a capacidade de se ligar a pelo menos uma molécula adicional docomplexo principal de histocompatibilidade humano (MHC) de classe II.

7. Peptídeo associado a tumor, de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 6, em que o peptídeo inclui ligações não-peptídicas.

8. Peptídeo associado a tumor, de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 7, em que o peptídeo é uma proteína de fusão compreen-dendo, em particular, aminoácidos N-terminal de cadeia invarianteassociada ao antígeno HLA-DR (li).

9. Ácido nucléico caracterizado pelo fato de codificando umpeptídeo como definido em qualquer das reivindicações 1 a 8.

10. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 9, o qual éDNA1 cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações dos mesmos.

11. Vetor de expressão sendo capaz de exprimir um ácido nu-cléico como definido na reivindicação 9 ou 10.

12. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de compreen-dendo um ácido nucléico como definido na reivindicação 9 ou 10 ou um vetorde expressão definido na reivindicação 11.

13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 o qualé uma RCC recombinante ou uma célula Awells.

14. Método para a produção de peptídeo associado a tumor,como definido em quasquer das reivindicações 1 a 8, o método compreen-dendo a cultura da célula hospedeira como definida na reivindicação 13 e oisolamento entre o peptídeo e a célula hospedeira ou o respectivo meio decultura.

15. Composição farmacêutica compreendendo um peptídeoassociado a tumor como definido em quasquer das reivindicações 1 a 8, umácido nucléico de acordo com a reivindicação 9 ou 10 ou um vetor de ex-pressão como definido na reivindicação 11, e um veículo farmaceuticamenteaceitável.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-15, estando na forma de vacina para o câncer, compreendendo opcional-mente pelo menos um adjuvante adequado.

17. Peptídeo associado a tumor como definido em quasquerdas reivindicações 1 a 8, um ácido nucléico como definido na reivindicação 9ou 10 ou vetor de expressão como definido na reivindicação 11, destinadoao uso em medicina.

18. Método para a eliminação de células-alvo em um pacientecujas células-alvo expressam de modo aberrante um polipeptídeo que com-preende uma seqüência de aminoácidos como definido com a seqüênciadescrita em qualquer das reivindicações 1 a 6, sendo que tal método com-preendendo a administração, ao paciente, de uma quantidade eficaz de umpeptídeo como definido em qualquer das reivindicações 1 a 8, ou de um áci-do nucléico como definido em qualquer das reivindicações 9 ou 10, ou de umvetor de expressão como definido na reivindicação 11, sendo que a quanti-dade do peptídeo ou do ácido nucléico ou do vetor de expressão menciona-dos provoca, no dito paciente, uma resposta imunológica anticélula-alvo.

19. Uso de um peptídeo associado a tumor como definido emqualquer das reivindicações 1 a 6 ou de um ácido nucléico como definido nareivindicação 9 ou 10 ou de um vetor de expressão como definido na reivin-dicação 11, aplicado à fabricação de um medicamento para eliminar células-alvo em um paciente cujas células-alvo expressam de forma aberrante umpolipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos como definidaem qualquer das reivindicações 1 a 6.

20. Uso de um peptídeo associado a tumor como definido emqualquer das reivindicações 1 a 8 ou de um ácido nucléico como definido nareivindicação 9 ou 10 ou um vetor de expressão como definido na reivindica-ção 11, para a fabricação de um medicamento para indução de uma respos-ta imunológica, particularmente uma resposta imunológica celular, mais par-ticularmente uma resposta imunológica mediada por células T contra célulasde tumores sólidos cujas células expressam uma molécula MHC de classe Ilhumana na superfície e que apresentam um polipeptídeo que compreendeuma seqüência de aminoácidos como definido em quasquer das reivindica-ções 1 a 6.

21. Método para a produção in vitro de linfócitos T citotóxicosativados (CTL)1 o método compreendendo o contato in vitro de CTLs commoléculas MHC de classe Il humanas carregadas com antígeno e expressasna superfície de células apresentadoras do antígeno adequado durante umperíodo de tempo suficiente para ativar as ditas CTL em uma forma específi-ca de antígeno, sendo que o dito antígeno é um peptídeo como definido emquasquer das reivindicações 1 a 8.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que o antí-geno é carregado em moléculas MHC de classe Il expressas na superfíciede células apresentadoras de antígeno adequadas, através do contato deuma quantidade suficiente do antígeno com uma célula apresentadora deantígen.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que a célulaapresentadora de antígeno compreende um vetor de expressão como defini-do na reivindicação 11.

24. Método, de acordo com quasquer das reivindicações 21 a-23, em que a molécula MHC de classe Il é HLA-DRB1*0101.

25. Linfócitos T citotóxicos ativados (CTL), produzidos pelo mé-todo como definido em qualquer uma das reivindicações de 21 a 24 que re-conhecem seletivamente uma célula que expressa de forma aberrante umpolipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos como definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

26. Receptor de célula T (TCR) que reconhece uma célula queexpressa de forma aberrante um polipeptídeo que compreende uma se-qüência de aminoácidos como definida em qualquer uma das reivindicações-1 a 6, sendo que o dito TCR é obtido de linfócitos T citotóxicos (CTL) comodefinidos na reivindicação 24 ou 25, ou de uma molécula funcionalmenteequivalente ao TCR.

27. Receptor de célula T (TCR) codificando um ácido nucléicocomo definido na reivindicação 25 ou 26.

28. Vetor de expressão capaz de expressar um receptor de cé-lula T (TCR) definido na reivindicação 25 ou a reivindicação 26.

29. Método de eliminação de células-alvo em um paciente cu-jas células-alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo que com-preende uma seqüência de aminoácidos como definida em qualquer dasreivindicações 1 a 6, o método compreendendo a administração, ao pacien-te, de um número eficaz de linfócitos T citotóxicos (CTL), conforme definidona reivindicação 25 ou 26.

30. Método para a eliminação de células-alvo em um pacientecujas células-alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo que com-preende uma seqüência de aminoácidos como definida em qualquer dasreivindicações 1 a 6, o método compreendendo as etapas de:(1) obter células T citotóxicas (CTL) do paciente;(2) introduzir, nas ditas células, um ácido nucléico que codi-fica um receptor de célula T (TCR), ou uma molécula funcionalmente equiva-lente, conforme definido nas reivindicações 25 ou 26; e(3) introduzir, no paciente, as células produzidas na etapa (2).

31. Método de eliminação de células-alvo, de acordo com qual-quer das reivindicações 18, 29 ou 30, em que as células-alvo são células decâncer, em particular, células de um tumor sólido que expressa, em sua su-perfície, moléculas MHC de classe II humanas e apresenta um polipeptídeoque compreende uma seqüência de aminoácidos como definida em qualquerdas reivindicações 1 a 6.

32. Uso dos linfócitos T citotóxicos como definidos na reivindi-cação 25 ou 26 na produção de um medicamento para a eliminação de célu-las-alvo em um paciente cujas células-alvo expressam de forma aberranteum polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos como de-finida em qualquer das reivindicações 1 a 6.130551PCTImmatics biotechnologies GmbH