BRPI0615593A2 - liberação bacteriana de polipeptìdeos biologicamente ativos - Google Patents

Abstract

LIBERAçãO BACTERIANA DE POLIPEPTIDEOS BIOLOGICAMENTE ATIVOS A presente invenção se refere aos métodos para liberação de polipeptídeos biologicamente ativos para um indivíduo por colonização de bactérias não patogênicas, Gram negativas. Também são providos por essa invenção os métodos para tratamento ou prevenção de doenças por administração das bactérias de colonização Gram negativas que expressam um ou mais polipeptídeos biologicamente ativos. As bactérias de colonização não patogênicas, Gram negativas podem ser administradas em formulações farmacêuticas.

Description

LIBERAÇÃO BACTERIANA DE POLIPEPTÍDEOS BIOLOGICAMENTE ATIVOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere à colonização das cepasbacterianas Gram negativas. A invenção se refereespecificamente ã colonização de bactérias Gram negativasvivas e seu emprego para liberação in vivo das proteínasbiologicamente ativas.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A liberação dos produtos gênicos, tais como proteínase RNA, aos animais ou células de animais é desejável paravárias aplicações. Tais aplicações incluem tratamento dedoenças infecciosas, terapia de doenças adquiridas ouhereditárias ou condições, indução de uma resposta imune aum antígeno de proteína para o estudo de várias funçõescelulares, etc. Uma faixa das bactérias portanto, foidesenvolvida e empregada para liberação das moléculasterapêuticas.

Por exemplo, bactérias patogênicas Gram negativas,vivas, atenuadas, foram desenvolvidas como vacinas (Garmorye outros, 2003). Adicionalmente, foram desenvolvidasestratégias para usar as cepas de vacina bacterianaspatogênicas Gram negativas vivas, atenuadas, como vetorespara liberar uma variedade de antígenos de vacinaprotetores através da via mucosal (Medina, 2001; Roland eoutros, 2005) . Tais cepas geralmente não são decolonização.

Bactérias de ácido láctico não patogênicas Grampositivas estão também sendo correntemente desenvolvidascomo vacinas vivas orais (Bermudeζ-Humaran e outros, 2003) .Em contraste com as cepas bacterianas patogênicas Gramnegativas, bactérias Gram positivas, tais como Lactococcuslactis, não são patogênicas. Adicionalmente, os vetoresbacterianos Gram positivos possuem uma capacidade limitadade colonização. Além disso, para liberar os antigenos davacina, L. lactis também está sendo desenvolvido para aliberação de várias citocinas, tais como, IL-IO (Steidler,2002; Steidler e outros, 2003; Huybhebaert e outros, 2005),IL-12 (Bermudeζ-Humaran e outros, 2003; Kimoto e outros,2004) e IL-2 (Steidler, 2002). Os métodos para a liberaçãodas proteínas ancoradas na superfície das bactérias Grampositivas são revelados no US 6.737.521, e os métodos paraliberação das citocinas em L.lactis são descritos no US6.605.286.

Vetores bacterianos vivos são também potencialmenteúteis no tratamento de doenças infecciosas. Por exemplo, osvetores bacterianos vivos são potencialmente úteis notratamento de doenças infecciosas, tais como, enteritenecrótica. A enterite necrótica é uma doençaenterotoxêmica, causada por Clostridium perfringens queleva ao desenvolvimento de lesões necróticas nas paredesdos intestinos resultando na morbidez e mortalidade de avesdomésticas. Ela é também uma doença multifatorial comepidemiologia e patogênese complexas e parcialmentedesconhecidas (Kaldhusdal, 1999). A bactéria, C.perfringens é geralmente encontrada no tratogastrointestinal das aves domésticas (Tschirdewahn e outros1991), a ocorrência de enterite necrótica, contudo, éesporádica (Cowen e outros, 1987). Não obstante, osalimentos contaminados com C. perfringens estão implicadosnos surtos de enterite necrótica em galinhas (Kaldhusdal,1999). Estudos também demonstraram que as galinhassaudáveis possuem um número relativamente baixo de C.perfringens em seus tratos intestinais, enquanto um aumentona concentração da bactéria pode resultar em condição deenterite necrótica (Craven e outros, 1999).

Bacitracina, linocomicina e outros antibióticos vêmsendo geralmente utilizados para tratar as aves domésticasque sofrem de enterite necrótica (Craven e outros, 1999).

Contudo, devido ao isolamento das cepas resistentes aosantibióticos de C. perfringens de galinhas e perus(Devriese e outros, 1993; Kondo, 1988; Watkins e outros,1997) e do desejo geral de reduzir o uso de antibióticos emrazão do elo em potencial para resistência aos antibióticosem agentes patogênicos humanos, as autoridades de saúde deaves domésticas e produtores estão crescentementeinteressados no desenvolvimento e aplicação de novosprodutos para substituir os antibióticos tradicionais.

Atualmente, contudo, não tem havido relato de tratamento daenterite necrótica usando produtos terapêuticos que liberamvetores bacterianos vivos, proporcionalmente projetados.

Contudo, têm havido relatórios de uso de cepas probióticasde bactérias e o uso de isolados simples amplamente nãocaracterizados e populações misturadas de bactérias paratratamentos de exclusão competitivos.

A despeito de possuírem grande potencial, os vetoresbacterianos vivos usados atualmente, em outros sistemas,possuem limitações substanciais. Por exemplo, quandofornecidas oralmente, as células bacterianas são expostas àcondições gastrointestinais severas, resultando em tempo desobrevivência curto e requerendo que uma dose grande sejafornecida (Prakash e Jones, 2005) . Uma conseqüência dodesaparecimento das bactérias de um indivíduo é que aliberação da proteína biologicamente ativa é de duraçãolimitada. Um problema adicional associado ao uso de vetoresbacterianos Gram negativos atenuados tem sido a dificuldadena obtenção de um equilíbrio entre a virulência residualdos vetores invasivos e/ou reatogênicos (Tacket e outros,1992) e a liberação eficaz do polipeptídeo bioativo, talcomo uma construção imunogênica (Zhu e outros, 2006).

Consequentemente, existe a necessidade de vetoresbacterianos aperfeiçoados que não sejam impedidos por essaslimitações.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores isolaram agora novas cepas decolonização bacterianas Gram negativas que são úteis para aliberação das proteínas biologicamente ativas para umindivíduo. Essas cepas de colonização bacterianas permitema liberação de proteínas biologicamente ativas aos locaisespecíficos no indivíduo, onde a proteína biologicamenteativa é necessária.

Consequentemente, a presente invenção provê um métodopara liberação de um ou mais polipeptídeos heterólogos,biologicamente ativos para um indivíduo, o métodocompreendendo administração a um indivíduo de uma bactériade colonização não patogênica Gram negativa que expressa umou mais polipeptídeos heterólogos, biologicamente ativos.

Em uma concretização, a bactéria é E. coli.Preferivelmente, o E. coli possui um antígeno de sorotipoΗ, o HlO. Em uma concretização preferida, o E. coli é umacepa selecionada de CCEC22 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45635, CCEC31 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45636 ou CCEC59 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45637 que foi modificado para expressar um oumais polipeptideos heterólogos biologicamente ativos.

Em outra concretização, a bactéria é uma cepa deSalmonella. Preferivelmente, a cepa ê S. enterica subsp.enterica serovar sofia.

Em outra concretização, a bactéria é marcada com ummarcador selecionável. Exemplos de marcadores apropriadosincluem proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidase,ou luciferase, ou resistência a um antibiótico, tal como,cloranfenicol, tetraciclina, canamicina, ampicilina,rifampicina ou ácido nalidíxico.

Em outra concretização da presente invenção, oindivíduo é uma ave. Preferivelmente, o indivíduo é umaave doméstica e mais preferivelmente o indivíduo é agalinha.

Em outra concretização da presente invenção a bactériacoloniza uma superfície de mucosa do indivíduo.

Preferivelmente, a bactéria coloniza os intestinos doindivíduo.

Em outra concretização, um ou mais polipeptideosbiologicamente ativos são uma citocina, quimiocina,hormônio, peptídeo antimicrobiano, agente antitumor,enzima, anticorpo ou antígeno.

Em uma concretização preferida, a citocina éselecionada dentre IL-1J3, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16,IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-32, cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, IFN-Α, ΕΡΟ,G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL ou IFNct/β. Preferivelraente,a citocina é IL-6.

Era outra concretização, o peptídeo antimicrobiano éuma colicina, microcina, cecropina, magainina, defensina oubacteriocina, tal como, Piscicolina 126, Divercina V41,Pediocina PA-1, Enterocina P ou Divergicina 750, ou umavariação sintética de qualquer um desses peptídeosantimicrobianos. Preferivelmente, a bacteriocina éPiscicolina 126 ou uma variante sintética do mesmo.

Em uma concretização preferida, a bactéria Gramnegativa é administrada oralmente ao indivíduo.

a presente invenção também provê um método paraidentificação de uma colonização da cepa bacteriana nãopatogênica Gram negativa, o método compreendendo:

i) isolamento de uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas de um indivíduo;

ii) marcação de uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativa;

iii) reintrodução de uma ou mais cepa bacteriana Gramnegativa marcada no indivíduo; e

iv) determinação se uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas colonizam o indivíduo.

Preferivelmente, a etapa (i) envolve isolamento de umaou mais cepas bacterianas Gram negativas de um local noindivíduo onde a liberação do polipeptídeo heterólogo éeventualmente necessária.

Em outra concretização, a etapa (i) desse métodoenvolve isolamento de várias cepas bacterianas.

Em outra concretização, a etapa (ii) desse métodoenvolve marcação de várias cepas bacterianas e a etapa(iii) envolve reintrodução de várias cepas bacterianas Gramnegativas marcadas no indivíduo.

Em outra concretização, uma ou mais cepas bacterianasGram negativas são marcadas por resistência a um ou maisantibióticos. Preferivelmente, um ou mais antibióticos sãorifampicina e/ou ácido nalidíxico.

Ainda em outra concretização desse método, a etapa(iv)envolve isolamento de uma amostra biológica do indivíduo edeterminação se a amostra compreende uma ou mais cepasbacterianas Gram negativas marcadas. A amostra pode ser,por exemplo, uma amostra de tecido ou fluido ou umesfragaço. Preferivelmente a amostra é isolada de um localno indivíduo onde a liberação do polipeptídeo heterólogo éeventualmente necessária.

A presente invenção também provê uma cepa decolonização bacteriana não patogênica Gram negativa isoladapor um método da presente invenção.

A presente invenção também provê um método paratratamento ou prevenção de uma doença em um indivíduo, ométodo compreendendo administração a um indivíduo de umaquantidade terapeuticamente eficaz uma bactéria decolonização, não patogênica, Gram negativa que expressa umou mais peptídeos heterólogos biologicamente ativos.

A presente invenção também provê uma bactéria decolonização, não patogênica, Gram negativa que expressa umou mais peptídeos heterólogos biologicamente ativos, quequando administrada a um indivíduo, coloniza o indivíduo.m outra concretização da presente invenção, oindivíduo é uma ave. Preferivelmente, o indivíduo é avedoméstica e mais preferivelmente o indivíduo é a galinha.

Em uma concretização, a bactéria é E. coli.

Preferivelmente a bactéria E. coli possui um antígeno desorotipo Η, o HlO.

Em uma concretização preferida a cepa E. coli éselecionada de CCEC22, conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/4 563 5, CCEC31 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45636 ou CCEC59 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45637 que foi modificado para expressar um oumais polipeptídeos heterólogos biologicamente ativos.

Em outra concretização, a bactéria é uma cepa deSalmonella. Preferivelmente, a cepa é S. enterica subsp.enterica serovar sofia.

Em outra concretização, a bactéria é marcada com ummarcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveisapropriados incluem proteína verde fluorescente (GFP), β-galactosidase, ou luciferase, ou resistência a umantibiótico tal como, cloranfenicol, tetraciclina,canamicina, ampicilina, rifampicina ou ácido nalidíxico.

Em outra concretização a bactéria coloniza umasuperfície de mucosa do indivíduo. Preferivelmente abactéria coloniza os intestinos do indivíduo.

Em outra concretização um ou mais dos polipeptídeosbiologicamente ativos são uma citocina, hormônio, enzima,peptídeo antimicrobiano, agente antitumor, enzima,anticorpo ou antígeno.

Preferivelmente a citocina é selecionada dentre IL-ip,IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20,IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-32, cMGF, LT, GM-CSF,M-CSF, SCF, IFN-Y, IFN-λ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH,PRL ou IFNa/β. Em uma concretização preferida a citocina éIL-6 .

Em outra concretização um ou mais dos polipeptídeosbiologicamente ativos são um peptídeo antimicrobiano.Preferivelmente o peptídeo antimicrobiano é uma colicina,microcina, cecropina, magainina, defensina ou bacteriocina,tal como, Piscicolina 126, Divercina V41, Pediocina PA-1,Enterocina P ou Divergicina 750, ou uma variante sintéticade qualquer um desses peptídeos antimicrobianos. Em umaconcretização preferida a bacteriocina é Piscicolina 126 ouuma variante sintética da mesma.

A presente invenção também provê uma bactéria decolonização, não patogênica, Gram negativa selecionada deCCEC22 conforme depositada no National MeasurementInstitute (anteriormente AGAL) sob número de acessoNM05/45635, CCEC31 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45636 ou CCEC59 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45637.

Preferivelmente, a bactéria Gram negativa é modificadapara expressar um ou mais peptídeos heterólogosbiologicamente ativos.

A presente invenção também provê uma formulaçãofarmacêutica que é administrada a um indivíduo,compreendendo uma bactéria de colonização, não patogênica,Gram negativa de acordo com a invenção e um veículofarmaceuticamente aceitável.

Conforme ficará claro, aspectos e característicasdesejados de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitosoutros aspectos da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENOS ANEXOS

Figura 1. Persistência de cepas de E.coli marcadas emgalinhas SPF (Experiência 1).

Figura 2. Porcentagem de cada perfil de digestão dePFGE Xba I marcado, presente nas galinhas 4 2 dias apósdosagem (Experiência 1).

Figura 3. Persistência das cepas de E.coli marcadasnas galinhas de comercialização. O número de colôniasRif/Nal resistentes recuperadas do conteúdocecal(Experiência 2).

Figura 4. Persistência de cepas de E.coli marcadas nasgalinhas de comercialização. Porcentagem de galinhas comcepas de Rif/Nal detectadas (Experiência 2).

Figura 5. Estabilidade de plasmídeo in vivo doplasmídeo pQE3O(Cat) no dia 28, transportado nas cepasmarcadas usadas para dosar galinhas de comercialização.

Figura 6. Atividade biológica in vitro de IL-6 madurade galinhas a partir de cepa de E.coli derivada da galinhaCCEC31rn (indução +/- 1 mM IPTG).

Figura 7. Ensaio de inibição de placa mostrando aatividade de bacteriocina secretada (P126) contraClostridium perfringens NE15 (Painel A) e NE18 (Painel B).Vetores de E.coli derivados de galinhas transportando oplasmídeo pRM1503 codificando expressão constitutiva dogene P126 foram desenvolvidos durante a noite, rotacionadose 30 μL, do sobrenadante filtrado foram carregados nos poçospunçados em uma placa de sangue de cavalo desfribrinado BHIa 5%, pré-inundada com as bactérias indicadoras. A placafoi incubada nas condições anaeróbias a 370C por toda anoite. O lado esquerdo de cada placa é carregado comsobrenadante das cepas CCEC transportando o plasmídeo devetor pQE3 0 (nenhuma bacteriocina). O lado direito de cadaplaca é isolado com sobrenadante das cepas CCECtransportando o plasmídeo de expressão pRM1503, P126. Partesuperior: CCEC31rn, meio: CCEC59rn, parte inferior:CCEClOlrn.

Figura 8. Número de C. perfringens no conteúdo cecaldas galinhas.

Figura 9. Atividade da bacteriocina detectada nãoconteúdo cecal filtrado. O conteúdo cecal filtrado foiconfigurado e sobrenadante puro colocado em placa sobre L.innocua:

A- Controles: CCEC31rn(pQE30), aves 1-5 sobrenadantespuros individuais carregados.

B - CCEC31rn(P126), aves 1-5 sobrenadantes purosindividuais carregados.

C - CCEC31rn(P126), aves 6-10 sobrenadantes purosindividuais carregados.

Figura 10. Proliferação de linfócitos isolados detonsilas cecais de galinhas. A diferença entre o grupo decontrole (CCEC31rn(pQE30)) e o grupo de teste (CCEC31rn(IL-6)) foi significativa para ambos os linfócitos nãoestimulados e estimulados (Mann-Whitney teste U, P<0,0001).Figura 11. Número de células plasmáticas segregandoIgA nos tecidos dos intestinos das galinhas.

Figura 12. Populações de Salmonella enterica subsp.enterica serovar sofia dentro do ceco das galinhasinfectadas.

Figura 13. Proliferação de L. monocytogenes no ceco.São mostradas médias de grupo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Detalhas de Depósito de Microorganismo

A cepa de colonização de Escherichia coli designadaCCEC2 2 foi depositada em 12 de agosto 2005 no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45635.

A cepa de colonização de Escherichia coli designadaCCEC31 foi depositada em 12 de agosto de 2005 no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45636.

A cepa de colonização de Eseheriehia coli designadaCCEC59 foi depositada em 12 de agosto de 2005 no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45637.

Esses depósitos foram feitos de acordo com asdisposições Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms para afinalidade do Procedimento de Patente e Normalizações deacordo com o mesmo. Isso garante a manutenção de culturasviáveis por 30 anos a partir da data de depósito. Osorganismos estarão disponíveis no National MeasurementInstitute de acordo com os termos do Tratado de Budapestequê assegura disponibilidade permanente e irrestrita daprogênie da cultura ao público quando da emissão da patentepertinente.

O cessionário do presente pedido concordou que, se odepósito da cultura morresse ou fosse perdido ou destruídoquando cultivado sob condições apropriadas, o mesmo seriaprontamente substituído mediante notificação por umespécime viável da mesma cultura. A disponibilidade de umacepa depositada não deve ser tida como uma licença parapraticar a invenção na contravenção dos direitos concedidosde acordo com a autoridade de qualquer governo de acordocom suas leis de patente.

Técnicas e Definições Gerais

A menos que especificamente definido de outra forma,todos os termos técnicos e científicos usados aqui devemser tidos como possuindo os mesmos significados conformegeralmente entendido por um versado na técnica comum (porexemplo, na cultura celular, genética molecular,imunologia, imuno-histoquímica, química da proteína ebioquímica).

A menos que de outra forma indicado, a proteínarecombinante, cultura celular e técnicas imunológicasutilizadas na presente invenção sã procedimentos padrão,bem conhecidos dos versados na técnica. Tais técnicas sãodescritas e explicadas através de toda a literatura emfontes, tais como, J. Perbal, A Practical Guide toMolecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrooke outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown(editor), Essential Molecular Biology: A PracticalApproach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover andΒ.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach,Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), and F.M. Ausubel eoutros (editores), Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlowe David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan eoutros (editores) Current Protocols in Immunology, JohnWiley & Sons (incluindo todas as atualizações até opresente) e são incorporados aqui como referência.

Por conveniência, o termo "polipeptídeo" será usadodoravante para se referir às moléculas que são de pesomolecular suficientemente alto para serem chamadas deproteínas, aos produtos de peso molecular menor, geralmentedenominados polipeptídeos, e aos produtos de pesosmoleculares mesmo menores, normalmente referidos comopeptídeos.

O termo "polipeptídeo ativo" é usado aqui no sentidomais amplo possível. Ele se refere a qualquer peptídeo,polipeptídeo ou proteína que pode ser liberada para umhospedeiro animal para qualquer fim útil. Ele incluipolipeptídeos e peptídeos terapêuticos e profiláticos. Elepoderia ser um antígeno, de qualquer vírus patogênico ou deuma bactéria, parasita ou fungo. Em tais exemplos, opolipeptídeo ativo pode ser o antígeno completo, odeterminante antigênico do antígeno ou o segmento doantígeno que inclui o determinante antigênico. Opolipeptídeo ativo também seria, por meio de exemplos nãolimitantes, um anticorpo, uma citocina, hormônio, enzima,um peptídeo antimicrobiano ou uma bacteriocina."Atividade biológica" se refere à capacidade derealizar uma função biológica e, com referência a umpolipeptídeo, sugere que o polipeptideo adote umaconformação estável ("forma dobrada") que é a mesma oumuito análoga à sua configuração nativa. Quando dobradocorreta ou substancial e corretamente, por exemplo, comformação de unidades dobradas apropriadas, α-hélices, β-folhas, domínios, pontes de dissulfeto, etc. umpolipeptídeo teria a capacidade de realizar sua funçãonatural. De modo geral, a unidade de função em umpolipeptídeo é um domínio. Quando usada com referência a umpolipeptídeo, a "atividade biológica" sugere que o antígenoinduz uma resposta imune em um hospedeiro.

0 termo "polipeptídeo heterólogo" é bem entendido naarte e se refere a um polipeptídeo que não é endógeno emrelação a uma célula ou é um polipeptídeo nativo onde aseqüência nativa foi alterada, ou um polipeptídeo nativocuja expressão é quantitativamente alterada como resultadoda manipulação da célula por técnicas de DNA recombinante.A molécula de ácido nucléico codificando o polipeptídeo deinteresse pode ser originária de qualquer organismo capazde produzir o polipeptídeo de interesse ou pode ser um genecompletamente sintético. A molécula de ácido nucléicocodificando o polipeptídeo pode ser adicionada à célula,por exemplo, por infecção, transfecção, microinjeção,eletroporação, microprojeção ou semelhantes.

0 termo "aves" conforme usado aqui, se refere aquaisquer espécies, subespécies ou raças de organismos dasaves da classe taxonômica, tais como, porém não limitadoaos organismos, tais como, galinhas, perus, patos, gansos,codorna, faisão, pombos, tentilhões, falcões, corvos eratitas incluindo avestruz, ema e cassuar. O termo incluias várias cepas conhecidas de Gallus gallus, ou galinhas,(por exemplo, Leghorn Branca, Leghorn Marrom, Barred-Rock,Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Ausstralorp, Minorca,Amrox, Califórnia Gray, Italian Partidge-colored), bem comocepas de perus, faisão, codornas, pato, avestruz e outrasaves domésticas geralmente grelhadas em quantidadescomerciais.

O termo "composição imunogênica" cobre qualquercomposição que promova uma resposta imune contra o agentepatogênico alvo; por exemplo, após administração ou injeçãono animal (tal como uma ave, por exemplo galinha), promoveuma resposta imune contra o agente patogênico alvo (porexemplo, Clostridium perfringens).

O termo "vacina" cobre qualquer composição que induzauma resposta imune protetora contra o agente patogênicoalvo ou que proteja eficazmente contra o agente patogênico;por exemplo, após administração ou injeção ao animal (porexemplo, ave, tal como galinha ou porcino, tal como porco),promove uma resposta imune contra o agente patogênico alvoou promove proteção eficaz contra o agente patogênico (porexemplo, C. perfringens) . A subunidade de um agentepatogênico, por exemplo, um antígeno ou um imunógeno ouepítopo isolado do agente patogênico, e uma composição desubunidade compreende ou consiste essencialmente em um oumais antígenos, imunógenos ou epítopos isolados do agentepatogênico.

O termo "antígeno" é bem entendido na técnica e serefere à porção de uma macromolécula que é especificamentereconhecida por um componente do sistema imune, porexemplo, um anticorpo ou um receptor de antígeno de célulaΤ. O termo "antígeno" se refere a um peptídeo, umpolipeptídeo ou outra macromolécula a qual uma respostaimune pode ser induzida em um hospedeiro. Conforme usadoaqui, o termo "antígeno" engloba epítopos antigênicos, porexemplo, fragmentos de um antígeno que são epítoposantigênicos. Os epítopos são reconhecidos por anticorpos nasolução, por exemplo, livres de outras moléculas. Osepítopos são reconhecidos pelo receptor de antígeno decélula T quando o epítopo está associado a uma moléculacomplexa de histocompatibilidade maior da classe I ouclasse II.

Através desse relatório descritivo, a palavra"compreende" ou variações, tais como "compreendendo" serãoentendidas como implicando a inclusão de um elementodeclarado, inteiro ou etapa ou grupos de elementos,inteiros ou etapas, porém não a exclusão de qualquer outroelemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteirosou etapas.

Colonização por Bactérias Gram Negativas

A bactéria de acordo com a presente invenção será umabactéria de colonização, não patogênica, Gram negativa. Osversados na técnica entenderão que as bactérias Gramnegativas incluem Salmonellal E. coli, Shigella,Campylobacter, Fusobacterium, Bordetella, PasteurellalActinobacillus, Haemophilus e Histophilus. É previsto quequalquer cepa de uma bactéria de colonização, nãopatogênica, Gram negativa possa ser usada nos métodos dapresente invenção.Exemplos preferidos de bactéria de colonização, nãopatogênica Gram negativa para uso os métodos da presenteinvenção são as espécies Escherichia coli ou Salmonella,tais como, S. enterica subsp. enterica serovar sofia.

Em uma concretização especificamente preferida dapresente invenção, a bactéria é E.coli cepa CCEC22 conformedepositada no National Measurement Institute (anteriormenteAGAL) sob número de acesso NM05/45635, CCEC31 conformedepositada no National Measurement Institute (anteriormenteAGAL) sob número de acesso NM05/45636 ou CCEC59 conformedepositada no National Measurement Institute (anteriormenteAGAL) sob número de acesso NM05/45637.

Em uma concretização preferida da invenção, as cepasde E. coli CCEC22, CCEC31 e/ou CCEC59 são empregadas semmodificação adicional.

Será apreciado contudo, que modificações adicionaispossam ser feitas a essas cepas antes do uso. Como umexemplo, as cepas de E.coli CCEC22, CCEC31 ou CCEC59 podemser marcadas com um marcador selecionável antes do uso.Exemplos de marcadores selecionáveis apropriados incluemproteína verde fluorescente (GFP), β-galactosidase, ouluciferase, ou resistência a um antibiótico tal como,cloranfenicol, tetraciclina, canamicina, ampicilina,rifampicina ou ácido nalidíxico.

Em uma concretização, o marcador selecionável éresistente a um ou mais antibióticos. Em um exemploespecífico, a cepa de E. coli é marcada por resistência arifampicina (rif) e/ou ácido nalidíxico (nal). Essamarcação pode ser obtida, por exemplo, por ciclagem da cepaatravés do meio de crescimento contendo concentraçõesaumentadas de rif e/ou nal, conforme descrito no Exemplo 3.Marcadores de resistência antibiótica e outros marcadores,tais como, Proteína Fluorescente Verde pode também serintroduzidos às cepas usando plasmídeos apropriados.

Identificação das bactérias de colonização Gramnegativas

A presente invenção também provê um método paraidentificar uma cepa bacteriana de colonização nãopatogênica Gram negativa que é útil para a liberação depolipeptídeos heterólogos biologicamente ativos in vivo.

Esse método compreende:

i) isolamento de um ou mais cepas bacterianas Gramnegativas de um indivíduo;

ii) marcação de uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas;

iii) reintrodução de uma ou mais cepas bacterianasGram negativas marcadas no indivíduo; e

iv) determinação se uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas colonizam o indivíduo.

Preferivelmente, uma ou mais cepas bacterianas sãoisoladas de um local no indivíduo onde a liberação dopolipeptídeo heterólogo é eventualmente necessária.

Será apreciado que o método de isolamento podeenvolver números grandes de classificação de bactérias, afim de identificar as cepas de colonização Gram negativasque são úteis para liberar os polipeptídeos heterólogosbiologicamente ativos in vivo. Por exemplo, várias cepasbacterianas Gram negativas podem ser isoladas do indivíduo,de comercialização e então reintroduzidas no indivíduo.

Em um exemplo específico do método, a etapa(i) envolvecoleta de uma faixa de cepas bacterianas de um local noindivíduo, onde a liberação do polipeptídeo heterólogo énecessária. As bactérias coletadas podem então serenriquecidas por desenvolvimento em meios apropriados antesdo isolamento de cepas simples, por exemplo por raiação nosmeios sólidos. Colônias simples que lembram bactérias Gramnegativas, tais como aquelas possuindo morfologia decolônia de E. coli ou Salmonellal podem ser isoladas edesenvolvidas em meios seletivos adicionais paraconfirmação de identificação.

Embora não necessário, as cepas isoladas podem serentão caracterizadas adicionalmente por análise fenotípicaou por análise do material genético. Essa análise domaterial genético pode envolver, por exemplo, técnicaspadrão, tais como, eletroforese em gel de campo pulsado(PFGE) ou análise do gene de RNA ribossômico 16S.

Na etapa (ii) do método, as cepas isoladas são entãomarcadas com um marcador selecionável. Pode ser empregadoqualquer um de uma faixa de marcadores selecionáveis. Emuma concretização preferida, o marcador selecionável éresistente a um ou mais antibióticos, tal como, resistênciaà rifampicina (rif) e/ou ácido nalidíxico (nal). Essamarcação pode ser obtida, por exemplo, por ciclagem da cepanos meios de crescimento contendo concentrações aumentadasou rif e/ou nal, conforme descrito aqui em maiores detalhesno Exemplo 3.

A etapa (iii) do método envolve reintrodução das cepasisoladas e marcadas no indivíduo, preferivelmente poradministração oral.

A etapa (iv) do método envolve a determinação se ounão as cepas marcadas colonizam o indivíduo. Em umaconcretização preferida, a etapa (iv) envolve isolamento deuma amostra biológica (tal como por esfregaço) de um localno indivíduo onde a liberação de o polipeptídeo heterólogo,biologicamente ativo é desejada e determinação se a amostracompreende um ou mais das cepas marcadas. Preferivelmente,as amostras biológicas são isoladas do indivíduo e testadasquanto à presença de cepas marcadas em várias ocasiões emum período de tempo. Por exemplo, amostras biológicas podemser isoladas e testadas várias vezes (tal como, porexemplo, a cada dia, dois, três, quadro ou cinco dias) porum período de uma a sete semanas.

As cepas marcadas que persistem no indivíduo por umperíodo (especificamente por um período de duas semanas oumais) seguindo-se a reintrodução no indivíduo sãoconsideradas como colonizando o indivíduo.

Assim, uma vez que uma cepa de colonização marcadatenha sido identificada, é possível empregar a cepa marcadaou a cepa não marcada isolada correspondente, como um vetorpara liberação dos polipeptídeos biologicamente ativos paraum local desejado em um indivíduo.

Polipeptídeos biologicamente ativosUm versado na técnica apreciará que os métodos dapresente invenção poderiam ser usados para liberar umafaixa de polipeptídeos biologicamente ativos. Exemplos depolipeptídeos apropriados incluem os que são capazes defuncionar local ou sistemicamente, por exemplo, é umpolipeptídeo capaz de exercer atividades endócrinas queafetam o metabolismo local ou total do corpo.

Por exemplo, o polipeptídeo biologicamente ativo podeser um que seja capaz de regular o sistemaimunoemopoiético. Alternativamente, o polipeptídeobiologicamente ativo pode ser um que seja capaz de afetar aviabilidade, desenvolvimento e diferenciação de umavariedade de células normais ou neoplásticas no corpo.Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativo podeser um que seja capaz de afetar uma regulação imune ouindução de respostas inflamatórias de fase aguda para lesãoe infecção. Alternativamente, o polipeptídeo biologicamenteativo pode ser um que seja capaz de melhorar ou induzirresistência à infecção das células e tecidos mediada porquimiocinas atuando nos seus receptores de célula alvo ou aproliferação de células epiteliais ou a promoção da cura daferida.

Exemplos específicos de tais polipeptídeos inclueminsulina, hormônio do crescimento, prolactina, calcitonina,hormônio luteinizante, hormônio da paratireóide,somatostatina, hormônio estimulador da tireóide,polipeptídeo intestinal vasoativo, uma citocina do grupo 1estrutura, tal como, IL-1J3, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16,IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-32, cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, IFN-λ, EPO,G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL ou IFNa/β, uma citocina dogrupo 2 estrutural, tal como, a família TNF das citocinas,por exemplo, TNFa, TNFp, CD40, CD27 ou ligantes FAS, afamília IL-I das citocinas, a família do fator docrescimento do fibroblasto, os fatores do crescimentoderivados de plaquetas, o fator β de transformação docrescimento e fatores do crescimento dos nervos, umacitocina do grupo 3 estrutural, por exemplo, a família dofator de crescimento epidérmico das citocinas, asquimiocinas, as citocinas relacionadas à insulina, umacitocina do grupo 4 estrutural, tal como, heregulinas ouneuregulinas, por exemplo, EGF.

Alternativamente, o polipeptídeo biologicamenteativo pode ser um receptor ou antagonista parapolipeptídeos biologicamente ativos, conforme definidoacima.

Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativopode ser um antígeno. Se o antígeno for, por exemplo, deuma bactéria, fungo, ou agente de doença parasitária ouvirótica, a colonização da cepa bacteriana Gram negativapode ser usada para vacinar um indivíduo contra doençascausadas por tais agentes. Por exemplo, a colonização dacepa bacteriana Gram negativa seria usada para liberar umantígeno de um microorganismo patogênico aviário. Taismicroorganismos incluem, porém não estão limitados àsespécies de Corynebacterial Mycoplasma, histeria, Borrelia,Chlamydia, Clostridia, Coxiella, Eysipelothrix,Flavobacteria, Staphylococcus, e Streptococcus. Exemplosde agentes patogênicos de fungos e parasíticos de avesconhecidos por infectar aves domésticas são as espécies deAmoebotaenia, Aproetella, Asearidia, Aspergillus, Candida,Capillaria, Cryptosporidium, Cyathostroma, DispharynxlEimeria, Fimbriaria, Gongylonemia, Heterakis, Histomonas,Oxyspirura, Plasmodium, Raillietina, Strongyloides,Subulura, Syngamus, Tetrameres e Trichostrongylus. Os vírusconhecidos por infectar aves domésticas incluem adenovírus(por exemplo, vírus da enterite hemorrágica), astrovírus,coronavírus (por exemplo, vírus da bronquite infecciosa),paramixovirus (por exemplo, vírus da doença de Newcastle),picornavírus (por exemplo, vírus da encefalomieliteaviária), vírus da varíola, retrovírus (por exemplo, vírusda leucose/sarcoma aviário), reovírus e rotavírus. Exemplosespecíficos incluem vírus da gripe aviária, vírus da doençade Marek e vírus da anemia de galinhas. Os produtos gênicospreferidos para uso como antígenos são polipeptídeos epeptídeos, incluindo glicoproteínas e lipoproteínas. Osgenes que codificam antígeno desses organismosprocarióticos e eucarióticos podem ser clonados e expressosna colonização da cepa Gram negativa usando técnicas padrão.

Em outra concretização da invenção, o polipeptídeobiologicamente ativo é um anticorpo, preferivelmente umanticorpo recombinante. 0 termo "anticorpo" conformeempregado nessa invenção inclui moléculas intactas, bemcomo fragmentos das mesmas, tais como, Fab, F(ab')2, e Fvque são capazes de ligação ao determinante epitópico. Essesfragmentos de anticorpo mantêm alguma capacidade de seligarem seletivamente ao seu antígeno ou receptor eincluem:

(1) Fab, o fragmento que consiste em uma cadeia levecompleta (VL e CL) associada a um fragmento de Vh-Cy1 dacadeia pesada e pode ser produzido por digestão de todo oanticorpo com a enzima papaína, para render uma cadeia leveintacta e uma porção de uma cadeia leve ou por introduçãode DNA codificando o fragmento de Fab em uma bactéria nãopatogênica Gram negativa;

(2) Fab1, o fragmento de uma molécula de anticorpoobtido por tratamento do anticorpo integral com pepsina,seguido por redução, para render uma cadeia leve intacta euma porção de uma cadeia pesada (dois fragmentos Fab' sãoobtidos por molécula de anticorpo) ou por introdução de DNAcodificando o fragmento Fab' em uma bactéria não patogênica

Gram negativa;

(3) (Fab1)2, é um dimero de dois fragmentos Fab'mantido em conjunto por duas ligações de dissulfeto;

(4) Fv, definido como um fragmento construídogeneticamente contendo uma região variável de cadeia leve ea região variável de cadeia pesada expressas como duascadeias;

(5) Anticorpo de cadeia simples ("SCA"), definido comouma molécula construída geneticamente contendo a regiãovariável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesadaligadas por um ligante de polipeptídeo apropriado como umamolécula de cadeia simples fundida geneticamente; e

(6) Anticorpo de domínio simples, tipicamente umdomínio pesado variável isento de cadeia leve.

Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativopode ser um peptídeo antimicrobiano ou uma variantesintética do mesmo. Peptídeos antimicrobianos incluemcecropinas, magaininas e defensinas. As cecropinas foram aprimeira família bem caracterizada de peptídeosantimicrobianos estruturalmente correlatos e sãoencontradas em uma ampla distribuição de insetos (Boman,2003). Nos vertebrados, a família da magainina dospeptídeos antimicrobianos foi isolada das glândulas da pelee trato gastrointestina de Xenopus laevis, e acredita-seque formem a base para o sistema de defesa das superfíciesda mucosa anfibiana contra infecção (Soravia e outros,1988).

As defensinas são peptídeos antimicrobianosencontrados nas células fagocíticas isoladas de váriasespécies de mamíferos incluindo o ser humano e podem sercaracterizadas por oito resíduos invariáveis dentro daseqüência (Gabay e outros, 1989). 0 mecanismo da atividadeantimicrobiana dos peptídeos, tais como as defensinas éatravés de uma interrupção seletiva da membrana conduzindoa um amplo espectro característico da atividade antibiótica(Bowman, 1995). 0 espectro antimicrobial das defensinasinclui bactérias gram positivas e gram negativas,micobactérias, muitos fungos e alguns vírus encapsulados.

Os peptídeos antimicrobianos de origem bacteriana sãoconhecidos como microcinas, colicinas e bacteriocinas (Jacke outros, 1995; Ingham e outros, 2003). Sabe-se que aseqüência, estrutura e mecanismos de atividade dasbacteriocinas são diversos. As bacteriocinas maisabundantes e completamente estudadas incluem asbacteriocinas da classe I (lantibióticos) e classe II(peptídeos não contendo lantionina pequena estável emaquecimento) (Ennahar e outros, 2000). As bacteriocinas daclasse II formam um subgrupo importante em razão de suasatividades e aplicações em potencial. As bacteriocinas daclasse IIa incluem Piscicolina 126, leucocina A eenterocina P entre outras. As bacteriocinas da classe IIapossuem o motivo de término N:YGNGVXaaCXaa(K/N)XaaXaaCXaaV(N/D)(W/K/R)Xaa-(G/A/S)(A/N),onde os resíduos com capacidade de variação maior sãorepresentados por Xaa (Bhugaloo-Vial, e outros 1996). Em umexemplo demonstrando as propriedades antimicrobianas dasbacteriocinas, Piscicolina 126, que quando injetada noscamundongos, mostrou revelar atividade antimicrobiana invivo e reduziu significativamente a carga listérica nofígado e baço (Ingham e outros, 2003).

Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativopode ser uma enzima. A enzima pode ser qualquer enzima quepossua uma atividade desejada. Por exemplo, ela pode serdesejável para emprego no método da invenção, para liberaruma enzima que desempenha um papel no aperfeiçoamento dacapacidade de digestão do alimento ou a remoção doscompostos anti-nutritivos. Por exemplo, as enzimas dedegradação de polissacarídeo e as fibrolíticas, tais como,xilanases (Liu e outros 2005), glucanases (Cho e outros2000), celulases (Liu . e outros 2005), amilases,levansucrases e inulosucrases podem ser liberadas paraaumentar a capacidade de digestão dos alimentos. Asproteinases, peptidases e lipases também podem serliberadas a fim de aumentar o valor nutritivo dos alimentosingeridos. As fitases (Vohra e Satyanarayana, 2003;Nahashon e outros 1994) e as fosfatases ácidas (Palacios eoutros 2005) podem ser liberadas para reduzir os efeitosantinutritivos do ftato que é encontrado nas sementes dasplantas.

Expressão dos polipeptídeos biologicamente ativos

A bactéria da presente invenção expressa opolipeptídeo biologicamente ativo a partir do ácidonucléico contido no mesmo. O ácido nucléico podecompreender uma ou mais construções de ácido nucléico ondeo ácido nucléico codificando o polipeptídeo biologicamenteativo está sob controle das seqüências reguladorasapropriadas para expressão na bactéria.

Vetores apropriados, tais como aqueles por Ingham eoutros (Ingham e outros, 2005), compreendendo ácidonucléico para introdução na bactéria podem ser escolhidosou construídos contendo seqüências reguladoras apropriadas,incluindo seqüências promotoras, fragmentos terminadores,seqüências melhoradoras, genes marcadores e outrasseqüências conforme apropriado. Os vetores podem serplasmídeos, vírus, por exemplo, fago e fagemido, conformeapropriado. Para detalhes adicionais vide, por exemplo,Molecular Cloning a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrooke outros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.Muitas técnicas conhecidas e protocolos para manipulação deácido nucléico, por exemplo, na preparação das construçõesde ácido nucléico, mutagênese, sequenciamento, introduçãode DNA nas células e expressão gênica além de análise deproteínas, são descritos em detalhes em Short Protocols inMolecular Biology, segunda edição, Ausubel e outros eds.,John Wiley & Sons, 1992. As revelações de Sambrook e outrose de Ausubel e outros são incorporadas aqui comoreferência.

As seqüências de codificação para o polipeptídeobiologicamente ativo podem estar contidas em um Opéron,isto é, uma construção de ácido nucléico para expressãomulticistrônica. Em um Opéron, a transcrição do promotorresulta em um RNAm que compreende mais de uma seqüência decodificação, cada uma com seu próprio local de ligação deribossoma posicionado apropriadamente a montante. Assim,mais polipeptídeos podem ser traduzidos de um RNAm simples.O emprego de um Opéron, portanto, permite a expressão demais de um polipeptídeo biologicamente ativo pela bactériada presente invenção.

Alternativamente, as seqüências de codificação paradois polipeptídeos biologicamente ativos podem fazer partedo mesmo vetor de ácido nucléico, ou vetores separados,quando eles estiverem individualmente sob o controleregulador dos promotores separados. Os promotores podem seros mesmos ou diferentes.

Um promotor empregado de acordo com a presenteinvenção é preferivelmente expresso constitutivamente nabactéria. O uso de um promotor constitutivo evita anecessidade de se fornecer um indutor ou outro sinalregulador para que a expressão se realize. Preferivelmente,o promotor direciona a expressão em um nível onde a célulahospedeira bacteriana permanece viável, isto é, mantémalguma atividade metabólica, mesmo se o desenvolvimento nãofor mantido. Vantajosamente, tal expressão pode estar em umnível baixo. Por exemplo, quando o produto de expressão seacumula intracelularmente, o nível de expressão podeconduzir ao acúmulo do produto de expressão a menos decerca de 10% da proteína celular, preferivelmente cerca oumenos de cerca de 5%, por exemplo, cerca de 1-3%. 0promotor pode ser homólogo à bactéria empregada, isto é, uminato àquela bactéria. 0 promotor seria, como um exemplonão limitante, o promotor de fago T5 que é funcional emE.coli.

Conforme será apreciado pelos versados na técnica, opolipeptídeo biologicamente ativo pode incluir umaseqüência de sinal que provê a secreção da proteínaexpressa nas bactérias Gram negativas. A seqüência de sinalcodifica, preferivelmente, um peptídeo de sinal quedireciona a secreção da proteína da célula através de ummecanismo de secreção bacteriano. A proteína pode sersecretada para o interior dos meios de crescimento, noespaço periplásmico localizado entre a membrana interna eexterna da célula ou para a superfície da célula. Aproteína expressa pode também estar localizada dentro doscorpos de inclusão no interior da parede da célula bacteriana.

Um exemplo de um mecanismo de secreção bacteriano quepode ser usado na presente invenção é o tipo de mecanismode secreção do tipo I de E.coli que utiliza umtransportador de α-hemolisina (HlyA) (Mergulhao, 2005). Ospolipeptídeos recombinantes alvejados para secreção contêmuma seqüência de sinal compreendendo a região de término Cde HlyA. Mecanismos de secreção alternativos incluem a viadependente de SecB, a via de reconhecimento de sinal (SRP)e uma via de translocamento de arginina dupla (Mergulhao,2005). Outros exemplos não limitantes de sinais de secreçãobacteriana apropriados incluem PelB, OmpA, PhoA e MalE(Choi 2004).

Os métodos para expressão de proteínas recombinantesna superfície da célula são bem conhecidos na arte. Pormeio de exemplo, um vetor para expressar lipoproteínasrecombinantes na superfície da célula bacteriana é descritoem Cullen e outros (2003), e o sistema Audodisplay queexplora o mecanismo de secreção natural da proteínatransportadora AINDA-I é descrito por Jose (2006).

Composições imunogênicas ou vacinasAs composições imunogênicas (ou vacinas) da invençãocompreendem uma bactéria de colonização, não patogênica,Gram negativa de acordo com a invenção, que expressa um oumais antígenos heterólogos e/ou proteínas imunoreguladoras.

Por exemplo, um ou mais antígenos podem ser um polipeptídeoantigênico de um agente patogênico bacteriano, tal como,Clostridium perfringens. Uma ou mais proteínasimunoreguladoras da composição imunogênica podem funcionarcomo um adjuvante. Exemplos de polipeptídeos que podemfuncionar como adjuvantes incluem citocinas, tais como, IL-6 e IL-2. A composição imunogênica pode compreender,adicionalmente, um veículo farmacêutica ou veterinariamenteaceitável. Em outra concretização, a proteínaimunoreguladora é liberada sozinha.

Como é conhecido de um versado na técnica, acomposição imunogênica ou vacina pode ser combinada com umou mais imunógenos, antígenos ou epítopos selecionados deoutros microorganismos ou vírus em uma forma viva ouinativada.

Formulações farmacêuticas

As formulações da invenção incluem formulações devolume de medicamento, úteis na fabricação de formulaçõesfarmacêuticas. Tais formulações compreendem uma quantidadeprofilática ou terapeuticamente eficaz de uma bactéria decolonização Gram negativa e um veículo farmaceuticamenteaceitável. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui umveículo veterinariamente aceitável. Preferivelmente, asformulações da invenção compreendem uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma ou mais bactérias decolonização Gram negativas da invenção e um veículofarmaceuticamente aceitável.

Em uma concretização específica, o termo"farmaceuticamente aceitável" significa aprovado pelaagência reguladora Federal ou governo estadual ou listadana Farmacopéia dos Estados Unidos ou outra farmacopéia demodo geral reconhecida para uso em animais e maisespecificamente nos seres humanos. O termo "veiculo" serefere a um diluente, excipiente, ou veículo com o qual asubstância terapêutica é administrada. Tais veículosfarmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como, águae óleos incluindo aqueles de origem de petróleo, animal,vegetal ou sintética, tais como, óleo de amendoim, óleo desoja, óleo mineral, óleo de mamona e semelhantes.

Geralmente, os ingredientes das formulações dainvenção são fornecidos tanto separadamente quantomisturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, comoum pó seco liofilizado ou concentrado isento de água em umrecipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ousache indicando a quantidade do agente ativo.

Para liberar as bactérias para o tratogastrointestinal ou para as vias aéreas, o modo preferidode administração é por ingestão oral ou aerossol nasal oupor alimentação (sozinho ou incorporado ao alimento doindivíduo ou suprimento de água). Com relação a isso, deveser observado que as bactérias probióticas, tais como,Lactobacillus acidophilus, são vendidas como cápsulas degel contendo uma mistura liofilizada de células bacterianase um suporte sólido, tal como, manitol. Quando a cápsula degel é ingerida com líquido, as células liofilizadas sãoreidratadas e se tornam bactérias viáveis. Assim, em ummodo semelhante, as células bacterianas Gram negativas dapresente invenção podem ser fornecidas coo uma preparaçãoem pó, liofilizada, em uma cápsula de gel, ou em volumepara aspersão sobre alimentos ou bebidas. As célulasbacterianas viáveis, reidratadas, então popularão e/oucolonizarão os locais através de todo o sistemagastrointestinal superior e inferior.

Para aplicações tópicas, a bactéria pode ser formuladacomo um ungüento ou creme a ser aspergindo sobre asuperfície da pele infectada. As formulações de ungüento oucreme são também apropriadas para liberação retal ouvaginal, juntamente com outras formulações padrão, taiscomo, supositórios. As formulações apropriadas paraadministração tópica, vaginal ou retal são bem conhecidasdos químicos medicinais.

A presente invenção será de utilidade específica paraadministração à mucosa, de modo a tratar várias infecçõesbacterianas ou condições indesejáveis bacterialmentecorrelatas.

A invenção será descrita, doravante, por meio deExemplos não limitantes que se seguem e com referência àsfiguras anexas.

EXEMPLOS

Exemplo 1; Isolamento de cepas de E. coli de galinhas

Uma faixa de espécies bacterianas foi coletada degalinhas de comercialização em esfregaços da cloaca e porcoleta do conteúdo cecal das aves. As bactérias coletadasforam enriquecidas por crescimento por toda a noite de cadaesfregaço em 2 mL de caldo MacConkey (MacConkey, 1905) a37°C, antes do raiar uma alça de cultura enriquecida nasplacas de ágar MacConkey que foram incubadas a 370C portoda a noite. Colônias simples que lembraram a morfologiade colônia típica de E.coli foram raiadas em placas de ágarEosina Metileno-Blue Lactose Sacarose (EMB) (Holt-Harris eTeague7 1916) , desenvolvidas a 37 0C por toda a noite eentão os estoques congelados foram preparados em glicerol a80%. As cepas presumíveis de E.coli foram designadas CCEC1a 101, e denominadas cepas de E.coli (CCEC) de galinhaCSIRO. As cepas de CCEC coletadas foram desenvolvidas emmeios ágar seletivos adicionais (Desoxicolato de xiloselisina (XLD) ágar (Taylor, 1965) e ágar para aidentificação de Salmonella de acordo com Onoz (Onoz eHoffman, 1978) para identificação confirmatória de E. colide acordo com a morfologia característica da colônia,observada nas placas. Qualquer um dos isolados de CCEC quenão fosse identificado como E.coli nas placas de ágarseletivas não foram usados para análise adicional.

De modo a confirmar a identificação inicial, umaporção do gene de RNA de ribossoma 16S (RNAr) dos isoladosde CCEC foi ampliada por PCR. Os iniciadores de PCRampliaram uma região variável do gene de 16S RNAr o quepermitiu a discriminação contra uma ampla variedade deespécies bacterianas. Quando o produto PCR foi purificado,sequenciado e alinhado em um busca blastn, o produto de 630bp (pares de base) dos isolados CCEC selecionados tinha aidentidade de seqüência mais próxima à da seqüência de RNAr16S de E.coli. Consequentemente, os isolados de CCECcoletados do conteúdo cecal da galinha e esfregaços dacloaca foram identificados como E.coli por seqüência gênicae desenvolvimento e morfologia da colônia nos meiosindicadores.

Exemplo 2: Subtipagem dos isolados de E.coli poreletroforese de campo de pulso

As cepas de E. coli (isolados de CCEC) foramadicionalmente analisadas usando uma técnica de tipagem deeletroforese de gel de campo pulsado (PFGE). Após análisede todos os isolados, 25 perfis de DNA digeridos com XbaIforam encontrados dentro da coleção.

Exemplo 3: Geração de cepas de E.coli resistentes aosantibióticos

Cepas representativas de diferentes subtipos de PFGEforam repetidamente cicladas através do caldo contendoconcentrações aumentadas dos antibióticos rifampicina ouácido nalidíxico, a fim de isolar variantes de cepa comníveis selecionáveis de resistência em relação aosantibióticos citados. Os mutantes resistentes à rifampicinaforam subseqüentemente subcultivados através de níveiscrescentes de ácido nalidíxico para selecionar cepasresistentes a ambos os antibióticos. A partir dos isoladosrepresentativos dos diferentes subtipos de PFGE, nósisolamos derivados que eram resistentes à rifampicina(rif), outro conjunto de derivados resistentes ao ácidonalidíxico (nal) e um terceiro conjunto resistente a ambosantibióticos (rif/nal).

Exemplo 4: Identificação de cepas de E. coli quepersistem no trato gastrointestinal de galinhas isentas deagente patogênico específico (SPF) (Experiência 1)

Quatorze galinhas SPF foram dosadas oralmente com 1 mLde uma cultura de E.coli mista contendo isolados de cadasubtipo de PFGE marcado duplamente. Cinco aves em contatonão foram dosadas diretamente com a cultura de E.coli.Esfregaços da cloaca foram retirados das aves a cadasegundo dia para verificar a presença das cepas marcadas.Os esfregados foram retirados até o 42° dia para estudarquanto tempo as cepas marcadas persistiriam nas galinhas(figura 1). Antes da dosagem com a cultura de E.coli mista,nenhum isolado bacteriano duplamente resistente (rif/nal)foi detectado. Após a dosagem, as cepas marcadas seriamprontamente isoladas de todas as aves em cada ponto deamostragem pelos 42 dias de duração da experiência. E.coliduplamente resistente seria isolado de todas as aves emcontato um dia após a dosagem de outras aves, indicando arápida dispersão para aves co-alojadas. Quando cepasduplamente marcadas foram isoladas do conteúdo cecal dasgalinhas dosadas, apenas perfis de 4 subtipos de PFGE foramrecuperados (figura 2), indicando que essas cepaspersistiram, considerando-se que todas as outras cepas eramindetectáveis no nível de análise em que foram realizadas.

Exemplo 5:_Serotipagem de cepas de E.colipersistentes

Embora as cepas de E. coli fossem originalmenteisoladas de galinhas saudáveis e a dosagem subsequente degalinhas não tivesse indicado quaisquer implicaçõesadversas de saúde, nós em seguida confirmamos que as cepassão elementos não prejudiciais, não patogênicos da floracomensal por determinação de seus sorotipos e procura dapresença de fatores de virulência conhecidos. As cepasCCEC31rn, CCEC5 9rn e CCEClOlrn foram analisadas peloNational E. coli Laboratory (Microbiological DiagnosticUnit, Department of Microbiology, University of Melbourne,Austrália) para confirmação da identificação demicroorganismos, a sorotipagem de antígenos OeHeaprodução de quaisquer fatores de virulência comuns dessascepas. Todas as três amostras foram identificadas comoE.coli, e todas tinham o antígeno H de sorotipo, HlO. Acepa CCEC31rn mostrou expressar uma α-hemolisina, etransportada o antígeno 0 (Ont). As cepas CCEC59rn eCCEClOlrn foram ambas tipadas como E.coli ORzHlO e não eramhemolíticas. Tanto E.coli Ont:HlO quanto OR:HlO foramregistrados na literatura como sendo responsáveis porquaisquer surtos de doença maiores ou enfermidade em sereshumanos ou animais. Todas as 3 cepas não eramverocitotóxicas, não produziram as toxinas Shiga ouproduziram quaisquer Fatores Necrozantes Citotóxicos.

Exemplo 6: Persistência dos subtipos de E. coli emgalinhas de comercialização (Experiência 2)

Essa experiência foi essencialmente a mesma daquelaressaltada no Exemplo 5, exceto que as galinhas para seremgrelhadas de comercialização foram empregadas. Um resumodos resultados da experiência é apresentado nas figuras 3 e4. Nessa experiência, as cepas CCEC31rn, 59rn, e IOlrnforam recuperadas como na primeira experiência, porémCCEC35rn, que constituiu uma porcentagem menor da populaçãorecuperada na experiência 1, não foi recuperada naexperiência 2. Contudo, CCEC22rn foi recuperada com bonsnúmeros nas aves de comercialização, porém não foi vista naexperiência 1. Uma cepa laboratorial de E.coli, a JM109,se perdeu rapidamente nas galinhas e não pode serrecuperada após o quinto dia.

Exemplo 7: Capacidade de transformação, estabilidadedo plasmídeo e expressão de proteína recombinante das cepasE.coli persistentes

Vários isolados de E. coli mostraram persistir nointestino de ambas as galinhas SPF e de comercialização econsequentemente foram bons candidatos para uso comovetores vivos. Um segundo requisito para uso como vetores éque deva ser possível a manipulação genética das cepas demodo a expressar as proteínas recombinantes que devem serliberadas. Nós, portanto, testamos a capacidade das cepaspersistentes de serem transformadas com um plamídeo devetor de clonagem e expressarem uma proteína modelo,manipular geneticamente Proteína Verde Fluorescente (GFP).As cepas de E. coli, CCEC22rn, 31rn, 59rn, e IOlrn foramtodas prontamente transformáveis com o vetor de clonagem deexpressão pQE30 empregando técnicas de eletro-transformaçãode E.coli padrão. Quando o plasmídeo pTracer-CMV2transportando Proteína Verde Fluorescente (GFP) foiintroduzido nas cepas, CCEC31rn, 59rn, e IOlrn, todas 3cepas demonstraram um fenótipo fluorescente verde brilhantesob luz UV. De modo semelhante, quando as célulastransformadas cresceram em uma cultura de líquido e foramobservadas usando um microscópio de fluorescência, todas ascélulas expressaram o gene GFP. Portanto, as cepas deE.coli persistentes podem expressar eficazmente a proteínarecombinante.

A estabilidade in vivo dos plasmídeos dentro das cepaspersistentes também foi medida. A estabilidade de plasmídeode um plasmídeo de clonagem de expressão padrão, pQE30(Cat)transportado nas cepas marcadas inoculadas nas galinhas decomercialização foi avaliada 28 dias após a dosagem.Colônias isoladas das aves dosadas com cepas CCEC31rn eCCEC59rn tinham uma estabilidade de plasmídeo alta com73+6% e 7i±i6% das colônias mantendo a expressão daresistência antibiótica codificada pelo plasmídeo. Ascolônias isoladas das aves dosadas com cepas CCEC22rn eCCEClOlrn tiveram estabilidade de plasmídeo menor, em3 8+13 % e 25+17% respectivamente, conforme mostrado nafigura 5.

Exemplo 8: Detecção da proteína de IL-6 expressa emgalinhas e derivada dos vetores E.coli

O plasmídeo pQE9-IL-6 contém o gene da Interleucina-6(IL-6) madura de galinha e foi introduzido nos vetores deE.coli derivados de galinha. A IL-6 de galinha recombinantefoi expressa dos vetores de E.coli derivados de galinhaconforme evidenciado por uma faixa de proteína induzida comum peso molecular de aproximadamente 2 7 KDa. A atividade invitro biológica dos sobrenadantes de célula foi medida emum bioensaio de proliferação celular induzido por IL-6(figura 6) . Os sobrenadantes de CCEC31rn(pQE9-IL-6)induzidos com IPTG mostraram atividade biológicasignificativa, enquanto a mesma cepa não induzida ou sem oplasmídeo de expressão não mostrou atividade biológica nobioensaio de IL-6. CCEC31rn(pQE9-IL-6) produziu um nívelmais alto de atividade de IL-6 em relação à cepalaboratorial usada de modo geral, JMlO9, transportando oplasmídeo de expressão. A cepa de E.coli persistente,CCEC31rn é claramente capaz de produzir IL-6 recombinante,uma citocina com empregos terapêuticos em potencial.

Exemplo 9: Atividade anti-bacteriana de Piscicolina126 (P126) secretada pelos vetores E. coliOs plasmídeos expressando constitutivamente abacteriocina P126 nas cepas de vetor E. coli, CCEC31rn,CCEC5 9rn e CCEClOlrn foram testados quanto a secreção daatividade da bacteriocina in vitro por ensaio de inibiçãoem placa. Listeria innocua e Clostridium perfringens(Coleção de cepas NE15 e NE18, CSIRO) foram desenvolvidasem laboratório e colocadas em placas como organismos deteste nos ensaios de inibição da bacteriocina em placa. Asecreção de P126 nos sobrenadantes das cepas de E.coliderivadas de galinha inibiu o crescimento de ambas L.innocua, e as cepas C. perfringens NE que foram testadas noensaio (figura 7).

Exemplo 10: Liberação das proteínas terapêuticas paraos intestinos das galinhas

Uma das cepas E.coli persistentes, (CCEC31rn) foiempregada para demonstrar a eficácia da abordagem devetoração viva na liberação das proteínas recombinantesterapêuticas para os intestinos das galinhas. Plasmídeostransportando os genes codificando as proteínas a seremliberadas foram introduzidos nessa cepa, conforme definidoa seguir:

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Cepas de E.coli transportando plasmídeos conformedescrito acima cresceram até a fase Iog média e então cadagalinha recebeu uma dose oral de 1 mL da cultura pura. Trêstempos diferentes para dosagem de E.coli foram testados,dia 1, dia 18 e dia 20 após eclosão. Nos dias 21 e 22 apóseclosão, as aves foram desafiadas experimentalmente com C.perfringens por inoculação oral de uma cultura de 1 mL deisolado NE15 de galinha C. perfringens (capaz de produzirum alto nível de doença). A alimentação foi suspensa por 24horas no galinheiro entre as duas doses de desafio e quandoretornou foi inoculada com 2 0 mL de cultura de C.perfringens por galinheiro. As aves sofreram autópsia trêsdias após o segundo desafio; os intestinos de cada aveforam examinados quanto a lesões focais de necrose ouulceração para avaliar o nível de enterite necrótica.

Exemplo 11: Liberação de P126

As galinhas inoculadas com CCEC31rn(P126) no dia 18estavam completamente protegidas do desafio do C.perfringens (isto é, nenhuma lesão foi observada emqualquer galinha nesse grupo) em comparação ao grupo decontrole relevante e ao grupo de controle de desafio. Asgalinhas dosadas com essa cepa e plasmídeo nos outros dias(dia 1 ou dia 20) não mostraram qualquer proteção (reduçãoda classificação da lesão) a partir do desafio com C.perfringens, em comparação com seu grupo de controle dedose relevante ou o grupo de controle de desafio.

Seguindo-se a autópsia, os números de C. perfringensno conteúdo cecal das galinhas dosadas foram determinadospor colocação em placa das diluições sobre ágar de sanguede cavalo BHI (incubado anaerobialmente a 37°C). Osresultados mostrados na figura 8 demonstram que os númerosde C. perfringens coletados de galinhas que foram dosadascom CCEC31rn(P126), no dia 18, reduziram significativamenteem comparação aos outros grupos, incluindo o grupo decontrole de vetor relevante (E. coli (vetor), dia 18). Essegrupo era o mesmo grupo de galinhas que mostrouanteriormente proteção (número reduzido de lesões) apósdesafio com C. perfringens. Portanto, uma liberaçãoapropriadamente cronometrada de P126 nesse vetor de E.coliteve uma ação profilática; parando o desenvolvimento daenterite necrótica nas galinhas.

Exemplo 12: Detecção da atividade antimicrobiana noconteúdo cecal de galinhas

Em uma experiência separada, galinhas a seremgrelhadas e comercializadas foram dosadas com CCEC31rn(P126) e os controles de vetor relevante e foramautopsiadas 3 dias após o desafio. A presença da proteínaP12 6 ativa no intestino das galinhas foi investigada poramostragem do conteúdo cecal, ressuspensão em PBS,centrifugação e então filtragem do sobrenadante através deum filtro de 0,22 μιη. 30 μΐ; do sobrenadante foramcarregados nos poços de uma placa de inibição semeada comL. innocua ou C. perfringens. A placa foi incubada por todanoite a 37°C, e zonas de inibição foram avaliadas (figura9) .

A atividade da bacteriocina, conforme demonstradapelas zonas de extermínio bacteriano, foi claramenterecuperada do ceco de todas as aves dosadas comCCEC31rn(P126). Nenhuma atividade antibacteriana foidetectada no ceco das aves de controle dosadas comCCEC3Irn(pQE3 0) . Fica claro que as cepas persistentes deE.coli isoladas das galinhas são capazes de liberar umaproteína potencialmente terapêutica, a Piscicolina 126 parao intestino das galinhas. Quando liberada em um tempoapropriado, ela pode parar completamente o desenvolvimentode uma doença séria que acomete as galinhas, a enteritenecrótica.

Exemplo 13: Liberação de IL-6 para as galinhas

IL-6 madura de galinha foi liberada para galinhausando o vetor de E.coli, CCEC31rn. As galinhas foramdosadas com 1 mL de cultura induzida de CCEC31rn(IL-6) ouCCEC31rn(pQE3 0) nos dias 1 e 18 e amostras de tecido foramcoletadas dos intestinos para avaliar os efeitos biológicosda liberação de vetores vivos de IL-6.

Foi reportado que a IL-6 estimula a diferenciação eproliferação da célula B in vitro e in vivo. Na presençade IL-6, as células B são capazes de se diferenciar em IgAproduzindo células plasmáticas e IgA é secretada nassuperfícies da mucosa para prover proteção para as galinhascontra agentes patogênicos que entram no corpo das mesmaspelas bodas das membranas da mucosa. Consequentemente, IL-6tem um papel importante na imunidade da mucosa e aliberação correta de IL-6 para o trato gastrointestinal dasgalinhas pode ser avaliada pela observação de umaproliferação aumentada de células B (linfócitos) norevestimento intestinal; um número aumentado de célulasplasmáticas e uma produção aumentada de IgA e secreção nasuperfície da mucosa.

Exemplo 14: Proliferação de linfócitos nas galinhasdosadas com CCEC31rn(IL-6)

Na autópsia, os linfócitos foram extraídos dostonsilas cecais e do revestimento intestinal das galinhas.Após a contagem, números iguais de linfócitos de ambas asamostras foram usados em um ensaio de proliferação paraavaliar a capacidade desses linfócitos de proliferar,medida usando um marcador radioativo incorporado às célulasde multiplicação.

Os linfócitos isolados de tonsilas cecais das galinhasdosadas com IL-6 tinham um potencial de proliferação maisalto em relação aos linfócitos das galinhas de controleinoculadas com CCEC31rn(pQE30), ambas com e sem estimulaçãocom um mitogênio, ConA (figura 10) . Presume-se que ascélulas que podem proliferar sem estimulação tenham sidoativadas anteriormente e sejam altamente ativadas paradefesa. Os resultados foram estatisticamente significativosem um teste U de Mann-Whitney. Fica claro que os linfócitosisolados das aves dosadas com CCEC31rn(IL-6) possuem umpotencial maior de proliferação em relação aos linfócitosisolados de aves que foram dosadas com vetor de E.coliportanto, apenas o plasmídeo de base. Isso demonstra que aIL-6 está sendo eficazmente liberada para o tratogastrointestinal das galinhas através do vetor do E.coli eo produto de IL-6 liberado está tendo um efeito sobre ascélulas de linfócito B das galinhas.

Exemplo 15: Número de células secretando IgA norevestimento intestinal e tonsilas cecais de galinhas dosadas

Seções de tonsilas cecais e revestimento intestinalforam marcados com IgA e o número de células plasmáticassecretando IgA por centímetro linear de tecido em cadaamostra foi contado. Nas amostras coletadas do revestimentointestinal (figura 11), as aves dosadas com cepa de vetorE.coli expressando IL-6 tinham números maiores de célulassecretando IgA por centímetro linear de tecido em relaçãoàs aves no grupo que foram dosadas com a cepa de vetorportando o plasmídeo de base. A diferença entre esses doisgrupos foi significativa (P=0,0286) quando testada no testeU de Mann-Whitney. Contagens médias entre os dois grupos degalinhas coletadas das tonsilas cecais dessas aves nãoforam estatisticamente diferentes, conforme esperado dascélulas isoladas de tecidos que não estavam diretamenteenvolvidas na imunidade da mucosa.

Exemplo 16: Liberação de Piscicolina 126 paragalinhas empregando S. sofia

A P12 6 expressando S. sofia foi testada no modelode listeriose de galinha. Quatro grupos, cada um de dezgalinhas SPF, foram alojados em dois isoladores em bolha(grupos 1 2 e em um isolador e 3 e 4 em outro) . Os gruposde tratamento eram como se segue:

1. Desafio com S. sofia Nalr e L. monocytogenes

2. Desafio com S. sofia Nalr (P126) e L. monocytogenes

3. Desafio penas com L. monocytogenes4. Não desafiado

Os grupos 1 e 2 receberam aproximadamente IO9 ufc dacepa s. sofia apropriada no primeiro dia de vida. No dia 2,os grupos 1, 2 e 3 receberam 2 χ IO8 ufc de L.monocytogenes. A saúde geral das aves foi observada atravésde toda a experiência e duas aves foram mortas e asbactérias enumeradas nos dias 1, 2, 5 e 7 após desafio.

Os resultados mostraram que as populações de S.sofiase mantiveram em um alto nível através de toda aexperiência (figura 12) e L. monocytogenes não puderam serrecuperados após o dia 2 do grupo pré-tratado com P126expressando S. sofia, porém foram encontrados em todos osoutros grupos, incluindo o das aves de controle em contato(figura 13).

Conclusão

Os resultados demonstram que uma pequena porcentagemde isolados de E.coli recuperados de galinhas saudáveistinham a capacidade de persistir. Os métodos ressaltadosdefinem como tais isolados podem ser identificados etestados. Várias cepas persistentes foram identificadas emostraram possuir, subseqüentemente, outras característicasnecessárias para tornar um vetor de liberação vivo útil,elas podem ser transformadas com DNA de plasmídeo, podemmanter os vetores de plasmídeo em condições in vivo e podemexpressar uma proteína recombinante modelo.

Fica claro que as cepas persistentes de E.coliisoladas das galinhas são capazes de liberar a proteínapotencialmente terapêutica Piscicolina 126 para osintestinos das galinhas. Quando liberada em um momentoapropriado, ela pode parar completamente o desenvolvimentoda doença séria das galinhas, a enterite necrótica.

A liberação de IL-6 através do vetor de E.coliCCEC31rn aumentou a diferenciação das células B norevestimento intestinal do trato gastrointestinal dasgalinhas em células plasmáticas, que são capazes desecretar IgA nas superfícies das mucosas para defesa damucosa. A liberação de IL-6 para o trato gastrointestinalde galinhas pelo vetor bacteriano selecionado teve sucesso,e estimulo as células B do sistema imune a proliferarem ese diferenciarem a fim de preparar o sistema imune degalinha para invasão de agentes patogênicos e contra-ataqueimune.

A piscicolina 126 também foi liberada para as galinhasusando S. sofia. Os resultados demonstram que S. sofia podeser mantida nas galinhas e que a Piscicolina 126 liberadabacterialmente foi ativa contra Listeria monocytogenes invivo.

Será apreciado pelos versados na arte que inúmerasvariações e/ou modificações podem ser feitas à invenção,conforme mostrado nas concretizações específicas, sem comisso fugir do espírito e escopo da invenção, conformedescrita amplamente. As presentes concretizações devem,portanto, ser consideradas como ilustrativas e nãorestritivas.

Todas publicações citadas acima são incorporadas aquiem sua totalidade.

Quaisquer citações de documentos, leis,materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes que foramincluídas no presente relatório descritivo se destinamunicamente aos fins de provisão de um contexto para apresente invenção. Não devem ser tidos como uma admissão deque quaisquer ou todas essas matérias fazem parte datécnica anterior ou eram de conhecimento geral no camporelevante da presente invenção, como se existissem antes dadata de prioridade de cada reivindicação desse pedido.Referências

Bermudez-Humaran, LG (2003) Infect Immun. 71: 1887-1896

Bhugaloo-Vial, P e outros, (1996) Appl EnvironMicrobiol. 62: 4410-4416

Boman, HG (1995) Annu Rev Immunol. 13: 61-92

Boman7 HG (2003) J Intern Med. 254: 197-215

Cho, JS e outros (2000) Curr Microbiol. 40: 257-263

Choi, JH and Lee, SY (2004) Appl Microbiol Biotechnol.64:625-635

Cowen, BS e outros (1987) Avian Dis. 31: 904-906

Craven, SE e outros (1999) Avian Dis. 43: 484-490

Cullen, PA e outros (2003) Plasmid. 49: 18-29

Devriese, LA e outros (1993) J Appl Bacteriol. 75: 55-57

Ennahar, S e outros (2000) FEMS Microbiol Rev. 24: 85-106

Gabay, JE et al (1989) Proc Natl Acad Sci USA. 86:10183

Garmory, HS e outros, (2003) J Drug Target. 11: 471-479

Holt-Harris, JE and Teague, OA (1916) J Infect Dis.18: 596-600

Huybhebaert, N e outros, (2005) Eur J Pharm Biopharm.60: 349-359Ingham e outros (2003) J Antimicrob Chemother. 51:1365-1371

Ingham, e outros (2005) J Appl Microbiol. 98: 676-683Jaek, RW e outros (1995) Mierobiol Rev. 59: 171-200

Kaldhusdal, M. (1999) FEMS Immunol Med Mierobiol. 24:337-343

Kimoto, H e outros, (2 004) Mierobiol Immunol. 48: 75-82

Kondo, F. (1988). Res Vet Sei. 45: 337-340

Liu JR e outros (2005) Appl Environ Mierobiol. 71:6769-6775

MacConkey, A (1905) J Hyg. 8: 333-379

Medina, E e outros, (2001) Vaeeine. 19: 1573-1580

Mergulhao FJM et al (2005) Bioteehnology Advances. 23:177-202

Nahashon, SN e outros (1994) Poult Sei. 73: 1552-1562

Onoz, E and Hoffman, K (1978) Zentralbl Bakteriol.240: 16-21

Palaeios MC e outros (2005) J Appl Mierobiol. 98: 229-237

Prakash, S and Jones, ML (2005). J Biomed Biotechnol.1: 44-56.

Roland, KL e outros (2005) Curr Opin Mol Ther. 7: 62-72

Soravia, E e outros, (1988) FEBS Lett. 228: 337-340

Steidler, L. (2002) Antonie Van Leeuwenhoek. 82: 323-331

Steidler, L e outros, (2003) Nat Bioteehnol. 21: 785-789

Taeket, CO e outros (1992) Vaeeine. 10: 443-6Tagg, JR e outros (1976) Bacteriol Rev. 40: 722-756Taylorj WJ (1965) Am J Clin Path. 44: 471-475Tschirdewahn, B e outros (1991) Int J Food Microbiol.14: 175-178

Vohra, A and Satyanarayana, T (2 003) Crit RevBiotechnol. 23: 29-60

Watkins, KL e outros (1997) Vet Mierobiol. 54: 195-200Zhu, C. e outros, (2006) Vaccine. 24: 3821-31

Claims (54)

1. Método de liberação de um ou mais polipeptideosheterólogos biologicamente ativos para um indivíduocaracterizado pelo fato de que compreende administração aum indivíduo de uma bactéria de colonização não patogênicaGram negativa que expressa um ou mais polipeptideosheterólogos biologicamente ativos.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a bactéria é E. coli.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que E. coli possui o antígeno desorotipo H, HlO.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que E. coli é uma cepaselecionada de CCEC22 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45635, CCEC31 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45636 ou CCEC59 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/4 563 7 que foi modificada para expressar um oumais polipeptideos heterólogos biologicamente ativos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma cepa deSalmonella.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a cepa é S. enterica subsp.Enterica serovar sofia.

7. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fatode que a bactéria é marcada com um marcador selecionável.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o marcador selecionável éselecionado dentre proteína verde fluorescente (GFP), β-galactosidase, luciferase, ou resistência antibiótica a umantibiótico selecionado de cloranfenicol, tretraciclina,canamicina, ampicilina, rifampicina ou ácido nalidíxico.

9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelofato de que o indivíduo é uma ave.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é uma avedoméstica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é uma galinha.

12. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que a bactéria coloniza asuperfície de mucosa do indivíduo.

13. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizado pelo fato de que a bactéria coloniza osintestinos do indivíduo.

14. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13,caracterizado pelo fato de que um ou mais dos polipeptídeosbiologicamente ativos é uma citocina, hormônio, peptídeoantimicrobiano, agente antitumor, enzima, anticorpo ouantígeno.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionadadentre IL-ΐβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-- 9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18,IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-32,cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-γ, IFN-λ, EPO, G-CSF,LIF, OSM, CNTF, GH, PRL ou IFNa/β.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-6.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano éselecionado dentre colicina, microcina, cecropina,magainina, defensina ou bacteriocina ou uma variantesintética das mesmas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a bacteriocina é selecionadade Piscicolina 126, Divercina V41, Pediocina PA-1,Enterocina P ou Divergicina 750 ou uma variante sintéticadas mesmas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a bacteriocina é Piscicolina- 126 ou uma variante sintética da mesma.

20. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,- 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que abactéria Gram negativa é administrada oralmente aoindivíduo.

21. Método para identificação de uma cepa bacterianade colonização não patogênica Gram negativa caracterizadopelo fato de que compreende:i) isolamento de uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas de um indivíduo;ii) marcação de uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas;iii) reintrodução de uma ou mais cepas bacterianasGram negativas marcada no indivíduo; eiv) determinação se uma ou mais cepas bacterianas Gramnegativas coloniza o indivíduo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que a etapa (i) envolveisolamento de uma ou mais cepas bacterianas Gram negativasde um local no indivíduo, onde a liberação de umpolipeptídeo heterólogo é eventualmente necessária.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que a etapa (i) envolveisolamento de uma pluralidade cepas bacterianas.

24. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21, 22 ou 23, caracterizado pelo fato de quea etapa (ii) envolve marcação de várias cepas bacterianas ea etapa (iii) envolve reintrodução de várias cepasbacterianas Gram negativas marcadas no indivíduo.

25. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21, 22, 23 ou 24, caracterizado pelo fato deque uma ou mais cepas bacterianas Gram negativas sãomarcadas por resistência a um ou mais antibióticos.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que um ou mais antibióticos sãorifampicina e/ou ácido nalidíxico.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a etapa (iv) envolveisolamento de uma amostra biológica do indivíduo edeterminação se a amostra compreende uma ou mais cepasbacterianas Gram negativas marcadas.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a amostra é um tecido ouamostra de fluido ou esfregaço.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28,caracterizado pelo fato de que a amostra é isolada de umlocal no indivíduo onde a liberação do polipeptídeoheterólogo é eventualmente necessária.

30. Cepa de colonização bacteriana Gram negativacaracterizada pelo fato de que é isolada pelo método dequalquer uma das reivindicações 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,-28 ou 2 9.

31. Método para tratamento ou prevenção de uma doençaem um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreendeadministração a um indivíduo de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma bactéria de colonização nãopatogênica Gram negativa que expressa um ou mais peptídeosheterólogos biologicamente ativos.

32. Bactéria de colonização não patogênica Gramnegativa caracterizada pelo fato de que expressa um ou maispeptídeos heterólogos biologicamente ativos e quandoadministrada a um indivíduo, coloniza o indivíduo.

33. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 32, caracterizada pelo fato de que oindivíduo é uma ave.

34. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 33, caracterizada pelo fato de que oindivíduo é uma ave doméstica.

35. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 34, caracterizada pelo fato de que oindivíduo é uma galinha.

36. Bactéria Gram negativa, de acordo com qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34 ou 35, caracterizada pelofato de que a bactéria é E. coli.

37. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a bactériaE. coli possui o antígeno H de sorotipo, HlO.

38. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a cepa deE. coli é selecionada de CCEC22 conforme depositada noNational Measurement Institute (anteriormente AGAL) sobnúmero de acesso NM05/45635, CCEC31 conforme depositada noNational Measurement Institute (anteriormente AGAL) sobnúmero de acesso NM05/45636 ou CCEC59 conforme depositadano National Measurement Institute (anteriormente AGAL) sobnúmero de acesso NM05/45637 que foi modificada paraexpressar um ou mais polipeptídeos heterólogosbiologicamente ativos.

39. Bactéria Gram negativa, de acordo com qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34 ou 35, caracterizada pelofato de que a bactéria é uma cepa de Salmonella.

40. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a cepa éS. enterica subsp. enterica serovar sofia.

41. Bactéria Gram negativa, de acordo com qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40,caracterizada pelo fato de que a bactéria é marcada com ummarcador selecionável.

42. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o marcadorselecionável é escolhido dentre proteína verde fluorescente(GFP), β-galactosidase, luciferase, ou resistência a umantibiótico selecionado de cloranfenicol, tetraciclina,canamicina, ampicilina, rifampicina ou ácido nalidíxico.

43. Bactéria Gram negativa, de acordo com qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41ou 42, caracterizada pelo fato de que a bactéria colonizauma superfície de mucosa do indivíduo.

44. Bactéria Gram negativa, de acordo com qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,-42 ou 43, caracterizada pelo fato de que a bactériacoloniza os intestinos do indivíduo.

45. Bactéria Gram negativa, de acordo com qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,-42, 43 ou 44, caracterizada pelo fato de que um ou mais dospolipeptídeos biologicamente ativos é uma citocina,hormônio, enzima, peptídeo antimicrobiano, agenteantitumor, enzima, anticorpo ou antígeno.

46. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 45, caracterizada pelo fato de que a citocinaé selecionada dentre IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16,IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-24, IL-25, IL--26, IL-32, cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-y, IFN-λ, EPO,G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL ou IFNd/β.

47. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a citocinaé IL-6.

48. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 45, caracterizada pelo fato de que um ou maisdos polipeptídeos biologicamente ativos é um peptídeoantimicrobiano.

49. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 48, caracterizada pelo fato de que o peptídeoantimicrobiano é uma colicina, microcina, cecropina,magainina, defensina ou bacteriocina ou uma variantesintética das mesmas.

50. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 49, caracterizada pelo fato de que abacteriocina é Piscicolina 126, Divercina V41, PediocinaPA-I, Enterocina P ou Divergicina 750 ou uma variantesintética das mesmas.

51. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 50, caracterizada pelo fato de que abacteriocina é Piscicolina 126 ou uma variante sintética damesma.

52. Bactéria de colonização não patogênica Gramnegativa caracterizada pelo fato de que é selecionada deCCEC22 conforme depositada no National MeasurementInstitute (anteriormente AGAL) sob número de acessoNM05/4 563 5, CCEC31 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45636 ou CCEC59 conforme depositada no NationalMeasurement Institute (anteriormente AGAL) sob número deacesso NM05/45637.

53. Bactéria Gram negativa, de acordo com areivindicação 52, caracterizada pelo fato de que émodificada para expressar um ou mais peptídeos heterólogosbiologicamente ativos.

54. Formulação farmacêutica que é administrada a umindivíduo caracterizada pelo fato de que compreende umabactéria Gram negativa, conforme definida em qualquer umadas reivindicações 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,- 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 49, 50, 51, 52 OU 53 e umveículo farmaceuticamente aceitável.