BRPI0616222A2 - gene, proteÍna recombinante, vetor recombinante, mÉtodos para preparar uma planta transgÊnica e para aperfeiÇoar a tolerÂncia a estresse de uma planta - Google Patents

Abstract

GENE, PROTEÍNA RECOMBINANTE, VETOR RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA E PARA APERFEIÇOAR A TOLERÂNCIA A ESTRESSE DE UMA PLANTA. A presente invenção refere-se a um fator de transcrição indutível por estresse, derivado de milho, a um gene que codifica o mesmo e a um método para usar o mesmo. Especificamente, a presente invenção põe à disposição um gene, que compreende o seguinte DNA (a) ou (b): (a) DNA que consiste na sequência de nucleotídeo, tal como mostrada na SEQ ID NO: 1; ou (b) DNA derivado de milho que se hibridiza sob condições constritivas com DNA, constituído de uma sequência de nucleotídeo que é complementar ao DNA constituído da sequência de nucleotídeo, tal como mostrada na SEQ ID NO: 1 e codifica uma proteína, que regula a transcrição de um gene localizado a jusante de um elemento sensível a estresse. Além disso, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica com tolerância aperfeiçoada a estresses ambientais, tais como estresse por alta temperatura ou desidratação, na qual esse gene foi introduzido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GENE, PROTEÍ-NA RECOMBINANTE, VETOR RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PREPA-RAR UMA PLANTA TRANSGÊNICA E PARA APERFEIÇOAR A TOLERÂN-CIA A ESTRESSE DE UMA PLANTA".

campo da TÉCNICA

A presente invenção refere-se a um fator de transcrição indutívelpor estresse, derivado do milho, um gene que codifica o mesmo e um méto-do para usar o mesmo.

ANTECEDENTE DA TÉCNICA

As plantas possuem mecanismos de tolerância para enfrentardiversos tipos de estresses ambientais na natureza, tais como desidratação,alta temperatura, congelação ou estresse por sal. Considera-se que os genesque reagem a esses diversos tipos de estresses ambientais se sobreponham, econsidera-se que a tolerância a cada estresse seja atingida como resultadode respostas intracelulares intimamente relacionadas (Plant Physiol., 115: 327-334, 1997). Porém, genes que reagem a cada estresse são diferentes entreestresses por temperatura, desidratação e sal e sugere-se que esses genestenham sistemas para reconhecer separadamente cada estresse.

No passado, os presentes inventores isolaram e identificaramfatores de transcrição que se ligam a um elemento eis, sensível a estresses,especificamente ativam a transcrição de genes localizados a jusante dosmesmos, e conferem tolerância a estresses às plantas. Exemplos incluem osgenes DREB, tais como os genes DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB2A eDREB2B, de Arabidopsis thaliana (Publicação de Patente Japonesa (kokai)No. 10-228457 A (1998)). Eles informaram que a introdução e superexpres-são dos genes em uma planta possibilitaram que a tolerância a estressesseja conferida sem o retardamento de uma planta (Publicação de PatenteJaponesa (kokai) No. 10-292348 A (1998)).

As proteínas de DREB são classificadas grosseiramente no tipoDREB1 e no tipo DREB2, e os dois têm domínios de ligação de DNA (domí-nios AP2/ERF) que reconhecem e se ligam à seqüência de DRE. Ortólogosde DREB1 dos genes DREB em diversas plantas, tais como arroz e milho,foram estudados (The Plant Cell Physiology, 45: 1042-1052, 2004); porémos tipos DREB2 praticamente não foram estudados e exemplos de ortólogosde DREB2 estão limitados a pervinca de Madagascar ORCA1, arroz Os-DREB2A e similares.

Os genes DREB1 têm uma seqüência de D/SEV/LR conservadano domínio de AP2/ERF, e os genes DREB2 têm a seqüência de AEIR.Considera-se que essa diferença diferencie suas propriedades de ligação aoDNA (The Plant Cell, 10:1-17, 1998).

Plantas que superexpressam DREB1A, que é do tipo DREB1,apresentam uma tolerância aperfeiçoada a estresses por desidratação, sal ebaixas temperaturas; mas, plantas que superexpressam DREB2A, que é dotipo DREB2, ou um ortólogo de arroz do mesmo, OsDREB2A, não expressamum fenótipo claro ou tolerância a estresses aperfeiçoada (The Plant Cell, 10:1-17, 1998). Isto é, a ativação dos tipos DREB2, que era conhecida, necessitoude alguma modificação, tal como remoção de uma região específica.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção destina-se a identificar um gene derivadode milho, do tipo DREB2, e pôr à disposição uma nova planta tolerante aestresses ambientais, através da análise da função desse gene identificado.

A presente invenção conseguiu identificar um gene DREB2Acongênito do milho e designou o mesmo como "ZmDREB2A". Diferentemen-te de DREB2A, ZmDREB2A apresenta a atividade de um fator de transcriçãosem modificação e aperfeiçoa a tolerância a estresses ambientais de plan-tas. Além disso, verificou-se que ZmDREB2A aperfeiçoa a tolerância a altastemperaturas.

Especificamente, a presente invenção refere-se a um gene quecodifica ZmDREB2A, que é um fator de transcrição derivado de um milho.Mais especificamente, esse gene compreende os seguintes DNA (a) ou (b):

(a) DNA que consiste na seqüência de nucleotídeo, tal comomostrada em SEQ ID NO: 1; ou

(b) DNA derivado de milho, que se hibridiza sob condições rígi-das com DNA constituído de uma seqüência de nucleotídeo que é comple-mentar ao DNA constituído da seqüência de nucleotídeo, tal como mostradaem SEQ ID NO: 1 e codifica uma proteína que regula a transcrição de umgene localizado a jusante de um elemento sensível a estresse.

O gene da presente invenção codifica a seguinte proteína (c) ou (d):

(c) uma proteína que consiste na seqüência de aminoácido, talcomo mostrada em SEQ ID NO: 2; ou

(d) uma proteína derivada de milho, que consiste em uma se-qüência de aminoácido derivada da seqüência de aminoácido, tal como mos-trada na SEQ ID NO: 2 por remoção, substituição ou adição de um ou maisaminoácidos e regula a transcrição de um gene localizado a jusante de umelemento sensível a estresse.

O gene da presente invenção é capaz de regular a tolerância deuma planta a estresses ambientais, tais como estresse por desidratação, altatemperatura ou sal.

A presente invenção também põe à disposição a proteína recombinante (c) ou (d) acima.

Essa proteína recombinante pode ser obtida introduzindo o geneda presente invenção em uma célula hospedeira adequada, deixando que ogene se expresse na mesma e recuperar o produto resultante de uma solu-ção de cultura ou similar.

A presente invenção também põe à disposição um vetor recom-binante, que compreende o gene da presente invenção e uma célula hospe-deira ou planta transgênica, que foi transformado com esse vetor.

A planta transgênica na qual o gene da presente invenção foiintroduzido e expressado a um nível alto apresenta tolerância aperfeiçoada aestresses ambientais, tais como estresses por desidratação, alta temperatu-ra ou sal. A presente invenção também põe à disposição um método paraaperfeiçoar a tolerância a estresses de uma planta através da introdução dogene da presente invenção nessa planta.

O gene ZmDREB2A da presente invenção apresenta atividadede um fator de transcrição, sem modificação, e pode aperfeiçoar a tolerânciaa estresses ambientais de plantas, diferentemente do DREB2A conhecido ouum ortólogo do mesmo (por exemplo, OsDREB2A). Além disso, o gene Zm-DREB2A também pode aperfeiçoar a tolerância à alta temperatura de plantas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1A mostra uma seqüência de nucleotídeo de compri-mento total do cDNA de forma longa de ZmDREB2A. A figura 1A mostrauma seqüência de cDNA de comprimento total do ZmDREB2A, que compre-ende uma parte que é considerada como sendo um íntron. Uma parte subli-nhada indica um íntron.

A figura 1B mostra uma seqüência de nucleotídeo e uma se-quência de aminoácidos putativa do cDNA de forma curta de ZmDREB2A. Odomínio de AP2 está sublinhado e indicado por caracteres alfanuméricos, eo sinal de transporte nuclear está sublinhado com linha dupla. Muitos amino-ácidos ácídicos estão presentes no terminal C e, desse modo, o terminal C éconsiderado como sendo um domínio de ativação transcricional.

A figura 2(A) mostra os resultados da análise Northern do geneZmDREB2A em milho. A figura 2(B) mostra os resultados da amplificaçãosimultânea do cDNA de forma curta e do cDNA de forma longa por RT-PCR.Dois grupos são observados no momento da aplicação de cada forma deestresse (estresse por baixa temperatura por 24 horas, estresse por altatemperatura por 10 minutos, estresse por desidratação por 1 hora, e estres-se por NaCI por 24 horas; D: o controle positivo da forma longa; Β: o controlepositivo da forma curta; Ν: o controle negativo).

A figura 3 mostra os resultados da análise de expressão do mR-NA de forma longa e mRNA de forma curta por RT-PCR (♦: mRNA de formalonga; mRNA de fomra curta; forma longa não tratada: 1) figura 3(A) mos-tra os resultados da análise de expressão do mRNA de forma longa e domRNA de forma curta por RT-PCR; figura (3B) mostra a quantidade alteradade mRNA de forma longa e que de mRNA de forma curta, representados porum gráfico que indica a mudança da quantia sem aplicação de estresse.

A figura 4 mostra os resultados da análise Southern do geneZMDREB2A no milho: à esquerda: condições de baixa constrição (0,5% deSSC, 0,5% de SDS, 50°C); à direita: condições de alta constrição (0,1% deSSC1 0,1% de SDS, 65°C).

A figura 5A mostra os resultados da análise de atividade de Zm-DREB2A (atividade da proteína de 2 modalidades de ZmDREB2A), usando oprotoplasto T87. O valor experimental é determinado dividindo a atividade deGUS pela atividade de LUC, e o valor obtido com o uso de um vetor apenasé mostrado com 1 como um controle: DREB2A FL: DREB2A de comprimentolocal; DREB2A CA; DREB2A modificado.

A figura 5B mostra os resultados da análise de domínio ativo deZmDREB2A (uma variante de ZmDREB2A removida internamente), usandoo protoplasto T87. O valor experimental é determinado dividindo a atividadede GUS pela atividade de LUC, e o valor obtido com o uso de um vetor vazioé mostrado com 1 como um controle.

A figura 6 mostra os resultados da pesquisa de homologia deuma seqüência de aminoácido parcial de ZmDREB2A. Milheto perlífero(Pennisetum glaucum: PgDREB2A), cevada (Hordeum vulgare: HvDRFI),arroz (Oryza sativa: OsDREB2B). Impressões em vermelho indicam parteshomólogas = *: aminoácido conservado por 4 seqüências; .: aminoácidoconservado por 3 seqüências.

A figura 7 mostra os níveis de expressão de ZmDREB2A erd29A em Arabidopsis thaliana, que superexpressa ZmDREB2A.

A figura 8 mostra as características de Arabidopsis thaliana, quesuperexpressa ZmDREB2A. (A) O fenótipo de Arabidopsis thaliana, que su-perexpressa ZmDREB2A: foi observada a morfologia sob condições decrescimento comuns. A parte superior mostra uma planta que foi cultivadapor 21 dias em meio de ágar; e a parte inferior mostra uma planta 35 diasapós a semeadura. Essa planta foi cultivada por 2 semanas em um meio deágar e depois transplantada no solo (isto é, 15 dias depois de transplantada).Uma variedade introduzida de vetor vazio foi usada como uma variedade dotipo silvestre. (B) A expressão de ZmDREB2A e de genes induzidos sob ca-da estresse, uma estresse de baixa temperatura foi aplicada colocando aplanta a 5°C, a estresse de desidratação foi induzida colocando a planta ex-traída do meio em uma placa de petri e tratando a planta na mesma, à tem-peratura ambiente. A estresse de sal foi induzida colocando a planta em 250mM de NaCl por 5 horas.

- A figura 9 mostra os resultados de um teste de tolerância a es-tresses de Arabidopsis thaliana, que superexpressa ZmDREB2A. (A) Tole-rância à congelação: parte superior: o controle; parte inferior: após o trata-mento por congelação; (B) tolerância à desidratação: valores numéricos entreparênteses indicam as relações de contagens viáveis/número de amostras.

A figura 10 mostra a tolerância à estresse por alta temperatura deArabidopsis thaliana, que superexpressa ZmDREB2A, usando o promotor 35S.

A figura 11 mostra plantas às quais foi aplicada uma carta poralta temperatura e a relação de sobrevivência das mesmas (desvio médio epadrão (N>50)). No desenho, WT indica uma planta de controle, na qualZmDREB2A não foi introduzido. A, B e C indicam, cada um deles, uma plan-ta na qual foi introduzido ZmDREB2A (3 linhas).

A figura 12 mostra os resultados da análise Northern de plantasque foram cultivadas sob condições de crescimento comuns, sob condiçõesde estresse por alta temperatura, sob condições de estresse por sal e sobcondições de estresse por desidratação. No desenho, WT indica uma plantade controle, na qual ZmDREB2A não foi introduzido; 35S: ZmDREB2A-a,35S: ZmDREB2A-b, e 35S: ZmDREB2A-c, cada um dos quais indica umaplanta na qual ZmDREB2A foi introduzido (3 linhas).

A figura 13 mostra a tolerância a estresse de Arabidopsis thalia-na, que superexpressa ZmDREB2A, usando o promotor rd29A indutível porestresse. No sendo, rd29A: ZmDREB2A-a, rd29A: ZmDREB2A-b, e rd29A:ZmDREB2A-c, cada um dos quais indica uma planta na qual ZmDREB2A foiintroduzido (3 linhas).

A figura 14 mostra a tolerância à estresse por alta temperaturada Arabidopsis thaliana, que superexpressa DREB2A ativo (DREB2A modifi-cado usando o promotor 35S.

Esta especificação inclui parte ou todo o teor, tal como descritona especificação do Pedido de Patente Japonês No. 2005-270970, que é umdocumento de prioridade do presente pedido.MELHORES MODOS PARA EXECUTAR A INVENÇÃO

O gene da presente invenção é um gene derivado de milho, quecodifica um fator de transcrição, que se liga a um elemento eis localizado amontante dos genes que codificam proteínas reativas a estresses, expres-sadas em resposta a estresses ambientais, tais como estresses por tempe-ratura, desidratação ou sal, desse modo ativando a transcrição. Exemplosespecíficos do elemento eis acima incluem elemento sensível a desidratação(DRE), elemento sensível a ácido abscísico (ABRE), e elemento sensível abaixa temperatura. A proteína codificada pelo gene da presente invençãofunciona para ativar a transcrição de genes localizados a jusante dos ele-mentos sensíveis a estresse mencionados acima (DRE e similares).

O gene de acordo com a presente invenção pode ser identifica-do, por exemplo, tal como descrito abaixo.

1. Identificação do gene da presente invenção

O gene de acordo com a presente invenção pode ser detectadocom base na homologia com um gene conhecido com funções análogas; istoé, um gene que codifica um fator de transcrição específico para um genetolerante a estresse de uma planta. Coleções de mRNA e cDNA de milho ouuma biblioteca de genomas de milho pode ser preparada e pode ser subme-tida a uma detecção. Alternativamente, um banco de dados existente deDNA de milho pode ser submetido a uma detecção.

Os genes detectados são submetidos a uma clonagem adequa-da e todas as seqüências de nucleotídeos dos mesmos são determinadas deacordo com métodos convencionais. A sequenciação de nucleotídeos incluio método de modificação química de Maxam-Gilbert ou o método de termi-nação de cadeia de dideoxinucleotídeo, usando um fato M13. Normalmente,a sequenciação é realizada usando um sequenciador de nucleotídeo auto-mático (por exemplo, 377 DNA Sequencer Perkin-Elmer).

Desse modo, 2 tipos de cDNAs ( ZmDREB2A forma curta: SEQID NO: 1; ZmDREB2A forma longa: SEQ ID NO: 3) foram isolados como or-tólogos de DREB2A derivados de milho. Analisando os ORFs dos mesmos,foram identificadas proteínas codificadas pelos genes de interesse, as prote-ínas ZmDREB2A (forma curta: SEQ ID NO:2; forma longa: SEQ ID NO: 4).Um cDNA mais longo (isto é, a forma longa) dos 2 tipos identificados de cD-NAs compreendia um íntron de 53 bp, e o outro sDNA (isto é, a forma curta)não compreendia o mesmo. Devido à presença do íntron, ocorreu uma mu-dança de estrutura e deduziu-se que a seqüência de aminoácido codificadaera muito curta. Em contraste, deduziu-se que a seqüência de aminoácidocodificada pela forma curta era de um tipo de DREB2.

A figura 1A mostra a seqüência de nucleotídeo do cDBA de for-ma longa e a figura 1B mostra a seqüência de nucleotídeo e a seqüência deaminoácido putativa do cDNA de forma curta. Tal como descrito abaixo, ocDNA de forma curta funciona como uma forma ativa do gene ZmDREB2A,e esse gene ativo ZmDREB2A (SEQ ID NO: 1) é referido como o gene dapresente invenção.

O gene de acordo com a presente invenção não está limitado aogene que compreende a seqüência de nucleotídeo, tal como mostrada emSEQ ID NO: 1. Um DNA que compreende um gene, que é hibridizável sobcondições constritivas com DNA que compreende uma seqüência de nucleo-tídeo que é complementar ao DNA que compreende uma seqüência de nu-cleotídeo, tal como mostrada em SEQ ID NO:1, é também o gene da presen-te invenção, desde que ele codifique proteínas que regulam a transcrição degenes localizados a jusante de um elemento sensível a estresse. Sob "con-dições constritivas", a hibridização é realizada com uma concentração deformamida de 30%-50%, a 37°C a 50°C, em uma solução de 6 χ SSC. Depreferência, a hibridização é realizada com uma concentração da formamidade 50%, a 42°C, em uma soluçãod e 6 χ SSC.

Os genes da presente invenção codificam proteínas, que com-preendem seqüências de aminoácido, tais como mostradas em SEQ ID NO:2. Ainda que a proteína compreenda uma seqüência de aminoácido derivadada seqüência de aminoácido, tal como mostrada em SEQ ID NO:2 por remo-ção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos, os genes que codi-ficam essas proteínas estão dentro do âmbito dos genes da presente inven-ção, desde que essa proteína possa regular a transcrição dos genes Iocali-zados a jusante de um elemento sensível a estresse. O termo "mais amino-ácidos" refere-se, de preferência, a 20 ou menos e, de modo particularmentepreferido, a 5 ou menos aminoácidos.

A introdução de mutação no gene da presente invenção podeser realizada por técnicas convencionais, tais como o método de Kunkel, ométodo duplex interrompido ("gapped duplex") ou variações do mesmo, u-sando um kit de introdução de mutação (por exemplo, Mutant-K (Takara) ouMutant-G (Takara)), utilizando, por exemplo, mutagênese dirigida à posiçãoou usando um LA PCR in vitro Mutagenesis Series Kit (Takara).

Uma vez que a seqüência de nucleotídeo para o gene da pre-sente invenção tenha sido determinada, o gene da presente invenção podeser obtido, quer por síntese química, por PCR usando o cDBA ou DBA ge-nômico do gene como um gabarito, quer pela hibridização do fragmento deDNA com a seqüência de nucleotídeo acima como um sonda.2. Análise da capacidade de ligação ao DRE e capacidade de ativar a trans-crição das proteínas da presente invenção(1) Análise da capacidade de ligação ao DRE

A capacidade da proteína de acordo com a presente invençãode ligar-se ao DRE pode ser confirmada pelo teste de mudança no gel (U-rao, T. et al., Plant Cell 5:1529-1539, 1993), usando uma proteína de füsãocomposta da proteína, GST e similar. A proteína de acordo com a presenteinvenção pode ser preparada ligando o gene de acordo com a presente in-venção a jusante da região de codificação da glutadiona S transferase de(GST) de um plasmídio que codifica o gene de GST (por exemplo, vetorpGEX-4T-1: Pharmacia), de tal modo que as estruturas de leitura dos doisgenes coincidam uma com a outra, cultivando E. coli que foi transformadocom o plasmídio, sob condições que induzem a síntese da proteína de fu-são, e purificando a proteína do E. coli transformado.

G teste de mudança no gel é um método para examinar a intera-ção entre DNA e uma proteína. Um fragmento de DNA que contém DRE,marcado com 32P ou similar, é misturado com a proteína de fusão descritaacima e incubado, e a mistura resultante é submetida a uma eletroforese.Depois da secagem, o gel é autorradiografado para detectar os grupos quemigraram para o lado posterior, como resultado da ligação do fragmento deDBA com a proteína. A ligação específica da proteína de acordo com a pre-sente invenção à seqüência de DRE pode ser confirmada mostrando que ogrupo acima mencionado não é detectado quando é usado um fragmento deDNA que contém uma seqüência de DRE mutante.

(2) Análise da capacidade de ativar a transcrição

A capacidade de ativar a transcrição das proteínas da presenteinvenção pode ser analisada por um teste de transativação usando um sis-tema de protoplasto de milho. Por exemplo, cDNA de ZmDREB2A é ligadoao plasmídio pBI221 (CIontech)1 que contém um promotor de CaMV35S paraconstruir um plasmídio eficiente. Por outro lado, o fragmento de DNA quecontém DRE é ligado a montante do promotor de TATA, localizado a mon-tante de um gene de β-glucoronidase (GUS) para construir um plasmídiotransmissor. Subseqüentemente, esses dois plasmídios são introduzidos emprotoplastos de milho e, depois, a atividade de GUS é medida. Se a ativida-de de GUS for aumentada pela expressão simultânea da proteína de Zm-DREB2A, deduz-se que a proteína de ZmDREB2A expressada nos proto-plastos está ativando a transcrição através da seqüência de DRE.

Na presente invenção, a preparação de protoplastos e introdu-ção de DNA de plasmídio nos protoplastos podem ser realizadas pelo méto-do de Abel et al. (Abel, S. et al., Plant J. 5:421-427, 1994). A fim de minimi-zar erros experimentais resultantes de diferenças nas eficiências de introdu-ção do dNA de plasmídio, um plasmídio, no qual um gene de Iuciferase estáligado a jusante do promotor de CaMV35S, pode ser introduzido nos proto-plastos, junto com os dois plasmídios descritos acima, e a atividade de β-glucurodinase contra a atividade de Iuciferase pode ser determinada. De-pois, o valor determinado pode ser usado para indicar a capacidade de ativara transcrição. A atividade de β-glucurodinase pode ser determinada pelo mé-todo de Jefferson et al. (Jefferson, R.A. et al., EMBO J. 83:8447-8451, 1986);e a atividade da Iuciferase pode ser determinada usando o kit de teste Pica-Gene Luciferase (Tokyo Ink).3. Preparação de vetores recombinantes e transformantes(1) Preparação de vetores recombinantes

O vetor reeombinante da presente invenção pode ser obtido li-gando (inserindo) o gene da presente invenção em um vetor apropriado. Ovetor no qual o gene da presente invenção deve ser inserido não está parti-cularmente limitado, desde que seja replicável em um hospedeiro. Por e-xemplo, DNA de plasmídio, DNA de fago, ou similar podem ser usados. DNAde plasmídio inclui: plasmídios para hospedeiros de E. coli, tais como p-BR322, pBR325, pUC118 e pUC119; plasmídios para hospedeiros de Bacil-Ius subtilis, tais como pUB110 e pTP5; plasmídios para hospedeiros de Ieve-do, tais como YEp13, YEp24 e YCp50; e plasmídios para hospedeiros decélulas de plantas, tais como pBI221 e pBI1121. DNA de fago inclui fago λ esimilar. Além disso, um vetor de vírus animal, tal como um vetor de retrovírusou de vírus de vaccinia ou um vetor de vírus de inseto, tal como um vetor debaculovírus, também pode ser usado.

A fim de inserir o gene da presente invenção em um vetor, podeser usado, por exemplo, um método no qual o DNA purificado é clivado comuma enzima de restrição apropriada e depois inserido na posição de restri-ção ou na posição de multiclonagem de um DNA de vetor apropriado paraligação no vetor. O gene da presente invenção deve ser incorporado nó ve-tor de tal modo que a função do gene seja expressada. Para esse fim, a adi-ção a um promotor e ao gene da presente invenção, os que contêm elemen-tos eis, tais como realçador, um sinal de divisão, sinal de poli(A) adição,marcador de seleção, seqüência de ligação de ribossoma (seqüência de SD)ou similares, podem ser ligados ao vetor da presente invenção, caso desejado.Exemplos de marcadores de seleção são gene de redutase de diidrofolato, ge-ne de tolerância à ampicilina, gene de tolerância à neomicina, e similares.(2) Preparação de transformantes

Os transformantes da presente invenção podem ser obtidos pelaintrodução do vetor reeombinante da presente invenção em um hospedeiro,de modo que o gene de interesse possa ser expressado. O hospedeiro não estáparticularmente limitado, desde que o gene da presente invenção possa ser ex-pressado no mesmo. Exemplos específicos do hospedeiros incluem Escherichiabactéria, tal como E. coii, bactérias de Bacillus, tal como Bacillus subtilis, bacté-rias de Pseudomonas, tal como Pseudomonas putida; bactérias de Rhizobiium,tal como Rhizobium melilotr, levedos, tais como Saccharomyces cerevisiae e S-chizosaccharomyces pombe; variedades de células vegetais, estabelecidas deArabidopsis thaüana, tabaco, milho, arroz ou cenoura etc., ou protoplastos pre-parados dessas plantas; células animais, tais como células CÓS e célulasCHO; e células de insetos, tais como células Sf9 e células Sf21.

Quando uma bactéria, tal como E. coii, é usada como hospedeiro,o vetor recombinante da presente invenção é capaz de replicação autônomadentro do hospedeiro e, ao mesmo tempo, está constituído, de preferência, deum promotor, uma seqüência de ligação a ribossoma, do gene da presenteinvenção e de uma seqüência de terminação de transcrição. O vetor tambémpode conter um gene para regular o promotor. Variedades de Escherichiacoli, tais como HMS174(DE3), K12 ou DH1 podem ser usadas. Variedadesde Bacillus subtilis, tais como MI114 ou 207-021 podem ser usadas.

Qualquer promotor pode ser usado, desde que ele seja capaz dedirigir a expressão do gene de interesse em um hospedeiro, tal como E. coii.Por exemplo, um promotor derivado de E. coii ou de fago, tal como promotorde trp, promotor de lac, promotor de Pl ou promotor de PR, pode ser usado.Um promotor artificialmente executado e alterado, tal como promotor de tac,também pode ser usado. Métodos para itnroduzir o vetor recombinante emuma bactéria não estão particularmente limitados, e exemplos dos mesmosincluem um método que usa íons de cálcio (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 69:2110-2114, 1972) e eletroporação.

Quando levedo, tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosac-charomyces pombe, ou Pichia patoris, é usado como hospedeiro, o promotornão está particularmente limitado, e qualquer promotor pode ser usado, des-de que ele seja capaz de dirigir a expressão do gene de interesse em leve-do. Por exemplo, promotor de gah, promotor de gal10, promotor de proteína dechoque térmico, promotor de MFaI, promotor de PH05, promotor de PGK,promotor de GAP, promotor de ADH ou promotor de AOX1, podem ser usados.Um método para introduzir o vetor recombinante em Ievedo nãoestá particularmente limitado, e exemplos do mesmo incluem eletroporação(Becker, D.M. et al., Methods Enzymol. 194:182-187, 1990), o método de esfe-roplasto (Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:1929-1933, 1978) e ométodo de acetato de lítio (ltoh, H., J. Bacteriol., 153:163-168, 1983).

Quando uma célula vegetal é usada como hospedeiro, por e-xemplo, são usadas variedades de células estabelecidas de arroz, milho,trigo, Arabidopsis thaliana, tabaco, cenoura etc. ou protoplastos preparadosdessas plantas. Nesse caso, o promotor a ser usado não está particularmen-te limitado, desde que seja capaz de dirigir a expressão do gene de interes-se em plantas. Exemplos dos mesmos incluem o promotor 35SRNA do vírusde mosaico de couve-flor, promotor do gene rd29A e promotor rbcS.

Um método para introduzir o vetor recombinante em uma plantainclui o método de Abel et al., usando polietilenoglicol (Abel, H. et al., Plant J.5:421-427, 1994) e eletroporação. Quando uma célula animal é usada comohospedeiro, por exemplo, células COS-7 de símio ou células Vero, célulasde ovário de hamster chinês (células de CHO), células L de camundongo,células GH3 de rato, células FL humanas e promotor de SRa, promotor deSV40, promotor de LTR, promotor de CMV, ou similar, pode ser usada. Opromotor de gene primitivo de citomegalovírus humano ou similar tambémpode ser usado.

Para introduzir o vetor recombinante em uma célula animal, podeser usado eletroporação, o método de fosfato de cálcio, lipofecção, ou simi-lar. Quando uma célula de inseto é usada como hospedeiro, por exemplo,células Sf9, células Sf21, ou similares, podem ser usadas. O vetor recombi-nante pode ser introduzido em uma célula de inseto pelo método de fosfatode cálcio, lipofecção, eletroporação ou similar.

4. Produção das proteínas recombinantes de acordo com a presente invenção

A proteína recombinante da presente invenção é uma proteínaque tem uma seqüência de aminoácido codificada pelo gene da presenteinvenção ou uma proteína que tem uma seqüência de aminoácido com pelomenos uma mutação de aminoácido na seqüência de aminoácido descritaacima e que é capaz de regular a transcrição de genes localizados a jusantede um elemento sensível a estresse.

A proteína da presente invenção pode ser obtida cultivando otransformante em um meio e recuperando a proteína do produto de culturaresultante. O termo "produto de cultura" significa qualquer um dos seguintesmateriais: material flutuante de cultura, células cultivadas, micro-organismoscultivados ou células ou micro-organismos desintegrados. O transformanteda presente invenção em um meio é cultivado por métodos convencionaispara cultivar um hospedeiro.

Como meio para cultivar o transformante obtido de um hospedei-ro de micro-organismo, tal como E. coli ou levedo, pode ser usado tanto ummeio natural como sintético, desde que ele contenha fontes de carbono, fon-tes de nitrogênio e sais inorgânicos assimiláveis pelo micro-organismo e sejacapaz de cultura eficiente do transformante. Quando uma célula vegetal éusada como hospedeiro, vitaminas, tais como tiamina e piridoxina podem seradicionadas ao meio, caso necessário. Quando uma célula animal é usadacomo hospedeiro, soro, tal como RPMI1640, pode ser adicionado ao meio,caso necessário.

Exemplos de fontes de carbono incluem: carboidratos, tais comoglicose, frutose, sacarose e amido; ácidos orgânicos, tais como ácido acéticoe ácido propiônico; e álcoois, tais como etanol e propanol. Exemplos de fon-tes de nitrogênio incluem: amônia, sais de amônio de ácidos inorgânicos ouorgânicos, tais como cloreto de amônio, sulfato de amônio, acetato de amô-nio e fosfato de amônio; outros compostos que contêm nitrogênio; peptona;extrato de carne e água de maceração de milho.

Exemplos de substâncias inorgânicas incluem: fosfato monopo-tássico, fosfato dipotássico, fosfato de magnésio, sulfato de magnésio, clore-to de sódio, sulfato de ferro(l), sulfato de manganês, sulfato de cobre e car-bonato de cálcio.-Normalmente, a cultura é realizada sob condições aeróbi-cas (tal como cultura de agitação ou cultura de agitação sob aeração), a a-proximadamente 30°C a 37°C, por aproximadamente 6 horas a 3 dias. Du-rante a cultura, o pH é mantido em aproximadamente 7,0 a 7,5. O pH é ajus-tado com um ácido inorgânico ou orgânico, uma solução alcalina ou similar.

Durante a cultura, um antibiótico, tal como ampicilina ou tetraci-clina pode ser adicionado ao meio, caso necessário. Quando um micro-organismo transformado com um vetor de expressão que contém um promotorindutível é cultivado, um indutor pode ser adicionado ao meio, caso necessário.Por exemplo, quando um micro-organismo transformado com um vetor deexpressão contendo promotor de Lac é cultivado, isopropil-p-D-tiogalactopira-nosida (IPTG) ou similar pode ser adicionado ao meio. Quando um micro-orga-nismo transformado com um vetor de expressão que contém um promotor detrp é cultivado, ácido indolacrílico (IAA) ou similar pode ser adicionado ao meio.

Normalmente, a cultura é realizada na presença de 5% de CO2,a aproximadamente 30°C a 37°C, por aproximadamente 6 horas a 3 dias.Durante o cultivo, um antibiótico, tal como camamicina ou penicilina, podeser adicionado ao meio, caso necessário. Depois do cultivo, a protéina dapresente invenção é extraída por desintegração do micro-organismo ou célu-la cultivado, se a proteína é produzida no micro-organismo ou célula. Se aproteína da presente invenção for secretada fora do micro-organismo ou cé-lula, o fluido de cultura pode ser usado para as seguintes etapas, tal comoestá ou depois de ser submetido a centrifugação, para remover o micro-organismo ou células. Depois, técnicas bioquímicas convencionais usadaspara isolação/purificação de uma proteína, por exemplo, são usadas precipi-tação de sulfato de amônio, cromatografia de gel, cromatografia de troca deíons e cromatografia de afinidade, independentemente ou em uma combina-ção apropriada para isolar e purificar a proteína da presente invenção doproduto de cultura acima.

5. Preparação de plantas transqênicas, nas quais o gene da presente inven-ção foi introduzido

Uma planta transgênica tolerante a estresses ambientais e, par-ticularmente estresses por alta temperatura-e desidratação, pode ser produ-zida introduzindo DNA que codifica a proteína da presente invenção em umaplanta hospedeira por meio de técnicas de engenharia genética. Um métodopara introduzir o gene da presente invenção em uma planta hospedeira incluiintrodução indireta, tal como o método de infecção de Agrobacterium, e in-trodução direta, tal como o método de pistola de partículas, o método de po-lietilenoglicol, o método de Iipossoma e o método de microinjeção. Quando éusado o método de infecção de Agrobacterium, a planta transgênica da pre-sente invenção pode ser produzida pelo seguinte procedimento.

(1) Preparação de um vetor recombinante a ser introduzido em uma planta etransformação de Agrobacterium

Um vetor recombinante a ser introduzido em uma planta podeser preparado dividindo DNA que compreende os genes da presente inven-ção com uma enzima de restrição apropriada, ligando um Iigante apropriadoao DNA resultante, caso necessário, e inserindo o DNA em um vetor de clo-nagem para o hospedeiro de célula vegetal. Um plasmídio do tipo de vetorbinário, tal como Pbi2113Not, pBI2113, pBI01, pBI121, pGA482, pGAH oupBIG, ou um plasmídio do tipo de vetor intermediário, tal como pLGV23Neo,pNCAT ou pMON200, podem ser usados como vetores de clonagem.

Quando um plasmídio do tipo de vetor binário é usado, o genede interesse é inserido entre as seqüências de borda (LB, RB) do vetor biná-rio. O vetor recombinante resultante é amplificado em E. coli. O vetor recom-binante amplificado é depois introduzido na Agrobacterium tumefaciens C58,LBA4404, EHA101, C58CIRifR, EHA105 etc. por congelação-degelo, eletro-poração ou similar. A Agrobacterium resultante é usada para a transforma-ção da planta de interesse.

Na presente invenção, o método de conjugação de três mem-bros (Nucleic Acids Research 12:8711, 1984) também pode ser usado, alémdo método descrito acima para preparar uma Agrobacterium que contém ogene da presente invenção para infecção de plantas. Especificamente, E colicontendo plasmídio que compreende o gene de interesse E. coli que contémplasmídio adjuvante (por exemplo, pRK2013 ) e Agrobacterium são mistura-dos e= cultivador em-um-meioque contém rifampicilina e canamicina. Dessemodo, pode ser obtido Agrobacterium zigoto para infectar plantas.

Para a expressão de um gene estranho e similar em um corpode planta, um promotor e um terminador para plantas devem ser localizados,em cada caso, a montante e a jusante do gene estrutural. Exemplos especí-ficos de promotores que podem ser utilizados na presente invenção incluem otranscrito 35S derivado do vírus de mosaico de couve-flor (GaMV) (Jefferson,R.A. et al., The EMBO J. 6:3901-3907, 1987); o promotor para o gene de ubi-quitina de milho (Christensen, A.H. et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992);o promotor para o gene de sintase de nopalina (NOS); e o promotor para ogene de sintase de octopina (OCT). Exemplos específicos de terminadoresúteis incluem terminadores derivados de CaMV e terminadores derivados deNOS. Promotores e terminadores não estão limitados aos exemplos acimamencionados, desde que se saiba que funcionam em corpos de plantas.

Se o promotor usado em uma planta transgênica for um promotor responsável para a expressão constitutiva do gene de interesse (por e-xemplo, promotor 35S de CaMV) e o uso do mesmo tiver causado retarda-mento no crescimento ou retardamento da planta transgênica, um promotorque dirige a expressão transitória do gene de interesse (por exemplo, promo-tor do gene rd29A) pode ser usado. Caso necessário, uma seqüência deíntron, que intensifica a expressão do gene da presente invenção pode serlocalizado entre a seqüência de promotor e o gene. Por exemplo, o íntron dedeidrogenase de álcool de milho (AdhI) (Genes & Development 1:1183-1200, 1987) pode ser introduzido.

A fim de selecionar eficientemente células transformadas de in-teresse, é preferível usar um gene marcador de seleção eficiente, em com-binação com o gene da presente invenção. Como marcador de seleção, umou mais genes selecionados do gene de tolerância a canamicina (NPTII), ogene de fosfotransferase de higromicina (htp), que confere tolerância ao an-tibiótico higromicina em plantas, o gene de fosfinotricina acetil transferase(bar), que confere tolerância a bialafos e similar pode ser usado. O gene dapresente invenção e o gene marcador de seleção podem ser incorporados,juntosy em um único vetor. Alternativamente, dois tipos de DNAs recombi-nantes, incorporados em vetores separados, podem ser usados.(2) Introdução do gene da presente invenção em um hospedeiro

Na presente invenção, embora o hospedeiro para o transforman-te não esteja particularmente limitado, é, de preferência, uma planta. A plan-ta pode ser composta de quaisquer células de planta cultivadas, o corpo deplanta inteiro de uma planta cultivada, órgãos de plantas (tais como folhas, pé-talas, hastes, raízes, rizomas ou sementes), ou tecidos de plantas (tais comoepiderme, floema, parênquima, xilema ou feixe vascular). As plantas são, depreferência, plantas monocotiledôneas, tais como arroz, milho e trigo. Quandouma célula de planta cultivada, corpo de planta, órgãos de planta ou tecido deplanta é usado como hospedeiro, o método de infecção de Agrobacterium, ométodo de pistola de partículas, ou o método de polietilenoglicol pode serusado para introduzir o DNA que codifica a proteína da presente invençãopara transformar essa planta hospedeira pela introdução de um vetor emseções de plantas. Alternativamente, um vetor pode ser introduzido em umprotoplasto por eletroporação, para produzir uma planta transformada.

Por exemplo, quando um gene é introduzido em Arabidopsis tha-liana pelo método de infecção de Agrobacterium, a etapa de infectar a plantacom um plasmídio contendo Agrobacterium, que compreende o gene de in-teresse, é essencial. Essa etapa pode ser realizada pelo método de infiltra-ção por vácuo (CR Acad. Sei. Paris, Life Science, 316:1194, 1993).

Especificamente, Arabidopsis thaliana é cultivado em solo com-posto de partes equivalentes de vermiculita e perlita. O Arabidopis thaliana éimerso diretamente em um fluido de cultura de Agrobacterium, contendo umplasmídio, que compreende o gene da presente invenção, o milho cultivadoé colocado em um dessecador, e o produto resultante é depois aspirado comuma bomba a vácuo para 65-70 mmHg. Depois, deixa-se a planta em repou-so à temperatura ambiente por 5-10 min. O vaso de planta é transferido parauma bandeja, que é coberta com uma cobertura para manter a umidade. Nodia seguinte, a cobertura é removida. A planta é cultivada nesse estado atéter sementes de colheita.

----- Subsequente as sementes são semeadas em meio de

ágar de MS, suplementado com antibióticos apropriados para selecionar asplantas que têm o gene de interesse. Plantas de Arabidopsis thaliana culti-vadas nesse meio são transferidas para vasos e ali cultivadas. Como resul-tado, podem ser obtidas as sementes de uma planta transgênica, na qual ogene da presente invenção foi introduzido. Em geral, os genes são introduzi-dos no genoma da planta hospedeira de maneira similar. Porém, devido adiferenças nas posições específicas no genoma no qual os genes foram in-traduzidos, a expressão dos genes introduzidos varia. Esse fenômeno échamado de "efeito de posição". Testando os transformantes com fragmen-tos de DNA do gene introduzido como uma sonda por Northern blotting, épossível selecionar os transformantes, nos quais o gene introduzido estáexpressado a um nível mais alto.

A confirmação de que o gene de interesse foi integrado na plan-ta transgênica, na qual o gene da presente invenção foi introduzido e nasplantas da geração subsequente da mesma, pode ser feita extraindo DNA decélulas e tecidos dessas plantas e detectando o gene introduzido por PCRou análise Southern, que são métodos convencionais na técnica.(3) Análise do nível de expressão e posição de expressão do gene da pre-sente invenção em tecidos de plantas

O nível de expressão e a posição de expressão de um gene emuma planta transgênica, na qual o gene da presente invenção foi introduzido,podem ser analisados extraindo RNA das células e tecidos da planta e de-tectando do mRNA do gene introduzido por RT-PCR ou análise Northern,que são métodos convencionais na técnica. Alternativamente, o nível de ex-pressão e a posição de expressão podem ser analisados diretamente porWestern blotting ou similar do produto de gene da presente invenção usandoum anticorpo contra o produto acima.(4) Alterações nos níveis de mRNA de diversos genes em uma planta trans-gênica, na qual foi introduzido o gene da presente invenção

É possível identificar por hibridização Northern os genes, cujosníveis de expressão podem ter se alterado, como resultado da ação do fatorde transcrição da presente invenção em -uma planta transgênica, na qual foiintroduzido o gene da presente invenção.

Por exemplo, plantas cultivadas hidroponicamente ou similar sãosubmetidas a estresse ambiental por um período de tempo específico (porexemplo, 1 a 2 semanas). Exemplos de estresses ambientais incluem es-tresses por alta temperatura, desidratação e sal. Por exemplo, a estresse pordesidratação pode ser imposta arrancando a planta do meio hidropônico esecando a mesma sobre um papel de filtro por 10 minutos a 24 horas. A es-tresse por alta temperatura pode ser imposta mantendo a planta a 30°C a50°C por 10 minutos a 24 horas. Estresses por sal podem ser impostas, porexemplo, substituindo o meio hidropônico com uma solução de NaCI de 50 a500 mM e mantendo a planta por 10 minutos a 24 horas.

RNAs totais são preparados separadamente de uma planta decontrole, que não foi submetida a nenhuma estresse, e os RNAs totais resultan-tes são submetidos a eletroforese. Os padrões de expressão podem ser anali-sados por hibridização Northern, usando a sonda do gene a ser observado.

(5) Avaliação da tolerância da planta transqênica a estresses ambientais

A tolerância a estresses ambientais da planta transgênica, naqual foi introduzido o gene da presente invenção, pode ser avaliada colo-cando a planta transgênica em um vaso contendo um solo constituído devermiculita, perlita e similar, expondo a planta a diversas estresses ambien-tais e examinando a sobrevivência da planta. Estresses ambientais incluemestresses por alta temperatura, desidratação e sal. Por exemplo, tolerância àestresse por desidratação pode ser avaliada deixando a planta sem irrigaçãopor 2 a 4 semanas e depois examinando a sobrevivência. A tolerância à es-tresse por alta temperatura pode ser avaliada deixando a planta a 30°C a50°C por 30 minutos a 10 dias, cultivando a planta a 20°C a 30°C por 2 diasa 3 semanas, e depois examinando a taxa de sobrevivência. A tolerância àestresse por sal pode ser avaliada, por exemplo, deixando a planta em 200 a600 mM de NaCI por 1 hora a 7 dias, cultivando a mesma a 20°C a 35°C por1 a 3 semanas, e depois examinando sua taxa de sobrevivência.

6. Determinação de níveis de estresse em plantas

A transcrição do gene de acordo com a presente invenção é ati-vada por estresse por baixa temperatura, estresse por desidratação, estressepor sal ou estresse por alta temperatura. Portanto, a determinação do nível detranscrição do gene da presente invenção possibilita a determinação do nívelde estresse, tal como referente a estresse por baixa temperatura, estressepor desidratação, estresse por sal ou estresse por alta temperatura, à qual aplanta está submetida.

O nível de transcrição do gene de acordo com a presente inven-ção pode ser determinado, por exemplo, por análise de blot de gel de RNA,ou PCR quantitativo. Uma sonda a ser usada na análise de blot de gel deRNA pode ser produzida de acordo com qualquer método convencional, ba-seado no gene de acordo com a presente invenção e/ou uma região de 10O-1000 bp, que compreende uma seqüência específica adjacente ao gene. Uminiciador a ser usado em PCR quantitativo pode ser preparado por qualquermétodo convencional, com base na seqüência na região que codifica o geneda presente invenção ou na região adjacente à mesma.

A sonda ou iniciador descritos acima podem ser usados em umkit para determinar o nível de transcrição do gene de acordo com a presenteinvenção.7. Outros

Além disso, a proteína de acordo com a presente invenção podeser utilizada produzindo um anticorpo contra a proteína. O anticorpo podeser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O método para produzir um anti-corpo não está particularmente limitado e pode ser realizado de acordo comqualquer método convencional (veja, por exemplo, Sambrook, J. et al., Mole-cular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). O anticorpo podeser utilizado, por exemplo, na detecção da proteína de interesse por Westernblotting ou imunoprecipitação.EXEMPLOS

A presente invenção é descrita mais detalhadamente com refe-rência aos seguintes exemplos, embora o alcance da presente invenção nãoesteja limitado aos mesmos.Exemplo 1: Isolação do gene ZmDREB2A1 . Pesquisa de homoloqia em banco de dados

Com base na seqüência do domínio de AP2/ERF, a pesquisa dehomologia foi realizada usando BLAST em bancos de dados de DNA de mi-lho do GenBank, e diversas seqüências de EST foram obtidas. Com base naseqüência de EST mais longa, foram criados os seguintes iniciadores paraRT-PCR, e dois tipos de cDNAs foram obtidos de RNA de milho por meio deRT-PCR.

Iniciadores para isolação de ZmDREB2A

AY108198 Avanço: 5'-GGTCTTATCGACTCCAACAAGAAC-3' (SEQ ID NO: 5)

AY108198 Inversão: 5'-AAAAGCAAGCACTCTTTTTA-3' (SEQ ID NO: 6)

O cDNA de comprimento total de ZmDREB2A foi submetido asequenciação de nucleotídeo usando o Sequenciador de DNA 377 (Perkin-Elmer). Além disso, ORF foi analisado para determinar todas as seqüênciasde aminoácido.

Como resultado, a seqüência de nucleotídeo do gene de Zm-DREB2A (forma curta: SEQ ID NO: 1, forma longa: SEQ ID NO: 3) e a se-qüência de aminoácido correspondente da proteína de ZmDREB2A (formacurta: SEQ ID NO: 2, forma longa: SEQ ID NO: 4) foram identificadas. OcDNA mais longo dos dois tipos de cDNAs identificados (isto é, a forma lon-ga) compreendeu um íntron de 53 bp, e o cDNA mais curto (isto é, a formacurta) não compreendia o íntron. No cDNA de forma longa, ocorreu umamudança de estrutura no íntron, e o ORF era muito curto. O cDNA de formacurta apresentou uma estrutura do tipo DREB. A figura 1A mostra a seqüên-cia de nucleotídeo do cDNA de forma longa e a figura 1B mostra a seqüên-cia de nucleotídeo do cDNA de forma curta e uma seqüência de aminoácidoputativa do mesmo. Tal como descrito abaixo, esse cDNA de forma curtafunciona como uma forma ativa do gene de ZmDREB2A.

Exemplo 2: Análise da expressão do gene de ZmDREB2A em uma plantanão transgênica

Características de expressão do gene de ZmDREB2A em milhoforam analisadas por meio de análise Northern, RT-PCR e análise Southern.

1. Materiais e método

(1) Condições para cultivo de milho

Sementes de milho (variedade: Golden Cross Bantam) foramtratadas com 70% de etanol por 5 minutos, lavadas cuidadosamente comágua e colocadas em uma tela de aço inoxidável. A tela foi introduzida emum recipiente contendo água, e as sementes foram cultivadas em uma incu-badora a 26°C, com um fotoperíodo de 12 horas.

(2) Aplicação de estresse

As plantas que foram cultivadas hidroponicamente por 1 semanaforam submetidas às seguintes aplicações de estresse.

Estresse por baixa temperatura: a tela de aço inoxidável, comsementes sobre a mesma, foi transferida para água que foi previamente re-frigerada para 4°C, e o material resultante foi tratado nesse estado em umaincubadora a 4°C.

Estresse por alta temperatura: a tela de aço inoxidável, com se-mentes sobre a mesma, foi transferida para água que foi previamente aque-cida para 42°C, e o material resultante foi tratado nesse estado em uma in-cubadora a 37°C.

Estresse por sal: a tela de aço inoxidável com sementes sobre amesma foi tratada com uma solução de NaCl de 250 mM, e o material resul-tante foi tratado em uma incubadora a 26°C.

Estresse por desidratação: as plantas foram batidas levemente esecadas em uma toalha Kim, depois que as raízes foram cuidadosamentedrenadas.

Essas plantas foram tratadas por 0 minutos, 10 minutos, 20 mi-nutos, 40 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas e 24 horas, recuperadas, imedia-tamente congeladas em nitrogênio líquido e depois armazenadas a -80°C.

(3) Extração de RNA

Enquanto as plantas, que foram submetidas a estresse, forammantidas em um estado congelado, foram desintegradas usando o agitadorprincipal (BMS-12, Tommy), e o RNA foi extraído usando um líquido Trizol(Invitrogen) de acordo com uma técnica convencional.

(4) Análise Northern

O RNA extraído (6 μg) foi isolado, 19 μΙ de corante Northern(0,1% de BPB, 1 χ de tampão de eletroforese de RNA, 20% de formaldeído,60% de formamida, 0,033 μΙ/μΙ de EtBr) foi adicionado ao mesmo, e o mate-rial resultante foi tratado a 65°C por 15 minutos, seguido de resfriamentopara desnaturação.

- - O RNA preparado foi aplicado a um gel, e o material resultantefoi eletroforado em 1 χ de tampão de eletroforese de RNA (0,02 M de MOPS,8 mM de acetato de sódio, 1 mM de EDTA) a 90 V por 2,5 horas. O produtofoi transferido para uma membrana de náilon (Hybond-XL, Amersham) u-sando 20x de SSC durante a noite, secado ao ar por 1 hora, e tratado sobpressão reduzida a 80°C por 2 horas.

Os iniciadores foram preparados de tal modo que uma região decerca de 500 bp no terminal C específico para ZmDREB2A tornou-se umasonda. As seqüências de iniciador são tais como mostradas na tabela 1. U-sando esses iniciadores, as sondas foram preparadas por PCR. A composi-ção da solução de PCR (quantidade total: 20 μΙ) era tal como mostrada abai-xo e a solução foi preparada de acordo com o protocolo da polimerase de

DNA de KOD plus (TOYOBO).Condição de reação

10 χ tampão 2,0 μΙ

2 mM de dNTPs 2,0 μΐ

25 mM de MgCI2 0,8 μΙ

10 pmol de iniciador de avanço 1,0 μΙ

10 pmol de iniciador de inversão 1,0 μΙ

Plasmídio de solução de DNA 1,0 μΙ

polimerase KOD plus 0,4 μΙCondições de PCR95°C por 15 minutos

95°C por 15 segundos, 60°C por 30 segundos, e 68°C por 30 segundos χ 25 ciclos68°C por 7 minutos

O grupo foi confirmado por meio de eletroforese, dividido e puri-ficado. O grupo purificado foi marcado com o Kit de Marcação de BcaBEST(TaKaRa) e usado como uma sonda. Água destilada foi adicionada a umamistura de 2 μΙ de iniciador "randam", e 25 ng de solução de DNA de gabari-to para sonda, para perfazer a quantidade total de 14 μ. O material resultan-te foi aquecido para 95°C por 3 minutos, e o material resultante foi depoisresfriado em gelo por 5 minutos, para desnaturação. 10x de tamponador (2,5μl), dNTP (2,5 μl), polimerase de DNA (1 μl) e [a-32P] dCTP (5 μl) foram adi-cionados, e a mistura foi tratada a 55°C por 10 minutos. Depois da reação, oproduto de reação foi aplicado à coluna Sephadex G50 (Pharmacia) paraseparar uma sonda marcada de [a-32P]dCTP.

A membrana para a qual foi transferido o RNA foi introduzidaem um tubo de vidro, a membrana foi lavada com água destilada e 5 χ desolução de SSC (80 mM de Na Cl e 80 mM de citrato de sódio), 30 ml de umtampão de hibridização (0,5 M de Na2HPO4-12H20, 0,5M de NaH2PO4^H2O,7% de SDS e 10 mM de EDTA) foi adicionado e a pré-hibridização foi reali-zada a 65°C por pelo menos 30 minutos. Subseqüentemente, a solução foidescartada, sondas marcadas foram adicionadas a 30 ml de um tampão dehibridização fresco para uma concentração de 1,0 χ 10^6 dpm/ml, e a hibridi-zação foi realizada a 65°C durante a noite.

A membrana foi lavada com uma soluçãod e lavagem 1 (1x SSCe 1x SDS) a 65°C por 5 min e depois com uma solução de lavagem 2 (0,1 χSSC e 0,1 SDS) duas vezes por 30 minutos e uma vez por 5 minutos. De-pois de a membrana ter sido secada ao ar por pelo menos 1 hora, o sinal foidetectado. A análise do sinal foi realizada usando o Analisador de ImagensBAS2000 (Fuji Film).

(5) Análise quantitativa de RT-PCR

A diferença entre o comprimento da forma longa e o da formacurta é de apenas 53 bp. Consequentemente, os sinais não podem ser dis-tinguidos por meio de análise Nortehrn. A fim de analisar separadamente cadaexpressão, portanto, iniciadores específicos para a forma longa e para a formacurta foram preparados e a análise quantitativa de RT-PCR foi realizada.

cDNA foi sintetizado usando o kit ReverTra Ace (Toyobo). A ta-bela 4-mostra as seqüências de iniciadores específicos para o cDNA de for-ma longa e para o cDNA de forma curta.

Como um aparelho para RT-PCR quantitativo, foi usado o LightCycler (Roche) e SYBR Green Ex taq (TaKaRa) foi usado como agente dereação. 2 χ SYBR (5 μΙ), 2 pmol do iniciador de avanço, 2 pmols do iniciadorde inversão, e 3,5 μΙ de água MiIIiQ foram adicionados ao cDNA de gabarito(1 μΙ de ZmDREB2A e 0,001 μΙ de 18 SrRNA), e a reação foi deixada pros-seguir. 18 SrRNA foi usado como um padrão interno. Tabela 1 mostra asseqüências dos iniciadores usados.

Tabela 1

<table>table see original document page 27</column></row><table>

* De cima para baixo, as seqüências de iniciador mostradas na tabela 1 sãoas das SEQ ID NOS: 7 a 16 na Relação de Seqüências.

Condições de PCR_

95°C por 10 segundos

95°C por 5 segundos, 60°C por 20 segundos e 74°C por 5 segundos χ 40 ciclos

Subseqüentemente, a amplificação da seqüência de nucleotí-deos putativa foi confirmada por análise da temperatura de fusão do produtode amplificação.

A fim de quantificar os níveis de expressão, o vetor pBlueScript,que compreende os cDNAs de forma longa e forma curta de concentraçõesconhecidas incorporados no. mesmo, foi usado para preparar uma curva decalibração. A concentração determinada com base nessa curva de calibra-ção foi dividida por um padrão interno para determinar os níveis de expres-são relativos.

(6) Análise Southern

A análise genômica Southernm foi realizada a fim de determinaro número de cópias de ZmDREB2A do genoma de milho.

Os iniciadores e o kit usados eram os mesmos como os usadosem (4) acima. DNA genômico foi extraído de uma folha de milho de acordocom o método de CTAB.

DNA extraído (10 μg) foi tratado com 10 μΙ de cada uma das en-zimas de restrição SamHI1 Dra\ e Hind\\\ (TaKaRa) a 37°C, durante a noite.DNA foi recuperado da solução por meio de precipitação com etanol e dis-solvido em 300 μΙ de solução de TE. O produto foi eletroforado em gel deagarose de 1% (1x TBE) a 70 V por 6,5 horas. O material resultante foi su-cessivamente submetido à desnaturação com ajuda de uma solução ácida(0,25N HCI), uma solução de desnaturação (0,5N NaOH e 1,5M NaCI), euma solução de neutralização (0,5 M Tris-HCI e 1,5 M NaCI), nessa ordem, eo produto desnaturado foi transferido para uma membrana de náilon (Amer-sham) durante a noite.

A membrana sobre a qual o produto desnaturado foi transferidofoi submetida a hibridização com uma sonda. A mesma sonda tal como ausada na análise Northern foi usada. Esses procedimentos estão de acordocom os da análise Northern; mas, a lavagem foi realizada de 2 maneiras, talcomo abaixo:

sob condições de baixa constrição: 0,5x de SSC, 0,5x de SDS,50°C (duas vezes por 30 minutos);sob condições de alta constrição: 0,1 χ de SSC, 0,1 χ de SDS,

65°C (duas vezes por 30 minutos).2. Resultados(1) Análise Northern

Plantas que foram cultivadas hidroponicamente por 1 semanaapós a semeadura foram submetidas a diversos tipos de aplicação e estres-se e RNA extraídos dessas plantas foi usado para realizar uma experiência.A análise de expressão foi realizada pelo método Northern usando regiõesespecíficas de ZmDREB2A como sondas (figura 2A). Quando estresse portemperatura baixa foi aplicada a ZmDREB2A, a indução de expressão foiobservada 2 horas depois e uma expressão consideravelmente forte foi ob-servada 5 horas depois. Quando foi aplicada estresse por alta temperatura,a indução da expressão foi observada com tratamento a 42°C. No caso deindução da expressão por alta temperatura, foi confirmado que uma forteexpressão foi induzida por 10 a 20 minutos de tratamento e que o nível deexpressão foi gradualmente baixado, depois disso. Quando estresse por de-sidratação foi aplicada, foi observada uma expressão constante e fraca; po-rém, o nível da indução de expressão não era significativo. Quando foi apli-cada estresse por sal, uma expressão um tanto forte foi observada na raiz,10 minutos após a aplicação da estresse, e a expressão ficou mais forte como decorrer do tempo.

A expressão de ZmDREB2A foi observada, principalmente, na raiz,quando da aplicação de cada tipo de estresse, e a expressão não era significa-tiva na haste e na folha. Porém, foi observada indução de expressão na folha,quando da aplicação de estresse por baixa temperatura e alta temperatura.

Isso demonstra que a expressão de ZmDREB2A é induzidaquando da aplicação de estresse e que os padrões de expressão do mesmovariam dependendo do tipo de estresse.

(2) Análise de RT-PCR quantitativa

O iniciador de avanço do cDNA de forma curta compreende umaseqüência parcialmente homóloga à do cDNA de forma longa. Confirmou-seque esses iniciadores funcionam de um modo específico para seqüência. OcDNA de forma longa e o cDNA de forma curta foram usados como gabaritos, oPCR foi realizado adicionando esses iniciadores e a solução de reação foi ele-troforada em gel de agarose de 2%. Como resultado, constatou-se que essesiniciadores amplificam seqüências em um modo específico para gabarito.

Os iniciadores idênticos (AY108198 cDNA BamHI e AY108198R90 mais curto)estavam presentes fora do íntron, e dois fragmentos decomprimento diferente foram amplificados simultaneamente. Desse modo,foi confirmado se 2 tipos de mRNAs foram, ou não, efetivamente acumula-dos (figura 2B). Exceto pelo controle, a formação de 2 grupos de eletroforesefoi observada quando da aplicação de cada tipo de estresse. Como tanto oscDNAs de forma longa como os deforma curta desenvolvem grupos namesma posição com o controle positivo, esses grupos foram confirmadoscomo sendo cDNAs de forma longa e forma curta, e a presença de 2 tiposde clones foi confirmada.

Além disso, foram analisadas mudanças na acumulação demRNA ao longo do tempo (figs. 3A e 3B). Sem aplicação de estresse, subs-tancialmente nenhuma expressão foi observada nos dois mRNAs. Quando omRNA de forma longa foi comparado com o mRNA de forma curta, verificou-seque a quantidade do mRNA de forma longa era 1.000 vezes mais do que a domRNA de forma curta. A expressão dos mesmos foi induzida por aplicação deestresse. No total, o nível de expressão do mRNA de forma mais longa eramais alto, o nível de expressão do mRNA de forma curta tornou-se muito altaquando da aplicação de estresse, e a quantidade de mRNA de forma curtaacumulada ocasionalmente era maior do que do mRNA de forma longa, talcomo com a aplicação de estresse por alta temperatura por 10 minutos.(3) Análise Southern

Análise de Southern genômica foi realizada a fim de determinar o número de cópias do ZmDREB2A do genoma de milho (figura 4). Tal còmono caso da análise Northern, uma região terminal C de ZmDREB2A foi usa-da como sonda. A fim de inspecionar a presença de genes altamente homó-logos, a lavagem de membrana foi realizada de 2 modos, isto é, sob condi-ções altamente constritivas e sob condições de baixa constrição. Como ape- nas 1 grupo foi observado por meio do tratamento sob condições altamenteconstritivas, o número de cópias de ZmDREB2A foi considerado como sendoapenas 1. Sob condições de baixa constrição, porém, foram detectados di-versos grupos. Isso indica a presença de vários genes altamente homólogos.3. Exame ·

DREB2A de Arabidopsis thaliana é induzido por estresse pordesidratação, sal ou alta temperatura. Tal como com o caso de DREB2A, aexpressão de ZmDREB2A freqüentemente foi induzida por estresse por salou alta temperatura (figura 2A). Em contraste, a expressão do mesmo nãofoi induzida, substancialmente, pela estresse por desidratação, e a expres-são do mesmo induzida por estresse por baixa temperatura ocorreu em umtempo consideravelmente tardio. Esse padrão de expressão difere do deDREB2A. Quando estresse por desidratação foi aplicada a Arabidopsis thali-ana, o nível de expressão era continuamente fraco, de 20 minutos a 2 horasdepois da aplicação de estresse, o nível de expressão ficou consideravel-mente forte 5 horas após a aplicação de estresse, e atingiu o pico cerca de10 horas após a aplicação de estresse, e o nível de expressão após a apli-cação de estresse era substancialmente igual ao de 5 horas após a aplica-ção de estresse (Liu et al. The Plant Cell 10, 1391-1406, 1998, Nakashima etal., Plant Molecular Biology 42, 657-65, 2000). Em contraste, a expressão deOsDREB2A em arroz, por ocasião da aplicação da estresse por desidrata-ção era constantemente, em vez de transitoriamente, um tanto forte (Dubou-zet et al., descrito acima). Embora o padrão de expressão de ZmDREB2Aseja similar ao do arroz, o nível de expressão do mesmo e muito mais fraco.Arabidopsis thaliana e arroz estavam quase completamente desidratados 5horas após a aplicação de estresse; entretanto, milho não foi suficientemen-te desidratado 5 horas após a aplicação de carga. Isso indica que o milho éfortemente resistente à estresse por desidratação. Embora ZmDREB2A fos-se sensível à desidratação, as condições no espaço de 24 horas após a a-plicação da estresse por desidratação não foram consideradas como sufici-entes. Consequentemente, a expressão do mesmo não foi observada.

A expressão de ZmDREB2A foi induzida, principalmente, na raiz.Mas, quando a temperatura foi modificada, a expressão também foi obser-vada na folha e na haste. Estresse por sal foi aplicada embebendo a partedo subsolo da planta em uma solução de cloreto de sódio, e a estresse pordesidratação foi aplicada removendo a planta que havia sido submetida aocultivo hidropônico, uma vezrde uma tela-de aço inoxidável, tal carga foi a-plicada mais fortemente a parte do subsolo. No caso da estresse por tempe-ratura, a folha e a haste também recebem essa estresse e, desse modo, aexpressão de ZmDREB2A é induzida nessas partes. Embora o nível de ex-pressão de ZmDREB2A seja forte na raiz, a expressão do mesmo é obser-vada ao longo de toda a planta e a expressão é induzida imediatamente aoreceber a estresse.

Foi inspecionado como os mRNAs de forma longa e forma curtade ZmDREB2A estavam acumulados (figura 3). A expressão dos dois tiposde mRNAs foi induzida por aplicação de estresse; mas, a expressão de mR-NA de forma curta tinha mais probabilidade de ser induzida. O mRNA deforma longa tem um íntron, e um códon de parada está presente na parte deíntron. Consequentemente, a síntese de proteína é considerada como tendosido terminada. Desse modo, é necessário mRNA de forma curta quandoestresse é aplicada. Também foram acumuladas quantidades maiores demRNAs de forma curta, que são consideradas como sendo formas ativas(isso é examinado no exemplo 3), à medida que a estresse se tornou maisforte. A quantidade de mRNAs de forma curta é de cerca de 1/1.000 a dosmRNAs de forma longa, quando nenhuma estresse é aplicada; mas, a quan-tidade dos mesmos é aumentada quando da aplicação de estresse (figura3B). Isso sugere que mRNA de forma curta, ativo, é um gene que é necessá-rio quando o nível de estresse é alto. Quando é aplicada estresse por baixatemperatura, a acumulação de mRNAs de forma longa, não ativos, é aumen-tada com o decorrer do tempo, mas a acumulação de mRNAs de forma curtanão é muito significativa. Isso indica que a atividade de uma enzima, neces-sária quando o mRNA de forma curta é formado de mRNA de forma longa, édiminuída por estresse por baixa temperatura (Figura 3A).Exemplo 3: Exame do mecanismo ativador de transcrição usando protoplasto1. Material e método(1) Células cultivadas

Foram usadas células T87 cultivadas de Arabidopsis thaliana.Foram obtidas células armazenadas no Centro de BioRecursos do Institutode Pesquisas Físicas e Químicas.(2) Método de subcultura e meio

As composições do meio de crescimento (meio JPL) são mos-tradas abaixo. A cultura e a subcultura foram realizadas a 22°C, com a apli-cação contínua de uma luz branca, sob condições de agitação moderadas.Nessa experiência, foram usadas células que haviam sido subcultivadas por5 a 6 dias. —

Matérias-primas:

Matéria-prima A _Concentração (g/l)

KNO3 65,5CaCl2-H2O 4,4MgSO4 ·7Η20 3,7KH2 PO4_1, 7

Matéria-prima B _Concentração (g/l)

H3BO3 6,2

MnSO4 ·4Η20 22,3

ZnSO4 ·7Η20 10,6

KI 0,83

Na2MoO4-2 H2O 0,25CoCl2· 6H20 0,025_CuSO4«5H20_0, 025

Matéria-prima C _Concentração (g/l)

FeSO4 ·7Η20 2,7 8_Na2EDTAD2H20_3 , 72

Matéria-prima D _Concentração (g/l)

Mio-inositol 10

Glicina 0,2

Matéria-prima VT_Concentração (g/l)

Ácido nicotínico 0,5Piridoxina-HCl 0,5_Tiamina-HCl_0, 4

100 mM

Na2HPO4/KH2PO4 Concentração (g/l)

Na2HPO4* 12H20 71,62

0,2M KH2PO4 27,22

As soluções de matéria-prima acima e outros reagentes forammisturados do seguinte modo, para preparar o meio de crescimento

<table>table see original document page 34</column></row><table>

(3) Preparação do construtor (mutante de remoção)

Foi usado o vetor pGreenllE135Q. Um mutante de remoção foipreparado por meio de PCR de duas fases, com o uso de 2 pares de iniciado-res (um par do iniciador A e iniciador B e um par do iniciador C e iniciador D), deacordo com uma técnica convencional. Os iniciadores foram preparados de par-tes a serem removidas de um mutante de remoção do terminal C e PCR geral foirealizado. O vetor pGreenll foi tratado com EcoRV e BamHI a 30°C, durante anoite, e um fragmento de alvo foi inserido no mesmo. O fragmento de alvo foiamplificado pelo uso de iniciadores por PCR, tratado com EcoRV e SamHI a30°C, durante a noite,e ligado usando Ligation high (Toyobo). O plasmídio foiintroduzido em E. coli DH5oc, para obter uma variedade tolerante a canamicina.E. coli foi transformado pelo método de choque térmico. O material resultantefoi cultivado em meio de LB contendo 25 mg/ml de canamicina, durante a noite,para selecionar uma variedade tolerante. A variedade selecionada foi submeti-da à extração de plasmídeo, usando um separador de DNA automático (PI-100,Kurabo). Além disso, o material resultante foi tratado com RNase a 37°C, por 1hora, purificado por extração com fenol/clorofórmio e precipitação de etanol, edepois sequenciado usando um sequenciador (ABI3100 Genetic Analyzer, Appli-ed Biõsystem Japan). Os iniciadores usados são mostrados nas tabelas 2 a 4.Tabela 2

<table>table see original document page 35</column></row><table>

* De cima para baixo, as seqüências mostradas na tabela 2 são as de SEQID NOS: 17 a 24 da relação de seqüências

Tabela 3

<table>table see original document page 35</column></row><table>

* De cima para baixo, as seqüências mostradas na tabela 3 são as de SEQID NOS: 25 a 31 da listagem de seqüências<table>table see original document page 36</column></row><table>(4) Preparação de plasmídeo e introdução em protoplasto

DNA de plasmídio foi produzido em massa de acordo com o mé-todo de SDS alcalino, usando o kit Plasmideo Mega ou kit Maxi de Qiagen.Um plasmídio recombinante foi pré-cultivado em 2 ml de meio de LB1 con-tendo antibióticos, a 37°C, por 8 horas, transferido para 500 ml de meio deLB (composição: 10 g de bacto-tripton, 5 g de extrato de bacto-levedo, 10 gde NaCI e 1,5 ml de NaOH de 1N por litro de meio), e cultivado adicional-mente durante a noite. As células cultivadas foram coletadas, suspensas em50 ml de solução P1, e depois agitadas vigorosamente. A solução P2 (50 ml)foi adicionada, a mistura foi misturada de modo invertido, e o material resul-tante foi deixado em repouso à temperatura ambiente por 5 minutos. A issofoi adicionada a solução P3, a mistura foi agitada para cima e para baixo, 50ml de solução de FWB foram adicionados, e o produto de filtração foi remo-vido. Tampão de QBT foi adicionado ao produto de filtração, a mistura foi apli-cada à coluna e DBA de plasmídio foi extraído com ajuda do tampão de QF. Omaterial resultante foi submetido à precipitação com isopropanol, dissolvido emuma quantidade adequada de tampão de TE e a concentração foi medida.

Células T87 que haviam sido cultivadas por 5 a 6 dias foram re-cuperadas (5 g), as células foram suspensas em 100 ml de uma solução deenzima (0,4 mM de MES-KOH (pH 5,6), 0,1% de Cellulase Onozauka R-10,0,05% de Macerozyme), e a suspensão foi tratada, enquanto era agitada noescuro a 80 rpm por 2 horas, para preparar protoplastos. Os protoplastosforam lavados com Solução A (0,4 M de manitol, 0,5 mM de MES-KOH (pH5,6), 70 mM de CaCI2) e os protoplastos foram depois suspensos em umasolução de MaMg (0,4 M de manitol, 15 mM de MgCI2, 0,5 mM de MES-KOH(pH 5,6) para uma concentração de cerca de 5,0 χ 106 células/ml. Depois deterem sido adicionados 10 μg de plasmídio transmissor e plasmídio efetua-dor, 100 μΙ de uma solução de PEG-CMS (400 mM de manitol, 100 mM deCaNO3, 40% de PEG) foram adicionados, a mistura foi agitada moderada-mente, e o material resultante foi deixado em repouso sobre gelo por 30 mi-nutos. O produto foi diluído com um diluente (0,4 M de manitol, 125 mM deCaCI2, 5 mM de KCI, 5 mM de glicose, 1,5 mM de MES-KOH (pH 5,7)) ecentrifugado para remover o material flutuante. Os protoplastos foram sus-pensos em meio de MS-manitol (0,4 M de manitol foram adicionados aomeio de MS, do qual tinha sido removida a sacarina), e a suspensão foisubmetida à cultura estacionária a 22°C, no escuro, por 20 horas.

O construto efetuador usado na experiência foi preparado ligan-do cDNA contendo ZmDREB2A de comprimento total e uma mutação de remo-ção, o promotor CaMV35S, e a seqüência TMVQ. O construto transmissor foipreparado ligando um alinhamento de 3 fragmentos de 75 bp (DRE χ 3), con-tendo DRE do promotor rd29A, o promotor mínimo TATA e a seqüência GUS. Oplasmídio de padrão interno foi preparado ligando o promotor CaMV35S e ogene de luciferase. Os plasmídios efetuador, transmissor e de padrão internoforam introduzidos nos protoplastos pelo método de PEG.

(5) Análise da atividade de luciferase

Protoplastos foram recuperados por centrifugação a 500 rpm, àtemperatura ambiente, por 5 minutos, os protoplastos recuperados foramsuspensos em 150 μΙ de tampão triturador (50 mM de tampão de fosfato desódio, 1 mM de EDTA, 0,1% de Triton X-100, 10 mM de β-mercaptoetanol),a suspensão foi triturada usando um homogeneizador, o produto foi centrifu-gado a 15.000 rpm a 4°C por 10 minutos, para remover frações insolúveis, eo material resultante foi designado como um extrato celular. A atividade deluciferase foi analisada usando um kit de análise de luciferase Pickagene(Toyo Ink) de acordo com as instruções do fabricante. O extrato celular (10μΙ) foi deixado reagir com 50 μΙ de solução de Pickagene, e a atividade foianalisada usando um luminômetro.

(6) Analise da atividade de GUS

Uma solução de substrato (100 μΙ, uma mistura de um tampãotriturador e 2,5 mM de 4-MUG (4-metilumbiliferiip-D-glicuronida)) foi misturadacom 10 μίς do extrato celular, a mistura foi deixada reagir a 37°C por 1 hora e oproduto foi adicionado a 1 ml de terminador de reação (2M Na2Co3), para ter-minar a reação. A solução resultante (100 μΙ) foi usada para a análise.2. Resultados

cDNA de forma longa, de comprimento total, cDNA de forma cur-ta, de comprimento total, uma região de ORF deduzida, extraída do cDNA deforma longa, e uma região de ORF deduzida, extraída do cDNA de formacurtarforam submetidos a uma análise de atividade.ORF do eDNA de formalonga foi preparado com referência à parte da seqüência registrada no bancode dados (figura 1B, partindo de metionina como aminoácido 72). A ativaçãoda transcrição de GUS não foi observada, substancialmente, tanto no cDNAde forma longa, de comprimento total, como no ORF do cDNA de forma lon-ga (figura 5A). Em contraste, a atividade de GUS/LUC foi elevada 40 a 100vezes em células, nas quais cDNA de forma curta foi introduzido. O nível deatividade era cerca de duas vezes o de DREB2A de Arabidopsis thaliana(forma ativa). Na experiência usando cDNA que compreendia uma mutaçãode remoção adicionada ao mesmo, o nível de atividade fica consideravel-mente baixo, com a remoção de uma região do terminal C do aminoácido272 (doravante, referido como "272aa"). Além disso, com a remoção de umaregião até 236aa, não foi observada, substancialmente, nenhuma atividade(figura 5B). A remoção da região de 235aa a 272aa, isto é, a região internade uma proteína de ZmDREB2A, resulta em um nível de atividade extrema-mente baixo. Desse modo, considera-se que um domínio para ativar a trans-crição de ZmDREB2A está presente entre a região entre 235aa e o terminal C.

3. Exame

No sistema de expressão transitória, que usa protoplastos decélulas t87, foi observado um alto nível de ativação de transcrição indutívelpor ZmDREB2A. Isso indica que ZmDREB2A liga-se a DRE e funciona comoum ativador de transcrição. Substancialmente não foi observada, nenhumaatividade no cDNA de forma longa; mas, verificou-se que o cDNA de formacurta tem uma capacidade muito alta de ativação de transcrição (figura 5A).No caso do cDNA de forma longa, uma seqüência de 53 nucleotídeos, queestá presente no centro de uma seqüência, e deduzida como sendo um ín-tron, está ausente no cDNA de forma curta, e causa uma mudança de estru-tura. Um códon de parada está inserido na seqüência. Isso possibilita a codi-ficação de uma proteína ativa. cDNA de forma longa está registrado comoEST no banco de dados, e metionina como 72aa é indicada como um códonde iniciação. No entanto, quando um ORF desse cDNA de forma longa éusado como um efetuador, não foi observada nenhuma ativação de transcri-ção.

Quando cDNA de comprimento total foi usado como efetuador,DREB2A de Arabidopsis thaliana apresentou baixa capacidade de ativaçãode transcrição; mas, ele apresentou uma alta atividade, após a remoção deuma região constituída de 30 aminoácidos a jusante de um domínio de liga-ção de DNA (Sakuma et al., não publicado). Pelo contrário, ZmDREB2A a-presentou uma alta capacidade de ativação de transcrição em cDNA decomprimento total, e os níveis de atividade não mudaram significativamente,mesmo quando uma região interna (141aa a 208aa) foi removida (figura 5B).Sabe-se que uma grande quantidade de aminoácidos ácídicos está presenteno terminal C e que uma grande quantidade de aminoácidos ácídicos estápresente nos domínios ativadores de transcrição. Como a atividade detranscrição é significativamente diminuída quando da remoção da região de236aa-272aa no terminal C, deduz-se que um domínio ativador de transcri-ção está presente na vizinhança do mesmo. Como resultado da busca deseqüências em torno da região de 236aa-272aa no banco de dados, foramencontradas seqüências altamente homólogas em proteínas homólogas detrigo HvDRFI, arroz OsDREB2B e milheto perlífero DREB2A (figura 6). Co-mo uma região apresentando uma atividade mais alta do que o cDBA decomprimento total não foi observado quando da remoção, deduziu-se queuma região equivalente a um domínio negativo de DREB2A não estava pre-sente.

Não foram encontradas quaisquer diferenças óbvias entre o fe-nótipo de uma planta na qual DREB2A de Arabidopsis thaiana foi introduzidoe o de uma planta do tipo silvestre, e essa planta transgênica não é tolerante-a estresse ambiental. Desse modo, a proteína-DREB2A foi considerada co-mo sendo inativa apenas com a síntese. Isso é porque DREB2A compreen-de um domínio rico em serina(Ser)/treonina (Thr) e fosforilação desse domí-nio pode ser necessária para ativação (Liu et al., 1998). Também, DREB2Atorna-se ativo quando uma região de 135aa-165aa de DREB2A é removida(Sakuma et al., não publicado). A seqüência de aminoácido de ZmDREB2Acompreende um domínio que é rico em Ser/Thr de 99aa a 118 aa. Zm-DREB2A está sempre ativo, devido à presença de um mecanismo confor-macional, pelo qual o domínio acima mencionado tem probabilidade de serfosforilado.

Uma seqüência de PEST está presente em uma região de135aa-165aa de DREB2A. Essa seqüência refere-se a uma seqüência de 10bp ou mais longa, partilhada por aminoácidos básicos e é rica em prolina (P),ácido glutâmico (E), serina (S), treonina (T) e ácido aspártico (D). Esse do-mínio está contido em muitas proteínas de vida curta, reconhecido pelas en-zimas e decomposto. A presença da seqüência de PEST em DREB2A e emZmDREB2A foi inspecionada por meio de análise de busca de PEST WWWem EMBNet AUSTRIA

(httD://www.at.embnet.ora/embnet/tools/bio/PESTfind). Não foi descobertanenhuma seqüência candidata resultante para ZmDREB2A. Isso indica queZmDREB2A é decomposto pela seqüência de PEST e, desse modo, geral-mente não apresenta atividade. Também foi informado que OsDREB2A nãoapresenta atividade de transcrição (Dubouzet et al., The Plant Journal, 33,751-763). Esse OsDREB2A também foi inspecionado com relação à presen-ça da seqüência de PEST e não havia domínio equivalente para a mesma.Desse modo, é improvável que essa seqüência seja a única razão para ina-tivação.

TExempIo 41 Análise da função de ZmDREB2A usando um transformante (1)A fim de inspecionar precisamente as funções de ZmDREB2Aem plantas, ZmDREB2A foi introduzido em Arabidopsis thaliana para prepa-rar Arabidopsis thaliana transgênica, e a tolerância a estresses por baixatemperatura e desidratação de um gene de alvo ou de uma planta transgêni-ca foi analisada. -1. Material e método - —(~\) Planta de amostra e condições de crescimento

ZmDREB2A de comprimento total foi introduzido em plantas pa-ra produzir plantas transgênicas. Sementes desidratadas foram embebidascom uma solução de 1% de NaCIO e 0,02% de Triton X-100 por 10 minutos,para esterilização. As sementes esterilizadas foram semeadas em meio deágar GMK, submetidas a um tratamento de baixa temperatura a 4°C por 2dias, e depois cultivadas a 22°C com um fotoperíodo de 16 horas por 14 di-as. Plantas (4 plantas) foram recuperadas e o nível de expressão de Zm-DREB2A nas mesmas foi analisado. Além disso, as plantas restantes foramtransferidas para vasos, deixadas crescer por 1 semana, e depois submeti-das a testes de tolerância a estresses ou similar. Foram usados vasos deplantas redondos contendo solo profissional (Kakiuchi).(2) Meio de crescimento

As composições do meio das plantas são tais como mostradasabaixo.

- Meio de ágar GMK: sal de Murashige-Skoog (Wako Pure Che-micals), 0,4 g/l de Tiaina-HCI, 0,1 g/l de mioinositol, 3% (w/v) de sacarina, 1nM de ácido acético de indol, 10 mM de 6-benzil amino purina, 0,83% debacto-ágar e 30 mg/l de canamicina

- meio de ágar de GMKV: meio de ágar de GMK, 100 mg/l devancomicina

(3) Preparação de Arabidopsis thaliana Transgênica

Arabidopsis thaliana foi transformada usando pGreen E12 35SQ-zm forma curta, usada na experiência que envolve o uso de protoplastos.Plasmídios (1 μΙ, cerca de 70 μg foram misturados com 40 μΙ de célulascompetentes para eletroporação (Agrobacterium GV3101, nas quais foi pre-viamente introduzido o plasmídio adjuvante pSoup), o material resultante foiintroduzido em uma cubeta que foi refrigerada para 4°C, e a eletropração foirealizada a 200 Ω, 25 μΡ e 2,5 kV. Meio de SOC (1 ml, 20 g de bacto-triptona, 5 g de extrato de bacto-levedo, 0,5 g de NaCI, 0,02M glicose, 0,01 MMgSo4r O1OI M MgG^Hoi adicionado, a cultura foi conduzida a 28°C por 1

-hora e a cultura foi conduzida adicionalmente em meio de ágar LB, contendocanamicina por 2 dias, para selecionar variedades tolerantes.

Arabidopsis thaliana foi infectada com Agrabacterium transgêni-ca de acordo com uma técnica convencional. Sementes obtidas da Arabi-dopsis thaliana infectada foram semeadas em meio de GMKV e plantas tole-rantes a canamicina cultivadas foram selecionadas. As plantas selecionadasforam transferidas para um meio de GMKV fresco e transplantadas no soloquando tinham crescido adequadamente.

(4) Análise Northern e análise de RT-PCR quantitativa

Análise Northern e análise de RT-PCR quantitativa foram reali-zadas de acordo com o exemplo 2, exceto que a quantidade de RNA usadaera de 5 μς.

(5) Aplicação de estresse

A fim de inspecionar os níveis de expressão de ZmDREB2A e dogene rd29A indutível por estresse, influenciados por estresse por baixa tem-peratura e desidratação, 4 linhas de células, nas quais ZmDREB2A tinhasido introduzido, uma linha de células, na qual DREB1A e DREB2A (um tiposilvestre e uma forma ativa) tinham sido introduzidos, e uma linha de células,na qual o controle do vetor pB1121 tinha sido introduzido, foram submetidasà aplicação de estresses por baixa temperatura, desidratação e sal. A es-tresse por baixa temperatura foi aplicada deixando a placa repousar a 4°Cpor 5 horas. A estresse por desidratação foi aplicada arrancando Arabidopsisthaliana do meio, sem deixar meio sobre a raiz, colocando a mesma na pla-ca e tratando a mesma em uma bancada limpa por 5 horas. A estresse porsal foi aplicada arrancando Arabidopsis thaliana do meio, sem deixar meiosobre a raiz, e embebendo a mesma em 250 mM de solução de NaCI.

(6) Teste de tolerância a estresse

Tolerância a estresse por congelação foi avaliada cultivandoplantas em meio de GMK por 21 dias, transferindo as plantas para vasoscom solo, cultivando as plantas por 1 semana, transferindo as plantas parauma incubadora a -6°C, para tratar as plantas por 30 horas, e cultivando asplantas por 1 semana, seguido de avaliação.

-------- Estresse por desidratação foi aplicada semeando plantas sobre

meio, cultivando as plantas por 21 dias, transferindo as plantas para vasoscom solo, cultivando as plantas por 1 semana, cessar a irrigação, e depois,irrigar novamente cerca de 10 dias depois. As condições de recuperação dasplantas, depois disso, foram observadas para avaliar a tolerância.(7) Análise de gene indutível usando microdisposição

Uma experiência foi realizada usando o kit de microdisposiçãode DNA de Arabidopsis 2 oligo (21,500 genes detectados, Agilent). Os rea-gentes e aparelhos usados na experiência foram os da Agilent, a não serquando especificado de outro modo.

Do mesmo modo como no exemplo 2, RNA foi extraído por meiodo método de Trizol (Invitrogen). Quatro plantas foram usadas por amostra.O RNA extraído foi inspecionado usando o Bioanalyzer, para confirmar queos grupos de rRNA estavam bem definidos e que os índices de rRNA esta-vam de acordo com índices teóricos.

RNA total (800 ng) foi usado para cada amostra, 400 ng dosquais foram marcados com Cy3, e os outros 400 ng foram marcados comCy5. Os iniciadores do promotor de T7 foram adicionados ao mesmo, e osprodutos foram submetidos à desnaturação térmica, a 65°C por 10 minutos,seguida de resfriamento em gelo por 5 minutos. A mistura principal de sínte-se de cDBA (2,0 μΙ de 5x tampão First Strand, 1,0 μΙ de 0,1 M DTT, 0,5 μΙ demistura de 10 mM dNTP, 0,5 μΙ de MMLV-RT e 0,25 μΙ de RNaseOUT) foiadicionada e o material resultante foi tratado a 40°C por 2 horas. Depois, oproduto de reação foi tratado a 65°C por 15 minutos, e a reação foi termina-da, seguida de resfriamento em gelo por 5 minutos. Às soluções de reaçãoforam adicionados 1,2 μΙ de 10mM de cianina 3-CTP (trifosfato de citosina) e1,2 μΙ de 10 mM de cianina 5-CTP, a isso foi adicionada a mistura de trans-crição (7,65 μΙ de água livre de nuclease, 10,0 μΙ de 4x tampão de transcri-ção, 3,0 μΙ de 0,1 M DTT1 4,0 μΙ de mistura de NTP, 3,2 μΙ de 50% de PEG(preaquecido, 40°C), 0,25 μΙ de RNaseOUT, 0,3 μΙ de pirofosfatase inorgâni-ca, e 0,4 μΙ de polimerase de RNA de T7), e as misturas foram agitadas vi-gorosamente para continuar a reação sob condições sombreadas a 40°C por120 minutos. Ao produto foram adicionados 60 μΙ de água livre de nuclease,350 μΙ de tampão de RLT e 250 μΙ de EtOH e misturados usando uma pipe-ta. A solução resultante foi transferida para uma minicoluna RNeasy (Qia-gen), equipada com um tubo coletor de 2 ml e depois centrifugada a 13.000rpm por 30 segundos. A coluna foi transferida para um novo tubo coletor, aomesmo foram adicionados 500 μl de tampão de RPR, e a centrifugação foirealizada a 13.000 rpm por 30 segundos. Esse procedimento foi repetidouma vez, a coluna foi transferida para um tubo coletor de 1,5 ml, ao mesmoforam adicionados 30 μl de água livre de RNase, o tubo foi deixado em re-pouso por 1 minuto, e a centrifugação foi realizada a 13.000 rpm por 30 se-gundos, para recuperar cRNA. Esse procedimento foi realizado novamente,e a absorveção a 260 nm foi analisada, para determinar a concentração.

A solução de alvo de cRNA (1 μg de cRNA marcado com Cy3, 1μg de cRNA marcado com Cy5, 50 μl de 10x alvo de controle, e até 250 μlde água livre de nuclease) foi preparada, 10 μl de tampão de fragmentaçãode 25x foi adicionado à mesma, e a mistura foi vigorosamente agitada parafragmentar o alvo. A solução foi tratada sob condições sombreadas a 60°Cpor 30 minutos. Tampão de hibridização de 2x (250 μl) foi adicionado àmesma, a mistura foi agitada sem formação de espuma, e o material resul-tante foi transferido para lâminas de microdisposição. Depois, a hibridizaçãofoi realizada a 60°C por 17 horas. Depois da hibridização, as lâminas foramlavadas com tampão de lavagem 1 (6x de SSC, 0,005% de Triton X-102), àtemperatura ambiente, por 10 minutos. Subseqüentemente, as lâminas fo-ram lavadas com tampão de lavagem 2 (0,1 χ de SSC, 0,005% de Triton X-102) a 4°C, por 5 minutos. As lâminas lavadas foram secadas por gás denitrogênio com ajuda de uma pistola de ar de filtração. No final, as lâminasforam colocadas sobre o suporte de lâminas do scanner de microdisposiçãoAgilent para escaneamento, e digitalização de pontos e análise de dadosforam realizadas.

2. Resultados

(1) Análise de características de Arabidopsis thaliana transgênica de Zm-DREB2A e expressão do gene introduzido

51 linhas transgênicas de ZmDREB2A foram obtidas, e 32 linhasdas mesmas, que forneceram sementes de T1 em quantidades suficientespara análises subsequentes, foram submetidas a RT-PCR quantitativo paraanalisar os níveis de expressão dos genes introduzidos. Resultados parciaissão mostrados na figura 7. As plantas foram cultivadas em meio de ágar deGMK e as condições das mesmas foram observadas 21 dias depois da se-meadura (fila do alto, figura 8A). Comparadas com linhas de controle, verifi-cou-se que as plantas com superexpressão tinham probabilidade de ter seudesenvolvimento tolhido. As plantas foram cultivadas em meio de GMK por 2semanas e depois transferidas para o solo, e as condições das mesmas fo-ram observadas. A figura 8 mostra as plantas no dia 35 (i.e, 21 dias depoisdo transplante). Tal como o caso que envolve o uso de uma placa de ágar,essas plantas mostraram retardamento de crescimento. O gene de alvo queé controlado por ZmDREB2A em Arabidopsis thaliana é desconhecido; mas,a expressão foi induzida por ZmDREB2A de um gene transmissor ligado auma posição a jusante de uma seqüência de DRE de um promotor de rd29Ano exemplo 3. Consequentemente, deduz-se que os níveis de expressão dogene de red29A seriam elevados na superexpressão de ZmDREB2A emArabidopsis thaliana . A figura 8B mostra os resultados da análise Northerndos genes introduzidos e dos genes de rd29A em Arabidopsis thaliana quesuprexpresssa ZmDREB2A. Quatro linhas transgênicas, nas quais os níveisde expressão dos genes introduzidos e dos genes de rd29A eram altas eforam observadas mudanças nas características (isto é, R6, R14, R21 e R25),foram submetidos a análises subsequentes.

(2) Avaliação da tolerância a estresses de Arabidopsis thaliana transqêni-ca de ZmDREB2A

As quatro linhas de Arabidopsis thaliana transgênica seleciona-das acima foram avaliadas em termos de tolerância quando da aplicação deestresse por congelação e desidratação. Uma linha introduzida por vetor(controle de pBI121) foi designada como uma linha de controle. A tolerânciaà congelação foi testada duas vezes, e a tolerância à desidratação foi testa-da 4 vezes. Quando estresse-por congelação foi aplicada, 10 entre as 25-plantas R14 sobreviveram; mas, todas as outras plantas transgênicas morre-ram (figura 9A). A estresse por desidratação foi aplicada transferindo asplantas no dia 21 a vasos de terra, cultivando as plantas sob condições ge-rais por 1 semana, e cessando a irrigação por 10 dias. Depois disso, as ca-racterísticas foram observadas por 1 a 2 semanas, para avaliar a tolerância.R6 apresentou um aperfeiçoamento especial em tolerância. As outras 3 li-nhas apresentaram tolerância relativamente alta, em comparação com asplantas de controle (figura 9B). Desse modo, Arabidopsis thaliana que su-perexpressa ZmDREB2A apresentou tolerância à desidratação; mas, subs-tancialmente, não apresentou nenhum aperfeiçoamento na tolerância à es-tresse por congelação.

(3) Análise do gene de alvo usando microarranjosA fim de identificar genes com níveis de expressão que variam

com a superexpressão de ZmDREB2A, uma ampla análise de expressão foirealizada usando um kit de microdisposição de DNA de Arabidopsis 2 oligoda Agilent (tabela 5). A análise de microdisposição envolveu o uso das linhasR6 e R14. A linha R6 apresenta uma expressão mais forte de genes introdu-zidos. Essas linhas foram submetidas duas vezes à experimentação, e oscoeficientes de correlação das duas experimentações foram muito altos. Osnúmeros de genes que apresentam níveis de expressão que eram 5 vezesou mais altos do que os dos controles em uma das experimentações foi de88. Esses genes foram classificados em termos de funções, e 11 genes e-ram genes relacionados à proteína LEA, 7 genes eram genes relacionados àproteína de choque térmico, 5 genes eram genes relacionados à estresseoxidativa, 7 genes eram genes relacionados à oleosina, 5 genes eram genesrelacionados ao metabolismo de açúcar, 2 genes eram genes relacionadosao transporte de membrana e 6 genes eram genes relacionados à germina-ção.<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>Tabela 5: Continuacao

<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>Razões: Foram determinadas as intensidades de sinal de plantas do tiposilvestre, normalizadas, e plantas com superexpressão, normalizadas, foicalculada a média de dois valores de hibridização e foi calculada a médiados valores resultantes.

DRE: O banco de dados do cDNA de comprimento total de Arabidopsis Xha-Iiana (Riken) foi usado para referência. "DRE" representa o número de umaseqüência de DRE (ACCGAC), que está presente dentro de 1.000 nucleotí-deos a montante do ponto de iniciação de transcrição.*: Genes com cDNA de comprimento total não estão registrados em RARGE.DREB2A: Genes com níveis de expressão que são aumentados (pelo menos3 vezes) quando DREB2A modificado é aplicado ao arrranjo. Valores numé-ricos indicam os índices atingidos nesse momento.

Estresse: Genes com níveis de expressão que aumentaram pelo menos 3vezes quando da aplicação de estresse (N: 250 mM de NaCI por 10 horas;D: desidratação por 10 horas; C: 4°C por 10 horas; H: alta temperatura por 5horas)

3. Discussão

Plantas que superexpressam Arabidopsis thaiiana (32 linhas)foram deixadas crescer por 2 semanas e depois foram submetidas à inspe-ção dos níveis de expressão de ZmDREB2A (figura 8B). Como resultado, osníveis de expressão de ZmDREB2A encontrados eram altos em plantas queapresentavam retardamento de crescimento. Dentre essas linhas, foram se-lecionadas 4 linhas que apresentavam altos níveis de expressão de Zm-DREB2A. A linha R6 apresentou o nível mais alto de expressão de Zm-DREB2A entre as linhas selecionadas, embora a linha R6 apresentasse umíndice de germinação baixo. Em comparação com plantas do tipo silvestre,essas 4 plantas transgênicas cresceram lentamente (figura 8A). Já foi infor-mado que plantas na quais os genes do tipo DREB/CBF estavam superex-pressados com o uso do promotor 35S são de crescimento lento. Mas, o quefoi informado no passado era o gene do tipo DREB1, e não foram observa-das diferenças de fenótipo em Arabidopsis thaiiana, que superexpressaDREB2A ou OsDREB2A de arroz. Como o retardamento de crescimentoocorreu aqui em genes do tipo DREB2A, considera-se que ZmDREB2A temuma capacidade de ativar a transcrição em plantas sem modificação, dife-rentemente de Arabidopsis thaliana DREB2A ou OsDREB2A de arroz.

Considera-se que a expressão de funções de DREB2A exija al-gumas modificações pós-translacionais. Sakuma et al. prepararam DREB2Aativo e submeteram Arabidopsis thaliana transgênica de DREB2A ativo àanálise de microdisposição (não publicada). Como resultado da análise demicrodisposição de Arabidopsis thaliana com superexpressão de Zm-DREB2A, muitos genes comuns aos genes de DREB2A a jusante e genesindutíveis por NaCI foram detectados (tabela 5). Uma seqüência de promo-tor, que compreende uma região de até 1.000 bp, a montante do ponto deiniciação da transcrição, que está descrita no banco de dados de cDNA decomprimento total de Arabidopsis thaliana (Riken)

(http://rarqe.asc.riken.QO.ip/). e constatou-se que 35 genes entre os genesidentificados contêm uma seqüência de DRE. Entre esses 35 genes, verifi-cou-se que os níveis de expressão de 24 genes de DREB2A modificadosaumentaram. Acredita-se que ZmDREB2A se ligue a uma seqüência deDRE e induza a expressão de um gene a jusante. Consequentemente, acre-dita-se que níveis de expressão aumentados de genes com essas seqüên-cias de promotor sejam induzidos diretamente por proteínas de ZmDREB2A.Desse modo, acredita-se que ZmDREB2A funcione de um modo similar aode DREB2A em Arabidopsis thaliana E ZmDREB2A foi identificado comosendo um gene do tipo DREB2.

Exemplo 5: Análise das funções de ZmDREB2A usando transformante (2)

A fim de inspecionar minuciosamente as funções de ZmDREB2Aem plantas, ZmDREB2A foi introduzido em Arabidopsis thaliana de acordocom o procedimento do exemplo 4, para preparar Arabidopsis thalianatransgênica, e a tolerância a estresse de alta temperatura de genes-alvo eplantas transgênicas foi analisada.

Materiais e métodos usados estavam basicamente de acordocom os do exemplo 4. Duas plantas de cada uma de duas linhas de Arabi-dopsis thaliana, que supreexpressam ZmDREB2A (isto é, linha 6 e linha 25)foram usadas. Plantas criadas a partir de sementes, que foram cultivadasem meio de GM por 18 dias, foram transferidas para vasos contendo solo decultura. Depois de as plantas terem sido cultivadas por 11 dias, as partesterrestres foram embebidas em um banho de água a 44°C por 10 minutos(isto é, aplicação de estresse por alta temperatura). As plantas foram culti-vadas sob condições comuns depois disso, e as condições de crescimento fo-ram observadas 4 dias e 7 dias mais tarde. Os resultados são mostrados nafigura 10.

As plantas de controle morreram 7 dias depois da aplicação deestresse; mas, uma das plantas da linha 6 sobreviveu. Desse modo, consta-tou-se que ZmDREB2A contribui para a resposta à estresse por alta tempe-ratura.

Exemplo 6: Análise das funções de ZmDREB2A usando transformante (3)(11 Viabilidade contra carga em alta temperatura

Plantas nas quais ZmDREB2A tinha sido introduzido foram se-meadas em meio de ágar de GM contendo canamicina, as plantas foramcultivadas por 6 dias e as plantas cultivadas foram transferidas para um pa-pel de filtro embebido em 4 ml de meio de GM (em uma placa petri). Primei-ramente, as plantas foram cultivadas a 22°C por 2 dias, deixas em repouso a22°C, 44°C ou 45°C (isto é, estresse por alta temperatura) por 1 hora, e de-pois devolvidas a 22°C, para crescer. Como controle, Arabidopsis thaliana,na qual ZmDREB2A não foi introduzido (isto é, um tipo silvestre), foi deixadacrescer da mesma maneira.

A figura 11 mostra que plantas que foram cultivadas em meio deGM líquido por um período adicional de 2 semanas, depois do teste, e a via-bilidade das mesmas (o desvio médio e o desvio padrão (n>50)). "WT" re-presenta uma planta de controle, na qual ZmDREB2A não foi introduzido, eA, B e C representam, cada qual, uma planta na qual ZmDREB2A foi intro-duzido (3-linhas no total).

Tal como é visível da figura 11, uma-planta na qual ZmDREB2Afoi introduzido apresentou uma tolerância à estresse por alta temperaturasignificativamente mais alta do que uma planta do tipo silvestre.(21 Análise Northern

Plantas nas quais foi introduzido ZmDREB2A foram submetidasa condições de crescimento comuns, a carta por alta-temperatura (a 37°Cpor 1 hora ou 5 horas), a estresse por sal (em 250 mM de solução salina por5 horas), ou a estresse por desidratação (desidratadas por 5 horas), e ex-pressão de genes, isto é, At5g03720 (AtHSFA3), at3g12580 (proteína dechoque térmico 70), Atlg52560 (proteína de choque térmico pequena, locali-zada em cloroplasto), Atg25200 (AtHSP23.6-mito), At4g10250 (proteína dechoque térmico 22.0) e At5g12030 (proteína de choque térmico 17.6A), comreferência às expressões das quais se sabe que são induzidas, particular-mente, pela estresse por alta temperatura, foi analisada por meio do métodoNorthern. Como controle, Arabidopsis thaliana, na qual ZmDREB2A não foiintroduzido, foi deixada crescer da mesma maneira e depois analisada.

Os resultados são mostrados na figura 12. Os níveis de expres-são encontrados dos genes citados acima foram significativamente mais al-tos em plantas, nas quais ZmDREB2A havia sido introduzido, do que os deuma planta de controle (tipo silvestre).

Exemplo 7: Análise de funções de ZmDREB2A. usando transformante (4)

De acordo com os procedimentos dos exemplos 3 e 4, Zm-DREB2A foi ligado ao promotor de rd29A, isto é, um promotor indutível porestresse, para preparar plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas (3 li-nhas) e a tolerância a estresse por desidratação e baixa temperatura dasmesmas foi analisada. Como controle, Arabidopsis thaliana, na qual Zm-DREB2A não foi introduzido (isto é, do tipo silvestre), foi deixada crescer damesma maneira e depois analisada.

Os resultados são mostrados na figura 13. Em plantas de Arabi-dopsis thaliana, nas quais ZmDREB2A é superexpressado constantementecom a ajuda do promotor de 35S, foi observada uma forte inibição de cres-cimento-(figura 8A). Em plantas, nas quais o nível de expressão de Zm-DREB2A é alto, sob o controle do promotor de rd29A, porém, não foi obser-vado qualquer retardamento de crescimento óbvio, comparado com umaplanta do tipo silvestre (figura 13A). A acumulação de mRNA de rd29A, cujaexpressão é induzida por ZmDREB2A, foi aumentada quando da aplicaçãode estresse (figura 13B). Como resultado da aplicação de estresse por desi-dratação, por interrupção de irrigação por 10 dias, apenas 30% das plantasde Arabidopsis thaliana do tipo silvestre sobreviveram; mas, as três plantasde rd29A:ZmDREB2A apresentaram viabilidades de, em cada caso, 96,3%,88,8% e 81,3% (figura 13C). Por regulação da expressão de ZmDREB2Apelo promotor de rd29A, a tolerância à estresse por desidratação foi aperfei-çoada, enquanto foi evitada a inibição de crescimento. Em contraste, o aper-feiçoamento na tolerância à estresse por congelação não foi tão significativacomo o na tolerância à estresse por desidratação (figura 13C), tal como como caso que envolve o uso do promotor de 35S (figura 9A).

Exemplo de Referência: Tolerância à estresse por alta temperatura^de Ara-bidopsis thaliana alterada (modificada), que superexpressa DREB2A

A tolerância à estresse por alta temperatura de uma planta deArabidopsis thaliana ativa, que superexpressa DREB2A (DREB2A CA OX),da qual uma região que compreende os aminoácidos 136 a 165 foi removi-da, foi comparada com a de uma planta de controle. Como controle, foi usa-da uma planta de Arabidopsis thaliana que compreende um vetor de expres-são, sem uma seqüência de DREB2A introduzida no mesmo. Plantas queforam cultivadas em meio de ágar de GM por 5 dias depois da semeadura,foram transferidas para um papel de filtro umedecido com meio de GM e asplanas foram deixadas crescer por mais 2 dias. Depois de 7 dias após a se-meadura, as plantas foram submetidas a um teste de tolerância a uma es-tresse por alta temperatura. A estresse por alta temperatura foi aplicada a22°C, 42°C, 43°C, 44°C ou 45°C por 1 hora. Depois da aplicação de estres-se por alta temperatura, a temperatura foi imediatamente retornada paratemperatura ambiente, as plantas foram deixadas crescer a essa temperatu-ra por 1 semana, e, depois, as viabilidades foram determinadas.

Quando tratadas a 42°C ou 43°C, não foi observada nenhumadiferença entre uma-planta-de controle e DREB2A CA OX (figura 14). Mas, aviabilidade de uma planta de controle foi reduzida para 76%, quando tratadaa 44°C, e a viabilidade a 45°C baixou para 2%. Em contraste, a viabilidadede DREB2A CA OX não foi reduzida quando tratada a 45°C (figura 14).

De acordo com essa experiência, verificou-se que ZmDREB2Afunciona em resposta a-estresses ambientais, tais como estresse por desi-dratação ou alta temperatura. Além disso, essa experiência sugere a possibi-Iidade do desenvolvimento de culturas tolerantes a estresses por desidrata-ção e alta temperatura usando o gene ZmDREB2A.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados nopresente, estão incorporadas ao presente por referência, em sua totalidade.Aplicabilidade industrial

O uso do gene ZmDREB2A de acordo com a presente invençãopode conferir às plantas tolerância a estresses ambientais, tais como estres-ses por desidratação ou alta temperatura, sem modificações especiais. Con-sequentemente, a presente invenção e de alta utilidade na preparação deuma nova planta tolerante a estresses ambientais.

Texto livre de listagem de seqüências

SEQ ID NO: 1: cDNA (forma curta) do gene ZmDREB2A

SEQ ID NO: 3: cDNA (forma longa) do gene ZmDREB2A

SEQ ID NOs: 5 a 45: descrição de seqüências artificiais: DNAs sintéticos

(iniciadores)LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Incorporated Administrative Agency Japan International Research CenterforAgricultural Sciences

<120> FATOR DE TRANSCRIÇÃO INDUZIDO POR ESTRESSE, DERIVADO DOMILHO

<130> PH-2768-PCT

<140><141>

<140> JP2005-270970<141 >2005-09-16

<160> 44

55

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1<211>1283<212> DNA<213> Zea mays L

<220>

<223> ZmDREB2A cDNA (Curtot form)

<220><221 > CDS

<222> (89)..(1042)

<400> 1

ggtcttatcg actccaacaa gaacacacta cacaccagcc agcgagatag cgaacgctag 60

gaacccagtg gccatctttg gagcggcc atg acg ctg gat cag aac cat gcc 112

Met Thr Leu Asp Gln Asn His Ala1 5

atg ccg atg cag ccc ccg gcc ctg cag ccc gga agg aag aag cga cct 160Met Pro Met Gln Pro Pro Ala Leu Gln Pro Gly Arg Lys Lys Arg Pro10 15 20

cgc aga tca cga gat ggg cct acg tca gtg gca gct gtc ate cag cgg 208Arg Arg Ser Arg Asp Gly Pro Thr Ser Val Ala Ala Val Ile Gln Arg25 30 35 40

tgg gct gag cgc aac aag cat ttg gag tat gag gaa tet gag gag gca 256Trp Ala Glu Arg Asn Lys His Leu Glu Tyr Glu Glu Ser Glu Glu Ala50 45 50 55

aag cga cca aga aaa gca cct gca aag ggt tcg aag aag ggc tgt atg 304Lys Arg Pro Arg Lys. Ala . Pro. ..Ala__Lys Gly Ser^Lys Lys Gly Cys Met60 65 70

aag gga aaa ggg ggg cct gac aat act caa tgt gga tac cgt gga gtg 352Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn Thr Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Val75 80 85agg cag cgt act tgg ggg aag tgg gtt gct gaa ata aga gag cca aat 400Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn90 95 100

cgt gtc gac aga ctc tgg ctg ggt acc ttc cca acc gcg gag gat gca 448Arg Val Asp Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu-Asp Ala105 110 115 120

gct agg gcc tat gac gag gca gcc aga gcg atg tat gga gac ttg gca 496Ala Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Asp Leu Ala125 130 135

cgg act aac ttc ccc gga cag gat gca aca acc tct gcc caa gct gct 544Arg Thr Asn Phe Pro Gly Gln Asp Ala Thr Thr Ser Ala Gln Ala Ala140 145 150

cta gca tcg acc tct gcc cag gct gct cca aca gct gtc gaa gct ctt 592Leu Ala Ser Thr Ser Ala Gln Ala Ala Pro Thr Ala Val Glu Ala Leu155 160 165

cag act ggc acg tca tgc gag tcg aca acg aca tca aat tac tcg gac 640Gln Thr Gly Thr Ser Cys Glu Ser Thr Thr Thr Ser Asn Tyr Ser Asp170 175 180

ate gca tcc acc tca cac aag cct gaa gcc tct gac ate tcg age tcc 688Ile Ala Ser Thr Ser His Lys Pro Glu Ala Ser Asp Ile Ser Ser Ser185 190 195 200

cta aag gca aaa tgc cca gct gga tca tgt ggt ate caa gag ggt aca 736Leu Lys Ala Lys Cys Pro Ala Gly Ser Cys Gly Ile Gln Glu Gly Thr205 210 215

ccc agt gta gct gac aag gag gtc ttt ggg ccg ttg gag cct ate aca 784Pro Ser Val Ala Asp Lys Glu Val Phe Gly Pro Leu Glu Pro Ile Thr220 225 230

aat ctt cca gat ggt ggt gat ggt ttt gat ate ggt gag atg ctg agg 832Asn Leu Pro Asp Gly Gly Asp Gly Phe Asp Ile Gly Glu Met Leu Arg235 240 245

atg atg gaa age gat cca cat aat gca ggt gga gct gac gct ggc atg 880Met Met Glu Ser Asp Pro His Asn Ala Gly Gly Ala Asp Ala Gly Met250 255 260

ggg cag ccc tgg tgt ctt gat gag ctg gat tcg agt gtc ttg gag age 928Gly Gln Pro Trp Cys Leu Asp Glu Leu Asp Ser Ser Val Leu Glu Ser265 270 275 280

atg ctc cag cca cag cca gag cca gag cca ttc ctg atg tct gaa gaa 976Met Leu Gln Pro Gln Pro Glu Pro Glu Pro Phe Leu Met Ser Glu Glu285 290 295

ccg gac atg ttt ctt gct ggc ttc gaa age gct ggt ttc gtc gag ggt 1024Pro Asp Met Phe Leu Ala Gly Phe Glu Ser Ala Gly Phe Val Glu Gly300 305 310

ctg gag cgg cta aac tga atttctgatg tttgaccgtt gatcctcatc 1072Leu Glu Arg Leu Asn315

ccacttcatg tctgagcttg tgaattcgga ggcaaacatt ggcagaactt ataagctcta 1132

gcaattctag gcttttatat tcctctgtaa atagttctct agtcatggga actgggtttg 1192cttcacattt tttgtaagac cagaagtgat gtaaatagtt cccaccttgt ggaaggacaa 1252

gaaaaaaata aataaaaaga gtgcttgctt t

1283<210> 2<211> 317<212> PRT<213> Zea mays L

<220>

<223> ZmDREB2A cDNA (Curto t form)<400>2

Met Thr Leu Asp Gln Asn His Ala Met Pro Met Gln Pro Pro Ala Leu

1 5 10 15

Gln Pro Gly Arg Lys Lys Arg Pro Arg Arg Ser Arg Asp Gly Pro Thr

20 25 30

Ser Val Ala Ala Val Ile Gln Arg Trp Ala Glu Arg Asn Lys His Leu

35 40 45

Glu Tyr Glu Glu Ser Glu Glu Ala Lys Arg Pro Arg Lys Ala Pro Ala

50 55 60

Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Asp Asn65 70 75 80

Thr Gln Cys Gly Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Thr Trp Gly Lys Trp

85 90 95

Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Val Asp Arg Leu Trp Leu Gly

100 105 110

Thr Phe Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Met Tyr Gly Asp Leu Ala Arg Thr Asn Phe Pro Gly Gln Asp

130 135 140

Ala Thr Thr Ser Ala Gln Ala Ala Leu Ala Ser Thr. Ser Ala Gln Ala

Jr45. ..... -..150 --- ■ ■ 155 160

Ala Pro Thr Ala Val Glu Ala Leu Gln Thr Gly Thr Ser Cys Glu Ser

165 170 175

Thr Thr Thr Ser Asn Tyr Ser Asp Ile Ala Ser Thr Ser His Lys Pro

180 185 190

Glu Ala Ser Asp Ile Ser Ser Ser Leu Lys Ala Lys Cys Pro Ala Gly

195 200 205

Ser Cys Gly Ile Gln Glu Gly Thr Pro Ser Val Ala Asp Lys Glu Val

210 215 220

Phe Gly Pro Leu Glu Pro Ile Thr Asn Leu Pro Asp Gly Gly Asp Gly225 230 235 240

Phe Asp Ile Gly Glu Met Leu Arg Met Met Glu Ser Asp Pro His Asn

245 250 255

Ala Gly Gly Ala Asp Ala Gly Met Gly Gln Pro Trp Cys Leu Asp Glu

260 265 270

Leu Asp Ser Ser Val Leu Glu Ser Met Leu Gln Pro Gln Pro Glu Pro

275 280 285

Glu Pro Phe Leu Met Ser Glu Glu Pro Asp Met Phe Leu Ala Gly Phe

290 295 300

Glu Ser Ala Gly Phe Val Glu Gly Leu Glu Arg Leu Asn305 310 315

<210> 3<211> 1336<212> DNA<213> Zea mays L

<220>

<223> ZmDREB2A cDNA (Longo form)<220><221 > CDS<222> (89)..(358)

<400> 3

ggtcttatcg actccaacaa gaacacacta cacaccagcc agcgagatag cgaacgctag 60

gaacccagtg gccatctttg gagcggcc atg acg ctg gat cag aac cat gcc 112

Met Thr Leu Asp Gln Asn His Ala1 5

atg ccg atg cag ccc ccg gcc ctg cag ccc gga aga gca tat gga gca 160Met Pro Met Gln Pro Pro Ala Leu Gln Pro Gly Arg Ala Tyr Gly Ala10 15 20

gag ggc agt gct gtg gtg cat ggt tcc ate aga aca gta gga aga age 208Glu Gly Ser Ala Val Val His Gly Ser Ile Arg Thr Val Gly Arg Ser25 30 35 40

gac ctc gca gat cac gag atg ggc cta cgt cag tgg cag ctg tca tcc 256Asp Leu Ala Asp His Glu Met Gly Leu Arg Gln Trp Gln Leu Ser Ser45 50 55

age ggt ggg ctg age gca aca age att tgg agt atg agg aat ctg agg 304Ser Gly Gly Leu Ser Ala Thr Ser Ile Trp Ser Met Arg Asn Leu Arg60 65 70

agg caa age gac caa gaa aag cac ctg caa agg gtt cga aga agg gct 352Arg Gln Ser Asp Gln Glu Lys His Leu Gln Arg Val Arg Arg Arg Ala75 80 85

gta tga agggaaaagg ggggcctgac aatactcaat gtggataccg tggagtgagg 408Val

90

cagcgtactt gggggaagtg ggttgctgaa ataagagagc caaatcgtgt cgacagactc 468tggctgggta ccttcccaac cgcggaggat gcagctaggg cctatgacga ggcagccaga 528gcgatgtatg gagacttggc acggactaac ttccccggac aggatgcaac aacctctgcc 588caagctgctc tagcatcgac ctctgcccag gctgctccaa cagctgtcga agctcttcag 648actggcacgt catgcgagtc gacaacgaca tcaaattact cggacatcgc atccacctca 708cacaagcctg aagcctctga catctcgagc tccctaaagg caaaatgccc agctggatca 768tgtggtatcc aagagggtac acccagtgta gctgacaagg aggtctttgg gccgttggag 828cctatcacaa atcttccaga tggtggtgat ggttttgata tcggtgagat gctgaggatg 888atggaaagcg atccacataa tgcaggtgga gctgacgctg gcatggggca gccctggtgt 948cttgatgagc tggattcgag tgtcttggag agcatgctcc agccacagcc agagccagag 1008ccattcctga tgtctgaaga accggacatg tttcttgctg gcttcgaaag cgctggtttc 1068gtcgagggtc tggagcggct aaactgaatt tctgatgttt gaccgttgat cctcatccca 1128cttcatgtct gagcttgtga attcggaggc aaacattggc agaacttata agetetagea 1188attctaggct tttatattcc tctgtaaata gttctctagt catgggaact gggtttgctt 1248cacatttttt gtaagaccag aagtgatgta aatagttccc accttgtgga aggacaagaa 1308aaaaataaat aaaaagagtg cttgcttt 1336<210>4<211> 89<212> PRT<213> Zea mays L

<220>

<223> ZmDREB2A cDNA (Longo form)<400>4

Met Thr Leu Asp Gln Asn His Ala Met Pro Met Gln Pro Pro Ala Leu1 5 10 15 Gln Pro Gly Arg 20 Ala Tyr Gly Ala Glu 25 Gly Ser Ala Val Val 30 His GlySer Xle Arg 35 Thr Val Gly Arg Ser 40 Asp Leu Ala Asp His 45 Glu Met GlyLeu Arg 50 Gln Trp Gln Leu Ser 55 Ser Ser Gly Gly Leu 60 Ser Ala Thr SerIle Trp Ser Met Arg Asn Leu Arg Arg Gln Ser Asp Gln Glu Lys His65 70 75 80Leu Gln Arg Val Arg 85 Arg Arg Ala Val

Claims (8)

1. Gene, caracterizado pelo fato de que compreende o seguinteDNA (a) ou (b):(a) DNA, que consiste na seqüência de nucleotídeo, tal comomostrada em SEQ ID NO: 1; ou(b) DNA derivado de milho, que se hibridiza sob condições cons-tritivas com DNA, constituído de uma seqüência de nucleotídeo que é com-plementar ao DNA constituído da seqüência de nucleotídeo, tal como mos-trada na SEQ ID NO: 1 e codifica uma proteína, que ativa a transcrição deum gene localizado a jusante de um elemento sensível a estresse, para a-perfeiçoar a tolerância a estresse por desidratação e alta temperatura deuma planta.

2. Gene, caracterizado pelo fato de que codifica a seguinte pro-teína (c) ou (d):(c) uma proteína, que consiste na seqüência de aminoácido, talcomo mostrada na SEQ ID NO: 2; ou(d) uma proteína derivada de milho, que consiste em uma se-qüência de aminoácido derivada da seqüência de aminoácido, tal como mos-trada na SEQ ID NO: 2, por remoção, substituição ou adição de um ou maisaminoácidos, e que ativa a transcrição de um gene localizado a jusante deum elemento sensível a estresse, para aperfeiçoar a tolerância a estressepor desidratação e alta temperatura de uma planta.

3. Proteína recombinante, caracterizada pelo fato de que é deriva-da da seguinte proteína (c) ou (d):(c) uma proteína, que consiste na seqüência de aminoácido, talcomo mostrada em SEQ ID NO: 2; ou(d) uma proteína derivada de milho, que consiste em uma se-qüência de aminoácido derivada da seqüência de aminoácido, tal como mos-trada em SEQ ID NO: 2, por remoção, substituição ou adição de um ou maisaminoácidos, e que ativa a transcrição de um gene localizado a jusante deum elemento sensível a estresse, para aperfeiçoar a tolerância a estressepor desidratação e alta temperatura de uma planta.

4. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compre-ende o gene, como definido na reivindicação 1 ou 2, ligado a jusante de umpromotor indutível por estresse.

5. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracte-rizado pelo fato de que o promotor indutível por estresse é o promotor derd29A.

6. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transfor-mada com o vetor recombinante como definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Método para preparar uma planta transgênica, com tolerânciaa estresse por desidratação e alta tempertura aperfeiçoada em relação àplanta do tipo silvestre, caracterizado pelo fato de que compreende introduziro vetor recombinante como definido na reivindicação 4 ou 5, em uma planta.

8. Método para aperfeiçoar a tolerância a estresse de uma plan-ta, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir o vetor recombinan-te como definido na reivindicação 4 ou 5, na planta.