BRPI0615837A2 - método para a determinação quantitativa de poloxámeros - Google Patents

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Abstract

MéTODO PARA A DETERMINAçãO QUANTITATIVA DE POLOXáMEROS A presente invenção refere-se à determinação analítica de poloxâmeros em uma amostra líquida de proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA A DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE POLOXÂMEROS".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo da determinação analí-tica de um tensoativo que pertence à classe de poloxâmeros em uma amos-tra de proteína líquida.
Antecedentes da Invenção
Os poloxâmeros são copolímeros em bloco não iônicos do oxidode etileno (EO) e óxido propileno (PO). Eles são usados em formulaçõesfarmacêuticas como tensoativos, agentes emulsificantes, agentes de solubi-lização e agentes dispersantes.
Uma aproximação analítica bem-conhecida para caracterizar umpoloxâmero é um método colorimétrico no qual são analisadas as absorvân-cias UV em 320 nm e 620 nm, que resultam da formação complexa do polo-xâmero com o tiocianato de cobalto (II).
Yun Mao et al (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analy-sis, 35 (2004), 1127) descrevem para a determinação do poloxâmero o usoda cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando uma coluna comTHF como fase móvel e a detecção do índice de refração (RI). O método foiaplicado às formulações farmacêuticas Avapro, Neurontin e Sudafed nasquais o princípio ativo é "uma molécula pequena". As moléculas pequenassão convenientemente separáveis da massa molecular elevada dos poloxâ-meros por SEC.
A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), também cha-mada de cromatografia de permeação em gel (GPC), usa partículas porosaspara separar moléculas de tamanhos diferentes. É geralmente usada paraseparar moléculas de polímero e determinar pesos moleculares e distribui-ções de peso moleculares do polímero. As moléculas que são menores doque o tamanho do poro podem se introduzir nas partículas e por isso têm umcaminho mais longo e o tempo de trânsito mais longo do que mais moléculasgrandes que não podem se introduzir nas partículas. Todas as moléculasmaiores do que o tamanho do poro não são retidas e eluem juntas. As mole-cuias que podem se introduzir nos poros terão um tempo de residência mé-dio nas partículas que depende do tamanho e da forma das moléculas. Mo-léculas diferentes, desse modo, possuem diferentes tempos totais de trânsitopela coluna.
Nenhum método foi fornecido por enquanto que permitisse a de-terminação quantitativa de poloxâmeros em amostras de proteína, já que asproteínas têm uma massa molecular que é comparável com a dos poloxâme-ros.
Há uma necessidade particular para a determinação quantitativade poloxâmeros em amostras de proteína, nas quais a proteína tem umamassa molecular entre 5 kDa e 70 kDa, preferivelmente entre 20 kDa e 70kDa.
Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a um método que permite a de-terminação quantitativa de um poloxâmero em uma amostra de proteína,especialmente uma amostra de proteína líquida, por exemplo, em uma for-mulação farmacêutica líquida. Especialmente, a invenção fornece um méto-do para a medição quantitativa da concentração de poloxâmeros em umaamostra de proteína. Assim, a quantidade de poloxâmeros na formulaçãopode ser determinada a qualquer momento durante um tempo de armaze-namento de aproximadamente 2 anos de uma formulação de proteína.
O método para a determinação quantitativa de um poloxâmeroem uma amostra de proteína líquida compreende os passos de submeter adita amostra:
(a) uma etapa de separação dos componentes da dita amostrausando uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho; e
(b) uma etapa de detecção do poloxâmero analisando o índicede refração;
Preferivelmente, a presente invenção refere-se a um método pa-ra a determinação quantitativa de um poloxâmero em uma amostra de prote-ína líquida compreendendo os passos de submeter a dita amostra a:
(a) uma etapa de separação usando uma coluna de cromatogra-fia de exclusão de tamanho;
(b) uma etapa de eluição com uma fase móvel; e
(c) opcionalmente uma etapa de detecção do poloxâmero.
Assim a cromatografia de exclusão de tamanho combinada comuma etapa de eluição com uma fase móvel permite separar o poloxâmerodos componentes restantes.
O poloxâmero é descoberto no contexto de uma etapa adicionalanalisando-se a fase eluída, por exemplo, usando um sistema de detecçãodo Rl (índice de refração).
Descrição Resumida do Desenho
A Figura 1 mostra um cromatograma para a determinação quan-titativa do Poloxamer 188 em uma formulação hCG. A área do pico do Polo-xamer 188 está neste exemplo em um tempo de eluição de aproximadamen-te 14 a 16 minutos (o tempo de retenção pode variar como uma função dataxa de fluxo). A área embaixo da curva permite a quantificação do Poloxa-mer 188 dentro da amostra de hCG.Abreviaturas
As seguintes abreviaturas são usadas na descrição da presenteinvenção:
FSH: hormônio de estimulação folicular; r-FSH; R-LH; r-hCG;r-GH;
r-IFN beta, r-TSH: FSH recombinante, LH, hCG, GH, INF beta, TSH;hFSH: FSH humano;
r-hFSH: FSH humano recombinante;
RI: índice de refração;
KD ou Kd ou kDa: kiloDalton;
SEC: Cromatografia de exclusão de tamanho;
RT: Temperatura ambiente;
WFI: água de injeção;
Poloxamer 188: sinônimo de Pluronic F68 da BASF Inc.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção refere-se a um método conveniente quepermite a determinação quantitativa de um poloxâmero, que é um tensoati-vo, em uma amostra de proteína. Preferivelmente1 a amostra de proteína éuma amostra de proteína líquida. A amostra de proteína líquida pode estarna forma de qualquer formulação líquida, preferivelmente ela é uma formula-ção farmacêutica líquida tal como descrito abaixo. Em uma modalidade, adita amostra de proteína farmacêutica líquida é contida em um frasco, paraaplicação única ou administração de múltiplas doses.
Em uma modalidade adicional a amostra de proteína a ser ana-lisada é Iiofilizada e deve ser solubilizada em um solvente aquoso conveni-ente antes de ser analisado.
O método para a determinação quantitativa de um poloxâmeroem uma amostra de proteína líquida compreende as etapas de submeter adita amostra a:
(a) uma etapa de separação dos componentes da dita amostrausando uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (especialmen-te uma coluna de SE-HPLC); e
(b) uma etapa de detecção do poloxâmero analisando o índicede refração.
Preferivelmente, a invenção fornece um método para a determi-nação quantitativa de um poloxâmero em uma amostra de proteína líquidacompreendendo das etapas de submeter a dita amostra a:
(a) uma etapa de separação usando uma coluna de cromatogra-fia de exclusão de tamanho;
(b) uma etapa de eluição com uma fase móvel; e
(c) opcionalmente uma etapa de detecção do poloxâmero.
Tipicamente a coluna de exclusão de tamanho seria uma colunade SE-HPLC.
Em uma modalidade, o poloxâmero é o Poloxamer 188.
Em uma modalidade preferida a proteína na amostra de proteínalíquida tem uma massa molecular que é comparável com a massa de polo-xâmero.
Em uma modalidade particularmente preferida, a proteína naamostra de proteína líquida tem uma massa molecular entre 5 e 70 kDa,mais preferivelmente entre 20 e 70 kDa.
A razão da massa de proteína para a respectiva massa de polo-xâmero pode estar preferivelmente entre 1:3 e 10:1, preferivelmente entre1:2 e 7:1.
Os exemplos da proteína de acordo com a presente invençãoincluem as proteínas dos mamíferos, como, por exemplo, o hormônio docrescimento, inclusive hormônio humano e o hormônio bovino do crescimen-to; fator de liberação do hormônio de crescimento; hormônio da paratireóide;hormônio de estímulo da tireóide; Iipoproteínas; a-l-antitripsina; insulina dacadeia A; insulina da cadeia B; pró-insulina; hormônio estimulador de folícu-lo; coriogonadotropina; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatoresde coagulação como o fator VlIIC, fator IX, fator de tecido, e fator de von Wil-lebrands; fatores de anti-coagulação como Proteína C; fator natriurético atri-al; pulmão tensoativo; um ativador do plasminogênio, tal como a asuroquina-se ou ativador do plasminogênio do tipo de tecido (t-PA); bombazina; trombi-na; fatores alfa e beta da necrose tumoral; enquefalinase; RANTES (célula Tnormalmente expressada e secretada regulado na ativação); proteína huma-na inflamatória macrófago (MIP-l-alfa); albumina do soro tal como a albuminado soro humano; substância inibidora mullerian; relaxina da cadeia A; relaxi-na da cadeia B; prorelaxina; gonadotropina de rato associada a peptídio;DNase; inibina; ativina; fator de crescimento vascular endotelial (VEGF); re-ceptores de hormônios ou fatores de crescimento; uma integrina; proteínas Aou D; fatores reumatóides; um fator neurotrófico tal como o fator neutróficoderivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5, ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5, ouNT-6), ou um fator de crescimento de nervos tal como NGF-P; fator de cres-cimento plaquetário (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto tal comoaFGF e bFGF, particularmente FGF-18; fator de crescimento epidérmico(EGF); fator de crescimento de transformação (TGF) como o TGF-alfa e oTGF-beta, incluindo TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, õuTGF-beta 5; fator de crescimento semelhante a insulina I e Il (IGF-I e IGF-II);des(l-3)-IGF-1 (IGF-I cerebral); Proteínas de ligação de fator de crescimentosemelhante a insulina; Proteínas CD tal como CD3, CD4, CD8, CD19 eCD20; eritropoietina (EPO); trombopoietina (TPO); fatores de osteoindutivo;osteopontina; imunotoxinas; proteína morfogenética de osso (BMP); um in-terferon, tal como o interferon alfa, beta e gama; fatores estimuladores decolônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs),por exemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutase; receptores da célula T; pro-teína da membrana da superfície; fator de aceleração do decaimento (DAF);um antígeno viral tal como, por exemplo, uma parte do envelope da AIDS;proteínas de transporte; receptores de residência; adressinas; proteína regu-ladora; imunoadesinas; anticorpos; e fragmentos biologicamente ativos ouvariantes de qualquer um dos polipeptídios acima listados.
Preferivelmente, a proteína de acordo com a presente invençãoé selecionada do hormônio estimulador folicular (FSH), coriogonadotropina(CG), hormônio luteinízante (LH), beta Interferon (IFN-beta), beta InterferonPEGuiIado (PEG-IFN-beta), hormônio do crescimento (GH), hormônio esti-mulador da tireóide (TSH), fator 18 de crescimento do fibroblasto (FGF-18)ou osteopontina.
Os FSH, CG, LH e TSH são glicoproteínas que caem na classedas gonadotrofinas. As gonadotrofinas são usadas no tratamento da infertilidade.
A IFN-beta é uma glicoproteína que cai na classe das interleuci-nas. A IFN-beta é usada no tratamento de esclerose múltipla.
O PEG-IFN-beta é uma IFN-beta derivatizada por uma cadeiade polietilenoglicol, que confere uma estabilidade melhorada.
O hormônio do crescimento é uma proteína não glicosilada. Éusado para tratar as deficiências do hormônio do crescimento infantil ou adulto.
O FGF-18 é usado no tratamento de osteoartrite.
A osteopontina é um polipeptídio de cadeia simples glicosilada.
Em uma modalidade preferida a dita proteína é um heterodímerocomo as gonadotropinas (FSH, LH, CG, TSH bem como suas variantes). Emuma modalidade adicional a proteína é o Hormônio do Crescimento (GH) oubeta interferem (IFN-beta ou variantes, por exemplo, variantes PEGuiladas).Em uma modalidade ainda adicional, a proteína é a FGF-18 ou a osteopontina.
Em uma modalidade preferida, a amostra de proteína líquida in-clui uma ou várias proteínas terapêuticas. Preferivelmente, tal amostra nãoinclui uma não-proteína terapêutica, tal como um composto químico de baixopeso molecular.
O hormônio estimulador folicular, ou FSH, tal como aqui utilizadorefere-se ao FSH produzido como uma proteína madura de comprimentototal que inclui, mas não está limitada ao FSH humano ou "hFSH", quer sejaproduzido recombinantemente ou isolado de fontes humanas, tal como aurina de mulheres pós-menopausa.
O método é aplicável à proteína natural bem como a uma prote-ína recombinante. Em uma modalidade a formulação de proteínas é de FSH,LH, CG, TSH, GH ou IFN-beta recombinantes humanas.
O hormônio estimulador folicular (FSH) é uma glicoproteína quecai na classe das gonadotrofinas. O FSH é usado no tratamento da infertili-dade e distúrbios reprodutores tanto em pacientes femininos como em mas-culinos, por exemplo, para a indução da espermatogênese em homens quesofrem de oligospermia.
O hormônio Iuteinizante (LH) é uma gonadotropina segregadapelo lobo anterior da hipófise. A LH é usada em pacientes femininos emcombinação com FSH em Ol (indução da ovulação) e em COH (hiperestimu-lação ovariana controlada), particularmente naqueles pacientes que têm ní-veis muito baixos de LH endógenos ou resistência à LH1 como mulheres quesofrem de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH, WHO do grupo I) ou paci-entes idosos (isto é de 35 anos ou mais), e pacientes nos quais a implanta-ção de embrião ou aborto precoce sejam um problema.
A gonadotropina coriônica (CG) é uma gonadotropina produzidapela placenta e obtida da urina de mulheres grávidas. A CG atua no mesmoreceptor que o LH e produz as mesmas respostas. O CG tem uma meia-vidade circulação mais longa do que o LH e por isso é comumente usado comouma fonte de longa duração da atividade do LH. O CG é usado em Ol e re-gimes COH para mimetizar o pico do LH natural e o gatilho da ovulação.
Uma injeção de gonadotrofina coriônica humana (hCG) é usada para provo-car a ovulação ao final da estimulação com FSH ou uma mistura de FSH eLH. A CG também pode ser usada em conjunto com o FSH durante a esti-mulação da Ol e COH, para fornecer a atividade do LH durante a estimula-ção em pacientes nos quais a atividade do LH seja desejável, como os aci-ma mencionados.
O FSH1 LH e CG são membros da família de hormônio glicopro-teína heterodímero, que também inclui o hormônio estimulador da tireóide(TSH). Os membros desta família são heterodímeros, compreendendo su-bunidades α e β. As subunidades são mantidas juntas por interações nãocovalentes. O FSH humano (hFSH) heterodímero compõe-se de (i) um ami-noácido 92 maduro da subunidade alfa da glicoproteína, que também é co-mum a outros membros da família humana (isto é gonadotrofina coriônica("CG"), hormônio Iuteinizante ("LH") e hormônio estimulador da tireóide("TSH"); e (ii) um aminoácido 111 maduro da subunidade beta que é únicapara o FSH. O LH humano heterodímero compõe-se de (i) aminoácido 92maduro da subunidade alfa da glicoproteína; e (ii) um aminoácido 112 madu-ro da subunidade beta que é única para o LH. As subunidades alfa e betadas glicoproteínas podem ser propensas a se dissociarem em formulações,devido à interação com um conservante, um tensoativo e outros excipientes.
A dissociação das subunidades leva à perda da potência biológica.
O FSH é formulado para injeção intramuscular (IM) ou subcutâ-nea (SC). Em uma modalidade o FSH é fornecido na forma Iiofilizada (sólida)em frascos ou ampolas de 75 lU/frasco e 150 lU/frasco com um tempo dearmazenamento de um e meio a dois anos quando armazenado de 2°C a25°C. Uma solução para injeção é formada reconstituindo o produto Iiofiliza-do com a água de injeção (WFI). Além disso, formulações líquidas de FSHestão disponíveis (Gonal-F pen) contendo 22 Mg/O,5 ml, 33 pg/0,75 ml ou 66Mg/1,5 ml de FSH bem como Poloxamer 188, sacarose, tampão, metionina em-cresol.Desse modo, o FSH foi formulado tanto em formatos líquidos dedose única bem como de múltiplas doses em frascos, ou ampolas. Os forma-tos de dose única devem permanecer estáveis e potentes no armazenamen-to antes do uso. Os formatos de múltiplas doses só não devem permanecerestáveis e potentes no armazenamento antes do uso, mas também perma-necer estáveis, potentes e relativamente sem bactérias antes do período deadministração do regime de múltiplas doses, depois que o selo da ampola foicomprometido. Por essa razão, os formatos de múltiplas doses normalmentecontêm um agente bacteriostático, por exemplo, álcool benzílico ou m-cresol.
O LH é formulado para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea(SC). O LH é fornecido na forma Iiofilizada (sólida) em frascos ou ampolasde 75 IU/frasco com um tempo de armazenamento de um e meio a dois a-nos quando armazenado de 2°C a 25°C. Uma solução para injeção é forma-da reconstituindo o produto Iiofilizado com a água de injeção (WFI). A Luve-ris® contém também para o LH os seguintes excipientes: sacarose, tampão,Polissorbato 20, metionina. Mais recentemente, as formulações de LH foramdescritas contendo Poloxamer 188 (WO 2004/087213).
As composições farmacêuticas líquidas que contêm hCG estãotambém no mercado, por exemplo, a Ovitrelle® contendo manitol, em umtampão fosfato em pH 7, metionina e Poloxamer 188.
A expressão "variante" está destinada a abranger aquelas molé-culas que se diferenciam na seqüência de aminoácidos, no modelo de glico-silação ou na ligação inter subunidades de FSH, LH, CG, TSH, IFN-beta ouGH humanos mas exibindo a atividade biológica correspondente de FSH,LH, CG, TSH, IFN-beta ou GH. Os exemplos incluem CTP-FSH, um FSHrecombinante modificado de longa duração, composto da subunidade α dotipo selvagem e uma subunidade β do tipo híbrido no qual o peptídio terminalcarbóxi do hCG foi fundido ao C-terminal da subunidade β do FSH, tal comodescrito em LaPolt et al., Endocrinoiogy, 1992, 131, 2514-2520; ou Klein etal.; Development and characterization of a long-acting r-hFSH agonist, Hu-man fíeprod. 2003, 18, 50-56. Também incluída está a CTP-FSH de cadeiaúnica, composta das seguintes seqüências (do N terminal ao C terminal):<table>table see original document page 11</column></row><table>
em que o pFSH significa a subunidade β do FSH, phCG CTP (113-145) sig-nifica o peptídio carbóxi terminal do hCG e ccFSH significa a subunidade αdo FSH, tal como descrito por Klein et al.; (Pharmacokinetics and pharma-codynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormonecontaining the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in therhesus monkey; Fertiiity & Steriiity, 2002, 77, 1248-1255). Outros exemplosde variantes FSH incluem moléculas FSH que incorporam sítios adicionaisde glicosilação nas subunidades α e/ou β, tal como descrito na WO01/58493 (Maxygen), particularmente tal como descrito nas reivindicaçõese 11 da WO 01/58493, e nas moléculas FSH com ligações S-S intersubu-nidades, tal como descrito na WO 98/58957.
As variantes FSH aqui mencionadas também incluem as elimi-nações de carbóxi terminal da subunidade beta que são mais curtas do queo comprimento total da.proteína FSH madura. Os heterodímeros do FSH ouvariantes dos heterodímeros do FSH podem ser produzidos por qualquermétodo conveniente, tal como recombinantemente, pelo isolamento ou pelapurificação de fontes naturais como pode ser o caso, ou pela síntese quími-ca, ou qualquer combinação das mesmas.
As "variantes" também compreendem as formas PEGuiIadas daproteína.
O uso do termo "recombinante" refere-se a preparações deFSH, LH, CG, TSH1 GH, beta INF ou variantes que são produzidas pelo usoda tecnologia de DNA recombinante (vide, por exemplo, a WO 85/01958).Um exemplo de um método de expressão do FSH ou do LH usando tecnolo-gia recombinante é por transfecção de células eucarióticas com as seqüên-cias de DNA que codificando as subunidades α e β do FSH ou do LH, sefornecido em um vetor ou em dois vetores com cada subunidade possuindoum promotor separado, tal como descrito nas Patentes Européias N5 EP0211894 e EP 0487512. Um outro exemplo do uso da tecnologia recombi-nante para produzir FSH ou LH é pelo uso da recombinação homóloga parainserir um segmento regulador heterólogo em conexão operacional com asseqüências endógenas que codificam as subunidades do FSH ou do LH, talcomo descrito na Patente Européia N9. EP 0505500 (Applied Research Sys-tems ARS Holding NV).
O FSH ou a variante do FSH usada conforme a presente inven-ção podem ser produzidos não só por meios recombinantes, incluindo decélulas de mamíferos, mas também podem ser purificados de outras fontesbiológicas, como de fontes urinárias. As metodologias aceitáveis incluem osdescritos por Hakola, K., em Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69, 1997; Keene, et al., J. Biol. Chem., 264 :4769-4775, 1989 ; Cerpa-Poljak,et al., Endocrinology, 132 :351-356, 1993 ; Dias, et al., J. Biõl. Chem.,269:25289-25294, 1994; Flack, et al., J. BioL Chem., 269:14015-14020,1994; e Valove, et al., Endocrinology, 135:2657-2661, 1994, Patente U.S. N93.119.740 e na Patente U.S. N9 5.767.067.
O hormônio luteinizante, ou LH, tal como aqui utilizado referem-se à LH produzida como uma proteína madura de comprimento total, queinclui, mas não é limitada à LH humana, produzida recombinantemente ouisolada de fontes humanas, como a urina de mulheres pós-menopausa. Aseqüência de proteínas da subunidade alfa da glicoproteína humana é for-necida na SEQ ID N9: 1, e a seqüência de proteína da subunidade beta daLH humana é fornecida na SEQ ID N9: 6. Em uma modalidade preferida aLH é recombinante.
A expressão "variante do LH" está destinada a abranger aquelasmoléculas que se diferenciam na seqüência de aminoácidos, no modelo deglicosilação ou na ligação das inter subunidades do LH humano, mas ex-põem atividades do LH.
Os hetèrodímeros do LH ou as variantes dos heterodímeros doLH podem ser produzidos por qualquer método conveniente, tal como re-combinantemente, pelo isolamento ou a purificação de fontes naturais con-forme seja o caso, ou pela síntese química, ou qualquer combinação dosmesmos.
As amostras de proteína líquidas de acordo com a presente in-venção também compreendem misturas de FSH/LH e variantes (WO2004/087213) bem como FSH e hCG e variantes (WO 2004/105788).
O termo "diluente aquoso" refere-se a um solvente líquido con-tendo água. Os sistemas de solventes aquosos podem ser compostos so-mente de água, ou podem ser compostos de água mais um ou vários solven-tes miscíveis, e conter solutos dissolvidos tal como açúcar, tampões, sais ououtros excipientes. Os solventes não-aquosos mais comumente usados sãoálcools orgânicos de cadeia curta, como, metanol, etanol, propanol, cetonasde cadeia curta, como acetona, e poliálcools, como o glicerol.
O termo "bacteriostático" ou "agente bacteriostático" refere-se aum composto ou composições acrescentadas a uma formulação para atuarcomo um agente antibacteriano. Um FSH conservado ou a variante do FSHou o FSH e o LH contendo a formulação de acordo com a presente invençãopreferivelmente encontram orientações estabelecidas ou reguladoras de efi-cácia de conservantes para que sejam um produto de multiuso comercial-mente viável, para uso preferivelmente em seres humanos. Os exemplos debacteriostáticos incluem fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorócresol, álco-ol benzílico, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e assim por diante),cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e ti-merosal.
O termo "tampão" ou "tampão fisiologicamente aceitável" refere-se a soluções de compostos que são conhecidos como sendo seguros parao uso farmacêutico ou veterinário em formulações e que possuem o efeito demanutenção ou controle do pH da formulação na faixa de pH desejada paraa formulação. Os tampões aceitáveis para controlar o pH de um pH modera-damente ácido a um pH moderadamente básico, incluem, mas não estãolimitados a, tais compostos como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS, ehistidina. "TRIS" refere-se a 2-amino-2-hidroximetil-1, 3-propanodiol e aqualquer sal farmacologicamente aceitável do mesmo. Os tampões preferí-veis são tampões de fosfato com solução salina ou um sal aceitável domesmo.
O termo "tampão fosfato" refere-se a soluções que contêm ácido,fosfórico ou um sal do mesmo, ajustada ao pH desejado. Geralmente ostampões de fosfato são preparados do ácido fosfórico, ou um sal do ácidofosfórico, incluindo mas não limitados a sais de potássio e sódio. Vários saisde ácido fosfórico são conhecidos na técnica, tais como sais monobásicos,dibásicos e tribásicos de sódio e potássio do ácido. Também se conheceque sais de ácido fosfórico ocorrem como hidratos do sal em questão. Ostampões de fosfato podem abarcar diversas faixas de pH, tal como de apro-ximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, e as variações preferidas deaproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, e a variedade mais prefe-rida de pH igual a ou de aproximadamente 6,0 até o pH igual a ou de apro-ximadamente 8,0, sendo mais preferivelmente a de aproximadamente pH 7,0.
O termo "frasco" refere-se amplamente a um reservatório con-veniente para conservar o FSH na forma sólida ou líquida contida em umreservatório estéril. Exemplos de um frasco tal com aqui utilizado incluemampolas, cartuchos, pacotes blister, ou outro reservatório conveniente para aliberação do FSH ao paciente via uma seringa, uma bomba (inclusive osrnó-tica), cateter, implante transdérmico, borrifo pulmonar ou borrifo transmuco-sa. Os frascos convenientes para produtos embalados para administraçãoparenteral, pulmonar, transmucosa ou transdérmica são bem-conhecidos ereconhecidos na técnica.
A expressão "uso de múltiplas doses" é destinada a incluir o usode um frasco ampola ou cartucho únicos de uma formulação de FSH ou umaformulação da proteína para mais de uma injeção, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6ou mais injeções. As injeções são preferivelmente feitas durante um períodoigual a, ou de pelo menos aproximadamente, 12 horas, 24 horas, 48 horasetc, preferivelmente até um período de aproximadamente 12 dias. As inje-ções podem ser espaçadas no tempo, por exemplo, por um período de 6, 12,24, 48 OU 72 horas.
O termo "estabilidade" refere-se à estabilidade física, química, econformacional de uma dada proteína nas formulações de acordo com apresente invenção (incluindo a manutenção da potência biológica). A instabi-lidade de uma formulação de proteína pode ser causada por degradaçãoquímica ou agregação de moléculas de proteína para formar polímeros deordem superior, pela dissociação dos heterodímeros em monômeros, degli-cação, a modificação da glicosilação, oxidação (particularmente em hetero-dímeros da subunidade a) ou qualquer outra modificação estrutural que re-duza pelo menos uma atividade biológica de um polipeptídio incluído na pre-sente invenção.
Uma solução ou formulação "estável" é aquela em que o graude degradação, modificação, agregação, a perda de atividade biológica eassim por diante, das proteínas contidas na mesma a aceitavelmente contro-lada, e não aumenta com o tempo até valores inaceitáveis. Preferivelmente aformulação conserva pelo menos, ou aproximadamente, 80% da atividadeda proteína marcada durante um período de até 2 anos.
O problema qüe está implícito de acordo com a presente inven-ção é fornecer um método conveniente e rápido para determinar a quantida-de de um poloxâmero em uma amostra de proteína. Um poloxâmero podeser usado como um tensoativo e é selecionado do copolímero em bloco deóxido de etileno e óxido propileno, preferivelmente Pluronic® F77, PluronicF87, Pluronic F88 e Pluronic® F68, particularmente preferivelmente PluronicF68 (BASF, Pluronic F68 que também é conhecido como Poloxamer 188).
Tal como acima mencionado, as formulações farmacêuticas de-vem ter um tempo de armazenamento de até 2 anos em uma temperatura dearmazenamento de 2°C a 25°C. Isto implica que se espera que a formulaçãopermaneça estável durante este tempo. Desde que as formulações líquidascontêm vários excipientes que podem afetar diretamente, ou indiretamentepor meio de decomposição, a estabilidade da formulação de proteína, existea necessidade de se ter os instrumentos analíticos para avaliar a dita estabi-lidade da formulação.
Mais especificamente, poloxâmeros tensoativos são os copolí-meros em bloco do óxido de etileno (EO) e do óxido propileno(PO). O blocode óxido propileno (PO) é imprensado entre dois blocos de óxido de etileno (EO).<formula>formula see original document page 16</formula>
Os poloxâmeros são sintetizados em um processo de duas eta-pas:
• um hidrófobo do peso molecular desejado é criado pela adiçãocontrolada de oxido de propileno a dois grupos hidroxila do propileno glicol; e
• óxido de etileno é acrescentado para imprensar o hidrófobo en-tre grupos hidrofílicos.
Os poloxâmeros tensoativos também são conhecidos como plurônicos.
No Pluronic® F77, a porcentagem de polioxietileno (hidrófilo) é70%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é de aproximada-mente 2,306 Da.
No Pluronic F87, a porcentagem de polioxietileno (hidrófilo) é de70%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é de aproximada-mente 2,644 Da.
No Pluronic F88, a porcentagem de polioxietileno (hidrófilo) é de80%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é de aproximada-mente 2,644 Da.
No Pluronic F68, a porcentagem de polioxietileno (hidrófilo) é de80%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é de aproximada-mente 1,967 Da.
As propriedades típicas do Pluronic F77 são enumeradas abai-xo:
Peso Molecular Médio: 6600;
Ponto de fusão/escorrimento: 48°C;
Forma Física à 20°C: sólido;
Viscosidade (BrookfieId) cps: 480 [líquidos a 25°C, pastas a60°C e sólidos a 77°C];
Tensão superficial, N/m (dinas/cm) a 25°C;
Cone. de 0,1%: 0,047 (47,0);Cone. de 0,01 %: 0,0493 (49,3) ;Cone. de 0,001 %: 0,0528 (52,8).Tensão interfacial, N/m (dinas/cm) 25°C vs. Nujol;Cone. de 0,1%: 0,0177 (17,7);Cone. de 0,01 %: 0,0208 (20,8);Cone. de 0,01%: 0,0255 (25,5);Umectação por Draves, Segundos 25°C;Cone. de 1,0%: > 360;Cone. de 0,1%: > 360.Altura da Espuma;
Ross Miles, 0,1%, mm ã 50°C: 100; .Ross Miles, 0,1%, mm a 26°C: 47;Dinâmico, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600.Ponto de névoa em solução aquosa, 0CCone. de 1%: > 100;Cone. de 10%: > 100.HLB (equilíbrio hidrofílico-lipofílico): 25.
As propriedades típicas do Pluronic F87 são enumeradas abai-xo:
Peso Molecular Médio: 7700;Ponto de fusão/escorrimento: 49°C;Forma Física à 20°C: sólido;
Viscosidade (BrookfieId) cps: 700 [líquidos a 25°C, pastas a60°C e sólidos a 77°C];Tensão superficial, N/m (dinas/cm) a 25°C;
Cone. de 0,1%: 0,044 (44,0);Cone. de 0,01%: 0,047 (47,0);Cone. de 0,001%: 0,0502 (50,2).Tensão interfacial, N/m (dinas/cm) 25°C vs. Nujol;Cone. de 0,1%: 0,0174 (17,4;)Cone. de 0,01%: 0,0203 (20,3);Cone. de 0,01%: 0,0233 (23,3);Umectação por Draves, Segundos 25°C;
Cone. de 1,0%: > 360;Cone. de 0,1%: > 360.
Altura da Espuma;
Ross Miles, 0,1%, mm a 50°C: 80;Ross Miles, 0,1%, mm a 26°C: 37;Dinâmico, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600.
Ponto de névoa em solução aquosa, 0C
Cone. de 1%: > 100;Cone. de 10%: > 100.
HLB (equilíbrio hidrofílico-lipofílico): 24.
As propriedades típicas do Pluronic F88 são enumeradas abaixo:
Peso Molecular Médio: 11,400;Ponto de fusão/escorrimento: 54°C;Forma Física à 20°C: sólido;
Viscosidade (BrookfieId) cps: 2300 [líquidos a 25°C, pastas a60°C e sólidos a 77°C];
Tensão superficial, N/m (dinas/cm) a 25°C;
Cone. de 0,1 %: 0,0485 (48,5);Cone. de 0,01%: 0,0526 (52,6);
Cone. de 0,001%: 0,0557 (55,7).
Tensão interfacial, N/m (dinas/cm) 25°C vs. Nujol;Cone. de 0,1%: 0,0205 (20,5;)Cone. de 0,01%: 0,0233 (23,3);Cone. de 0,01%: 0,027 (27,0).Umectação por Draves, Segundos 25°C;Cone. de 1,0%: > 360;Cone. de 0,1%: > 360.
Altura da Espuma;
Ross Miles, 0,1%, mm a 50°C: 80;Ross Miles, 0,1%, mm a 26°C: 37;Dinâmico, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600.Ponto de névoa em solução aquosa, 0CCone. de 1%: > 100;Cone. de 10%: > 100.HLB (equilíbrio hidrofílico-lipofílico): 28.
As propriedades típicas do Pluronic F68 são enumeradas abai-xo:
Peso Molecular Médio: 8400;Ponto de fusão/escorrimento: 52°C;Forma Física à 20°C: sólido;
Viscosidade (BrookfieId) cps: 1,000 [líquidos a 25°C, pastas a60°C e sólidos a 77°C];Tensão superficial, N/m (dinas/cm) a 25°C;
Cone. de 0,1 %: 0,0503 (50,3);Cone. de 0,01 %: 0,0512 (51,2);Cone. de 0,001 %: 0,0536 (53,6).Tensão interfacial, N/m (dinas/cm) 25°C vs. Nujol;Cone. de 0,1%: 0,0198 (19,8);Cone. de 0,01 %: 0,024 (24,0);Cone. de 0,01 %: 0,026 (26,0);Umectação por Draves, Segundos 25°C;Cone. de 1,0%: > 360;Cone. de 0,1%: > 360.Altura da Espuma;
Ross Miles, 0,1%, mm a 50°C: 35;Ross Miles, 0,1%, mm a 26°C: 40;Dinâmico, 0,1%, mm a 400 ml/min: > 600.Ponto de névoa em solução aquosa, 0CCone. de 1%: > 100;Cone. de 10%: > 100.HLB (equilíbrio hidrofílico-lipofílico): 29.
Outros polímeros poloxâmeros possuindo propriedades seme-lhantes aos listados acima podem também ser usados nas formulações dainvenção. O poloxâmero tensoativo preferido presente nas formulações deproteína que são analisadas com o método presente é o Pluronic F68 (= Po-loxamer 188).
Preferivelmente a concentração de Pluronic, particularmentePluronic F68, nas formulações líquidas de proteína está em, ou é de, apro-ximadamente 0,01 mg/ml até igual a, ou de aproximadamente 1 mg/ml; maispreferivelmente está em, ou é de, aproximadamente 0,05 mg/ml, até igual a,ou de aproximadamente 0,5 mg/ml; mais particularmente preferivelmenteestá em, ou é de, aproximadamente 0,2 mg/ml até igual a, ou de aproxima-damente 0,4 mg/ml; bem mais preferivelmente está em, ou é de aproxima-damente 0,1 mg/ml.
As formulações de proteína analisadas segundo o método deacordo com a presente invenção têm um pH entre igual a, ou de aproxima-damente 6,0 e igual a, ou de aproximadamente 8,0; mais preferivelmente umpH entre igual a, ou de aproximadamente 6,8 até igual a, ou de aproxima-damente 7,8; incluindo aproximadamente pH 7,0, pH 7,2 e 7,4. Um tampãopreferido é o fosfato, com os contra-íons preferidos sendo íons de potássioou de sódio. Os tampões de fosfato salino são bem-conhecidos na técnica,tal como o tampão de fosfato salino da Dulbecco. As concentrações de tam-pão na solução total podem variar entre igual a, ou de aproximadamente 5mM, 9,5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM e 500mM. Preferivelmente a concentração de tampão está em ou é de aproxima-damente 10 mM. Particularmente preferido é um tampão de 10 mM em íonsde fosfato com um pH de 7,0.
Preferivelmente, as formulações do FSH analisado segundo ométodo de acordo com a presente invenção têm pH entre igual a, ou de a-proximadamente 6,0 e igual a, ou de aproximadamente 8,0; mais preferivel-mente entre igual a, ou de aproximadamente 6,8 até igual a, ou de aproxi-madamente 7,8; incluindo aproximadamente pH 7,0, pH 7,2 e 7,4. Um tam-pão preferido é o fosfato, com os contra-íons preferidos sendo íons de po-tássio ou de sódio.Preferivelmente as formulações de misturas de FSH e LH anali-sadas segundo o método de acordo com a presente invenção têm pH entreigual a, ou de aproximadamente 6,0 e igual a, ou de aproximadamente 9,0;mais preferivelmente em ou de aproximadamente 6,8 até igual a, ou de a-proximadamente 8,5, incluindo aproximadamente pH 7,0, pH 8,0 e pH 8,2mais preferivelmente em ou de aproximadamente pH 8,0.
Preferivelmente as formulações de hCG analisadas segundo ométodo de acordo com a presente invenção têm pH entre igual a, ou de a-proximadamente 6,0 e igual a, ou de aproximadamente 8,0; mais preferivel-mente em ou de aproximadamente 6,8 até igual a, ou de aproximadamente7,8 incluindo aproximadamente pH 7,0, pH 7,2 e pH 7,4.
A amostra de proteína é preferivelmente uma formulação líquidade administração em dose única ou de múltiplas doses. As formulações lí-quidas de acordo com a invenção que são destinadas para o uso de múlti-plas doses preferivelmente compreendem um bacteriostático, como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquiiparabeno (meti-la, etila, propila, butila e assim por diante), timol, cloreto benzalcônio, cloretobenzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal. Particularmente preferidosão fenol, álcool benzílico e m-cresol, mais preferidos são o fenol e o m-cresol, o mais preferido é o m-cresol. O agente bacteriostático é usado emuma quantidade que produzirá uma concentração que é eficaz para manter aformulação essencialmente livre de bactérias (conveniente para a injeção)durante o período das injeções de múltiplas doses, que pode estar em ou deaproximadamente 12 horas ou 24 horas até estar em ou ser de aproxima-damente 12 dias ou 14 dias; preferivelmente em ou de aproximadamente 6até estar em ou ser de aproximadamente 12 dias. O bacteriostático está pre-ferivelmente presente em uma concentração de, ou aproximadamente, 0,1%(massa bacteriostática/massa de solvente) até de, ou aproximadamente,2,0%, mais preferivelmente este em, ou é de aproximadamente 0,2% até, ouaproximadamente, 1,0%. No caso do álcool benzílico, particularmente prefe-rida é uma concentração de 0,9%. No caso do fenol, particularmente preferi-da é uma concentração de, ou aproximadamente, 0,5%. No caso do m-cresol, particularmente preferido é uma concentração de, ou aproximada-mente, 0,3% (por exemplo, de ou aproximadamente 3 mg/ml em WFI).
As colunas de exclusão de tamanho são bem-conhecidas daspessoas versadas na técnica. Elas são escolhidas de acordo com a respec-tiva proteína e o poloxâmero contido na amostra. O gel da coluna deve serde uma matriz a base de polímero. Uma coluna preferida é uma coluna deSE-HPLC possuindo a denominação de TSK G3000PW, da TosoHaas Inc.As pérolas da matriz têm um tamanho de partícula de 10 pm ou 17 pm, umtamanho de poro de aproximadamente 200 Á. A coluna é comercialmentedisponível.
A etapa de detecção pode ser realizada com qualquer um dossistemas de detecção RI, que são conhecidos de uma pessoa versada natécnica.
Foi encontrado que sob condições mais ácidas, o poloxâmeropode ser separado mais facilmente das proteínas.
Assim, a fase móvel usada no método de acordo com a presen-te invenção é um solvente aquoso tal como a água ou uma solução tampo-nada.
Em uma determinada modalidade, a fase móvel é ajustada a umpH menor do que 7, preferivelmente menor do que 3, mais preferivelmenteentre aproximadamente 1,6 e 2,0 e bem mais preferivelmente entre 1,9 a2,0. Em uma modalidade, a proteína é um heterodímero, como FSH, CG, LHou TSH. Em condições ácidas uma proteína heterodímero tende a decom-por-se nas suas subunidades que migram mais facilmente melhorando as-sim a separação e a etapa de detecção (resolução). Os agentes ácidos con-venientes para ajustar o pH podem ser selecionados pela pessoa versada natécnica. O ácido mais preferido é o ácido trifluoracético (TFA).
Tipicamente, as amostras a serem avaliadas são preparadas einjetadas na coluna. Levando em consideração o índice de refração na etapade detecção do método um cromatograma é obtido tendo uma área do picodo poloxâmero bem como pelo menos um pico adicional da(s) proteínà(s) eexcipientes. A avaliação da área do pico permite a quantificação do poloxâ-mero presente na amostra analisada. A quantificação é permitida desde queseja preparada uma curva padrão com poloxâmeros (vide Exemplos).
EXEMPLOS.
A presente invenção será ilustrada agora por meio de exemplos.
EXEMPLO 1 (cf. a Figura 1).
O objetivo deste Exemplo foi analisar a concentração do Polo-xamer 188 em uma amostra comercialmente disponível da formulação Ovi-trelle® líquida de hCG depois de 18 meses de armazenamento na tempera-tura ambiente. Assim, foi avaliada a estabilidade da formulação líquida emrelação ao Poloxamer 188. A concentração do Poloxamer 188 no momentoda preparação foi de aproximadamente 100 mcg/ml. O protocolo para aquantificação do Poloxamer 188 no Ovitrelle® foi como se segue.
O Ovitrelle® injetável líquido continha os seguintes componen-tes: coriogonadotropina alfa, manitol, L-metionina, Poloxamer 188, ácido fos-fórico, NaOH e água.
1- Equipamentos e Materiais Fornecedor.
HPLC ALLIANCE mod.269 Waters
Detector de Rl mod. 2414 Waters
Software habilitado Waters
PC IBM (ou equiv.)
Poloxamer 188-Lutrol F68 cod. 010293-1 BASF
Ácido trifluoroacético(TFA)cod.9470 (10x1 mL) JT.BAKER
Coluna analítica TSKgeI G3000 PWxI cod.08021 TOSOH
D(-)manitol cod. 1.05983 MERCK
L-metionina cod. 1.05707 MERCK
Ácido orto-fosfórico 85% cod. 1.00573 MERCK
Hidróxido de sódio 50% cod. 7067 JT.BAKER
Gradiente de etanol cod. 1.11727 MERCK
Seringas OvitreIle/formulação de hCG líquido de 250 mcg SERONO
2. Procedimento
2.1 Eluente A (H?Q/TFA 0.5%)
A 950 ml de água purificada, em uma proveta graduada de 1 Ii-tro, foram acrescentados 5 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e misturadossob agitação até 1,000 ml. O pH do eluente foi entre 1,7 e 1,9.
2.2 Eluente B (Etanol a 20%)
A 750 ml de água purificada, em uma proveta graduada de 1 li-tro, foram acrescentados 200 ml de etanol e misturados sob agitação até1,000 ml.
2.3 Solução de lavagem para auto-amostraaem (metanol a 10%)
A 850 ml de água purificada, em uma proveta graduada de 1 li-tro, foram acrescentados 100 ml de metanol e misturados sob agitação até1,000 ml.
2.4 Solvente de lavagem dos selos (metanol a 5%)
A 900 ml de água purificada, em uma proveta graduada de 1 li-tro, foram acrescentados 50 ml de metanol e misturados sob agitação até1,000 ml.
2.5 Solução de diluição da curva padrão (formulação líquida sem Poloxamer 188)
A 850 ml de água purificada, em uma proveta graduada de 1 li-tro, foram acrescentados 54,6 g de D(-)manitol, 0,98 g de ácido orto-fosfórico85%, e 200 mcg de L-metionina. A solução foi levada a um pH 7,0 pela adi-ção gota a gota de hidróxido de sódio a 50% e completada a 1 ml. A soluçãofoi filtrada por um filtro de 0,45 pm. Como uma alternativa, a água pode serusada como a solução de diluição da curva padrão.
2.6 Solução de curva padrão concentrada
200 mg de Poloxamer 188 foram dissolvidos em 80 ml de águapurificada, em uma proveta graduada de 100 ml, e completados até 100 ml.A curva padrão foi preparada com base na concentração esperada nas a-mostras a serem analisadas. Nesse Exemplo, uma concentração de Polo-xamer 188 de aproximadamente 100 mcg/ml foi esperada no líquido injetávelOvitrelle®, a curva padrão assim variou de 50 mcg/ml a 160 mcg/ml.
3 Preparação de Amostras
Branco
Foram injetados 0,05 ml da solução de diluição de curva padrão.Amostras
Todas as amostras foram testadas sem qualquer pré-tratamentoe 0,05 ml foram injetados.4. Condições operacionais4.1. Ajuste do instrumento
As seguintes soluções foram conectadas às linhas de HPLC:Linha A: Eluente A (H20/TFA 0,5%)Linha B: Eluente B (Etanol 20%)
As linhas AeB foram cheias, o sistema foi purgado e enxagua-do com uma taxa de fluxo de 2 mL/min durante 3 minutos. O degaseificadorem linha, se presente, foi ligado.
Antes da análise a válvula de solenóide do Detector de Rl dofluxo foi trocada pelo modo de purga durante pelo menos 30 minutos com alinha A. A purga da célula de fluxo foi executada para lavar a fase móvelfresca para o lado de referência da célula.
Conexão da coluna aos instrumentos e introdução dos seguintes parâme-tros:
• Temperatura do Detector de RI: 30°C
• Temperatura da Coluna: + 20 ± 5°C
• Taxa de fluxo de Coluna: 0,5 ml/min
• Taxa de fluxo de eluição: 20 ml/min (no caso do degaseifi-
cador não estar em linha)
• Temperatura do Auto-amostrador: + 4°C
• Loop do Auto-amostrador: 200 mel
• Tamanho de Seringa: 250 mel
• Duração da Análise: 40 minutos
• Próxima injeção: 5 minutos
4.2 Equilíbrio da Coluna
A coluna foi lavada com o eluente A, para equilibrar a coluna. Oequilíbrio foi concluído quando a linha de base estabilizou.
4.3 Coluna de Armazenamento
Depois da realização da análise a coluna foi enxaguada com pe-Io menos 30 ml de água purificada seguida por 30 ml de etanol a 20%.
4.4 Determinação da concentração de Poloxamer 188 nas amostras de Ovitrelle
O modelo usado para calcular a concentração de Poloxamer188 nas amostras de Ovitrelle foi a regressão linear.
Y= a + bx
em que:
Y = a área total do Poloxamer 188.
a = valor de interceptação.
b = valor da inclinação.
χ = Concentração de Poloxamer 188 em pg/ml injetado.
A amostra foi integrada tal como mostrado na Figura 1.
A interceptação (a) e a inclinação (b) da curva padrão foram cal-culadas, a regressão linear foi calculada pelo software Statgraphics Plus.
A seguinte fórmula foi aplicada para calcular a concentração dePoloxamer 188.
<formula>formula see original document page 26</formula>
FD (FD = Fator de diluição) Equação 1
A solução da equação 1 fornece a concentração do Poloxamer188 em cada uma das amostras de Ovitrelle expressas em pg/ml.
A concentração de poloxâmero encontrada nas amostras desseExemplo (vide a Figura 1) foi em torno de 94 mcg/ml.
EXEMPLO 2
O objetivo deste Exemplo é analisar a concentração do Poloxa-mer 188 em uma amostra da formulação líquida comercialmente disponívelde hFSH Gonal-F RFF Pen® depois de 18 meses de armazenamento natemperatura ambiente. Assim, a estabilidade da formulação líquida em rela-ção ao Poloxamer 188 deveria ser avaliada. A concentração do Poloxamer188 no momento da preparação foi de aproximadamente 100 mcg/ml. O pro-tocolo de quantificação do Poloxamer 188 no Gonal-F RFF Pen® foi idênticoao mostrado no Exemplo 1 para o Ovitrelle, com exceção de que a taxa defluxo de coluna foi de 0,75 ml/min.O poloxâmero pode ser separado do hFSH e foi separadamentequantificado.
EXEMPLO 3
O objetivo deste Exemplo é analisar a concentração do Poloxa-mer 188 em uma amostra da formulação líquida de hGH comercialmentedisponível, Serostim®. O protocolo foi idêntico ao do Exemplo 2.
O poloxâmero pode ser separado do hGH e foi separadamentequantificado.
EXEMPLO 4
O objetivo desse Exemplo foi analisar a concentração do Polo-xamer 188 em uma amostra de uma formulação líquida de hlFN-beta. O pro-tocolo foi idêntico ao do Exemplo 2.
O poloxâmero pode ser separado da hlFN-beta e foi separada-mente quantificado.

Claims (15)

1. Método para a determinação quantitativa de um poloxâmeroem uma amostra líquida de proteína compreendendo as etapas de submetera dita amostra:a) uma etapa de separação usando uma coluna de cromatogra-fia de exclusão de tamanho;b) uma etapa de eluição com uma fase móvel; ec) opcionalmente uma etapa de detecção do poloxâmero.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o poloxâme-ro é o Poloxamer 188.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a pro-teína tem uma massa molecular entre 5 e 70 kDa, preferivelmente entre 20 e-70 kDa.
4. Método de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a 3,em que a proteína é uma proteína heterodímero.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a proteína éuma gonadotropina selecionada de FSH, LH, hCG, TSH.
6. Método de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a 3,em que a proteína a ser analisada é a Interferon beta ou o Hormônio deCrescimento (GH).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 6, em que a amostra é uma composição farmacêutica aquosa contendoFSH, LH1 hCG, TSH1 GH ou beta interferon.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 7, em que a fase móvel é um solvente aquoso, particularmente um tampo-nado.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 8, em que a eluição da amostra é realizada com uma fase móvel de pHacídico.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o pH dafase móvel é ajustado para abaixo de 3.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o pH dafase móvel é ajustado para aproximadamente 1,9 a 2,0.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 em que a etapa de detecção do poloxâmero implica na análise doíndice de retração.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, em que a coluna de exclusão de tamanho é uma coluna de SE-HPLCcheia de uma matriz de base polimérica contendo pérolas.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as péro-las da matriz possuem um tamanho de partícula de 10 ou 17 μιτι.
15. Método de aGordo com a reivindicação 13 ou 14, em que aspérolas da matriz têm um tamanho de poro de aproximadamente 200 À.
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