BRPI0615610A2

BRPI0615610A2 - processos e composições para vacinação de animais com antìgenos de prrsv com maior imunogenicidade

Info

Publication number: BRPI0615610A2
Application number: BRPI0615610-0A
Authority: BR
Inventors: Israrul H Ansari; Fernando A Osorio; Asit K Pattnaik
Original assignee: Univ Nebraska
Priority date: 2005-08-30
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2011-05-24
Also published as: WO2007040876A3; EP1929047A2; JP2009506129A; EP1929047A4; US20080233083A1; ES2343371T3; EP1929047B1; PL1929047T3; CA2620667A1; KR20080064813A; DE602006013003D1; DK1929047T3; CN101300363A; US7608272B2; ATE461295T1; WO2007040876A2

Abstract

PROCESSOS E COMPOSIçõES PARA VACINAçãODE ANIMAIS COM ANTIGENOS DE PRRSV COM MAIOR IMUNO- GENICIDADE. Porcos desafiados com variações hipoglicosiladas da proteína GP5 principal de superfície do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respíratória Suma (PRRSV) exibiram maior produção de anticorpos neutralizadores de PRRSV em relação aos níveis de anticorpos neutralizadores produzidos por porcos imunizados com GP5 do tipo selvagem (wt) ou glicosilada. Esta invenção fornece processos de obtenção de respostas imunológicas maioresem porcos para o PRRSV, composições úteis para a obtenção de respostas imunológicas maiores assim como polinucleotídeos isolados que codificam variações hipoglícosiladas da proteína GP5 principal de superfície de PR- RSV.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOSE COMPOSIÇÕES PARA VACINAÇÃO DE ANIMAIS COM ANTÍGENOSDE PRRSV COM MAIOR IMUNOGENICIDADE".

Referência Cruzada aos Pedidos de Patentes Relacionados

Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Paten-te U.S. Provisório N2 60/712.357, depositado em 30 de agosto de 2005.

Citação Em Relação à Pesquisa ou ao Desenvolvimento Patrocinado Fede-ralmente

Esta invenção foi feita com o apoio do Governo sob uma Con-cessão Competitiva de Iniciativa de Pesquisa Nacional #2004-01576 do De-partamento U.S. de Agricultura e sob um programa COBRE do Instituto Na-cional de Saúde (National Institute of Health) do Centro Nacional para Re-cursos para Pesquisa Projeto # P20RR15636. O governo possui certos direi-tos a esta invenção.

Apêndice

Não Aplicável

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se de forma geral a composiçõesque compreendem antígenos do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respira-tória Suína (PRRSV) com maior imunogenicidade e a métodos para o usodos mesmos. As composições e os métodos descritos aqui resultam em res-postas imunogênicas melhoradas de porcos aos antígenos de PRRSV, for-necendo assim uma maior proteção de porcos à infecção causada pelo PR-RSV.

Arte Relacionada

O PRRSV é um agente patogênico economicamente importanteque afeta porcos. A infecção de porcas e Ieitoas com PRRSV pode resultarem falha reprodutiva. O PRRSV causa ainda doença respiratória em porcosde todas as idades. É possível vacinar os porcos para protegê-los da infec-ção com PRRSV. Entretanto, as vacinas disponíveis comercialmente atuais(cuja maior parte é constituída de vacinas atenuadas vivas) são de algumamaneira ineficientes e, portanto, devem ser melhoradas. Os mecanismosimunológícos completos de proteção contra o PRRSV não estão claros; en-tretanto, foi mostrado claramente que os anticorpos que neutralizam o PR-RSV são fundamentais para esta proteção. Infelizmente, o próprio PRRSV(em sua forma do tipo selvagem) ou as vacinas vivas atuais derivadas domesmo possuem pouca capacidade de induzir anticorpos neutralizadoresespecíficos ao vírus de uma maneira conveniente e em níveis eficientes (istoé, protetores).

A Patente U.S. Ns 6.500.662, "lnfectious cDNA clone of NorthAmerican porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) vírus e u-ses thereof" (por Calvert e outros, 31 de dezembro de 2002) descreve o de-senvolvimento de um clone de cDNA de PRRSV Norte Americano infecciosoe seu uso como uma vacina. Entretanto, a Patente U.S. N2 6.500.662 nãodivulga vacinas para PRRSV que compreendem antígenos de PRRSV hipo-glicosilados.

Em um outro estudo, as seqüências da proteína GP5 (ou proteí-na do ORF5) de várias cepas de PRRSV Norte Americanas foram compara-das uma com as outras e ao isolado representativo de PRRSV Europeu co-nhecido como a cepa Lelystad, revelando que os sítios de glicosilação Iiga-dos a N na Asparagina 44 (N44) e na Asparagina 51 (N51) da seqüênciaconsenso de GP5 eram conservados em todos os isolados de PRRSV verifi-cados (Pirzadeh e outros, Can. J. Vet Res., 1998, 62: 170-177). Entretanto, osítio de N-glicosilação localizado na Asparagina 31 (N31) da seqüência con-senso de GP5 estava ausente em certos isolados de PRRSV Norte Ameri-canos e ausente no isolado da cepa Lelystad de PRRSV européia. Proteínasde fusão GST-GP5 recombinantes de quatro (4) cepas de PRRSV NorteAmericanas e a cepa Leylstad foram produzidas em E. coli na forma de cor-pos de inclusão insolúveis, renaturadas e utilizadas como agentes imunogê-nicos em coelhos. Tais proteínas recombinantes produzidas em E. coli man-têm, mas não glicosilam seus sítios de N-glicosilação nativos.

Também foi mostrado que a inoculação de porcos com uma va-cina de DNA que compreende uma fusão do promotor de CMV ao gene GP5do isolado de PRRSV Norte Americano IAF-KIop fornece proteção em ani-mais imunizados contra o desafio com PRRSV (Pirzadeh e Dea, 1998, J.General Virology, 79, 989-999). Este isolado do gene GP5 particular codificauma proteína GP5 que contém os resíduos de Asparagina N31, N44 e N51que são presumidamente glicosilados quando expressos em porcos imuni-zados com a vacina de DNA. A vacinação de porcos com GST-GP5 produzi-da por E. coli, que mantém, mas não glicosila os sítios de N-glicosilação dogene GP5 da cepa IAF-ΚΙορ, não protege os pulmões de porcos desafiadoscom o vírus.

Também foram descritos os clones infecciosos de PRRSV Euro-peu contendo mutações que resultam na expressão de proteínas de PRRSVhipoglicosiladas (Wissink e outros, 2004, J. Gen. Virol. 85: 3715-23). Estareferência particular relata que o PRRSV que contém mutações no Resíduode Asparagina 53 (N53) na proteína GP(5) da cepa de PRRSV Lelystad queprevine a glicosilação ligada a N de tal sítio é infeccioso e pode produzir par-tículas virais infecciosas da cepa de PRRSV. Em contraste, o PRRSV quecontém mutações no N46 da proteína GP(5) de PRRSV Lelystad que previ-ne a glicosilação ligada a N de tal sítio não é infeccioso e não produz partí-culas virais infecciosas da cepa de PRRSV Lelystad. Wissink e outros espe-culam que os sítios de N-glicano na proteína GP2a de PRRSV Europeu e,por analogia, o sítio N53 da proteína GP5, poderiam atuar em níveis muitodiferentes no hospedeiro natural, incluindo interações com o receptor ou pro-teção imunológica.

Em vírus sem ser o PRRSV, os resíduos de glicano foram impli-cados em uma variedade de funções. A glicosilação ligada a N, em geral, éimportante para corrigir o dobramento, o alvo e a atividade biológica de pro-teínas (Helenius, A. e M. Aebi., Annu. Rev. Biochem. 73: 1019-1049, 2004.;Williams, D. B. e Glycoconj J., 12: iii-iv. 1995; Zhang, e outros, Glycobiology14: 1229-46, 2004). Em muitos vírus envelopados, as proteínas do envelopesão modificadas pela adição de porções de açúcar e a glicosilação ligada aN da proteína do envelope desempenha funções diversas de glicoproteínasvirais tais como a ligação ao receptor, a fusão de membrana, a penetraçãonas células e o brotamento viral (Braakman, I. é E. van Anken, Traffic 1: 533-9, 2000; Doms e outros Virology 193: 545-62, 1993). Estudos recentes de-monstraram a função da glicosilação ligada a N da glicoproteína do vírusHantaan no dobramento das proteínas e no tráfego intracelular (Shi, X. e R.M. Elliottl J. Virol. 78: 5414-22, 2004) assim como na atividade biológica e naantigenicidade da proteína hemaglutinina (HA) do vírus influenza (Abe, Y., eoutros, J. Virol. 78: 9605-11, 2004). Além disso, se tornou evidente que aglicosilação de proteínas do envelope viral é um mecanismo principal para aevasão imunológica viral e para a persistência utilizada para vários vírus en-velopados diferentes para escapar, bloquear ou minimizar a resposta de an-ticorpo que neutraliza os vírus. Os exemplos deste efeito foram relatadospara SIV (Reitter, J. N. e outros, Nat. Med. 4: 679-84, 1998) e HIV-1 (Wei, X.e outros, Nature 422: 307-12, 2003), HBV (Lee, J. e outros. Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 303: 427-32, 2003), influenza (Skehel, J. J. e outros,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1779-83, 1984) e o arterivírus LDV (Chen, Z.e outros Virology 266: 88-98, 2000).Sumário da Invenção

É em vista dos problemas anteriores que a presente invenção foidesenvolvida. É demonstrado que as variações hipoglicosiladas de uma pro-teína de superfície principal de PRRSV GP5 aumentavam o nível de anticor-pos neutralizadores de PRRSV produzidos por porcos imunizados em rela-ção aos níveis de anticorpos neutralizadores produzidos por porcos imuniza-dos com a GP5 do tipo selvagem (wt) ou glicosilada.

Esta invenção fornece primeiramente um método de ativação deuma resposta imunológica melhorada em um porco a um antígeno do Vírusda Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV), que compreende aadministração de uma composição que compreende um polinucleotídeo quecodifica uma variação do polipeptídeo GP5 do PRRSV hipoglicosilada emque pelo menos um sítio de glicosilação ligada a N correspondente à aspa-ragina 34 ou à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referência da SEQID NO: 1 está inativado. Em certas modalidades do método, pelo menos umsítio de glicosilação ligada a N correspondente à asparagina 34 ou à aspara-gina 51 na SEQ ID NO: 1 é inativado. Este polinucleotídeo pode compreen-der uma molécula de RNA infecciosa de PRRSV ou uma molécula de DNAque codifica uma molécula de RNA infecciosa de PRRSV. A molécula deRNA infecciosa de PRRSV é um derivado de PRRSV Norte Americano ouum derivado de PRRSV Europeu. Alternativamente, este polinucleotídeo po-de compreender uma molécula de DNA em que um promotor ativo em célu-las de mamíferos está ligado de forma operacional ao dito polinucleotídeoque codifica uma proteína GP5 hipoglicosilada. Este promotor é um promotorde CMV em certas modalidades preferidas da invenção. Alternativamente, opolinucleotídeo pode ser um vetor viral. Os vetores virais representativos quepodem ser utilizados incluem vetores do vírus vaccinia, vetores virais deherpes simplex, vetores de adenovírus, vetores de alfavírus e vetores deTG EV.

Uma variedade de tipos e fontes de seqüências de PRRSV podeser utilizada para a obtenção do polinucleotídeo que codifica uma variaçãodo polipeptídeo GP5 de PRRSV hipoglicosilada em que pelo menos um sítiode glicosilação ligada a N correspodente à asparagina 34 ou à asparagina51 em uma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está inativado. Emcertas modalidades da invenção, um polinucleotídeo que codifica uma varia-ção do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipoglicosilada é obtido através da sín-tese direta, da mutagênese de uma seqüência de nucleotídeos de GP5 doisolado de PRRSV Norte Americano ou da mutagênese de uma seqüênciade nucleotídeos de GP5 de PRRSV Norte Americano. A seqüência de nu-cleotídeos de GP5 do isolado de PRRSV Norte Americano pode ser selecio-nada do grupo de nucleotídeos que codifica as proteínas GP5 da SEQ IDNO: 1, da SEQ ID NO: 2, da SEQ ID NO: 3, da SEQ ID NO: 4, da SEQ IDNO: 5, da SEQ ID NO: 6, da SEQ ID NO: 7, da SEQ ID NO: 8, da SEQ IDNO: 9, da SEQ ID NO: 10, da SEQ ID NO: 11, da SEQ ID NO: 12 e da SEQID NO: 13. A seqüência de nucleotídeos consenso de GP5 de PRRSV NorteAmericano codifica uma proteína GP5 consenso que é pelo menos 85% i-dêntica a SEQ ID NO: 14. Em outras modalidades da invenção, o polinucleo-tídeo que codifica uma variação do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipoglicosi-lada é obtido através da síntese direta, da mutagênese de uma seqüência denucleotídeos de GP5 do isolado de PRRSV Europeu ou da mutagênese deuma seqüência de nucleotídeos de GP5 consenso de PRRSV Europeu. Aseqüência de nucleotídeos de GP5 do isolado de PRRSV Europeu codificauma proteína GP5 que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15.

Uma variedade de métodos de inativação dos sítios de glicosila-ção ligada a N especificados pode ser utilizada para a prática eficiente dométodo desta invenção. Um método preferido de inativação de um sítio deglicosilação ligada a N correspondendo à asparagina 51 é substituir o códonde asparagina por um códon que codifica um aminoácido sem ser a aspara-gina. Este códon de substituição pode codificar um resíduo de alanina ou deglutamina. Em modalidades mais preferidas, ambos os ditos sítios de glicosi-lação ligada a N correspondendo à asparagina 34 e à asparagina 51 emuma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 estão inativados. Em ou-tras modalidades, o sítio de glicosilação ligada a N correspondendo à aspa-ragina 34 está inativado. Este sítio de glicosilação ligada a N da asparagina34 pode ser inativado através da substituição de um códon que codifica adita asparagina 34 por um códon que codifica um aminoácido sem ser a as-paragina. O códon que codifica um outro aminoácido pode codificar um resí-duo de alanina ou de glutamina. Em outras modalidades preferidas, ambosos sítios de glicosilação ligada a N correspondendo à asparagina 34 e à as-paragina 51 em uma proteína GP5 de referência podem ser inativados atra-vés da substituição de códons que codificam a asparagina 34 e a asparagina51 por códons que codificam um aminoácido sem ser a asparagina. Ambosos códons que codificam a asparagina 34 e a asparagina 51 podem sersubstituídos por códons que codificam um resíduo de alanina ou de glutami-na para inativar tais sítios de glicosilação. Alternativamente, ambos códonspodem ser substituídos por códons que codificam um resíduo de alanina pa-ra inativar ambos os sítios de glicosilação. Alternativamente, um dos sítiosde glicosilação ligados a N é inativado pela substituição de um códon quecodifica a dita asparagina 34 ou a dita asparagina 51 por um códon que codi-fica um aminoácido sem ser a asparagina enquanto que o outro sítio de gli-cosilação ligada a N é inativado por outras técnicas.

Em modalidades preferidas, o método emprega uma moléculade RNA infecciosa de PRRSV que é um derivado do PRRSV Norte America-no que codifica uma proteína variante do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipo-glicosilada em que pelo menos um sítio de glicosilação ligada a N corres-pondendo à asparagina 34 ou à asparagina 51 em uma proteína GP5 dereferência da SEQ ID NO: 1 está inativado. Em modalidades mais preferidas,ambos os ditos sítios de glicosilação ligada a N correspondendo à asparagi-na 34 e à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO:1 estão inativados. Ambos os sítios de glicosilação ligada a N corresponden-do à asparagina 34 e à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referênciapodem ser inativados através da substituição dos códons que codificam aasparagina 34 e a asparagina 51 por códons que codificam um aminoácidosem ser a asparagina. Ambos os códons que codificam a asparagina 34 e aasparagina 51 podem ser substituídos por códons que codificam um resíduode alanina ou de glutamina para inativar tais sítios de glicosilação. Alternati-vamente, ambos os códons podem ser substituídos por códons que codifi-cam um resíduo de alanina para inativar tal sítio de glicosilação.

Para a prática deste método, a composição que contém o poli-nucleotídeo é administrada através de injeção subcutânea, injeção intrave-nosa, injeção intradermal, injeção parenteral, injeção intramuscular, injeçãoisenta de agulha, eletroporação, fornecimento oral, fornecimento, intranasal,fornecimento oronasal ou qualquer combinação dos mesmos. A composiçãoadministrada pode compreender ainda um veículo terapeuticamente aceitá-vel. Este veículo terapeuticamente aceitável é selecionado do grupo queconsiste em uma proteína, um tampão, um tensoativo e um polímero de po-Iietileno glicol ou qualquer combinação dos mesmos.

A composição administrada pode compreender ainda um adju-vante. Este adjuvante pode ser hidróxido de alumínio, Quil A, uma interrup-ção brusca em gel de alumina, óleos minerais, glicerídeos, ácidos graxos,subprodutos de ácidos graxos, micobactérias e oligodesoxinucleotídeos CpGou qualquer combinação dos mesmos. Uma composição administrada tam-bém pode compreender um segundo adjuvante tal como interleucina 1 (IL-1),IL-2, IL4, IL-5, IL6, IL- 12, interferon gama (g-IFN), fator de necrose celular,MDP (muramil dipeptídeo). complexo imuno estimulante (ISCOM) e Iiposso-mos.

A resposta imunológica melhorada de um porco a um antígenode PRRSV pode compreender a maior produção de anticorpos neutralizado-res de PRRSV pelo dito porco. A maior produção de anticorpos neutralizado-res de PRRSV é tipicamente observada após a imunização do porco atravésdos métodos e das composições desta invenção. A resposta imunológicamelhorada pode ser obtida em uma porca, uma leitoa, um porco não castra-do ou um leitão.

A invenção fornece ainda um método de ativação de uma res-posta imunológica melhorada em um porco a um antígeno do Vírus da Sin-drome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV)1 que compreende a admi-nistração de uma composição que compreende uma variação do polipeptí-deo GP5 de PRRSV hipoglicosilada em que pelo menos um sítio de glicosi-lação ligada a N correspondendo à asparagina 34 ou à asparagina 51 emuma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está inativado no dito por-co. A proteína variante do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipoglicosilada podeser produzida pelos mesmos põlinucleotídeos utilizados nos métodos descri-tos anteriormente em sistemas bacterianos, de levedura ou de mamíferos.

A presente invenção fornece ainda composições que compreen-dem um polinucleotídeo que codifica um variação do polipeptídeo GP5 doPRRSV Norte Americano hipoglicosilada em que pelo menos um sítio deglicosilação ligada a N correspondendo à asparagina 51 em uma proteínaGP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está inativado e um veículo terapeuti-camente aceitável. Em certas modalidades, as composições compreendempolinucleotídeos em que ambos os sítios de glicosilação ligada a N corres-pondendo à asparagina 34 e à asparagina 51 na SEQ ID NO: 1 estão inati-vados. Em modalidades preferidas, esta composição pode compreenderuma molécula de RNA infecciosa do PRRSV Norte Americano ou uma molé-cula de DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa do PRRSV NorteAmericano. Em outras modalidades, o polinucleotídeo compreende uma mo-lécula de DNA em que um promotor ativo em células de mamíferos está li-gado de forma operacional ao dito polinucleotídeo que codifica a dita varia-ção do polipeptídeo GP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosilada. Emcertas modalidades preferidas, este promotor é um promotor do CMV. Aindaem outras modalidades, o polinucleotídeo na composição compreende umvetor viral. Os vetores virais que podem ser utilizados na composição podemser qualquer um de um vetor do vírus vaccinia, um vetor viral de herpes sim-plex, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavírus e um vetor de TGEV.

Nos polinucleotídeos da composição, um sítio de glicosilaçãoligada a N é inativado através da substituição de um códon que codifica adita asparagina 51 por um códon que codifica um aminoácido sem ser a as-paragina. O códon que codifica um aminoácido sem ser a asparagina codifi-ca um resíduo de alanina ou de glutamina. Em outras modalidades destacomposição, um sítio de glicosilação ligada a N adicional é inativado atravésda substituição de um códon que codifica a asparagina 34 por um códon quecodifica um aminoácido sem ser a asparagina. Este códon que codifica umoutro aminoácido pode codificar um resíduo de alanina ou de glutamina. Ascomposições preferidas que compreendem os polinucleotídeos que codifi-cam uma proteína variante do polipeptídeo GP5 do PRRSV Norte Americanohipoglicosilada em que ambos os ditos sítios de glicosilação ligada a N cor-respondendo à asparagina 34 e à asparagina 51 em uma proteína GP5 dereferência Norte Americana da SEQ ID NO: 1 estão inativados e são assimfornecidos por este pedido de patente. Ambos os ditos sítios de glicosilaçãoligada a N podem ser inativados através da substituição dos códons que co-dificam a dita asparagina 34 e a dita asparagina 51 por códons que codifi-cam um aminoácido sem ser a asparagina. Estes códons que codificam umaminoácido sem ser a asparagina podem codificar um resíduo de alanina oude glutamina.

O veículo terapeuticamente aceitável utilizado na composiçãopode ser uma proteína, um tampão, um tensoativo e um polímero de polieti-Ieno glicol ou qualquer combinação dos mesmos. A composição compreen-de ainda pelo menos um adjuvante. Este adjuvante pode ser hidróxido dealumínio, Quil A1 uma interrupção brusca em gel de alumina, óleos minerais,glicerídeos, ácidos graxos, subprodutos de ácidos graxos, micobactérias eoligodesoxinucleotídeos CpG ou qualquer combinação dos mesmos. A com-posição pode compreender ainda um segundo adjuvante selecionado dogrupo que consiste em interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL4, IL-5, IL6, IL-12, interfe-ron gama (g-IFN ), fator de necrose celular, MDP (muramil dipeptídeo), com-plexo imuno estimulante (ISCOM) e lipossomos.

Uma composição que compreende uma variação do polipeptídeoGP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosilada em que pelo menos umsítio de glicosilação ligada a N correspondendo à asparagina 51 em umaproteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está inativado e um veículoterapeuticamente aceitável é também fornecida por esta invenção. Em mo-dalidades preferidas, os sítios de glicosilação ligada a N correspondendo àasparagina 34 ou à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referência daSEQ ID NO: 1 estão inativados. A proteína variante do polipeptídeo GP5 dePRRSV hipoglicosilada pode ser produzida pelos mesmos polinucleotídeosutilizados nos métodos previamente descritos em sistemas de expressãobacterianos, de leveduras ou de mamíferos.

A presente invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados quecodificam uma variação do polipeptídeo GP5 do PRRSV Norte Americanohipoglicosilada em que pelo menos um sítio de glicosilação ligada a N cor-respondendo à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referência da SEQID NO: 1 está inativado. Em certas modalidades, são fornecidos os polinu-cleotídeos em que ambos os sítios de glicosilação ligada a N corresponden-do à asparagina 34 e à asparagina 51 na SEQ ID NO: 1 estão inativados.Em modalidades preferidas, este polinucleotídeo isolado pode compreenderuma molécula de RNA infecciosa do PRRSV Norte Americano ou uma molé-cula de DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa do PRRSV NorteAmericano. Em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado compreendeuma molécula de DNA em que um promotor ativo nas células de mamíferosestá ligado de forma operacional ao dito polinucleotídeo que codifica a ditavariação do polipeptídeo GP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosilada.Em certas modalidades preferidas, este promotor é um promotor do CMV.Ainda em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende umvetor viral. Os vetores virais que podem ser utilizados na composição podemser qualquer um de um vetor de vírus vaccinia, um vetor viral de herpes sim-plex, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavírus e um vetor de TGEV.

Nos polinucleotídeos isolados um sítio de glicosilação ligada a Né inativado através da substituição de um códon que codifica a dita aspara-gina 51 por um códon que codifica um aminoácido sem ser a asparagina. Ocódon que codifica um aminoácido sem ser a asparagina codifica um resíduode alanina ou de glutamina. Em outras modalidades preferidas, um sítio deglicosilação ligada a N adicional é inativado através da substituição de umcódon que codifica a asparagina 34 por um códon que codifica um aminoá-cido sem ser a asparagina. Este códon que codifica um outro aminoácidopode codificar um resíduo de alanina ou de glutamina. São fornecidos ospolinucleotídeos preferidos que codificam uma proteína variante do polipep-tídeo GP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosilada em que ambos osditos sítios de glicosilação ligada a N correspondendo à asparagina 34 e àasparagina 51 em uma proteína GP5 de referência Norte Americana da SEQID NO: 1 estão inativados. Ambos os ditos sítios de glicosilação ligada a Npodem ser inativados através da substituição dos códons que codificam adita asparagina 34 e a dita asparagina 51 por códons que codificam um ami-noácido sem ser a asparagina. Estes códons que codificam um aminoácidosem ser a asparagina podem codificar um resíduo de alanina ou de glutami-na.

A invenção fornece ainda um polipeptídeo isolado que é umavariação do polipeptídeo GP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosiladaem que pelo menos um sítio de glicosilação ligada a N correspondendo àasparagina 51 em uma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 estáinativado. A proteína variante do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipoglicosila-da isolada pode ser produzida pelos mesmos polinucleotídeos utilizados nosmétodos previamente descritos nos sistemas de expressão bacterianos, deleveduras ou de mamíferos e purificada por cromatógrafia ou outras técni-cas.

As características e as vantagens adicionais da presente inven-ção, assim como a estrutura e a operação de várias modalidades da presen-te invenção, estão descritas em detalhes abaixo com referência às figurasem anexo.

Breve Descrição das Figuras

As figuras em anexo, que são incorporadas e que constituemuma parte dó relatório descritivo, ilustram as modalidades da presente in-venção e junto com a descrição, servem para explicar os princípios da in-venção. Nas figuras:

A Figura 1 ilustra a Expressão transitória da proteína GP5 e Mdo PRRSV. A. Esquema do constructo bicistrônico que mostra as regiõesque codificam GP5 e M que flanqueiam o IRES (IE) do vírus da encefalomio-cardite. As regiões codificadoras estão sob o controle do promotor da RNApolimerase de T7 (retângulo em preto) presente a montante da região codifi-cadora de GP5. A seta dobrada mostra a posição e a direção da transcriçãopela RNA polimerase de T7 do vetor. B. Expressão das proteínas GP5 e Mem células transfectadas com o vetor bicistrônico. As células transfectadasde forma simulada (faixa 1) ou transfectadas com o plasmídeo (faixas 2-7)foram marcadas de forma radioativamente como descrito em Materiais e Mé-todos, imunoprecipitadas com o anticorpo anti-Gp5 (faixas 1-5) ou com oanticorpo anti-M (faixas 6-7). As proteínas imunoprecipitadas foram mantidasnão-tratadas (-) (faixas 1, 2, 6 e 7) ou tratadas (+) com Endo H (faixa 3),PNGase F (faixa 4) e analisadas por eletroforese. A faixa 5 contém proteínasimunoprecipitadas provenientes de células transfectadas tratadas (+) comtunicamicina. É mostrada a mobilidade das proteínas com massa molecularrelativa (Mr) em quilodáltons.

A Figura 2 ilustra a análise da glicosilação de WT-GP5 e seusmutantes utilizando um plasmídeo bicistrônico. A. Representação esquemá-tica do vetor bicistrônico e da GP5 do PRRSV com os três supostos sítios deglicosilação nas posições de aminoácidos 34, 44 e 51 mostradas. B. Váriosmutantes foram utilizados no presente estudo. C. Expressão da GP5 do tiposelvagem e mutante e sua sensibilidade a Endo Η. O experimento foi reali-zado como descrito na legenda da Figura 1, as proteínas foram imunopreci-pitadas com o anticorpo anti-GP5, digeridas com Endo H (+) ou deixadasnão-digeridas (-) e analisadas por eletroforese. As proteínas GP5 mutantessão mostradas por pontas de setas. A mobilidade das proteínas com massamolecular relativa (Mr) em quilodáltons é mostrada à direita.

A Figura 3 ilustra a caracterização de vírus mutantes que codifi-cam GP5 mutante. A. Cinética de crescimento em uma única etapa de PR-RSVs do tipo selvagem (FL-12) e vários mutantes em células MARC-145. Ascélulas em placas de seis cavidades foram infectadas com PRRSV a umaMOI de 3, os sobrenandantes de cultura foram coletados nos tempos indica-dos após a infecção e os títulos virais foram determinados. São mostradosos títulos médios com desvio padrão (barras de erros) proveniente dos trêsexperimentos independentes. B. Morfologia de placas de vírus mutantes. Assetas vazadas e as pontas de setas exibem placas que são menos eviden-tes. C. Transcomplementação para a recuperação de PRRSVs mutantes.Análise quantitativa da recuperação de vírus mutantes partindo de célulasque expressam a proteína GP5 do tipo selvagem. É mostrado o rendimentomédio de vírus provenientes de três experimentos independentes com des-vio padrão (representado por barras de erros).

A Figura 4 ilustra uma verificação da GP5 incorporada em virionsmutantes e sintetizada em células infectadas por vírus. A. Os virions radior-rotulados provenientes dos sobrenadantes de cultura de células infectadasforam peletizados, a proteína GP5 foi imunoprecipitada, tratada com (+) ousem (-) Endo H e analisada por eletroforese. A GP5 com e sem digestãocom Endo H nas faixas 1 e 2 é mostrada por colchetes brancos. B. As célu-las infectadas com vários vírus mutantes foram radiorrotuladas, a GP5 foiimunoprecipitada, tratada com (+) ou sem (-) Endo H e analisada por eletro-forese. A GP5 com e sem digestão com Endo H nas faixas 2 e 3 é mostradapor colchetes brancos. A mobilidade das proteínas com massa molecularrelativa (Mr) em quilodáltons é mostrada do lado direito de cada painel.A Figura 5 ilustra um alinhamento de seqüências de aminoáci-dos N-terminais de GP5 do PRRSV Norte Americano com a seqüência N-terminal de referência de GP5 do PRRSV Norte Americano (SEQ ID NO: 1;cepa NVSL 97-7895). São mostrados os primeiros 60 aminoácidos N-terminais de um alinhamento das proteínas de 200 aminoácidos. Os sítios deglicosilação ligada a N da asparagina 34 "NSS" e da asparagina 51 "NGT"nas proteínas são mostrados em negrito. Outros sítios de glicosilação ligadaa N localizados entre os resíduos 29 e 35 da proteína GP5 de referência es-tão sublinhados.

A Figura 6 ilustra um alinhamento da seqüência de aminoácidosN-terminais do PRRSV europeu com a seqüência N-terminal de referênciade GP5 do PRRSV Norte Americano (SEQ ID NO: 1; cepa NVSL 97-7895).Um alinhamento da proteína GP5 inteira de proteínas de aproximadamente200 aminoácidos é mostrando quando um sítio de glicosilação ligada a N daasparagina 51 "NGT" é mostrado em negrito (isto é, a asparagina 53 na SEQID NO: 15).

Descrição Detalhada das Modalidades PreferidasDefinições:

"Veículo aceitável", como utilizado aqui, se refere a um veículoque não é deletério aos outros ingredientes da composição e não é deletérioao material ao qual será aplicado. "Veículo terapeuticamente aceitável" serefere a um veículo que não é deletério aos outros ingredientes da composi-ção e não é deletério ao receptor humano ou outro animal do mesmo. Nocontexto dos outros ingredientes da composição, "não-deletério" significaque o veículo não-reagirá com ou degradará os outros ingredientes ou inter-ferirá com a eficiência dos mesmos. A interferência com a eficiência de umingrediente não abrange a mera diluição do ingrediente. No contexto do ani-mal, "não deletério" significa que o veículo não é prejudicial ou letal à plantaou ao animal.

"Adjuvante", como utilizado aqui, se refere a qualquer materialutilizado em associação com um antígeno que aumenta a capacidade de talantígeno para a indução de uma resposta imunológica."Administração", como utilizado aqui, se refere a quaisquer mei-os de fornecimento de um polinucleotídeo, um polipeptídeo ou uma compo-sição do mesmo a um indivíduo. Os exemplos não Iimitantes de meios deadministração incluem injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção in-tradermal, injeção parenteral, injeção intramuscular, injeção isenta de agu-lha, eletroporação, fornecimento oral, fornecimento intranasal, fornecimentooronasal ou qualquer combinação dos mesmos.

"Antígeno", como utilizado aqui, se refere a qualquer entidadeque induza uma resposta imunológica em um hospedeiro.

"Seqüência consenso", como utilizado aqui, se refere a uma se-qüência de aminoácidos, de DNA ou de RNA criada através do alinhamentode duas ou mais seqüências homólogas e que deriva de uma nova seqüên-cia que representa a seqüência de aminoácidos, de DNA ou de RNA co-mum.

"Variação do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipoglicosilada", co-mo utilizado aqui, se refere às proteínas GP5 do PRRSV em que a seqüên-cia de aminoácidos original ou não-variante que compreende um ou maissítios de glicosilação ligada a N foram alteradas de forma a reduzir o númerode sítios de glicosilação ligada a N na proteína variante de GP5 resultante.

Sob esta definição, a expressão de uma proteína GP5 original ou não varian-te em E. coli para a produção de uma proteína GP5 com a seqüência deGP5 original contendo o mesmo número de sítios de glicosilação não resul-taria na produção de uma variação do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipogli-cosilada.

"Resposta imunológica", como utilizado aqui, se refere à produ-ção de anticorpos e/ou de células (tais como linfócitos T) que se ligam, de-gradam ou inibem de outra maneira um antígeno particular. As expressõesrelacionadas tal como "uma resposta imunológica melhorada" se referem aouso dos métodos e das composições que resultam em qualquer melhoriaque possa ser medida na resposta de um hospedeiro imunizado para umantígeno. Por exemplo, as melhorias que podem ser medidas em uma res-posta imunológica incluem, mas não estão limitadas, à maior produção deanticorpos neutralizadores (isto é, maiores títulos de anticorpos) em relaçãoaos níveis de produção observados nos animais de controle que foram imu-nizados com antígenos que não possuem as modificações estruturais quesão responsáveis por uma resposta imunológica melhorada.

"Molécula de RNA infecciosa" se refere a uma molécula de RNAque codifica todos os elementos necessários para a produção de um virionfuncional quando introduzido em uma célula hospedeira permissiva.

"Clone infeccioso", como utilizado aqui, se refere a uma molécu-la de DNA què codifica uma molécula de RNA infecciosa.

"PRRSV Norte Americano", como utilizado aqui, se refere aqualquer PRRSV que compreende seqüências de polinucleotídeos associa-do com isolados do PRRSV Norte Americano, tal como, mas não limitado àcepa NVSL 97-7895 (Truong e outros, Virology, 325: 308-319 e referênciascontidas no mesmo) ou cepas IAF-ΚΙορ, MLV, ATCC VR-2332, ATCC VR-2385, IAF-BAJ, IAF-DESR, IAF-CM, IAF 93-653, IAF 93-2616, IAF 94-3182,IAF 94-287 descritas em Pirzadeh e outros Can. J. Vet Res, 62: 170-177 ereferências contidas no mesmo. Para esta invenção, o PRRSV que compre-ende as seqüências de polinucleotídeos associadas com um isolado do PR-RSV Norte Americano são PRRSV que contêm seqüências de polinucleotí-deos em que a região que codifica GP5 codifica um polipeptídeo que possuipelo menos 85% de identidade de seqüência com a proteína em relação àSEQ ID NO: 1.

"PRRSV Europeu", como utilizado aqui, se refere a qualquerPRRSV que compreende seqüências de polinucleotídeos associadas comum isolado do PRRSV Norte Americano, tal como, mas não limitado à cepaLelystad (Wissink e outros, J. Gen. Virol. 85: 3715, 2004 e referências conti-das no mesmo). Para esta invenção, o PRRSV que compreende as seqüên-cias de polinucleotídeos associadas com um isolado do PRRSV Europeusão PRRSV que contêm seqüências de polinucleotídeos em que a regiãoque codifica GP5 codifica um polipeptídeo que possui pelo menos 85% deidentidade de seqüência com a proteína em relação à SEQ ID NO: 15.

"Porcentagem de identidade", como utilizado aqui, se refere aonúmero de elementos (isto é, aminoácidos ou nucleotídeos) em uma se-qüência que é idêntico dentro de um comprimento definido de dois segemen-tos de DNA1 RNA ou proteína alinhados de forma ótima. Para calcular a"porcentagem de identidade", o número de elementos idênticos é divididopelo número total de elementos no comprimento definido dos segmentosalinhados e multiplicado por 100. Quando a porcentagem de identidade éutilizada em referência às proteínas, é entendido que certos resíduos de a-minoácidos podem não ser idênticos, mas são, todavia, substituições con-servativas de aminoácidos que refletem substituições de resíduos de amino-ácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, resíduos ácidosou básicos, hidrofóbicos, hidrofílicos, doadores ou receptores de ligação dehidrogênio). Tais substituições podem não alterar as propriedades funcionaisda molécula. Conseqüentemente, a porcentagem de identidade de seqüên-cias de proteínas pode ser aumentada para considerar substituições conser-vativas.

Introdução

A glicoproteína 5 (GP5) do vírus da síndrome reprodutiva e res-piratória suína (PRRSV) é a glicoproteína de envelope mais abundante e umindutor principal de anticorpos neutralizadores in vivo. Três supostos sítiosde glicosilação ligada a N (N34, N44 e N51) ficam localizados no ectodomí-nio da GP5, onde existe também um epitopo de neutralização principal. Paradeterminar quais destes supostos sítios de glicosilação são utilizados no ci-clo de vida do PRRSV e a função dos grupamentos de glicano na indução deanticorpos neutralizadores, foi gerado um conjunto de mutantes de GP5 con-tendo substituições de aminoácidos isoladas e múltiplas nestes sítios. A ex-pressão transitória de proteínas do tipo selvagem (wt) assim como mutantese os estudos bioquímicos subseqüentes revelaram que a GP5 madura con-tém alto conteúdo de grupamentos de açúcar do tipo manose em todos ostrês sítios. Estas mutações foram subseqüentemente incorporadas em umclone de cDNA de comprimento completo para a recuperação de PRRSVinfeccioso. Os resultados dos presentes inventores demonstram que muta-ções envolvendo o resíduo N44 não resuItavam na produção de progênieinfecciosa, indicando que N44 é o resíduo de aminoácido mais crítico para acapacidade de infecção viral. Os vírus que carregam mutações em N34, N51e N34/51 cresceram em títulos mais baixos que o PRRSV do tipo selvageme exibiam efeito citopático reduzido nas células MARC 145. Nos ensaios deneutralização no soro, os vírus mutantes exibiam sensibilidade à neutraliza-ção por anticorpos específicos ao PRRSV do tipo selvagem. Além disso, ainoculação de porcos com os vírus mutantes induziu níveis significativamen-te maiores de anticorpos neutralizadores contra o PRRSV mutante assimcomo do tipo selvagem, sugerindo assim que a perda de resíduos de glicanono ectodomínio de GP5 aumenta tanto a sensibilidade destes vírus à neutra-lização in vitro assim como a imunogenicidade do epitopo de neutralizaçãopróximo. Estes resultados devem ter grande significância para o desenvol-vimento de vacinas para PRRSV de eficiência protetora melhorada.

Os anticorpos neutralizadores são conhecidos como sendo umcorrelativo principal de proteção contra o PRRSV. Foi descoberto que a eli-minação dos sítios de glicosilação na GP5 proteína do PRRSV resulta noaumento significativo: (1) da capacidade da cepa de PRRSV modificada deser neutralizada por um anti-soro convalescente do PRRSV e (2) da capaci-dade desta cepa de PRRSV modificada de produzir níveis sem precedentede anticorpos neutralizadores para PRRSV quando utilizada para inocularporcos. A aplicação deste conceito em qualquer vírus vivo (do tipo selvagemou atenuado) utilizado para a imunização contra a infecção pelo PRRSV te-ria impacto significativo sobre este uso para conferir proteção eficiente con-tra a infecção pelo PRRSV.

Atualmente, há três abordagens principais para a imunizaçãocontra infecções causadas pelo PRRSV: (1) vacinas atenuadas vivas, (2)vacinas inativadas (que se baseam no crescimento do PRRSV do tipo selva-gem in vitro e quimicamente inativados) e (3) uso da infecção intencionalcom o PRRSV do tipo selvagem virulento de uma maneira sistemática emtodos os animais do rebanho. Há muita discussão e controvérsia em relaçãoa qual destas 3 formas é mais eficiente. A presente invenção seria benéfica,independentemente da abordagem utilizada para imunização. A alteraçãogenética de um PRRSV vivo para modificar o nível de glicosilação de suasproteínas pode ser feita na cepa vacinai de PRRSV atenuada ou na cepa dePRRSV do tipo selvagem utilizada para produzir uma vacina inativada ou nacepa de PRRSV do tipo selvagem para a inoculação direta do rebanho porinfecção em massa.

O vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV)pertence à família Arteriviridae dentro da ordem Nidovirales que inclui aindao vírus da arterite eqüina (EAV)1 o vírus de elevação da Iactate desidrogena-se (LDV) e o vírus da febre hemorragia de símios (SHFV). O genoma viral éuma molécula de RNA de filamento positivo linear de aproximadamente 15,0kb de comprimento e possui uma estrutura cap na extremidade a 5' e umacauda poli(A) na extremidade a 3'. Oito quadros abertos de leitura (ORF) sãocodificados no genoma viral. Os dois primeiros quadros abertos de leitura(ORF1a e ORFIab) codificam poliproteínas virais não-estruturais (NS) queestão envolvidas no processamento de poliproteínas e na transcrição e nareplicação do genoma. As proteínas estruturais virais, codificadas no ORF2-7, são expressas partindo dos seis mRNAs com cap e poliadenilados subge-nômicos que são sintetizados na forma do conjunto aninhado co-terminal a3' de mRNAs com uma seqüência líder comum na extremidade a 5'. A prote-ína de envelope viral principal é a glicoproteína 5 (GP5), que é codificada noORF5 do genoma viral. A GP5 é uma proteína transmembrana glicosiladacom aproximadamente 25 kDa de tamanho. Possui um suposto peptídeosinal N-terminal e possui três sítios de glicosilação ligada a N potenciais queficam localizados em um ectodomínio pequeno que compreende os primei-ros 40 resíduos da proteína madura. No EAV e no LDV, a glicoproteína deenvelope principal forma um heterodímero ligado por dissulfeto com o produ-to gênico do ORF6, a proteína de matriz viral (Μ). A interação similar entre aGP5 e a proteína M do PRRSV foi observada, mas o modo de interação ain-da não foi identificado. Foi postulado que a formação de heterodímeros dasproteínas GP5 e M pode desempenhar uma função crítica na montagem doPRRSV infeccioso. Em adição a sua função na montagem do vírus, a GP5parece estar envolvida na entrada do vírus em células hospedeiras susceptí-veis. E presumido que a GP5 interage com o receptor da célula hospedeira,sialoadesina para a entrada nos macrófagos alveolares suínos (PAMs), ascélulas-alvo in vivo para o PRRSV. A função da GP5 no reconhecimento doreceptor é sustentada pela presença de um epitopo de neutralização princi-pal no ectodomínio N-terminal, implicando assim em uma função central pa-ra o ectodomínio da GP5 no processo de infecção.

As glicanas ligadas a N do ectodomínio da GP5 podem ser críti-cas para o funcionamento apropriado da proteína. A glicosilação ligada a N,em geral, é importante para o dobramento correto, para o alvo e para a ativi-dade biológica das proteínas. Em muitos vírus envelopados, as proteínas doenvelope são modificadas através da adição de grupamentos de açúcar e aglicosilação ligada a N da proteína do envelope desempenha funções diver-sas de glicoproteínas virais tais como a ligação ao receptor, a fusão commembranas, a penetração nas células e o brotamento do vírus. Estudos re-centes demonstraram a função da glicosilação ligada a N da glicoproteína dovírus Hantaan no dobramento de proteínas e no tráfego intracelular assimcomo na atividade biológica e na antigenicidade da proteína hemaglutinina(HA) do vírus influenza. Além disso, se tornou evidente que a glicosilaçãodas proteínas do envelope viral é um mecanismo principal para a evasãoimunológica viral e para a persistência utilizada por vários vírus envelopadosdiferentes para escapar, bloquear ou minimizar a resposta de anticorposneutralizadores do vírus. Os exemplos deste efeito foram relatados para SIVe HIV-I, HBV, influenza e, de forma mais importante, no caso do PRRSV, oarterivírus LDV.

Recentemente o desenvolvimento de sistemas genéticos inver-sos para o PRRSV foi relatado por vários laboratórios incluindo o dos pre-sentes inventores. Evidentemente, estudos de mutação com clones infeccio-sos levaram a um melhor entendimento dos mecanismos de transcrição e dereplicação do genoma viral dos arterivírus. Assim, com a finalidade de verifi-car a importância da glicosilação ligada a N na atividade biológica da GP5 doPRRSV na produção de vírus infecciosos ou na ativação de anticorpos neu-tralizadores in vivo, foi construída uma série de proteínas GP5 mutantes emque cada um dos sítios de glicosilação ligada a N potenciais foi mutado indi-vidualmente ou em várias combinações. As proteínas mutantes resultantesforam verificadas em relação ao seu padrão de glicosilação, sua função narecuperação de vírus infecciosos e na neutralização cruzada por anticorposproduzidos, através de inoculações experimentais, contra o PRRSV do tiposelvagem ou contra os vírus mutantes. Os dados dos presentes inventoresmostram que todos os três supostos sítios de glicosilação são utilizados paraa glicosilação com glicanas do tipo de alto conteúdo de manose e a glicosi-lação da proteína GP5 no resíduo 44 é crítica para a recuperação do PRRSVinfeccioso. De maneira muito importante, os dados dos presentes inventorespartindo da neutralização e dos estudos de resposta de anticorpos indicamque a infecção natural com o PRRSV pode envolver uma evasão imunológi-ca baseada nos mecanismos de proteção das glicanas como foi previamentedescrito para outros vírus, ajudando assim a explicar a resposta imunológicahumoral protetora bastante ineficiente que é observada nos animais infecta-dos pelo PRRSV.

Sítios de Glicosilação Ligada a N e Métodos de Inativacão

A glicosilação ligada a N nas glicoproteínas ocorre tipicamentenas seqüências Asn-Xaa-Ser/Thr (NXS/T), em que Xaa (X) é qualquer resí-duo de aminoácido exceto Pro. Uma variedade de mutações pode ser intro-duzida nos sítios de glicosilação ligada a N para fornecer a sua inativação.Um método preferido de inativação compreende a substituição do resíduo deasparagina por um resíduo que codifica qualquer aminoácido sem ser a as-paragina. Em modalidades mais preferidas desta invenção, o resíduo de as-paragina é substituído por um resíduo de alanina ou de glutamina.

Outros métodos de inativação de sítios de glicosilação ligada a Ne, em particular, dos sítios de glicosilação ligada a N correspondendo às as-paraginas 34 e/ou 51 da proteína de referência GP5 da SEQ ID NO: 1, tam-bém são considerados aqui. As substituições de certos aminoácidos tal co-mo prolina, triptofano, aspartato, glutamato ou Leucina na posição Xaa tam-bém podem ser utilizadas para inativar os sítios de glicosilação ligada a N(Kasturi e outros, Biochem J. 323 (2): 415-9, 1997). Alternativamente, assubstituições da posição de hidróxi aminoácido final dó sítio de glicosilaçãoligada a N (isto é, o resíduo de serina ou de treonina da seqüência NXS/T)por qualquer aminoácido sem ser hidróxi (isto é, qualquer aminoácido semser serina ou treonina) podem ser também utilizadas para inativar o sítio deglicosilação ligada a N. Os exemplos de aminoácidos sem ser hidróxi queforam utilizados para inativar os sítios de glicosilação ligada a N incluem cis-terna (Kasturi e outros, J. Biol. Chemistry 270(24), 14756-14761, 1995).

Em adição às substituições de aminoácidos, outros tipos de mu-tações que inativam os sítios de glicosilação ligada a N tais como inserçõesde aminoácidos ou deleções de aminoácidos são também considerados poresta invenção. Os versados na técnica considerarão que um sítio de glicosi-lação ligada a N pode ser facilmente inativado por deleções que removemaminoácidos chaves na seqüência NXS/T (isto é, os resíduos de asparagina)e resultarão na inativação de tal sítio de glicosilação. As deleções do resíduoX òu do resíduo serina/treonina podem similarmente inativar certos sítios deglicosilação ligada a N em que o resíduo S ou T não é seguido por um outroresíduo S ou T na seqüência que ocorre naturalmente. Quando X for um a-minoácido sem ser hidróxi (isto é, não for serina ou treonina), as inserçõesde qualquer resíduo de aminoácido na extremidade carbóxi terminal do resí-duo N podem inativar o sítio de glicosilação ligada a N. As inserções dequaisquer aminoácidos sem ser hidróxi na extremidade carbóxi terminal doresíduo X também podem inativar o sítio de glicosilação ligada a N.

Em resumo, é entendido que a característica chave da mutaçãoutilizada para a prática da invenção é que esta inativa a glicosilação ligada aN nos sítios de asparagina 34 e/ou de asparagina 51 em uma proteína GP5.Embora não esteja ligado à teoria, acredita-se que a característica chavedestas mutações são que estas previnem a glicosilação em uma certa regiãoda proteína (isto é, resíduos que correspondem sítios de asparagina 34 e/oude asparagina 51 em uma proteína de referência GP5 da SEQ ID NO: 1).Previnindo a glicosilação nestes sítios, os resíduos de açúcar que comumen-te escondem os epitopos chaves do vírus do tipo selvagem são removidos,permitindo assim a ativação de uma resposta imunológica melhorada. Gon-seqüentemente, é esperado que um número de tipos diferentes de mutações(isto é, substituição, inserção ou deleção de aminoácidos) possa ser utilizadopara inativar os sítios de glicosilação ligada a N identificados e para a obten-ção de um antígeno que ativará a resposta imunológica melhorada.

Descrição dos polinucleotídeos e dos polipeptídeos do PRRSV da invençãoOs métodos desta invenção podem ser praticados com uma va-riedade de polinucleotídeos diferentes que podem ser derivados de uma va-riedade de fontes diferentes. A característica comum de todos os polinucleo-tídeos é que codificam uma variação do polipeptídeo GP5 de PRRSV hipo-glicosilada em que os sítios de glicosilação ligada a N que correspondem àasparagina 34, à asparagina 51 ou tanto à asparagina 34 quanto à asparagi-na 54 em uma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 estão inativa-dos. Para a identificação dos sítios de glicosilação ligada a N corresponden-do à asparagina 34 e à asparagina 54 na proteína GP5 de referência daSEQ ID NO: 1, a seqüência do polipeptídeo GP5 do PRRSV não variante enormalmente glicosilada pode ser alinhada com a proteína GP5 de referên-cia da SEQ ID NO: 1. Os exemplos de tal alinhamento são mostrados nasFiguras 5 e 6. As seqüências particulares utilizadas neste alinhamento sãodescritas na Tabela 1.

Tabela 1. Descrição de Seqüências

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Para identificar os sítios de glicosilação ligada a N correspon-dendo à asparagina 34 ou à asparagina 51 em uma proteína GP5 de refe-rência da SEQ ID NO: 1 que podem ser inativados e utilizados nos métodosdesta invenção, as proteínas GP5 de um isolado do PRRSV Norte America-no desejado (Figura 5) ou de um isolado do PRRSV Europeu (Figura 6) sãoalinhadas com a proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 (cepa NorteAmericana NVSL 97-7895). Utilizando a proteína GP5 da SEQ ID NO: 1 co-mo um proteína de referência, um versado na técnica pode facilmente identi-ficar os sítios de glicosilação ligada a N em qualquer proteína GP5 e entãoconstruir as variações da proteína GP5 hipoglicosiladas desta invenção. Éassim evidente que o termo "correspondendo a (asparagina 34 e/ou aspara-gina 51) em uma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1" serve comoum descritor do sítio de glicosilação ligada a N em qualquer proteína GP5.

A proteína GP5 hipoglicosilada pode ser obtida partindo de umisolado do PRRSV Norte Americano que inclui, mas não está limitado àsSEQ ID NO: 1-13, um isolado do PRRSV Norte Americano que é pelo menos85% idêntico em um nível de seqüência de aminoácidos a uma seqüênciaconsenso do PRRSV Norte Americano tal como a SEQ ID NO: 14 ou de umaseqüência consenso do PRRSV Norte Americano. A proteína GP5 hipoglico-silada pode também ser obtida partindo de isolados do PRRSV Europeu in-cluindo, mas não limitados à SEQ ID NO: 15, um isolado do PRRSV Euro-peu que é pelo menos 85% idêntico em um nível de seqüência de aminoáci-dos a uma seqüência consenso do PRRSV Europeu tal como SEQ ID NO:15 ou de uma seqüência consenso do PRRSV Europeu. Para a obtençãodos polinucleotídeos que codificam a variação de GP5 hipoglicosilada, ospolinucleotídeos de qualquer uma das fontes listadas anteriormente podemsofrer mutação através de técnicas padronizadas de mutagênese direciona-da ao sítio de forma que codificarão um polipeptídeo variante de GP5 hipo-glicosilado. Alternativamente, pode ser construída uma seqüência de DNAinteiramente sintética que codifica o polipeptídeo variante de GP5 hipoglico-silado desejado. Isto é tipicamente realizado através da utilização de umprograma de análise de seqüências tal como "back translate" que converteuma seqüência de polipeptídeo em uma seqüência de polinucleotídeo cor-respondente (GCG Wisconsin Package™, Accelrys, lnc, San Diego, CA). Sedesejado, o "codon bias" adequado pode ser incorporado no programa "backtranslate" para fornecer o planejamento de um gene sintético que incorporacódons apropriados para uso no hospedeiro de expressão (isto é, mamíferoou levedura). [0074] O sítio de glicosilação ligada a N correspondendo à as-paragina 51 da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está presenteem todos os isolados representativos do PRRSV Norte Americano mostra-dos na Figura 5 e na cepa representativa do PRRSV Europeu Lelystad (Fi-gura 6). Nestes exemplos e não-limitantes de cepas dó PRRSV Norte Ame-ricano e Europeu, o sítio de glicosilação ligada a N nesta posição compreen-de a seqüência "NGT". Entretanto, é previsto que outras variações do PR-RSV podem compreender outros sítios de glicosilação ligada a N estrutural-25 mente intercambiáveis (isto é, NXS ou T) que poderiam ser inativados atra-vés dos métodos ensinados aqui. Este sítio de glicosilação ligada a N podeser inativado através da substituição dos códons que codificam outros resí-duos de aminoácidos tal como glutamina ou alanina pela asparagina 51 naseqüência de polinucleotídeo correspondente. Nestes casos, a seqüência deaminoácidos correspondente na variação de proteína GP5 do PRRSV NorteAmericano hipoglicosilada compreenderia as seqüências tal como "QGT","AGT" ou "XGT", em que X é qualquer aminoácido sem ser a asparagina.Estas e outras variações hipoglicosiladas dos isolados da proteína GP5 doPRRSV Norte Americano em que o sítio de glicosilação ligada a N corres-pondendo à asparagina 51 está inativado também podem ser combinadascom outras variações de GP5 hipoglicosiladas em que outros sítios de glico-silação ligada a N estão inativados. Outros métodos de inativação de sítiosde glicosilação ligada a N incluem substituições de aminoácidos dos resí-duos "X" ou "S/T" da seqüência NXS/T, deleções de aminoácidos ou inser-ções de aminoácidos e são descritos anteriormente.

O sítio de glicosilação ligada a N correspondendo extatamente àasparagina 34 da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está presen-te em apenas certos isolados representativos do PRRSV Norte Americanomostrados aqui (Figura 5). Mais especificamente, as proteínas GP5 dos iso-lados representativos do PRRSV Norte Americano IAF-BAJ (SEQ ID NO: 3),94-3182 (SEQ ID NO: 7) e 94-287 (SEQ ID NO: 8) contêm o sítio de glicosi-lação ligada a N correspondendo exatamente à asparagina 34 da proteínaGP5 de referência da SEQ ID NO: 1 e compreendem o sítio de glicosilaçãoligada a N "NSS". É evidentemente previsto que outros isolados de GP5 doPRRSV não-mostrados aqui conterão também os sítios de glicosilação liga-da a N correspondendo à asparagina 34 da proteína GP5 de referência daSEQ ID NO: 1 e que as variações hipoglicosiladas destas outras proteínasGP5 podem também ser obtidas utilizando os métodos descritos aqui. Estesítio de glicosilação ligado a N das SEQ ID NO: 3, 7 e 8 ou de outros isola-dos do PRRSV contendo o sítio de glicosilação ligada a N da asparagina 34pode ser também inativado através da substituição dos códons que codifi-cam outros resíduos de aminoácidos tal como glutamina ou alanina pela as-paragina 34 na seqüência de polinucleotídeo correspondente. Nestes casosem que o sítio de glicosilação ligada a N na asparagina 34 é "NSS", a se-qüência de aminoácidos correspondente na variação de proteína GP5 doPRRSV Norte Americano hipoglicosilada compreenderia as seqüências talcomo "QSS", "ASS" ou "XSS", em que X é qualquer aminoácido sem ser aasparagina. Alternativamente, o resíduo de serina da seqüência "NSS" podeser substituído por um aminoácido sem ser hidróxi (isto é, sem ser serina ousem ser treonina). Nestes casos, a seqüência de aminòácido corresponden-te na variação de proteína GP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosiladacompreenderia a seqüência "NSX", em que X é qualquer aminoácido semser a asparagina. Uma inserção de um aminoácido sem ser hidróxi entredois resíduos de se ri na da seqüência "NSS" (isto é, entre as serinas 35 e 36)também pode ser utilizada para inativar este sítio de glicosilação particular.

Nos outros isolados do PRRSV Norte Americano a ausência dosítio de glicosilação ligada a N correspondendo exatamente à asparagina 34da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1, outros sítios de glicosilaçãoligada a N localizados no resíduo 30 (Figura 5 "NAS" nas SEQ ID NO: 2, 3,4, 6, 7, 8, 9, 11, 13) e no resíduo 33 (Figura 5 "NNS" nas SEQ ID NO: 3, 8;"NSS" nas SEQ ID NO: 6, 10, "NDS" na SEQ ID NO: 11, 13) pode estar ina-tivados. Em outras palavras, os sítios de glicosilação ligada a N em outrosisolados Norte Americanos localizados nas posições de aminoácidos corres-pondendo aos resíduos 30 e 33 da proteína GP5 de referência da SEQ IDNO; 1 podem também estar inativados e ser utilizados nos métodos destainvenção. Sem ficar limitado à teoria, a região particular da proteína GP5 doPRRSV localizada entre os resíduos 29 e 35 da proteína de referência GP5da SEQ ID NO: 1 parece ser uma região hipervariável (Figura 5) que podetolerar uma variedade de seqüências de aminoácidos distintas (Figura 5; vertambém Pirzadeh e outros, Can. J. Vet Res., 1998, 62: 170-177). Emboracertos isolados do PRRSV que ocorrem naturalmente não contenham sítiosde glicosilação ligada a N nesta região (isto é, isolados Norte Americanosdas SEQ ID NO: 5, 12; isolado Europeu da SEQ ID NO: 15), outros isoladospodem conter entre 1 até 3 sítios de glicosilação nesta região. Conseqüen-temente, a inativação de qualquer um dos sítios de glicosilação de uma certaproteína GP5 na região localizada entre os resíduos 29 e 35 da proteína dereferência GP5 da SEQ ID NO: 1 é considerada aqui como uma composiçãoou um método para a ativação de uma resposta imunológica melhorada paraa proteína GP5 do PRRSV. Além disso, a inativação de mais de um ou detodos os sítios de glicosilação de uma certa proteína GP5 na região localiza-da entre os resíduos 29 e 35 da proteína de referência GP5 da SEQ ID NO:1 é também considerada aqui como uma composição ou um método para aativação de uma resposta imunológica melhorada para a proteína GP5 doPRRSV.

O alinhamento da seqüência do PRRSV Norte Americano e Eu-ropeu mostra que o sítio de glicosilação ligada a N correspondendo à aspa-ragina 51 da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 também está pre-sente em um isolado representativo do PRRSV Europeu. Neste caso particu-lar, o sítio de glicosilação ligada a N compreende a seqüência "NGT" e aasparagina 51 da seqüência de referência da SEQ ID NO: 1 corresponde àasparagina 53 da SEQ ID NO: 15. Este sítio de glicosilação ligada a N podeser inativado através da substituição dos códons que codificam outros resí-duos de aminoácidos tal como a glutamina ou a alanina pela asparagina 53na seqüência de polinucleotídeo do PRRSV Europeu correspondente. Nes-tes casos, a seqüência de aminoácidos correspodente na variação da prote-ína GP5 do PRRSV Europeu hipoglicosilada compreenderia as seqüênciastal como "QGT", "AGT" ou "XGT", em que X é qualquer aminoácido sem sera asparagina. Estas ou outras variações hipoglicosiladas dos isolados doPRRSV Europeu em que o sítio de glicosilação ligada a N correspondendo àasparagina 51 está inativado podem também ser combinadas com outrasvariações de GP5 hipoglicosiladas em que outros sítios de glicosilação liga-da a N estão inativados.

As proteínas variantes GP5 hipoglicosiladas podem ser codifica-das por vírus PRRS que podem ser utilizados para preparar vacinas vivas,mortas ou atenuadas para a proteção de porcos das infecções causadaspelo PRRSV. Em modalidades preferidas da invenção, as proteínas varian-tes GP5 hipoglicosiladas desta invenção são engenheiradas em clones dePRRSV infecciosos que são capazes de produzir RNA infeccioso do PR-RSV. As descrições de clones infecciosos do PRRSV Norte Americano quepoderiam ser engenheirados para codificar as proteínas variantes GP5 hipo-glicosiladas são encontradas na Patente U.S. N- 6.500.662, Nielsen e ou-tros, J. Virol. 77: 3702-11, 2003 e Truong e outros, Virology 325: 308-19,2004. As seqüências de clones infecciosos do PRRSV Norte Americano quepodem ser submetidas à mutagênese para a obtenção de vírus PRRSV parauso em vacinas incluem, mas não estão limitadas às cepas Norte America-nas NVSL 97-7895 (SEQ ID NO: 16) e à cepa VR-2332 (SEQ ID NO: 17). Asdescrições de clones infecciosos do PRRSV Europeu que poderiam ser en-genheirados para codificar as proteínas variantes GP5 hipoglicosiladas sãoencontradas na Patente U.S. Ns 6.268.199. Em modalidades em que a vaci-na compreende um PRRSV vivo ou atenuado, o sítio de glicosilação ligada aN correspondendo a N44 na proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1(isto é, a seqüência "NLT" nas Figuras 5 e 6) não está inativado uma vezque a glicosilação deste sítio é necessária para a capacidade de infecção doPRRSV. No caso dos isolados do PRRSV Europeu, o sítio de glicosilaçãoligada a N correspondendo a N44 na proteína GP5 de referência da SEQ IDNO: 1 é a seqüência NLT que começa na asparagina 46 da cepa representa-tiva do PRRSV Europeu Lelystad (SEQ ID NO: 15; Figura 6). O sítio de gli-cosilação ligada a N de N46 das cepas do PRRSV Europeu é também ne-cessário para a capacidade de infecção e não é inativado em modalidadesda invenção em que uma vacina viva ou atenuada de PRRSV é utilizada.

Alternativamente, as proteínas variantes GP5 hipoglicosiladaspodem ser introduzidas nos porcos com vacinas de DNA. Tais vacinas deDNA compreendem tipicamente uma molécula de DNA em que um promotorativo em células de mamíferos está ligado de forma operacional ao dito poli-nucleotídeo que codifica a dita variação do polipeptídeo GP5 de PRRSV hi-poglicosilada. Os promotores que podem ser utilizados para controlar a ex-pressão das proteínas variantes GP5 hipoglicosiladas incluem, mas não es-tão limitados ao promotor inicial imediato do CMV (citomegalovírus), ao pro-motor de repetição terminal longa do RSV (vírus do sarcoma de Rous) e aopromotor do antígeno T do SV40 (Vírus de Símios 40). Em certas modalida-des preferidas, este promotor é um promotor do CMV.

Ainda em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado que ex-pressa a proteína variante GP5 hipoglicosilada compreende um vetor viralsem ser o PRRSV. Os vetores virais sem ser o PRRSV incluem, mas nãoestão limitados aos vetores do vírus vaccinia, aos vetores virais de herpessimplex, aos vetores de adenovírus, aos vetores de alfavírus e aos vetoresde TGEV. Tais vetores são descritos em várias publicações tais como asPatentes U.S. N2i 7.041.300 (para vetores de TGEV) e 6.692.750 (para veto-res de alfavírus).

Veículos e adiuvantes terapeuticamente aceitáveis

Na prática da invenção, os polipeptídeos da variação de GP5hipoglicosilada ou os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos da va-riação de GP5 hipoglicosilada podem ser combinados com veículos ou exci-pientes terapeuticamente aceitáveis. Os exemplos não-limitantes de tais veí-culos incluem solução salina fisiológica ou outras soluções salinas similares,proteínas tais como as proteínas da albumina do soro, tampões tais comotampões à base de carbonato, fosfato, fosfonato ou Tris, tensoativos tal co-mo NP40 ou Triton X100 e polímeros de polietileno glicol. Qualquer combi-nação de tais veículos pode ser utilizada nas composições e nos métodosdesta invenção. Um veículo preferido para as composições que compreen-dem vírus PRRSV vivos ou atenuados é o acetato de dl-a-tocoferol em umaconcentração entre 50 até 100 mg/mL.

O uso de adjuvantes nas composições que contêm os polipeptí-deos da variação de GP5 hipoglicosilada ou os polinucleotídeos que codifi-cam os polipeptídeos da variação de GP5 hipoglicosilada também é conside-rado. Tais adjuvantes tipicamente têm natureza aquosa ou oleosa. Os adju-vantes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados ao hidró-xido de alumínio, ao Quil A, a uma interrupção brusca em gel de alumina,aos óleos minerais, aos glicerídeos, aos ácidos graxos, aos subprodutos deácidos graxos, às micobactérias e aos oligodesoxinucleotídeos CpG ou qual-quer combinação dos mesmos. Vários tipos de adjuvantes de CpG que po-dem ser utilizados são descritos nas Patentes U.S. N— 6.977.245 e6.406.705.

O uso de outros adjuvantes que potencializam respostas imuno-lógicas celulares (isto é, potenciadores de subpopulações de células T hel-per (Th.sub.l e Th.sub.2)) também é considerado. Tais adjuvantes incluem,mas não estão limitados a interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL4, IL-5, IL6, IL-12, in-terferon gama (g-IFN ), fator de necrose celular, MDP (muramil dipeptídeo),complexo imuno estimulante (ISCOM) e lipossomos.

A administração da composição pode ser realizada através deinjeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intradermal, injeção paren-teral, injeção intramuscular, injeção isenta de agulha, eletroporação, forne-cimento oral, fornecimento intranasal, fornecimento oronasal ou qualquercombinação dos mesmos. A injeção isenta de agulha é tipicamente realizadacom um dispositivo tal como um injetor Agro-Jet® injector (Medicai Internati-onal Technologies, Montreal, Canadá).

Exemplos

Exemplo 1.

O exemplo a seguir ilustra a construção de vários polinucleotí-deos do PRRSV que codificam várias variações do polipeptídeo GP5 doPRRSV Norte Americano hipoglicosiladas, composições que incluem taispolinucleotídeos que são utilizados para ativar respostas imunológicas me-lhoradas para um antígeno do PRRSV e métodos de utilização dos polinu-cleotídeos e das composições para a ativação de uma resposta imunológicamelhorada em um porco para um antígeno do PRRSV.

MATERIAIS E MÉTODOS

Células, meios e anticorpos. As células MARC-145 foram propa-gadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10%de soro fetal bovino (FBS) e 100 unidades de penicilina, 20 unidades de es-treptomicina e 20 unidades de canamicina por ml_ de meio de cultivo. Estascélulas foram utilizadas para a eletroporação do RNA1 a infecção viral, ocrescimento viral e os ensaios de placas. As células renais de hâmster bebê(BHK-21) foram mantidas em Meio Mínimo Essencial (MEM) com sal de Earlcontendo 5% de PBS e os antibióticos mencionados anteriormente. As célu-las BHK-21 foram utilizadas para a expressão transitória de GP5 seguida porensaios de imunofluorescência (IFA) ou experimentos de marcação radioati-va e de imunoprecipitação. Todas as células foram mantidas a 37°C e ambi-ente de 5% de CO2. Os anticorpos monoclonais de coelho para as proteínasGP5 e M do PRRSV foram gentilmente fornecidos por Carl A. Gagnon (Uni-versity of Quebec, Montreal, Canadá). O anticorpo monoclonal (SDOW17)contra a proteína do nucleocapsídeo (N) foi obtido nos National VeterinaryServices Laboratories (NVSL, Ames, IA, USA). O Alexa-488 anticamundongofoi obtido na Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon, USA).

Manipulação genética dos plasmídeos que codificam GP5 e o clone infeccioso do PRRSV

O clone de cDNA infeccioso do PRRSV de comprimento comple-to (FL12; SEQ ID NO: 16) em pBR322 foi digerido com as enzimas de restri-ção EcoRV e BstZI 7 I e o fragmento de -4,9 kpb abrangendo a maior partedo ORF2, o ORF3-7 completo e a UTR a 3' inteira do PRRSV foi clonado empBR322 utilizando os mesmos sítios de enzimas. Este plasmídeo intermediá-rio serviu como o molde para a mutagênese para a introdução de mutaçõesnos sítios de glicosilação ligada a N potenciais (N34, N44 e N51) dentro deGP5 (Fig. 2). A mutagênese foi realizada utilizando a PCR de extensão desobreposição com iniciadores sintéticos (Tabela 2) utilizando técnicas pa-dronizadas.

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Tabela 2. Iniciadores e suas seqüências utilizadas neste estudo. As seqüên-cias dos códons sublinhadas indicam o sítio da mutação.

O produto da PCR foi digerido com as enzimas de restrição Bs-rG I e BstE II e colocado de volta no plasmídeo intermediário. Os clones con-tendo as mutações desejadas foram identificados e confirmados por se-qüenciamento. A região codificadora inteira de GP5 foi seqüenciada paraassegurar que mutações adicionais não estavam presentes nos clones. Ofragmento EcoRV-Pac I do plasmídeo intermediário contendo mutações naregião codificadora de GP5 foi transferido de volta para o clone de cDNA decomprimento completo utilizando os mesmos sítios das enzimas de restri-ção. A região codificadora de GP5 nos clones de comprimento completo foinovamente seqüenciada com iniciadores internos específicos do PRRSVpara confirmar a presença das mutações.

O GP5 do tipo selvagem e os mutantes individuais foram clona-dos em um vetor bicistrônico em que o GP5 é o primeiro cístron seguido pelosítio de entrada interna de ribossomos (IRES) do vírus da encefalomiocardite(EMCV) e as seqüências codificadoras de M (Fig. 1A). O GP5 de compri-mento completo também foi clonado no vetor controlado pelo promotor doCMV (pcDNA 3.0™, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA)para estudos de complementação. Para esta finalidade, a região codificado-ra de GP5 foi amplificada pela PCR, clonada e seqüenciada.Transcrição e eletroporacão in vitro

Os plasmídeos de comprimento completo foram digeridos comAcll e o DNA Iinearizado foi utilizado como o molde pára gerar produtos datranscrição do RNA com cap utilizando o kit mMESSAGE mMACHINE UltraT7™ seguindo as recomendações do fabricante (Ambion, Inc., Austin, Tx,USA) e como descrito anteriormente. A mistura de reação foi tratada comDNaseI para digerir o molde de DNA e extraída com fenol e clorofórmio efinalmente precipitada com isopropanol. A integridade dos produtos datranscrição in vitro foi analisada através da eletroforese em gel de agaroseglioxal seguida pela coloração com brometo de etídio.

As células MARC-145 foram submetidas à eletroporação comaproximadamente 5,0 μg dos produtos da transcrição in vitro junto com 5,0μg do RNA total isolado das células MARC-145. Aproximadamente 2x106células em 400 μΐ_ de DMEM contendo 1,25% de DMSO foram submetidas apulsos uma vez utilizando o Bio-Rad Gene Pulser Xcell™ (Bio-Rad, Inc.,Hercules, CA, USA) a 250V, 950pF em uma cubeta de 4,0 mm. As célulasforam diluídas em meio de cultivo normal, plaqueadas em uma placa de cul-tura de 60 mm. Uma pequena proporção das células eletroporadas foi pla-queada em uma placa de 24 cavidades para verificar a expressão da proteí-na N 48 h após a eletroporação, que indicaria a replicação do genoma e atranscrição. Uma vez que a expressão da proteína N é confirmada utilizandoo ensaio de imunofluorescência indireto (IFA), o sobrenadante da massa dascélulas eletroporadas na placa de 60 mm foi coletado 48 h após a eletropo-ração, clarificado e passado por células MARC-145 "naíve". As células infec-tadas foram observadas em relação ao efeito citopático (CPE) junto com aexpressão da proteína N utilizando IFA. Os sobrenadantes das células infec-tadas exibindo tanto CPE quanto fluorescência positiva foram consideradoscomo contendo vírus infeccioso. Após a confirmação, o estoque de vírus foicrescido e congelado a -80°C em pequenas alíquotas para estudos adicio-nais. Em todos os experimentos, o genoma do PRRSV do tipo selvagemcontendo FL12 e o genoma do PRRSV defeituoso em relação à polimerasecontendo FL12pol foram utilizados como controles.Marcação radioativa metabólica e análises das proteínas

As células BHK-21 em placas de seis cavidades foram infecta-das com o vírus vaccinia recombinante (vTF7-3) em uma MOI de 3,0 e sub-seqüentemente transfectadas com o DNA do plasmídeo bicistrônico que co-difica GP5 do tipo selvagem ou vários mutantes sob o promotor da RNA po-limerase de 17. A transfecção do DNA foi realizada utilizando Lipofectami-ne2000™ seguindo o protocolo do fabricante (Life Technologies, USA). 16 hapós a transfecção, as células foram lavadas duas vezes com PBS e manti-das sob estarvação em DMEM isento de metionina/cisteína durante uma h emaracadas radioativamente com 0,6 mL de DMEM isento de metioni-na/cisteína contendo 100 μΟ\ de Expre35S 35S Protein Labeling Mix (NENLife Sciences, Boston, MA) por mL de meio durante três horas. Após a mar-cação radioativa, as células foram lavadas em PBS gelado três vezes e osextratos celulares foram preparados em 300 μί de tampão de ensaio de ra-dioimunoprecipitação (RIPA) (10 mM de Tris-HCI pH 8,0, 150 mM de NaCI11% de Triton X-100, 0,1% de SDS1 1% de desoxicolato de sódio e 1x inibidorde protease). Os extratos celulares clarificados foram incubados durante anoite a 40C com anticorpo anti-GP5 ou anti-proteína M de coelho. Uma inter-rupção brusca de aproximadamente 4,0 mg de proteína A sepharose (Phar-macia, Uppsala, Suécia) em 100 μΙ_ de tampão de RIPA foi adicionada e in-cubada adicionalmente durante 2 h. Os complexos imunoprecipitados foramlavados 3 vezes com 500 μΙ_ de tampão de RIPA e utilizados para análisesadicionais.

Para o tratamento com a endoglicosidase H (Endo H), os com-plexos imunoprecipitados foram ressuspensos em 20 μΙ_ de tampão de des-naturação 1x (0,5% de SDS, 1,0% de β-mercaptoetanol) e fervidos durante10 min. O sobrenadante foi coletado, ajustado ao tampão G5 1x (0,05 M decitrato de sódio pH 5,5) e incubado durante 16 h a 37°C com 100 unidadesde Endo H (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). As amostras de con-trole não digeridas foram processadas similarmente, mas a Endo H não foiadicionada. Após a digestão com a Endo H, as amostras foram misturadascom um volume equivalente de tampão de amostra de SDS-PAGE 2x, fervi-das durante 5 min e resolvidas por PAGE com 12% de SDS sob condiçõesdesnaturantes junto com o marcador de proteína (Protein Plus PrecisionStandard, Bio-Rad, lnc). O gel foi fixado com 10% de ácido acético durante15 min, lavado três vezes com água, tratado com 0,5 M de salicilato de sódiodurante 30 min, seco e finalmente exposto ao filme de raio X a -70°C. Para adigestão de peptídeos com N-Glicosidase F (PNGase F) (New England Bio-labs, Inc), os complexos imunoprecipitados foram suspensos em tampão G71x (0,05 M de fosfato de sódio pH 7,5, 1,0% de NP-40) e a digestão foi reali-zada através da incubação durante 16 h a 37°C com 2 unidades da enzima.Para verificar a síntese de GP5 na presença de tunicamicina (Sigma, St.Louis, MO), as células transfectadas foram tratadas com 2,0 μg de tunicami-cina por ml_ de meio durante uma hora e a marcação radioativa foi realizadana presença do fármaco durante 3 h como anteriormente.

Para a obtenção de GP5 radiorrotulada expressa por virions ex-tracelulares ou por vírus intracelulares, as células MARC-145 foram infecta-das com PRRSVs do tipo selvagem ou mutantes. 48 horas após a infecção,as células foram mantidas em jejum durante uma hora e radiorrotuladas com100 pCi de Expre35S 35S Protein Labeling Mix por mL de meio contendo 90%de DMEM isento de metionina/cisteína e 10% de DMEM regular durante 24h. Após a marcação, o sobrenadante de cultura foi coletado, clarificado emrelação aos restos celulares e os virions extracelulares foram peletizados a100.000x g durante 3 h a 4°C. As pelotas virais foram ressuspensas em 200pL de tampão de RIPA, imunoprecipitadas com o anticorpo anti-GP5 e asproteínas foram verificadas com ou sem o tratamento com a Endo H. Para aimunoprecipitação da GP5 expressa por vírus intracelulares, a infecção foirealizada como anteriormente e 24 h após a infecção, as células foram sub-metidas ao jejum durante uma hora, radiorrotuladas como anteriormente du-rante 2 h antes da preparação dos extratos celulares.Cinética de crescimento viral e ensaio de placas

As células MARC-145 foram infectadas com PRRSV mutante oudo tipo selvagem a uma MOI de 3,0 UFP por célula e incubadas a 37SC emuma incubadora. Em vários pontos de tempo após a infecção, foram coleta-das alíquotas dos sobrenadantes de cultura das células infectadas e o títuloviral nos sobrenadantes foi determinado e expresso por 50% da dose infec-ciosa na cultura de tecido por mL (TCID50/mL). A cinética do crescimentoviral foi realizada três vezes. Para verificar a morfologia das placas dos vírusmutantes, o ensaio de placas foi realizado utilizando células MARC-145. Ascélulas foram infectadas com diluições em série de 10 vezes de vírus indivi-duais durante uma hora a 37°C. A monocamada de células infectadas foilavada com PBS e coberta com DMEM-5% de FBS contendo 0,8% de aga-rose Seaplaque (FMC Bioproducts, Rockland, ME USA). Após 96 h, os plu-gues de agarose foram removidos e a monocamada de células foi incubadacom solução de coloração (20% de Formaldeído 9,0% de Etanol e 0,1% deCristal violeta) durante 30 min à temperatura ambiente. As células foramgentilmente lavadas com água para remover o excesso de corante e secasao ar para verificar e contar as placas.Complementacão da recuperação do vírus através da expressão da GP5 dotipo selvagem em trans

As células BHK-21 foram transfectadas com pcDNA-GP5. 40 hapós a transfecção, as células foram coletadas e submetidas à eletropora-ção com produtos da transcrição in vitro com cap derivados do cDNA dePRRSV de comprimento completo que codifica a GP5 mutante. As célulassubmetidas à eletroporação foram diluídas com meio fresco e plaqueadasem uma placa de 6 cavidades. O sobrenadante das células eletroporadas foicoletado 48 h após a eletroporação, centrifugado para remover os restoscelulares e utilizado para infectar células MARC-145 "naíve". As célulasMARC-145 infectadas foram verificadas 48 h após a infecção em relação àexpressão da proteína N por IFA como descrito anteriormente. O número decélulas positivas foi contado para determinar o número de pseudopartículasproduzidas no sobrenadante. O número médio de células positivas foi calcu-lado partindo de três experimentos independentes e foi apresentado na for-ma do número de pseudopartículas produzidas por micrograma do RNAtranscrito in vitro transfectado nas células.Ensaios de neutralização do soro (SN)

O título dos anticorpos neutralizadores de PRRSV em uma a-mostra de soro foi determinado utilizando o ensaio de neutralização com fo-calização fluorescente descrito anteriormente. As diluições em série dos so-ros de teste foram incubadas durante 60 min a 37°C na presença de 200TCID50 do vírus de desafio, que consistia em FL12 (PRRSV do tipo selva-gem) ou qualquer um dos vírus que codificam a GP5 mutante, FL-N34A, FL-N51A e FL-N34/51A em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo5% de soro fetal de bezerro. As misturas foram adicionadas a placas paramicrotitulação de 96 cavidades contendo células MARC-145 confluentes queforam semeadas 48 h antes. Após a incubação durante 24 h a 37°C em umaatmosfera umedecida contendo 5% de CO2, as células foram fixadas durante10 min com uma solução de 50% de metanol e 50% de acetona. Após lava-gem vigorosa com PBS, a expressão da proteína N do PRRSV foi detectadacom o anticorpo monoclonal SDOW17 utilizando uma diluição de 1:500, se-guido pela incubação com IgG anticamundongo de cabra conjugada comFITC (Sigma, St.Louis, MO, USA) a uma diluição de 1:100. Os títulos deneutralização foram expressos como o coeficiente recíproco da maior dilui-ção que inibia 90% dos focos presentes nos poços de controle.

Inoculacão experimental de porcos com mutantes de GP5 e PRRSV do tiposelvagem

Os estoques com títulos altos (obtidos através de 3 passagensem células MARC 145) dos vírus mutantes de GP5 (FL-N34A, FL-N51A eFL-N34/51A) e o FL12 (PRRSV do tipo selvagem) foram utilizados para in-fectar porcos jovens. Porcos recentemente desmamados de vinte um dias deidade foram obtidos de um rebanho isento de agentes patogênicos específi-cos com um registro certificado de ausência de infecção pelo PRRSV. Todosos animais eram negativos em relação a anticorpos anti-PRRSV o que foitestado por ELISA (Iddex Labs, Portland, ME). Três porcos por grupo foraminfectados còm PRRSV do tipo selvagem FL12 ou FL-N34A, FL-N51A e FL-N34/51A mutantes. Em todos os casos, o inóculo consistia em 105 TICD50diluídos em 2 mL e administrado de forma intramuscular no pescoço. Astemperaturas retais dos animais inoculados foram monitoradas durante 15dias após a inoculação (PI). A viremia foi medida através do isolamento re-guiar em células MARC 145 nos dias 4, 7 e 14 PI. As amostras de soro fo-ram retiradas semanalmente durante um período total de 49 dias PI. As a-mostras de soro foram utilizadas para a detecção de títulos de neutralizaçãocruzada homólogos e heterólogos para cada um dos PRRSVs mutantes oudo tipo selvagem.

RESULTADOS

Expressão e caracterização de GP5 do PRRSV

O GP5 da cepa do PRRSV 97-7895 possui três supostos sítiosde glicosilação (N34, N44 e N51). Para verificar o padrão de glicosilação deGP5, foi primeiramente gerado um vetor bicistrônico em que as regiões codi-ficadoras das proteínas GP5 e M que flanqueiam o IRES do EMCV foramcolocadas sob o controle do promotor da RNA polimerase de T7 (Figura 1A).A base lógica para a construção do vetor bicistrônico é que as proteínasGP5 e M são conhecidas (para LDV e EAV) ou postuladas (para PRRSV)como interagindo uma com a outra e que tais interações podem ser impor-tantes para o dobramento da proteína, a glicosilação, o transporte intracelu-lar e/ou outra atividade biológica de GP5.

A expressão transitória de GP5 e M através da transfecção doplasmídeo bicistrônico seguida pela marcação radioativa e a imunoprecipita-ção com o anticorpo anti-GP5 revelou duas espécies de proteínas principais.As espécies de proteínas que migram com uma massa de -25,5 kDa são aforma totalmente glicosilada de GP5 (Figura 1B, faixa 2). Uma vez que cadaglicosilação ligada a N adiciona -2,5 kDa de massa molecular a uma proteí-na, isto indica que todos os três sítios de glicosilação potenciais são possi-velmente utilizados para a glicosilação de GP5. A espécie de proteína de19,0 kDa é a proteína M viral uma vez que era imunoprecipitada apenas como anticorpo anti-M (faixa 7). Os resultados indicam que as proteínas GP5 eM interagem uma com a outra nas células que expressam ambas as proteí-nas. Após o tratamento com a Endo H, uma enzima que remove cadeias deoligossacarídeos do tipo com alto teor de manose, o tamanho da GP5 foireduzida para -18 kDa, enquanto que o tamanho da proteína M permaneciainalterado (faixa 3). O tratamento de GP5 com a PNGase F (faixa 4), umaenzima que remove todos os tipos de açúcares da estrutura da proteína ou asíntese da GP5 na presença de tunicamicina (faixa 5) resultou em uma pro-teína que migrou com mobilidade eletroforética ligeiramente maior que a pro-teína com tratamento com a Endo-H. Isto é esperado uma vez que o trata-mento com a tunicamicina ou a digestão com a PNGase F geraria proteínasnão-glicosiladas enquanto que o tratamento com a Endo-H resultaria em pro-teínas que mantêm os resíduos de N-acetilglucosamina em cada um dossítios de glicosilação ligada a N. Deve-se observar que uma espécie de pro-teína notória de massa molecular de -30 kDa foi imunoprecipitada com oanticorpo anti-M. A identidade desta proteína não é conhecida, mas poderiaser uma proteína celular que interage com a proteína M.

Os resultados dos estudos anteriores sugerem que as formasnão-glicosiladas e totalmente glicosiladas de GP5 possuem tamanhos mole-culares aparentes de 18,0 kDa e 25,5 kDa, respectivamente. Parece quetodos os três sítios de glicosilação potenciais são utilizados para gerar aforma totalmente glicosilada de GP5. As porções de glicano adicionados aestes sítios são do tipo de alto conteúdo de manose uma vez que são sensí-veis à digestão pela Endo H. Em adição, os resultados indicam que ambasas formas não glicosiladas e totalmente glicosiladas de GP5 parecem intera-gir com a proteína M.

Análise dos sítios de qlicosilacão ligada a N utilizados para a qlicosilacão deGP5

Para determinar mais precisamente se todos ou alguns dos sí-tios de glicosilação ligada a N potenciais na GP5 são utilizados para a adi-ção de grupamentos de açúcar, foi gerada uma série de mutantes no plas-mídeo bicistrônico em que todos os três sítios de glicosilação potenciaisN34, N44 e N51 (Figura 2A) foram alterados para alaninas individualmenteou em várias combinações (Figura 2B). Em células transfectadas com plas-mídeo, as proteínas foram radiorrotuladas e imunoprecipitadas com o anti-corpo anti-GP5. Os complexos imunológicos foram deixados não tratados ouforam tratados com a Endo H e verificados por SDS-PAGE. Como pode servisto partindo dos dados apresentados na Figura 2C, as proteínas GP5 mu- tantes que carregam mutações isoladas (N34A, N44A ou N51A) migraramcomo as espécies de proteínas de aproximadamente 23,0 kDa (faixas 4, 6 e8, ponta de seta). Após o tratamento com a Endo H, estas proteínas migra-ram como as espécies de proteínas de -18,0 kDa (faixas 5, 7 e 9, respecti-vamente) similares à GP5 do tipo selvagem após o tratamento com a EndoH (faixa 3). As diferenças menos importantes na mobilidade eletroforéticadas proteínas é mais provavelmente um reflexo do fato de que a proteína dotipo selvagem manteria todos os três resíduos de N-acetilglucosamina apóso tratamento com a Endo H quando comparada com os mutantes isoladosque conteriam dois tais resíduos. Os duplo mutantes (N34/44A, N44/51A eN34/51A) produziram espécies de proteínas que migraram próximas à prote-ína de -20,5 kDa (faixas 10, 12 e 14) e após o tratamento com a Endo H1 otamanho das proteínas foi reduzido para 18,0 kDa (faixas 11, 13 e 15). Otriplo mutante (N34/44/51A) gerou uma proteína que migrou como a proteínade 18,0 kDa (faixa 16) e era resistente à digestão com a Endo H (faixa 17).

Assim, partindo dos estudos de mutação anteriores, é evidenteque todos os três sítios de glicosilação potenciais sejam utilizados para aglicosilação para gerar a GP5 do PRRSV totalmente madura. Parece quetodos os três sítios de glicosilação são modificados por porções de glicanodo tipo com alto conteúdo de manose.

Recuperação do vírus PRRSV infeccioso com mutantes de GP5

Para avaliar a importância da glicosilação ligada a N na produ-ção de PRRSV infeccioso, as regiões codificadoras das proteínas GP5 mu-tantes foram inseridas no clone de cDNA de comprimento completo. Os pro-dutos da transcrição in vitro com cap produzidos partindo dos clones foramsubmetidos à eletroporação em células MARC-145 e foi verificada a produ-ção de PRRSV infeccioso. Os resultados dos presentes inventores mostra-ram que o vírus infeccioso era facilmente recuperado das células eletropora-das com produtos da transcrição de comprimento completo contendo muta-ções em N34, N51 e N34/51. Entretanto, sob condições similares de recupe-ração do vírus, tentativas repetidas de recuperação de outros vírus mutantesnão foram bem-sucedidas. Embora a cinética de crescimento dos vírus re-20 cuperados fosse similar àquela do vírus do tipo selvagem, o rendimento totaldos vírus FL-N34A e FL-N51A contendo mutações em N34 e N51 era deaproximadamente um Iog menor nas células MARC-145 enquanto que doFL-N34/51A com duplas mutações (N34/51A) era quase 1,5 Iog menor que odo PRRSV do tipo selvagem (Fig. 3A). A amplificação por RT-PCR do RNAde células infectadas seguida pelo seqüenciamento de nucleotídeos indicavaque estes vírus são estáveis, continham as mutações desejadas e nenhumaoutra mutação foi detectada na região de GP5 inteira (dados não mostra-dos).

O ensaio de placas virais foi realizado em células MARC-145para monitorar o fenotipo de placas de vírus mutantes. As placas geradaspelo PRRSV do tipo selvagem eram claras e distintas enquanto que os vírusmutantes produziam placas que tinham fenotipos diferentes. Os vírus FL-Ν34Α, FL-N51A e FL-N34/51A geravam placas que eram menos distintas emuitas das células dentro da placa pareciam normais (Figura 3B, seta aber-ta). Em adição, FL-N51A, FL-N34/51A produziam algumas placas em que osvírus falhavam em clarear a monocamada de células (Figura 3B, seta preen-chida). Estes dados indicam que os vírus mutantes recuperados são na ver-dade menos citopáticos quando comparados com o PRRSV do tipo selva-gem.

Uma vez que não era possível recuperar PRRSV infeccioso comos moldes mutantes FL-N44A, FL-N31/44A, FL-N44/51A e FL-N31/44/51A1 épossível que mutações na região codificadora de GP5 possam ter afetadoalgumas outras funções dos moldes de RNA1 tal como o empacotamento doRNA genômico dentro de partículas. Para investigar isso, foi verificado quaiscélulas expressando a GP5 do tipo selvagem em trans poderia sustentar oempacotamento de moldes de RNA mutantes que são de outra maneira de-feituosos na produção de PRRSV infeccioso. As células BHK-21 transfecta-das com pcDNA-GP5 foram submetidas à eletroporação com produtos datranscrição in vitro e 48 h após a eletroporação, os sobrenadantes de culturaforam coletados e utilizados para infectar células MARC-145 "naíve" paradeterminar a produção de pseudopartículas de PRRSV. Se as pseudopartí-cuias fossem geradas, seria esperada a observação da expressão da proteí-na N no caso de células MARC-145 infectadas. A expressão de N é possívelapenas quando células MARC-145 "naíve" recebem o genoma de RNA mu-tante encapsulado de comprimento completo que inicia a replicação após aentrada das pseudopartículas nas células. De todos os mutantes que nãopodiam ser recuperados anteriormente, foi possível recuperar pseudopartí-culas contendo dois genomas mutantes de comprimento completo (FL-N44Ae FL-N34/44A) (Figura 3C). Cada célula com fluorescência verde na culturainfectada com o vírus mutante representa uma pseudopartícula infecciosa.Uma vez que estas partículas contêm apenas a GP5 do tipo selvagem fun-cional no envelope, mas contém as seqüências codificadoras para a GP5mutante não funcionais no genoma, não podem produzir partículas infeccio-sas para o espalhamento para as células circundantes. Várias tentativas pa-ra a recuperação de partículas pseudoinfecciosas com outros moldes mutan-tes (FL-N44/51A e FL-N31/44/51A) não foram bem sucedidas.

Uma estimativa quantitativa do número de pseudopartículas in-fecciosas produzidas partindo destes experimentos sugere que aproxima-damente 1000 partículas são produzidas por micrograma de RNA mutanteeletroporado nas células (Figura 3D). Isto é aproximadamente 100 vezesmenos que o obtido com o RNA que codifica a GP5 do tipo selvagem. A pro-dução de tais níveis baixos de pseudopartículas infecciosas poderia ser cau-sada pelo fato de que apenas aproximadamente 5-10% das células que ex-pressavam a GP5 do tipo selvagem receberam os produtos da transcriçãode comprimento completo como é observado pela expressão da proteína Nnestas células. É também possível que os níveis baixos de expressão daGP5 do tipo selvagem nas células transfectadas possam ter contribuído paraos níveis baixos de produção destes pseudovirions.

Verificação da GP5 incorporada nos vírus mutantes e das expressas nascélulas infectadas

Para determinar a natureza da proteína GP5 incorporada nosvirions infecciosos produzidos partindo de células transfectadas, foram gera-dos PRRSV radiorrotulados partindo de células infectadas com os vírus dotipo selvagem e mutantes. Os virions extracelulares presentes no sobrena-dante de cultura foram peletizados por ultracentrifugação e a GP5 presentenestes virions foram verificadas por imunoprecipitação utilizando anticorpoanti-GP5 e a análise eletroforética subseqüente. Os resultados mostram quea GP5 do tipo selvagem incorporada nos virions migrava na forma de umabanda amplamente difusa de uma espécie de proteína de -25-27 kDa (Figu-ra 4A, faixa 1), que é parcialmente resistente à digestão com a Endo H (faixa2). A GP5 mutante (N34A e N51A) incorporada nos virions era sensível aendo H. Com base no tamanho dos produtos gerados após a digestão com aEndo H, parece que apenas uma porção de glicano nestes mutantes comum único sítio é sensível enquanto que o outro é resistente. Em contraste, aGP5 duplo mutante (N43/51A) era resistente a endo H. Além disso, a diges-tão com a Endo da GP5 de vírus mutantes também produziu quantidadesmuito pequenas da estrutura da proteína GP5, indicando que estes vírusincorporam proteínas GP5 que contêm porções de glicano resistentes a en-do H assim como sensíveis a endo H.

Uma vez que nas células transfectadas com o vetor bicistrônico,as proteínas GP mutantes eram completamente sensíveis a endo H (Figuras1 e 2), foi surpreendente a observação de que a GP5 nos virions de PRRScontinham formas fortemente resistentes a endo H. Para verificar se as for-mas resistentes a endo H da proteína são também sintetizadas nas célulasinfectadas, as células MARC-145 infectadas com o PRRSV do tipo selvagemou mutante foram radiorrotuladas, as proteínas GP foram imunoprecipitadascom anticorpo anti-GP5 e analisadas por eletroforese com ou sem a diges-tão com a Endo H. Os resultados de tal experimento são mostrados na Figu-ra 4B. A maior parte da GP5 do tipo selvagem continha glicanas resistentesa endo H em todos os três sítios (faixas 2 e 3), enquanto que os dois mutan-tes isolados continham glicanas resistentes a endo H somente em um sítio(faixas 4-7). Alguns das porções de glicana no duplo mutante eram resisten-tes enquanto outros eram sensíveis a endo H (faixas 8 e 9). Embora o pa-drão de resistência a endo H seja similar ao que é observado para a GP5associada ao virion, é diferente do que é observado nas células que expres-sam ambas as proteínas GP5 e M (Figuras 1 e 2). Estes resultados indicamque outras proteínas virais podem desempenhar uma função na modificaçãoadicional de glicanas na GP5. Influência da hipoglicosilação de GP5 sobre acapacidade dos PRRSVs de serem neutralizados por anticorpos específicos.

O nível de glicosilação de glicoproteínas virais que estão envol-vidas na interação com receptores virais é conhecido por afetar a capacida-de dos virions de reagirem com anticorpos neutralizadores de vírus. Paratestar se este fenômeno ocorre no caso do PRRSV, os mutantes de GP5 doPRRSV com padrões de glicosilação alterados (FL-N34A, FL-N51A e FL-N34/51A) foram comparados com o PRRSV do tipo selvagem (FL12) emrelação a sua capacidade de serem neutralizados pelo anti-soro convales-cente. Para isto, foram utilizados anti-soros convalescentes (47 dias p.i.) de4 animais que foram infectados com o PRRSV do tipo selvagem. Doses simi-lares (2.000 TCID50) de mutantes de GP5 do PRRSV infecciosos (FL-N34A,FL-N51A e FL-N34/51A) assim como do PRRSV do tipo selvagem derivadodo clone infeccioso (FL12) foram utilizadas como o vírus de desafio nos en-saios de neutralização do soro seguindo o protocolo de ensaio padronizadodos presentes inventores e o conjunto de 4 soros anti-PRRSV do tipo selva-gem (FL12) utilizado como referência. A Tabela 3 mostra os títulos de neu-tralização do soro de ponto final obtidos. Normalmente, uma amostra de soroconvalescente do PRRSV do tipo selvagem coletada 47-54 dias p.i. contémníveis moderados de atividade de neutralização do PRRSV do tipo selvagem(1:8 até 1:32, Tabelas 3 e 4), refletindo a qualidade relativamente fraca etardia da resposta de anticorpos neutralizadores que é típica de infecçõescom o PRRSV do tipo selvagem. Entretanto, o uso de mutantes de PRRSVhipoglicosilados (que não possuem um ou dois grupamentos de glicano noectodomínio da GP5) como o vírus de desafio nos ensaios de SN parece teraumentado significativamente o ponto final dos soros de referência, com amelhoria do título de ponto final variando de seis até vinte e duas vezes (Ta-bela 3). Esta observação sugere claramente que a remoção de um e particu-larmente dois, dos grupamentos de glicano aumenta a acessibilidade do epi-topo de neutralização aos anticorpos específicos. Estes resultados parecemindicar a presença de uma quantidade significativa de anticorpos neutraliza-dores para PRRSV nos soros convalescentes infectados com o PRRSV dotipo selvagem que de outra maneira seria indetectável por causa do uso típi-co do PRRSV do tipo selvagem contendo a GP5 totalmente glicosilada emensaios de SN.Tabela 3. Efeito da alteração do padrão de glicosilação da GP5 do PRRSVsobre a capacidade do virion infeccioso de reagir com anticorpos neutraliza-dores. Os números na Tabela 3 correspondem à diluição do ponto final in-versa exibindo neutralização (ponto final de SN).

Soro de animais infectados com 105 TCID50 do PRRSV do tipo selvagem FL12 Cepa de PF ÍRSV utilizada como o desafio para o teste de SN <table>table see original document page 48</column></row><table>

Influência da hipoqlicosilacão de GP5 sobre a capacidade do PRRSV de in-duzir anticorpos neutralizadores in vivo

Um efeito notável que foi relatado quando a remoção de carboi-dratos de uma glicoproteína do envelope viral leva à produção de altos títu-los de anticorpos neutralizadores contra o vírus mutante quando este mutan-te é utilizado para a inoculação in vivo do hospedeiro; em alguns casos indu-zindo também títulos maiores de anticorpo para o vírus do tipo selvagem queo próprio vírus do tipo selvagem. Foram infectados grupos de porcos comdoses idênticas do PRRSV do tipo selvagem FL12 ou de cada um dos mu-tantes com padrões de glicosilação alterados. De forma interessante, a ava-liação clínica/virological da infecção através da avaliação da temperaturaretal e da avaliação da viremia nos dias 4, 7 e 10 p.i. indicaram um padrãosimilar de infecção em todos os grupos como descrito anteriormente paraFL12 sem evidência de atenuação ou exacerbação de virulência para qual-quer um dos mutantes (dados não mostrados). Entretanto, a amostragemseqüencial do soro destes animais ao longo de todo um período de 48 diasindicou diferenças pronunciadas entre o PRRSV do tipo selvagem e os mu-tantes em relação a sua cinética de indução de uma resposta de anticorposneutralizadores para PRRSV (Tabelas 4A e 4B). Os mutantes desenvolve-ram uma resposta de anticorpos neutralizadores homóloga mais cedo e maisrobusta que a desenvolvida pelo PRRSV do tipo selvagem, até o ponto emque, no caso dos mutantes, a natureza caracteristicamente lenta e escassada resposta de anticorpos neutralizadores de PRRSV parece ter sido corrigi-da (Tabela 4B). A cinética de aparecimento de anticorpos neutralizadoreshomólogos para os mutantes (Tabela 4B) indica uma soroconversão de anti-corpos neutralizadores mais regular coerente com a descrita para outras in-fecções virais tal como do vírus influenza ou da Pseudorraiva, mas não parao PRRSV. É de importância máxima o fato de que a infecção com os mutan-tes de glicosilação de GP5 induzia uma resposta de anticorpos neutralizado-res específica ao PRRSV do tipo selvagem que é significativamente maiorque a resposta com o próprio PRRSV do tipo selvagem. Os vírus mutantesFL-N34 e FL-N51A induziam níveis cinco vezes maiores (p<0,05) de título deanticorpos neutralizadores contra o PRRSV do tipo selvagem que o próprioPRRSV do tipo selvagem enquanto que o mutante FL-N34/51 induziu umtítulo seis vezes maior (p<0,01) de anticorpos neutralizadores para o PRRSVdo tipo selvagem que o próprio PRRSV do tipo selvagem (Tabela 4B).

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Tabela 4A

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Tabela 4B

Tabela 4A. Efeito da alteração do padrão de glicosilação da GP5 do PRRSVsobre a capacidade das cepas de PRRSV de indução de anticorpos neutrali-zadores para o PRRSV do tipo selvagem (4A) ou para a cepa homóloga in-fectante (4B) (*) Os números nas Tabelas 4A e B correspondem à médiageométrica do ponto final de SN para o grupo (n=3).DISCUSSÃO

No presente estudo, foi verificada" a influência da glicosilação deGP5 do PRRSV na recuperação do vírus infeccioso, sua função na capaci-dade dos vírus mutantes de serem neutralizados por anticorpos e na induçãode anticorpos neutralizadores in vivo. Foi descoberto que todos os três sítiosde glicosilação potenciais (N34, N44 e N51) na GP5 são utilizados para aadição de porções de glicano. Os resultados dos presentes inventores reve-lam que a adição de glicano no sítio N44 é mais crítica para a recuperaçãode vírus infeccioso. Além disso, os resultados dos presentes inventores mos-tram que os PRRSVs contendo formas hipoglicosiladas da GP5 são inten-samente sensíveis à neutralização por anticorpos e que os vírus mutantesinduzem níveis significativamente maiores de anticorpos neutralizadores nãosomente para os vírus mutantes homólogos, mas também para o PRRSV dotipo selvagem.

A confirmação de que todos os três sítios de glicosilação ligadaa N potenciais são utilizados para a adição de glicano na GP5 foi fornecidaatravés da utilização de mutantes com alterações em sítios isolados ou múl-tiplos (Figura 2). Estudos bioquímicos mostraram que a proteína GP5 doPRRSV quando co-expressa com a proteína M nas células transfectadas,contém glicanas do tipo de alto conteúdo de manose sensíveis a endo Η. Aobservação de que a maior parte da GP5 incorporada nos virions é resisten-te a endo H (Figura 4A) enquanto que a GP5 expressa na presença da pro-teína M nas células transfectadas é completamente sensível a endo H, éintrigante. É possível que a GP5 quando expressa na presença da proteínaM nas células transfectadas, se acumule principalmente no RE ou na regiãode cis-GoIgi e, portanto, permanece sensível a endo H. Entretanto, nas célu-las infectadas pelo PRRSV, a GP5 pode interagir com proteínas virais adi-cionais e o transporte da GP5 além do RE ou do cis-GoIgi é facilitado atra-vés da formação de complexos com as outras proteínas virais. De forma co-erente com esta interpretação, foi observado que nas células infectadas como PRRSV do tipo selvagem ou mutante, a proteína GP5 é também resistentea endo H. Foi sugerido que a GP5, que é sintetizada no RE nas células in-fectadas, fosse transportada para as regiões mediai- e/ou trans-GoIgi onde amaior parte das moléculas de GP5 adquire resistência a endo H antes deserem incorporadas nos virions de PRRSV. Vários estudos com arterivírusincluindo o PRRSV sugerem que a GP5 e a proteína M formem um hetero-dímero, que pode desempenhar uma função chave na capacidade de infec-ção viral. No EAV e no LDV, foi demonstrada a interação direta da GP5 e aproteína M através da formação de pontes dissulfeto. Tais interações podemocorrer antes do processamento adicional de cadeias laterais de oligossaca-rídeos ligados a N, presumivelmente antes da GP5 ser transportada parafora do RE ou do compartimento de cis-Golgi.

É interessante observar que o padrão de resistência a endo H daGP5 incorporada nos virions do tipo selvagem e mutantes é diferente. Embo-ra a maior parte das moléculas de GP5 no PRRSV do tipo selvagem fosseresistente a endo H, a maioria das moléculas de GP5 nos virions mutantesem um único sítio (FL-N34A e FL-N51A) era sensível a endo H (Figura 4A).Além disso, das duas porções de glicanas nestes mutantes, apenas um erasensível enquanto o outro era resistente. O virion duplo mutante (FL-N34/51A) também incorporava a GP5 que continha glicanas, das quais al-gumas também eram sensíveis a endo H. Estes dados são coerentes com ainterpretação de que os virions de PRRSV do tipo selvagem assim comomutantes incorporam uma população mista de moléculas de GP5 que con-têm porções de glicano diferentes em sítios diferentes. Estudos anterioresdemonstrando a incorporação de formas diferentemente glicosiladas de GP5nos virions de PRRSV do tipo selvagem fortalecem adicionalmente a inter-pretação dos presentes inventores. Partindo do padrão de sensibilidade aendo H da GP5 incorporada nos virions, é tentador especular que o sítio N44pode conter as glicanas resistentes a endo H, embora algumas moléculas deGP5 com glicanas sensíveis a endo H neste sítio fossem incorporadas nosvirions. O fato de que este padrão não usual de glicanas em vários sítios naGP5 e da incorporação de várias formas de GP5 nos virions possui qualquerrelevância para o padrão da resposta imunológica observada em animaisinfectados pelo PRRSV precisa ser investigado.

Em um estudo recente, foi mostrado que dos dois sítios de glico-silação ligada a N (N46 e N53) na GP5 do PRRSV Lelystad, a glicosilaçãodo resíduo N46 era enormemente necessária para a produção de partículasvirais. O rendimento de vírus infeccioso foi reduzido em aproximadamente100 vezes com a mutação em N46. Os presentes resultados sugerem que aadição de glicano em N44 (para o PRRSV Norte Americano) é absolutamen-te essencial para a recuperação do PRRSV infeccioso. É possível então queos isolados Europeus e Norte Americanos do PRRSV possam de algumamaneira diferir em relação aos seus requerimentos para a glicosilação ligadaa N para a produção de vírus infecciosos. Sob este aspecto, deve ser obser-vado que o vírus Lelystad contém apenas dois sítios de glicosilação ligada aN enquanto que o isolado Norte Americano que foi utilizado neste estudocontém três tais sítios.

A GP5 é a glicoproteína mais importante do PRRSV envolvidana produção de anticorpos neutralizadores e imunidade protetora para oPRRSV. Os resultados dos presentes inventores revelam que a ausência deglicanas nos resíduos 34 e 51 no ectodomínio da GP5, embora gere mutan-tes de PRRSV viáveis, aumenta tanto a sensibilidade destes mutantes àneutralização por anticorpos assim como a imunogenicidade do epitopo deneutralização próximo. O efeito imediato da ausência de glicanas na GP5 dePRRSVs mutantes foi a maior sensibilidade dos vírus à neutralização porsoros convalescentes de porcos infectados com o PRRSV do tipo selvagem(Tabela 3). Estudos com HIV-1 e SIV mostraram que a aquisição ou a remo-ção de glicanas nas alças variáveis de gp160 modificam a sua sensibilidadeà neutralização. Portanto, foi postulado que as glicanas desempenham pelomenos dois tipos de funções essenciais durante a biossíntese da glicoprote-ína do envelope viral. Em um caso, a ausência de glicanas acarreta em de-feitos da glicoproteína e assim, na viabilidade global da cepa viral. Foi postu-lado que as glicanas em N44 da GP5 do PRRSV têm uma função similar. Nosegundo caso, as glicanas servem potencialmente para proteger as proteí-nas virais contra a neutralização por anticorpos. Para a GP5 do PRRSV1 asglicanas em N34 e N51 podem ter uma função similar. No caso do HIV, a"proteção das glicanas" é postulada como sendo um mecanismo primáriopara explicar a evasão da resposta imunológica neutralizadora, garantindoassim a persistência in vivo do HIV. Isto incita a deduzir algumas compara-ções paralelas com o PRRSV. A infecção com o PRRSV, que é conhecidapor persistir durante vários meses nos animais individuais, apresenta umcomportamento não usual em termos de indução de uma resposta imunoló-gica neutralizadora específica ao vírus. É bem estabelecido que os animaisinfectados com o PRRSV levam geralmente mais que o tempo normal paraestabelecer uma resposta de anticorpos neutralizadores para PRRSV detec-tável. Uma vez estabelecida, esta resposta neutralizadora do PRRSV é fracae varia significativamente de animal para animal. O retardo na resposta deanticorpos neutralizadores foi postulado como sendo causado pela presençade um epitopo de atração imunodominente próximo (posições de aminoáci-dos 27 até 30), que evoca uma resposta imunológica não protetora precocerobusta que mascara e/ou retarda a resposta para o epitopo neutralizador(posições de aminoácidos 37 até 45) (26, 38). Embora esta seja uma expli-cação plausível para a qualidade atípica da resposta de anticorpos neutrali-zadores para PRRSV, precisa ainda ser testada. No laboratório dos presen-tes inventores, foi provado que a deleção do epitopo de atração é coerente-mente letal para a recuperação do PRRSV infeccioso (Ansari e outros, da-dos não publicados) tornando assim difícil testar esta hipótese.

É possível que um mecanismo alternativo ou complementar paraexplicar a natureza peculiar da resposta de neutralização do PRRSV pudes-se ser previsto pelo fenômeno de "proteção das glicanas" proposto para HIVe SIV. O uso de PRRSVs mutantes que não possuem um ou dois grupamen-tos de glicano nos presentes estudos fornece evidência pela primeira vez dapresença de grandes quantidades de anticorpos neutralizadores de PRRSVnos soros de animais infectados pelo PRRSV do tipo selvagem que eram deoutra maneira indetectáveis por causa do uso do PRRSV do tipo selvagemnos ensaios de SN. Os anticorpos neutralizadores de PRRSV1 embora pre-sentes na resposta do hospedeiro, são incapazes de reagir com os virionsinfectantes do PRRSV do tipo selvagem por causa do bloqueio ou da prote-ção do epitopo de neutralização pelos grupamentos de glicano na GP5.

Um precedente importante para escapar da neutralização pelaglicosilação de glicoproteínas nos arterivírus foi descrito para o vírus queeleva a Iactato desidrogenase (LDV). O LDV é altamente resistente à neutra-lização por anticorpos por causa da forte proteção pelas glicanas de sua gli-coproteína principal, VP-3, entretanto, certas cepas de LDV que ocorremnaturalmente são altamente susceptíveis à neutralização, por causa da per-da dos dois sítios de glicosilação no ectodomínio da VP-3. De maneira inte-ressante, este fenotipo de sensibilidade à neutralização se correlaciona comum alto grau de neurotropismo no hospedeiro adquirido por estas cepas deLDV que podem ser facilmente neutralizadas. Tal aumento na neuropatoge-nicidade reflete provavelmente na facilitação da interação das glicoproteínasvirais com receptores nas células neurais, possivelmente por causa da au-sência da proteção de glicanas. No modelo de porcos jovens que foi utilizadopara a inoculação com o PRRSV, não foi possível detectar diferenças pato-gênicas entre qualquer um dos PRRSVs mutantes e o PRRSV do tipo selva-gem, embora as limitações tivessem sido limitadas às medidas de tempera-tura e de viremia. É possível que sob condições experimentais diferentes(isto é, em um modelo de porcas prenhes), algumas alterações na patogeni-cidade destes PRRSVs mutantes pudessem ser observadas. Não é sabidose a descoberta de cepas de PRRSV hipoglicosiladas que ocorrem natural-mente é uma ocorrência comum, embora relatos anteriores tenham sugeridoa sua presença.

Uma observação notável nos presentes experimentos foi que osmutantes da GP5, quando infectam porcos in vivo, podem superar o PRRSVdo tipo selvagem em relação a sua capacidade de montar uma resposta deneutralização do PRRSV do tipo selvagem que pode ser medida nas fasestardias da infecção (Tabela 4A). Em um cenário paralelo, foram observadosnão somente títulos de neutralização maiores contra mutantes de PRRSVhomólogos, mas também títulos mensuráveis contra ò PRRSV do tipo selva-gem (Tabela 4A). Em adição, a resposta ocorrida mais cedo, com títulos deneutralização detectáveis em 14 dias p.i., uma observação que não é tipica-mente notada com a infecção pelo PRRSV do tipo selvagem (Tabela 4B). Aneutralização aumentada do PRRSV do tipo selvagem pelos soros de porcosinfectados com os mutantes do PRRSV sugere que as glicanas estavammascarando o(s) epitopo(s) de neutralização que não induz(em) os anticor-pos neutralizadores quando as glicanas estão presentes. Esta observaçãotem enorme significado sobre o planejamento de vacinas para PRRSV maiseficientes melhores, sugerindo que novas vacinas planejadas de forma ra-cional devem carregar modificações no padrão de glicosilação da GP5 coma finalidade de melhorar a produção de anticorpos neutralizadores. Em adi-ção, será importante estudar os efeitos que esta remoção de carboidratosdas glicoproteínas imunologicamente proeminentes do PRRSV pode ter so-bre os títulos crescentes de SN não somente para as cepas de imunizaçãohomólogas, mas também para cepas de PRRSV não relacionadas diferen-tes.

Exemplo 2. Identificação de sítios de Glicosilação ligada a N nos isolados dePRRSV Norte Americano e Europeu

Para identificar os sítios de glicosilação ligada a N correspon-dendo à asparagina 34 ou à asparagina 51 em uma proteína GP5 de refe-rência da SEQ ID NO: 1 que podem ser inativados e utilizados nos métodosdesta invenção, as proteínas GP5 de um isolado do PRRSV Norte America-no (Figura 5) ou de um isolado do PRRSV Europeu (Figura 6) desejado sãoalinhadas com a proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 (cepa NorteAmericana NVSL 97-7895). Neste exemplo, os alinhamentos foram criadoscom o programa MegAlign™ da DNASTAR, Inc. (Madison, Wl1 USA) utili-zando o método de alinhamento de Jotun-Hein (Hein, J.J. Em Methods inEnzymology, Vol. 183: pp. 626-645, 1990). Vários parâmetros de alinhamen-to de seqüências eram uma penalidade de espaço de 11 e uma penalidadede comprimento de espaço de 3. Para as comparações em pares, foi utiliza-do um valor de Ktuple de 2.Na Figura 5, é evidente que o sítio de glicosilação ligada a N cor-respondendo à asparagina 51 da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO:1 está presente em todos os isolados do PRRSV Norte Americano mostra-dos e compreende o sítio de glicosilação ligada a N "NGT". Este sítio de gli-cosilação ligada a N pode ser inativado através da substituição de códonsque codificam outros resíduos de aminoácidos tal como glutamina ou alaninapela asparagina 51 na seqüência de polinucleotídeo correspondente. Nestescasos, a seqüência de aminoácidos correspondente na variação de proteínaGP5 do PRRSV Norte Americano hipoglicosilada compreenderia as seqüên-cias tais como "QGT", "AGT" ou "XGT", em que X é qualquer aminoácidosem ser a asparagina. Estas ou outras variações hipoglicosiladas dos isola-dos do PRRSV Norte Americano em que o sítio de glicosilação ligada a Ncorrespondendo à asparagina 51 está inativado também podem ser combi-nadas com outras variações de GP5 hipoglicosiladas em que outros sítios deglicosilação ligada a N estão inativados.

É também evidente partindo da Figura 5, que o sítio de glicosila-ção ligada a N correspondendo exatamente à asparagina 34 da proteínaGP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está presente em apenas certos isola-dos do PRRSV Norte Americano. Mais especificamente, as proteínas GP5dos isolados do PRRSV Norte Americano IAF-BAJ (SEQ ID NO: 3), 94-3182(SEQ ID NO: 7) e 94-287 (SEQ ID NO: 8) contêm o sítio de glicosilação liga-da a N correspondendo exatamente à asparagina 34 da proteína GP5 dereferência da SEQ ID NO: 1 e compreendem o sítio de glicosilação ligada aN "NSS". Este sítio de glicosilação ligada a N das SEQ ID NO: 3, 7 e 8 podeser inativado através da substituição de códons que codificam outros resí-duos de aminoácidos tal como a glutamina ou a alanina pela asparagina 34na seqüência de polinucleotídeo correspondente. Nestes casos, a seqüênciade aminoácidos correspondente na variação de proteína GP5 do PRRSVNorte Americano hipoglicosilada compreenderia as seqüências tal como"QSS", "ASS" ou "XSS", em que X é qualquer aminoácido sem ser a aspa-ragina.

Em outros isolados do PRRSV Norte Americano que não possu-em o sítio de glicosilação ligada a N correspondendo exatamente à aspara-gina 34 da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1, outros sítios deglicosilação ligada a N localizados no resíduo 30 (Figura 5 "NAS" nas SEQID NO: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 13) e no resíduo 33 (Figura 5 "NNS" nas SEQID NO: 3, 8; "NSS" nas SEQ ID NO: 6, 10, "NDS" nas SEQ ID NO: 11, 13)também podem estar inativados. Em outras palavras, os sítios de glicosila-ção ligada a N em outros isolados Norte Americanos localizados nas posi-ções de aminoácidos correspondendo aos resíduos 30 e 33 da proteína GP5de referência da SEQ ID NO: 1 também podem estar inativados e ser utiliza-dos nos métodos desta invenção.

Na Figura 6, é evidente que o sítio de glicosilação ligada a N cor-respondendo à asparagina 51 da proteína GP5 de referência da SEQ ID NO:1 também está presente em um isolado representativo do PRRSV Europeu ecompreende o sítio de glicosilação ligada a N "NGT". Este sítio de glicosila-ção ligada a N pode ser inativado através da substituição dos códons quecodificam outros resíduos de aminoácidos tal como a glutamina ou a alaninapela asparagina 51 na seqüência de polinucleotídeo correspondente. Nestescasos, a seqüência de aminoácidos correspondente na variação da proteínaGP5 do PRRSV Europeu hipoglicosilada compreenderia as seqüências talcomo "QGT", "AGT" ou "XGT", em que X é qualquer aminoácido sem ser aasparagina. Estas ou outras variações hipoglicosiladas dos isolados do PR-RSV Europeu em que o sítio de glicosilação ligada a N correspondendo àasparagina 51 está inativado também podem ser combinadas com outrasvariações de GP5 hipoglicosiladas em que outros sítios de glicosilação Iiga-da a N estão inativados.

Em vista do que foi descrito anteriormente, será observado queas várias vantagens da invenção são atingidas e realizadas.

As modalidades foram escolhidas e descritas com a finalidadede melhor explicar os princípios da invenção e sua aplicação prática paraatravés das mesmas possibilitar que outros versados na técnica melhor utili-zem a invenção em várias modalidades e com várias modificações que sãoadequadas para o uso particular considerado.Uma vez que várias modificações poderiam ser feitas nas cons-truções e nos métodos descritos e ilustrados aqui sem sair do âmbito da in-venção, é pretendido que toda a matéria contida da descrição anterior oumostrada nas figuras em anexo seja interpretada como ilustrativa ao invésde limitante. Assim, a extensão e o âmbito da presente invenção não devemser limitados por qualquer um dos exemplos de modalidades descritos ante-riormente, mas devem ser definidos apenas de acordo com as reivindica-ções a seguir em anexo aqui e os equivalentes das mesmas.

É divulgada aqui uma variedade de referências de patentes eque não são de patentes, das quais cada uma é expressamente incorporadaaqui como referência em sua totalidade.LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Board of Reagents University of Nebraska-LincolnPattnaik, Asit K

<120> PROCESSOS E COMPOSIÇÕES PARA VACINAÇÃO DE ANIMAIS COM ANTÍGENOSDE PRRSV COM MAIOR IMUNOGENICIDADE

<130> 46589-62814

<160> 26

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 1

Met Leu Gly Arg Cys Leu. Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Asn

20 25 30

Ser Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Lys Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu195 200

<210> 2<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 2

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Ala Val Gly Leu Ile Thr Val85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Val Tyr100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe130 135 140

Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro195 200

<210> 3

<211> 200

<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 3

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Asn Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Val Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro195 200

<210> 4

<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 4

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Val Gly Tyr Cys Ser Gln Leu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser

20 25 30

Ser Thr Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 .45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Glu Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Val

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Val Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Gly Gly His Leu Ile Asp Leu165 170 175Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro195 200

<210> 5

<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 5

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe15 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Val Ala Leu Val Asn Ala Asn

20 25 30

Thr Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Ala Ile Arg Leu Thr

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Arg Gln Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val180 185 190

Ser Ala Glu Arg Trp Gly Arg Pro195 200

<210> 6<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 6

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Pro Phe15 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asp Lys Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly Gln Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ile Thr Lys Val180 185 190Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro195 200

<210> 7

<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 7

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Val Asn Ala Ser

20 25 30

Pro Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Ala Arg Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Val Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro195 200

<210> 8<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 8

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Lèu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Asn Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Ile Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Lys Gly Lys Val Glu Val Glu Gly Gln Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro195 200<210> 9

<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da sindrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 9

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe. Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Ala Val Gly Leu Ile Thr Val85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Ser Val Leu Ser Ser Val Tyr100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe130 135 140

Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro195 200

<210> 10<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 10

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Trp Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Ser

20 25 30

Asn Ser Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asp Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 .55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe His His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro195 200

<210> 11<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 11

Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro195 200

<210> 12<211> 200<212> PRT<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 12

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Cys Phe Val Ala Leu Val Ser Ala Asn

20 25 30

Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Cys Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Met Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Ser Arg Pro195 200

<210> 13

<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína<400> 13

Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Leu Ser1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu Val Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Ala

115 120 125

Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Gly Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro

195 200

<210> 14

<211> 200<212> PRT

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína Consensus

<220><221> misc_feature

<222> (34).. (34)

<223> Xaa pode ser Ser, Asp, Asn ou Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (58).. (58)

<223> Xaa pode ser Lys, Asn, Glu, Asp, ou Ala

<220>

<221> misc_feature

<222> (94) ... (94)

<223> Xaa pode ser Ile ou Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (164)..(164)

<223> Xaa pode ser Gly, Arg, Lys, òu Gln

<400> 14

Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe1 5 10 15

Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Xaa Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys

35 40 45

Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Xaa Lys Phe Asp Trp Ala Val

50 55 60

Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly65 70 75 80

Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Xaa Thr Val

85 90 95

Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr

100 105 110

Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala115 120 125Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe

130 135 140

Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile145 150 155 160

Ile Glu Lys Xaa Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu

165 170 175

Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Arg Val

180 185 190

Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro195 200

<210> 15<211> 201

<212> PRT

<213> Vírus da sindrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 15

Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Sér Cys1 5 10 15

Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala

20 25 30

Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Ser His Phe Gly Trp

50 55 60

Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser65 70 75 80

Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly

85 90 95

Ala Val Ser Thr Ala Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Cys Ser

100 105 110

Val Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg

115 120 125

Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe ThrAsn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro

Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val

Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr

Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala

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<212> DNA

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 16

atgacgtata ggtgttggct ctatgccatg acatttgtat tgtcaggagc tgcgaccatt 60ggtacagccc aaaactagct gcacagaaaa cgcccttctg tgacagccct cttcagggga 120gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ccggagttgc actgctttac ggtctctcca 180

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ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300

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aggctctaca agtttatgaa cggggttgcc gctggtaccc tatagtcgga cctgtccctg 600

gagtggccgt ttttgccaac tccctacatg tgagtgataa acctttcccg ggagcaactc 660

atgtgctaac caacctgcca ctcccgcaga ggcctaagcc tgaagacttt tgcccttttg 720

agtgtgctat ggctgacgtc tatgatattg gtcatggcgc cgtcatgtat gtggccaaag 780

ggaaagtctc ctgggcccct cgtggcgggg atgaggcgaa atttgaaact gtccctaggg 840

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tgtctaagtt tgtgttcata gcccctggga gtggtgtctc tatgcgggtc gagtgcccac 960

acggctgtct ccccgctaat actgtccctg aaggtaactg ctggtggcgc ttgtttgact 1020

cgctcccact ggacgttcag aacaaagaaa ttcgccgtgc caaccaattc ggctatcaaa 1080ccaagcatgg tgtcgctggc aagtacctaccagtgactga tacagatgga cccattgtcgtccgccactt cagactggcg gaagagcctataagggtaga gcccaatacg tcgccattgagcagtcacaa atggtacggt gctggaaagaccacagtcgc tcaccgcgcc ttgcccgctcatgccggcgc tgataaggct gtgcatctcagtggttggca ctgcatttcc gccatcgccactcttcccga gagggtgaga ccttcagatgccatccaaat tctcaagctc cctgcggcctaatacgtgct taagctggaa ggcgagcattcttctttgct cccccttgaa tgtgttcaggccccagatgc ggtcgaagtt ttcggatttgtaatgcactt gcctagcagt gtcatcccagactgtccggc ttccccggtc actactgtgtgaggaggaga gcaccctgat caggtgcgctttgaggaatg ctgttgccat cagaataaaacaaggattga tcagtacctc catggtgcaaagagggtttg cccgccgagc gctgcggacagggttggggc ttcaactcag acaaccaaacttcctgtcgt gactcaagag cctttggacatgtccaattg ctactatcct gcacaaggtgccgtactctc taagctggag ggggttgttcctggcccgcg acccgcacta ccgaacgggcatctgctgaa actagtcaac gcccaggcaaaggttgatct gaaagcttgg gtcaaaaactcaagagttca gcctcgaaaa acaaagtctgccgctccacg caggaaggtc agatctgattttcctgacgg tcgggaagat ttgactgttgagccgatgac acctctgagt gagcctgcaccagtgacatc tttgagtgtg ctggccccagcggtgacgcc cttgagtgag ccaatttttg

àacggaggct gcaagctaat ggtctccgag 1140

tacagtattt ctctgttagg gagagctgga 1200

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gtgacaaggg tggaaaaatc ttccggtttg 1320

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ctgctctggc cgaaatgtcc ggcgacccca 1920

ggactgtttc acaattcttt gcccgccaca 1980

taggaaaaat catcagcctt tgtcaagttg 2040

ccaaccgggc caccccggaa gaggttgcgg 2100

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ccttctttga ttggaatgtt gtgctccctg 2220

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gtgaggaata tgggctcacg ccaactgaac 2460

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cttcagaaat gatggcctgg gcagccgagc 2580

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gtggcagccc gattttgatg ggcgacaatg 2760

gtggccccct tgatctttcg acaccatccg 2820

ttatgcccgc gttgcaatat atttctaggc 2880

ttcctgcacc gcgtagaact gtgtcccgac 2940

tgtctgcacc gcgacacaaa tttcagcagg 3000tggaagaagc gaatctggcg gcaacaacgcctgcatcctc acagactgaa tatgaggcttttctggaggt gggggggcaa gaagctgaggatgacatcaa ccctgcacct gtgtcatcaagcccaaaaca ctctgctcaa gccatcattggaagggaaaa agaagcatgc ctcagcatcagtgaccctgc cacgcaggaa tggctttctcggcgcaacac gtctgcttac caggcgttcccaaagatgat actcgagaca ccgccgccctcgcctgcacc ttccgtgggt gcagagagtgatgttccacg catcctcggg aaaatagaaatgacatcctt cggggaagaa ccggtgtgcgcgcgggggtt tgacgagagc acaacggctcccaccgattt gccaccttca gatggtttggtaagaaagaa agctgaaagg ctcttcgacccccatctccc tgttttcttc tcacacctctattggggttt tgcagctttt actttattttttggttttgt tcccctcttg ggtgtttttttttttggctg ttggttggct tttgctgttggcactgcttg tgagtttgac tcgccagagttcaaaccttg ggaccctgtt cgcagccttgttcttggcag gttactgggc ggggcacgctttgttgcaga ttgtatcttg gctggagcttgctggggatc ttgtgtaaga actgctcctacgcgtgcgac caggtcgtca ctcatcgacctggaccccat tttcctcgct actgggtggcagcaaccctc tgaaaaaccc atcgcgttcggaactgtggt cgctcagcct tatgatcctaaggcgggtgg ggcgatagtg gccgaggcagcattccgagc tccctttttt cccaccggagtcgaccccga cacttttact acagctctccttggtgtggg ggactttgcc caactgaatg

tgacgcacca ggacgaacct ctagatttgt 3060

ctcccctaac accactgcag aacatgggta 3120

aagttctgag tgaaatctcg gatacactga 3180

gcagctccct gtcaagtgtt aagatcacac 3240

actcgggcgg gccctgcagt gggcatctcc 3300

tgcgtgaggc ttgtgatgcg gctaagctta 3360

gcatgtggga tagggttgac atgctgactt 3420

gcatcttaga tggtaggttt gagtttctcc 3480

acccgtgtgg gtttgtgatg ctgcctcaca 3540

accttaccat tggttcagtc gccactgaag 3600

acgccggcga gatgcccaac caggggctct 3660

accaacctgt caaggactcc tggatgtcgt 3720

cgtccgctgg tacaggtggt gctgacttac 3780

atgcggacga gtgggggccg ttacggacgg 3 840

aattgagccg tcaggttttt aacctcgtct 3900

tcaaatctga cagtggttat tctccgggtg 3960

gcctcttttt gtgttacagc tacccattct 4020

ctgggtcttc tcggcgtgtg cgcatggggg 4080

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gtaggaacgt ccttcattct tttgagcttc 4200

ttgtgggccc cgtcggtctc ggccttgcca 42 60

acatctggca ttttttgctt aggcttggca 4320

atgtgctttc tcaaggtagg tgtaaaaagt 4380

atgaaatcgc cttcaacgtg ttccctttta 4440

tgtgcgatcg gttttgtgcg ccaaaaggca 4500

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cccagttgga tgaaaagagg attacggcta 4620

accaagccgt aaagtgcttg cgggtgttac 4680

tcccaaaagt ggtcaaggtt tccgctattc 4740

tgaaggttga tcctgagtgc aggatcgtgg 4800

ggtctggtta ctccaccaca aacctcgtcc 4860

gattaaaaat caggcaaatt tccaagccct 4920cgggaggagg cccgcacctc attgctgccctgcttgctgg agtttatgta actgcagtggggtgcactaa cccattcgcc gtccctggcttgtgcatctc ccaacatggc cttaccctgcttcaggaaat tgccctagtc gttttgattttgagttgtaa ggctgatatg ctgtgcgtctcccttacctg gttgctctgt gtgtttcctttcaccattct atggttggtg tttttcttgaccgtggtgtt attggttgct ctttggcttcttacccccta tgatattcat cattacaccaccgcaccaga tgggacttac ttggccgctgtgctgtttac cccgtctcag cttgggtccccctcactgaa caccgtcãat gtggtcgggttcgatgggaa aattaagtgc gtgactgccgtttccggggt cggcttcaat caaatgcttgctgattgccc gaattggcaa ggggctgctcctggccgcgc ctattggctg acatcctctgtcgccttctg cttcaccgcg tgcggcgattagcttgtcgg cgttcacaca ggatcaaacactggccagtt ttgcaatgtg gcacccatcagacctaaggt cccgctcggt gatgtgaaggaggtaccttc agatctttgc gccttgcttgccaccgtcca acttctgtgt gtgtttttcccgcccttggt tgctgttggg ttttttatctggagtgtttt ctcctttgga atgtttgtgcttctgatgat caggcttcta acagcagctcacagccttgg tgcagcgacc ggttttgtcgtgcaggcagt aatgaattta agtacctatgcaccagtccc agtgattgcg tgtggtgttgttaagtaccg ctgcctgcac aatgtccttgtcttgcgata ctttgccgag gggaaattgaatcatgagtc gctgactggt gccctcgcta

tgcatgttgc ttgctcgatg gcgttgcaca 4980

ggtcttgcgg taccggcacc aacgatccgt 5040acggacctgg ctccctctgc acgtccagat 5100

ccttgacagc acttgtggca ggattcggtc 5160

tcgtttccat cggaggcatg gctcataggt 5220

tacttgcaat cgccagctat gtttgggtac 5280

gctggttgcg ctggttctct ttgcaccctc 5340

tgtctgtaaa tatgccttcg ggaatcttaa 5400

taggccgtta tactaatgtt gttggtcttg 5460

atggcccccg cggtgttgcc gccttggcta 5520

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ttcttgaggg cgctttcaga actcgaaagc 5640

cctccatggg ctctggcgga gtgttcacta 5700

cacatgtcct tacgggtaat tcagctaggg 5760

actttgatgt aaaaggggac ttcgccatag 5820

ctaagaccca attctgcgag gatggatgga 5880

gcgtcgaacc cggtgtcatt gggaatggat 5940

ccgggtcccc agtgatcacc gaagccggtg 6000

aacaaggagg aggcattgtt acgcgcccct 6060

agctgagcga attaagtgag ttctttgctg 6120

ttggcagcca cataattaaa gacatatgcg 6180

ctgccaaacc cgaactggaa ggaggcctct 6240

tcctgtggag aatgatggga catgcctgga 6300

tgaatgaggt tctcccagct gtactggtcc 6360

tatcttggct cacaccatgg tctgcgcaag 6420

ttaacaggaa cagattgtca ctcgcctttt 6480

cagatctggc ggcaactcaa gggcacccgt 6540

ccttcctgcc tcggataatg gtcgtgacct 6600

tgcacctcct tgccataatt ttgtacttgt 6660

ttggcgatgg tgcgttctct gcggctttct 6720

gggaaggggt gtcgcaatcc tgcgggatga 6780

tgagacttaa tgacgaggac ttggattttc 6840ttacgaaatg gactgatttt aagtgttttg tttctgcatc caacatgagg aatgcggcgg 6900

gccagttcat cgaggctgcc tatgctaaag cacttagaat tgaacttgcc cagttggtgc 6960

aggttgataa ggttcgaggt actttggcca aacttgaagc ttttgctgat accgtggcac 7020

cccaactctc gcccggtgac attgttgttg ctcttggcca tacgcctgtt ggcggtatct 7080

tcgacctaaa ggttggtagc accaagcata ccctccaagc cattgagacc agagttcttg 7140

ccgggtccaa aatgaccgtg gcgcgtgtcg ttgatccaac ccccacaccc ccacccgcac 7200

ccgtgcctat cccccttcca ccgaaagttc tggagaatgg tcccaacgcc tggggggatg 7260

aggatcgttt gaataagaag aagaggcgca ggatggaagc cgtcggcatc tttgttatgg 7320

gtggaaagaa atatcagaaa ttttgggaca agaactccgg tgatgtgttt tatgaggagg 73 80

tccatgataa cacagacgcg tgggagtgcc tcagagttga caaccctgcc gactttgacc 7440

ctgagaaggg aactctgtgc gggcatacta ccattgaaga taagacttac agtgtctacg 7500

cctccccatc tggcaagaaa ttcctggtcc ccgtctaccc agagagcaaa aaaaaccaat 7560

gggaagctgc gaagctttcc gtggaacagg cccttggcat gatgaatgtc gacggtgaac 7620

tgacagccaa agaagtggag aaactgaaaa gaataattga caaactccag ggcctgacta 7680

aggagcagtg tttaaactgc tagccgccag cggcttgacc cgctgtggtc gcggcggctt 7740

ggttgttact gagacagcgg taaaaatagt caaatttcac aaccggacct tcaccctagg 7800

acctgtgaat ttaaaagtgg ccagtgaggt tgagctaaaa gacgcggtcg agcataacca 7860

acacccggtt gcaagaccgg ttgatggtgg tgttgtgctc ctgcgctccg cagttccttc 7920

gcttatagac gtcttaatct ccggcgctga tgcatctccc aagttactcg cccgccacgg 7980

gccgggaaac actgggatcg atggcacgct ttgggatttt gaggccgagg ccactaaaga 8040

ggaaattgca ctcagtgcgc aaataataca ggcttgtgac attaggcgcg gcgacgcacc 8100

tgaaattggt cttccttata agctgtaccc tgtcaggggc aaccctgagc gggtaaaagg 8160

agttttacag aatacaaggt ttggagacat accttataaa acccccagtg acactggaag 8220

cccagtgcac gcggctgcct gcctcacgcc caatgccact ccggtgactg atgggcgctc 82 80

cgtcttggcc acgactatgc cctccggttt tgagttgtat gtaccgacca ttccagcgtc 8340

tgtccttgat tatcttgatt ctaggcctga ctgccccaaa cagttgacag agcacggctg 8400

tgaggacgcc gcattaagag acctctccaa gtatgacttg tccacccaag gctttgtttt 8460

acctggagtt cttcgccttg tgcgtaagta cctgtttgct catgtgggta agtgcccgcc 8520

cgttcatcgg ccttccactt accctgccaa gaattctatg gctggaataa atgggaacag 8580

gtttccaacc aaggacatcc agagcgtccc tgaaatcgac gttctgtgcg cacaggccgt 8640

gcgggaaaac tggcaaactg ttaccccttg taccctcaag aaacagtatt gtgggaagaa 8700

gaagactagg acaatactcg gcaccaataa cttcattgca ctggcccacc gggcagcgtt 8760gagtggtgtc acccagggct tcatgaaaaa ggcgtttaac tcgcccattg ccctcggtaa 8820

aaacaaattt aaagagcttc agactccggt cttaggcagg tgccttgaag ctgatcttgc 8880

atcctgcgat cgctccacac ctgcaattgt ccgctggttt gccgccaatc ttctttatga . 8940

acttgcctgt gctgaagagc acctgccgtc gtacgtgttg aactgctgcc acgacctact 9000

ggtcacgcag tccggcgcag taactaagag aggtggcctg tcgtctggcg acccgatcac 9060

ttctgtgtcc aacaccattt acagcttggt gatatatgca caacacatgg tgctcagtta 9120

ctttaaaagt ggtcaccctc atggccttct gtttctacaa gaccagctga agtttgagga 9180

catgctcaag gttcaacccc tgatcgtcta ttcggacgac ctcgtactgt atgccgagtc 9240

tcccaccatg ccaaactacc actggtgggt tgaacatctg aacctgatgc tgggttttca 9300

gacggaccca aagaagacag ccataacaga ctcgccatca tttctaggct gtaggataat 9360

aaatggacgc cagctcgtcc ctaaccgtga caggattctc gcggccctcg cctaccatat 9420

gaaggcaagc aatgtctctg aatactacgc ctcggcggct gcgatactca tggacagctg 9480

tgcttgttta gagtatgatc ccgaatggtt tgaagagctt gtagttggga tagcgcagtg 9540

tgcccgcaag gacggctaca gttttcccgg cccgccgttc ttcttgtcca tgtgggaaaa 9600

actcagatcc aatcatgagg ggaagaagtc cagaatgtgc gggtactgcg gggccccggc 9660

tccgtacgcc actgcctgtg gcctcgacgt ctgtatttac cacacccact tccaccagca 9720

ttgtccagtc atcatctggt gtggccaccc ggctggttct ggttcttgta gtgagtgcaa .9780

acccccccta gggaaaggca caagccctct agatgaggtg ttagaacaag tcccgtataa 9840

gcctccacgg actgtaatca tgcatgtgga gcagggtctc acccctcttg acccaggcag 9900

ataccagact cgccgcggat tagtctccgt taggcgtggc attagaggaa atgaggttga 9960

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ccagaccatg ctcgatatga ttagggcttt ggggacgtgc cggttcaacg tcccagcagg 10200

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tcaaggcgcc acatttgatg tggttacact gcatttgccc actaaagatt cactcaacag 10680gcaaagagcc cttgttgcta ttaccagggccaggcaactg cagagcatgt ttgatcttccgcaccgtgac gagcagctga tcgtgctagaggctctaggc aatggggata aattcagggccgccatttgt gcagatctgg aagggtcgàggggattttat ttctcgcctg atttgacacaccactggccc gtggtgacaa cccagaacaaccttcgcccc gtccataagt atagccgcgcctcagtgttt ctgggcaccc ctggggttgtcgaggctcaa atgcttccgg agacagtctttgagtatctt gatgaccggg agcgagaaatcgacgtcaaa ggcactaccg ttggaggatgcttccttccc aaggaatcag tcgcggtagtagcagtttgc acattaacag atgtgtatctgacccagtcc aagtgctgga aaatgatgttgaaggacaag acggcctatt ttcaacttgaaagctatgcc tcgtacatcc gagttcctgtgggccctgcc ctttgcaaca gaagagttgtagtcacccct tatgattacg gtgccaaaatgccccctggg tacaaaatcc tggcgtgcgccaaacacacc tgggggtttg aatcggatactgaggactgg gaggattaca atgatgcgttggccactgcc accagcatga ggtttcatttaggcctgaat tgaaatgaaa tggggtccatttttgtggat gctttcacgg aatttttggtcattttgttt ggctttacca tcgctggctgctccgcggta ctccgtgcgc gccctaccataggcctttct ttctcagtgc caggtggataggatgctttg gcaccataag gtgtcaacccaccgcaccat ggaaaaagca ggacaggctgtgtctcgcat tagtggtttg gatgtggtggccgagacctg taaatatttg gcctctcggc

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caatactacg tactgttttt ggtttccgct ggttaggggc aatttttcct tcgaactcac 12840

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gatagggaat gtgagtcaag tttatgttga catcaagcac caattcatct gcgccgttca 13140

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tctcagtgcc gcgcggcgat agggacgccc gtgtacatca ctgtcacagc caatgtcaca 13500

gatgagaatt atttacattc ttctgatctc cttatgcttt cttcttgcct tttctatgct 13560

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ttttgctgcg ctcgtcaacg ccaacagcaa cagcagctct catcttcagt tgatttacaa 13920

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tagccatttc cttgacacag tcggtctggt tactgtgtct accgccgggt tctaccacgg 14100

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gggtaaggtt gaggtcgaag gtcacctgat cgacctcaaa agagttgtgc ttgatggttc 14340

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gtgatgatat atgctctaaa ggtaagtcgc ggccgacttt tagggcttct gcaccttttg 14520atctttctga attgtacttt taccttcggg tacatgacat tcgtgcactt taatagcaca 14580

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atagaaacct ggaagttcat cacctccaga tgccgtttgt gcttgctagg ccgcaagtac 14700

attctggccc ccgcccacca cgtcgaaagt gccgcgggct ttcatccgat cgcggcaaat 14760

gataaccacg catttgtcgt ccggcgtccc ggctccacta cggttaacgg cacattggtg 14820

cccgggttga aaagcctcgt gttgggtggc agaaaagctg ttaaacaggg agtggtaaac 14880

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gaagaatgtg tggtgaatgg cactgattgg cactgtgcct ctaagtcacc tattcaatta 15360

gggcgaccgt gtgggggtta agtttaattg gcgagaàcca tgcggccgaa atta 15414

<210> 17

<211> 15451

<212> DNA

<213> Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

<400> 17

tatgacgtat aggtgttggc tctatgcctt ggcatttgta ttgtcaggag ctgtgaccat 60

tggcacagcc caaaacttgc tgcacagaaa cacccttctg tgatagcctc cttcagggga 120

gcttagggtt tgtccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180

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tatggcggag ggccaagtat actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccttcccct 300

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ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgttgagtgc tcccccgccg gggcctgctg 420

gctttctgca atctttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacctgaact tccaacaaag 480

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cgtgttgacc aacctgccgc tcccgcagag acccaagcct gaagactttt gcccctttga 720gtgtgctatg gctactgtct atgacattgggaaagtctcc tgggcccctc gtggcggggagttgaagttg attgcgaacc ggctccgcacgtctaagttc gccttcacag cccctgggtgcggctgcctt cccgctgaca ctgtccctgagcttccactg gaagttcaga acaaagaaatcaagcatggt gtctctggca agtacctacaagtaactgac ctaaacggac ctatcgtcgtccgccatttg aaactggcgg gagaacccagaagggttgag cctaacacgt cgccattggccagtcacaag tggtacggcg ctggaaagagtacagtcgct ggccgcgctt tgtccgttcgtgccggcgcc aacaaggctg agcacctcaatggttggcac tgcatttccg ccatcgccaaccttcccgaa agagtgagac ctccagatgacatçcaaatc ctcagactcc ctgcggccttgtacgtactt aagctggaag gtgagcattgttctttgctc cctcttgaat gtgttcagggcccagatgca gtcgaggtct ccggatttgagatgcacctg cctagcagtg ctatcccagctcgttcggct tctccggtca ccaccgtgtgcggagggaat caccctgacc aagtgcgctttgaggactgc tgctgttccc agaacaaaacaaagattgac ctgtacctcc gtggtgcaacgaaagcgcgc ccgccacgcg taatcgacacggttgaggcg gcaacccaga cgatcaagctccctgttgtg actcaaaagt ccttggacaaggctaactac tactaccgtg cgcaaggtgacgtgctctcc aagttggaaa aggttgttcgtggtccacgg cccacactgc cacgcgggctcttgctgaaa ctggctaacg cccagacgacggttgaccta aaaacttggg tcaagaactatcatgacgcc gtcatgtatg tggccgaaag 780tgaagtgaaa tttgaagctg tccccgggga 840tccttcccg ccccaccaca cagtggacat 900tggtgtttct atgcgggtcg aacgccaaca 960aggcaactgc tggtggagct tgtttgactt 1020tcgccatgct aaccaatttg gctatcagac 1080gcggaggctg caagttaatg gtctccgagc 1140acagtacttc tccgttaagg agagttggat 1200ctactctggg tttgaggacc tcctcagaat 12 60tgacaaggaa gaaaaaattt tccggtttgg 1320agcaagaaaa gcacgctctt gtgcgactgc 13 80tgaaacccgg caggccaagg agcacgaggt 1440acactactcc ccgcctgccg aagggaattg 1500ccggatggtg aattccaaat ttgaaaccac 1560ctgggctact gacgaggatc ttgtgaatgc 1620agacaggaac ggtgcttgta ctágcgccaa 1680gactgtcact gtgacccctg ggatgtcccc 1740ctgttgtggg cacaagggcg gtcttggttc 1800ccctgcctgc cttgaccggc tggctgaggt 1860cgctctggcc gaaatgtctg gcgattccga 1920gactgtttcg cagttctttg cccgtcacag 1980agggaaaatt atcagccttt gtcaggtgat 2040caaccgggtc accccggagg aggtcgcagc 2100aaatcttgaa gaatgcttgg ccaggcttga 2160ctcctttgat tgggatgttg tgctccctgg 2220gccccaggtc aaccagtgtc gtgctctggt 2280caactcggtc cccctgaccg ccttttcact 2340cgaagttcgt caccgtgaaa gactaaccgc 2400agaagaatat gggctcatgc caaccgagcc 2460cgacgaactc aaagaccaga tggaggagga 2520ttcggacatg atggcctggg cagtcgagca 2580cccgcggtgg acaccaccac cccctccgcc 2640aaaagttcag cctcgaaaaa cgaagcctgtcgccccgcgc aggaaggttg ggtccgattgccctaacagt tgggaagatt tggctgttaggccggcaaca ccttcaagtg agctggtgatggcgacaccc ttgagtgagc cggctccaâtggtgacaccc ttgagtgagc cgatccctgtgaaaagattg agttcggcgg cggcaatccctgcttcctca cagactgaat atgaggcctctctgggagta gaggggcatg aagctgaggataacattaaa cctgcgtccg tgtcatcaagcccaaaatac tcagctcaag ccatcatcgaagaggtaaag gaaacatgcc ttagtgtcattgaccctgct acgcaggaat ggctttctcggcgcaacacg tctgtttacc aggcgatttgaaaaatgata ctcgagacac cgccgccctagcctgcacct tccgtaggtg cggagagcgatgttccacgc atcctcgaga aaatagaaaaggccttctcc gaggataaac cggtagatgagcggaggcct gacgagagca catcagctcctaccgatttg ccgccttcag atggcgcggaaaaaagaaaa gctgaaaggc tctttgaccaccatctccct gttttcttct cacgccttttttggggtttt gcagctttta ctctattgtgtggtattgct cccctcttgg gtgtgttttcttttggctgc tggttggctt ttgctgttggcgctgcttgt gagtttgact cgccagagtgcaaaccttgg gaccctgttc gcagccttgttcttggcagg ttactgggcg gggcacgctgtgttgcagac tgtatcttgg ctggagcttactggggatct tgtataagaa ctgctcctaaacgtgcgacc aggtcgtcac ttatcgacctggaccccatt tttctcgcca ctgggtggcg

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gaaattggtc tcccttacaa gctgtaccct gttaggggta accctgagcg ggtgaaagga 8160

gttctgcaga atacaaggtt tggagacata ccttacaaaa cccccagtga cactggaagc 8220

ccagtgcacg cggctgcctg ccttacgccc aacgccactc cggtgactga tgggcgctcc 82 80

gtcttggcca cgaccatgcc ccccgggttt gagttatatg taccgaccat accagcgtct 8340

gtccttgatt accttgactc tággcctgac tgccctaaac agctgacaga gcacggctgc 8400gaagatgccg cactgaaaga cctctctaaacctggagttc ttcgccttgt gcggaaatacgttcatcggc cttctactta ccctgctaagttcccaacca aggacattca gagcgtccctcgagaaaact ggcaaactgt caccccttgtaagactagga ccatactcgg caccaataacagtggtgtta cccagggctt catgaaaaagaacaagttta aggagctaca gactccggtctcctgcgatc gatccacgcc tgcaattgtccttgcctgtg ctgaagagca tctaccgtcggtcacgcagt ccggcgcagt gactaagagatctgtgtcta acaccattta tagtttggtgttcaaaagtg gtcaccccca tggccttctgatgctcaagg ttcaacccct gatcgtctatcccaccatgc caaactatca ctggtgggttacggacccaa agaagacagc aataacagacaatgggcgcc agctagtccc caaccgtgacaaggcgagta atgtttctga atactatgccgcttgtttgg agtatgatcc tgaatggtttgcccgcaagg acggctacag ctttcccggcctcaggtcca attatgaggg gaagaagtcgccgtacgcta ctgcctgtgg cctcgacgtctgtccagtca caatctggtg tggccatccatcccctgtag ggaaaggcac aagccctttacccccacgga ccgttatcat gcatgtggagtaccaaactc gcçgcggatt agtctctgtcctaccagacg gtgattatgc tagcaccgccgtcgctgtcg cttccaatgt attgcgcagcaaaacatact ggctccttca acaggtccagcagaccatgc ttgacatgat tagggctttgacaacgctgc aattccccgt cccctcccgcggttggtgtc ctggcaagaa ttccttccta

tatgacttgt ccacccaagg ctttgtttta 8460ctgtttgccc atgtaggtaa gtgcccaccc 8520aattctatgg ctggaataaa tgggaacagg 8580gaaatcgacg ttctgtgcgc acaggctgtg 8640actcttaaga aacagtattg cgggaagaag 8700ttcatcgcac tagcccaccg agcagtgttg 8760gcgtttaact cgcccatcgc cctcggaaag 8820ctgggcaggt gccttgaagc tgatctcgca 8880

cgctggtttg ccgccaacct tctttatgaa 8940

tacgtgctga actgctgcca cgacttactg 9000

ggtggcctgt cgtctggcga cccgatcacc 9060

atctatgcac agcatatggt gcttagttac 9120

ttcttacaag accagctaaa gtttgaggac 9180

tcggacgacc tcgtgctgta tgccgagtct 9240

gaacatctga atttgatgct ggggtttcag 9300

tcgccatcat ttctaggctg tagâataata 9360

aggatcctcg cggccctcgc ctatcacatg 9420

tcagcggctg caatactcat ggacagctgt 9480

gaagaacttg tagttggaat agcgcagtgc 9540

acgccgttct tcatgtccat gtgggaaaaa 9600

agagtgtgcg ggtactgcgg ggccccggcc 9660

tgcatttacc acacccactt ccaccagcat 9720

gcgggttctg gttcttgtag tgagtgcaaa 9780

gacgaggtgc tggaacaagt cccgtataag 9840

cagggtctca ccccccttga tccaggtaga 9900

aggcgtggaa ttaggggaaa tgaagttgaa 9960

ttgctcccta cctgcaaaga gatcaacatg 10020

aggttcatca tcggcccácc cggtgctggg 10080

gatggtgatg ttatttacac accaactcac 10140

gggacgtgcc ggttcaacgt cccggcaggc 10200

accggtccgt gggttcgcat cctagccggc 102 60

gatgaagcag cgtattgcaa tcaccttgat 10320gttttgaggc ttcttagtaa aactaccctc acctgtctag gagacttcaa gcaactccac 10380

ccagtgggtt ttgattctca ttgctatgtt tttgacatca tgcctcaaac tcaactgaag 10440

accatctgga ggtttggaca gaatatctgt gatgccattc agccagatta cagggacaaa 10500

ctcatgtcca tggtcaacac aacccgtgtg acctacgtgg aaaaacctgt caggtatggg 10560

caggtcctca ccccctacca cagggaccga gaggacgacg ccatcactat tgactccagt 10620

caaggcgcca cattcgatgt ggtcacattg catttgccca ctaaagattc actcaacagg 10680

caaagagccc ttgttgccat caccagggca agacacgcta tctttgtgta tgacccacac 10740

aggcagctgc agggcttgtt tgatcttcct gcaaaaggca cacccgtcaa cctcgcagtg 10800

caccgcgacg ggcagctgat cgtgctggat agaaataaca aagaatgcac ggttgctcag 10860

gctctaggca acggggataa atttagggcc acagacaagc gtgttgtaga ttctctccgc 10920

gccatttgtg ctgatctaga agggtcgagc tctccgctcc ccaaggtcgc acacaacttg 10980

ggattttatt tctcacctga tttaacacag tttgctaaac tcccagtaga acttgcacct 11040

cactggcccg tggtgacaac ccagaacaat gaaaagtggc cagatcggct ggttgccagc 11100

cttcgcccta tccataaata cagccgcgcg tgcatcggtg ccggctatat ggtgggccct 11160

tcggtgtttc taggcactcc tggggtcgtg tcatactatc tcacaaaatt tgttaagggc 11220

gaggctcaag tgcttccgga gacggttttc agcaccggcc gaattgaggt agactgccgg 11280

gaatatcttg atgatcggga gcgagaagtt gctgcgtccc tcccacacgc tttcattggc 11340

gacgtcaaag gcactaccgt tggaggatgt catcatgtca cctccagata cctcccgcgc 11400

gtccttccca aggaatcagt tgcggtagtc ggggtttcaa gccccggaaa agccgcgaaa 11460

gcattgtgca cactgacaga tgtgtacctc ccagatcttg aagcctatct ccacccggag 11520

acccagtcca agtgctggaa aatgatgttg gacttcaaag aagttcgact aatggtctgg 11580

aaagacaaaa cagcctattt ccaacttgaa ggtcgctatt tcacctggta tcagcttgcc 11640

agctatgcct cgtacatccg tgttcctgtc aactctacgg tgtacttgga cccctgcatg 11700

ggccccgccc tttgcaacag gagagtcgtc gggtccaccc actggggggc tgacctcgcg 11760

gtcacccctt atgattacgg cgctaaaatt atcctgtcta gcgcgtacca tggtgaaatg 11820

ccccccggat acaaaattct ggcgtgcgcg gagttctcgt tggatgaccc agttaagtac 11880

aaacatacct gggggtttga atcggataca gcgtatctgt atgagttcac cggaaacggt 11940

gaggactggg aggattacaa tgatgcgttt cgtgcgcgcc aggaagggaa aatttataag 12000

gccactgcca ccagcttgaa gttttatttt cccccgggcc ctgtcattga accaacttta 12060

ggcctgaatt gaaatgaaat ggggtccatg caaagccttt ttgacaaaat tggccaactt 12120

tttgtggatg ctttcacgga gttcttggtg tccattgttg atatcattat atttttggcc 12180

attttgtttg gcttcaccat cgccggttgg ctggtggtct tttgcatcag attggtttgc 12240tccgcgatac tccgtacgcg ccctgccatt cactctgagc aattacagaa gatcttatga 12300ggcctttctt tcccagtgcc aagtggacat tcccacctgg ggaactaaac atcctttggg 12360gatgctttgg caccataagg tgtcaaccct gattgatgaa atggtgtcgc gtcgaatgta 12420ccgcatcatg gaaaaagcag ggcaggctgc ctggaaacag gtggtgagcg aggctacgct 12480gtctcgcatt agtagtttgg atgtggtggc tcattttcag catctagccg ccattgaagc 12540cgagacctgt aaatatttgg cctcccggct gcccatgcta cacaacctgc gcatgacagg 12600gtcaaatgta accatagtgt ataatagcac tttgaatcag gtgtttgcta tttttccaac 12660ccetggttcc cggccaaagc ttcatgattt tcagcaatgg ttaatagctg tacattcctc 12720catattttcc tctgttgcag cttcttgtac tctttttgtt gtgctgtggt tgcgggttcc 12780aatactacgt actgtttttg gtttccgctg gttaggggca atttttcttt cgaactcaca 12840gtgaattaca cggtgtgtcc accttgcctc acccggcaag cagccacaga gatctacgaa 12900cccggtaggt ctctttggtg caggataggg tatgaccgat gtggggagga cgatcatgac 12960gagctagggt ttatgatàcc gcctggcctc tccagcgaag gccacttgac tagtgtttac 13020gcctggttgg cgttcttgtc cttcagctac acggcccagt tccatcccga gatattcggg 13080atagggaatg tgagtcgagt ttatgttgac atcaaacatc aactcatctg cgccgaacat 13140gacgggcaga acaccacctt gcctcgtcat gacaacattt cagccgtgtt tcagacctat 13200taccaacatc aagtcgacgg cggcaattgg tttcacctag aatggcttcg tçccttcttt 13260tcctcgtggt tggttttaaa tgtctcttgg tttctcaggc gttcgcctgc aaaccatgtt 13320tcagttcgag tcttgcagat attaagacca acaccaccgc agcggcaagc tttgctgtcc 13380tccaagacat cagttgcctt aggcatcgcg actcggcctc tgaggcgatt cgcaaaatcc 13440ctcagtgccg tacggcgata gggacacccg tgtatgttac catcacagcc aatgtgacag 13500atgagaatta tttacattct tctgatctcc tcatgctttc ttcttgcctt ttctatgctt 13560ctgagatgag tgaaaaggga tttaaggtgg tatttggcaa tgtgtcaggc atcgtggctg 13620tgtgtgtcaa ttttaccagc tacgtccaac atgtcaagga gtttacccaa cgctccctgg 13680tggtcgacca tgtgcggttg ctccatttca tgacacctga gaccatgagg tgggcaactg 13740ttttagcctg tctttttgcc attctgttgg caatttgaat gtttaagcat gttggagaaa 13800tgcttgaccg cgggctgttg ctcgcgattg ctttctttgt ggtgtatcgt gccgttctgt 13860tttgctgtgc tcgccaacgc cagcaacgac agcagctccc atctacagct gatttacaac 13920ttgacgctat gtgagctgaa tggcacagat tggctagcta acaaatttga ttgggcagtg 13980gagagttttg tcatctttcc cgttttgact cacattgtct cctatggtgc cctcactacc 14040agccatttcc ttgacacagt cgctttagtc actgtgtcta ccgccgggtt tgttcacggg 14100cggtatgtcc taagtagcat ctacgcggtc tgtgccctgg ctgcgttgac ttgcttcgtc 14160attaggtttg caaagaattg catgtcctgg cgctacgcgt gtaccagata taccaacttt 14220

cttctggaca ctaagggcag actctatcgt tggcggtcgc ctgtcatcat agagaaaagg 14280

ggcaaagttg aggtcgaagg tcatctgatc gacctcaaaa gagttgtgct tgatggttcc 14340

gtggcaaccc ctataaccag agtttcagcg gaacaatggg gtcgtcctta gatgacttct 14400

gtcatgatag cacggctcca caaaaggtgc ttttggcgtt ttctattacc tacacgccag 14460

tgatgatata tgccctaaag gtgagtcgcg gccgactgct agggcttctg caccttttga 14520

tcttcctgaa ttgtgctttc accttcgggt acatgacttt cgcgcacttt cagagtacaa 14580

ataaggtcgc gctcactatg ggagcagtag ttgcactcct ttggggggtg tactcagcca 14640

tagaaacctg gaaattcatc acctccagat gccgtttgtg cttgctaggc cgcaagtaca 14700

ttctggcccc tgcccaccac gttgaaagtg ccgcaggctt tcatccgatt gcggcaaatg 14760

ataaccacgc atttgtcgtc cggcgtcccg gctccactac ggtcaacggc acattggtgc 14820

ccgggttaaa aagcctcgtg ttgggtggca gaaaagctgt taaacaggga gtggtaaacc 14880

ttgtcaaata tgccaaataa caacggcaag cagcagaaga gaaagaaggg ggatggccag 14940

ccagtcaatc agctgtgcca gatgctgggt aagatcatcg ctcagcaaaa ccagtccaga 15000

ggcaagggac cgggaaagaa aaataagaag aaaaacccgg agaagcccca ttttcctcta 15060

gcgactgaag atgatgtcag acatcacttt acccctagtg agcggcaatt gtgtctgtcg 15120

tcaatccaga ccgcctttaa tcaaggcgct gggacttgca ccctgtcaga ttcagggagg 15180

ataagttaca ctgtggagtt tagtttgcct acgcatcata ctgtgcgcct gatccgcgtc 15240

acagcatcac cctcagcatg atgggctggc attcttgagg catctcagtg tttgaattgg 15300

aagaatgtgt ggttaacggc actgattgac attgtgcctc taagtcacct attcaattag 15360

ggcgaccgtg tgggggtgag atttaattgg cgagaaccat gcggccgaaa ttaaaaaaaa 15420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 15451<210> 18

<211>

22

<212>

DNA

<213>

sintética

<400>

18

gccaacagcg ccagcagctc tc

22

<210>

19

<211>

24

<212>

DNA

<213>

sintética<400> 19

gttgatttac gccttgacgc tatg<210> 20<211> 22<212> DNA

<213> sintética

<400> 20

gtgagctggc tggcacagat tg<210> 21<211> 53

<212> DNA

<213> sintética

<400> 21

gccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttacg ccttgacgct atg<210> 22<211> 45

<212> DNA

<213> sintética

<400> 22

gttgatttac gccttgacgc tatgtgagct ggctggcaca gattg

<210> 23

<211> 74

<212> DNA

<213> sintética

<400> 23

gccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttaca acttgacgct atgtgagctg

gctggcacag attg

<210> 24

<211> 74

<212> DNA

<213> sintética

<400> 24gccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttacg ccttgacgct atgtgagctg

gctggcacag attg

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> sintética

<400> 25

ctaccaacat caggtcgatg gcgg

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> sintética

<400> 26

gtcggccgcg acttaccttt agag

Claims

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende umpolinucleotídeo que codifica uma variação do polipeptídeo GP5 de PRRSVda América do Norte hipoglicosilada em que pelo menos um sítio de glicosi-lação ligado a N correspondendo à asparagina 51 em uma proteína GP5 dereferência da SEQ ID NO: 1 está inativado e um veículo terapeuticamenteaceitável.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molécula de RNAde PRRSV da América do Norte infecciosa.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molécula de DNAque codifica uma molécula de RNA de PRRSV da América do Norte infec-ciosa.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molécula de DNAem que um promotor ativo em células de mamíferos está ligado de formaoperacional ao dito polinucleotídeo que codifica a dita variação de polipeptí-deo de GP5 de PRRSV da América do Norte hipoglicosilada.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizadapelo fato de que o dito promotor é um promotor de CMV.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito sítio de glicosilação ligado a N é inativado através dasubstituição de um códon que codifica a dita asparagina 51 por um códonque codifica um aminoácido sem ser a asparagina.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que o dito códon que codifica um aminoácido sem ser a aspara-gina codifica um resíduo de alanina ou de glutamina.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito polinucleotídeo que codifica uma proteína variante dopolipeptídeo de GP5 de PRRSV da América do Norte hipoglicosilada em queambos os ditos sítios de glicosilação ligados a N correspondendo à aspara-gina 34 e à asparagina 51 na proteína GP5 de referência da América do Nor-te da SEQ ID NO: 1 estão inativados.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizadapelo fato de que ambos os ditos sítios de glicosilação ligados a N estão inati-vados através da substituição dos códons que codificam a dita asparagina-34 e a dita asparagina 51 por códons que codificam um aminoácido sem sera asparagina.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizadapelo fato de que os ditos códons que codificam um outro aminoácido codifi-cam um resíduo de alanina ou de glutamina.

11. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizadapelo fato de que um dos ditos sítios de glicosilação ligados a N é inativadoatravés da substituição de um códon que codifica a dita asparagina 34 ou adita asparagina 51 por um códon que codifica um aminoácido sem ser a as-paragina.

12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito veículo terapeuticamente aceitável é selecionado dogrupo que consiste em uma proteína, um tampão, um tensoativo e um polí-mero de polietileno glicol ou qualquer combinação dos mesmos.

13. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a dita composição compreende ainda pelo menos um adju-vante.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracteriza-da pelo fato de que o dito adjuvante é selecionado do grupo que consiste emhidróxido de alumínio, Quil A, uma interrupção brusca em gel de alumina,óleos minerais, glicerídeos, ácidos graxos, subprodutos de ácidos graxos,micobactérias e oligodesoxinucleotídeos CpG ou qualquer combinação dosmesmos.

15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracteriza-da pelo fato de que a dita composição compreende ainda um segundo adju-vante que é selecionado do grupo que consiste em interleucina 1 (IL-1), IL-2,IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, interferon gama (g-IFN), fator de necrose celular, MDP(muramil dipeptídeo), complexo imuno estimulante (ISCOM) e lipossomos.

16. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende um vetor viral seleciona-do do grupo que consiste em um vetor de vírus vaccinia, um vetor viral deherpes simplex, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavírus e um vetor deTG EV.

17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeuma variação do polipeptídeo de GP5 de PRRSV da América do Norte hipo-glicosilada em que pelo menos um sítio de glicosilação ligado a N corres-pondendo à asparagina 51 em uma proteína consenso GP5 de referência daSEQ ID NO: 1 está inativado e um veículo terapeuticamente aceitável.

18. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codi-fica uma variação do polipeptídeo de GP5 de PRRSV da América do Nortehipoglicosilada em que pelo menos um sítio de glicosilação ligado a N cor-respondendo à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referência da SEQID NO: 1 está inativado.

19. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que ambos sítios de glicosilação ligados a N cor-respondendo à asparagina 34 e à asparagina 51 na SEQ ID NO: 1 estãoinativados.

20. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molé-cula de RNA de PRRSV da América do Norte infecciosa.

21. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molé-cula de DNA que codifica uma molécula de RNA de PRRSV da América doNorte infecciosa.

22. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molé-cuia de DNA em que um promotor ativo em células de mamíferos está ligadode forma operacional ao dito polinucleotídeo que codifica a dita variação depolipeptídeo de GP5 de PRRSV da América do Norte hipoglicosilada.

23. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o dito promotor é um promotor de CMV.

24. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito sítio de glicosilação ligado a N corres-pondendo à asparagina 51 está inativado através da substituição de um có-don que codifica a dita asparagina 51 por um códon que codifica um amino-ácido sem ser a asparagina.

25. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o dito códon que codifica um outro aminoáci-do codifica um resíduo de alanina ou de glutamina.

26. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que um sítio de glicosilação ligado a N correspon-dendo à asparagina 34 em uma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO:-1 está inativado.

27. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de ser através da substituição de um códon que codi-fica a dita asparagina 34 por um códon que codifica um aminoácido sem sera asparagina.

28. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o dito códon que codifica um outro aminoáci-do codifica um resíduo de alanina ou de glutamina.

29. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que um dos ditos sítios de glicosilação ligados a Nestá inativado através da substituição de um códon que codifica a dita aspa-ragina 34 ou a dita asparagina 51 por um códon que codifica um aminoácidosem ser a asparagina.

30. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende um vetorviral selecionado do grupo que consiste em um vetor de vírus vaccinia, umvetor viral de herpes simplex, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavíruse um vetor de TGEV.

31. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de ser uma va-riação de polipeptídeo de GP5 de PRRSV da América do Norte hipoglicosi-Iada em que pelo menos um sítio de glicosilação ligado a N correspondendoà asparagina 51 em uma proteína de referência GP5 da SEQ ID NO: 1 estáinativado.

32. Uso de um polinucleotídeo isolado como definido em qual-quer uma das reivindicações 18 a 31, caracterizado pelo fato de que é napreparação de composição para ativação de uma resposta imunológica mai-or em um porco para um antígeno do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Res-piratória Suína (PRRSV).

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molécula de RNA dePRRSV infecciosa.

34. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molécula de DNA quecodifica uma molécula de RNA de PRRSV infecciosa.

35. Uso de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizadopelo fato de que a dita molécula de RNA de PRRSV infecciosa é um deriva-do de PRRSV da América do Norte ou um derivado de PRRSV da Europa.

36. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelofato de que a dita molécula de RNA de PRRSV infecciosa é um derivado dePRRSV da América do Norte que codifica uma proteína variante do polipep-tídeo GP5 de PRRSV hipoglicosilada em que pelo menos um sítio de glicosi-lação ligado a N correspondendo à asparagina 34 ou à asparagina 51 emuma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 está inativado.

37. Uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelofato de que o sítio de glicosilação ligado a N correspondente à asparagina 51na SEQ ID NO: 1 está inativado.

38. Uso de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelofato de que ambos os ditos sítios de glicosilação ligados a N correspondendoà asparagina 34 e à asparagina 51 em uma proteína GP5 de referência daSEQ ID NO: 1 estão inativados.

39. Uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelofato de que ambos os ditos sítios de glicosilação ligados a N estão inativadosatravés da substituição dos códons que codificam a dita asparagina 34 e adita asparagina 51 por códons que codificam um aminoácido sem ser a as-paragina.

40. Uso de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelofato de que os ditos códons que codificam um outro aminoácido codificamum resíduo de alanina ou de glutamina.

41. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelofato de que os ditos códons codificam um resíduo de alanina.

42. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo compreende uma molécula de DNA emque um promotor ativo em células de mamíferos está ligado de forma opera-cional ao dito polinucleotídeo que codifica uma proteína GP5 hipoglícosilada.

43. Uso de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelofato de que ó dito promotor é um promotor de CMV.

44. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito sítio de glicosilação ligado a N está inativado através dasubstituição de um códon que codifica a dita asparagina 51 por um códonque codifica um aminoácido sem ser a asparagina.

45. Uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelofato de que o dito códon que codifica um outro aminoácido codifica um resí-duo de alanina ou de glutamina.

46. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito sítio de glicosilação ligado a N que corresponde à aspara-gina 34 está inativado através da substituição de um códon que codifica adita asparagina 34 por um códon que codifica um aminoácido sem ser a as-paragina.

47. Uso de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelofato de que o dito códon que codifica um outro aminoácido codifica um resí-duo de alanina ou de glutamina.

48. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo codifica uma proteína variante do polipep-tídeo GP5 de PRRSV hipoglicosilada em que ambos os ditos sítios de glico-silação ligados a N correspondentes à asparagina 34 e à asparagina 51 emuma proteína GP5 de referência da SEQ ID NO: 1 estão inativados.

49. Uso de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelofato de que ambos os ditos sítios de glicosilação ligados a N estão inativadosatravés da substituição dos códons que codificam a dita asparagina 34 e adita asparagina 51 por códons que codificam um aminoácido sem ser a as-paragina.

50. Uso de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelofato de que os ditos códons que codificam um outro aminoácido codificamum resíduo de alanina ou de glutamina.

51. Uso de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelofato de que um dos ditos sítios de glicosilação ligados a N está inativado a-través da substituição de um códon que codifica a dita asparagina 34 ou adita asparagina 51 por um códon que codifica um aminoácido sem ser a as-paragina.

52. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a dita composição é administrada através de injeção subcutâ-nea, injeção intravenosa, injeção intradermal, injeção parenteral, injeção in-tramuscular, injeção sem agulha, eIetroporação, fornecimento oral, forneci-mento intranasal, fornecimento oronasal ou qualquer combinação dos mes-mos.

53. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a dita composição compreende ainda um veículo terapeutica-mente aceitável.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelofato de que o dito veículo é selecionado do grupo que consiste em uma pro-teína, um tampão, um tensoativo e um polímero de polietileno glicol ou qual-quer combinação dos mesmos.

55. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a dita composição compreende ainda um adjuvante.

56. Uso de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelofato de que o dito adjuvante é selecionado do grupo que consiste em hidró-xido de alumínio, Quil A, uma interrupção brusca em gel de alumina, óleosminerais, glicerídeos, ácidos graxos, subprodutos de ácidos graxos, mico-bactérias e oligodesoxinucleotídeos CpG ou qualquer combinação dosmesmos.

57. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo compreende um vetor viral selecionado dogrupo que consiste em um vetor de vírus vaccinia, um vetor viral de herpessimplèx, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavírus e um vetor de TGEV.

58. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a dita resposta imunológica aumentada do dito porco a um antí-geno de PRRSV compreende uma maior produção de anticorpos neutraliza-dores de PRRSV pelo dito porco.

59. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que ó dito porco é uma porca, uma leitoa, um porco não castrado ouum leitão.

60. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo que codifica uma variação do polipeptídeoGP5 de PRRSV hipoglicosilada é obtido através da síntese direta, da muta-gênese de uma seqüência de nucleotídeos de GP5 do isolado de PRRSV daAmérica do Norte ou de uma seqüência de nucleotídeos de GP5 consensode PRRSV da América do Norte.

61. Uso de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelofato de que a dita seqüência de nucleotídeos de GP5 do isolado de PRRSVda América do Norte codifica um peptídeo selecionado do grupo que consis-te da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13.

62. Uso de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelofato de que a dita seqüência de nucleotídeos de GP5 de PRRSV da Américado Norte consenso codifica uma proteína GP5 consenso que é pelo menos-85% idêntica à SEQ ID NO: 14.

63. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que o dito polinucleotídeo que codifica uma variação de polipeptídeoGP5 de PRRSV hipoglicosilada é obtido através da síntese direta, da muta-gênese de uma seqüência de nucleotídeos de GP5 do isolado de PRRSV daEuropa ou da mutagênese de uma seqüência de nucleotídeos de GP5 dePRRSV da Europa consenso.

64. Uso de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelofato de que a dita seqüência de nucleotídeos de GP5 do isolado de PRRSVda Europa codifica uma proteína GP5 que é pelo menos 85% idêntica à SEQID NO: 15.

65. Uso de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelofato de que a dita seqüência de nucleotídeos de GP5 de PRRSV da Europaé a SEQ ID NO: 15.

66. Uso de um polipeptídeo isolado como definido na reivindica-ção 32, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composiçãopara ativação de uma resposta imunológica maior em um porco para um an-tígeno do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV).