ES2245048T3 - Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso. - Google Patents

Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso.

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ES2245048T3 ES98954421T ES98954421T ES2245048T3 ES 2245048 T3 ES2245048 T3 ES 2245048T3 ES 98954421 T ES98954421 T ES 98954421T ES 98954421 T ES98954421 T ES 98954421T ES 2245048 T3 ES2245048 T3 ES 2245048T3
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Ludger Standker
Markus Meyer
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Hans-Georg Opitz
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Abstract

Péptido designado como Cadherin Derived Growth Factor (CDGF), caracterizado porque se trata de un péptido que se escinde como pro-secuencia durante el procesamiento de la pro-cadherina en cadherina o de un fragmento del mismo, y porque el péptido o el fragmento tiene un efecto de proliferación celular sobre osteoblastos primarios de calvarias de rata, y/o de protección celular y/o de diferenciación celular sobre cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina, y porque presenta una de las secuencias Cadherina-1 humana (28-154): Cadherina-2 humana (24-159): Cadherina-3 humana (27-107): Cadherina-4 humana (21-169): Cadherina-5 humana (26-47): Cadherina-6 humana (19-53): Cadherina-6 humana (19-51): Cadherina-8 humana: Precursor de Cadherina-B humana (Cadherina-11) (23-53): Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-54): Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-52): Cadherina-D humana (Cadherina 13) (23-138): Cadherina-F humana (Cadherina 14) (22-60):

Description

Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso.
Son objeto de la presente invención péptidos (albúmina) con propiedades de proliferación celular, diferenciación celular y/o protección celular, que se denominan "Cadherin Derived Growth Factor" (CDGF - factor de crecimiento derivado de cadherina), así como su uso.
El objeto de la invención consiste en poner a disposición péptidos que presentan propiedades de proliferación celular, protección celular y/o diferenciación celular.
El objeto se cumple mediante los péptidos denominados Factor de Crecimiento Derivado de Cadherina (CDGF), cuya secuencia corresponde a una secuencia parcial de una pre-pro-cadherina, donde la pre-pro-cadherina presenta los dominios secuencia de señal, pro-secuencia, repeticiones de cadherina, región transmembrana y dominio intracelular, caracterizados porque la secuencia del péptido abarca la prosecuencia, falta al menos uno de los otros dominios de la pre-pro-cadherina y porque el péptido presenta propiedades de proliferación celular, protección celular y/o de diferenciación celular.
El documento Cell Adhesion and Communication 2 (1994), 15 a 26, divulga la clonación de 5 cadherinas humanas y describe dominios extracelulares.
La acción de proliferación celular puede ser determinada, por ejemplo, en osteoblastos primarios de calvarias de rata, la acción de protección celular y/o diferenciación celular en cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina.
En una forma de realización preferida, el CDGF es un fragmento de la pro-cadherina, es decir, de la pre-pro-cadherina acortada en la secuencia de señal.
Con especial preferencia se trata de un término N de la pro-cadherina, es decir, la parte que es escindida durante el procesamiento de la pro-cadherina para obtener la cadherina, o bien, de un fragmento acortado en un término N o C.
Con preferencia, el CDGF no presenta ninguna repetición de cadherina.
Las formas de realización preferidas según la invención son péptidos con la secuencia
Cadherina-1 humana (28-154):
CHPGFDAESYTFTVPRRHLERGRVLGRVNFCTGRQRTAYFSLDTRFKVGTDGVITVKRPLRFHNPQIHFLVYAWDSTYRK FSTKVTLNGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKR
Cadherina-2 humana (24-159):
EASGEIALCKTGFPEDVYSAVLSKDVHEGQPLLNVFSNCNGKRKVQYESSEPADFKVDEDGMVYAVRSFPLSSEHAKFLIYAQDKETQEKWQKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQFSKHSGHLQRQKR
Cadherina-3 humana (27-107):
CRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGQEPALFSTDNDDFTVRNGETVQERRSLKERNPLKIFPSKRILRRHKR
Cadherina-4 humana (21-169):
HNEDLTTRETCKAGFSEDDYTALISQNILEGEKLLQVKSSCVGTKGTQYETNSMDFKGADGTVFATRELQVPSEQVAFTV TAWDSQTAEKWDAVLVAQTSSPHSGHKPQKGKKVVALDPSPPPKDTLLPWPQHQNANGLRRRKR
Cadherina-5 humana (26-47):
AGANPAQRDTHSLLPTHRRQKR
Cadherina-6 humana (19-53):
TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRSKR
Cadherina-6 humana (19-51):
TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRS
Cadherina-8 humana:
MLLDLWTPLIILWITLPPCIYMAPMNQSQVLMSGSPLELNSLGEEQRILNRSKR
Precursor de cadherina-B humana (Cadherina-11) (23-53):
FAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKR
Precursor de cadherina-B humana (Cadherina-11) (26-51):
ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS (OB-CDGF)
Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-54):
QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRVKR
Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-52):
QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRV
Cadherina-D humana (Cadherina 13) (23-138):
EDLDCTPGFQQKVFHINQPAEFIEDQSILNLTFSDCKGNDKLRYEVSSPYFKVNSDGGLVALRNITAVGKTLFVHARTPHAEFDMAELVIVGGKDISLQDIFKFARTSPVPRQKRPSVLLLSLFSLACL
Cadherina-F humana (Cadherina 14) (22-60):
VPGWRRPTTLYPWRRAPALSRVRRAWVIPPISVSENHKR.
Con preferencia, la proteína según la invención es una proteína que puede obtenerse del hombre o una de sus variantes que existe naturalmente.
Un objeto de la invención también es una nueva proteína que abarca partes de la secuencia de aminoácidos de CDGF. La invención se refiere con preferencia a un CDGF que contiene las secuencias de aminoácidos precedentemente representadas, pero también puede contener variantes de esas secuencias. Por "variantes" en el sentido de la presente invención se entienden secuencias que, por sustitución, supresión y/o inserción de distintos aminoácidos o breves secciones de aminoácidos, se distinguen de las secuencias de aminoácidos del CDGF precedentemente representadas.
Entre "variantes" se cuentan tanto variaciones alélicas de los CDGF naturales, como también proteínas generadas por tecnología de ADN recombinante (especialmente por mutagénesis in vitro con ayuda de oligonucleótidos sintetizados químicamente), que corresponden a los CDGF respecto de su actividad biológica y/o inmunológica.
Reemplazos conservativos son, por ejemplo, Y por/contra V, K por/contra S, A por/contra S, D por/contra E, G por/contra S, R por/contra Q, R por/contra A, Q por/contra K.
También se reivindican según la invención ácidos nucleicos que codifican los péptidos o los derivados o que son complementarios de estos ácidos nucleicos. En el caso de los ácidos nucleicos se puede tratar, por ejemplo, de ADN, ARN, APN o análogos resistentes a nucleasa. Los ácidos nucleicos según la invención son adecuados para la expresión de los CDGF in vivo en lo que se refiere a una terapia génica, así como nucleótidos antisentido para reducir la expresión. También son objeto de la invención vectores que contienen los ácidos nucleicos. Los vectores son especialmente adecuados para la expresión del péptido en organismos modificados por técnicas genéticas.
Además, la invención se refiere a anticuerpos que están dirigidos contra el CDGF o sus derivados, así como antagonistas / inhibidores que están dirigidos contra CDGF, un derivado o uno de los ácidos nucleicos según la invención. Estas sustancias también son apropiadas como medicamentos para el tratamiento de estados que están relacionados con una sobreexpresión de CDGF, así como para su uso para el diagnóstico.
Los CDGF, derivados, compuestos, ácidos nucleicos, anticuerpos y/o antagonistas / inhibidores según la invención se pueden usar como medicamentos junto con coadyuvantes usuales. Se prefiere en especial que los medicamentos estén disponibles en forma de preparaciones galénicas adecuadas para administración por vía oral, bucal, intravenosa, intramuscular, intracutánea, intratecal, intranasal, local-tópica, así como en aerosol para la aplicación transpulmonar.
La cantidad de medicamento que debe ser administrada es preferentemente de 1 \mug a 1 g por unidad de administración por día.
Los medicamentos según la invención son apropiados para el tratamiento y la prevención de patologías degenerativas, así como metabólicas del hueso, tales como osteoporosis, osteomalacia y osteopenia, del páncreas tal como diabetes mellitus, del músculo tales como distrofias musculares, de los vasos, del sistema nervioso central y periférico, tales como neuropatías periféricas y centrales, del pulmón tal como asma bronquial, del estómago tal como úlcera, así como para la terapia y la prevención de procesos inflamatorios, reacciones inflamatorias alteradas, enfermedades tumorales, así como para la curación de heridas y huesos.
El agente de diagnóstico según la invención contiene anticuerpos poli- o monoclonales contra el péptido según la invención, eventualmente de forma marcada, como con marca fluorescente o radioactiva, para ser usado en un ELISA o RIA en sí conocidos. El agente de diagnóstico según la invención contiene ADN, ARN y/o APN eventualmente de forma modificada y/o marcada para emplear en sistemas de ensayo conocidos por el especialista tales como PCR o Fingerprinting.
Los agentes de diagnóstico son apropiados para el control de niveles de CDGF en tejidos, en secreciones y/o en líquidos corporales tales como plasma, orina y líquido cerebroespinal, así como también como marcadores en trastornos funcionales del hueso, de los músculos, de los vasos, del sistema nervioso, de los órganos linfáticos, del tracto gastrointestinal, del sistema inmunológico y de diabetes, así como procesos inflamatorios y neoplásicos, así como también como marcador en caso de cáncer (marcador de tumores).
Los CDGF según la invención y sus derivados se pueden obtener por aislamiento a partir de hemofiltrado mediante la extracción por intercambio de cationes con posterior elución de las sustancias adsorbidas, una nueva cromatografía por intercambio de cationes del extracto que contiene los péptidos, así como una cromatografía en fase inversa en varias etapas. Los péptidos según la invención se pueden obtener de modo totalmente sintético mediante una síntesis en fase sólida en el sentido de la síntesis de Merrifield o una síntesis en fase líquida según métodos conocidos por el especialista con aminoácidos protegidos y posterior purificación. Los péptidos según la invención también se pueden preparar mediante vectores biotecnológicos usuales a través de procedimientos de expresión heteróloga en sí conocidos por el especialista.
Por ejemplo, un péptido designado como OB-CDGF, se purificó mediante métodos cromatográficos a partir de hemofiltrado humano y se identificó con ayuda de un bioensayo.
El péptido presenta una masa molecular de 3062,8 Da. Hasta ahora, a través del análisis de un ADNc se presentó una pre-pro-secuencia de OB-cadherina. En esta secuencia derivada del ADNc se encuentra la secuencia peptídica según la invención directamente detrás de la secuencia de señal putativa (véase Figura 1).
La caracterización bioquímica del péptido según la invención se efectuó mediante espectrometría de masa y secuenciación del péptido completo. Del análisis de la secuencia del péptido biológicamente activo resultó la siguiente secuencia de aminoácido para OB-CDGF:
ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS
En el espectro de masa ESI (Elektrospray Ionisation) del OB-CDGF se determinó la masa molecular (MW) con:
OB-CDGF, MW 3062,8 Da
El péptido según la invención se puede obtener mediante un procedimiento de purificación a partir de hemofiltrado humano. Este procedimiento de acuerdo con el documento DE 36 33 707, que divulga la obtención de albúminas a partir de hemofiltrado, se efectuó de una forma modificada.
Durante la ultrafiltración de la sangre de enfermos renales se producen grandes cantidades de hemofiltrado. El hemofiltrado humano se diluye eventualmente con agua y se acidifica. El valor del pH varía preferentemente de 1,5 a 3,5, en especial de 2,5 a 3,0. Posteriormente, el hemofiltrado es guiado a través de un intercambiador de cationes, por ejemplo un material de soporte modificado con grupos de ácido sulfónico (Fraktogel SP - 650 (M), Merck, Darmstadt). Los péptidos unidos con el intercambiador de cationes se eluyen con una disolución salina con una concentración relativamente elevada. La intensidad iónica de la disolución de elución corresponde, en este caso, aproximadamente a una disolución de acetato de amonio 0,5 a 1 molar.
El eluato recolectado se somete a otra cromatografía por intercambio de cationes. Esta cromatografía es preferentemente una elución en etapas con tampones con valores crecientes del pH.
Las fracciones que contienen el péptido según la invención se continúan purificando mediante cromatografía preparativa de fase inversa y posterior cromatografía semipreparativa de fase inversa, por ejemplo en materiales de soporte modificados en C4. El grado de pureza se verifica preferentemente mediante cromatografía analítica de fase inversa en materiales de soporte modificados en C18.
La sustancia obtenida por purificación cromatográfica se condujo hacia la clarificación estructural. La determinación de la masa molecular del péptido nativo se efectuó mediante un espectrómetro de masa por electronebulización. El análisis de secuencia se llevó a cabo a través de una degradación de Edman de los péptidos, así como de derivados químicamente modificados con un secuenciador ABI 473 A.
La síntesis total se efectuó en las usuales fases sólidas en el sentido de la síntesis de Merrifield. La estrategia de síntesis y la estructura del péptido y de sus derivados con los aminoácidos correspondientemente protegidos son conocidos por el especialista.
El OB-CDGF según la invención, así como su ADNc, su gen y análogos, fragmentos y derivados del péptido, del ADNc y del gen, así como anticuerpos, que neutralizan la acción del OB-CDGF, pueden ser utilizados como medicamentos.
Figura 1 muestra la estructura del dominio de las cadherinas.
Figura 2 muestra los cromatogramas del aislamiento del OB-CDGF a partir de hemofiltrado. La identificación se realiza mediante un ensayo de proliferación en osteoblastos primarios. Los detalles de la purificación se pueden deducir del Ejemplo 1.
Figura 3 muestra el espectro de masa por electronebulización del OB-CDGF aislado. A partir de los iones protonados dos y tres veces se calcula un peso molecular de 3.062 Dalton.
Figura 4 muestra la curva dosis-efecto del OB-CDGF sintetizado químicamente sobre la proliferatina de células óseas primarias. En Figura 4a se muestra el efecto durante un tiempo de incubación de 72 horas, en Figura 4b, durante un tiempo de incubación de 48 horas. Se midió la absorción de bromodesoxiuridina (BrdU). La inserción de BrdU se midió por medio de ELISA.
Figura 5 muestra la unión específica de OB-CDGF marcado con yodo a osteoblastos primarios (monocapa) y a la matriz extracelular (ecm) de osteoblastos primarios. Se representa el desplazamiento del OB-CDGF marcado por OB-CDGF no marcado con una creciente concentración de la cantidad de OB-CDGF no marcado.
Figura 6 muestra la estimulación de osteoblastos primarios mediante la adición de OB-CDGF. La concentración intracelular de calcio aumenta mediante la adición de OB-CDGF. Se midió el contenido de calcio en presencia de Fura 2 en células individuales en el microscopio fluorescente.
Figura 7 es un Western blot que comprueba la actividad intracelular de la MAP-quinasa. Esta actividad rige como parámetro para la respuesta celular mediada por receptor y calcio a OB-CDGF en osteoblastos primarios. La banda superior (46 kD) muestra la concentración de la MAP-quinasa tras la estimulación con suero fetal de ternero FCS (izquierda) u OB-CDGF (derecha) en función del tiempo de incubación. La banda inferior muestra un control interno para la separación celular / Western blot.
La invención se explica mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Extracción por lotes de hemofiltrado
Se ajustan 800 a 1.000 l de hemofiltrado con HCl a un valor pH de 2,7 y se diluyen con agua a una conductividad de 5,5 mS/cm y se aplican con una velocidad de flujo de 3 l/min en un fuerte intercambiador de cationes.
Condiciones de cromatografía
Columna: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Material de columna: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
Flujo: 3 l/min
Detección: 280 nm, pH, conductividad
Tampón A: hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm
Tampón B: acetato de amonio 0,5 M
Equipo: sistema de cromatografía Autopilot, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Después de aplicar el total de 1.000 l de líquido durante la noche, se enjuaga con varios volúmenes de columna de HCl 5 mM. La elución de los péptidos unidos se efectúa como elución en lotes con acetato de amonio 0,5 M. En este caso se logra una completa elución de los péptidos a través del creciente valor del pH (6,8 - 7,2) y creciente conductividad (56 mS/cm) en aproximadamente 5 l de eluato.
Primera separación preparativa
Los eluatos de acetato de amonio de la extracción por lotes se combinan en cantidades de 5.000 a 10.000 l de hemofiltrado-péptido. Tras ajustar a un valor pH de 2,7, el extracto de péptido se aplica sobre el intercambiador catiónico preparativo bajo la adición de agua-VE con una conductividad de 5,5 mS/cm.
Condiciones de cromatografía
Columna: Vantage 250 VA
Material de columna: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm x 20 cm
Flujo: de hasta 3 l/min durante la aplicación
0,5 a 1 l durante la elución
Detección: 280 nm, pH, conductividad
Muestra: hemofiltrado pH 2,7, conductividad 5,5 mS/cm
Equipo: sistema de cromatografía Autopilot, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Después de la aplicación del extracto en bruto durante 240 min., se enjuaga la columna con HCl 0,01 M, hasta que la conductividad sea menor que 1 mS/cm. En este caso, la elución se realiza en varias etapas con los tampones indicados a continuación
Tampón (mS/cm) Valor pH Sustancias tampón Conductividad
Tampón de lavado: 2,0 HCl 0,01 M 1
Tampón de elución 1: 3,6 ácido cítrico-1-hidrato 0,1 M 2,9
Tampón de elución 2: 4,5 ácido acético 0,1 M + acetato de sodio 0,1 M 4,0
Tampón de elución 3: 5,0 ácido málico 0,1 M 6,2
Tampón de elución 4: 5,6 ácido succínico 0,1 M 6,1
Tampón de elución 5: 6,6 NaH_{2}PO_{4} 0,1 M 4,9
Tampón de elución 6: 7,4 NaH_{2}PO_{4} 0,1 M 6,7
Tampón de elución 7: 9,0 carbonato de amonio 0,1 M 6,7
Los eluatos 1-7 se designan como pool de pH I-VII. Se recolectan por separado. La elución se lleva a cabo hasta lograr una línea base, donde para los distintos pools de pH I a VII se alcanzan volúmenes de elución de 10 a 25 l. El cromatograma se muestra en Figura 2a.
Segunda separación preparativa
Los distintos pools de pH para el fraccionamiento y la simultánea desalinización son separados mediante una cromatografía en fase inversa.
Condiciones de cromatografía
Columna: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Material de columna: Source RPC, 15 Fm 10 x 12,5 cm (FineLine 100)
Flujo: 150 ml/min (FineLine 100)
Detección: 280 nm, conductividad, pH
Tampón A: HCl 10 mM
Tampón B: 80% de acetonitrilo en HCl 10 mM
Gradiente: 0-60% de tampón B en 5 volúmenes de columna
Después de la aplicación del pool de pH, se enjuaga la columna con el tampón A. Durante la elución se recolectan fracciones de 200 ml cada una. El cromatograma se muestra en Figura 2 b. En el bioensayo se verifican alícuotas de las fracciones. Las fracciones son liofilizadas y almacenadas a -20EC.
Cromatografía C18 semipreparativa de fase inversa
La fracción 13 activa en el bioensayo del pool de pH VI fue separada a través de una columna semipreparativa de fase inversa. Las fracciones 5-7 contenían la sustancia según la invención.
Condiciones de cromatografía
Columna: columna de acero de 4,7 cm x 30 cm
Material de relleno: Vydac RP-C18 15-20 Fm, 300 \ring{A}
Tampón A: 0,1% de TFA
Tampón B: 0,1% de TFA, 80% de acetonitrilo
Gradiente: 5 - 50% de B en 45 min, 50 - 100% de B en 10 min
Flujo: 42 ml/min
Detección: 214 nm y 280 nm
Equipo de cromatografía: BioCad
Fracciones: cada 1,5 min después de inicio del gradiente.
Se muestra el cromatograma en Figura 2c.
Determinaciones de las masas
Se determinaron todas las masas de los péptidos nativos y sintéticos en el espectrómetro de masa por electronebulización (ESI-MS). Las masas moleculares del péptido se determinaron de acuerdo con los números másicos (MW) que se indicaron previamente. El espectro de masa se indica en Figura 3.
Determinación de la secuencia
El péptido purificado, nativo y preparado por síntesis fue analizado por degradación de Edman en un secuenciador ABI 473 A usando el programa estándar. Las muestras se aplicaron en una membrana de polibreno en cantidades entre 100 y 400 pmol. En concordancia con los resultados de las determinaciones de masas, resultó la siguiente secuencia de aminoácidos:
ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS
Comparación del banco de datos
Se efectuó una comparación del banco de datos con ayuda del paquete del programa HUSAR en los bancos de datos SwissProt y EMBL-Nukleinsäure. La secuencia equivale a los aminoácidos derivados del ADNc del precursor de la cadherina-11 humana (cadherina de osteoblastos, propéptido, aminoácidos 26-51).
Resíntesis
La síntesis del péptido con la secuencia ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS se realizó según el método en fase sólida de Merrifield, partiendo de aminoácidos protegidos con Fmoc. El péptido sintético se purificó mediante una cromatografía en fase inversa. La identidad y la pureza de la sustancia se comprobó con ayuda de espectrometría de masa, análisis de secuencias y electroforesis de zonas capilares.
Determinación de la actividad biológica de OB-CDGF (efecto de proliferación celular)
El aislamiento del OB-CDGF se realizó mediante su actividad biológica en un ensayo de proliferación de osteoblastos primarios. Para ello, se liofilizaron, en cada caso, alícuotas de las distintas etapas cromatográficas que se describieron en el Ejemplo 1 y luego se sometieron al ensayo biológico. Las fracciones, de las que resultó en cada caso una señal positiva, se sometieron a una ulterior purificación.
El ensayo mide la proliferación de las células, después de que se mantuvieron en un medio sin suero con 1 mg/ml de albúmina de suero ovino, se añadieron luego las muestras y al cabo otras 48 horas se determinó la inserción de ^{3}H-timidina o bromodesoxiuranosina (Brdu). Como control positivo se utilizan en este ensayo factores que promueven el crecimiento óseo, tales como IGF o angiotensina o suero fetal de ternero (FCS).
Los experimentos se realizaron según Pfeilschifter et al., Endocrinology 126, 703, 1990.
La obtención de osteoblastos primarios se efectuó a través de digestión secuencial mediante colagenasa de calvarias fetales de rata. En este caso se obtuvieron 5 fracciones celulares. El pool de las fracciones celulares 3-5 se cultivó in vitro. El cultivo de las células se realizó en una incubadora con una humedad relativa ambiente de 95%, un contenido de CO_{2} de 5% y una temperatura de 37EC. Se estudiaron las sustancias de ensayo en cultivos del primero, segundo o tercer pasaje celular.
Para el estudio, las células fueron sembradas al menos 95 horas previas a la adición de las sustancias de ensayo, en una cantidad celular de 7 x 10^{3} células (en 100 \mul de medio de cultivo / pocillo en placas de microtitulación (MTP) con fondo redondo. En este caso se utilizó como medio de cultivo MEM Dulbecco (más 4,5 g/l de glucosa más
3,7 g/l de NaHCO_{3} sin glutamina), al que se añadió suero fetal de ternero al 5% (FKS) y 5000 U/ml de penicilina / estreptomicina.
Inmediatamente antes de añadir las sustancias de ensayo al cultivo celular, se realizó un intercambio del medio por 150 \mul de medio, el que, en lugar de FKS, contenía 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (RSA). Las sustancias de ensayo se añadieron en las concentraciones deseadas al medio con contenido de RSA. Como control positivo se preparó, además, TGF\beta_{1} (Transforming growth factor \beta_{1}) en concentraciones de 0,1-0,2 ng/ml. Por cada control (positivo) o bien concentración de sustancia se efectuaron tres determinaciones.
La incubación de los cultivos celulares con sustancias de ensayo se realizó durante 24 a 72 horas, en las últimas 3 horas adicionalmente en presencia de la sonda de timidina (adición de 1 \muCi metil-^{3}H-timidina / cavidad de MTP en 20 \mul de disolución de PBS).
Al final del tiempo de incubación se lavaron los cultivos celulares 3 veces con disolución salina al 0,9% y, a continuación, se mezcló cada vez con 100 \mul de líquido de centelleo (OptiPhase Supermix^{J} de la empresa Wallac). Posteriormente se efectuó la medición de la radiactividad incluida en el ADN en un contador de líquido de centelleo (1450 MicroBeta^{J} de la empresa Wallac) en cpm.
En la evaluación, los cultivos celulares que exclusivamente recibieron medio con contenido de RSA, sirvieron como controles (100%).
El OB-CDGF presenta, en función de la dosis, una acción promotora del crecimiento sobre osteoblastos primarios (células óseas). Esta acción biológica fue comprobada tanto para el péptido nativo, como también para el péptido obtenido por síntesis.
Ejemplo 2 Determinación de la actividad biológica de BR-CDGF
El péptido correspondiente a la región del CDGF de la Cadherina-12 (BR-Cadherina; N-Cadherina-2) con la secuencia de aminoácidos QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRV, que fue sintetizado según la síntesis en fase sólida -como se describió en el Ejemplo 1 para el OB-CDGF-, se estudió respecto de su acción estimuladora de supervivencia sobre cultivos primarios de neuronas de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina.
El modelo de ensayo se estructuró del siguiente modo:
Cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina (desarrollo embrionario E10)
La preparación y el cultivo se realizaron como se describió por Borasio G. D., John J., Wittinghofer A., Barde Y.-A., Sendtner M. Heumann R. (1989) Neuron 2, 1087-1096. Para determinar los efectos estimuladores de la supervivencia de principios activos, se utiliza la determinación del contenido celular de LDH después de un tiempo de incubación de 48 horas. Para ello, se retira el medio de cultivo golpeando la placa. Sólo las células vitales se mantienen adheridas al fondo de la placa y pueden entonces ser determinadas. Para determinar el contenido de LDH se utiliza el kit de verificación de la citotoxicidad de LDH de Boehringer Mannheim (BM).
Los cultivos se colocan como duplicados en placas de microtitulación de 96 pocillos. En cada placa se lleva una curva de graduación de NGF y se expresa la actividad biológica de las sustancias en pg/ml de equivalentes de NGF. Como sustancia de referencia de bajo peso molecular, se conlleva el derivado de estaurosporina K252a en una concentración de 300 nmol/l.
El péptido mostró en función de la concentración una acción estimuladora de la supervivencia sobre estas neuronas primarias. Estas células son células nerviosas típicas, de modo que el BR-CDGF constituye un factor de neuroprotección.
Ejemplo 3 Determinación de la actividad biológica de CAD6-CDGF (efecto de protección celular)
El péptido correspondiente a la región de CDGF de la Cadherina-6 con la secuencia de aminoácidos TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRS, que fue sintetizado según la síntesis en fase sólida -como se describió en el Ejemplo 1 para el OB-CDGF-, se estudió respecto de su acción estimuladora de supervivencia sobre cultivos primarios de neuronas de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina. El modelo de ensayo se estructuró como se describió en el Ejemplo 2.
El péptido mostró en función de la concentración una acción estimuladora de supervivencia sobre estas neuronas primarias.
Ejemplo 4 Ensayo de unión de OB-CDGF marcado en osteoblastos
La unión de péptidos osteoproliferativos con monocapas de osteoblastos neonatales de ratas se realizó utilizando péptidos marcados con ^{125}I. La yodación se realizó con cloramina T. La actividad específica de los péptidos fue de 100.000 cpm/ng. Los estudios de unión se realizaron en capas confluentes, así como en la matriz extracelular de un primer pasaje de osteoblastos neonatales de ratas. Las células se incubaron en un medio con contenido de suero durante 24 horas, y luego se lavaron cuatro veces con PBS y se incubaron durante 2 horas a 4ºC en 250 \mul del tampón de ensayo (HEPES 20 mM, 0,1 mg/ml de BSA, pH 7,0) con 80.000 cpm del péptido marcado con yodo en presencia de diferentes concentraciones del péptido no marcado. Luego se retiró el tampón de incubación, las células se lavaron cuatro veces con PBS frío y se solubilizaron con NaOH 1 M. La actividad relacionada con las células fue determinada con ayuda de un contador gamma. Los correspondientes resultados del ensayo están representados en Figura 5. Al aumentar la concentración de OB-CDGF no marcado, disminuye la cantidad de OB-CDGF marcado específicamente unido.
Ejemplo 5 Liberaciones de calcio intracelular en osteoblastos primarios
La cadena de señales intracelulares para calcio^{2+} se mide en células individuales de osteoblastos. La actividad intracelular de Ca^{2+} de osteoblastos primarios se mide con el colorante Fura-2 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania) sensible al Ca^{2+}. Los osteoblastos primarios se cultivan sobre portaobjetos de vidrio (diámetro de 30 mm) durante uno a tres días, los que están fijados a una cámara de perfusión de un microscopio invertido (Axiomat IDC-UV, Zeiss, Göttingen, Alemania). Las células se incubaron durante 10 minutos a 37ºC en una disolución tampón de Krebs-Henseleit modificada (KHB, composición NaCl 145 mM, K_{2}HPO_{4} 1,6 mM, KH_{2}PO_{4}0,4 mM, gluconato de calcio 1,3 mM, MgCl_{2} 1,0 mM, D-glucosa 5,0 mM, pH 7,4) con 5 \muM de Fura-2/éster acetoximetílico disuelto en 0,1 g/l de Pluronic F-127 (Sigma, Deisenhofen, Alemania) en RPMI 1640 (PAA, Cölbe, Alemania).
A la incubación siguió un período de equilibrio de 10 a 15 min, en el cual las células se enjuagan con una disolución de KHB a 37º con una velocidad de perfusión de 5 ml/min. Los osteoblastos primarios cargados con Fura-2 se miden a 340, 360, 380 nm con una rueda filtrante de alta velocidad (velocidad de rotación 10 hercios), un tubo contador de fotones individuales (Hamamatsu, Herrsching, Alemania) y una lámpara de xenón de cuarzo (XBO 75 W/OFR, Zeiss, Alemania) como fuente de luz / impulsos. La emisión de Fura-2 se mide a través de un filtro de onda larga a 510 nm con una lente Ultrafluar 125 x de inmersión en glicerol. Todas las mediciones se realizan en las distintas células. El campo de medición se elige mediante un orificio ajustable de aproximadamente 8 \mum de diámetro. Se evalúa la relación de la emisión de fotones después de excitar a 340 y 380 nm. Los datos en bruto se corrigen respecto de la autofluorescencia y del ruido. El valor de fondo así obtenido se descuenta de las señales de medición en cada experimento. Los datos en bruto se calculan y se median 10 puntos de datos adyacentes, a los efectos de lograr una resolución de tiempo de 1 Hz. La fluorescencia a 360 nm se utiliza para verificar la actividad del calcio. Todas las muestras se disuelven en un tampón de fosfato previo al experimento y se miden al menos durante 1 a 2 minutos. La calibración del Ca^{2+} se mide al final de cada experimento mediante la incubación de las células con el ionóforo Ca^{2+}, Ionomicina (10 \mumol, Sigma, Deisenhofen, Alemania) en presencia de 1,3 mmol de Ca^{2+}, o bien la ausencia nominal (etilenglicol-bis(\beta-aminoetiléter 5 mM), ácido N,N,N',N'-tetraacético, en presencia de EGTA). Sólo se utilizan calibraciones, tanto con valores máximos como también mínimos, para la determinación del valor de Ca^{2+}. En los experimentos, en los cuales no fue exitosa la doble calibración, se utiliza el valor medio de todas las calibraciones. Los correspondientes resultados se muestran en Figura 6.
Ejemplo 6
Como ya se mostró en el Ejemplo 5, mediante la incubación con CDGF se puede inducir una liberación intracelular de calcio en osteoblastos primarios. A los efectos de caracterizar con mayor detalle esta respuesta fisiológica, se estudió el siguiente recorrido de señal intracelular ("corriente abajo" del calcio). Una posible cascada de transducción de señales es la activación de la MAP-quinasa, una enzima que desempeña un papel esencial en la transmisión de señales del citoplasma al núcleo celular. Al transmitirse la señal, se produce una fosforilación de la enzima que puede ser detectada con un anticuerpo específico. La detección de esta proteína se puede efectuar, por lo tanto, en el Western blot y, debido al estímulo, constituye una medida para la fosforilación, como también para la expresión. Se incubaron osteoblastos primarios durante diferentes períodos con cadherina o bien con controles (FCS). Mediante la adición del anticuerpo se comprobó en el Western blot la expresión de la enzima (MAP-quinasa) en la célula. Los resultados se muestran en Figura 7. Se puede apreciar claramente que, sin un estímulo como FCS u OB-CDGF, no se produce expresión alguna, mientras que después de la estimulación aparece una clara banda del tamaño esperado de la MAP-quinasa (banda superior). Cuanto más se haya estimulado con OB-CDGF, tanto más clara se tornaba la banda visible. Esto muestra unívocamente que el OB-CDGF lleva a una expresión de la MAP-quinasa intracelular. De aquí se puede deducir que el CDGF actúa como mediador del receptor a través del calcio y que el consiguiente procesamiento de señal pasa a través de la MAP-quinasa.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Wolf-Georg Forssmann
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Feodor-Lynen-Strasse 31
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Hannover
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 30625
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Factor de crecimiento derivado de cadherina y su uso
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
CANTIDAD DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
VERSIÓN PARA COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
COMPUTADORA: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 78 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 144 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Ala Asn Pro Ala Gln Arg Asp Thr His Ser Leu Leu Pro Thr}
\sac{His Arg Arg Gln Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro Ala Lys}
\sac{Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu Asn Arg}
\sac{Ser Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro Ala Lys}
\sac{Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu Asn Arg}
\sac{Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Leu Asp Leu Trp Thr Pro Leu Ile Ile Leu Trp Ile Thr Leu}
\sac{Pro Pro Cys Ile Tyr Met Ala Pro Met Asn Gln Ser Gln Val Leu Met}
\sac{Ser Gly Ser Pro Leu Glu Leu Asn Ser Leu Gly Glu Glu Gln Arg Ile}
\sac{Leu Asn Arg Ser Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg Pro Ser Phe His Gly His}
\sac{His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln Arg Ser Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Arg Gly His Leu Arg Pro Ser Phe His Gly His His Glu Lys}
\sac{Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln Arg Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Gln Gln Thr Leu Ala Thr Glu Pro Arg Glu Asn Val}
\sac{Ile His Leu Pro Gly Gln Arg Ser His Phe Gln Arg Val Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(Xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Pro Gln Pro Gln Gln Thr Leu Ala Thr Glu Pro Arg Glu Asn Val}
\sac{Ile His Leu Pro Gly Gln Arg Ser His Phe Gln Arg Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 129 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
6
7 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: no se conoce
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no se conoce
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Gly Trp Arg Arg Pro Thr Thr Leu Tyr Pro Trp Arg Arg Ala}
\sac{Pro Ala Leu Ser Arg Val Arg Arg Ala Trp Val Ile Pro Pro Ile Ser}
\sac{Val Ser Glu Asn His Lys Arg}

Claims (9)

1. Péptido designado como Cadherin Derived Growth Factor (CDGF), caracterizado porque se trata de un péptido que se escinde como pro- secuencia durante el procesamiento de la pro-cadherina en cadherina o de un fragmento del mismo, y porque el péptido o el fragmento tiene un efecto de proliferación celular sobre osteoblastos primarios de calvarias de rata, y/o de protección celular y/o de diferenciación celular sobre cultivos de células nerviosas primarias de ganglios de la radícula dorsal de embriones de gallina, y porque presenta una de las secuencias
Cadherina-1 humana (28-154):
CHPGFDAESYTFTVPRRHLERGRVLGRVNFCTGRQRTAYFSLDTRFKVGTDGVITVKRPLRFHNPQIHFLVYAWDSTYRKFSTKVTLNGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKR
Cadherina-2 humana (24-159):
EASGEIALCKTGFPEDVYSAVLSKDVHEGQPLLNVFSNCNGKRKVQYESSEPADFKVDEDGMVYAVRSFPLSSEHAKFLIYAQDKETQEKWQKLSLKPTLTEESVKESAEVEEIVFPRQFSKHSGHLQRQKR
Cadherina-3 humana (27-107):
CRAVFREAEVTLEAGGAEQEPGQALGKVFMGQEPALFSTDNDDFTVRNGETVQERRSLKERNPLKIFPSKRILRRHKR
Cadherina-4 humana (21-169):
HNEDLTTRETCKAGFSEDDYTALISQNILEGEKLLQVKSSCVGTKGTQYETNSMDFKGADGTVFATRELQVPSEQVAFTVTAWDSQTAEKWDAVLVAQTSSPHSGHKPQKGKKVVALDPSPPPKDTLLPWPQHQNANGLRRRKR
Cadherina-5 humana (26-47):
AGANPAQRDTHSLLPTHRRQKR
Cadherina-6 humana (19-53):
TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRSKR
Cadherina-6 humana (19-51):
TLSTPLSKRTSGFPAKKRALELSGNSKNELNRS
Cadherina-8 humana:
MLLDLWTPLIILWITLPPCIYMAPMNQSQVLMSGSPLELNSLGEEQRILNRSKR
Precursor de Cadherina-B humana (Cadherina-11) (23-53):
FAPERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRSKR
ERRGHLRPSFHGHHEKGKEGQVLQRS (OB-CDGF)
Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-54):
QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRVKR
Precursor de cadherina encefálica-cadherina-C humana (Cadherina-12) (24-52):
QPQPQQTLATEPRENVIHLPGQRSHFQRV
Cadherina-D humana (Cadherina 13) (23-138):
EDLDCTPGFQQKVFHINQPAEFIEDQSILNLTFSDCKGNDKLRYEVSSPYFKVNSDGGLVALRNITAVGKTLFVHARTPHAEFDMAEELVIVGGKDISLQDIFKFARTSPVPRQKRPSVLLLSLFSLACL
o
Cadherina-F humana (Cadherina 14) (22-60):
VPGWRRPTTLYPWRRAPALSRVRRAWVIPPISVSENHKR.
2. Ácidos nucleicos que codifican el CDGF de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Ácido nucleico caracterizado porque es complementario del ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Vectores que contienen ácidos nucleicos de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 2 ó 3.
5. Anticuerpos caracterizados porque están dirigidos contra CDGF de acuerdo con la reivindicación 1.
6. Medicamentos que contienen CDGF de acuerdo con la reivindicación 1, ácidos nucleicos de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 2 ó 3 y/o anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 5 junto con coadyuvantes usuales.
7. Medios de diagnóstico que contienen CDGF de acuerdo con la reivindicación 1, ácidos nucleicos de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 2 ó 3 y/o anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 5 junto con coadyuvantes usuales.
8. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 6 en forma de preparaciones galénicas adecuadas para la administración por vía oral, intravenosa, intramuscular, intracutánea, intratecal, así como en aerosol para la aplicación transpulmonar.
9. Procedimientos para la preparación de CDGF de acuerdo con la reivindicación 1,
- a partir de hemofiltrado por extracción de intercambio de cationes con posterior elución de las sustancias adsorbidas, una nueva cromatografía por intercambio de cationes del extracto que contiene los péptidos, así como una cromatografía en fase inversa de varias etapas, o
- por síntesis en fase sólida en el sentido de la síntesis de Merrifield, así como síntesis en fase líquida según métodos en sí conocidos por el especialista con aminoácidos protegidos y purificación, o
- por procedimientos de expresión heteróloga en sí conocidos por el especialista mediante vectores biotecnológicos convencionales de acuerdo con la reivindicación 5.
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