BRPI0615547A2 - produto alimentìcio, preparação farmacêutica, método de fabricação de produto alimentìcio, método de fabricação de preparação farmacêutica, uso do produto alimentìcio, usos da preparação farmacêutica, método de fornecimento de benefìcios à saúde do intestino e implementos de liberação para uso com produto alimentìcio - Google Patents

Abstract

PRODUTO ALIMENTìCIO, PREPARAçãO FARMACêUTICA, MéTODO DE FABRICAçãO DE PRODUTO ALIMENTìCIO, MéTODO DE FABRICAçãO DE PREPARAçãO FARMACêUTICA, USO DO PRODUTO ALIMENTICIO, USOS DA PREPARAçãO FARMACêUTICA, MéTODO DE FORNECIMENTO DE BENEFìCIOS à SAúDE DO INTESTINO E IMPLEMENTOS DE LIBERAçãO PARA USO COM PRODUTO ALIMENTìCIO A presente invenção refere-se a produtos alimentícios ou preparações farmacêuticas que compreendem anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são ativos no intestino e mícroorganísmos probióticos independentes dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos Particularmente, a presente invenção refere-se a método de preparação de produtos alimentícios e preparações farmacêuticas que compreendem os anticorpos ou fragmentos de anticorpos e microorganísmos probjótícos e o uso desses produtos para fornecer benefícios à saúde de seres humanos

Description

"PRODUTO ALIMENTÍCJO, PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DEFABRICAÇÃO DE PRODUTO ALIMENTÍCIO, MÉTODO DE FABRICAÇÃODE PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO PRODUTO ALIMENTÍCIO,USOS DA PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE FORNECIMENTODE BENEFÍCIOS À SAÚDE DO INTESTINO E IMPLEMENTOS DELIBERAÇÃO PARA USO COM PRODUTO ALIMENTÍCIO"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a produtos alimentícios oupreparações farmacêuticas que compreendem anticorpos ou fragmentos .deanticorpos que são ativos no intestino e microorganismos probióticosindependentes dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos. Particularmente, apresente invenção refere-se a método de preparação de produtos alimentíciose preparações farmacêuticas que compreendem os anticorpos ou fragmentosde anticorpos e microorganismos probióticos e ao uso desses produtos parafornecer benefícios à saúde de seres humanos.

Antecedentes da Invenção

Anticorpos (também denominados imunoglobulinas) sãoglicoproteínas que reconhecem especificamente moléculas exógenas.Estas moléculas exógenas reconhecidas são denominadas antígenos.Quando antígenos invadem seres humanos ou animais, é acionadareação imunológica que envolve a produção de anticorpos por linfócitosB. Por meio desta reação imunológica, microorganismos, parasitasmaiores, vírus e toxinas bacterianas podem ser tornados inofensivos. Acapacidade exclusiva de anticorpos de reconhecer especificamente eunir-se com alta afinidade a virtualmente qualquer tipo de antígeno torna-os moléculas úteis em pesquisa médica e científica.

Em vertebrados, são descritas cinco classes de imunoglobulina,que incluem IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, todas as quais diferem de função nosistema imunológico. IgGs são as imunoglobulinas mais abundantes nosangue. Elas possuem estrutura básica de dois polipeptídeos de cadeia pesada(H) idênticos e dois polipeptídeos de cadeia leve (L) idênticos. As cadeias HeLsão mantidas juntas por pontes de dissulfeto e uniões não covalentes. Aspróprias cadeias podem ser divididas em domínios variáveis e constantes. Osdomínios variáveis da cadeia pesada e leve (VH e VL) que são extremamentevariáveis em seqüências de aminoácidos estão localizados na parte N-terminalda molécula de anticorpo. Vh e Vl juntos formam o local de reconhecimento deantígenos exclusivo. As seqüências de aminoácidos dos domínios C-terminaisrestantes são muito menos variáveis e são denominadas ChI1 Ch2, Ch3 e CL.

A parte de ligação não antígeno de molécula de anticorpo édenominada domínio constante Fc e media diversas funções imunológicas, taiscomo união a receptores sobre células alvo e fixação de complementos.

O local de ligação de antígenos exclusivo de anticorpo consistedos domínios variáveis de cadeia leve e pesada (VH e VL). Cada domíniocontém quatro regiões de estrutura (FR) e três regiões denominadas CDRs(regiões de determinação de complementaridade) ou regiões hipervariáveis. AsCDRs variam fortemente de seqüência e determinam a especificidade doanticorpo. Os domínios Vl e Vh juntos formam local de ligação que uneantígeno específico.

Vários fragmentos de anticorpos de ligação de antígenosfuncionais poderão ser elaborados por meio de proteólise de anticorpos,utilizando, por exemplo, digestão de papaína, digestões de pepsina ou outrasabordagens enzimáticas. Esse método pode ser utilizado para gerar Fab, Fv oufragmentos com domínio isolado.

Fragmentos de Fab são os domínios de ligação de antígenos demolécula de anticorpo. Fragmentos de Fab podem ser preparados por meio dedigestões de papaína de anticorpos inteiros. Fragmentos de Fv são ofragmento mínimo (cerca de 30 kDa) que ainda contém o local de ligação deantígenos inteiros de anticorpo IgG inteiro. Fragmentos de Fv são compostosde domínios de cadeia pesada variável (Vh) e cadeia leve variável (VL). Esteheterodímero, denominado fragmento Fv (para variável de fragmento) ainda écapaz de unir o antígeno.

Desta forma, fragmentos de anticorpos menores podem sersintetizados e estes fragmentos terão vantagem sobre anticorpos inteiros emaplicações que necessitem de penetração nos tecidos e rápida liberação dosangue ou rim.

A produção in vitro de anticorpos tem sido possível desde odesenvolvimento de tecnologia de anticorpos monoclonais. Isso gerou o uso deanticorpos em muitas áreas que incluem pesquisa, medicina e, recentemente,em aplicações de consumo. Estas aplicações, entretanto, dependem daprodução em larga escala de anticorpos e geralmente envolvem o uso dopróprio anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou seja, a proteína colhida desistema de expressão de anticorpos.

Escherichia coli vem sendo utilizado como sistema de expressãopara a produção de fragmentos de anticorpos. E. coli é facilmente acessívelpara modificações genéticas, requer meios baratos e simples para crescimentorápido e podem ser facilmente cultivados em fermentadores, permitindo aprodução em larga escala de proteínas de interesse.

Além disso, em artigo recente, In situ Delivery of PassiveImmunity by Lactobacilli Producing Single-Chain Antibodies, Nature Biotechnol.(2002) 20, 702-706, Kruger et al relataram a produção de fragmentos deanticorpos scFv contra Streptococcus mutans pela bactéria de grau alimentíciograma positiva Lactobacillus zeae. Este tratamento envolveu o fornecimento insitu de imunidade passiva em locais da mucosa oral somente quando sedemonstra que os fragmentos de anticorpos de cadeia isolada fornecemproteção contra cárie dental em ratos.

Lactobacilos foram pesquisados com relação às suas propriedadesantidiarréicas desde a década de 1960 (Beck, C. et al, Beneficiai Effects ofAdministration of Lactobacillus acidophilus in Diarrhoeal and other IntestinalDisorders, Am. J. GastroenteroL (1961) 35, 522-30. Quantidade limitada detestes controlados recentes demonstrou que certas linhagens de Iactobacilospodem possuir propriedades terapêuticas e profiláticas em gastroenterite viralaguda (Mastretta, E. et al, Effect of Lactobacillus CG and Breast-Feeding in thePrevention of Rotavirus Nosocomial Infeetion, J. Pediatr; Gastroenteroi Nutr:(2002) 35, 527-531). Também se demonstrou que linhagens selecionadas deLactobacillus casei e Lactobacillus plantarum exercem fortes efeitos adjuvantessobre a reação imunológica sistêmica e da mucosa.

Lactobacilos são bactérias bem conhecidas aplicadas nafabricação de produtos alimentícios. Iogurte, por exemplo, é normalmentefabricado por meio de fermentação de leite com, entre outros, linhagem deLactobacillus. O produto acidificado fermentado, que ainda contémLactobacillus viável, é resfriado e consumido no momento desejado.

Outra aplicação de Lactobacillus em produtos alimentícios é aprodução de produtos de carne, tais como lingüiças. Aqui, o Lactobacillus éadicionado à massa de carne antes da aplicação do invólucro, seguido porperíodo de amadurecimento no qual tem lugar o processo de fermentação.

Ainda outra aplicação de Lactobacillus na fabricação de produtosalimentícios é o tratamento em salmoura de legumes tais como repolho,cenoura, azeitonas ou beterraba. Aqui, o processo de fermentação naturalpode ser controlado por meio da adição de cultivo inicial de Lactobacillusapropriado.

A aplicação de Lactobacillus em produtos alimentícios éfreqüentemente associada a vários efeitos à saúde; vide, por exemplo, A.C.Ouwehand et al em Int. Dairy Journal 8 (1998) 749-758. Particularmente, aaplicação de produtos é associada a vários efeitos à saúde, tais como relativosao bem estar intestinal, como IBS (Síndrome Intestinal Irritável), redução da mádigestão de Iactose1 sintomas clínicos de diarréia, estímulo imunológico,atividade antitumores e aumento da absorção de minerais.

WO 99/23221 descreve proteínas de ligação de antígenosmultivalentes para desativar fagos. Os hospedeiros podem ser bactérias deácido láctico que são utilizadas para produzir fragmentos de união deanticorpos que são recuperados. WO 99/23221 descreve a adição dosfragmentos de anticorpos colhidos a bactérias para fornecer efeitosantidiarréicos.

WO 00/65057 refere-se à inibição de infecções virais, utilizandoproteínas de ligação de antígenos monovalentes. A proteína de ligação deantígenos pode ser domínio variável de cadeia pesada derivado de imunoglobulinanaturalmente isento de cadeias leves, tais como os derivados de camelídeosconforme descrito em WO 94/04678. WO 00/65057 descreve a transformação dehospedeiro com gene que codifica as proteínas de ligação de antígenosmonovalentes. Hospedeiros apropriados podem incluir bactérias de ácido láctico.Esta revelação refere-se ao campo de processamento de fermentação e oproblema de infecção de fagos que dificulta a fermentação. Especificamente,fragmentos VHH de Ihama são utilizados para solucionar o problema de infecção defagos por meio da neutralização de bacteriófago P2 de Lactoccoccus lactis.

Tanto WO 00/65057 quanto WO 99/23221 envolvem o uso defragmentos de anticorpos colhidos de sistema de expressão bacteriana.

US 6.605.286 refere-se ao uso de bactérias grama positivas parafornecer polipeptídeos biologicamente ativos, tais como citoquinas, ao corpo.US 6.190.662 e EP 0.848.756 B1 referem-se a métodos de obtenção daexpressão na superfície de proteína desejada ou polipeptídeo. Monedero et al,Selection of Single-Chain Antibodies Against the VP8 Subunit of Rotavirus VP4Outer Capsid Protein and Their Expression in L. casei, Applied andEnvironmental Microbiology (2004) n° 4, 6936-6939, refere-se a estudos in vitrosobre o uso de anticorpos de fita única (scFv) expressos por L. casei quereconhecem o VP8 e a fração de capsídeo externo de rotavírus e bloqueiainfecções com rotavírus in vitro. Entretanto, nenhum destes documentosdescreve o uso de imunoglobulinas de cadeia pesada ou fragmentos do tipoVHH ou VNAR ou anticorpos de domínio (dAbs) das cadeias leve ou pesada deimunoglobulinas ou seus fragmentos.

Outros microorganismos utilizados na fabricação de produtosalimentícios incluem leveduras. Levedura é bem conhecida em fermentação ecozimento e seus produtos alimentícios associados incluem, por exemplo, pãoe cerveja.

Uma desvantagem desses sistemas conhecidos é que o uso dospróprios anticorpos ou fragmentos de anticorpos (ou seja, a proteína colhida)no tratamento de doença em seres humanos pode resultar na degradação oudigestão do anticorpo antes que forneçam os benefícios à saúde desejados eaté antes que atinjam o local desejado.

Além disso, é freqüentemente desejável garantir que o anticorpoou fragmento de anticorpo seja ativo em região específica do corpo, tal comono intestino.

Além disso, é desejável que sejam fornecidos benefícios à saúdepara sejam os mais benéficos possíveis.

Desta forma, a presente invenção pretende fornecer benefícios àsaúde de pacientes deles necessitados.

Descrição Resumida da Invenção

Conforme primeiro aspecto da presente invenção é fornecidoproduto alimentício ou preparação farmacêutica que compreende i) anticorposou fragmentos de anticorpos que são ativos no intestino e ii) microorganismosprobióticos independentes dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos.

Conforme segundo aspecto da presente invenção é fornecidométodo de elaboração de produto alimentício ou preparação farmacêutica deacordo com o primeiro aspecto que compreende a adição independente dosanticorpos ou fragmentos de anticorpos e dos microorganismos probióticosdurante a fabricação do produto alimentício, preparação farmacêutica ou seuingrediente.

Conforme terceiro aspecto da presente invenção é fornecido o usodo produto alimentício ou preparação farmacêutica de acordo com o primeiroaspecto da presente invenção ou fabricado de acordo com o segundo aspecto dapresente invenção para fornecer benefícios à saúde do intestino de paciente.

Conforme quarto aspecto da presente invenção é fornecidométodo de fornecimento de benefícios à saúde do intestino de paciente quecompreende a administração do produto alimentício ou preparaçãofarmacêutica de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção oufabricado de acordo com o segundo aspecto da presente invenção a pacientedele necessitado.

Conforme quinto aspecto da presente invenção é fornecidoimplemento de liberação para uso com produto alimentício que compreendemicroorganismos probióticos, em que o implemento de liberação é revestidosobre pelo menos uma superfície com anticorpos ou fragmentos de anticorposque são ativos no intestino.

Conforme sexto aspecto da presente invenção é fornecidoimplemento de liberação para uso com produto alimentício em que oimplemento de liberação é revestido sobre pelo menos uma superfície comanticorpos ou fragmentos de anticorpos que são ativos no intestino emicroorganismos probióticos.Para evitar dúvidas, a expressão "produto alimentício", da formautilizada no presente, engloba bebidas.

Pela expressão "bactérias inviáveis", da forma utilizada nopresente, indica-se população de bactérias que não é capaz de reproduzir-sesob nenhuma condição conhecida. Deve-se compreender, entretanto, que,devido a variações biológicas normais em população, um pequeno percentualda população (ou seja, 5% ou menos) pode ainda ser viável e, desta forma,capaz de reprodução sob condições de cultivo apropriadas em população que,de outra forma, é definida como inviável.

Pela expressão "bactérias viáveis", da forma utilizada no presente,indica-se população de bactérias que é capaz de reproduzir-se sob condiçõesapropriadas sob as quais é possível a reprodução. Deve-se compreender,entretanto, que, devido a variações biológicas normais em população, umpequeno percentual da população (ou seja, 5% ou menos) pode ainda serinviável e, desta forma, incapaz de reprodução sob estas condições em umapopulação que, de outra forma, é definida como viável.

Pela expressão "microorganismos probióticos independentes dosanticorpos ou fragmentos de anticorpos", da forma utilizada no presente, indica-se que os microorganismos não fazem parte de nenhum sistema defornecimento para os anticorpos ou fragmentos de anticorpos e não são a elesunidos.

Breve Descrição das Figuras

Na descrição detalhada das realizações da presente invenção,faz-se referência às figuras a seguir.

As Figuras 1a e b demonstram que partículas de VHH específicasde rotavírus neutralizam rotavírus in vitro.

A Figura 2 demonstra que partículas de VHH específicas derotavírus neutralizam rotavírus in vivo.A Figura 3 exibe mapa de vetores de expressão de Lactobacillus:

(a) âncora 2A10;

(b) âncora VHH-1, que media a expressão ancorada nasuperfície de fragmentos de anticorpos por meio de fusão aos últimos 244aminoácidos de proteinase P de L. casei;

(c) secretado por 2A10; e

(d) secretado por VHH1 com códon de parada (TAA) inseridoapós a seqüência de marca E1 mediando a secreção do fragmento deanticorpo.

Tldh: término de transcrição do gene Iactato desidrogenase de Lcasei;

Tld excluído: seqüência restante após a exclusão de Tldh;

2A10-scFv: anticorpo de fita única contra VP4/VP7;VHH1 fragmento de anticorpo de cadeia pesada contra rotavírus;âncora longa, seqüência de âncoras do gene proteinase P de L casei (244aminoácidos);

Jcbh\ seqüência de término de transcrição do gene hidrolaseácida da bile conjugado de L. plantarum 80;

Pldh: seqüência promotora do gene Iactato desidrogenase de Lcasei, SS PrtP',

seqüência de sinal do gene PrtP (33 aa), PrtP N-terminal,terminal N (36 aminoácidos) do gene PrtR,

Ampr-. gene de resistência à ampicilina;

Ery. gene de resistência à eritromicina;

Rep: gene repA do plasmídeo p353-2 de L. pentosis;

Ori: origem de reprodução (Ori+ = ori E. coli, Ori- = oriLactobacillus).

As setas indicam códon de parada.A Figura 4a exibe os resultados de citometria de fluxo que exibema expressão de 2A10-scFv (cinza claro) e VHH1 (cinza escuro) sobre asuperfície de Lactobacillus paracasei por meio de detecção de marca E poranticorpo anti-marca E de camundongo (b) Fotografia de microscópio eletrônicode varrimento (SEM) que exibe a união de rotavírus pela superfície de VHH1que expressa Lactobacillus paracasei.

A Figura 5 exibe resultados de teste de neutralização in vitro quetesta a eficácia de Iactobacilos que expressam fragmentos ancorados a VHH1para inibir a infecção por rotavírus de células MA104. A redução da infecçãopara 60% ou mais foi considerada neutralização específica. A linha sólidarepresenta o nível de neutralização atingido por anticorpo VHH1 purificado pormarca E produzido por Iactobacilos (20 μg/ml). Linha pontilhada indica o nívelde neutralização de sobrenadante de hibridoma monoclonal 2A10 (147 ng/ml).

Neutralização atingida por diferentes concentrações de Iactobacilos ancoradosa VHH1 (■), Iactobacilos ancorados a 2A10 (■) e Iactobacilos nãotransformados (□).

A Figura 6 (a) exibe a incidência de diarréia em camundongostratados com Iactobacilos que expressam fragmentos ancorados a VHH1.Resultados reunidos de três experimentos (b) Incidência de diarréia emcamundongos tratados com Iactobacilos que expressam na superfícieIactocorpos derivados de 2a10-scFv. Resultados reunidos de trêsexperimentos.

A Figura 7 exibe seções de duodeno e jejuno de filhotes tratadoscom formulações diferentes, manchadas com hematoxilina e eosina. A barrarepresenta comprimento de 100 μιτι.

A Figura 8 exibe a carga de RNA vp7 em amostras de tecidointestinal pequenas conforme determinado por meio de PCR em tempo real.

A Figura 9 exibe a avaliação de diferentes doses de Iactobacilosque expressam fragmentos ancorados a VHH1 e sua eficácia para reduzir adiarréia.

A Figura 10 exibe avaliação de Iactobacilos que expressamfragmentos ancorados a VHH1 em forma seca por congelamento.

As Figuras 11 (a) e (b) exibem fotografia de microscópioeletrônico de varrimento (SEM) que exibe a união de rotavírus pela superfíciede VHH1 que expressa Lactobacillus paracasei.

A Figura 12 exibe alinhamento de VHHs que possuem afinidadepara partículas virais de rotavírus.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção será agora descrita como forma de exemplopor uma série de realizações.

De forma geral, a presente invenção refere-se a produtoalimentício ou preparação farmacêutica que compreende i) anticorpos oufragmentos de anticorpos que são ativos no intestino e ii) microorganismosprobióticos independentes dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos.

i. Anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são ativos no intestino:

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são ativos nointestino podem ser utilizados como parte de seu sistema de fornecimento ou não.

Segundo realização da presente invenção, prefere-se que osanticorpos ou seus fragmentos compreendem parte de sistema defornecimento para fornecê-los ao trato gastrointestinal (denominado a seguir"sistema de fornecimento").

Segundo aspecto da presente realização ao utilizar-se sistema defornecimento dos anticorpos ou seus fragmentos para fornecê-los ao tratogastrointestinal, isso pode ser efetuado por meio do uso de encapsulados, taiscomo os conhecidos nas indústrias alimentícias e farmacêuticas. Podem serutilizados biopolímeros naturais. Exemplos incluem alginato de cálcio,carrageno, goma gelano ou gelatina. O sistema de fornecimento pode sermétodo de encapsulação conhecido na técnica, que fornecerá a imunoglobulinaou seus fragmentos especificamente para o intestino. O encapsulado deve,portanto, ser capaz de sobreviver até a entrada no intestino e ser liberado emseguida. Esse sistema de fornecimento compreende sistema protetor geral queproteja os anticorpos contra a degradação. Estes métodos podem incluircaptura de lipossomos, disco de centrifugação e coaglutinação. Qualqueracionador pode ser utilizado para avisar a liberação do ingredienteencapsulado, tal como alteração de pH (revestimento entérico), tensãomecânica, temperatura e atividade enzimática. Estes métodos são expandidosno artigo de Sebastien Gouin, Microencapsulation: Industrial Appraisal ofExisting Technologies and Trends, Food Science and Technology (2004) 15:330-347. Preferencialmente, utiliza-se revestimento entérico. Além disso, ométodo de encapsulação pode permitir a liberação lenta do anticorpo nointestino e/ou no estômago. Isso permitirá liberação constante do anticorpo,fragmento funcional ou equivalente ao longo de período de tempo definido.

Alternativamente, de acordo com outro aspecto desta realização,o sistema de fornecimento pode compreender microorganismo,preferencialmente transformado para que seja capaz de produzir os anticorposou fragmentos de anticorpos. Este microorganismo é adicional aosmicroorganismos probióticos indicados no presente como ii) e é independentedos anticorpos ou fragmentos de anticorpos. Desta forma, para evitar dúvidas,a presente invenção pode compreender dois microorganismos diferentes. Oprimeiro é o microorganismo probiótico indicado no presente como ii), que nãofaz parte de nenhum sistema de fornecimento para os anticorpos ou seusfragmentos. O segundo é o microorganismo que pode fazer parte do sistemade fornecimento. O primeiro é indicado no presente como "microorganismoprobiótico" e o último como "microorganismo".Segundo aspecto específico da presente invenção é fornecidapreparação farmacêutica que compreende sistema de fornecimento parafornecer anticorpos ao trato gastrointestinal, em que os anticorpos são ativosno intestino e o sistema de fornecimento compreende microorganismotransformado com anticorpos ou seus fragmentos, em que os anticorpos sãoimunoglobulinas de cadeia pesada do tipo VHH ou seus fragmentos,preferencialmente derivados de camelídeos, de maior preferência anticorpos decadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos, ou anticorpos de domínio (dAbs)das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos e,independentemente, microorganismo probiótico.

Como o microorganismo probiótico, o microorganismo deverá serpreferencialmente capaz de sobreviver à passagem no trato gastrointestinal edeverá ser ativo no estômago/intestino. Preferencialmente, o microorganismodeverá ser capaz de sofrer colonização transitória do trato gastrointestinal; sercapaz de expressar o gene no trato gastrointestinal; e ser capaz de estimular osistema imunológico do intestino.

Preferencialmente, o microorganismo pode também sermicroorganismo probiótico com as características acima. Neste caso, haverádois microorganismos probióticos utilizados de acordo com a presenteinvenção; um que é independente dos anticorpos ou seus fragmentos e um quefaz parte do seu sistema de fornecimento. Probióticos são definidos comosuplementos alimentares microbianos viáveis que influenciam de formabenéfica o hospedeiro melhorando o seu equilíbrio microbiano intestinal deacordo com Fuller (1989), Probiotics in Man and Animais, Journal of AppliedBacteriology 66, 365-378. Caso o microorganismo probiótico seja bactéria,prefere-se que seja bactéria de ácido láctico.

Exemplos de outros microorganismos probióticos apropriadosincluem levedura tal como Saccharomyces, Debaromyees, Kluyveromyces ePichia, fungos tais como Aspergillus, Rhizopus, Mucore Penicillium e bactériastais como os gêneros Bifidobacterium, Propionibacterium, Streptococcus,Enteroeoeeus, Lactoeoceus, Bacillus1 Pedioeoceus, Mierococeus, Leueonostoe,Weissella, Oenoeoeeus e Laetobaeillus. Pode-se também utilizarKluyveromyces laetis.

Exemplos específicos de microorganismos probióticosapropriados são:

Kluyveromyces laetis, Kluyveromyces fragilis, Piehia pastoris,Saceharomyces eerevisiae, Saccharomyees boulardii, Aspergillus niger,Aspergillus oryzae, Mueor miehei, Bacillus subtilis, Bacillus natto,Bifidobaeterium adoleseentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B.laetis, B. longum, Enteroeoeeus faeeium, Enteroeoeeus faeealis, Eseheriehiacoli, Laetobaeillus aeidophilus, L. brevis, L. casei, L. delbrueekii, L. fermentum,L. gasseri, L. helvetieus, L. johnsonii, L. laetis, L. paraeasei, L. plantarum, L.reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, L. sanfraneiseus, Lactoeoceuslaetis, Lactococcus cremoris, Leueonostoe mesenteroides, Leueonostoe laetis,Pedioeoceus acidilactici, P. eerevisiae, P. pentosaceus, Propionibacteriumfreudenreichii, Propionibacterium shermaniie Streptococcus salivarius.

Linhagens probióticas específicas são:

Saccharomyces boulardii, Laetobaeillus casei shiròta,Laetobaeillus casei immunitas, Laetobaeillus casei DN-114 001, Laetobaeillusrhamnosus GG (ATCC 53103), Laetobaeillus reuteri ATCC 55730/SD 2112,Laetobaeillus rhamnosus HN001, Laetobaeillus plantarum 299v (DSM9843),Laetobaeillus johnsonii La1 (1-1225 CNCM), Laetobaeillus plantarum WCFS1,Bifidobacterium laetis HN019, Bifidobacterium animalis DN-173010,Bifidobacterium animalis Bb12, Laetobaeillus casei 431, Laetobaeillusaeidophilus NCFM, Laetobaeillus reuteri ING1, Laetobaeillus salivarius UCC118,Propionibacterium freudenreichii JS, Escherichia coli Nissle 1917.Convenientemente, o microorganismo pode ser bactéria de ácidoláctico. Além disso, preferencialmente, o microorganismo é selecionado a partirde Iactobacilos ou bifidobactérias. De preferência ainda maior, omicroorganismo é Lactobacillus. Particularmente, o Lactobacillus èLactobacillus casei 393 pLZ15. Lactobacillus casei foi recentementereidentificado como Lactobacillus paracasei (Perez-Martinez, 2003). OutroLactobacillus preferido é Lactobacillus reutaríi.

Alternativamente, o microorganismo pode ser levedura. Levedurasapropriadas incluem a levedura de padaria S. cerevisiae. Outras levedurascomo Candida boidinii, Hansenula polymorpha, Pichia methanolica e Pichiapastoris, que são sistemas bem conhecidos de produção de proteínasheterólogas e podem ser utilizadas na presente invenção.

Fungos filamentosos, particularmente espécies dos gênerosTrichoderma e Aspergillus possuem a capacidade de secreção de grandesquantidades de proteínas, metabólitos e ácidos orgânicos no seu meio decultivo. Esta propriedade vem sendo amplamente explorada pelas indústrias dealimentos e bebidas, em que os compostos secretados por essas espéciesfúngicas filamentosas vêm sendo utilizados há décadas.

Sistema de fornecimento com base em bactérias probióticasrepresenta abordagem segura e atrativa e representa um dos sistemas deprodução de anticorpos mais baratos. A aplicação em ampla escala domicroorganismo, preferencialmente Lactobacillus, que expressa anticorpos érelativamente fácil e necessita de manipulação e custos de armazenagemmínimos e é econômica.

Preferencialmente, o microorganismo é transformado com vetorde expressão que compreende o gene para o anticorpo. O vetor de expressãopode conter promotor constitutivo a fim de expressar os anticorpos ou seusfragmentos. Esse promotor constitutivo sustentará a expressão in situ deanticorpos por meio de Iactobacilos transformados que persistem (ao menospor curto período) no trato intestinal após a administração. Alternativamente,pode-se selecionar promotor que seja ativo somente no trato gastrointestinale/ou estômago/intestino, ou seja, apropriado somente para expressãoespecífica no trato gastrointestinal. Isso garantirá a expressão e/ou secreçãodo anticorpo de cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos no tratogastrointestinal, preferencialmente no intestino. Muitos promotores constitutivospara Iactobacilos são conhecidos na técnica e exemplo de promotor que éespecificamente indutível no trato gastrointestinal é PIdh (Pouwels et al,Lactobacilli as Vehicles for Targeting Antigens to Mucosal Tissues by SurfaeeExposition of Foreign Antigens, Methods in Enzymology (2001) 336: 369-389).

Os vetores de expressão descritos nos exemplos podemreproduzir-se nos Iactobacilos transformados e expressar os anticorpos ouseus fragmentos. Compreender-se-á que a presente invenção não é limitadaapenas a esses vetores de expressão de reprodução. O conjunto de expressãointeiro pode ser inserido em chamado plasmídeo de "integração", por meio doquê o conjunto de expressão será integrado ao cromossomo dos Iactobacilosapós a transformação, conforme conhecido na técnica (Pouwels, Ρ. H. eChaillou, S., Gene Expression in Lactobacilli (2003), Geneties of Laetic AeidBactéria, pág. 143-188). Desta forma, podem ser utilizados vetores dereprodução ou integração de acordo com a presente invenção.

Quando o sistema de fornecimento compreender microorganismotransformado com anticorpos ou seus fragmentos, os anticorpos são expressose/ou secretados no intestino. Desta forma, o uso de microorganismo comosistema de fornecimento possui as vantagens de que a produção in vivo defragmentos de anticorpos localmente no trato gastrointestinal soluciona oproblema prático de degradação de anticorpos administrados por via oral noestômago. Esse sistema baseado em bactérias probióticas representaabordagem segura e atrativa para o fornecimento de anticorpos para o tratogastrointestinal. Desta forma, a aplicação em larga escala dos Iactobacilos queexpressam anticorpos é relativamente fácil, requer manipulação e custos dearmazenagem mínimos e é econômica. Além disso, as bactérias probióticaspermanecerão no intestino por mais tempo e permitirão a produção constantedo anticorpo para permitir proteção mais constante contra o microorganismoenteropatogênico.

Convenientemente, a quantidade do microorganismo no sistemade fornecimento em produtos alimentícios de acordo com a presente invençãoé de 106 a 1011 por porção ou (se o tamanho da porção não for conhecido, porexemplo) de 106 a 1011 por cem gramas de produto, de maior preferência estesníveis são de 108 a 109 por porção ou por cem gramas de produto.

Os anticorpos para uso de acordo com a presente invençãodevem ser ativos no intestino/estômago, ou seja, devem ser funcionais e reter asua atividade normal, que inclui a desativação do seu alvo. Os anticorposativos de acordo com a presente invenção deverão unir-se ao seu alvoconforme normal, de forma que a afinidade de união do anticorpo para oantígeno deverá também ser normal. A afinidade de união está presentequando a constante de dissociação for de mais de 105.

Desta forma, o produto alimentício ou a preparação farmacêuticade acordo com a presente invenção será capaz de abordar seletivamentedoença específica ou sintoma de doença. A seleção de anticorpo determinará adoença ou o sintoma a ser tratado ou reduzido.

Compreender-se-á que, quando o produto for produto alimentício,qualquer anticorpo pode ser utilizado. Entretanto, quando o produto forpreparação farmacêutica, imunoglobulinas de cadeia pesada ou seusfragmentos do tipo VHH ou VNAR ou anticorpos de domínio (dAbs) dascadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos são preferidos.Preferencialmente, o anticorpo ou seus fragmentos deverãopossuir uma ou mais das características a seguir:

i. eles exibem boa afinidade de união e a funcionalidade deinibição desejada sob as condições presentes no trato gastrointestinal; e

ii. eles possuem boa estabilidade proteolítica pelo fato deserem estáveis contra a degradação por enzimas proteolíticas;

iii. os anticorpos deverão ser termoestáveis, o que possibilita asua inclusão em uma série de produtos alimentícios. Os produtos alimentíciospodem ser preparados em processo que requer pasteurização e prefere-se quea atividade dos anticorpos seja mantida em grande parte apesar do tratamentoa quente.

O uso de fragmentos ou partes de anticorpo inteiro que podem,entretanto, exibir afinidade de ligação de antígenos também é contemplado.Fragmentos deverão ser preferencialmente fragmentos funcionais. Fragmentofuncional de imunoglobulina indica fragmento de imunoglobulina que exibeafinidade de união para antígeno e possui a mesma atividade biológica daseqüência de comprimento total. Estes fragmentos incluem fragmentos de Fabe scFv. A afinidade de união está presente quando a constante de dissociaçãofor maior que 105. Esse fragmento pode ser convenientemente utilizado emterapia, por exemplo, pois é provável que seja menos imunogênica e maiscapaz de penetrar tecidos devido ao seu menor tamanho.

Equivalentes funcionais também são contemplados. Equivalentefuncional indica seqüência que exibe afinidade de união para antígeno similar àseqüência de comprimento total. Adições ou exclusões de aminoácidos quenão resultem em alteração de funcionalidade, por exemplo, são englobadaspela expressão equivalentes funcionais.

O anticorpo ou seu fragmento deverá poder ser expresso esecretado no intestino. São bem conhecidos na técnica vários testes queimitam condições do trato gastrointestinal e são utilizados, por exemplo, paraselecionar probióticos apropriados que podem sobreviver a condições do tratogastrointestinal. Teste apropriado para determinar se anticorpo pode sobreviveràs condições do trato gastrointestinal é descrito por Picot, A. e Lacroix, C.(International Dairy Journal 14 (2004) 505-515).

A fim de determinar se anticorpo será apropriado para uso napresente invenção, pode ser aplicado o teste a seguir. O anticorpo produzido éselecionado sob condições específicas de baixo pH, preferencialmente de 1,5 a3,5, e na presença de pepsina (protease abundante no estômago) para resultarem moléculas altamente benéficas que funcionam bem no trato gastrointestinale são apropriadas para uso de acordo com a presente invenção.

O anticorpo ou seu fragmento pode ser de ocorrência natural oupode ser obtido por meio de engenharia genética utilizando métodos bemconhecidos na técnica.

O anticorpo pode ser selecionado para que seja ativo contramuitos antígenos diferentes, que incluem microorganismos, parasitas maiores,vírus e toxinas bacterianas.

O presente pedido pode ser aplicável à administração demicroorganismos enteropatogênicos em geral. Microorganismosenteropatogênicos incluem vírus ou bactérias enteropatogênicas. Compreende-se que a administração indica terapia e/ou profilaxia.

Bactérias enteropatogênicas podem incluir, por exemplo,Salmonella, Campilobacter, E. coli ou Helicobacter. É contemplado o uso deanticorpos que desativam Helicobacter que causa úlceras do estômago.

Vírus enteropatogênicos podem incluir, por exemplo, norovírus(vírus similar a Norwalk), adenovírus entéricos, coronavírus, astrovírus,calicevírus e parvovírus. Rotavírus e a família Norwalk de vírus são asprincipais causas de gastroenterite viral, mas uma série de outros vírus érelacionada a erupções. De maior preferência, a presente invenção refere-se àadministração de infecção por rotavírus.

O presente pedido pode também ser utilizado na administração deoutros vírus não enteropatogênicos como hepatite.

Preferencialmente, imunoglobulinas de cadeia pesada ou seusfragmentos do tipo VHH ou VNAR ou anticorpos de domínio das cadeias leveou pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos podem ser utilizadas napresente invenção. Essas imunoglobulinas de cadeia pesada do tipo VHH ouVNAR são obtidas utilizando métodos bem conhecidos na técnica. De maiorpreferência, a imunoglobulina ou seu fragmento é derivada de camelídeos, demaior preferência lhamas.

Van der Linden, R. H. et al, Comparison of Physical Propertiesof Llama VHH Antibody Fragments and Mouse Monoclonal Antibodies,Biochim. Biophys. Acta (1990) 1431, 37-46, obtiveram anticorpos de cadeiapesada com alta especificidade e afinidade contra uma série de antígenos.Além disso, imunoglobulinas de cadeia pesada são facilmente clonadas eexpressas em bactérias e levedura conforme exibido em Frenken, L. G. J. etal, Isolation of Antigen Specific Llama VHh Antibody Fragments and theirHigh Levei Seeretion by Saccharomyees eerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78,11-21. Métodos de preparação dessas imunoglobulinas ou seus fragmentosem larga escala que compreendem a transformação de fungo ou leveduracom seqüência de DNA que pode ser expressa e codifica o anticorpo oufragmento também são descritos no Pedido de Patente WO 94/25591(Unilever). Por fim, EP-A-0584421 descreve regiões de imunoglobulina decadeia pesada obtidas de camelídeos.

Preferencialmente, os anticorpos podem ser anticorpos de cadeiapesada de lhama, de maior preferência anticorpos VHH ou seus fragmentos.Em 1993, Hamers-Casterman et al revelaram classe inovadora de anticorposIgG em camelídeos, ou seja, camelos, dromedários e Ihamas (NaturallyOccurring Antibodies of Devoid Light Chains, Nature (1993) 363, 446-448).Anticorpos de cadeia pesada constituem cerca de um quarto dos anticorposIgG produzidos pelos camelídeos, lhamas. Estes anticorpos são formados porduas cadeias pesadas, mas são isentos de cadeias leves. A parte de ligaçãode antígenos variável é indicada como domínio VHH e representa o menorlocal de ligação de antígenos intacto de ocorrência natural (Desmyter, A. et al,Antigen Specificity and High Affinity Binding Provided by One Single Loop of aCamel Single-Domain Antibody, J. Bioi Chem. (2001) 276, 26285-26290).Anticorpos de cadeia pesada com alta especificidade e afinidade podem sergerados contra uma série de antígenos e são facilmente clonados e expressosem bactérias e leveduras (Frenken, L. G. J. et al, Isolation of Antigen SpeeifieLlama Vhh Antibody Fragments and their High Levei Seeretion bySaccharomyees eerevisiae, J. Bioteehnoi (2000) 78, 11-21). Os seus níveis deexpressão, solubilidade e estabilidade são significativamente mais altos que osde fragmentos de F(ab) ou Fv clássicos (Ghahroudi, M. A. et al, Seleetion andIdentification of Single Domain Antibody Fragments from Camel Heavy-ChainAntibodies, FEBS Lett. (1997) 414, 521-526).

Outra boa fonte de anticorpos de cadeia pesada pode serencontrada em tubarões. Demonstrou-se recentemente que tubarões tambémpossuem um único domínio similar a VH nos seus anticorpos denominadoVNAR (Nuttall et al, Isolation and Charaeterization of an IgNAR VariableDomain Speeifie for the Human Mitoehondrial Transloease Receptor Toml0,Eur. J. Biochem. (2003) 270, 3543-3554; Dooley et al, Selection andCharaeterization of Naturally Oeeurring Single-Domain (IgNAR) AntibodyFragments from Immunized Sharks by Phage Display, Molecular Immunology(2003) 40, 25-33; Nutall et al, Selection and Affinity Maturation of IgNARVariable Domains Targeting Plasmodium falcinarum AMA1, Proteins: Strueture,Function and Bioinformatics (2004) 55, 187-197). Fragmentos daimunoglobulina tipo VNAR podem ser utilizados.

Holt et al, Domain Antibodies: Proteins for Therapy, Trends inBiotechnology (2003): Vol. 21, n° 11: 484-490, analisam fragmentos de ligaçãode antígenos denominados "anticorpos de domínio" ou dAbs que compreendemapenas o domínio Vh ou Vl de anticorpo e são conseqüentemente menoresque, por exemplo, Fab e scFv. DABs são os menores fragmentos de anticorposde ligação de antígenos conhecidos, variando de 11 kDa a 15 kDa. Eles sãoaltamente expressos em cultivo de células microbianas. Cada dAb contém trêsdas seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de ocorrêncianatural de anticorpo.

A imunoglobulina ou seu fragmento pode ser monovalente,multivalente (multiespecífica), ou seja bivalente, trivalente, tetravalente, pelofato de que compreende mais de um local de ligação de antígenos. Os locaisde ligação de antígenos podem ser derivados do mesmo anticorpo parental ouseu fragmento ou de diferentes anticorpos que unem o mesmo epítopo. Casotodos os locais de união possuam a mesma especificidade, é produzidaimunoglobulina monoespecífica. Alternativamente, imunoglobulinamultiespecífica pode ser produzida unindo-se a diferentes epítopos do mesmoantígeno ou mesmo antígenos diferentes. Prefere-se que os locais de união oupelo menos um deles sejam dirigidos a patógenos (ou seus produtos, tais comoenzimas produzidas a partir deles) encontrados no trato gastrointestinal.

Prefere-se ainda que a imunoglobulina ou seu fragmento una-se a rotavírus e,de maior preferência, que o neutralize.

A imunoglobulina ou seu fragmento do tipo VHH ou VNAR, ouanticorpos de domínio (dAbs) das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinasou seus fragmentos, pode ser de ocorrência natural, ou seja permitida in vivomediante imunização de animal com o antígeno desejado, ou fabricadasinteticamente, ou seja, obtida por meio de métodos de engenharia genética.

Métodos de síntese de genes, que os incorporam a hospedeirosde microorganismos e que expressam genes em microorganismos são bemconhecidos na técnica e os técnicos no assunto seriam facilmente capazes decolocar a presente invenção em prática utilizando conhecimento geral comum.É contemplado o uso de vetores de repetição ou integração.

Segundo realização da presente invenção, o produto alimentícioou a preparação farmacêutica compreende anticorpos que são imunoglobulinasde cadeia pesada ou seus fragmentos do tipo VHH ou VNAR1 ou anticorpos dedomínio (dAbs) das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seusfragmentos que são ativos no intestino. Segundo aspecto da presenteinvenção, o produto alimentício ou a preparação farmacêutica compreendesistema de fornecimento para fornecer os anticorpos mencionados acima aotrato gastrointestinal em que o sistema de fornecimento é microorganismo e asimunoglobulinas são anticorpos derivados de Ihamas ou seus fragmentos.Revelamos surpreendentemente que estes microorganismos transformadosexpressarão anticorpos de cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos sobrea sua superfície e podem reduzir a carga viral, normalizar a patologia e reduzira diarréia em modelo animal de infecção por rotavírus. Além disso, revelou-seque os anticorpos de cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos são muitoeficazes na redução das infecções em modelos in vitro e in vivo de infecção porrotavírus. Revelou-se surpreendentemente que fragmentos de anticorpos VHHde Ihama reduzem a carga viral, normalizam a patologia e reduzem a diarréiadurante infecção por rotavírus.

Seqüências de VHH derivadas de Ihama particularmentepreferidas que possuem afinidade de rotavírus são fornecidas pelo presenterelatório descritivo na listagem de seqüências SEQ ID N0 1 a 21 e na Figura 12.

Alternativamente, seqüências de VHH que contêm pelo menos 70%, 80%,85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos com SEQ ID N0 1e que possuem afinidade para partícula de rotavírus ou antígeno também sãorealizações preferidas de acordo com a presente invenção. Seqüências deVHH podem ser derivadas de camelídeos, por meio de imunização e/ouseleção de afinidade, mas também podem ser derivadas de outras espécies demamíferos, tais como camundongos ou seres humanos e/ou podem sercamelizadas por meio de substituições de aminoácidos, conforme descrito natécnica. Em outra realização, as seqüências de VHH podem ser fundidas paragerar unidades multiméricas de duas, três, quatro, cinco ou mais unidades deVHH, opcionalmente ligadas por meio de molécula espaçadora. Em outrarealização, várias seqüências de VHH podem ser combinadas, separadamenteou em uma molécula multimérica. Preferencialmente, as seqüências de VHHpossuem especificidades diferentes; seqüências de VHH podem sercombinadas, por exemplo, para gerar amplo espectro de afinidades parapatógeno específico. Em realização altamente preferida, duas, três, quatro,cinco ou mais seqüências de VHH que possuem afinidade para qualquer daslinhagens de rotavírus Wa, CK5, Wal1 RRV ou CK5 podem ser combinadas, naforma de unidades monoméricas separadas ou como unidades combinadassobre veículo, tal como sobre bactéria probiótica e/ou sobre moléculamultimérica.

Além disso, concluiu-se inesperadamente que anticorpos decadeia pesada de Ihama são apropriados para administração no tratogastrointestinal. Revelou-se que anticorpos de cadeia pesada de Ihama sãoaltamente resistentes à degradação de protease no estômago e suportam oambiente ácido do estômago. Isso ocorre apesar do fato de que o sistemaproteolítico no trato gastrointestinal é ambiente mais agressivo que, porexemplo, o encontrado na boca. A atividade no intestino é prejudicada pelaatividade proteolítica, que inclui protease e peptidase. Revelamos agora que,ainda mais surpreendentemente, a liberação ou produção in vivo de fragmentosde anticorpos localmente no trato gastrointestinal soluciona o problema práticode degradação de anticorpos administrados oralmente no estômago e nointestino. A presente invenção é o primeiro sistema que permite a expressão deanticorpos no trato gastrointestinal que são adequados para administração deinfecção por rotavírus.

Ao selecionar-se microorganismos probióticos como sistema defornecimento, revelamos que estes microorganismos transformadosexpressarão anticorpos de cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos sobrea sua superfície e são capazes de reduzir a carga viral, normalizar a patologiae reduzir a diarréia em modelo animal de infecção por rotavírus.

Os anticorpos de cadeia pesada de Ihama são expressos emseguida pelo microorganismo no trato gastrointestinal. A expressão dofragmento de anticorpo VHH derivado de Ihama pode ser sobre a superfície domicroorganismo e/ou na forma de proteína secretada do microorganismo.Formas preferencialmente secretadas do fragmento de anticorpo VHHencontram-se em forma multimérica para aumentar a agregação e a liberaçãoda carga viral.

Preferencialmente, o microorganismo ou, de maior preferência,bactéria probiótica é transformado com vetor de expressão que compreende ogene para o anticorpo de cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos. O vetorde expressão pode conter promotor constitutivo a fim de expressar osanticorpos ou seus fragmentos. Esse promotor constitutivo sustentará aexpressão in situ de anticorpos por Iactobacilos transformados que persistem(ao menos por curto período) no trato intestinal após a administração.

Alternativamente, o promotor pode ser selecionado como sendo ativo apenasno trato gastrointestinal e/ou no estômago/intestino, ou seja, apropriadosomente para expressão específica no trato gastrointestinal. Isso garantirá aexpressão e/ou secreção do anticorpo de cadeia pesada de Ihama ou seusfragmentos no trato gastrointestinal, preferencialmente no intestino. Muitospromotores constitutivos para Iactobacilos são conhecidos na técnica eexemplo de promotor que é especificamente indutível no trato gastrointestinal éPldh (Pouwels et al, Lactobacilli as Vehicles for Targeting Antigens to MucosalTissues by Surfaee Exposition of Foreign Antigens, Methods in Enzymology (2001) 336: 369-389).

Os vetores de expressão descritos nos exemplos são capazes dereproduzir-se nos Iactobacilos transformados e expressar os anticorpos ouseus fragmentos. Compreender-se-á que a presente invenção não se limitaapenas a estes vetores de expressão de reprodução. O conjunto de expressãocompleto pode ser inserido em chamado plasmídeo de "integração", por meiodo quê o conjunto de expressão será integrado ao cromossomo doslactobacilos após a transformação, conforme conhecido na técnica (Pouwels,Ρ. H. e Chaillou, S., Gene Expression in Lactobacilli (2003), Geneties of LaeticAeidBaeteria1 págs. 143-188).

ii. Microorganismos probióticos independentes dos anticorpos oufragmentos de anticorpos.

O produto alimentício ou preparação farmacêutica de acordo coma presente invenção compreende adicionalmente microorganismo probióticoque é independente dos anticorpos ou seus fragmentos.

O microorganismo probiótico pode ser utilizado em condiçãoviável ou inviável, conforme o desejado. Caso os microorganismos devam serutilizados em estado inviável, eles podem ser tornados inviáveis por quaisquermeios apropriados.

O microorganismo probiótico pode ser qualquer bactériaprobiótica comestível apropriada, fungo ou levedura e, particularmente, podeser de qualquer dos tipos, incluindo os tipos preferidos, relacionados acimapara o microorganismo que faz parte de qualquer sistema de fornecimento paraos anticorpos ou seus fragmentos. Bactéria probiótica particularmente preferidapara uso como "microorganismo probiótico independente" é Lactobacillusreutarii.

Convenientemente, a quantidade do microorganismo no sistemade fornecimento em produtos alimentícios de acordo com a presente invençãoé de 106 a 1011 por porção ou (por exemplo, caso o tamanho da porção nãoseja conhecido) de 106 a 1011 por cem gramas de produto, de maior preferênciaestes níveis são de 108 a 109 por porção ou por cem gramas de produto. Emalgumas circunstâncias, é conveniente que a quantidade total demicroorganismo no produto alimentício (ou seja, o total da quantidade domicroorganismo no sistema de fornecimento e a quantidade do microorganismoprobiótico que é independente dos anticorpos ou seus fragmentos) seja de 10a 1011 por porção ou (por exemplo, caso o tamanho da porção não sejaconhecido) de 106 a 1011 por cem gramas de produto, de maior preferênciaestes níveis são de 108 a 109 por porção ou por cem gramas de produto.

O microorganismo probiótico pode ser adicionado por qualquermeio apropriado ao produto alimentício ou preparação farmacêutica.

Produtos alimentícios:

Vários produtos alimentícios podem ser preparados de acordocom a presente invenção, tais como substituintes de refeições, sopas,macarrões, sorvete, molhos, coberturas, espalhantes, lanches, cereais,bebidas, pão, biscoitos, outros produtos de padaria, doces, barras, chocolate,chicles, produtos lácteos, produtos dietéticos tais como produtos paraemagrecimento ou substituintes de refeições etc. Para algumas aplicações, osprodutos alimentícios de acordo com a presente invenção podem também sersuplementos alimentícios, embora a aplicação em produtos alimentícios do tipoacima seja preferida.Em todas as aplicações, os microorganismos transformadospodem ser adicionados na forma de biomassa (úmida) cultivada viável ou comopreparação seca, que ainda contém microorganismos viáveis conformeconhecido na técnica.

A Tabela 1 indica uma série de produtos, que podem serpreparados de acordo com a presente invenção, e tamanho típico de porção.

Tabela 1

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Meio alternativo de administração dos anticorpos ou seusfragmentos (incluindo sistema de fornecimento que compreendemicroorganismo transformado com anticorpos ou seus fragmentos funcionais) eos microorganismos probióticos compreende implemento de liberação para usocom produto alimentício que compreende microorganismos probióticos,implemento este que é revestido sobre pelo menos uma superfície comanticorpos ou fragmentos de anticorpos que sejam ativos no intestino. Prefere-se que os anticorpos ou fragmentos de anticorpos compreendam sistema defornecimento para fornecer os anticorpos ou fragmentos de anticorpos para otrato gastrointestinal.

Ainda outro meio alternativo de administração dos anticorpos ouseus fragmentos e dos microorganismos probióticos compreende implementode liberação para uso com produto alimentício, em que o implemento deliberação é revestido sobre pelo menos uma superfície com anticorpos oufragmentos de anticorpos que sejam ativos no intestino e microorganismosprobióticos. Prefere-se que os anticorpos ou fragmentos de anticorposcompreendam sistema de fornecimento para fornecer os anticorpos oufragmentos de anticorpos para o trato gastrointestinal.

Para os dois meios alternativos de administração acima, prefere-se que o sistema de fornecimento compreenda anticorpos encapsulados oufragmentos de anticorpos e/ou que o sistema de fornecimento compreendamicroorganismo transformado para que seja capaz de produzir anticorpos ouseus fragmentos.

A expressão implemento de liberação cobre tubo, canudos, facas,garfos, colheres, bastões ou outros implementos que são utilizados parafornecer produto alimentício líquido ou semi-sólido para consumidor. Oimplemento de liberação pode também ser utilizado para fornecer produtoalimentício sólido para consumidor. Este tubo ou canudo de liberação éespecialmente apropriado para uso com certas bebidas em que baixo ou altopH e/ou temperatura indica que a adição direta do microorganismo à bebidanão é recomendada.

O implemento de liberação pode também ser utilizado quando osistema de fornecimento de acordo com a presente invenção compreenderanticorpos encapsulados ou seus fragmentos ou mesmo com os própriosanticorpos ou seus fragmentos.

Após o revestimento do implemento de liberação com oscomponentes relevantes de acordo com o acima, o implemento é armazenadoem envelope externo que é impermeável à umidade e outra contaminação. Omaterial de revestimento que contém estas partículas é atóxico para sereshumanos e bactérias e pode ser óleo tal como óleo de milho ou cera. Esteaspecto é descrito em US 6.283.294 B1. Após a penetração do implemento deliberação que contém estes componentes na bebida ou produto alimentíciosemi-sólido, as partículas são integradas ao produto alimentício, gerando dosedesejável dos anticorpos ou seus fragmentos e dos microorganismosprobióticos com porção do produto.

Preferencialmente, os componentes acima a serem revestidossobre o implemento podem ser suspensos em água, que é aplicada emseguida ao implemento de liberação e evaporada. Utilizando este método, oimplemento de liberação possuirá revestimento dos componentes que pode serliberado quando o implemento de liberação entrar em contato com o produtoalimentício semi-sólido ou líquido.

Ainda outra realização da presente invenção refere-se a métodode fabricação de produto alimentício ou preparação farmacêutica de acordocom o quarto aspecto da presente invenção.

Caso se deseje que o microorganismo e/ou o microorganismoprobiótico esteja(m) vivo(s) no produto, tal como se o produto for aquecidodurante o processamento, o microorganismo necessita ser adicionado após aetapa de aquecimento (após a dosagem). Entretanto, caso produto sejafermentado com o microorganismo, etapa de aquecimento após a fermentaçãopode não ser aceitável. Caso o produto seja produto líquido, a administraçãodo microorganismo poderá ter lugar utilizando implemento de liberação talcomo canudo para beber.

Realização adicional da presente invenção refere-se ao uso doproduto alimentício ou preparação farmacêutica de acordo com a presenteinvenção para fornecer benefícios à saúde do intestino de paciente após aadministração. Esses benefícios à saúde incluem o benefício à saúdeespecífico que o anticorpo pode fornecer. O próprio microorganismo utilizadoem qualquer sistema de fornecimento pode também fornecer vários efeitos àsaúde, tais como relativos ao bem estar intestinal como IBS (SíndromeIntestinal Irritável), redução da má digestão de lactose, sintomas clínicos dediarréia, modulação imunológica, atividade antitumores, efeitos adjuvantes eaumento da absorção de minerais.

O produto alimentício ou preparação farmacêutica de acordo com apresente invenção pode ser apropriado para administração, incluindo tratamentoou profilaxia de infecções causadas por bactérias enteropatogênicas ou vírus.Outros anticorpos que podem ser incorporados à presente invenção serãocapazes de fornecer uma série de outros benefícios à saúde.

A presente invenção baseia-se na revelação de que imunoglobulinasde cadeia pesada ou seus fragmentos do tipo VHH ou VNAR, ou anticorpos dedomínio (dAbs) das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seusfragmentos, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas na terapiaou profilaxia de infecções por microorganismos enteropatogênicos. Além disso, asimunoglobulinas ou seus fragmentos do tipo VHH ou VNAR, ou anticorpos dedomínio (dAbs) das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seusfragmentos, podem ser utilizadas na terapia ou profilaxia de gastroenterite viral oudiarréia causada pelo microorganismo enteropatogênico rotavírus.

Vantagem adicional da presente invenção é que o uso deprodutos alimentícios ou preparações farmacêuticas que compreendemmicroorganismos probióticos que expressam imunoglobulinas ou seusfragmentos do tipo VHH ou VNAR, ou anticorpos de domínio (dAbs) dascadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos, permite que omicroorganismo utilizado como parte de qualquer sistema de fornecimento, talcomo Lactobacillus, forneça os benefícios normais à saúde a ele associados,junto com os benefícios profiláticos/terapêuticos na administração da infecção aser tratada. Esta terapia de "efeito duplo" fornece benefícios à saúde maiorespara o paciente que o conhecido na técnica.

Segundo outra realização da presente invenção, asimunoglobulinas de cadeia pesada ou seus fragmentos do tipo VHH sãoderivadas de camelídeos, incluindo Ihamas e camelos. Muitos fragmentos deanticorpos de cadeia pesada derivados de Ihamas foram descritos na técnica. Éde maior preferência a imunoglobulina de cadeia pesada ou seu fragmento queexibe afinidade de união com constante de dissociação de pelo menos 105 pararotavírus, especialmente as linhagens de rotavírus Wa1 CK5, Wa1, RRV ou CK5.

Revelamos, surpreendentemente, que anticorpos de cadeiapesada de Ihama são eficazes na administração de infecções por rotavírus.Quando os anticorpos utilizados forem anticorpos de cadeia pesada de lhama,o benefício à saúde fornecido incluirá efeito antidiarréico. Desta forma,anticorpos de cadeia pesada de lhama podem ser utilizados na administraçãode infecções por rotavírus, incluindo a terapia ou profilaxia de infecções porrotavírus. Revelamos que fragmentos de anticorpos de VHH de lhama podemreduzir a carga viral, normalizar a patologia e reduzir a diarréia duranteinfecções por rotavírus. Rotavírus permanece sendo a causa isolada maiscomum de diarréia infantil no mundo e a maior parte das crianças fica infectadadurante oá cinco primeiros anos de vida. Em países em desenvolvimento,diarréia induzida por rotavírus pode causar de 600.000 a 870.000 mortes porano e, em países desenvolvidos, doença de rotavírus representa imensosprejuízos econômicos.

Além disso, também se concluiu inesperadamente que anticorposde cadeia pesada de lhama são apropriados para administração no intestino.Revelamos surpreendentemente que os anticorpos de cadeia pesada de lhamasão altamente resistentes à degradação de protease no estômago e suportamo ambiente ácido do estômago. Isso ocorre apesar do fato de que o sistemaproteolítico no intestino/estômago é ambiente mais agressivo que, por exemplo,o encontrado na boca. A produção in vivo de fragmentos de anticorposlocalmente no trato gastrointestinal soluciona o problema prático dedegradação de anticorpos administrados por via oral no estômago. A presenteinvenção é o primeiro sistema que permite a expressão de anticorpos no tratogastrointestinal que sejam apropriados para administração de infecções porrotavírus.

Desta forma, o uso de produtos alimentícios ou preparaçõesfarmacêuticas que compreendem Iactobacilos que expressam anticorpos decadeia pesada de Ihama permite que os Iactobacilos utilizados como parte dequalquer sistema de fornecimento proporcionem os benefícios à saúde normaisa eles associados, junto com os benefícios profiláticos/terapêuticos naadministração de infecções por rotavírus. A presente invenção é o primeirosistema que permite a expressão de anticorpos no trato gastrointestinal quesão apropriados para administração de infecções por rotavírus.

Compreender-se-á que o produto alimentício ou preparaçãofarmacêutica pode ser administrado a fim de fornecer benefício à saúde dopaciente e/ou combater doença ou infecção específica. A seleção do anticorpodependerá da doença a ser tratada.

Preferencialmente, o microorganismo é transformado com vetorde expressão que compreende o gene para o anticorpo de cadeia pesada deIhama ou seu fragmento. Pode-se utilizar vetor de integração ou dereprodução.

Caso a encapsulação seja selecionada como sistema defornecimento, o método de encapsulação deverá sobreviver à passagem para oestômago através do trato gastrointestinal e deverá ser capaz de fornecerliberação sustentada do anticorpo ao longo de período de tempo estabelecido.Isso garantirá que o anticorpo de cadeia pesada de Ihama ou seu fragmentoseja fornecido ao longo do tempo para o estômago. Anticorpos de cadeiapesada de Ihama ou suas cadeias pesadas são particularmente apropriadospara este método de encapsulação devido à sua capacidade de sobrevivênciano intestino quando liberados.

Especificamente, os anticorpos que fazem parte de qualquersistema de fornecimento podem ser fornecidos ao trato gastrointestinalutilizando microorganismo transformado com anticorpos de cadeia pesada delhama, que compreende as etapas de i) transformação do microorganismo como gene que codifica anticorpos de cadeia pesada de lhama; e ii) administraçãodo microorganismo transformado ao trato gastrointestinal do ser humano ouanimal necessitado de terapia.

A presente invenção será agora adicionalmente ilustrada peladescrição de realizações apropriadas dos produtos alimentícios preferidos parauso na presente invenção. Acredita-se que esteja dentro da capacidade dostécnicos no assunto o uso dos ensinamentos fornecidos para a preparação deoutros produtos de acordo com a presente invenção.

Margarinas ε outros espalhantes:

Tipicamente, estas são emulsões de óleo em água ou água emóleo e também são cobertos espalhantes que são substancialmente livres degordura. Tipicamente, estes produtos são espalháveis e não despejáveis àtemperatura de uso, tal como 2 a 10 0C. Os níveis de gordura podem variar emampla faixa, tais como margarinas com gordura plena com 60 a 90% em pesode gordura, margarinas com gordura média com 30 a 60% em peso degordura, produtos com baixa gordura com 10 a 30% em peso de gordura emargarinas com gordura muito baixa ou livres de gordura com 0 a 10% empeso de gordura.

A gordura na margarina ou outro espalhante pode ser qualquergordura comestível e são freqüentemente utilizados óleo de soja, óleo de colza,óleo de girassol e óleo de palma. Gorduras podem ser utilizadas como tal ouem forma modificada, tais como hidrogenadas, esterificadas, refinadas etc.Outros óleos apropriados são bem conhecidos na técnica e podem serselecionados conforme o desejado.

O pH de margarina ou espalhante pode convenientemente ser de4,5 a 6,5.

Exemplos de espalhantes diferentes de margarinas sãoespalhantes de queijo, espalhantes doces, espalhantes de iogurte etc.

Ingredientes adicionais opcionais de espalhantes podem seremulsificantes, corantes, vitaminas, conservantes, emulsificantes, gomas,espessantes etc. O saldo do produto normalmente será de água.

Tamanho típico de porção média de margarina ou outrosespalhantes é de quinze gramas. Lactobacillus produtores de VHH preferidosna margarina ou espalhante são de 106 e 1011 por porção, de maior preferência108 a 1010 por porção. A linhagem de Lactobacillus necessita ser adicionadaassepticamente após as etapas de aquecimento no processo.Alternativamente, VHHs encapsulados podem ser adicionados a essesprodutos alimentícios. Preferencialmente, são adicionados 25 a 5000 μg porporção, de maior preferência de 50 a 500 μg são adicionados por porção. Depreferência superior, duas ou três porções são servidas por dia.

Produtos de confeitaria congelados:

Para os propósitos da presente invenção, a expressão produto deconfeitaria congelado inclui leite que contém confeitos congelados, tal comosorvete, iogurte congelado, sorvete de frutas, picolé, leite congelado e pudimcongelado, gelos de água, granitas e purês de fruta congelados.

Preferencialmente, o nível de sólidos no confeito congelado (talcomo açúcar, gordura, aromatizante etc.) é de mais de 3% em peso, de maiorpreferência de 10 a 70% em peso, tal como de 40 a 70% em peso.

Sorvete compreenderá tipicamente de 2 a 20% em peso degordura, 0 a 20% em peso de adoçantes, 2 a 20% em peso de componentes deleite sem gordura e componentes opcionais tais como emulsificantes,estabilizantes, conservantes, ingredientes aromatizantes, vitaminas, saisminerais etc., em que o saldo é água. Tipicamente, o sorvete será aerado, talcomo até sobrecondução de 20 a 400%, de forma mais geral de 40 a 200%, econgelado até temperatura de -2 a -200 0C, de forma mais geral de -10 a -30 0C.

Sorvete normalmente compreende cálcio em nível de cerca de 0,1 % em peso.Tamanho típico de porção média de material de confeitariacongelado é de 150 gramas. Os níveis de Lactobacillus preferidos são de 106 a1011 por porção, de maior preferência estes níveis são de 107 a 1010 por porção,de preferência superior de 108 a 109 por porção. A linhagem de Lactobacillusnecessita ser adicionada assepticamente após as etapas de aquecimento noprocesso. Alternativamente, VHHs encapsulados podem ser adicionados a estesprodutos alimentícios. Preferencialmente, adiciona-se de 25 a 5000 μg porporção, de maior preferência de 50 a 500 μg são adicionados por porção. Depreferência superior, duas ou três porções são fornecidas por dia.

Bebidas, tais como produtos com base em chá ou substituintes dealimentos:

Lactobacillus podem ser convenientemente utilizados parabebidas tais como suco de frutas, refrigerantes etc. Bebida muito vantajosa deacordo com a presente invenção é produto com base em chá ou bebidasubstituinte de refeição. Estes produtos serão descritos com mais detalhesabaixo. Será evidente que níveis e composições similares aplicam-se a outrasbebidas que compreendem bactérias de Lactobacillus e vitaminas.

Para os propósitos da presente invenção, a expressão produtoscom base em chá designa produtos que contêm chá ou composições de ervasque substituem chá, tais como sacos de chá, folhas de chá, sacos de chá deervas, infusões de ervas, chá em pó, chá de ervas em pó, chá gelado, chá deervas gelado, chá gelado carbonatado, infusão de ervas carbonatada etc.

Tipicamente, alguns produtos com base em chá de acordo com apresente invenção podem necessitar de etapa de preparação pouco antes doconsumo, tal como a elaboração de chá a partir de sacos de chá, folhas dechá, sacos de chá de ervas ou infusões de ervas ou a solubilização de cháem pó ou chá de ervas em pó. Para estes produtos, prefere-se ajustar o nívelde Lactobacillus no produto, de tal forma que uma porção do produto final aser consumido contenha os níveis desejados de Lactobacillus conformedescrito acima.

Para chá gelado, chá de ervas gelado, chá gelado carbonatado einfusões de ervas carbonatadas, o tamanho típico de uma porção será de 200ml ou 200 gramas.

Bebidas substituintes de refeições baseiam-se tipicamente embase líquida que pode ser espessada, por exemplo, por meio de gomas oufibras e às quais adiciona-se coquetel de minerais e vitaminas. A bebida podeser aromatizada no sabor desejado, tal como sabor de frutas ou de chocolate.

Tamanho de porção típico pode ser de 330 ml ou 330 gramas.

Para bebidas com base em chá e para bebidas substituintes dealimentos, os níveis de Lactobacillus preferidos são de 106 a 1011 por porção,de maior preferência estes níveis são de 107 a 1010 por porção, de maiorpreferência de 108 a 109 por porção. Alternativamente, VHHs encapsuladospodem ser adicionados a estes produtos alimentícios. Preferencialmente, sãoadicionados de 25 a 5000 μg por porção, de maior preferência são adicionadosde 50 a 500 μg por porção. De preferência superior, duas ou três porções sãofornecidas por dia.

Para produtos que são extraídos para a obtenção do produto final,geralmente o propósito é garantir que uma porção de 200 ml ou 200 gramascompreenda as quantidades desejadas conforme indicado acima. Nestecontexto, dever-se-á apreciar que normalmente apenas parte do Lactobacilluspresente no produto com base em chá a ser extraído será eventualmenteextraído para a bebida de chá final. Para compensar este efeito, geralmente édesejável incorporar aos produtos a serem extraídos cerca de duas vezes aquantidade que se deseja ter no extrato.

Para folhas de chá ou sacos de chá, tipicamente seriam utilizadosum a cinco gramas de chá para preparar uma única porção de 200 ml.

Caso sejam utilizados sacos de chá, o Lactobacillus pode serconvenientemente incorporado ao componente de chá. Apreciar-se-á,entretanto, que, para algumas aplicações, pode ser conveniente separar oLactobacillus do chá, tal como por meio da sua incorporação a compartimentoseparado do saco de chá ou sua aplicação sobre o papel de saco de chá.Alternativamente, o microorganismo pode ser administrado em forma secautilizando canudo, colher ou bastão com revestimento de microorganismo seco.

Coberturas de salada ou maionese:

Geralmente, coberturas ou maionese são emulsões de óleo emágua, em que a fase de óleo da emulsão é geralmente de 0 a 80% em peso doproduto. Para produtos sem redução de gordura, o nível de gordura étipicamente de 60 a 80%, para coberturas de salada o nível de gordura égeralmente de 10 a 60% em peso, de maior preferência de 15 a 40% em peso,e coberturas com baixa ou nenhuma gordura podem conter, por exemplo,níveis de triglicérides de 0, 5, 10 e 15% em peso.

Coberturas e maionese são geralmente produtos com baixo pHque possuem pH preferido de 2 a 6.

Coberturas ou maionese podem conter opcionalmente outrosingredientes tais como emulsificantes (por exemplo, gema de ovo), estabiiizantes,acidulantes, biopolímeros, agentes formadores de volume, aromas, agentescorantes etc. O saldo da composição é água, que poderá estar convenientementepresente em nível de 0,1 a 99,9% em peso, mais geralmente de 20 a 99% empeso, de preferência superior de 50 a 98% em peso.Tamanho típico de porção média de coberturas ou maionese é detrinta gramas. Os níveis preferidos de Lactobacillus nesses produtos seriam de106 a 1011 por porção, de maior preferência estes níveis são de 107 a 1010 porporção, de preferência superior de 108 a 109 por porção. A linhagem deLactobacillus necessita ser adicionada assepticamente após as etapas deaquecimento no processo. Alternativamente, VHHs encapsulados podem seradicionados a esses produtos alimentícios. Preferencialmente, são adicionadosde 25 a 5000 μg por porção, de maior preferência de 50 a 500 μg sãoadicionados por porção. De preferência superior, são fornecidas duas ou trêsporções por dia.

Barras ou lanches substituintes de refeições:Estes produtos freqüentemente compreendem matriz de materialcomestível em que o Lactobacillus pode ser incorporado. A matriz pode ser, porexemplo, com base em gordura (tal como cobertura ou chocolate) ou pode serbaseada em produtos de confeitaria (pão, roscas, biscoitos etc.), ou pode serbaseada em partículas aglomeradas (arroz, grãos, nozes, passas, partículas defrutas).

Tamanho típico de lanche ou barra de substituição derefeições poderá ser de 20 a 200 g, geralmente de 40 a 100 g. Os níveispreferidos de Lactobacillus nestes produtos seriam de 10 a 10 porporção, de maior preferência estes níveis são de 107 a 1010 por porção,de preferência superior de 108 a 1010 por porção. A linhagem deLactobacillus necessita ser adicionada assepticamente após as etapas deaquecimento no processo. Alternativamente, VHHs encapsulados podemser adicionados a esses produtos alimentícios. Preferencialmente, sãoadicionados de 25 a 5000 μg por porção, de maior preferência de 50 a500 μg são adicionados por porção. De preferência superior, duas ou trêsporções são fornecidas por dia.Podem ser agregados ingredientes adicionais ao produto acima,tais como materiais aromatizantes, vitaminas, sais minerais etc.

Para cada um dos produtos alimentícios acima, a quantidade deLactobacillus por porção foi fornecida como exemplo preferido. Compreender-se-á que alternativamente qualquer microorganismo apropriado ou vírus podeestar presente neste nível.

Limonada em pó:

Lactobacillus podem também ser utilizados em pós secos emsachês, a serem dissolvidos instantaneamente em água para gerarlimonada refrescante. Este pó pode possuir veículo com base emalimento, tal como maltodextrina ou qualquer outro. Ingredientesadicionais opcionais podem ser corantes, vitaminas, sais minerais,conservantes, gomas, espessantes etc.

Tamanho típico para porção média, margarina ou outrosespalhantes é de trinta a cinqüenta gramas. Lactobacillus produtores de VHHpreferidos na limonada em pó são de 106 a 1011 por porção, de maiorpreferência de 108 a 1010 por porção. A linhagem de Lactobacillus necessita serpulverizada sobre o veículo de forma a ser mantida viva, de acordo commétodos conhecidos dos técnicos no assunto. Alternativamente, VHHsencapsulados podem ser adicionados a esses produtos alimentícios.Preferencialmente, são adicionados de 25 a 5000 μg por porção, de maiorpreferência de 50 a 500 μg são adicionados por porção.

Em todos os produtos acima, o microorganismo transformadopode ser adicionado na forma de biomassa cultivada viável (úmida) ou depreparação seca, que ainda contém os microorganismos viáveis conformeconhecido na técnica.

A presente invenção será adicionalmente ilustrada nosexemplos.Exemplos

Exemplos 1 a 3: Geração de Fragmentos de Anticorpos com Teste in Vitro εin Vivo Subseqüente

Exemplo 1

Seleção de Fragmentos de Anticorpos de Cadeia Pesada Específicos deRotavírus de Biblioteca de Exibição de Fagos Imunes de Lhama ε Produçãoem Levedura

RRV de linhagem de rotavírus de Rhesus (sorotipo G3) foipurificado, amplificado e concentrado conforme descrito anteriormente(Svensson, L., Finlay, B. B., Bass1 D., Vonbonsdorff1 C. H., Greenberg, H. B.,Symmetrical Infection on Polarised Human Intestinal Epithelial (CaCo-2) Cells,J. Virol. (1991) 65, 4190-4197.

Lhama foi imunizada por via subcutânea e intramuscular no dia 0,42, 63, 97 e 153 com 5 χ 1012 pfu de rotavírus linhagem RRV.

Antes da imunização, as partículas virais foram absorvidas ememulsão em óleo (1:9 VA/, antígeno em PBS: Specol (Bokhout, Β. A., VanGaalen, C. e Van Der Heijden, Ph. J., A Selected Water-in-Oil Emulsion:Composition and Usefulness as an Immunological Adjuvant, Vet. Immunol.Immunopath. (1981) 2: 491-500 e Bokhout, Β. A., Bianchi, A. T. J., Van DerHeijden, Ph. J., Scholten, J. W. e Stok, W., The Influence of a Water-in-OilEmulsion on Humoral Immunity1 Comp. Immun. Mierobioi Infeet. Dis. (1986) 9:161-168, conforme descrito acima (Frenken, L. G. J. et al, Isolation of AntigenSpeeifie Llama Vhh Antibody Fragments and their High Levei Seeretion bySaccharomyees eerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78, 11-21). A reaçãoimunológica foi seguida por titulação de amostras de soro em ELISA comrotavírus RRV revestido em título de 4 χ 106 pfu/ml em 0,9% NaCI seguindo oprotocolo descrito acima (De Haard, H. J., van Neer, N., Reurs, A., Hufton, S.E., Roovers, R. C., Henderikx, P., de Bruine, A. P., Arends, J. W. eHoogenboom, Η. R., A Large Non-Immunized Human Fab Fragment PhageLibrary that Permits Rapid Isolation and Kinetic Analysis of High AffmityAntibodies, J. Bioi Chem. (1999) 274: 18218-18230; Frenken, L. G. J. et al,Isolation of Antigen Specific Llama Vhh Antibody Fragments and their HighLevei Secretion by Saccharomyees eerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78, 11-21).

População de linfócitos enriquecida foi obtida a partir da amostrade sangue de 153 dias de cerca de 150 ml por meio de centrifugação sobregradiente descontínuo Ficoll (Pharmacia). A partir destas células, o RNA total(250 a 400 μg) foi isolado por meio de extração com tiocianato de guanídioácido, Chomczynski1 P. e Sacchi, N., Single-Step Method of RNA Isolation byAeid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraetion, Anal. Bioehem.(1987) 162: 156-159. Em seguida, cDNA de primeira fita foi sintetizadoutilizando o kit de cDNA de primeira fita Amersham (RPN 1266). Em mistura dereação de 20 μΙ, utilizou-se 0,4 a 1 μg de RNA. O primer aleatório 6-mer foiutilizado para servir de primer para a primeira fita de DNA. Após a síntese decDNA, a mistura de reação foi utilizada diretamente para amplificação por meiode PCR. Genes VHH foram amplificados com os primers:

Lam-16: (GAGGTBCARCTGCAGGASAGYGG);

Lam-17: (GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG);

Lam-07: (primer até a região de articulação curta); e

Lam-08: (específico de articulação longa).

(Frenken, L. G. J. et al, Isolation of Antigen Speeifie Llama VhhAntibody Fragments and their High Levei Seeretion by Saccharomyeeseerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78, 11-21). Realizou-se amplificação de DNAconforme descrito por De Haard, H. J., van Neer1 N., Reurs, A., Hufton1 S. E.,Roovers, R. C., Henderikx, P., de Bruine, A. P., Arends1 J. W. e Hoogenboom,H. R., A Large Non-Immunized Human Fab Fragment Phage Library thatPermits Rapid Isolation and Kinetie Analysis of High Affinity Antibodiesy J. Biol.Chem. (1999) 274: 18218-18230.

Os produtos amplificados foram digeridos com Psfl e Not\ (NewEngland Biolabs1 Estados Unidos) e clonados em vetor de fagomídeopUR5071, que é baseado em pHEN1 (Hoogenboom, H. R., Griffiths1 A. D.,Johnson, K. S., Chiswell1 D. J., Hudson1 P. e Winter1 G., Multi-Subunit Proteinson the Surface of Filamentous Phage: Methodologies for Dispiaying Antibody(Fab) Heavy and Light Chains, Nucieic Acids Res. (1991) 19: 4133-4137) econtém cauda de hexahistidina para Cromatografia de Afinidade Imobilizada(Hochuli1 E., Bannwarth1 W., Dobeli1 H., Gentz, R. e Stüber, D., GenetieApproaeh to Faeilitate Purifieation of Reeombinant Proteins with a Novel MetalChelate Adsorbent, Bio/Teehnol. (1988) 6: 1321-1325) e marca derivada de c-myc (Munro, S. e Pelham1 H. R., An Hsp70-like Protein in the ER: Identity withthe 78 kd Glucose-Regulated Protein and Immunoglobulin Heavy Chain BindingProtein, Cell (1986) 46: 291-300) para detecção. Ligação e transformaçãoforam realizadas conforme descrito anteriormente (De Haard1 H. J., van Neer1N., Reurs, A., Hufton1 S. E., Roovers1 R. C., Henderikx1 P., de Bruine1 A. P.,Arends1 J. W. e Hoogenboom1 H. R., A Large Non-Immunized Human FabFragment Phage Library that Permits Rapid Isolation and Kinetie Analysis ofHigh AffinityAntibodies, J. Bioi Chem. (1999), 274: 18218-18230). O resgatecom fago auxiliar VCS-M13 e precipitação de PEG foi realizado conformedescrito por Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnert, T. P., McCafferty1 J.,Griffiths1 A. D. e Winter1 G., By-Passing Immunization: Human Antibodies fromV-Gene Libraries Displayedon Phage, J. Moi Biol. (1991), 222: 581-597.

Seleções de fagos específicos de rotavírus foram realizadas pormeio do método de biomistura (Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnert1 T.P., McCafferty, J., Griffiths1 A. D. e Winter, G., By-Passing Immunization:Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage, J. Moi Bioi(1991), 222: 581-597) por meio de revestimento de RRV de linhagem derotavírus (2,5 χ 107 pfu/ml na rodada 1; 5 χ 104 pfu/ml na rodada 2; 500 pfu/mlna rodada 3). Imunotubos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidos poruma noite a 4 0C com diluição 1:1000 de soro de coelho anti-rotavírus ou sorode cobaias anti-rotavírus em tampão de carbonato (16% (v/v) 0,2 M NaHCO3 +9% (v/v) 0,2 M Na2CO3). Partículas virais foram capturadas por meio de soroanti-rotavírus policlonal. Além das seleções padrão, o fragmento de anticorpoque exibe fagos foi selecionado em ambiente ácido. Isso foi realizado por meiode seleção em solução de HCI diluída (pH 2,3). Após este processo de seleçãoadaptado, foi seguido o procedimento padrão.

VHH solúvel foi produzido por clones TG1 de E. coli conformedescrito por Marks, J. D., Hoogenboom, H. R., Bonnert1 T. P., McCafferty1 J.,Griffiths, A. D. e Winter, G., By-Passing Immunization: Human Antibodies fromV-Gene Libraries Displayed on Phage, J. Mol. Bioi (1991) 222: 581-597.Sobrenadantes de cultivo foram testados em ELISA. Placas Microlon F (GreinerBio-One GmbH, Alemanha) foram revestidas com 50 μΙ/cavidade de diluição1:1000 de soro policlonal de coelho anti-rotavírus ou soro policlonal de cobaiaanti-rotavírus em tampão de carbonato (16% (v/v) 0,2 M NaHCO3 + 9% (v/v)0,2 M Na2CO3) e incubadas em seguida com rotavírus linhagem RRV ou CK5(cerca de 109 pfu/ml). Após a incubação dos sobrenadantes que contêm VHH,VHHs foram detectados com mistura do anticorpo monoclonal anti-myc decamundongo 9E10 (500 ng/ml, produção doméstica) e conjugado de HRP anti-camundongo (250 ng/ml, Dako, Dinamarca). Alternativamente, realizou-sedetecção com conjugado anti-6xHis-anticorpo HRP (1000 ng/ml, RocheMolecular, Estados Unidos). Análise de impressão digital (Marks, J. D.,Hoogenboom, H. R., Bonnert, T. P., McCafferty, J., Griffiths, A. D. e Winter, G.,By-Passing Immunization: Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayedon Phage, J. Mol. Biol. (1991) 222: 581-597) com a enzima de restrição H/nFI(New England Biolabs, Estados Unidos) foi realizada em todos os clones.Realizou-se seqüenciamento na Baseclear Β. V. (Leiden, Países Baixos).

Foi selecionado conjunto de fragmentos de anticorposespecíficos de rotavírus. Seqüências de DNA que codificam estesfragmentos de anticorpos foram isoladas a partir de pUR5071 (Psf/l/SsíEII,New England Biolabs, Estados Unidos) e clonadas em pUR4547 que éidêntico ao pUR4548 descrito anteriormente (Frenken1 L. G. J. et al, Isolationof Antigen Specific Llama VHh A ntibody Fragments and their High LeveiSecretion by Saccharomyces eerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78, 11-21),mas não codifica nenhuma seqüência de marca C-terminal. Este vetor deexpressão de levedura epissomal contém o promotor GAL7, a seqüência desinal SUC2 para expressão em alto nível e secreção no meio decrescimento, respectivamente. A linhagem VWK18gal1 de S. eerevisiae foitransformada e induzida para produção de fragmentos de anticorposconforme descrito anteriormente (Van der Vaart, J. M., Éxpression of VHHAntibody Fragments in Saccharomyees eerevisiae. Em Methods in MolecularBiology (2001), vol. 178, págs. 359-366, editado por Ρ. M. 0'Brien e R.Aiken, Humana Press Inc., Totowa NJ). Fragmentos de anticorpos forampurificados e concentrados por meio de filtragem sobre filtros microcon comcorte de 10 kDa (Amicon, Estados Unidos).

Exemplo 2

i nl bicão IN VlTRO de rotavírusRotavírus bovino Compton CK5 foi obtido a partir do InstitutoMoredun, Midlothian, Escócia, e as células BS-C1 foram adquiridas da ColeçãoEuropéia de Cultivo de Células Animais.

As células BS-C1 foram cultivadas em Meio Essencial Modificadode Earles suplementado com soro de feto de bezerro desativado por calor a10%, solução de aminoácidos MEM a 1% (100X), 20 mmol I"1 de L-glutamina,100 Ul ml"1 de penicilina, 100 μg ml'1 de estreptomicina e 2,5 μg ml"1 deanfotericina B (todos da Sigma, Estados Unidos).

Estoque de rotavírus CK5 foi diluído em Meio Livre de Soro (SFM)EMEM suplementado com 1% solução de aminoácidos MEM (100x), 20 mmol Γ1 de L-glutamina e 0,5 ^ig/ml de tripsina cristalina e, em seguida, adicionou-se 5ml de sementes diluídas a monocamadas confluentes de células BS-C1 emfrascos de cultivo de tecidos de 162 cm2 (Costar, Reino Unido). O vírus foiadsorvido sobre as células por uma hora a 37 0C e, em seguida, o meio foicompletado até 75 ml. As garrafas foram incubadas a 37 0C até observar-seefeito citopático completo. Cultivos foram congelados (-70 0C) e descongeladospor duas vezes, depois reunidos e centrifugados a 1450 g por quinze minutos a4 'C para remover fragmentos celulares. O sobrenadante foi decantado earmazenado em parcelas a -70 0C.

Monocamadas de células BS-C1 foram cultivadas em placas decultivo de tecidos com doze cavidades a 37 0C em atmosfera de 95% de ar e5% de dióxido de carbono. O meio foi removido e substituído com SFM porpelo menos duas horas antes do uso. O vírus CK5 foi diluído para gerar cercade 50 pfu/ml em SFM. Os fragmentos anti-rotavírus selecionados foramdiluídos em SFM e, em seguida, volumes iguais de vírus e diluição defragmentos foram misturados (volume total de 200 μΙ) e incubados por umahora a 37 0C.

As misturas de vírus e fragmento foram colocadas em placas emseguida sobre as monocamadas de células (três cavidades iguais cada). Asplacas foram incubadas por uma hora a 37 0C em atmosfera de 95% de ar e5% de dióxido de carbono. Em seguida, o vírus foi removido e sobrecamadaque consiste de 0,75% Agarose de Placa Marítima (FMC) em EMEM contendo100 Ul ml"1 de penicilina, 100 μg ml"1 de estreptomicina, 2,5 μg ml"1 deanfotericina B e adicionou-se 0,1 μρ/ιτιΙ de tripsina cristalina. As placas foramincubadas em seguida a 37 0C em atmosfera de 95% de ar e 5% de dióxido decarbono por quatro dias. Após fixação e manchas com violeta de cristal a 1%em formaldeído a 10%, a agarose foi removida, as cavidades foram lavadascom água e as placas foram contadas.

De 23 clones testados de acordo com o método descrito acima,nove produziram fragmentos de anticorpos capazes de neutralizar estalinhagem de rotavírus. Os fragmentos 2B10 e 1D3 neutralizaram maiseficientemente rotavírus nos testes de placas (Fig. 1).

A Figura 1 exibe neutralização de vírus de rotavírus CK5determinada por teste de placas in vitro. A taxa média de neutralização dasquatro medições obtidas é indicada em cada ponto de dados. Caso hajaespalhante de mais de 10% em ponto de dados, são indicadas as duasmedições mais extremas (barra tracejada). Os fragmentos de anticorpostestados foram divididos por dois gráficos, AeB. Nos controles A negativos, ovírus foi omitido (ausência de vírus) ou adicionou-se VHH não específico derotavírus. O fragmento de VHH não específico é específico para o hormônio dagravidez humana hCG. Foi descrito o isolamento deste fragmento (Spinelli, S.,Frenken, L., Bourgeois, D., de Ron1 L., Bos1 W., Verrips, T., Anguille, C.,Cambillau, C. e Tegoni, M., The Crystal Structure of a Llama Heavy ChainDomaln, Nat. Struct. Biol (1996) 3: 752-757; Frenken, L. G. J. et al, Isolation ofAntigen Specific Llama Vhh Antibody Fragments and their High Levei Secretionby Saccharomyces eerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78, 11-21).

Desta forma, utilizando este método, foi identificada uma série defragmentos de VHH que podem inibir infecções por rotavírus em sistema in vitro.

Exemplo 3

Inibicão de rotavírus IN VlVO em camundongos

Alguns dos fragmentos de VHH selecionados por meio daabordagem descrita no Exemplo 2 foram utilizados em experimentos in vivopara estudar a eficácia destes fragmentos de anticorpos na prevenção outratamento de diarréia induzida por rotavírus em camundongos. Este modelo desistema vem sendo utilizado freqüentemente para o estudo de infecções porrotavírus (Ebina, T., Ohta1 M., Kanamaru, Y., Yamamotoosumi, Y., Baba1 K.,Passive Immunisations of Suckling Mice and Infants with Bovine ColostrumContaining Antibodies to Human Rotavírus, J. Med. Viroi (1992) 38: 117-123).

Fêmeas de camundongos BALB/c negativas para rotavírusprenhas por quatorze dias foram obtidas por meio da Mõllegârd, Dinamarca. Oscamundongos foram abrigados individualmente na instalação de animais doHospital de Huddinge. Foi obtida aprovação do comitê ético local do InstitutoKarolinska no Hospital Huddinge, Suécia. Alimentação em pelotas normal eágua foram fornecidas à vontade.

A fim de examinar se os fragmentos podem inibir infecçõesquando unidos a rotavírus (RV)1 fragmentos de VHH selecionados forampreviamente misturados com quantidades tituladas (2 χ 107 ffu) ou RRV antesda sua utilização para infecções no dia 1.

Filhotes de camundongos com quatro dias de idade foramtratados diariamente com fragmentos de VHH1 incluindo o dia O (dia antes dainfecção) até o dia 4 (Fig. 2), inclusive, e determinou-se a diarréia. Notávelredução da ocorrência de diarréia foi observada para o fragmento de anticorpo2B10, exibido na Figura 2. O número de filhotes com diarréia ésignificativamente mais baixo no dia 2 no grupo que recebe fragmento 2B10 emcomparação com o grupo não tratado. Além disso, nos dias 3, 4 e 5, nenhumdos filhotes no grupo tratado com 2B10 exibiu sinais de diarréia emcomparação com a maior parte dos filhotes nos demais grupos tratados comRRV (Fig. 2). Nenhum efeito estatisticamente significativo do fragmento deVHH não relacionado RR6 (dirigido contra tinturas azo; Frenken1 L. G. J. et al,Isolation of Antigen Specific Llama VHh Antibody Fragments and their HighLevei Seeretion by Saccharomyees eerevisiae, J. Bioteehnol. (2000) 78, 11-21)foi encontrado em comparação com o grupo não tratado.

Além disso, a quantidade média de dias de diarréia por filhote decamundongo foi calculada para cada grupo de tratamento como o número dedias de diarréia por filhote dividido pelo número total de filhotes por grupo detratamento. Para os grupos tratados com fragmento 2B10, concluiu-se que ésignificativamente reduzido para 0,33 ± 0,21 dias em comparação com 2,87 ±0,29 dias para o grupo não tratado.

É importante observar que, a partir de agora nos exemplos aseguir, o plasmídeo derivado de pUR5071 que contém o gene codificador dofragmento 2B10 foi denominado pUR655 e o anticorpo codificado foirenomeado fragmento VHH1 (Peter Pouwels et al, Lactobacilli as Vehicles forTargeting Antigens to Mucosal Tissues by Surface Exposition of ForeignAntigens).

Exemplo 4 (a a k)

Experimentos adicionais separados similares aos Exemplos 1 a 3foram conduzidos conforme segue:

a. Construção de vetores de expressão VHH1 e scFv-2A10 anti-rotavírus.

RNA total foi extraído de hibridoma que secreta mAb 2A10 anti-rotavírus (classe IgA) (Giammarioli et al (1996), Viroi 225: 97-110)).Seqüências codificadoras de regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve(VK) foram amplificadas utilizando kit 5' RACE (Sistema 5' RACE paraAmplificação Rápida de Extremidades de cDNA (Versão 2.0, Invitrogen® LifeTechnologies, Carlsbad CA). Os primers para o 5' RACE de VH foram:

ACRACE1: 5-CAGACTCAGGATGGGTAAC-3';

ACRACE2: 5'-CACTTGAATGATGCGCCACTGTT-3';

ACRACE3: 5'-GAGGGCTCCCAGGTGAAGAC-3'; enquanto osprimers:mkRACEI (5'-TCATGCTGTAGGTGCTGTCT-3');mkRACE2 (5'-TCGTTCACTGCCATCAATCT-3'); emkRACE3 (5-TGGATGGTGGGAAGATGGAT-3')foram utilizados para amplificar a região variável da cadeia leve. Oproduto de PCR com extremidade A resultante foi clonado em vetor pGEM®-Teasy com sobreposições 3'-T e seqüenciado. As seqüências VH e VK foramfundidas entre si com Iigante que codifica gene (com a seqüência deaminoácidos (G4S)3). As duas cadeias foram novamente amplificadas a partirdos produtos 5' RACE clonados utilizando os primers:

CIaI-VHs (5'-TTTTATCGATGTGCAGTTGGTGGAGTCTGG-3'); eLigante-VHas (5'-CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGG-3');

Ligante-VKs (5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGATGACCCAGTC-3'); eEcoRI-Vkas (5'-TTTTGAATTCTTTTATTTCCAGCCTGGTCC-3').

Os produtos de PCR VH e VK resultante foram misturados entre si e utilizadoscomo modelo para PCR de fusão utilizando os primers CIaI-VHs e EcoRI-VKas.Os produtos de PCR fundidos foram clonados em vetor pGEM®-T easy após aadição de sobreposição A utilizando Taq DNA polimerase. A seqüênciacodificadora de scFv-2A10 fundida foi finalmente cortada dos plasmídeosutilizando EcoRI mais C/al e subclonada em pBluescript Il SK (+) (Stratagene,La Jolla CA) que contém marca E (pBS-marca E).

O VHH1 foi amplificado a partir de pUR655 utilizando primer comsentido que contém local de restrição de C/al e primer sem sentido que contémlocal de restrição de EcoRI e, em seguida, inserido no vetor pBS-marca E. Paraa geração de fragmentos de anticorpos expressos na superfície, scFv-2A10-marca E e VHH-1 -marca E foram extirpados do vetor pBS-marca E utilizandolocais de restrição C/al e Xho\ e fundidos a seqüência de ancoramento, osúltimos 244 aminoácidos da proteína proteinase P de L. casei (Krüger et al,Nature Biotechnoi (2002) 20: 702-706) no vetor de expressão de LactobacilluspLP502 (Fig. 3A e 3C). Para gerar o fragmento de anticorpo secretado, códonde parada (TAA) foi inserido por meio de amplificação de PCR após a marca Ee os produtos foram inseridos em pLP502 entre os locais de restrição C/al eXho\ (Fig. 3B e 3D). O vetor pLP502 contém o promotor constitutivo do geneIactato desidrogenase (PIdh) (Pouwels et al, Lactobacilli as Vehieles forTargeting Antigens to Mueosal Tissues by Surfaee Exposition of ForeignAntigens, Methods in Enzymology (2001) 336: 369-389). Transformação em L.paraeasei foi realizada conforme descrito anteriormente (Krüger et al, 2002conforme acima).

b. Comparação dos níveis de expressão de transgenes específicos deanticorpos em lactobacilos transformados.

RNA total foi extraído de diferentes construções de Iactobacilosaté ODeoo de 0,8 (QIAGEN) e transcrição reversa foi realizada após a digestãode DNA residual com RQ1 DNase (Promega). A quantidade de RNAm para osdiferentes fragmentos de anticorpos foram medidos utilizando o kit centralqPCR® para SYBR® verde I (MedProbe, Oslo, Noruega) e sistema dedetecção de seqüências ABI PRISM 7000 (PE Applied Biosystems, Foster CityCA). Tempos de perfil típicos utilizados foram: etapa inicial, 95 0C, dez minutosseguido por segunda etapa, 95 0C por quinze segundos e 58 0C por um minuto,quarenta ciclos. cDNA reunido foi utilizado para a geração de curva padrão de16SrRNA e o inserto de anticorpo utilizando os primers:

pO (5'GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'); e

- p6 (5'CTACGGCTACCTTGTTACGA 3') para o 16SrRNA; e

primers prtpsp (5TCTTGCCAGTCGGCGAAAT 3'); e

XhoI-VHH (5'CCGCTCGAGTGCGGCACGCGGTTCC 3') parao inserto.c. Purificação de fragmentos de anticorpos secretados.

Para purificação de fragmentos de anticorpos secretados porVHH1, L. paracasei que contém as construções foram cultivados até OD60O de0,8. Após a centrifugação, o pH dos sobrenadantes foi ajustado em 7 e foramfiltrados através de filtro de 0,45 μm. Os fragmentos de anticorpos secretadosforam purificados em seguida de acordo com as instruções fornecidas noMódulo de Purificação RPAS (Amersham-Bioscience, Little Chalfont,Buckinghamshire1 Reino Unido). Diálise por uma noite a 8°C foi realizada commembrana Spectra/Por® MWCO 6-8000 (Spectrum Medicai Industries, Inc.,Los Angeles CA) contra 1xPBS. Os fragmentos de anticorpos purificados foramconduzidos em gel de SDS-poliacrilamida a 15% para verificar a pureza daamostra e a concentração de proteína total foi determinada por meio do testede proteínas BioRad (BioRad Laboratories, Hercules CA).

p. Extração de proteínas ε determinação da concentração deproteínas.

L paracasei que contém as construções 2A10-âncora, VHH1-âncora, 2A10-secretadas, VHH1-secretadas, irrelevantes-secretadas eirrelevantes-âncora foram cultivados em caldo MRS que contêm 3 μg/ml deeritromicina até ODeoo de 0,8. As bactérias foram lisadas em 10 mM de Tris-HCI, pH 8,0, que contém 10 mg/ml de Iisozima a 37°C por uma hora e, emseguida, rompidas por meio de sonicação (6 χ ciclos de liga/desliga de 30 s)com ciclo de trabalho a 60% (Digital Sonifier®, modelo 250, BransonUltrasonics Corporation, Danbury CT). Fragmentos foram removidos por meiode centrifugação. Os sobrenadantes foram concentrados a 50x utilizandoultrafiltragem (Amicon, Beverly MA). Utilizou-se teste de proteína BioRad paradeterminar a concentração de proteína conforme descrito acima.

e. Teste imunoabsorvente ligado por enzimas ε citometria de fluxo.

Placas de 96 cavidades ELISA foram revestidas com soro anti-rotavírus humano de coelho (1/1000). Diluição 1:100 de estoque rotavírus deRhesus (RRV) foi utilizada para revestimento secundário. Após o bloqueio, asplacas foram incubadas com os extratos de proteína ou sobrenadantesconcentrados. Anticorpos anti-marca E de camundongos (AmershamPharmacia Biotech, Bucks1 Reino Unido) ou anticorpos anti-lhama de coelhos,anticorpos anti-camundongos de cabra conjugados a rabanete silvestre (HRP)ou anticorpos anti-coelhos de suínos (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) esubstrato de S1S11S1S1-IetrametiIbenzidina (TMB) foram adicionados e aabsorção foi medida a 630 nm utilizando leitor de microplacas Vmax (MolecularDevices, Sunnyvale CA). Todos os anticorpos foram diluídos 1/1000.Anticorpos 2A10 monoclonais e VHH1-marca E purificados foram utilizadoscomo padrão para determinar a concentração de fragmentos de anticorposproduzidos pelos diferentes transformadores de lactobacilos.

Conduziu-se citometria de fluxo de acordo com protocolos padrãoutilizando anticorpos anti-marca E e as amostras foram analisadas utilizandomáquina FACS Calibur (Becton Dickinson, Estocolmo, Suécia).

Os resultados são exibidos na Figura 4a.

f. Microscopia eletrônica SEM TEM.

Para cultivos em Microscópio Eletrônico de Varrimento (SEM) detransformadores de lactobacilos que expressam VHH1 ancorado sobre asuperfície e o L. paracasei não transformado foram misturados com RRV e,após a incubação, fixados e adicionados sobre lâmina revestida com RC58revestida com poli-L-lisina. As lâminas foram analisadas por meio de SEM(JEOL JSM-820, Tóquio, Japão) a 15 kV.

Para Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM), RRV foiadicionado sobre telas, mergulhado em sobrenadante (concentrado 25 vezes)a partir dos lactobacilos que expressam VHH1 secretado ou sobrenadante doL. paracasei não transformado. Adicionou-se em seguida anticorpo anti-marcaE de camundongo (1:1000) e 10 nm de anticorpos IgG anti-camundongo decabra marcados com ouro (1:1000) (Amersham Biosciences). As telas foramanalisadas por meio de TEM (microscópio eletrônico de transmissão Tecnai 10,

Fei Company1 Países Baixos) a 80 kV.

Os resultados são exibidos na Figura 4b e na Figura 11.

g. Produção ε purificação de vírus.

Rotavírus de Rhesus foi cultivado em células MA104 conformedescrito anteriormente. RRV purificado em placas foi utilizado ao longo de todoo estudo. Estoque de vírus isolado foi produzido para todo o estudo por meiode infecção de células MA104 com RRV em uma série de infecções (MOI) de0,1 em meio M199 livre de soro (Gibco Laboratories, Grand Island NY) quecontém 0,5 μg de tripsina (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) por mililitro.Quando o efeito citopatogênico atingiu cerca de 75% da monocamada, células

foram congeladas e descongeladas por duas vezes e os Iisatos celulares foramlimpos por meio de centrifugação sob baixa velocidade. A suspensão de vírusfoi dividida em parcelas e armazenadas a -80 0C até o uso. Foi realizadadeterminação de títulos de vírus por meio de teste de redução do foco deimunoperoxidase. Um único estoque de vírus foi produzido para todo o estudo.

h. Testes de neutralização in vitro.

Lactobacilos que expressam anticorpos foram adicionalmentetestados para determinar o efeito inibidor sobre rotavírus por meio de teste demicroneutralização conforme descrito anteriormente (Giammarioli et al, 1996conforme acima). Para fragmentos de anticorpos ancorados, as bactérias foramdiluídas em série em meios MEM e incubadas por uma hora a 37 0C com 200ffu de RRV ativado por tripsina (100 μΙ). Ao final da incubação, bactérias foramremovidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi utilizado parainocular monocamadas celulares MA104 cultivadas em placas com 96cavidades. Sobrenadantes de cultivos concentrados de Iactobacilos quesecretam fragmentos de anticorpos, puros ou diluídos em MEM1 foramutilizados para incubação com RRV e inoculação de monocamadas de célulasMA104. As placas inoculadas foram incubadas a 37 0C por uma hora, lavadascom meio MEM1 recebem meio MEM novo suplementado com antibióticos(gentamicina e penicilina/estreptomicina) e são incubadas a 37 0C ematmosfera de CO2 por dezoito horas. Monocamadas foram fixadas emanchadas com imunoperoxidase conforme descrito (Svensson et al, 1991conforme acima). Redução na quantidade de células infectadas com RRV demais de 60% com relação ao número em poços de controle foi consideradocomo indicando neutralização. Fragmentos de VHH1 purificados produzidospor Iactobacilos foram utilizados na forma de controle positivo.

Resultados são exibidos na Figura 5.

Testes in vivo.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitêético local do Karolinska Institutet no Hospital Huddinge, Suécia. Fêmeas decamundongos BALB/c prenhas foram adquiridas da Mollegard, Dinamarca.Filhotes com quatro dias de idade foram utilizados para o estudo. Os filhotesreceberam 10 μΙ de tratamentos diferentes uma vez por dia, a partir do dia -1até o dia 3. Lactobacilos foram administrados uma vez, um dia antes do desafiocom rotavírus. Infecções foram realizadas oralmente no dia 0 utilizando 2 χ 107ffu RRV em volume de 10 μΙ.

A ocorrência de diarréia foi registrada diariamente até o dia 4. Osfilhotes sofreram eutanásia utilizando pentobarbital intraperitoneal no dia 5.Seções de intestinos delgados foram estabilizadas em RNAIater® (QIAGEN)para isolamento de RNA ou fixadas em formalina tamponada neutra paraanálise histopatológica ou novamente suspensas em PBS estéril para o estudode sobrevivência de Lactobacillus. Foram conduzidos quatro experimentosindependentes com vários lactocorpos, testando inicialmente o comportamentode reação à dosagem das bactérias que produzem fragmentos de VHH1ancorados a VHH1, testando em seguida outros lactocorpos na dose ideal. Oslactocorpos controle que expressam fragmentos de anticorpos irrelevantes oulactobacilos não transformados foram incluídos em cada experimento. Gruposomente com infecção também foi incluído em cada experimento.

Para avaliar a sobrevivência de lactobacilos no intestino decamundongos, filhotes receberam uma vez lactobacilos que expressam VHH1ancorado no dia -1 e a metade deles foi infectada com RRV no dia 0. Doisfilhotes em cada grupo sofreram eutanásia e seções do intestino delgado foramremovidas nos dias 1, 3, 7 e 14. A presença de transformadores foi determinadapor meio de cultivo de extratos intestinais sobre placas Rogosa que contêmeritromicina (3 μg/ml). Utilizou-se PCR para detecção do inserto de VHH1.

Os resultados são exibidos na Figura 6.

J. Análise de amostras intestinais.

Seções do intestino delgado foram tomadas no dia 4 e sofreramperfusão com formalina tamponada neutra a 4% e foram efetuadas manchascom hematoxilina e eosina após seccionamento de acordo com os protocolospadrão. Lâminas individuais sofreram avaliação cega para determinar sinaistípicos de infecções por rotavírus.

RNA celular total foi isolado de tecido do intestino delgado eutilizado para análise em tempo real após a digestão de DNA genômicoresidual utilizando DNase® livre de RNase. Kit de reagentes centrais EZ RT-PCR® (PE Applied Biosystems, Foster City CA, Estados Unidos) foi utilizadopara PCR em Tempo Real. Curva padrão foi gerada utilizando vetor pet28a (+)com o gene vp7 RRV clonado entre os locais de restrição de Ncol e Xhol. RNAgenômico viral ou RNAm vp7 de rotavírus foi amplificado a 58°C (ciclizador ABI7000, Applied Biosystems) na presença de 600 nM de primers, 300 nM desonda, 5 mM de Mn para gerar amplicon com 121 bp de comprimento. O primercom sentido (VP7f: 5'-CCAAGGGAAAAT GTAGCAGTAATTC-3') (nucleotídeo(nt) 791-815), o primer sem sentido (VP7r: 5'-TGCCACCATTCTTTCCAATTAA-3'), (nt 891-912) e a sonda (5-6FAM-TAACGGCTGATCCAACCACAGCACC-TAMRA-3' (nt 843-867) foramprojetados com base na seqüência de gene vp7 de rotavírus de rhesus(número de acesso AF295303). O nível mais baixo de detecção de PCR é dedez cópias de RNA viral. As amostras de RNA de cada animal foramnormalizadas para o gene doméstico interno controle GAPDH (Overbergh et al(1999), Cytokine 11: 305-312). A detecção de genomas sem nenhum vírus oucom menos de dez vírus foi definida como ausência de infecção.

Os resultados são exibidos na Figura 7.

κ. Expressão in situ dos fragmentos de VHH1 sobre a superfície delactobacilos nas fezes.

Amostras de fezes de três animais dos grupos que recebem osIactobacilos que expressam os fragmentos ancorados a VHH1, Iactobacilos nãotransformados ou grupo não tratado foram recolhidas no dia do término. Asamostras foram cortadas em lâmina de vidro revestida Super frost e fixadas pormetanol: acetona (1:1) por dez minutos sobre gelo. Anticorpo anti-marca E decamundongo (1/200) e, em seguida, anticorpo anti-camundongo de burromarcado com cy2 (1/200) foram adicionados às lâminas e incubados por umahora sob condições úmidas. Fragmentos de VHH1 expressos na superfícieforam detectados por microscópio de fluorescência.

Estatísticas:

As doenças de diarréia em filhotes foram determinadas com basena consistência das fezes. Diarréia aquosa recebeu avaliação 2 e evacuaçãosolta recebeu avaliação 1, nenhuma evacuação ou evacuação normal recebeuavaliação 0. O percentual de avaliações de diarréia foi calculado a cada dia. Aavaliação diária total em grupo de tratamento foi comparada com grupo nãotratado por meio de teste exato de Fisher. A severidade foi definida como asoma de avaliação de diarréia para cada filhote durante o transcurso do estudoe a duração foi definida como a soma de dias com diarréia. Tanto a severidadequanto a duração foram analisadas por meio de testes Kruskal Wallis e Dunn.

Resultados:

Discussão de Figuras ε Tabelas

Tabela 2

<table>table see original document page 59</column></row><table>

A Fig. 4a demonstra que a expressão na superfície de 2A10-scFve VHH1 por Iactobacilos foi exibida por meio de citometria de fluxo utilizandoanticorpo anti-marca E. Nível mais baixo de detecção da marca E foi observadoem Iactobacilos que produzem os fragmentos ancorados a 2A10 emcomparação com os fragmentos de controle scFv e VHH irrelevantes eancorados a VHH1 que expressam bactérias (dados não exibidos).

A atividade de união dos fragmentos de anticorpos foi analisadapor meio de ELISA e microscopia eletrônica. Para ELISA, homogeneizados deIactobacilos transformados com 2A10-âncora e VHH1-âncora e sobrenadantedos Iactobacilos transformados secretados por VHH1 e secretados por 2A10foram testados utilizando a marca E para detecção. Fragmentos de anticorpos,ancorados a VHH1, secretados por VHH1 e ancorados a 2A10, expressos porlactobãcilos uniram-se a placas revestidas com rotavírus. Nível mais alto deunião foi observado para os fragmentos de VHH1 de lhama, tanto ancoradosquanto secretados (purificados e do sobrenadante). A quantidade de 2A10secretado foi baixa demais para detecção por meio de ELISA. Os fragmentosde anticorpos irrelevantes de L. paracasei não transformados de Iactobacilostransformados que expressam scFv secretado ou ancorado e VHH ancoradoou secretado não se uniram a rotavírus (dados não exibidos). Calculou-se quea quantidade de fragmentos de anticorpos produzidos pelos transformadoresde VHH1-âncora é de cerca de 104 fragmentos de VHH1/bactéria e 600fragmentos de 2A1 O/bactéria (intracelular e sobre a superfície). Ostransformadores secretados por VHH1 produziram cerca de 1 ng/ml defragmentos de VHH1 no sobrenadante.

As Figuras 4b e 11a exibem Iactobacilos que expressamfragmentos de anticorpos VHH1 sobre a sua superfície, que foram incubadoscom rotavírus e analisados em seguida por meio de SEM. Os resultadosexibiram a união do vírus sobre a superfície bacteriana (Fig. 4ba e 11b), masnão a linhagem de L. paracasei não transformada (Fig. 11b). Utilizando TEM(manchas negativas), a união ao vírus por fragmentos de anticorpos de lhamado sobrenadante de Iactobacilos transformados com o vetor secretado porVHH1 poderá ser demonstrada, enquanto o sobrenadante controle de linhagemde L. paracasei não transformado não uniu rotavírus (dados não exibidos).

O efeito de fragmentos de anticorpos produzidos por Lactobacillusem teste de neutralização de rotavírus foi analisado na Figura 5. A linha sólida5 desta figura representa o nível de neutralização atingido por anticorpo VHH1purificado por marca E produzido por Iactobacilos (20 ng/ml). Linha pontilhadaindica o nível de neutralização de sobrenadante de hibridoma monoclonal 2A10(147 ng/ml). Neutralização atingida por diferentes concentrações delactobacilos ancorados a VHH1 (■), Iactobacilos ancorados a 2A10 (■) elactobacilos não transformados (□).

A Figura 5 exibe redução dependente de dosagem significativa dainfecção na presença de Iactobacilos que expressam VHH1 unido na superfícieou na presença do sobrenadante que contém VHH1 secretado. Levecapacidade de neutralização do sobrenadante de Iactobacilos nãotransformados também foi observada. Os Iactobacilos transformados por 2A10(secretados e ancorados) não foram protetores, muito embora o sobrenadantedas células de hibridoma monoclonal 2A10, que contém 150 ng/ml doanticorpo, tenha apresentado proteção de 95%.

A Figura 6 exibe a incidência de diarréia em camundongos tratadoscom Iactobacilos que expressam fragmentos ancorados a VHH1. Lactobacilos queexpressam VHH1 na superfície reduziram significativamente a incidência dediarréia no dia 2 sobre Iactobacilos não transformados (P = 0,0172).

A Figura 7 demonstra que, no grupo não tratado, a histologia dasseções de duodeno e jejuno revela sinais típicos de infecção por rotavírus;inchaço de extremidades vilosas, vacuolização, restrição de bases vilosas enúcleos não polarizados nas células (a). Os grupos que recebem L paracasei(b) ou Iactobacilos que expressam (c) ancorado em VHH1 e (d) não infectadoexibem histologia razoavelmente normalizada.A Figura 8 demonstra que a carga viral média em grupo detratamento ancorado em VHH1 é pelo menos duzentas vezes mais baixa que ogrupo não tratado. Efeito probiótico de lactobacilos controle irrelevantestambém foi observado (redução de dez vezes da carga viral). A liberação dovírus foi definida como ausência de detecção de vp7 ou detecção de menos dedez moléculas de RNA vp7. 27% dos animais foram liberados de rotavírus emgrupo de tratamento ancorado em VHH1 em comparação com 9% no gruponão tratado.

A Figura 9 demonstra que, no dia 2, doses de 108 CFU e 109 CFUde lactobacilos que expressam fragmentos ancorados a VHH1 causam reduçãosignificativa da incidência de diarréia em comparação com o grupo não tratado,P < 0,0001 e P = 0,0024. Número de filhotes em cada grupo: sete cada em 107CFU/dose e 108 CFU/dose e 8 em 109 CFU/dose e não tratados.

A Figura 10 demonstra que grupo em que infecções foramrealizadas com RRV incubados com lactobaeilos que expressam fragmentosancorados a VHH1 foi incluído. O tratamento neste grupo prosseguiuconforme habitual. Lactobaeilos que expressam VHH1 na superfíciefornecidos em forma seca por congelamento reduziram significativamente aincidência de diarréia no dia 2 em comparação com o grupo não tratado (P =0,031 7). No dia 3, houve redução significativa da incidência de diarréia emgrupos que recebem lactobaeilos de expressão ancorados a VHH1previamente incubados (n = 7; P = 0,0004), lactobaeilos de expressãoancorados a VHH1 Iiofilizados (n = 7; P = 0,0072), lactobaeilos de expressãoancorados a VHH1 (n = 10; P = 0,0022) em comparação com o grupo nãotratado (n = 10). A severidade da doença, em comparação com o grupo nãotratado, também foi reduzida quando Lactobacillus que expressa nasuperfície VHH1 foi administrado em forma seca por congelamento (n = 10;P < 0,01) ou quando infecções foram realizadas com RRV previamenteincubado com cultivo novo destas bactérias por duas horas (P < 0,05).

Expressão in situ de fragmentos de VHH1 sobre a superfície delactobacllos nas fezes (resultados do exemplo 4 (k)):

Amostras de fezes de três animais dos grupos que recebemlactobacilos que expressam os fragmentos ancorados a VHH1, camundongosdo grupo não tratado e controle negativo foram recolhidos no dia 4, o dia dotérmino, para determinação da expressão in situ dos fragmentos ancorados aVHH1. Lactobacilos que expressam VHH1 poderão ser detectados utilizandoanticorpo anti-marca E fluorescente nos camundongos tratados. Nenhumamancha pôde ser observada no grupo controle (dados não exibidos).

Sobrevivência de lactobacilos no intestino de camundongos:

Filhotes foram alimentados com lactobacilos que expressam oVHH1 ancorado contra rotavírus por uma vez (no dia 0) e a metade deles foiinfectada em seguida com RRV no dia 1. Dois filhotes em cada grupo foramsacrificados a cada segundo dia e verificados para determinar a presença detransformadores de Lactobacillus por meio de cultivo do teor intestinal. Asbactérias puderam ser detectadas no duodeno e no íleo 48 horas após otratamento sem diferença entre os grupos não infectados e infectados comrotavírus, enquanto em 96 horas após o tratamento, nenhum transformadorpôde ser detectado (dados não exibidos).

Eficácia de transformadores de Lactobacillus para reduzir diarréia emmodelo de infeccão por rotavírus:

O efeito terapêutico dos lactobacilos transformados foi testado emmodelo de filhotes de camundongos de diarréia induzida por rotavírus. Osfilhotes foram alimentados oralmente com lactobacilos que expressam 2A10-scFv ou VHH1 em formas secretadas ou ancoradas durante cinco dias (dia -1 a3) e infectados com RRV no dia 0. Grupos de controle incluíram L paracasei nãotransformado e bactérias que expressam fragmento de anticorpo VHH ancoradoirrelevante. 108 CFU como dose ideal para intervenção em diarréia (Fig. 9).VHH1 de superfície que expressa bactérias reduziu a duração da doença(duração normal de 1,2 dias) em cerca de 0,9 dias (P < 0,01) e em 0,7 dias emcomparação com camundongos tratados com L. paracasei não transformado (P< 0,05). A severidade da diarréia também foi reduzida de 3,7 para 1,7 emcamundongos tratados com Iactobacilos que expressam VHH1 na superfície emcomparação com a severidade da doença em filhotes não tratados (P < 0,001) epor fator de 1,2 em comparação com filhotes tratados com L paracasei nãotransformado (P < 0,01). Também foi observado efeito probiótico menor peloslactobacilos não transformados (Tabela 2). Além disso, a incidência de diarréiafoi significativamente reduzida nos dias 2 e 3 em camundongos tratados com oLactobacillus que expressa VHH1 na superfície em comparação comcamundongos não tratados (P < 0,0001 para os dois dias) ou camundongostratados com L. paracasei não transformado (P < 0,02, para o dia 2) (Fig. 6a). Asconstruções que expressam o 2A10 secretado ou ancorado, bem como VHH1secretado, não induziram proteção significativamente mais alta que Iactobacilosnão transformados (Fig. 6a, b). A severidade da doença, em comparação com ogrupo não tratado, também foi reduzida quando Lactobacillus que expressa nasuperfície VHH1 foi administrado em forma seca por congelamento (P < 0,01) ouquando foram realizadas infecções com RRV previamente incubado com cultivonovo destas bactérias por duas horas (P < 0,05) (Tabela 2 e Fig. 5).

Exame histológico de seções do intestino delgado próximas no dia 4revelaram notável redução de alterações patológicas em animais infectados comrotavírus tratados com Iactobacilos que expressam VHH1 na superfície e, em algunscamundongos, a histologia foi completamente normalizada. A histologia no grupo quenão recebe laetobacilos revelou sinais típicos de infecção com rotavírus com inchaçode extremidades vilosas, restrição de bases vilosas, vacuolização e núcleos celularesem locais irregulares (Fig. 7a, b, c, d). Para determinar se houve redução dareprodução viral nos enterócitos, foi desenvolvida PCR em tempo real para aexpressão do gene vp7 de rotavírus. A carga viral média em animais que recebemlactobacilos que expressam fragmentos de anticorpos VHH1 unidos na superfície foipelo menos 250 vezes mais baixa que em camundongos não tratados. Lactobacilosque expressam fragmento de VHH irrelevante também reduziram a carga de vp7 viral(até dez vezes). A taxa de liberação foi de 27% no grupo que recebeu Iactobacilosque expressam VHH1 ancorado na superfície em comparação com 9% no grupo nãotratado (Figura 8).

Estes experimentos demonstram a expressão bem sucedida defragmentos de anticorpos VHH derivados de Ilama (VHH1) e scFv (scFv-2A10)contra rotavírus tanto sobre a superfície de Lactobacillus casei 393 pLZ15 ecomo proteína secretada. Também foi demonstrada a eficácia destesIactobacilos recombinantes no tratamento de rotavírus por meio deneutralização in vitro e em modelo de infecção de filhotes de camundongos.

Exemplo 5

Encapsulacão de Alginato de Cálcio de VHH anti-Rotavírus

Solução de alginato de sódio a 2% foi adicionada em gotas asolução de 0,1 M de cloreto de cálcio, que contém 1% do VHH1 resultando naformação de esferas de alginato de cálcio (com tamanho de cerca de 2 mm). Adispersão foi mantida em repouso por trinta minutos para depósito das esferasde alginato de cálcio no fundo do beaker. As esferas foram recolhidas emseguida com peneira e lavadas uma vez com água.

Exemplo 6

Composições ε Preparações de Sorvetes que Contêm VHH anti-Rotavírus

Encapsulado ou Lactobacillus que Produz este VHH ε BactériasProbióticas

O exemplo a seguir de composição de sorvete é produtoalimentício de acordo com a presente invenção:<table>table see original document page 66</column></row><table>

Solução de VHH encapsulada em volume que resulta em 5 a5000 microgramas de VHH por porção.

Bactéria probiótica*1 em quantidade de 106 a 1011 por 100 g dacomposição de sorvete.

<table>table see original document page 66</column></row><table>

*1 A bactéria probiótica pode ser qualquer dos tipos mencionados nadescrição detalhada.

Total de sólidos solúveis: 35% em peso.

Teor de gelo a -18 0C: 54% em peso.

Todos os ingredientes do sorvete são misturados entre siutilizando misturador de alto corte por cerca de três minutos. A água éadicionada sob temperatura de 80 0C. A temperatura da mistura de água e geloé de cerca de 55 a 65 0C após mistura.

A mistura é homogeneizada em seguida (2000 psi) e passadapara trocador de calor de placas para pasteurização a 81 0C por 25 segundos.

A mistura é resfriada em seguida até cerca de 4 0C no trocador de calor deplacas antes da utilização.

Alternativamente, linhagem de Lactobacillus produtora de VHHanti-rotavírus pode ser adicionada no lugar da solução de VHH encapsulada,preferencialmente em concentração de 109 por porção ou mais.

A mistura prévia de sorvete é congelada em seguida utilizandotrocador de calor de superfície raspada Technohoy MF 75, tal como semsobrecondução introduzida no sorvete. O sorvete pode ser extrudado sobtemperatura de -4,4 °C a -5,4 °C. O produto pode ser endurecido em seguidaem congelador por impulso a -35 °C e armazenado em seguida a -25 °C.

Solução de água com gelo que possui a composição a seguir foipreparada conforme segue:

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Solução de VHH encapsulada em volume que resulta em 5 a5000 microgramas de VHH por porção.

Bactéria probiótica*1 em quantidade de 106 a 1011 por cem gramasda com

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Total de sólidos solúveis: 25,5% em peso.

Teor de gelo a -18 °C: 62% em peso.

Todos os ingredientes da água com gelo são misturados entre siutilizando misturador de alto corte por cerca de três minutos. Adiciona-se águasob temperatura de 80 °C. A temperatura da mistura de água com gelo é decerca de 55 a 65 °C após mistura.

A mistura é homogeneizada em seguida (2000 psi) e passadapara trocador de calor de placas para pasteurização a 81 °C por 25 segundos.A mistura é resfriada em seguida a cerca de 4 °C no trocador de calor deplacas antes da utilização.

Em vez da solução de VHH encapsulada neste momento,linhagem de Lactobacillus produtora de VHH anti-rotavírus pode também seradicionada, preferencialmente em concentração de 109 por porção ou superior.

A solução de água e gelo pode ser congelada em trocador decalor de superfície raspada Technohoy MF 75 com sobrecondução (fração devolume de ar) de 30%. A água com gelo pode ser extrudada sob temperaturade -3,8°C a -4,5 °C . O produto pode ser endurecido em seguida em congeladorpor impulso a -35°C e armazenado a -25°C .

Exemplo 7

Composições de Espalhantes que Contêm VHH anti-RotavírusEncapsulado ou Lactobacillus Produtor Deste VHH ε Bactérias

Probióticas

Foram elaborados espalhantes de acordo com procedimentopadrão conforme conhecido na técnica, utilizando as composições fornecidasna Tabela 3.

Tabela 3<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table>

No lugar da solução de VHH encapsulada após a última etapa deaquecimento, pode-se também adicionar assepticamente linhagem deLactobacillus produtora de VHH anti-rotavírus, preferencialmente emconcentração de 109 por porção ou superior.

Claims (44)

1. PRODUTO ALIMENTÍCIO, caracterizado pelo fato de quecompreende i) anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são ativos nointestino e ii) microorganismos probióticos independentes dos anticorpos oufragmentos de anticorpos.

2. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os anticorpos ou fragmentos de anticorposcompreendem parte do sistema de fornecimento para fornecer os anticorpos oufragmentos de anticorpos para o trato gastrointestinal.

3. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o sistema de fornecimento compreende anticorposencapsulados ou fragmentos de anticorpos que são liberados no intestino.

4. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o sistema de fornecimentocompreende um microorganismo transformado para ser capaz de produziranticorpos ou seus fragmentos.

5. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os anticorpos ou fragmentos de anticorpossão expressos e/ou secretados no intestino.

6. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma asreivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é ummicroorganismo probiótico, preferencialmente bactéria de ácido láctico, fungoou levedura.

7. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o microorganismo éLactobacillus ou Bifidobacterium.

8. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o Lactobacillus é Lactobacillus casei.

9. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os anticorpos sãoimunoglobulinas de cadeia pesada ou seus fragmentos do tipo VHH ou VNAR,preferencialmente derivados de Camelídeos, de maior preferência anticorposde cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos, ou anticorpos de domínio(dAbs) das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos.

10. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que os anticorpos oufragmentos de anticorpos estão presentes em quantidade eficaz para tratar,reduzir ou evitar diarréia em pacientes que consomem o produto alimentício.

11. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os microorganismosprobióticos (ii) são microorganismos viáveis.

12. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os microorganismosprobióticos (ii) são microorganismos inviáveis.

13. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os microorganismosprobióticos (ii) compreendem bactéria probiótica, leveduras probióticas e/oufungos probióticos.

14. PRODUTO ALIMENTÍCIO, de acordo com a reivindicação-13, caracterizado pelo fato de que a bactéria probiótica (ii) compreendeLactobacillus e/ou Bifido bacteríum.

15. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fatode que compreende i) anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são ativosno intestino e ii) microorganismos probióticos independentes dos anticorpos oufragmentos de anticorpos.

16. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 15, caracterizada pelo fato de que os anticorpos ou fragmentosde anticorpos compreendem parte do sistema de fornecimento para fornecer osanticorpos ou fragmentos de anticorpos para o trato gastrointestinal.

17. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sistema de fornecimentocompreende anticorpos encapsulados ou fragmentos de anticorpos que sãoliberados no intestino.

18. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que o sistema defornecimento compreende um microorganismo transformado para ser capaz deproduzir anticorpos ou seus fragmentos.

19. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 18, caracterizada pelo fato de que os anticorpos ou fragmentosde anticorpos são expressos e/ou secretados no intestino.

20. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com asreivindicações 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que o microorganismo é ummicroorganismo probiótico, preferencialmente bactéria de ácido láctico, fungoou levedura.

21. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que o microorganismo éLactobacillus ou Bifidobacterium.

22. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o Lactobacillus éLactobacillus casei.

23. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 15 a 22, caracterizada pelo fato de que os anticorpos sãoimunoglobulinas de cadeia pesada ou seus fragmentos do tipo VHH ou VNAR,preferencialmente derivados de Camelídeos, de maior preferência anticorposde cadeia pesada de Ihama ou seus fragmentos, ou anticorpos de domínio(dAbs) das cadeias leve ou pesada de imunoglobulinas ou seus fragmentos.

24. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 15 a 23, caracterizada pelo fato de que os anticorpos oufragmentos de anticorpos estão presentes em quantidade eficaz para tratar,reduzir ou evitar diarréia em pacientes que consomem a preparaçãofarmacêutica.

25. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 15 a 24, caracterizada pelo fato de que os microorganismosprobióticos (ii) são microorganismos viáveis.

26. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 15 a 24, caracterizada pelo fato de que os microorganismosprobióticos (ii) são microorganismos inviáveis.

27. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com uma dasreivindicações 15 a 26, caracterizada pelo fato de que os microorganismosprobióticos (ii) compreendem bactéria probiótica, leveduras probióticas e/oufungos probióticos.

28. PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com areivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a bactéria probiótica (ii)compreende Lactobacillus e/ou Bifido bacterium.

29. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PRODUTOALIMENTÍCIO, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 14,caracterizado pelo fato de que compreende a adição dos anticorpos oufragmentos de anticorpos e os microorganismos probióticos durante afabricação do produto alimentício ou um ingrediente deste.

30. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE PREPARAÇÃOFARMACÊUTICA, conforme definida em uma das reivindicações 15 a 28,caracterizado pelo fato de que compreende a adição dos anticorpos oufragmentos de anticorpos e os microorganismos probióticos durante afabricação da preparação farmacêutica ou um ingrediente desta.

31. USO DO PRODUTO ALIMENTÍCIO, conforme definido emuma das reivindicações 1 a 14, ou fabricado segundo o método tal comodefinido na reivindicação 29, caracterizado por fornecer benefícios à saúde dointestino de um paciente.

32. USO DA PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, conformedefinida em uma das reivindicações 15 a 28, ou fabricada segundo o métodotal como definido na reivindicação 30, caracterizado por fornecer benefícios àsaúde do intestino de paciente.

33. USO, de acordo com uma das reivindicações 31 ou 32,caracterizado pela administração de microorganismos enteropatogênicos.

34. USO, de acordo com uma das reivindicações 31 a 33,caracterizado pelo fato de que os anticorpos ou fragmentos de anticorpos sãoanticorpos de cadeia pesada de Ihama ou fragmentos de anticorpos e obenefício à saúde fornecido é efeito antidiarréico.

35. USO, de acordo com conforme uma das reivindicações 31a 34, caracterizado pela administração de infecções por rotavírus.

36. MÉTODO DE FORNECIMENTO DE BENEFÍCIOS ÀSAÚDE DO INTESTINO, de paciente, caracterizado pelo fato de quecompreende a administração do produto alimentício ou da preparaçãofarmacêutica conforme definidos em de acordo com uma das reivindicações 1 a-28, ou fabricados segundo o método das reivindicações 29 ou 30, à umpaciente dele necessitado.

37. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO PARA USO COMPRODUTO ALIMENTÍCIO, caracterizado pelo fato de que compreendemicroorganismos probióticos em que o implemento de liberação é revestidosobre pelo menos uma superfície com anticorpos ou fragmentos de anticorposque são ativos no intestino.

38. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO, de acordo com areivindicação 37, caracterizado pelo fato de que os anticorpos ou fragmentosde anticorpos compreendem sistema de fornecimento para fornecer osanticorpos ou fragmentos de anticorpos para o trato gastrointestinal.

39. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO PARA USO COM PRODUTOALIMENTÍCIO, caracterizado pelo fato de que o implemento de liberação érevestido sobre pelo menos uma superfície com anticorpos ou fragmentos deanticorpos que são ativos no intestino e microorganismos probióticos.

40. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO, de acordo com areivindicação 39, caracterizado pelo fato de que os anticorpos ou fragmentosde anticorpos compreendem sistema de fornecimento para fornecer osanticorpos ou fragmentos de anticorpos para o trato gastrointestinal.

41. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO, de acordo com uma dasreivindicações 37 a 40, caracterizado pelo fato de que o sistema de fornecimentocompreende anticorpos encapsulados ou fragmentos de anticorpos.

42. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO, de acordo com uma dasreivindicações 37 a 41, caracterizado pelo fato de que o sistema defornecimento compreende microorganismo transformado para que seja capazde produzir anticorpos ou seus fragmentos.

43. IMPLEMENTO DE LIBERAÇÃO, d e acordo com umadas reivindicações 37 a 42, caracterizado pelo fato de que o implementode liberação é uma faca, garfo, colher, tubo, canudo para bebidas oubastão.

44. USO DE UMA PREPARAÇÃO FARMACÊUTICA, conformedefinida em uma das reivindicações 15 a 28, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para fornecimento de benefícios à saúde dointestino.