BRPI0616242A2 - floculaÇço de proteÍna usando sais - Google Patents

Abstract

FLOCULAÇçO DE PROTEÍNA USANDO SAIS. Métodos de separação, por exemplo, para isolar uma proteína recombinante, são revelados. Em algumas implementações, um método inclui formação de um sólido contendo um primeiro cátion e um primeiro ânion em um meio contendo uma proteína, e separação do sólido da proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FLOCULAÇÃO DE PROTEÍNA USANDO SAIS".REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica o beneficio de Pedido Provisório dosEstados Unidos Nq 60/717.838 depositado em 15 de setembro de 2005, queé aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA TÉCNICA

A invenção refere-se a métodos de separação, por exemplo, mé-todos de recuperação de um produto purificado a partir de um fluido incluin-do impurezas tal como uma ou mais impurezas solúveis, células, restos celu-lares ou impurezas insolúveis.

ANTECEDENTES

Dentro da indústria da biotecnologia, a purificação de proteínasem uma escala comercial é um desafio importante para o desenvolvimentode proteínas recombinantes para propósitos terapêuticos e de diagnóstico.Problemas relacionados ao rendimento, pureza e produtividade total desafi-am o setor de fabricação. Com o advento de tecnologia de proteína recom-binante, uma proteína de interesse pode ser produzida usando linhagens decélula hospedeira eucariótica culturada engenheiradas para expressar umgene codificando a proteína. O que pode resultar de um processo de culturade célula hospedeira, no entanto, é uma mistura da proteína desejada juntocom impurezas que são ou derivadas da própria proteína, tal como variantesde proteína, ou da célula hospedeira, tal como proteínas de célula hospedei-ra, DNA e restos celulares. O uso da proteína recombinante desejada paraaplicações farmacêuticas pode ser contingente em ser capaz de recuperarconfiavelmente níveis adequados da proteína a partir dessas impurezas.Tecnologia recombinante pode também produzir proteínas que não são en-contradas na natureza, por exemplo, proteínas mutantes novas, proteínas defusão ou proteínas com seqüências de sinal heterólogas que direcionam asecreção da proteína para o meio. Proteínas recombinantes podem ser ex-pressas em muitos tipos de célula eucariótica, incluindo células de Ovário deHamster Chinês (CHO), rim de hamster Chinês (BHK), células mieloma NSOe células de levedura Pichia pastoris.

Tipicamente, para produzir uma proteína recombinante, um vetorde DNA recombinante é criado, o qual contém um gene que codifica a prote-ína a ser expressa com seqüências apropriadas para direcionar a transcriçãoe tradução do gene no tipo de célula desejado. O vetor pode também conterseqüências tal como marcadores selecionávei sou contra-selecionáveis, porexemplo, genes de resistência a fármaco, e/ou seqüências desenvolvidaspara promover a retenção estável das seqüências de expressão de proteína.Para células de mamífero, vetores de plasmídeo e virais, por exemplo, veto-res retrovirais, podem ser usados.

Seguindo a criação do vetor, o vetor é então introduzido nas célu-las. O vetor pode ser transfectado como DNA nu usando métodos padrão,por exemplo, lipofecção, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação oubiolística (pistola de gene). Vetores virais podem ser introduzidos através deinfecção com partículas virais. As células são então avaliadas ou seleciona-das quanto àquelas que contêm o vetor.

Células que contêm o vetor e expressam a proteína recombinan-te podem ser cultivadas em um meio líquido ou em um apoio sólido, e a pro-teína isolada da cultura celular. Densidade de célula de mamífero varia entre1 06 células/mL a 2x107 células por mL ou mais. A maioria das proteínas ésecretada. Concentrações de proteína secretada podem variar entre 4 mg/La 10 g/L. No entanto, se a proteína for produzida intracelularmente, as célu-las são quebradas para liberar a proteína, enquanto se a proteína for secre-tada, ela pode ser isolada do meio de crescimento ou do apoio seguindo re-moção das células e restos celulares. A proteína isolada pode ser então puri-ficada.

Métodos de purificação de proteína biofarmacêuticos convencio-nais usados para remover células e restos celulares incluem centrifugação,microfiltragem e filtros de profundidade. Auxiliares de filtro, tal como terradiatomácea, podem ser usados para aumentar o desempenho dessas eta-pas, mas eles não são sempre eficazes e algumas vezes se ligam significan-temente ao produto de interesse. Seu uso pode também requerer a adiçãode um sólido ou uma suspensão homogênea que pode ser desafiadora co-mo parte de operações biofarmacêuticas em larga escala.

Floculantes poliméricos podem ser usados para auxiliar na clarifi-cação de correntes de processo de cultura de célula de mamífero, mas elespodem ter limitações. Por exemplo, preparações de sulfato de protamina tipi-camente usadas como auxiliares de processamento são limitadas em aplica-ções devido a preocupações sobre inativação da proteína de interesse ouperda de produto devido à precipitação (Scopes, 1987). Reagente de altaqualidade, tal como aquele vendido para uso médico, pode ser caro. Em cer-tos casos, remoção para níveis muito baixos pode requerer validação paraassegurar que não haja quaisquer efeitos inesperados em pacientes. Porexemplo, a quitosana não é um reagente bem definido e há preocupaçõescom relação ao seu desempenho consistente em uso de rotina em aplica-ções de clarificação. Polímeros carregados múltiplos, tal como DEAE dex-trano, polímeros baseados em acrilamida freqüentemente usados em trata-mento de água de refugo (NALCO Water Handbook, Capítulo 8) e polietilenoamina (PEI) foram considerados para uso em aplicações de clarificação.Com relação aos dois últimos tipos de polímeros, os reagentes de acrilamidatêm o potencial para contaminação com reagentes tóxicos e polietileno ami-na, enquanto um reagente de clarificação altamente eficaz, é freqüentemen-te contaminado com quantidades variáveis de monômero de etilenoimina,um agente de câncer suspeito (Scawen e outros). Além disso, muitos dessespolímeros, incluindo PEI, tendem a se ligar quase que irreversivelmente amuitas resinas cromatográficas, deste modo limitando opções de processa-mento a jusante. As preocupações reguladoras e de reuso de matérias-primas associadas com esses polímeros têm limitado sua aplicação princi-palmente a estudos acadêmicos.

Floculantes baseados em não-polímero, tal como alume e sais deferro, têm sido utilizados na indústria de tratamento de água de refugo(NALCO Water Handbook). Essas substâncias podem parecer ser não-úteisem processamento de produtos de proteína porque elas podem se ligar aoproduto de proteína ou podem catalisar reações químicas resultando emmodificações da proteína que poderiam afetar segurança ou eficácia.

SUMÁRIO

A invenção refere-se a métodos de separação. Os métodos deseparação podem ser usados para isolar uma proteína, tal como uma proteí-na recombinante, de um fluido contendo impurezas tal como uma ou maisimpurezas solúveis, impurezas insolúveis, células ou restos celulares.

Em um aspecto, a invenção refere-se a métodos de separaçãoque incluem adição a um fluido de uma ou mais (por exemplo, duas ou mais)soluções solúveis que podem formar um precipitado que auxilia na remoçãode impurezas. O precipitado pode se associar mais fortemente com impure-zas e menos fortemente com um produto alvo. A(s) solução(ões) pode(m)incluir cátions solúveis, por exemplo, íons de metal e/ou ânions solúveis quesão capazes de interagir com, por exemplo, particulatos, material coloidal,restos celulares ou células, e formar um precipitado insolúvel, por exemplo,quando misturados juntos. O precipitado resultante pode ser clarificado ouremovido usando técnicas de separação sólido-líquido, tal como microfiltra-gem, filtragem em profundidade ou centrifugação. O fluido tratado pode terum nível de impureza reduzido em comparação com fluido não-tratado pro-cessado similarmente.

Impurezas podem ser relacionadas com aqueles elementos en-contrados em suspensão dentro do fluido. Em algumas modalidades, as im-purezas incluem material coloidal, material particulado, células, restos decélula tal como fragmentos de membrana e outros complexos celularesgrandes que são insolúveis sob condições de processamento típicas. Impu-rezas podem também referir-se a componentes celulares que permanecemsolúveis sob condições de processamento típicas. DNA, proteínas de célulahospedeira e fosfolipídeos são exemplos de componentes celulares que es-tão presentes em solução durante clarificação. Adicionalmente, impurezasrelacionadas a produto solúvel, tal como isoformas inativas ou espécies a-gregadas, podem estar presentes.Os níveis de impureza podem ser avaliados através de uma vari-edade de métodos. Um método que provê uma medida da quantidade derestos no fluido é a medição nefalométrica de turvação. Alternativamente, onível de restos pode ser avaliado medindo a área de filtro de membrana re-querida para processar um volume conhecido do fluido. Impurezas específi-cas podem ser também solúveis no fluido requerendo testes bioquímicosespecíficos para avaliar. Níveis de DNA podem ser medidos usando métodosbaseados em fluormétrica, tal como usando o corante comercialmente dis-ponível Picogreen (Invitrogen, Número do Produto P-7581). Abordagens al-ternativas incluem métodos de hibridização, tal como técnicas slot-blot, oureações de cadeia de polimerase (métodos de PCR). Níveis de proteína decélula hospedeira podem ser avaliados através de métodos de eletroforesede gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE),cromatografia de fase reversa ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima(ELISA). Fosfolipídeos podem ser analisados através de cromatografia decamada fina ou cromatografia líquida de alto desempenho.

O precipitado resultante pode interagir com ambas impurezas emsolução e impurezas solúveis e esta interação pode diminuir os níveis des-sas impurezas no fluido purificado. Como resultado, os métodos de separa-ção podem prover economias de custo e/ou tempo, bem como qualidade deproduto maior, por exemplo, para um processo industrial que usa cultura decélula de mamífero para a produção de proteínas recombinantes.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um aumento no de-sempenho de etapas cromatográficas subseqüentes, por exemplo, o desem-penho de uma etapa cromatográfica de Proteína A. A cromatografia de Pro-teína A é tipicamente realizada através de aplicação direta de meio condicio-nado livre de célula à resina onde a proteína A de Staphylococcus aureus foiimobilizada. A resina é subseqüentemente lavada com uma solução aquosade pH neutro (aproximadamente pH 6-8) e proteína ligada é freqüentementeeluída com um tampão ácido. Antes do processamento subseqüente, o gru-po de eluato é ajustado para pH neutro. O grupo de eluato da proteína A fre-qüentemente precipita quando da neutralização, especialmente quando cul-turas celulares de alta densidade são usadas para a carga. De acordo com ainvenção, remoção de proteína de célula hospedeira pela etapa da ProteínaA é maior do que a carga que foi tratada com um metal e um ânion em com-paração com um fluido não-tratado. Em modalidades, a precipitação do picode Proteína A quando da neutralização é freqüentemente menos quando ofluido da carga foi tratado com um cátion e um ânion provendo um aperfei-çoamento no processamento.

Em outro aspecto, a invenção refere-se à seleção de dois agen-tes solúveis que, quando misturados, formam um sólido que pode melhorar apureza do fluido do processo com recuperação de produto alta sob condi-ções apropriadas. Esses agentes podem incluir, mas não estão limitados a,cálcio, manganês, magnésio, alumínio, cobalto, níquel, carbonato, flúor, sul-feto, fosfato, silicato e alginatos. Esses compostos representam uma combi-nação de íons de metal multivalentes com ânions monovalentes, ou, alterna-tivamente, ânions multivalentes ou polivalentes, que são os Iigantes preferi-dos para o metal. Sais desses cátions e ânions, quando misturados sobcondições apropriadas potencialmente para formar complexos que são mo-deradamente solúveis, podem ser de utilidade em aplicações de clarificação.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método, incluindoformação de um sólido tendo um primeiro cátion e um primeiro ânion em ummeio incluindo uma proteína; e separação do sólido da proteína.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método, incluindointrodução de um primeiro cátion e um primeiro ânion em um meio tendouma proteína; precipitação de um sólido tendo o primeiro cátion e o primeiroânion; e separação do sólido da proteína.

Os métodos descritos aqui podem ser usados para facilitar a fil-tragem de uma ou mais impurezas a partir de um meio, por exemplo, ummeio fluido (por exemplo, uma suspensão turva). Por exemplo, esses méto-dos podem ser usados em um meio tendo um ou mais agentes causadoresde turvação que tornam as impurezas difíceis ou inconvenientes de removerusando métodos de filtragem convencionais. Deste modo, em outro aspecto,a invenção refere-se a um método que inclui (i) formação de um sólido queinclui um primeiro cátion e um primeiro ânion em um meio (por exemplo, ummeio fluido) que inclui uma porção alvo (por exemplo, uma porção a ser puri-ficada) e um ou mais agentes causadores de turvação tal como proteínas decélula hospedeira precipitadas ou agregadas, lipídeos, restos celulares, célu-Ias inteiras, DNA precipitado ou o precipitado que se forma quando da neu-tralização de pico da Proteína A e (ii) separação do sólido e do(s) agente(s)causadores de turvação da solução através de, por exemplo, filtragem. Emmodalidades, o agente causador de turvação pode ser de origem não-celular, tal como material coloidal, material em partícula derivado de fontesambientais tal como areia, terra, partículas finas de ácido inoxidável moídoou excipientes precipitados tal como antiespumante ou uréia. O meio (porexemplo, uma suspensão turva) pode ter uma turvação relativamente alta,tal como maior do que 5NTU conforme medido por um medidor de turvação,ou maior do que 10ONTU ou maior do que 500NTU. Em algumas modalida-des, a presença do sólido pode aumentar a capacidade de filtro do meio. Emalgumas modalidades, a turvação do meio tratado (por exemplo, o meio a-pós realização das etapas (i) e (ii)) pode ser menos do que o meio não-tratado. Em algumas modalidades, a porção alvo pode ser uma proteína (porexemplo, uma proteína solúvel, por exemplo, um anticorpo). O método podeincluir ainda recuperação da porção alvo a partir da solução após filtragem.

Modalidades podem incluir uma ou mais das características que

seguem.

O primeiro cátion pode ser cálcio, magnésio, estrôncio, alumínio,escândio, lântano, silício, titânio, zircônio, tório, manganês, cobalto, cobre,cromo, ferro, níquel zinco ou vanádio. O primeiro cátion pode ser cálcio.

O primeiro ânion pode ser fosfato, carbonato, cromato, tungstato,hidróxido, haleto, succinato, tartrato, citrato, sulfeto, molibdato, nitrato, flúor,silicato e alginato. O primeiro ânion pode ser fosfato.

O primeiro cálcio pode ser cálcio e o primeiro ânion pode ser fos-fato.

O sólido pode ter uma constante de produto de solubilidade denão mais do que cerca de 10"4M2.O método pode ainda incluir introdução de a partir de cerca de 4mM a cerca de 200 mM do primeiro cátion ou do primeiro ânion no meio.

O produto das concentrações do primeiro cátion e do primeiroânion pode ser maior do que cerca de IO 5M2, IO 4M2 ou 2,7x10 2M2.

As concentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion no meiopodem ser diferentes.

As concentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion no meiopodem ser substancialmente as mesmas.

O método pode incluir ainda mudança do pH do meio.

O pH do meio pode ser mantido entre e de a partir de cerca de 5a cerca de 9.

O método pode proverseparação de pelo menos cerca de 50%da proteína no meio. O método pode prover separação de pelo menos cercade 70% da proteína no meio.

O método pode incluir ainda diminuição da turvação clarificada domeio clarificado em pelo menos cerca de 30% com relação a um segundomeio clarificado idêntico ao meio e livre do sólido. O método pode incluir ain-da diminuição da turvação do meio clarificado em pelo menos cerca de 50%com relação a um segundo meio clarificado idêntico ao meio e livre do sóli-do.

O meio pode incluir células. O meio pode incluir ainda células demamífero. O meio pode incluir ainda células eucarióticas.

O método pode incluir ainda centrifugação do meio, filtragem domeio através de uma membrana de microfiltragem ou filtragem do meio atra-vés de um filtro de profundidade.

O sólido pode incluir ainda uma segunda espécie de cátion ou umsegundo ânion.

O meio que inclui a proteína, após o sólido ser formado e sepa-rado, pode ser aplicado a uma coluna de Proteína A e eluído para prover umpico eluído tendo uma turvação menor do que um pico similarmente eluídode um segundo meio idêntico ao primeiro meio e livre de formação do sólido.O meio que inclui a proteína, após o sólido ser formado e sepa-rado, pode ser aplicado a uma coluna de Proteína A e eluído para prover umpico eluído tendo um nível de impureza solução menor do que um pico eluí-do de um segundo meio idêntico ao meio e livre de formação do sólido.

O primeiro cátion e o primeiro ânion podem ser introduzidos se-qüencialmente.

O primeiro cátion e o primeiro ânion podem ser introduzidos si-multaneamente.

O método pode incluir introdução de concentrações diferentes doprimeiro cátion e do primeiro ânion no meio ou introdução da mesma con-centração do primeiro cátion e do primeiro ânion no meio.

O método pode incluir ainda ajuste da temperatura do meio.

A proteína pode ser uma proteína secretada. A proteína pode serum anticorpo, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo, umreceptor solúvel, uma fusão de receptor, uma citocina, um fator de cresci-mento, uma enzima ou um fator de coagulação.

Em modalidades onde a proteína é um anticorpo ou um fragmen-to dele, ela pode incluir pelo menos uma, e tipicamente duas cadeias pesa-das de comprimento integral, e tipicamente duas cadeias leves. Alternativa-mente, os anticorpos ou fragmentos deles podem incluir apenas um frag-mento de ligação de antígeno (por exemplo, um Fab, F(ab')2, Fv ou umfragmento Fc de cadeia simples). O anticorpo ou fragmento dele pode serum anticorpo monoclonal ou de especificidade única. O anticorpo ou frag-mento dele pode ser também um anticorpo humano, humanizado, quimérico,enxertado com CDR ou gerado in vitro. Em ainda outras modalidades, o an-ticorpo tem uma região constante de cadeia pesada escolhida de, por exem-plo, IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em outra modalidade, o anticorpo tem umacadeia leve escolhida de, por exemplo, kappa ou lambda. Em uma modali-dade, a região constante é alterada, por exemplo, mutada, para modificar aspropriedades do anticorpo (por exemplo, para aumentar ou diminuir um oumais de: ligação de receptor Fc, glicosilação de anticorpo, o número de resí-duos cisteína, função de célula efetora ou função de complemento). Tipica-mente, o anticorpo ou fragmento dele se liga especificamente a um antígenopredeterminado, por exemplo, um antígeno associado com um distúrbio, porexemplo, um distúrbio neurodegenerativo, metabólico, inflamatório, auto-imune e/ou um maligno. Anticorpos exemplares que podem ser separadospelos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorposcontra um peptídeo Αβ, interleucina-13 (IL-13), interleucina-22 (IL-22), 5T4 efator-8 de crescimento e diferenciação (GDF-8).

Outros aspectos, características e vantagens ficarão aparente apartir da descrição das suas implementações preferidas e a partir das reivin-dicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A FIGURA 1 é um fluxograma de uma modalidade de um métodode separação.

A FIGURA 2 é uma representação gráfica que mostra o efeito deescala e método de mistura sobre a floculação.

A FIGURA 3 é uma representação gráfica que mostra o efeito develocidade de mistura sobre a floculação.

A FIGURA 4 é um sumário gráfico de cinco experimentos de flo-culação de escala piloto.

A FIGURA 5 é um sumário gráfico que mostra mudanças em %de recuperação de anticorpo ao longo do tempo para cada um dos cinco ex-perimentos de floculação de escala piloto sumarizados na FIGURA 4.DESCRIÇÃO DETALHADA

Com referência à FIGURA 1, um método 30 para separação deuma proteína alvo, tal como uma proteína recombinante, é mostrado. O mé-todo 30 inclui adição de sais solúveis (tal como um sal contendo cálcio e umsal contendo fosfato) a um fluido contendo a proteína (etapa 32) e impurezas(que podem incluir, mas não estão limitadas a, restos celulares, células,DNA, proteína de célula hospedeira e impurezas relacionadas a produto talcomo espécies isoformas ou agregadas). As soluções de sal podem conteragentes de tamponamento para minimizar as mudanças de pH ou otimizar opH no fluido quando da mistura das soluções de sal. Quando do contato (porexemplo, mistura), os sais solúveis freqüentemente começam a reagir paraformarem um precipitado insolúvel (tal como um fosfato de cálcio sólido) quepode sedimentar no meio. Conforme mostrado na FIGURA 1, o meio podeser subseqüentemente titulado para um pH predeterminado e a temperaturaajustada (etapa 34), conforme necessário, para aumentar a precipitação. Oprecipitado de sedimentação também sedimenta as células e os restos, epotencialmente outras impurezas, enquanto a proteína alvo permanece es-sencialmente solúvel no fluido. A suspensão de fluido é incubada sob condi-ções apropriadas por uma duração fixada a fim de promover precipitação eotimizar clarificação enquanto mantendo altos níveis de recuperação de pro-teína alvo (etapa 36). Subseqüentemente, o precipitado é separado do fluidocontendo a proteína alvo (etapa 38). Esta operação pode acontecer em umavariedade de maneiras incluindo sedimentação por gravidade, centrifugaçãoou filtragem onde alternativas para filtragem incluem filtragem em fluxo tan-gencial, filtragem em profundidade, filtragem através de meio carregado, fil-tragem em almofada onde terra diatomácea é um componente do meio. Aquantidade de cátion e ânion adicionada ao meio pode não ser suficientepara permitir sedimentação por gravidade da precipitação ou de restos, maspode ainda facilitar filtragem através da ação como um auxiliar de filtro. Aseparação sólido-líquido pode incluir processamento através de uma sériede opções acima mencionadas, tipicamente culminando com passagem defluido através de um filtro com uma taxa de tamanho de poro nominal baixa(tal como 0,45, 0,2 ou 0,1 μΜ), que pode ser considerada esterilizante emgrau. O fluido clarificado pelos métodos de floculação descritos aqui poderequerer menos áreas de filtragem, ou como parte da clarificação primária ouapós uma etapa de separação sólido-líquido inicial tal como centrifugação.Além disso, a turvação do filtro pós-almofada e de grau pós-esterilizaçãopode ser significantemente reduzida comparado com um controle não-floculado.

Tipicamente, purificação subseqüente pode proceder através deuma serie de etapas cromatográficas, embora outros métodos de purifica-ção, tal como cristalização e precipitação, possam ser concebidos. Após cia-rificação usando o método descrito, o desempenho da primeira etapa croma-tografia, que para anticorpos é freqüentemente uma coluna de Proteína A,pode ser aumentado. A remoção geral de impurezas derivadas de célula,incluindo proteína de célula hospedeira, pode ser maior do que quando tra-tamento de floculação não é conduzido. Em muitos casos, pico de grupo deeluato de Proteína A neutralizado também tem menos precipitação conformecomparado com o controle não-tratado. Este nível menor de precipitaçãopode requerer menos área de filtro ou pode reduzir o tempo de processa-mento necessário. O nível menor de precipitação também indica a remoçãode uma impureza indesejada.

Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o precipita-do insolúvel aumente a separação da proteína ao seletivamente se associarcom as células, restos celulares e outras impurezas da corrente de processoenquanto não significantemente interagindo com a proteína. Um exemplonão-limitante do processo de remoção de impureza tomado como hipótese émostrado na equação (1) abaixo:

<formula>formula see original document page 13</formula>

Com referência à equação (1), M+ é um cátion solúvel (isto é,"(s)"], e A- é um ânion solúvel que pode interagir com M+ para formar um salou complexo insolúvel; os círculos sombreados e cheios representam cadaum uma impureza solúvel ou insolúvel; 1 é um precipitado insolúvel que in-clui o sal ou complexo de cátion-ânion e impurezas associadas com eles (1 éalgumas vezes referido aqui como o "complexo ou sal final" ou "sólido tendoum primeiro cátion e um primeiro ânion"; e a seta apontando para baixo indi-ca que 1 está em forma precipitada. Por exemplo, fosfato de cálcio pode in-teragir ionicamente e/ou através de quelação com DNA, proteína de célulahospedeira e restos celulares, enquanto não interagindo significantementecom a proteína alvo. Esta seletividade permite que a proteína permaneça nosobrenadante, e, subseqüentemente, seja prontamente separada do meio eoutros componentes do meio condicionado.

Ainda com referência à FIGURA 1, o método de separação 30inclui introdução de um primeiro sal solúvel e um segundo sal solúvel em ummeio (etapa 32). O meio pode ser, por exemplo, uma solução aquosa condi-cionada onde uma proteína recombinante foi formada. O primeiro sal solúvelinclui um primeiro cátion e o segundo sal solúvel inclui um primeiro ânion.Quando do contato, o primeiro cátion e o primeiro ânion são capazes de inte-ragir no meio e podem começar a formar um precipitado insolúvel. O ambi-ente do fluido pode ser ajustado em qualquer momento no pH ou temperatu-ra para otimizar condições de precipitação (por exemplo, etapa 34) e a solu-ção é incubada por uma duração fixada para permitir que o sistema equilibrecompletamente (etapa 36).

Em geral, qualquer combinação de cátion (por exemplo, um pri-meiro cátion)/ânion (por exemplo, um primeiro ânion) pode ser selecionada,que seja capaz de formar um sal ou complexo relativamente insolúvel nofluido contendo o produto de interesse. Em modalidades, tais sais ou com-plexos podem ser identificados como sendo insolúveis, moderadamente so-lúveis, praticamente insolúveis, muito levemente insolúveis ou levementeinsolúveis em uma solução comparável com o fluido contendo o produto deinteresse. Combinações de cátion/ânion exemplares incluem aquelas onde ocátion selecionado (por exemplo, um primeiro cátion, por exemplo, M+ naequação 2 abaixo) e o ânion selecionado (por exemplo, um primeiro ânion,por exemplo, A- na equação 2 abaixo) são capazes de formar um sal oucomplexo (por exemplo, MA na equação 2 abaixo) que é relativamente inso-lúvel em água:

<formula>formula see original document page 14</formula>

em que "(s)" e a seta apontando para baixo são conforme definido com rela-ção à equação (1). Em muitos casos, caracterização de solubilidade em á-gua conforme descrito em The Merck Index ou no The Handbook of Physicsand Chemistry ou outras referências similares serve como um indicador a-propriado de desempenho potencial.

Em algumas modalidades, o cátion selecionado e o ânion sele-cionado são capazes de formar um sal ou complexo tendo uma constante deproduto de solubilidade (Ksp) em água de a partir de cerca de 1 χ 10 4 M2 acerca de 1 χ 10"50 M2 (por exemplo, de a partir de cerca de 1 χ 10 5 M2 a cer-ca de 1 χ 10"50 M2, de a partir de cerca de 1 χ 10"6 M2 a cerca de 1 χ 10"50 M2,de a partir de cerca de 1 χ 10"4 M2 a cerca de 1 χ 10"40 M2). Em algumas mo-dalidades, cátions e ânions exemplares podem ser identificados como umaconstante de produto de solubilidade (Ksp) entre o primeiro cátion e o primei-ro ânion ([cátion/ χ [ânion]) de menos do que cerca de 10"4 M2, por exemplo,e de preferência abaixo de cerca de 10"5 M2 ou 10"6 M2. Substâncias comvalores Ksp de menos do que 10'4 M2 podem ser utilizadas nos métodos umavez que essas substâncias, quando da mistura com o cátion e o ânion, po-dem resultar em uma solução final de no máximo 10 mM de cada; adição docátion ou ânion em excesso de 10 mM pode resultar em precipitação e sub-seqüente floculação. Substâncias com valores Ksp maiores do que aqueleslistados acima podem ser usadas, no entanto, uma quantidade excessiva decátion e ânion pode ser necessária para formar o sólido.

O cátion (por exemplo, um primeiro cátion) pode ser um metal

alcalino-terroso, um metal de transição ou um elemento de grupo principal.Esses elementos podem ser classificados em ácidos duros, ácidos borderli-ne ou ácidos moles. Exemplos de primeiros cátions incluem cálcio (Ca2+),magnésio (Mg2+), estrôncio (Sr2+), alumínio (AI3+), cobre (Cu(I) ou Cu(II), es-cândio (Sc3+), lântano (La+3), silício (Si4+), titânio (Ti(III) ou Ti(IV)), tório, zir-cônio, manganês (Mn(II) ou Mn(IIII)), cobalto (Co(II) ou Co(IIII)), cromo (Cr(II)ou Cr(III)), ferro (Fe(II) ou Fe(III)), níquel (Ni2+), zinco (Zn2+) e vanádio (V(lll),V(IV) ou V(V)). Esses representam os ácidos duros e borderline. O primeiroânion pode ser uma espécie atômica ou uma espécie molecular. Em algu-mas modalidades, o primeiro cátion pode ser Ca2+, Mg2+, Mn(II), Co(II) ouNI2+. Em certas modalidades, o primeiro cátion pode ser Ca2+.Exemplos de primeiros ânions incluem ânions que são os Iigantespreferidos para o íon de metal usado. Para o ácido duro e os ácidos border-line, os ânions podem incluir fluoreto, fosfato, carbonato, silicato, cromato,tungstato, hidróxido, sulfeto, nitrato, molibdato, succinato, tartarato e citrato,e até certo ponto sulfatos e percloratos (vide Aquatic Chemistry, Editores W.Stumm e J.S. Morgan, J. Wiley (1981)(, p. 343; e R.G. Pearson, J. Amer.Chem. Soc., v. 85, p. 3533 (1963). Em algumas modalidades, o primeiro â-nion pode ser fosfato, sulfito, carbonato, fluoreto, molibdato ou silicato. Emcertas modalidades, o primeiro ânion pode ser fosfato.

Em algumas modalidades, o primeiro cátion pode ser Ca2+ e oprimeiro ânion pode ser fosfato, sulfeto, carbonato, fluoreto, molibdato ousilicato. Em certas modalidades, o primeiro cátion pode ser Ca2+ e o primeiroânion pode ser fosfato.

Em algumas modalidades, o primeiro cátion pode ser Mg2+,Mn(II), Co(II) ou Nl2+e o primeiro ânion pode ser fosfato, carbonato ou fluore-to.

A concentração inicial para cada um dos primeiro cátion e primei-ro ânion (isto é, a concentração do primeiro cátion e do primeiro ânion que éintroduzida no meio (antes do início da precipitação)) pode variar de a partirde cerca de 2 milimolares a cerca de 200 milimolares (por exemplo, de apartir de cerca de 3 milimolares a cerca de 200 milimolares, de a partir decerca de 4 milimolares a cerca de 200 milimolares, de a partir de cerca de5 milimolares a cerca de 200 milimolares, de a partir de cerca de 4 mili-molares a cerca de 100 milimolares, de a partir de cerca de 4 milimolares acerca de 50 milimolares, de a partir de cerca de 4 milimolares a cerca de 40milimolares, de a partir de cerca de 4 milimolares a cerca de 30 milimolares,de a partir de cerca de 4 milimolares a cerca de 10 milimolares,de a partir de cerca de 10 milimolares a cerca de 80 milimolares,de a partir de cerca de 10 milimolares a cerca de 40 milimolares,de a partir de cerca de 10 milimolares a cerca de 30 milimolares, de a partirde cerca de 20 milimolares a cerca de 80 milimolares, de a partir de cerca de20 milimolares a cerca de 40 milimolares, por exemplo, cerca de 4 mili-molares, cerca de 6 milimolares, cerca de 10 milimolares, cerca de 13,3 mi-limolares, cerca de 16 milimolares, cerca de 20 milimolares, cerca de 24 mi-limolares, cerca de 30 milimolares, cerca de 33,3 milimolares, cerca de 40milimolares, cerca de 50 milimolares ou cerca de 80 milimolares) dependen-do da solubilidade do complexo final. Em certas modalidades, a concentra-ção do primeiro cátion introduzido no meio (antes do início da precipitação)pode ser cerca de 6 milimolares, cerca de 10 milimolares, cerca de 20 mili-molares, cerca de 24 milimolares, cerca de 30 milimolares, cerca de 40 mili-molares, cerca de 50 milimolares ou cerca de 80 milimolares. Em certas mo-dalidades, a concentração do primeiro ânion introduzido no meio (antes doinício da precipitação) pode ser 4 milimolares, cerca de 10 milimolares, cercade 13,3 milimolares, cerca de 16 milimolares, cerca de 20 milimolares, cercade 24 milimolares, cerca de 30 milimolares, cerca de 40 milimolares, cercade 50 milimolares ou cerca de 80 milimolares. Por exemplo, a concentraçãodo primeiro cátion introduzido no meio (antes do início da precipitação) podeser cerca de 30 milimolares e a concentração do primeiro ânion introduzidono meio (antes do início da precipitação) pode ser cerca de 20 milimolares.Como outro exemplo, a concentração do primeiro cátion introduzido no meio(antes do início da precipitação) pode ser cerca de 24 milimolares e a con-centração do primeiro ânion introduzido no meio (antes do início da precipi-tação) pode ser cerca de 16 milimolares.

Em algumas modalidades, o produto das concentrações iniciaisdescritas acima do primeiro cátion e do primeiro ânion pode ser de a partirde cerca de 4 χ 10"6 M2 a cerca de 4 χ 10"2 M2 (por exemplo, de a partir decerca de 1,6 χ 10"5 M2 a cerca de 4 X 10'2 M2, de a partir de cerca de 2,5 χ10"5 M2 a cerca de 4 χ 10"2 M2, de a partir de cerca de 1,6 χ 10"5 M2 a cercade 6 χ 10"2 M2 ou de a partir de cerca de 2,5 χ 10'5 M2 a cerca de 6,4 χ 10'3M2). Em algumas modalidades, o produto das concentrações iniciais acimadescritas do primeiro cátion e do primeiro ânion pode ser maior do que cercade 1 x10"5 M2, maior do que cerca de 2x10 5 M2, maior do que cerca de 1 x10"4M2, maior do que cerca de 2 χ 10'4 M2, maior do que cerca de 10 χ 10"4 M2ou maior do que cerca de 2,7 χ 10"2 M2. Em algumas modalidades, essasconcentrações podem resultar em precipitação significante do sal insolúveljunto com as impurezas. Concentrações que são muito altas podem resultarem volume sólido de mais do que cerca de 10% do volume de fluido total.Concentrações em excesso de 500 mM de cátion ou ânion com constantesde solubilidade baixas podem dar volumes sólidos grandes. Recuperação deproduto adequada a partir de um volume de sólido grande pode ser difícilusando técnicas de separação sólido-líquido padrão. Exemplos de precipita-dos incluem fosfato de cálcio, sulfeto de cálcio, carbonato de cálcio, fluoretode cálcio, silicato de cálcio, molibdato de cálcio, carbonato de magnésio, fos-fato de magnésio, fluoreto de magnésio, fosfato de manganês, carbonato demanganês, fosfato de cobalto, fosfato de níquel e carbonato de níquel.

Em algumas modalidades, a Ksp do sal ou complexo final no meiode fluido (por exemplo, 1 na equação (1), isto é, o precipitado insolúvel que-inclui o sal ou complexo de cátion-âfflon o impwezas associadas com ele)pode ser de a partir de cerca de 1 χ 10"4 M2 a cerca de 1 χ 10'50 M2 (por e-xemplo, de a partir de cerca de 1 χ 10"5 M2 a cerca de 1 χ 10"50 M2, de a par-tir de cerca de 1 χ 10"6 M2 a cerca de 1 χ 10'50 M2, de a partir de cerca de 1 χ10-4 M2 a cerca de 1 χ 10"40 M2). Em algumas modalidades, a Ksp do sal oucomplexo final no meio fluido pode ser menos do que cerca de 10"4 M2, porexemplo, e de preferência, menos do que cerca de 10'5 M2 ou 10"6 M2. Porexemplo, na amostra N5 2 anti-IL13 com 40 mM de cálcio e 20 mM de fosfa-to na Tabela 1, o sobrenadante após centrifugação (isto é, após precipitação)continha 8,19 mM de cálcio e 1,04 mM de fosfato. Este nível de cálcio e fos-fato solúveis corresponde a uma Ksp de 8,5 χ 10"6 M2. Na amostra N- 1 anti-AB com 80 mM de cálcio e 20 mM de fosfato na Tabela 1, o sobrenadanteapós centrifugação continha 22,2 mM de cálcio e 0,4 mM de fosfato. Estenível de cálcio e fosfato solúveis corresponde a uma Ksp de 8,4 χ 10'6 M2.

Em algumas modalidades, o Ksp do sal ou complexo final no meiofluido (por exemplo, 1 na equação (1)) pode ser diferente (por exemplo, mai-or do que) a Ksp do próprio sal ou complexo de cátion-ânion (isto é, quais-quer impurezas associadas, por exemplo, 2 na equação (2))) em água. Porexemplo, com referências às equações (1) e (2), a Ksp de, por exemplo, 1(por exemplo, MA = fosfato de cálcio) no fluido pode ser diferente da (porexemplo, maior do que) Ksp do próprio fosfato de cálcio em água (por exem-plo, 2 na equação (2) onde MA = fosfato de cálcio).

Outras implementações de formação do precipitado podem serrealizadas. Por exemplo, o primeiro cátion e o primeiro ânion podem ser in-troduzidos no meio substancialmente simultaneamente ou seqüencialmente.Em implementações onde o primeiro cátion e cálcio e o primeiro ânion é sul-feto, introdução do sulfeto no meio antes da introdução do cálcio no meiopode aumentar a precipitação de impurezas (Exemplo 2). As concentraçõesdo primeiro cátion e do primeiro ânion podem ser substancialmente iguais oudiferentes (ricas em cátion ou rico em ânion). Por exemplo, a concentraçãode um íon pode ser cerca de 1,5 vez, cerca de duas vezes, cerca de trêsvezes, cerca de quatro vezes ou cerca de 5 vezes maior do que a concen-tração do outro íon. Em algumas implementações, mais de um cátion e/oumais de um ânion é introduzido no meio. A concentração total de cátions po-de variar de a partir de cerca de 5 milimolares a cerca de 200 milimolares,como pode a concentração total dos ânions. Onde soluções poliméricas fo-rem usadas, a concentração, em mM, pode ser substancialmente menorcom base no peso molecular do polímero; a concentração pode ao invésdepender do peso molecular do monômero. Em outras implementações, a-penas um ou mais cátions ou apenas um ou mais ânions é/são introduzidosno meio. Por exemplo, quando o meio contendo a proteína já inclui ânion(s)ou cátion(s) capaz(es) de formar um precipitado, então o(s) cátion ou â-nion(s) apropriado(s), respectivamente, pode(m) ser adicionados(s) paraformar o precipitado. Alternativamente, íons podem ser adicionados para re-agir com os íons já no meio para formar um primeiro precipitado, e combina-ção(ões) de cátion/ânion adicional(ais) pode(m) ser adicionada(s) no meiopara formar outro(s) precipitado(s).

Conforme mostrado na FIGURA 1, o método pode incluir opcio-nalmente titulação do meio para um pH apropriado e/ou ajuste da temperatu-ra (etapa 34).Em algumas modalidades, o pH do meio pode ser ajustado paraum pH predeterminado para aumentar precipitação (etapa 34). O pH do meiopode ser aumentado ou diminuído, por exemplo, através de titulação comuma base (por exemplo, NaOH) ou um ácido, tal como ácido fosfórico ouácido clorídrico. O pH predeterminado pode ser uma função do(s), por e-xemplo, cátion(s) e ânion(s) no meio, outros materiais no meio e/ou a com-posição do meio. O pH predeterminado pode variar de a partir de cerca decinco a cerca de nove, por exemplo, de a partir de cerca de 6,5 a cerca de 9.

Em outras modalidades, o pH do meio não é ajustado.Em algumas modalidades, o meio pode ser aquecido ou esfriado

para otimizar o desempenho (etapa 34). Como com ajuste do pH, a tempera-tura e o tempo pelos quais o meio é aquecido ou incubado podem ser umafunção do(s), por exemplo, cátion(s) e ânion(s) no meio, outros materiais nomeio e/ou a composição do meio.O meio pode ser incubado em temperatura ambiente ou aquecido

até, por exemplo, cerca de 37°C. O período de incubação ou aquecimento(etapa 36) pode variar de a partir de cerca de uma hora a cerca de doze ho-ras. Enquanto o meio está incubando ou aquecendo, o meio pode ser mistu-rado (por exemplo, em baixas velocidades para reduzir cisalhamento dosmateriais), ou o meio pode ser misturado por um período de tempo inicial edeixado sedimentar sem mistura de modo que o precipitado possa sedimen-tar, o que permite que o sobrenadante contendo proteína seja facilmenteseparado.

Em outras modalidades, o meio não é aquecido, por exemplo, seprecipitação for suficiente para prover boa separação.

Em seguida, o meio é centrifugado (etapa 38) para ajudar a sepa-rar o precipitado do sobrenadante, que reduz a turvação do sobrenadante.Outros métodos de remoção de sólidos são possíveis, tal como filtragemcom profundidade ou microfiltragem. Conforme ilustrado abaixo nos exem-pios, a turvação do meio pode ser reduzida em pelo menos cerca de 30%com relação a uma solução controle não-tratada, onde nenhuma floculaçãoaconteceu. Em algumas implementações, a turvação do meio é reduzida empelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% ou mais. Con-forme aqui usado, a turvação é medida usando um nefalômetro (tal comoaqueles feitos pela HACH, Loveland, CO) de acordo com procedimentos pa-drão.

Após clarificação primária tal como através de centrifugação, re-moção de restos adicionais pode acontecer através do uso de filtragem (eta-pa 38). Conforme ilustrado abaixo nos exemplos, os métodos de separaçãodescritos aqui podem prover rendimentos altos, com uma recuperação deproteína de pelo menos cerca de 50% (tal como pelo menos cerca de 60%,pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cercade 90%). Conforme aqui usado, a recuperação é calculada como a massada proteína alvo no grupo pós-tratado para a massa no grupo pré-tratamento. A massa de produto é o produto da concentração de proteínaalvo e volume onde concentração pode ser determinada através de uma va-riedade de métodos, tal como ensaios de cromatografia líquida de alto de-sempenho. Para proteínas alvo que são anticorpos, concentração pode serfreqüentemente determinada usando métodos de análise baseados em pro-teína A. Aqueles de habilidade na técnica de cultura de célula farmacêutica,purificação ou metodologias de caracterização de proteína podem identificarmétodos de ensaio adequados.

A proteína pode ser subseqüentemente purificada, de acordocom métodos convencionais.Proteínas ou Polipeptídeos

A presente invenção refere-se à separação de proteínas, por e-xemplo, proteínas solúveis ou secretadas, de um fluido. O termo "proteína",conforme aqui usado, refere-se a um ou mais polipeptídeos que podem fun-cionar como uma unidade. O termo "polipeptídeo" conforme aqui usado refe-re-se a uma cadeia seqüencial de aminoácidos ligados juntos através deligações peptídeo. O termo "polipeptídeo" é usado para se referir a uma ca-deia de aminoácido de qualquer comprimento, mas uma pessoa de habilida-de comum na técnica vai compreender que o termo não é limitado a cadeiascompridas e pode se referir a uma cadeia mínima compreendendo dois ami-noácidos ligados juntos através de uma ligação peptídeo. Se um único poli-peptídeo puder funcionar como uma unidade, os termos "polipeptídeo" e"proteína" podem ser usados intercomutavelmente.

Em certas modalidades, as proteínas são produzidas recombi-nantemente. Os termos "proteína recombinantemente expressa" e "proteínarecombinante" conforme aqui usados referem-se a um polipeptídeo expressoa partir de uma célula hospedeira que foi manipulada pela mão do homempara expressar este polipeptídeo. Em certas modalidades, a célula hospedei-ra é uma célula de mamífero. Em certas modalidades, esta manipulação po-de compreender uma ou mais modificações genéticas. Por exemplo, as célu-las hospedeiras podem ser geneticamente modificadas pela introdução deum ou mais genes heterólogos codificando o polipeptídeo a ser expresso. Opolipeptídeo heterólogo recombinantemente expresso pode ser idêntico ousimilar a polipeptídeos que são normalmente expressos na célula hospedei-ra. O polipeptídeo heterólogo recombinantemente expresso pode ser tam-bém estranho para a célula hospedeira, por exemplo, heterólogo para poli-peptídeos normalmente expressos na célula hospedeira. Em certas modali-dades, o polipeptídeo heterólogo recombinantemente expresso é quimérico.Por exemplo, porções de um polipeptídeo podem conter seqüências de ami-noácido que são idênticas ou similares a polipeptídeos normalmente expres-sos na célula hospedeira, enquanto outras porções contêm seqüências deaminoácido que são estranhas para a célula hospedeira. Adicionalmente oualternativamente, um polipeptídeo pode conter seqüências de aminoácido dea dois ou mais polipeptídeos diferentes que são ambos normalmente ex-pressos na célula hospedeira. Ainda, um polipeptídeo pode conter seqüên-cias de aminoácido de dois ou mais polipeptídeos que são ambos estranhospara a célula hospedeira. Em algumas modalidades, a célula hospedeira égeneticamente modificada pela ativação ou supra-regulagem de um ou maisgenes endógenos.

Qualquer proteína que possa desejavelmente ser separada deacordo com a presente invenção será freqüentemente selecionada com baseem uma atividade biológica ou química interessante ou útil. Por exemplo, apresente invenção pode ser empregada para separar qualquer anticorpo,receptor, citocina, fator de crescimento, enzima, fator de coagulação, hormô-nio, fator regulador, antígeno, agente de ligação, farmaceuticamente ou co-mercialmente relevante, dentre outros. A lista de proteínas que segue quepodem ser separadas de acordo com a presente invenção é meramente e-xemplar em natureza, e não pretende ser uma citação limitante. Uma pessoade habilidade comum na técnica vai compreender que qualquer proteína po-de ser expressa de acordo com a presente invenção e será capaz de sele-cionar a proteína particular a ser produzida com base conforme necessário.Anticorpos e Fragmentos de Ligação

Anticorpos, também conhecidos como imunoglobulinas, são tipi-camente proteínas glicosiladas tetraméricas compostas de duas cadeias le-ves (L) de aproximadamente 25 kDa cada uma e duas cadeias pesadas (H)de aproximadamente 50 kDa cada uma. Dois tipos de cadeia leve, chama-das Iambda e capa, podem ser encontrados em anticorpos. Dependendo daseqüência de aminoácido do domínio constante de cadeias pesadas, imuno-globulinas podem ser atribuídas a cinco classes principais: A, D, E, G e M, evárias dessas podem ser divididas mais em subclasses (isótipos), por exem-pio, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2. Cada cadeia leve inclui um domí-nio variável (V) N-terminal (VL) e um domínio (C) constante (CL). Cada ca-deia pesada inclui um domínio (V) N-terminal (VH), três ou quatro domíniosC (CHs) e uma região de impedimento. O domínio CH mais próximo de VH édesignado CH1. Os domínios VH e VL consistem em quatro regiões de se-qüências relativamente conservadas chamadas regiões de estrutura princi-pal (FR1, FR2, FR3 e FR4), que formam um "scaffold" para três regiões deseqüências hipervariáveis (regiões de determinação de complementaridade,CDRs). As CDRs contêm a maioria dos resíduos responsáveis pelas intera-ções específicas do anticorpo com o antígeno. CDRs são referidas comoCDR1, CDR2 e CDR3. Deste modo, constituintes de CDR na cadeia pesadasão referidos como H1, H2 e H3, enquanto constituintes de CDR na cadeialeve são referidos como L1, L2 e L3. CDR3 é tipicamente a fonte maior dediversidade molecular dentro do sítio de ligação de anticorpo. H3, por exem-plo, pode ser tão curta quanto dois resíduos de aminoácido ou maior do que26 aminoácidos. As estruturas de subunidade e configurações tridimensio-nais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas na técni-ca. Para uma revisão da estrutura de anticorpo vide Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Eds. Harlow e outros, 1988. Umapessoa de habilidade na técnica vai reconhecer que cada estrutura de subu-nidade, por exemplo, uma estrutura CH, VH1 CL, VL, CDR, FR, compreendefragmentos ativos, por exemplo, a porção da subunidade VH, VL ou CDRque se liga ao antígeno, isto é, o fragmento de ligação de antígeno, ou, porexemplo, a porção da subunidade CH que se liga a e/ou ativa, por exemplo,um receptor Fc e/ou complemento. As CDRs tipicamente referem-se àsCDRs Kabat, conforme descrito em Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, US Department of Health and Human Services (1991), Eds. Kabat eoutros. Outro padrão para caracterização do sítio de ligação de antígeno éreferir-se às alças hipervariáveis conforme descrito por Chothia. Vide, porexemplo, Chothia, D. e outros (1992) J. Mol. Biol., 227:799-817; e Tomlinsone outros (1995) EMBO J., 14:4628-4638. Ainda outro padrão é a definição deAbM usada pelo Oxford Molecular's AbM antibody modelling software. Vide,geralmente, por exemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Anti-body Variable Domains. Em: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel,S. e Kontermann1 R., Springer-Verlag, Heidelberg). Modalidades descritascom relação a CDRs Kabat podem ser alternativamente implementadas u-sando relações descritas similares com relação alças hipervariáveis de Cho-thia ou às alças definidas por AbM.

Conforme aqui usado, o termo "anticorpo" inclui uma proteínacompreendendo pelo menos um, tipicamente dois, domínios VH ou porçõesdele e/ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios VL ou porções dele.Em uma modalidade, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias de imuno-globulina pesadas e duas cadeias de imunoglobulina leves, onde as cadeiasde imunoglobulina pesadas e leves são interconectadas através de, por e-xemplo, ligações dissulfeto. Os anticorpos, ou porções deles, podem ser ob-tidos a partir de uma origem, incluindo, mas não limitado a, roedor, primata(por exemplo, primata humano ou não-humano), camelídeo (por exemplo,camelo ou lhama), bem como recombinantemente produzidos, por exemplo,quiméricos, humanizados e/ou gerados in vitro, conforme descrito em maisdetalhes aqui.

Exemplos de fragmentos de ligação compreendidos no termo"fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmen-to Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH1 CL eCH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo doisfragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de impedimento;(iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmentoFv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo,(v) um fragmento dAb, que consiste em um domínio VH; (vi) um domínio va-riável camelídeo ou camelizado; (vii) um Fv de cadeia simples (scFv); e (viii)um anticorpo biespecífico. Ainda, embora os dois domínios do fragmento Fv,VL e VH sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos,usando métodos recombinantes, por um Iigante sintético que permite queeles sejam feitos como uma cadeia de proteína única onde as regiões VL eVH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fvde cadeia simples (scFv), vide, por exemplo, Bird e outros (1988) Science242:423-26; Huston e outros (1988) Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-83). Tais anticorpos de cadeia simples pretendem também ser compreendi-dos no termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo. Essesfragmentos são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas daquelesde habilidade na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à função damesma maneira que são os anticorpos intactos.

O fragmento de ligação de antígeno pode, opcionalmente, incluiruma porção que aumenta um ou mais de, por exemplo, estabilidade, funçãode célula efetora ou fixação de complemento. Por exemplo, o fragmento deligação de antígeno pode incluir uma porção peguilada, albumina ou umaregião constante de cadeia pesada e/ou leve (ou uma porção da mesma).Exceto por anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais", um anti-corpo é compreendido ter cada um de seus sítios de ligação idênticos. Um"anticorpo biespecífico" ou "bifuncional", ou um fragmento de ligação de an-tígeno do mesmo, é um anticorpo híbrido artificial ou fragmento dele tendodois sítios de ligação de antígeno diferentes. Anticorpos biespecíficos, oufragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, podem ser produzidos a-través de uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas, ligaçãode fragmentos Fab', ou recombinantemente. Vide, por exemplo, Songsvilai &Lanchman, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny e outros, J. Im-munol., 148, 1547-1553 (1992).

Vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica estãodisponíveis para obtenção de anticorpos ou fragmentos de ligação de antí-geno deles. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidosatravés de geração de hibridomas de acordo com métodos conhecidos. Hi-bridomas formados desta maneira são então avaliados usando métodos pa-drão, tal como ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e resso-nância de plasmon de superfície (Biacore®), para identificar um ou mais hi-bridomas que produzem um anticorpo que se liga especificamente com umantígeno específico. Qualquer forma do antígeno especificado pode ser usa-da como o imunógeno, por exemplo, antígeno recombinante, formas de o-corrência natural, quaisquer variantes ou fragmentos dele, bem como peptí-deo antigênico dele.

Um método exemplar de fabricação de anticorpos inclui avaliaçãode bibliotecas de expressão de proteína, por exemplo, bibliotecas de mostrade fago ou ribossoma. Mostra de fago é descrita, por exemplo, em Ladner eoutros, Patente U.S. N9 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317;WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288;WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809.

Em adição ao uso de bibliotecas de fago, o antígeno especificadopode ser usado para imunizar um animal não-humano, por exemplo, um ro-edor, por exemplo, um camundongo, hamster ou rato. Em uma modalidade,o animal não-humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imuno-globulina humano. Por exemplo, é possível engenheirar linhagens de ca-mundongo deficientes em produção de anticorpo de camundongo com frag-mentos grandes dos Ioci Ig humanos. Usando a tecnologia de hibridoma,anticorpos monoclonais específicos de antígeno derivados dos genes com aespecificidade desejada podem ser produzidos e selecionados. Vide, porexemplo, XENOMOUSE®, Green e outros (1994) Nature Genetics 7:13-21,US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado em 31 de outubro de 1996 ePedido de Patente PCT Ne PCT/US96/05928 depositado em 29 de abril de1996.

Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal é obtido de umanimal não-humano e então modificado, por exemplo, humanizado, desimu-nizado, quimérico, pode ser produzido usando técnicas de DNA recombinan-tes conhecidas no campo. Uma variedade de abordagens para fazer anticor-pos quiméricos foi descrita. Vide, por exemplo, Morrison e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda e outros, Nature 314:452, 1985,Cabilly e outros, Patente U.S. Nq 4.816.567; Boss e outros, Patente U.S. Ng4.816.397; Tanaguchi e outros, Publicação de Patente Européia EP171496;Publicação de Patente Européia 0173494, Patente do Reino Unido GB2177096B. Anticorpos humanizados podem ser também produzidos, por e-xemplo, camundongos transgênicos que expressam genes de cadeias pesa-da e leve humanos, mas são incapazes de expressar os genes de cadeiaspesada e leve de imunoglobulina de camundongo endógenos. Winter des-creve um método de enxerto de CDR exemplar que pode ser usado parapreparar os anticorpos humanizados descritos aqui (Patente U.S. Ns5.225.539). Todas as CDRs de um anticorpo humano particular podem sersubstituídas com pelo menos uma porção da CDR não-humana, ou apenasalgumas das CDRs podem ser substituídas com CDRs não-humanas. É a-penas necessário substituir o número de CDRs requerido para ligação doanticorpo humanizado para um antígeno predeterminado.

Anticorpos humanizados ou fragmentos deles podem ser geradosatravés de substituição das seqüências do domínio variável Fb que não es-tão diretamente envolvidas em ligação de antígeno com seqüências equiva-lentes de domínios variáveis Fv humanos. Métodos exemplares para gera-ção de anticorpos humanizados ou fragmentos deles são providos por Morri-son (1985) Science 229:1202-1207; por Oi e outros (1986) BioTechniques4:214; e pelas US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; eUS 6.407.213. Esses métodos incluem isolamento, manipulação e expres-são de seqüências de ácido nucléico que codificam todo ou parte dos domí-nios variáveis Fv de imunoglobulina de pelo menos uma de uma cadeia pe-sada ou leve. Tais ácidos nucléicos podem ser obtidos de um hibridoma pro-duzindo um anticorpo contra um alvo predeterminado, conforme acima des-crito, bem como de outras fontes. O DNA recombinante codificando a molé-cula de anticorpo humanizado pode então ser clonado em um vetor de ex-pressão apropriado.

Em certas modalidades, um anticorpo humanizado é otimizadopela introdução de substituições conservativas, substituições de seqüênciade consenso, substituições de linha germinativa e/ou retromutação (backmu-tation). Tais moléculas de imunoglobulina alteradas podem ser feitas atravésde qualquer uma de várias técnicas conhecidas no campo (por exemplo,Teng e outros, Proc. Nati Acad. Sci., U.S.A., 80:7308-7312, 1983; Kozbor eoutros, Immunology Today, 4:7279, 1983; Olsson e outros, Meth. Enzymol.,92:3-16, 1982) e podem ser feitas de acordo com os ensinamentos da Publi-cação PCT WO 92/06193 ou WO 0239400).

Um anticorpo ou fragmento dele pode ser também modificadoatravés de deleção específica de epítopos de célula T ou "desimunização"através dos métodos descritos no WO 98/52976 e no WO 00/34317. Resu-midamente, os domínios variáveis de cadeias pesada e leve de um anticorpopodem ser analisados quanto a peptídeos que se ligam à Classe Il de MHC;esses peptídeos representam epítopos de célula T potenciais (conforme de-finido no WO 98/52976 e WO 00/34317). Para detecção de epítopos de célu-la T potenciais, uma abordagem de modelagem por computador chamada"peptide threading" pode ser aplicada, e ainda um banco de dados de peptí-deos de ligação de classe I de MHC humanos pode ser pesquisado quanto amotivos presentes nas seqüências VH e VL, conforme descrito no WO98/52976 e no WO //034317. Esses motivos se ligam a qualquer um dos 18principais alotipos de DR de classe Il de MDR1 e então constituem epítoposde célula T potenciais. Epítopos de célula T potenciais detectados podem sereliminados substituindo números pequenos de resíduos de aminoácido nosdomínios variáveis ou, de preferência, por substituição de aminoácido úni-cas. Tipicamente, substituições conservativas são feitas. Freqüentemente,mas não exclusivamente, um aminoácido comum a uma posição em se-qüências de anticorpo de linha germinativa humanas pode ser usado. Se-qüências de linha germinativa humanas, por exemplo, são reveladas emTomlinson e outros (1992) J. Mol. Biol., 227:776-798; Cook1 G.P. e outros(1995) lmmunol. TodayVol. 16(5):237-242; Chothia, D. e outros (1992) J.Mol. Biol., 227:799-817; e Tomlinson e outros (1995) EMBO J., 14:4628-4638. O diretório V BASE provê um diretório compreensivo de seqüênciasde região variável de imunoglobulina humanas (compiladas por Tomlinson,I.A. e outros, MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Essasseqüências podem ser usadas como uma fonte de seqüência humana, porexemplo, para regiões de estrutura principal e CDRs. Regiões de estruturaprincipal humanas de consenso podem ser também usadas, por exemplo,conforme descrito na US 6.300.064.

Em certas modalidades, um anticorpo pode conter uma regiãoconstante ou Fc de imunoglobulina alterada. Por exemplo, um anticorpo pro-duzido de acordo com os presentes ensinamentos pode se ligar mais forte-mente ou com mais especificidade a moléculas efetoras tal como comple-mentos e/ou receptores Fc, que podem controlar várias funções imunes doanticorpo tal como atividade de célula efetora, lise, atividade mediada porcomplemento, liberação de anticorpo e meia-vida de anticorpo. Receptoresde Fc típicos que se ligam a uma região de Fc de um anticorpo (por exem-plo, um anticorpo IgG) incluem, mas não estão limitados a, receptores dassubclasses FcyRI, FcyRII e FcyRII e FcRn, incluindo variantes alélicas e al-ternativamente formas unidas desses receptores. Receptores Fc são revis-tos em Ravetch e Kinet, Annu. fíev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capei e ou-tros, Immunomethods 4:25-34, 1994; e de Haas e outros, J. Lab. Clin. Med.,126:330-41, 1995).

Exemplos não-limitantes de anticorpos que podem ser separadosatravés dos métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, anti-corpos contra Αβ, IL-13, IL-22I GDF8 e 5T4. Cada um desses anticorpos édescrito em mais detalhes abaixo e nos Exemplos apensos.Anticorpos Αηίΐ-Αβ

Conforme descrito nos Exemplo apensos, anticorpos anti-AB po-dem ser separados através dos métodos da invenção. Os termos "anticorpoAB", "anticorpo Αβ", "anticorpo anti-Αβ" e "anti-Αβ" são usados aqui interco-mutavelmente para se referir a um anticorpo que se liga a um ou mais epíto-pos ou determinantes antigênicos de APP, proteína Αβ ou ambos. Epítoposou determinantes antigênicos exemplares podem ser encontrados na proteí-na precursora amilóide humana (APP), mas são de preferência encontradosdentro do peptídeo Αβ de APP. Isoformas múltiplas de APP existem, por e-xemplo, APP695, APP751 e APP770. Aminoácidos dentro de APP são de núme-ro designado de acordo com a seqüência da isoforma APP770 (vide, por e-xemplo, N9 de Acesso no GenBank P05067). Peptídeo Αβ (também referidoaqui como peptídeo beta amilóide e A beta) é um fragmento interno de ~4kDa de 39-43 aminoácidos de APP (Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43). Αβ40,por exemplo, consiste nos resíduos 672-711 de APP e Αβ42 consiste nosresíduos 672-713 de APP. Como um resultado de processamento proteolíticode APP por enzimas secretases diferentes in vivo ou in situ, Αβ é encontradoem ambas uma "forma curta", 40 aminoácidos de comprimento, e uma "for-ma longa", variando de 42-43 aminoácidos de comprimento. Epítopos oudeterminantes antigênicos podem estar localizados dentro do terminal N dopeptídeo Αβ e incluem resíduos dentro dos aminoácidos 1-10 de Αβ, de pre-ferência dos resíduos 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-7, 3-6 ou 3-7 de Αβ42 ou den-tro dos resíduos 2-4, 5, 6, 7 ou 8 de Αβ, resíduos 3-5, 6, 7, 8 ou 9 de Αβ ouresíduos 4-7, 8, 9 ou 10 de Αβ42. Epítopos "centrais" ou determinantes anti-gênicos estão localizados dentro da porção central ou média do peptídeo Αβe incluem resíduos dentro dos aminoácidos 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 19-21, 19-22, 19-23 ou 19-24 de Αβ. Epítopos "C-terminais" ou determinantesantigênicos estão localizados dentro do terminal C do peptídeo Αβ e incluemresíduos dentro dos aminoácido 33-40, 33-41 ou 33-42 de Αβ.

Em várias modalidades, um anticorpo Αβ é específico de extre-midade. Conforme aqui usado, o termo "específico de extremidade" refere-se a um anticorpo que se liga especificamente aos resíduos N-terminais ouC-terminais de um peptídeo Αβ, mas que não reconhece os mesmos resí-duos quando presente em uma espécie Αβ mais longa compreendendo osresíduos ou em APP.

Em várias modalidades, um anticorpo Αβ é "específico C-terminal". Conforme aqui usado, o termo "específico C-terminal" significa queo anticorpo reconhece especificamente um C-terminal livre de um peptídeoΑβ. Exemplos de anticorpos Αβ específicos C-teminais incluem aqueles que:reconhecem um peptídeo Αβ terminando no resíduo 40, mas não reconheceum peptídeo Αβ terminando no resíduo 41, 42 e/ou 43; reconhece um peptí-deo Αβ terminando no resíduo 42, mas não reconhece um peptídeo Αβ ter-minando no resíduo 40, 41 e/ou 43; etc.

Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo 3D6 ouvariante dele ou um anticorpo 10D5 ou variante dele, ambos são aqui descri-tos na Publicação de Patente U.S. Ne 2003/0165496A1, Publicação de Pa-tente U.S. N- 2004/0087777A1, Publicação de Patente Internacional N2W002/46237A3. Descrição de 3D6 e 10D5 pode ser também encontrada,por exemplo, na Publicação de Patente Internacional Nq W002/088306A2 ePublicação de Patente Internacional N0 W002/088307A2. 3D6 é um anticor-po monoclonal (mAb) que se liga especificamente a um epítopo N-terminallocalizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 1-5.Por comparação, 10D5 é um mAb que se liga especificamente a um epítopoN-terminal localizado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, re-síduos 3-6. Em outra modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo 12B4ou variante dele, conforme descrito na Publicação de Patente U.S. Ng2004008276A1 e Publicação de Patente Internacional N6 W003/077858A2.12B4 é um mAb que se liga especificamente a um epítopo N-terminal Iocali-zado no peptídeo β-amilóide humano, especificamente, resíduos 3-7. Emainda outra modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo 12A11 ou umavariante dele, conforme descrito no Pedido de Patente U.S. Nq 10/858.855 ePedido de Patente Internacional Nq PCT/US04/17514. 12A11 é um mAb quese liga especificamente a um epítopo N-terminal localizado no peptídeo β-amilóide, especificamente, resíduos 3-7. Em ainda outra modalidade, o anti-corpo pode ser um anticorpo 266 conforme descrito no Pedido de PatenteU.S. Ne 10/789.273 e Pedido de Patente Internacional Nq W001/62801A2.Anticorpos desenvolvidos para se ligar a epítopos C-terminais localizados nopeptídeo β-amilóide humano, para uso na presente invenção, incluem, masnão estão limitados a, 369.2B, conforme descrito na Patente U.S. N95.786.160.

Em modalidades exemplares, o anticorpo é um anticorpo 3D6 depeptídeo anti Αβ humanizado que se liga seletivamente a peptídeo Αβ. Maisespecificamente, o anticorpo 3D6 de peptídeo anti Αβ humanizado é desen-volvido para se ligar especificamente a um epítopo NH2 terminal localizadono peptídeo β-amilóide 1-40 ou 1-42 humano encontrado em depósitos deplaca no cérebro (por exemplo, em pacientes sofrendo de doença de Al-zheimer).

Anticorpos anti-AB podem ser usados para tratar doenças amiloi-dogênicas, em particular doença de Alzheimer. O termo "doença amiloidogê-nica" inclui qualquer doença associada com (ou causada pela) formação oudeposição de fibrilas amilóides insolúveis. Doenças amiloidogênicas exem-plares incluem, mas não estão limitadas a, amiloidose sistêmica, doença deAlzheimer, diabetes de início na maturidade, doença de Parkinson, doençade Huntington, demência fronto-temporal e as encefalopatias espongiformestransmissíveis relacionadas a prion (doença kuru e Creutzfeldt-Jacob emhumanos e scrapie e BSE em ovelha e gado, respectivamente). Doençasamiloidogênicas diferentes são definidas ou caracterizadas pela natureza docomponente polipeptídeo das fibrilas depositadas. Por exemplo, em indiví-duos ou pacientes tendo doença de Alzheimer, proteína β-amilóide (por e-xemplo, proteína do tipo selvagem, variante ou β-amilóide truncada) é ocomponente peptídeo caracterizante do depósito de amilóide. Deste modo, adoença de Alzheimer é um exemplo de uma "doença caracterizada por de-pósitos de Αβ" ou uma "doença associada com depósitos de Αβ", por exem-plo, no cérebro de um indivíduo ou paciente. Os termos "proteína β-amilóide", "peptídeo β-amilóide", "β-amilóide", "Αβ" e "peptídeo Αβ" são usa-dos intercomutavelmente aqui.Anticorpos anti-5T4

O antígeno 5T4 foi previamente caracterizado (vide, por exemplo,WO 89/07947). A seqüência de ácido nucléico integral de 5T4 humano é co-nhecida (Myers e outros (1994) J. Bioi Chem., 169:9319-24 e GenBank emN9 de Acesso Z29083). A seqüência para antígeno 5T4 de outra espécie étambém conhecida, por exemplo 5T4 de murino (WOOO/29428), 5T4 canino(Wo01/36486) ou 5T4 felino (US05/0100958).

5T4 humano é uma glicoproteína de cerca de 72 kDa expressaamplamente em carcinoma, mas tendo um padrão de expressão altamenterestrito em tecidos adultos normais. Ele parece estar fortemente correlacio-nado com metástase em cânceres colorretal e gástrico. Expressão do antí-geno 5T4 é também encontrada em alta freqüência em cânceres de mama eovário (Starzynska e outros (1998) Eur. J. Gastroenteroi Hepatoi 10:479-84;Starzynska e outros (1994) Br. J. Câncer 69:899-902; Starzynska e outros(1992) Br. J. Câncer 66:867-9). 5T4 foi proposto como um marcador, comenvolvimento mecanístico possível, para progressão de tumor e potencial demetástase (Carsberg e outros (1996) Int. J. Câncer 68:84-92). 5T4 foi tam-bém proposto para uso como um agente imunoterapêutico (videWOOO/29428). Peptídeos antigênicos de 5T4 são revelados na, por exemplo,US 05/0100958, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.

Vários pedidos pendentes se referem geralmente a ácidos nu-cléicos codificando o anticorpo monoclonal anti-5T4, vetores e células hos-pedeirass deles, por exemplo, Publicações de Pedido U.S. Nos.2003/0018004 e 2005/0032216. Um pedido de patente provisório relaciona-dos geralmente aos anticorpos monoclonais H8 anti-5T4 humanizados econjugados calicheamicina deles, bem como métodos de tratamento usandoesses conjugados de calicheamicina, foi depositado (Publicação de PedidoU.S. N2 2006/0088522). Os conteúdos de todos esses pedidos são aqui in-corporados a título de referência em sua totalidade.

Anticorpos anti-IL 13

Outros anticorpos exemplares que podem ser separados atravésdos métodos da invenção são anticorpos anti-IL13. lnterleucina-13 (IL-13) éuma citocina previamente caracterizada secretada por linfócitos T e mastóci-tos (McKenzie e outros (1993) Proc. NatL Acad. Sci., USA 90:3735-39; Boste outros (1996) Immunology 87:663-41). O termo "ÍL-13" refere-se à interleu-cina-13, incluindo a forma precursora não-processada de comprimento com-pleto de IL-13, bem como as formas maduras resultantes de clivagem pós-traducional. O termo também refere-se a qualquer fragmento e variantes deIL-13 que mantenham pelo menos algumas atividades biológicas associadascom IL-13 madura, incluindo seqüências que foram modificadas (por exem-plo, recombinantemente modificadas). O termo "IL-13" inclui IL-13 humana,bem como outras espécies de vertebrado. Vários pedidos pendentes reve-lam anticorpos contra IL-13 humana e de macaco, peptídeos de IL-13, veto-res e células hospedeiras produzindo os mesmos, por exemplo, Publicaçõesde Pedido U.S. Nqs 2006/0063228A e 2006/0073148.

A IL-13 compartilha várias atividades biológicas com IL-4. Porexemplo, ou IL-4 ou IL-13 pode causar troca de isótipo IgE em células B(Tomkinson e outros (2001) J. Immunol., 166:5792-5800). Adicionalmente,níveis aumentados de CD23 na superfície celular e CD23 no soro (sCD23)foram relatados em pacientes asmáticos (Sanchez-Guerrero e outros (1994)Allergy 49:587-92; DiLorenzo e outros (1999) Allergy Asthma Proc., 20:119-25). Ainda, ou IL-4 ou IL-13 pode supra-regular a expressão de classe Il deMHC e o receptor de IgE de baixa afinidade (CD23) em células B e monóci-tos, que resulta em apresentação de antígeno aumentada e função de ma-crófago regulada (Tomkinson e outros, supra). Essas observações sugeremque IL-13 pode ser uma peça importante no desenvolvimento de eosinofiliadas vias aéreas e hiper-responsividade das vias aéreas (AHR) (Tomkinsoneoutros, supra; Wills-Karp e outros (1998) Science 282:2258-61). Deste mo-do, inibição de IL-13 pode ser útil na melhora da patologia de várias condi-ções inflamatórias e/ou alérgicas, incluindo, mas não limitado a, distúrbiosrespiratórios, por exemplo, asma; doença pulmonar obstrutiva crônica(COPD); outras condições envolvendo inflamação das vias aéreas, eosinofi-lia, fibrose e produção de muco em excesso, por exemplo, fibrose cística efibrose pulmonar; distúrbios atópicos, por exemplo, dermatite atópica, urticá-ria, eczema, rinite alérgica; condições inflamatórias e/ou auto-imunes da pele(por exemplo, dermatite atópica), órgãos gastrintestinais (por exemplo, do-enças do intestino inflamatório (IBD), tal como colite ulcerativa e/ou doençade Crohn), fígado (por exemplo, cirrose, carcinoma hepatocelular); esclero-derma; tumores ou cânceres (por exemplo, tumores de tecido mole ou sóli-dos), tal como leucemia, glioblastoma e linfoma, por exemplo, Iinfoma deHodgkin; infecções virais (por exemplo, de HTLV-1), fibrose de outros ór-gãos, por exemplo, fibrose do fígado (por exemplo, fibrose causada por he-patite do vírus B e/ou C).Anticorpos anti-IL22

Outros anticorpos exemplares que podem ser separados atravésdos métodos da invenção são anticorpos de IL-22. A interleucina-22 (IL-22) éuma citocina de classe Il previamente caracterizada que mostra homologiade seqüência com IL-10. Sua expressão é supra-regulada em células T porIL-9 ou ConA (Dumoutier, L. e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA,97(18):10144-9). Estudos mostraram que expressão de mRNA de IL-22 éinduzida in vivo em resposta à administração de LPS, e que IL-22 modulaparâmetros indicativos de uma resposta de fase aguda (Dumoutier L. e ou-tros, (2000) supra-, Pittman, D.l e outros (2001) Genes and Immunity 2:172),e que uma redução da atividade de IL-22 usando um anticorpo anti-IL-222de neutralização melhora sintomas inflamatórios em um modelo de artriteinduzida por colágeno em camundongo (CIA). Deste modo, agonistas de IL-22, por exemplo, anticorpo anti-IL-22 de neutralização e fragmentos deles,podem ser usados para induzir supressão imune in vivo, por exemplo, paratratamento de distúrbios auto-imunes (por exemplo, distúrbios artríticos talcomo artrite reumatóide); distúrbios respiratórios (por exemplo, asma, doen-ça pulmonar obstrutiva crônica (COPD)); condições inflamatórias da, por e-xemplo, pele (por exemplo, psoríase), sistema cardiovascular (por exemplo,aterosclerose), sistema nervoso (por exemplo, doença de Alzheimer), rins(por exemplo, nefrite), fígado (por exemplo, hepatite) e pâncreas (por exem-plo, pancreatite).

O termo "IL-22" refere-se à interleucina-22, incluindo forma pre-cursora não-processada de comprimento complexo de IL-22, bem como asformas maduras resultantes de clivagem pós-traducional. O termo refere-setambém a quaisquer fragmentos e variantes de IL-22 que mantenham pelomenos algumas atividades biológicas associadas com a IL-22 madura, inclu-indo seqüências que foram modificadas. O termo "IL-22" inclui IL-22 huma-na, bem como outras espécies de vertebrado. As seqüências de aminoácidoe nucleotídeo de IL-22 humana e de roedor, bem como anticorpos contra IL-22, são reveladas nas, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente U.S.N9s 2005-0042220 e 2005-0158760 e Patente U.S. Ne 6.939.545. Os conteú-dos de todas essas publicações são aqui incorporados a título de referênciaem sua totalidade.

Anticorpos Anti-GDF8

Ainda outros anticorpos exemplares que podem ser separadosatravés dos métodos da invenção são anticorpos anti-GDF8. Fator-8 decrescimento e diferenciação (GDF-8), também conhecido como miostatina, éuma proteína secretada e é um membro da superfamília de fator-beta decrescimento transformante (TGF-β) de fatores de crescimento estruturalmen-te relacionados, todos os quais possuem propriedades reguladoras do cres-cimento e morfogenéticas fisiologicamente importantes (Kingsley e outros,(1994) Genes Dev., 8:133-146; Hoodless e outros (1998) Curr. Topics Micro-biol. Immunol., 228:235-272). Similarmente a TGF-β, GDF-8 humano é sinte-tizado como uma proteína precursora longa de 375 aminoácidos. A proteínaGDF-8 precursora forma um homodímero. Durante o processamento o pep-tídeo amino-terminal é clivado em Arg-266. O peptídeo clivado, conhecidocomo o "peptídeo associado à latência" (LAP), pode permanecer não-covalentemente ligado ao homodímero, deste modo inativando o complexo(Miyazono e outros (1988) J. Biol Chem. 263:6407-6415; Wakefield e outros(1988) J. Biol Chem. 263:7646-7654; Brown e outros (1990) Growth Factors,3:35-43; e Thies e outros (2001) Growth Factors, 18:251-259). O complexode GDF-8 maduro com pré-peptídeo é geralmente referido como o "comple-xo latente pequeno" (Gentry e outros, (1990) Biochemistry, 29:6851-6857;Derynck e outros (1995) Nature, 316:701-705; e Massague (1990) Ann. Ver.Cell. Biol., 12:597-641). Outras proteínas são também conhecidas se ligar aGDF8- maduro e inibir sua atividade biológica. Tais proteínas inibidoras in-cluem folistatina e proteínas relacionadas com folistatina (Gamer e outros(1999) Dev. Biol., 208:222-232).

O termo "GDF-8" refere-se a fator-8 de crescimento e diferencia-ção e, onde apropriado, fatores que são estruturalmente ou funcionalmenterelacionados com GDF-8, por exemplo, BMP-11 e outros fatores pertencen-tes à superfamília TGF-β. O termo refere-se à forma precursora não-processada de comprimento completo de GDF-8, bem como as formas ma-dura e pró-peptídeo resultante de clivagem pós-traducional. O termo refere-se também a quaisquer fragmentos e variantes de GDF-8 que mantêm pelomenos algumas atividades biológicas associadas com GDF-8 maduro, inclu-indo seqüências que foram modificadas. GDF-8 humano de seqüência deaminoácido, bem como muitas outras espécies de vertebrado (incluindo mu-rino, babuíno, bovino, galinha) é revelado, por exemplo, nas US 2004-0142382, US 2002-1057125 e McPherron e outros (1997) Proc. Nat. Acad.Sei. U.S.A., 94:12457-12461; conteúdos de todas são aqui incorporados atítulo de referência em sua totalidade). Exemplos de anticorpos de neutrali-zação contra GDF-8 são revelados na, por exemplo, US 2004-0142382 epodem ser usados para tratar ou prevenir condições onde um aumento emtecido muscular ou densidade óssea é desejável. Doenças e distúrbios e-xemplares incluem distúrbios musculares e neuromusculares tal como distro-fia muscular (incluindo distrofia muscular de Duchenne); esclerose amiotrófi-ca lateral; atrofia muscular; atrofia de órgão; debilidade; síndrome do túnel;doença pulmonar obstrutiva congestiva; sarcopenia, caquexia e outras sín-dromes de perda muscular; distúrbios do tecido adiposo (por exemplo, obe-sidade); diabetes tipo 2; tolerância à glicose prejudicada; síndromes metabó-licas (por exemplo, síndrome X); resistência à insulina induzida por traumatal como queimaduras ou desequilíbrio de nitrogênio; e doenças neurodege-nerativas do osso (por exemplo, osteoartrite e osteoporose).

Receptores e Fusões de Receptor SolúveisEm algumas modalidades, proteínas separadas através dos mé-todos da invenção podem ser receptores solúveis ou fragmentos deles. E-xemplos de receptores solúveis incluem o domínio extracelular de um recep-tor, tal como receptores alfa e beta de fator de necrose de tumor solúvel(TNFR-1; EP 417.563 publicado em 20 de março de 1991; TNFR-2, EP417.014 publicada em 20 de março de 1991; e revista em Naismith e S-prang, J. Inflamm. 47(1-2):1-7, 1995-96, cada um deles aqui incorporado atítulo de referência em sua totalidade. Em outras modalidades, o receptorsolúvel inclui o domínio extracelular de receptor de interleucina-21 (IL-21R)conforme descrito na, por exemplo, US2003-0108549 (cujos conteúdos sãoaqui incorporados a título de referência).

Em outras modalidades, os métodos da invenção são usadospara separar fusões de receptor solúveis. A proteína de fusão pode incluiruma porção de direcionamento, por exemplo, um fragmento de receptor ouum ligante solúvel, e uma cadeia de imunoglobulina, um fragmento Fc, regi-ões constantes de cadeia pesada de vários isótipos, incluindo: IgGI, lgG2,lgG3, lgG4, IgM, IgAI, lgA2, IgD e IgE). Por exemplo, a proteína de fusãopode incluir o domínio extracelular de um receptor e, por exemplo, fundido a,uma cadeia Fc de imunoglobulina humana (por exemplo, IgG humana, porexemplo, IgGI humana ou lgG4 humana, ou uma forma mutada dela). Emuma modalidade, a seqüência Fc humana foi mutada em um ou mais amino-ácidos, por exemplo, nos resíduos 254 e 257 da seqüência do tipo selvagempara reduzir ligação de receptor Fe. As proteínas de fusão podem incluir adi-cionalmente uma seqüência Iigante unindo a primeira porção à segunda por-ção, por exemplo, o fragmento de imunoglobulina. Por exemplo, a proteínade fusão pode incluir um Iigante peptídeo, por exemplo, um Iigante peptídeode cerca de 4 a 20, com mais preferência, 5 a 10, aminoácidos de compri-mento; o Iigante peptídeo é de 8 aminoácidos de comprimento. Por exemplo,a proteína de fusão pode incluir um Iigante peptídeo tendo a fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y onde y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. Em outras modalidades,seqüências de aminoácido adicionais podem ser adicionadas ao terminal Nou C da proteína de fusão para facilitar expressão, flexibilidade estérica, de-tecção e/ou isolamento ou purificação.

Em certas modalidades, a fusão de receptor solúvel compreendeum TNFFR-Ig solúvel (por exemplo, um fragmento solúvel de um receptorTNF, por exemplo, receptor TNF humano p55 ou p75 ou derivado dele, porexemplo, TNFR-IgG de 75 kd (por exemplo, receptor TNF de 75 kD fundidoa uma porção Fc de IgGI humano).

Uma proteína quimérica ou de fusão da invenção pode ser pro-duzida através de técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo,fragmentos de DNA codificando seqüências de polipeptídeo diferentes sãoligados juntos em estrutura de acordo com técnicas convencionais, por e-xemplo, empregando terminais de extremidade cega ou extremidade irregu-lar, digestão de enzima de restrição para prover terminais apropriados, en-chimento de extremidades coesas conforme apropriado, tratamento com fos-fatase alcalina para evitar união indesejável e ligação enzimática. Em outramodalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado através de técnicas con-vencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente,amplificação por PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usandoiniciadores âncora que dão origem a protuberâncias complementares entredois fragmentos de gene consecutivos que podem ser subseqüentementeanelados e reamplificados para gerar uma seqüência de gene quimérico (vi-de, por exemplo, Ausubel e outros, (Eds.) Current Protocols in Molecular Bio-logy, John Wiley & Sons, 1992). Além disso, muitos vetores de expressãoestão comercialmente disponíveis que codificam uma porção de fusão (porexemplo, uma região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina). Polipep-tídeos de fusão de imunoglobulina são conhecidos na técnica e são descri-tos nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.516.964; 5.225.538; 5.428.130;5.514.582; 5.714.147; e 5.455.165.Fatores de Crescimento e Citocinas

Outra classe de polipeptídeo que foi mostrada ser eficaz comoagentes farmacêuticos e/ou comerciais e que pode ser desejavelmente pro-duzida de acordo com os ensinamentos da presente invenção inclui fatoresde crescimento e outras moléculas de sinalização, tal como citocinas.

Fatores de crescimento são tipicamente glicoproteínas que sãosecretadas por células e se ligam a e ativam receptores em outras células,iniciando uma mudança metabólica ou desenvolvimental na célula receptora.Exemplos não-limitantes de fatores de crescimento de mamífero e outrasmoléculas de sinalização incluem citocinas; fator de crescimento epidermal(EGF); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fatores de cres-cimento de fibroblasto (FGFs) tal como aFGF e bFGF; fatores de crescimen- to transformantes (TGFs) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-beta1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TGF-beta 4 ou TGF-beta 5; fatores de cresci-mento tipo insulina-l e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-OGF-1l (IGF-I de cére-bro), proteínas de ligação de fator de crescimento tipo insulina; proteínas CDtal como CD-3, CD-4, CD-8 e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutores;imunotoxinas; uma proteína morfogenética de osso (BMP); um interferon talcomo interferon-alfa, -beta e -gama; fatores de estimulação de colônia(CSFs); por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (TLs), porexemplo, IL-1 a IL-13 (por exemplo, IL-11); fator de necrose de tumor (TNF)alfa e beta; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró-insulina; hormôniode estimulação de folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fato-res de coagulação tal como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido e fator VonWillebrands; fatores anticoagulantes tal como Proteína C; fator natriuréticoatrial; tensoativo pulmonar; um ativador de plasminogênio, tal como urocina-se ou urina humana ou ativador de plasminogênio do tipo tecido (t-PA);bombesina; trombina, fator de crescimento hematopoiético; encefalinase;RANTES (célula T regulada sob ativação normalmente expressa e secreta-da); proteína inflamatória de macrófago humana (ΜΙΡ-1-alfa); substância deinibição mulleriana; cadeia A de relaxin; cadeia B de relaxin; pró-relaxin; pep-tídeo associado à gonadotropina de camundongo; fatores neurotróficos talcomo fator neurotrófico derivado de osso (BNDF)1 neurotrofina-3, -4, -5 ou -6(NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6) ou um fator de crescimento de nervo tal comoNGF-beta. Um versado comum na técnica terá consciência de outros fatoresou moléculas de sinalização que podem ser expressos de acordo com méto-dos e composições da presente invenção.

Alterações específicas no padrão de glicosilação de fatores decrescimento ou outras moléculas de sinalização foram mostradas ter efeitosdrásticos em suas propriedades terapêuticas. Como um exemplo, um méto-do comum de tratamento para pacientes que sofrem de anemia crônica éprovê-los com injeções freqüentes de eritropoietina humana recombinante(rHuEPO) a fim de reforçar sua produção de células vermelhas do sangue.Um análogo de rHuEPO, darbepoetina alfa (Anaresp®), foi desenvolvido parater uma duração mais longa do que rHuEPO normal. A diferença primáriaentre darbepoetina e rHuEPO é a presença de duas cadeias de oligossaca-rídeo N-Iigadas contendo ácido siálico extras. Produção de darbepoetina alfafoi realizada usando glicoengenharia in vitro (vide Elliott e outros, Nature Bio-technology 21(4):414-21, 2003, incorporado aqui a título de referência emsua totalidade). Elliott e outros usaram mutagênese in vitro para incorporarsítios de glicosilação extras na estrutura principal do polipeptídeo rHuEPO,resultando em expressão do análogo de darboepoetina alfa. As cadeias deoligossacarídeo extras estão localizadas distais do sítio de ligação de recep-tor EPO e aparentemente não interferem com ligação de receptor. No entan-to, a meia-vida da darbepoetina alfa é até três vezes maior do que rHuEPO,resultando em um agente terapêutico muito mais eficaz.

Fatores de Coagulação

Fatores de coagulação foram mostrados ser eficazes como agen-tes farmacêuticos e/ou comerciais. Hemofilia B é um distúrbio onde o sanguede quem sofre é incapaz de coagular. Deste modo, qualquer ferimento pe-queno que resulte em sangramento é potencialmente um evento ameaçadorà vida. Por exemplo, Fator de Coagulação IX (Fator IX ou "FIX") é uma gli-coproteína de cadeia única cuja deficiência resulta em Hemofilia Β. A FIX ésintetizada como um zimógeno de cadeia única que pode ser ativado parauma serina protease de duas cadeias (Fator IXa) através da liberação de umpeptídeo de ativação. O domínio catalítico de Fator IXa está localizado nacadeia pesada (vide Chang e outros, J. Clin. Invest., 100:4, 1997, incorpora-do aqui a título de referência em sua totalidade). FIX tem sítios de glicosila-ção múltiplos incluindo ambos carboidratos N-Iigados e O-ligados. Uma es-trutura O-Iigada particular em Serina 61 (Sia-a2,3-Gal-p1, 4-GlcNAc-pi,3-Fuc-a1-0-Ser) foi uma vez imaginada ser única para FIX mas desde entãofoi encontrada em algumas outras moléculas incluindo a proteína Notch emmamíferos e Drosophila (Maloney e outros, Journal of Biol. Chem., 275(13),2000). FIX produzida por células de Ovário de Hamster Chinês ("CHO") emcultura celular exibe alguma variabilidade na cadeia de oligossacarídeo Seri-na 61. Essas glicoformas diferentes e outras glicoformas potenciais podemter habilidades diferentes para induzir coagulação quando administradas ahumanos ou animais e/ou podem ter estabilidades diferentes no sangue,resultando em coagulação menos eficaz.

A hemofilia A, que é clinicamente indistinguível da Hemofilia B, écausada por um defeito em fator Vlll de coagulação humano, outra glicopro-teína que é sintetizada como uma cadeia única e então processada em umaforma ativa de duas cadeias. A presente invenção pode ser também empre-gada para controlar ou alterar o padrão de glicosilação de fator Vlll de coa-gulação a fim de modular sua atividade de coagulação. Outros fatores decoagulação que podem ser produzidos de acordo com a presente invençãoincluem fator de tecido e fator Von Willebrands.

Enzimas

Outra classe de polipeptídeos que foi mostrada ser eficaz comoagentes farmacêuticos e/ou comerciais e pode ser desejavelmente produzi-da de acordo com os ensinamentos da presente invenção incluem enzimas.Enzimas podem ser glicoproteínas cujo padrão de glicosilação afeta a ativi-dade enzimática. Deste modo, a presente invenção pode ser também usadapara produzir enzimas em uma cultura de célula onde as enzimas produzi-das têm um padrão de glicosilação mais extensivo ou de outro modo maisdesejável.

Apenas como um exemplo não-limitante, uma deficiência em glu-cocerebrosidase (GCR) resulta em uma condição conhecida como doençade Gaucher, que é causada por um acúmulo de glucocerebrosidase em Ii-sossomas de certas células. Indivíduos com doença de Gaucher exibemuma faixa de sintomas incluindo esplenomegalia, hepatomegalia, distúrbioesqueletal, trombocitopenia e anemia. Friedman e Hayes mostraram queGCR recombinante (rGCR) contendo uma única substituição na seqüênciade aminoácido primária exibiu um padrão de glicosilaçãoo alterado, especifi-camente um aumento em resíduos de fucose e N-acetil glicosamina compa-rado com GCR de ocorrência natural (vide Patente dos Estados Unidos Nú-mero 5.549.892).

Friedman e Hayes também demonstraram que esta rGCR exibiupropriedades farmacocinéticas aperfeiçoadas comparado com rGCR de o-corrência natural. Por exemplo, aproximadamente duas vezes mais rGCR sedirecionaram às células Kufper do fígado do que o fizeram GCR de ocorrên-cia natural. Embora as seqüências de aminoácido primárias das duas proteí-nas diferissem em um único resíduo, Friedman e Hayes tomaram como hipó-tese que o padrão e glicosilação alterado de rGCR pode também influenciaro direcionamento a células Kupfer. Uma pessoa de habilidade comum natécnica terá consciência de outros exemplos conhecidos de enzimas queexibem propriedades enzimática, farmacocinética e/ou farmacodinâmicasalteradas resultante de uma alteração em seus padrões de glicosilação.

Produção de Proteína

Proteínas separadas através dos métodos da invenção podemser produzidas recombinantemente usando técnicas bem conhecidas nocampo. Seqüências de nucleotídeo codificando as proteínas são tipicamenteinseridas em um vetor de expressão para introdução nas células hospedei-ras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de anticorpomodificado que, por sua vez, provê os polipeptídeos. O termo "vetor" incluium construto de ácido nucléico freqüentemente incluindo um ácido nucléico,por exemplo, um gene, e incluindo ainda elementos mínimos necessáriospara replicação, transcrição, estabilidade de ácido nucléico e/ou expressãoou secreção de proteína a partir de uma célula hospedeira. Tais construtospodem existir com elementos extracromossomais ou podem ser integradosao genoma de uma célula hospedeira.

O termo "vetor de expressão" inclui um tipo específico de vetoronde o construto de ácido nucléico é otimizado para a expressão de alto ní-vel de um produto de proteína desejado. Vetores de expressão freqüente-mente têm agentes reguladores transcripcionais, tal como elementos promo-tores e aumentadores, otimizados para níveis altos de transcrição em tiposde célula específicos e/ou otimizados de modo que expressão é constitutivacom base no uso de um agente de indução específico. Vetores de expressãotêm ainda seqüências que provêem tradução apropriada e/ou aumentada daproteína. Como conhecido daqueles versados na técnica, tais vetores podemser facilmente selecionados do grupo consistindo em plasmídeos, fagos, ví-rus e retrovírus. O termo "cassete de expressão" inclui um construto de áci-do nucléico contendo um gene e tendo elementos em adição ao gene quepermitem expressão apropriada e/ou aumentada deste gene em uma célulahospedeira. Para produção de anticorpos, ácidos nucléicos codificando ca-deias pesadas e leves podem ser inseridos em vetores de expressão. Taisseqüências podem estar presentes na mesma molécula de ácido nucléico(por exemplo, o mesmo vetor de expressão) ou, alternativamente, podem serexpressas a partir de moléculas de ácido nucléico separadas (por exemplo,vetores de expressão separados).

O termo "operavelmente ligado" inclui uma justaposição onde oscomponentes estão em uma relação permitindo que eles funcionem de suamaneira pretendida (por exemplo, funcionalmente ligados). Como um exem-plo, um promotor/aumentador operavelmente ligado a um polinucleotídeo deinteresse é ligado ao dito polinucleotídeo de modo que a expressão do poli-nucleotídeo de interesse é conseguida sob condições que ativam a expres-são diretamente pelo promotor/aumentador.Vetores de expressão são tipicamente replicáveis nos organis-mos hospedeiros ou como episômeros ou como uma parte integral do DNAcromossomal do hospedeiro. Geralmente, vetores de expressão contêmmarcadores de seleção (por exemplo, resistência à ampicilina, resistência àhigromicina, resistência à tetraciclina, resistência à canamicina ou resistên-cia à neomicina) para permitir detecção daquelas células transformadas comas seqüências de DNA desejadas (por exemplo, vide Itakura e outros, Paten-te U.S. N5 4.704.362). Em adição às seqüências de cassete de DNA de imu-noglobulina, seqüências inertes e seqüências reguladoras, os vetores deexpressão recombinantes da invenção podem carregar seqüências adicio-nais, tal como seqüências que regulam replicação do vetor em células hos-pedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecio-náveis. O gene marcador selecionável facilita seleção de células hospedei-ras onde o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos.4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas de Axel e outros). Por exemplo,tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármaco, talcomo G418, higromicina, ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qualo vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem ogene de diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr"com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção deG418).

Uma vez o vetor tendo sido incorporado à célula hospedeira a-propriada, a célula hospedeira é mantida sob condições adequadas paraexpressão de alto nível das seqüências de nucleotídeo e a coleta e purifica-ção dos anticorpos desejados. Qualquer célula hospedeira suscetível à cul-tura de célula, e à expressão de proteínas ou polipeptídeos, pode ser utiliza-da de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, a célulahospedeira é mamífera. Exemplos não-limitantes de células de mamíferoque podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem Iinha-gem de mieloma de camundongo BALB/c (NOS/I, ECACC No: 85110503);retinoblastos humanos (PER.C6, CruCeII, Leiden, Países Baixos); linhagemCV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651);linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas paracrescimento em cultura de suspensão, Graham e outros, J. Gen. Virol.,36:59, 1977); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); célulasde ovário de hamster Chinês +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 77:4216, 1980); células sertoli de camundongo (TM4, Ma-ther, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCCCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células derim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75);células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camun-dongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather e outros, ArmaisN.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linha-gem de hepatoma humano (Hep G2).

Adicionalmente, qualquer número de linhagens de célula hibri-doma comercialmente e não-comercialmente disponíveis que expressempolipeptídeos ou proteínas pode ser utilizado de acordo com a presente in-venção. Um versado na técnica vai compreender que linhagens de célula dehibridoma podem ter necessidades de nutrição diferentes e/ou podem reque-rer condições de cultura diferentes para crescimento e expressão de polipep-tídeo ou proteína ótimo, e serão capazes de modificar condições conformenecessário.

Vetores de expressão para essas células podem incluir seqüên-cias de controle de expressão, tal como uma origem de replicação, um pro-motor e um aumentador (Queen e outros, Immunol. Rev., 89:49 (1986)), esítios de informação de processamento necessários, tal como sítios de liga-ção de ribossomo, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação e se-qüências terminadoras transcripcionais. Seqüências de controle de expres-são preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulina, SV40,adenovírus, vírus papiloma bovino, citomegalovírus e similar. Vide, por e-xemplo, Co e outros (1992) J. Immunol. 148:1149. Seqüências reguladoraspreferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem ele-mentos virais que direcionam níveis altos de expressão de proteína em célu-las de mamífero, tal como promotores e/ou aumentadores derivados depromotor FF-1A e BGH poli A, citomegalovírus (CMV) (tal como o promo-tor/aumentador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promo-tor/aumentador de SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio princi-pal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para descrição adicional de elemen-tos reguladores virais, e seqüências deles, vide, por exemplo, Patente U.S.N9 5.168.062 de Stinski, Patente U.S. Ne 4.510.245 de Bell e outros e Paten-te U.S. N2 4.968.615 de Schaffner e outros. Em modalidades exemplares, osgenes de cadeias pesada e leve de anticorpo são operativamente ligadospara aumentar/promover elementos reguladores (por exemplo, derivados deSV40, CMV, adenovírus e similar, tal como aumentador de CMV/elementoregulador de promotor AdMLP ou um aumentador de SV40/elemento regula-dor de promotor AdMLP) para dirigir níveis altos de transcrição dos genes.Em modalidades exemplares da invenção, o construto inclui um sítio de en-trada de ribossomo interno (IRES) para prover níveis relativamente altos depolipeptídeos da invenção em células hospedeiras eucarióticas. Seqüênciasde IRES compatíveis são reveladas na Patente U.S. Ne 6.193.980, que étambém aqui incorporada.

Alternativamente, seqüências de codificação podem ser incorpo-radas em um transgene para introdução no genoma de um animal transgêni-co e subseqüente expressão no leite do animal transgênico (vide, por exem-plo, Deboer e outros, US 5.741.957, Rosen, US 5.304.489 e Meade e outros,US 5.849.992). Transgenes adequados incluem seqüências de codificaçãopara cadeias pesadas e/ou leves em ligação operável com um promotor eaumentador de um gene específico de glândula mamária, tal como caseínaou beta lactoglobulina.

Células hospedeiras procarióticas podem ser também adequadaspara produção dos anticorpos da invenção. E. coli é um hospedeiro procarió-tico particularmente útil para clonagem dos polinucleotídeos (por exemplo,seqüências de DNA) da presente invenção. Outros hospedeiros microbianosadequados para uso incluem bacilos, tal como Bacillus subtilis, enterobacte-riaceae, tal como Escherichia, Salmonella e Serratia, e várias espéciesPseudomonas. Nesses hospedeiro procarióticos, uma pessoa pode tambémfazer vetores de expressão, que vão tipicamente conter seqüências de con-trole de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, umaorigem de replicação). Ainda, qualquer número de uma variedade de promo-tores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema promotor de Iac-tose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-Iactamase ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores vão tipi-camente controlar expressão, opcionalmente com uma seqüência operado-ra, e têm seqüências de sítio de ligação de ribossomo e similar, para inicia-ção e término da transcrição e da tradução.

Expressão de proteínas em procariontes é mais freqüentementerealizada em E. coli com vetores contendo promotores constitutivos ou indu-zíveis direcionando a expressão de proteínas de fusão ou não-fusão. Veto-res de fusão adicionam vários aminoácidos a um anticorpo codificado neles,freqüentemente à região constante do anticorpo recombinante, sem afetarespecificidade ou reconhecimento de antígeno do anticorpo. Adição dos a-minoácidos do peptídeo de fusão pode adicionar função adicional ao anti-corpo, por exemplo, como um marcador (por exemplo, marcação de epítopotal como myc ou flag).

Outros micróbios, tal como levedura, são também úteis para ex-pressão. Saccharomyces é um hospedeiro de levedura preferido, com veto-res adequados tendo seqüências de controle de expressão (por exemplo,promotores), uma origem de replicação, seqüências de terminação e similarconforme desejado. Promotores típicos incluem 3-fosfoglicerato cinase eoutras enzimas glicolíticas. Promotores de levedura induzíveis incluem, den-tre outros, promotores de álcool desidrogenase, isocitocroma C e enzimasresponsáveis pela utilização de maltose e galactose.

Os vetores contendo as seqüências de polinucleotídeo de inte-resse (por exemplo, as seqüências de codificação de cadeias pesada e levee seqüências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célulahospedeira através de métodos bem conhecidos, que variam dependendodo tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção com cloreto de cál-cio é geralmente utilizada para células procarióticas, enquanto tratamentocom fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, biolística ou transfecçãocom base viral pode ser usada para outros hospedeiros celulares. (Vide ge-ralmente Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ColdSpring Harbor Press, 2- Ed., 1989), incorporado aqui a título de referênciaem sua totalidade para todos os propósitos. Outros métodos usados paratransformar células de mamífero incluem o uso de polibreno, fusão de proto-plasto, lipossomas, eletroporação e microinjeção (vide geralmente, Sambro-ok e outros, supra). Para produção de animais transgênicos, transgenes po-dem ser microinjetados em oócitos fertilizados ou podem ser incorporadosao genoma de células tronco embriônicas, e os núcleo de tais células trans-feridos para oócitos enucleados.

Quando cadeias pesadas e leves são clonadas em vetores deexpressão separados, os vetores são co-transfectados para se obter expres-são e montagem de imunoglobulinas intactas. Uma vez expressos, os anti-corpos integrais, seus dímeros, cadeias leves e pesadas individuais ou ou-tras formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser separadosconforme aqui descrito e/ou purificados mais de acordo com procedimentosconhecidos na técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, colu-nas de afinidade, cromatografia de coluna, purificação por HPLC, eletrofore-se de gel e similar (vide geralmente Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menoscerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99% ou maishomogeneidade mais preferida, para usos farmacêuticos.

Os exemplos que seguem são ilustrativos e não pretendem serlimitantes.

Exemplo 1

Floculação com vários cátions e ânions: Vários anticorpos mono-clonais (mAb) (mostrados na Tabela 1) foram produzidos por células de Ová-rio de Hamster Chinês (CHO) culturadas em meio livre de soro. Aproxima-damente 50 ml_ do meio condicionado contendo célula foram separados emalíquota em frascos Erlenmeyer de 125 ml_ (exceto o exemplo de fosfato decálcio 30/20 com anti-GDF8 Nq 2 que tinha 400 mL em um frasco de 1000mLeo exemplo de fosfato de cálcio 30/20 com anti-IL13 N2 1 que tinha 1000mL em um frasco de 2000 mL). HEPES foi adicionado a 40 mM para controledo pH. Uma solução concentrada de cátions de metal foi adicionada à solu-ção para atingir uma concentração fixada final (vide Tabela 1) e misturadagentilmente. Uma solução concentrada de ânions foi adicionada à mistura(vide Tabela 1) para atingir a concentração de ânion final e misturada gentil-mente (em alguns dos exemplos, indicado por um asterisco (*) na Tabela 1abaixo, o ânion foi adicionado primeiro e o cátion segundo). O pH foi aumen-tado através da adição de NaOH ou diminuído pela adição de HCI para afaixa de pH fixado. Em muitos dos exemplos, o pH não precisou ser ajusta-do. A mistura foi deixada incubar em um agitador a 18-259C por uma a qua-tro horas junto com controles negativos. Após a incubação, a mistura foi ver-tida em um tubo centrífuga de 50 mL. Cada mistura foi girada a 340 g pordez minutos. O sobrenadante clarificado foi separado em alíquota e a turva-ção medida usando um nefalômetro (HACH, Loveland, CO). A turvação re-sultante é relatada na Tabela 1 como uma redução percentual daquela docontrole não-tratado. A concentração de anticorpo foi medida através de ummétodo de HPLC de Proteína A geral para anticorpos. A recuperação con-forme comparado com o controle não-tratado é relatada na Tabela 1.Tabela 1: Resultados de floculação para os cátions de cálcio, magnésio,manganês, cobalto (II) e níquel. Todos os tratamentos foram realizados coma adição de cátion antes do ânion, exceto onde indicado por um asterisco (*),onde o ânion foi adicionado antes do cátion.

Cálcio

Produto de

Cátion/ Concentra-Ânion ções

Ânion (mM) (Mz)

pH mAb

dução deTurbidez ,

% de Re-,

% deRecupe-ração deProduto<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>Os níveis residuais de cálcio e fosfato nos sobrenadantes de al-gumas amostras foram medidos. Resíduos de cálcio foram medidos usandoum BioAssay Systems QuantiChrom® Calcium Assay Kit (DICA-500). Resí-duos de fosfato foram medidos usando um BioAssay Systems MalachiteGreen Phosphate Assay Kit (POMG-25H). Na amostra anti-IL13 Ne 2 com 40mM de cálcio e 20 mM de fosfato na Tabela 1, o sobrenadante após centrifu-gação continha 8,19 mM de cálcio e 1,04 mM de fosfato. Este nível de cálcioe fosfato solúveis se traduz em uma Ksp de 8,5x10"6 M2. Na amostra anti-ABNg 1 com 80 mM de cálcio e 20 mM de fosfato na Tabela 1, o sobrenadanteapós centrifugação continha 22,2 mM de cálcio e 0,4 mM de fosfato. Estenível de cálcio solúvel e fosfato solúvel se traduz em uma Ksp de 8,4x10"6 M2.Exemplo 2

Efeito da ordem da adição de ânion/cátion: um mAb, anti-GDF8N2 1 foi produzido por células CHO recombinantes culturadas em meio livrede soro. Aproximadamente 50 mL do meio condicionado contendo célulaforam separados em alíquota em frascos Erlenmeyer de 3x125 mL, A, B e C.A amostra A foi deixada não-tratada e serviu como um controle negativo.HEPES foi adicionado a 40 mM para controlar o pH nas Amostras B e C.Cloreto de cálcio a 5 M foi adicionado à Amostra B para uma concentraçãode 50 mM; após mistura suave, sulfeto de sódio a 0,5M foi adicionado parauma concentração de 33,3 mM. Para Amostra C, a ordem de adição foi re-vertida. Sulfeto de sódio a 0,5M foi adicionado para uma concentração de33,3 mM; após mistura suave, cloreto de cálcio a 5 M foi adicionado parauma concentração de 50 mM. Todas as três misturas tinham pHs entre 7,4 e7,6. As misturas foram deixadas incubar em um agitador por uma hora a 18-25°C. Após a incubação, as misturas foram vertidas em tubos de centrifugade 50 mL. Cada mistura foi girada a 340 g por dez minutos. O sobrenadanteclarificado foi removido e ensaiado quanto à concentração de anticorpo atra-vés de HPLC de Proteína A e quanto à turvação usando um nefalômetro.

Ambas amostras BeC tinham recuperações de anticorpo de

94% conforme comparado com amostra não-tratada. A Amostra B, com ocátion adicionado primeiro, mostra um aumento em turvação conforme com-parado com a amostra não-tratada, indicando que um precipitado tinha seformado, mas que ele era muito pequeno para ser facilmente removido atra-vés de centrifugação. A Amostra C1 com o ânion adicionado primeiro, mos-trou uma redução de 46% na turvação conforme comparado com a amostranão-tratada, indicando que o precipitado que se formou era grande o sufici-ente para ser facilmente girado através de centrifugação. A redução na tur-vação também indica que alguma quantidade de restos celulares e/ou mate-rial coloidal foi ligada pelo precipitado e removida no pélete.

Exemplo 3

Um experimento de escala piloto usando cálcio e fosfato comoprecipitantes e os efeitos sobre etapas de clarificação e cromatografia a ju-sante: Um mAb, anti-AB N2 1, foi produzido por células CHO recombinantesculturadas em meio livre de soro em um biorreator de 500 L. No momento dacoleta, a cultura foi trazida para temperatura ambiente (18-25eC). 350 L dacultura foram deixados não-tratados e serviram como um controle negativo.150 L da cultura foram transferidos para uma bombona de 200L e lentamen-te misturados com um agitador no alto. Um tampão foi adicionado a 40 mMpara controlar o pH. Fosfato de potássio a 2M foi então adicionado para umaconcentração de 20 mM. Cloreto de cálcio a 5M foi então adicionado parauma concentração de 30 mM. O pH da mistura era 7,3. A cultura floculada foiincubada por 160 minutos enquanto misturando. No final da incubação o pHda mistura era 7,0.

Ambas culturas floculada e não-tratada foram processadas atra-vés de uma centrífuga de discos Alfa Lavai BTPX 205 em uma taxa de fluxode 4,4 L/min e uma velocidade de bacia de 7630 RPM (8000 g). A turvaçãode centrado de estado estacionário da amostra floculada era 14 NTU, con-forme comparado com 117 NTU para amostra não-tratada, uma redução de88% na turvação. A recuperação de título de anticorpo no centrado (centrate)floculado era 96% comparado com o centrado não-tratado. O nível de prote-ínas de célula hospedeira (HCP) no centrado floculado foi reduzido em 35%de 533.341 ppm para 348.087 ppm conforme comparado com o centradonão-tratado.Ambos centrados floculados e não-tratados foram processadosatravés de Millipore A1HC Pad Filters para uma capacidade de 250 L de cen-trado por metro quadrado de filtro. A amostra não-tratada mostrou uma gran-de mudança de turvação uniforme, de 4 NTU a 24 LVm2 para 26 NTU a 121L/m2 para 37 NTU a 254 Um2. A turvação do grupo de filtrado de almofadafinal para a amostra não-tratada era 21 NTU. A amostra floculada mostrouapenas um pequeno aumento em turvação através das almofadas, de 2 NTUa 21 L/m2 para 6 NTU a 150 L/m2 para 7 NTU a 254 L/m2. A turvação do gru-po de filtrado de almofada final para a amostra floculada era 5 NTU1 umaredução de 76% na turvação conforme comparado com a amostra não-tratada.

Após filtragem em almofada e filtragem adicional através de umfiltro de polimento de 0,2 pm, as amostras foram cromatografadas usandouma coluna de afinidade de Proteína A GE Healthcare MabSeIect. Quandoanticorpos são eluídos de colunas de Proteína A, os grupos de pico freqüen-temente são turvos, e que a turvação tipicamente aumenta quando o pico éneutralizado. O grupo de pico não-tratado tinha uma turvação de 10 NTU, eaumentou para 22 NTU quando da neutralização. O grupo de pico floculadotinha uma turvação de 3 NTU, e aumentou para 8 NTU quando da neutrali-zação, 63% menor do que o pico não-tratado.

Exemplo 4

Floculação com cálcio e fosfato resultando em turvação reduzidaem ambos meio condicionado clarificado e no pico de Proteína A. Reduçãosignificante de ambas impurezas relacionada com célula e relacionada comproduto foi também conseguida.

Um mAb, anti-5T4, foi produzido por células CHO recombinantesculturadas em meio livre de soro. Aproximadamente 3L de cultura foram dei-xados não-tratados e serviram como um controle negativo. Outros 3L da cul-tura foram transferidos para um recipiente de 4L. Um tampão foi adicionadoa 40 mM para controlar o pH e gentilmente misturado a 18-24°C. Fosfato depotássio a 2M foi então adicionado a uma concentração de 20 mM e a solu-ção misturada gentilmente. Cloreto de cálcio a 5M foi então adicionado parauma concentração de 30 mM e a solução gentilmente misturada. O pH damistura era 7,2. A cultura flocuiada foi transferida para três frascos Erlenme-yer de 2L e incubada por 2 horas, enquanto misturando. No final da incuba-ção o pH da mistura era 7,0.

Uma amostra de 50 mL de ambas cultura flocuiada e cultura não-tratada foi agitada a 340 g por dez minutos. O sobrenadante clarificado foiremovido e ensaiado quanto à concentração de anticorpo através de HPLCde Proteína A e quanto à turvação usando um nefalômetro. A recuperaçãototal de material relacionado com produto era 78% conforme comparadocom amostra não-tratada. A turvação da amostra não-tratada era 29 NTU. Aturvação da amostra flocuiada era 2 NTU, uma redução de 93% na turvaçãoconforme comparado com amostra não-tratada.

Ambas amostras flocuiada e não-tratada foram processadas a -través de Millipore A1HC Pad Filters. Após filtragem em almofada e filtragemadicionado em um filtro de polimento de 0,2 pm, as amostras foram croma-tografadas usando uma coluna de afinidade de Proteína A GE HealthcareMabSelect. Como anticorpos eluem das colunas de Proteína A em altas con-centrações, o material no ápice do pico de produto freqüentemente precipita,resultando em uma solução turva. O nível de precipitação no ápice do picoda amostra não-tratada, conforme medido através de absorbância a 600 nmem um espectrômetro, era 1,85AU. O nível de precipitação no ápice do picoda amostra flocuiada, conforme medido através de absorbância a 600 nmem um espectrômetro, era 0,03AU, uma redução de 98% em turvação com-parado com a amostra não-tratada.

Quando anticorpos são eluídos das colunas de Proteína A, osgrupos de pico são ocasionalmente turvos. Quando da neutralização, a tur-vação tipicamente aumenta significantemente entre pH 5,5 e pH 6,0, con-forme material precipita e sai da solução. Alguns desses precipitados tendema se tornar solúveis novamente conforme o pH é aumentado acima de 7. Ogrupo de pico não-tratado, com uma concentração de anticorpo de 8,1mg/mL tinha uma turvação de 8,5 NTU quando eluído, aumentou para 839NTU entre pH 5,5 e 6,0 e diminuiu para 53 NTU em pH 7,0. Quando da fil-tragem em um filtro de grau de esterilização de 0,2 μιτι, a turvação foi ape-nas reduzida para 40 NTU.

O grupo de produto floculado eluiu da coluna em volume menor eentão era mais concentrado. O grupo de pico floculado, com uma concentra-ção de anticorpo de 15,1 mg/ml, tinha uma turvação de 5,6 NTU quando elu-ído, aumentou para 31 NTU entre pH 5,5 e 6,0, uma redução de 96% emturvação do controle. A turvação aumentou ligeiramente para 46 NTU em pH7,0 a 15,1 mg/mL. Quando da filtragem em um filtro de grau de esterilizaçãode 0,2 μιτι, a turvação foi reduzida para 8,1 NTU, uma redução de 80% docontrole.

Quando o pico da Proteína A neutralizado foi diluído para umaconcentração de 8,1 mg/mL para igualar com a amostra não-tratada, a tur-vação da amostra floculada não-filtrada diminuiu de 46 NTU para 25 NTU,uma redução de 53% conforme comparado com a amostra não-tratada.Quando da filtragem em um filtro de grau de esterilização de 0,2 μιτι, a tur-vação foi reduzida para 4,1 NTU, uma redução de 90% na turvação compa-rado com a amostra não-tratada.

O nível de agregado de peso molecular alto (HMW) presente nogrupo de pico de Proteína A foi medido através de HPLC de exclusão de ta-manho. O nível de agregado na amostra não-tratada foi 9,51%. O nível deagregado na amostra floculada era 1,05%, uma redução de 89% em agre-gado conforme comparado com a amostra não-tratada. Com a redução emagregado levada em consideração, a recuperação de produto de 78% nacultura se traduz em uma recuperação de 85% do monômero desejado.

Os níveis de proteínas de célula hospedeira (HCP), impurezas

indesejadas secretadas pelas células CHO, foram medidos em etapas dife-rentes do processo usando um ELISA. Os níveis de HCP são relatados co-mo partes por milhão (ppm), equivalentes a ng de HCP por mg de anticorpo.O nível de HCP na cultura não-tratada era 2,53E6 ppm. O nível de HCP nomeio condicionado floculado era 3,83E5 ppm, uma redução de 84% da cultu-ra não-tratada. Ambas culturas tratadas e não-tratadas tinham uma reduçãode aproximadamente 60% em HCP através dos filtros de almofada para1,02Ε6 e 1,62Ε5, respectivamente. Quando da purificação na coluna de Pro-teína A, os níveis de HCP na amostra não-tratada foram reduzidos em 90%para 1,03E5 ppm. Os níveis de HCP na amostra floculada foram reduzidosem 98% para 3,83E2 ppm. No geral, houve uma remoção de 1,4 Iog de HCPpara a série de purificação não-tratada. A série de purificação floculada atin-giu uma remoção 3,8 Iog de HCP resultando em uma redução de 250 vezesem HCP conforme comparado com a série de purificação não-tratada.

Embora várias implementações tenham sido descritas, a inven-ção não é tão limitada.

Como um exemplo, em algumas implementações, os métodos defloculação descritos aqui podem ser realizados sem células presentes, porexemplo, após as células terem sido removidas. O meio pode conter materialinsolúvel não-celular (vide Exemplo 5 abaixo).

Exemplo 5

O uso de cálcio e fosfato para formar um precipitado sólido paraauxiliar na filtragem de uma solução contendo proteína turva: Um mAb, anti-GDF8 Ne 1, foi produzido por células CHO recombinantes em meio livre desoro. As células foram removidas por uma centrífuga de discos Alfa LavaiBTPX 205 e os centrados resultantes foram processados através de Millipo-re A1HC Pad Filters. Após filtragem em almofada e filtragem adicional emum filtro de polimento de 0,2 pm, as amostras foram cromatografadas usan-do uma coluna de afinidade de Proteína A GE Healthcare MabSeIect. Quan-do anticorpos são eluídos da coluna de Proteína A, usando um tampão depH baixo, os grupos de pico são ocasionalmente turvos. Quando da neutrali-zação, a turvação tipicamente aumenta significantemente.

Neste exemplo, o pico de ProteinaAfoi mantido não-filtrado por 7dias a 4°C e então aquecido para temperatura ambiente. A turvação do picoera 192 NTU. O pico foi separado em amostras de 800 mL, com uma amos-tra deixada não-tratada. À segunda amostra foram adicionados fosfato depotássio a 4 mM e cloreto de cálcio a 6 mM. A amostra tratada foi então agi-tada em um frasco Erlenmeyer de 2L por 1 hora a 18-25°C. Após agitação aturvação da amostra tratada era 460 NTU.Ambas amostras tratadas e não-tratadas foram então filtradas emum filtros de cápsula de polietersulfona de 0,5/0,2 pm Millipore Express SCHde 17,7 cm2. Com base na quantidade de solução que foi capaz de passarpor cada filtro, uma capacidade de filtro máxima foi calculada. A capacidadede filtro máxima é o número de litros de solução que pode passar por 1 m2de filtro antes do filtro entupir e nenhuma solução mais passar. A amostranão-tratada foi capaz de atingir uma capacidade de filtro máxima de aproxi-madamente 30 Um2, enquanto a amostra tratada atingiu uma capacidade defiltro máxima de aproximadamente 1500 L/m2, um aumento de 50 vezes nacapacidade do filtro. A turvação pós-filtro para ambas amostras não-tratadase tratadas foi 9 NTU, indicando que o tratamento não resultou provavelmentena remoção de matéria em partícula adicional, mas serviu como um auxiliarde filtro e permitiu que volumes maiores de solução passassem pelo filtroantes dele entupir.15 Exemplo 6

O efeito de escala e método de mistura sobre o uso de cálcio efosfato para formar um precipitado sólido para auxiliar na remoção de maté-ria em partícula em uma solução contendo proteína turva: Anti-AB N2 2 mAb,escrito como "mAb B" nas Figuras 2 e 3, foi produzido por células CHO re-combinantes culturadas em meio livre de soro em biorreatores de escalapiloto (150-500L de cultura de célula). Aproximadamente 125L, 1,5L ou 50mL do meio condicionado contendo célula foram separados em alíquota emuma bombona de 200L, um béquer de 2L ou um frasco Erlenmeyer de 125mL, respectivamente. HEPES foi adicionado a 40 mM para controlar o pH. Abombona de 200L e o béquer de 2L foram misturados com propulsores. OErlenmeyer de 125 mL foi misturado por um agitador. Uma solução concen-trada de fosfato de potássio foi adicionada a cada mistura para atingir umaconcentração final de 20 mM na solução final. Uma solução concentrada decloreto de cálcio foi adicionada a cada solução para atingir uma concentra-ção fixada final de 30 mM e misturada. Os pHs finais estavam entre 7,0 e7,5. O sólido e o meio foram incubados por mais de uma hora sob condiçõesde mistura em temperatura ambiente (20-23°C). Alíquotas de 50 mL de a-mostra não-tratada, e as amostras tratadas de 125L, 1,5L e 50 mL foramcentrifugadas por 10 minutos a 340 xg. As turvações e concentrações deanticorpo nos sobrenadantes foram medidas.

O efeito sobre a turbidez da escala e método de mistura é mostrado na Figura 12. A turbidez é reduzida em mais de 90% do controle emtodos os exemplos de floculação independente da escala e independente dométodo de mistura (propulsor ou agitador). Adicionalmente, a recuperaçãode anticorpo em todas as amostras tratadas era 100% comparado com aamostra não-tratada. Deste modo, não parece que a floculação na presenteinvenção seja dependente de escala ou do método de mistura para essascondições amplamente diferentes.

Os níveis de proteínas de célula hospedeira (HCP), impurezasindesejadas secretadas pelas células CHO, foram medidos no sobrenadantenão-tratado e a amostra de 125L tratada usando um ELISA. Os níveis deHCP são relatados como partes por milhão (ppm), equivalentes a ng de HCPpor mg de anticorpo. A amostra de 125L tratada tinha uma redução em HCPde 50% conforme comparado com a amostra não-tratada.

Exemplo 7

O efeito da velocidade de mistura sobre o uso de cálcio e fosfatopara formar um precipitado sólido para auxiliar na remoção de matéria empartícula em uma solução contendo proteína turva: mAb Anti-AB N9 2, escritocomo "mAb B" na FIGURA 3, foi produzido por células CHO recombinantesculturadas em meio livre de soro em biorreatores de escala piloto (160-500Lde cultura de célula). Aproximadamente 125L do meio condicionado conten-do célula foram postos em duas bombonas de 200L. HEPES foi adicionado a40 mM para controlar o pH. A mistura foi realizada com propulsores, um ope-rado em uma velocidade da pá de 0,9 m/s e o outro a 2,5 m/s. Uma soluçãoconcentrada de fosfato de potássio foi adicionada à mistura para atingir umaconcentração final de 20 mM na solução final. Uma solução concentrada decloreto de cálcio foi adicionada à solução para atingir uma concentração fi-xada final de 30 mM e misturada. O pH final era entre 7,0 e 7,5. O sólido e omeio foram incubados sob condições de mistura em temperatura ambiente(20-23°C), e as amostras tomadas em vários pontos de tempo. A turvação decada sobrenadante de amostra foi medida após centrifugação a 340 xg pordez minutos. O efeito sobre a turvação da velocidade da pá do propulsor émostrado na FIGURA 3. A turvação é reduzida em mais de 90% a partir docontrole em todos os exemplos de floculação independente das velocidadesde pá investigadas após uma hora. A velocidade de pá mais rápida pareciater uma redução mais rápida na turvação no ponto de tempo de 15 minutos.Esta diferença, no entanto, não é significante. Deste modo, não parece quea floculação na presente invenção seja dependente da velocidade de pá pa-ra as velocidades investigadas após uma hora de incubação.

Os níveis de proteínas de célula hospedeira (HCP), impurezasindesejadas produzidas pelas células CHO, foram medidos no sobrenadantenão-tratado e na amostra tratada a 0,9 m/s usando um ELISA. Os níveis deHCP são relatados como partes por milhão (ppm), equivalentes a ng de HCPpor mg de anticorpo. A amostra tratada teve uma redução em HCP de 47%conforme comparado com a amostra não-tratada.Exemplo 8

Floculação em Larga Escala:

Um experimento de escala piloto usando cálcio e fosfato comoprecipitantes e os efeitos sobre etapas de clarificação e cromatografia a ju-sante: Um mAb, anti-IL-13 N9 1 (escrito como mAb E nas Figuras 4 e 5) foiproduzido em cinco bateladas diferentes por células CHO recombinantesculturadas em meio livre de soro em um biorreator de 190 L. O biorreator foiativado com um tempo de cultura de 12-14 dias, e as células tinham umaviabilidade entre 8x106 - 11x106 células viáveis/mL, e eram 66-88% viáveis.No momento da coleta, a cultura foi trazida para temperatura ambiente (18-25°C). 150L de cultura foram transferidos para uma bombona de 200L (paraa primeira das quatro bateladas) ou deixados no biorreator (para a últimabatelada) e lentamente misturados com um misturador no alto. Tampão HE-PES foi adicionado a 40 mM para controlar o pH. Fosfato de potássio a 2Mfoi então adicionado para uma concentração de 20 mM. Cloreto de cálcio a5M foi então adicionado para uma concentração de 30 mM. O pH da misturaestava entre 7 e 7,5. A cultura floculada foi incubada entre 2 e 3 horas, en-quanto misturando.

As culturas floculadas foram processadas através de uma centrí-fuga de discos Alfa Lavai BTPX 205 em uma taxa de fluxo entre 4 e 5 L/mine uma velocidade de bacia de 7630 RPM (8000 g). A turvação dos centradosobtidos é comparada com o sobrenadante da amostra não-floculada (obtidoda centrifugação do controle não-tratado a 340 g por dez minutos) na FIGU-RA 4. Em todos os casos, a floculação reduz a turvação em mais de 85%. Arecuperação de título de anticorpo nos sobrenadantes floculados é mostradana FIGURA 5 como uma função de tempo de incubação, e está acima de75% em todos os casos. Amostras de 50 ml_ são tomadas das bateladas 403e 405 e incubadas em frascos Erlenmeyer de 125 ml_ por tempo adicional.Após 7 horas, a batelada 403 tinha um título de 60% da amostra não-tratadae a batelada 405 tinha um título de 70% da amostra não-tratada.

Os níveis de proteínas de célula hospedeira (HCP), impurezasindesejadas secretadas pelas células CHO, foram medidos nos sobrenadan-tes não-tratados e centrados tratados usando um ELISA. Os níveis de HCPsão relatados como partes por milhão (ppm), equivalente a ng de HCP pormg de anticorpo. As amostras tratadas das 5 bateladas mostraram reduçõesem HCP de 49%-69% conforme comparado com amostras não-tratadas.

As primeiras 3 bateladas foram processadas através de MilliporeA1HC Pad Filters para uma capacidade de 270 L de centrado por metroquadrado de filtro em um fluxo de 120 litros por metro quadrado por horasem nenhum aumento em pressão ou turbidez.

Após filtragem em almofada, as amostras geralmente permane-ceram estáveis por muitos dias conforme medido através da turvação.

As 2 últimas bateladas foram diretamente sobre filtros de 0,2 μηηsem irem através de almofadas. Capacidades dos filtros de 730 e 150 /m2foram atingidas, respectivamente, sem o uso de filtros de almofada antesdos filtros de 0,2 pm. Essas capacidades de filtro representam um aperfeiço-amento significante na capacidade de filtragem sobre aquela de materialnão-floculado. Quando da manutenção dos centrados filtrados em 0,2 pm(sem almofadas) em temperatura ambiente (18-24°C), a turvação começa aaumentar dentro de algumas horas devido à precipitação contínua do cálcioe do fosfato. Após 24-48 horas os precipitados sedimentam, formando umacamada cristalina de fosfato de cálcio no fundo do recipiente. A solução con-tendo proteína clarificada resultante tem excelentes características de capa-cidade de filtragem ambos antes e após os precipitados sedimentarem. Ne-nhum anticorpo é perdido no precipitado.

Floculação para a batelada final foi realizada diretamente no bior-reator piloto. O reator foi efetivamente limpo usando procedimentos de Iim-peza-no-local (CIP) (enxágue com água seguido por uma lavagem com Na-OH a 0,1 N a 60-80°C).

Todas as 5 bateladas foram processadas em escala piloto atra-vés de uma coluna de Proteína A, etapa de troca de ânion, filtro de retençãode vírus e ultrafiltragem/diafiltragem final (UF/DF) sem quaisquer conse-quências operacionais. Picos de Proteína A neutralizados tinham todos tur-vações de <20 NTU e eram altamente filtráveis. Qualidade do produto, talcomo níveis de agregado de peso molecular alto e clips de peso molecularbaixo, conforme medido através de HPLC de exclusão de tamanho e eletro-forese de gel SDS-PAGE e níveis de espécies ácidas e básicas, conformemedido através de HPLC de troca de cátion, eram comparáveis com umacampanha piloto não-floculada anterior com este anticorpo.Exemplo 9

O uso de cálcio e fosfato como precipitantes e efeitos sobre umaetapa de cromatografia de Proteína A a jusante e filtragem subseqüente:Três mAbs, anti-AB N5 2, anti-GDF8 Nq 1 e anti-IL22 foram produzidos porcélulas CHO recombinantes culturadas em meio livre de soro. Para cada um,as culturas foram separadas na metade, com a primeira amostra sendo dei-xada não-tratada. À segunda amostra (a amostra tratada) foram adicionadosHEPES para um nível de 40 mM, fosfato de potássio para um nível de 20mM e cloreto de cálcio para um nível de 30 mM. As células de todas as a-mostras foram removidas através de centrifugação e os sobrenadantes re-sultantes foram processados através de Millipore A1HC Pad Filters. Apósfiltragem em almofada e filtragem adicional através de filtros de polimento de0,2 pm, as amostras foram cromatografadas usando colunas de afinidade deProteína A GE Healthcare MabSelect. Quando anticorpos são eluídos dascolunas de Proteína A, usando um tampão de pH baixo, os grupos de picosão ocasionalmente turvos. Quando da neutralização, a turvação tipicamenteaumenta significantemente.

As turvações de pico neutralizadas das amostras não-tratadas etratadas são mostradas na Tabela 2 abaixo. Todas as três amostras tratadasmostraram uma redução significante em turvação de pico neutralizada con-forme comparado com amostras não-tratadas.

Tabela 2: Diminuição na turvação de Pico da Proteína A após tra-tamento com fosfato de cálcio da cultura celular antes do carregamento

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Ambos picos neutralizados anti-IL22 não-tratados e tratados fo-ram então filtrados através de filtros de seringa de polietersulfona de 0,8/0,2pm Pall Acrodisc Supor de 2,8 cm2. Com base na quantidade de solução quefoi capaz de passar por cada filtro, uma capacidade de filtro máxima foi cal-culada. A capacidade de filtro máxima é o número de litros de solução quepode passar por 1 m2 de filtro antes do filtro entupir e solução não poder maispassar. A amostra não-tratada foi capaz de atingir uma capacidade de filtromáxima de aproximadamente 10"30 L/m2. 170 L/m2 da amostra tratada pas-saram pelo filtro sem uma redução no fluxo, ponto onde nenhuma amostratratada permaneceu. A amostra tratada passou pelo filtro muito rapidamentepara calcular com precisão uma capacidade de filtro máxima. No entanto,como não houve nenhuma redução em fluxo determinada para um lança-mento de 170 L/m2, pode ser suposto que a capacidade máxima teria sidosignificantemente maior do que 170 L/m2.Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras refe-rências mencionadas aqui são incorporados a título de referência em suatotalidade.

Outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicaçõesque seguem:

Claims (65)

1. Método compreendendo:formação de um sólido compreendendo um primeiro cátion eum primeiro ânion em um meio compreendendo uma proteína; eseparação do sólido da proteína.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o primeiro cá-tion é selecionado do grupo consistindo em cálcio, magnésio, estrôncio, a-lumínio, escândio, lântano, silício, titânio, zircônio, tório, manganês, cobalto,cobre, cromo, ferro, níquel, zinco e vanádio.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o primeiro cá-tion é cálcio.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o primeiro â-nion é selecionado do grupo consistindo em fosfato, carbonato, tungstato,hidróxido, haleto, succinato, tartrato, citrato, sulfeto, molibdtao, nitrato, fluore-to, silicato e alginato.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o primeiro â-nion é fosfato.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o primeiro cá-tion é cálcio e o primeiro ânion é fosfato.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o sólido temuma constante de produto de solubilidade de não mais do que cerca de 10"4M2.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a-inda introdução de a partir de cerca de 4 mM a cerca de 200 mM do primeirocátion e do primeiro ânion no meio.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o produto dasconcentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion antes da formação dosólido é maior do que cerca de 10'5 M2.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o produtodas concentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion antes da formaçãodo sólido é maior do que cerca de 10"4M2.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o produto dasconcentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion antes da formação dosólido é maior do que cerca de 2,7 χ 10"2 M2.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, onde as concen-trações do primeiro cátion e do primeiro ânion no meio são diferentes.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, onde as concen-trações do primeiro cátion e do primeiro ânion no meio são substancialmenteiguais.

14. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendoainda mudança do pH do meio.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o pH domeio é mantido entre cerca de 5 a cerca de 9.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, onde pelo menoscerca de 50% da proteína no meio são separados.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, onde pelo menos-70% da proteína no meio são separados.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoainda diminuição da turvação do meio clarificado em pelo menos cerca de-30% com relação a um segundo meio clarificado idêntico ao meio e livre dosólido.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoainda diminuição da turvação do meio clarificado em pelo menos cerca de-50% com relação a um segundo meio clarificado idêntico ao meio e livre dosólido.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o meio com-preende ainda células de mamífero.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o meio com-preende ainda células eucarióticas.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoainda centrifugação do meio, filtragem do meio através de uma membranade microfiltragem ou filtragem do meio através de um filtro de profundidade.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o sólidocompreende ainda uma segunda espécie de cátion ou um segundo ânion.

24. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o meio com-preendendo a proteína, após o sólido ser formado e separado, é aplicado auma coluna de Proteína A e eluído para prover um pico eluído tendo umaturbidez menor do que um pico eluído similar de um segundo meio idênticoao primeiro meio e livre de formação de sólido.

25. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o meio com-preendendo a proteína, após o sólido ser formado e separado, é aplicado auma coluna de Proteína A e eluído para prover um pico eluído tendo um ní-vel de impureza solúvel menor do que um pico eluído de um segundo meioidêntico ao meio e livre de formação do sólido.

26. Método compreendendo:introdução de um primeiro cátion e um primeiro ânion em ummeio compreendendo uma proteína;precipitação de um sólido compreendendo o primeiro cátion e oprimeiro ânion; eseparação do sólido da proteína.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeirocátion e o primeiro ânion são introduzidos seqüencialmente.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeirocátion e o primeiro ânion são introduzidos simultaneamente.

29. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeirocátion é selecionado do grupo consistindo em cálcio, magnésio, estrôncio,alumínio, escândio, lântano, silício, titânio, zircônio, tório, manganês, cobalto,cobre, cromo, ferro, níquel, zinco e vanádio.

30. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeiroânion é selecionado do grupo consistindo em fosfato, carbonato, tungstato,hidróxido, haleto, succinato, tartrato, citrato, sulfeto, molibdtao, nitrato, fluore-to, silicato e alginato.

31. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o sólidotem uma constante de produto de solubilidade de não mais do que cerca de 10"4 M2.

32. Método de acordo com a reivindicação 26, compreendendoainda introdução de a partir de cerca de 4 mM a cerca de 200 mM do primei-ro cátion ou do primeiro ânion no meio.

33. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o produtodas concentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion é maior do quecerca de 10"5 M2.

34. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o produtodas concentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion é maior do quecerca de 10"4M2.

35. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o produtodas concentrações do primeiro cátion e do primeiro ânion é maior do quecerca de 2,7 χ 10"2 M2.

36. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendointrodução de concentrações diferentes do primeiro cátion e do primeiro â-nion no meio.

37. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendointrodução da mesma concentração do primeiro cátion e do primeiro ânionno meio.

38. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendoainda mudança do pH do meio.

39. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o pH domeio é mantido entre cerca de 5 a cerca de 9.

40. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendoainda ajuste da temperatura do meio.

41. Método de acordo com a reivindicação 26, onde pelo menoscerca de 50% da proteína no meio são separados.

42. Método de acordo com a reivindicação 26, onde pelo menoscerca de 70% da proteína no meio são separados.

43. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendoainda diminuição da turvação do meio clarificado em pelo menos cerca de30% com relação a um segundo meio clarificado idêntico ao meio e livre dosólido.

44. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendoainda diminuição da turvação do meio clarificado em pelo menos cerca de 50% com relação a um segundo meio clarificado idêntico ao meio e livre dosólido.

45. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o meiocompreende ainda células de mamífero.

46. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o meiocompreende ainda células eucarióticas.

47. Método de acordo com a reivindicação 26 compreendendoainda centrifugação do meio.

48. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o sólidocompreende ainda um segundo cátion ou um segundo ânion.

49. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o meiocompreendendo a proteína, após o sólido ser formado e separado, é aplica-do a uma coluna de Proteína A e eluído para prover um pico eluído tendouma turvação menor do que um pico similarmente eluído de um segundomeio idêntico ao primeiro meio e livre de formação do sólido.

50. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o meiocompreendendo a proteína, após o sólido ser formado e separado, é aplica-do a uma coluna de Proteína A e eluído para prover um pico eluído tendo umnível de impureza solúvel menor do que um pico eluído de um segundo meioidêntico ao meio e livre de formação do sólido.

51. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a proteína éuma proteína secretada.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, onde a proteínaé selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um fragmento de liga-ção de antígeno de um anticorpo, um receptor solúvel, uma fusão de recep-tor, uma citocina, um fator de crescimento, uma enzima e um fator de coagu-lação.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, onde a proteínaé um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, onde o anticorpoou fragmento de ligação de antígeno dele se liga a um peptídeo Αβ, interleu-cina-13, interleucina-22 ou fator-8 de diferenciação de crescimento.

55. Método de acordo com a reivindicação 26, onde a proteínaé uma proteína secretada.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, onde a proteínaé selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um fragmento de liga-ção de antígeno de um anticorpo, um receptor solúvel, uma fusão de recep-tor, uma citocina, um fator de crescimento, uma enzima e um fator de coagu-lação.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, onde a proteínaé um anticorpo ou um fragmento de ligação dele.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, onde o anticorpoou fragmento de ligação de antígeno dele se liga a um peptídeo Αβ, interleu-cina-13, interleucina-22, 5T4 ou fator-8 de crescimento e diferenciação.

59. Método compreendendo: (i) formação de um sólido que in-clui um primeiro cátion e um primeiro ânion em um meio compreendendouma porção alvo e um agente causador de turvação; e (ii) separação do só-lido e agente causador de turvação da solução através de filtragem.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, onde a porçãoalvo é uma proteína.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, onde a proteínaé uma proteína solúvel.

62. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeirocátion é cálcio.

63. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeiroânion é fosfato.

64. Método de acordo com a reivindicação 26, onde o primeirocátion é cálcio e o primeiro ânion é fosfato.

65. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo ainda ajuste datemperatura do meio.