BRPI0615941A2 - método para aumentar o rendimento de planta em relação às plantas de controle, planta, construção, método para a produção de uma planta transgênica, planta transgênica, partes colhìveis de uma planta, produtos, uso de um ácido nucleico/gene oslea3a ou variante do mesmo ou uso de um polipeptìdeo oslea3a ou um homólogo do mesmo, e, semente de planta - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTA EM RELAçãO àS PLANTAS DE CONTROLE, PLANTA, CONSTRUçãO, METODO PARA A PRODUçãO DE UMA PLANTA TRANSGêNICA, PLANTA TRANSGêNICA, PARTES COLIIIVEIS DE UMA PLANTA, PRODUTOS, USO DE UM ACIDO NUCLEICO/GENE OSLEA3A OU VARIANTE DO MESMO OU USO DE UM POLIPEPTìDEO OSLEA3A OU UM HOMóLOGO DO MESMO, E, SEMENTE DE PLANTA A presente invenção diz respeito a um método para aumentar o rendimento de planta pela modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo. Um tal método compreende introduzir em uma planta um ácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo. A invenção também diz respeito às plantas transgênicas tendo nelas introduzido um ácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo, plantas estas que têm rendimento aumentado e perfil metabólico alterado, em relação às plantas de controle. A presente invenção também diz respeito às construções úteis nos métodos da invenção.

Description

"MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTA EMRELAÇÃO ÀS PLANTAS DE CONTROLE, PLANTA, CONSTRUÇÃO,MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA,PLANTA TRANSGÊNICA, PARTES COLHÍVEIS DE UMA PLANTA,PRODUTOS, USO DE UM ÁCIDO NUCLEICO/GENE OSLEA3A OUVARIANTE DO MESMO OU USO DE UM POLIPEPTÍDEO OSLEA3AOU UM HOMÓLOGO DO MESMO, E, SEMENTE DE PLANTA"

A presente invenção no geral diz respeito ao campo dabiologia molecular e diz respeito a um método para aumentar o rendimento deplanta em relação às plantas de controle. Mais especificamente, a presenteinvenção diz respeito a um método para aumentar o rendimento de planta quecompreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico quecodifica o polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo. A invençãoalém disso diz respeito a uma mudança composicional em metabólitos ligadosao aumento de rendimento. A presente invenção também diz respeito aplantas tendo expressão modulada de um ácido nucleico que codifica opolipeptídeo OsLEASa ou um homólogo do mesmo, plantas estas que têmrendimento aumentado em relação às plantas de controle. A invenção tambémfornece construções úteis nos métodos da invenção.

A população mundial sempre crescente e a oferta em declíniode terra arável disponível para a pesquisa de combustíveis agrícolas voltadapara a melhora da eficiência da agricultura. Meios convencionais para asmelhoras de safra e horticultura utilizam técnicas de cruzamento seletivo paraidentificar plantas que tenham características desejáveis. Entretanto, taistécnicas de cruzamento seletivo têm diversas desvantagens, que dizer queestas técnicas são tipicamente intensivas em trabalho e resultam em plantasque freqüentemente contêm componentes genéticos heterogêneos que nemsempre podem resultar no traço desejado que é passado das plantasprecursoras. Avanços na biologia molecular têm possibilitado que ahumanidade modifique o material genético de animais e plantas. A engenhariagenética de plantas acarreta necessariamente a isolação e manipulação dematerial genético (tipicamente na forma de DNA ou RNA) e a introduçãosubseqüente deste material genético em uma planta. Tal tecnologia tem acapacidade para liberar safras ou plantas tendo vários traços econômicos,agronômicos ou horticulturais melhorados. Um traço de interesse econômicoparticular é o rendimento, necessariamente relacionado com uma safra, áreae/ou período de tempo específicos. O rendimento é normalmente definidocomo a produção mensurável de valor econômico de uma safra. Isto pode serdefinido em termos de quantidade e/ou qualidade. O rendimento édiretamente dependente de diversos fatores, por exemplo, o número etamanho dos órgãos, arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramos),produção de semente e mais. O desenvolvimento de raiz, captação denutriente e tolerância ao estresse também podem ser fatores importantes nadeterminação do rendimento. A otimização de um dos fatores mencionadosacima portanto pode contribuir para aumentar o rendimento de safra.

A biomassa vegetal é produzida para safras forrageiras comoalfafa, milho de silagem e feno. Muitos substitutos para o rendimento têmsido usados em safras de grão. O principal entre estes são estimativas detamanho da planta. O tamanho da planta pode ser medido em muitos modosdependendo das espécies e estágio de desenvolvimento, mas incluem o pesoseco da planta total, peso seco acima do solo, peso fresco acima do solo, áreade folha, volume de caule, altura da planta, diâmetro da roseta, comprimentode folha, comprimento da raiz, massa da raiz, número de brotos e número defolhas. Muitas espécies mantêm uma razão conservativa entre o tamanho departes diferentes da planta em um dado estágio de desenvolvimento. Estasrelações alométricas são usadas para extrapolar de uma destas medidas detamanho para uma outra (por exemplo, Tittonell et al 2005 Agric Ecosys &Environ 105: 213). O tamanho da planta em um estágio de desenvolvimentoinicial tipicamente correlacionar-se-á com o tamanho da planta mais tarde nodesenvolvimento. Uma planta maior com uma área de folha maiortipicamente pode absorver mais luz e dióxido de carbono do que uma plantamenor e portanto provavelmente ganhará um peso maior durante o mesmoperíodo (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Isto está além dacontinuação potencial da vantagem micro-ambiental ou genética que a plantateve para alcançar o tamanho maior inicialmente. Existe um componentegenético forte para o tamanho da planta e taxa de crescimento (por exemplo,ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139: 1078), e assim para uma faixa degenótipos diversos, o tamanho da planta sob uma condição ambiental éprovável correlacionar-se com o tamanho sob uma outra (Hittalmani et al2003 Theoretical Applied Genetics 107: 679). Deste modo um ambientepadrão é usado como um substituto para os ambientes diversos e dinâmicosencontrados em locais e tempos diferentes pelas safras no campo.

O índice de colheita, a razão de rendimento de semente para opeso seco acima do solo, é relativamente estável sob muitas condiçõesambientais e assim uma correlação robusta entre o tamanho da planta e orendimento de grão pode ser freqüentemente obtido (por exemplo, Rebetzkeet al 2002 Crop Science 42: 739). Estes processos são intrinsecamente ligadosporque a maioria da biomassa de grão é dependente da produtividadefotossintética corrente ou armazenada pelas folhas e caules da planta(Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press,pp 68-73). Portanto, a seleção quanto o tamanho da planta, mesmo emestágios iniciais de desenvolvimento, foram usados como um indicador para o rendimento potencial futuro (por exemplo, Tittonell et al 2005 Agric Ecosys& Environ 105: 213). Quando do teste quanto ao impacto de diferençasgenéticas sobre a tolerância ao estresse, a capacidade para padronizar aspropriedades do solo, temperatura, disponibilidade de água e nutriente eintensidade de luz é uma vantagem intrínseca de ambientes de estufa oucâmara de crescimento de planta comparados com o campo. Entretanto, aslimitações nos rendimentos artificiais devido à polinização deficiente devido àausência de vento ou insetos ou espaço insuficiente para a raiz madura oucrescimento da copa, pode restringir o uso destes ambientes controlados paratestar as diferenças de rendimento. Portanto, as medições de tamanho daplanta em desenvolvimento inicial, sob condições padronizadas em umacâmara de crescimento ou estufa, são práticas padrão para fornecer indicaçãode vantagens de rendimento genético potenciais.

O rendimento de semente é um traço particularmenteimportante visto que as sementes de muitas plantas são importantes para anutrição humana e animal. As safras tais como, milho, arroz, trigo, canola esoja respondem por mais de metade da ingestão calórica humana total, sejaatravés do consumo direto das próprias sementes ou através do consumo deprodutos de carne fortalecidos com sementes processadas. Estas também sãouma fonte de açúcares, óleos e muitos tipos de metabólitos usados emprocessos industriais. As sementes contêm um embrião (a fonte de novosbrotos e raízes) e um endosperma (a fonte de nutrientes para o crescimento deembrião durante a germinação e durante o crescimento inicial de mudas). Odesenvolvimento de uma semente envolve muitos genes, e requer atransferência de metabólitos das raízes, folhas e caules para dentro dasementes em crescimento. O endosperma, em particular, assimila osprecursores metabólicos de carboidratos, óleos e proteínas e os sintetizam emmacromoléculas de armazenagem para o enchimento do grão. A capacidadepara aumentar o rendimento de planta pode ter muitas aplicações em áreas taiscomo agricultura, incluindo na produção de plantas ornamentais,arboricultura, horticultura e silvicultura. O rendimento aumentado tambémpode encontrar uso na produção de algas para o uso em biorreatores (para aprodução biotecnológica de substâncias tais como produtos farmacêuticos,anticorpos ou vacinas ou para a bioconversão de resíduos orgânicos) e outrasde tais áreas.

OsLEA3a é uma proteína do arroz que pode ser classificada comouma proteína LEA do Grupo 3a (Wise & Tunnacliffe, Trends Plant Sei.9, 13-17, 2004). As proteínas LEA (proteínas Abundantes de EmbriogêneseTardia) são expressadas em estágios diferentes de embriogênese tardia emembriões de semente de planta superior e sob condições de estresse dedesidratação. Estas também podem ser induzidas pelo ácido abscísico.Freqüentemente, a função destas proteínas é desconhecida. Uma classificaçãorecente discrimina 7 grupos dentro das proteínas LEA; diversos destes grupossão caracterizados por um motivo de seqüência típico e a análisecomputacional permitiu um prognóstico de função (Wise & Tunnacliffe,2004). As proteínas Lea do Grupo 3 compreendem as superfamílias de LEA 2e 5 e são caracterizadas pela presença de motivos de aminoácido de 11-merque amplamente podem ser definidos como segue: nas posições 1, 2, 5 e 9 umresíduo hidrofóbico, nas posições 3, 7 e 11 um resíduo negativo ou de amida,nas posições 6 e 8 um resíduo positivo e nas posições 4 e 10 qualqueraminoácido pode estar presente (Wise & Tunnacliffe, 2004, Dure III, L.,Protein and Peptide Letters 8, 115-122, 2001). As proteínas LEA do Grupo 3são postuladas para funcionar como um acompanhante molecular e podedesempenhar um papel na tolerância à dessecação (Goyal et al., Biochem. J.388, 151-157, 2005). Porque as proteínas LEA são induzidas em plantas sobas condições de estresse à água, foi levantada a hipótese de que as proteínasLEA poderiam ser úteis para fabricar plantas mais resistentes ao sal e à seca.Xu et al. (Plant Physiol. 110, 249-257, 1996) demonstraram que o arroztransformado com LEA3a da cevada foi mais tolerante ao déficit de água eestresse salino, Rohila et al. (Plant Sei. 163, 525-532, 2002) descrevem que oarroz Basmati transgênico com expressão constitutiva ou induzida peloestresse de LEA3a da cevada mostra tolerância aumentada contra a seca esalinidade alta. Similarmente, o trigo transformado com LEA3a de cevada sobo controle de um promotor constitutivo foi mais resistente à seca do que asplantas de controle (Bahieldin et ai, Physiol. Plant. 123, 421-427, 2005).

Entretanto, estes estudos também mostraram que não houve nenhum aumentono rendimento comparado com as plantas de controle quando as plantas foramcultivadas sob condições sem estresse. A WO 97/13843 descreve o uso deHVAl da cevada para aumentar a resistência à seca e o estresse salino,entretanto não foi demonstrado que as plantas que expressam HVAl dacevada tiveram propriedades de crescimento melhoradas sob condições quenão de estresse.

Surpreendentemente, foi agora verificado que a expressãomodular em uma planta de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeoLEA3a do arroz (OsLEA3a) ou um homólogo do mesmo dá plantas tendorendimento aumentado em relação às plantas de controle. Este aumento norendimento foi surpreendentemente observado quando as plantas foramcultivadas sob condições sem estresse (condições que não de estresse).Preferivelmente, o homólogo de OsLEA3a é de origem vegetal, maispreferivelmente, o homólogo de OsLEA3a origina-se de uma planta monocot,contanto que o homólogo de OsLEA3a não seja a SEQ ID NO: 22 (Hordeumvulgaré). O mais preferivelmente, o homólogo se origina de Oryza sativa.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção,é fornecido um método para aumentar o rendimento de planta, quecompreende modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico quecodifica o polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo.

Vantajosamente, o desempenho dos métodos de acordo com apresente invenção resulta em plantas tendo rendimento aumentado,particularmente rendimento de semente, em relação às plantas de controle.

A escolha de plantas de controle é uma parte da rotina de umcenário experimental e pode incluir plantas do tipo selvagem correspondentesou plantas correspondentes sem o gene de interesse. A planta de controle étipicamente da mesma espécie vegetal ou ainda da mesma variedade como aplanta a ser comparada. A planta de controle também pode ser um nulizigotoda planta a ser comparada. Os nulizigotos são indivíduos que perdem otransgene pela segregação. Uma "planta de controle" como aqui usado refere-se não apenas às plantas inteiras, mas também às partes vegetais, incluindosementes e partes de semente.

Uma "referência", "planta de referência", "controle", "plantade controle", "tipo selvagem" ou "planta do tipo selvagem" são em particularuma célula, um tecido, um órgão, uma planta ou uma parte destes, que nãoforam produzidos de acordo com o método da invenção. Conseqüentemente,os termos "tipo selvagem", "controle" ou "referência" são cambiáveis epodem ser uma célula ou uma parte da planta tal como uma organela outecido ou uma planta, que não foi modificada ou tratada de acordo com ométodo aqui descrito de acordo com a invenção. Conseqüentemente, a célulaou uma parte da planta tal como uma organela ou uma planta usada como tiposelvagem, controle ou referência corresponde à célula, planta ou parte destatanto quanto possível e está em qualquer outra propriedade mas no resultadodo processo da invenção tão idêntica com a matéria objeto da invenção quantopossível. Assim, o tipo selvagem, controle ou referência são tratados de modoidêntico ou tão idêntico quanto possível, dizendo que apenas as condições oupropriedades poderiam ser diferentes que não influenciam a qualidade dapropriedade testada. Isto significa em outras palavras que o tipo selvagemdenota (1) uma planta, que carrega a forma inalterada ou não modulada de umgene ou alelo ou (2) o material/planta de partida a partir da qual as plantasproduzidas pelo processo ou método da invenção são derivadas.

Preferivelmente, qualquer comparação entre as plantas do tiposelvagem e as plantas produzidas pelo método da invenção é realizada sobcondições análogas. O termo "condições análogas" significa que todas ascondições tais como, por exemplo, as condições de cultura ou crescimento,condições de ensaio (tais como composição de tampão, temperatura,substratos, cepa de patógeno, concentrações e outros) são mantidos idênticosentre os experimentos a serem comparados.

A "referência", "controle" ou "tipo selvagem" é preferivelmente um paciente, por exemplo, uma organela, uma célula, umtecido, uma planta, que não foram modulados, modificados ou tratados deacordo com o processo da invenção aqui descrito e são em qualquer outrapropriedade tão similares quanto a matéria objeto da invenção quantopossível. A referência, controle ou tipo selvagem são no seu genoma,transcriptoma, proteoma ou metaboloma tão similar quanto possível ao objetoda presente invenção. Preferivelmente, o termo organela, célula, tecido ouplanta "de referência" "controle" ou "tipo selvagem", diz respeito a umaorganela, célula, tecido ou planta, que é quase geneticamente idêntica àorganela, célula, tecido ou planta, da presente invenção ou uma parte destapreferivelmente 95 %, mais preferido são 98 %, ainda mais preferido são99,00 %, em particular 99,10 %, 99,30 %, 99,50 %, 99,70 %, 99,90 %, 99,99%, 99,999 % ou mais. O mais preferivelmente a "referência", "controle" ou"tipo selvagem" é um objeto, por exemplo, uma organela, uma célula, umtecido, uma planta, que é geneticamente idêntica à planta, célula organelausadas de acordo com o método da invenção exceto que as moléculas deácido nucleico ou o produto de gene codificado por elas são mudados,modulados ou modificados de acordo com o método da invenção.

O termo "expressão" ou "expressão de gene" significa oaparecimento de um traço fenotípico como uma conseqüência da transcriçãode um gene específico ou genes específicos. O termo "expressão" ou"expressão de gene" em particular significa a transcrição de um gene ou genesem RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com tradução subseqüente doúltimo em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA,processamento do produto de mRNA resultante e a sua tradução em umaproteína ativa.

O termo "modulação" significa em relação à expressão ouexpressão de gene, um processo no qual o nível de expressão é mudado peladita expressão de gene em comparação com a planta de controle,preferivelmente o nível de expressão é aumentado, a expressão original, nãomodulada pode ser de qualquer tipo de expressão de um RNA estrutural(rRNA, tRNA) ou mRNA com tradução subseqüente. O termo "modular aatividade" deve significar qualquer mudança da expressão das seqüências deácido nucleico inventivas ou proteínas codificadas, que leva ao rendimento aumentado e/ou crescimento aumentado das plantas.

O termo "rendimento" no geral significa uma produçãomensurável de valor econômico, necessariamente relacionado com uma safraespecificada, a uma área, e a um período de tempo. As partes de plantaindividuais diretamente contribuem para o rendimento com base no seunúmero, tamanho e/ou peso, ao passo que o rendimento real é o rendimentopor acre para uma safra e ano, que é determinado dividindo-se a produçãototal (inclui tanto a produção colhida quanto estimada) pelos acres plantados.

Os termos "aumento", "melhora" ou "melhorar" sãointercambiáveis e devem significar no sentido da aplicação de pelo menos umrendimento e/ou crescimento de 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % ou 10 %,preferivelmente pelo menos 15 % ou 20 %, mais preferivelmente 25 %, 30 %,35 % ou 40 % maior em comparação com a planta do tipo selvagem comoaqui definida.

O aumento que se refere à atividade do polipeptídeo atinge emuma célula, um tecido, uma organela, um órgão ou um organismo ou umaparte deste preferivelmente a pelo menos 5 %, preferivelmente a pelo menos10 % ou a pelo menos 15 %, especial e preferivelmente a pelo menos 20 %,25 %, 30 % ou mais, muito de modo especialmente preferível são de pelomenos 40 %, 50 % ou 60 %, o mais preferivelmente são de pelo menos 70 %ou mais em comparação ao controle, referência ou tipo selvagem.

O termo "rendimento aumentado" como aqui definido ésignifica um aumento na biomassa (peso) de uma ou mais partes de umaplanta, que podem incluir partes acima do solo (colhíveis) e/ou partes(colhíveis) abaixo do solo.

Em particular, tais partes colhíveis são sementes, e odesempenho dos métodos da invenção resulta em plantas tendo rendimento desemente aumentado em relação ao rendimento de semente de plantas decontrole.

O rendimento de semente aumentado pode se manifestar por sisó como um ou mais dos seguintes: a) um aumento na biomassa de semente(peso de semente total) que pode ser em uma base de semente individual e/oupor planta e/ou por hectare ou acre; b) número aumentado de flores porplanta; c) número aumentado de sementes (cheias); d) taxa de enchimento desemente aumentada (que é expressada como a razão entre o número desementes cheias dividido pelo número total de sementes; e) índice de colheitaaumentado, que é expressado como uma razão do rendimento de partescolhíveis, tais como sementes, dividido pela biomassa total; e f) peso de milgrãos (TKW) aumentado, que é extrapolado do número de sementes cheiascontadas e seu peso total. Um TKW aumentado pode resultar de um tamanhode semente e/ou peso de semente aumentados, e também pode resultar de umaumento no tamanho do embrião e/ou endosperma.

Um aumento no rendimento de semente também podem sermanifestado como um aumento no tamanho da semente e/ou volume dasemente, que também pode influenciar a composição de sementes (incluindoteor e composição de óleo, proteína e carboidrato total). Além disso, umaumento no rendimento de semente também pode manifestar-se por si sócomo um aumento na área da semente e/ou comprimento da semente e/oulargura da semente e/ou perímetro da semente. O rendimento aumentadotambém pode resultar em arquitetura modificada ou pode ocorrer por causa daarquitetura modificada.

Tomando-se o milho como um exemplo, um aumento norendimento pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: aumentono número de plantas por hectare ou acre, um aumento no número de espigaspor planta, um aumento no número de fileiras, números de grãos por fileira,peso do grão, peso de mil grãos, comprimento/diâmetro da espiga, aumentona taxa de enchimento da semente (que é o número de sementes cheiasdividido pelo número total de sementes e multiplicado por 100), entre outros.

Tomando-se o arroz como um exemplo, um aumento norendimento pode ser manifestado por um aumento em um ou mais dosseguintes: número de plantas por hectare ou acre, número de panículos porplanta, número de espiguetas por panículo, número de flores (flósculas) porpanículo, (que é expressado como uma razão do número de sementes cheiasem relação ao número de panículos primários), aumento na taxa deenchimento de semente, (que é o número de sementes cheias dividido pelonúmero total de sementes e multiplicado por 100), aumento no peso de milgrãos, entre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar emarquitetura modificada ou pode ocorrer como um resultado da arquiteturamodificada.

De acordo com uma característica preferida, o desempenhodos métodos da invenção resultam em plantas tendo rendimento aumentado,particularmente rendimento de semente. Portanto, de acordo com a presenteinvenção, é fornecido um método para aumentar o rendimento de planta,método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácidonucleico que codifica o polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo.

Visto que as plantas transgênicas de acordo com a presenteinvenção têm rendimento aumentado, é provável que estas plantas exibamuma taxa de crescimento aumentada (durante pelo menos parte do seu ciclo devida), em relação à taxa de crescimento de plantas de controle em um estágiocorrespondente em seu ciclo de vida. As plantas tendo uma taxa decrescimento aumentada pode ter um ciclo de vida mais curto. O ciclo de vidade uma planta pode ser considerado significar o tempo necessário para crescerde uma semente madura seca até o estágio onde a planta tem produzidosementes maduras secas, similar ao material de partida. Este ciclo de vidapode ser influenciado por fatores tais como vigor inicial, taxa de crescimento,tempo de florescimento e velocidade de maturação de semente. O aumento nataxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida deuma planta ou durante substancialmente o ciclo de vida da planta inteira. Ataxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida deuma planta pode refletir vigor realçado. O aumento na taxa de crescimentopode alterar o ciclo de colheita de uma planta que possibilita que as plantassejam semeadas mais tarde e/ou colhidas mais cedo do que de outro modoseria possível (um efeito similar pode ser obtido com tempo de florescimentomais cedo). Se a taxa de crescimento é suficientemente aumentada, isto podepermitir a outra semeadura de sementes da mesma espécie de planta (porexemplo semeadura e colheita de plantas de arroz seguidos pela semeadura ecolheita de outras plantas do arroz todas dentro de um período de crescimentoconvencional). Similarmente, se a taxa de crescimento é suficientementeaumentada, pode permitir a semeadura adicional de sementes de espécies deplantas diferentes (por exemplo a semeadura e colheita de plantas de arrozseguido, por exemplo, pela semeadura e colheita opcional de feijão soja,batata ou qualquer outra planta adequada). Tempos de colheita adicionais domesmo rizoma no caso de algumas plantas de safra também podem serpossíveis. A alteração do ciclo de colheita de uma planta pode levar a umaumento na produção de biomassa anual por acre (devido a um aumento nonúmero de vezes (diga-se em um ano) que qualquer planta particular pode sercultivada e colhida). Um aumento na taxa de crescimento também podepermitir o cultivo de plantas transgênicas em uma área geográfica mais amplado que as suas contrapartes do tipo selvagem, visto que as limitaçõesterritoriais para o cultivo de uma safra são freqüentemente determinados pelascondições ambientais adversas no momento de plantar (estação inicial) ou nomomento da colheita (estação tardia). Tais condições adversas podem serevitadas se o ciclo de colheita é encurtado. A taxa de crescimento pode serdeterminada pela derivação de vários parâmetros de curvas de crescimento,tais parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo levado para que as plantasatinjam 50 % do seu tamanho máximo) e T-90 (tempo levado para que asplantas atinjam 90 % do seu tamanho máximo), entre outros.

Plantas com uma taxa de crescimento aumentada exibem emuma ou mais partes desta planta, um metabolismo alterado, refletido comoníveis alterados de metabólitos. Os níveis de metabólitos alterados são ligadosà presença do transgene. Portanto, o perfil metabólico pode ser usado comouma ferramenta de diagnóstico para caracterizar ou identificar plantas tendorendimento aumentado, para prognosticar novas proteínas que são envolvidasno aumento de rendimento ou para identificar os caminhos que estãoenvolvidos no aumento de rendimento.

O termo "metabólitos" refere-se às substâncias intermediárias,preferivelmente tais de peso molecular baixo, que ocorrem durante oanabolismo e catabolismo em uma planta ou uma célula vegetal, em outraspalavras, uma substância produzida ou consumida durante o metabolismo, talcomo aminoácidos. O termo "composição melhorada" de metabólitosreferem-se às mudanças desejadas na concentração destes metabólitos.Dependendo do tipo de metabólito, a mudança pode ser um aumento oudiminuição na concentração. Preferivelmente, a mudança naconcentração/nível de metabólito é medida em relação a plantas de controleadequadas. Os metabólitos preferidos na presente invenção compreendemetabólitos, por exemplo, do metabolismo de aminoácido, metabolismo decarotenóide, metabolismo de co-fator, metabolismo de ácido graxo,metabolismo de ácido orgânico, metabolismo de fenólicos, metabolismo defito-hormônio, metabolismo de fitosterol, metabolismo de açúcar,metabolismo de tocoferol e compostos relacionados, metabolismo decomposto ceroso, metabolismo de lipídeo. Os níveis de vários metabólitostipicamente variam dentro de certos limites (ver por exemplo os dados noExemplo 6) e as mudanças nos níveis de um ou mais metabólitos podem serusadas para definir um perfil metabólico. Um tal perfil metabólico podecompreender os dados para os níveis alterados de metabólitos específicos e/ouclasses de metabólitos (tais como metabolismo de aminoácido, metabolismode carotenóide, metabolismo de co-fator, metabolismo de ácido graxo,metabolismo de ácido orgânico, metabolismo de fenólicos, metabolismo defito-hormônio, metabolismo de fitosterol, metabolismo de açúcar,metabolismo de tocoferol e composto relacionado, metabolismo de compostoceroso, metabolismo de lipídeo). Os níveis de metabólito podem ser alteradossubstancialmente por toda a planta inteira ou em certas partes de planta,órgãos, tecidos ou células, devido à expressão modulada do gene de interesse,no caso LEA3a. Em uma forma de realização preferida, os níveis dometabólito são alterados em sementes.

De acordo com uma característica preferida da presenteinvenção, o desempenho dos métodos da invenção dá plantas tendo uma taxade crescimento aumentada ou rendimento aumentado em comparação com asplantas de controle. Portanto, de acordo com a presente invenção, é fornecidoum método para aumentar o rendimento e/ou taxa de crescimento em plantas,método este que compreende modular a expressão em uma planta de um ácidonucleico que codifica o polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo.

Um aumento no rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre sea planta está sob condições não estressantes ou se a planta é exposta a váriosestresses comparado com as plantas de controle. O aumento no rendimentoe/ou taxa de crescimento é particularmente observado quando a planta estásob condições não estressantes. As plantas tipicamente respondem àexposição ao estresse pelo crescimento mais lento. Em condições de estressesevero, a planta pode mesmo interromper o seu crescimento no total. Oestresse brando por outro lado é aqui definido como sendo qualquer estresseao qual uma planta é exposta que não resulta na cessação pela planta decrescer completamente sem a capacidade para reassumir o crescimento. Oestresse brando no sentido da invenção leva a uma redução no crescimentodas plantas estressadas de menos do que 40 %, 35 % ou 30 %,preferivelmente menos do que 25 %, 20 % ou 15 %, mais preferivelmentemenos do que 14 %, 13 %, 12 %, 11 % ou 10 % ou menos em comparaçãocom a planta de controle sob condições não estressantes. Devido aos avançosnas práticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentos com pesticidas) osestresses severos não são freqüentemente encontrados em plantas de safracultivadas. Como uma conseqüência, o crescimento comprometido induzidopelo estresse brando é freqüentemente uma característica indesejável para aagricultura. Os estresses brandos são os estresses típicos aos quais uma plantapode ser exposta. Estes estresses podem ser os estresses bióticos e/ouabióticos de cada dia (ambientais) aos quais uma planta é exposta. Osestresses abióticos ou ambientais típicos incluem os estresses de temperaturacausados pelas temperaturas quentes ou frias/congelantes atípicas; estressesalino; estresse de água (seca ou água em excesso). Os produtos químicostambém podem causar estresses abióticos. Os estresses bióticos sãotipicamente aqueles estresses causados pelos patógenos, tais como bactérias,vírus, fungos e insetos.

Em particular, os métodos da presente invenção podem serrealizados sob condições que não de estresse para dar plantas tendorendimento aumentado em relação às plantas de controle. Como relatado emWang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), o estresse abiótico leva a uma série demudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares que afetamadversamente o crescimento e produtividade da planta. Seca, salinidade,temperaturas extremas e estresse oxidativo são conhecidos ser interconectadose podem induzir o crescimento e dano celular através de mecanismossimilares. Rabbani et ai. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) descreve umgrau particularmente alto de "conversa cruzada" entre estresse pela seca eestresse de salinidade alta. Por exemplo, seca e/ou salinização sãomanifestadas primariamente como estresse osmótico, resultando norompimento da homeostase e distribuição iônica na célula. Estresse oxidativo,que freqüentemente acompanha a temperatura alta ou baixa, salinidade ouestresse pela seca, pode causar a desnaturação de proteínas funcionais eestruturais. Como uma conseqüência, estes estresses ambientais diversosfreqüentemente ativam os caminhos de sinalização de célula similares erespostas celulares, tais como a produção de proteínas de estresse, a super-regulagem de anti-oxidantes, o acúmulo de solutos compatíveis e a parada docrescimento. O termo condições "não estressantes" como aqui usado sãoaquelas condições ambientais que não impõem estresse, tal como os estressesdescritos acima, nas plantas. As pessoas habilitadas na técnica estão cientesde condições de solo normal e condições climáticas para uma dadalocalização.

As características de crescimento mencionadas acimavantajosamente podem ser modificadas em qualquer planta.

O termo "planta" como aqui usado abrange plantas inteiras,ancestrais e progênie das plantas, células vegetais e partes vegetais, incluindosementes, brotos, hastes, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, e tecidose órgãos, em que cada um dos anteriormente mencionados compreende ogene/ácido nucleico de interesse. O termo "planta" também abrange culturasde suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos,esporófitos, pólen e microsporos, mais uma vez em que cada um dosanteriormente mencionados compreende o gene/ácido nucleico de interesse.

As plantas que são particularmente úteis nos métodos dainvenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamíliaViridiplantae, em particular plantas monocotilédone e dicotilédone incluindoleguminosas ou forragem, plantas ornamentais, safras alimentícias, árvores ouarbustos selecionados da lista que compreende Acer spp., Actinidia spp.,Abelmoschus spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananascomosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Araehis spp,Artoearpus spp., Asparagus ojficinalis, Avena sativa, Averrhoa earambola,Benineasa hispida, Bertholletia exeelsea, Beta vulgaris, Brassiea spp.,Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carexelata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamustinctorius, Castanea spp., Ciehorium endivia, Cinnamomum spp., Citrulluslanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp.,Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus,Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp.,Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp.,Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp.,Fagus spp., Ficus eariea, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba,Glyeine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hemerocallis fulva,Hibiseus spp., Hordeum spp., batatas Ipomoea, Juglans spp., Laetuea sativa,Lathyrus spp., Lens eulinaris, Linum usitatissimum, Litehi ehinensis, Lotusspp., Luffa aeutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatiea, Maerotyloma spp.,Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica,Manihot spp., Manilkara zapota, Medieago sativa, Melilotus spp., Menthaspp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp.,Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passifloraedulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Ptemeolus spp.,Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp.,Populm spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum,Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum,Ribes spp., Rubus spp., Saeeharum spp., Sambucus spp., Seeale eereale,Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp., Sorghum bieolor, Spinaeia spp.,Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma eaeao, Trifolium spp.,Triticoseeale rimpaui, Tritieum spp., Tropaeolum minus, Tropaeolum majus,Vaeeinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays,Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outros.

Outras plantas vantajosas são selecionadas do grupo queconsiste de Asteraceae tal como o gênero Helianthus, Tagetes por exemplo, aespécie Helianthus annuus [girassol], Tagetes lúcida, Tagetes ereeta ouTagetes tenuifolia [Cravo de defunto]; Brassicaceae tal como os gênerosBrassica, Arabidopsis por exemplo, as espécies Brassica napus, Brassicarapa ssp. [canola, colza, nabo] ou Arabidopsis thaliana; Fabaeeae tal como ogênero Glicina por exemplo, a espécie Glycine max, Soja hispida ou Soja max[soja]; Linaceae tal como os gêneros Linum por exemplo, a espécie Linumusitatissimum, [linho, linhaça]; Poaceae tal como os gêneros Hordeum,Secale, Avena, Sorghum, Oryza, Zea, Triticum por exemplo, a espécieHordeum vulgare [cevada], Secale eereale [centeio], Avena sativa, Avenafatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [aveia],Sorghum bieolor [sorgo, painço], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zeamays [milho] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum,Triticum hybernum, Triticum macha, Tritieum sativum ou Triticum vulgare[trigo, trigo de pão, trigo comum]; Solanaceae tal como os gêneros Solanum,Lycopersicon por exemplo, a espécie Solanum tuberosum [batata],Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersiconpyriforme, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum [tomate].

De acordo com uma forma de realização preferida da presenteinvenção, a planta é uma planta de safra. Os exemplos de plantas de safraincluem soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodão, tomate, batata e tabaco.Além disso, preferivelmente, a planta é uma planta monocotilédone. Osexemplos de plantas monocotilédone incluem cana de açúcar. Maispreferivelmente a planta é um cereal. Os exemplos de cereais incluem arroz,milho, trigo, cevada, painço, centeio, sorgo e aveia.

O termo "polipeptídeo OsLEA3 a ou um homólogo do mesmo"como aqui definido refere-se a um polipeptídeo tal como aquele representadona SEQ ID NO: 2 e às proteínas que pertencem ao Grupo 3 de proteínas LEA,que têm 2 domínios de proteína LEA_4 correspondentes à Pfam acessoPF02987 ou o InterPro acesso IPR004238 e que compreende o motivo deseqüência de aminoácido de 11-mer no geral definido como segue: nasposições 1, 2, 5 e 9 um resíduo hidrofóbico, nas posições 3, 7 e 11 um resíduonegativo ou amida, nas posições 6 e 8 um resíduo positivo e nas posições 4 e10 qualquer aminoácido pode estar presente; dentro deste motivo umdesemparelhamento pode ocorrer (Dure III, L., Protein and Peptide Letters 8,115-122, 2001). O grupo de resíduos de aminoácido hidrofóbicos consiste deA, C, F, G, I, L, Μ, Τ, V, W, S e Y. Os aminoácidos negativos são D ou E eresíduos de amida são Q e N. Os aminoácidos positivos são Η, K e R. Aconservação de seqüência neste motivo não é absoluta e um ou doisdesemparelhamentos podem ocorrer (Figura 3).

Preferivelmente, o motivo de seqüência de aminoácido de 11-mer (a seguir chamado de assinatura de consenso) corresponde à seqüência

T(S/T/A/K)(Q/E/D)A(A/T)(R/K)(D/Q/E)(K/R)A(A/G/Y)(E/G) (SEQ IDNO:3),

mais preferivelmente a seqüência de assinatura de consensocorresponde à seqüência

T(S/T/A/K)(Q/E/D)A(A/T)(R/K)(D/Q/E)(K/R)A(A/GAf)E

mais preferivelmente, a assinatura de consenso corresponde àseqüênciaT(S/A/K)(Q/D)A(A/T)(R/K)(D/E)KA(A/Y)E,

o mais preferivelmente a assinatura de consenso éT(S/A)QAARDKAAE.

O termo "domínio" refere-se a um conjunto de aminoácidosconservados nas posições específicas junto com um alinhamento deseqüências de proteínas evolucionariamente relacionadas. Enquanto osaminoácidos nas outras posições pode variar entre homólogos, osaminoácidos que são altamente conservadas em posições específicas indicamaminoácidos que são essenciais na estrutura, na estabilidade ou na atividadede uma proteína. Identificado pelo seu alto grau de conservação emseqüências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, estes podemser usados como identificadores para determinar se algum polipeptídeo emquestão pertence a uma família de polipeptídeo previamente identificada(neste caso, a família de proteínas LEA3). O termo "motivo" ou "seqüênciade consenso" ou "assinatura" referem-se a uma região conservada curta emuma seqüência de proteína. Os motivos são freqüentemente partes altamenteconservadas de domínios, mas também podem incluir apenas parte dodomínio ou estar localizado fora do domínio conservado (se todos osaminoácidos do motivo caem fora de um domínio definido).

As bases de dados especializadas existem para a identificaçãode domínios. O domínio LEA_4 em uma proteína LEA3 pode ser identificadousando, por exemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244),InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite(Bucher e Bairoch (1994), Um perfil generalizado syntax para motivos deseqüências biomoleculares e a sua função na interpretação de seqüênciaautomática. (Em) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference onIntelligent Systems for Molecular. Altman R., Brutlag D., Karp P., LathropR., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl.Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)) ou Pfam (Bateman et al., Nucleic AeidsResearch 30(1): 276-280 (2002)). Um conjunto de ferramentas para a análiseem ambiente virtual de seqüências de proteína é disponível no servidorExPASY proteomics (hospedado pelo Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth proteinknowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)). Aseqüência de proteína OsLEA3 a foi analisada com a ferramenta SMART(versão 4.1; Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5857-5864;Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244) e foi usado para triar oPfam (Versão 17.0, March 2005; Bateman et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32,D138-141) e a base de dados InterPro (Release 11.0, 26 Julho 2005; Mulderet al. (2005) Nucl. Acids. Res. 33, D201-205). O primeiro domínio LEA 4 naseqüência da SEQ ID NO: 2 começa no G28 e termina no D97, o segundocomeça em GlOl a D163.

Alinhando-se outras seqüências de proteína com a SEQ IDNO: 2, a seqüência de assinatura de consenso correspondente, o domínioLEA_4 ou outros motivos de seqüência podem ser facilmente identificados.Deste modo, polipeptídeos LEA3 ou homólogos destes (que abrangemortólogos e parálogos) podem ser facilmente identificados, usando técnicas derotina bem conhecidas no ramo, tal como pelo alinhamento de seqüência. Osmétodos para o alinhamento de seqüências para a comparação são bemconhecido na técnica, tais métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST,FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) JMol Biol 48: 443-453) para encontrar o alinhamento de duas seqüênciascompletas que maximiza o número de emparelhamento e minimiza o númerode intervalos. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10) calcula a identidade de seqüência percentual e realiza uma análiseestatística da similaridade entre as duas seqüências. O software para realizar aanálise é publicamente disponível através do National Centre forBiotechnology Information. Os homólogos podem ser facilmenteidentificados usando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de seqüênciamúltipla ClustalW (versão 1.83), com os parâmetros de alinhamento aos paresde valor padrão, e um método de contagem em porcentagem. As porcentagensglobais de similaridade e identidade também podem ser determinadas usandoum dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella etaL, BMC Bioinformatics. 10 de Julho de 2003; 4: 29. MatGAT: um pedidoque gera matrizes de similaridade/identidade usando seqüências de proteínaou DNA). a edição manual menor pode ser realizada para otimizar oalinhamento entre os motivos conservados, como seria evidente a uma pessoahabilitada na técnica. Além disso, ao invés de usar seqüências decomprimento completo para a identificação de homólogos, domíniosespecíficos (tais como o domínio LEA_4) também podem ser usados. Osvalores de identidade de seqüência, que são indicados abaixo como umaporcentagem foram determinados no domínio conservado inteiro ou seqüênciade ácido nucleico ou aminoácido usando os programas mencionados acimausando os parâmetros de valor padrão.

Os exemplos de proteínas OsLEA3 a ou homólogos destasincluem as seqüências representadas pela SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ IDNO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30,SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36.

Deve ser entendido que as seqüências que caem sob adefinição de "polipeptídeo OsLEA3 a ou homólogo do mesmo" não devem serlimitados às seqüências representadas pela SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8,SEQ ED NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ IDNO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ IDNO: 36, mas que qualquer polipeptídeo que compreende a seqüência deassinatura de consenso da SEQ ID NO: 3 e preferivelmente também tendopelo menos 42 % de identidade de seqüência (usando o algoritmo deNeedleman-Wunsch com uma Penalidade de abertura de intervalo de 11 euma Penalidade de extensão de intervalo de 1) para a SEQ ED NO: 2, pode seradequado para o uso nos métodos da invenção. Entretanto o termo"polipeptídeo OsLEA3a ou homólogo do mesmo" como aqui usado nãoabrange a SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeum vulgaré). Preferivelmente, opolipeptídeo é um polipeptídeo do arroz.

Abrangido pelo termo "homólogos" estão as seqüênciasortólogas e as seqüências parálogas, duas formas especiais de homologia queabrange conceitos evolucionários usados para descrever relações ancestrais degenes. Os parálogos são genes dentro das mesmas espécies que têm originadoatravés da duplicação de um gene ancestral e ortólogos são genes deorganismos diferentes que se originaram da especiação.

Os ortólogos e parálogos podem ser encontrados pelarealização de uma chamada pesquisa blast recíproca. Isto pode ser feito porum primeiro BLAST envolvendo submeter a BLAST uma seqüência dúvida(por exemplo, a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) contra qualquer base dedados de seqüência, tal como a base de dados da NCBI publicamentedisponível. BLASTN ou TBLASTX (usando valores básicos padrão) podemser usados quando do início de uma seqüência de nucleotídeo e BLASTP ouTBLASTN (usando valores básicos padrão) podem ser usados quando doinício de uma seqüência de proteína. Os resultados de BLAST podem seropcionalmente filtrados. As seqüências de tamanho natural de cada um dosresultados filtrados ou resultados não filtrados são depois retro submetidos aBLAST (segundo BLAST) contra seqüências do organismo a partir do qual aseqüência dúvida é derivada (onde a seqüência dúvida é a SEQ ID NO: 1 ou aSEQ ID NO: 2, o segundo BLAST portanto seria contra as seqüências doarroz). Os resultados do primeiro e segundo BLASTs são depois comparados.Um parálogo é identificado se um acerto de alta classificação do segundoBLAST é da mesma espécie como da que a seqüência dúvida é derivada; umortólogo é identificado se um acerto de alta classificação não é da mesmaespécie como da que a seqüência dúvida é derivada. Os ortólogos preferidossão ortólogos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Os acertos de altaclassificação são aqueles tendo um valor E baixo. Quanto mais baixo o valorE, mais significante a contagem (ou em outras palavras mais baixa a chancede que o acerto fosse encontrado por acaso). A computação do valor E é bemconhecida na técnica. Além dos valores E, as comparações também sãocontadas pela identidade percentual. A identidade percentual refere-se aonúmero de nucleotídeos (ou aminoácidos) idênticos entre as duas seqüênciasde ácido nucleico (ou polipeptídeo) comparadas em um tamanho particular.Preferivelmente a contagem é maior do que 50, mais preferivelmente maiordo que 100; e preferivelmente o valor E é menor do que e-5, maispreferivelmente menor do que e-6. No caso de famílias grandes, ClustalWpode ser usado, seguido pela geração de uma árvore de junção de vizinhos,para ajudar a visualizar a formação de grupos de genes relacionados e paraidentificar ortólogos e parálogos. Os exemplos de seqüências ortólogas para aSEQ ID NO: 2 incluem SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 32 eSEQ ID NO: 22. Os exemplos de parálogos da SEQ ID NO: 2 incluem a SEQID NO: 8 e SEQ ID NO: 12.

Preferivelmente, os domínios LEA 4 das proteínas LEA3 úteisnos métodos da presente invenção têm, na ordem crescente de preferência,pelo menos 40 %, 42 %, 45 %, 49 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %,80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade deseqüência com a proteína da SEQ ID NO: 2. A matriz mostrada na Figura 4mostra similaridades e identidades (em negrito) em relação ao tamanhonatural da proteína. No caso apenas domínios específicos são comparados, aidentidade ou similaridade pode ser mais alta entre as proteínas diferentes.Um ensaio pode ser realizado para determinar a atividade deOsLEA3a. Para determinar a atividade de proteína LEA3, os ensaios sãodisponíveis e conhecidos na técnica, por exemplo, um ensaio de estresse aocalor e um de estresse pela água são descritos por Goyal et ai. (Biochem. J.388,151-157,2005).

Além disso, a expressão da proteína OsLEA3a ou de umhomólogo desta em plantas, e em particular em arroz, tem o efeito deaumentar o rendimento da planta transgênica quando comparada com asplantas de controle, em que o rendimento aumentado compreende pelo menosum de: peso total de sementes, número total de sementes e número desementes cheias.

Um polipeptídeo OsLEA3 a ou homólogo do mesmo écodificado por um ácido nucleico/gene OsLEA3 a. Portanto o termo "ácidonucleico/gene OsLEA3a" como aqui definido é qualquer ácido nucleico/geneque codifica um polipeptídeo OsLEA3 a ou um homólogo do mesmo comodefinido acima.

Os exemplos de ácido nucleicos OsLEA3 a incluem mas nãosão limitados àqueles representados por qualquer uma da SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ IDNO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33.

Os ácido nucleicos/genes OsLEA3 a e variantes destes podemser adequados na prática dos métodos da invenção. O termo "ácidonucleico/gene OsLEA3a ou variantes destes" como aqui definido não abrangeácidos nucleicos que codificam a SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeumvulgarè). Preferivelmente, as variantes de um gene OsLEA3a origina-se dearroz. Os ácido nucleico/genes OsLEA3 a variantes incluem porções de umácido nucleico/gene OsLEA3a, variantes de junção, variantes alélicas e/ouácidos nucleicos capazes de hibridizar com um ácido nucleico/geneOsLE Α3 a.

Referência aqui a uma "seqüência de ácido nucleico" éconsiderado significar uma forma polimérica de um polímero dedesoxirribonucleotídeo ou um ribonucleotídeo de qualquer comprimento, defilamento duplo ou único ou análogos destes, que tem as característicasessenciais de um ribonucleotídeo natural em que o mesmo pode hibridizarcom as seqüências de ácido nucleico em uma maneira similar aospolinucleotídeos que ocorrem naturalmente.

O termo porção como aqui definido refere-se a um pedaço deDNA que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios LEA4correspondentes ao acesso Pfam PF02987 ou ao acesso InterPro IPR004238 ea seqüência de assinatura de consenso da (SEQ ID NO: 3). Uma porção podeser preparada, por exemplo, fabricando-se uma ou mais deleções a um ácidonucleico OsLEA3 a. As porções podem ser usadas na forma isolada ou elaspodem ser fundidas a outras seqüências codificadoras (ou não codificadoras)de modo, por exemplo, a produzir uma proteína que combine diversasatividades. Quando fundido a outras seqüências codificadoras, o polipeptídeoresultante produzido na tradução pode ser maior do que aquele prognosticadopara o fragmento OsLEA3a. A porção tem tipicamente pelo menos 100, 150ou 200 nucleotídeos no comprimento, preferivelmente pelo menos 250, 300ou 350 nucleotídeos no comprimento, mais preferivelmente pelo menos 400,450 ou 500 nucleotídeos no comprimento e o mais preferivelmente pelomenos 550 ou 600 nucleotídeos no comprimento. Preferivelmente, a porção éuma porção de um ácido nucleico como representada por qualquer uma daSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO:33. O mais preferivelmente a porção de um ácido nucleico OsLEA3a é comorepresentada pela SEQ ID NO: 1.Os termos "fragmento", "fragmento de uma seqüência" ou"parte de uma seqüência" "porção" ou "porção desta" significam umaseqüência truncada da seqüência original aludida. A seqüência truncada(seqüência de ácido nucleico ou proteína) pode variar amplamente nocomprimento; o tamanho mínimo sendo uma seqüência de tamanho suficientepara fornecer uma seqüência com pelo menos uma função e/ou atividadecomparável da seqüência original aludida ou hibridizando com a molécula deácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção sob condiçõesseveras, embora o tamanho máximo não seja crítico. Em algumas aplicações, o tamanho máximo usualmente não é substancialmente maior do que aquelerequerido para fornecer a(s) atividade(s) e/ou função(ões) desejadas daseqüência original. Uma função comparável significa pelo menos 40 %, 45 %ou 50 %, preferivelmente pelo menos 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % ou mais dafunção da seqüência original.

Uma outra variante de um ácido nucleico/gene OsLEA3 a é umácido nucleico capaz de hibridizar sob condições de severidade reduzida,preferivelmente sob condições severas, com um ácido nucleico/geneOsLEA3a como mais acima definidos ou com uma porção como mais acimadefinido, cuja seqüência de hibridização preferivelmente codifica umpolipeptídeo que compreende dois domínios LEA4 correspondentes ao acessoPfam PF02987 ou ao acesso InterPro IPR004238 e as seqüência de assinaturade consenso de OsLEA3a (SEQ ID NO: 3). A seqüência de hibridização temtipicamente pelo menos 300 nucleotídeos no comprimento, preferivelmentepelo menos 400 nucleotídeos no comprimento, mais preferivelmente pelomenos 500 nucleotídeos no comprimento e o mais preferivelmente pelomenos 600 nucleotídeos no comprimento.

Preferivelmente, a seqüência de hibridização é uma que écapaz de hibridizar a um ácido nucleico como representado pela SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ IDNO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 ou a umaporção de qualquer uma das seqüências anteriormente mencionadas, umaporção sendo definida como acima. O mais preferivelmente a seqüência dehibridização é capaz de hibridizar com a SEQ ID NO: 1 ou com as porções(ou sondas desta) desta. Os métodos para planejar sondas são bem conhecidosna técnica. As sondas são no geral menores do que 1000 pares de base, 900pares de base, 800 pares de base, 700 pares de base, 600 pares de base nocomprimento, preferivelmente menores do que 500 pares de base, 400 paresde base, 300 pares de base, 200 pares de base ou 100 pares de base nocomprimento. Freqüentemente, os comprimentos de sonda para ashibridizações de DNA-DNA tais como Southern blotting, variam entre 100 e500 pares de base, ao passo que a região de hibridização em sondas para ashibridizações de DNA-DNA tais como na amplificação pela PCR no geral sãomais curtas do que 50 mas mais longas do que 10 nucleotídeos,preferivelmente elas têm 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 pares de base nocomprimento.

O termo "hibridização" como aqui definido é um processo emque seqüências de nucleotídeo complementares substancialmente homólogasrecozem-se entre si. O processo de hibridização pode ocorrer totalmente emsolução, isto é, ambos os ácidos nucleicos complementares estão em solução.O processo de hibridização também pode ocorrer com um dos ácidosnucleicos complementares imobilizados a uma matriz tal como pérolasmagnéticas, pérolas de Sepharose ou qualquer outra resina. O processo dehibridização além disso pode ocorrer com um dos ácidos nucleicoscomplementares imobilizados a um suporte sólido tal como uma membranade nitro-celulose ou náilon ou imobilizado por exemplo, fotolitografia, porexemplo, a um suporte de vidro silicoso (o último conhecido como série deácido nucleico ou microssérie ou como lascas de ácido nucleico). De modo apermitir que a hibridização ocorra, as moléculas de ácido nucleico são nogeral térmica ou quimicamente desnaturadas para fundir um filamento duploem dois filamentos únicos e/ou para remover grampos de cabelo ou outrasestruturas secundárias de ácidos nucleicos de filamento único.

O termo "severidade" refere-se às condições sob as quais umahibridização ocorre. A severidade de hibridização é influenciada pelascondições tais como temperatura, concentração salina, concentração iônica ecomposição de tampão de hibridização. No geral, as condições de severidadebaixa são selecionadas para serem cerca de 3 O0C mais baixas do que o pontode fusão térmica (Tm) para a seqüência específica em uma concentraçãoiônica e pH definidos. As condições de severidade média são quando atemperatura está 20°C abaixo da Tm, e as condições de severidade alta sãoquando a temperatura está IO0C abaixo da Tm. As condições de hibridizaçãode severidade alta são tipicamente usadas para isolar seqüências dehibridização que têm alta similaridade de seqüência com a seqüência de ácidonucleico alvo. Entretanto, os ácidos nucleicos podem desviar na seqüência eainda codificar um polipeptídeo substancialmente idêntico, devido àdegenerescência do código genético. Portanto as condições de hibridização deseveridade média algumas vezes podem ser necessárias para identificar taismoléculas de ácido nucleico.

A Tm é a temperatura sob concentração iônica e pH definidos,na qual 50 % da seqüência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamenteemparelhada. A Tm é dependente das condições de solução e da composiçãobase e do comprimento da sonda. Por exemplo, as seqüências mais longashibridizam especificamente em temperaturas mais altas. A taxa máxima dehibridização é obtida de cerca de 16°C até 32°C abaixo da Tm. A presença decátions monovalentes na solução de hibridização reduz a repulsãoeletrostática entre os dois filamentos de ácido nucleico promovendo destemodo a formação de híbrido; este efeito é visível para as concentrações desódio de até 0,4 M (para concentrações mais altas, este efeito pode serignorado). A formamida reduz a temperatura de fusão de duplexes de DNA-DNA e DNA-RNA com 0,6 a 0,7°C para cada por cento de formamida, e aadição de 50 % de formamida permite que a hibridização seja realizada de 30a 45°C, embora a taxa de hibridização seja diminuída. Osdesemparelhamentos de par de base reduzem a taxa de hibridização e aestabilidade térmica dos duplexes. Na média e para sondas grandes, a Tmdiminui a cerca de 10C por % de desemparelhamento de base. A Tm pode sercalculada usando as seguintes equações, dependendo dos tipos de híbridos:

1) Híbridos de DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284, 1984):

Tm= 81,5°C + 16,6 χ logio[Na+]a + 0,41 χ %[G/Cb] - 500 χ [Lc]"1 -0,61 χ % de formamida

2) Híbridos de DNA-RNA ou RNA-RNA:

Tm= 79,8 + 18,5 (logio[Na+]a) + 0,58 (% de G/Cb) +11,8 (% deG/Cb)2 - 820/L°

3) híbridos de oligo-DNA ou oligo-RNAd:Para < 20 nucleotídeos: Tm = 2 (In)

For 20 a 35 nucleotídeos: Tm = 22 + 1,46 (In)a ou para outro cátion monovalente, mas apenas preciso na faixa de 0,01 a0,4 M.

b apenas preciso para % de GC na faixa de 30 % a 75 %.

0L = comprimento de duplex em pares de base.

d Oligo, oligonucleotídeo; ln, comprimento eficaz do iniciador = 2x(n2 deG/C)+( n- de A/T).

A ligação não específica pode ser controlada usando qualqueruma de várias técnicas conhecidas tais como, por exemplo, bloquear amembrana com soluções contendo proteína, adições de RNA, DNA, e SDSheterólogos ao tampão de hibridização, e tratamento com Rnase. Para assondas não homólogas, uma série de hibridizações pode ser realizadavariando-se um de (i) diminuir progressivamente a temperatura derecozimento (por exemplo de 68°C para 42°C) ou (ii) diminuirprogressivamente a concentração de formamida (por exemplo de 50 % a 0 %).

O técnico habilitado está ciente de vários parâmetros que podem ser alteradosdurante a hibridização e que manterão ou mudarão as condições deseveridade.

Além das condições de hibridização, a especificidade dehibridização tipicamente também depende da função de lavagens de pós-hibridização. Para remover o fundo que resulta da hibridização não específica,as amostras são lavadas com soluções salinas diluídas. Os fatores críticos detais lavagens incluem a concentração iônica e a temperatura da solução delavagem final: quanto mais baixa a concentração salina e quanto mais alta atemperatura de lavagem, mais alta a severidade da lavagem. As condições delavagem são tipicamente realizadas na ou abaixo da severidade dehibridização. Uma hibridização positiva dá um sinal que é pelo menos duasvezes daquele do fundo. No geral, as condições severas adequadas para osensaios de hibridização de ácido nucleico ou procedimentos de detecção deamplificação de gene são como apresentados acima. As condições mais oumenos severas também podem ser selecionadas. O técnico habilitado estáciente de vários parâmetros que podem ser alterados durante a lavagem e quemanterá ou mudará as condições de severidade.

Por exemplo, as condições de hibridização de alta severidadetípicas para híbridos de DNA mais longos do que 50 nucleotídeos abrange ahibridização a 65°C em Ix SSC ou a 42°C em Ix SSC e 50 % de formamida,seguido pela lavagem a 65°C em 0,3x SSC. Os exemplos de condições dehibridização de severidade média para os híbridos de DNA mais longos doque 50 nucleotídeos abrangem a hibridização a 50°C em 4x SSC ou a 40°Cem 6x SSC e 50 % de formamida, seguido pela lavagem a 50°C em 2x SSC.O comprimento do híbrido é o comprimento previsto para o ácido nucleicohibridizador. Quando ácidos nucleicos de seqüência conhecida sãohibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado alinhando-se asseqüências e identificando as regiões conservadas nestas descritas. IxSSC é0.15 M de NaCl e 15 mM de citrato de sódio; as hibridizações e lavagenspodem adicionalmente incluir 5 χ reagente de Denhardt, 0,5 a 1,0 % de SDS,100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, fragmentado, 0,5 %de pirofosfato de sódio.

Para os propósitos de definir o nível de severidade, referênciapode ser feita a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratorymanual, 3a Edição Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nova Iorqueou a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989e atualizações anuais).

Também úteis nos métodos da invenção são ácidos nucleicosque codificam homólogos para a seqüência de aminoácido representados pelaSEQ ID NO: 2.

"Homólogos" de uma proteína abrange peptídeos,oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições,deleções e/ou inserções de aminoácido em relação à proteína não modificadaem questão e tendo atividade biológica e funcional similares como a proteínanão modificada a partir da qual elas são derivadas.

Um homólogo pode estar na forma de uma "variantesubstitucional" de uma proteína, isto é, onde pelo menos um resíduo em umaseqüência de aminoácido foi removida e um resíduo diferente inserido no seulugar. As substituições de aminoácido são tipicamente de resíduos únicos,mas podem ser feitas em grupos dependendo dos constrangimentos funcionaiscolocados no polipeptídeo; as inserções usualmente serão da ordem de cercade 1 a 10 resíduos de aminoácido. Preferivelmente, as substituições deaminoácido compreendem substituições de aminoácido conservativas. Paraproduzir tais homólogos, os aminoácidos da proteína podem ser substituídospor outros aminoácidos tendo propriedades similares (tais comohidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão para formar ouromper estruturas helicoidais α ou estruturas de folha β, similares). As tabelasde substituição conservativas são bem conhecidas na técnica (ver por exemploCreighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company e Tabela 1 abaixo).

Tabela 1: Exemplos de substituições de aminoácido conservadas

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Um homólogo também pode estar na forma de uma "varianteinsercional" de uma proteína, isto é, onde um ou mais resíduos de aminoácidosão introduzidos em um sítio pré determinado em uma proteína. As inserçõespodem compreender fusões de terminal N e/ou de terminal C assim comoinserções de intra-seqüência de aminoácidos únicos ou múltiplos. No geral, asinserções dentro da seqüência de aminoácido serão menores do que as fusõesde terminal N ou C, da ordem de cerca de 1 to 10 resíduos. Os exemplos deproteínas ou peptídeos de fusão de terminal N ou C incluem o domínio deligação ou domínio de ativação de um ativador transcricional como usado nosistema de híbrido duplo de levedura, proteínas de revestimento de fago,rótulo de (histidina)-6, rótulo de glutationa S-transferase, proteína A, proteínade ligação de maltose, diidrofoliato redutase, epítopo de Tag-100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, IacZ, CMP (peptídeo de ligação de calmodulina),epítopo HA, epítopo de proteína C e epítopo VSV.

Homólogos na forma de "variantes de deleção" de umaproteína são caracterizados pela remoção de um ou mais aminoácidos de umaproteína.

As variantes de aminoácido de uma proteína (variantes desubstituição, deleção e/ou inserção) podem ser facilmente fabricadas usandotécnicas sintéticas de peptídeo bem conhecidas na técnica, tais como a síntesede peptídeo de fase sólida e outros ou pelas manipulações de DNArecombinante. Os métodos para a manipulação de seqüências de DNA paraproduzir variantes de substituição, inserção ou deleção de uma proteína sãobem conhecidos na técnica. Por exemplo, técnicas para fabricar mutações desubstituição em sítios pré determinados no DNA são bem conhecidos poraqueles habilitados na técnica e incluem a mutagênese Ml3, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagênese Direcionada ao SítioQuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese direcionada ao sítiomediada pela PCR ou outros protocolos de mutagênese direcionada ao sítio.

Também úteis nos métodos da invenção são os ácidosnucleicos que codificam derivados do polipeptídeo representados pela SEQID NO 2 ou ortólogos ou parálogos destes. "Derivados" incluem peptídeos,oligopeptídeos, polipeptídeos que, comparados com a seqüência deaminoácido da forma que ocorre naturalmente da proteína, tal como aquelaapresentada na SEQ ID NO: 2, podem compreender substituições de aminoácidos com resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente ouadições de resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente."Derivados" de uma proteína também abrangem peptídeos, oligopeptídeos,polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácido que ocorremnaturalmente alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados,miristoilados, sulfatados, etc) ou naturalmente não alterados comparados coma seqüência de aminoácido de uma forma que ocorre naturalmente dopolipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou maissubstituintes que não aminoácido ou adições comparado com a seqüência deaminoácido da qual o mesmo é derivado, por exemplo uma molécula repórterou outro ligando, covalente ou não covalentemente ligado à seqüência deaminoácido, tal como uma molécula repórter que é ligada para facilitar a suadetecção, e resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente em relaçãoà seqüência de aminoácido de uma proteína que ocorre naturalmente.

Uma outra variante de ácido nucleico útil nos métodos dapresente invenção é uma variante de junção que codifica um polipeptídeoOsLEA3a como definido acima. O termo "variante de junção" como aquiusado abrange variantes de uma seqüência de ácido nucleico em que intronse/ou exons selecionados foram excisados, substituídos, deslocados ouadicionados ou em que introns foram encurtados ou encompridados. Taisvariantes serão aquelas em que a atividade biológica da proteína ésubstancialmente retida, isto pode ser obtido retendo-se seletivamentesegmentos funcionais da proteína. Tais variantes de junção podem serencontradas na natureza ou podem ser fabricadas pelo ser humano. Osmétodos para fabricar tais variantes de junção são conhecidos na técnica. Asvariantes de junção preferidas são variantes de junção do ácido nucleico quecodifica um polipeptídeo que compreende a seqüência de assinatura deconsenso OsLEA3a (SEQ ID NO: 3). Preferivelmente, o polipeptídeoOsLEA3a ou o homólogo do mesmo tem pelo menos 42 %, 45 %, 50 %, 55%, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou99 % de identidade de seqüência com a SEQ ID NO: 2. Mais preferidas são asvariantes de junção representadas pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33. A mais preferida é a variantede junção representada pela SEQ ID NO: 1.

Uma outra variante de ácido nucleico útil nos métodos dapresente invenção é uma variante alélica de um ácido nucleico que codificaum polipeptídeo OsLEA3a como definido acima. Preferivelmente a variantealélica é um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende aseqüência de assinatura de consenso OsLEA3a (SEQ ID NO: 3) e tendo pelomenos 42 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de seqüência com a SEQ IDNO: 2. Preferivelmente, o polipeptídeo codificado pela variante alélica érepresentado pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ IDNO: 31 e SEQ ID NO: 33. O mais preferivelmente, a variante alélica quecodifica o polipeptídeo OsLEA3a é representada pela SEQ ID NO: 1. Asvariantes alélicas existem na natureza, e abrangido dentro dos métodos dapresente invenção está o uso destes alelos naturais. As variantes alélicasabrangem Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), assim comoPolimorfismos de Inserção/Deleção Pequenos (INDELs). O tamanho deINDELs é usualmente menor do que 100 pares de base. SNPs e INDELsformam o maior conjunto de variantes de seqüência em cepas polimórficasque ocorrem naturalmente da maioria dos organismos.

Uma outra variante de ácido nucleico útil nos métodos dainvenção é uma variante de ácido nucleico obtida pelo embaralhamento degene. O embaralhamento de gene ou a evolução dirigida também podem serusados para gerar variantes de ácidos nucleicos OsLEA3. Isto consiste deiterações de embaralhamento de DNA seguido pela triagem e/ou seleçãoapropriadas para gerar variantes de ácidos nucleicos OsLEA3 ou porçõesdestas tendo uma atividade biológica modificada (Castle et al., (2004) Science304(5674): 1151-4; Patentes US 5.811.238 e 6.395.547).

Além disso, a mutagênese direcionada ao sítio pode ser usadapara gerar variantes de ácido nucleicos OsLEA3. Diversos métodos sãodisponíveis para se obter a mutagênese direcionada ao sítio; os mais comunssendo os métodos com base em PCR (Current Protocols in MolecularBiology. Wiley Eds.).

O ácido nucleico OsLEA3 a ou variante do mesmo podem serderivados de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucleico/gene ouvariante dos mesmos podem ser isolados de uma fonte microbiana, tal comolevedura ou fungos ou de uma fonte vegetal, alga ou animal (incluindo o serhumano). Este ácido nucleico pode ser modificado a partir da sua formanativa na composição e/ou ambiente genômico através da manipulaçãohumana deliberada. O ácido nucleico é preferivelmente de origem vegetal,seja da mesma espécie vegetal (por exemplo daquela na qual o mesmo devaser introduzido) ou seja de uma espécie vegetal diferente. O ácido nucleicopode ser isolados de uma espécie monocotilédone, preferivelmente da famíliaPoaceae, mais preferivelmente da Oryza sativa. Mais preferivelmente, oácido nucleico OsLEA3a é representado pela SEQ ID NO: 1, e a seqüência deaminoácido OsLEA3a é como representada pela SEQ ID NO: 2.

Qualquer referência aqui a um polipeptídeo OsLEA3 a éportanto considerada significar uma proteína OsLEA3 a como definido acima.Qualquer ácido nucleico que codifica uma tal proteína OsLEA3 a é adequadopara o uso nos métodos da invenção.

De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, aexpressão modulada, preferivelmente aumentada do ácido nucleico OsLEA3aou variante do mesmo é considerada. Os métodos para aumentar a expressãode genes ou produtos de gene são bem documentados na técnica e incluem,por exemplo, a super expressão direcionada pelos promotores apropriados, ouso de realçadores de transcrição ou realçadores de tradução. Os ácidonucleicos isolados que servem como elementos promotores ou realçadorespodem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente a montante)de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo de modo a super regulara expressão de um ácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo. Porexemplo, promotores endógenos podem ser alterados in vivo pela mutação,deleção e/ou substituição (ver, Kmiec, Pat. U.S. N- 5.565.350; Zarling et ai,PCT/US93/03868) ou promotores isolados podem ser introduzidos em umacélula vegetal na orientação apropriada e a distância de um gene da presenteinvenção de modo a controlar a expressão do gene. Os métodos para reduzir aexpressão de genes ou produtos de gene são bem documentados na técnica.

A expressão de um ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo pode ser modulada pelaintrodução de uma modificação genética (preferivelmente no local de umgene OsLEA3a). O local de um gene como aqui definido é consideradosignificar uma região genômica, que inclui o gene de interesse e 10 kb amontante ou a jusante da região codificadora.

A modificação genética pode ser introduzida, por exemplo, porqualquer um (ou mais) dos seguintes métodos: a ativação de T-DNA5TILLING, mutagênese direcionada ao sítio, evolução direcionada erecombinação homólogas ou pela introdução e expressão em um planta de umácido nucleico que codifica um polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo domesmo. A seguir da introdução da modificação genética, segue uma etapa deseleção quanto a expressão modificada de um ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo, modificação esta que naexpressão dá plantas tendo rendimento aumentado.

A rotulação de ativação de T-DNA (Hayashi et ai. Science(1992) 1350-1353) envolve a inserção de T-DNA, usualmente contendo umpromotor (também podem ser um realçador de tradução ou um intron), naregião genômica do gene de interesse ou 10 kb a montante ou a jusante daregião codificadora de um gene em uma configuração tal que o promotordirecione a expressão do gene alvejado. Tipicamente, a regulagem daexpressão do gene alvejado pelo seu promotor natural é rompido e o genefalha sob o controle do promotor recém introduzido. O promotor étipicamente embutido em um T-DNA. Este T-DNA é aleatoriamente inseridono genoma da planta, por exemplo, através da infecção por Agrobacterium eleva à superexpressão de genes próximo ao T-DNA inserido. As plantastransgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido à superexpressão de genes próximo ao promotor introduzido. O promotor a serintroduzido pode ser qualquer promotor capaz de direcionar a expressão deum gene no organismo desejado, neste caso uma planta. Por exemplo,promotores constitutivos, preferidos de tecido, preferidos do tipo de célula eindutíveis são todos adequados para o uso na ativação de T-DNA.

Uma modificação genética também pode ser introduzida nolocal de um gene OsLEA3a usando a técnica de TILLING (Lesões LocaisInduzidas Alvejadas Em Genomas). Esta é uma tecnologia de mutagênese útilpara gerar e/ou identificar, e eventualmente isolar variantes mutagenizadas deum ácido nucleico OsLEA3a com expressão e/ou· atividade moduladas.TILLING também permite a seleção de plantas que carregam tais variantesmutantes. Estas variantes mutantes podem exibir expressão modificada, naresistência ou na localização ou no controle do tempo (se as mutações afetamo promotor por exemplo). Estas variantes mutantes podem exibir aindaatividade de OsLEA3 a mais alta do que aquela exibida pelo gene na suaforma natural. TILLING combina a mutagênese de alta densidade commétodos de triagem de alto rendimento. As etapas tipicamente seguidas emTILLING são: (a) mutagênese de EMS (Redei GP e Koncz C (1992) EmMethods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds.Singapura, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al.,(1994) Em Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J eCaspar T (1998) Em J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods onMolecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b)preparação de DNA e agrupamento de indivíduos; (c) amplificação pela PCRde uma região de interesse; (d) desnaturação e recozimento para permitir aformação de heteroduplexes; (e) DHPLC, onde a presença de umheteroduplex em um agrupamento é detectada como um pico extra nocromatograma; (f) identificação do indivíduo mutante; e (g) seqüenciamentodo produto de PCR mutante. Métodos para TILLING são bem conhecido natécnica (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado porStemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

A mutagênese direcionada ao sítio pode ser usada para gerarvariantes de ácidos nucleicos OsLEA3a. Diversos métodos são disponívelpara se obter a mutagênese direcionada ao sítio; o mais comum sendo osmétodos com base na PCR (Current Protocols in Molecular Biology. WileyEds. www.4ulr.com/products/current protocols/index.html).

A evolução direcionada também podem ser usada para gerarvariantes de ácidos nucleicos OsLEA3a. Esta consiste de iterações deembaralhamento de DNA seguido pela triagem e/ou seleção apropriadas paragerar variantes de ácidos nucleicos OsLEA3 a ou porções destas quecodificam os polipeptídeos OsLEA3a ou homólogos ou porções destes tendouma atividade biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674):1151-4; Patentes US 5.811.238 e 6.395.547).

A ativação de T-DNA, TILLING, mutagênese direcionada aosítio e evolução direcionada são exemplos de tecnologias que permitem ageração de novos alelos e variantes OsLEA3a.

Os efeitos da invenção também podem ser produzidos usandoa recombinação homóloga, que permite a introdução em um genoma de umácido nucleico selecionado em uma posição selecionada definida. Arecombinação homóloga é uma tecnologia padrão usada rotineiramente naciência biológica para organismos inferiores tais como levedura ou o musgoPhyscomitrella. Os métodos para realizar a recombinação homóloga emplantas foram descritos não apenas para plantas modelo (Offringa et al.(1990) EMBO J 9(10): 3077-84) mas também para plantas de safra, porexemplo arroz (Terada et ai. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; Iida eTerada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8).

Um método preferido para introduzir uma modificaçãogenética (que neste caso não precisa ser no local de um gene OsLEA3 a) éintroduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico que codifica umpolipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo, como definido acima. Oácido nucleico a ser introduzido em uma planta pode ser um ácido nucleico detamanho natural ou pode ser uma porção ou uma seqüência de hibridizaçãocomo mais acima definido.

A invenção também fornece construções genéticas e vetorespara facilitar a introdução e/ou expressão das seqüências de nucleotídeo úteisnos métodos de acordo com a invenção.

Portanto, é fornecido uma construção de gene quecompreende:

(i) um ácido nucleico OsLEA3 a ou variante do mesmo, comoaqui definido acima;

(ii) uma ou mais seqüências de controle capazes de direcionara expressão da seqüência de ácido nucleico de (i),

contanto que o dito ácido nucleico OsLEA3a ou uma variantenão codifica a SEQ ID NO: 22 (proteína LEA3a de Hordeum vulgare).

Construções úteis nos métodos de acordo com a presenteinvenção podem ser construídas usando a tecnologia de DNA recombinantebem conhecida pelas pessoas habilitadas na técnica. As construções de genepodem ser inseridas em vetores, que podem ser comercialmente disponíveis,adequadas para a transformação em plantas e adequadas para a expressão dogene de interesse nas células transformadas. A invenção portanto fornece usode uma construção de gene como aqui definida acima nos métodos dainvenção.

As plantas são transformadas com um vetor que compreende aseqüência de interesse (isto é, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeoOsLEA3a ou homólogo do mesmo). O técnico habilitado está bem ciente doselementos genéticos que devem estar presentes no vetor de modo atransformar, selecionar e propagar com êxito as células hospedeiras contendoa seqüência de interesse. A seqüência de interesse está operavelmente ligada auma ou mais seqüências de controle (pelo menos a um promotor). Os termos"elemento regulatório", "seqüência de controle" e "promotor" são todasusadas aqui intercambiavelmente e devem ser interpretadas em um amplocontexto para se referir às seqüências de ácido nucleico regulatórias capazesde efetuar a expressão das seqüências às quais elas são ligadas. O termo"promotor" tipicamente refere-se a uma seqüência de controle de ácidonucleico localizada a montante do início transcricional de um gene e que estáenvolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outrasproteínas, direcionando deste modo a transcrição de um ácido nucleicooperavelmente ligado. Abrangidos pelos termos anteriormente mencionados6s uio as sequencias reguiauOuas uanscncioiiais uenvauas ue uni ^ciicgenômico eucariótico clássico (incluindo o TATA box que é requerido para oinício de transcrição preciso, com ou sem uma seqüência de CCAAT box) eelementos regulatórios adicionais (isto é, seqüências ativadoras, realçadores esilenciadores a montante) que alteram a expressão de gene em respostas aosestímulos desenvolvimentais e/ou externos ou em uma maneira específica detecido. Também incluído dentro do termo está uma seqüência regulatóriatranscricional de um gene procariótico clássico, em cujo caso a mesma podeincluir uma seqüência de -35 box e/ou -10 box seqüências regulatóriastranscricionais. O termo "elemento regulatório" também abrange umamolécula de fusão sintética ou derivado que confere, ativa ou realça aexpressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão.

O termo "operavelmente ligado" como aqui usado refere-se a uma ligaçãofuncional entre a seqüência promotora e o gene de interesse, tal que aseqüência promotora é capaz de iniciar a transcrição do gene de interesse.

Vantajosamente, qualquer tipo de promotor pode ser usadopara direcionar a expressão da seqüência de ácido nucleico. O promotor podeser um promotor indutível, isto é, tendo início de transcrição induzido ouaumentado em resposta a um estímulo químico, ambiental ou físico. Umexemplo de um promotor indutível é um promotor indutível por estresse, istoé, um promotor ativado quando uma planta é exposta a várias condições deestresse ou um promotor induzido por patógeno. Adicional oualternativamente, o promotor pode ser um promotor preferido de tecido, istoé, um que é capaz de preferencialmente iniciar a transcrição em certos tecidos,tais como as folhas, raízes, tecido de semente, etc; ou pode ser um promotorubíquo, que é ativo substancialmente em todos os tecidos ou células de umorganismo ou o promotor pode ser desenvolvimentalmente regulado, sendodeste modo ativo durante certos estágios de desenvolvimento ou em partes daplanta que sofrem as mudanças desenvolvimentais. Os promotores capazes deiniciar a transcnçao apenas em certos tecidos são aqui aludidos como"específicos de tecido", similarmente, promotores capazes de iniciar atranscrição em certas células apenas são aqui aludidos como "específicos decélula".

Os promotores adequados, que são funcionais em plantas, sãono geral conhecidos. Estes podem tomar a forma de promotores constitutivosou indutíveis. Os promotores adequados podem permitir a expressãoespecífica de desenvolvimento e/ou tecido em eucariotas multi-celulares;assim, os promotores de folha, raiz, flor, semente, estorna, tubérculo ou frutapodem ser vantajosamente usados em plantas.

Os promotores de planta diferentes utilizáveis em plantas sãopromotores tais como, por exemplo, o promotor USP, o LegB4, o DC3 ou opromotor da ubiquitina da salsa.

Um promotor "vegetal" compreende elementos regulatórios,que medeiam a expressão de um segmento de seqüência codificadora emcélulas vegetais. Conseqüentemente, um promotor vegetal não precisa ser deorigem vegetal, mas pode se originar de vírus ou micro-organismos, emparticular por exemplo de vírus que atacam as células vegetais.

O promotor "vegetal" também pode originar-se de uma célulavegetal, por exemplo, da planta que é transformada com a seqüência de ácidonucleico a ser expressada no processo inventivo e aqui descrito. Isto tambémse aplica a outros sinais regulatórios "vegetais", por exemplo em terminadores"vegetais".

Para a expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico,como descrito acima, deve ser ligada operavelmente a ou compreende umpromotor adequado que expressa o gene no ponto certo no tempo e em umamaneira específica de célula ou tecido. Os promotores utilizáveis sãopromotores constitutivos (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), talcomo aqueles que se originam de vírus vegetal, tal como 35S CAMV (Francket al, Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (ver também a US 5352605 e WO84/02913), 34S FMV (Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), opromotor da ubiquitina da salsa ou promotores vegetais tais como o promotorda subunidade pequena de Rubisco descrito na US 4.962.028 ou ospromotores vegetais PRPl [Ward et al, Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU,PGEL1, OCS [Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557],lib4, usp, mas [Cornai (1990) Plant Mol Biol 15 (3): 373-381], STLS1, ScBV(Schenk (1999) Plant Mol Biol 39(6): 1221-1230), B33, SADl ou SAD2(promotores do linho, Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696-1701) ounos [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846]. Outrosexemplos de promotores vegetais constitutivos são os promotores da V-ATPase da beterraba açucareira (WO 01/14572). Os exemplos de promotoresconstitutivos sintéticos são o promotor Super (WO 95/14098) e os promotoresderivados de G-boxes (WO 94/12015). Se apropriado, promotoresquimicamente indutíveis além disso também podem ser usados, comparar aEP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. A expressão constitutiva, estáveldas proteínas de acordo com a invenção uma planta pode ser vantajosa.Entretanto, a expressão indutível do polipeptídeo da invenção é vantajosa, se,por exemplo, uma expressão tardia antes da colheita é de vantagem, comomanipulação metabólica pode levar ao retardo do crescimento da planta.

A expressão de genes vegetais também pode ser facilitada porintermédio de um promotor quimicamente indutível (para uma revisão, verGatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Ospromotores quimicamente indutíveis são particularmente adequados quando édesejado expressar o gene em uma maneira específica de tempo. Os exemplosde tais promotores são um promotor indutível do ácido salicílico (WO95/19443), e promotor indutível do ácido abscísico (EP 335 528), umpromotor indutível de tetraciclina (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404), umpromotor indutível por ciclo-hexanol ou etanol (WO 93/21334) ou outroscomo aqui descrito.

Outros promotores adequados são aqueles que reagem comcondições de estresse biótico ou abiótico, por exemplo o promotor do genePRPl induzido por patógeno (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), o promotor hsp80 indutível por calor do tomate (US 5.187.267), opromotor da alfa-amilase indutível pelo congelamento da batata (WO96/12814) ou o promotor pinll indutível por ferimento (EP-A-O 375 091) ououtros como aqui descrito.

Os promotores preferidos são em particular aqueles que levamà expressão de gene em tecidos e órgãos, em células de semente, tais comocélulas do endosperma e células do embrião em desenvolvimento. Ospromotores adequados são o promotor do gene napin da colza(US 5.608.152), o promotor USP da Vicia faba (Baeumlein et al., Mol GenGenet, 1991, 225 (3): 459-67), o promotor oleosina da Arabidopsis (WO98/45461), o promotor da faseolina de Ptemeolus vulgaris (US 5.504.200), opromotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980), o promotor arc5 do feijão, opromotor DcG3 da cenoura ou o promotor B4 de Legumina (LeB4;Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9), e promotores querealizam a expressão específica de semente em plantas monocotilédones taiscomo milho, cevada, trigo, centeio, arroz e outros. Os promotores específicosde semente vantajosos são o promotor da proteína de ligação da sacarose (WO00/26388), o promotor da faseolina e o promotor napin. Os promotoresadequados que devem ser considerados são o promotor do gene lpt2 ou Iptlda cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), e os promotores descritos na WO99/16890 (promotores do gene hordeína da cevada, o gene da glutelina doarroz, o gene da orizina do arroz, o gene prolamina do arroz, o gene gliadinado trigo, o gene glutelina do trigo, o gene zeína do milho, o gene glutelina daaveia, o gene casirina do sorgo e o gene secalina do centeio). Outrospromotores adequados são Amy32b, Amy6-6 e Aleuraína [US 5.677.474],Bce4 (colza) [US 5.530.149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenolpiruvatocarboxilase (soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [WO 98/08962], isocitratoliase (colza) [US 5.689.040] ou α-amilase (cevada) [EP 781 849]. Outrospromotores que são disponíveis para a expressão de genes em plantas são ospromotores específicos de semente tais como aqueles descritos na DE-A19644478 ou promotores regulados por luz tais como, por exemplo, opromotor petE da ervilha.

Outros promotores vegetais adequados são o promotor FBPasecitossólico ou o promotor ST-LSI da batata (Stockhaus et al., EMBO J. 8,1989, 2445), o promotor da fosforribosilpirofosfato amidotransferase daGlycine max (Acesso no GenBank Ns U87999) ou o promotor específico denodo descrito na EP-A-O 249 676.

Preferivelmente, o ácido nucleico OsLEA3a ou variante domesmo é operavelmente ligado a um promotor constitutivo. Um promotorconstitutivo é transcricionalmente ativo durante a maioria, mas nãonecessariamente todas, das fases do seu crescimento e desenvolvimento e soba maioria das condições ambientais em pelo menos uma célula, tecido ouórgão. Um promotor constitutivo preferido é um promotor constitutivo quetambém é substancialmente ubiquamente expressado. Mais preferivelmente, opromotor constitutivo é derivado de uma planta, mais preferivelmente de umaplanta monocotilédone. O mais preferido é o uso de um promotor GOS2 (doarroz, como representado pela SEQ ID NO: 6). Deve estar claro que aaplicabilidade da presente invenção não está restrita ao ácido nucleicoOsLEA3a representado pela SEQ ID NO: 1, nem é a aplicabilidade dainvenção restrita à expressão de um ácido nucleico OsLEA3 a quandodirecionado por um promotor GOS2. Os exemplos de outros promotoresconstitutivos que também podem ser usados para direcionar a expressão deum ácido nucleico OsLEA3a são mostrados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Exemplos de promotores constitutivos

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Opcionalmente, uma ou mais seqüências terminadoras(também uma seqüência de controle) podem ser usadas na construçãointroduzida em uma planta. O termo "terminador" abrange uma seqüência decontrole que é uma seqüência de DNA na extremidade de uma unidadetranscricional que sinaliza o processamento 3' e a poliadenilação de umtranscrito primário e terminação de transcrição. O terminador pode serderivado do gene natural, a partir de uma variedade de outros genes vegetaisou a partir do T-DNA. O terminador a ser adicionado pode ser derivado, porexemplo, os genes da nopalina sintase ou octopina sintase ou alternativa deum outro gene vegetal ou menos preferivelmente de qualquer outro geneeucariótico. Os elementos regulatórios adicionais podem incluir realçadorestranscricionais assim como traducionais. Aqueles habilitados na técnica estaráciente de seqüências terminadoras e realçadoras que podem ser adequadaspara o uso na realização da invenção. Tais seqüências seriam conhecidas oupodem ser facilmente obtidos por uma pessoa habilitada na técnica.

Uma seqüência de intron também pode ser adicionada à regiãonão traduzida 5' (UTR) ou na seqüência codificadora para aumentar aquantidade da mensagem madura que acumula no citossol. A inclusão de umintron passível de união na unidade transcricional tanto nas construções deexpressão vegetal quanto animal foi mostrado para aumentar a expressão degene tanto ao nível de mRNA quanto de proteína até 1000 vezes, Buchman eBerg, Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987). Tal realce de intron da expressão de gene é tipicamente maiorquando colocado próximo à extremidade 5' da unidade de transcrição. O usodos introns do milho, os introns de Adhl-S 1, 2, e 6, o intron Bronze-I sãoconhecidos na técnica. Ver no geral, The Maize Handbook, Capítulo 116,Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Outras seqüências de controle (além do promotor, realçador,silenciador, seqüências de intron, regiões 3'-UTR e/ou 5'-UTR) podem serproteína e/ou elementos estabilizadores de RNA. Tais seqüências seriamconhecidas ou podem ser facilmente obtidas por uma pessoa habilitada natécnica.

As construções genéticas da invenção podem incluir aindauma seqüência de origem de replicação que é requerida para a manutençãoe/ou replicação em um tipo de célula específico. Um exemplo é quando umaconstrução genética é requerida ser mantida em uma célula bacteriana comoum elemento genético epissômico (por exemplo, molécula plasmídica oucosmídica). As origens preferidas de replicação incluem, mas não sãolimitadas à fl-ori e colEl.

Para a detecção e/ou seleção da transferência com êxito dasseqüências de ácido nucleico como representadas no protocolo de seqüência eusadas no processo da invenção, é vantajoso usar genes marcadores (= genesrepórter). Estes genes marcadores possibilitam a identificação de umatransferência bem sucedida das moléculas de ácido nucleico por intermédio deuma série de princípios diferentes, por exemplo por intermédio daidentificação visual com a ajuda da fluorescência, luminescência ou na faixade comprimento de onda de luz que seja discernível para o olho humano, poruma resistência a herbicidas ou antibióticos, por intermédio do que éconhecido como marcadores nutritivos (marcadores de auxotrofismo) oumarcadores antinutritivos, por intermédio de ensaios de enzima ou porintermédio de fito-hormônios. Os exemplos de tais marcadores que podem sermencionados são GFP (= proteína fluorescente verde); o sistema daluciferina/luciferase, a β-galactosidase com seus substratos coloridos, porexemplo X-Gal, as resistências a herbicida, por exemplo, a imidazolinona,glifosato, fosfinotricina ou sulfoniluréia, a resistência a antibiótico, porexemplo, a bleomicina, higromicina, estreptomicina, canamicina, tetraciclina,cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina oublasticidina, para mencionar apenas uns poucos, marcadores nutritivos taiscomo a utilização de manose ou xilose ou marcadores antinutritivos tais comoa resistência à 2-desoxiglicose. Esta lista representa apenas um pequenonúmero de marcadores possíveis. O trabalhador habilitado está muitofamiliarizado com tais marcadores. Os marcadores diferentes são preferidos,dependendo do organismo e do método de seleção.

Portanto, a construção genética pode opcionalmentecompreender um gene marcador selecionável. Como aqui usado, os termos"marcador selecionável" ou "gene marcador selecionável" incluem qualquergene que confere um fenótipo em uma célula na qual a mesma é expressadapara facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas outransformadas com uma construção de ácido nucleico da invenção. Osmarcadores adequados podem ser selecionados de marcadores que conferemresistência a antibiótico ou herbicida, que introduzem um novo traçometabólico ou que permitem a seleção visual. Os exemplos de genesmarcadores selecionáveis incluem genes que conferem resistência aosantibióticos (tais como nptll que fosforila a neomicina e a canamicina ou hpt,que fosforila a higromicina), aos herbicidas (por exemplo bar que forneceresistência a Basta; aroA ou gox que fornece resistência contra glifosato) ougenes que fornecem um traço metabólico (tal como manA que permite que asplantas usem manose como a única fonte de carbono). A expressão de genesmarcadores visuais resulta na formação de cor (por exemplo β-glicuronidase,GUS), luminescência (tal como luciferase) ou fluorescência (ProteínaFluorescente Verde, GFP, e seus derivados).

E conhecido que na integração estável ou transitória de ácidosnucleicos em células vegetais, que apenas uma minoria das células absorvemo DNA estranho e, se desejado, o integra dentro do seu genoma, dependendodo vetor de expressão usado e da técnica de transfecção usada. Paraidentificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcadorselecionável (como descrito acima, por exemplo de resistência a antibióticos)é usualmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene deinteresse. Os marcadores selecionáveis preferidos em plantas compreendeaqueles que conferem resistência a um herbicida tal como glifosato ouglifosinato. Outros marcadores adequados são, por exemplo, marcadores quecodificam genes envolvidos nos caminhos biossintéticos, por exemplo, deaçúcares ou aminoácidos, tais como β-galactosidase, ura3 ou ilv2. Marcadoresque codificam genes tais como luciferase, gfp ou outros genes defluorescência são igualmente adequados. Estes e os marcadores anteriormentemencionados podem ser usados em mutantes em que estes genes não sãofuncionais, por exemplo, visto que eles foram deletados pelos métodosconvencionais. Além disso, as moléculas de ácido nucleico que codificam ummarcador selecionável podem ser introduzidas em uma célula hospedeira nomesmo vetor que compreende a seqüência que codifica os polipeptídeos dainvenção ou usados no processo ou ainda em um vetor separado. As célulasque foram estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzidopodem ser identificadas por exemplo pela seleção (por exemplo, células queintegraram o marcador selecionável sobrevivem ao passo que as outras célulasmorrem).

Visto que os genes marcadores, particularmente genes para aresistência aos antibióticos e herbicidas, não são mais requeridos ou sãoindesejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucleicosforam introduzidos com êxito, o processo de acordo com a invenção paraintroduzir os ácidos nucleicos vantajosamente utiliza técnicas que permitem aremoção ou excisão destes genes marcadores. Um tal método é o que éconhecido como co-transformação. O método da co-transformação utilizadois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor carregando oácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo carregando o(s)gene(s) marcador(es). Uma proporção grande de transformantes recebe ou, nocaso de plantas, compreende (até 40 % dos transformantes e acima), ambos osvetores. Em caso de transformação com Agrobacteria, os transformantesusualmente recebem apenas uma parte do vetor, a seqüência flanqueada peloT-DNA, que usualmente representa o cassete de expressão. Os genesmarcadores subseqüentemente podem ser removidos da planta transformadapela realização de cruzamentos. Em um outro método, os genes marcadoresintegrados em um transposon são usados para a transformação junto com oácido nucleico desejado (conhecido como a tecnologia Ac/Ds). Ostransformantes podem ser cruzados com um recurso de transposase ou ostransformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico queconfere a expressão de uma transposase, transitoriamente ou estável. Emalguns casos (aprox. 10 %), o transposon salta do genoma da célulahospedeira uma vez que a transformação tenha ocorrido com êxito e éperdido. Em vários outros casos, o transposon salta para um local diferente.Nestes casos o gene marcador deve ser eliminado pela realização decruzamentos. Em microbiologia, técnicas foram desenvolvidas que tornampossível ou facilitam, a detecção de tais eventos. Um outro método vantajosoconta com o que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagemé que a eliminação pelo cruzamento pode ser dispensada. O sistema melhorconhecido deste tipo é o que é conhecido como o sistema Cre/lox. Crel é umarecombinase que remove as seqüências localizadas entre as seqüências IoxP.Se o gene marcador é integrado entre as seqüências IoxP, o mesmo éremovido uma vez que a transformação tenha ocorrido com êxito, pelaexpressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são o sistemaHIN/fflX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000:22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Umaintegração específica de sítio no genoma vegetal das seqüências de ácidonucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodostambém podem ser aplicados aos microorganismos tais como levedura,fungos ou bactérias.

A presente invenção também abrange plantas, partes de plantaou células vegetais obteníveis pelos métodos de acordo com a presenteinvenção. A presente invenção portanto fornece plantas obteníveis pelométodo de acordo com a presente invenção, plantas estas que têm introduzidonelas um ácido nucleico OsLEA3 a ou variante do mesmo, como definidoacima.

A invenção também fornece um método para a produção deplantas transgênicas tendo rendimento aumentado, que compreende aintrodução e a expressão em uma planta de um ácido nucleico OsLEA3 a ouuma variante do mesmo como definido acima.

Para os propósitos da invenção, "transgênico", "transgene" ou"recombinante" significam com respeito a, por exemplo, uma seqüência deácido nucleico, um cassete de expressão (= construção de gene) ou um vetorque compreende a seqüência de ácido nucleico ou um organismotransformado com as seqüências de ácido nucleico, cassetes de expressão ouvetores de acordo com a invenção, todas estas construções realizadas pelosmétodos recombinantes em que

a) as seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção,ou

b) as seqüências de controle genético que são operavelmenteligadas com a seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção, porexemplo um promotor, ou

c) a) e b)

não estão localizadas em seu ambiente genético natural ouforam modificadas pelos métodos recombinantes, sendo possível para amodificação tomar a forma, por exemplo, de uma substituição, adição,deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. Oambiente genético natural é entendido como significando o local genômico oucromossômico naturais na planta original ou a presença em uma bibliotecagenômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético naturalda seqüência de ácido nucleico é preferivelmente retido, pelo menos em parte.O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado etem um comprimento de seqüência de pelo menos 50 pares de base,preferivelmente pelo menos 500 pares de base, de modo especialmentepreferível pelo menos 1000 pares de base, o mais preferivelmente pelo menos5000 pares de base. Um cassete de expressão que ocorre naturalmente - porexemplo a combinação que ocorre naturalmente do promotor natural dasseqüências de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleicocorrespondente que codifica um polipeptídeo tendo domínios LEA 4 ou umhomólogo de tal polipeptídeo - torna-se um cassete de expressão transgênicoquando este cassete de expressão é modificado pelos métodos não naturais,sintéticos ("artificiais") tais como, por exemplo, o tratamento mutagênico. Osmétodos adequados são descritos, por exemplo, na US 5.565.350 ou WO 00/15815.

Uma planta transgênica para os propósitos da invenção éportanto entendida como significando, como acima, que os ácidos nucleicosusados no método da invenção não estão no seu local natural no genoma dadita planta, sendo possível para os ácidos nucleicos serem expressadoshomóloga ou heterologamente. Entretanto, como mencionado, transgênicotambém significa que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a invençãoou usados no método da invenção estejam na sua posição natural no genomade uma planta, a seqüência foi modificada com respeito à seqüência natural,e/ou que as seqüências reguladoras das seqüências naturais forammodificadas. Transgênico é preferivelmente entendido como significando aexpressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um local nãonatural no genoma, isto é, a expressão homóloga ou, preferivelmente,heteróloga dos ácidos nucleicos ocorre. As plantas transgênicas preferidas sãoaqui mencionadas.

As plantas hospedeiras para os ácidos nucleicos ou o vetorusado no método de acordo com a invenção, o cassete de expressão ouconstrução ou vetor são, em princípio, vantajosamente todas as plantas, quesão capazes de sintetizar os polipeptídeos usados no método da invenção.

Mais especificamente, a presente invenção fornece um métodopara a produção de plantas transgênicas tendo rendimento aumentado, métodoeste que compreende:

(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula vegetal umácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo; e

(ii) cultivar a célula vegetal sob condições que promovam ocrescimento e desenvolvimento da planta.

O ácido nucleico pode ser introduzido diretamente em umacélula vegetal ou na própria planta (incluindo a introdução em um tecido,órgão ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com umacaracterística preferida da presente invenção, o ácido nucleico épreferivelmente introduzido em uma planta pela transformação.

Os termos "introdução" ou "transformação" como aquialudidos abrangem a transferência de um polinucleotídeo exógeno em umacélula hospedeira, independente do método usado para transferência. O tecidovegetal capaz de propagação clonal subseqüente, seja pela organogênese ouembriogênese, pode ser transformado com uma construção genética dapresente invenção e uma planta inteira regenerada desta. O tecido particularescolhido variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis,e melhor adaptados, para a espécie particular que é transformada. Os alvos detecido exemplares incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédones,hipocótilos, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente(por exemplo, meristema apical, brotos axilares e meristemas de raiz), etecido meristemático induzido (por exemplo, meristema de cotilédone emeristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser transitória ouestavelmente introduzido em uma célula hospedeira e pode ser mantido nãointegrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, o mesmopode ser integrado no genoma hospedeiro. A célula vegetal transformadaresultante pode ser depois usada para regenerar uma planta transformada emuma maneira conhecida pelas pessoas habilitadas na técnica.

A transferência de genes estranhos no genoma de uma planta échamada de transformação. Fazendo-se isto, os métodos descritos para atransformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou célulasvegetais são utilizados para a transformação transitória ou estável. Ummétodo de transformação vantajoso é a transformação in planta. Para estafinalidade, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias atuem nassementes de planta ou inocular o meristema da planta com agrobactérias. Estetem se mostrado particularmente expediente de acordo com a invenção parapermitir que uma suspensão de agrobactérias transformadas atuem sobre aplanta intacta ou pelo menos sobre a flor primordial. A planta ésubseqüentemente cultivada até que as sementes da planta tratada sejamobtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Para selecionar plantastransformadas, o material vegetal obtido na transformação é, como uma regra,submetida às condições seletivas de modo que as plantas transformadaspossam ser distinguidas das plantas não transformadas. Por exemplo, assementes obtidas na maneira descrita acima podem ser plantadas e, depois deum período de cultivo inicial, submetidas a uma seleção adequada pelapulverização. Uma outra possibilidade consiste em cultivar as sementes, seapropriado depois da esterilização, em placas de ágar usando um agente deseleção adequado de modo que apenas as sementes transformadas podemcrescer em plantas. Outros métodos de transformação vantajosos, emparticular para as plantas, são conhecidos pelo técnico habilitado e são aquidescritos abaixo.

A transformação de espécies vegetais é agora uma técnicarazoavelmente de rotina. Vantajosamente, qualquer um de diversos métodosde transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em umacélula ancestral adequada. Os métodos de transformação incluem o uso delipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a captação deDNA livre, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeamento depistola de partícula, transformação usando vírus ou pólen e microprojeção. Osmétodos podem ser selecionados do método de cálcio/polietileno glicol paraprotoplastos (Krens, F. A. et ai., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et ai.(1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinjeção em material vegetal(Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeamentode partícula revestida de DNA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327:70) infecção com vírus (não integrativo) e outros. As plantas do arroztransgênicas são preferivelmente produzidas por intermédio da transformaçãomediada pela Agrobacterium usando qualquer um dos métodos bemconhecidos para a transformação de arroz, tais como descritos em qualquerum dos seguintes: Pedido de Patente Europeu EP 1198985 Al, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), divulgações estas quesão aqui incorporadas por referência como se completamente apresentadas.No caso de transformação de milho, o método preferido é como descrito emIshida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (PlantPhysiol 129(1): 13-22, 2002), divulgações estas que são aqui incorporadas porreferência como se completamente apresentadas. Os ditos métodos são aindadescritos por via de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for GeneTransfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos oua construção a serem expressados são preferivelmente clonados em um vetor,que seja adequado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por exemplopBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). As agrobactériastransformadas por um tal vetor podem ser depois usadas na maneiraconhecida para a transformação de plantas, em particular de plantas de safratais como, por via de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo banhando-se asfolhas esmagadas ou as folhas picadas em uma solução agrobacteriana edepois cultivando-as em meio adequado. A transformação de plantas por meiode Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hõfgen eWillmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia deF. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em TransgenicPlants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu5Academic Press, 1993, pp. 15-38.

No geral depois da transformação, as células vegetais ouagrupamentos de célula são selecionados quanto a presença de um ou maismarcadores que são codificados pelos genes expressáveis em planta co-transferidos com o gene de interesse, a seguir do que o material transformadoé regenerado em uma planta inteira.

Como mencionado, a Agrobacteria transformada com umvetor de expressão de acordo com a invenção também pode ser usada damaneira conhecida por si para a transformação de plantas tais como plantasexperimentais como Arabidopsis ou plantas de safra, tais como, cereais,milho, aveia, centeio, cevada, trigo, soja, arroz, algodão, beterraba açucareira,canola, girassol, linho, cânhamo, batata, tabaco, tomate, cenoura, pimentãosino, colza, tapioca, mandioca, araruta, tagetes, alfafa, alface e as váriasárvores, nozes, e espécies de videira, em particular plantas de safra quecontenham óleo tais como soja, amendoim, planta de mamona, girassol,milho, algodão, linho, colza, coco, dendê, cártamo (Carthamus tinctorius) oucacau, por exemplo banhando-se folhas escarificadas ou segmentos de folhaem uma solução agrobacteriana e subseqüentemente cultivando-as em meioadequado.

Além da transformação de células somáticas, que depois foramregeneradas em plantas intactas, também é possível transformar as células demeristemas vegetais e em particular aquelas células que desenvolvem emgametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimentoda planta natural, dando origem a plantas transgênicas. Assim, por exemplo,sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactéria e as sementes sãoobtidas das plantas em desenvolvimento das quais uma certa proporção étransformada e assim transgênica [Feldman, KA e Marks MD (1987). MolGen Genet 208: 274-289; Feldmann K (1992). Em: C Koncz, N-H Chua e JShell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapura,pp. 274-289]. Os métodos alternativos são fundamentados na remoçãorepetida das influorescências e incubação do sítio de excisão no centro daroseta com as agrobactérias transformadas, as sementes deste modotransformadas do mesmo modo podem ser obtidas em um ponto posterior notempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet,245: 363-370). Entretanto, um método especialmente eficaz é o método dainfiltração a vácuo com as suas modificações tais como o método da "imersãofloral". No caso da infiltração a vácuo de Arabidopsis, as plantas intactas sobpressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold,N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sei, 316: 1194-1199], enquanto que nocaso do método da "imersão floral" o tecido floral em desenvolvimento éincubado ligeiramente com uma suspensão agrobacteriana tratada comtensoativo [Clough, SJ und Bent, AF (1998). The Plant J. 16, 735-743]. Umacerta proporção de sementes transgênicas são coletadas em ambos os casos, eestas sementes podem ser distinguidas das sementes não transgênicascultivando-se sob as condições seletivas descritas acima. Além disso, atransformação estável de plastídeos é de vantagem porque os plastídeos sãomaternalmente herdados está a maioria das safras reduzindo ou eliminando orisco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma decloroplasto é no geral obtida por um processo que foi esquematicamentedemonstrado em Klaus et ai, 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229].Em resumo as seqüências a serem transformadas são clonadas junto com umgene marcador selecionável entre seqüências homólogas flanqueadoras para ogenoma de cloroplasto. Estes homólogos flanqueiam a integração deseqüências direcionados ao sítio específicas no plastoma. A transformaçãoplastídica foi descrita para muitas espécies de planta diferentes e uma vistageral é dada em Bock (2001) Transgenie plastids in basic research and plantbiotechnology. J Mol Biol. 21 de setembro de 2001; 312 (3): 425-38 ouMaliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastidtransformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Outros progressosbiotecnológicos foram recentemente reportados na forma de transformantesplastídicos isentos de marcador, que podem ser produzidos por um genemarcador co-integrado transitório (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology22(2), 225-229).

As células vegetais geneticamente modificadas podem serregeneradas por intermédio de todos os métodos com os quais o trabalhadorhabilitado está familiarizado. Os métodos adequados podem ser encontradosnas publicações mencionadas acima por S. D. Kung e R. Wu, Potrykus ouHõfgen e Willmitzer.

A seguir da transferência e regeneração de DNA, as plantasputativamente transformadas podem ser avaliadas, por exemplo usando aanálise de Southern, quanto a presença do gene de interesse, número de cópiae/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, os níveis deexpressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados usando aanálise de Northern e/ou Western, ambas as técnicas sendo bem conhecidaspelas pessoas tendo habilidade comum na técnica.

As plantas geradas transformadas podem ser propagadas poruma variedade de meios, tais como pela propagação clonal ou técnicas decruzamento clássicas. Por exemplo, uma planta transformada na primeirageração (ou TI) pode ser auto-polinizada e os transformantes da segundageração (ou T2) homozigóticos selecionados, e as plantas T2 podem serdepois propagadas ainda através das técnicas de cruzamento clássicas.

Os organismos transformados gerados podem tomar umavariedade de formas. Por exemplo, elas podem ser quimeras de célulastransformadas e células não transformadas; transformantes clonais (porexemplo, todas as células transformadas para conter o cassete de expressão);enxertos de tecidos transformados e não transformados (por exemplo, emplantas, um rizoma transformado enxertado a uma muda não transformada).

A presente invenção claramente estende-se a qualquer célulavegetal ou planta produzidas por qualquer um dos métodos aqui descritos, e atodas as partes de planta e propágulos desta. A presente invenção estende-seainda a abranger a progênie de uma célula, tecido, órgão ou planta inteiratransformada ou transfectada primária que tenha sido produzida por qualquerum dos métodos anteriormente mencionados, a única exigência sendo aquelaque a progênie exiba as mesmas características genotípicas e/ou fenotípicascomo aquelas produzidas pelo precursor nos métodos de acordo com ainvenção. A invenção também inclui células hospedeiras contendo um ácidonucleico OsLEA3a isolado ou variante do mesmo. As células hospedeiraspreferidas de acordo com a invenção são células vegetais. A invenção tambémestende-se às partes colhíveis de uma planta tais como, mas não limitados asementes, folhas, frutas, flores, hastes, culturas de haste, rizomas, tubérculos ebulbos. A invenção além disso diz respeito a produtos diretamente derivadosde uma parte colhível de uma tal planta, tais como pelotas secas ou pós, óleo,gordura e ácidos graxos, amido ou proteínas. Estes produtos tambémabrangem os metabólitos que estão presentes em níveis aumentados e que têmum valor econômico.

A presente invenção também abrange o uso de ácidosnucleicos OsLEA3a ou variantes destes e o uso de polipeptídeos OsLEA3a ouhomólogos destes.

Um tal uso diz respeito à melhora das características decrescimento de plantas, em particular na melhora do rendimento,especialmente rendimento de semente. O rendimento de semente pode incluirum ou mais dos seguintes: peso total aumentado de sementes, númeroaumentado de sementes cheias e número total aumentado de sementes.Os ácidos nucleicos OsLEA3 a ou variantes destes oupolipeptídeos OsLEA3 a ou homólogos destes podem encontrar uso emprogramas de cruzamento em que um marcador de DNA é identificado quepode ser geneticamente ligado a um gene OsLEA3a ou variante do mesmo.Os ácidos nucleicos/genes OsLEA3a ou variantes destes ou polipeptídeosOsLEA3a ou homólogos destes podem ser usados para definir um marcadormolecular. Este marcador de DNA ou proteína podem ser depois usados emprogramas de cruzamento para selecionar plantas tendo rendimentoaumentado. O gene OsLEA3a ou variante do mesmo, por exemplo, podem serum ácido nucleico como representado por qualquer uma das SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ IDNO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25,SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33.

As variantes alélicas de um ácido nucleico/gene OsLEA3atambém podem encontrar uso em programas de cruzamento assistidos pormarcador. Tais programas de cruzamento algumas vezes requerem aintrodução de variação alélica pelo tratamento mutagênico das plantas, usandopor exemplo a mutagênese EMS; alternativamente, o programa pode começarcom uma coleção de variantes alélicas da chamada origem "natural" causadasnão intencionalmente. A identificação de variantes alélicas então ocorre, porexemplo, pela PCR. Isto é seguido por uma etapa para a seleção de variantesalélicas superiores da seqüência em questão e que dá rendimento aumentado.A seleção é tipicamente realizada monitorando-se o desempenho decrescimento de plantas contendo variantes alélicas diferentes da seqüência emquestão, por exemplo, variantes alélicas diferentes de qualquer uma das SEQID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ IDNO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33.O desempenho de cultivo pode ser monitorado em uma estufa ou no campo.Outras etapas opcionais incluem cruzar plantas, em que a variante alélicasuperior foi identificada, com uma outra planta. Isto pode ser usado, porexemplo, para fabricar uma combinação de características fenotípicasinteressantes.

Um ácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo tambémpode ser usado como sondas para mapear genética e fisicamente os genes queeles são uma parte, e como marcadores para traços ligados àqueles genes. Talinformação pode ser útil no cruzamento de planta de modo a desenvolverlinhas com fenótipos desejados. Tal uso de ácidos nucleicos OsLEA3a ouvariantes destes requer apenas uma seqüência de ácido nucleico de pelomenos 15 nucleotídeos no comprimento. Os ácidos nucleicos OsLEA3a ouvariantes destes podem ser usados como marcadores de polimorfismos decomprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Sambrook J,Fritsch EF e Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) deDNA genômico vegetal digerido com restrição pode ser sondado com osácidos nucleicos OsLEA3a ou variantes destes. Os padrões de faixasresultantes podem ser depois submetidos à análise genética usando programasde computador tais como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) de modo a construir um mapa genético. Além disso, os ácidos nucleicospodem ser usados para sondar Southern blots contendo DNAs genômicostratados com endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos querepresentam precursor e progênie de um cruzamento genético definido. Asegregação dos polimorfismos de DNA é mencionada e usada para calcular aposição do ácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo no mapa genéticopreviamente obtido usando esta população (Botstein et al. (1980) Am. J.Hum. Genet. 32:314-331).

A produção e uso de sondas derivadas de gene vegetal para ouso no mapeamento genético estão descritos em Bernatzky e Tanksley (1986)Plant Mol. Biol. Repórter 4: 37-41. Numerosas publicações descrevem omapeamento genético de clones de cDNA específicos usando a metodologiaesboçada acima ou variações destas. Por exemplo, populações deintercruzamento F2, populações de retrocruzamento, populaçõesaleatoriamente acasaladas, linhagens quase isogênicas e outros conjuntos deindivíduos podem ser usados para o mapeamento. Tais metodologias são bemconhecidas por aqueles habilitados na técnica.

As sondas de ácido nucleico também podem ser usadas para omapeamento físico (isto é, colocação de seqüências em mapas físicos; verHoheisel et al. Em: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide,Academic press 1996, pp. 319-346, e referências aí citadas).

Em uma outra forma de realização, as sondas de ácidonucleico podem ser usadas no mapeamento da hibridização in situ defluorescência direta (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Emboraos métodos correntes de mapeamento FISH favoreçam o uso de clonesmaiores (diversos kb a diversas centenas de kb; ver Laan et al. (1995)Genome Res. 5: 13-20), melhorias na sensibilidade podem permitir odesempenho de mapeamento FISH usando sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos com base na amplificação de ácidonucleico para o mapeamento genético e físico pode ser realizada usando osácidos nucleicos. Os exemplos incluem a amplificação específica de alelo(Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96), polimorfismos de fragmentosamplificados pela PCR (CAPS; Sheffield et al (1993) Genomics 16: 325-332), ligação específica de alelo (Landegren et al (1988) Science 241: 1077-1080), reações de extensão de nucleotídeo (Sokolov (1990) Ácido NucleicoRes. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al. (1997) Nat. Genet.7: 22-28) e Happy Mapping (Dear e Cook (1989) Nucleic Acids Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a seqüência de um ácido nucleico é usadapara planejar e produzir pares de iniciador para o uso na reação deamplificação ou em reações de extensão de iniciador. O planejamento de taisiniciadores é bem conhecida por aqueles habilitados na técnica. Nos métodosque utilizam o mapeamento genético com base na PCR, pode ser necessárioidentificar diferenças de seqüência de DNA entre os precursores domapeamento cruzado na região correspondente à presente seqüência de ácidonucleico. Isto, entretanto, no geral não é necessário para os métodos demapeamento.

Os métodos de acordo com a presente invenção resultam emplantas tendo rendimento aumentado e perfis metabólicos alterados, comodescrito mais acima. Estas características de cultivo vantajosas tambémpodem ser combinadas com outros traços economicamente vantajosos, taiscomo outros traços que realçam o rendimento, tolerância a vários estresses,traços que modificam várias características de arquitetura e/ou característicasbioquímicas e/ou fisiológicas. O perfil metabólico alterado pode encontrar usocomo um modo alternativo para caracterizar plantas tendo rendimentoaumentado, plantas estas que são produzidas pelos métodos da presenteinvenção. O perfil metabólico alterado também pode ser usado como umaferramenta de diagnóstico ou como um biomarcador.

Descrição das figuras

A presente invenção será agora descrita com referência àsseguintes figuras em que:

A Fig. 1 mostra a estrutura de domínio típica de polipeptídeosOsLEA3a. A proteína codificada pela SEQ ID NO: 2 compreende doisdomínios LEA 4 (em itálicos); os motivos de aminoácido de 11-mer sãosublinhados. O domínio mais terminal C (em itálicos) é uma região de baixacomplexidade.

A Fig. 2 mostra um vetor binário p070, para a expressão emOryza sativa de uma seqüência codificadora OsLEA3a de Arabidopsisthaliana sob o controle de um promotor GOS2 (referência interna PROO129).

A Fig. 3 detalha exemplos de seqüências úteis na realizaçãodos métodos de acordo com a presente invenção. A SEQ ID NO: 1 e 2representa a seqüência codificadora OsLEA3a e a seqüência de proteínadeduzida. As SEQ ID NOs: 7 a 20 representam seqüências de outras proteínase seqüências codificadoras LEA3a do arroz, as SEQ ID NOs: 21 e 22 sãoseqüências de HVAl da cevada. As SEQ ID NOs: 4 e 5 são as seqüênciasiniciadoras usadas para a clonagem de OsLEA3a. As SEQ ID NOs: 23 a 34representam seqüências codificadoras e seqüências de proteína de homólogosde LEA3 de espécies que não de arroz. As SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36são variantes das SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 34 respectivamente. A SEQID NO: 3 representa a seqüência de assinatura de consenso.

A Fig. 4 representa uma tabela de identidade/similaridade deseqüência produzida com MATGAT (matriz BLOSUM62, penalidade deabertura de intervalo 11, penalidade de extensão de intervalo 1). Asidentidades de seqüência são dadas em negrito acima da diagonal, assimilaridades de seqüência são dadas abaixo da diagonal. As seqüências deproteína de tamanho natural foram usadas.

Exemplos

A presente invenção será agora descrita com referência aosseguintes exemplos, que são apenas por via de ilustração.

Manipulação de DNA: a menos que de outro modoestabelecido, as técnicas de DNA recombinantes são realizadas de acordocom protocolos padrão tais como aqueles descritos em Sambrook (MolecularCloning: a laboratory manual, 3a Edição Cold Spring Harbor LaboratoryPress, CSH, Nova Iorque, 2001) ou nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al.(1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols(www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html). Os materiais padrão emétodos para o trabalho molecular vegetal são descritos em Plant MolecularBiology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS ScientificPublications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).Exemplo 1: Clonagem de gene de OsLEA3a

O gene que codifica OsLEA3a de Oryza sativa foi amplificadousando-se a PCR como padrão uma biblioteca de cDNA de muda de Oryzasativa japonica cv Nipponbare (Invitrogen, Paisley, UK). Depois datranscrição reversa de RNA extraído das mudas, os cDNAs foram clonadosem pCMV Sport 6.0. O tamanho do inserto médio do banco foi de 1,5 kb, e onúmero original de clones foi de 1,59 χ IO7 cfu. O título original foideterminado ser 9,6 χ IO5 cfu/ml, depois de uma primeira amplificação de 6 χIO11 cfu/ml. Depois da extração de plasmídeo, 200 ng de padrão foram usadosem uma mistura de PCR de 50 μΐ. Os iniciadores prm06120 (sentido, sítioAttBl em itálico, códon de início em negrito: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcttc ccaccagga-3') (SEQ ID NO4) e prm06121 (reverso, complementares, sítio AttB2 em itálico, códon deparada em negrito: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaatcattcacggcgtctagt-3') (SEQ ID NO 5), que incluem os sítios AttB para a recombinaçãoGateway, foram usados para a amplificação pela PCR. A PCR foi realizadausando Hifi Taq DNA polimerase em condições padrão. Um fragmento dePCR do tamanho esperado foi amplificado e purificado também usandométodos padrão. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foidepois realizada, durante o que o fragmento de PCR recombina in vivo com oplasmídeo pDONR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway,um "clone de entrada", p06. Plasmídeo pDONR201 foi adquirido daInvitrogen, como parte da tecnologia Gateway®.

Exemplo 2: Construção de Vetor

O clone de entrada p06 foi subseqüentemente usado em umareação LR com p00640, um vetor de destinação usado para a transformaçãoem Oryza sativa. este vetor contêm como elementos funcionais dentro dasbordas de T-DNA: um marcador selecionável vegetal; um cassete deexpressão de marcador triável; e um cassete Gateway intencionado para arecombinação LR in vivo com a seqüência de interesse já clonada no clone deentrada. Um promotor GOS2 do arroz (SEQ ID NO: 6) para a expressãoconstitutiva (PR00129) foi localizado a montante deste cassete Gateway.

Depois da etapa de recombinação LR, o vetor de expressãoresultante, p07 (Figura 1), foi transformado na cepa de AgrobacteriumLBA4044 usando protocolos de choque térmico ou eletroporação. As colôniastransformadas foram cultivadas em meio YEP e selecionados pelosrespectivos antibióticos por dois dias a 28°C. Estas culturas de Agrobacteriumforam usadas para a transformação de planta descrita no Exemplo 3.

Outras cepas de Agrobacterium tumefaciens podem ser usadaspara a transformação em planta e são bem conhecidos na técnica. Osexemplos de tais cepas são C58C1 ou EHA105.Exemplo 3: Transformação VegetalTransformação no Arroz

A Agrobaeterium contendo o vetor de expressão foi usado paratransformar plantas de Oryza sativa. As sementes secas maduras do arrozjaponiea cultivar Nipponbare foram descascadas. A esterilização foi realizadapela incubação por um minuto em etanol a 70 %, seguido por 30 minutos em0,2 % de HgCl2, seguido por uma lavagem de 6 vezes 15 minutos com águadestilada estéril. As sementes estéreis foram depois germinadas em um meiocontendo 2,4-D (meio de indução de calo). Depois da incubação no escuro porquatro semanas, os calos embriogênicos, derivados de scutellum foramexcisados e propagados no mesmo meio. Depois de duas semanas, os calosforam multiplicados ou propagados pela subcultura no mesmo meio por mais2 semanas. Os pedaços de calo embriogênico foram sub-cultivados em meiofresco 3 dias antes do co-cultivo (para reforçar a atividade de divisão celular).

A cepa de Agrobaeterium LBA4404 contendo o vetor deexpressão foi usada para o co-cultivo. A Agrobaeterium foi inoculada emmeio AB com os antibióticos apropriados e cultivados por 3 dias a 28°C. Asbactérias foram depois coletadas e colocadas em suspensão em meio de co-cultivo líquido a uma densidade (OD6oo) de cerca de 1. A suspensão foi depoistransferida a uma placa de Petri e os calos imersos na suspensão por 15minutos. Os tecidos de calo foram depois manchados secos sobre um papel defiltro e transferidos para o meio de cultivo solidificado, meio de co-cultivo eincubado por 3 dias no escuro a 25°C. Os calos co-cultivados foramcultivados em meio contendo 2,4-D por 4 semanas no escuro a 28°C napresença de um agente de seleção. Durante este período, as ilhas de caloresistente que crescem rapidamente desenvolveram. Depois da transferênciadeste material a um meio de regeneração e incubação na luz, o pontencialembriogênico foi liberado e os brotos se desenvolveram nas quatro a cincosemanas seguintes. Os brotos foram excisados dos calos e incubados por 2 a 3semanas em um meio contendo auxina a partir do qual eles foram transferidospara o solo. Os brotos endurecidos foram cultivados sob alta umidade e diascurtos em uma estufa.

Aproximadamente 35 transformantes TO do arrozindependentes foram gerados para uma construção. Os transformantesprimários foram transferidos a partir de uma câmara de cultura de tecido parauma estufa. Depois de uma análise de PCR quantitativa para verificar o número de cópia do inserto de T-DNA, apenas as plantas transgênicas decópia única que exibe tolerância ao agente de seleção foram mantidas para acolheita da semente Tl. As sementes foram depois colhidas três a cinco mesesdepois do transplante. O método produziu transformantes de local único auma taxa de mais de 50 % (Aldemita e Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Transformação de milho

A transformação de milho {Zea mays) é realizada com umamodificação do método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6):745-50. A transformação é dependente de genótipo no milho e apenas osgenótipos específicos são passíveis de transformação e regeneração. Alinhagem inata Al88 (University of Minnesota) ou os híbridos com Al88como um precursor são boas fontes de material doador para a tansformação,mas outros genótipos também podem ser usados com êxito. As espigas sãocolhidas de planta de milho aproximadamente 11 dias depois da polinização(DAP) quando o comprimento do embrião imaturo é de cerca de 1 a 1,2 mm.Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefacienscontendo o vetor de expressão, e as plantas transgênicas são recuperadasatravés da organogênese. Os embriões excisados são cultivados em meio deindução de calo, depois meio de regeneração de milho, contendo o agente deseleção (por exemplo imidazolinona mas vários marcadores de seleção podemser usados). As placas de Petri são incubadas na luz a 25°C por 2 a 3 semanasou até que os brotos se desenvolvam. Os brotos verdes são transferidos decada embrião para o meio de enraizamento do milho e incubados a 25°C por 2a 3 semanas, até o desenvolvimento das raízes. Os brotos enraizados sãotransplantados para o solo na estufa. As sementes Tl são produzidas dasplantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contêm uma cópiaúnica do inserto de T-DNA.

Transformação do Trigo

A transformação de trigo é realizada com o método descritopor Ishida et ai. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. O cultivar Bobwhite(disponível da CIMMYT, México) é habitualmente usada na transformação.Os embriões imaturos são co-cultivados com Agrobacterium tumefacienscontendo o vetor de expressão, e as plantas transgênicas são recuperadasatravés da organogênese. Depois da incubação com Agrobaeterium, osembriões são cultivados in vitro no meio de indução de calo, depois meio deregeneração, contendo o agente de seleção (por exemplo imidazolinona masvários marcadores de seleção podem ser usados). As placas de Petri sãoincubadas na luz a 25°C por 2 a 3 semanas ou até que os brotos sedesenvolvam. Os brotos verdes são transferidos de cada embrião para o meiode enraizamento e incubados a 25 0C por 2 a 3 semanas, até que as raízes sedesenvolvam. Os brotos enraizados são transplantados para o solo na estufa.As sementes Tl são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância aoagente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.

Transformação de Soja

A soja é transformada de acordo com uma modificação dométodo descrito na patente da Texas A&M US 5.164.310. Diversasvariedades de soja comercial são passíveis de transformação por este método.O cultivar Jack (disponível da Illinois Seed Foundation) é habitualmenteusado para a transformação. As sementes de soja são esterilizadas para asemeadura in vitro. O hipocótilo, a radícula e um cotilédone são excisados demudas jovens de sete dias de idade. O epicótilo e o cotilédone remanescentesão ainda cultivados para desenvolver nodos axilares. Estes nodos axilares sãoexcisados e incubados com Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor deexpressão. Depois do tratamento de co-cultivo, os explantes são lavados etransferidos para meio de seleção. Os brotos regenerados são excisados ecolocados em um meio de alongamento de broto. Os brotos não mais longosdo que 1 cm são colocados em meio de enraizamento até que as raízes sedesenvolvam. Os brotos enraizados são transplantados para o solo na estufa.As sementes Tl são produzidas a partir de plantas que exibem tolerância aoagente de seleção e que contêm uma cópia única do inserto de T-DNA.Transformação de colza/canola

Os pecíolo cotiledonário e hipocótilos de mudas jovens de 5 a6 dias de idade são usados como explantes para cultura de tecido etransformados de acordo com Babic et ai. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188).O cultivar comercial Westar (Agriculture Canada) é a variedade padrão usadapara a transformação, mas outras variedades também podem ser usadas. Assementes de canola são esterilizadas na superfície para a semeadura in vitro.Os explantes de pecíolo de cotilédone com o cotilédone ligado são excisadosdas mudas in vitro, e inoculados com Agrobacterium (contendo o vetor deexpressão) pela imersão da extremidade do corte do explante de pecíolo nasuspensão bacteriana. Os explantes são depois cultivados por 2 dias em meioMSBAP-3 contendo 3 mg/l de BAP, 3 % de sacarose, 0,7 % de Phytagar a23°C, 16 horas de luz. Depois de dois dias de co-cultivo com Agrobacterium,os explantes de pecíolo são transferidos para o meio MSBAP-3 contendo 3mg/l de BAP, cefotaxime, carbenicilina ou timentina (300 mg/l) por 7 dias, edepois cultivados em meio MSBAP-3 com cefotaxime, carbenicilina outimentina e agente de seleção até a regeneração de broto. Quando os brotosestiverem com 5 a 10 mm no comprimento, eles são cortados e transferidospara o meio de alongamento de broto (MSBAP-0,5, contendo 0,5 mg/l deBAP). Os brotos de cerca de 2 cm no comprimento são transferidos para omeio de enraizamento (MSO) para a indução de raiz. Os brotos enraizados sãotransplantados para o solo na estufa. As sementes Tl são produzidas a partirde plantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém umaúnica cópia do inserto de T-DNA.

Transformação de Alfafa

Um clone de regeneração de alfafa (Medicago sativa) étransformado usando o método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119:839-847). A regeneração e transformação da alfafa é dependente do genótipoe portanto uma planta em regeneração é requerida. Os métodos para se obterplantas em regeneração foram descritos. Por exemplo, estes podem serselecionados do cultivar Rangelander (Agriculture Canada) ou qualquer outravariedade de alfafa comercial como descrito por Brown DCW e A Atanassov(1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Alternativamente, avariedade RA3 (University of Wisconsin) foi selecionada para o uso emcultura de tecido (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654-659). Os explantes depecíolo são co-cultivados com uma cultura durante a noite de Agrobacteriumtumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et ai, 1999 Plant Physiol 119: 839-847) ou LBA4404 contendo o vetor de expressão. Os explantes são co-cultivados por 3 dias no escuro em meio de indução SH contendo 288 mg/Lde Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2SO4, e 100 pm deacetossiringinona. Os explantes são lavados em meia concentração de meio deMurashige-Skoog (Murashige e Skoog, 1962) e plaqueados no mesmo meiode indução SH sem acetossiringinona mas com um agente de seleçãoadequado e antibiótico adequado para inibir o crescimento de Agrobacterium.Depois de várias semanas, os embriões somáticos são transferidos para meiode desenvolvimento BOÍ2Y não contendo nenhum dos reguladores decrescimento, nenhum dos antibióticos, e 50 g/L de sacarose. Os embriõessomáticos são subseqüentemente germinados em metade da concentração demeio de Murashige-Skoog. As mudas enraizadas foram transplantadas emvasos e cultivadas em uma estufa. As sementes Tl são produzidas a partir deplantas que exibem tolerância ao agente de seleção e que contém uma únicacópia do inserto de T-DNA.

Exemplo 4: Avaliação e resultados da expressão de OsLEA3a em arrozsob o controle do promotor GOS2 do arroz

Aproximadamente 15 a 20 transformantes do arroz TOindependentes foram gerados. Os transformantes primários foram transferidosde uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para crescimento ecolheita de semente TI. Cinco eventos, dos quais a progênie Tl segregou 3:1quanto a presença/ausência do transgene, foram retidos. Para cada um desteseventos, aproximadamente 10 mudas Tl contendo o transgene (hetero- ehomo-zigotos) e aproximadamente 10 mudas Tl carecendo do transgene(nulizigotos) foram selecionados pelo monitoramento da expressão demarcador visual. As plantas Tl selecionadas foram transferidas para umaestufa. Cada planta recebeu um rótulo de código de barras único para ligar demodo não ambíguo os dados de fenotipagem para a planta correspondente. Asplantas Tl selecionadas foram cultivadas em solo em vasos de 10 cm dediâmetro sob os seguintes cenários ambientais: fotoperíodo = 11,5 h,intensidade de luz do dia = 30.000 Iux ou mais, temperatura diurna = 28°C,temperatura noturna = 22°C, umidade relativa = 60 a 70 %. As plantastransgênicas e os nulizigotos correspondentes foram cultivados lado a ladonas posições aleatórias. Cuidado foi tomado para que as plantas não fossemsubmetidas a nenhum estresse. Do estágio de semeadura até o estágio dematuridade as plantas foram passadas diversas vezes através de uma cabina deformação de imagem digital. Em cada ponto de tempo imagens digitais (2048χ 1536 pixéis, 16 milhões de cores) foram tiradas de cada planta de pelomenos 6 ângulos diferentes.

A área acima do solo (correspondente à biomassa folhada) foideterminada pela contagem do número total de pixéis das partes da plantaacima do solo discriminadas do fundo. Este valor foi calculado em média paraas imagens tiradas no mesmo ponto de tempo dos ângulos diferentes e foiconvertido a um valor de superfície física expressado em mm quadrado pelacalibração. Os experimentos mostram que a área de planta acima do solomedido deste modo correlaciona-se com a biomassa de partes de planta acimado solo.

Os panículos primários maduros foram colhidos, ensacados,rotulados com código de barra e depois secados por três dias na estufa a 37°C.

Os panículos foram depois debulhados e todas as sementes coletadas. Ascascas cheias foram separadas das vazias usando um dispositivo de soprar ar.

Depois da separação, ambos os lotes de semente foram então contados usandouma máquina contadora comercialmente disponível. As cascas vazias foramdescartadas. As cascas cheias foram pesadas em uma balança analítica e aárea transversal das sementes foi medida usando a formação de imagemdigital. Este procedimento resultou no conjunto dos seguintes parâmetrosrelacionados com semente:O número de sementes cheias foi determinado contando-se onúmero de cascas cheias que permaneceram depois da etapa de separação. Orendimento de semente total (peso de semente total) foi medido pesando-setodas as cascas cheias colhidas de uma planta. O número de semente total porplanta foi medido contando-se o número de cascas colhidas de uma planta. OPeso por Mil Grãos (TKW) é extrapolado a partir do número de sementescheias contadas e seu peso total. O índice de colheita é definido como a razãoentre o peso de semente total e a área acima do solo (mm2), multiplicado porum fator de IO6. Estes parâmetros foram derivados em um modoautomatizado a partir das imagens digitais usando o software de análise deimagem e foram analisados estatisticamente. Os parâmetros de sementeindividuais (incluindo largura, comprimento, área, peso) foram medidosusando um dispositivo feito de encomenda consistindo de dois componentesprincipais, um dispositivo de pesagem e formação de imagem, ligado aosoftware para a análise de imagem.

Um ANOVA de dois fatores (análise da variação) corrigidoquanto ao planejamento desequilibrado foi usado como modelo estatísticopara a avaliação global de características fenotípicas vegetais. Um teste F foirealizado em todos os parâmetros medidos de todas as plantas de todos oseventos transformados com este gene. O teste F foi realizado para checarquanto a um efeito do gene em relação a todos os eventos de transformação epara verificar quanto a um efeito global do gene, também aqui chamado"efeito de gene global". Se o valor do teste F mostra que os dados sãosignificantes, então é concluído que existe um efeito de "gene", significandoque não apenas a presença ou a posição do gene está causando o efeito. Olimiar para significância para um efeito de gene global verdadeiro é ajustado a5 % de nível de probabilidade para o teste F.

Para checar quanto a um efeito dos genes dentro de um evento,isto é, para um efeito específico de linhagem, um teste t foi realizado dentrode cada evento usando conjuntos de dados das plantas transgênicas e dasplantas nulas correspondentes. As "plantas nulas" ou "segregantes nulos" ou"nulizigotos" são as plantas tratadas do mesmo modo como a plantatransgênica, mas da qual o transgene segregou. As plantas nulas tambémpodem ser descritas como as plantas transformadas negativas homozigotas. Olimiar para a significância para o teste t é ajustado a 10 % de nível deprobabilidade. Os resultados para alguns eventos podem estar acima ouabaixo deste limiar. Isto está fundamentado na hipótese de que um genepoderia apenas ter um efeito em certas posições no genoma, e que aocorrência deste efeito dependente de posição não é incomum. Este tipo deefeito de gene também é aqui chamado de um "efeito de linhagem do gene".O valor ρ é obtido comparando-se o valor t com a distribuição t oualternativamente, comparando-se o valor F com a distribuição F. O valor ρ dáentão a probabilidade de que a hipótese nula (isto é, que não existe nenhumefeito do transgene) esteja correta.

Os dados obtidos para OsLEA3a no primeiro experimentoforam confirmados em um segundo experimento com plantas T2. Quatrolinhagens que tiveram o padrão de expressão corrigido foram selecionadospara outra análise. Os lotes de semente das plantas positivas (tanto hetero-quanto homo-zigotos) em Tl5 foram tríadas monitorando-se a expressão domarcador. Para cada evento escolhido, os lotes de semente heterozigóticaforam depois retidos para a avaliação T2. Dentro de cada lote de semente umnúmero igual de plantas positivas e negativas foram cultivadas na estufa paraavaliação.

Um número total de 120 plantas OsLEA3 a transformadasforam avaliadas na geração T2, isto é 30 plantas por evento das quais 15positivas para o transgene e 15 negativas.

Porque dois experimentos com eventos sobrepostos foramrealizados, uma análise combinada foi realizada. Isto é útil para checar aconsistência dos efeitos sobre os dois experimentos, e se este for o caso, paraacumular evidência de ambos os experimentos de modo a aumentar aconfiança na conclusão. O método usado foi um método de modelo misto queleva em conta a estrutura de nível múltiplo dos dados (isto é, experimento -evento - segregantes). Os valores ρ são obtidos comparando-se a o teste darazão de probabilidade com as distribuições de qui-quadrado.

Exemplo 5: Avaliação de transformantes OsLEA3a: medição de parâmetrosrelacionados com o rendimento

Na análise das sementes como descrito acima, os inventoresverificaram que as plantas transformadas com a construção de gene OsLEA3 ativeram um rendimento de semente mais alto, expressado como número totalde sementes (11 % de aumento), número de sementes cheias (21 % deaumento) e peso total das sementes (25 % de aumento), comparados com asplantas que carecem do transgene OsLEA3 a.

Os resultados obtidos para as plantas na geração T1 estãoresumidos na Tabela 3:

Tabela 3:

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Estes resultados positivos foram mais uma vez obtidos nageração T2. Os dados de T2 foram re-avaliados em uma análise combinadacom os resultados para a geração T1, e os valores ρ obtidos mostraram que osefeitos observados foram altamente significantes.

Exemplo 6: Análise metabólica de plantas transformadas

As plantas transformadas com OsLEA3 a (como descrito noExemplo 1) foram cultivadas na estufa como descrito no Exemplo 4. Acomposição modificada de acordo com a invenção, com respeito a váriosmetabólitos, foi determinada pelos seguintes procedimentos.

a) Homogeneização das amostras

Dez a trinta grãos de arroz foram transferidos em tubosplásticos (Eppendorf, Safe-Lock, 2 ml) e homogeneizado com uma bola deaço inoxidável em um moinho de bolas (Retsch) sob esfriamento comnitrogênio líquido.

b) Liofilização

Durante o experimento, cuidado foi tomado para que asamostras permanecessem em um estado congelado profundo (abaixo de -40°C) ou fossem liberadas da água pela liofilização do materialhomogeneizado até o primeiro contato com solventes. As amostras foramtransferidas em um secador por congelamento pré-esfriado (-40 °C). Atemperatura inicial durante a fase de secagem principal foi de -35°C e apressão foi de 0,120 mbar. Durante o processo de secagem, os parâmetrosforam alterados, seguindo uma programa de pressão e temperatura. Atemperatura final depois de 12 horas foi de +3 O0C e a pressão final foi de0,001 a 0,004 mbar. No desligar da bomba de vácuo e da máquina derefrigeração, o sistema foi fluxado com ar (seco por intermédio de um tubo desecagem) ou argônio.

c) Extração

Imediatamente depois que o aparelho de liofilização foifluxado, os tubos com o material vegetal liofilizado foram firmemente seladopara proteger o material da umidade do ar. Para a extração, uma porção de 50mg de material vegetal homogeneizado seco foi pesada em tubos de extraçãode fibra de vidro e transferidos em cartuchos de extração de 5 ml dodispositivo ASE (Extrator com Solvente Acelerado ASE 200 comControlador de Solvente e software AutoASE (DIONEX)). As 24 posições deamostra de um dispositivo ASE (Extrator com Solvente Acelerado ASE 200com Controlador de Solvente e software AutoASE (DIONEX)) foramenchidas com amostras de planta, incluindo algumas amostras para o teste decontrole de qualidade.

As substâncias polares foram extraídas com aproximadamente10 ml de metanol/água (80/20, v/v) a 70°C e uma pressão de 140 bar, fase deaquecimento de 5 minutos, extração estática de 1 minuto. As substâncias maislipofílicas foram extraídas com aproximadamente 10 ml demetanol/diclorometano (40/60, v/v) a 70°C e uma pressão de 140 bar, fase deaquecimento de 5 minutos, extração estática de 1 minuto. As duas misturas desolvente foram reunidas nos mesmos tubos de vidro (tubos de centrífuga, 50ml, equipados com tampa de rosca e septo perfurável para o ASE(DIONEX)). A solução foi suplementada com padrões internoscomercialmente disponíveis, tais como ribitol, L-glicina-2,2-d2, L alanina-2,3,3,3-d4, metionina-d3, Arginina_(13C), Triptofano-d5, a-metilglicopiranosídeo metil nonadecanoato, undecanoato de metila,tridecanoato de metila, pentadecanoato de metila e nonacosanoato de metila.O extrato total foi misturado com 8 ml de água. O resíduo sólido da amostrade planta e a manga de extração foram descartados. O extrato foi agitado edepois centrifugado por 5 a 10 minutos no mínimo a 1400 g de modo aacelerar a separação de fase. 1 ml da fase de metanol/água sobrenadante("fase polar", incolor) foi removido para a análise cromatográfica a gás (GC),e 1 ml foi removido para a análise cromatográfica líquida (LC). O resto dafase de metanol/água foi descartado. Similarmente, 0,75 ml da fase orgânica("fase lipídica", verde escura) foi removido para a análise GC adicional e 0,75ml foi removido para a análise LC. Todas estas amostras foram evaporadasaté a secura usando um evaporador a vácuo de infravermelho IR Dancer(Hettich). A temperatura máxima durante o processo de evaporação nãoexcedeu 40°C. A pressão no aparelho foi de 10 mbar ou mais baixa.d) Processamento das fases lipídica e polar para a análise de LC/MS ouLC/MS/MS

O extrato lipídico e o extrato polar, que foram evaporados atéa secura, foram absorvidos na fase móvel para a análise de LC.e) Análise de LC-MSA parte LC foi realizada em um sistema de LC/MScomercialmente disponível da Agilent Technologies, USA. A partir dosextratos polares 10 μΐ foram injetados no sistema a uma razão de fluxo de 200μΐ/min. A coluna de separação (Reversed Pteme C18) foi mantida a 150Cdurante a cromatografia. Para os extratos lipídicos, 5 μΐ foram injetados nosistema a uma razão de fluxo de 200 μΐ/min. A coluna de separação (PtemeReverso C18) foi mantida a 30°C. A HPLC foi realizada com eluição degradiente. A análise espectrométrica de massa foi realizada em uminstrumento quadripolar triplo API 4000 da Applied Biosystems com a fontede pulverização iônica turbo. Para os extratos polares, o instrumento mediu nomodo de íon negativo no modo de varredura completa de 100 a 1000 amu; aopasso que para os extratos lipídicos o instrumento mediu no modo de íonpositivo no modo de varredura completa de 100-1000 amu.

f) Derivação da fase lipídica para a análise de GC/MS

Uma mistura de 140 μΐ de clorofórmio, 37 μΐ de ácidoclorídrico (37 % em peso de HCl em água), 320 μΐ de metanol e 20 μΐ detolueno foram adicionados ao extrato evaporado para a transmetanólise. Ovaso foi firmemente selado e aquecido por 2 horas a IOO0C5 sob agitação. Asolução foi subseqüentemente evaporada até que o resíduo foi completamentesecado. A metoximação dos grupos carbonila foi realizada pela reação comcloridreto de metoxiamina (5 mg/ml em piridina, 100 ml por 1,5 horas a60°C) em um vaso firmemente selado. 20 μΐ de uma solução de númeroímpar, ácidos graxos de cadeia reta (solução de cada 0,3 mg/ml de ácidosgraxos de 7 a 25 átomos de carbono e cada 0,6 mg/ml de ácidos graxos com27, 29 e 31 átomos de carbono em 3/7 (v/v) piridina/tolueno) foramadicionados como padrões de tempo. Finalmente, a derivação com 100 μΐ deN-metil-N-(trimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamida (MSTFA) foi realizada por30 minutos a 60°C, mais uma vez no vaso firmemente selado. O volume finalantes da injeção no GC foi de 220 μΐ.g) Derivação da fase polar para a análise GC/MS

A metoximação dos grupos carbonila foi realizada pela reaçãocom cloridreto de metoxiamina (5 mg/ml em piridina, 50 ml por 1,5 horas a60°C) em um vaso firmemente selado. 10 μΐ de uma solução de númeroímpar, ácidos graxos de cadeia reta (solução de cada 0,3 mg/ml de ácidosgraxos de 7 a 25 átomos de carbono e cada 0,6 mg/ml de ácidos graxos com27, 29 e 31 átomos de carbono em 3/7 (v/v) piridina/tolueno) foramadicionados como padrões de tempo. Finalmente, a derivação com 50 μΐ deN-metil-N-(trimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamida (MSTFA) foi realizada por30 minutos a 60°C, mais uma vez no vaso firmemente selado. O volume finalantes da injeção na GC foi de 110 μl.

h) Análise de GC-MS

O sistema GC-MS consistiu de um Agilent 6890 GC ligado aum Agilent 5973 MSD. Os autoamostradores foram CompiPal ou GCPal daCTC. Para a análise colunas de separação capilares comercialmentedisponíveis (30 m χ 0,25 mm χ 0,25 μηι) com fases estacionárias de poli-metil-siloxano diferentes contendo 0 % até 35 % de porções aromáticas foramusadas, dependendo do material de amostra e das frações da etapa deseparação de fase a serem analisados (por exemplo: DB-lms, HP-5ms, DB-XLB, DB-35ms, Agilent Technologies). Até 1 μΙ, do volume final foiinjetado sem separação e com um gradiente de temperatura de estufa de 70°Ca 340°C com taxas de aquecimento diferentes dependendo do material deamostra e fração da etapa de separação de fase, de modo a obter umaseparação cromatográfica suficiente e número de varreduras dentro de cadapico de analito. As condições de GC-MS padrão usuais, por exemplo fluxoconstante com nominal de 1 a 1,7 ml/min. e hélio como o gás de fase móvelforam usadas. A ionização foi feita pelo impacto de elétron com 70 eV,varredura dentro de uma faixa m/z de 15 a 600 com razões de varredura de2,5 a 3 varreduras/s e condições de sintonia padrão.i) Análise das várias amostras de planta

As amostras foram medidas em séries individuais de 20amostras de planta cada. Nos experimentos cada série conteve pelo menos 3réplicas por linhagem transgênica mais pelo menos 3 plantas da linhagem desegregante nulo respectivo como controles. As áreas de pico para cada analitoforam ajustadas para o peso seco estabelecido para a planta (áreanormalizada). Ps valores de razão foram calculados por outra normalizaçãoem relação ao controle. Nos experimentos, os valores de razão foramcalculados dividindo-se a área normalizada pela média dos dadoscorrespondentes do grupo de controle na mesma série. Os valores obtidos sãoaludidos como a razão_pelo_controle. Estes são comparáveis entre as séries eindicam quanto da concentração do analito na planta transgênica difere dogrupo de controle, que são as plantas das respectivas linhagens de segregantenulo em uma dada série. Os controles apropriados foram feitosantecipadamente para provar que o vetor e o próprio procedimento detransformação não tiveram nenhuma influência significante sobre acomposição metabólica das plantas.

Os resultados das diferentes análises de planta podem serobservados a partir da tabela 4 seguinte:

Tabela 4: Resultados da análise de sementes de transformantes OsLEA3a, arazão mínima e a razão máxima são em relação às plantas de controle

<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>

A coluna 2 mostra o metabólito analisado, a coluna 1 dá aclasse metabólica à qual o metabólito pertence. As colunas 3 e 4 mostram arazão mínima e máxima, da qual a faixa de aumento ou diminuição dometabólito analisado como encontrado em experimentos independentes entreas plantas transgênicas e suas linhagens de controle segregantes nulasrespectivas do tipo selvagem pode ser derivada. A coluna 4 indica o métodoanalítico (Cromatografia Gasosa ou Cromatografia Líquida). A tabela mostraque os valores da razão_pelo_controle dentro do grupo de aminoácidos podevariar entre 0,7 e 7,7; dentro do grupo de carotenóides entre 1,8 e 19,3; dentrodo grupo de cofatores entre 1,3 e 1,5; dentro do grupo de ácidos graxos emetabólitos relacionados entre 0,3 e 0,9; dentro do grupo de ácidos orgânicosentre 1,4 e 20,0; dentro do grupo de fenólicos entre 1,4 e 8,5; dentro do grupode fito-hormônios e fitosteróis entre 1,0 e 10,9; dentro do grupo demetabólitos do açúcar entre 0,5 e 7,1, dentro do grupo de tocoferol emetabólitos relacionados entre 0,3 e 4,2.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas tendo rendimento aumentado e método para fabricar asmesmas

<130> PF57950

<150> EP 05108483.8

<151> 15-09-2005

<150> US 60/717.738

<151> 19-09-2005

<160> 36

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 603

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggcttccc

gagaaggcgg

gcgtcggagg

gagaaggcgc

acctccagca

ggcttcctcg

gccaagcaga

gacaagaccg

gccaaggacg

ggcgccaaca

tag

accaggaccaggcaggtgatcggcggggcaaggcggcgaacgtcgcaggcgcgagaagacagaccgccgagcagcgtcctcggtgatgagaggacacctc

ggctagctacgggggcgagccgccgccggcggagagggcgggcgagggaccgagcaggccgacggcgcagccaacaggcgcacgctggggtgccaccgcc

cgcgccggcgaaggacaaggaaggggcaggtcggagacggaaagccgccgaagcagaaggtacaccaaggagtgagcaggatgaccgaaggccgccacgg

agaccaaggccgagcgaggcataccaaggacgcaggcggcagagcaaggaccgccgagacactctgccattgaagagcacacgaggccggagacgacggc

ccacaccgaggaaggacaggggcgacgaaggaaggacaagccagaccggccgctggcgcccgccggcaagggtggtcggccaccgacgacgagggatcac

60120180240300360420480540600603

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys15 10 15

Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp

20 25 30

Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala

35 40 45

Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Gln

50 55 60

Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys65 70 75 80

Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys

85 90 95

Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln

100 105 110

Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Ala Glu Thr

115 120 125

Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly

130 135 140

Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly145 150 155 160

Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala165 170 175Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala

180 185 190

Thr Glu Thr Thr Ala Arg Asp His195 200

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> motivo

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> /substitui = "Thr" /substitui = "Ala" /substitui = "Lys"<220>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(3)

<223> /substitui = "Glu" /substitui = "Asp"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(5)

<223> /substitui = "Thr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> /substitui = "Lys"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7)..(7)

<223> /substitui = "Gln" /substitui = "Glu"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8) .. (8)

<223> /substitui = "Arg"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(10)

<223> /substitui = "Gly" /substitui = "Tyr"

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> /substitui = "Gly"

<4 00> 3

Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu15 10

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> iniciador: prm06118

<400> 4

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggc ttcccaccag ga 52

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador: prm06119

<400> 5

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta aatcattcac ggcgtctagt

<210> 6

<211> 2193

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 6

aatccgaaaa

aaatataaaa

catccaccta

tttccttagt

tctgtcatga

aaaaaatctt

atgaagatat

ttgtgcattc

ttagtaatta

gtacttacgc

tcaactagca

tgaattcaag

aattttacag

aaaaaaagaa

acagagtggc

tccgcaacaa

aaccaagcat

ggaggcatcc

cgaccgcctt

cacctcctcc

tgtagtacgg

gatttgggat

ggttttcaat

gattttgtga

aataaaagta

ctatcctttg

atgagattga

acagtagtcc

cctgttcttc

ctttctggtt

gctgtagttc

tttctgatct

attatttttt

tgtcctcaat

cctgtagaag

agctgtaatc

tggtgtagct

<210> 7<211> 968<212> DNA

gtttctgcactgagaccttactttagtggcaattaagtggagttaaattatctagctgaatctgaacgtagtcatatcgcaagacaattgacacactttgacacatctctcactccaccaaatagcatgattttgctcgttgcccacagaccttttaacacctcctcctcaagccaagaacttcgatccatcacagggtagcgttgatgtagaggggttccgtctggagagtaccttttgcggttgtttgtttattccctatgattgattccatcacgaacgatttgcttcagttcaatgagttaataggccatttttaattattagctctttgttttcatttctttttggggatagttatgccactttc

cgttttcacctatatgtagcaatcgggctagaaaatgaaattcgaggtagctcaatgggtttggcaaagaacatcattaaacttattttttgctcatgtgaatatcactctcaccagaccaaagtatgaagcgcgagcgcacaacccacagcaggctttgccatctataagagggagagctatcttccggtgtgcccttctaggaaagggttgatgttgcgctctatggatttgaggtaagtcctcgattattgaacaaacttaagcctgattcatggaatagtcccagaaattgattgctaatacccctttatatgaaatcaccccttcaattcacatcgttattcctttactgcttgtaccagcaaag

ccctaactaagctgataactaataaaaaagtcattattgcccataattgtaaagagagagtttaaacataggacatgtctattatttatccatgtgtgaggcctatttaaacttttaataacgaactattcaatctcccaaaaaacgatgcggccaggagattcctccccaccaaggacatcgagttcttggttgttcttgatctgtatcatgttatcggaatgaaatggaatcagagcactggtagtgaaataatccaatccaaaatttacagttataaattttttttctacaaataatatagtttagttgaactgtagattattctgagattatctatgactgcttgatcttatgattttc

caatatagggagaactatgcagtcgctacattagaatatacatcaaactcattttttttataattatatatactccatccttttttcgattgcacctccttacatttaggatatctaaaataggtttttctattgggcacatctaacggaagaggaggagccttttcccccgcgactagcggtcgatctcggatttattgtgtgatgattttcggtttgatttagggtacccggtgattttgcttctcgactttgaagaccgcagctggctcctcaggaaccaaatatctgcttttatagcaggagaagacataagcagtgctgaaagtcgcattatcctttacagaaagcatttccttt

aacgtgtgctaagaaaaactctagtttcgtcgttcacatcttcttgaataaaaaaatagaattttatagtcaatttttattagatgcaagcaatacacgttagcaatatctacaaaaaatacatacaaaaacaggcaacaggacagcaagaggcaaagaatctctatataagaagccgagttccctcctcttctaggttgcctgttcttgttagtagtatggaatcttgctgcttggtgttttgacgaagggtcccgttgttgtttagatcaggggattctaaaaagtcacgttatcctaacttatccgaattcatttggtggcatgaaccttgtatctaaaatttatgagtgcagttct

60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602193<213> Oryza sativa<400> 7

agccagtgca aatctgatcg atcaaggtaa tcgagcaaaa tccatcagag ttctaacatt 60

cgcgcgtgaa tttcgaggtt aatttttgaa gcttaggatc aatggcttcc caccaggacc 120

aggctagcta ccgcgccggc gagaccaagg cccacaccga ggagaaggcg gggcaggtga 180

tgggggcgag caaggacaag gcgagcgagg cgaaggacag ggcgtcggag gcggcggggc 240

acgccgccgg caaggggcag gataccaagg aggcgacgaa ggagaaggcg caggcggcga 300

aggagagggc gtcggagacg gcgcaggcgg cgaaggacaa gacctccagc acgtcgcagg 360

cggcgaggga caaagccgcc gagagcaagg accagaccgg cggcttcctc ggcgagaaga 420

ccgagcaggc caagcagaag gccgccgaga ccgctggcgc cgccaagcag aagaccgccg 480

agacggcgca gtacaccaag gactctgcca tcgccggcaa ggacaagacc ggcagcgtcc 540

tccaacaggc gagtgagcag gtgaagagca cggtggtcgg cgccaaggac gcggtgatga 600

gcacgctggg gatgaccgaa gacgaggccg gcaccgacga cggcgccaac aaggacacct 660

ctgccaccgc cgccgccgcg gagacgacgg cgagggatca ctagacgccg tgaatgattt 720

ccctttgggt ctatttatgt atgttttcac ttcaaattcg gtgcaagttt gaatttgttt 780

ttgtgtcgtt ttgagtctgt atcgatgctg tatgaagtgg tggtcgtcgc aggggaggat 840

ttctgacggg tgtgggtgat gtgtactgat gatgttcagt tgttttcgtc agagtttctc 900

gtctgtgttc tgtttattat ggcgtaacaa taataaaagt ttgggcctaa agcccgcatt 960

tgtggttt 968

<210> 8

<211> 200

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<4 00> 8Met Ala1

Ala His

Lys Ala

Ala Gly

50Ala Ala65

Thr Ser

Asp Gln

Lys Ala

Ala Gln130Ser Val145

Ala LysGly ThrAla Glu

Ser

Thr

Ser

35

Lys

Lys

Ser

Thr

Ala115Tyr

Leu

Asp

Asp

Thr195

His

Glu20

Glu

Gly

Glu

Thr

Gly100Glu

Thr

Gln

Ala

Asp180Thr

Gln5

Glu

Ala

Gln

Arg

Ser

85

Gly

Thr

Lys

Gln

Val165Gly

Ala

Asp

Lys

Lys

Asp

Ala

70

Gln

Phe

Ala

Asp

Ala150Met

Ala

Arg

Gln

Ala

Asp

Thr

55

Ser

Ala

Leu

Gly

Ser135Ser

Ser

Asn

Asp

Ala Ser Tyr10

Gly Gln Val25

Arg Ala Ser40

Lys Glu Ala

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<210> 9

<211> 966

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 9

gatcaagata atcgagcaaa atccatcaga gttctaacat tcgcgcgtga atttcgaggt 60

taatttttga agcttaggat caatggcttc ccaccaggac caggctagct accgcgccgg 120

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ggataccaag gaggcgacga aggagaaggc gcaggcggcg aaggagaggg cgtcggagac 300

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ggagacgacg gcgagggatc actagacgcc gtgaatgatt tccctttggg tctatttatg 720

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<210> 10

<211> 200

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<213> Oryza sativa

<4 00> 10Met Ala Ser1

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Gly160Ala

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<210> 11

<211> 603

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 11

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cgcgccggcgaaggacaaggaaggggcaggtcggagacggaaagccgccgaagcagaaggtacaccaaggagtgagcaggatgaccgaag

agaccaaggccgagcgaggcataccaaggacgcaggcggcagagcaaggaccgccgagacactctgccattgaagagcacacgaggccgg

ccacaccgaggaaggacaggggcgacgaaggaaggacaagccagaccggccgctggcgcccgccggcaagggtggtcggccaccgacgac

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<210> 12<211> 200 <212> PRT <213> Oryza sativa <4 00> 12 Met Ala Ser His Gln Asp Gln Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala His Thr Glu Glu Lys Ala Gly Gln Val Met Gly Ala Ser Lys Asp 20 25 30 Lys Ala Ser Glu Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Ala Ala Gly His Ala 35 40 45 Ala Gly Lys Gly Gln Asp Thr Lys Glu Ala Thr Lys Asp Lys Ala Gln 50 55 60 Ala Ala Lys Asp Arg Ala Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys65 70 75 80Thr Ser Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg Asp Lys Ala Ala Glu Ser Lys 85 90 95 Asp Gln Thr Gly Gly Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Gln Ala Lys Gln 100 105 110 Lys Ala Ala Glu Thr Ala Gly Ala Ala Lys Gln Lys Thr Pro Glu Thr 115 120 125 Ala Gln Tyr Thr Lys Asp Ser Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly 130 135 140 Ser Val Leu Gln Gln Ala Ser Glu Gln Val Lys Ser Thr Val Val Gly145 150 155 160Ala Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly Met Thr Glu Asp Glu Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Asp Gly Ala Asn Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala 180 185 190 Thr Glu Thr Thr Ala Arg Asp His 195 200 <210> 13

<211><212>

996DNA

<213> Oryza sativa

<400> 13

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gcaagagcatcgtagtttcaaggaacgggcgcatgatgggcggggcgcgcagaccaaggaccggccgcgcatgccaaggaccgggcagacgcgccgcgcatccagcaggcacacgctcggcctacaagcctttggcactgcgacgtgttctccatggaggagttggttaa

ccgtattaacgttcgtgtgttagctaccaccacggcgcaggatgggcaggcgcgaccaagcatggacaagcagggcggctcgggagctacgtacgccaagaggggagcaggatgtcaggctggaactgggatgccaaagtggtgtcacacgccagtgtgggacctg

cagccttttgtggtgagtgagccggcgagagagaaggcgcggacacggcggagaaggcgtggccgcggcggacacggcgcattggacagagagaccgcgagtgaagagcggataacaagaagtgactaccgtacgtgttgtttggtttttaggtcaatgt

agacttgagattccagccaaccaaggcccagggaggccaaccaaggaggcacgaggcaaaccgcgggcgcagtccgccgcccgccgaggctcgccggcaatggcggtgggacaacgccgcagtaatacggtatcctctttcagttgtgctttaagctttc

60120180240300360420480540600660720780840900960996

<210> 14<211> 215<212> PRT<213> Oryza sativa <400> 14 Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala His Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu 20 25 30 Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala 35 40 45 Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr 50 55 60 Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala65 70 75 80Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Gly Ala Ala 85 90 95 Gly Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp 100 105 110 Thr Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr 115 120 125 Gly Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala 130 135 140 Gly Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys145 150 155 160Thr Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Gln Val Lys Ser Val Ala 165 170 175 Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr Thr Leu Gly Met Ser Gly Asp 180 185 190 Asn Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro 195 200 205 Gly Thr Gly Ser Asp Tyr Gln 210 215

<210> 15

<211> 1006

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 15

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accagcctttgttggtgagtacgccggcgaaggagaaggcggggacacggaggagaaggcagggccgcggctgacacggcacattggacaaggagaccgcaggtgaagaggcgataacaaggagtgactagtgtacgtgtactttggtttggaggtcaatagcgtt

tgagacttgagattccagccgaccaaggccgcgggaggcccgccaaggaggtacgaggcacgccgcgggcgcagtccgccgaccgccgaggatcgccggccgtggcggtggaacaacgccccagtaatactgtatcctctttcagttgtggtttaagctt

601201802403003604204805406006607207808409009601006

<210> 16

<211> 215

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<4 00> 16

Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu 20 25 30 Lys Ala Arg 35 Glu Ala Lys Asp Thr 40 Ala Ser Asp Ala Ala 45 Gly Arg AlaMet Gly 50 Arg Gly His Gly Ala 55 Lys Glu Ala Thr Lys 60 Glu Lys Ala TyrGlu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala65 70 75 80Ala Ser Asp Ala Thr 85 Gly Arg Ala Met Asp 90 Lys Gly Arg Gly Ala 95 AlaGly Ala Thr Arg 100 Asp Lys Ala Tyr Asp 105 Ala Lys Asp Arg Ala 110 Ala AspThr Ala Gln 115 Ser Ala Ala Asp Arg 120 Ala Arg Asp Gly Ala 125 Gly Gln ThrGly Ser 130 Tyr Ile Gly Gln Thr 135 Ala Glu Ala Ala Lys 140 Gln Lys Ala AlaGly Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys145 150 155 160Thr Gly Ala Val Leu 165 Gln Gln Ala Gly Glu 170 Gln Val Lys Ser Val 175 AlaVal Gly Ala Lys 180 Asp Ala Val Met Tyr 185 Thr Leu Gly Met Ser 190 Gly AspAsn Lys Asn 195 Asn Ala Ala Ala Gly 200 Lys Asp Thr Ser Thr 205 Tyr Lys ProGly Thr 210 Gly Ser Asp Tyr Gln 215

<210> 17

<211> 648

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 17

atggcttctc agcaggaacg ggctagctac cacgccggcg agaccaaggc ccgcgccgag 60

gagaagacgg ggcgcatgat gggcacggcg caggagaagg cgcgggaggc caaggacacg 120

gcgtccgacg ccgcggggcg cgcgatgggc aggggacacg gcgccaagga ggcgaccaag 180

gagaaggcgt acgagaccaa ggacgcgacc aaggagaagg cgtacgaggc aaaggacgcg 24 0

gcctccgacg ccaccggccg cgccatggac aagggccgcg gcgccgcggg cgccacgagg 300

gacaaggcgt acgatgccaa ggacagggcg gctgacacgg cgcagtccgc cgccgaccgc 360

gcccgcgacg gcgccgggca gaccgggagc tacattggac agaccgccga ggccgccaag 420

cagaaagcgg ccggcgccgc gcagtacgcc aaggagaccg cgatcgccgg caaggacaag 480

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gacgcggtga tgtacacgct cgggatgtca ggcgataaca agaacaacgc cgctgccggc 600

aaggacacca gcacctacaa gcctggaact gggagtgact accagtaa 648

<210> 18<211> 215<212> PRT

<213> Oryza sativa <400> 18 Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu 20 25 30 Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala 35 40 45 Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr 50 55 60 Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala65 70 75 80Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Gly Ala Ala85 90 95 Gly Ala Thr Arg 100 Asp Lys Ala Tyr Asp 105 Ala Lys Asp Arg Ala 110 Ala AspThr Ala Gln 115 Ser Ala Ala Asp Arg 120 Ala Arg Asp Gly Ala 125 Gly Gln ThrGly Ser 130 Tyr Ile Gly Gln Thr 135 Ala Glu Ala Ala Lys 140 Gln Lys Ala AlaGly Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys145 150 155 160Thr Gly Ala Val Leu 165 Gln Gln Ala Gly Glu 170 Gln Val Lys Ser Val 175 AlaVal Gly Ala Lys 180 Asp Ala Val Met Tyr 185 Thr Leu Gly Met Ser 190 Gly AspAsn Lys Asn 195 Asn Ala Ala Ala Gly 200 Lys Asp Thr Ser Thr 205 Tyr Lys ProGly Thr 210 Gly Ser Asp Tyr Gln 215

<210> 19

<211> 978

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<4 00> 19

aagaggcaag agcatccgta ttaaccagcc ttttgagact tgagagtgtg tgtgactcga 60

tccagcgtag tttcagttcg tgtgttggtg agtgattcca gccaagtttg cgatggcttc 120

tcagcaggaa cgggctagct accacgccgg cgagaccaag gcccgcgccg aggagaagac 180

ggggcgcatg atgggcacgg cgcaggagaa ggcgcgggag gccaaggaca cggcgtccga 240

cgccgcgggg cgcgcgatgg gcaggggaca cggcgccaag gaggcgacca aggagaaggc 300

gtacgagacc aaggacgcga ccaaggagaa ggcgtacgag gcaaaggacg cggcctccga 360

cgccaccggc cgcgccatgg acaagggccg cgccgcgggc gccacgaggg acaaggcgta 420

cgatgccaag gacagggcgg ctgacacggc gcagtccgcc gccgaccgcg cccgcgacgg 480

cgccgggcag accgggagct acattggaca gaccgccgag gccgccaagc agaaagcggc 540

cggcgccgcg cagtacgcca aggagaccgc gatcgccggc aaggacaaga ccggcgccgt 600

gctccagcag gcaggggagc aggtgaagag cgtggcggtg ggggcgaagg acgcggtgat 660

gtacacgctc gggatgtcag gcgataacaa gaacaacgcc gctgccggca aggacaccag 720

cacctacaag cctggaactg ggagtgacta ccagtaatac ggtagaagaa gcatgtgtcg 780

tctttggcac tgatgccaaa gtgtacgtgt tgtatcctct tttttaagtt tcagctcgac 840

ttcgacgtgt tcggtgtcac actttggttt ttcagttgtg ctcaactgtt catgtttctg 900

gttccatgga gggccagtgt ggaggtcaat gtttaagctt tcgttttaaa atctgataat 960

aaagttggtt aagacctg 978

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<4 00> 20

Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys15 10 15

Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly Arg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu

20 25 30

Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr Ala Ser Asp Ala Ala Gly Arg Ala

35 40 45

Met Gly Arg Gly His Gly Ala Lys Glu Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr

50 55 60

Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Lys Asp Ala65 70 75 80

Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Lys Gly Arg Ala Ala Gly

85 90 95

Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Thr

100 105 110

Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr Gly115 120 125

Ser Tyr 130 Ile Gly Gln Thr Ala 135 Glu Ala Ala Lys Gln 140 Lys Ala Ala GlyAla Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ile Ala Gly Lys Asp Lys Thr145 150 155 160Gly Ala Val Leu Gln 165 Gln Ala Gly Glu Gln 170 Val Lys Ser Val Ala 175 ValGly Ala Lys Asp 180 Ala Val Met Tyr Thr 185 Leu Gly Met Ser Gly 190 Asp AsnLys Asn Asn 195 Ala Ala Ala Gly Lys 200 Asp Thr Ser Thr Tyr 205 Lys Pro GlyThr Gly Ser Asp Tyr Gln

210

<210> 21

<211> 642

<212> DNA

<213> Hordeiam vulgare

<400> 21

atggcctcca accagaacca ggggagctac cacgccggcg agaccaaggc ccgcaccgag 60

gagaagaccg ggcagatgat gggcgccacc aagcagaagg cggggcagac caccgaggcc 120

accaagcaga aggccggcga gacggccgag gccaccaagc agaagaccgg cgagacggcc 180

gaggccgcca agcagaaggc cgccgaggcc aaggacaaga cggcgcagac ggcgcaggcg 240

gccaaggaca agacgtacga gacggcgcag gcggccaagg agcgcgccgc ccagggcaag 300

gaccagaccg gcagcgccct cggcgagaag acggaggcgg ccaagcagaa ggccgccgag 360

acgacggagg cggccaagca gaaggccgcc gaggcaaccg aggcggccaa gcagaaggcg 420

tccgacacgg cgcagtacac caaggagtcc gcggtggccg gcaaggacaa gaccggcagc 480

gtcctccagc aggccggcga gacggtggtg aacgccgtgg tgggcgccaa ggacgccgtg 540

gcaaacacgc tgggcatggg aggggacaac accagcgcca ccaaggacgc caccaccggc 600

gccaccgtca aggacaccac caccaccacc aggaatcact ag 642

<210> 22

<211> 213

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<4 00> 22

Met Ala Ser Asn Gln Asn Gln Gly Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Met Met Gly Ala Thr Lys Gln 20 25 30 Lys Ala Gly Gln Thr Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr 35 40 45 Ala Glu Ala Thr Lys Gln Lys Thr Gly Glu Thr Ala Glu Ala Ala Lys 50 55 60 Gln Lys Ala Ala Glu Ala Lys Asp Lys Thr Ala Gln Thr Ala Gln Ala65 70 75 80Ala Lys Asp Lys Thr Tyr Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Glu Arg Ala 85 90 95 Ala Gln Gly Lys Asp Gln Thr Gly Ser Ala Leu Gly Glu Lys Thr Glu 100 105 110 Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ala Glu Thr Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys 115 120 125 Ala Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ser Asp Thr Ala 130 135 140 Gln Tyr Thr Lys Glu Ser Ala Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser145 150 155 160Val Leu Gln Gln Ala Gly Glu Thr Val Val Asn Ala Val Val Gly Ala 165 170 175 Lys Asp Ala Val Ala Asn Thr Leu Gly Met Gly Gly Asp Asn Thr Ser 180 185 190 Ala Thr Lys Asp Ala Thr Thr Gly Ala Thr Val Lys Asp Thr Thr Thr195

Thr Thr Arg Asn His210

200

205

<210> 23

<211> 552

<212> DNA

<213> Bromus inermis

<400> 23

atggcatcca accaggacaa ggcaagctacgagaaggccg gacaggtgac cggcgcggccgcgtcggacg cggcggggca cgcgaccgggcagaaggccg gcgaggcggg gcagaagacggccgccgagg gcaaggacca ggccggcagcgagaaggcct cccaggcgac ggggtacacgacgaaggact ccgccgtcgc cggcaaggacgagcaggtga agaacgtggt ggttggcgccgggggagaca acaacactag ctcaaccaagaatcatcact ag

cacgccggcg aggccaaggc ccgcaccgag 60aaggacaagg cgtgcgaggc caaggaccgg 120aaggggcagg gcgccgtcga ggccacgaag 180tccgagacgg cgcaggccgc caaggaccgg 240tacctcggcc agacggccga ggccgccaag 300caggacaggg ccgccgacgc ggcgcagtac 360aagaccggca gcgtcctcgc tcaggccggc 420aaagacgcgg tggccaacac gctggggatg 480gacagtagca ccaccgagac gatcaccaag 540 552

<210> 24

<211> 183

<212> PRT

<213> Bromus inermis

<400> 24 Met Ala Ser Asn Gln Asp Lys Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Ala Lys1 5 10 15 Ala Arg Thr Glu 20 Glu Lys Ala Gly Gln 25 Val Thr Gly Ala Ala 30 Lys AspLys Ala Cys 35 Glu Ala Lys Asp Arg 40 Ala Ser Asp Ala Ala 45 Gly His AlaThr Gly 50 Lys Gly Gln Gly Ala 55 Val Glu Ala Thr Lys 60 Gln Lys Ala GlyGlu Ala Gly Gln Lys Thr Ser Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Arg65 70 75 80Ala Ala Glu Gly Lys 85 Asp Gln Ala Gly Ser 90 Tyr Leu Gly Gln Thr 95 AlaGlu Ala Ala Lys 100 Glu Lys Ala Ser Gln 105 Ala Thr Gly Tyr Thr 110 Gln AspArg Ala Ala 115 Asp Ala Ala Gln Tyr 120 Thr Lys Asp Ser Ala 125 Val Ala GlyLys Asp 130 Lys Thr Gly Ser Val 135 Leu Ala Gln Ala Gly 140 Glu Gln Val LysAsn Val Val Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Ala Asn Thr Leu Gly Met145 150 155 160Gly Gly Asp Asn Asn 165 Thr Ser Ser Thr Lys 170 Asp Ser Ser Thr Thr 175 GluThr Ile Thr Lys 180 Asn His His

<210> 25

<211> 666

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 25

atggcttccc accaggacaa ggctagctac caggccggcg agaccaaggc ccgcaccgag 60

gagaagaccg ggcaggcggt gggggcgacc aaggacacgg cgcagcacgc caaggaccgg 120

gcggcggacg cggcggggca cgcggcgggc aagggccagg acgccaagga ggccaccaag 180

cagaaggcgt ccgacaccgg cagctacctg ggcaagaaga ccgacgaggc caagcacaag 240

gccggcgaga cgacggaggc caccaagcac aaggccggcg agacgacgga ggccgccaag 300gacgccaacacactag

cagaaggccg gcgagacgac ggaggccgccaccaagcaga aggccggcga gacgacggaggaggccgcca agcagaaggc cgccgaggccggcaaggaca agtccggcgg cgtcatccaggcggggcgca aggacgcggt gatgagcacg

ccaacaccaa caccaacacc

aagcagaagg ccggcgagac gacggagacg 360

gccgccaggc agaaggcagc cgacgccatg 420

gggcagtacg ccaaggacac cgccgtctcc 480

caggccactg agcaggtgaa gagcgcggcg 540

ctggggatgg gcggggacaa caagcagggc 600

accaaggact cctctaccat caccagggat 660

666

<210> 26

<211> 221

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 26

Met Ala Ser His Gln Asp Lys Ala Ser Tyr Gln Ala Gly Glu Thr Lys15 10 15

Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Ala Val Gly Ala Thr Lys Asp

20 25 30

Thr Ala Gln His Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Ala Ala Gly His Ala

35 40 45

Ala Gly Lys Gly Gln Asp Ala Lys Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Ser

50 55 60

Asp Thr Gly Ser Tyr Leu Gly Lys Lys Thr Asp Glu Ala Lys His Lys65 70 75 80

Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Thr Lys His Lys Ala Gly Glu Thr Thr

85 90 95

Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Ala Lys Gln

100 105 110

Lys Ala Gly Glu Thr Thr Glu Thr Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr

115 120 125

Thr Glu Ala Ala Arg Gln Lys Ala Ala Asp Ala Met Glu Ala Ala Lys

130 135 140

Gln Lys Ala Ala Glu Ala Gly Gln Tyr Ala Lys Asp Thr Ala Val Ser145 150 155 160

Gly Lys Asp Lys Ser Gly Gly Val Ile Gln Gln Ala Thr Glu Gln Val

165 170 175

Lys Ser Ala Ala Ala Gly Arg Lys Asp Ala Val Met Ser Thr Leu Gly

180 185 190

Met Gly Gly Asp Asn Lys Gln Gly Asp Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr

195 200 205

Asn Thr Thr Lys Asp Ser Ser Thr Ile Thr Arg Asp His210 215 220

<210> 27<211> 690<212> DNA

<213> Brassica napus<400> 27

atggcgtcta accaacaaag ctacaaagct ggtgaaacca gaggcaagac tcaggagaag 60

acaggacaag caatgggagc aatgagggac aaggctgagg aaggcaagga caagacttcc 120

cagacggctc aaaaggccca acaaaaggca caagagactg cccaggcagc taaagacaag 180

acatctcaag ctgcccaaac gacccaacaa aaggctcaag agacggcaca ggcagcgaaa 240

gacaagacat ctcaagctgc ccaaacgacc cagcaaaagg ctcatgagac gacccaatca 300

gcaaaagaca agacatctca agctgcccag acggcccaag aaaaagcccg ggagacgaag 360

gacaagaccg gaagttacat gtccgagaca ggagaagcca taaagcagaa ggctcaaaac 420

gctgctcagt acacaaagga gacggctcaa gaagcggctc agtacacgaa agagacggct 480

gaagccggta gagacaagac cggtgggttc ttgagccaga caggcgagca agtgaagcag 540

atggcaatgg gtgcagctga tgcggtgaag cacactgttg gaatggctac ggaggaagaa 600

gaccgggagc attatccagg caccactacg accactactg gtactactcg gaccactgat 660

ccgactcatc atacttatca gaggaagtga 690

<210> 28<211> 229<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 28 Met Ala Ser Asn Gln Gln Ser Tyr Lys Ala Gly Glu Thr Arg Gly Lys1 5 10 15 Thr Gln Glu Lys Thr Gly Gln Ala Met Gly Ala Met Arg Asp Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Gly Lys Asp Lys Thr Ser Gln Thr Ala Gln Lys Ala Gln Gln 35 40 45 Lys Ala Gln Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys Thr Ser Gln Ala 50 55 60 Ala Gln Thr Thr Gln Gln Lys Ala Gln Glu Thr Ala Gln Ala Ala Lys65 70 75 80Asp Lys Thr Ser Gln Ala Ala Gln Thr Thr Gln Gln Lys Ala His Glu 85 90 95 Thr Thr Gln Ser Ala Lys Asp Lys Thr Ser Gln Ala Ala Gln Thr Ala 100 105 110 Gln Glu Lys Ala Arg Glu Thr Lys Asp Lys Thr Gly Ser Tyr Met Ser 115 120 125 Glu Thr Gly Glu Ala Ile Lys Gln Lys Ala Gln Asn Ala Ala Gln Tyr 130 135 140 Thr Lys Glu Thr Ala Gln Glu Ala Ala Gln Tyr Thr Lys Glu Thr Ala145 150 155 160Glu Ala Gly Arg Asp Lys Thr Gly Gly Phe Leu Ser Gln Thr Gly Glu 165 170 175 Gln Val Lys Gln Met Ala Met Gly Ala Ala Asp Ala Val Lys His Thr 180 185 190 Val Gly Met Ala Thr Glu Glu Glu Asp Arg Glu His Tyr Pro Gly Thr 195 200 205 Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Arg Thr Thr Asp Pro Thr His His

210 215 220

Thr Tyr Gln Arg Lys225

<210> 29<211> 696<212> DNA<213> Zea mays

<4 00> 29

atggcttctc gtcagcagca tcctactagc taccacgccg gcgagaccaa ggcccgtgcc 60

gaggagaaga cgggtcaagt gatgggggcg acgcaggaga aagggaggga ggccaagcac 120

aaggcgtccg acgcctccga ccgcgccatg ggaatgggcc acgacgccat ggaggcgacc 180

agggagaagg cgcgcgccgc cgcggaccga accatgggga tgggccacga cgccggggag 24 0

gcggccaagg acagggcgta ccgggccaag gacgcggcct ccggtgccgc tggccgcgcc 300

agggacactg cgtccgacgc ggccggcgct gccggggacc gcgcccgcga cggcgcgcag 360

cagaccggga gctacgtcgc gcagacggcc gaggccgcca ggcagaaggc ggccggcgcc 420

gcgctgtacg ccaaggacac cgtggtggcc ggcaaggaca agaccggcgc cctcctgcag 480

caggcagggg agaaggtgat gagcacggcc gtgggggcca aggacacggt tgtcagcacg 540

gccgtggggg ccaaggacac ggttgtcagc accgccgtgg gagccaagga cgcgatgatg 600

aactcgctcg gcatggccgg cgaggacaag gacggcacca ccaccaccga cgccggcaag 660

gacaccagca cccgcaagcc tggcagggac tattag 696

<210> 30

<211> 231

<212> PRT

<213> Zea mays

<4 00> 30

Met Ala Ser Arg Gln Gln His Pro Thr Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr15 10 15Lys

Glu

Ala

Arg

65

Ala

Ala

Asp

Thr

Lys145Gln

Val

Val

Asp

Arg225

Ala

Lys

Met

50

Ala

Ala

Gly

Arg

Ala130Asp

Ala

Val

Gly

Lys210Lys

Arg

Gly

35

Gly

Ala

Lys

Arg

Ala115Glu

Thr

Gly

Ser

Ala195Asp

Pro

Ala Glu20

Arg Glu

Met Gly

Ala Asp

Asp Arg

85Ala Arg100

Arg Asp

Ala Ala

Val Val

Glu Lys165Thr Ala180

Lys AspGly ThrGly Arg

Glu

Ala

His

Arg

70

Ala

Asp

Gly

Arg

Ala150Val

Val

Ala

Thr

Asp230

Lys

Lys

Asp

55

Thr

Tyr

Thr

Ala

Gln135Gly

Met

Gly

Met

Thr215Tyr

Thr

His

40

Ala

Met

Arg

Ala

Gln120Lys

Lys

Ser

Ala

Met200Thr

Gly Gln25

Lys Ala

Met Glu

Gly Met

Ala Lys90

Ser Asp105

Gln Thr

Ala Ala

Asp Lys

Thr Ala170Lys Asp185

Asn Ser

Val

Ser

Ala

Gly

75

Asp

Ala

Gly

Gly

Thr155Val

ThrLeuAsp Ala Gly

Met Gly Ala30

Asp Ala Ser45

Thr Arg Glu60

His Asp Ala

Ala Ala Ser

Ala Gly Ala110

Ser Tyr Val125

Ala Ala Leu140

Gly Ala Leu

Gly Ala Lys

Val Val Ser190

Gly Met Ala

205Lys Asp Thr220

Thr Gln

Asp Arg

Lys Ala

Gly Glu80Gly Ala95

Ala Gly

Ala Gln

Tyr Ala

Leu Gln160Asp Thr175

Thr AlaGly GluSer Thr

<210> 31

<211> 588

<212> DNA

<213> Zea mays

<4 00> 31

atggcttccc accaggacaa ggctagctacgagaagaccg ggcaggcggt gggggcgaccgcggcggacg cggcggggca cgcggcgggccagaaggcgt ccgacaccgg cagctacctggccggcgaga cgacggaggc caccaagcagcagaaggccg gcgagacgac ggaggccgccgccaagcaga aggccgccga ggccgggcaggacaagtccg gcggcgtcat ccagcaggccgccaaggacg cggtgatgag cacgctggggaacaccaaca ccaacaagga ctcctctacc

caggccggcg aaaccaaggc ccgcaccgag 60aaggacacgg cgcagcacgc caaggaccgg 120aagggccagg acgccaagga ggccaccaag 180ggcaagaaga ccgacgaggc caagcacaag 240aaggccggcg agacgacgga ggcgaccaag 300aggcagaagg cagccgacgc catggaggca 360tacgccaagg acaccgccgt ctccggcaag 420actgagcagg tgaagagcgc ggcggcgggc 480atgggcgggg acgacaagca gggcgacgcc 540atcaccaggg atcactag 588

<210> 32

<211> 195

<212> PRT

<213> Zea mays

<4 00> 32

Met Ala Ser His Gln Asp Lys Ala1 5

Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly20

Thr Ala Gln His Ala Lys Asp Arg

35 40

Ala Gly Lys Gly Gln Asp Ala Lys

50 55

Asp Thr Gly Ser Tyr Leu Gly Lys65 70

Ala Gly Glu Thr Thr Glu Ala Thr

Ser Tyr Gln Ala Gly Glu Thr Lys

10 15

Gln Ala Val Gly Ala Thr Lys Asp25 30

Ala Ala Asp Ala Ala Gly His Ala45

Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Ser60

Lys Thr Asp Glu Ala Lys His Lys

75 80

Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Thr85 90 95 Glu Ala Thr Lys 100 Gln Lys Ala Gly Glu 105 Thr Thr Glu Ala Ala 110 Arg GlnLys Ala Ala 115 Asp Ala Met Glu Ala 120 Ala Lys Gln Lys Ala 125 Ala Glu AlaGly Gln 130 Tyr Ala Lys Asp Thr 135 Ala Val Ser Gly Lys 140 Asp Lys Ser GlyGly Val Ile Gln Gln Ala Thr Glu Gln Val Lys Ser Ala Ala Ala Gly145 150 155 160Ala Lys Asp Ala Val 165 Met Ser Thr Leu Gly 170 Met Gly Gly Asp Asp 175 LysGln Gly Asp Ala 180 Asn Thr Asn Thr Asn 185 Lys Asp Ser Ser Thr 190 Ile Thr

Arg Asp His195

<210> 33<211> 636<212> DNA

<213> Triticum aestivum<4 00> 33

atggcctcca accagaacca ggccagctac cacgccggcg agaccaaggc ccgcaccgag 60

gagaagaccg ggcaggtgat gggcgcgacc aaggacaagg cggggcagac cacggaggcc 120

accaagcaga aggccggaca gaccaccgag gccaccaagc agaaggccgg cgagacggcc 180

gaggcaacga agcagaaggc cggtcaggcc acggaggcca cgaagcagaa ggccggcgag 240

acggccgagg ccaccaagca gaaggccgcc gaggccaagg acaagactgc gcagacggcg 300

caggcggcca aggagcgcgc cgccgagacc aaggaccaga ccggcagcta cctcggcgag 360

aagacagaga tggccaagca gaaggccgcc gagacgaccg aggctgccaa gcagaaggcc 420

tcggagacgg cgcagtacac caaggagtcc gtcgccggca aggacaagac cggcagcgtc 480

ctccagcagg ccggcgagac ggtggtgaac gccgtggatg gcgccaagga cgccgtggcc 54 0

aacacgctgg gcaatgggcc ggacaacgcc accaaggaca cctccaccgg cgccaccacg 600

aaggacacca ccaccaccac caccaggaat cactag 636

<210> 34<211> 211<212> PRT

<213> Triticum aestivum <4 00> 34 Met Ala Ser Asn Gln Asn Gln Ala Ser Tyr His Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Val Met Gly Ala Thr Lys Asp 20 25 30 Lys Ala Gly Gln Thr Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Gln Thr 35 40 45 Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Lys 50 55 60 Gln Lys Ala Gly Gln Ala Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu65 70 75 80Thr Ala Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Ala Glu Ala Lys Asp Lys Thr 85 90 95 Ala Gln Thr Ala Gln Ala Ala Lys Glu Arg Ala Ala Glu Thr Lys Asp 100 105 110 Gln Thr Gly Ser Tyr Leu Gly Glu Lys Thr Glu Met Ala Lys Gln Lys 115 120 125 Ala Ala Glu Thr Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ser Glu Thr Ala 130 135 140 Gln Tyr Thr Lys Glu Ser Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser Val145 150 155 160Leu Gln Gln Ala Gly Glu Thr Val Val Asn Ala Val Asp Gly Ala Lys 165 170 175 Asp Ala Val Ala Asn Thr Leu Gly Asn Gly Pro Asp Asn Ala Thr Lys180 185 190

Asp Thr Ser Thr Gly Ala Thr Thr Lys Asp Thr Thr Thr Thr Thr Thr

195 200 205

Arg Asn His210

<210> 35

<211> 214

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<4 00> 35

Met Ala Ser Gln Gln Glu Arg Ala1 5 Ala Arg Ala Glu Glu Lys Thr Gly 20 Lys Ala Arg Glu Ala Lys Asp Thr 35 40Met . Gly Arg Gly His Gly Ala Lys 50 55 Glu Thr Lys Asp Ala Thr Lys Glu65 70 Ala Ser Asp Ala Thr Gly Arg Ala 85 Ala Thr Arg Asp Lys Ala Tyr Asp 100 Ala Gln Ser Ala Ala Asp Arg Ala 115 120Ser Tyr Ile Gly Gln Thr Ala Glu 130 135 Ala Ala Gln Tyr Ala Lys Glu Thr145 150 Gly Ala Val Leu Gln Gln Ala Gly 165 Gly Ala Lys Asp Ala Val Met Tyr 180 Lys Asn Asn Ala Ala Ala Gly Lys 195 200Thr Gly Ser Asp Tyr Gln

210

Ser Tyr 10 His Ala Gly Glu Thr 15 LysArg Met Met Gly Thr Ala Gln Glu25 30 Ala Ser Asp Ala Ala 45 Gly Arg AlaGlu Ala Thr Lys 60 Glu Lys Ala TyrLys Ala Tyr 75 Glu Ala Lys Asp Ala 80Met Asp Lys Gly Arg Ala Ala Gly 90 95 Ala Lys Asp Arg Ala Ala Asp Thr105 110 Arg Asp Gly Ala Gly Gln Thr Gly 125 Ala Ala Lys Gln 140 Lys Ala Ala GlyAla Ile Ala 155 Gly Lys Asp Lys Thr 160Glu Gln 170 Val Lys Ser Val Ala 175 ValThr Leu Gly Met Ser Gly Asp Asn185 190 Asp Thr Ser Thr Tyr Lys Pro Gly

205

<210> 36

<211> 169

<212> PRT

<213> Trit

cum aestivum

<4 00> 36

Met Ala Ser Asn Gln Asn Gln Ala Ser Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys1 5 10 15 Ala Arg Thr Glu Glu Lys Thr Gly Gln Met Met Asp Lys Ala Gly Gln 20 25 30 Ala Thr Glu Ala Thr Lys Gln Lys Ala Gly Glu Ala Lys Asp Lys Thr 35 40 45 Ala Gln Thr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Arg Ala Ala Glu Ser Lys Asp 50 55 60 Gln Thr Gly Ser Phe Leu Gly Glu Lys Thr Glu Ala Ala Lys Gln Lys65 70 75 80Thr Ala Glu Ala Thr Asp Ala Ala Lys Gln Lys Ala Ser Glu Thr Ala 85 90 95 Gln Tyr Ala Gln Glu Arg Ser Ser Asp Ala Ala Gln Tyr Thr Lys Glu 100 105 110 Ser Ala Val Ala Gly Lys Asp Lys Thr Gly Ser Val Leu Gln Gln Ala

115 120 125Gly Glu Thr Val Val Ser Ala Val Val Gly Ala Lys Asp Ala Val Ala

130 135 140

Asn Thr Leu Gly Met Gly Gly Asp Asn Thr Asn Thr Ala Lys Asp Ser145 150 155 160

Thr Thr Glu Lys Ile Thr Arg Asp His165

Claims (28)

1. Método para aumentar o rendimento de planta em relação àsplantas de controle, caracterizado pelo fato de que compreende modular aexpressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeoOsLEA3a ou um homólogo do mesmo, e opcionalmente selecionar quanto àsplantas tendo rendimento aumentado, contanto que o dito polipeptídeoOsLEA3a ou homólogo do mesmo não seja a SEQ ID NO: 22 {Hordeumvulgaré).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita expressão modulada é efetuada pela introdução de umamodificação genética preferivelmente no local de um gene que codifica umpolipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a dita modificação genética é efetuada por um de: ativação de Τ-DNA, TILLING, mutagênese direcionada ao sítio ou evolução direcionada.

4. Método para aumentar o rendimento de planta em relação àsplantas de controle, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir eexpressar em uma planta um ácido nucleico OsLEA3 a ou uma variante domesmo, contanto que o dito ácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmonão codifique a SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeum vulgaré).

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o dito ácido nucleico codifica um homólogo da proteína OsLEA3 ada SEQ ID NO: 2, preferivelmente o dito ácido nucleico codifica um parálogoda proteína OsLEA3a da SEQ ID NO: 2.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a dita variante é uma porção de um ácido nucleico OsLEA3 a ouuma seqüência capaz de hibridizar a um ácido nucleico OsLEA3a, porção ouseqüência de hibridização estas que codificam um polipeptídeo quecompreende 2 domínios LEA_4 e a seqüência de assinatura de consensoOsLEA3a da SEQ ID NO: 3.

7. Método de acordo com as reivindicações 5 ou 6,caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico OsLEA3 a ou variante domesmo é superexpressado em uma planta.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-5 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico OsLEA3a ouvariante do mesmo é de origem vegetal, preferivelmente de uma plantamonocotilédone, mais preferivelmente da família Poaceae, o maispreferivelmente o ácido nucleico é de Oryza sativa.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-5 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito ácido nucleico OsLEA3a ouvariante do mesmo é operavelmente ligado a um promotor constitutivo.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o dito promotor constitutivo é um promotor GOS2.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 10, caracterizado pelo fato de que o dito rendimento aumentado é orendimento de semente aumentado.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-1 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito rendimento aumentado éselecionado de: peso total aumentado de sementes, número aumentado desementes cheias ou índice de colheita aumentado.

13. Planta, caracterizada pelo fato de que é obtenível por ummétodo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12.

14. Construção, caracterizada pelo fato de que compreende:(i) um ácido nucleico OsLEA3a ou uma variante do mesmo;(ii) uma ou mais seqüências de controle operavelmente ligadaà seqüência de ácido nucleico de (a),contanto que o dito ácido nucleico OsLEA3a ou uma variantedo mesmo não codifique a SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeum vulgarè).

15. Construção de acordo com a reivindicação 14, caracterizadapelo fato de que a dita seqüência de controle é um promotor constitutivo.

16. Construção de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de que o dito promotor constitutivo é um promotor GOS2.

17. Construção de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o dito promotor GOS2 é como representadopela SEQ ID NO: 6.

18. Planta, caracterizada pelo fato de que é transformada comuma construção como definida em qualquer uma das reivindicações de 14 a 17.

19. Método para a produção de uma planta transgênica tendorendimento aumentado comparado com as plantas de controle, caracterizadopelo fato de que compreende:(i) introduzir e expressar em uma planta ou célula vegetal umácido nucleico OsLEA3a ou variante do mesmo;(ii) cultivar a célula vegetal sob condições que promovam ocrescimento e desenvolvimento da planta,contanto que o dito ácido nucleico OsLEA3 a ou variante domesmo não codifique a SEQ ID NO: 22 (LEA3a de Hordeum vulgaré).

20. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que possuirendimento aumentado quando cultivada sob condições não estressantes,resultando de um ácido nucleico OsLEA3a ou um variante do mesmointroduzidos na dita planta.

21. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, 18 ou-20, caracterizada pelo fato de que a dita planta é uma planta monocotilédone,tal como cana de açúcar ou em que a planta é um cereal, tal como arroz,milho, trigo, cevada, painço, centeio, aveia ou sorgo.

22. Partes colhíveis de uma planta, caracterizadas pelo fato deque estão de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 18, 20 ou 21.

23. Partes colhíveis de uma planta de acordo com areivindicação 22, caracterizadas pelo fato de que as ditas partes colhíveis sãosementes.

24. Produtos, caracterizados pelo fato de que são diretamentederivados de uma planta como definida na reivindicação 21 e/ou de partescolhíveis de uma planta como definida nas reivindicações 22 ou 23.

25. Uso de um ácido nucleico/gene OsLEA3a ou variante domesmo ou uso de um polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo,caracterizado pelo fato de ser na melhora de rendimento, especialmenterendimento de semente, de plantas cultivadas sob condições não estressantes eem relação às plantas de controle.

26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que o dito rendimento de semente é um ou mais de: peso totalaumentado de sementes, número aumentado de sementes cheias e índice decolheita aumentado.

27. Uso de um ácido nucleico/gene OsLEA3a ou variante domesmo ou uso de um polipeptídeo OsLEA3a ou um homólogo do mesmo,caracterizado pelo fato de ser como um marcador molecular.

28. Semente de planta, caracterizada pelo fato de que temníveis de metabólito alterados em que a razão dos níveis de metabólito na ditasemente de planta comparados com aqueles das sementes de planta decontrole varia dentro do grupo de aminoácidos entre 0,7 e 7,7; dentro dogrupo de carotenóides entre 1,8 e 19,3; dentro do grupo de co-fatores entre 1,3e 1,5; dentro do grupo de ácidos graxos e metabólitos relacionados entre 0,3 e-0,9; dentro do grupo de ácidos orgânicos entre 1,4 e 20,0; dentro do grupo defenólicos entre 1,4 e 8,5; dentro do grupo de fito-hormônios e fitosteróis entre-1,0 e 10.9; dentro do grupo de metabólitos de açúcar entre 0,5 e 7,1, dentro dogrupo de tocoferol e metabólitos relacionados entre 0,3 e 4,2; planta esta quetem a expressão modulada de um ácido nucleico que codifica uma proteínaOsLEA3 ou um homólogo desta.