ES2343371T3 - Procedimientos y composiciones para la vacunacion de animales con antigenos de vsrrp con una inmunogenicidad mejorada. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende un polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 o a la asparagina 34 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un antígeno del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP).
Description
Procedimientos y composiciones para la
vacunación de animales con antígenos de VSRRP con una
inmunogenicidad mejorada.
La presente invención se realizó con
financiación del Gobierno de los Estados Unidos de acuerdo con la
National Research Initiative Competitive Grant Nº
2004-01576 del Departamento de Agricultura de los
Estados Unidos y de acuerdo con el programa COBRE del Instituto
Nacional de la Salud del National Center for Research Resources
Proyect Nº P20RR15636. El gobierno tiene ciertos derechos respecto a
la presente invención.
La presente invención se refiere en general a
composiciones que comprenden antígenos del Virus del Síndrome
Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP) con una inmunogenicidad
mejorada y a procedimientos para su uso. Las composiciones y
procedimientos descritos en el presente documento dan como resultado
respuestas inmunogénicas mejoradas de cerdos a antígenos de VSRRP,
proporcionando de este modo una protección mejorada de los cerdos
frente a la infección por VSRRP.
El VSRRP es un patógeno económicamente
importante que afecta a cerdos. La infección de cerdas multíparas y
cerdas nulíparas con VSRRP puede dar como resultado el fracaso
reproductivo. El VSRRP también causa enfermedades respiratorias en
cerdos de todas las edades. Es posible vacunar a los cerdos para
protegerlos de la infección por VSRRP. Sin embargo, las vacunas
actuales disponibles en el mercado (siendo la mayoría vacunas vivas
atenuadas) son algo ineficaces y por lo tanto deberían mejorarse.
Los mecanismos inmunológicos completos de la protección frente al
VSRRP no están claros; sin embargo, se ha demostrado claramente que
los anticuerpos neutralizantes contra VSRRP son fundamentales para
esta protección. Desgraciadamente, el propio VSRRP (en su forma de
tipo silvestre) o las vacunas vivas actuales obtenidas a partir del
mismo tienen una escasa capacidad para inducir anticuerpos
neutralizantes específicos de virus de una forma oportuna y a
niveles eficaces (es decir, protectores).
La Patente de Estados Unidos Nº 6.500.662,
"Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and
respiratory syndrome (SRRP) virus and uses thereof" (por Calvert
y col., 31 de diciembre, 2002) describe el desarrollo de un clon de
ADNc de VSRRP norteamericano infeccioso y su uso como vacuna. Sin
embargo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.500.662 no desvela
vacunas de VSRRP que comprendan antígenos de VSRRP
hipoglicosilados.
En otro estudio, se compararon secuencias de la
proteína GP5 (o proteína de la ORF5) de diversas cepas de VSRRP
norteamericano entre sí y con el aislado de VSRRP europeo
representativo conocido como la cepa Lelystad, poniendo de
manifiesto que los sitios de glicosilación ligada a N en la
Asparagina 44 (N44) y la Asparagina 51 (N51) de la secuencia
consenso de GP5 estaban conservados en todos los aislados de VSRRP
examinados (Pirzadeh y col., Can. J. Vet Res., 1998, 62:
170-177). Sin embargo, el sitio de
N-glicosilación localizado en la Asparagina 31
(N31) de la secuencia consenso de GP5 estaba ausente en ciertos
aislados de VSRRP norteamericanos y estaba ausente en el aislado de
la cepa Lelystad de VSRRP europeo. Se produjeron proteínas de fusión
recombinantes GST-GP5 de cuatro (4) cepas de VSRRP
norteamericano y de la cepa Lelystad en E. coli como cuerpos
de inclusión insolubles, se renaturalizaron y se usaron como
inmunógenos en conejos. Dichas proteínas recombinantes producidas
en E. coli conservan pero no glicosilan sus sitios de
N-glicosilación nativos.
También se ha demostrado que la inoculación de
cerdos con una vacuna de ADN que comprende la fusión de un promotor
de CMV con el gen de GP5 del aislado de VSRRP norteamericano
IAF-Klop proporciona protección en animales
inmunizados frente a la exposición a VSRRP (Pirzadeh y Dea, 1998, J.
General Virology, 79, 989-999). Este aislado de gen
de GP5 particular codifica una proteína GP5 que contiene los restos
Asparagina N31, N44 y N51 que presumiblemente están glicosilados
cuando se expresan en cerdos inmunizados con la vacuna de ADN. La
vacunación de cerdos con GST-GP5 producida en E.
coli, que conserva pero no glicosila los sitios de
N-glicosilación nativos del gen de GP5 de la cepa
IAF-Klop, no protegía los pulmones de los cerdos
expuestos a virus.
También se han descrito clones infecciosos de
VSRRP europeo que contienen mutaciones que dan como resultado la
expresión de proteínas de VSRRP hipoglicosiladas (Wissink y col.,
2004, J. Gen. Virol. 85: 3715-23). Esta referencia
particular informa de que los VSRRP que contienen mutaciones en el
resto Asparagina 53 (N53) de la proteína GP(5) de la cepa
Lelystad de VSRRP, que impiden la glicosilación ligada a N de ese
sitio, son infecciosos y pueden producir partículas de virus de la
cepa Lelystad de VSRRP infecciosas. Por el contrario, los VSRRP que
contienen mutaciones en la N46 de la proteína GP(5) de la
cepa Lelystad de VSRRP, que impiden la glicosilación ligada a N de
ese sitio, no son infecciosos y no producen partículas de virus de
la cepa Lelystad de VSRRP infecciosas. Wissink y col. especulan que
los sitios de N-glicanos en la proteína GP_{2a}
del VSRRP europeo y, por analogía, el sitio N53 de la proteína GP5,
podrían actuar a muchos niveles diferentes en el huésped natural,
incluyendo interacciones con receptores o protección frente al
sistema inmune. Kwang y col. (Research in Veterinary Science, vol.
67, nº 2, 1 de enero de 1999) desvelaron respuestas inmunes
celulares y humorales después de procedimientos de inmunización con
ADN usando las ORF 4, 5, 6 y 7 del virus SRRP. Plagemann y col.
(Archives of Virology, vol. 147, 1 de enero de 2002) desvela que un
epítope neutralizante de GP5 de VSRRP estaba localizado en un sitio
asociado con la unión de N-glicanos y que el sitio
estaba conservado entre aislados europeos y norteamericanos.
En virus distintos del VSRRP, se ha implicado a
los restos de glicanos en una diversidad de papeles. La
glicosilación ligada a N, en general, es importante para un
plegamiento, direccionamiento y actividad biológica correctos de
las proteínas (Helenius, A. y M. Aebi., Annu. Rev. Biochem. 73:
1019-1049, 2004; Williams, D. B. y Glycoconj J.,
12: iii-iv, 1995; Zhang, y col. Glycobiology 14:
1229-46, 2004). En muchos virus con envoltura, las
proteínas de la envoltura se modifican por adición de restos de
azúcares y la glicosilación ligada a N de proteínas de la envoltura
desempeña diversas funciones de glicoproteínas virales tales como
unión a receptor, fusión de membrana, penetración en células y
gemación de virus (Braakman, I. y E. van Anken, Traffic 1:
533-9, 2000; Doms y col. Virology 193:
545-62, 1993). Estudios recientes han demostrado el
papel de la glicosilación ligada a N de la glicoproteína de virus
Hantaan en el plegamiento de proteínas y el transporte intracelular
(Shi, X. y R. M., Elliott, J. Virol. 78: 5414-22,
2004), así como en la actividad biológica y la antigenicidad de la
proteína hemaglutinina (HA) de virus influenza (Abe, Y., y col., J.
Virol. 78: 9605-11, 2004). Además, se ha hecho
evidente que la glicosilación de proteínas de la envoltura viral es
un mecanismo principal para la evasión del sistema inmune y la
persistencia usado por varios virus con envoltura diferentes para
escapar, bloquear o minimizar la respuesta de anticuerpos
neutralizantes de virus. Se ha informado de ejemplos de este efecto
para el VIS (Reitter, J. N. y col., Nat. Med. 4:
679-84, 1998) y el VIH-1 (Wei, X. y
col., Nature 422: 307-12, 2003), el VHB (Lee, J. y
col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303: 427-32,
2003), virus influenza (Skehel, J. J. y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 1779-83, 1984) y el arterivirus VLD
(Chen, Z. y col. Virology 266: 88-98, 2000).
La presente invención se desarrolló a la vista
de los problemas anteriores. Se demuestra que las variantes
hipoglicosiladas de una proteína de superficie principal de VSRRP
GP5 aumentaba el nivel de anticuerpos neutralizantes de VSRRP
producidos por cerdos inmunizados respecto a los niveles de
anticuerpos neutralizantes producidos por cerdos inmunizados con
GP5 de tipo silvestre (wt) o glicosilada.
La presente invención proporciona primero una
composición que comprende un polinucleótido que codifica una
variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hiploglicosilada, en la que
al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la
asparagina 51 o a la asparagina 34 de una proteína GP5 de referencia
de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, para su uso en un procedimiento
de generación de una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra
un antígeno de virus del síndrome respiratorio y reproductivo
porcino (VSRRP). El polinucleótido puede comprender una molécula de
ARN de VSRRP infecciosa o una molécula de ADN que codifique una
molécula de ARN de VSRRP infecciosa. La molécula de ARN de VSRRP
infecciosa puede ser un derivado de VSRRP norteamericano o un
derivado VSRRP europeo. Como alternativa, este polinucleótido puede
comprender una molécula de ADN en la que un promotor activo en
células de mamífero se une operativamente a dicho polinucleótido que
codifica una proteína GP5 hipoglicosilada. Este promotor es un
promotor de CMV en ciertas realizaciones preferidas de la
invención. Como alternativa, el polinucleótido puede ser un vector
viral. Los vectores virales representativos que pueden usarse
incluyen vectores de virus vaccinia, vectores de virus herpes
simple, vectores de adenovirus, vectores de alfavirus y vectores
del virus de la GET.
Pueden usarse una diversidad de tipos y fuentes
de secuencias de VSRRP para obtener el polinucleótido que codifica
una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada, en la
que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a
la asparagina 34 o a la asparagina 51 de una proteína GP5 de
referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado. En ciertas
realizaciones de la invención, se obtiene un polinucleótido que
codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada
por síntesis directa, mutagénesis de una secuencia de nucleótidos
de GP5 aislada de VSRRP norteamericano o mutagénesis de una
secuencia de nucleótidos consenso de GP5 de VSRRP norteamericano.
La secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP norteamericano
puede seleccionarse del grupo de nucleótidos que codifican las
proteínas GP5 de las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC
ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8,
SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12 y SEC ID
Nº: 13. La secuencia de nucleótidos consenso de GP5 de VSRRP
norteamericano codifica una proteína GP5 consenso que tiene una
identidad de al menos el 85% con la SEC ID Nº: 14. En otras
realizaciones de la invención, el polinucleótido que codifica una
variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada se obtiene
por síntesis directa, mutagénesis de una secuencia de nucleótidos de
GP5 aislada de VSRRP europeo o mutagénesis de una secuencia de
nucleótidos consenso de GP5 de VSRRP europeo. La secuencia de
nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP europeo codifica una proteína
GP5 que tiene una identidad de al menos el 85% con la SEC ID Nº:
15.
Pueden usarse una diversidad de procedimientos
de inactivación de sitios de glicosilación ligada a N específicos
para poner en práctica eficazmente el procedimiento de la presente
invención. Un procedimiento preferido de inactivación de un sitio
de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51
consiste en sustituir el codón de asparagina con un codón que
codifica un aminoácido distinto de asparagina. Este codón de
sustitución puede codificar un resto alanina o glutamina. En
realizaciones más preferidas, ambos de dichos sitios de
glicosilación ligada a N correspondientes a la asparagina 34 y a la
asparagina 51 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1
están inactivadas. En otras realizaciones, el sitio de glicosilación
ligada a N correspondiente a la asparagina 34 está inactivado. Este
sitio de glicosilación ligada a N de la asparagina 34 puede
inactivarse por sustitución de un codón que codifique dicha
asparagina 34 con un codón que codifique un aminoácido distinto de
asparagina. El codón que codifica otro aminoácido puede codificar un
resto alanina o glutamina. En otras realizaciones preferidas, ambos
sitios de glicosilación ligada a N correspondientes a la asparagina
34 y a la asparagina 51 de una proteína GP5 de referencia pueden
inactivarse por sustitución de los codones que codifican la
asparagina 34 y la asparagina 51 con codones que codifiquen un
aminoácido distinto de asparagina. Ambos codones que codifican la
asparagina 34 y la asparagina 51 pueden sustituirse con codones que
codifiquen un resto alanina o glutamina para inactivar esos sitios
de glicosilación. Como alternativa, ambos codones pueden
sustituirse con codones que codifiquen un resto alanina para
inactivar ambos sitios de glicosilación. Como alternativa, uno de
los sitios de glicosilación ligada a N se inactiva por sustitución
de un codón que codifica dicha asparagina 34 o dicha asparagina 51
con un codón que codifica un aminoácido distinto de asparagina,
mientras que el otro sitio de glicosilación ligada a N se inactiva
por otras técnicas.
En realizaciones preferidas, la invención emplea
una molécula de ARN de VSRRP infecciosa que es un derivado de VSRRP
norteamericano que codifica una proteína variante polipeptídica de
GP5 de VSRRP hipoglicosilada en la que al menos un sitio de
glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 34 o a la
asparagina 51 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1
está inactivado. En realizaciones más preferidas, ambos de dichos
sitios de glicosilación ligada a N correspondientes a la asparagina
34 y a la asparagina 51 de una proteína GP5 de referencia de la SEC
ID Nº: 1 están inactivados. Ambos sitios de glicosilación ligada a
N correspondientes a la asparagina 34 y a la asparagina 51 de una
proteína GP5 de referencia pueden inactivarse por sustitución de
los codones que codifican la asparagina 34 y la asparagina 51 con
codones que codifiquen un aminoácido distinto de asparagina. Ambos
codones que codifican la asparagina 34 y la asparagina 51 pueden
sustituirse con codones que codifiquen un resto alanina o glutamina
para inactivar esos sitios de glicosilación. Como alternativa,
ambos codones pueden sustituirse con codones que codifiquen un resto
alanina para inactivar ese sitio de glicosilación.
Para poner en práctica la invención, la
composición que contiene un polinucleótido se administra por
inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección
intradérmica, inyección parenteral, inyección intramuscular,
inyección sin aguja, electroporación, administración por vía oral,
administración intranasal, administración oronasal o cualquier
combinación de las mismas. La composición administrada puede
comprender además un vehículo terapéuticamente aceptable. Este
vehículo terapéuticamente aceptable se selecciona del grupo
constituido por una proteína, un tampón, un tensioactivo y un
polímero de polietilenglicol, o cualquier combinación de los
mismos.
La composición administrada puede comprender
además un adyuvante. Este adyuvante puede ser hidróxido de aluminio,
Quil A, una suspensión de gel de alúmina, aceites minerales,
glicéridos, ácidos grasos, subproductos de ácidos grasos,
micobacterias y oligodesoxinucleótidos CpG o cualquier combinación
de los mismos. La composición administrada también puede comprender
un segundo adyuvante tal como interleucina 1 (IL-1),
IL-2, IL4, IL-5, IL6,
IL-12, interferón gamma (IFN-g),
factor de necrosis tumoral, MDP (dipéptido de muramilo), complejo
inmunoestimulante (ISCOM) y liposomas.
La respuesta inmune mejorada de un cerdo contra
un antígeno de VSRRP puede comprender una producción aumentada de
anticuerpos neutralizantes de VSRRP por dicho cerdo. La producción
aumentada de anticuerpos neutralizantes de VSRRP se observa
típicamente tras la inmunización del cerdo por los procedimientos y
composiciones de la presente invención. La respuesta inmune
mejorada puede obtenerse en una cerda multípara, una cerda nulípara,
un verraco o un cochinillo.
La invención también proporciona una composición
que comprende una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP
hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada
a N correspondiente a la asparagina 51 y a la asparagina 34 de una
proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, para
su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmune
mejorada en un cerdo contra un antígeno del virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP). La proteína variante
polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada puede producirse
mediante los mismos polinucleótidos usados en los procedimientos
descritos anteriormente en sistemas de expresión bacterianos, de
levaduras o mamíferos.
La presente invención también proporciona
composiciones que comprenden un polinucleótido que codifica una
variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano
hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación
ligada a N correspondiente a la asparagina 51 de una proteína GP5 de
referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, y un vehículo
terapéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, las
composiciones comprenden polinucleótidos en los que ambos sitios de
glicosilación ligada a N correspondientes a la asparagina 34 y a la
asparagina 51 de la SEC ID Nº: 1 están inactivados. En
realizaciones preferidas, esta composición puede comprender una
molécula de ARN de VSRRP norteamericano infecciosa o una molécula de
ADN que codifique una molécula de ARN de VSRRP norteamericano
infecciosa. En otras realizaciones, el polinucleótido comprende una
molécula de ADN en la que un promotor activo en células de mamífero
se une operativamente a dicho polinucleótido que codifica dicha
variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano
hipoglicosilada. En ciertas realizaciones preferidas, este promotor
es un promotor de CMV. En otras realizaciones más, el polinucleótido
de la composición comprende un vector viral. Los vectores virales
que pueden usarse en la composición pueden ser uno cualquiera de un
vector de virus vaccinia, un vector de virus herpes simple, un
vector de adenovirus, un vector de alfavirus o un vector del virus
de la GET.
En los polinucleótidos de la composición, un
sitio de glicosilación ligada a N se inactiva por sustitución de un
codón que codifica dicha asparagina 51 con un codón que codifica un
aminoácido distinto de asparagina. El codón que codifica un
aminoácido distinto de asparagina codifica un resto alanina o
glutamina. En otras realizaciones de esta composición, un sitio de
glicosilación ligada a N adicional se inactiva por sustitución de
un codón que codifica la asparagina 34 con un codón que codifica un
aminoácido distinto de asparagina. Este codón que codifica otro
aminoácido puede codificar un resto alanina o glutamina. Se
proporcionan por lo tanto mediante esta solicitud composiciones
preferidas que comprenden polinucleótidos que codifican una
proteína variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano
hipoglicosilada, en la que ambos de dichos sitios de glicosilación
ligada a N correspondientes a la asparagina 34 y a la asparagina 51
de una proteína GP5 de referencia de virus norteamericano de la SEC
ID Nº: 1 están inactivados. Ambos de dichos sitios de glicosilación
ligada a N pueden inactivarse por sustitución de los codones que
codifican dicha asparagina 34 y dicha asparagina 51 con codones que
codifiquen un aminoácido distinto de asparagina. Estos codones que
codifican un aminoácido distinto de asparagina pueden codificar un
resto alanina o glutamina.
El vehículo terapéuticamente aceptable usado en
la composición puede ser una proteína, un tampón, un tensioactivo y
un polímero de polietilenglicol, o cualquier combinación de los
mismos. La composición comprende además al menos un adyuvante. Este
adyuvante puede ser hidróxido de aluminio, Quil A, una suspensión de
gel de alúmina, aceites minerales, glicéridos, ácidos grasos,
subproductos de ácidos grasos, micobacterias y
oligodesoxinucleótidos CpG o cualquier combinación de los mismos.
La composición puede comprender además un segundo adyuvante
seleccionado del grupo constituido por interleucina 1
(IL-1), IL-2, IL4,
IL-5, IL6, IL-12, interferón gamma
(IFN-g), factor de necrosis tumoral, MDP (dipéptido
de muramilo), complejo inmunoestimulante (ISCOM) y liposomas.
También se proporciona mediante la presente
invención una composición que comprende una variante polipeptídica
de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada, en la que al menos
un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la
asparagina 51 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1
está inactivado, y un vehículo terapéuticamente aceptable. En
realizaciones preferidas, los sitios de glicosilación ligada a N
correspondientes tanto a la asparagina 34 como a la asparagina 51
de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 están
inactivados. La proteína variante polipeptídica de GP5 de VSRRP
hipoglicosilada puede producirse mediante los mismos polinucleótidos
usados en los procedimientos descritos anteriormente en sistemas de
expresión bacterianos, de levaduras o mamíferos.
La presente invención también proporciona
polinucleótidos aislados que codifican una variante poilpeptídica
de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada en la que al menos un
sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina
51 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está
inactivado. En ciertas realizaciones, se proporcionan
polinucleótidos en los que ambos sitios de glicosilación ligada a N
correspondientes a la asparagina 34 y a la asparagina 51 están
inactivados. En realizaciones preferidas, este polinucleótido
aislado puede comprender una molécula de ARN de VSRRP
norteamericano infecciosa o una molécula de ADN que codifica una
molécula de ARN de VSRRP norteamericano infecciosa. En otras
realizaciones, el polinucleótido aislado comprende una molécula de
ADN en la que un promotor activo en células de mamíferos se une
operativamente a dicho polinucleótido que codifica dicha variante
polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada. En
ciertas realizaciones preferidas, este promotor es un promotor de
CMV. En otras realizaciones más, el polinucleótido aislado
comprende un vector viral. Los vectores virales que pueden usarse en
la composición pueden ser uno cualquiera de un vector de virus
vaccinia, un vector de virus herpes simple, un vector de adenovirus,
un vector de alfavirus y un vector del virus de la GET.
En los polinucleótidos aislados, un sitio de
glicosilación ligada a N se inactiva por sustitución de un codón
que codifica dicha asparagina 51 con un codón que codifica un
aminoácido distinto de asparagina. El codón que codifica un
aminoácido distinto de asparagina codifica un resto alanina o
glutamina. En otras realizaciones preferidas, un sitio de
glicosilación ligada a N adicional se inactiva por sustitución de un
codón que codifica la asparagina 34 con un codón que codifica un
aminoácido distinto de asparagina. Este codón que codifica otro
aminoácido puede codificar un resto alanina o glutamina. Por lo
tanto, se proporcionan polinucleótidos preferidos que codifican una
proteína variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano
hipoglicosilada en la que ambos de dichos sitios de glicosilación
ligada a N correspondientes a la asparagina 34 y a la asparagina 51
de una proteína GP5 de referencia de virus norteamericano de la SEC
ID Nº: 1 están inactivados. Ambos de dichos sitios de glicosilación
ligada a N pueden inactivarse por sustitución de los codones que
codifican dicha asparagina 34 y dicha asparagina 51 con codones que
codifiquen un aminoácido distinto de asparagina. Estos codones que
codifican un aminoácido distinto de asparagina pueden codificar un
resto alanina o glutamina.
La invención también proporciona un polipéptido
aislado que es una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP
norteamericano hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de
glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 de una
proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado. La
proteína variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada
aislada puede producirse mediante los mismos polinucleótidos usados
en los procedimientos descritos anteriormente en sistemas de
expresión bacterianos, de levaduras o mamíferos, y purificarse por
cromatografía u otras técnicas.
Características y ventajas adicionales de la
presente invención, así como la estructura y el funcionamiento de
diversas realizaciones de la presente invención, se describen en
detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos.
Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y
forman parte de la memoria descriptiva, ilustran las realizaciones
de la presente invención y, junto con la descripción, sirven para
explicar los principios de la invención. En los
dibujos:
dibujos:
La Figura 1 ilustra la expresión transitoria de
las proteínas GP5 y M de VSRRP. A. Representación esquemática de la
construcción bicistrónica que muestra las regiones codificantes de
GP5 y M flanqueando el IRES (IE) del virus de la
encefalomiocarditis. Las regiones codificantes están bajo el control
del promotor de la ARN polimerasa de T7 (rectángulo negro),
presente inmediatamente cadena arriba de la región codificante de
GP5. La flecha doblada muestra la posición y la dirección de la
transcripción por la ARN polimerasa de T7 desde el vector. B.
Expresión de las proteínas GP5 y M en células transfectadas con el
vector bicistrónico. Las células con transfección simulada (carril
1) o transfectadas con plásmido (carriles 2-7) se
radiomarcaron como se describe en los Materiales y Procedimientos,
se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-Gp5
(carriles 1-5) o anticuerpo anti-M
(carriles 6-7). Las proteínas inmunoprecipitadas se
dejaron sin tratar (-) (carriles 1, 2, 6 y 7) o se trataron (+) con
Endo H (carril 3), PNGasa F (carril 4) y se analizaron por
electroforesis. El carril 5 contiene proteínas inmunoprecipitadas
de células transfectadas tratadas (+) con tunicamicina. Se muestra
la movilidad de las proteínas con respecto a su masa molecular
relativa (Mr) en kilodaltons.
La Figura 2 ilustra el análisis de glicosilación
de WT-GP5 y sus mutantes usando un plásmido
bicistrónico. A. Se muestra una representación esquemática del
vector bicistrónico y de la GP5 de VSRRP con los tres supuestos
sitios de glicosilación en las posiciones aminoacídicas 34, 44 y 51.
B. Diversos mutantes usados en el presente estudio. C. Expresión de
GP5 wt y mutante y su sensibilidad a Endo H. El experimento se
realizó como se describe en la leyenda de la Figura 1, las
proteínas se inmunoprecipitaron con anticuerpo
anti-GP5, se digirieron con Endo H (+) o se dejaron
sin digerir (-) y se analizaron por electroforesis. Las proteínas
GP5 mutantes se muestran mediante puntas de flecha. Se muestra a la
derecha la movilidad de las proteínas con respecto a su masa
molecular relativa (Mr) en
kilodaltons.
kilodaltons.
La Figura 3 ilustra la caracterización de virus
mutantes que codifican una GP5 mutante. A. Cinética de crecimiento
en una sola etapa de VSRRP wt (FL-12) y diversos
VSRRP mutantes en células MARC-145. Se infectaron
células en placas de seis pocillos con VSRRP a una MOI de 3, se
recogieron los sobrenadantes de cultivo a los tiempos indicados
después de la infección y se determinaron los títulos de virus. Se
muestra el promedio de los títulos con su desviación típica (barras
de error) de tres experimentos independientes. B. Morfología de
placas de virus mutantes. Las flechas sin relleno y puntas de
flecha muestran placas que están menos claras. C.
Trans-complementación para recuperar VSRRP
mutantes. Análisis cuantitativo de la recuperación de virus mutante
a partir de células que expresan proteína GP5 wt. Se muestra el
promedio de la producción de virus de tres experimentos
independientes con su desviación típica (representada mediante
barras de error).
La Figura 4 ilustra un examen de la GP5
incorporada en viriones mutantes y sintetizada en células infectadas
por virus mutante. A. Los viriones radiomarcados de sobrenadantes
de cultivo de células infectadas se sedimentaron, se
inmunoprecipitó la proteína GP5, se trató con (+) o sin (-) Endo H y
se analizó por electroforesis. La GP5 con y sin digestión con Endo
H en los carriles 1 y 2 se muestra mediante llaves blancas. B. Se
radiomarcaron células infectadas con diversos virus mutantes, se
inmunoprecipitó la GP5, se trató con (+) o sin (-) Endo H y se
analizó por electroforesis. La GP5 con y sin digestión con Endo H en
los carriles 2 y 3 se muestra mediante llaves blancas. La movilidad
de las proteínas con respecto a su masa molecular relativa (Mr) en
kilodaltons se muestra en el lado derecho de cada panel.
La Figura 5 ilustra un alineamiento de
secuencias de aminoácidos N-terminales de GP5 de
VSRRP norteamericano con la secuencia N-terminal de
referencia de GP5 de VSRRP norteamericano (SEC ID Nº: 1; cepa NVSL
97-7895). Se muestran los primeros 60 aminoácidos
N-terminales de un alineamiento de las proteínas de
200 aminoácidos. Los sitios de glicosilación ligada a N de la
asparagina 34 "NSS" y de la asparagina 51 "NGT" de las
proteínas se muestran en negrita. Otros sitios de glicosilación
ligada a N localizados entre los restos 29 y 35 de la proteína GP5
de referencia están subrayados.
La Figura 6 ilustra un alineamiento de la
secuencia de aminoácidos N-terminal de GP5 de VSRRP
europeo con la secuencia N-terminal de referencia
de GP5 de VSRRP norteamericano (SEC ID Nº: 1; cepa NVSL
97-7895). Se muestra un alineamiento de la proteína
GP5 completa de proteínas de aproximadamente 200 aminoácidos en el
que el sitio de glicosilación ligada a N de la asparagina 51
"NGT" se muestra en negrita (es decir, la asparagina 53 de la
SEC ID Nº: 15).
La expresión "vehículo aceptable", como se
usa en el presente documento, se refiere a un vehículo que no es
perjudicial para los demás ingredientes de la composición y que no
es perjudicial para el material al que se va a aplicar. La
expresión "vehículo terapéuticamente aceptable" se refiere a un
vehículo que no es perjudicial para los demás ingredientes de la
composición y que no es perjudicial para el ser humano u otro
destinatario animal de la misma. En el contexto de los demás
ingredientes de la composición, "no perjudicial" significa que
el vehículo no reaccionará con ni degradará los demás ingredientes
ni interferirá de otro modo con su eficacia. La interferencia con
la eficacia de un ingrediente no incluye la simple dilución del
ingrediente. En el contexto del animal, "no perjudicial"
significa que el vehículo no causa lesiones ni es letal para la
planta o animal.
El término "adyuvante", como se usa en el
presente documento, se refiere a cualquier material usado junto con
un antígeno que aumenta la capacidad de ese antígeno para inducir
una respuesta inmune.
La "administración", como se usa en el
presente documento, se refiere a cualquier medio para proporcionar
un polinucleótido, un polipéptido o composición de los mismos a un
sujeto. Los ejemplos no limitantes de medios de administración
incluyen la inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección
intradérmica, inyección parenteral, inyección intramuscular,
inyección sin aguja, electroporación, administración por vía oral,
administración intranasal, administración oronasal o cualquier
combinación de las mismas.
El término "antígeno", como se usa en el
presente documento, se refiere a cualquier entidad que induzca una
respuesta inmune en un huésped.
La expresión "secuencia consenso", como se
usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de
aminoácidos, de ADN o ARN generada por alineamiento de dos o más
secuencias homólogas y de la que se obtiene a nueva secuencia que
representa la secuencia común de aminoácidos, ADN o ARN.
La expresión "variante polipeptídica de GP5 de
VSRRP hipoglicosilada", como se usa en el presente documento, se
refiere a proteínas GP5 de VSRRP en las que la secuencia de
aminoácidos original o no variante que comprende uno o más sitios
de glicosilación ligada a N se ha modificado para reducir el número
de sitios de glicosilación ligada a N en la proteína variante de
GP5 resultante. De acuerdo con esta definición, la expresión de una
proteína GP5 original o no variante en E. coli para producir
una proteína GP5 con la secuencia original de GP5 que contenga el
mismo número de sitios de glicosilación no daría como resultado la
producción de una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP
hipoglicosilada.
La expresión "respuesta inmune", como se
usa en el presente documento, se refiere a la producción de
anticuerpos y/o células (tales como linfocitos T) que se unen,
degradan o inhiben de otro modo un antígeno particular. Expresiones
relacionadas tales como "una respuesta inmune mejorada" se
refieren al uso de los procedimientos y composiciones que dan como
resultado cualquier mejora medible en la respuesta de un huésped
inmunizado contra un antígeno. Por ejemplo, las mejoras medibles en
una respuesta inmune incluyen, pero sin limitación, una producción
aumentada de anticuerpos neutralizantes (es decir, títulos de
anticuerpos aumentados) respecto a los niveles de producción
observados en animales de control que se han inmunizado con
antígenos que carecen de las modificaciones estructurales que
proporcionan una respuesta inmune mejorada.
La expresión "molécula de ARN infecciosa"
se refiere a una molécula de ARN que codifica todos los elementos
necesarios para la producción de un virión funcional cuando se
introduce en una célula huésped permisiva.
La expresión "clon infeccioso", como se usa
en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN que
codifica una molécula de ARN infecciosa.
La expresión "VSRRP norteamericano", como
se usa en el presente documento, se refiere a cualquier VSRRP que
comprende secuencias polinucleotídicas asociadas con aislados de
VSRRP norteamericanos tales como, pero sin limitación, la cepa NVSL
97-7895 (Truong y col., Virology, 325:
308-319 y referencias contenidas en la misma) o las
cepas IAF-Klop, MLV, ATCC VR-2332,
ATCC VR-2385, IAF-BAJ,
IAF-DESR, IAF-CM, IAF
93-653, IAF 93-2616, IAF
94-3182, IAF 94-287 descritas en
Pirzadeh y col. Can. J. Vet Res, 62: 170-177 y
referencias contenidas en la misma). Para la presente invención,
los VSRRP que comprenden secuencias polinucleotídicas asociadas con
aislados de VSRRP norteamericanos son VSRRP que contienen secuencias
polinucleotídicas en las que la región codificante de GP5 codifica
un polipéptido que tiene una identidad de secuencia proteica de al
menos el 85% con la SEC ID Nº: 1.
La expresión "VSRRP europeo", como se usa
en el presente documento, se refiere a cualquier VSRRP que comprende
secuencias polinucleotídicas asociadas con aislados de VSRRP
norteamericanos, tales como, pero sin limitación, la cepa Lelystad
(Wissink y col., J. Gen. Virol. 85: 3715, 2004 y referencias
contenidas en la misma). Para la presente invención, los VSRRP que
comprenden secuencias polinucleotídicas asociadas con aislados de
VSRRP europeos son VSRRP que contienen secuencias polinucleotídicas
en las que la región codificante de GP5 codifica un polipéptido que
tiene una identidad de secuencia proteica de al menos el 85% con la
SEC ID Nº:
15.
15.
El "porcentaje de identidad", como se usa
en el presente documento, se refiere al número de elementos (es
decir, aminoácidos o nucleótidos) en una secuencia que son idénticos
dentro de una longitud definida de dos segmentos de ADN, ARN o
proteína óptimamente alineados. Para calcular el "porcentaje de
identidad", el número de elementos idénticos se divide entre el
número total de elementos en la longitud definida de los segmentos
alineados y se multiplica por 100. Cuando el porcentaje de identidad
se usa en relación con proteínas, se entiende que ciertos restos
aminoacídicos pueden no ser idénticos pero ser sin embargo
sustituciones de aminoácidos conservativas, que reflejan
sustituciones de restos aminoacídicos con propiedades químicas
similares (por ejemplo, restos ácidos o básicos, hidrófobos,
hidrófilos, donadores o aceptores de enlaces de hidrógeno). Dichas
sustituciones pueden no cambiar las propiedades funcionales de la
molécula. Por consiguiente, el porcentaje de identidad de las
secuencias de proteínas puede aumentarse para representar las
sustituciones conservativas.
La glicoproteína 5 (GP5) del virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP) es la glicoproteína de
la envoltura más abundante y un inductor muy importante de
anticuerpos neutralizantes in vivo. Tres supuestos sitios de
glicosilación ligada a N (N34, N44 y N51) se localizan en el
ectodominio de GP5, donde también existe un epítope de
neutralización principal. Para determinar cuál de estos supuestos
sitios de glicosilación se usa en el ciclo vital del VSRRP y el
papel de los restos de glicanos en la inducción de anticuerpos
neutralizantes, los presentes inventores generaron un panel de
mutantes de GP5 que contenían sustituciones de aminoácidos
individuales o múltiples en estos sitios. La expresión transitoria
de las proteínas de tipo silvestre (wt) así como mutantes y los
estudios bioquímicos posteriores pusieron de manifiesto que la GP5
madura contiene restos de azúcares de tipo de alto contenido en
manosa en los tres sitios. Posteriormente estas mutaciones se
incorporaron en un clon de ADNc de longitud completa para recuperar
VSRRP infeccioso. Los resultados de los presentes inventores
demuestran que las mutaciones que implicaban al resto N44 no daban
como resultado la producción de progenie infecciosa, indicando que
la N44 es el resto aminoacídico más crítico para la infectividad
viral. Los virus que llevaban mutaciones en las posiciones N34, N51
y N34/51 se desarrollaban hasta títulos menores que el VSRRP wt y
presentaban un efecto citopático reducido en células MARC 145. En
ensayos de neutralización en suero, los virus mutantes presentaban
una sensibilidad aumentada a la neutralización por anticuerpos
específicos de VSRRP wt. Además, la inoculación de cerdos con los
virus mutantes inducía niveles significativamente superiores de
anticuerpos neutralizantes contra el VSRRP mutante así como contra
el VSRRP wt, sugiriendo por lo tanto que la pérdida de restos de
glicanos en el ectodominio de GP5 aumenta tanto la sensibilidad de
estos virus a la neutralización in vitro como la
inmunogenicidad del epítope de neutralización cercano. Estos
resultados deberían tener una gran importancia para el desarrollo
de vacunas de VSRRP de eficacia protectora mejorada.
Se sabe que los anticuerpos neutralizantes son
un factor de correlación importante de la protección frente al
VSRRP. Los presentes inventores han descubierto que la eliminación
de sitios de glicosilación en la proteína GP5 de VSRRP da como
resultado un aumento significativo de: (1) la capacidad de la cepa
de VSRRP modificada para ser neutralizada por un antisuero de
convaleciente de VSRRP y (2) la capacidad de esta cepa de VSRRP
modificada para producir niveles de anticuerpos neutralizantes de
VSRRP sin precedentes cuando se usa para inocular cerdos. La
aplicación de este concepto a cualquier virus vivo (wt o atenuado)
para la inmunización frente a la infección por VSRRP tendría un
impacto significativo en su uso para conferir una protección eficaz
frente a la infección por
VSRRP.
VSRRP.
En el momento actual, existen tres estrategias
principales para inmunizar frente a infecciones por VSRRP: (1)
vacunas vivas atenuadas, (2) vacunas inactivadas (que se basan en
VSRRP wt cultivado in vitro e inactivado químicamente) y (3)
el uso de una infección a propósito con VSRRP wt virulento de forma
sistemática a todos los animales de la piara. Existen muchas
discusiones y controversia acerca de cuál de estas 3 formas es la
más eficaz. La presente invención sería beneficiosa
independientemente de la estrategia usada para la inmunización. La
alteración genética de un VSRRP vivo para modificar el nivel de
glicosilación de sus proteínas puede realizarse en la cepa vacunal
de VSRRP atenuada o la cepa de VSRRP wt usada para producir una
vacuna inactivada, o la cepa de VSRRP wt usada para la inoculación
directa de la piara por infección masiva.
El virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (VSRRP) pertenece a la familia
Arteriviridae dentro del orden Nidovirales, que
también incluye el virus de la arteritis equina (VAE), el virus
elevador de la lactato deshidrogenasa (VLD) y el virus de la fiebre
hemorrágica de los simios (VFHS). El genoma viral es una molécula
de ARN lineal de cadena positiva de aproximadamente 15,0 kb de
longitud y posee una estructura de caperuza en el extremo 5' y una
cola poli(A) en el extremo 3'. Están codificadas ocho fases
de lectura abierta (ORF) en el genoma viral. Las primeras dos fases
de lectura abierta (ORF1a y ORF1ab) codifican poliproteínas virales
no estructurales (NS) que están implicadas en el procesamiento de
las poliproteínas y en la transcripción y replicación del genoma.
Las proteínas virales estructurales, codificadas en las
ORF2-7, se expresan a partir de seis ARNm
subgenómicos con caperuza y poliadenilados que se sintetizan como un
conjunto anidado 3'-coterminal de ARNm con una
secuencia líder común en el extremo 5'. La proteína de la envoltura
viral principal es la glicoproteína 5 (GP5), que está codificada en
la ORF5 del genoma viral. La GP5 es una proteína transmembrana
glicosilada de aproximadamente 25 kDa de tamaño. Tiene un supuesto
péptido señal N-terminal y posee tres sitios de
glicosilación ligada a N potenciales que se localizan en un pequeño
ectodominio que comprende los primeros 40 restos de la proteína
madura. En el VAE y el VLD, la glicoproteína de la envoltura
principal forma un heterodímero unido por enlace disulfuro con el
producto génico de la ORF6, la proteína viral de la matriz (M). Se
ha observado una interacción similar entre las proteínas GP5 y M
del VSRRP pero el modo de interacción no se ha definido todavía. Se
ha postulado que la formación de heterodímeros de las proteínas GP5
y M puede desempeñar un papel crítico en el ensamblaje de VSRRP
infecciosos. Además de este papel en el ensamblaje del virus, la GP5
parece estar implicada en la entrada del virus en células huésped
susceptibles. Se supone que la GP5 interacciona con el receptor de
la célula huésped, la sialoadhesina, para su entrada en macrófagos
alveolares porcinos (MAP), las células diana in vivo para el
VSRRP. El papel de la GP5 en el reconocimiento del receptor se
confirma por la presencia de un epítope de neutralización principal
en el ectodominio N-terminal, implicando por lo
tanto un papel fundamental del ectodominio de GP5 en el proceso
infeccioso.
Los glicanos ligados a N del ectodominio GP5
pueden ser críticos para un funcionamiento apropiado de la proteína.
La glicosilación ligada a N, en general, es importante para el
plegamiento, direccionamiento y actividad biológica correctos de
las proteínas. En muchos virus con envoltura, las proteínas de la
envoltura se modifican por adición de restos de azúcares y la
glicosilación ligada a N de la proteína de la envoltura desempeña
diversas funciones de glicoproteínas virales tales como unión a
receptor, fusión de membrana, penetración en células y gemación de
virus. Estudios recientes han demostrado el papel de la
glicosilación ligada a N de la glicoproteína de virus Hantaan en el
plegamiento de la proteína y el transporte intracelular, así como en
la actividad biológica y en la antigenicidad de la proteína
hemaglutinina (HA) de virus influenza. Además, se ha hecho evidente
que la glicosilación de proteínas de la envoltura viral es un
mecanismo principal para la evasión inmune y la persistencia del
virus usado por varios virus con envoltura diferentes para escapar,
bloquear o minimizar la respuesta de anticuerpos neutralizantes de
virus. Se ha informado de ejemplos de este efecto para el VIS y el
VIH-1, el VHB, virus influenza y, lo que es más
importante en el caso del VSRRP, el arterivirus VLD.
Recientemente, se ha informado del desarrollo de
sistemas genéticos inversos para VSRRP en varios laboratorios
incluyendo el de los presentes inventores. Evidentemente, los
estudios mutacionales con clones infecciosos han conducido a un
mejor entendimiento de los mecanismos de transcripción y replicación
del genoma viral de los arterivirus. Por lo tanto, para examinar la
importancia de la glicosilación ligada a N en la actividad
biológica de GP5 de VSRRP en la generación de virus infecciosos o la
generación de anticuerpos neutralizantes in vivo, los
presentes inventores han construido una serie de proteínas GP5
mutantes en las que cada uno de los sitios de glicosilación ligada
a N potenciales se ha mutado individualmente o en diversas
combinaciones. Las proteínas mutantes resultantes se examinaron
para determinar su patrón de glicosilación, su papel en la
recuperación de virus infeccioso y en la neutralización cruzada por
anticuerpos generados, por medio de inoculaciones experimentales,
contra el VSRRP wt o contra los virus mutantes. Los datos de los
presentes inventores muestran que los tres supuestos sitios de
glicosilación se usan para la glicosilación con glicanos de tipo de
alto contenido en manosa y que la glicosilación de la proteína GP5
en el resto 44 es crítica para la recuperación de VSRRP
infecciosos. De forma muy importante, los datos de los presentes
inventores a partir de los estudios de neutralización y respuesta
de anticuerpos indican que la infección natural con VSRRP puede
implicar una evasión del sistema inmune basada en mecanismos de
protección de glicanos como se ha descrito previamente para otros
virus, contribuyendo por lo tanto a explicar la respuesta inmune
humoral protectora bastante ineficaz que se observa en animales
infectados por
VSRRP.
VSRRP.
\vskip1.000000\baselineskip
La glicosilación ligada a N en glicoproteínas se
produce típicamente en secuencias
Asn-Xaa-Ser/Thr (NXS/T) donde Xaa
(X) es cualquier resto aminoacídico excepto Pro. Pueden introducirse
una diversidad de mutaciones en sitios de glicosilación ligada a N
para proporcionar su inactivación. Un procedimiento de inactivación
preferido comprende la sustitución del resto asparagina con un resto
que codifique cualquier aminoácido distinto de asparagina. En
realizaciones más preferidas de la presente invención, el resto
asparagina se sustituye con un resto alanina o
glutamina.
glutamina.
Otros procedimientos de inactivación de sitios
glicosilación ligada a N y, en particular, los sitios de
glicosilación ligada a N correspondientes a las asparaginas 34 y/o
51 de la proteína de referencia GP5 de la SEC ID Nº: 1, también se
contemplan en el presente documento. Las sustituciones de ciertos
aminoácidos tales como prolina, triptófano, aspartato, glutamato o
leucina en la posición Xaa también pueden usarse para inactivar
sitios de glicosilación ligada a N (Kasturi y col., Biochem J. 323
(2):415-9, 1997). Como alternativa, también pueden
usarse sustituciones de la posición hidroxiaminoacídica final del
sitio de glicosilación ligada a N (es decir, el resto serina o
treonina de la secuencia NXS/T) con cualquier aminoácido que no sea
un hidroxiaminoácido (es decir, cualquier aminoácido distinto de
serina o treonina) para inactivar el sitio de glicosilación ligada
a N. Los ejemplos de aminoácidos que no son hidroxiaminoácidos que
se han usado para inactivar sitios de glicosilación ligada a N
incluyen cisteína (Kasturi y col., J. Biol. Chemistry 270 (24),
14756-14761, 1995).
Además de las sustituciones de aminoácidos,
también se contemplan en la presente invención otros tipos de
mutaciones que inactiven sitios de glicosilación ligada a N tales
como inserciones de aminoácidos o deleciones de aminoácidos. Los
expertos en la materia apreciarán que un sitio de glicosilación
ligada a N puede inactivarse fácilmente por deleciones que eliminen
aminoácidos clave en la secuencia NXS/T (es decir, los restos
asparagina), que darán como resultado la inactivación de ese sitio
de glicosilación. Las deleciones del resto X o del resto
serina/treonina pueden inactivar de forma similar ciertos sitios de
glicosilación ligada a N en los que el resto S o T no está seguido
de otro resto S o T en la secuencia de origen natural. Cuando X es
un aminoácido que no es un hidroxiaminoácido (es decir, no es
serina ni treonina), las inserciones de cualquier resto aminoacídico
en el extremo carboxi terminal del resto N pueden inactivar el
sitio de glicosilación ligada a N. Las inserciones de cualquier
aminoácido que no sea un hidroxiaminoácido en el extremo carboxi
terminal del resto X también pueden inactivar el sitio de
glicosilación ligada a N.
En resumen, se entiende que la característica
clave de la mutación usada para realizar la invención es que
inactiva los sitios de glicosilación ligada a N en la asparagina 34
y/o la asparagina 51 de una proteína GP5. Aunque quedar ligado a
teoría alguna, se cree que la característica clave de estas
mutaciones es que impiden la glicosilación en una región
determinada de la proteína (es decir, los restos correspondientes a
los sitios de la asparagina 34 y/o la asparagina 51 en una proteína
de referencia GP5 de la SEC ID Nº: 1). Impidiendo la glicosilación
en estos sitios, se eliminan los restos de azúcares que comúnmente
protegen a epítopes clave del virus de tipo silvestre, permitiendo
de este modo la generación de una respuesta inmune mejorada. Por
consiguiente, se prevé que puedan usarse varios tipos de mutaciones
diferentes (es decir, sustitución, inserción o deleción de
aminoácidos) para inactivar los sitios de glicosilación ligada a N y
obtener un antígeno que generará la respuesta inmune
mejorada.
mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos de la presente invención
pueden ponerse en práctica con una diversidad de polinucleótidos
diferentes que pueden obtenerse de una diversidad de fuentes
diferentes. La característica común de todos los polinucleótidos es
que codifican una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP
hipoglicosilada en la que los sitios de glicosilación ligada a N
correspondientes a la asparagina 34, a la asparagina 51 o tanto a la
asparagina 34 como a la asparagina 54 de una proteína GP5 de
referencia de la SEC ID Nº: 1 están inactivados. Para identificar
los sitios de glicosilación ligada a N correspondientes a la
asparagina 34 y a la asparagina 54 de la proteína GP5 de referencia
de la SEC ID Nº: 1, la secuencia polipeptídica de GP5 de VSRRP no
variante y normalmente glicosilada puede alinearse con la proteína
GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1. Se presentan ejemplos de
dicho alineamiento en las Figuras 5 y 6. Las secuencias particulares
usadas en este alineamiento se describen en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar los sitios de glicosilación
ligada a N correspondientes a la asparagina 34 o a la asparagina 51
de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 que pueden
inactivarse y usarse en los procedimientos de la presente
invención, las proteínas GP5 de un aislado de VSRRP norteamericano
(Figura 5) o un aislado de VSRRP europeo (Figura 6) deseado se
alinean con la proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 (cepa
norteamericana NVSL-97-7895).
Mediante el uso de la proteína GP5 de la SEC ID Nº: 1 como proteína
de referencia, un experto en la materia puede identificar
fácilmente los sitios de glicosilación ligada a N en cualquier
proteína GP5 y después construir las variantes proteicas de GP5
hipoglicosiladas de la presente invención. Por lo tanto, es
evidente que la expresión "correspondiente a (la asparagina 34 y/o
la asparagina 51) en una proteína GP5 de referencia de la SEC ID
Nº: 1" sirve como descriptor del sitio de glicosilación ligada a
N en cualquier proteína
GP5.
GP5.
La proteína GP5 hipoglicosilada puede obtenerse
a partir de un aislado de VSRRP norteamericano incluyendo, pero sin
limitación, la SEC ID Nº: 1-13, un aislado de VSRRP
norteamericano que tiene una identidad de al menos el 85% a nivel
de secuencia de aminoácidos con una secuencia consenso de VSRRP
norteamericano tal como la SEC ID Nº: 14, o a partir de una
secuencia consenso de VSRRP norteamericano. La proteína GP5
hipoglicosilada también puede obtenerse a partir de aislados de
VSRRP europeo incluyendo, pero sin limitación, la SEC ID Nº: 15, un
aislado de VSRRP europeo que tiene una identidad de al menos el 85%
a nivel de secuencia de aminoácidos con una secuencia consenso de
VSRRP europeo tal como la SEC ID Nº: 15, o a partir de una secuencia
consenso de VSRRP europeo. Para obtener los polinucleótidos
codificantes de variantes de GP5 hipoglicosiladas, pueden mutarse
polinucleótidos de cualquiera de las fuentes enumeradas
anteriormente mediante técnicas de mutagénesis dirigida
convencionales de modo que codifiquen un polipéptido variante de GP5
hipoglicosilado. Como alternativa, puede construirse una secuencia
de ADN totalmente sintética que codifique el polipéptido variante de
GP5 hipoglicosilado deseado. Esto se logra típicamente usando un
programa de análisis de secuencia tal como "back
translate" (retrotraducción) que convierte una secuencia
polipeptídica en la secuencia polinucleotídica correspondiente (GCG
Wisconsin Package^{TM}, Accelrys, Inc., San Diego, CA). Si se
desea, pude incorporare una "preferencia de codones" adecuada
en el programa "back translate" para proporcionar el
diseño de un gen sintético que incorpore codones apropiados para su
uso en el huésped de expresión deseado (es decir, mamífero o
levadura).
levadura).
El sitio de glicosilación ligada a N
correspondiente a la asparagina 51 de la proteína GP5 de referencia
de la SEC ID Nº: 1 está presente en todos los aislados de VSRRP
norteamericano representativos que se muestran en la Figura 5 y en
la cepa de VSRRP europeo representativa Lelystad (Figura 6). En
estas cepas de VSRRP norteamericano y europeo ejemplares y no
limitantes, el sitio de glicosilación ligada a N en esta posición
comprende la secuencia "NGT". Sin embargo, también se prevé
que otras variantes de VSRRP puedan comprender otros sitios de
glicosilación ligada a N estructuralmente intercambiables en esta
posición (es decir, NXS o T) que también podrían inactivarse por
medio de los procedimientos contenidos en el presente documento.
Este sitio de glicosilación ligada a N puede inactivarse por
sustitución de codones que codifiquen otros restos aminoacídicos
tales como glutamina o alanina en lugar de la asparagina 51 en la
secuencia polinucleotídica correspondiente. En estos casos, la
secuencia de aminoácidos correspondiente en la variante proteica de
GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada comprendería secuencias
tales como "QGT", "AGT" o "XGT", en las que X es
cualquier aminoácido distinto de asparagina. Estas u otras
variantes hipoglicosiladas de los aislados de proteína GP5 de VSRRP
norteamericanos, en los que el sitio de glicosilación ligada a N
correspondiente a la asparagina 51 está inactivado, también pueden
combinarse con otras variantes de GP5 hipoglicosiladas en las que
estén inactivados otros sitios de glicosilación ligada a N. Otros
procedimientos de inactivación de sitios de glicosilación ligada a N
incluyen sustituciones de aminoácidos de los restos "X" o
"S/T" de la secuencia NXS/T, deleciones de aminoácidos o
inserciones de aminoácidos, y se han descrito
anteriormente.
anteriormente.
El sitio de glicosilación ligada a N que se
corresponde exactamente con la asparagina 34 de la proteína GP5 de
referencia de la SEC ID Nº: 1 está presente sólo en ciertos aislados
de VSRRP norteamericanos representativos que se muestran en el
presente documento (Figura 5). Más específicamente, las proteínas
GP5 de los aislados de VSRRP norteamericanos representativos
IAF-BAJ (SEC ID Nº: 3), 94-3182 (SEC
ID Nº: 7) y 94-287 (SEC ID Nº: 8) contienen el
sitio de glicosilación ligada a N que se corresponde exactamente con
la asparagina 34 de la proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº:
1 y que comprende el sitio de glicosilación ligada a N "NSS".
Evidentemente, se prevé que otros aislados de GP5 de VSRRP que no se
muestran en el presente documento también contendrán sitios de
glicosilación ligada a N correspondientes a la asparagina 34 de la
proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 y que también pueden
obtenerse variantes hipoglicosiladas de estas otras proteínas GP5
usando los procedimientos descritos en el presente documento. Este
sitio de glicosilación ligada a N de las SEC ID Nº: 3, 7 y 8 u
otros aislados de VSRRP que contienen el sitio de glicosilación
ligada a N de la asparagina 34 pueden inactivarse por sustitución
de codones que codifiquen otros restos aminoacídicos tales como
glutamina o alanina en lugar de la asparagina 34 en la secuencia
polinucleotídica correspondiente. En estos casos, en los que el
sitio de glicosilación ligada a N de la asparagina 34 es "NSS",
la secuencia de aminoácidos correspondiente en la variante proteica
de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada comprendería
secuencias tales como "QSS", "ASS" o "XSS", en las
que X es cualquier aminoácido distinto de asparagina. Como
alternativa, el resto serina de la secuencia "NSS" puede
sustituirse con un aminoácido que no sea un hidroxiaminoácido (es
decir, que no sea serina ni treonina). En estos casos, la secuencia
de aminoácidos correspondiente en la variante proteica GP5 de VSRRP
norteamericano hipoglicosilada comprendería la secuencia "NSX",
en la que X es cualquier aminoácido distinto de asparagina. También
puede usarse una inserción de un aminoácido que no sea un
hidroxiaminoácido entre los dos restos serina de la secuencia
"NSS" (es decir, entre las serinas 35 y 36) para inactivar este
sitio de glicosilación
particular.
particular.
En otros aislados de VSRRP norteamericanos que
carecen del sitio de glicosilación ligada a N que se corresponde
exactamente con la asparagina 34 de la proteína GP5 de referencia de
la SEC ID Nº: 1, también pueden inactivarse otros sitios de
glicosilación ligada a N localizados en el resto 30 (Figura 5
"NAS" en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 13) y el
resto 33 (Figura 5 "NNS" en las SEC ID Nº: 3, 8; "NSS" en
las SEC ID Nº: 6, 10, "NDS" en las SEC ID Nº: 11, 13). En
otras palabras, también pueden inactivarse sitios de glicosilación
ligada a N en otros aislados norteamericanos localizados en
posiciones aminoacídicas correspondientes a los restos 30 y 33 de
la proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1, y usarse en los
procedimientos de la presente invención. Sin quedar ligado a teoría
alguna, la región particular de la proteína GP5 de VSRRP localizada
entre los restos 29 y 35 de la proteína de referencia GP5 de la SEC
ID Nº: 1 parece ser una región hipervariable (Figura 5) que puede
tolerar una diversidad de secuencias aminoacídicas diferentes
(Figura 5; véase también Pirzadeh y col., Can. J. Vet Res., 1998,
62: 170-177). Aunque ciertos aislados de VSRRP de
origen natural no contienen sitios de glicosilación ligada a N en
esta región (es decir, los aislados norteamericanos de las SEC ID
Nº: 5, 12; el aislado europeo de la SEC ID Nº: 15), otros aislados
pueden contener entre 1 y 3 sitios de glicosilación en esta región.
Por consiguiente, la inactivación de uno cualquiera de los sitios
de glicosilación de una proteína GP5 dada en la región localizada
entre los restos 29 y 35 de la proteína de referencia GP5 de la SEC
ID Nº: 1 se contempla en el presente documento como una composición
o procedimiento para generar una respuesta inmune mejorada contra
la proteína GP5 de VSRRP. Además, la inactivación de más de uno o
de todos los sitios de glicosilación de una proteína GP5 dada en la
región localizada entre los restos 29 y 35 de la proteína de
referencia GP5 de la SEC ID Nº: 1 también se contempla en el
presente documento como una composición o procedimiento para
generar una respuesta inmune mejorada contra la proteína GP5
de
VSRRP.
VSRRP.
El alineamiento de la secuencia de VSRRP
norteamericanos y europeos muestra que el sitio de glicosilación
ligada a N correspondiente a la asparagina 51 de la proteína GP5 de
referencia de la SEC ID Nº: 1 también está presente en un aislado
de VSRRP europeo representativo. En este caso particular, el sitio
de glicosilación ligada a N comprende la secuencia "NGT" y la
asparagina 51 de la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 1 se
corresponde con la asparagina 53 de la SEC ID Nº: 15. Este sitio de
glicosilación ligada a N puede inactivarse por sustitución de
codones que codifiquen otros restos aminoacídicos tales como
glutamina o alanina en lugar de la asparagina 53 en la secuencia
polinucleotídica de VSRRP europeo correspondiente. En estos casos,
la secuencia de aminoácidos correspondiente en la variante proteica
de GP5 de VSRRP europeo hipoglicosilada comprendería secuencias
tales como "QGT", "AGT" o "XGT", en las que X es
cualquier aminoácido distinto de asparagina. Estas u otras
variantes hipoglicosiladas de los aislados de VSRRP europeos en los
que el sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la
asparagina 51 está inactivado también pueden combinarse con otras
variantes de GP5 hipoglicosiladas en las que estén inactivados
otros sitios de glicosilación ligada a N.
Las proteínas variantes de GP5 hipoglicosiladas
pueden estar codificadas por virus SRRP que pueden usarse para
preparar vacunas vivas, muertas o atenuadas para proteger a los
cerdos de infecciones por VSRRP. En realizaciones preferidas de la
invención, las proteínas variantes de GP5 hipoglicosiladas de la
presente invención se modifican por ingeniería genética hacia
clones de VSRRP infecciosos que sean capaces de producir ARN de
VSRRP infeccioso. Se encuentran descripciones de clones de VSRRP
norteamericanos infecciosos que podrían modificarse por ingeniería
genética para codificar proteínas variantes de GP5 hipoglicosiladas
en la Patente de Estados Unidos Nº 6.500.662, Nielsen y col., J.
Virol. 77: 3702-11, 2003, y Truong y col., Virology
325: 308-19, 2004. Las secuencias de clones
infecciosos de VSRRP norteamericanos que pueden mutarse para obtener
virus VSRRP para su uso en vacunas incluyen, pero sin limitación,
las cepas norteamericanas NVSL 97-7895 (SEC ID Nº:
16) y la cepa VR-2332 (SEC ID Nº: 17). Se
encuentran descripciones de clones de VSRRP europeos infecciosos que
podrían modificarse por ingeniería genética para codificar
proteínas variantes de GP5 hipoglicosiladas en la Patente de Estados
Unidos Nº 6.268.199. En realizaciones en las que la vacuna
comprende un VSRRP vivo o atenuado, el sitio de glicosilación
ligada a N correspondiente a la N44 en la proteína GP5 de referencia
de la SEC ID Nº: 1 (es decir, la secuencia "NLT" en las
Figuras 5 y 6) no está inactivado ya que la glicosilación de este
sitio es necesaria para la infectividad del VSRRP. En el caso de
los aislados de VSRRP europeos, el sitio de glicosilación ligada a N
correspondiente a la N44 en la proteína GP5 de referencia de la SEC
ID Nº: 1 es la secuencia NLT que comienza en la asparagina 46 de la
cepa de VSRRP europea representativa Lelystad (SEC ID Nº: 15; Figura
6). El sitio de glicosilación ligada a N N46 de las cepas de VSRRP
europeo también es necesario para la infectividad y no se inactiva
en realizaciones de la invención en las que se usa una vacuna de
VSRRP viva o atenuada.
Como alternativa, las proteínas variantes de GP5
hipoglicosiladas pueden introducirse en cerdos con vacunas de ADN.
Dichas vacunas de ADN comprenden típicamente una molécula de ADN en
la que un promotor activo en células de mamífero se une
operativamente a dicho polinucleótido que codifica dicha variante
polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada. Los promotores que
pueden usarse para dirigir la expresión de las proteínas variantes
de GP5 hipoglicosiladas incluyen, pero sin limitación, el promotor
temprano inmediato de CMV (citomegalovirus), el promotor de la
repetición terminal larga de VSR (virus del sarcoma de Rous) y el
promotor del antígeno T del VS40 (Virus de los Simios 40). En
ciertas realizaciones preferidas, este promotor es un promotor
de
CMV.
CMV.
En otras realizaciones más, el polinucleótido
aislado que expresa la proteína variante de GP5 hipoglicosilada
comprende un vector viral distinto de VSRRP. Los vectores virales
distintos de VSRRP incluyen, pero sin limitación, vectores de virus
vaccinia, vectores de virus herpes simple, vectores de adenovirus,
vectores de alfavirus y vectores del virus de la GET. Dichos
vectores se describen en diversas publicaciones tales como las
Patentes de Estados Unidos Nº 7.041.300 (para vectores del virus de
la GET) y 6.692.750 (para vectores de alfavirus).
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En la práctica de la invención, los polipéptidos
variantes de GP5 hipoglicosilados o polinucleótidos que codifican
polipéptidos variantes de GP5 hipoglicosilados pueden combinarse con
vehículos o excipientes terapéuticamente aceptables. Los ejemplos
no limitantes de dichos vehículos incluyen solución salina
fisiológica u otras soluciones salinas similares, proteínas tales
como proteínas de albúmina sérica, tampones tales como carbonato,
fosfato, fosfonato o tampones basados en Tris, tensioactivos tales
como NP40 o Triton X100 y polímeros de polietilenglicol. Cualquier
combinación de dichos vehículos puede usarse en las composiciones y
procedimientos de la presente invención. Un vehículo preferido para
composiciones que comprenden virus VSRRP vivos o atenuados es
acetato de dl-\alpha-tocoferol a
una concentración de entre 50 y 100 mg/ml.
También se contempla el uso de adyuvantes en
composiciones que contienen los polipéptidos variantes de GP5
hipoglicosilados o polinucleótidos que codifican polipéptidos
variantes de GP5 hipoglicosilados. Dichos adyuvantes son
típicamente de naturaleza acuosa u oleosa. Los adyuvantes que pueden
usarse incluyen, pero sin limitación, hidróxido de aluminio, Quil
A, una suspensión de gel de alúmina, aceites minerales, glicéridos,
ácidos grasos, subproductos de ácidos grasos, micobacterias y
oligodesoxinucleótidos CpG, o cualquier combinación de los mismos.
Se describen diversos tipos de adyuvantes de CpG que pueden usarse
en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.977.245 y
6.406.705.
6.406.705.
También se contempla el uso de otros adyuvantes
que potencian respuestas inmunes celulares (es decir, potenciadores
de subpoblaciones de células T auxiliares (Th.sub.1 y Th.sub.2)).
Dichos adyuvantes incluyen, pero sin limitación, interleucina 1
(IL-1), IL-2, IL4,
IL-5, IL6, IL-12, interferón gamma
(IFN-g), factor de necrosis tumoral, MDP (dipéptido
de muramilo), complejo inmunoestimulante (ISCOM) y liposomas.
La administración de la composición puede
realizarse por inyección subcutánea, inyección intravenosa,
inyección intradérmica, inyección parenteral, inyección
intramuscular, inyección sin aguja, electroporación, administración
por vía oral, administración intranasal, administración oronasal o
cualquier combinación de las mismas. La inyección sin aguja se
efectúa típicamente con un dispositivo tal como un inyector
Agro-Jet® (Medical International Technologies,
Montreal, Canadá).
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Ejemplo
1
El ejemplo siguiente ilustra la construcción de
diversos polinucleótidos de VSRRP que codifican diversas variantes
polipeptídicas de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosiladas,
composiciones que incluyen dichos polinucleótidos que se usan para
generar respuestas inmunes mejoradas contra un antígeno de VSRRP y
procedimientos de uso de los polinucleótidos y composiciones para
generar una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un antígeno
de VSRRP.
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Células, medios y anticuerpos. Las células
MARC-145 se propagaron en Medio de Eagle Modificado
por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) y
100 unidades de penicilina, 20 unidades de estreptomicina y 20
unidades de kanamicina por ml de medio de cultivo. Estas células se
usaron para la electroporación de ARN, infección viral, cultivo de
virus y ensayos de placas. Las células de riñón de cría de hámster
(BHK-21) se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo
(MEM) con sal de Earl que contenía FBS al 5% y los antibióticos
mencionados anteriormente. Las células BHK-21 se
usaron para la expresión transitoria de GP5 seguida de ensayos de
inmunofluorescencia (IFA) o experimentos de radiomarcaje e
inmunoprecipitación. Todas las células se mantuvieron a 37ºC y en un
entorno de CO_{2} al 5%. Los anticuerpos policlonales de conejo
contra las proteínas GP5 y M de VSRRP se obtuvieron por cortesía de
Carl A. Gagnon (Universidad of Quebec, Montreal, Canadá). El
anticuerpo monoclonal (SDOW17) contra la proteína de la
nucleocápside (N) se adquirió en National Veterinary Laboratories
(NVSL, Ames, IA, Estados Unidos). El anticuerpo
anti-ratón Alexa-488 se obtuvo en
Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregón, Estados
Unidos).
Unidos).
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El clon de ADNc infeccioso de VSRRP de longitud
completa (FL12, SEC ID Nº: 16) en pBR322 se digirió con las enzimas
de restricción EcoRV y BstZ17 I y el fragmento de \sim4,9 kpb que
incluía la mayor parte de la ORF2, las ORF3-7
completas y la 3'UTR completa de VSRRP se clonó en pBR322 usando los
mismos sitios enzimáticos. Este plásmido intermedio servía como
molde para la mutagénesis para introducir mutaciones en los sitios
de glicosilación ligada a N potenciales (N34, N44 y N51) dentro de
GP5 (Figura 2). La mutagénesis se llevó a cabo usando PCR de
extensión por solapamiento con cebadores sintéticos (Tabla 2) usando
técnicas convencionales.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El producto de PCR se digirió con las enzimas de
restricción BsrGI y BstEII y se volvió a colocar en el plásmido
intermedio. Se identificaron los clones que contenían las mutaciones
deseadas y se confirmaron por secuenciación. La región codificante
completa de GP5 se secuenció para asegurarse de que no estaban
presentes mutaciones adicionales en los clones. El fragmento
EcoRV-PacI del plásmido intermedio que contenía
mutaciones en la región codificante de GP5 se movió de nuevo al
clon de ADNc de longitud completa usando los mismos sitios de
enzimas de restricción. La región codificante de GP5 en los clones
de longitud completa se secuenció de nuevo con cebadores internos
específicos de VSRRP para confirmar la presencia de las
mutaciones.
La GP5 wt y los mutantes individuales se
clonaron en un vector bicistrónico en el que la GP5 es el primer
cistrón, seguido del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del
virus de la encefalomiocarditis (VEMC) y de las secuencias
codificantes de M (Figura 1A). La GP5 de longitud completa también
se clonó en un vector dirigido por el promotor de CMV (pcDNA
3,0^{TM}, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, Estados
Unidos) para estudios de complementación. Con este fin, la región
codificante de la GP5 se amplificó por PCR, se clonó y se
secuenció.
Los plásmidos de longitud completa se digirieron
con AcII y se usó ADN linealizado como molde para generar
transcritos de ARN con caperuza usando el kit mMESSAGE mMACHINE
Ultra T7^{TM} de acuerdo con las recomendaciones del fabricante
(Ambion, Inc., Austin, Tx, Estados Unidos) y como se ha descrito
anteriormente. La mezcla de reacción se trató con DNasaI para
digerir el molde de ADN y se extrajo con fenol y cloroformo y, por
último, se precipitó con isopropanol. Se analizó la integridad de
los transcritos in vitro mediante electroforesis en gel de
agarosa con glioxal seguida de tinción con bromuro de etidio.
Se sometieron a electroporación células
MARC-145 con aproximadamente 5,0 \mug de
transcritos in vitro, con 5,0 \mug de ARN total aislado de
células MARC-145. Aproximadamente 2 x 10^{6}
células en 400 \mul de DMEM que contenía DMSO al 1,25% se
sometieron a un pulso usando Bio-Rad Gene Pulser
XCell^{TM} (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA, Estados
Unidos) a 250 V, 950 \muF en una cubeta de 4,0 mm. Las células se
diluyeron en medio de cultivo normal, se sembraron en una placa de
cultivo de células de 60 mm. Se sembró una pequeña porción de las
células sometidas a electroporación en una placa de 24 pocillos para
examinar la expresión de proteína N a las 48 h después de la
electroporación, que indicaría la replicación y la transcripción del
genoma. Una vez confirmada la expresión de proteína N usando un
ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA), se recogió el
sobrenadante del volumen de células sometidas a electroporación en
placa de 60 mm a las 48 h después de la electroporación, se aclaró
y se pasó sobre células MARC-145 sin tratamiento
previo. Las células infectadas se observaron para determinar el
efecto citopático (ECP) junto con la expresión de proteína N usando
IFA. Se determinó que los sobrenadantes de células infectadas que
mostraban tanto ECP como fluorescencia positiva contenían virus
infeccioso. Después de la confirmación, la reserva de virus se
cultivó y se congeló a -80ºC en alícuotas pequeñas para estudios
adicionales. En todos los experimentos, se usaron como controles
FL12 que contenía genoma de VSRRP wt y FL12pol que contenía genoma
de VSRRP deficiente en polimerasa.
Se infectaron células de BHK-21
en placas de seis pocillos con virus vaccinia recombinante
(vTF7-3) a un MOI de 3,0 y posteriormente se
transfectaron con ADN plasmídico bicistrónico que codificaba GP5 wt
o diversas GP5 mutantes bajo el promotor de la ARN polimerasa de
T7. Se llevó a cabo una transfección de ADN usando
Lipofectamine2000^{TM} de acuerdo con el protocolo del fabricante
(Life Technologies, Estados Unidos). A las 16 horas después de la
transfección, las células se lavaron dos veces con PBS y se las
privó de DMEM sin metionina/cisteína durante una h y se
radiomarcaron con 0,6 ml de DMEM sin metionina/cisteína que contenía
100 \muCi de mezcla de marcaje de proteínas Expre^{35}S^{35}S
(NEN Life Sciences, Boston, MA) por ml de medio durante tres horas.
Después del radiomarcaje, las células se lavaron en PBS frío tres
veces y se prepararon extractos celulares en 300 \mul de tampón
de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA)
(Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton
X-100 al 1%, SDS al 0,1%, desoxicolato sódico al 1%
e inhibidor de proteasas 1x). Los extractos celulares aclarados se
incubaron durante una noche a 40ºC con anticuerpos de conejo
anti-GP5 o anti-proteína M. Se
añadió una suspensión de aproximadamente 4,0 mg de proteína A
Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia) en 100 \mul de tampón RIPA
y se incubó adicionalmente durante 2 h. Los complejos
inmunoprecipitados se lavaron 3 veces con 500 \mul de tampón RIPA
y se usaron para un análisis adicional.
Para el tratamiento con endoglicosidasa H (Endo
H), los complejos inmunoprecipitados se resuspendieron en 20 \mul
de tampón desnaturalizante 1x (SDS al 0,5%,
\beta-mercaptoetanol al 1,0%) y se llevaron a
ebullición durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió, se
ajustó a tampón G5 1x (citrato sódico 0,05 M, pH 5,5) y se incubó
durante 16 h a 37ºC con 100 unidades de Endo H (New England Biolabs,
Beverly, MA, Estados Unidos). Las muestras de control sin digerir
se procesaron de forma similar pero no se añadió Endo H. Después de
la digestión con Endo H, las muestras se mezclaron con un volumen
equivalente de tampón de muestras de SDS-PAGE 2x,
se llevaron a ebullición durante 5 min y se resolvieron mediante
SDS-PAGE al 12% en condiciones desnaturalizantes
junto con marcador de proteínas (Protein Plus Precision Standard,
Bio-Rad, Inc). El gel se fijó con ácido acético al
10% durante 15 min, se lavó tres veces con agua, se trató con
salicilato sódico 0,5 M durante 30 min, se secó y, por último, se
expuso a una película de rayos X a -70ºC. Para la digestión
peptídica con N-glicosidasa F (PNGase F) (New
England Biolabs, Inc), se resuspendieron complejos
inmunoprecipitados en tampón G7 1x (fosfato sódico 0,05 M, pH 7,5,
NP-40 al 1,0%) y se realizó una digestión por
incubación durante 16 h a 37ºC con 2 unidades de la enzima. Para
examinar la síntesis de GP5 en presencia de tunicamicina (Sigma, St.
Louis, MO), se trataron células transfectadas con 2,0 \mug de
tunicamicina por ml de medio durante una h y se realizó el
radiomarcaje en presencia del fármaco durante 3 h como
anteriormente.
anteriormente.
Para obtener GP5 radiomarcada expresada en
viriones extracelulares o virus intracelulares, se infectaron
células MARC-145 con VSRRP wt o mutantes. A las 48
h después de la infección, las células se privaron de medio durante
una h y se radiomarcaron con 100 \muCi de mezcla de marcaje de
proteínas Expre^{35}S^{35}S por ml de medio que contenía DMEM
sin metionina/cisteína al 90% y DMEM normal al 10% durante 24 h.
Después del marcaje, se recogió el sobrenadante de cultivo, se
aclaró de residuos celulares y los viriones extracelulares se
sedimentaron a 100.000 x g durante 3 h a 4ºC. Los sedimentos
virales se resuspendieron en 200 \mul de tampón de RIPA, se
inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-GP5 y las
proteínas se examinaron con o sin tratamiento con
Endo-H. Para la inmunoprecipitación de GP5
expresada en virus intracelular, se llevó a cabo una infección como
anteriormente y a las 24 h después de la infección las células se
privaron de medio durante una h, y se radiomarcaron como
anteriormente durante 2 h antes de preparar los extractos
celulares.
Se infectaron células MARC-145
con VSRRP mutante o wt a una MOI de 3,0 UFP por célula y se
incubaron a 37ºC en una incubadora. A diversos puntos temporales
postinfección, se recogieron alícuotas de sobrenadantes de cultivo
de células infectadas y se determinó el título de virus en los
sobrenadantes y se expresó por dosis infecciosa en cultivo de
tejidos 50 por ml (DICT50/ml). La cinética de multiplicación viral
se realizó tres veces. Para examinar la morfología de las placas de
virus mutantes, se realizó un ensayo de placas usando células
MARC-145. Las células se infectaron con diluciones
seriadas de 10 veces de virus individuales durante una h a 37ºC. La
monocapa de células infectadas se lavó con PBS y se cubrió con
DMEM-FBS al 5% que contenía agarosa Seaplaque al
0,8% (FMC Bioproducts, Rockland, ME, Estados Unidos). Después de 96
h, los tapones de agarosa se retiraron y se incubó la monocapa de
células con solución de tinción (formaldehído al 20%, etanol al
9,0% y cristal violeta al 0,1%) durante 30 min a temperatura
ambiente. Las células se lavaron suavemente con agua para eliminar
el exceso de colorante y se secaron al aire para examinarlas y
realizar el recuento de las placas.
Se transfectaron células BHK-21
con pcDNA-GP5. A las 40 horas después de la
transfección, las células se recogieron y se sometieron a
electroporación con transcritos con caperuza obtenidos in
vitro a partir de ADNc de VSRRP de longitud completa que
codifica GP5 mutante. Las células sometidas a electroporación se
diluyeron con medio recién preparado y se sembraron en placas de 6
pocillos. Se recogió el sobrenadante de las células sometidas a
electroporación a las 48 h después de la electroporación, se
centrifugaron para eliminar los residuos celulares y se usaron para
infectar células MARC-145 sin tratamiento previo.
Las células MARC-145 infectadas se examinaron a las
48 h después de la infección para determinar la expresión de
proteína N mediante IFA como se ha descrito anteriormente. Se contó
el número de células positivas para determinar el número de
pseudopartículas producidas en el sobrenadante. Se calculó el
número promedio de células positivas a partir de tres experimentos
independientes y se presentó como el número de pseudopartículas
producidas por microgramo de ARN transcrito in vitro usado
para transfectar células.
El título de anticuerpos neutralizantes de VSRRP
en una muestra de suero se determinó usando el ensayo de
neutralización de focos fluorescentes descrito anteriormente. Se
incubaron diluciones seriadas de los sueros de ensayo durante 60
min a 37ºC en presencia de DICT50 200 del virus de exposición, que
estaba constituido por FL12 (VSRRP wt) o cualquiera de los virus
codificantes de una GP5 mutante, FL-N34A,
FL-N51A y FL-N34/51A en Medio de
Eagle Modificado por Dulbecco que contenía suero fetal de ternera al
5%. Las mezclas se añadieron a placas de microtitulación de 96
pocillos que contenían células MARC-145 confluentes
que se habían sembrado 48 h antes. Después de la incubación durante
24 h a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al
5%, las células se fijaron durante 10 min con una solución de
metanol al 50% y acetona al 50%. Después de un lavado exhaustivo
con PBS, se detectó la expresión de proteína N de VSRRP con el
anticuerpo monoclonal SDOW17 usando una dilución 1:500, seguida de
incubación con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón
conjugado con FITC (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) a una
dilución 1:100. Los títulos de neutralización se expresaron como la
inversa de la mayor dilución que inhibía el 90% de los focos
presentes en los pocillos de control.
Se usaron reservas de alto título (obtenidas por
medio de 3 pases en células MARC 145) de los virus con GP5 mutante
(FL-N34A, FL-N51A y
FL-N34/51A) y del FL12 (VSRRP wt) para infectar
cerdos jóvenes. Se adquirieron cerdos recién destetados de veintiún
días de edad de una piara libre de patógenos específicos con un
registro certificado de ausencia de infección por VSRRP. Todos los
animales eran negativos para anticuerpos anti-VSRRP
según se ensayó mediante ELISA (Iddex Labs, Portland, ME). Se
infectaron tres cerdos por grupo con VSRRP wt FL12 o los mutantes
FL-N34A, FL-N51A y
FL-N34/51A. En todos los casos, el inóculo estaba
constituido por una DICT50 de 105 diluida en 2 ml y administrada
por vía intramuscular en el cuello. Las temperaturas rectales de
los animales inoculados se controlaron durante 15 días después de la
inoculación (PI). Se midió la viremia por aislamiento normal en
células MARC 145 los días 4, 7 y 14 PI. Se extrajeron muestras de
suero semanalmente durante un periodo total de 49 días PI. Las
muestras de suero se usaron para detectar títulos de neutralización
cruzada homóloga y heteróloga para cada uno de los VSRRP mutantes y
wt.
La GP5 de la cepa de VSRRP
97-7895 tiene tres sitios de glicosilación posibles
(N34, N44 y N51). Para examinar el patrón de glicosilación de la
GP5, los presentes inventores generaron primero un vector
bicistrónico en el que las regiones codificantes de las proteínas
GP5 y M flanqueando el IRES del VEMC se colocaron bajo el control
del promotor de la ARN polimerasa de T7 (Figura 1A). El fundamento
para construir el vector bicistrónico es que las proteínas GP5 y M
se sabe (para el VLD y el VAE) o se postula (para el VSRRP) que
interaccionan entre sí y que dichas interacciones pueden ser
importantes para el plegamiento de proteínas, la glicosilación, el
transporte intracelular y/u otra actividad biológica de GP5.
La expresión transitoria de GP5 y M por
transfección del plásmido bicistrónico seguida de radiomarcaje e
inmunoprecipitación con anticuerpo anti-GP5 puso de
manifiesto dos especies proteicas principales. La especie proteica
que migra con una masa de \sim25,5 kDa es la forma totalmente
glicosilada de la GP5 (Figura 1B, carril 2). Puesto que cada
glicosilación ligada a N añade \sim2,5 kDa de masa molecular a una
proteína, esto indica que los tres sitios de glicosilación
potenciales se usan posiblemente para la glicosilación de GP5. La
especie proteica de 19,0 kDa es la proteína M viral puesto que
también se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-M
(carril 7). Los resultados indican que las proteínas GP5 y M
interaccionan entre sí en células que expresan ambas proteínas.
Después del tratamiento con Endo H, una enzima que elimina cadenas
de oligosacáridos de tipo de alto contenido en manosa, se reducía
el tamaño de la GP5 hasta \sim18 kDa, mientras que el tamaño de la
proteína M permanecía sin cambios (carril 3). El tratamiento de la
GP5 con PNGasa F (carril 4), una enzima que elimina los azúcares de
todo tipo de la cadena principal de la proteína, o la síntesis de
GP5 en presencia de tunicamicina (carril 5) daban como resultado
una proteína que migraba con una movilidad electroforética
ligeramente más rápida que la proteína con tratamiento con Endo H.
Esto se espera, puesto que el tratamiento con tunicamicina o la
digestión con PNGasa F generaría proteínas sin glicosilar, mientras
que el tratamiento con Endo H daría como resultado proteínas que
conservan restos N-acetilglucosamina en cada uno de
los sitios de glicosilación ligada a N. Debe señalarse que se
inmunoprecipitó una especie proteica destacada de una masa molecular
\sim30 kDa con anticuerpo anti-M. La identidad de
esta proteína no se conoce pero podría ser una proteína celular que
interaccione con la proteína M.
Los resultados de los estudios anteriores
sugieren que las formas sin glicosilar y totalmente glicosilada de
la GP5 poseen tamaños moleculares aparentes de 18,0 kDa y 25,5 kDa,
respectivamente. Parece que los tres sitios de glicosilación
potenciales se usan para generar la forma totalmente glicosilada de
la GP5. Los restos de glicanos añadidos a estos sitios son de tipo
de alto contenido en manosa puesto que son sensibles a la digestión
por Endo H. Además, los resultados indican que ambas formas sin
glicosilar y totalmente glicosilada de la GP5 parecen interaccionar
con la proteína M.
Para determinar con mayor exactitud si se usan
todos o algunos de los sitios de glicosilación ligada a N
potenciales de la GP5 para la adición de restos de azúcares, se
generaron una serie de mutantes en el plásmido bicistrónico en los
que se modificaban los tres sitios de glicosilación potenciales N34,
N44 y N51 (Figura 2A) a alaninas, individualmente o en diversas
combinaciones (Figura 2B). En células transfectadas con plásmido,
las proteínas se radiomarcaron y se inmunoprecipitaron con
anticuerpo anti-GP5. Los inmunocomplejos se dejaron
sin tratar o se trataron con Endo H y se examinaron mediante
SDS-PAGE. Como puede observarse a partir de los
datos presentados en la Figura 2C, las proteínas GP5 mutantes que
llevaban mutaciones individuales (N34A, N44A o N51A) migraban como
especies proteicas de aproximadamente 23,0 kDa (carriles 4, 6 y 8,
punta de flecha). Tras el tratamiento con Endo H, estas proteínas
migraban como especies proteicas de \sim18,0 kDa (carriles 5, 7 y
9, respectivamente) similares a la GP5 wt después del tratamiento
con Endo H (carril 3). Las diferencias minoritarias en la movilidad
electroforética de las proteínas reflejan más probablemente el hecho
de que la proteína wt conservaría los tres restos
N-acetilglucosamina después del tratamiento con Endo
H en comparación con los mutantes individuales que contendrían dos
restos de este tipo. Los dobles mutantes (N34/44A, N44/51A y
N34/51A) producían especies proteicas que migraban próximas a la
proteína de \sim20,5 kDa (carriles 10, 12 y 14) y, tras el
tratamiento con Endo H, el tamaño de las proteínas se reducía hasta
18,0 kDa (carriles 11, 13 y 15). El triple mutante (N34/44/51A)
generaba una proteína que migraba como una proteína de 18,0 kDa
(carril 16) y era resistente a la digestión con Endo H (carril
17).
Por lo tanto, a partir de los estudios
mutacionales anteriores es evidente que los tres sitios de
glicosilación potenciales se usan para la glicosilación para
generar GP5 de VSRRP totalmente madura. Parece que los tres sitios
de glicosilación están modificados por restos de glicanos de tipo de
alto contenido en manosa.
Para evaluar la importancia de la glicosilación
ligada a N en la generación de VSRRP infeccioso, se insertaron las
regiones codificantes de las proteínas GP5 mutantes en el clon de
ADNc de longitud completa. Los transcritos con caperuza producidos
in vitro a partir de los clones se introdujeron por
electroporación en células MARC-145 y se examinó la
generación de VSRRP infeccioso. Los resultados de los presentes
inventores mostraban que se recuperaba fácilmente virus infeccioso
a partir de las células sometidas a electroporación con transcritos
de longitud completa que contenían mutaciones en las posiciones N34,
N51 y N34/51. Sin embargo, en condiciones de recuperación de virus
similares, los intentos repetidos para recuperar otros virus
mutantes no tuvieron éxito. Aunque la cinética de multiplicación de
los virus recuperados era similar a la del virus wt, la producción
global de virus FL-N34A y FL-N51A
que contenían mutaciones en las posiciones N34 y N51 era
aproximadamente un logaritmo menor en células
MARC-145, mientras que la del
FL-N34/51A con dobles mutaciones (N34/51A) era casi
1,5 logaritmos menor que la del VSRRP wt (Figura 3A). La
amplificación por RT-PCR de ARN de células
infectadas seguida de secuenciación de nucleótidos indicaba que
estos virus eran estables, contenían las mutaciones deseadas y no
se detectaron otras mutaciones en la región completa de la GP5 (no
se muestran los datos).
Se realizó un ensayo de placas virales en
células MARC-145 para controlar el fenotipo de
placas de los virus mutantes. Las placas generadas por el VSRRP wt
eran claras y definidas, mientras que los virus mutantes producían
placas que tenían fenotipos diferentes. Los virus
FL-N34A, FL-N51A y
FL-N34/51A generaban placas que estaban menos
definidas y muchas de las células dentro de la placa parecían
normales (Figura 3B, flecha sin relleno). Además, los
FL-N51A, FL-N34/51A producían
algunas placas en las que los virus no conseguían despejar la
monocapa de células (Figura 3B, flecha con relleno). Estos datos
indican que los virus mutantes recuperados son de hecho menos
citopáticos en comparación con el VSRRP wt.
Puesto que los presentes inventores fueron
incapaces de recuperar VSRRP infeccioso con los moldes mutantes
FL-N44A, FL-N31/44A,
FL-N44/51A y FL-N31/44/51A, es
posible que las mutaciones en la región codificante de la GP5
puedan haber afectado algunas otras funciones de los moldes de ARN,
tales como el empaquetamiento del ARN genómico en partículas. Para
abordar esto, los presentes inventores examinaron si las células que
expresaban GP5 wt en trans podían servir de soporte al
empaquetamiento de moldes de ARN mutantes que de otro modo serían
defectuosos en la generación de VSRRP infeccioso. Células
BHK-21 transfectadas con pcDNA-GP5
se sometieron a electroporación con transcritos in vitro y a
las 48 h después de la electroporación se recogieron los
sobrenadantes de cultivo y se usaron para infectar células
MARC-145 sin tratamiento previo para determinar la
producción de pseudopartículas de VSRRP. Si se generan
pseudopartículas, entonces se esperaría observar expresión de la
proteína N en estas células MARC-145 infectadas. La
expresión de N sólo es posible cuando células
MARC-145 sin tratamiento previo reciben genoma de
ARN mutante encapsidado de longitud completa que pone en marcha la
replicación después de la entrada de las pseudopartículas en
células. De todos los mutantes que no pudieron recuperarse
anteriormente, los presentes inventores fueron capaces de recuperar
pseudopartículas que contenían dos genomas mutantes de longitud
completa (FL-N44A y FL-N34/44A)
(Figura 3C). Cada célula verde fluorescente en el cultivo infectado
con virus mutante representa una pseudopartícula infecciosa. Puesto
que estas partículas sólo contienen la GP5 wt funcional en la
envoltura pero contienen las secuencias codificantes para GP5
mutante no funcional en el genoma, no pueden producir partículas
infecciosas para propagarse a las células circundantes. Los
múltiples intentos para recuperar pseudopartículas infecciosas con
los otros moldes mutantes (FL-N44/51A y
FL-N31/44/51A) no tuvieron éxito.
Una estimación cuantitativa del número de
pseudopartículas infecciosas producidas a partir de estos
experimentos sugiere que se producen aproximadamente 1000
partículas por microgramo de ARN mutante introducido por
electroporación en las células (Figura 3D). Esto es aproximadamente
100 veces menos de lo obtenido con ARN que codifica GP5 wt. La
producción de dichos bajos niveles de pseudopartículas infecciosas
podría deberse al hecho de que sólo aproximadamente el
5-10% de las células que expresaban la GP5 wt
recibían los transcritos de longitud completa, como se observa por
la expresión de la proteína N en estas células. También es posible
que los bajos niveles de expresión de GP5 wt en las células
transfectadas puedan haber contribuido a los bajos niveles de
producción de estos pseudoviriones.
Para determinar la naturaleza de la proteína GP5
incorporada en viriones infecciosos producidos a partir de células
transfectadas, los presentes inventores generaron VSRRP radiomarcado
a partir de células infectadas con virus wt y mutantes. Los
viriones extracelulares presentes en el sobrenadante de cultivo se
sedimentaron por ultracentrifugación y se examinó la GP5 presente
en estos viriones por inmunoprecipitación usando anticuerpo
anti-GP5 y posterior análisis electroforético. Los
resultados muestran que la GP5 wt incorporada en viriones migraba
como una banda ampliamente difusa de una especie proteica de
\sim25-27 kDa (Figura 4A, carril 1), que es
parcialmente resistente a la digestión con Endo H (carril 2). Las
GP5 mutantes (N34A y N51A) incorporadas en viriones eran sensibles
a Endo H. Basándose en el tamaño de los productos generados después
de la digestión con Endo H, parece que sólo un resto glicano en
estos mutantes de un solo sitio es sensible mientras que el otro es
resistente. Por el contrario, la GP5 doble mutante (N43/51A) era
resistente a Endo H. Además, la digestión con Endo H de GP5 de
virus mutantes también producía cantidades muy pequeñas de cadena
principal de proteína GP5, indicando que estos virus incorporan
proteínas GP5 que contienen restos de glicanos resistentes a Endo H
así como sensibles a Endo H.
Puesto que en las células transfectadas con el
vector bicistrónico las proteínas GP wt así como mutantes eran
completamente sensibles a Endo H (Figuras 1 y 2), los presentes
inventores estaban sorprendidos de la observación de que la GP5 en
viriones de SRRP contenía formas enormemente resistentes a Endo H.
Para examinar si las formas resistentes a Endo H de la proteína
también se sintetizan en células infectadas, se radiomarcaron
células MARC-145 infectadas con VSRRP wt o mutante,
se inmunoprecipitaron proteínas GP con anticuerpo
anti-GP5 y se analizaron por electroforesis con o
sin digestión con Endo H. Los resultados de un experimento de este
tipo se muestran en la Figura 4B. La mayoría de la GP5 wt contenía
glicanos resistentes a Endo H en los tres sitios (carriles 2 y 3)
mientras que los dos mutantes individuales contenían glicanos
resistentes a Endo-H sólo en un sitio (carriles
4-7). Algunos de los restos de glicanos en el doble
mutante eran resistentes mientras que otros eran sensibles a Endo H
(carriles 8 y 9). Aunque el patrón de resistencia a Endo H es
similar al observado para la GP5 asociada a viriones, es diferente
del observado en células que expresan proteínas tanto GP5 como M
(Figuras 1 y 2). Estos resultados indican que otras proteínas
virales pueden desempeñar un papel en la modificación adicional de
glicanos en GP5.
Se sabe que el nivel de glicosilación de
glicoproteínas virales que están implicadas en la interacción con
receptores virales afecta a la capacidad de los viriones para
reaccionar con anticuerpos neutralizantes de virus. Para ensayar si
este fenómeno se produce en el caso del VSRRP, los mutantes de GP5
de VSRRP con patrones de glicosilación alterados
(FL-N34A, FL-N51A y
FL-N34/51A) se compararon con el VSRRP wt (FL12) en
su capacidad para neutralizarse por antisueros de convalecientes.
Para esto, los presentes inventores usaron antisueros de
convalecientes (47 días p.i.) de 4 animales que se habían infectado
con VSRRP wt. Se usaron dosis similares (DICT50 2.000) de mutantes
de GP5 de VSRRP infecciosos (FL-N34A,
FL-N51A y FL-N34/51A), así como del
VSRRP wt derivado de un clon infeccioso (FL12), como virus de
exposición en ensayos de neutralización en suero siguiendo el
protocolo de ensayo convencional de los presentes inventores, y el
conjunto de 4 sueros anti-VSRRP wt (FL12) usado
como referencia. La Tabla 3 muestra los diferentes títulos de
neutralización en suero a punto final obtenidos. Normalmente, una
muestra de suero de convaleciente de VSRRP wt recogida a los
47-54 días p.i. contiene niveles moderados de
actividad neutralizante de VSRRP wt (de 1:8 a 1:32, Tablas 3 y 4),
reflejando el carácter relativamente débil y tardío de la respuesta
de anticuerpos neutralizantes que es típica de infecciones con
VSRRP wt. Sin embargo, el uso de mutantes de VSRRP hipoglicosilados
(que carecen de uno o dos restos glicanos en el ectodominio de GP5)
como virus de exposición en los ensayos de NS parece haber aumentado
significativamente el punto final de los sueros de referencia, con
un aumento del título a punto final que varía de seis a veintidós
veces (Tabla 3). Esta observación sugiere claramente que la
eliminación de uno, y particularmente dos, de los restos glicanos
aumenta la accesibilidad del epítope neutralizante a anticuerpos
específicos. Estos resultados parecen indicar la presencia de una
cantidad significativa de anticuerpos neutralizantes de VSRRP en los
sueros de convalecientes infectados por VSRRP que de otro modo
sería indetectable, debido al uso típico de VSRRP wt que contiene
GP5 totalmente glicosilada en los ensayos de NS.
Un efecto notable que se ha descrito cuando la
eliminación de carbohidratos de una glicoproteína de la envoltura
viral conduce a la producción de altos títulos de anticuerpos
neutralizantes contra el virus mutante cuando se usa este mutante
para la inoculación in vivo del huésped, en algunos casos
induce también mayores títulos de anticuerpo contra el virus wt que
el propio virus wt. Los presentes inventores infectaron grupos de
cerdos con dosis idénticas del VSRRP wt FL12 o de cada uno de los
mutantes con patrones de glicosilación alterados. Curiosamente, la
evaluación clínica/virológica de la infección por evaluación de la
temperatura rectal y evaluación de la viremia los días 4, 7 y 10
p.i. indicaban un patrón de infección similar en todos los grupos,
como se ha descrito anteriormente para el FL12, sin pruebas de
atenuación o exacerbación de la virulencia para ninguno de los
mutantes (no se muestran los datos). Sin embargo, el muestreo
secuencial de suero de estos animales durante todo un periodo de 48
días indicaba diferencias pronunciadas entre el VSRRP wt y los
mutantes en su cinética de inducción de una respuesta de
anticuerpos neutralizante de VSRRP (Tablas 4A y 4B). Los mutantes
desarrollaron una respuesta de anticuerpos neutralizantes homólogos
temprana y más robusta que la desarrollada por VSRRP wt, hasta el
punto en el que, en el caso de los mutantes, la naturaleza
característicamente lenta y escasa de la respuesta de anticuerpos
neutralizantes contra VSRRP parece haberse corregido (Tabla 4B). La
cinética de aparición de anticuerpos neutralizantes homólogos de
mutantes (Tabla 4B) indica una seroconversión de anticuerpos
neutralizantes más regular, que concuerda con la descrita para otras
infecciones víricas tales como para virus influenza o de la
pseudorrabia, pero no para VSRRP. Es de suma importancia el hecho de
que la infección con mutantes de glicosilación de GP5 inducía una
respuesta de anticuerpos neutralizantes específicos de VSRRP wt que
es significativamente superior a la respuesta con el propio VSRRP
wt. Los virus mutantes FL-N34 y
FL-N51A inducían niveles cinco veces mayores (p <
0,05) de título de anticuerpos neutralizantes contra VSRRP wt que
el propio VSRRP wt, mientras que el mutante
FL-N34/51 inducía un título seis veces mayor (p <
0,01) de anticuerpos neutralizantes de VSRRP que el propio VSRRP wt
(Tabla 4B).
En el presente estudio, se examinó la influencia
de la glicosilación de GP5 de VSRRP en la recuperación de virus
infeccioso, su papel en la capacidad de los virus mutantes para ser
neutralizados por anticuerpos y en la inducción de anticuerpos
neutralizantes in vivo. Los presentes inventores han
descubierto que los tres sitios de glicosilación potenciales (N34,
N44 y N51) en GP5 se usan para la adición de restos de glicanos.
Los resultados de los presentes inventores ponen de manifiesto que
la adición de glicanos en el sitio N44 es más crítica para la
recuperación de virus infeccioso. Además, los resultados de los
presentes inventores muestran que los VSRRP que contienen formas
hipoglicosiladas de GP5 son exquisitamente sensibles a la
neutralización por anticuerpos y que los virus mutantes inducen
niveles significativamente mayores de anticuerpos neutralizantes,
no sólo contra los virus mutantes homólogos, sino también contra el
VSRRP wt.
La confirmación de que los tres sitios de
glicosilación ligada a N potenciales se usan para la adición de
glicanos en GP5 se proporcionó usando mutantes con modificaciones en
uno solo o en múltiples sitios (Figura 2). Los estudios bioquímicos
mostraban que la proteína GP5 de VSRRP, cuando se coexpresaba con la
proteína M en células transfectadas, contiene glicanos de tipo de
alto contenido en manosa sensibles a Endo H. La observación de que
la mayoría de la GP5 incorporada en viriones es resistente a Endo H
(Figura 4A), mientras que la GP5 expresada en presencia de proteína
M en células transfectadas es totalmente sensible a Endo H, es
intrigante. Es posible que cuando la GP5 se expresa en presencia de
proteína M en células transfectadas, se acumule en su mayor parte
en el RE o en la región cis-Golgi, y de este modo
continúe siendo sensible a Endo H. Sin embargo, en células
infectadas por VSRRP, la GP5 puede interaccionar con proteínas
virales adicionales y el transporte de la GP5 más allá del RE o del
cis-Golgi se facilita por la formación de complejos
con las demás proteínas virales. De acuerdo con esta
interpretación, los presentes inventores han observado que en
células infectadas por VSRRP wt o mutante, la proteína GP5 también
es resistente a Endo H. Los presentes inventores sugieren que la
GP5, que se sintetiza en el RE en células infectadas, se transporta
a las regiones medial- y/o trans-Golgi donde la
mayoría de las moléculas de GP5 adquieren resistencia a Endo H antes
de incorporarse en viriones de VSRRP. Varios estudios con
arterivirus incluyendo VSRRP sugieren que las proteínas GP5 y M
forman heterodímeros, que pueden desempeñar un papel clave en la
infectividad viral. En el VAE y el VLD, se ha demostrado la
interacción directa de proteína GP5 y M por medio de la formación
de enlaces disulfuro. Dichas interacciones pueden producirse antes
del procesamiento adicional de cadenas laterales de oligosacáridos
ligados a N, presumiblemente antes de que la GP5 se transporte
fuera del RE o del compartimento cis-Golgi.
Es interesante observar que el patrón de
resistencia a Endo H de la GP5 incorporada en viriones wt y mutantes
es diferente. Aunque la mayoría de las moléculas de GP5 en VSRRP wt
eran resistentes a Endo H, la mayoría de las moléculas de GP5 en
los viriones mutantes en un solo sitio (FL-N34A y
FL-N51A) eran sensibles a Endo H (Figura 4A).
Además, de los dos restos de glicanos en estos mutantes, sólo uno
era sensible mientras que el otro era resistente. El virión doble
mutante (FL-N34/51A) también incorporaba una GP5 que
contenía glicanos, algunos de los cuales también eran sensibles a
Endo H. Estos datos concuerdan con la interpretación de que los
viriones de VSRRP wt así como mutantes incorporan una población
mixta de moléculas de GP5 que contienen restos de glicanos
diferentes en diferentes sitios. Estudios previos que demuestran la
incorporación de formas glicosiladas de forma diferente de GP5 en
viriones de VSRRP wt refuerzan adicionalmente la interpretación de
los presentes inventores. A partir del patrón de sensibilidad a Endo
H de la GP5 incorporada en los viriones, es tentador especular que
el sitio N44 puede contener los glicanos resistentes a Endo H,
aunque se incorporaron en los viriones algunas moléculas de GP5 con
glicanos sensibles a Endo H en este sitio. Todavía tiene que
investigarse si este patrón de glicanos poco habitual en diversos
sitios de la GP5 y la incorporación de diversas formas de GP5 en
viriones tiene alguna relevancia para el patrón de respuesta inmune
observado en animales infectados con VSRRP.
En un estudio reciente, se demostró que de los
dos sitios de glicosilación ligada a N (N46 y N53) en la GP5 del
VSRRP Lelystad, la glicosilación del resto N46 era claramente
necesaria para la producción de partículas de virus. La producción
de virus infeccioso se redujo aproximadamente 100 veces con la
mutación en la posición N46. Los resultados de los presentes
inventores sugieren que la adición de glicanos en la N44 (para VSRRP
norteamericanos) es absolutamente esencial para la recuperación de
VSRRP infecciosos. Entonces es posible que los aislados europeos y
norteamericanos de VSRRP puedan diferir algo en sus necesidades de
glicosilación ligada a N para la producción de virus infecciosos. A
este respecto, debe señalarse que el virus Lelystad contiene sólo
dos sitios de glicosilación ligada a N, mientras que el aislado
norteamericano que han usado los presentes inventores en el
presente estudio contiene tres sitios de este tipo.
La GP5 es la glicoproteína más importante del
VSRRP implicada en la generación de anticuerpos neutralizantes de
VSRRP y de una inmunidad protectora. Los resultados de los presentes
inventores ponen de manifiesto que la ausencia de glicanos en los
restos 34 y 51 del ectodominio de GP5, al tiempo que genera mutantes
de VSRRP viables, aumenta tanto la sensibilidad de estos mutantes a
la neutralización por anticuerpos como la inmunogenicidad del
epítope de neutralización cercano. El efecto inmediato de la
ausencia de glicanos en GP5 de VSRRP mutantes ha sido la
sensibilidad aumentada de los virus a la neutralización por sueros
de convalecientes de cerdos infectados con VSRRP wt (Tabla 3). Los
estudios con VIH-1 y VIS han demostrado que la
adquisición o eliminación de glicanos en los bucles variables de la
gp160 modifica su sensibilidad a la neutralización. Por lo tanto,
se ha postulado que los glicanos desempeñan al menos dos tipos de
papeles esenciales durante la biosíntesis de glicoproteínas de la
envoltura viral. En un caso, la ausencia de glicanos implica
defectos de la glicoproteína y, por lo tanto, en la viabilidad
global de la cepa viral. Los presentes inventores proponen que los
glicanos en la posición N44 de la GP5 de VSRRP cumplen un papel
similar. En el segundo caso, los glicanos sirven potencialmente
para proteger a las proteínas virales frente a la neutralización por
anticuerpos. Para la GP5 de VSRRP, los glicanos en las posiciones
N34 y N51 pueden tener un papel similar. En el caso del VIH, se
postula que la "protección de glicanos" es un mecanismo
primario para explicar la evasión de la respuesta inmune
neutralizante, asegurando de este modo la persistencia del VIH
in vivo. Esto invita a sacar algunos paralelismos con el
VSRRP. La infección con VSRRP, que se sabe que persiste durante
varios meses en animales individuales, presenta un comportamiento
poco habitual en términos de inducción de respuesta inmune
neutralizante específica de virus. Está bien establecido que a los
animales infectados con VSRRP habitualmente les lleva más tiempo
del normal establecer una respuesta de anticuerpos neutralizantes de
VSRRP detectable. Una vez establecida, esta respuesta neutralizante
de VSRRP es débil y varía significativamente de un animal a otro. Se
ha postulado que el retraso en la respuesta de anticuerpos
neutralizantes se debe a la presencia de un epítope señuelo
inmunodominante cercano (posiciones aminoacídicas 27 a 30) que
provoca una respuesta inmune robusta temprana no protectora que
enmascara y/o ralentiza la respuesta contra el epítope neutralizante
(posiciones aminoacídicas 37 a 45) (26, 38). Aunque esta es una
explicación verosímil para el carácter atípico de la respuesta de
anticuerpos neutralizantes de VSRRP, todavía tiene que ensayarse.
En el laboratorio de los presentes inventores, la deleción del
epítope señuelo ha demostrado sistemáticamente ser letal para la
recuperación de VSRRP infeccioso (Ansari y col., datos no
publicados), haciendo por lo tanto difícil ensayar esta
hipótesis.
Es posible que pueda imaginarse un mecanismo
alternativo o complementario para explicar la naturaleza peculiar
de la respuesta neutralizante de VSRRP mediante el fenómeno de
"protección de glicanos" propuesto para el VIH y el VIS. El
uso de VSRRP mutantes que carecen de uno o dos restos de glicanos en
los estudios de los presentes inventores proporciona por primera
vez pruebas de la presencia de grandes cantidades de anticuerpos
neutralizantes de VSRRP en los sueros de animales infectados por
VSRRP wt que de otro modo serían indetectables debido al uso de
VSRRP wt en los ensayos de NS. Los anticuerpos neutralizantes de
VSRRP, aunque están presentes en la respuesta del huésped, son
incapaces de reaccionar con los viriones de VSRRP wt infecciosos
debido al bloqueo o la protección del epítope neutralizante por los
restos de glicanos en GP5.
Un precedente importante para el escape a la
neutralización por glicosilación de glicoproteínas en arterivirus
se ha descrito para el virus elevador de la lactato deshidrogenasa
(VLD). El VLD es altamente resistente a la neutralización por
anticuerpos debido a la gran protección de glicanos de su
glicoproteína principal, VP-3, sin embargo, ciertas
cepas de origen natural de VLD son altamente susceptibles a la
neutralización, debido a la pérdida de dos sitios de glicosilación
en el ectodominio de la VP-3. Curiosamente, este
fenotipo sensible a la neutralización se correlaciona con un alto
grado de neurotropismo en el huésped adquirido por estas cepas de
VLD fácilmente neutralizables. Dicha potenciación de su
neuropatogenicidad refleja probablemente la facilitación de la
interacción de las glicoproteínas virales con receptores en células
neuronales, posiblemente debido a la ausencia de la protección de
glicanos. En el modelo de cerdos jóvenes que se usó para la
inoculación con VSRRP, los presentes inventores no fueron capaces
de detectar diferencias patogénicas entre ninguno de los VSRRP
mutantes y el VSRRP wt, aunque los presentes inventores limitaron
sus observaciones a las mediciones de la temperatura y de la
viremia. Es posible que en condiciones experimentales diferentes (es
decir, en un modelo de cerda gestante), puedan observarse algunas
alteraciones en la patogenicidad de estos VSRRP mutantes. No se
sabe si el descubrimiento de cepas de VSRRP hipoglicosiladas de
origen natural es un hecho común, aunque informes previos han
sugerido su presencia.
Una observación notable en los experimentos de
los presentes inventores ha sido que los mutantes de GP5, cuando
infectan cerdos in vivo, pueden superar al VSRRP wt en su
capacidad para organizar una respuesta neutralizante de VSRRP wt
considerable en fases tardías de la infección (Tabla 4A). En un
escenario paralelo, los presentes inventores han observado no sólo
mayores títulos de anticuerpos neutralizantes contra mutantes de
VSRRP homólogos, sino también títulos considerables contra el VSRRP
wt (Tabla 4A). Además, la respuesta se producía antes, con títulos
neutralizantes detectables a los 14 días p.i., una observación que
no se observa típicamente con la infección por VSRRP wt (Tabla 4B).
La neutralización aumentada de VSRRP wt por sueros de cerdos
infectados con los mutantes de VSRRP sugiere que los glicanos
estaban enmascarando el epítope o epítopes neutralizantes, que no
inducían anticuerpos neutralizantes cuando estaban presentes los
glicanos. Esta observación tiene una gran importancia sobre el
diseño de vacunas de VSRRP mejores y más eficaces, sugiriendo que
nuevas vacunas diseñadas racionalmente deberían llevar
modificaciones en el patrón de glicosilación de la GP5 para aumentar
la producción de anticuerpos neutralizantes. Además, será
importante estudiar los efectos que esta eliminación de
carbohidratos de glicoproteínas inmunológicamente importantes de
VSRRP pueda tener sobre el aumento de los títulos de NS, no sólo
contra la cepa inmunizante homóloga sino también contra diversas
cepas de VSRRP no relacionadas.
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Ejemplo
2
Para identificar los sitios de glicosilación
ligada a N correspondientes a la asparagina 34 o a la asparagina 51
en una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 que pueden
inactivarse y usarse en los procedimientos de la presente
invención, las proteínas GP5 de un aislado de VSRRP norteamericano
(Figura 5) o un aislado de VSRRP europeo (Figura 6) deseado se
alinean con la proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 (cepa
norteamericana NVSL 97-7895). En este ejemplo, los
alineamientos se generaron con el programa MegAlign^{TM} de
DNASTAR, Inc. (Madison, WI, Estados Unidos) usando el procedimiento
de alineamiento de Jotun-Hein (Hein, J. J. en
Methods in Enzymology, Vol. 183: págs. 626-645,
1990). Los parámetros de alineamiento de múltiples secuencias eran
una penalización por huecos de 11 y una penalización por longitud de
huecos de 3. Para las comparaciones por parejas, se usó un valor
Ktuple de 2.
En la Figura 5, está claro que el sitio de
glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 de la
proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está presente en todos
los aislados de VSRRP norteamericanos mostrados y comprende el
sitio de glicosilación ligada a N "NGT". Este sitio de
glicosilación ligada a N puede inactivarse por sustitución de
codones que codifiquen otros restos aminoacídicos tales como
glutamina o alanina en lugar de la asparagina 51 en la secuencia
polinucleotídica correspondiente. En estos casos, la secuencia de
aminoácidos correspondiente en la variante proteica de GP5 a VSRRP
norteamericano hipoglicosilada comprendería secuencias tales como
"QGT", "AGT" o "XGT", en las que X es cualquier
aminoácido distinto de asparagina. Estas y otras variantes
hipoglicosiladas de los aislados de VSRRP norteamericanos en los que
el sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la
asparagina 51 está inactivado también pueden combinarse con otras
variantes de GP5 hipoglicosiladas en las que están inactivados
otros sitios de glicosilación ligada a N.
También es evidente a partir de la Figura 5 que
el sitio de glicosilación ligada a N que se corresponde exactamente
con la asparagina 34 de la proteína GP5 de referencia de la SEC ID
Nº: 1 está presente sólo en ciertos aislados de VSRRP
norteamericanos. Más específicamente, las proteínas GP5 de los
aislados de VSRRP norteamericanos IAF-BAJ (SEC ID
Nº: 3), 94-3182 (SEC ID Nº: 7) y
94-287 (SEC ID Nº: 8) contienen el sitio de
glicosilación ligada a N que se corresponde exactamente con la
asparagina 34 de la proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 y
que comprende el sitio de glicosilación ligada a N "NSS". Este
sitio de glicosilación ligada N de las SEC ID Nº: 3, 7 y 8 puede
inactivarse por sustitución de codones que codifiquen otros restos
aminoacídicos tales como glutamina o alanina en lugar de la
asparagina 34 en la secuencia polinucleotídica correspondiente. En
estos casos, la secuencia de aminoácidos correspondiente en la
variante proteica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada
comprendería secuencias tales como "QSS", "ASS" o
"XSS", en las que X es cualquier aminoácido distinto de
asparagina.
En otros aislados de VSRRP norteamericanos que
carecen del sitio de glicosilación ligada a N que se corresponde
exactamente con la asparagina 34 de la proteína GP5 de referencia de
la SEC ID Nº: 1, también pueden inactivarse otros sitios de
glicosilación ligada a N localizados en el resto 30 (Figura 5
"NAS" en las SEC ID Nº: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 13) y el
resto 33 (Figura 5 "NNS" en las SEC ID Nº: 3, 8; "NSS" en
las SEC ID Nº: 6, 10, "NDS" en las SEC ID Nº: 11, 13). En
otras palabras, también pueden inactivarse sitios de glicosilación
ligada a N en otros aislados norteamericanos localizados en las
posiciones aminoacídicas correspondientes a los restos 30 y 33 de
la proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 y usarse en los
procedimientos de la presente invención.
En la Figura 6, está claro que el sitio de
glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 de la
proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 también está presente
en un aislado de VSRRP europeo representativo y comprende el sitio
de glicosilación ligada a N "NGT". Este sitio de glicosilación
ligada a N puede inactivarse por sustitución de codones que
codifiquen otros restos aminoacídicos tales como glutamina o alanina
en lugar de la asparagina 51 en la secuencia polinucleotídica
correspondiente. En estos casos, la secuencia de aminoácidos
correspondiente en la variante proteica de GP5 de VSRRP europeo
hipoglicosilada comprendería secuencias tales como "QGT",
"AGT" o "XGT", en las que X es cualquier aminoácido
distinto de asparagina. Estas u otras variantes hipoglicosiladas de
los aislados de VSRRP europeos en los que el sitio de glicosilación
ligada a N correspondiente a la asparagina 51 está inactivado
también pueden combinarse con otras variantes de GP5
hipoglicosiladas en las que están inactivados otros sitios de
glicosilación ligada a N.
En vista de lo anterior, se observará que se
consiguen y logran varias ventajas de la invención.
Las realizaciones se seleccionaron y
describieron para explicar mejor los principios de la invención y su
aplicación práctica para permitir de este modo que otros expertos
en la materia utilicen mejor la invención en diversas realizaciones
y con diversas modificaciones según sean apropiadas para el uso
particular contemplado.
Ya que podrían realizarse diversas
modificaciones en las construcciones y procedimientos del presente
documento descrito e ilustrado sin alejarse del ámbito de la
invención, se pretende que toda la materia contenida en la
descripción anterior o que se muestra en los dibujos adjuntos deberá
interpretarse como ilustrativa más que limitante. Por lo tanto, la
amplitud y el ámbito de la presente invención no deberían limitarse
a ninguna de las realizaciones ejemplares descritas anteriormente,
sino que deberían definirse solamente de acuerdo con las siguientes
reivindicaciones adjuntas al presente documento y sus
equivalentes.
<110> Board of Reagents university of
Nebraska-Lincoln
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos y composiciones para
la vacunación de animales con antígenos de VSRRP con una
inmunogenicidad mejorada
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AHB/FP6533640
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 06824866.5
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
30-08-2006
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US2006/033990
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-08-2006
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/712.357
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-08-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<400> 2
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<210> 3
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reproductivo porcino
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<210> 6
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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reproductivo porcino
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<400> 9
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<210> 10
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<210> 12
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<210> 13
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 200
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<212> PRT
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<213> Consenso de virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Ser, Asp, Asn o
Thr
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Lys, Asn, Glu, Asp, o
Ala
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (94)..(94)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Ile o Val
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (164)..(164)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Gly, Arg, Lys, o
Gln
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 201
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<212> PRT
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
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\hskip0,8cm
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<210> 16
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<211> 15414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<400> 16
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipgccaacagcg ccagcagctc tc
\hfill22
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<210> 19
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> sintético
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipgttgatttac gccttgacgc tatg
\hfill24
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<210> 20
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<211> 22
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<213> ADN
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<213> sintético
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipgtgagctggc tggcacagat tg
\hfill22
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<210> 21
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<211> 53
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<212> ADN
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<213> sintético
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskipgccaacagcg ccagcagctc tcatcttcag ttgatttacg ccttgacgct atg
\hfill53
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> sintético
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskipgttgatttac gccttgacgc tatgtgagct ggctggcaca gattg
\hfill45
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<212> ADN
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<213> sintético
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<400> 23
\hskip0,8cm
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<212> ADN
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<213> sintético
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\hskip0,8cm
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<212> ADN
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<213> sintético
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<400> 25
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\hskip-.1em\dddseqskipctaccaacat caggtcgatg gcgg
\hfill24
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<212> ADN
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<213> sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcggccgcg acttaccttt agag
\hfill24
Claims (39)
1. Una composición que comprende un
polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de
VSRRP hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación
ligada a N correspondiente a la asparagina 51 o a la asparagina 34
de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está
inactivado, para su uso en un procedimiento de generación de una
respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un antígeno del Virus
del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP).
2. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que cualquiera o ambos de dichos sitios de
glicosilación ligada a N se inactivan por sustitución de los codones
que codifican dicha asparagina 51 o dicha asparagina 34 con un
codón que codifica un aminoácido distinto de asparagina.
3. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que dicho codón que codifica otro
aminoácido codifica un resto alanina o glutamina.
4. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que dicho codón que codifica otro
aminoácido codifica un resto alanina.
5. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
polinucleótido comprende una molécula de ARN de VSRRP
infecciosa.
6. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho
polinucleótido comprende una molécula de ADN que codifica una
molécula de ARN de VSRRP infecciosa.
7. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 5 o la reivindicación 6, en la que dicha molécula de
ARN de VSRRP infecciosa es un derivado de VSRRP europeo o un
derivado de VSRRP norteamericano.
8. La composición para su uso de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho
polinucleótido comprende una molécula de ADN en la que un promotor
activo en células de mamíferos se une operativamente a dicho
polinucleótido que codifica una proteína GP5 hipoglicosilada.
9. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicho promotor es un promotor de
CMV.
10. La composición para su uso de acuerdo con
las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polinucleótido comprende
un vector viral seleccionado del grupo constituido por un vector de
virus vaccinia, un vector de virus herpes simple, un vector de
adenovirus, un vector de alfavirus y un vector del virus de la
GET.
11. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha composición comprende además un
vehículo o un adyuvante terapéuticamente aceptable.
12. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que dicho vehículo se selecciona del grupo
constituido por una proteína, un tampón, un tensioactivo y un
polímero de polietilenglicol o cualquier combinación de los
mismos.
13. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que dicho adyuvante se selecciona del
grupo constituido por hidróxido de aluminio, Quil A, una suspensión
de gel de alúmina, aceites minerales, glicéridos, ácidos grasos,
subproductos de ácidos grasos, micobacterias y
oligodesoxinucleótidos CpG o cualquier combinación de los
mismos.
14. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha
composición se administra por inyección subcutánea, inyección
intravenosa, inyección intradérmica, inyección parenteral,
inyección intramuscular, inyección sin aguja, electroporación,
administración por vía oral, administración intranasal,
administración oronasal o cualquier combinación de las mismas.
15. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha
respuesta inmune mejorada de dicho cerdo contra un antígeno de VSRRP
comprende una producción aumentada de anticuerpos neutralizantes de
VSRRP por dicho cerdo.
16. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
cerdo es una cerda multípara, una cerda nulípara, un verraco o un
cochinillo.
17. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de
VSRRP hipoglicosilada se obtiene por síntesis directa, mutagénesis
de una secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP europeo o
mutagénesis de una secuencia de nucleótidos consenso de GP5 de
VSRRP europeo.
18. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 17, en la que dicha secuencia de nucleótidos de GP5
aislada de VSRRP europeo codifica una proteína GP5 que tiene una
identidad de al menos el 85% con la SEC ID Nº: 15.
19. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 18, en la que dicha secuencia de nucleótidos de GP5
de VSRRP europeo es la SEC ID Nº: 15.
20. La composición para su uso de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicho
polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de
VSRRP hipoglicosilada se obtiene por síntesis directa, mutagénesis
de una secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP
norteamericano o mutagénesis de una secuencia de nucleótidos
consenso de GP5 de VSRRP norteamericano.
21. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 20, en la que dicha secuencia de nucleótidos de GP5
aislada de VSRRP norteamericano codifica un péptido seleccionado del
grupo constituido por las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3,
SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº:
8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12 y SEC
ID Nº: 13.
22. La composición para su uso de acuerdo con la
reivindicación 20, en la que dicha secuencia de nucleótidos
consenso de GP5 de VSRRP norteamericano codifica una proteína GP5
consenso que tiene una identidad de al menos el 85% con la SEC ID
Nº: 14.
23. Una composición que comprende una variante
polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada, en la que al menos
un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina
51 o a la asparagina 34 de una proteína GP5 de referencia de la SEC
ID Nº: 1 está inactivado, para su uso en un procedimiento de
generación de una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un
antígeno del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino
(VSRRP).
24. Un polinucleótido aislado que codifica una
variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano
hipoglicosilada en la que al menos un sitio de glicosilación ligada
a N correspondiente a la asparagina 51 de una proteína GP5 de
referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado.
25. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 24, en el que dicho sitio de glicosilación ligada a N
correspondiente a la asparagina 51 se inactiva por sustitución de
un codón que codifica dicha asparagina 51 con un codón que codifica
un aminoácido distinto de asparagina.
26. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 24 ó 25, en el que ambos sitios de glicosilación
ligada a N correspondientes a la asparagina 34 y a la asparagina 51
de la SEC ID Nº: 1 están inactivados.
27. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 26, en el que dicho sitio de glicosilación ligada a N
correspondiente a la asparagina 34 se inactiva por sustitución de
un codón que codifica dicha asparagina 34 con un codón que codifica
un aminoácido distinto de asparagina.
28. El polinucleótido aislado de acuerdo con la
reivindicación 25 ó 27, en el que dicho codón que codifica otro
aminoácido codifica un resto alanina o glutamina.
29. El polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho
polinucleótido comprende una molécula de ARN de VSRRP norteamericano
infecciosa.
30. El polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho
polinucleótido comprende una molécula de ADN que codifica una
molécula de ARN de VSRRP norteamericano infecciosa.
31. El polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho
polinucleótido comprende una molécula de ADN en la que un promotor
activo en células de mamíferos se une operativamente a dicho
polinucleótido que codifica dicha variante polipeptídica de GP5 de
VSRRP norteamericano hipoglicosilada.
32. El polinucleótido aislado de la
reivindicación 31, en el que dicho promotor es un promotor de
CMV.
33. El polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho
polinucleótido comprende un vector viral seleccionado del grupo
constituido por un vector de virus vaccinia, un vector de virus
herpes simple, un vector de adenovirus, un vector de alfavirus y un
vector del virus de la GET.
34. Una composición que comprende un
polinucleótido como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 28, y un vehículo terapéuticamente aceptable
y, opcionalmente, al menos un adyuvante.
35. La composición de la reivindicación 33, en
la que dicho vehículo terapéuticamente aceptable se selecciona del
grupo constituido por una proteína, un tampón, un tensioactivo y un
polímero de polietilenglicol, o cualquier combinación de los
mimos.
36. La composición de la reivindicación 34 ó 35,
en la que dicho adyuvante se selecciona del grupo constituido por
hidróxido de aluminio, Quil A, una suspensión de gel de alúmina,
aceites minerales, glicéridos, ácidos grasos, subproductos de
ácidos grasos, micobacterias y oligodesoxinucleótidos CpG, o
cualquier combinación de los mismos.
37. La composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 34 a 36, en la que dicha composición
comprende además un segundo adyuvante que se selecciona del grupo
constituido por interleucina 1 (IL-I),
IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-12, interferón gamma
(IFN-g), factor de necrosis tumoral, MDP (dipéptido
de muramilo), complejo inmunoestimulante (ISCOM) y liposomas.
38. Una composición que comprende una variante
polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada, en la
que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a
la asparagina 51 en una proteína consenso GP5 de referencia de la
SEC ID Nº: 1 está inactivado, y un vehículo terapéuticamente
aceptable.
39. Un polipéptido aislado que es una variante
polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada, en la
que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a
la asparagina 51 en una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº:
1 está inactivado.
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