CN101263155A

CN101263155A - 利用盐絮凝蛋白质

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Publication number: CN101263155A
Application number: CNA2006800338666A
Authority: CN
Inventors: J·L·科夫曼; R·I·施普里策; S·M·维茨克
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2008-09-10
Also published as: US20070066806A1; JP5707025B2; JP2009508486A; TW200801039A; JP2014040449A; AU2006292739A1; ES2704040T3; EP1934242A1; EP1934242B1; CA2620193A1; CA2620193C; BRPI0616242A2; US7855280B2; WO2007035283A1

Abstract

本发明公开了分离方法，以，例如分离重组蛋白质。该方法包括在包含蛋白质的介质中形成包含第一阳离子和第一阴离子的固体，然后将该蛋白质与该固体分离。

Description

利用盐絮凝蛋白质

相关申请的交互参考

本申请要求于2005年9月15日递交的美国临时申请号60/717,838的利益，所述临时申请完整地在此处并入作为参考。

技术领域

本发明涉及分离方法，例如从包括杂质例如一种或多种可溶性杂质、细胞、细胞碎屑或不溶性杂质的液体中回收纯化的产物的方法。

背景技术

在生物技术产业中，工业规模的蛋白质纯化对于研制用于治疗和诊断目的的重组蛋白质来说是重大的挑战。与产量、纯度和吞吐量相关的问题对制造业构成挑战。随着重组蛋白质技术的出现，可以利用培养的真核宿主细胞系产生目的蛋白质，其中所述宿主细胞系经改造以表达编码该蛋白质的基因。但是，可由宿主细胞培养方法产生的是目的蛋白质与杂质的混合物，所述杂质可以来源于蛋白质本身，例如蛋白质变体，或者来源于宿主细胞，例如宿主细胞蛋白质、DNA和细胞碎屑。目的重组蛋白质在制药上的应用可取决于是否能够从这些杂质中可靠地回收足够水平的蛋白质。重组技术还可以产生在自然界中未发现的蛋白质，例如：新的突变蛋白质、融合蛋白质或具有指导蛋白质向培养基分泌的异源信号序列的蛋白质。可以用很多真核细胞类型来表示重组蛋白质，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、NS0骨髓瘤细胞和巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)细胞。

一般来说，为了产生重组蛋白质，制备重组DNA载体，其包含编码待表达的蛋白质的基因以及在目的细胞类型中指导基因转录和翻译的适当序列。载体还可以包含如选择性或反向选择性标记，例如抗药性基因等序列，和/或设计用于促进蛋白质表达序列稳定滞留的序列。就哺乳动物细胞来说，可使用质粒和病毒载体，例如反转录病毒载体。

在形成载体之后，将载体导入细胞。可以利用标准方法，例如脂转染、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔或生物轰击(biolistics)(基因枪)，转染裸DNA形式的载体。可以通过用病毒颗粒感染来导入病毒载体。然后筛选或者选择那些包含载体的细胞。

可在液体培养基中或在固相支持物上培养包含载体并表达重组蛋白质的细胞，并自细胞培养物分离该蛋白质。哺乳动物细胞密度介于10⁶细胞/毫升到2×10⁷细胞/毫升之间或更高。大多数蛋白质的是分泌型的。分泌性蛋白质的浓度可介于4mg/L到10g/L之间。但是，如果蛋白质在细胞内产生的话，则破碎细胞来释放蛋白质，而如果蛋白质分泌的话，则可在除去细胞和细胞碎屑之后从生长培养基或支持物中分离蛋白质。然后可以纯化分离的蛋白质。

用于除去细胞和细胞碎屑的常规生物医药蛋白质纯化法包括离心、微量过滤和深层过滤(depth filter)。可使用助滤剂，如硅藻土来增强这些步骤的性能，但是其并不总是有效，并且有时显著地结合目的蛋白质。其应用可能还需要添加固体或均匀的悬浮液，这作为大规模生物制药操作的一部分可能是具有挑战性的。

高分子絮凝剂可用于帮助澄清哺乳动物细胞培养工艺物流(processstream)，但其具有局限性。例如，由于担心目的蛋白质失活或因沉淀导致的产物损失(Scopes，1987)，所以限制了通常用作加工助剂的硫酸鱼精蛋白质的应用。高质量的试剂，例如为医学应用而出售的试剂可能是昂贵的。在某些情况下，可能需要确认清除到极低的水平来保证在患者中没有意外的影响。例如，脱乙酰壳多糖不是一个成分十分明确的试剂，有关于其在澄清应用中的常规使用是否具有一致的性能存在担心。已考虑将多种带电荷的聚合物，例如DEAE葡聚糖、常用于废水处理(NALCO WaterHandbook，第8章)的基于丙烯酰胺的聚合物和聚乙烯胺(PEI)用于澄清应用中。就后两种聚合物来说，丙烯酰胺试剂有被毒性试剂污染的潜在危险，而聚乙烯胺尽管是一种高效澄清试剂但常被不等量的疑为致癌剂的氮丙啶(ethylenimine)单体所污染(Scawen等人)。另外，这些聚合物中有很多，包括PEI，趋向于几乎不可逆地与很多层析树脂结合，从而限制了后续加工过程的选择。与这些聚合物相关的管理和原料再利用问题将其应用主要限制于学术研究。

已将基于非聚合物的絮凝剂，例如明矾和铁盐用于废水处理工业(NALCO Water Handbook)。这些物质可能看起来对于处理蛋白质产物没有用处，因为其可能结合蛋白质产物或者可能催化化学反应从而导致可影响安全性或功效的蛋白质修饰。

发明概述

本发明涉及分离方法。该分离方法可用于从包含杂质如一种或多种可溶性杂质、不溶性杂质、细胞或细胞碎屑的液体中分离蛋白质，例如重组蛋白质。

在一个方面，本发明涉及分离方法，该方法包括向液体加入一种或多种(例如：两种或两种以上)可溶性溶液，所述溶液可以形成有助于杂质清除的沉淀。该沉淀可更强地与杂质结合并且更弱地与目标产物结合。该溶液可以包括可溶性阳离子，例如金属离子和/或可溶性阴离子，所述离子能与如微粒、胶体物质、细胞碎屑或细胞相互作用，并例如，在混合在一起时形成不溶性沉淀物。可以利用固液分离技术，如微量过滤、深层过滤或离心来澄清或除去产生的沉淀。经处理的液体与经过类似加工的未经处理的液体相比可具有减低的杂质水平。

杂质可以与悬浮在液体中的那些成分相关。在一些实施方案中，杂质包括胶体物质、微粒物质、细胞、细胞碎屑如膜碎片，以及在典型工艺条件下不溶的其它大的细胞复合物。杂质还可以指在典型工艺条件下保持可溶的细胞成分。DNA、宿主细胞蛋白质和磷脂是在澄清时存在于溶液中的细胞成分的实例。另外，可以存在与产物相关的可溶性杂质，如无活性的同种型或聚集体。

可用各种方法确定杂质水平。一种提供了液体中碎屑量测定的方法是混浊度的浊度测定。或者，可以通过测定处理已知量的液体所需要的膜过滤器的面积来评价碎屑的水平。特定的杂质也可能在液体中是可溶的，从而需要特定的生物化学试验来评价。可利用基于荧光分析的方法，如通过利用市售可得的染料Picogreen(Invitrogen，产品号P-7581)测定DNA水平。替代方法包括杂交法，如狭缝印迹技术或聚合酶链式反应(PCR法)。可用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、反相色谱法或酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来鉴定宿主细胞蛋白质水平。可用薄层色谱法或高效液相色谱法来分析磷脂。

产生的沉淀可以与悬浮的杂质和可溶性杂质均相互作用，并且该相互作用可以降低这些杂质在纯化后的液体中的水平。因此，例如，就使用哺乳动物细胞培养物产生重组蛋白质的工业生产方法而言，该分离方法可节约成本和/或时间，并且提高产品质量。

在另一个方面，本发明涉及增强随后的层析步骤的性能，例如，蛋白质A层析步骤的性能。典型地通过将无细胞的条件培养基直接施用于其上固定有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A树脂来进行蛋白质A层析。随后用中性pH(大约pH 6-8)的水溶液洗涤树脂，并常用酸性缓冲液洗脱所结合的蛋白质。在后续加工之前，把合并的洗脱物调节到中性pH。合并的蛋白质A洗脱物常常在中和时发生沉淀，尤其是当高密度细胞培养物用于上样时。根据本发明，当用金属和阴离子处理上样的样品时，与未处理的液体相比，通过蛋白质A步骤实现的宿主细胞蛋白质的清除更大。在具体实施方式中，当用阳离子和阴离子处理上样液时，蛋白质A峰在中和时常常发生较少的沉淀，从而使工艺得以改进。

在另一个方面，本发明涉及选择两种可溶性试剂，当混合时这两种试剂在适当的条件下形成可提高工艺液体的纯度及导致高产物回收率的固体。这些试剂可包括，但不限于，钙、锰、镁、铝、钴、镍、碳酸根、氟离子、亚硫酸根、磷酸根、硅酸根和藻酸根。这些化合物是多价金属离子与作为该金属的优选配基的一价阴离子、或者高价或多价阴离子的组合。当在适当的条件下混合时可能形成难溶性复合物的这些阳离子和阴离子的盐，可用于澄清应用中。

在另一个方面，本发明涉及一种方法，其包括在含有蛋白质的介质中形成具有第一阳离子和第一阴离子的固体；和从该蛋白质中分离该固体。

在另一个方面，本发明涉及一种方法，其包括将第一阳离子和第一阴离子引入含有蛋白质的介质；沉淀具有第一阳离子和第一阴离子的固体；以及从蛋白质中分离固体。

此处所述的方法可用于促进从介质，如液体介质(例如混浊的悬浮液)中过滤一种或多种杂质。例如，这些方法可用于具有一种或多种致混浊因子的介质中，其中所述因子使得用常规过滤方法难于或不便于除去杂质。因此，在另一个方面，本发明涉及一种方法，其包括(i)在介质(例如液体介质)中形成包含第一阳离子和第一阴离子的固体，所述介质包括靶部分(例如要纯化的部分)和一种或多种致混浊因子，如沉淀的或聚集的宿主细胞蛋白质、脂类、细胞碎屑、完整细胞、沉淀的DNA或在中和蛋白质A峰时形成的沉淀，以及(ii)通过如过滤从溶液中分离固体和致混浊因子。在具体实施方式中，致混浊因子可为非细胞来源的，如胶体物质、来源于环境来源的微粒物质如沙子、灰尘、磨碎的不锈钢细粉，或沉淀的赋形剂如消泡剂或尿素等。介质(例如混浊的悬浮液)可具有比较高的混浊度，如由浊度仪测定大于5NTU，或大于100NTU，或大于500NTU。在一些具体实施方式中，固体的存在可增加介质的过滤性。在一些具体实施方式中，经处理的介质(例如：在进行步骤(i)和(ii)之后的介质)的混浊度可小于未处理的介质。在一些具体实施方式中，靶部分可为蛋白质(例如：可溶性蛋白质，如抗体)。该方法还可以包括过滤后从溶液中回收靶部分。

具体实施方式可包含一个或多个下列特征。

第一阳离子可为钙、镁、锶、铝、钪、镧、硅、钛、锆、钍、锰、钴、铜、铬、铁、镍、锌或钒。第一阳离子可为钙。

第一阴离子可为磷酸根、碳酸根、铬酸根、钨酸根、氢氧根、卤离子、琥珀酸根、酒石酸根、柠檬酸根、亚硫酸根、钼酸根、硝酸根、氟离子、硅酸根和藻酸根。第一阴离子可为磷酸根。

第一阳离子可为钙并且第一阴离子可为磷酸根。

固体可具有不超过大约10^-4M²的溶度积常数。

该方法还可以包括将从大约4mM到大约200mM的第一阳离子或第一阴离子引入介质中。

第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积可大于大约10^-5M²、10^-4M²或2.7×10^-2M²。

介质中第一阳离子和第一阴离子的浓度可不同。

介质中第一阳离子和第一阴离子的浓度可基本上相同。

该方法还可以包括改变介质的pH。

介质的pH可保持在大约5到大约9之间。

该方法可分离介质中至少大约50％的所述蛋白质。该方法可分离介质中至少大约70％的所述蛋白质。

该方法还可以包括澄清后的介质的澄清后的混浊度与等同于不含固体的该介质的第二澄清后的介质的混浊度相比降低至少大约30％。该方法还可以包括澄清后的介质的混浊度相对于等同于不含固体的该介质的第二澄清后的介质降低至少大约50％。

介质可包括细胞。介质还可以包括哺乳动物细胞。介质还可以包括真核细胞。

该方法还可以包括离心介质，通过微量过滤膜过滤介质，或通过深层过滤器过滤介质。

固体还可以包括第二种阳离子或第二阴离子。

在形成并分离固体之后，可将包含蛋白质的介质上样于蛋白质A柱，并洗脱以提供如下洗脱峰，该峰具有比第二介质的类似洗脱峰更低的混浊度，所述的第二介质相当于无固体形成的所述第一介质。

在形成并分离固体之后，可将包含蛋白质的介质上样于蛋白质A柱，并洗脱以提供如下洗脱峰，该峰具有比第二介质的洗脱峰更低的可溶性杂质水平，所述的第二介质相当于无固体形成的所述介质。

可相继地引入第一阳离子和第一阴离子。

可同时引入第一阳离子和第一阴离子。

该方法可包括将不同浓度的第一阳离子和第一阴离子引入介质中或将相同浓度的第一阳离子和第一阴离子引入介质中。

该方法还可以包括调节介质的温度。

所述蛋白质可为分泌性蛋白质。所述蛋白质可为抗体、抗体的抗原结合片段、可溶性受体、受体融合物、细胞因子、生长因子、酶或凝血因子。

在蛋白质是抗体或其片段的具体实施方式中，其可包括至少一条，并且典型地两条全长的重链，和/或至少一条，并且典型地两条轻链。或者，抗体或其片段可仅包括抗原结合片段(例如：Fab、F(ab′)₂、Fv或单链Fv片段)。抗体或其片段可为单克隆的或单特异性的抗体。抗体或其片段还可为人的、人源化的、嵌合的、CDR-嫁接的或体外产生的抗体。在再其它具体实施方式中，抗体具有选自如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄的重链恒定区。在另一个具体实施方式中，抗体具有选自如κ或λ的轻链。在一个具体实施方式中，改变，如突变恒定区，以修饰抗体的性质(例如：增加或减少以下性质中的一个或多个：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能)。抗体或其片段一般特异地结合预先确定的抗原，如与疾病有关的抗原，所述疾病如神经变性病、代谢病、炎症、自身免疫病和/或恶性病。可通过本发明的方法分离的示例性抗体包括，但不局限于抗Aβ肽、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-22(IL-22)、5T4和生长分化因子-8(GDF-8)的抗体。

鉴于本发明的优选实施方式的描述和权利要求，本发明的其它方面、特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1是分离方法的具体实施方式的流程图。

图2显示规模和混合方法对于絮凝的影响。

图3显示混合速度对于絮凝的影响。

图4总结了五个试点规模的絮凝试验。

图5总结了对于图4所总结的五个试点规模的絮凝试验之每一个，抗体回收百分率随时间的变化。

发明详述

参照图1，显示了分离靶蛋白质，如重组蛋白质的方法30。方法30包括向包含蛋白质(步骤32)和杂质(其可包括，但不局限于，细胞碎屑、细胞、DNA、宿主细胞蛋白质和产物相关杂质如无活性的同种型或聚集体)的液体中加入可溶性盐(如包含钙的盐和包含磷酸根的盐)。盐溶液可包含缓冲剂，以便当混合盐溶液时使液体中的pH改变减到最少，或使pH最佳化。当接触(如混合)时，可溶性盐常开始反应而形成可在介质中沉降的不溶性沉淀物(如固体磷酸钙)。如图1所示，随后可根据需要将介质滴定至预先确定的pH并调节温度(步骤34)，以增强沉淀。此正在沉降的沉淀物也造成细胞和碎屑，以及可能地其它杂质的沉降，而靶蛋白质保持基本上可溶于液体。在适当的条件下孵育该液体悬浮液靶持续时间长度，以便促进沉淀并且使澄清最佳化，同时保持高水平的靶蛋白质回收(步骤36)。随后，从包含靶蛋白质的液体中分离沉淀(步骤38)。该操作可以以各种方式进行，包括重力沉降、离心或过滤，其中可选的过滤方法包括切向流过滤、深层过滤、通过带电介质的过滤、使用硅藻土作为介质组分的滤垫过滤(pad filtration)。加入介质的阳离子和阴离子的量可能不足以容许沉淀或碎屑发生重力沉降，但仍可通过作为助滤剂来促进过滤。固液分离可包括通过一系列上述可选方法的加工，典型地终结于使流体通过具有低标称孔径额定值(例如0.45、0.2或0.1μM)的过滤器，所述过滤器可以考虑除菌级别的。作为初级澄清的一部分或在初始固液分离步骤(如离心)之后，通过本文所述的絮凝方法所澄清的液体可需要较少的过滤面积。而且，与未经絮凝的对照相比，滤垫过滤之后以及除菌级滤器过滤之后的混浊度可显著降低。

典型地，随后的纯化可经由一系列层析步骤来进行，但也可考虑其它的纯化法，如结晶和沉淀。在利用所述方法澄清之后，可加强第一个层析步骤的性能，对于抗体来说该步骤常常是蛋白质A柱。(包括宿主细胞蛋白质在内的)宿主细胞衍生的杂质的整体去除可大于不进行絮凝处理时的整体去除。在很多情况下，与未经处理的对照相比，中和后的合并蛋白质A洗脱物峰也具有更少的沉淀。该降低的沉淀水平可需要较少的过滤面积或可减少所需的加工时间。该降低的沉淀水平还表明除去了不想要的杂质。

不希望受理论束缚，不溶性沉淀物被认为可以通过有选择地与细胞、细胞碎屑及其它工艺物流(process stream)杂质结合而与蛋白质不发生显著相互作用的方式来加强蛋白质的分离。该推测的杂质清除过程的一个非限制性实例显示在以下反应式(1)中：

参照反应式(1)，M⁺是可溶性(即“(s)”)阳离子，而A^-是可与M⁺相互作用以形成不溶性盐或复合物的可溶性阴离子；带阴影的和填充的圆圈各表示可溶性或不溶性的杂质；1是包括阳离子-阴离子盐或复合物以及与其结合的杂质的不溶性沉淀物(本文中1有时称作“最终复合物或盐”或“具有第一阳离子和第一阴离子的固体”)；并且向下指的箭头表示1为沉淀形式。例如，磷酸钙可以通过离子和/或通过螯合与DNA、宿主细胞蛋白质和细胞碎屑相互作用，而不与靶蛋白质显著地相互作用。这种选择性使蛋白质保持在上清液中，并且随后易于与介质及条件介质中的其它组分分离。

再次参照图1，分离方法30包括将第一可溶性盐和第二可溶性盐引入介质中(步骤32)。介质可为如其中已经形成重组蛋白质的条件水溶液。第一可溶性盐包括第一阳离子，而第二可溶性盐包括第一阴离子。当接触时，第一阳离子和第一阴离子能在介质中相互作用，并可以开始形成不溶性的沉淀。可在任何时候调节该液体环境的pH或温度来使沉淀条件最佳化(例如：步骤34)然后孵育该溶液靶持续时间长度以允许该系统充分平衡(步骤36)。

通常可选择能在包含目的产物的液体中形成相对不溶的盐或复合物的任何阳离子(例如第一阳离子)/阴离子(例如第一阴离子)组合。在具体实施方式中，可以在相当于包含目的产物的液体的溶液中将这样的盐或复合物鉴定为不溶的、难溶的、实际上不溶的、极微溶的或微溶的。示例性阳离子/阴离子组合包括其中所选的阳离子(如第一阳离子，例如在以下反应式2中的M⁺)和所选的阴离子(如第一阴离子，例如在以下反应式2中的A^-)能形成相对不溶于水的盐或复合物(例如在以下反应式2中的MA)的那些组合：

其中“(s)”和向下指的箭头如针对反应式(1)进行的定义。在很多的情况中，将如The Merck Index或理化手册(Handbook of Physics andChemistry)或其它类似的参考文献中所述的水溶解度特征用作潜在性能的适宜指针。

在一些具体实施方式中，所选的阳离子和所选的阴离子能形成具有从大约1×10^-4M²到大约1×10^-50M²(如从大约1×10^-5M²到大约1×10^-50M²、从大约1×10^-6M²到大约1×10^-50M²、从大约1×10^-4M²到大约1×10^-40M²)的水溶度积常数(K_sp)的盐或复合物。在一些具体实施方式中，示例性的阳离子和阴离子可通过第一阳离子和第一阴离子之间([阳离子]x[阴离子])的溶度积常数(K_sp)小于例如大约10^-4M²，并优选小于大约10^-5M²或10^-6M²而鉴定。可在该方法中使用K_sp值小于10^-4M²的材料，因为这些材料当阳离子和阴离子混合时可产生该阳离子和阴离子各至多10mM的终溶液；加入超过10mM的阳离子或阴离子可导致沉淀及随后的絮凝。可使用Ksp值高于上列Ksp值的材料，但是，可能需要过量的阳离子和阴离子来形成固体。

阳离子(如第一阳离子)可为碱土金属、过渡金属或主族元素。这些元素可分为硬酸、边缘酸或软酸。第一阳离子的实例包括钙(Ca²⁺)、镁(Mg²⁺)、锶(Sr²⁺)、铝(Al³⁺)、铜(Cu(I)或Cu(II))、钪(Sc⁺³)、镧(La⁺³)、硅(Si⁴⁺)、钛(Ti(III)或Ti(IV))、钍、锆、锰(Mn(II)或Mn(III))、钴(Co(II)或Co(III))、铬(Cr(II)或Cr(III))、铁(Fe(II)或Fe(III))、镍(Ni²⁺)、锌(Zn²⁺)和钒(V(III)、V(IV)或V(V))。这些代表硬酸和边缘酸。第一阴离子可为原子类型或分子类型的。在一些具体实施方式中，第一阳离子可为Ca²⁺、Mg²⁺、Mn(II)、Co(II)或Ni²⁺。在某些具体实施方式中，第一阳离子可为Ca²⁺。

第一阴离子的实例包括是所用金属离子的优选配基的阴离子。就硬酸和边缘酸而言，阴离子可以包括氟离子、磷酸根、碳酸根、硅酸根、铬酸根、钨酸根、氢氧根、亚硫酸根、硝酸根、钼酸根、琥珀酸根、酒石酸根和柠檬酸根，以及在某种程度上硫酸根和高氯酸根(参见AquaticChemistry，编辑W.Stumm和JS Morgan，J Wiley(1981)，第343页；以及R.G.Pearson，J.Amer.Chem.Soc，第85卷，第3533页(1963))。在一些具体实施方式中，第一阴离子可以是磷酸根、亚硫酸根、碳酸根、氟离子、钼酸根或硅酸根。在某些具体实施方式中第一阴离子可为磷酸根。

在一些具体实施方式中，第一阳离子可为Ca²⁺，而第一阴离子可为磷酸根、亚硫酸根、碳酸根、氟离子、钼酸根或硅酸根。在某些具体实施方式中，第一阳离子可为Ca²⁺，而第一阴离子可为磷酸根。

在一些具体实施方式中，第一阳离子可为Mg²⁺、Mn(II)、Co(II)或Ni²⁺，而第一阴离子可为磷酸根、碳酸根或氟离子。

第一阳离子和第一阴离子的各自初始浓度(即引入介质的第一阳离子和第一阴离子(在沉淀开始之前)的浓度)可为大约2毫摩尔到大约200毫摩尔(例如从大约3毫摩尔到大约200毫摩尔、从大约4毫摩尔到大约200毫摩尔、从大约5毫摩尔到大约200毫摩尔、从大约4毫摩尔到大约100毫摩尔、从大约4毫摩尔到大约50毫摩尔、从大约4毫摩尔到大约40毫摩尔、从大约4毫摩尔到大约30毫摩尔、从大约4毫摩尔到大约10毫摩尔、从大约10毫摩尔到大约80毫摩尔、从大约10毫摩尔到大约40毫摩尔、从大约10毫摩尔到大约30毫摩尔、从大约20毫摩尔到大约80毫摩尔、从大约20毫摩尔到大约40毫摩尔，例如大约4毫摩尔、大约6毫摩尔、大约10毫摩尔、大约13.3毫摩尔、大约16毫摩尔、大约20毫摩尔、大约24毫摩尔、大约30毫摩尔、大约33.3毫摩尔、大约40毫摩尔、大约50毫摩尔或大约80毫摩尔)，这取决于最终复合物的溶解度。在某些具体实施方式中，引入介质的第一阳离子的浓度(在沉淀开始之前)可为大约6毫摩尔、大约10毫摩尔、大约20毫摩尔、大约24毫摩尔、大约30毫摩尔、大约40毫摩尔、大约50毫摩尔或大约80毫摩尔。在某些具体实施方式中，引入介质的第一阴离子的浓度(在沉淀开始之前)可为4毫摩尔、大约10毫摩尔、大约13.3毫摩尔、大约16毫摩尔、大约20毫摩尔、大约24毫摩尔、大约30毫摩尔、大约40毫摩尔、大约50毫摩尔或大约80毫摩尔。例如，引入介质的第一阳离子的浓度(在沉淀开始之前)可为大约30毫摩尔，而引入介质的第一阴离子的浓度(在沉淀开始之前)可为大约20毫摩尔。作为另一个实例，引入介质的第一阳离子的浓度(在沉淀开始之前)可为大约24毫摩尔，而引入介质的第一阴离子的浓度(在沉淀开始之前)可为大约16毫摩尔。

在一些具体实施方式中，第一阳离子和第一阴离子的上述初始浓度的乘积可为从大约4×10^-6M²到大约4×10^-2M²(如从大约1.6×10^-5M²到大约4×10^-2M²、从大约2.5×10^-5M²到大约4×10^-2M²、从大约1.6×10^-5M²到大约6.4×10^-3M²或从大约2.5×10^-5M²到大约6.4×10^-3M²)。在一些具体实施方式中，第一阳离子和第一阴离子的上述初始浓度的乘积可大于大约1×10^-5M²、大于大约2×10^-5M²、大于大约1×10^-4M²、大于大约2×10^-4M²、大于大约10×10^-4M²或大于大约2.7×10^-2M²。在一些具体实施方式中，这些浓度可导致不溶性盐连同杂质的显著沉淀。过高的浓度可导致大于约10％的总液体体积的固体体积。浓度超过500mM、具有低溶解度常数的阳离子或阴离子可导致大的固体体积。利用标准的固液分离技术可能难以从大的固体体积中实现充足的产物回收。沉淀物的实例包括磷酸钙、亚硫酸钙、碳酸钙、氟化钙、硅酸钙、钼酸钙、碳酸镁、磷酸镁、氟化镁、磷酸锰、碳酸锰、磷酸钴、磷酸镍和碳酸镍。

在一些具体实施方式中，在液体介质中最终盐或复合物(如在反应式(1)中的1，即包括阳离子-阴离子盐或复合物和与其结合的杂质的不溶性沉淀物)的K_sp可从大约1×10^-4M²到大约1×10^-50M²(如从大约1×10^-5M²到大约1×10^-50M²、从大约1×10^-6M²到大约1×10^-50M²、从大约1×10^-4M²到大约1×10^-40M²)。在一些具体实施方式中，在液体介质中最终盐或复合物的K_sp可小于大约10^-4M²，例如并且优选地小于大约10^-5M²或10^-6M²。例如，在表1的具有40mM钙和20mM磷酸根的抗IL13#2样品中，离心后(即沉淀后)的上清液包含8.19mM钙和1.04mM磷酸根。该水平的可溶性钙和磷酸根相当于8.5×10^-6M²的K_sp。在表1的具有80mM钙和20mM磷酸根的抗AB#1样品中，离心后的上清液包含22.2mM钙和0.4mM磷酸根。该水平的可溶性钙和磷酸根相当于8.4×10^-6M²的K_sp。

在一些具体实施方式中，最终盐或复合物(如在反应式(1)中的1)在液体介质中的K_sp可不同于(如大于)该阳离子-阴离子盐或复合物自身(即不结合杂质，如在反应式(2)中的2)在水中的K_sp。例如，参照反应式(1)和(2)，例如，1(如MA＝磷酸钙)在液体中的K_sp可不同于(如大于)磷酸钙自身(如在反应式(2)中的2，其中MA＝磷酸钙)在水中的K_sp。

可实施形成沉淀的其它实施方式。例如，可基本上同时或相继地将第一阳离子和第一阴离子引入介质。在第一阳离子是钙而第一阴离子是亚硫酸根的实施方式中，在向介质引入钙之前向介质引入亚硫酸根可以增加杂质的沉淀(实施例2)。第一阳离子和第一阴离子的浓度可基本上相同或不同(富阳离子的或富阴离子的)。例如，一种离子的浓度可以比另一种离子的浓度高约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍或约5倍。在一些实施方式中，将一种以上的阳离子和/或一种以上的阴离子引入介质中。阳离子的总浓度可从大约5毫摩尔到大约200毫摩尔，而阴离子的总浓度也可如此。当使用聚合物溶液时，浓度(以mM表示)基于聚合物的分子量可能实质上较低；该浓度相反地可能取决于单体分子量。在其它的实施方式中，将仅仅一种或多种阳离子或仅仅一种或多种阴离子引入介质。例如，当包含蛋白质的介质已经包括能形成沉淀的阴离子或阳离子时，则可相应地加入适当的阳离子或阴离子来形成沉淀。或者，可加入离子以与已处于介质中的离子反应来形成第一沉淀，并且可向介质中加入额外的阳离子/阴离子组合来形成其它沉淀。

如图1所示，该方法可任选地包括将介质滴定到适当的pH和/或调节温度(步骤34)。

在一些具体实施方式中，可将介质的pH调节到预先确定的pH来增加沉淀(步骤34)。可例如通过用碱(如NaOH)或酸(如磷酸或盐酸)滴定来增加或降低介质的pH。预先确定的pH可由如介质中的阳离子和阴离子、介质中的其它物质和/或介质的组成来决定。预先确定的pH的范围可从大约5到大约9，例如从大约6.5到大约9。

在其它的具体实施方式中，不调节介质的pH。

在一些具体实施方式中，可加热或冷却介质来优化性能(步骤34)。如同调节pH一样，加热或温育介质的温度和时间可由如介质中的阳离子和阴离子、介质中的其它物质和/或介质的组成而定。

可将介质在室温下温育或加热到如大约37℃。温育期或加热期(步骤36)可为大约一个小时到大约十二个小时。当温育或加热介质时，介质可以进行混合(如在低速下以减少对物质的剪切)，或可以在初始的一段时间混合介质之后容许其静置以便沉淀物可以发生沉降，这使得包含蛋白质的上清液易于分离。

在其它的具体实施方式中，例如若沉淀足以提供良好的分离，则不加热介质。

然后，离心介质(步骤38)来帮助从上清液中分离沉淀，这减低了上清液的混浊度。可用清除固体的其它方法，如深层过滤或微量过滤。如以下实施例中所述，介质的混浊度相对于其中不发生絮凝的未处理的对照溶液可降低至少大约30％。在一些实施方式中，介质的混浊度降低至少大约50％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约98％或更高。如本文所用的，根据标准程序利用浊度仪(如HACH，Loveland公司所生产的)来测定混浊度。

在如通过离心实施初级澄清之后，可以通过使用过滤来清除其它的碎屑(步骤38)。如下列实施例所述，本文所述的分离方法可提供高产率，蛋白质回收率至少大约50％(如至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％或至少大约90％)。如本文所用，按靶蛋白质在处理后的合并液中的质量与在处理前合并液中的质量的比率来计算回收率。产物的质量为靶蛋白质浓度和体积的乘积，其中浓度可由各种方法确定，如高效液相色谱分析。就靶蛋白质为抗体而言，常常可利用基于蛋白质A的分析方法来确定浓度。属于生物制药学上的细胞培养、纯化或蛋白质表征方法学领域的技术人员可鉴定适宜的测定方法。

随后可根据惯常方法纯化蛋白质。

蛋白质或多肽

本发明涉及从液体中分离蛋白质，如可溶性或分泌性蛋白质。本文所用的术语“蛋白质”指可作为一个单位起作用的一个或多个多肽。本文所用的术语“多肽”指经由肽键连接在一起的氨基酸的连续链。术语“多肽”用来指任何长度的氨基酸链，但是本领域技术人员将理解该术语不局限于长链，也可指包含两个经由肽键连接在一起的氨基酸的最小链。如果单一一个多肽可作为一个单位起作用的话，则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。

在某些具体实施方式中，重组产生蛋白质。如本文所用的术语“重组表达的蛋白质”和“重组蛋白质”指由宿主细胞表达的多肽，其中所述宿主细胞已经经过人工操作而表达该多肽。在某些具体实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些具体实施方式中，该操作可包括一种或多种遗传修饰。例如，可通过导入一个或多个编码要表达的多肽的异源基因来对宿主细胞进行遗传修饰。异源重组表达的多肽可与通常在宿主细胞中表达的多肽相同或相似。异源重组表达的多肽还可以对宿主细胞而言是外来的，例如与通常在宿主细胞中表达的多肽不同。在某些具体实施方式中，异源重组表达多肽是嵌合的。例如：多肽的一些部分可包含与通常在宿主细胞中表达的多肽相同或类似的氨基酸序列，而其它的部分包含对宿主细胞而言外来的氨基酸序列。另外或备选地，多肽可包含来自通常都在宿主细胞中表达的两种或两种以上不同多肽的氨基酸序列。此外，多肽可包含来自相对于宿主细胞而言外来的两种或两种以上不同多肽的氨基酸序列。在某些具体实施方式中，宿主细胞通过一种或多种内源基因的激活或上调来进行遗传修饰。

常常根据感兴趣或有用的生物学或化学活性来选择可能期望根据本发明分离的任何蛋白质。例如，可应用本发明来分离任何药学上或商业上相关的抗体、受体、细胞因子、生长因子、酶、凝血因子、激素、调节因子、抗原、结合剂等。可根据本发明分离的下列蛋白质在性质上仅是示例性的，并且不旨在构成限制。本领域技术人员将理解根据本发明可表达任何蛋白质，并且本领域技术人员能基于需要挑选特定的蛋白质来制备。

抗体和结合片段

抗体，亦称免疫球蛋白，一般是由两条各大约25kDa的轻(L)链和两条各大约50kDa的重(H)链组成的四聚体糖基化蛋白质。可在抗体中找到两种轻链，称为λ和κ。根据重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为五个主要类型：A、D、E、G和M，并且这些中的一些可进一步分为亚类(同种型，isotype)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。每条轻链包括一个N末端可变(V)结构域(VL)和一个恒定(C)结构域(CL)。每条重链包括一个N末端V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH)和一个铰链区。将最接近VH的CH结构域指定为CH1。VH和VL结构域由称为构架区的具有相对保守序列的四个区域(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，这些构架区形成了三个具有超变序列的区域(互补决定区，CDR)的支架。CDR包含大部分负责抗体与抗原特异性相互作用的残基。CDR被称作CDR1、CDR2和CDR3。相应地，在重链上的CDR组分被称作H1、H2和H3，而在轻链上的CDR组分被称作L1、L2和L3。CDR3一般是抗体结合位点中分子多样性的最大来源。例如，H3可短至两个氨基酸残基，或大于26个氨基酸。在本领域中已知不同类型的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型。就抗体结构的综述而言，参见：抗体：实验室指南(Antibodies：ALaboratory Manual)，冷泉港实验室，编辑，Harlow等人，1988。本领域技术人员明了每个亚单位结构，例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构，都包含活性片段，如VH、VL或CDR亚单位中结合抗原的部分，即：抗原结合片段，或如CH亚单位中结合和/或活化如Fc受体和/或补体的部分。CDR一般指Kabat CDR，如“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，US Department of Health and Human Services(1991)，编辑，Kabat等人所述的。表征抗原结合位点的另一个标准是由Chothia所述的超变环。参见，例如Chothia，D.等人(1992)，J.Mol.Biol.227：799-817；以及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638。又一个标准是OxfordMolecular的AbM抗体模建软件所用的AbM定义。一般参见，例如，Antibody Engineering Lab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，海德堡)中的Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains。利用根据Chothia超变环或AbM定义的环所描述的类似关系，可以采用替代手段实施就Kabat CDR所描述的具体实施方式。

如本文所用的，术语“抗体”包括含有至少一个并且一般两个VH结构域或其部分，和/或至少一个并且一般两个VL结构域或其部分的蛋白质。在一个具体实施方式中，抗体是两条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链与轻链通过如二硫键互相连接，可从任何来源中获得抗体或其部分，包括但不限于啮齿类动物、灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物)、camelid(例如骆驼或美洲驼)，以及重组产生的，例如嵌合的、人源化的和/或体外产生的，本文中将对此作更详细描述。

包含在术语抗体的“抗原结合片段”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含在绞链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体一条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；(vi)camelid或camelid化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)；以及(viii)双特异性抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由分开的基因编码的，但是可利用重组方法由合成的接头将其相连，从而使其形成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成一价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见，例如：Bird等人(1988)Science 242：423-26；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci美国85：5879-83)。这样的单链抗体也旨在包含在术语抗体的“抗原结合片段”之内。利用本领域技术人员已知的常规技术可以获得这些片段，并且用和完整抗体相同的方法可以评价这些片段的功能。

抗原结合片段可任选地包括增强如稳定性、效应细胞功能或补体固定中的一个或多个性质的部分。例如，抗原结合片段可包括聚乙二醇化部分、白蛋白或重和/或轻链恒定区(或其部分)。

除了“双特异性”或“双功能性”抗体以外，抗体应理解为其每一个结合位点都是相同的。“双特异性”或“双功能抗体”或其抗原结合片段是具有两个不同的抗原结合位点的人造杂种抗体或其片段。可通过各种方法制备双特异性抗体或其抗原结合片段，包括杂交瘤融合、Fab′片段连接或重组。参见，例如，Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。

本领域技术人员已知的很多方法可用于获得抗体或其抗原结合片段。例如，可根据已知方法通过制备杂交瘤来产生单克隆抗体。然后利用标准方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(Surfaceplasmon resonance，Biacore^TM)分析来筛选用这样的方式产生的杂交瘤，从而鉴定产生与指定的抗原特异性结合的抗体的一个或多个杂交瘤。所述指定的抗原的任何形式都可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段、以及其抗原肽。

制备抗体的一个示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示在例如Ladner等人，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690和WO 90/02809中描述。

除了利用展示文库之外，也可以用指定的抗原免疫非人动物，如啮齿类动物，例如小鼠、仓鼠或大鼠。在一个具体实施方式中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可用人Ig座位的大片段改造小鼠抗体生产缺陷型小鼠品系。利用杂交瘤技术，可生产和选择源于具有所要特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSE^TM，Green等人(1994)Nature Genetics 7：13-21，US 2003-0070185，WO96/34096，1996年10月31日公开，以及1996年4月29日提交的PCT申请号PCT/US96/05928。

在另一个具体实施方式中，从非人动物中获得单克隆抗体，然后可利用本领域已知的重组DNA技术制备修饰的，如人源化的、去免疫的，嵌合体。已经描述了用于制备嵌合抗体的各种途径。参见，例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国81：6851，1985；Takeda等人，Nature 314：452，1985，Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Boss等人，美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494，英国专利GB 2177096B。还可，例如，利用表达人重和轻链基因、但不能表达内源的小鼠免疫球蛋白重和轻链基因的转基因小鼠，生产人源化抗体。Winter描述了一种示例性CDR嫁接方法，该方法可用于制备本文所述的人源化抗体(美国专利号5,225,539)。可将特定人类抗体的全部CDR各自用至少一部分非人CDR替换，或可将仅仅一些CDR替换为非人CDR。唯一的要求是进行替换的CDR数目是对于人源化抗体与预先确定的抗原的结合而言所必需的CDR数目。

可通过将不直接涉及抗原结合的Fv可变结构域序列替换成来自人Fv可变结构域的等价序列，以产生人源化抗体或其片段。Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；以及US5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205和US 6,407,213提供了产生人源化抗体或其片段的示例性方法。那些方法包括分离、操作和表达编码来自重或轻链中的至少一个的免疫球蛋白Fv可变结构域之全部或部分的核酸序列。这样的核酸可从产生抗预定靶的抗体的杂交瘤(见上述)中获得，以及从其它来源获得。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆入适当的表达载体中。

在某些具体实施方式中，通过引入保守性替代、共有序列替代、胚系替代(germline substitution)和/或回复突变来优化人源化抗体。可通过本领域已知的几种技术来制备这样改变的免疫球蛋白分子(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，80：7308-7312，1983；Kozbor等人，ImmunologyToday，4：7279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol，92：3-16，1982)，并可根据PCT公开WO 92/06193或EP 0239400的教导来制备。

还可用在WO 98/52976和WO 00/34317中公开的方法通过人T细胞表位的特异性缺失或“去免疫”来修饰抗体或其片段。简短来说，可分析抗体重和轻链可变结构域中能结合MHC II类分子的肽，这些肽是潜在的T-细胞表位(如在WO 98/52976和WO 00/34317中所定义的)。为了检测潜在的T-细胞表位，如WO 98/52976和WO 00/34317所述，可以应用称为“肽穿线(peptide threading)”的计算机模拟方法，并且另外地可检索人MHC II类分子结合肽数据库找出存在于VH和VL序列中的基序。这些基序可能与18种主要的MHC II类DR同种异型中的任一种结合，并且因此构成潜在的T细胞表位。可通过在可变结构域中置换小量的氨基酸残基，或优选通过单个的氨基酸置换来消除检测到的潜在T-细胞表位。一般进行保守置换。常常，但不是唯一地，可以使用在人胚系抗体序列中的位置上共有的氨基酸。人胚系序列公开在例如Tomlinson等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook，G.P.等人(1995)Immunol.Today第16卷(5)：237-242；Chothia，D.等人(1992)J.MoI Biol.227：799-817；以及Tomlinson等人(1995)EMBOJ.14：4628-4638。V BASE目录提供了一个全面的人免疫球蛋白可变区序列目录(Tomlinson，LA.等人汇编，MRC Centre for Protein Engineering，剑桥，英国)。这些序列可以作为人序列的来源，例如用于构架区和CDR。如US 6,300,064所述，也可以使用共有人构架区。

在某些具体实施方式中，抗体可包含改变的免疫球蛋白恒定或Fc区。例如，根据本文教导所制备的抗体可更强烈或更有特异性地与效应分子如补体和/或Fc受体结合，这可控制抗体的一些免疫功能如效应细胞活性、裂解、补体介导的活性、抗体清除和抗体半衰期。典型的结合抗体(如IgG抗体)的Fc区的Fc受体包括，但不限于FcγRI、FcγRII和FcγRIII以及FcRn亚类的受体，包含这些受体的等位变体和可变拼接形式。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92，1991；Capel等人，Immunomethods4：25-34，1994以及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41，1995中综述了Fc受体。

可用本发明的方法分离的抗体的非限制性实例包括但不限于，抗Aβ、IL-13、IL-22、GDF8和5T4的抗体。在下文和后附的实施例中更详细地描述了所有这些抗体。

抗Aβ抗体

如后附的实施例所述，可用本发明的方法分离抗AB抗体。术语“AB抗体”、“Aβ抗体”、“抗Aβ抗体”和“抗Aβ”在本文中可交换使用来指与APP、Aβ蛋白质或两者的一个或多个表位或抗原决定簇结合的抗体。可在人淀粉样前体蛋白质(APP)中发现示例性的表位或抗原决定簇，但优选在APP的Aβ肽内发现的示例性的表位或抗原决定簇。存在多种APP同种型，例如APP⁶⁹⁵、APP⁷⁵¹和APP⁷⁷⁰。根据APP⁷⁷⁰同种型的序列将APP内的氨基酸编号(参见例如，GenBank登录号P05067)。Aβ(本文也称β淀粉样肽和Aβ)肽是具有39-43个氨基酸的～4kDa的APP内部片段(Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43)。例如，Aβ40由APP的672-711残基组成，而Aβ42由APP的672-713残基组成。作为APP在体内或原位被不同的分泌酶蛋白质水解加工的结果，发现“短形式”，长度40个氨基酸，和“长形式”，长度42-43个氨基酸，的Aβ。表位和抗原决定簇可位于Aβ肽的N-末端之内，并且包括位于Aβ的氨基酸1-10之内的残基(优选来自Aβ42的残基1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-7、3-6或3-7)，或位于Aβ的残基2-4、5、6、7或8、Aβ的残基3-5、6、7、8或9、或Aβ42的残基4-7、8、9或10之内的残基。“中心”表位或抗原决定簇位于Aβ肽的中心或中部，并且包括位于Aβ的氨基酸16-24、16-23、16-22、16-21、19-21、19-22、19-23或19-24之内的残基。“C-末端”表位或抗原决定簇位于Aβ肽的C-末端之内，并且包括位于Aβ的氨基酸33-40、33-41或33-42之内的残基。

在各种具体实施方式中，Aβ抗体是末端特异性的。如本文所用，术语“末端特异性”指能与Aβ肽的N-末端或C-末端残基特异性结合，但当该残基存在于包含其的更长Aβ中时或存在于APP中时不识别该相同的残基的抗体。

在多种具体实施方式中，Aβ抗体是“C末端特异性的”。如本文所用，术语″C-末端-特异性的″指抗体特异性地识别Aβ肽的游离C-末端。C-末端-特异性的Aβ抗体的实例包括以下抗体：识别终止于残基40的Aβ肽，但不识别终止于残基41、42和/或43的Aβ肽的抗体；识别终止于残基42的Aβ肽，但不识别终止于残基40、41和/或43的Aβ肽的抗体等。

在一个具体实施方式中，抗体可为3D6抗体或其变体，或10D5抗体或其变体，这两种抗体都在美国专利公开号2003/0165496A1、美国专利公开号2004/0087777A1、国际专利公开号WO 02/46237A3中加以描述。有关3D6和10D5的描述也可参见例如国际专利公开号WO 02/088306A2和国际专利公开号WO 02/088307A2。3D6是与位于人β-淀粉样肽中的N-末端表位，具体地说，残基1-5，特异性结合的单克隆抗体(mAb)。而10D5是与位于人β-淀粉样肽中的N-末端表位，具体地说，残基3-6，特异性结合的mAb。在另一个具体实施方式中，抗体可为如美国专利公开号20040082762A1和国际专利公开号WO03/077858A2所述的12B4抗体或其变体。12B4是与位于人β-淀粉样肽中的N-末端表位(具体地说，残基3-7)特异性结合的mAb。在又一个具体实施方式中，抗体可为如美国专利申请号10/858,855和国际专利申请号PCT/US04/17514所述的12A11抗体或其变体。12A11是与位于人β-淀粉样肽中的N-末端表位(具体地说，残基3-7)特异性结合的mAb。在又一个具体实施方式中，抗体可为如美国专利申请号10/789,273和国际专利申请号WO01/62801A2所述的266抗体。设计与位于人β-淀粉样肽中的C-末端表位特异性结合的、可用于本发明的抗体包括，但不限于369.2B，其如美国专利号5,786,160所述。

在示例性的具体实施方式中，抗体是选择性地结合Aβ肽的人源化抗Aβ肽3D6抗体。更特别地，对人源化抗Aβ肽3D6抗体进行设计以使其特异性地与位于人β-淀粉样1-40或1-42肽中的NH2末端表位结合，所述人β-淀粉样1-40或1-42肽发现于(如在患阿尔茨海默氏病的患者)脑的斑块沉积物中。

抗AB抗体可用于治疗促淀粉样变疾病(amyloidogenic disease)，尤其是阿尔茨海默氏病。术语“促淀粉样变疾病”包括与不溶性淀粉样纤维的形成或沉淀有关(或起因于不溶性淀粉样纤维的形成或沉淀)的任何疾病。示例性的促淀粉样变疾病包括，但不限于，系统性淀粉样变病、阿尔茨海默氏病、成年发病型糖尿病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、额颞叶痴呆和朊病毒相关的传染性海绵状脑病(在人中为kuru病和Creutzfeldt-Jacob病以及在羊和牛中分别为羊搔痒症(scrapie)和BSE)。由沉积的纤维中的多肽组分的性质来定义或表征不同的促淀粉变样疾病。例如，在患有阿尔茨海默氏病的对象或患者中，β-淀粉样蛋白质(如野生型、变体或截短的β-淀粉样蛋白质)是该淀粉样沉积物的特征性多肽组分。因此，阿尔茨海默氏病是在如对象或患者的脑中发生的“以Aβ沉积为特征的疾病”或“与Aβ沉积有关的疾病”的实例。本文中术语“β-淀粉样蛋白质”、“β-淀粉样肽”、“β-淀粉样”、“Aβ”和“Aβ肽”可互换使用。

抗5T4抗体

以前已表征了5T4抗原(参见例如WO 89/07947)。已知人5T4的全长核酸序列(Myers等人(1994)J Biol Chem 169：9319-24和GenBank登录号Z29083)。还已知来自其它物种的5T4抗原序列，如鼠的5T4(WO00/29428)、犬的5T4(WO 01/36486)或猫的5T4(US 05/0100958)。

人5T4是在肿瘤中广泛表达的大约72kDa的糖蛋白质，其在正常成人组织中具有高度局限的表达模式。其似乎与结肠直肠癌和胃癌的转移强烈相关。还发现在乳房癌和卵巢癌中5T4抗原高频率表达(Starzynska等人(1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10：479-84；Starzynska等人(1994)Br.J.Cancer 69：899-902；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer 66：867-9)。已提出将5T4作为肿瘤发展和转移潜力的标志(存在可能的机理上的牵连)(Carsberg等人(1996)Int J Cancer 68：84-92)。还提出将5T4用作免疫治疗试剂(参见WO 00/29428)。在如US05/0100958中公开了5T4的抗原肽，其内容并入作为参考。

一些待决的申请一般性地涉及编码抗5T4单克隆抗体的核酸、载体和其宿主细胞，例如美国申请公开号2003/0018004和2005/0032216。已经提交了一般性地涉及人源化抗5T4H8单克隆抗体和其与加利车霉素(calicheamicin)的缀合物，以及利用这些加利车霉素缀合物进行治疗的方法的临时专利申请(美国申请公开号2006/0088522)。所有这些申请的全部内容并入此处作为参考。

抗IL13抗体

另一个可用本发明的方法分离的示例性抗体是抗IL-13抗体。白细胞介素-13(IL-13)是先前已经表征过的由T淋巴细胞和肥大细胞分泌的细胞因子(McKenzie等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.美国90：3735-39；Bost等人(1996)Immunology 87：663-41)。术语“IL-13”指白细胞介素-13，包括IL-13的全长未加工的前体形式，以及由翻译后裂解引起的成熟形式。该术语还指保持至少一些与成熟IL-13有关的生物学活性的、IL-13的任何片段和变体，包括已经被改变(如重组改变)的序列。术语“IL-13”包括人IL-13，以及其它的脊椎动物IL-13。一些待决申请公开了抗人和猴IL-13的抗体、IL-13肽、产生其的载体和宿主细胞，如美国申请公开号2006/0063228A和2006/0073148。所有这些出版物的内容以全文并入本文作为参考。

IL-13与IL-4共有一些生物学活性。例如，IL-4或IL-13可在B细胞中导致IgE同种型转换(Tomkinson等人(2001)J.Immunol.166：5792-5800)。另外，已经报道了在哮喘患者中细胞表面CD23和血清CD23(sCD23)的水平增加(Sanchez-Guererro等人(1994)Allergy 49：587-92；DiLorenzo等人(1999)Allergy Asthma Proc.20：119-25)。另外，IL-4或IL-13可上调MHC II类分子和低亲合性IgE受体(CD23)在B细胞和单核细胞上的表达，其导致增强的抗原呈递和受调控的巨噬细胞功能(Tomkinson等人，同上引文)。这些观察结果说明IL-13可能在呼吸道嗜曙红细胞增多和呼吸道高反应性(AHR)的发展中起重要的作用(Tomkinson等人，同上引文；Wills-Karp等人(1998)Science 282：2258-61)。因此，IL-13的抑制可用于一些炎性和/或过敏性状况的病状改善，所述的炎性和/或过敏性状况包括但不限于呼吸道疾病，例如哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；涉及呼吸道发炎、嗜曙红细胞增多、纤维化和过量粘液产生的其它状况，如囊性纤维化和肺纤维化；特应性病症，如特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎；皮肤(如特应性皮炎)、胃肠器官(如炎性肠病(IBD)，例如溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病)、肝(如肝硬化、肝细胞癌)的炎症和/或自身免疫症；硬皮病；肿瘤或癌(如软组织或实体肿瘤)，如白血病、成胶质细胞瘤和淋巴瘤，例如霍杰金氏淋巴瘤；病毒感染(如HTLV-1)；其它器官的纤维化，如肝的纤维化(如由乙型和/或丙型肝炎病毒所引起的纤维化)。

抗IL22抗体

另一个可用本发明的方法分离的示例性抗体是抗IL-22抗体。白细胞介素-22(IL-22)是以前已表征过的显示出与IL-10序列同源的II类细胞因子。其表达在T细胞中被IL-9或ConA上调(Dumoutier L.等人(2000)Proc NatlAcad Sci美国97(18)：10144-9)。研究显示IL-22mRNA的表达在体内响应于LPS给药而被诱导，而且IL-22调节指示急性期应答的参数(Dumoutier L.等人(2000)同上引文；Pittman D.等人(2001)Genes andImmunity 2：172)，并且利用中和抗IL-22抗体来降低IL-22的活性可以改善小鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)模型的炎症症状。因此，IL-22拮抗剂，如抗IL-22中和抗体和其片段，可用于诱导体内免疫抑制，如用于治疗自身免疫病(如关节炎病症，例如类风湿性关节炎)；呼吸道疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；例如皮肤(如牛皮癣)、心血管系统(如动脉粥样硬化)、神经系统(如阿尔茨海默氏病)、肾(如肾炎)、肝(如肝炎)和胰腺(如胰腺炎)的炎症。

术语“IL-22”指白细胞介素-22，包括IL-22的全长未加工的前体形式，以及由翻译后裂解引起的成熟形式。该术语还指保持至少一些与成熟IL-22有关的生物学活性的、IL-22的任何片段和变体，包括已经修饰的序列。术语“IL-22”包括人IL-22，以及其它的脊椎动物IL-22。在如美国申请公开号2005-0042220和2005-0158760，以及美国专利号6,939,545中公开了人和啮齿类动物IL-22的氨基酸和核苷酸序列，以及抗IL-22的抗体。所有这些出版物的内容以其全文并入本文作为参考。

抗GDF8抗体

可用本发明的方法分离的又一个示例性抗体是抗GDF8抗体。生长分化因子-8(GDF-8)，亦称肌肉生长抑制素(myostatin)，是分泌性蛋白质，并且是具有结构上相关的生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，所述这些生长因子都具有生理学上重要的生长调节和形态发生性质(Kingsley等人(1994)Genes Dev.，8：133-146；Hoodless等人(1998)Curr.Topics Microbiol.Immunol.，228：235-272)。类似于TGF-β，合成的人GDF-8是375个氨基酸长的前体蛋白质。前体GDF-8蛋白质形成同型二聚体。在加工期间，在Arg-266处裂解除去氨基末端前肽。裂解下来的前肽，被称为“潜伏相关肽”(latency-associated peptide，LAP)可保持与同型二聚体非共价结合，从而使该复合物失活(Miyazono等人(1988)J.Biol Chem.263：6407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.263：7646-7654；Brown等人(1990)Growth Factors，3：35-43；以及Thies等人(2001)Growth Factors，18：251-259)。成熟GDF-8与前肽的复合物通常称为“小的潜伏复合物”(Gentry等人(1990)Biochemistry，29：6851-6857；Derynck等人(1995)Nature，316：701-705；以及Massague(1990)Ann.Rev.CellBiol，12：597-641)。还已知其它的蛋白质与成熟的GDF-8结合并抑制其生物学活性。这样的抑制性蛋白质包括促滤泡素抑制素和促滤泡素抑制素相关蛋白(Gamer等人(1999)Dev.Biol，208：222-232)。

术语“GDF-8”指生长分化因子-8，以及如果适当的话，结构上或功能上与GDF-8相关的因子，例如属于TGF-β超家族的BMP-11及其它因子。该术语指GDF-8的全长未加工的前体形式，以及由翻译后裂解引起的成熟形式和前肽形式。该术语还指保持至少一些与成熟GDF-8有关的生物学活性的、GDF-8的任何片段和变体，包括已经修饰的序列。在例如US2004-0142382，US 2002-0157125，以及McPherron等人(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.美国，94：12457-12461中公开了人GDF-8，以及很多其它的脊椎动物GDF-8(包括鼠、狒狒、牛、鸡)的氨基酸序列；所有这些文献以全文并入本文作为参考。在如US2004-0142382中公开了抗GDF-8的中和抗体的实例，并且这些实例可用于治疗或预防其中想要增加肌肉组织或骨密度的病况。示例性的疾病和病症包括肌肉和神经肌肉失调如肌营养不良(包括Duchenne氏肌营养不良)；肌萎缩性侧索硬化；肌肉萎缩；器官萎缩；虚弱(frailty)；tunnel syndrome；充血性阻塞性肺疾病；sarcopenia、恶病质及其它肌消耗性综合征；脂肪组织病症(如肥胖)；2型糖尿病；葡萄糖耐量受损；代谢综合症(如X综合症)；由创伤如烧伤或氮失调诱导的胰岛素抵抗；以及骨退行性疾病(如骨关节炎和骨质疏松症)。

可溶性受体和受体融合物

在某些具体实施方式中，用本发明的方法分离的蛋白质可为可溶性受体或其片段。可溶性受体的实例包括受体的胞外结构域，如可溶性肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；1991年3月20日公开的EP417,563；TNFR-2，1991年3月20日公开的EP417,014；以及在Naismith和Sprang，J Inflamm.47(1-2)：1-7，1995-96中的综述，所有文献以全文并入本文作为参考)。在其它的具体实施方式中，可溶性受体包括在如US2003-0108549中所述的白细胞介素-21受体(IL-21R)的胞外结构域(所述US2003-0108549的内容也并入作为参考)。

在其它的具体实施方式中，将本发明的方法用于分离可溶性受体融合物。融合蛋白质可包括寻靶部分，如可溶性受体片段或配体，以及各种同种型(包括：IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgM、IgA₁、IgA₂、IgD和IgE)的免疫球蛋白链、Fc片段、重链恒定区。例如，融合蛋白质可包括受体的细胞外结构域，以及，如与之融合的，人免疫球蛋白Fc链(如人IgG，例如人IgG₁或人IgG₄或其突变形式)。在一个具体实施方式中，人Fc序列已自野生型序列在一个或多个氨基酸上发生突变，如在残基254和257上突变来减少Fc受体的结合。融合蛋白质还可以包括将第一部分与第二部分，如免疫球蛋白片段连结在一起的接头序列。例如，融合蛋白质可包括肽接头，如长度大约4到20、更优选5到10个氨基酸的肽接头；肽接头长度可以是8个氨基酸。例如，融合蛋白质可包括具有分子式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y的肽接头，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。在其它的具体实施方式中，将额外的氨基酸序列加入融合蛋白质的N-或C-末端以利于表达、空间柔性、检测和/或分离或纯化。

在某些具体实施方式中，可溶性受体融合物包含可溶性TNFR-Ig(如TNF受体，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物的可溶性片段，如75kdTNFR-IgG，例如融合到人IgG₁的Fc部分上的75kD TNF受体)。

可用标准的重组DNA技术来制备本发明的嵌合或融合蛋白质。例如，根据常规方法将编码不同多肽序列的DNA片段在读框中彼此连接在一起，如使用平末端或交错末端用于连接，限制性酶消化来提供适当的末端，根据情况填平粘性末端，碱性磷酸酶处理来避免不需要的连接，以及酶催化连接。在另一个具体实施方式中，可用包括自动化DNA合成仪在内的常规方法合成融合基因。或者，可利用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述的锚定引物导致在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，所述的基因片段可随后退火和再扩增来产生嵌合基因序列(参见，例如Ausubel等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，1992)。另外，很多表达载体是编码融合部分(如免疫球蛋白重链的Fc区)的市售可得的载体。免疫球蛋白融合多肽在本领域中是已知的，并且在如美国专利号5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147以及5,455,165中有描述。

生长因子和细胞因子

已经证明是有效的药物和/或商业试剂并且可能期望根据本发明的教导制备的另一类多肽包括生长因子及其它信号分子，如细胞因子。

生长因子一般是由细胞分泌的糖蛋白质，其与其它细胞上的受体结合并活化该受体，从而起始在受体细胞中的代谢或发育变化。哺乳动物生长因子及其它信号分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)如aFGF和bFGF；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(l-3)-IGF-I(脑IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白质；CD蛋白质如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导生长因子(Osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形态发生蛋白质(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(TL)，如IL-1到IL-13(例如IL-11)；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和Von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶，造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(正常T-细胞表达和分泌的调节活化因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；mullerian抑制物；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β。本领域的普通技术人员将意识到可根据本发明的方法和组合物表达的其它生长因子或信号分子。

已经证实生长因子或其它信号分子的糖基化模式的特异性改变对于其治疗特性具有巨大的影响。作为一个实例，治疗患慢性贫血的病人的通用方法是给他们频繁注射重组人促红细胞生成素(rHuEPO)以便提高其红血细胞的产生。已经开发出一种rHuEPO的类似物，darbepoetin α(Aranesp

)，其具有比正常rHuEPO长的持续时间。在darbepoetin α和rHuEPO之间的主要区别是两个额外的含唾液酸的N-连接寡糖链的存在。利用体外糖工程已经完成了darbepoetin α的产生(参见Elliott等人，NatureBiotechnology 21(4)：414-21，2003，以其全文并入本文作为参考)。Elliott等人使用体外诱变将额外的糖基化作用位点插入rHuEPO多肽主链，导致darbepoetin α类似物的表达。该额外的寡糖链位于EPO受体结合位点的远侧，并且显然不妨碍受体结合。但是，darbepoetin α的半衰期比rHuEPO高了多达三倍，产生了有效得多的治疗剂。

凝血因子

已经证明凝血因子作为药物和/或商业试剂是有效的。乙型血友病是患者的血液不能凝结的病症。因此，任何导致流血的小创伤都是潜在危急生命的事件。例如，凝血因子IX(因子IX或“FIX”)是单链糖蛋白质，其缺乏导致乙型血友病。FIX以可单链酶原形式合成，该形式通过活化肽的释放而被活化成双链丝氨酸蛋白质酶(因子IXa)。因子IXa的催化结构域位于该重链中(参见Chang等人，J.Clin.Invest，100：4，1997，以其全文并入本文作为参考)。FIX具有包括N-连接和O-连接的糖的多个糖基化作用位点。曾经认为在丝氨酸61上的一种特别的O-连接结构(Sia-α2，3-Gal-βl，4-GlcNAc-βl，3-Fuc-αl-O-Ser)是FIX所独有的，但是后来在哺乳动物和果蝇中的一些其它的分子(包括Notch蛋白质)上也发现了该结构(Maloney等人，Journal of Biol.Chem.，275(13)，2000)。在细胞培养中由中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞产生的FIX显示在丝氨酸61寡糖链中存在一些可变性。这些不同的糖型，及其它潜在的糖型，当给予人或动物时可能具有不同的凝血诱导能力，和/或可能在血液中具有不同的稳定性，导致低效的凝血。

临床上难以与乙型血友病相区分的甲型血友病，是由人凝血因子VIII的缺陷造成的，所述人凝血因子VIII是以单链合成然后加工成双链的活性形式的另一种糖蛋白质。也可应用本发明来控制或改变凝血因子VIII的糖基化模式以便调节其凝血活性。可根据本发明产生的其它凝血因子包括组织因子和Von Willebrands因子。

酶

已经证明是有效的药物和/或商业试剂并且可能期望根据本发明的教导制备的另一类多肽包括酶。酶可为糖蛋白质，其糖基化模式影响酶催化活性。因此，本发明还可用来在细胞培养物中生产酶，其中产生的酶具有更广泛的或更想要的糖基化模式。

作为一个非限制性实例，葡糖脑苷脂酶(GCR)的缺乏导致一种称为高歇氏病的病症，其是由葡糖脑苷脂酶在某些细胞的溶酶体中的累积所造成的。患有高歇氏病的对象表现出一系列症状，包括脾肿大、肝肿大、骨胳病症、血小板减少和贫血。Friedman和Hayes证明在一级氨基酸序列中包含单个置换的重组GCR(rGCR)显示出改变的糖基化模式，具体地说与天然存在的GCR相比增加了岩藻糖和N-乙酰基葡糖胺残基(参见美国专利号5,549,892)。

Friedman和Hayes还阐明该rGCR显示出与天然存在的rGCR相比改进的药物动力学性质。例如，rGCR靶向肝枯否细胞的量是天然存在的GCR的大约两倍。虽然两种蛋白质的一级氨基酸序列在单个残基上不同，但是Friedman和Hayes推测改变的rGCR糖基化模式也可能影响其靶向枯否细胞。本领域技术人员将意识到由糖基化模式的改变而表现出改变的酶学、药物动力学和/或药效学性质的其它已知酶实例。

蛋白质生产

可以利用本领域众所周知的技术重组生产由本发明的方法分离的蛋白质。一般将编码蛋白质的核苷酸序列插入表达载体，该载体被导入可用来生产想要数量的修饰抗体的宿主细胞，由此提供该多肽。术语“载体”包括核酸构建体，所述构建体常常包含核酸(如基因)并且进一步包括为核酸复制、转录、稳定性和/或蛋白质表达或从宿主细胞分泌所必需的最少元件。这样的构建体可作为染色体外元件存在，或者可整合入宿主细胞的基因组中。

术语“表达载体”包括特定类型的载体，其中该核酸构建体被优化用于想要的蛋白质产品的高水平表达。表达载体常常具有转录的调节因子，如启动子和增强子元件，其经优化用于在特定细胞类型中实现高水平的转录，和/或经优化以便基于使用特异诱导剂而实现组成型的表达。表达载体还具有为蛋白质的适当和/或增强的翻译提供条件的序列。如本领域技术人员所知，可容易地从由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组中选出这样的载体。术语“表达盒”包括含有基因并且具有除了该基因之外的使得该基因在宿主细胞中适当和/或增强表达的元件的核酸构建体。为了生产抗体，可将编码轻和重链的核酸插入表达载体中。这些序列可存在于相同的核酸分子(如相同的表达载体)中，或者可由分开的核酸分子(如分开的表达载体)表达。

术语“可操作连接”包括毗邻，其中组分处于容许其以其预期的方式起作用的关系中(如功能性连接)。例如，与目的多核苷酸可操作连接的启动子/增强子以如下方式连接到所述多核苷酸上，所述方式使得目的多核苷酸的表达在可以激活由启动子/增强子指导的表达的条件下实现。

表达载体一般可以以附加体形式或作为宿主染色体DNA的一个不可分割的部分在宿主生物中复制。表达载体通常包含选择标记(如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以便容许检测被期望的DNA序列转化的那些细胞(参见，例如Itakura等人，美国专利号4,704,362)。除了免疫球蛋白DNA盒序列、插入序列、以及调节序列，本发明的重组表达载体还可携带额外的序列，如在宿主细胞中调节载体复制的序列(如复制原点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择其中已引入了载体的宿主细胞(参见，例如Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地选择标记基因可以使载体已导入其中的宿主细胞具备抗药性，如对G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(与氨甲蝶呤选择/扩增一起用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

当将载体导入适当的宿主细胞后，在适于高水平表达核苷酸序列的条件下维持宿主细胞并且收集和纯化想要的抗体。任何易于进行细胞培养和蛋白质或多肽的表达的宿主细胞均可用于本发明。在某些具体实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可用于本发明的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell，Leiden，荷兰)；SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham等人，J Gen Virol.，36：59，1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，77：4216，1980)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251，1980)；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci，383：44-68，1982)；MRC 5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)。

另外，许多商业上和非商业上可得的表达多肽或蛋白质的杂交瘤细胞系也可用于本发明。本领域技术人员将明了杂交瘤细胞系可能具有不同的营养要求和/或可能需要不同的培养条件来实现最佳生长和多肽或蛋白质的表达，本领域技术人员将能根据需要改变条件。

用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制原点、启动子和增强子(Queen等人，Immunol.Rev.89：49(1986))以及必需的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA拼接位点、多聚腺苷酸化位点和翻译终止序列。优选的表达控制序列是来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见，例如Co等人(1992)J.Immunol.148：1149。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，如来源于FF-1a启动子和BGHpolyA、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的美国专利号5,168,062，Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615。在示例性的具体实施方式中，抗体的重链和轻链基因可操作地与增强子/启动子调节元件(例如来源于SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)连接从而驱使该基因高水平转录。在本发明的示例性具体实施方式中，构建体包括内部核糖体进入位点(IRES)来提供本发明的多肽在真核宿主细胞中的较高水平。在美国专利号6,193,980中公开了相容的IRES序列，所述文献也并入本文。

或者，编码序列可并入转基因中，以导入转基因动物的基因组并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如Deboer等人，US 5,741,957，Rosen，US 5,304,489以及Meade等人，US 5,849,992)。适宜的转基因包括与来自乳腺特异性基因，如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。

原核宿主细胞也可适于生产本发明的抗体。大肠杆菌(E.coli)是一种尤其可用于克隆本发明的多核苷酸(如DNA序列)的原核生物宿主。适于使用的其它微生物宿主包括芽胞杆菌(bacilli)，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌(Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)和沙雷氏菌(Serratia)，以及各种假单胞菌种(Pseudomonas)。在这些原核生物宿主中，也可以制备表达载体，其一般包含与宿主细胞相容的表达控制序列(如复制原点)。另外，还可以存在任何数目的各种众所周知的启动子，如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。这些启动子典型地控制表达(任选地与操纵基因序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等，以便起始和完成转录和翻译。

最常在具有包含指导融合或非融合蛋白质表达的组成型或诱导型启动子的载体的大肠杆菌中实施原核生物中蛋白质的表达。融合载体向其编码的抗体添加一些氨基酸，常常加到重组抗体的恒定区，不影响抗体的特异性或抗原识别。融合肽氨基酸的加入可使抗体增加附加功能，例如作为标记(如表位标签例如myc或flag)。

其它的微生物，如酵母也可用于表达。酵母(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，其具有适宜的载体，所述载体按需具有表达控制序列(如启动子)、复制原点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶及其它糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括，尤其是，来自醇脱氢酶、isocytochrome C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

可用众所周知的方法将包含目的多核苷酸序列(如重和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所用方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染、生物轰击或基于病毒的转染可用于其它的细胞宿主。(一般性地参见Sambrook等人，分子克隆：实验指南(Molecular Cloning：A laboratoryManual)(冷泉港出版社，第二版，1989)，为了所有目的将其全文并入本文作为参考)。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括利用Polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和微量注射(一般参见Sambrook等人，同上引文)。为了产生转基因动物，可将转基因微量注射到受精的卵细胞中，或可并入胚胎干细胞的基因组中，并将该细胞的细胞核转移到去核的卵细胞中。

当在分开的表达载体中克隆重链和轻链时，可以共转染这些载体来获得完整免疫球蛋白的表达和装配。当表达时，可如本文所述分离和/或根据本领域已知的方法进一步纯化本发明的完整的抗体、其二聚体、单个的轻链和重链或其它免疫球蛋白形式，所述纯化方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(通常参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，纽约，(1982))。优选至少大约90到95％同质的基本上纯的免疫球蛋白，并且最优选98到99％或更大的同质性，用于药物用途。

以下实施例是举例说明性的，并非意在限制。

实施例1

用各种阳离子和阴离子进行絮凝：用在无血清培养基中培养的重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制备各种单克隆抗体(mAb)(如表1中所示)。将大约50mL包含细胞的条件培养基等分试样加到125mL锥形瓶中(除了用于抗GDF8 #2的30/20磷酸钙实例为1000mL烧瓶中有400mL以及用于IL13#1的30/20磷酸钙实例为2000mL烧瓶中有1000mL)。将HEPES加至40mM来控制pH。将金属阳离子的浓缩液加入溶液来实现最终的靶浓度(参见表1)并且温和地混合。将阴离子的浓缩液加入混合物(参见表1)来实现最终的阴离子浓度(参见表1)并且温和地混合(在一些实施例中，在以下表1中用星号(^＊)指示，首先加入阴离子再加入阳离子)。通过添加NaOH增加pH或通过添加HCl降低pH，以使pH达到靶pH范围。在许多实施例中，不需要调节pH。使混合物与阴性对照一起在摇床上18-25℃温育一至四个小时。在温育之后，将混合物倾倒入50mL离心管中。将每个混合物以340g离心十分钟。将澄清的上清液等分，并用浊度计(HACH，Loveland CO)测量混浊度。在表1中报道了得到的混浊度，表示为相对于未处理对照降低的百分数。通过一般用于抗体的蛋白质A HPLC方法来测定抗体浓度。在表1中报道了与未处理的对照相比的回收率。

表1：对于钙、镁、锰、钴(II)和镍阳离子得到的絮凝结果。除用星号(^＊)标注的处理是在阳离子之前加入阴离子之外，所有其它处理均为在阴离子之前加入阳离子。

测定了在某些样品的上清液中钙和磷酸根的残余水平。利用BioAssaySystems QuantiChrom^TM Calcium Assay Kit(DICA-500)测定钙的残余量。利用BioAssay Systems Malachite Green Phosphate Assay Kit(POMG-25H)测定磷酸根的残余量。在表1的具有40mM钙和20mM磷酸根的抗IL13 #2样品中，离心后的上清液包含8.19mM钙和1.04mM磷酸根。此水平的可溶性钙和磷酸根相当于8.5×10^-6M²的K_sp。在表1的具有80mM钙和20mM磷酸根的抗AB #1样品中，离心后的上清液包含22.2mM钙和0.4mM磷酸根。此水平的可溶性钙和磷酸根相当于8.4×10^-6M²的K_sp。

实施例2

阴离子/阳离子加入顺序的影响：用在无血清培养基中培养的重组CHO细胞生产一种mAb，抗GDF8 #1。将大约50mL包含细胞的条件培养基等分试样加入3×125mL锥形瓶A、B和C。对样品A不加处理，将之用作阴性对照。将HEPES加入至40mM来控制样品B和C中的pH。将5M氯化钙加到样品B中至50mM的浓度；在温和地混合之后，将0.5M亚硫酸钠加入至33.3mM的浓度。对于样品C，加入顺序是相反的。将0.5M亚硫酸钠加入至33.3mM的浓度；在温和地混合之后，将5M氯化钙加入至50mM的浓度。所有的三个混合物具有在7.4至7.6之间的pH。使混合物在摇床上18-25C下温育一小时。在温育之后，将混合物倾入50mL离心管中。每个混合物在340g下离心十分钟。取出澄清的上清液，用蛋白质A HPLC测定抗体浓度，以及用浊度计测定混浊度。

样品B和C与未处理的样品相比都具有94％的抗体回收率。首先加入阳离子的样品B与未处理的样品相比显示出混浊度的增加，表明沉淀已经形成，但是其太小以至于不能容易地通过离心除去。首先加入阴离子的样品C与未处理的样品相比显示出混浊度减少46％，表明形成的沉淀足够大以至可以容易地通过离心除去。此混浊度的降低还表明一定量的细胞碎屑和/或胶体物质与该沉淀物结合并在沉淀中除去。

实施例3

利用钙和磷酸根作为沉淀剂的试点规模的试验以及对下游澄清和层析步骤的影响：用在无血清培养基中培养的重组CHO细胞在500L生物反应器中生产一种mAb，抗AB #1。在收获的时候，将培养物恢复到室温(18-25℃)。将350L的培养物留下不加以处理，并用作阴性对照。将150L的培养物转入200L酸坛(carboy)中，并用高架混合器(overhead mixer)来缓慢混合。将缓冲液加至40mM来控制pH。然后将2M磷酸钾加入至20mM的浓度。然后将5M氯化钙加入至30mM的浓度。混合物的pH是7.3。混合下温育絮凝的培养物160分钟。在温育结束时混合物的pH是7.0。

通过Alfa Laval BTPX 205碟片式离心机以4.4L/分钟的流速和7630RPM的转鼓速度(8000g)处理絮凝的和未处理的培养物。絮凝样品的稳态离心液(centrate)的混浊度是14NTU，与未处理的样品的117NTU相比较，混浊度减少88％。与未处理的离心液相比，絮凝的离心液中抗体效价的回收率是96％。与未处理的离心液相比，在絮凝的离心液中宿主细胞蛋白质(HCP)的水平降低35％，从533,341ppm到348,087ppm。

通过Millipore A1HC滤垫过滤器(Pad Filter)处理絮凝的和未处理的离心液，达到每平方米过滤器250L离心液的容量。未处理的样品显示出混浊度的稳定增加的突破，从在24L/m²的4NTU到在121L/m²的26NTU到在254L/m²的37NTU。对于未处理样品，最终滤垫过滤合并物的混浊度是21NTU。絮凝的样品显示出通过这些滤垫后混浊度仅有小的增加，从在21L/m²的2NTU到在150L/m²的6NTU到在254L/m²的7NTU。对于絮凝的样品，最终滤垫过滤合并物的混浊度是5NTU，与未处理的样品相比混浊度减少76％。

在滤垫过滤和经由0.2μm精炼过滤器(polishing filter)进行额外过滤之后，利用GE Healthcare MabSelect蛋白质A亲合柱层析样品。当从蛋白质A柱上洗脱抗体时，峰的合并物常是混浊的，而且当峰被中和时混浊度典型地增加。未处理的峰合并物具有10NTU的混浊度，而当中和后增加到22NTU。絮凝的峰合并物具有3NTU的混浊度，而当中和后增加到8NTU，比未处理的峰低63％。

实施例4

用钙和磷酸根絮凝在澄清的条件培养基和蛋白质峰中均导致混浊度降低。还实现了细胞有关的杂质及产物有关的杂质两者的明显减少。

由在无血清培养基中培养的重组CHO细胞来生产一种mAb，抗5T4。将大约3L的培养物留置不加处理，并用作阴性对照。将另一3L的培养物转入4L容器中。将缓冲液加至40mM来控制pH并在18-24℃下温和地混合。然后将2M磷酸钾加入至20mM的浓度，并温和地混合溶液。然后将5M氯化钙加入至30mM的浓度，并温和地混合溶液。混合物的pH是7.2。将絮凝的培养物转入三个2L锥形瓶中，并在混合下温育2小时。在温育期结束时混合物的pH是7.0。

将絮凝的培养物和未处理的培养物的各50mL样品在340g下离心十分钟。取出澄清的上清液，并用蛋白质A HPLC测定抗体浓度，用浊度计测定混浊度。与未处理样品相比，与产物相关的物质的总回收率是78％。未处理样品的混浊度是29NTU。絮凝的样品的混浊度是2NTU，与未处理的样品相比混浊度降低93％。

经由Millipore A1HC滤垫过滤器处理絮凝的和未处理的样品。在滤垫过滤和经由0.2μm精炼过滤器的额外过滤之后，利用GE HealthcareMabSelect蛋白质A亲合柱层析样品。当以高浓度从蛋白质A柱洗脱抗体时，在产物峰的顶点中物质常常沉淀，导致混浊的溶液。按分光光度计中600nm处吸光度的测定，未处理样品的峰顶中的沉淀水平是1.85AU。按分光光度计中600nm处吸光度的测定，絮凝的样品的峰顶中的沉淀水平是0.03AU，与未处理的样品相比混浊度降低98％。

当从蛋白质A柱洗脱抗体时，峰合并物有时是混浊的。中和后，由于物质沉淀并且从溶液中析出，混浊度典型地在pH5.5和pH6.0之间显著增加。当pH升高到7以上时，此沉淀中的一些趋向再次溶解。具有8.1mg/mL抗体浓度的未处理的峰合并物在洗脱时具有8.5NTU的混浊度，在pH5.5到6.0之间增加到839NTU，并且在pH7.0处减少到53NTU。当经由0.2μm除菌级过滤器过滤后，混浊度仅仅降低到40NTU。

絮凝的产物合并物以较少体积从柱上洗脱，并因此更浓缩。当洗脱时，抗体浓度为15.1mg/ml的絮凝的峰合并物具有5.6NTU的混浊度，在pH5.5到6.0之间增加到31NTU，与对照相比混浊度降低96％。在pH7.0及15.1mg/mL下混浊度稍微增加到46NTU。当经由0.2μm除菌级过滤器过滤后，混浊度降低到8.1NTU，比对照降低80％。

当将中和后的蛋白质A峰稀释到8.1mg/mL浓度来与未处理的样品相匹配时，未过滤的絮凝样品的混浊度从46NTU降低到25NTU，与未处理的样品相比降低53％。当经由0.2μm除菌级过滤器过滤后，混浊度降低到4.1NTU，与未处理的样品相比混浊度降低90％。

由尺寸排阻HPLC(Size-Exclusion HPLC)测定存在于蛋白质A峰合并物中的高分子量(HMW)聚集体的水平。在未处理样品中的聚集体的水平是9.51％。在絮凝样品中聚集体的水平是1.05％，与未处理的样品相比聚集体减少89％。将聚集体的减少考虑进去，培养物中78％的产物回收率可以转化为85％的期望单体的回收率。

利用ELISA在处理的不同步骤中测定宿主细胞蛋白质(HCP)，由CHO细胞分泌的不需要的杂质，的水平。以百万分率(ppm)来报道HCP水平，相当于每mg抗体HCP的ng数。在未处理的培养物中HCP水平是2.53E6ppm。在絮凝的条件培养基中HCP的水平是3.83E5ppm，比未处理的培养物降低84％。未处理的和絮凝的培养物在经由滤垫过滤后HCP都降低大约60％，分别至1.02E6和1.62E5。当通过蛋白质A柱纯化后，在未处理的样品中HCP的水平降低了90％达到1.03E5ppm。在絮凝的样品中HCP的水平减少了98％达到3.83E2ppm。总的说来，对于未处理的纯化链，存在HCP的1.4log清除。絮凝的纯化链实现HCP的3.8log清除，导致与未处理的纯化链相比HCP降低250倍。

已经描述了一些实施方式，但是本发明不因此受到限制。

例如，在某些实施方式中，可在无细胞存在下，例如在已经除去细胞之后实施本文所述的絮凝方法。培养基可包含非细胞的不溶性物质(参见以下的实施例5)。

实施例5

利用钙和磷酸根形成固体沉淀可以帮助过滤混浊的包含蛋白质的溶液：由在无血清培养基中培养的重组CHO细胞生产一种mAb，抗GDF8 #1。用Alfa Laval BTPX 205碟片式离心机除去细胞，经由Millipore A1HC PadFilter处理产生的离心液。在滤垫过滤和经由0.2μm精炼过滤器的额外过滤之后，将样品用GE Healthcare MabSelect蛋白质A亲合柱层析。当利用低pH的缓冲液从蛋白质A柱上洗脱抗体时，峰合并物有时是混浊的。中和后，混浊度典型地显著升高。

在这个实施例中，在4℃下将蛋白质A峰保持7天未过滤，然后升温到室温。该峰的混浊度是192NTU。将峰分成两个800mL的样品，留下一个样品不加处理。将4mM磷酸钾和6mM氯化钙加入第二个样品中。然后在18-25℃下在2L锥形瓶中振摇该处理的样品1小时。在振摇之后，处理的样品的混浊度为460NTU。

然后经由17.7cm² Millipore Express SHC 0.5/0.2μm聚醚砜囊式过滤器过滤未处理的和处理的样品。根据能通过每个过滤器的溶液的量来计算最大过滤能力(filter capacity)。最大过滤能力是在过滤器堵上且不再有溶液可通过之前能够通过1m²过滤器的溶液的升数。未处理的样品能够达到大约30L/m²的最大过滤能力，而处理的样品达到大约1500L/m²的最大过滤能力，在过滤能力上增加50倍。未处理的和处理的样品的过滤后混浊度都是9NTU，表明该处理可能不导致额外颗粒物质的清除，但确实起到助滤作用并容许更大体积的溶液在过滤器堵上之前通过过滤器。

实施例6

就利用钙和磷酸根形成固体沉淀来帮助清除混浊的包含蛋白质的溶液中的颗粒物质而言，规模和混合方法所导致的影响：在试点规模的生物反应器(160-500L细胞培养物)中从无血清培养基培养的重组CHO细胞生产抗AB #2 mAb(在图2和3中标注为“mAb B”)。将大约125L、1.5L或50mL的包含细胞的条件培养基等分试样分别加到200L酸坛、2L烧杯或125mL锥形瓶中。将HEPES加入至40mM来控制pH。将200L酸坛和2L烧杯用叶轮(impeller)混合。将125mL锥形瓶用摇床混合。将磷酸钾的浓缩液加入每个混合物以在终溶液中达到20mM的终浓度。将氯化钙的浓缩液加入每个溶液中达到30mM的最终靶浓度，并混合。最终的pH在7.0到7.5之间。在混合条件下室温(20-23℃)温育固体和培养基超过一个小时。将未处理样品以及125L、1.5L和50mL处理的样品的50mL等分试样在340xg下离心10分钟。测定上清液中的混浊度和抗体浓度。

规模及混合方法对于混浊度的影响见图2所示。与规模无关并且与混合方法(叶轮或摇床)无关，在所有的絮凝实例中，混浊度比对照减少了90％以上。另外，与未处理的样品相比，在所有的处理样品中抗体回收率是100％。因此，就这些迥然不同的条件而言，在本发明中絮凝看起来与规模或混合方法无关。

利用ELISA在未处理的上清液和处理的125L样品中测定了宿主细胞蛋白质(HCP)，由CHO细胞分泌的不需要的杂质，的水平。以百万分率(ppm)来报道HCP水平，相当于每mg抗体HCP的ng数。经处理的125L样品与未处理的样品相比HCP减少了50％。

实施例7

对于利用钙和磷酸根形成固体沉淀来帮助清除混浊的包含蛋白质的溶液中的颗粒物质而言，混合速度的影响：在试点规模的生物反应器(160-500L细胞培养物)中从无血清培养基培养的重组CHO细胞生产抗AB #2 mAb(在图3中标注为“mAb B”)。将大约125L的包含细胞的条件培养基装入两个200L酸坛中。将HEPES加至40mM来控制pH。用叶轮混合，一个以0.9m/s的叶尖速(tip speed)操作而另一个以2.5m/s的叶尖速操作。将磷酸钾的浓缩液加入混合物以在终溶液中达到20mM的终浓度。将氯化钙的浓缩液加入溶液中达到30mM的最终靶浓度，并混合。最终的pH在7.0到7.5之间。在混合条件下室温(20-23℃)温育固体和培养基，在不同的时间点取样。在以340xg离心10分钟后测定每个样品上清液的混浊度。叶轮叶尖速对于混浊度的影响如图3所示。在一个小时之后与所研究的叶尖速无关，所有絮凝实施例与对照相比混浊度都降低了90％以上。在15分钟的时间点上，较快的叶尖速看来似乎可以较快地降低混浊度。但是，该区别是不明显的。因此，在温育一个小时之后就所研究的速度而言，本发明中的絮凝看起来与叶尖速无关。

利用ELISA在未处理的上清液和处理的0.9m/s样品中测定了宿主细胞蛋白质(HCP)，由CHO细胞生产的不需要的杂质，的水平。以百万分率(ppm)来报道HCP水平，相当于每mg抗体HCP的ng数。处理的样品与未处理的样品相比HCP减少了47％。

实施例8

大规模絮凝：

利用钙和磷酸根作为沉淀剂的试点规模试验以及对下游澄清和层析步骤的影响：在190L生物反应器中从无血清培养基培养的重组CHO细胞分不同五批来生产一种mAb，抗IL-13#1(在图4和5中标注为mAb E)。以12-14天的培养时间运作生物反应器，并且细胞具有在8×10⁶-11×10⁶活细胞/mL之间的存活力，为66-88％存活。在收获的时候，将培养物恢复到室温(18-25℃)。将150L的培养物转入200L酸坛中(前四批)或留在生物反应器中(最后一批)并且用高架混合器来缓慢混合。将HEPES缓冲液加至40mM来控制pH。然后将2M磷酸钾加入至20mM的浓度。然后将5M氯化钙加入至30mM的浓度。混合物的pH在7到7.5之间。将絮凝的培养物在混合下温育2到3小时。

通过Alfa Laval BTPX 205碟片式离心机以4和5L/分钟的流速和7630RPM的转鼓速度(8000g)处理絮凝的培养物。在图4中将获得的离心液的混浊度与未絮凝的样品的上清液(未处理的对照以340g离心十分钟而获得)相比较。在所有的情况下，絮凝使混浊度降低85％以上。在絮凝的上清液中抗体效价的回收率随温育时间的变化见图5所示，并且在所有情况下均超过75％。从批次403和405取50mL样品，并在125mL锥形瓶中额外再温育一段时间。在7小时之后，批次403具有未处理样品60％的效价，而批次405具有未处理样品80％的效价。

利用ELISA在未处理的上清液和处理的离心液中测定了宿主细胞蛋白质(HCP)，由CHO细胞分泌的不需要的杂质，的水平。以百万分率(ppm)来报道HCP水平，相当于每mg抗体HCP的ng数。来自5个批次的处理样品与未处理的样品相比HCP减少了49％-69％。

将头3个批次经由Millipore A1HC Pad Filter处理，以每小时每平方米120升的流量达到每平方米过滤器270L离心液的过滤能力，且无压力或混浊度的增加。

在滤垫过滤之后，根据混浊度的测定，样品通常很多天保持稳定。

将最后的2个批次直接通过0.2μm过滤器而不经过滤垫。在0.2μm过滤器之前不使用滤垫过滤器，分别达到730和160L/m²的过滤能力。这些过滤能力代表了在过滤性上与未絮凝的物质相比的显著改善。当在室温下(18-24℃)保持0.2μm-滤过的离心液(无滤垫)时，由于钙和磷酸根的持续沉淀，在几小时内混浊度开始增加。在24-48小时之后沉淀物沉降，在容器底部形成磷酸钙的结晶层。在沉淀物沉降前后，所得的澄清的包含蛋白质的溶液均具有优良的过滤性特征。没有抗体损失在沉淀中。

对于最后一批，絮凝直接在该试点生物反应器中进行。利用标准的就地清洗(CIP)方法(在60-80℃下水冲洗继之以0.1N NaOH洗涤)有效地清洁反应器。

以试点规模经由蛋白质A柱、阴离子交换步骤、病毒滞留过滤器和最终的超滤/渗滤(UF/DF)来处理全部5个批次，无操作问题。中和后的蛋白质A峰都具有＜20NTU的混浊度，并且是高度滤过性的。产物质量，例如按尺寸排阻HPLC和SDS-PAGE凝胶电泳所测的高分子量聚集体和低分子量截短物(clip)的水平，以及按阳离子交换HPLC所测的酸性和碱性物的水平，可与先前使用这个抗体进行的未絮凝试点活动相当。

实施例9

利用钙和磷酸根作为沉淀剂，以及对下游蛋白质A层析步骤和的随后过滤的影响：由在无血清培养基中培养的重组CHO细胞生产三种mAb：抗AB #2、抗GDF8 #1和抗IL22。对每一种抗体，将培养物一分为二，并将第一个样品留下不加处理。向第二个样品(处理的样品)加入HEPES至40mM的水平，加入磷酸钾加20mM的水平，并且加入氯化钙至30mM的水平。通过离心将细胞从所有样品中除去，并将产生的上清液经由Millipore A1HCPad Filter处理。在滤垫过滤和经由0.2μm精炼过滤器的额外过滤之后，利用GE Healthcare MabSelect蛋白质A亲合柱层析样品。当利用低pH的缓冲液从蛋白质A柱上洗脱抗体时，峰合并物有时是混浊的。中和后，混浊度典型地显著升高。

未处理的和处理的样品的中和后峰的混浊度如以下表2所示。所有的三个处理的样品显示出与未处理的样品相比中和后峰混浊度明显降低。

表2：在上样前对细胞培养物进行磷酸钙处理之后蛋白质A峰混浊度的降低

	未处理的样品的峰混浊度(NTU)	处理的样品的峰混浊度(NTU)	混浊度从未处理的样品到处理的样品的降低％
	未处理的样品的峰混浊度(NTU)	处理的样品的峰混浊度(NTU)	混浊度从未处理的样品到处理的样品的降低％	抗-AB #2	61	25	60％
抗-GDF8#1	153	25	84％	抗-AB #2	61	25	60％
抗-GDF8#1	153	25	84％	抗-IL22	233	12	95％

然后经由2.8cm² Pall Acrodisc Supor 0.8/0.2μm聚醚砜注射过滤器过滤未处理的和处理的抗IL22中和峰。根据能通过每个过滤器的溶液的量来计算最大过滤能力。最大过滤能力是在过滤器堵上且不再有溶液可通过之前能够通过1m²过滤器的溶液的升数。未处理的样品能够达到大约10-30L/m²的最大过滤能力。170L/m²的处理的样品通过该过滤器而无流速的降低，在该点没有处理的样品被滞留。处理的样品通过过滤器太快以致不能精确计算最大过滤能力。但是，因为对于170L/m²的测试而言流速没有降低，所以可以预期最大能力将显著大于170L/m²。

本文提到的全部出版物、专利申请、专利，及其它参考文献以其全文并入本文作为参考。

其它的具体实施方式在以下权利要求的范围之内。

Claims

1、一种方法，包括：

在包含蛋白质的介质中形成包含第一阳离子和第一阴离子的固体；以及

将该蛋白质与该固体分离。

2、权利要求1的方法，其中第一阳离子选自由钙、镁、锶、铝、钪、镧、硅、钛、锆、钍、锰、钴、铜、铬、铁、镍、锌和钒组成的组。

3、权利要求1的方法，其中第一阳离子是钙。

4、权利要求1的方法，其中第一阴离子选自由磷酸根、碳酸根、铬酸根、钨酸根、氢氧根、卤离子、琥珀酸根、酒石酸根、柠檬酸根、亚硫酸根、钼酸根、硝酸根、氟离子、硅酸根和藻酸根组成的组。

5、权利要求1的方法，其中第一阴离子是磷酸根。

6、权利要求1的方法，其中第一阳离子是钙，并且第一阴离子是磷酸根。

7、权利要求1的方法，其中固体具有不超过大约10^-4M²的溶度积常数。

8、权利要求1的方法，还包括将约4mM到约200mM的第一阳离子或第一阴离子引入介质。

9、权利要求1的方法，其中在形成固体之前第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积大于约10^-5M²。

10、权利要求1的方法，其中在形成固体之前第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积大于约10^-4M²。

11、权利要求1的方法，其中在形成固体之前第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积大于约2.7×10^-2M²。

12、权利要求1的方法，其中第一阳离子和第一阴离子在介质中的浓度是不同的。

13、权利要求1的方法，其中第一阳离子和第一阴离子在介质中的浓度基本上是相同的。

14、权利要求1的方法，还包括改变介质的pH。

15、权利要求1的方法，其中介质的pH保持在约5到约9之间。

16、权利要求1的方法，其中介质中至少约50％的所述蛋白质得以分离。

17、权利要求1的方法，其中介质中至少约70％的所述蛋白质得以分离。

18、权利要求1的方法，还包括使澄清的介质的混浊度相对于与该介质相同但不含固体的第二澄清的介质的混浊度降低至少约30％。

19、权利要求1的方法，还包括使澄清的介质的混浊度相对于与该介质相同但不含固体的第二澄清的介质的混浊度降低至少约50％。

20、权利要求1的方法，其中所述介质还包含哺乳动物细胞。

21、权利要求1的方法，其中所述介质还包含真核细胞。

22、权利要求1的方法，还包括离心介质、通过微量过滤膜过滤介质，或通过深层过滤器过滤介质。

23、权利要求1的方法，其中固体还包含第二种阳离子或第二阴离子。

24、权利要求1的方法，其中在形成并分离固体之后，将包含蛋白质的介质施加至蛋白质A柱上，并且洗脱以提供与第二介质的类似洗脱峰相比具有更低的混浊度的洗脱峰，所述的第二介质与所述的第一介质相同但无固体形成。

25、权利要求1的方法，其中在形成并分离固体之后，将包含蛋白质的介质施加至蛋白质A柱上，并且洗脱以提供与第二介质的洗脱峰相比具有更低的可溶性杂质水平的洗脱峰，所述的第二介质与所述介质相同但无固体形成。

26、一种方法，包括：

将第一阳离子和第一阴离子引入包含蛋白质的介质中；

沉淀包含第一阳离子和第一阴离子的固体；和

将该蛋白质与该固体分离。

27、权利要求26的方法，其中相继地引入第一阳离子和第一阴离子。

28、权利要求26的方法，其中同时引入第一阳离子和第一阴离子。

29、权利要求26的方法，其中第一阳离子选自由钙、镁、锶、铝、钪、镧、硅、钛、锆、钍、锰、钴、铜、铬、铁、镍、锌和钒组成的组。

30、权利要求26的方法，其中第一阴离子选自由磷酸根、碳酸根、铬酸根、钨酸根、氢氧根、卤离子、琥珀酸根、酒石酸根、柠檬酸根、亚硫酸根、钼酸根、硝酸根、氟离子、硅酸根和藻酸根组成的组。

31、权利要求26的方法，其中固体具有不超过约10^-4M²的溶度积常数。

32、权利要求26的方法，还包括将约4mM到约200mM的第一阳离子或第一阴离子引入介质。

33、权利要求26的方法，其中第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积大于约10^-5M²。

34、权利要求26的方法，其中第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积大于约10^-4M²。

35、权利要求26的方法，其中第一阳离子和第一阴离子的浓度的乘积大于约2.7×10^-2M²。

36、权利要求26的方法，包括将不同浓度的第一阳离子和第一阴离子引入介质中。

37、权利要求26的方法，其中将相同浓度的第一阳离子和第一阴离子引入介质中。

38、权利要求26的方法，还包括改变介质的pH。

39、权利要求26的方法，其中介质的pH维持在约5到约9之间。

40、权利要求26的方法，还包括调节介质的温度。

41、权利要求26的方法，其中分离介质中至少约50％的所述蛋白质。

42、权利要求26的方法，其中分离介质中至少约70％的所述蛋白质。

43、权利要求26的方法，还包括使澄清的介质的混浊度相对于与该介质相同但不含固体的第二澄清的介质的混浊度降低至少约30％。

44、权利要求26的方法，还包括使澄清的介质的混浊度相对于与该介质相同但不含固体的第二澄清的介质的混浊度降低至少约50％。

45、权利要求26的方法，其中介质还包含哺乳动物细胞。

46、权利要求26的方法，其中介质还包含真核细胞。

47、权利要求26的方法，还包括离心介质。

48、权利要求26的方法，其中固体还包含第二阳离子或第二阴离子。

49、权利要求26的方法，其中在形成并分离固体之后，将包含蛋白质的介质施加至蛋白质A柱上，并且洗脱以提供与第二介质的类似洗脱峰相比具有更低的混浊度的洗脱峰，所述的第二介质与所述的第一介质相同但无固体形成。

50、权利要求26的方法，其中在形成并分离固体之后，将包含蛋白质的介质施加至蛋白质A柱上，并且洗脱以提供与第二介质的洗脱峰相比具有更低的可溶性杂质水平的洗脱峰，所述的第二介质与所述介质相同但无固体形成。

51、权利要求1的方法，其中蛋白质是分泌性蛋白质。

52、权利要求51的方法，其中蛋白质选自由抗体、抗体的抗原-结合片段、可溶性受体、受体融合物、细胞因子、生长因子、酶和凝血因子组成的组。

53、权利要求52的方法，其中蛋白质是抗体或其抗原-结合片段。

54、权利要求53的方法，其中抗体或其抗原结合片段可以与Aβ肽、白细胞介素-13、白细胞介素-22、5T4或生长分化因子-8结合。

55、权利要求26的方法，其中蛋白质是分泌性蛋白质。

56、权利要求55的方法，其中蛋白质选自由抗体、抗体的抗原-结合片段、可溶性受体、受体融合物、细胞因子、生长因子、酶和凝血因子组成的组。

57、权利要求56的方法，其中蛋白质是抗体或其抗原结合片段。

58、权利要求57的方法，其中抗体或其抗原结合片段可以与Aβ肽、白细胞介素-13、白细胞介素-22、5T4或生长分化因子-8结合。

59、一种方法，包括：(i)在包含靶部分和致混浊因子的介质中形成包括第一阳离子和第一阴离子的固体；以及(ii)通过过滤从溶液中分离所述固体和致混浊因子。

60、权利要求59的方法，其中靶部分是蛋白质。

61、权利要求60的方法，其中蛋白质是可溶性蛋白质。

62、权利要求26的方法，其中第一阳离子是钙。

63、权利要求26的方法，其中第一阴离子是磷酸根。

64、权利要求26的方法，其中第一阳离子是钙，并且第一阴离子是磷酸根。

65、权利要求1的方法，还包括调节介质的温度。