BRPI0616009A2 - bactérias novas pertencentes ao gênero bifidobacterium e utilização das mesmas - Google Patents

Abstract

BACTéRIAS NOVAS PERTENCENTES AO GêNERO BIFIDOBACTERIUM E UTILIZAçAO DAS MESMAS. O objetivo é prover Bifidobacterium bifidum que tem 3 um efeito de eliminação de Helicobacter pylori e mostra alta taxa de sobrevivência mesmo no caso de ser armazenada em um alimento ou bebida de leite fermentado sob condição aeróbica. A Bifidobacterium bifidum tem as seguintes características: (1) um efeito de eliminação de Helicobacter pylori; e (2) uma taxa de sobrevivência de 10% ou mais no caso de ser armazenada em uma bebida ou alimento de leite fermentado sob condição aeróbica a 10<198>C durante 14 dias

Description

"BACTÉRIAS NOVAS PERTENCENTES AO GÊNEROBIFIDOBACTERIUM E UTILIZAÇÃO DAS MESMAS".

Campo Técnico

A presente invenção se refere a uma Bifidobacteriumbifidum nova que tem como um efeito matar Helicobacter pylori e quemostra alta taxa de sobrevivência em uma bebida ou alimento de leitefermentado, e à utilização da mesma.

Histórico da Técnica

Bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium(doravante, referidas como "bactéria bifidus") são bactériasimportantes na flora bacteriana intestinal humana, e são conhecidaspor terem efeitos favoráveis à saúde humana, tal como regulação dafunção intestinal, incluindo melhoria de sintomas de constipação oudiarréia, supressão de aumento do colesterol sérico, efeito de ativaçãoimunológica, e similares. Muitos produtos comerciais de bactériaBifidus estão disponíveis nas formas de vários alimentos ou bebidasde leite fermentado ou preparações bacterianas vivas, resultando emum mercado bem estabelecido. Em especial, as bebidas e alimentos deleite fermentado contendo bactéria bifidus possuem um sabor favorávele são adequadas para ingestão contínua de bactéria bifidus.

Com o progresso recente no estudo da eficácia debactéria bifidus, foi descoberto que as bactérias bifidus têm um efeitoantiúlcera; por exemplo, foi relatado que 3 espécies de Bif idobacterium,a Bifidobacterium breve YIT 4014, Bifidobacterium breve YIT 4043 eBifidobacterium bifidum YIT 4007 (FERM BP-791), mostram um efeitoantiúlcera em um modelo de rato com úlcera induzida por ácido acético(documento não-patente 1). Adicionalmente, foi relatado que pelaadministração de Bifidobacterium bifidum YIT 4007 na forma de pó seco,a condição de pacientes que sofrem de úlcera gástrica ou úlcera doduo de no é melhorada e Helicobacter pylori desaparece da mucosa gástrica(documento não-patente 2) . Dessa maneira, é esperada a utilização dabactéria bif idus como um agente preventivo ou terapêutico em infecçãopor Helicobacter pylori ou como um agente preventivo ou terapêuticopara gastrite, úlcera gástrica e úlcera do duodeno. Adicionalmente,foi relatado que o efeito da Bifidobacterium bifidum YIT 4007 aumentade acordo com o aumento na contagem de células viáveis a seremadministradas (documento não patente 3) . De modo a fazer uso efetivoda ação farmacológica de Bif idobacteriumbif idum YIT 4007, é necessáriopermitir que tantas células vivas quanto possível atinjam o estômagoe o trato intestinal.

As bactérias bifidus que incluem Bifidobacteriumbifidum YIT 4007 são sensíveis ao oxigênio, visto que elas sãoobrigatoriamente aeróbias; especificamente, quando preservadas sobcondição aeróbica, surge o problema de que elas são rapidamentereduzidas quanto à quantidade de células vivas; portanto, era difíciladministrar a quantidade suficiente de bactérias bifidus.

De modo a solucionar este problema, está sendo feitauma tentativa de usar vários componentes para melhorar a taxa desobrevivência na preservação, tais como, suco de vegetais, abóbora,pepino, etc., ácido pirúvico, glutationa do tipo reduzido (documentode patente 1), glicerol, xilitol, etc. (documento de patente 2),lactitol (documento de patente 3), e similares. A adição destescomponentes, entretanto, envolve problemas tais como aumento no custode produção, diminuição no sabor, e similares e, dessa maneira, nãopode ser prontamente aplicado. Uma outra tentativa está sendo efetuadapara colocar um produto fermentado contendo uma bactéria bifidus emum recipiente composto de materiais de invólucro impermeáveis aoxigênio para bloquear completamente o contato com oxigênio.Entretanto, este recipiente com impermeabilidade perfeita a oxigênio,não foi ainda provido, e adicionalmente existe um problema de quemateriais tendo baixa permeabilidade a oxigênio não possuem boaflexibilidade de moldagem. Além do mais, quando um material compostoé usado para um recipiente composto de material com baixapermeabilidade a oxigênio, surgem problemas resultantes dadificuldade no tratamento de seus resíduos, o recipiente é por sipróprio, de alto custo, entre outras coisas, e dessa maneira existemmuitas limitações em sua utilização.

Ê considerado, conseqüentemente, que uma soluçãofinal para melhorar a sobrevivência da bactéria bifidus em bebidase alimentos de leite fermentado, etc., é criar uma cepa de bactériabifidus tendo alta taxa de sobrevivência mesmo em condição aeróbica;como exemplos destas cepas bacterianas, Bifidobacterium breve YIT10001 (FERM BP-8205) (documento de patente 4) , Bifidobacterium breveSBR3212 (FERM P-11915) (documento de patente 5), Bifidobacteriumbifidum YIT 4002 (FERM BP-1038) (documento de patente 6) , e similaresjá foram relatadas.

Estas bactérias bifidus tendo alta sobrevivência emcondição aeróbica, entretanto, exibiram atividade muito inferior naeliminação de Helicobacter pylori e na atividade antiúlcera, secomparadas à Bifidobacterium bifidum YIT 4007. Esta cepa que tem altaaxa de sobrevivência mesmo em condição aeróbica e exibe atividadede eliminação de Helicobacter pylori não foi ainda criada, e tem sidodifícil prover o número suficiente de células vivas para expressarum efeito antiúlcera no estômago ou trato intestinal.Documento de patente 1: JP-A-2003-250528Documento de patente 2: JP-A-11-137172Documento de patente 3: Patente Japonesa N- 3261571Documento de patente 4: WO 03/040350 Panfleto

Internacional Publicado

Documento de patente 5: Patente Japonesa N2 2922013Documento de patente 6: JP-B-61-19220Documento não patente 1: "The Japanese Society ofCarbohydrate Research, 16th CarbohydrateSymposium", Panfleto, 24-25 (1994)

Documento não patente 2: Jpn Pharmacol Ther Vol.22,No. 11, 253-256 (1994)

Documento não patente 3: Functional Foods andPharmacological Nutrients Vol.2, No. 3, 203-213 (2005)

Revelação da Invenção

Problema a ser solucionado pela Invenção

0 objetivo da invenção, conseqüentemente, é proveruma cepa nova de Bifidobacterium bif idum que tenha como um efeito matarHelicobacter pylori, e que mostre alta taxa de sobrevivência mesmono caso de estar presente em um alimento ou bebida de leite fermentadoarmazenado sob condição aeróbica.

Meios para solucionar os Problemas

Os presentes inventores trabalharam assiduamentepara solucionar os problemas acima e descobriram que Bifidobacteriumbifidum, que tinha um efeito na eliminação de Helicobacter pylori emostrava alta taxa de sobrevivência mesmo no caso de estar armazenadasob condição aeróbica, poderia ser obtida pela cultura e modificaçãoda Bifidobacterium bifidum que tem um efeito de eliminação daHelicobacter pylori sob as condições específicas. Dessa maneira, ainvenção foi completada.

Isto é, a invenção prove Bifidobacterium bifidumtendo as seguintes propriedades.

(1) Tem efeito de eliminação de Helicobacter pylori .

(2) Mostra uma taxa de sobrevivência de 10% ou maisno caso de estar presente em uma bebida ou alimento de leite fermentadoe armazenada sob condição aeróbica a IO0C durante 14 dias.

A invenção também provê um agente preventivo outerapêutico para infecção por Helicobacter pylori, um agentepreventivo ou terapêutico para gastrite e úlcera, um agente preventivoou terapêutico para distúrbio estomacal indefinido, ou um agentepreventivo ou terapêutico para hiperquilia e ref luxo gastroesofágico,que compreende a Bifidobacterium bifidum mencionada acima como umingrediente ativo.

Adicionalmente, a invenção provê uma bebida oualimento, especificamente uma bebida ou alimento de leite fermentado,que compreende a Bifidobacterium bifidum mencionada acima.

Efeito da Invenção

Visto que Bifidobaeterium bifidum da invenção éexcelente quanto à taxa de sobrevivência, mesmo no caso de estarpresente em uma bebida ou alimento de leite fermentado armazenada sobcondição aeróbica, seu efeito na eliminação de Helicobaeter pyloripode ser mantido durante um longo período.

Dessa maneira, Bifidobacterium bifidum da invençãopode ser utilizada preferivelmente na prevenção ou tratamento deinfecção por Helieobacter pylori, prevenção ou tratamento de gastritee úlcera, prevenção ou tratamento de distúrbio indefinido no estômago,ou prevenção ou tratamento de hiperquilia e refluxo gastroesofágicd.Adicionalmente, Bifidobacterium bifidum da invenção pode serpreferivelmente utilizado na produção de bebidas e alimentos tendoo efeito preventivo ou terapêutico mencionado acima, especificamentebebida ou alimento de leite fermentado, e não há necessidade decolocá-lo em um recipiente feito de um material de invólucroimpermeável a oxigênio; e, dessa maneira, as opções de recipientessão amplas.

Melhor Maneira para Executar a Invenção

Bifidobacterium bifidum tem o efeito de matarHelicobacter pylori e mostra uma taxa de sobrevivência de 10% ou maisno caso de estar presente em uma bebida ou alimento de leite fermentadoarmazenada sob condição aeróbica a IO0C durante 14 dias . 0 termo "efeitode matar Helicobacter pylori" indica que o número de células deHelicobacter pylori diminui devido a uma ação inibidora para adesãode Helicobacter pylori à célula gástrica humana ou a uma ação inibidoradireta no crescimento de Helicobacter pylori. Conforme descrito aqui,a ação inibidora para adesão de Helicobacter pylori à célula gástricahumana significa especificamente que quando Bifidobacterium bifidumda invenção é adicionada às células derivadas do estômago humano emum meio Leibovitz L-15 a uma taxa de IO8-IO9 UFC/ml e pré-incubada a37°C durante 2 horas, e Helicobacter pylori é adicionado a IO7 UFC/mle incubado a 3 7°C durante 90 minutos e deixado descansar a 4°C duranteuma noite, então a adesão de Helicobacter pylori à célula gástricahumana é inibida em 5% ou mais, preferivelmente em 5-20%.Alternativamente, isto pode significar que quando IO7 UFC/ml deHelicobacter pylori e IO8-IO9 UFC/ml de Bifidobacterium bifidum dainvenção são pré-incubados em um meio Leibovitz L-15 a 37°C durante2 horas, e a solução pré-incubada é adicionada às células derivadasdo estômago humano e incubada a 37°C durante 90 minutos e deixadadescansar a 4°C durante uma noite, então a adesão de Helicobacter pylorià célula gástrica humana é inibida em 5% ou mais, preferivelmente em5-20%. A ação inibidora para o crescimento de Helicobacter pylorisignifica especificamente que quando IO5 UFC/ml de Helicobacter pylorie IO7 UFC/ml de Bifidobacterium bifidum da invenção são adicionadosa um meio Brucella e incubados a 37°C durante 48 horas, a quantidadede células vivas de Helicobacter pylori é reduzida a IO3 UFC/ml oumenos, pref erivelmente 10 - IO3 UFC/ml. A diminuição do número de célulasde Helicobacter pylori se refere especificamente ao número reduzidodas células de Helicobacter pylori aderidas à célula gástrica, mucinagástrica ou tecido gástrico, ao número reduzido das células deHelicobacter pylori existente no trato intestinal tal como a cavidadeoral, cavidade nasal, garganta, esôfago, estômago, duodeno, intestinodelgado, apêndice, intestino grosso, reto, e similares, ao númeroreduzido das células de Helicobacter pylori em incubação concomitante(cultura mista) com Helicobacter pylori, diminuição do valor de A13CO2em um teste de uréia no hálito, diminuição do título de anticorpo paraHelicobacter pylori no soro, e diminuição da quantidade de antígenopara Helicobacter pylori nas fezes. Com relação a isto, a quantidadede células de Helicobacter pylori inclui o número de células vivas(UFC) de Helicobacter pylori, a quantidade de células (reatividadecom um anticorpo anti-Helicobacter pylori) , a quantidade de genes (aquantidade de DNA ou RNA capaz de reconhecer especificamenteHelicobacter pylori) , a quantidade ou atividade de um fator patogênicoespecífico a Helicobacter pylori (atividade de urease, toxina devacuolização VacA, CagPAI (ilha de patogenicidade), a quantidade deantígeno de LPS-Lewis). Adicionalmente, a taxa de sobrevivência serefere à proporção da contagem de células viáveis de um caldo de culturaou uma bebida ou alimento de leite fermentado após armazenagem sobcondição aeróbica (10°C, 14 dias) em relação à contagem de célulasviáveis antes da armazenagem sob condição aeróbica. A contagem decélulas viáveis pode ser obtida de acordo com um método convencional.

Por exemplo, um caldo de cultura ou uma bebida ou alimento de leitefermentado descrito posteriormente que foi usado na armazenagem sobcondição aeróbica é diluído adequadamente, e então é distribuído oumisturado em um meio de ágar de ácido propiônico TOS, então incubadoa 370C anaerobicamente durante 72 horas, e a colônia é contada paraobter o número de células.

Especificamente, a Bifidobacterium bifidum dainvenção pode ser derivada por cultura e modificação de Bifidobacteriumbifidum como uma cepa mãe que tem um efeito de eliminação de Helicobacterpylori. Quanto a Bif idobacterium bifidum utilizável como uma cepa mãe,não existe limitação específica contanto que ela tenha um efeito deeliminação de Helicobacter pylori; por exemplo, Bifidobacteriumbifidum YIT 4007 (ela foi depositada como FERM BP-791 em 2 de Fevereirode 1981 no "International Patent Organism Depository, NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology" (TsukubaCentral 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken)) pode serprovida.

Não existe limitação específica para um método decultura e modificação; por exemplo, são providos um método decondensação, um método de mutação por mutágeno, por exemplo, de raiode ultravioleta, nitrosoguanidina (NTG), de ácidoetilmetanossulfônico (EMS), e similares.Um exemplo específico de criação e modificação seráexplicado por meio de um método de condensação . Bifidobacteriumbifidumcomo uma cepa mãe que tem um efeito de eliminação de Helicobacter pylorié primeiramente incubada em um meio de leite para prover um caldo decultura, o qual é armazenado sob condição aeróbica. Entre aquelesorganismos que sobreviveram, uma cepa com alta resistência a oxigênioé selecionada dentre os organismos sobreviventes. Maisespecificamente, Bifidobacterium bifidum YIT4007 (FERM BP-791) éincubado em um meio de leite para prover um caldo de cultura, ao qualé, então, adicionada uma solução de xarope para preparar uma bebidaou alimento de leite fermentado; e então a bebida ou alimento de leitefermentado é armazenado sob condição aeróbica durante 21 dias, e osorganismos sobreviventes são selecionados. Usando os organismosselecionados conforme mencionado acima, o mesmo processo é repetidode modo que os organismos que têm alta resistência a oxigênio sejamconcentrados. Dessa maneira, a Bifidobacterium bifidum da invençãomostrando uma taxa de sobrevivência de 10% ou mais, preferencialmente10 a 40%, no caso em que está presente em uma bebida ou alimento deleite fermentado sob condição aeróbica a IO0C durante 14 dias, podeser obtida. Um exemplo de armazenagem sob condição aeróbica incluiarmazenagem sob aeração e agitação na qual atmosfera é passada atravésde um sistema de armazenagem por agitação contínua com uma barra deagitação ou lâmina de agitação em estado aeróbico.

o meio de cultura de leite usado no método decondensação acima se refere a um meio de cultura contendo leite comoo principal ingrediente, onde o leite inclui leite de vaca e produtoprocessado do mesmo, tal como leite desnatado, e peptídeos derivadosde leite. Não existe limitação específica na condição da cultura paraincubação de Bifidobacterium bifidum em um meio de cultura de leite,que pode ser definido conforme apropriado de acordo com a condiçãode crescimento de Bifidobacterium bifidum; no geral, é apropriadoconduzir a cultura anaerobicamente a 30-40°C, preferivelmente a 33-37°C.Entre as bactérias Bifidobacterium bifidum, existe uma cepa que édifícil de crescer devido ao fato de sua única fonte nutricional serleite; neste caso, uma substância de aceleração de crescimento, talcomo vários açúcares, extrato de fermento, peptídeos e similares, podemser adicionadas.

Na armazenagem do caldo de cultura pelo método decondensação acima em condição aeróbica, ingredientes opcionais taiscomo adoçantes, por exemplo, xarope, agente emulsificante, espessante(estabilizador) , vitaminas, minerais, acidificante, gordura de leite,aromatizante, extrato, e similares, podem ser adicionados. Serequerido, outros microorganismos diferentes de Bifidobacteriumbifidum podem ser usados em combinação em um método conhecido paraobter uma forma de bebida ou alimento de leite fermentado paracondensação. Neste caso, o ambiente é muito próximo da forma finaldo produto em comparação com o caso no qual um caldo de cultura sozinhoé usado; dessa maneira, a bactéria que mostra alta taxa de sobrevivênciana forma final do produto pode ser concentrada de forma mais eficiente.

Entre os ingredientes opcionais adicionados ao caldode cultura, o xarope inclui açúcares tais como glicose, sacarose,frutose, isoglicose, paratinose, trealose, lactose, xilose, açúcardemalte, mel, melaço, e similares; álcoois de açúcar tais como sorbitol,xilitol, eritritol, lactitol, paratinite, xarope de amido reduzido,xarope de açúcar de malte reduzido, e similares; adoçante altamentedoce tais como aspartame, taumatina, sucralose, acesulfame-K, estévia,e similares. O agente emulsificante inclui ésteres de ácido graxo desacarose, ésteres de ácidos graxos de glicerina, ésteres de ácido graxode poliglicerina, ésteres de ácido graxo de sorbitan, lecitina, esimilares. 0 espessante (estabilizador) inclui ágar, gelatina,carrageno, goma guar, goma xantano, pectina, goma de alfarrobeira,goma gelana, carboximetilcelulose, polissacarídeos de soja,propilenoglicol de ácido algínico, e similares. A vitamina incluivitamina A, vitaminas B, vitamina C, vitaminas E, esimilares. Omineralinclui cálcio, magnésio, zinco, ferro, manganês, e similares. 0acidif icante inclui ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, ácidomálico, ácido tartárico, ácido glicônico, e similares. Agordura deleite inclui creme, manteiga, creme azedo e similares. 0 aromatizanteinclui: tipo iogurte, tipo cereja, tipo laranja, tipo marmelo chinês,tipoperila, tipo cítrico, tipo maçã, tipomenta, tipo uva, tipo damasco,pêra, creme "custard", pêssego, melão, banana, tropical, tipo erva,chá, café, e similares. Oextratoinclui extrato de erva, açúcar mascavoe similares.

Os microorganismos diferentes de Bifidobacteriumbifidum incluem, por exemplo, bactérias que pertencem ao gêneroBifidobacterium tais como Bifidobacterium breve, Bifidobacteriumlongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum,Bifidobaeterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacteriumglobosum, e similares; bactérias que pertencem ao gênero Lactobacillustais como Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Lactobacillusgallinarum, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis,Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus kefir, Lactobacillusparacasei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus zeae,Lactobacillus helvetieus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillusgasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri,LaetobaeilIus crispatus, Lactobacillus delbrueekii subesp.bulgaricus, Lactobacillus delbrueekii subesp. delbrueekii,LaetobaeiIlus johnsonii, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus mali,e similares; bactérias do gênero Streptococcus tais como Streptococcusthermophilus; bactérias do gênero Lactococcus tais como Lactococcuslaetis subesp. Iactis, Lactococcus lactis subesp. cremoris, esimilares; bactérias do gênero Enterococcus tais como Enterococcusfaecalis, Enterococcus faecium, e similares; bactérias do gêneroBacillus tais como Bacillus subtilis; e leveduras que pertencem aogênero Saccharomyces, Torulaspora e Candida tais como Saccharomycescerevisiae, Torulaspora delbrueekii, Candida kefir, e similares.

Uma das cepas obtidas pelo método de condensaçãoacima, dos quais a taxa de sobrevivência foi reconhecida serespecificamente elevada, foi depositada em 23 de junho de 2005, comoBifidobacteriumbifidumYIT 10347 (FERM BP-10613) internacionalmenteno "International Patent Organism Depository, National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology" (Tsukuba Central 6, 1-1,Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) (FERM BP-10613 veio da FERMP-20569 depositada na Autoridade de Depósito acima em 23 de junho de 2005).

As propriedades bacteriológicas de Bifidobacteriumbifidum YIT 10347 (doravante referida algumas vezes como "YIT 10347")são mostradas como segue em comparação com a cepa mãe Bifidobacteriumbifidum YIT 4007 (doravante referida algumas vezes como "YIT 4007").

<Caráter da Colônia e Morfologia>Cada cepa foi inoculada em um meio de ágar MILS (Iwata& Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol.9, 165-168, 1989)e incubada a 3 7°C anaerobicamente, e o isolamento de uma única colôniafoi repetido. Assim, o caráter da colônia de cepa purificada e a formamorfológica foram observados.

[Tabela 1]

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<Resultados do teste de caráter de fermentação deaçúcar por API 50CH>

Usando API 50CH (produto da bioMerieux, Japão) , umasolução da bactéria após incubação durante uma noite foi inoculadaem cada substrato de acordo com o método descrito no manual anexadoao kit. Este foi incubado a 37°C em uma caixa de luva anaeróbica, eo caráter de fermentação de açúcar em cada substrato foi determinadono sétimo dia após incubação.

[Tabela 2]

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+: positivo; ±: pseudo-positivo; -: negativo

Bifidobacterium bifidum da invenção tem um efeitode eliminação de Helicobacter pylori, especificamente, efeitoinibidor para adesão de Helicobacter pylori às células gástricashumanas, e efeito inibidor para o crescimento de Helicobacter pylori.Adicionalmente, Bifidobacterium bifidum da invenção tem um efeitoprotetor para a mucosa gástrica, um efeito de melhoria do valor depepsinogênio sérico (PG), e um efeito de inibição da produção deinterleucina (IL) -8, similar na cepa mãe Bifidobacterium bifidum YIT4007 como um exemplo.Além disso, em bebidas e alimentos de leitefermentado produzidos pelo uso de bactérias Bifidobacterium oubactérias de ácido láctico, algumas modificações decorrentes do tempo,tal como aumento da acidez , são observadas durante armazenagem,deteriorando o sabor. É sabido que esta deterioração resultante daidade aumenta quando dissacarídeos, tais como sacarose, são usados,e especificamente, isto é marcante em uma concentração maior de leitesólido sem gordura (SNF). Utilizando a Bifidobacterium bifidum dainvenção, entretanto, o aumento da acidez é suprimido durante aarmazenagem mesmo no caso de uso de dissacarídeo tal como sacarosenas bebidas e alimentos de leite fermentado, embora seu mecanismo nãoseja compreendido; assim, a deterioração de um sabor pode ser suprimida.

Em um caso específico, quando a Bifidobacterium bifidum da invençãoé usada em uma bebida ou alimento de leite fermentado contendo 3% demassa ou mais, preferivelmente 3-6% de massa de sacarose, e 8% de massaou mais, preferivelmente de 8-12% de massa de porção de leite sólidoisento de gordura, e armazenada a 200C durante 4 dias em condiçãoaeróbica, a diferença da acidez antes (imediatamente após produção)e após armazenagem é de 2 ou menos, pref erivelmente de 1 ou menos.

Nesta situação, a acidez significa a quantidade de solução aquosa dehidróxido de sódio normal 1/10 (ml) requerida para neutralizar 9 gde uma amostra.

Bifidobacterium bifidum da invenção tendo aspropriedades mencionadas acima, visto que ela tem um efeito de matarHelicobacter pylori, pode ser utilizada como um agente preventivo outerapêutico para infecção por Helicobacter pylori. O efeito deeliminação como uma ação farmacológica da Bifidobacterium bifidum dainvenção é aumentado com o aumento da contagem de células viáveis e,portanto, é desejável usar Bifidobacterium bifidum da invenção em umestado de organismos vivos . Adicionalmente, visto que Bifidobacteriumbifidum da invenção tem uma alta resistência a oxigênio, um grandenúmero de células vivas pode ser enviado para o estômago e tratointestinal, e pode ser usada adequadamente na prevenção ou terapiade infecção com Helicobacter pylori, na prevenção ou terapia degastrite e úleera, na prevenção ou terapia de distúrbios estomacaisindefinidos, ou na prevenção ou terapia de hiperquilia e refluxogastroesofágico.

Bifidobacterium bifidum da invenção, visto que elatem um efeito preventivo para a mucosa gástrica e um efeito de melhoriado valor de pepsinogênio sérico (PG) , pode ser utilizada no tratamentoou melhoria ou prevenção de úleera de estresse, úleera necróticacausada por álcool, etc., gastrite ativa, gastrite dominantevestibular, gastrite dominante no corpo do estômago, pangastrite,adenoma gástrico, pólipo hiperplástico, pólipo nas glândulas de fundo,gastrite atrófica, refluxo gastroesofágico (esofagite de refluxo)distúrbios estomacais indefinidos (incluindo dispepsia não ulcerosa)e câncer estomacal intimamente relacionado com infeeção comHelicobacter pylori.

Na mucosa gástrica infectada com Helicobacter pylori,é causada gastrite ativa (gastrite do córtex) , que é uma gastritehistológica caracterizada por infiltração de neutrófilo e umaquantidade grande de células mononucleares . Com o progresso da gastrite,o crescimento das células é suprimido, a função da célula degrada,e a mucosa enfraquece, resultando em gastrite atrófica na qual nenhumaimagem inflamatória ativa é observada. Com o progresso da gastriteatrófica, metaplasia epitelial intestinal é causada aumentando o riscode câncer estomacal. Por outro lado, a falha do tecido da mucosa gástrica,que é causada pela influência de um fator de agressão tal como ácidogástrico ou pepsina ou medicamentos tais como NSAIDs em um estado degastrite ativa, resulta em úlcera péptica tal como úlcera gástricaou úlcera do duodeno. Portanto, Bifidobacterium bifidum da invençãotendo um efeito de eliminação de Helicobacter pylori pode ser utilizadacomo um agente preventivo ou terapêutico para gastrite ou úlceracausada por Helicobacter pylori, especificamente para úlcerasgástricas e do duodeno. Adicionalmente, Bifidobacterium bifidum dainvenção, visto que ela diminui o valor de pepsinogênio sérico I quese correlaciona fortemente com a secreção de ácido gástrico, pode serutilizada como um agente preventivo ou terapêutico para hiperquiliaou como um agente preventivo ou terapêutico para refluxogastroesofágico (esofagite de refluxo) que ocorre após tratamento deeliminação de Helicobacter pylori com um antibiótico.

Infecção com Helicobacter pylori induz uma citocinainflamatória tal como IL-8, IL-1β, ouTNF-α. IL-8 funciona na migraçãode neutrófilo para a mucosa gástrica e causa uma reação inflamatórialocalmente. IL-ΐβ e TNF-a agem para induzir a produção de IL-8, ediminuem adicionalmente a secreção de ácido gástrico, e elas sãoconsideradas terem relação com a atrofia da mucosa gástrica; dessamaneira, a inf ecção com Helicobacter pylori que tem uma alta capacidadede indução de citocina causa um estado inflamatório crônico na mucosagástrica de modo a causar dano à função da mucosa gástrica.Bifidobacterium bifidum da invenção é capaz de suprimir a produçãode IL-8 induzida pela infecção com Helicobacter pylori ou TNF-α.Adicionalmente, o efeito inibidor é maior que aquele da Bifidobacteriumbifidum YIT 4007, como um exemplo de cepas mães, e aumenta de acordocom o aumento da contagem de células viáveis.

Quando Bifidobacterium bifidum da invenção é usadacomo um agente preventivo ou terapêutico para inf ecção com Helicobacterpylori , um agente preventivo ou terapêutico para distúrbios estomacaisindefinidos, ou um agente preventivo ou terapêutico para hiperquiliae refluxo gastroesofágico, não existe limitação específica na formade Bifidobacterium bifidum como um ingrediente ativo, contanto queele esteja em um estado de organismo vivo, incluindo liofilizado ouum produto de cultura contendo a bactéria.

o agente preventivo ou terapêutico mencionado acimapara infecção por Helicobacter pylori, o agente preventivo outerapêutico para gastrite e úlcera, o agente preventivo ou terapêuticopara distúrbios estomacais indefinidos, ou o agente preventivo outerapêutico para hiperquilia e refluxo gastroesofágico pode ser administrado em uma forma de preparações farmacêuticas convencionaispreparadas pela mistura ou combinação de um ingrediente ativo deBifidobacterium bifidum com agentes de carga inócuos líquidos ousólidos para produtos farmacêuticos. Esta preparação inclui, porexemplo, preparações sólidas tais como comprimidos, grânulos, pós, ou cápsulas, preparações líquidas tais como soluções, suspensões ouemulsões, e preparações Iiofilizadas. Estas preparações podem serpreparadas por métodos de preparação conhecidos na tecnologiafarmacêutica. O agente de carga inócuo mencionado acima para produtosfarmacêuticos inclui, por exemplo, glicose, lactose, sacarose, amido, manitol, dextrina, glicerídeo de ácido graxo, polietilenoglicol,amido hidroxietila, etilenoglicol, ésteres de ácido graxo depolioxietileno sorbitan, aminoácidos, gelatina, albumina, água,solução salina fisiológica, e similares. Se requerido, um excipienteou excipientes conhecidos tais como um estabilizador, agente deumedecimento, agente emulsificador, aglutinador, agente de ajuste detonicidade, agente de carga, e similares podem ser apropriadamenteadicionados. 0 ingrediente ativo Bifidobacterium bifidum pode seradministrado como uma preparação única ou em combinação com um inibidorde secreção de ácido gástrico usado para úlcera péptica, esofagitede refluxo, refluxo gastroesofágico ou dispepsia funcional, incluindoinibidor de receptor de H2 tal como cimetidina, ranitidina, famotidina,roxatidina, nizatidina, lafutidina, ranitidina, esimilares; inibidorde bomba de próton tal como omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, esimilares; agente protetor de mucosa gástrica tal como Ecabet sódio,ornoprostil, enprostil, misoprostol, cetraxato, sucralfato,sofalcona, troxipida, plaunotol, teprenona, polaprezinco, cloridratode benexato, betadex, rebamipida, sulpirida, selectina, maleato deirsogladina, e similares para administrar cada ingrediente ativosimultaneamente. Conforme usado aqui, o agente protetor de mucosagástrica inclui medicamentos ou ingredientes tendo um efeito de aumentodo fator protetor, um efeito de aumento da expressão de ciclooxigenase,um efeito de aumento da produção de prostaglandinas, um efeito deaumento de secreção de muco, um efeito de citoproteção, um efeito deaumento do fluxo sangüíneo na mucosa, um efeito de supressão da secreçãode ácido gástrico, um efeito de aumento da secreção de íon de bicarbonato,um efeito antigastrina, um efeito antioxidação, um efeito de aumentoda geração de selectina endógena, e similares. 0 ingrediente ativoadministrado concomitantemente com Bifidobacterium bifidum incluiagente antimuscarina tal como cloridrato de pirenzepina, sulfato deatropina, e similares; um antiácido tal como carbonato de sódiohidrogênio, oxido de magnésio, solução de gel de hidróxido dealumínio/hidróxido de magnésio combinados, silicato de alumínio, esimilares; materiais de ocorrência natural tal como ácido ascórbico,ácido úrico, bilirrubina de ligação de albumina, β-caroteno, vitaminaE, coenzima Q, glutationa, cisteína, cistina, ácido pirúvico, fitina,ácido fítico, lignina, saponina, ácido ferúlico, ácidoy-aminobutírico,γ-orizanol, e similares; epolifenol tal como isoflavona, antocianina,catequina, flavona, flavonol, flavanona, chalcona, xantona,proantocianina, polifenol de fruta, polifenol de folha de chá,polifenol de cacau, polifenol de café, polifenol de chá verde; esimilares.

Bifidobacterium bifidum que é um ingrediente ativono agente preventivo ou terapêutico para infecção por Helicobacterpylori, o agente preventivo ou terapêutico para distúrbio estomacalindefinido, ou o agente preventivo ou terapêutico para hiperquiliae refluxo gastroesofágico na invenção já foi utilizada como alimento,e sua segurança foi confirmada.

Quando ela é usada como um agentepreventivo ou terapêutico para infecção por Helicobacter pylori,agente preventivo ou terapêutico para gastrite e úlcera, agentepreventivo ou terapêutico para distúrbio estomacal indefinido, ouagente preventivo ou terapêutico para hiperquilia e refluxogastroesofágico, não existe limitação rígida na dosagem, embora adosagem preferida seja a contagem de células viáveis de IO5 UFC - IO13UFC, especificamente IO9 UFC - IO13 UFC por dia.

0 agente preventivo ou terapêutico para infecção comHelicobacter pylori, o agente preventivo ou terapêutico para gastritee úlcera, o agente preventivo ou terapêutico para distúrbio estomacalindefinido, ou o agente preventivo ou terapêutico para hiperquiliae refluxo gastroesofágico na invenção pode ser usado não apenas comoas preparações farmacêuticas mencionadas acima, mas também emcombinação com bebidas e alimentos. No caso da combinação com bebidasou alimentos, ele pode ser adicionado aos mesmos como tal ou juntamentecom uma variedade de ingredientes nutricionais . As bebidas e alimentospodem ser utilizados como alimentos saudáveis ou materiaisalimentícios úteis na prevenção ou para melhoria ou tratamento deinfecção por Helicobacter pylori, ou na prevenção ou melhoria outratamento de gastrite, úlcera, distúrbio estomacal indefinido,hiperquilia ou refluxo gastroesofágico. Especificamente, quando oagente preventivo ou terapêutico para infecção por Helicobacter pylori ,o agente preventivo ou terapêutico para gastrite e úlcera, o agentepreventivo ou terapêutico para distúrbio estomacal indefinido, ou oagente preventivo ou terapêutico para hiperquilia e refluxogastroesofágico é usado em combinação com bebidas ou alimentos,aditivos apropriados que podem ser usados em bebidas ou alimentos podemser usados para moldagem em uma forma adequada para alimentos por meiode um método conhecido, istoé, grânulos, grãos, comprimidos, cápsulas,pasta, e similares, ou alternativamente ele pode ser adicionado a umavariedade de alimentos, por exemplo, produtos de carne processada taiscomo presunto ou salsicha; produtos de processamento de frutos do martais como empasta de peixe fervido ou salsicha de peixe; pão, confeitos,manteiga, leite em pó, e similares, ou ele pode se adicionado a bebidastais como água, suco de fruta, leite, refrigerantes, bebidas de chá,e similares. Bifidobacterium bifidum da invenção, visto que ele temuma alta resistência a oxigênio e não requer condição anaeróbicarestrita, pode ser adaptado a todas as formas de bebidas ou alimentos.As bebidas e alimentos incluem alimentos para uso animal.

Às bebidas ou alimentos mencionados acima podem seradicionada uma variedade de matérias primas para produtos alimentícios .Por exemplo, vários açúcares tais como glicose, sacarose, maltose,frutose, tagatose, lactose, isoglicose, trealose, trealose,ágar-oligossacarídeo, niger-oligossacarídeo,galacto-oligossacarídeo, frutooligossacarídeo,xilo-oligossacarídeo, rafinose, estaquiose, lactulose, maltriose,isomalto-oligossacarídeo, ciclodextrina, mel, xarope de bordo, açúcarmascavo, e xarope de batata doce; vários nutrientes tais como extratode carne, extrato de fermento, extrato de peixe, extrato de coração,extrato de fígado, e peptídeos; várias fibras alimentares ou seusvários hidrolisados ou extratos tais como ácido algínico, alginatode sódio, fucoidan, sargassum, fulceran, funoran, porfiran("porphyran"), laminaran, pululan, goma tara, konjakmanan, inulina,β-glicano, quitina, quitosan, polidextrose, ácido hialurônico,sulfato de condroitina, sulfato de heparano, sulfato de polissacarídeo,gangliosídeo, sulfatida, ácido siálico, ácido polissiálico, manan,galactano, frutano, xilano, arabinano, arabinogalactano, glicomana,galactomana, fibra de beterraba, fibra de aveia, fibra de trigo, fibrade soja, fibra de arroz, fibra de cevada, goma xantano, fibra de milho,fibra de maçã, fibra de citrus, fibra de psyllium, fibra de pinho,fibra de ameixa seca, fibra de banana, celulose de bactéria de ácidoacético, parede de célula de bactérias de ácido láctico, parede decélula de Bifidobacterium, parede de célula de levedura, frutano desoja fermentado, colágeno, e ácido poliglutâmico de soja fermentada;e várias matérias primas contendo uma grande quantidade de fibraalimentar de difícil digestão ou ingrediente extraído da mesma talcomo farelo de trigo, farelo de cevada, farelo de arroz, farelo deaveia, farinha de aveia, farelo de centeio, psyllium, pó de arroz,arroz não refinado, chicória, refugo de soja, polpa de maçã, amidoresistente, malte de cevada, casca de semente de milho, célula debactéria de ácido láctico, célula de Bifidobacterium, célula delevedura de cerveja, célula de levedura de vinho, célula de fermento para assar, borra de vinho, borra de saquê, borra de fonte de soja,borra de cerveja, fermento japonês de arroz, fermento japonês de trigo,fermento japonês de soja, fermento japonês vermelho, fermento japonêsamarelo, mucosa de soja fermentada, extrato de semente de uva, mel,geléiareal, própolis, Clorela, espirulina, Euglena, Aloe, wakame (um tipo de alga), egonori, iwanori, ogonori (Gracilarias), kawanori,tengusa, kombu (alga marinha desidratada), hon-dawara, arame, kajime,alga Asakusa, alface de mar("green laver"), hijiki, alface do mar,e mozuku; podem ser adicionados.

Adicionalmente, podem ser adicionados às bebidas ou alimentos acima: uma variedade de minerais ou seus sais tais como cálcio,magnésio, zinco, ferro, e dolomita; uma variedade de ácidos ou saisdos mesmos, tais como ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico,ácido glicônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido ascórbico,ácido láctico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácidofosfórico, e aminoácidos; uma variedade de ingredientes de ocorrêncianatural tais como glutationa, fitina, ácido fítico, lignina, saponina,ácido ferúlico, ácido γ-aminobutírico, γ-orizanol, chalcona,flavanona, flavona, flavonol, isoflavona, antociano, catequina,proantocianidina, polifenol de folha de chá, "curcumide", capsaicinóide, sesaminol, "gomalignan", teaflavina, β-dicetonas,carotinóides, compostos alil enxofre, isotiocianatos, terpenos,clorofilas, ácidos graxos saturados, ácidos graxos n-3poliinsaturados, ácidos graxos n-6 poliinsaturados, ácidos linoléicosconjugados, fosfolipídeos, esteróis de planta, proteínas de ovo,proteínas de leite, proteínas de arroz, proteínas de cevada, proteínasde trigo, proteínas de peixe, e colágeno; uma variedade de vitaminastais como vitamina A, vitaminas B, vitamina C, vitaminas D, vitaminaE, vitaminas K, β-caroteno, ácido retinóico, e ácido fólico; umavariedade de extratos ou seus ingredientes de cimicífuga racemosa("black cohosh"), sementes de abóbora, sementes de romãzeira,erva-de-são-joão, maracujá, valeriana, Pueraria mirifica, alecrim,ortelã-pimenta, salsinha, calêndula ("marry gold"), melissa,artemísia, cártamo, sementes de rabanete japonês, cafeeiro,Acanthopanax sieboldianum, cabaça-amargosa ("bottle gourd fruit"),pele de fruta cítrica, folha de ginkgo, dokudami (Saururaceae) , árvorede jujuba, sinforina ("Gouqizi"), raiz de alcaçuz, cogumelo Reishi,ginsém Panax, guaraná, "mactis sap" e similares; uma variedade deplantas ou extratos das mesmas tais como chá verde, chá preto, cháoolong, chá de hortênsia ( "Hydrangea serrata" ) , chá de gymnema, e folhade goiaba; e uma variedade de temperos, tais como pimenta, pimentajaponesa, cúrcuma, canela, mostarda, páprica, cúrcuma, Salviaofficinalis, tomilho, manjericão, cápsico, e noz-moscada.

Adicionalmente, os seguintes podem ser adicionadosàs bebidas ou alimentos acima: uma variedade de cereais ( todas as partesincluindo folha, caule, semente, raiz, flor, broto, casca, seiva, efruto ) ou os componentes de suas sementes germinadas ou seuscomponentes extraídos tais como arroz, arroz com casca, cevada, trigo,farinha de aveia, centeio, aveia, milho, planta amaranthaceous, painçoalemão, painço, fagópiro, capim-de-contas, capim-arroz, sorgo, sorgoem grão, cudzu comum, e mandioca; uma variedade de vegetais (todasas partes incluindo folha, caule, semente, raiz, flor, broto, casca,seiva, e fruto) ou suas sementes germinadas ou seus componentesextraídos tais como abóbora, pepino, cabaço-esponja, gengibre mioga,aipo, berinjela, cebola, alho, abacate, feijão Azuki, feijão brancoAzuki , feijão comum, feijão, ervilhas, f ei j ão "scarlet runner" , feijão"chanamame", soja branca, soja marrom, soja verde, "young soybean",feijão mungo (Vigna radiata) , fava, feijão daifuku, feijão "rennzu",lentilha vermelha, batata doce roxa, batata doce roxa, "Ashitaba",repolho crespo, cúrcuma, dente-de-leão, batata, batata doce, inhame,konjak, cará, berinjela, tomate, melão quinino, pimenta sino, gergelim,repolho, pepino chinês, brócolis, couve-flor, alface, gengibre,bardana, Aróideas, cabaço, haste de angélica Japonesa, rabaneteJaponês, rábano silvestre Japonês, pimentão, cenoura, espinafre,lírio, cebolinha, perila, "white stemmed onion", gynmight ("AlliumtuberosumRattler" ) , pastinaca, Farfugiumjaponicum ("Japanese silverIeaf"), alho vermelho, repolho chinês, salsa, manjericão, samambaiadas taperas, cavalinha, samambaia real, e broto de bambu; cogumelosou seus componentes extraídos tais como Shiitake, cogumelo, Maitake,cogumelo enokitake ("winter mushroom"), cogumelo "tree ear",Hatakeshimeji, Bunashimeji, Nameko, cogumelo cor-de-rosa ("oystermushroom"), Eringii, e Matsutake; frutos (todas as partes incluindofolha, caule, semente, raiz, flor, broto, casca, seiva e fruto) ouseus componentes extraídos tais como uva, caqui, limão, maçã, cereja,ameixa, morango, laranja, goiaba, banana, mirtilo, amora preta,oxicoco, framboesa, Mitchella rapens ("deer berry"), Myrica rubra("Chinese bayberry"), feijoa, tomateiro, acerola, azeitona, coco,lima, seakuwasar, melão, pêssego, Myrica rubra, lichia, manga, Yuzu("Citrus junus"), papaia, abacaxi, pera, ameixa, toronja, marmelochinês, damasco, damasco japonês, Natsumikan, nespereira, mandarina,romãzeira, terminalia beberica, melancia, ameixa do Japão, ameixaEuropéia, e kiwi; e uma variedade de nozes (todas as partes da plantaincluindo folha, caule, semente, raiz, flor, broto, casca, seiva, efruto) ou seus componentes extraídos tais como amêndoa, castanha decaju, amendoim, pinhão, noz de macadâmia, castanha, noz ginkgo, noz,cacau, e café.

Adicionalmente, proteínas de leite ou seushidrolisados tais como caseína ou proteína de soro do leite, oucomponentes do leite tais como peptídeos de leite, aminoácidos, soro,manteiga, gorduras do leite, a membrana de esférula de gordura do leite,lactoferrina, ou oligossacarídeo contendo ácido siálico, podem seradicionados às bebidas ou alimentos acima.

Adicionalmente, as seguintes matérias primas dealimento tendo efeito anti-bactéria pylori podem ser adicionados àsbebidas ou alimentos acima: o produto da reação de Maillard,melanoidina, proteína da gema do ovo contendo o anticorpo de ovoanti-pylori, cacau, chocolate, café, chá verde, chá ooIong, chá preto,infusão de cevada, vinho, cerveja, vinho de arroz Shaoxing, saquê,e etanol.

Entre as bebidas ou alimentos acima, leite fermentado,bebida de bactéria de ácido láctico, leite de soja fermentado, sucode fruta fermentado, ou líquido de vegetais fermentados, que contenhamBifidobacterium bifidum na forma de células vivas como um ingredienteativo, são preferidos. Estas bebidas ou alimentos de leite fermentadopodem ser preparados por um método conhecido, por exemplo,Bifidobacterium bifidum pode ser inoculado e incubado sozinho ousimultaneamente com um outro microorganismo em um meio de leiteesterilizado, e o produto é homogeneizado para resultar em uma basede leite fermentado. Subseqüentemente, uma solução de xarope preparadaseparadamente é adicionada ao mesmo e homogeneizada com um dispositivode homogeneização, ao qual é ainda adicionado um aromatizante oumatéria prima de alimento para resultar no produto final. Assim, oleite fermentado resultante pode ser formulado em qualquer tipo deproduto, incluindo do tipo natural, tipo suave, tipo sabor de fruta,na forma sólida, e na forma líquida.

Quando as bebidas ou alimentos de leite fermentadosão preparados usando Bifidobacterium bifidum em combinação com umaou mais espécies de bactérias dè ácido láctico selecionadas debactérias Lactobacillus, bactérias Streptococcus e bactériasLactococcus, eles possuem um sabor melhor e, dessa maneira, permitema ingestão contínua, o que é preferível.

Adicionalmente, na Bifidobacterium bifidum dainvenção, o aumento da acidez durante a armazenagem é suprimido mesmono caso de uso de um adoçante tal como um dissacarídeo, especificamente,sacarose, e a deterioração do sabor é suprimida, e, conseqüentemente,ela pode ser utilizada adequadamente em bebidas ou alimentos de leitefermentado que contenham os aditivos acima.

Até o momento, bebidas ou alimentos contendo abactéria bifidus foram colocados principalmente em recipientescompostos de um material de invólucro impermeável a oxigênio, tal comovidro ou papel revestido com alumínio. Bifidobacterium bifidum dainvenção, entretanto, tem uma propriedade de alta resistência aoxigênio e não requer condição anaeróbica rígida; assim, uma bebidaou alimento contendo este organismo pode ser colocado em qualquer tipode recipiente, aonde o material de revestimento do recipiente podeser tanto permeável quanto impermeável a oxigênio. Visto que ummaterial de invólucro permeável a oxigênio tem um custo menor e temmaior flexibilidade na moldagem do que um material de revestimentoimpermeável a oxigênio na preparação de um recipiente, é preferívelusar um recipiente composto de um material de invólucro permeável aoxigênio. Estes recipientes compostos de um material de invólucropermeável a oxigênio incluem aqueles nos quais a quantidade de oxigêniopermeável por recipiente é de 0,05 ml ou mais/24 horas na pressãoatmosférica a 25°C (por exemplo, recipiente de poliestireno (áreasuperficial de poliestireno de 125,6 cm2, área superficial da tampade alumínio de 5 cm2 (a quantidade de oxigênio permeando a porção detampa de alumínio é 0 ml)): 2,1 ml/24 h atm a 25°C; recipiente depolietileno de baixa densidade (área superficial de polietileno debaixa densidade de 125,6 cm2, área superficial da tampa de alumíniode 5 cm2 (a quantidade de oxigênio permeando a porção da tampa de alumínioé de 0 ml)) : 1,4 ml/ 24 h atm a 25°C; recipiente de polietileno dealta densidade (área superficial de polietileno de alta densidade de125,6 cm2, área superficial da tampa de alumínio de 5 cm2 (a quantidadede oxigênio permeando a porção da tampa de alumínio é de 0 ml)) : 0,63ml/ 24 h atm a 25°C; recipiente de tereftalato de polietileno (áreasuperficial de tereftalato de polietileno de 125,6 cm2, áreasuperficial da tampa de polietileno de baixa densidade de 5 cm2) : 0,08ml/ 24 h atm a 25°C; recipiente de composto de álcool de etileno vinil- polietileno de baixa densidade (área superficial de álcool de etilenovinil de 125,6 cm2, área superficial da tampa de polietileno de baixadensidade de 20, 9 cm2) : 0, 23 ml/ 24 h atm a 25°C; recipiente de compostode álcool de etileno vinil - polietileno de alta densidade (áreasuperficial de álcool de etileno vinil de 125,6 cm2, área superficialda tampa de polietileno de alta densidade de 20,9 cm2) : 0,10 ml/24h atm a 25°C, etc. ) (a quantidade de oxigênio permeando é mostrada paraum recipiente de 100 ml de volume em todos os casos)

[Exemplos]

A invenção será explicada em maiores detalhes pormeio dos Exemplos e Exemplos de Teste a seguir, que não objetivam seremlimitativos da mesma.

Exemplo 1

0 cultivo e melhoria de Bifidobacterium bif idum YIT4007

Bif idobacterium bif idum YIT 4007 (FERMBP-791) comouma cepa mãe foi inoculada em leite desnatado contendo uma porção sólidade leite isento de gordura de 14% de massa, e incubada a 37°C até umpH de 4,8 para prover uma solução de célula. A esta solução de célulafoi adicionada uma solução de Streptococcus thermophilus YIT 2021 quetinha sido inoculada separadamente e incubada em leite desnatadocontendo uma porção sólida de leite isento de gordura de 14% de massaa 37°C até um pH de 4,3 (proporção de mistura: 2 0 : 1) , e finalmenteum xarope contendo isoglicose foi adicionado à mesma de modo que aconcentração final foi de 3% de massa, resultando uma bebida ou alimentode leite fermentado.

Esta bebida ou alimento de leite fermentado foipreservado em condição aeróbica como segue, e os organismos tendo umapropriedade de alta resistência a oxigênio foram selecionados . Abebidaou alimento de leite fermentado preparado acima (10 L) foi colocadaem um tanque de 10 L, no qual ar foi introduzido a uma taxa de 7 L/min.de modo que a concentração de oxigênio dissolvida era de 12 mg/L oumaior, e preservada a 2°C com agitação a 60 rpm. Após um intervalode 21 dias, as células sobreviventes foram coletadas como cepas mãee foi feita uma solução de célula da mesma maneira que acima, que foiadicionalmente usada na preparação de uma bebida ou alimento de leitefermentado. Esta bebida ou alimento de leite fermentado foi preservadoa 2°C sob aeração e agitação durante 21 dias. Esta operação foi repetida3 vezes para concentrar cepas que tenham alta taxa de sobrevivência;as células sobreviventes do terceiro procedimento de concentraçãoforam distribuídas em um meio de ágar de ácido propiônico TOS (YakultPharmaceutical Industry Co., Ltd.) para isolar 24 cepas, cada uma comouma colônia única.

Usando uma das cepas isoladas acima e a YIT 4007 mãe,bebidas ou alimentos de leite fermentado foram preparados da mesmamaneira que acima. Estas (100 ml cada) foram colocadas respectivamenteem um recipiente de 100 mL de volume composto de um poliestirenopermeável a oxigênio (área superficial de poliestireno de 125,6 cm2;a quantidade de oxigênio permeando (por recipiente) foi de 2,1 ml/24h atra, 25°C) e armazenadas a 10°C (sob condição aeróbica). Os númerosde célula imediatamente após a preparação e após armazenagem foramcontados e sua taxa de sobrevivência foi comparada. Dessa maneira,YIT 10347 foi obtida como um microorganismo tendo taxa de sobrevivênciamaior que YIT 4007. Conforme mostrado na Tabela 3, a taxa desobrevivência 14 dias após armazenagem foi de 30% na YIT 10347 emcontraste com 2% na YIT 4007.

<table>table see original document page 32</column></row><table>Exemplo 2

Teste para o caráter de Bifidobacteriura bif idura YIT 10347

Por meio dos experimentos a seguir e da comparaçãodas propriedades de colônias, da forma dos organismos e daspropriedades na fermentação de açúcar, foi confirmado queBifidobacterium bifidum YIT 10347 é uma cepa criada e melhorada deBifidobacterium bifidum YIT 4007 como uma cepa mãe.

(1) Identificação das espécies por meio de primersespecíficos a espécie

DNAs foram extraídos de 1 ml da solução de célulade Bifidobacterium bifidum YIT 10347 e YIT 4007 de acordo com um métodode cloreto de benzila (Nuc. Acid. Res 21, 5279-5280 (1993)) usandocontas de vidro. As espécies dos organismos foram confirmadas por ummétodo PCR usando primers específicos a Bifidobacterium bif idura (FEMSMicrobiol. Letts . 167, 113-121 (1998)) e os DNAs acima como gabaritos.Como um resultado, amplificação específica a Bifidobacterium bifidumfoi observada em ambas as cepas, identificando ambas as cepas comopertencentes à Bifidobacterium bifidum (Fig. 1) .

BiBIF-I (SEQ ID N5: 1)

5'-CCACATGATCGCATGTGATTG-3'

BiBIF-2 (SEQ ID N2: 2)

5'-CCGAAGGCTTGCTCCCAAA-3'

(2) Discriminação das cepas por DNA polimórficoamplificado aleatório (RAPD)

Usando como gabarito o DNA extraído da mesma maneiraque acima, os organismos respectivos foram comparados pelo uso de 6membros de primers (Nuc. Acid. Res 20, 5137-5142 (1992)). Visto queYIT 4007 e YIT 10347 mostram o mesmo padrão de banda em todos os primers,foi sugerido que ambas as cepas são proximamente relacionadas de formagenética. A Figura 2 mostra os padrões de banda dos primers AeE quemostram uma diversidade de padrões de banda.

Primer A (SEQ ID N2: 3): CCGCAGCCAA

Primer B (SEQ ID N5: 4) : AACGCGCAAC

Primer C (SEQ ID N5: 5) : GCGGAAATAG

Primer D (SEQ ID NO: 6): GAGGACAAAG

Primer E (SEQ ID N-: 7) : CGAACTAGAC

Primer F (SEQ ID N5: 8) : GTAGACAAGC

(3) Discriminação das cepas por análise depolimorf ismo de DNA com enzima de restrição (RFLP : Restriction f ragmentlength polymorphisms (Polimorfismos de comprimento de fragmento derestrição))

Bloco de agarose preparado por mistura de caldos decultura de ambas as cepas com agarose de baixo ponto de fusão (agaroseLMP: feita pela BIO-RAD) foi lisada com lisozima, e apósdesproteinização com uma solução proteolítica (Proteinase Κ) , lavadacom um tampão de lavagem (20 mM Tris, 50 mM EDTA) . Subseqüentemente,60 unidades de cada enzima de restrição de Xbal (seqüência dereconhecimento: TiCTAGA), Hind III (seqüência de reconhecimento:

AA4-GCTT) e Vsp I (seqüência de reconhecimento: AT4-TAAT) (todas feitaspela Takara) fora adicionadas ao bloco de agarose, deixadas descansardurante uma noite a 4°C e, então, deixadas reagir para tratamento deenzima a 3 7°C durante 24 horas. Após tratamento com enzimas, o produtofoi submetido à eletroforese de campo de pulso em um gel de agarosede 1% de massa (Agarose PFC; feita pela BIO-RAD) usando CHEF MAPPER(feito pela BIO-RAD) . Após eletroforese, o gel foi manchado com 0,5mg/L de solução de brometo de etileno durante 30 minutos, entãodescolorido com água destilada durante 30 minutos, e fotografado sobraio de ultravioleta para análise a olho nu. Em todas as enzimas derestrição, os resultados da análise RFLP em ambas as cepas foramcompletamente idênticas (Fig. 3).

Exemplo 3

Teste para confirmação da taxa de sobrevivência:

Usando BifidobacteriumbifidumYIT 10347 e YIT 4007,bebidas ou alimentos de leite fermentado foram preparados como segue.Isto é, as cepas de Bifidobacteriumbifidum acima foram respectivamenteinoculadas em uma quantidade de 2% de massa em leite desnatado contendouma porção sólida de leite isento de gordura de 14% de massa e incubadasa 37°C até um pH de 4,8, e então homogeneizadas a 15 MPa para proveruma solução de célula A. Por outro lado, Streptococcus thermophilusfoi inoculado por 0,1% de massa em leite desnatado contendo uma porçãosólida de leite isento de gordura de 14% de massa, incubado a 37°Caté um pH de 4,3, e homogeneizado a 15 MPa para prover uma soluçãode células B. Subseqüentemente, uma solução de xarope contendo sacarosefoi preparada, de modo que a concentração final da mistura se tornou4% de massa. A solução de células A, a solução de células Bea soluçãode xarope foram misturadas na proporção de 55 : 3 : 42 para prepararleite fermentado contendo uma porção sólida de leite isento de gordurade 8,1% de massa.

O leite fermentado (100 ml cada) preparado como acimafoi colocado em um recipiente de papel-alumínio impermeável a oxigêniocombinados com 100 mL de volume (área superficial de 143 cm2;permeabilidade a oxigênio (por recipiente) 0 ml/24 h atm, 25°C) e umrecipiente de poliestireno permeável a oxigênio (área superficial de125,6 cm2; permeabilidade a oxigênio (por recipiente) 2,1 ml/24 h atm,25°C) , respectivamente, e preservado a IO0C durante 14 dias. O númerode células imediatamente após a preparação e após armazenagem foicontado, respectivamente, para comparar a sobrevivência deBifidobacterium bifidum. Neste teste, o recipiente de papel-alumíniocombinados corresponde à armazenagem sob condição anaeróbica e orecipiente de poliestireno corresponde à armazenagem sob condiçãoaeróbica.

Os resultados indicaram que a taxa de sobrevivênciade YIT 4007 no recipiente de poliestireno permeável a oxigênio foide 2%, mas aquela da cepa YIT 10347 no recipiente de poliestirenopermeável a oxigênio foi de 34%, indicando que YIT 10347 tem uma taxade sobrevivência maior que YIT 4007 (Tabela 4).

[Tabela 4]

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Exemplo 4

Teste para confirmação da mudança de caráterUsando Bifidobacterium bifidum, cepas YIT 10347 eYIT 4007, respectivamente, bebidas ou alimentos de leite fermentadoforam preparados como segue. Isto é, as cepas YIT 10347 e YIT 4007acima foram respectivamente inoculadas em uma quantidade de 2% de massaem leite desnatado contendo porção sólida de leite isento de gordurade 14% de massa e incubadas a 37°C até umpH de 4, 8, e então homogeneizadasa 15 MPa para prover uma solução de células A. Por outro lado,Streptococcus thermophilus foi inoculado em leite desnatado de 0,1%de massa contendo porção sólida de leite isento de gordura de 14% demassa, incubadas a 37°C até um pH de 4,3, e homogeneizadas a 15 MPapara prover uma solução de células B. Subseqüentemente, uma soluçãode xarope contendo sacarose (concentração final: percentual de massa4,2) ou isoglicose (concentração final: percentual de massa 5,6) comoadoçante foi preparado. A solução de células A, solução de célulasB e solução de xarope foram misturadas na proporção de 55 : 3 : 42para preparar uma bebida ou alimento de leite fermentado contendo umaporção sólida de leite isento de gordura de 8,1% de massa.

A bebida ou alimento de leite fermentado preparadoacima (100 ml) foi colocada no mesmo recipiente de poliestireno comono Exemplo 1, e armazenada a 20°C durante 4 dias (sob condição aeróbica).Imediatamente após a preparação e após armazenagem, a acidez e pH forammedidos e o sabor foi avaliado por 10 indivíduos. Neste teste, oscritérios para avaliação do sabor foram como segue.

Os resultados indicaram que quando sacarose foi usadacomo um adoçante, a cepa YIT 10347 mostrou uma mudança menor na acidezque a cepa YIT 4007, mesmo após armazenagem a 2O0C durante 4 dias,e o sabor foi também melhor devido aos odores de ácido acético e defermentação serem menores. Por outro lado, quando isoglicose foi usadacomo um adoçante, não ouve diferença entre as cepas YIT 4007 e YIT10347 na mudança de acidez e sabor após armazenagem a 20°C durante4 dias (Tabela 5 e Tabela 6).

<Critérios para avaliação do sabor >(Classificação) (Avaliação)

+2: sabor muito bom

+1: sabor bom

+0: sem preferência

-1: sabor desagradável

-2: sabor ruim

[Tabela 5]

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[Tabela 6]

<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>

Exemplo 5

Preparação de bebida de bactéria de ácido láctico

Leite empo integral (70 g) e peptídeo de leite (0,1g) foram dissolvidos em 290 g de água e esterilizado a 135°C durante3 segundos, nos quais 2 por cento de massa de Bifidobacterium bifidumYIT 10347 foram inoculados, e incubados a 37°C até um pH de 4,8, ehomogeneizados a 15 MPa para prover 360 g de uma solução de célulasA. Por outro lado, 6 g de leite desnatado foram dissolvidos em 24 gde água e esterilizados a 120°C durante 3 segundos, nos quais 0,1%de massa de Streptococcus thermophilus YIT 2021 foi inoculado, incubadoa 37°C até um pH de 4,3, e homogeneizado a 15 MPa para prover 30 gde uma solução de células B. Adicionalmente, sacarose (50 g),carboximetilcelulose (5 g), goma gelana (1 g), suclarose (0,1 g),DL-ácido málico (0,5 g) e flavorizante (Ig) foram dissolvidos em água,nos quais água foi adicionada para fazer o total de 610 g; estes foramesterilizados a 1200C durante 3 segundos para prover uma solução dexarope. A solução de células A, a solução de células Bea soluçãode xarope foram misturadas e colocadas em um recipiente de 100 ml devolume, de álcool de etileno vinil-polietileno de baixa densidadecombinados (área superficial de álcool de etileno vinil de 125,6 cm2,superfície da porção de tampa de polietileno de baixa densidade de20,9 cm2; A quantidade de oxigênio permeando (por recipiente) de 0,23ml/24 h atm, 25°C) para prover uma bebida de bactéria de ácido lácticocontendo uma porção sólida de leite isento de gordura de 5,5% de massa.0 número de células inicial de YIT 10347 na bebida de bactéria de ácidoláctico foi de 1,3 χ IO9 UFC/ml.

Quando esta bebida de bactéria de ácido láctico foiarmazenada a 10°C durante 14 dias, a taxa de sobrevivência de YIT 10347foi de 14% e o sabor foi favorável. Adicionalmente, quando ela foiarmazenada a 20°C durante 4 dias, a mudança na acidez foi tão pequenaquanto 0,6, e nenhuma deterioração do sabor foi observada.

Exemplo 6

Preparação de leite fermentado

Leite desnatado (80 g) foi dissolvido em 470 g deágua e esterilizado a 135°C durante 3 segundos, nos quais 2% de massade Bifidobacterium bifidum YIT 10347 foram inoculados, incubados a37°C até um pH de 4,8, e homogeneizados a 15 MPa para prover 550 gde uma solução de células A. Por outro lado, 5 g de leite desnatadofoi dissolvido em 25 g de água e esterilizado a 120°C durante 3 segundos,nos quais 0,1% de massa de Streptococcus thermophilus YIT 2021 foiinoculado, incubado a 37°C até um pH de 4,3, e homogeneizado a 15 MPapara prover 30 g de uma solução de células B. Adicionalmente, 60 gde isoglicose e 5 g de carboximetilcelulose foram dissolvidos em água,aos quais 1 g de flavorizante foi adicionado, a mistura foi aindaadicionada com água, de modo que a mistura se tornou um total de 420g. Então a mistura foi esterilizada a 120°C durante 3 segundos paraprover uma solução de xarope. A solução de células A, solução de célulasB e solução de xarope foram misturadas e colocadas no mesmo recipientede poliestireno como no Exemplo 1 para prover leite fermentado contendouma porção sólida de leite isento de gordura de 8,1% de massa. O númeroinicial de células de YIT 10347 no leite fermentado foi de 2,6 χ IO9UFC/ml.

Quando este leite fermentado foi armazenado a 10°Cdurante 14 dias, a taxa de sobrevivência de YIT 10347 foi de 3 5% eo sabor foi favorável. Adicionalmente, quando ela foi armazenada a20°C durante 4 dias, a mudança na acidez foi tão pequena quanto 0,7,e nenhuma deterioração do sabor foi observada.

Exemplo de Teste 1

Teste de adesão às células gástricas humanas

Bifidobacterium bifidum YIT 10347 ou YIT 4007 foiinoculada em um meio GAMbouillon (produto da Nissui Seiyaku) e incubadaa 37°C durante 20 horas sob condição anaeróbica. O caldo de culturafoi centrifugado a 3.000 rpm durante 10 minutos, e as célulasprecipitadas foram lavadas duas vezes com uma solução salinafisiológica tamponada de fosfato e suspensa em RPMI 1640 (produzidapela Gibco; sem soro bovino fetal (FBS) ; sem antibiótico) para prepararuma suspensão de células. Streptococcus thermophilus YIT 2021 (FERMBP-7537) usada como controle negativo foi inoculada em um meio MRS(feito pela Difco) , incubada da mesma maneira e suspensa para proveruma suspensão de células. Adicionalmente, Lactobacillus gasseri(isolado comercialmente disponível) foi isolada de iogurtecomercialmente disponível (Meiji Probioyogurt LG21; Meiji MilkProducts Co., Ltd.), inoculada em um meio MILS (Iwata & Morishita,LetterinAppliedMicrobiology, vol.9, 165-168, 1989), incubada damesma maneira, e suspensa para prover uma suspensão das células. Comopara Lactobacillus gasseri, a adesão às células gástricas humanas ea erradicação de Helicobacter pylori fóram relatadas.

A cepa de célula derivada do estômago humano (cepaGCIY, disponível do wBioresource Center, Institute of Physical andChemical Research") foi incubada em 15% de volume de meio FBS-eagle'sMEM (sem antibiótico) em uma placa revestida de colágeno de 24 poços(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) em um incubador de dióxido de carbonofixado a 3 7°C até um estado semi-confluente. O número médio de célulasda GCIY foi de 6,53 χ IO4 células/poço. Cada poço foi lavado com oRPMI 164 0 mencionado acima, ao qual a suspensão preparada acima decada cepa foi adicionada, e esta foi incubada durante 90 minutos elavada adicionalmente duas vezes com o RPMI 164 0 acima para removeras células não aderidas. Células GCIY assim tratadas foram liberadascom solução de 0,25% peso/volume de tripsina-EDTA ImM, diluídasapropriadamente com solução de extrato de levedura a 0,1% peso/vol.,e distribuídas em um meio de seleção para cada cepa (Bifidobacteriumbifidum: meio ágar ácido propiônico TOS (Yakult PharmaceuticalIndustry Co., Ltd.); Streptococcus thermophilus, Lactobacillusgasseri: meio ágar MRS (Difco)) ; assim o número das células que aderiramà cepa GCIY foi calculado do número de colônia (Fig. 4) .

A capacidade de adesão de Bifidobacterium bifidumYIT 10347 e YIT 4007 à cepa GCIY foi comparada com àquela deStreptococcus thermophilus como um controle negativo, indicando queo número de células aderidas foi aproximadamente igual 10 vezes emambas as células . Dessa maneira, a capacidade de adesão foi consideradaequivalente em ambas as cepas. Foi também descoberto que o número decélulas aderidas em ambas as células era ligeiramente maior que aquelede um isolado comercialmente disponível, Lactobacillus gasseri comoum controle positivo.

Exemplo de Teste 2

Teste de inibição para adesão de Helicobacter pyloriàs células gástricas humanas

<Experimento A: Um sistema de pré-incubação parabactéria bif idus e a cepa de célula GCIY derivada do estômago humano>

A cepa de célula GCIY derivada do estômago humanofoi incubada em um meio FBS Leibovitz L-15 de 15% de volume em umaplaca revestida de colágeno de 96 poços em um incubador de dióxidode carbono fixado a 3 7°C até um estado semi-confluente, em local escuro,durante 2-5 dias. Cada cepa de teste incubada da mesma maneira comono Experimento 1 foi suspensa em um tampão de fosfato (PBS)(concentração final IO8 - IO9 UFC/ml) e adicionada em cada poço, epré-incubada a 37°C durante 2 horas . Enquanto isso, Helicobacterpylorifoi incubada a 37°C durante 40 horas sob condição micro-aeróbica (5%de oxigênio, 10% de dióxido de carbono, 85% de nitrogênio) em um meioBrucella de soro eqüino a 10% de volume (feito pela Becton Dickinson)que havia sido lavada uma vez com meio HEPES Leibovitz L-15 a 20 mM(sem a presença de FBS) . A solução de Helicobacter pylori (concentraçãofinal IO7 UFC/ml) foi adicionada a cada poço, incubada a 37°C durante90 minutos, lavada com PBS, adicionada com solução de paraformaldeídoa 8% peso/volume, e deixada descansar a 4°C durante uma noite. Estafoi adicionalmente lavada duas vezes com PBS, adicionada com soluçãode peróxido de hidrogênio/metanol a 1% peso/volume, deixada descansarna temperatura ambiente durante 10 minutos, e lavada; então, umanticorpo anti-Helicobacter pylori (Anti H.p. (Murino IgGl): Cat.#2007; feito pela SYNBI0) (100 μΐ) diluído 200 vezes com 0,25%peso/volume de BSA (albumina de soro bovino)/PBS foi adicionado eincubado a 37°C durante 2 horas. Após lavagem, um anticorpo IgGanti-camundongo (peroxidase conjugado; feito pela Cappel) (100 μΐ)diluído 1.000 vezes com 0,25% peso/volume de albumina de soro bovino(BSA) /PBS foi adicionado, e incubado a 37°C durante lhora. Após lavagem,uma reação de coloração foi executada com reagente de coloração ABTS,e a reação foi terminada com 1% peso/volume de dodecilsulfato de sódio(SDS), e a absorbância foi medida a 405 nm. A taxa inibidora (%) paraadesão de Helicobacter pylori à cepa GCIY foi calculada de acordo coma equação a seguir (Fig. 5).

Taxa inibidora (%) = (1 - A/B) χ 100

A: Absorbância no momento da adição da suspensão acada cepa de célula de teste

B: Absorbância no caso de adição da suspensão de cadacepa de célula de teste

Como um resultado, foi descoberto que quando YIT10347 e YIT 4007 haviam sido deixados agir na cepa GCIY previamente,a adesão de Helicobacter pylori adicionada posteriormente foi inibida.

Em especial, a atividade inibidora de YIT 10347 era aproximadamente6 vezes tão potente quanto Streptococcus thermophilus YIT 2 021 comoum controle negativo, e ainda mais potente que Lactobacillus gasseri(isolado comercialmente disponível) como um controle positivo. Estesresultados sugerem que YIT 10347, similarmente à cepa mãe YIT4007,tem um efeito preventivo contra infecção ou re-infecção comHelicobacter pylori.

<Experimento B: Sistema de pré-incubação parabactéria bifidus e Helicobacter pylori>

Uma solução de Helicobacter pylori (IO7 UFC/ml) esuspensões de PBS de cada cepa de célula de teste (concentração final:10^8 - 10^9 UFC/ml) preparada da mesma maneira que no Experimento A forampré-incubadas a 37°C em um meio HEPES Leibovitz L-15 20 mM (sem adiçãode FBS) durante 2 horas . Por outro lado, a cepa de célula GCIY derivadado estômago humano foi incubada da mesma maneira como no ExperimentoA até um estado semi-confluente e lavada uma vez com o meio LeibovitzL-15. A estes poços foi adicionada a solução pré-incubada descritaacima, e os poços foram incubadas a 37°C durante 90 minutos, lavadoscom PBS, adicionados a 8% peso/volume de solução de paraformaldeído,e deixados descansar a 4°C durante uma noite. A operação abaixo foiconduzida da mesma maneira como no Experimento A, e a taxa de adesãoinibidora (%) para adesão de Helicobacter pylori à cepa GCIY foicalculada (Fig. 6).

Como um resultado, foi descoberto que quanto YIT10347 e YIT 4007 foram deixadas coexistir com Helicobacter pyloripreviamente, adesão de Helicobacter pylori à cepa GCIY foi inibida.Isto indica que YIT 10347 e YIT 4007 agem diretamente em Helicobacterpylori para inibir a inf ectividade. Aatividade inibidora de YIT 10347foi de aproximadamente 3 vezes tão potente quanto Streptococcusthermophilus YIT 2021 como um controle negativo, e o isoladocomercialmente disponível L. gasseri como um controle positivomostrado aproximadamente na mesma taxa inibidora como o controlenegativo YIT 2 021. Estesresultados sugerem que YIT 10347, similarmenteà cepa mãe YIT 4007, tem um efeito de supressão da atividade ou efeitode Helicobacter pylori em um estado de infecção com Helicobacter pylori.

Exemplo de Teste 3

Teste para efeito inibidor de Bifidobacteriumbifidum YIT 10347 contra IL-8 derivada da célula gástrica humana porinfecção com Helicobacter pylori

Bifidobacterium bifidum YIT 10347 foi inoculada nomeio MILS e incubada anaerobicamente a 37°C durante 20 horas. 0 caldode cultura foi centrifugado a 5.000 rpm durante 5 minutos para coletaras células, que foram lavados 3 vezes com meio FBS-eagle's MEM a 15%de volume (sem a presença de antibiótico) e suspenso em uma pequenaquantidade de meio FBS-eagle's MEM a 15% de volume (sem a presençade antibiótico) . Por outro lado, a cepa de célula GCIY derivada do estômago humano foi incubada em meio FBS-eagle's MEM a 15% de volume(sem a presença de antibiótico) em uma micro-placa revestida decolágeno de 96 poços em um incubador de dióxido de carbono a 3 7°C atéum estado confluente (1 - 2 χ IO5 células/cm2) . 0 meio de cultura nospoços foi removido e substituído por um novo, e a suspensão YIT 10347 acima foi adicionada nas células GCIY de modo que a concentração finalresultou em IO7 UFC/ml ou IO8 UFC/ml, e adicionalmente incubada durante6 horas (pré-incubação) . Com relação a isto, as células pré-incubadasapenas no meio de cultura foram usadas como controle. 0 meio no poçofoi removido, e o poço foi lavado 3 vezes com PBS para remover YIT10347; Helicobacter pylori foi adicionado ou não adicionado naconcentração final de IO7 UFC/ml juntamente com meio fresco, e as célulasGCIY foram incubadas durante 24 horas. Após término da incubação, oflutuante da cultura foi coletado do poço, e IL-8 no flutuante foideterminada por ELISA (Fig. 7).

Os resultados indicaram, conforme mostrado na Fig.7, que na célula pré-incubada juntamente com YIT 10347, a quantidadede IL-8 induzida por infecção com Helicobacter pylori foi diminuídaem comparação com o controle pré-incubado apenas no meio de cultura.A taxa de diminuição na quantidade de IL-8 foi 17% no caso depré-incubação com adição de IO7 UFC/ml e 38% no caso de adição de IO8UFC/ml. A partir deste resultado, foi sugerido que YIT 10347 tinhaum efeito de inibição da produção de uma IL-8 de fator de migraçãode leucócito induzida a partir da célula epitelial gástrica porinfecção com Helicobacter pylori e, dessa maneira, poderia melhorarinflamação no estômago causada pela infecção com Helicobacter pylori .Foi sugerido que o efeito inibidor se torna elevado com aumento donúmero de células vivas.

Exemplo de Teste 4

Teste para o efeito inibidor de Bifidobacteriumbifidum YIT 10347 contra IL-8 induzida a partir da célula gástricahumana por adição de TNF-a

Bifidobacterium bifidum YIT 10347 foi inoculado emum meio MILS e incubado anaerobicamente a 37°C durante 20 horas. 0caldo de cultura foi centrifugado a 5.000 rpm durante 5 minutos paracoletar as células, que foram lavadas 3 vezes com meio FBS-eagle'sMEM de 15% de volume (sem a presença de antibiótico). Por outro lado,a cepa de célula GCIY derivada do estômago humano foi incubada em meioFBS-eagle's MEM de 15% de volume (sem a presença de antibiótico) emuma microplaca revestida com colágeno de 96 poços em um incubador dedióxido de carbono a 3 7°C até um estado confluente (1 - 2 χ IO5células/cm2). 0 meio de cultura nos poços foi removido e substituídocom um meio fresco, e a suspensão de YIT 10347 foi adicionada nas célulasGCIY, de modo que a concentração final resultou em IO7 UFC/ml ou IO8UFC/ml, e incubada adicionalmente durante 6 horas (pré-incubação).Com relação a isto, as células pré-incubadas apenas no meio de culturaforam usadas como controle. 0 meio no poço foi removido, e o poço foilavado 3 vezes com PBS para remover YIT 10347; TNF-a foi adicionadona concentração final de 10 ng/ml juntamente com meio fresco, e ascélulas GCIY foram incubadas durante 24 horas. Após o término daincubação, o flutuante da cultura foi coletado do poço, e IL-8 noflutuante foi determinada por ELISA (Fig. 8).

Os resultados indicaram, conforme mostrado na Figura8, que na célula GCIY pré-incubada juntamente com YIT 10347, aquantidade de IL-8 induzida por tratamento subseqüente com TNF-a foidiminuída em comparação com o controle pré-incubado apenas no meiode cultura. A taxa de diminuição na quantidade de IL-8 foi de 36% nocaso de pré-incubação com adição de IO7 UFC/ml e 40% no caso depré-incubação com adição de IO8 UFC/ml. Apartir deste resultado, foidescoberto que YIT 10347 tem um efeito de inibição da produção de IL-8de fator de migração de leucócito induzida por TNF-a que é um mediadorde reação inflamatória. Isto é, foi sugerido que YIT 10347 podiamelhorar uma variedade de inflamação na qual TNF-a estava envolvido.

Exemplo de Teste 5

Teste para um efeito inibidor de Bifidobacteriumbifidum YIT 10347 em Helicobacter pylori em um meio de cultura

Helicobacter pylori (1 x IO5 UFC/ml) e

Bifidobacterium bifidum YIT 10347 (1 χ IO7 UFC/ml) foram inoculadasem um caldo de Brucella de soro eqüino a 10% de volume ajustado a umpH de 5,8 com ácido clorídrico, e incubadas em uma condiçãomicro-aeróbica a 37°C com agitação. Uma porção foi retirada do caldode cultura na cultura de mistura comum intervalo de tempo e distribuídaem placas de um meio de ágar de Helicobacter (Nissui Seiyaku) e demeio de ágar de ácido propiônico TOS (Yakult Pharmaceutical IndustryCo. , Ltd.), respectivamente. A anterior foi incubada em uma condiçãomicro-aeróbica a 37°C durante 5 dias, e a última anaerobicamente a37°C durante 3 dias para crescer colônias, a partir das quais o númerode células vivas em ambos os organismos foi determinado. Como umcontrole, Helicobacter pylori foi inoculada sozinha e o número decélulas vivas foi contado (Fig. 9).

Os resultados indicaram, conforme mostrado na Fig.9, que em um controle de Helicobacter pylori sozinho, Helicobacterpylori foi cultivado até 1 χ IO7 UFC/ml após um intervalo de 48 horas.No caso de coexistência de YIT 10347, o número de células vivas deHelieobacter pylori diminuiu com o intervalo de tempo e foi reduzidopara menos de 1 χ IO3 UFC/ml após 48 horas. Neste estágio, o númerode células vivas de YIT 10347 aumentou 10 vezes ou mais, se comparadocom o estágio de inoculação. A partir destes resultados, foi descobertoque o crescimento de Helicobacter pylori foi inibido por YIT 10347na presença das células vivas de YIT 10347. Isto é, é considerado quea cepa viva YIT 10347 ingerida por uma pessoa inibiria o crescimentode Helicobacter pylori no estômago.

Exemplo de Teste 6

Teste comparativo dos efeitos inibidores deBifidobacterium bifidum YIT 10347 e YIT 4007 para IL-8 induzida dascélulas gástricas humanas por infecção com Helicobacter pylori

Bifidobacterium bifidum YIT 10347 ou YIT 4007 foiinoculada em um meio MILS e incubada anaerobicamente a 3 7°C durantehoras. 0 caldo de cultura foi centrifugado a 5.000 rpm durante 5minutos para coletar as células, que foram lavadas 3 vezes com meioFBS-eagle's MEM a 15% de volume (sem a presença de substânciaantibiótica) e suspensas em uma pequena quantidade de meio FBS-eagle'sMEM a 15% de volume (sem a presença de substância antibiótica). Poroutro lado, a cepa de célula GCIY derivada do estômago humano foiincubada em meio FBS-eagle's MEM a 15% de volume (sem a presença deantibiótico) em uma micro-placa revestida de colágeno de 96 poços emum incubador de dióxido de carbono a 37°C até um estado confluente(1 - 2 χ IO5 células/cm2). 0 meio de cultura nos poços foi removidoe substituído com meio fresco, e a suspensão de YIT 10347 ou YIT 4007acima foi adicionada nas células GCIY, de modo que a concentração finalse tornou IO6 UFC/ml, e incubada adicionalmente durante 6 horas(pré-incubação). Com relação a isto, as células pré-incubadas apenas no meio de cultura foram usadas como controle. O meio no poço foiremovido, e o poço foi lavado 3 vezes com PBS para remover as célulasde Bifidobacterium bif idum; então, Helicobacterpylori foi adicionadoou não adicionado na concentração final de IO7 UFC/ml juntamente commeio fresco, e as células GCIY foram incubadas durante 24 horas. Apóso término da incubação, o flutuante da cultura foi coletado do poço,e IL-8 no flutuante foi determinada por ELISA (Fig. 10).

A partir dos resultados, conforme mostrado na Figura10, é indicado que na célula pré-incubada juntamente com YIT 10347ou YIT 4007, a quantidade de IL-8 induzida por infecção com Helicobacterpylori diminuiu em comparação com o controle pré-incubado apenas nomeio de cultura. A taxa de diminuição na quantidade de IL-8 foi de7% no caso de pré-incubação com adição de YIT 4007, mas tão elevadaquanto 28% no caso de pré-incubação com adição de YIT 10347. A partirdeste resultado, foi mostrado que YIT 10347 e YIT 4007 têm um efeitode inibição da produção de uma IL-8 de fator de migração de leucócitoinduzida a partir da célula epitelial gástrica por infecção comHelicobacter pylori, e o efeito inibidor de YIT 10347 é mais elevadoque aquele de YIT 4007.Exemplo de Teste 7

Teste comparativo dos efeitos inibidores deBifidobacterium bifidum YIT 10347 e YIT 4007 para IL-8 induzida dacélula gástrica humana pela adição de TNF-a

Bifidobacterium bifidum YIT 10347 ou YIT 4007 foiinoculada em um meio MILS e incubada anaerobicamente a 37°C durantehoras. 0 caldo de cultura foi centrifugado a 5.000 rpm durante 5minutos para coletar as células, que foram lavadas 3 vezes com meioFBS-eagle's MEM a 15% de volume (sem a presença de antibiótico) e10 suspensa em uma pequena quantidade de meio FBS-eagle's MEM a 15% devolume (sem a presença de antibiótico) . Por outro lado, a cepa de célulaGCIY derivada do estômago humano foi incubada em meio FBS-eagle's MEMa 15% de volume (sem a presença de antibiótico) em uma micro-placarevestida com colágeno de 96 poços em um incubador de dióxido de carbonoa 37°C para ser colocada em um estado confluente (1 a 2 χ IO5 células/cm2) .O meio de cultura nas células foi removido e substituído com um meiofresco, e a suspensão de YIT 10347 ou YIT 4007 acima foi adicionadanas células GCIY de modo que a concentração final se tornou IO6 UFC/ml,e incubada adicionalmente durante 6 horas (pré-incubação) . Com relaçãoa isto, as células pré-incubadas apenas nomeio de cultura foram usadascomo controle. O meio no poço foi removido, e o poço foi lavado 3 vezescom PBS para remover as células de Bifidobacterium bifidum; TNF-a foiadicionado na concentração final de 10 ng/ml juntamente com meio fresco,e as células GCIY foram incubadas durante 24 horas. Após o términoda incubação, o flutuante da cultura foi coletado do poço, e IL-8 noflutuante foi determinada por ELISA (Fig. 11).

A partir dos resultados, conforme mostrado na Fig.11, é indicado que na célula GCIY pré-incubada juntamente com YIT 10347ou YIT 4007, a quantidade de IL-8 induzida por tratamento subseqüentecom TNF-a diminuiu em comparação com o controle pré-incubado apenasno meio de cultura. A taxa de diminuição na quantidade de IL-8 foide 1% no caso de YIT 4007, mas de 15% no caso de pré-incubação comadição de YIT 10347. A partir deste resultado, foi mostrado que YIT10347 e YIT 4007 têm um efeito de inibição da produção de uma IL-8de fator de migração de leucócito induzida por TNF-a que é um mediadorde reação inf lamatória, e o efeito inibidor é mais elevado em YIT 10347do que em YIT 4007.

Exemplo de Teste 8

Teste de administração de uma bebida de bactéria deácido láctico contendo Bifidobacterium bifidum YIT 10347 em sereshumanos

Em 79 adultos saudáveis que apresentavam sintomasestomacais desagradáveis, foi conduzido um teste comparativoduplo-cego entre os dois grupos paralelos usando um placebo comocontrole. Nestes indivíduos, o consentimento informado foi obtidopreviamente.

<Indivíduos>

(1) Adultos saudáveis que apresentavam sintomasestomacais desagradáveis (excluindo mulheres grávidas)

(2) Aqueles cujos valores no teste de uréia no hálito(o valor Δ13 CO2 20 minutos após administração de Ubit; preparação de13C uréia feita pela Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. ; executado de acordocom o manual para exame) é 5% ou maior e euja proporção de pepsinogênio

I/II é menor que 6,5.

(3) Aqueles que não ingeriram qualquer produto

farmacêutico ou alimentar que poderiam ter influência na condiçãoestomacal

(4) Aqueles que não têm alergia a leite ouintolerância a lactose

(5) Aqueles que não possuem doenças crônicas

No teste, o produto alimentício a ser testado (bebidade bactéria de ácido láctico contendo BifidobacteriumbifidumYIT 10347preparado no Exemplo 5) ou um alimento de placebo (sem leite fermentado)foi ingerido em uma dose única (10 0 mL/peça) uma vez ao dia ao levantarou em um momento de fome durante 12 semanas; o termo de observaçãofoi de 8 semanas após o término da ingestão. Antes da ingestão, após4 semanas durante a ingestão, após 8 semanas durante a ingestão, após12 semanas durante a ingestão, e 8 semanas após a ingestão (na 20-semana após o início do teste), um médico observou a mudança de umsintoma subjetivo por entrevista e medida de acordo com os seguintesitens.

<Itens a serem medidos>

(1) Valor de exalação Δ13 CO2 por um teste de uréiano hálito

(2) Valor de pepsinogênio sérico

(3) A quantidade de antígeno de Helicobacter pylorinas fezes

A medição dos itens acima (1) a (3) foi conduzidana BML Co., Ltd.

Análise dos resultados de teste acima foi efetuadaem todos os indivíduos, indivíduos positivos para Helicobacter pylori,e do grupo de gastrite ativa e do grupo limítrofe de gastrite atróficacom base no agrupamento de Yoshihara et al. (Estimation of the stateof gastric mucosa by the pepsinogen value, the source: Yoshihara etal., Medicai Practice, vol.21, 77-81, 2004); adicionalmente,comparação entre os grupos para cada valor medido (teste deMann-Whitney) , comparação da variação da linha de base antes e após(teste de Wilcoxon), e comparação do grau de melhoramento de sintomasubjetivo foram efetuados.

(Resultados de Teste)

1. Influência no estado gástrico (secreção de ácidogástrico, endogastrite)

No total dos indivíduos ou nos indivíduos do grupode gastrite ativa, o valor de pepsinogênio I no grupo de produtoalimentício de teste foi significativamente menor que aquele do placebo(Fig. 12 e Fig. 13). Visto que o valor de pepsinogênio I se correlacionacom a secreção de ácido gástrico, estes resultados indicam que umabebida de bactéria de ácido láctico contendo YIT 10347 tem um efeitode supressão de aumento do ácido gástrico, e adicionalmente um efeitode supressão do ácido gástrico na gastrite ativa na qual uma reaçãoinflamatória é repetida por ataque de Helicobacter pylori, e um efeitopreventivo ou terapêutico para hiperquilia ou esofagite de refluxo.

Nos indivíduos do grupo limítrofe de gastriteatrófica, o valor de pepsinogênio II no grupo de produto alimentíciode teste foi significativamente inferior que aquele do placebo (Figura14) . Vistoqueovalor de pepsinogênio II reflete a inflamação da mucosagástrica, estes resultados indicam que uma bebida de bactéria de ácidoláctico contendo YIT 10347 tem um efeito de alívio de inflamação damucosa gástrica incluindo gastrite atrófica. Com relação a isto, vistoque Streptococcus thermophilus contido no produto alimentício de testefoi confirmado não ter efeito no valor de pepsinogênio, é consideradoque o efeito observado no produto alimentício de teste depende deBifidobacterium bifidum YIT 10347.

2. Inf luência em Helicobacter pylori (bioatividade,número de células, a quantidade de células)

Em todas as pessoas positivas a Helicobacter pyloriou indivíduos positivos a Helicobacter pylori do grupo de gastriteativa, o valor de exalação Δ13 CO2 no grupo de produto alimentício deteste foi menor que aquele da linha de base, e a variação foi tambémmenor que aquela do grupo de placebo (Fig. 15, Fig. 16) . Visto queo valor de exalação Δ13 CO2 reflete a atividade de urease essencialpara o crescimento e atividade de Helicobacter pylori no estômago,estes resultados indicam que uma bebida de bactéria de ácido lãcticocontendo YIT 10347 exibe um efeito anti-Helicobacter pylori(diminuição do número de células de Helicobacter pylori, inibição dageração de amônia por Helicobacter pylori, alívio/prevenção/cura delesão da mucosa gástrica por Helicobacter pylori, melhoria de umareação inflamatória por Helicobacter pylori, e similares) através dainibição da atividade de urease (diminuição da quantidade de amônia)de Helicobacter pylori . Nos indivíduos positivos a Helicobacter pylorido grupo limítrofe de gastrite atrófica, a quantidade de antígeno deHelicobacter pylori nas fezes no grupo de produto alimentício de testefoi menor que aquela da linha de base (Fig. 17) . Visto que a quantidadede antígeno de Helicobacter pylori reflete a quantidade das célulasde Helicobacter pylori, estes resultados indicam que uma bebida debactéria de ácido láctico contendo YIT 10347 exibe um efeito dediminuição do número de células de Helieobacter pylori. Com relaçãoa isto, visto que Streptococcus thermophilus contido no produtoalimentício de teste foi confirmado não ter efeito no Helicobacterpylori, é considerado que o efeito observado no produto alimentíciode teste depende da Bifidobacterium bifidum YIT 10347.

3. Influência na condição gástricaNa alteração de um sintoma subjetivo por meio deentrevista de todos os indivíduos, a taxa de melhoria de um distúrbioestomacal indefinido (dor estomacal, indigestão, peso no estômago,ânsia de vômito, sentimento incômodo, azia, dor na parte superior doabdômen, eructação) no grupo de produto alimentício de teste foi maiselevada do que no grupo de placebo (Fig. 18) . Os detalhes são comosegue: melhoria de dor estomacal no grupo de produto alimentício de teste: 9 indivíduos, e nenhuma melhoria: 1 indivíduo (taxa de melhoria90%) ; melhoria no grupo de placebo: 4 indivíduos, e nenhuma melhoria:2 indivíduos (taxa de melhoria 67%); melhoria de indigestão no grupode produto alimentício de teste: 4 indivíduos, e nenhuma melhoria:1 indivíduo (taxa de melhoria 80%); melhoria no grupo de placebo: 1indivíduo, e nenhuma melhoria: 2 indivíduos (taxa de melhoria 33%) ;e melhoria de outras condições (peso no estômago, ânsia de vômito,sensação desagradável, azia, dor na parte superior do abdômen,eructação) no grupo de produto alimentício de teste: 3 indivíduos,e nenhuma melhoria: nenhum (taxa de melhoria 100%) ; melhoria no grupode placebo: 5 indivíduos, e nenhuma melhoria: 3 indivíduos (taxa demelhoria 63%). Estes resultados indicam que uma bebida de bactériade ácido láctico contendo YIT 10347 exibe um efeito de melhoriaeficiente de distúrbio estomacal indefinido. Com relação a isto, vistoque Streptococcus thermophilus contida no produto alimentício de testefoi confirmada não ter efeito na condição gástrica, é considerado queo efeito observado no produto alimentício de teste depende daBifidobacterium bifidum YIT 10347.

Aplicabilidade IndustrialBifidobacterium bifidum da invenção tem um efeitode eliminação de Helicobacter pylori e mostra alta taxa desobrevivência mesmo no caso de ser armazenada em uma bebida ou alimentode leite fermentado sob condição aeróbica. Visto que o efeito deeliminação mencionado acima e a taxa de sobrevivência são mantidosdurante um longo período de tempo e uma grande quantidade das célulasvivas pode ser administrada no estômago e trato intestinal, ela podeser utilizada como um agente preventivo ou terapêutico para infecçãopor Helicobacter pylori, um agente preventivo ou terapêutico paragastrite e úlcera, uma agente preventivo ou terapêutico para distúrbioestomacal indefinido, ou um agente preventivo ou terapêutico parahiperquilia e refluxo gastroesofágico. Adicionalmente, ela pode serutilizada preferivelmente na produção de bebidas e alimentos,especialmente bebidas ou alimentos de leite fermentado. Além disso,visto que ela suprime o aumento da acidez e deterioração do sabor durantearmazenagem de uma bebida ou alimento de leite fermentado no qualsacarose é usada, ela pode ser utilizada preferivelmente em bebidase alimentos de leite fermentado contendo adoçantes.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra o resultado de identificação deespécies de YIT 4007 e YIT 10347 usando um primer BiBIF.

A Figura 2 mostra os padrões de banda RAPD de YIT4007 e YIT 10347.

A Figura 3 mostra os padrões de eletroforese de campode pulso de DNAS de cromossomo de YIT 4007 e YIT 10347.

A Figura 4 mostra os resultados de um teste paraadesão à célula gástrica humana.

A Figura 5 mostra os resultados de um teste deinibição para a adesão de Helicobacter pylori à célula gástrica.

A Figura 6 mostra os resultados de um teste deinibição para a adesão de Helicobacter pylori à célula gástrica.

A Figura 7 mostra os resultados de teste de um efeitoinibidor de YIT 10347 para IL-8 induzida a partir das células gástricashumanas por infecção com Helicobacter pylori.

A Figura 8 mostra os resultados de teste de um efeitoinibidor de YIT 10347 para IL-8 induzida de células gástricas humanaspela adição de TNF-a.

A Figura 9 mostra os resultados de teste de um efeitoinibidor para Helicobacter pylori por YIT 10347 no caldo de cultura(Experimento A: cultura por uma bactéria única; Experimento B: culturade mistura).

A Figura 10 mostra os resultados de um testecomparativo de um efeito inibidor de YIT 10347 e YIT 4007 para IL-8induzida das células gástricas humanas por infecção com Helieobacterpylori.

A Figura 11 mostra os resultados de um testecomparativo de um efeito inibidor de YIT 10347 e YIT 4007 em IL-8induzida de células gástricas humanas pela adição de TNF-a.

A Figura 12 mostra os resultados (o valor depepsinogênio I em todos os indivíduos) de um teste de administraçãode uma bebida de bactéria de ácido láctico contendo YIT 10347 em sereshumanos.

A Figura 13 mostra os resultados (o valor depepsinogênio I nos indivíduos com gastrite ativa) de um teste deadministração de uma bebida de bactéria de ácido láctico contendo YIT10347 em seres humanos.A Figura 14 mostra os resultados (o valor depepsinogênio II nos indivíduos do grupo limítrofe de gastrite atróf ica)de um teste de administração de uma bebida de .bactéria de ácido lácticocontendo YIT 10347 em seres humanos.

A Figura 15 mostra os resultados (o valor de exalaçãoΔ^13 CO2 em todos os indivíduos positivos para Helicobacter pylori) deum teste de administração de uma bebida de bactéria de ácido lácticocontendo YIT 10347 em seres humanos.

A Figura 16 mostra os resultados (o valor de exalaçãoΔ13 CO2 em indivíduos com gastrite ativa positivos para Helicobacterpylori) de um teste de administração de uma bebida de bactéria de ácidoláctico contendo YIT 10347 em seres humanos.

A Figura 17 mostra os resultados (a quantidade deantígeno de Helicobacter pylori nas fezes dos indivíduos do grupolimítrofe de gastrite atrófica e positivos para Helicobacter pylori)de um teste de administração de uma bebida de bactéria de ácido lácticocontendo YIT 10347 em seres humanos.

A Figura 18 mostra os resultados (a taxa de melhoriade distúrbio estomacal indefinido em todos os indivíduos) de um testede administração de uma bebida de bactéria de ácido láctico contendoYIT 10347 em seres humanos.LISTA DE SEQÜÊNCIAS

PF-060014-WO.ST25.TXT

LISTA DE SEQÜÊNCIAS

<110> Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Co., Ltd.<120> Nova bactérias do gênero Bifidobacterium e sua

utilização

<130> PF-060014-WO<150> JP2005-211670<151> 2005-07-21<160> 8

<170> PatentIn versão 3.1<210> 1<211> 21<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> BiBIF-I<400> 1

ccacatgatc gcatgtgatt g 21

<210> 2<211> 19<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> BiBIF-2<400> 2

ccgaaggctt gctcccaaa 19

<210> 3<211> 10<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> primer A<4 00> 3ccgcagccaa<210> 4<211> 10<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> primer B<4 00> 4aacgcgcaac<210> 5<211> 10<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> primer C<400> 5gcggaaatag<210> 6<211> 10<212> DNA<213> Artificial<220><223> primer D<400> 6gaggacaaag<210> 7<211> 10<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> primer E<400> 7cgaactagac<210> 8<211> 10<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> primer F<400> 8gtagacaagc

Claims (13)

1. Bifidobacterium bifidum , caracterizada pelofato de:(1) ter efeito de eliminação de Helicobacter pylori;(2) mostrar uma taxa de sobrevivência de 10% ou maisno caso de ser armazenada em uma bebida ou alimento de leite fermentadosob condições aeróbicas a IO0C durante 14 dias; e(3) a diferença da acidez em uma bebida ou alimentode leite fermentado contendo 3% massa ou mais de sacarose e 8% de massaou mais de porção sólida de leite isento de gordura após armazenagema 20°C durante 4 dias em uma condição aeróbica, em relação à acidezimediatamente após produção, ser 2 ou menor.

2. Bifidobacterium bifidum, de acordo com aReivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o efeito de eliminaçãode Helicobacter pylori é um efeito de inibição da adesão deHelicobacter pylori à célula gástrica.

3. Bifidobacterium bifidum, de acordo com aReivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o efeito de eliminaçãode Helicobacter pylori é um efeito de inibição do crescimento deHelicobacter pylori.

4. Bifidobacterium bifidum, de acordo com qualqueruma das Reivindicações 1, 2 ou 3 , caracterizada por ser Bif idobacteriumbifidum YIT 10347 (FERM BP-10613).

5. Agente preventivo ou terapêutico para infecçãocom Helicobacter pylori, de acordo com qualquer uma das Reivindicações- 1 ou 2 a 4, caracterizado por compreender Bifidobacterium bifidum comoum ingrediente ativo.

6. Agente preventivo ou terapêutico para gastriteou úlcera, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 ou 2 a 4,caracterizado por compreender Bifidobacterium bifidum como umingrediente ativo.

7. Agente preventivo ou terapêutico para distúrbioestomacal indefinido de acordo com qualquer uma das Reivindicações-1 ou 2 a 4, caracterizado por compreender Bifidobacterium bifidum comoum ingrediente ativo.

8. Agente preventivo ou terapêutico, parahiperquilia ou refluxo gastroesofágico, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 ou 2 a 4, caracterizado por compreenderBifidobacterium bifidum como um ingrediente ativo.

9. Bebida ou alimento, caracterizados porcompreender Bifidobacterium bifidum, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2 a 4.

10. Bebida ou alimento, de acordo com a Reivindicação-9, caracterizados por ser uma bebida ou alimento de leite fermentado.

11. Bebida ou alimento, de acordo com a Reivindicação-9 ou 10, caracterizados por conter um adoçante adicionado.

12. Bebida ou alimento, de acordo com qualquer umadas Reivindicações 9 a 11, caracterizados por serem embalados em umrecipiente.

13 . Bebida ou alimento, de acordo com a Reivindicação-12, caracterizados pelo fato de que o recipiente é composto de ummaterial de invólucro permeável a oxigênio.