BRPI0616298A2 - derivado do Ácido hialurânico, processo de produÇço do mesmo, composiÇço, artigo cosmÉtico, artigo cirérgico, mÉdico ou sanitÁrio, cÁpsula de medicamento, microcÁpsula, nanocÁpsulas, microesferas ou nanoesferas - Google Patents

Abstract

DERIVADO DO ÁCIDO HIALURâNICO, PROCESSO DE PRODUÇçO DO MESMO, COMPOSIÇçO, ARTIGO COSMÉTICO, ARTIGO CIRéRGICO, MEDICO OU SANITÁRIO, CÁPSULA DE MEDICAMENTO MICROCAPSULA, NANOCAPSULAS, MICROESFERAS OU NANOESFERAS. A presente invenção diz respeito à modificação do ácido hialurônico (HA) com anidridos aril/alquil succínicos (ASA) para produzir derivados HA do anidrido aril/alquil succínico, aos derivados como tais, e aos seus usos e aplicações, particularmente em indústrias cosméticas e biomédicas. Espera-se que os derivados ASA-HA tenham propriedades interessantes que podem ser usadas para formulação avançada (forte aderência à pele comparado ao HA não-modificado), possivelmente também em sistemas de liberação para medicamentos ou ativos para encapsulação (nano/micro cápsulas) ou formação de nano/micro esferas. Adicionalmente, espera-se que os derivados ASA-HA baixo MW penetrem na pele mais eficientemente que os HA não-modificados de mesmo MW.

Description

"DERIVADO DO ÁCIDO fflALURÔNICO, PROCESSO DE PRODUÇÃODO MESMO, COMPOSIÇÃO, ARTIGO COSMÉTICO, ARTIGOCIRÚRGICO, MÉDICO OU SANITÁRIO, CÁPSULA DEMEDICAMENTO, MICROCÁPSULA, NANOCÁPSULAS,MICROESFERAS OU NANOESFERAS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito à modificação do ácidohialurônico (HA) com anidrido aril ou alquil succínico (ASA) para produzirderivados HA do anidrido aril/alquil succínico (ASA-HA), aos derivadosASA-HA como tais, e aos seus usos e aplicações, particularmente emindústrias cosméticas e biomédicas.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Os heteropolissacarídeos mais abundantes no corpo são asglicosaminoglicanas. Glicosaminoglicanas são polímeros de carboidrato nãoramificado, consistindo em unidades de dissacarídeos repetidas (somentequerato-sulfato é ramificado na região central do carboidrato). As unidades dedissacarídeos geralmente compreendem, como uma unidade sacarídeaprimária, uma de dois açúcares modificados - N-acetilgalactosamina(GaINAc) ou N-acetilglicosamina (GIcNAc). A unidade secundária éusualmente um ácido urônico, tais como ácido glicurônico(GIcUA) ouiduronato.

Glicosaminoglicanas são moléculas carregadas negativamente,e têm uma configuração estendida que confere uma alta viscosidade quandoem solução. Glicosaminoglicanas estão localizadas basicamente na superfíciedas células ou na matriz extracelular. Glicosaminoglicanas também têmcompressibilidade baixa em solução e, como resultado, são ideais como umfluido lubrificante fisiológico, por exemplo, nas articulações. A rigidez dasglicosaminoglicanas fornece integridade estrutural das células e fornecepassagens entre células, permitindo a migração celular. Asglicosaminoglicanas de maior importância fisiológica são hialuronan, sulfatode condroitina, heparina, heparitina-sulfato, dermatossulfato, e querato-sulfato. A maioria das glicosaminoglicanas adere-se covalentemente àproteína central proteoglicana por meio de estruturas de oligossacarídeosespecíficas. Hialuronan forma agregados volumosos com certasproteoglicanas, mas é uma exceção quando cadeias de carboidrato livreformam complexos não-covalentes com proteoglicanas.

Inúmeras funções do hialuronan no corpo foram identificadas(veja, Laurent T. C. e Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; e TooleB.P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis anddifferentiation". Em: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341,Hay E. D., ed., Plenum, Nova Iorque). O hialuronan está presente nacartilagem hialina, no fluido sinovial da articulação, e tecido da pele, tanto naderme quanto na epiderme. O hialuronan é também suspeito de ter um papelem várias funções fisiológicas, tais como adesão, desenvolvimento,motilidade celular, câncer, angiogênese e cicatrização de ferimentos. Devidoàs propriedades biológicas e físicas exclusivas do ácido hialurônico, este éempregado em cirurgias na articulação e olho e está sendo avaliado em outrosprocedimentos médicos.

Os termos "hialuronan" ou " ácido hialurônico " são usados naliteratura para significar polissacarídeos acidificados com diferentes pesosmoleculares constituídos por resíduos de ácidos D-glicurônico e N-acetil-D-glicosamina, que ocorrem naturalmente nas superfícies das células, nassubstâncias extracelulares básicas de conectividade dos tecidos dosvertebrados, no fluido sinovial das articulações, no fluido endobulbar dosolhos, no tecido do cordão umbilical humano e em cristas de galo.

O termo "ácido hialurônico" é na verdade usualmente utilizadosignificando uma série total de polissacarídeos com resíduos alternados dosácidos D-glicurônico e N-acetil-D-glicosamina com pesos molecularesvariáveis, ou ainda as frações de degradação dos mesmos, e portanto pareceriamais correto usar o termo no plural de "ácidos hialurônicos ". O termosingular será, entretanto, usado com o mesmo significado nessa descrição;além do mais, a abreviação "HA" será freqüentemente usada no lugar dessetermo coletivo.

HA exerce um importante papel no organismo biológico, comoum suporte mecânico para as células de muitos tecidos, tais como a pele,tendões, músculos e cartilagem, ele é um componente principal da matrizintercelular. HA também representa outras partes importantes nos processosbiológicos, tais como a umidificação dos tecidos, e lubrificação.

HA pode ser extraído dos tecidos naturais mencionadosanteriormente, embora atualmente prefere-se prepará-lo pelos métodosmicrobiólogicos para minimizar o risco potencial de transferir agentesinfecciosos, e para aumentar a uniformidade, qualidade e disponibilidade doproduto.

HA e suas várias frações de tamanho molecular e os saisrespectivos destes têm sido usados como medicamentos, especialmente notratamento de artropatias, como um agente substituto e/ou auxiliar paratecidos e órgãos naturais, especialmente em cirurgias cosméticas eoftalmológicas, e como agentes em preparações cosméticas. Produtos dehialuronan também foram desenvolvidos para uso em ortopedia, reumatologiae dermatologia.

HA pode também ser usado como um aditivo para váriosmateriais poliméricos utilizados em artigos cirúrgicos e sanitários, tais comopoliuretanos, poliésteres etc. com o efeito de tornar esses materiaisbiocompatíveis.

A modificação ou derivação do ASA está bem estabelecida naindústria de papel em que os anidridos alquil succínicos foram usados paratornar as superfícies de papel (celulósico) mais resistentes à água (Chen,G.C.I., Woodward, T.W. (1986) Otimization the emulsification and sizing ofalkenyl succinic anhydride, Jornal Tappi, Agosto, 95-97). Na indústriaalimentícia, amidos modificados de anidrido 2-octeno-l-ilsuccínico (OSA)foram usados para estabilizar emulsões óleo/água, por exemplo, margarinascom pouca gordura e maioneses, (Jarowenko, W. (Em: Acetylated starch andmiscellaneous organic esters, 1986, Ed.: O. Wurzburg) Amido acetilado eésteres orgânicos misturados, pp 55-77). Adicionalmente, as propriedadesreológicas dos amidos modificados OSA são muito diferentes quandocomparadas às dos amidos não-modificados (Park, S., Chung, M.-G., Yoo, B.(2004) Effeets of octenylsueeinylation on rheologieal properties of comstarch pastes, Starch 56:399-406).

As vantagens do procedimento de derivação do ASA são, porexemplo, que os produtos são não-tóxicos, as substâncias químicas sãobaratas, e a reação é um procedimento de apenas uma etapa (Trubiano, PC.[Em: Properties and uses of modified starches, 1986, Ed.: OWurzburg]Succinate and substituted succinate derivatives of starch, pp 131-147;Wurzburg, OB. 1995. Modified starches, Em: Food Science and Technology,Vol. 67, New York, pp. 67-97).De acordo com estudos anteriores de amidos, tanto os gruposhidroxilas primários quanto secundários reagem com OSA (Shogren, RL,Viswanathan, A., Felker, F., Gross, RA (2000), Distribution of octenylsuccinate groups in octenyl succinic anhydride modified waxy maize starch,Starch 52:196-204).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Há uma necessidade, particularmente em indústrias cosméticase biomédicas, de compostos que possuem a base de ácido hialurônico ouderivados que têm certas características alteradas quando comparadas aos HAnão-modificados. Propriedades de interesse são a maior capacidade deestabilizar espuma, e a capacidade de se misturar com materiais não-hidrofílicos, tal como é usado tipicamente em produtos cosméticos.

A invenção fornece produtos HA-derivados anfifílicos compropriedades benéficas em aplicações cosméticas e biomédicas. Estesprodutos aderem-se mais fortemente à pele, e assim não são facilmentelaváveis. Os derivados ASA- HA são também adequados para uso emformulações cosméticas e biomédicas mais avançadas, por exemplo, naformação de nano/macro cápsulas ou nano/macro esferas para liberação demedicamentos ou compostos ativos. Os derivados ASA-HA de pesomolecular menor (MW) penetrarão na pele mais eficientemente que os não-derivados de HA em comparação aos MW.

Nos exemplos nesta, o ácido hialurônico (HA) foi modificadocom anidridos alquil/aril succínico (ASA) sob condições alcalinas (pH > 8,0)em água. Os produtos resultantes foram purificados (diálise ou precipitação).Estes produtos purificados formaram agregados parcialmente insolúveis emágua. Uma solução 1% mostrou estabilizar espuma (menor tensão superficial+ maior viscosidade interfacial). Um espectroscópio RMN 1H confirmou quea estrutura química da "espinha dorsal" do HA no produto resultante nãoalterou, exceto pela introdução de grupos metade-ésteres ASA até um grau desubstituição (DS) de cerca de 18%.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a invenção dizrespeito aos derivados do ácido hialurônico compreendendo 'n' unidadesrepetidas e tendo a fórmula estrutural geral (!) em pH 8-9:

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em que, em pelo menos uma unidade repetida, um ou mais deRI, R2, R3, R4 compreende um ácido alquil-/aril-succínico éster ligado tendoa fórmula estrutural geral (II) em pH 8-9 e, de outra forma, RI, R2, R3, R4são grupos hidroxila, OH:

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que pelo menos um de R5, R6, R7, R8 compreende umgrupo alquila ou arila e, de outra forma, R5, R6, R7, R8 são átomoshidrogênio, H, e em que o oxigênio rotulado "éster" participa da ligação éstercom a estrutura (I).

Em outras palavras, um aspecto da invenção diz respeito a umderivado do ácido hialurônico, em que um ou mais grupo hidroxilas do ácidohialurônico foram substituídos em uma reação com um ou mais anidridoalquil-/aril-succínico (ASA), para formar uma ligação éster entre o ácidohialurônico e o um ou mais ácido alquil-/aril-succínico resultante.

Em um segundo aspecto, a invenção diz respeito a umprocesso de produção de um derivado do ácido hialurônico, compreendendoas etapas de:

(a) reagir um ácido hialurônico (HA) com um ou mais anidridoalquiWaril-succínico (ASA) tendo a fórmula estrutural geral mostrada em<formula>formula see original document page 8</formula>

sob condições alcalinas em uma solução aquosa, através daqual o derivado do ácido hialurônico é formado; e

(b) recuperar o derivado do ácido hialurônico.

Em um terceiro aspecto, a invenção diz respeito a umacomposição compreendendo um derivado do ácido hialurônico definido noprimeiro aspecto, e um ingrediente ativo, preferivelmente o ingrediente ativoé um agente farmacologicamente ativo.

Um quarto aspecto da invenção diz respeito a uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um derivado do ácidohialurônico definido no primeiro aspecto, juntamente com um carreador,excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Um quinto aspecto diz respeito a uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um derivado do ácidohialurônico definido no primeiro aspecto como um veículo, juntamente comum agente farmacologicamente ativo.

Um sexto aspecto diz respeito a um artigo cosméticocompreendendo um ingrediente ativo uma quantidade eficaz de um derivadodo ácido hialurônico definido no primeiro aspecto ou uma composiçãodefinida em quaisquer dos segundo, terceiro, ou quarto aspectos.

Em um sétimo aspecto, a invenção diz respeito a um artigosanitário, médico ou cirúrgico compreendendo um derivado do ácidohialurônico definido no primeiro aspecto ou uma composição definida emquaisquer dos segundo, terceiro, ou quarto aspectos, preferivelmente o artigoé uma fralda, uma toalha sanitária, uma esponja cirúrgica, uma esponja paratratamento de ferimentos, ou uma parte compreendida em um curativo de peleou outro material para proteção de ferimentos.

Um aspecto importante diz respeito a uma cápsula demedicamento, microcápsula, nanocápsulas, microesferas ou nanoesferascompreendendo um derivado do ácido hialurônico definido no primeiroaspecto ou uma composição definida em quaisquer dos terceiro, quarto, ouquinto aspectos.

Aspectos finais da invenção dizem respeito aos métodos deatuação nos procedimentos de oftalmologia, no tratamento das osteoartrite oucâncer, perda de cabelo ou calvície, no tratamento de ferimentos, na atuaçãoda administração transdérmica ou dérmica de um agente farmacologicamenteativo, ou administração dérmica de um cosmético, a melhoria compreendendoo uso de um derivado de ácido hialurônico definido no primeiro aspecto, ouuma composição definida em quaisquer dos segundo, terceiro, ou quartoaspectos.

Inúmeros aspectos dizem respeito aos usos de um derivado deácido hialurônico definido em quaisquer dos primeiros aspectos ou umacomposição como definida em quaisquer dos terceiro, quarto, ou quintoaspectos para a produção de um medicamento para o tratamento dasosteoartrite, câncer, à produção de um medicamento para um tratamentooftálmico, à produção de medicamento para o tratamento de um ferimento, àprodução de um medicamento para angiogênese, à produção de ummedicamento para o tratamento de perda de cabelo ou calvície, ou à produçãode um creme hidratante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. A modificação ASA esquemática do HA é ilustradana Figura 1.

Figura 2. O espectro RMN 1H designado parcialmente deOSA-HA (14919-033) 100 kDa dos exemplos 5 e 6.Figura 3. A estrutura química dos ASAs usados para modificarHA.

Figura 4. O triângulo de Haug resume o relacionamento entreRg e Mw para conformações diferentes de polímeros. Traçando-se gráfico doraio de giro (Rg) em função do peso molecular (MW) em uma escalalogarítmica dupla, pode-se obter informações sobre a conformação do polímero.

Figura 5. Perfis de concentração (RI) para o ASA modificadoHA LMW do exemplo 12 a seguir.

Figura 6. Resultados das medições de tensão superficial emOSA-HA LMW usando um tensiômetro de superfície (placa de Wilhemy)como descrito no exemplo 13.

Figura 7. Mostra as propriedades de emulsificação do ASA-HA após 24 horas e 8 semanas com palmitato de etilexila (óleo cosmético)preparado como descrito no exemplo 15.

Figura 8. A concentração de agregação crítica (CAC) de umderivado OSA-HA foi determinada pela calorimetria como descrito noExemplo 18, variações de entalpia (ΔΗ) na célula amostra foram registradascom o tempo como mostrado na Figura 8.

Figura 9. A variação de entalpia (AH) do Exemplo 18 foicolocada em gráfico em função da concentração OSA-HA na célula amostra,e a CAC do OSA-HA foi determinada no ponto de inflexão da curvatura.Cada experimento foi repetido três vezes e a CAC foi fornecida como umvalor médio. Por exemplo, a CAC do OSA-HA com um grau de substituição(DS) de 16 % foi de 0,45 mg/mL.

Figura 10. Mostra o comprimento de onda da emissão máximaem função do OSA-HA (DS = 44 %) concentração em tampão 1 comodescrito no Exemplo 19.

Figura 11. Mostra o comprimento de onda da emissão máximaem função da concentração de OSA-HA (DS = 44 %), e que a CAC diminuiquando a concentração de NaCl aumenta, como descrito no Exemplo 20.

Figura 12. Mostra o potencial Zeta do OSA-HA (DS =44 %, 1mg/mL) em NaCl 10" M determinado no Exemplo 21.

Figura 13. Mostra a transmissão dos elétrons no micrógrafodas micelas poliméricas do OSA-HA (DS = 44 %) do Exemplo 22, que estãoem forma esférica e têm dimensões submicrônicas tipicamente de 50 a 200 nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Acido Hialurônico

"Ácido hialurônico" é aqui definido como umaglicosaminoglicana não- sulfatada composta de unidades dissacarídeasrepetidas do N-acetilglicosamina (GIcNAc) e ácido glicurônico (GIcUA)ligados entre si por ligações glicosídicas beta- 1,4 e beta -1,3 alternadas. Oácido hialurônico é também conhecido como um hialuronan, hialuronato, ouHA. Os termos hialuronan e ácido hialurônico são usados indiferentementenesta.

Cristas de galo são uma fonte comercial significante parahialuronan. Microrganismos são uma fonte alternativa. A Patente U.S. No.4.801.539 revela um método de fermentação para preparar ácido hialurônicoenvolvendo uma cepa de Streptococcus zooepidemicus com produção relatadade cerca de 3,6 g de ácido hialurônico por litro. A Patente Européia No.EP0694616 revela processos de fermentação usando uma cepa melhorada deStreptococcus zooepidemicus com produção relatada de cerca de 3,5 g deácido hialurônico por litro. Como verificado em WO 03/054163(Novozymes), que está incorporado nesta inteiramente, o ácido hialurônico ouos sais deste podem ser recombinantemente produzidos, por exemplo, em umhospedeiro Bacillus Gram-positivo.

Foram descritas sintases de hialuronan de vertebrados,patógenos bacterianos, e vírus de algas (DeAngelis, P. L., 1999, Cell Mol.Life Sei. 56: 670-682). WO 99/23227 revela um hialuronato sintase Grupo Ido Streptococcus equisimilis. WO 99/51265 e WO 00/27437 descreve umhialuronato sintase Grupo II do Pasturella multoeida. Ferretti et al revelam ooperon sintase hialuronan Streptocoeeus pyogenes, que é composto por trêsgenes, hasA, hasB, e hasC, que codificam a hialuronato sintase, deidrogenaseglicose UDP, e pirofosforilase UDP-glicose, respectivamente (Proc. Natl.Acad. Sei. USA. 98, 4658-4663, 2001). WO 99/51265 descreve um segmentode ácido nucléico tendo uma região codificada para um sintase hialuronanStreptocoeeus equisimilis.

Uma vez que o hialuronan de uma célula de Bacillusrecombinante é expresso diretamente de um meio de cultura, um processosimples pode ser usado para isolar o ácido hialurônico do meio de cultura.Primeiramente, as células do Bacillus e os restos celulares são fisicamenteremovidos do meio de cultura. O meio de cultura pode ser diluído primeiro, sedesejado, para reduzir a viscosidade do meio. Muitos métodos são conhecidospelos versados na tecnologia para remoção de células de meio de cultura, taiscomo centrifugação e microfiltração. Se desejado, o sobrenadante restantepode então ser filtrado, tal como por ultrafiltração, para concentrar e removermoléculas contaminantes pequenas do hialuronan. Seguindo a remoção dascélulas e dos restos celulares, uma precipitação simples de hialuronan do meioé realizada por mecanismos conhecidos. Sal, álcool, ou combinações de sal eálcool podem ser usados para precipitar o hialuronan do filtrado. Uma vezreduzido a um precipitado, o hialuronan pode ser facilmente isolado dasolução por recursos físicos. O hialuronan pode ser seco ou concentrado dasolução filtrante pelo uso de técnicas evaporativas conhecidas na tecnologia,tal como secagem por sopro com jato.

O primeiro aspecto da invenção diz respeito a um derivado doácido hialurônico compreendendo η unidades repetidas e tendo a fórmulaestrutural geral (!) em pH 8-9:

<formula>formula see original document page 13</formula>

em que, em pelo menos uma unidade repetida, um ou mais deRI, R2, R3, R4 compreende um ácido alquil-/aril-succínico éster-ligado tendoa fórmula estrutural geral (II) em pH 8-9 e, de outra forma, RI, R2, R3, R4são grupos hidroxilas, OH:

<formula>formula see original document page 13</formula>

em que pelo menos um de R5, R6, R7, R8 compreende umgrupo alquila ou arila e, de outra forma, R5, R6, R7, R8 são átomoshidrogênio, H, e em que o oxigênio rotulado "éster" participa da ligação éstercom a estrutura (I).

Em uma modalidade preferida do primeiro aspecto, dois oumais de RI, R2, R3, R4 compreendem um ou mais ácido alquil-/aril-succínicoéster-ligados tendo a fórmula estrutural geral (II) em pH 8-9; preferivelmentetrês ou mais de RI, R2, R3, R4 compreendem um ou mais ácido alquil-/aril-succínico éster-ligados tendo a fórmula estrutural geral (II) em pH 8-9.

Em uma outra modalidade preferida do primeiro aspecto, pelomenos um de R5, R6, R7, R8 compreende um grupo alquila, preferivelmentepelo menos um de R5, R6, R7, R8 compreende um grupo alquila, maispreferivelmente pelo menos três dos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupoalquila; preferivelmente o grupo alquila compreende um grupo alquila CrC2O,

preferivelmente propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila,ou 2-octadecenila.

Ainda uma outra modalidade preferida diz respeito aoderivado HA do primeiro aspecto, em que pelo menos um de R5, R6, R7, R8compreende um grupo arila, preferivelmente pelo menos dois dos R5, R6, R7,R8 compreende um grupo arila, mais preferivelmente pelo menos três dos R5,R6, R7, R8 compreendem um grupo arila; e preferivelmente o grupo arila é um fenila.

Prefere-se que R5, R6, R7, R8 compreendam dois ou maisgrupos alquila e/ou arila diferentes, preferivelmente escolhidos de propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, 2-octadecenila e fenila.

Peso molecular

O nível de ácido hialurônico pode ser determinado de acordocom o método carbazol modificado (Bitter e Muir, 1962, Anal Biochem. 4:330-334). Além disso, o peso molecular médio do ácido hialurônico pode serdeterminado usando métodos padrões na tecnologia, tal como aquele descritopor Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Buli. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993 ,Anal.Chim. Acta 272: 1-40; e Wyatt Technologies, 1999, "Light ScatteringUniversity DAWN Course Manual" e "Manual EOS DAWN" WyattTechnology Corporation, Santa Bárbara, Califórnia.

Em uma modalidade preferida, os derivados do ácidohialurônico obtidos por métodos da presente invenção têm um peso molecularde cerca de 800 a 10.000.000 Da. Em uma modalidade mais preferida, osderivados do ácido hialurônico obtidos pelos métodos da presente invençãotêm um peso molecular de cerca de 1.000 a 9.000.000 Da; de 2.000 aaproximadamente 10.000.000 Da; de 4.000 a cerca de 10.000.000 Da; de8.000 a cerca de 10.000.000 Da; de 10.000 a cerca de 10.000.000 Da; ou de25.000 a cerca de 5.000.000 Da. Mesmo que em uma modalidade maispreferida, os derivados do ácido hialurônico obtidos pelos métodos dapresente invenção têm um peso molecular de 50.000 a cerca de 3.000.000 Da.

Uma outra modalidade preferida diz respeito ao produto doprimeiro aspecto, em que o ácido hialurônico ou o sal deste tem um pesomolecular na faixa de 300.000 a 3.000.000; preferivelmente na faixa de400.000 e 2.500.000; mais preferivelmente na faixa de 500.000 e 2.000.000; emais preferivelmente na faixa de 600.000 e 1.800.000 Da.

No caso em que o ácido hialurônico produzidorecombinantemente ou sal deste é usado nos métodos da invenção paraproduzir os produtos ou as composições da invenção, pode ser vantajoso paraalgumas aplicações primeiro reduzir o peso molecular médio do ácidohialurônico ou derivados ou sais deste. Por exemplo, foi declarado por muitosfabricantes das assim chamadas frações de baixo peso molecular do ácidohialurônico, que são capazes de penetrar a barreira da pele para restabelecer oconteúdo natural de ácido hialurônico na pele, portanto tais frações sãoparticularmente adequadas para composições cosméticas vendidas comoagentes anti-envelhecimento da pele e anti-rugas. Para aplicaçõesalimentícias, ácido hialurônico de baixo peso molecular MW mostroupenetrar a barreira gastrointestinal, dessa forma aumentando suabiodisponibilidade. Finalmente, o ácido hialurônico de baixo peso molecularMW demonstra efeito antinflamatório e tem aplicações potenciais notratamento de doenças inflamatórias. Uma redução do peso molecular médiode um ácido hialurônico ou derivado ou sal deste pode ser alcançada por20 métodos padrões na tecnologia, tais como, tratamento por aquecimentosimples, degradação enzimática, sonicação através de ultra-som, ou hidróliseácida. Veja, por exemplo, a patente US 6.020.484, que descreve uma técnicade ultra-sonicação de HA incluindo NaOCl como aditivo, e T. Miyazaki et al.(2001) Polymer Degradation and Stability, 74: 77-85.

Conseqüentemente, uma modalidade preferida diz respeito aoderivado HA da invenção, em que o ácido hialurônico ou derivado ou saldeste tem um baixo peso molecular médio na faixa de 800 a 10.000.000 Da;preferivelmente na faixa de 10.000 a 1.500.000 Da; preferivelmente na faixade 10.000 a 50.000 Da; ou preferivelmente na faixa de 50.000 a 500.000 Da;ainda mais preferivelmente na faixa de 80.000 a 300.000 Da.Grau de substituição (DS)

DS foi determinado por um Espectroscópio RMN 1H (10mg/mL, D2O, 80°C, 128 varreduras, 400 MHz) de acordo com o exemplo 6 aseguir, em que os picos do grupo OSA foram designados pelo uso de umRMN -2D (gCOSY). O DS foi então calculado comparando a intensidade dosprótons vinil do OSA (5,4 e 5,6 ppm) com aquela dos prótons acetil (2,0PPm).

Em uma modalidade preferida o derivado HA do primeiroaspecto tem um Grau de substituição (DS) na faixa de 0,1 - 100%,preferivelmente 1 - 90%, mais preferivelmente 2 - 80%, ainda maispreferivelmente 4 - 70%, ainda mais preferivelmente 8 - 60%, ou 10 - 50%,14 - 40%, 16 - 30%, ou mais preferivelmente na faixa de 18 - 25%.Anidrido alquil-/aril-succínico (ASA)

Em uma modalidade preferida da invenção, um ou maisanidrido alquil-/aril-succínico (ASA) têm a fórmula estrutural geral (III):

<formula>formula see original document page 16</formula>

Em uma modalidade preferida, pelo menos um de R5, R6, R7,R8 compreende um grupo alquila, mais preferivelmente pelo menos dois dosR5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila, ainda mais preferivelmentepelo menos três dos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila; epreferivelmente o grupo alquila compreende um grupo alquila C1-C20,preferivelmente propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila,ou 2-octadecenila.

Em uma outra modalidade preferida, pelo menos um de R5,R6, R7, R8 compreende um grupo arila, preferivelmente pelo menos dois dosR5, R6, R7, R8 compreendem um grupo arila, mais preferivelmente pelomenos três dos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo arila, quepreferivelmente compreende um fenila.

Em ainda uma outra modalidade preferida R5, R6, R7, R8compreendem dois ou mais grupos alquila e/ou arila diferentes,preferivelmente escolhidos de propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, 2-octadecenila e fenila.

Ainda em uma outra modalidade preferida, um ou mais ASAcompreendem qualquer fórmula estrutural mostrada na figura 3.

Produção

Nos métodos da presente invenção, pode-se usar HArecombinantemente produzido que é produzido por um processo, em que ascélulas hospedeiras produtoras de HA são cultivadas em um meio nutrienteadequado para a produção do ácido hialurônico usando métodos conhecidosna tecnologia. Por exemplo, a célula pode ser cultivada pelo cultivo em frascode agitação, fermentação em escala maior ou menor (incluindo fermentaçõescontínua, em lotes, semi-contínua ou de estado sólido) em fermentadoresindustriais ou em laboratórios executados em um meio adequado e sobcondições que permitam que as enzimas envolvidas na síntese do ácidohialurônico sejam expressas e o ácido hialurônico seja isolado. O cultivoocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de nitrogênio ecarbono e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na tecnologia.Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem serpreparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, emcatálogos da American Type Culture Collection). O ácido hialurônicosecretado pode ser recuperado diretamente do meio.

O ácido hialurônico resultante pode ser isolado por métodosconhecidos na tecnologia. Por exemplo, o ácido hialurônico pode ser isoladodo meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mais semlimitações, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão,evaporação, ou precipitação. O ácido hialurônico isolado pode então seradicionalmente purificado por uma variedade de procedimentos conhecidosna tecnologia incluindo, mais sem limitações, cromatografia (por exemplo,troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão portamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focado em preparadosisoelétricos), solubilidade diferenciada(por exemplo, precipitação por sulfatode amônio), ou extração (veja, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Jansone Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

Células Hospedeiras

Uma modalidade preferida diz respeito a onde o ácidohialurônico ou sal deste é produzido recombinantemente, preferivelmente poruma bactéria Gram-positiva ou célula hospedeira, mais preferivelmente poruma bactéria do gênero Bacillus.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula Bacillusadequada para produção recombinante de ácido hialurônico. A célulahospedeira Bacillus pode ser uma célula Bacillus tipo-selvagem ou umamutante desta. Células Bacillus úteis na prática da presente invenção incluem,mais sem limitações, células de Bacillus agaraderhens, Bacillus alkalophilus,Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillusclausii, Bacillus coagulans, Bacillus firm us, Bacillus lautus, Bacillus lentus,Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis. Célulasmutantes de Bacillus subtilis particularmente adaptadas para expressãorecombinante estão descritas na WO 98/22598. Células de Bacillus não-encapsuladas são particularmente úteis na presente invenção.

Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira Bacillus éuma célula Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus lentus,Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Emuma modalidade mais preferida, a célula Bacillus é uma célula Bacillusamyloliquefaciens. Em uma outra modalidade mais preferida, a célulaBacillus é uma célula Bacillus elausii. Em uma outra modalidade maispreferida, a célula Bacillus é uma célula Bacillus lentus . Em uma outramodalidade mais preferida, a célula Bacillus é uma célula BacillusIieheniformis. Em uma outra modalidade mais preferida, a célula Bacillus éuma célula Bacillus subtilis. Em uma outra modalidade mais preferida, acélula hospedeira Bacillus é uma célula Bacillus subtilis A164L 5 (vejaPatente U.S. No. 5, 891, 701) ou Bacillus subtilis 168M.

A transformação da célula hospedeira Bacillus com umaconstrução de ácido nucléico na presente invenção pode, por exemplo, serefetuada por uma transformação protoplasta (veja, por exemplo, Chang eCohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), por uso de célulascompetentes (veja, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journal ofBacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal ofMolecular Biology 56: 209-221), por eletroporação (veja, por exemplo,Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou por conjugação(veja, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5271-5278).

Sais e HA reticulado

Uma modalidade preferida diz respeito ao derivado do ácidohialurônico do primeiro aspecto, que compreende um sal inorgânico do ácidohialurônico, preferivelmente hialuronato de sódio, hialuronato de potássio,hialuronato de amônio, hialuronato de cálcio, hialuronato demagnésio,hialuronato de zinco, ou hialuronato de cobalto.

A preparação de um HA reticulado ou sal deste, que épreparado pela reticulação de um HA com um composto epóxi polifuncionalestá revelado em EP 0 161 887 BI. Esteres de HA reticulados total ouparcialmente com um álcool alifático, e sais de tais ésteres parciais com basesorgânicas ou inorgânicas, estão reveladas em US 4.957.744. Outras formas dereticulação de HA estão reveladas nas patentes U.S. Nos. 5.616.568.5.652.347 e 5.874.417.

HA reticulado pode também ser preparado pelo tratamento deHA com ácido bórico, como se segue: Hialuronato de sódio seco (Na-HA,203 mg), recombinantemente produzido em um Bacillus subtilis porfermentação(WO 03/054163; Novozymes), foi dissolvido em NaOH 0,2 Mpara dar uma solução de 4%. Ácido bórico (35 mg (aproximadamente 1equivalente do dissacarídeo HA) foi adicionado e a amostra foi agitada àtemperatura ambiente por 1,5 hora, e então armazenada à 5°C poraproximadamente 2,5 dias. Uma amostra controle foi preparada em paraleloexatamente como descrito anteriormente, mas sem ácido bórico. Aviscosidade do hidrogel HA-borato resultante foi medida à 25°C usando umreômetro de tensão controlada CSL Carrimed (geometria do cone: 6 cm, 2°).A viscosidade dependeu da taxa de cisalhamento e aumentou pelo menos 4vezes (de 4,2- a 8,4 vezes) em hidrogel HA-borato quando comparado àamostra controle, indicando formação de uma rede reticulada. Picos novos à1.200 e 945 cm"1 foram observados no espectro FT-IR do hidrogel HA-borato,quando comparados ao espectro padrão de Na-HA, correspondendo àpresença de ésteres de borato formados novamente no hidrogel HA-boratoreticulado.

Conseqüentemente, uma modalidade preferida diz respeito aoderivado HA do primeiro aspecto, que compreende um ácido hialurônicoreticulado ou sal deste, preferivelmente o ácido hialurônico é reticulado com oácido bórico, e mais preferivelmente o ácido hialurônico reticuladocompreende ésteres de borato.

Tamanho de Partícula

Um derivado HA preferido do primeiro aspecto tem umtamanho de partícula 50 percentil do qual, D50, está entre IOe 1.000 microns,preferivelmente entre 100 e 1.000 microns, mais preferivelmente entre 150 e900 microns, e ainda mais preferivelmente entre 200 e 800 microns,determinado pela medição por difração a laser das partículas suspensas emisopropanol.

Em uma modalidade preferida, a polidispersão do derivadoHA do primeiro aspecto é medida como um valor SPAN, que é calculado deacordo com a fórmula seguinte: SPAN = (D90-D i0)/D50, e o valor SPAN estáentre 1,0 e 2,5, preferivelmente o valor SPAN está entre 1,2 e 2,2, maispreferivelmente o valor SPAN está entre 1,5 e 1,9; e acima de tudopreferivelmente o valor SPAN está entre 1,6 e 1,8.

Micropartículas

Como mostrado nos exemplos a seguir, a presente invençãofornece derivados ASA-HA que são capazes de formar micro ounanopartículas, ou micro ou nanocápsulas. Tais partículas ou cápsulas, oucomposições que compreendem estas, podem ser usadas em um enormenúmero de aplicações científicas e comerciais, tais como em cosméticos ou naliberação de medicamentos em geral.Outros ingredientes

Em uma modalidade preferida, as composições compreendemum derivado HA da invenção que podem também compreender outrosingredientes, preferivelmente um ou mais ingredientes ativos, preferivelmenteuma ou mais substâncias ativas farmacologicamente, e tambémpreferivelmente um excipiente solúvel em água, tal como a lactose.

Exemplos não-limitantes de um ingrediente ativo ousubstância farmacologicamente ativa que podem ser usados na presenteinvenção incluem proteína e/ou medicamentos/drogas peptídicos, tais como,hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento bovino,hormônio do crescimento suíno, hormônio do crescimento liberandopeptídeo/hormônio, fator estimulante de colônia de granulócitos, fatorestimulante de colônia de macrófagos granulócitos, fator estimulante decolônia de macrófagos, eritropoietina, proteína morfogênica dos ossos,interferon ou derivado deste, insulina ou derivado desta, atriopeptina-III,anticorpo monoclonal, fator de necrose tumoral, fator ativador de macrófagos,interleucina, fator de degeneração tumoral, fator de crescimento tipo insulina,fator de crescimento epidérmico, tecido ativador de plasminogênio, fator IIV,fator IIIV, e uroquinase.

Um excipiente solúvel em água pode ser incluído com opropósito de estabilizar os ingredientes ativos, tal excipiente pode incluir umaproteína, por exemplo, gelatina ou albumina; um aminoácido, tal comoglicina, alanina, ácido glutâmico, arginina, lisina e um sal deste; carboidratotal como glicose, lactose, xilose, galactose, frutose, maltose, sacarose,dextrano, manitol, sorbitol, trealose e sulfato de condroitina; um salinorgânico tal como fosfato; um agente tensoativo tal como TWEEN® (ICI),polietilenoglicol, e uma mistura destes. O excipiente ou estabilizador pode serusado em uma quantidade variando de 0,001 a 99% em peso do produto.

Muitos aspectos da invenção dizem respeito a váriascomposições e produtos farmacêuticos compreendendo, entre outrosconstituintes, uma quantidade eficaz do produto definido no primeiro aspecto,e um ingrediente ativo, preferivelmente o ingrediente ativo é um agentefarmacologicamente ativo; um carreador, excipiente ou diluentefarmaceuticamente aceitável, preferivelmente um excipiente solúvel em água,e acima de tudo preferivelmente a lactose.

Além disso, aspectos da invenção dizem respeito aos artigoscompreendendo um derivado HA definido no primeiro aspecto ou umacomposição definida nos aspectos e modalidades anteriormente, por exemplo,um artigo cosmético, um artigo sanitário, um artigo médico ou cirúrgico. Emum aspecto final, a invenção diz respeito a uma cápsula de medicamento oumicrocápsula compreendendo um produto definido no primeiro aspecto ouuma composição definida em outros aspectos e modalidades da invenção.

EXEMPLOS

Materiais

Ácido Hialurônico (HA) de alto peso molecular (Alto-MW):

-(lote MAG 30014)

- (lote MAF 145 SD)HA de baixo peso molecular (Baixo-MW):

- 100 kDa (lote 14919-021)

-30 kDa (lote 14919-032)

-23 kDa

- 14 kDa

Anidridos Alquil /Aril succínico:

- anidrido cis/trans-2-octen-l-ilsuccínico (OSA), AldrichChemical Company (d.: 1.000, MW 220.27, 97% pureza).

- anidrido fenilsuccínico (PhSA) (pó seco, MW 176.17).

- anidrido nonenilsuccínico (NSA) Aldrich ChemicalCompany (d.: 1.032, MW 224.30, 95+% pureza, 1JS38, 246-00198-1).

- anidrido dodecenilsuccínico (DSA) (d.: 1.01, MW 266.38,1JS38, 246-00168).

- anidrido tetrapropilsuccínico (TpSA).

- anidrido hexadecenil succínico (HDSA)

- anidrido octadecenil succínico (ODSA)

- Mistura de (50:50) de ODSA e HDSA

Etanol 96% desnaturado

HCl 4 M, e NaOH 4 M.

Na2CO3

Água ultrapura Milli-Q® (Millipore).

Tubos de diálise de celulose regenerada com um pesomolecular de corte de 12-14 kDa, 10 Spectr/Por M (Indústrias MédicasEspectro).

Membranas de ultrafiltração (MWCO 10 kDa e 3 kDa).Exemplo 1. OSA-HA Alto-MW, pH inicial 9,0, precipitação por etanol

HA (lote MAF 145 SD, 1,42 g) foi dissolvido durante umanoite à temperatura ambiente em água Milli-Q (200 mL) antes de ajustar o pHem 9,0 com NaOH 4 M. OSA (1 mL, 4,54 mmol) foi adicionado sob umaagitação vigorosa. A solução reagiu naturalmente com agitação vigorosa(aproximadamente 600 rpm) por 16 horas à temperatura ambiente. 20 mL desolução saturada de NaHCOs foi adicionada para tamponar a reação. Após areação, o pH foi ajustado e, 6,8 com HCl 1M. O produto foi recuperado porprecipitação com etanol pela adição de etanol 96% (4 volumes) para dar umaconcentração final de 80 % volume/volume. O precipitado foi recuperado porcentrifugação (3.000 rpm, 15 minutos e 4 gc.). O precipitado foi lavado cometanol 96 % antes de ser ré-dissolvido em água MQ e liofilizado.

Exemplo 2. OSA-HA Alto-MW, pH inicial 11, precipitação por etanol

A cada uma das três soluções de 50 mL de água Milli-Q, HA(lote MAF 145 SD, 1,13 g) foi adicionado e dissolvido naturalmente duranteuma noite à temperatura ambiente. O pH foi ajustado em 11 com NaOH 4 M.Quantidades diferentes de OSA (1,10 mL (5,23 mmol), 0,505 mL (2,62 mmol), 0,110 mL (0,52 mmol)) foram adicionadas a cada uma das trêssoluções sob agitação vigorosa. As soluções reagiram naturalmente emagitação vigorosa (aproximadamente 600 rpm) por 21 horas à temperaturaambiente. Todas as amostras tinham um pH de cerca de 4-5 após a reação. Oproduto foi recuperado por precipitação por etanol pela adição de etanol 96 %(4 volumes) para dar uma concentração final de 80 % volume/volume. Oprecipitado foi recuperado por centrifugação (3000 rpm, 15 min e 4°C). Oprecipitado foi lavado com etanol 96 % antes de ser re-dissolvido em águaMQ e liofilizado.

Exemplo 3. OSA-HA Alto-MW, pH inicial 9,0, pH mantido entre 9-11,diálise

HA (lote MAF 145 SD5 0,75 g) foi dissolvido por toda a noiteà temperatura ambiente em água Milli-Q (150 mL) antes de ajustar o pH em9,0. OSA (1,42 mL, 6,25 mmol) foi adicionado sob uma agitação vigorosa. Asolução reagiu naturalmente em uma agitação vigorosa (aproximadamente600 rpm) por 16 horas à temperatura ambiente. O pH foi mantido em torno de9-11 pelo uso de um estabilizador de pH (adicionando NaOH 1 Μ). O produtofoi dialisado 3 χ 3 h contra água MQ (4°C, 7 L, MWCO 12-14,000 Da),congelado e liofilizado.

Exemplo 4. OSA-HA Alto-MW, pH inicial 8,5, pH mantido entre 9-11,diálise

HA (lote MAG 30014, 0,75 g) foi dissolvido por toda a noite àtemperatura ambiente em água Milli-Q (150mL) antes de ajustar o pH em 8,5.OSA (1,42 mL, 6,25 mmol) foi adicionado sob uma agitação vigorosa. Asolução foi deixada sob agitação vigorosa (aproximadamente 600 rpm) por 16horas à temperatura ambiente. O pH foi mantido em torno de 9-11 pelo uso deum estabilizador de pH (adicionando NaOH 1 Μ). O pH foi ajustado em 6,5pelo uso de HCl 1M. O produto foi dialisado 3 χ 3 h contra NaOH 0,2 M, e 3χ 3 h contra água MQ (4°C, 7 L, MWCO 12-14,000 Da), congelado eliofilizado.

Exemplo 5. OSA-HA Baixo-MW (30 e 100 kDa)

HA baixo-MW (30 ou 100 kDa, 2,5 g) foi dissolvido por todaa noite à temperatura ambiente em água Milli-Q (50 mL) antes de ajustar opH em 8,5. Quantidades equimolares de OSA (3,35 mL, HA:OSA proporçãode 1:1) ou 1/10 da concentração molar de HA (0,35mL, HA:OSA proporçãode 10:1) foram adicionadas sob agitação vigorosa. A solução reagiunaturalmente em uma agitação vigorosa (aproximadamente 600 rpm) por 16horas à temperatura ambiente. O pH foi mantido em torno de 8,5-9,0 pelo usode um estabilizador de pH (adicionando NaOH 0,5 M ou 1 Μ). O produto foidialisado 3 χ 3 h contra água MQ (4°C, 7 L, MWCO 12-14.000 Da),congelado e liofilizado.

Exemplo 6. Caracterização do Produto - Resultados e discussão

Peso Molecular

OSA-HA 100 kDa do exemplo 5 foi analisado usando SEC-MALLS-VISC (fase móvel: NaCl 150 mM, NaH2PO4 50 mM, pH 7,0, 0,5mililitros/minuto, volume injetado: 0,5 mililitros). Colunas usadas: PLaquagel OH-40/OH-50/OH60. Sistema: sistema Waters Alliance HPLCdetector Waters 2410 RI e detector Wyatt MALLS. Os dados foramprocessados usando o software ASTRA V da Wyatt Technology Corp.Grau de substituição (DS)

DS foi determinado por espectroscopia RMN 1H (10 mg/mL,D2O, 80°C, 128 varreduras, 400 MHz). Os picos do grupo OSA foramdeterminados pelo uso de um 2D-RMN (gCOSY).

Resultados e Discussão; HA Alto-MW

Durante todos os experimentos com HA alto-MW asobservações foram as mesmas: OSA forma gotas de óleo de cor âmbar quegradualmente dividem-se em gotas menores por causa da agitação. Ao finalda reação, a solução estava branca e opaca como leite, que pode serinterpretado como formação de micelas ou agregados/gotículas em micro-escala. Mesmo após a purificação por precipitação ou diálise, em que oexcesso de OSA é removido, este fenômeno foi ainda observado em níveisdiferentes.

Durante os primeiros experimentos com HA alto-MW,precipitação em etanol 80 % foi usada para remover o excesso de produtoproveniente da modificação do OSA. Entretanto, devido aos problemas com aobtenção do produto para precipitá-lo completamente, diálise contra águaMilli-Q foi escolhida como um método melhor.

As preparações iniciais de OSA-HA alto-MW todas mostrarammudanças nas propriedades da solução. Um exemplo é que todas elasestabilizaram-se em espuma muito eficientemente por muitas horas; isto foisimplesmente testado agitando um solução 1 % seguida por inspeção visual.Uma outra observação durante os primeiros experimentos foi, que o valor depH da solução declina gradualmente durante a reação. Então, foi necessáriotanto tamponar o sistema, por exemplo, com NaCO3, quanto pelo uso de umestabilizador de pH. É importante que o valor de pH fique acima de 8,0 para areação proceder, e abaixo de 9,0 para evitar remoção dos grupos OSA por hidrólise.

Espectroscopia RMN foi tentada nos produtos OSA-HA alto-MW5 mas, por causa de problemas de solubilidade, somente alguns picosmuito fracos de OSA e HA foram observados, e nenhum DS pôde serdeterminado. Em todos os casos, as produções estavam perto ou levementemaiores que a quantidade de material inicial de HA (determinado por pesodos produtos liofilizados).Resultados e discussão; HA Baixo-MW

Quatro experimentos separados foram executados e estãoresumidos na Tabela I juntamente com o DS da espectroscopia NMR 1H e osrendimentos. O DS é calculado pela comparação da intensidade dos prótonsvinil do OSA (5,4 e 5,6 ppm) com aquele dos prótons acetil (2,0 ppm).

O espectro RMN 1H do OSA-HA 30 kDa foi elucidado porespectroscopia 2D RMN (gCOSY), e os picos determinados parcialmente são dadosna Figura 2, mostrando o espectro 1HNMRdo OSA-HA 100 kDa (14919-033).

Conclusivamente, nestes experimentos ambos os ácidoshialurônicos de alto e baixo-MW foram modificados de forma bem sucedidacom anidrido 2-octen-l-il succínico (OSA).

Tabela 1. Resultados da preparação de OSA-HA Baixo-MW.

<table>table see original document page 27</column></row><table>Exemplo 7. Derivados OSA-HA baixo-MW (14 kDa)

HA baixo-MW (14 kDa, 2,5 g) foi dissolvido em água Milli-Q(50 mL) à temperatura ambiente antes de ajustar o pH em 8,5. Quantidadesequimolares de OSA (3,35 mL, HA:OSA proporção 1:1) ou 1/10 daconcentração molar de HA (0,34 mL, HA:OSA proporção 10:1) foramadicionados sob agitação vigorosa. A solução reagiu naturalmente sobagitação vigorosa (aproximadamente 600 rpm) por 16 horas à temperaturaambiente. O pH foi mantido em torno de 8,5-9,0 pelo uso de um estabilizadorde pH (adicionando NaOH 0,5M). O produto foi dialisado 3 χ 3 h contra água MQ (4°C, 7L, MWCO 12-14,000Da), congelado e liofilizado. Osrendimentos após a purificação e liofilização foram 2,1 g e 2,1 g,respectivamente. DS foram determinados como descrito no Exemplo 6 para-11,5 % e 2,6 %, respectivamente.

Exemplo 8. Derivados HA do Anidrido fenil-succínico baixo-MW (PhSA)(14 kDa)

HA baixo-MW (14 kDa, 2,5 g) foi dissolvido em água Milli-Q(50mL) à temperatura ambiente antes de ajustar o pH em 8,5. Quantidadesequimolares de PhSA (2,8 g, HA:PhSA proporção 1:1) ou 1/10 daconcentração molar do HA ( 0,28 g, HA:PhSA proporção 10:1) foramadicionados gradualmente sob agitação vigorosa. A solução reagiunaturalmente sob agitação vigorosa (aproximadamente 600 rpm) por 16 horasà temperatura ambiente. O pH foi mantido em torno de 8,5-9,0 pelo uso deum estabilizador de pH (adicionando NaOH 0.5 Μ). O produto foi dialisado 3χ 3 h contra água MQ (4°C, 7L, MWCO 12-14,000Da), congelado eliofilizado. Os produtos após a purificação e liofilização foram 2,5 g e 2,4 g,respectivamente. DS foram determinados como descrito no Exemplo 6 em 15,1 % e 2,6 %, respectivamente.

Exemplo 9. Derivados HA do Anidrido 2-nonen-l-ilsuccínico baixo-MW(NSA) (14 kDa)HA baixo-MW (14k Da, 2,5 g) foi dissolvido em água Milli-Q(5OmL) à temperatura ambiente antes de ajustar o pH em 8.5. Quantidadesequimolares de NSA (3,55 mL, HA:NSA proporção 1:1) ou 1/10 daconcentração molar de HA (0,35mL, HA:NSA proporção 10:1) foramadicionados sob agitação vigorosa. A solução reagiu naturalmente sobvigorosa agitação (aproximadamente 600 rpm) por 16 horas à temperaturaambiente. O pH foi mantido em torno de 8,5-9,0 pelo uso de um estabilizadorde pH (adicionando NaOH 0,5 Μ). O produto foi dialisado 3 χ 3 h contraágua MQ (4°C, 7L, MWCO 12-14.000 Da), congelado e liofilizado. Osprodutos após purificação e liofilização foram 2,4 g e 2,2 g, respectivamente.DS foram determinados como descrito no Exemplo 6 para 11,4 % e 2,1 %,respectivamente.

Exemplo 10. Derivados HA do Anidrido 2-dodecen-l-ilsuccínico baixo-MW (DSA) (14 kDa)

HA baixo-MW (14kDa, 2,5g) foi dissolvido em água Milli-Q(50mL) em temperatura ambiente antes de ajustar o pH em 8,5. Quantidadesequimolares de DSA (4,20 mL, HA:DSA proporção 1:1) ou 1/10 daconcentração molar de HA (0.42 mL, HA:DSA proporção 10:1) foiadicionado sob agitação vigorosa. A solução reagiu naturalmente sob vigorosaagitação (aproximadamente 600 rpm) por 16 horas à temperatura ambiente. OpH foi mantido em torno de 8,5-9,0 pelo uso de um estabilizador de pH(adicionando NaOH 0,5M). O produto foi dialisado 3 χ 3 h contra água MQ(4°C, 7L, MWCO 12-14.000 Da), congelado e liofilizado. Os produtos apóspurificação e liofilização foram 2,2g e 2,2g, respectivamente. DS foramdeterminados como descrito no Exemplo 6 para 2,2 % e 1,7 %,respectivamente.

Exemplo 11. Derivados HA do Anidrido tetrapropilsuccínico baixo-MW(TpSA) (14 kDa)

HA baixo-MW (14kDa, 2,5 g) foi dissolvido em água Milli-Q(50 mL) à temperatura ambiente antes de ajustar o pH em 8,5. Quantidadesequimolares de TpA (3,25 mL, HA:TpSA proporção 1:1) ou 1/10 daconcentração molar de HA (0,33 mL, HArTpSA proporção 10:1 foramadicionados sob agitação vigorosa. A solução reagiu naturalmente sobvigorosa agitação (aproximadamente 600 rpm) por 16 horas à temperaturaambiente. O pH foi mantido em torno de 8,5-9,0 pelo uso de um estabilizadorde pH (adicionando NaOH 0,5 Μ). O produto foi dialisado 3 χ 3 h contraágua MQ (4°C, 7L, MWCO 12-14.000 Da), congelado e liofilizado.

Exemplo 12. Vários derivados HA ASA baixo-MW (14 kDa)

Onze experimentos separados foram executados modificandoHA LMW (14 kDa) com cinco diferentes ASAs (veja Figura 3 para os nomesASA , estruturas, e abreviações) em duas proporções molares diferentesHA:ASA (1:1 e 10:1). Os produtos resultantes foram purificados por diálisepara remover o excesso de reagente e subprodutos. O grau de substituição(DS) foi determinado em uma base monômera por espectroscopia RMN 1H. Oproduto foi determinado gravimetricamente nas amostras liofilizadas. Pesomolecular foi determinado por SEC-MALLS-VISC. Para evitar que materialficasse agarrado nas colunas de GPC, a temperatura foi ajustada de 4°C para15°C no auto-injetor. Todos os resultados das análises estão resumidos naTabela 2.

Tabela 2. Resultados da preparação e caracterização do HA LMW ASAmodificado (14 kDa material inicial).

<table>table see original document page 30</column></row><table>(a): Versão subtraída e repetida de 14658-148. PhSA foi adicionado em pequenas porçõesao invés de todas de uma só vez. (b): Problemas com DSA - muito pesado para dispersareficientemente com agitação normal; uma fase oleosa foi formada durante a diálise queteve que ser removida com pipeta e descartada, (c): Distribuição bimodal; pico 1:15,5 kDa,pico 2:27,2 kDa (*): Atualmente sendo analisado.

Como pode-se ver nos resultados da Tabela 2, a reação dederivação corre sem problemas quando um DS menor é o resultado desejado.Os DS's obtidos são muito similares para todos os diferentes ASAs, excetopara o PhSA que aparentemente é muito instável em água, resultando em umvalor baixo de DS (2.19) para a amostra 14658-148. O experimento foirepetido na medida em que o pó PhSA foi adicionado gradualmente à soluçãoHA. Este resultou em um DS de 15 % (15286-017), mostrando que a adiçãogradual de ASA poderia ser uma forma de aumentar a substituição em HA.

Para o HA LMW modificado com DSA, os valores DS sãotambém muito baixos em uma alta proporção de ASA:HA. Isto éprovavelmente por causa da alta viscosidade da fase DSA. Além disso, asgotículas de ASA não-reagentes poderiam ainda ser vistas após a diálise eliofilização. Estas tiveram que ser removidas manualmente por uma pipeta.

Provavelmente, o DS e a pureza do DSA-HA podem sermelhorados pelo aumento de temperatura durante a reação combinada comagitação muito vigorosa. Adicionando-se o DSA gradualmente, pode-setambém aumentar a quantidade de DSA reagente com o HA. As amostrasTpSA (15286-037 e 15286-028) não foram analisadas ainda.

Colocando o raio de giro (Rg) em gráfico em função do pesomolecular (Mw) em uma escala logarítmica dupla, pode-se obter informaçõessobre a conformação do polímero. O relacionamento Rg e Mw está resumidono triângulo de Haug (Figura 4).

Gráficos conformacionais foram feitos para todos os diferentesASA-HA, e os resultados estão apresentados na Tabela 2. A maioria dasamostras apresenta fatores similares a aqueles de espirais aleatórias, que étambém a conformação do HA não-modificado. As únicas exceções são osOSA HA1S altamente modificados, que têm uma conformação similar àquelade uma esfera, e os NSA-HAs que também mostram fatores conformacionaismuito baixos (0,20 e 0,04) indicando separação de coluna defeituosa ouseparação, talvez por causa das interações com o material da coluna.

Similarmente, olhando para o perfil de concentração (Rl-sinal) da SEC-análise MALLS-VISC (Veja figura 5), há um pico de agregação no tempo deeluição anterior, por aproximadamente 35 minutos, para amostra 15286-010(11 % NSA). Este fenômeno de agregação está também indicado pelo leveaumento no aparente MW (Tabela 2) para as amostras 14658-142 (9,7 % HAOSA modificado) e 15286-010 (11 % HA- NSA modificado).

Em resumo, ácido hialurônico de baixo MW (14kDa) foi deforma bem sucedida modificado com diversos anidridos aril-/alquilsuccínicos. Produtos de alto DS de HA-OSA e HA-NSA mostram algumastendências à agregação e mudanças na conformação, provavelmente causadaspor interações hidrofóbicas.

Exemplo 13 Atividade superficial do OSA-HA (14 kDa) em soluçãoaquosa

Soluções de HA -OSA 14 kDa (DS = 9,7 %, lote 14658-142) eHA LMW não-modificados(30kDa) foram preparadas em água MQ de acordocom as concentrações dadas na Tabela 3. As amostras foram analisadas pelamedição da tensão superficial usando um tensiômetro de superfície ( PlacaWilhelmy). A tensão superficial do solvente (água) foi determinada a 72mN/m com o mesmo método. Resultados das medições da tensão superficialsão dados na Figura 6 e resumidos na Tabela 3. Como pode ser visto, a tensãosuperficial diminui com o aumento da concentração do HA-OSA.Comparando-se com solvente puro (água MQ) e HA- LMW (30 kDa), atensão superficial é muito menor para os derivados HA.

Adicionalmente, pode-se ver que a tensão superficial continuaa diminuir em um tempo dependente da maneira dos HA-OSAs. Isto pode serexplicado pelo fato que o HA-OSA trabalha como um agente tensoativo deMW, usando um longo tempo para se difundir pela superfície da solução(visto que a velocidade de difusão é inversamente proporcional ao MW). Maispolímero de superfície ativa dá menor tensão superficial. Esta dependência dotempo é também mais uma prova de que frações de OSA na verdade sãoligadas covalentemente no HA, e não somente co-existem com o HA emsolução.

Isto adicionalmente indica que a modificação OSA do HA nãoo torna hidrofóbico, mas anfifílico. Estas propriedades podem potencialmenteser exploradas em sistemas em que uma tensão superficial baixa é necessária(por exemplo, oftálmico local) ou em que as propriedades emulsificantes sãonecessárias para estabilizar espumas ou emulsões em formulaçõesfarmacêuticas ou cosméticas.

Tabela 3. Medições de tensão superficial nas soluções de HA-OSA em águaMQ em 3.200 segundos.

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Exemplo 14. Preparação de derivados ASA alto MW por mistura de altocisalhamento

HA (4 g, MAG30021) foi dissolvido por uma noite em 400mL de água MQ. Soluções foram mantidas à temperatura ambiente (25°C) ouaquecidas até 60°C anteriormente Na2CO3 (2 g) foi adicionado sobcisalhamento (ULTRA-TURRAX 24 000 min"1, 5 min). Então o ASA foiadicionado de acordo com o esquema de reação apresentado na Tabela 4 emisturado sob forte cisalhamento (ULTRA-TURRAX 24 000 min"1, 5 min).As emulsões resultantes reagiram naturalmente por 6 horas na temperaturademonstrada (Tabela 4), então removidas para temperatura ambiente por umanoite. O pH foi ajustado em a neutralidade e antes os produtos forampurificados por ultrafiltração (MWCO 10 000) até que a condutividadeestivesse acima de 15 pSi/cm. Os produtos foram congelados e liofilizados. Aespectroscopia RMN confirmou que todos os produtos foram modificados.Todas as amostras resultaram em soluções túrbidas em NaCl 0,1 M com umaconcentração 1 % peso/volume.

Tabela 4. Esquema de reação para a preparação de ASA-derivados alto MW

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Anidrido dodecenil succínico.

Exemplo 15. HA ASA estabiliza emulsões OM

Os ASA-HAs números 1, 3, 4, 5, 6, 7, e HA não-modificados(MAG30014), preparados no exemplo 14 foram formulados com três óleoscosméticos (óleo mineral, carbonato de dietilexila e palmitato de etilexila) deacordo com a seguinte fórmula:

1. 6 mL de óleo foram adicionados a 14 mL de solução aquosade NaCl 0.1 M e 0.29 % HA-ASA

2. A solução foi misturada sob cisalhamento vigoroso por 25segundos (ULTRA-TURRAX a 24 000 min'1).

3. As emulsões foram deixadas à temperatura ambiente aoabrigo da luz por 8 semanas, sendo avaliadas visualmente depois de 24 horase 8 semanas para estabilidade.

Todos os derivados mostraram aumento da estabilidade daemulsão quando comparados ao controle e aos HA iniciais não-modificados(veja figura 7 para as amostras após 24 horas e 8 semanas para palmitato deetilexila). Isto mostra que HA- ASA podem ser usados como emulsificadoresem cosméticos ou medicamentos de liberação avançada baseados em emulsões.Exemplo 16. Vários derivados HA ASA de baixo-MW com longas cadeiasalquilas

ASA HA baixo MW foi preparado como descrito no exemplo15 para HA alto MW, a única diferença existente é que as concentraçõesiniciais de HA (23 kDa ) foram de 2 % peso/volume. Todas as amostras naTabela 5 foram preparadas à 60°C e purificadas por ultrafiltração (MWCO3.000 kDa) e liofilização. Os DS foram determinados por espectroscopiaRMN1H como descrito no exemplo 6.

Tabela 5. Esquema de reação para preparação de derivados HA baixo MWcom longas cadeias alquilas.

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Exemplo 17. Propriedades de capturar radicais livres do Ácido fenilsuccínico

HA-PhSA (14 kDa) (10 mg/ mL) em solução aquosa mostrouse degradar mais rapidamente que o HA não-modificado na presença deradicais hidroxila (gerado por Cu H2O2) seguido tanto por estudos deobservações por câmera de luz quanto por dispersão da luz (DLS/SLS). Istomostra que HA-PhSA tem um potencial como agente captador de radicaislivres para uso potencial em formulações cosméticas.

Exemplo 18. Determinação da concentração de agregação crítica (CAC)do anidrido octenil succínico - derivado do ácido hialurônico (HA-OSA,DS 16 %)A concentração de agregação crítica (CAC) de um derivadoHA-OSA foi determinada por calorimetria usando um calorímetro de titulaçãoisotérmica VP-ITC (Microcal LLC, USA). Uma solução concentrada de HA-OSA (0,294 mL, 15 mg/ mL em água destilada) foi usada para titular a água(1,4615 mL) na célula amostra do calorímetro. Uma solução de HA-OSA (2μL, 15 mg/ mL) foi injetada a cada 300 segundos, e variações de entalpia(ΔΗ) na célula amostra foram registradas ao longo do tempo como mostradana Figura 8.

ΔΗ foi colocada em gráfico em função da concentração deHA-OSA na célula amostra , e a CAC do HA-OSA foi determinada no pontode inflexão da curva. Cada experimento foi repetido três vezes e a CAC foifornecida como um valor médio. Por exemplo, a CAC do HA-OSA com umgrau de substituição (DS) de 16 % foi 0,45 mg/ mL (Figura 9).

Este estudo confirmou a existência de propriedadesassociadas ao HA-OS A. Além disso, isso indicou a formulaçãopotencial destes derivados dentro de micelas e/ou micro/nanopartículas,tornando-os adequados para uso em encapsulação e compostoshidrofóbicos de liberação tais como medicamentos e bioativos cosméticoshidrofóbicos.

Exemplo 19. Determinação da concentração de agregação crítica (CAC)do anidrido octenil succínico - derivado do ácido hialurônico (HA-OSA,DS 44 %)

A CAC do HA-OSA com um grau de substituição de 44 % foideterminada por espectroscopia por fluorescência usando umespectrofluorômetro (FluoroMax, Spex, United States) com temperaturaestabilizada em banho-maria (Julabo FIO, Merck, Estados Unidos). VermelhoNilo foi empregado como a sonda fluorescente. A fluorescência foi medidaem uma faixa de soluções HA-OSA (Tabela 6) preparadas em diferentestampões fosfato (Tabela 7).Tabela 6: Soluções HA-OSA

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Tabela 7: Tampões fosfato

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Vermelho Nilo (3,184 mg) foi dissolvido em uma mistura deTHF e acetona (50/50, 10 mL). Esta solução (10 μL) foi incubada com cadasolução HA-OSA (10 mL) sob agitação, por uma noite, no escuro e àtemperatura ambiente. Cada solução foi analisada à 25°C em umcomprimento de onda de excitação de 543 nanômetros enquanto que oespectro de emissão foi registrado de 580 a 700 nanômetros. A faixa deexcitação foi preparada para Iea faixa de emissão foi ajustada para cadasolução. A intensidade de emissão da fluorescência (I) foi colocada emgráfico em função do comprimento de onda (λ).

O comprimento de onda correspondente à intensidade máxima(λ max) foi determinado ajustando-se a curva I em função de λ com umafunção polinomial de ordem 6. Cada valor máximo λ foi o valor médio de trêsmedições.

Com o objetivo de determinar a CAC, λ max foi colocado emgráfico em função da concentração do polímero (C). A CAC foi deduzida noponto de inflexão da curva λ max em função de C (Figura 10).

Na Figura 10 a CAC de HA-OSA (DS = 44 %) foi algo entre0.003 e 0.004 mg/ mL. Este fenômeno não foi observado para HA não-modificado. Realmente, a fluorescência não poderia ser detectada emquaisquer concentrações de HA o que significa que não foi possívelsolubilizar o Vermelho Nilo em soluções HA. Isto evidencia a presença deconjuntos poliméricos nas soluções HA-OSA.

Exemplo 20. Influência da concentração de sal na CAC do HA-OSA (DS= 44 %)

A mesma configuração experimental descrita no exemploprévio foi usada para estudar a influência da concentração de sal no valor daCAC do HA- OSA (DS = 44 %). Os resultados são mostrados na Tabela 8 aseguir bem quanto na figura 11.

Tabela 8.

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Exemplo 21. Potencial Zeta das micelas poliméricas de OSA-HA (DS = 44%)

O potencial zeta das micelas poliméricas de OSA-HA (DS =44 %) foi determinado por eletroforese capilar (Zetasizer 3000HS, Malvern,Reino Unido) acoplado ao interferômetro à laser Doppler. Medições foramregistradas à 25°C. OSA-HA foi dissolvido em NaCl IO"3 M (em umaconcentração de 1 mg/ mL) antes da medição. O potencial zeta de OSA-HA(DS = 44 %, 1 mg/ mL em NaCl 10-3 M) foi avaliado em aproximadamente - mV (Figura 12).

Exemplo 22. Microscopia Eletrônica de Transmissão das micelaspoliméricas de OSA-HA (DS = 44 %).

Observações microscópicas das micelas poliméricas de HA -OSA (DS = 44 %) foram feitas com um microscópio eletrônico detransmissão (EM 410, Philips, Netherlands). Amostras foram depositadas emuma rede de cobre revestida por carbono ionizado e manchadas com umasolução aquosa de acetato de uranila (2 %). Instantâneos microscópicosmostraram claramente que as micelas poliméricas de OSA-HA são de formaesférica e têm dimensões submicrônicas tipicamente de 50 a 200 nm (dadosnão mostrados). Isto é mostrado na Figura 13.

Claims (45)

1. Derivado do ácido hialurônico, caracterizado pelo fato deque compreende η unidades repetidas e tendo a fórmula estrutural geral (I) empH 8-9:<formula>formula see original document page 40</formula>em que pelo menos uma unidade repetida um ou mais de R1,R2, R3, R4 compreende um ácido alquil-/aril-succínico éster ligado tendo afórmula estrutural geral (II) em pH 8-9 e, de outra forma, R1, R2, R3, R4 sãogrupos hidroxila, OH:<formula>formula see original document page 40</formula>em que pelo menos um de R5, R6, R7, R8 compreende umgrupo alquila ou arila e, de outra forma, R5, R6, R7, R8 são átomos dehidrogênio, H, e em que o oxigênio rotulado "éster" participa da ligação éstercom estrutura (I).

2. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dois ou mais de R1, R2, R3,R4 compreende um ou mais ácido alquil-/aril-succínico éster ligado tendo afórmula estrutural geral (II) em pH 8-9.

3. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que três ou mais de RI, R2,R3, R4 compreende um ou mais ácido alquil-/aril-succínico éster ligado tendoa fórmula estrutural geral (II) em pH 8-9.

4. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R5,R6, R7, R8 compreende um grupo alquila, preferivelmente pelo menos doisdos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila, mais preferivelmentepelo menos três dos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila.

5. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o grupo alquila compreendeum grupo alquila CrC2O, preferivelmente propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila.

6. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R5, R6, R7,R8 compreende um grupo arila, preferivelmente pelo menos dois dos R5, R6,R7, R8 compreendem um grupo arila, mais preferivelmente pelo menos trêsdos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo arila.

7. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o grupo arila é fenila.

8. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualquer umadas reivindicações 4-6, caracterizado pelo fato de que R5, R6, R7, R8compreendem dois ou mais diferentes grupos alquila e/ou arila,preferivelmente escolhido de propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, 2-octadecenila e fenila.

9. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecularmédio entre 800 e 10.000.000 Da; preferivelmente na faixa de 10.000 e-1.500.000 Da.

10. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecular médioentre 10.000 e 50.000 Da.

11. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecular médioentre 50.000 e 500.000 Da, preferivelmente entre 80.000 e 300.000 Da.

12. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualqueruma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que o Grau desubstituição (DS) está em uma faixa de 0,1 - 100 %, preferivelmente 1 - 90 %,mais preferivelmente 2 - 80 %, ainda mais preferivelmente 4-70 %, aindamais preferivelmente 8 - 60 %, ou 10 - 50 %, 14-40 %, 16-30 %, ou acimade tudo preferivelmente em uma faixa de 18-25 %, determinada definidanesta.

13. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualqueruma das reivindicações 1-12, caracterizado pelo fato de que o ácidohialurônico é produzido recombinantemente, preferivelmente em umhospedeiro Bacillus.

14. Derivado do ácido hialurônico, caracterizado pelo fato deque um ou mais grupo hidroxila do ácido hialurônico foram substituídos emuma reação com um ou mais anidrido alquil-/aril succínico (ASA), paraformar uma ligação éster entre o ácido hialurônico e o um ou mais ácidosalquil-/aril succínico resultantes.

15. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 14, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecularmédio entre 10.000 e 1.500.000 Da.

16. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecular,médio entre 20.000 e 50.000 Da.

17. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 15, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecular.médio entre 50.000 e 500.000 Da, preferivelmente entre 80.000 e 300.000 Da.

18. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualqueruma das reivindicações 14-17, caracterizado pelo fato de que um ou maisanidrido alquil-/aril-succínico (ASA) tem a fórmula estrutural geral (III):<formula>formula see original document page 43</formula>

19. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R5, R6,R7, R8 compreende um grupo alquila, preferivelmente pelo menos dois dosR5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila, mais preferivelmente pelomenos três dos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila.

20. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o grupo alquila compreendeum grupo alquila CrC2O, preferivelmente propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, ou 2-octadecenila.

21. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R5, R6,R7, R8 compreende um grupo arila, preferivelmente pelo menos dois dos R5,R6, R7, R8 compreendem um grupo arila, mais preferivelmente pelo menostrês dos R5, R6, R7, R8 compreendem um grupo arila.

22. Derivado do ácido hialurônico de acordo com areivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o grupo arila compreende umfenila.

23. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualqueruma das reivindicações 18-22, caracterizado pelo fato de que R5, R6, R7, R8compreendem dois ou mais diferentes grupos alquila e/ou arila,preferivelmente escolhidos de propila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, 2-octadecenila e fenila.

24. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualqueruma das reivindicações 14-23, caracterizado pelo fato de que o Grau desubstituição (DS) está em uma faixa de 0,1 - 100 %, preferivelmente 1 - 90 %,mais preferivelmente 2 - 80 %, ainda mais preferivelmente 4 - 70 %, aindamais preferivelmente 8 - 60 %, ou 10 - 50 %, 14 - 40 %, 16 - 30 %, ou maispreferivelmente em uma faixa de 18-25 %, determinado definido nesta.

25. Derivado do ácido hialurônico de acordo com qualqueruma das reivindicações 14-24, caracterizado pelo fato de que o ácidohialurônico é produzido recombinantemente, preferivelmente em umhospedeiro Bacillus.

26. Processo de produção de um derivado do ácidohialurônico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) reagir um ácido hialurônico (HA) com um ou mais anidridoalquil-/aril-succínico (ASA) tendo a fórmula estrutural geral mostrada em(III), sob condições alcalinas em uma solução aquosa, através da qual oderivado do ácido hialurônico é formado; e(b) recuperar o derivado do ácido hialurônico.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que pelo menos um de R5, R6, R7, R8 em (III) compreende umgrupo alquila, preferivelmente pelo menos dois dos R5, R6, R7, R8compreendem um grupo alquila, mais preferivelmente pelo menos três dosR5, R6, R7, R8 compreendem um grupo alquila.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o grupo alquila compreende um grupo alquila CrC2O,preferivelmente propila; 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila,ou 2-octadecenila.

29. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que pelo menos um de R5, R6, R7, R8 compreende um grupoarila, preferivelmente pelo menos dois dos R5, R6, R7, R8 compreendem umgrupo arila, mais preferivelmente pelo menos três dos R5, R6, R7, R8compreendem um grupo arila.

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o grupo arila é um fenila.

31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações26-30, caracterizado pelo fato de que um ou mais ASA compreende qualquerfórmula estrutural mostrada na figura 3.

32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-30, caracterizado pelo fato de que R5, R6, R7, R8 compreendem dois oumais diferentes grupos alquila e/ou arila, preferivelmente escolhidos depropila, 2-octenila, 2-nonenila, 2-dodecenila, 2-hexadecenila, 2-octadecenila efenila.

33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-32, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico tem um pesomolecular médio entre 10.000 e 1.500,000 Da.

34. Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que peso molecular médio entre 20.000 e 50.000 Da.

35. Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que peso molecular médio entre 50.000 e 500.000 Da,preferivelmente entre 80.000 e 300.000 Da.

36. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-35, caracterizado pelo fato de que o derivado do ácido hialurônico tem umGrau de substituição (DS) em uma faixa de 0,1 - 100 %, preferivelmente 1 --90 %, mais preferivelmente 2-80 %, ainda mais preferivelmente 4-70 %,ainda mais preferivelmente 8 - 60 %, ou 10 - 50 %, 14 - 40 %, 16 - 30 %, oumais preferivelmente em uma faixa de 18 - 25 %, determinado definido nesta.

37. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-26-36, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico é produzidorecombinantemente, preferivelmente em um hospedeiro Bacillus.

38. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeum derivado do ácido hialurônico como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 - 25 e um ingrediente ativo, preferivelmente o ingredienteativo é um agente farmacologicamente ativo.

39. Composição de acordo com a reivindicação 38,caracterizada pelo fato de que também compreende um excipiente solúvel emágua, preferivelmente a lactose.

40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade eficaz de derivado do ácido hialurônico, comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-25, juntamente com umcarreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

41. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma quantidade eficaz de derivado do ácido hialurônico, comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-25 como um veículo,juntamente com um agente farmacologicamente ativo.

42. Artigo cosmético, caracterizado pelo fato de quecompreende um derivado do ácido hialurônico, como definido em qualqueruma das reivindicações 1 - 25 ou uma composição como definida em qualqueruma das reivindicações 38 - 41.

43. Artigo cosmético, caracterizado pelo fato de quecompreende como um ingrediente ativo uma quantidade eficaz de derivado doácido hialurônico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 25ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 38 - 41.

44. Artigo cirúrgico, médico ou sanitário, caracterizado pelofato de que compreende um derivado do ácido hialurônico, como definido emqualquer uma das reivindicações 1 - 25 ou uma composição como definida emqualquer uma das reivindicações 38 - 41; preferivelmente o artigo é umafralda, uma toalha sanitária, uma esponja cirúrgica, uma esponja paratratamento de ferimentos, ou uma parte compreendida em um curativo de peleou outro material para proteção de ferimentos.

45. Cápsula de medicamento, microcápsula, nanocápsulas,microesferas ou nanoesferas, caracterizadafs) pelo fato de que compreendeum derivado do ácido hialurônico, como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 - 25 ou uma composição como definida em qualquer uma dasreivindicações 38-41.