BRPI0616370A2

BRPI0616370A2 - modulaÇço da expressço de receptor de glucocorticàide

Info

Publication number: BRPI0616370A2
Application number: BRPI0616370-0A
Authority: BR
Inventors: Brett P Monia; Robert Mckay; Susan M Freier; Sanjay Bhanot; Lynnetta Watts
Original assignee: Johnson & Johnson Pharmaceutical Res & Dev L L C
Priority date: 2005-09-19
Filing date: 2006-09-19
Publication date: 2011-06-14
Also published as: AU2006292293B2; US20070066557A1; AU2006292293A1; CR9906A; KR20080065617A; CN101313066A; US20100222412A1; EA200800868A1; CA2623772A1; ECSP088298A; EP2368988A1; ZA200803452B; IL190281A0; JP2009508527A; NO20081883L; EP1941040A1; WO2007035759A1

Abstract

MODULAÇçO DA EXPRESSçO DE RECEPTOR DE GLICOCORTICàIDE. A presente invenção refere-se a compostos, composições e processos para a modulação da expressá o do receptor de glicocorticóide. As composições compreendem compostos anti-sentido, particularmente oligonucleotídeos anti-sentido que possuem propriedades in vivo particulares, direcionadas a ácidos nucléicos que codificam o receptor de glicocorticóide. São fornecidos processos de utilização destes compostos para a modulação da expressão do receptor de glicocorticóide e para o tratamento de doenças.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA-ÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTOR DE GLICOCORTICÓIDE".

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Uma forma que pode ser lida no computador da listagem de se-qüência, em disquete, contendo o arquivo chamado BIOLOCI65WOSEQ.txt,que tem 37.122 bytes (medido no MS-DOS) e foi criado em 19 de setembrode 2006, é incorporada aqui como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

São descritos aqui compostos, composições e métodos para amodulação da expressão de receptor de glicocorticóide em uma célula, umtecido ou um animal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Como a gliconeogênese aumentada é considerada como sendoa maior fonte de maior produção de glicose no diabetes, foi investigado umnúmero de alvos terapêuticos para a inibição da produção da glicose hepáti-ca. Devido à capacidade dos antagonistas do receptor de glicocorticóide(também conhecido como subfamília 3 de receptor nuclear, grupo C, mem-bro 1; NR3C1; GCCR; GCR; GRL; receptor de Glicocorticóide, linfócito) demelhorar o diabetes em modelos animais, tais compostos estão entre as te-rapias potenciais que estão sendo exploradas. Entretanto, há efeitos sistê-micos prejudiciais dos antagonistas do receptor de glicocorticóide, incluindoa ativação do eixo HPA (Link, Curr Opin Infestig Drugs, 2003, 4, 421-429). Aatividade do eixo HPA está associada com a supressão da ação inflamatóriarelacionada com o sistema imunológico, que pode aumentar a susceptibili-dade a agentes infecciosos e a neoplasmas. Os estados de saúde associa-dos com a supressão da inflamação mediada pelo sistema imunológico atra-vés de defeitos no eixo HPA ou seus tecidos alvos, incluem a síndrome deCushing, o estresse crônico, o alcoolismo crônico e a depressão melancólica(Chrousos, N Engl J Med, 1995, 332, 1351-1362). Assim, é de grande valordesenvolver antagonistas do receptor de glicocorticóide específicos ao fíga-do e à gordura.

UMÁRIO DA INVENÇÃOA presente invenção refere-se a compostos oligoméricos dire-cionados e que podem ser hibridizados com uma molécula de ácido nucléi-co que codifica GCCR que modula a expressão de GCCR. São fornecidosaqui oligonucleotídeos quiméricos referidos como "gapmers", que compre-ende uma região de desoxinucleotídeos ou "gap" flanqueada em cada umadas extremidades a 5' e a 3' com "asas" compreendidas de um até quatro2'-0-metoxietil nucleotídeos. As regiões de desoxinucleotídeos dos oligo-nucleotídeos da invenção são compreendidas de mais que dez desoxinu-cleotídeos, assim os gapmers da presente invenção são "gap-alados"quando comparados com os compostos quiméricos que compreendem umaregião gap com dez desoxinucleotídeos, tal como é exemplificado na Publi-cação US2005-016271, que é incorporada aqui como referência em sua to-talidade. Em algumas modalidades, quando comparados com os oligonucle-otídeos que possuem a mesma seqüência, mas que compreendem uma re-gião flanqueada de dez desoxinucleotídeos em ambas as extremidades a 5'e a 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, os oiigonucieotídeos gap-alados possuem potência comparada ou melhorada sem acúmulo aumenta-do de oligonucleotídeo no fígado. Assim, as modalidades da presente inven-ção incluem oligonucleotídeos gap-alados que se direcionam a GCCR emque a potência é comparável ou melhor que a de um oligonucleotídeo quepossui a mesma seqüência, mas que compreende uma região de dez deso-xinucleotídeos flanqueada em ambas as extremidades a 5' e a 3' com cinco2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos sem acúmulo aumentado de oligonucleotí-deo nos tecidos alvos.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui oligonucleo-tídeos gap-alados que se direcionam a GCCR em que as concentrações nosrins do dito oligonucleotídeo são comparáveis ou diminuídas em relação àsde um oligonucleotídeo que possui a mesma seqüência, mas que compre-ende uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada em ambas as ex-tremidades a 5' e a 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos enquantomantém ou melhora a potência nos tecidos alvos tal como o fígado.

São adicionalmente fornecidos métodos de modulação da ex-pressão de GCCR em células, tecidos ou animais que compreendem o con-tato das ditas células, tecidos ou animais com um ou mais dos compostos oucomposições da presente invenção. Por exemplo, em uma modalidade, oscompostos ou as composições da presente invenção podem ser utilizadaspara reduzir a expressão de GCCR em células, tecidos ou animais.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um métodode tratamento de uma doença ou de um estado de saúde mediado pela ex-pressão de glicocorticóides em um animal que compreende o contato do a-nimal com uma quantidade eficiente de um composto da invenção. As doen-ças ou os estados de saúde incluem diabetes, diabetes do Tipo 2, obesida-de, síndrome metabólica X, hiperglicemia, hiperlipidemia ou esteatose dofígado. Em algumas modalidades, a hiperlipidemia está associada com lipí-deos elevados tal como o colesterol no sangue ou triglicerídeos elevados nosangue. Os lipídeos no sangue incluem lipídeos do plasma e lipídeos do so-ro. São ainda fornecidos métodos de diminuição dos níveis de lipídeos nosangue, métodos de redução da massa adiposa corporal, métodos de dimi-nuição dos níveis de triglicerídeos no fígado e métodos de aumento da sen-sibilidade à insulina em um animal através da administração de um compos-to da invenção.

É também fornecido um método de diminuição dos níveis de gli-cose no sangue em um animal que compreende a administração de umcomposto da invenção. Os níveis de glicose no sangue podem ser níveis deglicose sob jejum ou alimentada e os níveis de glicose no sangue incluemníveis de glicose no soro ou no plasma. São ainda fornecidos métodos deaumento da sensibilidade à insulina e de inibição da saída de glicose hepáti-ca.

Um outro aspecto da presente invenção é um método de retardoou de prevenção do início de um aumento nos níveis de lipídeos no sangueou de glicose no sangue em um animal através da administração de umcomposto da invenção.

O presente pedido de patente também está relacionado ao Pe-dido de Patente U.S. N2 60/718.684, que é incorporado como referência emsua totalidade. O presente pedido de patente também está relacionado aoPedido de Patente U.S. N2 11/231.243 e ao Pedido de Patente PCT NePCT/US2005/033837, cada um dos quais é incorporado aqui como referên-cia em sua totalidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA:

Visão Geral

São descritos aqui compostos oligoméricos, incluindo oligonu-cleotídeos anti-sentido e outros compostos anti-sentido para uso na modula-ção da expressão de moléculas de ácidos nucléicos que codificam GCCR.

Isto é realizado através do fornecimento de compostos oligoméricos que sehibridizam com uma ou mais moléculas de ácidos nucléicos alvos que codifi-cam GCCR.

De acordo com a presente invenção estão composições e méto-dos para a modulação da expressão de GCCR (também conhecido comoreceptor de glicocorticóide; subfamília 3 de receptor nuclear, grupo C1 mem-bro 1; GR; GRL; e NR3C1). Estão listados na Tabela 1 os números de aces-so do GENBANK® de seqüências que podem ser utilizadas para planejarcompostos oligoméricos direcionados para GCCR. Os compostos oligoméri-cos da invenção incluem compostos oligoméricos que se hibridizam comuma ou mais moléculas de ácidos nucléicos alvos mostradas na Tabela 1,assim como compostos oligoméricos que se hibridizam com outras molécu-las de ácidos nucléicos que codificam GCCR.

Os compostos oligoméricos podem ser direcionados a qualquerregião, segmento ou sítio de moléculas de ácidos nucléicos que codificamGCCR. As regiões, os segmentos e os sítios alvos adequados incluem, masnão estão limitados a 5'UTR, ao códon de início, ao códon de término, à re-gião codificadora, a 3'UTR, à região de cap a 5', aos íntrons, aos éxons, àsjunções íntron-éxon, às junções éxon-íntron e às junções éxon-éxon.Tabela 1Alvos Gênicos

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As localizações no ácido nucléico alvo nas quais os compostosoligoméricos ativos se hibridizam são referidas aqui abaixo como "segmen-tos alvos validados". Como utilizado aqui, o termo "segmento alvo validado"é definido como pelo menos uma parte de 8 nucleobases de uma região alvoà qual um composto oligomérico é direcionado. Embora não seja desejadoficar ligado à teoria, acredita-se atualmente que estes segmentos alvos re-presentam partes do ácido nucléico alvo que são acessíveis para hibridiza-ção.

A presente invenção inclui compostos oligoméricos que sãocompostos quiméricos. Um exemplo de um composto quimérico é um gap-mer que possui uma região de 2'-desoxinucleotídeo ou "gap" flanqueado porregiões que não são de desoxinucleotídeo ou "asas". Embora não seja dese-jado ficar ligado à teoria, o gap do gapmer apresenta um substrato que podeser reconhecido pela RNase H quando ligado ao alvo de RNA enquanto queas asas não são um substrato ótimo, mas podem conferir outras proprieda-des tal como a contribuição para a estabilidade do duplex ou efeitos farma-cocinéticos vantajosos. Cada asa pode ser um ou mais monômeros de oli-gonucleotídeos sem ser desóxi. Em uma modalidade, o gapmer é compre-endido de uma região de dezesseis 2'-desoxinucleotídeos flanqueada emcada uma das extremidades a 5' e a 3' por asas de 2'-0-(2-metoxietil) nucle-otídeos. Este é referido como um gapmer 2-16-2. Assim, o "motivo" destecomposto oligomérico quimérico ou gapmer é 2-16-2. Em uma outra modali-dade, todas as ligações internucleosídeos são ligações fosforotioato. Emuma outra modalidade, as citosinas do gapmer são 5-metilcitosinas.

As modalidades da presente invenção incluem compostos oli-goméricos que compreendem seqüências de 13 até 26 nucleotídeos decomprimento que compreendem uma região de desoxinucleotídeos maiorque 10 nucleobases de comprimento flanqueada em cada uma de suas ex-tremidades a 3' e a 5' com pelo menos um nucleotídeo 2'-0-(2-metoxietil).Os oligonucleotídeos "gap-alados" preferidos compreendem 11, 12, 13, 14,15, 16, 17 ou 18 desoxinucleotídeos na porção gap do oligonucleotídeo. Asregiões flanqueadoras a 5' e a 3' preferidas compreendem 1, 2, 3 ou 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Os gapmers gap-alados preferidos possuem mo-tivos que incluem 1-18-1,1-17-2, 2-17-1,2-16-2, 3-14-3 e 4-12-4.

Em modalidades preferidas, os compostos oligoméricos se dire-cionam ou se hibridizam com o RNA de GCCR. Em outras modalidades, oscompostos oligoméricos reduzem a expressão do RNA de GCCR. Em outrasmodalidades, os compostos oligoméricos reduzem a expressão de GCCRem que a expressão de GCCR é reduzida em pelo menos 10%, em pelomenos 20%, em pelo menos 30%, em pelo menos 35%, em pelo menos40%, em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 55%, empelo menos 60%, em pelo menos 65%, em pelo menos 70%, em pelo menos75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em peio menos 90%, empelo menos 95% ou em 100%.

Os oligonucleotídeos da presente invenção incluem aqueles emque as concentrações nos rins do dito oligonucleotídeo são diminuídas emrelação a um oligonucleotídeo que possui a mesma seqüência, mas quecompreende uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada em ambasas extremidades a 5' e a 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Osoligonucleotídeo da presente invenção incluem aqueles em que as concen-trações nos rins do dito oligonucleotídeo são comparáveis ou diminuídas emrelação aos de um oligonucleotídeo que possui a mesma seqüência, masque compreende uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada em am-bas as extremidades a 5' e a 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.Os oligonucleotídeos da presente invenção incluem aqueles em que a po-tência em relação à redução alvo ou a um efeito terapêutico é comparável oumelhor que a de um oligonucleotídeo que possui a mesma seqüência, masque compreende uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada em am-bas as extremidades a 5' e a 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeossem o acúmulo aumentado de oligonucleotídeo nos tecidos alvos. Os tecidosalvos preferidos incluem o fígado e o tecido adiposo.

A presente invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido com13 até 26 nucleobases de comprimento que compreende uma primeira regi-ão, uma segunda região e uma terceira região, em que a dita primeira regiãocompreende pelo menos 11 desoxinucleotídeos e em que as ditas segundae terceira regiões compreendem 1 até 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, asditas segunda e terceira regiões flanqueando a primeira região nas extremi-dades a 5' e a 3' da dita primeira região.

Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos da invenção sehibridizam especificamente a GCCR e reduzem a expressão de GCCR. Emalgumas modalidades, a região "gap" compreende 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17ou 18 nucleobases. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos anti-sentido possuem 20 nucleobases de comprimento.

Os compostos oligoméricos podem compreender aproximada-mente 8 até aproximadamente 80 nucleobases (isto é, de aproximadamente8 até aproximadamente nucleosídeos ligados), preferencialmente entre a-proximadamente 13 até aproximadamente 26 nucleobases. Um versado natécnica considerará que os compostos oligoméricos preferidos consideradosincluem compostos que possuem 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25 ou 26 nucleobases de comprimento.

Os compostos da invenção incluem seqüências de oligonucleo-tídeos que compreendem pelo menos as 8 nucleobases consecutivas partin-do do terminal a 5' de um dos compostos anti-sentido ilustrativos (as nucleo-bases restantes sendo um filamento consecutivo do mesmo oligonucleotídeocomeçando imediatamente a montante do terminal a 5' do composto anti-sentido que pode ser especificamente hibridizado com o ácido nucléico alvoe continuando até o oligonucleotídeo que compreende aproximadamente 13até 26 nucleobases). Outros compostos são representados por seqüênciasde oligonucleotídeos que compreendem pelo menos as 8 nucleobases con-secutivas partindo do terminal a 3' dos compostos anti-sentido ilustrativos(as nucleobases restantes sendo um filamento consecutivo do mesmo oligo-nucleotídeo começando imediatamente a jusante do terminal a 3' do com-posto anti-sentido que pode ser especificamente hibridizado com o ácidonucléico alvo continuando até o oligonucleotídeo que compreende aproxi-madamente 13 até aproximadamente 26 nucleobases). É também entendidoque os compostos podem ser representados por seqüências de oligonucleo-tídeos que compreendem pelo menos 8 nucleobases consecutivas partindode uma parte interna da seqüência de um composto ilustrativo e podem seestender em qualquer uma ou em ambas as direções até o oligonucleotídeoconter aproximadamente 13 até aproximadamente 26 nucleobases.

Os oligonucleotídeos da invenção incluem oligonucleotídeos an-ti-sentido com 20 nucleobases de comprimento direcionados a uma moléculade ácido nucléico que codifica GCCR e compreendendo pelo menos umaparte de 8 nucleobases da SEQ ID N2: 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63ou 96. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos da invenção são oligonu-cleotídeos anti-sentido com 20 nucleobases de comprimento direcionadospara uma molécula de ácido nucléico que codifica GCCR e possuindo a se-qüência da SEQ ID N2: 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63 ou 96. Em umamodalidade, os oligonucleotídeos da invenção possuem a seqüência de nu-cleobases da SEQ ID N2: 37.

A presente invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido quecompreendem a seqüência de nucleobases da SEQ ID N2: 37. Em uma mo-dalidade, os oligonucleotídeos da invenção compreendem pelo menos umaparte de 8 nucleobases da seqüência de nucleobases da SEQ ID N2: 37.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece oligonucleotí-deos anti-sentido com 20 nucleobases de comprimento direcionados parauma molécula de ácido nucléico que codifica GCCR e compreendendo pelomenos uma parte de 8 nucleobases da SEQ ID N2: 34, 33, 35, 36, 37, 42,45, 56, 61, 63 ou 96 em que o oligonucleotídeo compreende uma região dedesoxinucleotídeo de 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleobases de compri-mento que é flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com 1 até 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos e em que o oligonucleotídeo se hibridiza especifi-camente a e reduz a expressão do RNA de GCCR.Em uma modalidade, as regiões flanqueadoras são simétricas(possuindo o mesmo número de nucleotídeos na região flanqueadora a 5'como na região flanqueadora a 3'). Em uma outra modalidade, as regiõesflanqueadoras não são simétricas (possuindo um número diferente de nucle-otídeos na região flanqueadora a 5' comparado com o da região flanqueado-ra a 3').

Os oligonucleotídeos anti-sentido da invenção podem conter pe-lo menos uma ligação internucleosídeo modificada. As ligações internucleo-sídeo modificadas incluem ligações fosforotioato. Os oligonucleotídeos anti-sentido da invenção também podem conter pelo menos uma nucleobasemodificada. Em modalidades preferidas, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em outras modalidades, a presente invenção inclui oligonucleo-tídeos anti-sentido que possuem a seqüência de nucleobases da SEQ IDNO: 37, em que o oligonucleotídeo anti-sentido é caracterizado por uma re-gião de 12-desoxinuc!eotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3'com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, uma região de 14-desoxinu-cleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueadaem suas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos,uma região de 17-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5'e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos ou uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

Em uma modalidade particular, os oligonucleotídeos anti-sentidopossuem a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 37, em que o oligonucleo-tídeo anti-sentido possui uma região de 12-desoxinucleotídeos flanqueadaem suas extremidades a 5' e a 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotí-deos. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hi-bridiza especificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modali-dade adicional, pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fos-forotioato. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 37, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 14-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 37, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitósina.

Em uma modalidade particular, õ oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases of SEQ ID: 37, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 17-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotí-deos. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hi-bridiza especificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modali-dade adicional, pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fos-forotioato. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 37, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma outra modalidade os oligonucleotídeos anti-sentidocompreendem a seqüência de nucleobases da SEQ ID NO: 33. Em umamodalidade, os oligonucleotídeos da invenção compreendem pelo menosuma parte de 8 nucleobases da seqüência de nucleobases da SEQ ID NO:33.

Em outras modalidades, a presente invenção inclui oligonucleo-tídeos anti-sentido que possuem a seqüência de nucleobases da SEQ IDNO: 33, em que o oligonucleotídeo anti-sentido é caracterizado por uma re-gião de 12-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3'com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, uma região de 14-desoxinucleo-tídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-meto-xietil) nucleotídeos, uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, umaregião de 17-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5! e a3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos ou uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

Em uma modalidade particular, os oligonucleotídeos anti-sentidopossuem a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 33, em que os oligonu-cleotídeos anti-sentido possuem uma região de 12-desoxinucleotídeos flan-queada em suas extremidades a 5' e a 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nu-cleotídeos. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido sehibridiza especificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modali-dade adicional, pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fos-forotioato. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 33, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 14-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 33, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 33, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 17-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxieti!) nucleotí-deos. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hi-bridiza especificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modali-dade adicional, pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fos-forotioato. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 33, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

A presente invenção fornece oligonucleotídeos anti-sentido quecompreendem a seqüência de nucleobases da SEQ ID NO: 45. Em umamodalidade, os oligonucleotídeos da invenção compreendem pelo menosuma parte de 8 nucleobases da seqüência de nucleobases da SEQ ID NO:-45.

Em outras modalidades, a presente invenção inclui oligonucleo-tídeos anti-sentido que possuem a seqüência de nucleobases da SEQ IDNO: 45, em que o oligonucleotídeo anti-sentido é caracterizado por uma re-gião de 12-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3'com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, uma região de 14-desoxinucleo-tídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-me-toxietil) nucleotídeos, uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, umaregião de 17-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos ou uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

Em uma modalidade particular, os oligonucleotídeos anti-sentidopossuem a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 45, em que os oligonu-cleotídeos anti-sentido possuem uma região de 12-desoxinucleotídeos flan-queada em suas extremidades a 5' e a 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nu-cleotídeos. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido sehibridiza especificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modali-dade adicional, pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fos-forotioato. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-meti Icitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 45, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 14-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 45, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 45, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 17-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotí-deos. Em uma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hi-bridiza especificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modali-dade adicional, pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fos-forotioato. Em uma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina,

Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo anti-sentidopossui a seqüência de nucleobases da SEQ ID: 45, em que o oligonucleotí-deo anti-sentido possui uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo. Emuma modalidade adicional, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza espe-cificamente a e reduz a expressão de GCCR. Em uma modalidade adicional,pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforotioato. Emuma modalidade adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Também é considerada aqui uma composição farmacêutica quecompreende um oligonucleotídeo anti-sentido da invenção e opcionalmenteum veículo, um diluente, um intensificador ou um excipiente farmaceutica-mente aceitável. Os compostos da invenção também podem ser utilizadosna produção de um medicamento para o tratamento de doenças e distúrbiosrelacionados com a atividade de glicocorticóide mediada por GCCR.

As modalidades da presente invenção incluem métodos de re-dução da expressão de GCCR em tecidos ou células que compreendem ocontato das ditas células ou tecidos com uma composição farmacêutica ouum oligonucleotídeo anti-sentido da invenção, métodos de diminuição dosníveis de glicose no sangue, dos níveis de triglicerídeos no sangue ou dosníveis de colesterol no sangue em um animal que compreendem a adminis-tração ao dito animal de uma composição farmacêutica da invenção. Os ní-veis no sangue podem ser níveis no plasma ou no soro. São também consi-derados métodos de aumento da sensibilidade à insulina, métodos de dimi-nuição dos níveis de triglicerídeos no fígado e métodos de inibição da saídada glicose hepática em um animal que compreendem a administração aodito animal de uma composição farmacêutica da invenção. A maior sensibili-dade à insulina pode ser indicada por um decréscimo nos níveis de insulinacirculante. Um outro aspecto da presente invenção é um método de reduçãoda massa adiposa corporal em um animal.

Outras modalidades da presente invenção incluem métodos detratamento de um animal que possui uma doença ou um estado de saúdeassociado com a expressão do receptor de glicocorticóide que compreen-dem a administração ao dito animal de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficiente de um oligonucleotídeo anti-sentido da invenção. Adoença ou o estado de saúde pode ser uma doença ou um estado de saúdemetabólico. Em algumas modalidades, a doença ou o estado de saúde me-tabólico é diabetes, obesidade, síndrome metabólica X, hiperglicemia, hiper-Iipidemia ou resistência à insulina. Em algumas modalidades, a doença édiabetes do Tipo 2. Em algumas modalidades, a obesidade é induzida pordieta. Em algumas modalidades a hiperlipidemia está associada com níveiselevados de lipídeos no sangue. Os lipídeos incluem colesterol e triglicerí-deos. Em uma modalidade, o estado de saúde é a esteatose do fígado. Emalgumas modalidades, a esteatose é esteatohepatite ou esteatohepatite nãoalcoólica.

São também fornecidos métodos de prevenção ou de retardo doinício dos níveis elevados de glicose no sangue ou de lipídeos no sangue emum animal.

Os compostos da invenção podem ser utilizados para modular aexpressão de GCCR em um animal que precisa dos mesmos, tal como umser humano. Em uma modalidade não limitante, os métodos compreendem aetapa de administração ao dito animal de uma quantidade eficiente de umcomposto anti-sentido que reduz a expressão de GCCR. Em uma modalida-de, os compostos anti-sentido da presente invenção reduzem eficientementeos níveis ou a função do RNA de GCCR. Devido ao fato de que a reduçãonos níveis de mRNA de GCCR mRNA pode levar também à alteração nosprodutos de expressão da proteína GCCR, tais alterações resultantes tam-bém podem ser medidas. Os compostos anti-sentido da presente invençãoque reduzem eficientemente os níveis ou a função de um RNA de GCCR oude produtos da expressão da proteína são considerados um composto anti-sentido ativo. Em uma modalidade, os compostos anti-sentido da invençãoreduzem a expressão de GCCR causando uma redução do RNA em pelomenos 10%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos30%, em pelo menos 40%, em pelo menos 50%, em pelo menos 60%, empelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, em pelo menos 98%, empelo menos 99% ou em 100% como medido através de um ensaio exemplifi-cado aqui.

Mecanismos anti-sentido

"Mecanismos anti-sentido" são todos aqueles que envolvem ahibridização de um composto com o ácido nucléico alvo, em que o resultadoou o efeito da hibridização é a degradação do alvo ou a ocupação do alvocom a interrupção concomitante da maquinaria celular que envolve, por e-xemplo, a transcrição ou o processamento.

Alvos

Como utilizado aqui, os termos "ácido nucléico alvo" e "moléculade ácido nucléico que codifica GCCR" foram utilizados para conveniênciapara abranger o DNA que codifica GCCR, o RNA (incluindo pré-mRNA emRNA ou partes dos mesmos) transcrito partindo de tal DNA e ainda o cD-NA derivado de tal RNA.Regiões. Segmentos e SítiosO processo de direcionamento geralmente inclui ainda a deter-minação de pelo menos uma região, um segmento ou um sítio alvo dentrodo ácido nucléico alvo para que a interação anti-sentido ocorra de forma queresulte o efeito desejado, por exemplo, a modulação da expressão. "Região" é definida aqui como uma parte do ácido nucléico alvo que possui pelo me-nos uma estrutura, uma função ou uma característica que pode ser identifi-cada. Dentro das regiões de ácidos nucléicos alvos estão os segmentos."Segmentos" são definidos como as menores ou subpartes de regiões den-tro de um ácido nucléico alvo. "Sítios", como utilizado na presente invenção,são definidos como posições de nucleobases exclusivas dentro de um ácidonucléico alvo.

Uma vez que uma ou mais regiões, segmentos ou sítios alvosforam identificados, são planejados compostos oligoméricos que são sufici-entemente complementarès ao alvo, isto é, se hibridizam suficientemente bem e com especificidade suficiente, para fornecer o efeito desejado.

Variações

É também sabido na técnica que produtos da transcrição deRNA alternativos podem ser produzidos partindo da mesma região genômicado DNA. Estes produtos da transcrição alternativos são geralmente conheci- dos como "variações". Mais especificamente, "variações pré-mRNA" sãoprodutos da transcrição provenientes do mesmo DNA genômico que diferemde outros produtos da transcrição produzidos do mesmo DNA genômico emsua posição de início ou de término e contêm tanto seqüência de íntronsquanto de éxons.

Após a excisão de uma ou mais regiões de éxons ou de íntronso partes das mesmas durante o processamento, as variações de pré-mRNAproduzem "variações de mRNA" menores. Conseqüentemente, as variaçõesde mRNA são variações de pré-mRNA processadas e cada variação de pré-mRNA exclusiva tem sempre que produzir uma variação de mRNA exclusivacomo um resultado do processamento. Estas variações de mRNA são tam-bém conhecidas como "variações de processamento alternativas". Se ne-nhum processamento da variação de pré-mRNA ocorrer então a variação depré-mRNA é idêntica à variação de mRNA.

É também sabido na técnica que as variações podem ser produ-zidas através do uso de sinais alternativos para iniciar ou interromper atranscrição e que os pré-mRNAs e os mRNAs podem possuir mais de umcódon de início ou códon de término. As variações que se originam de umpré-mRNA ou de um mRNA que utilizam códons de início alternativos sãoconhecidas como "variações de início alternativas" de tal pré-mRNA ou mR-NA. Tais produtos da transcrição que utilizam um códon de término alternati-vo são conhecidas como "variações de término alternativas" de tal pré-mRNA ou mRNA. Um tipo específico de variação de término é a "variaçãode poliA" em que os vários produtos da transcrição produzidos resultam daseleção alternativa de um dos "sinais de término de poliA" pela maquinariade transcrição, produzindo assim produtos da transcrição que terminam emsítios de poliA exclusivos. Conseqüentemente, os tipos de variações descri-tas aqui são também ácidos nucléicos alvos adequados.

Modulação da Expressão Alvo

"Modulação" significa uma perturbação da função, por exemplo,um aumento (estímulo ou indução) ou um decréscimo (inibição ou redução)na expressão. Como um outro exemplo, a modulação da expressão podeincluir a perturação da seleção do sítio de processamento do processamentodo pré-mRNA. "Expressão" inclui todas as funções através das quais umainformação codificada por um gene é convertida em estruturas presentes eoperacionais em uma célula. Estas estruturas incluem os produtos da trans-crição e da tradução. "Modulação da expressão" significa a perturbação detais funções. "Moduladores" são aqueles compostos que modulam a expres-são de GCCR e que compreendem pelo menos uma parte de 8 nucleobasesque é complementar a um segmento alvo validado.

A modulação da expressão de um ácido nucléico alvo pode seratingida através da alteração de qualquer número de funções dos ácidosnucléicos (DNA ou RNA). As funções do DNA que serão moduladas podemincluir a replicação e a transcrição. A replicação e a transcrição, por exem-plo, podem ser partindo de um molde celular endógeno, de um vetor, de umconstructo de plasmídeo ou de outra maneira. As funções do RNA que serãomoduladas podem incluir funções de translocação, que incluem, mas nãoestão limitadas à translocação do RNA para um sítio de tradução da proteí-na, à translocação do RNA para sítios dentro da célula que estão distantesdo sítio de síntese de RNA e de tradução de proteína partindo do RNA. Asfunções de processamento do RNA que podem ser moduladas incluem, masnão estão limitadas ao processamento do RNA para fornecer uma ou maisespécies de RNA, à adição de cap ao RNA, à maturação a 3' do RNA e àatividade cataiítica ou à formação de complexos que envolve o RNA que po-de ser estar comprometida ou ser facilitada pelo RNA. A modulação da ex-pressão pode resultar no maior nível de uma ou mais espécies de ácidosnucléicos ou no menor nível de uma ou mais espécies de ácidos nucléicos,de forma temporal ou através do nível de estado estacionário livre. Um resul-tado de tal interferência na função do ácido nucléico alvo é a modulação daexpressão de GCCR. Assim, em uma modalidade a modulação da expres-são pode significar o aumento ou a diminuição nos níveis de RNA ou de pro-teína alvo. Em uma outra modalidade a modulação da expressão pode signi-ficar um aumento ou um decréscimo de um ou mais produtos do processa-mento do RNA ou uma alteração na proporção de dois ou mais produtos do processamento.

Hibridizacão e Complementaridade

"Hibridização" significa o pareamento de filamentos complemen-tares de compostos oligoméricos. Embora não limitado a um mecanismoparticular, o mecanismo mais comum de pareamento envolve a formação deligações de hidrogênio, que podem ser a formação de ligações de hidrogêniode Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertidas, entre bases de nucle-osídeos ou de nucleotídeos complementares (nucleobases) dos filamentosde compostos oligoméricos. Por exemplo, adenina e timina são nucleobasescomplementares que se pareiam através da formação de pontes de hidrogê-nio. A hibridização pode ocorrer sob circunstâncias variáveis. Um compostooligomérico pode ser especificamente hibridizado quando houver um grausuficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica docomposto oligomérico com seqüências alvos sem ser de ácido nucléico sobcondições em que a ligação específica é desejada, isto é, sob condiçõesfisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico e sob con-dições em que os ensaios são realizados no caso de ensaios in vitro.

"Condições de hibridização estringentes" ou "condições estrin-gentes" se referem às condições sob as quais um composto oligomérico iráse hibridizar com sua seqüência alvo, mas a um número mínimo de outrasseqüências. As condições estringentes são dependentes da seqüência eserão diferentes em circunstâncias diferentes e "condições estringentes" sobas quais os compostos oligoméricos se hibridizam com uma seqüência alvosão determinadas pela natureza e pela composição dos compostos oligomé-ricos e dos ensaios em que estão sendo investigados.

"Complementaridade", como utilizado aqui, se refere à capaci-dade do pareamento preciso entre duas nucleobases em um ou dois fila-mentos do composto oligomérico. Por exemplo, se uma nucleobase em umacerta posição de um composto anti-sentido for capaz de fazer ponte de hi-drogênio com uma nucleobase em uma certa posição de um ácido nucléicoalvo, então a posição da ponte de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e oácido nucléico alvo é considerada como sendo uma posição complementar.O composto oligomérico e o DNA ou o RNA adicional são complementaresum com o outro quando um número suficiente de posições complementaresem cada molécula for ocupado por nucleobases que podem fazer pontes dehidrogênio uma com a outra. Assim, "que pode se hibridizar especificamen-te" e "complementar" são termos que são utilizados para indicar um grausuficiente de pareamento ou complementaridade precisa ao longo de umnúmero suficiente de nucleobases de forma que ocorram ligações estáveis eespecíficas entre o composto oligomérico e um ácido nucléico alvo.

É entendido na técnica que a seqüência de um composto oligo-mérico não precisa ser 100% complementar à de seu ácido nucléico alvocom o qual poderá ser especificamente hibridizada. Além disso, um oligonu-cleotídeo pode se hibridizar ao longo de um ou mais segmentos de formaque segmentos intermediários ou adjacentes não estejam envolvidos no e-vento de hibridização (por exemplo, uma estrutura em alça, um pareamentoerrado ou uma estrutura em grampo). Os compostos oligoméricos da pre-sente invenção compreendem pelo menos 70% ou pelo menos 75% ou pelomenos 80% ou pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou pelo menos 92% oupelo menos 95% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos99% de complementaridade de seqüência com uma região alvo dentro daseqüência de ácido nucléico alvo à qual são direcionados. Por exemplo, umcomposto oligomérico em que 18 de 20 nucleobases do composto anti-sentido são complementares a uma região alvo e, portanto, se hibridizariamespecificamente, representaria 90 por cento de complementaridade. Nesteexemplo, as nucleobases não complementares restantes podem estar agru-padas ou intercaladas com nucleobases complementares e não precisamestar contíguas uma com as outras ou com nucleobases complementares.Como tal, um composto oligomérico que possui 18 nucleobases de compri-mento possuindo 4 (quatro) nucleobases não complementares que são flan-queadas por duas regiões de complementaridade completa com o ácido nu-cléico alvo teria 77,8% de complementaridade global com o ácido nucléicoalvo e se encaixaria assim dentro do âmbito da presente invenção. A porcen-tagem de complementaridade de um composto oligomérico com uma regiãode um ácido nucléico alvo pode ser determinada rotineiramente utilizandoprogramas BLAST (ferramentas de busca de alinhamentos locais básicos(basic local alignment search tools)) e programas PowerBLAST conhecidosna técnica (Altschul e outros, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang eMadden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). A porcentagem de homologia, deidentidade de seqüência ou de complementaridade, pode ser determinada,por exemplo, através do programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Pac-kage, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University ResearchPark, Madison Wl), utilizando ajustes pré-estabelecidos, que utilizam o algo-ritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

Compostos oligoméricos

O termo "composto oligomérico" se refere a uma estrutura poli-mérica capaz de se hibridizar com uma região de uma molécula de ácidonucléico. Este termo inclui oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos deoligonucleotídeos, imitadores de oligonucleotídeos e combinações quiméri-cas dos mesmos. Os compostos oligoméricos são preparados rotineiramentede forma linear, mas podem ser ligados ou preparados de outra maneira pa-ra serem circulares. Além disso, são conhecidas na técnica estruturas ramifi-cadas. Um "composto anti-sentido" ou "composto oligomérico anti-sentido"se refere a um composto oligomérico que é pelo menos parcialmente com-plementar à região de uma molécula de ácido nucléico à qual se hibridiza eque modula (aumenta ou diminui) sua expressão. Conseqüentemente, em-bora possa ser dito que todos os compostos anti-sentido são compostos oli-goméricos, nem todos os compostos oligoméricos são compostos anti-sentido. Um "oligonucleotídeo anti-sentido" é um composto anti-sentido queé um oligômero baseado em ácido nucléico. Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ser modificado quimicamente. Os exemplos não Iimitantes decompostos oligoméricos incluem iniciadores, sondas, compostos anti-sentido, oligonucleotídeos anti-sentido, oligonucleotídeos com seqüênciaguia externa (EGS), agentes de processamento alternativo e siRNAs. Comotais, estes compostos podem ser introduzidos na forma de filamento simples,filamento duplo, circular, ramificado ou grampos e podem conter elementosestruturais tais como arqueamentos ou alças internas ou terminais. Os com-postos oligoméricos de filamento duplo podem ser dois filamentos hibridiza-dos para formar compostos de filamento duplo ou um filamento simples comautocomplementaridade suficiente para permitir a hibridização e a formaçãode um composto de filamento duplo total ou parcial.

Compostos oligoméricos "quiméricos" ou "quimeras", no contex-to desta invenção, são compostos oligoméricos de filamento simples ou du-plo, tais como oligonucleotídeos, que contêm duas ou mais regiões quimi-camente distintas, cada uma compreendendo pelo menos uma unidade mo-nomérica, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto oligonucleotídico.

Um "gapmer" é definido como um composto oligomérico, geral-mente um oligonucleotídeo, que possui uma região de 2'-desoxioligonu-cleotídeo flanqueada por segmentos sem ser de desoxioligonucleotídeosegmentos. A região central é referida como o "gap". Os segmentos flan-queadores são referidos como "asas". Se uma das asas possuir zero monô-meros de desoxioligonucleotídeo, é descrito um "hemimer".NAFLD

O termo "doença hepática graxa não alcoólica" (NAFLD) abran-ge um espectro de doenças que varia de um simples acúmulo de triglicerí-deos nos hepatócitos (esteatose hepática) até esteatose hepática com infla-mação (esteatohepatite), fibrose e cirrose. A esteatohepatite não alcoólica(NASH) ocorre partindo da progressão de NAFLD além da deposição de tri-glicerídeos. Um segundo evento capaz de induzir necrose, inflamação e fi-brose é necessário para o desenvolvimento de NASH. Os candidatos para osegundo evento podem ser agrupados em categorias amplas: fatores quecausam um aumento no estresse oxidativo e fatores que promovem a ex-pressão de citocinas pró-inflamatórias. Foi sugerido que os teores aumenta-dos de triglicerídeos no fígado levam ao estresse oxidativo nos hepatócitosde animais e seres humanos, indicando uma relação potencial de causa eefeito entre o acúmulo de triglicerídeos hepáticos, estresse oxidativo e aprogressão da esteatose hepática para NASH (Browning e Horton, J. Clin.Invest., 2004, 114, 147-152). A hipertrigliceridemia e "hiperácido graxo de-mia" podem causar acúmulo de triglicerídeos nos tecidos periféricos(Shimamura e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 322, 1080-1085). Uma modalidade da presente invenção é um método de redução delipídeos no fígado de um animal através da administração de uma quantida-de profilaticamente ou terapeuticamente ativa de um composto oligoméricoda invenção. Uma outra modalidade da presente invenção é um método detratamento da esteatose hepática em um animal através da administração deuma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficiente de um com-posto oligomérico da invenção. Em algumas modalidades, a esteatose é es-teatohepatite. Em algumas modalidades, a esteatose é NASH.

Modificações Químicas

Nucleobases Modificadas e Alternativas

Os compostos oligoméricos da invenção incluem ainda varia-ções em que uma base está presente em uma ou mais das posições de nu-cleotídeos no composto. Por exemplo, se o primeiro nucleotídeo for uma a-denosina, podem ser produzidas variações que contêm timidina, guanosinaou citidina nesta posição. Isto pode ser feito em qualquer uma das posiçõesdo composto oligomérico. Estes compostos são então testados utilizando osmétodos descritos aqui para determinar a sua capacidade de reduzir a ex-pressão do mRNA de GCCR.

Os compostos oligoméricos também podem incluir modificaçõesou substituições de nucleobases (freqüentemente referidas na técnica comobase heterocíclica ou simplesmente "base"). Como utilizado aqui, nucleoba-ses "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A)e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U).Uma "substituição" é a reposição de uma base não modificada ou natural poruma outra base não modificada ou natural. Nucleobases "modificadas" signi-ficam outras nucleobases sintéticas e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilae outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros deri-vados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracila e citosina eoutros derivados de alquinila de bases pirimidina, 6-azouracila, citosina etimina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tio-alquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas substituídas em 8, 5-haloparticularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas substi-tuídas em 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenina e3-deazaguanina e 3-deazaadenina. As nucleobases adicionalmente modifi-cadas incluem pirimidinas tricíclicas tais como fenoxazina citidina(1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), "G-clamps" (cintas G) tais como fenoxa-zina citidina substituída (por exemplo, 9-(2-aminoetóxi)-H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo(2,3-d)pirimidin-2-ona). Asnucleobases modificadas podem incluir ainda aquelas em que a base purinaou pirimidina é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. As nucleobasesadicionais incluem as descrições na Patente U.S. N2 3.687.808, as descritasem The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pági-nas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, as descritas porEnglisch e outros, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613e as descritas por Sanghvi, Y.S., Capítulo 15, Antisense Research and Ap-plications, páginas 289-302, Crooke, S.T. e Lebleu, B., ed., CRC Press,1993. Certas destas nucleobases são conhecidas pelos versados na técnicacomo adequadas para aumentar a afinidade de ligação dos compostos dainvenção; Estas incluem pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas epurinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. Foi mostrado que as substituições de 5-metilcitosina aumentam a estabilidade do duplex de ácido nucléico em 0,6-1,2 0Ce são substituições de bases atualmente adequadas, ainda mais par-ticularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-0-metoxietila. É entendido na técnica que a modificação da base não vinculatais modificações químicas de forma a produzir substituições em uma se-qüência de ácido nucléico.

As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação decertas das nucleobases modificadas citadas anteriormente assim como ou-tras nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas à PatenteU.S. Ns 3.687.808 citada anteriormente, assim como as Patentes U.S. N-:4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272;5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540;5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653;5.763.588; 6.005.096; 5.681.941; e 5.750.692.

Os compostos oligoméricos da presente invenção podem incluirainda compostos heterocíclicos policíclicos no lugar de um ou mais porçõesde bases heterocíclicas que ocorrem naturalmente. Um número de compos-tos heterocíclicos tricíclicos foi relatado anteriormente. Estes compostos sãoutilizados rotineiramente nas aplicações anti-sentido para aumentar as pro-priedades de ligação do filamento modificado a um filamento alvo. As modifi-cações mais estudadas são direcionadas para as guanosinas, conseqüen-temente, foram chamadas de "G-clamps" ou análogos de citidina. Os análo-gos de citosina representativos que fazem 3 ligações de hidrogênio em umsegundo filamento incluem 1,3-diazafenoxazina-2-ona (Kurchavov e outros,Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846), 1,3-diazafenotiazina-2-ona , (Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soe. 1995, 117,3873-3874) e 6,7,8,9-tetraflúor-1,3-diazafenoxazina-2-ona (Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388). Incorporadas nosoligonucleotídeos foi mostrado que estas modificações de bases se hibridi-zam com guanina complementar e também foi mostrado que a última se hi-bridiza com adenina e para aumentar a estabilidade térmica da hélice atra-vés de interações acumuladas estendidas (vide ainda as Publicações U. S.Pré-Grant 20030207804 e 20030175906).

As propriedades adicionais que estabilizam as hélices foram ob-servadas quando um análogo/substituto de citosina possui uma porçõesaminoetóxi ligado à estrutura rígida de 1,3-diazafenoxazina-2-ona (Lin, K.-Y.;Matteucci, M. J. Am. Chem. Soe. 1998, 120, 8531-8532). Os estudos de Ii-gação demonstraram que uma única incorporação poderia aumentar a afini-dade de ligação de um oligonucleotídeo modelo ao seu DNA ou RNA alvocomplementar com uma ATm de até 18°C em relação a 5-metil citosina(dC5me), que é um grande aumento de afinidade para uma única modifica-ção. Por outro lado, o ganho na estabilidade da hélice não compromete aespecificiadade dos oligonucleotídeos.

Os compostos heterocíclicos tricíclicos e os métodos de utiliza-ção dos mesmos que podem ser usados na presente invenção são descritosnas Patentes U.S. Nes 6.028.183 e 6.007.992.

A maior afinidade de ligação dos derivados de fenoxazina juntocom sua especificidade de seqüência não comprometida os torna análogosde nucleobases valiosos para o desenvolvimento de fármacos com base an-ti-sentido mais potentes. Na verdade, dados promissores foram derivados deexperimentos in vitro demonstrando que os heptanucleotídeos contendosubstituições de fenoxazina são capazes de ativar a RNase H, aumentar acaptação celular e exibem uma maior atividade anti-sentido (Lin, K-Y; Mat-teucci, M. J. Am. Chem. Soe. 1998, 120, 8531-8532). O aumento da ativida-de foi ainda mais pronunciado no caso de "G-clamp", uma vez que foi mos-trado que uma única substituição aumentou significativamente a potência invitro de um 20mer de 2'-desoxifosforotioato oligonucleotídeos (Flanagan, W.M.; Wolf, J.J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999, 96, 3513-3518).

Os compostos heterocíclicos policíclicos modificados adicionaisúteis como bases heterocíclicas são descritos na, mas não limitados à Pa-tente U.S. N2 3.687.808 citada anteriormente, assim como nas Patentes U.S.N2s: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.2725.434.257; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.7115.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.645.9855.646.269; 5.750.692; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; e 5.681.941 e naPublicação U.S. Pré-Grant 20030158403.

Combinações

As composições da invenção podem conter dois ou mais com-postos oligoméricos. Em uma outra modalidade relacionada, as composi-ções da presente invenção podem conter um ou mais compostos anti-sentido, particularmente oligonucleotídeos, direcionados para um primeiroácido nucléico e um ou mais compostos anti-sentido adicionais direcionadospara um segundo ácido nucléico alvo. Alternativamente, as composições dapresente invenção podem conter dois ou mais compostos anti-sentido dire-cionados para regiões diferentes do mesmo ácido nucléico alvo. Dois oumais compostos combinados podem ser utilizados juntos ou seqüencialmen-te.

Terapia de combinação

Os compostos da invenção podem ser utilizados em terapias decombinação, em que um efeito aditivo é atingido através da administraçãode um ou mais compostos da invenção e um ou mais outros compostos te-rapêuticos/profiláticos adequados para tratar um estado de saúde. O(s)composto(s) terapêutico(s)/profilático(s) adequado(s) incluem, mas não es-tão limitados a agentes de diminuição da glicose, agentes anti-obesidade eagentes de diminuição de lipídeos. Os agentes de diminuição da glicose in-cluem, mas não estão limitados a hormônios, imitadores de hormônios ouimitadores de incretina (por exemplo, insulina, incluindo insulina inalada,GLP-1 ou análogos de GLP-1 tal como Iiraglutida ou exenatida), inibidoresde DPP(IV), uma sulfoniluréia (por exemplo, acetohexamida, clorpropamida,tolbutamida, tolazamida, glimepirida, uma glipizida, gliburida ou uma gliclazi-da), uma biguanida (metformina), uma meglitinida (por exemplo, nateglinidaou repaglinida), uma tiazolidinadiona ou outros agonistas de PPAR-gama(por exemplo, pioglitazona ou rosiglitazona) um inibidor de alfa-glicosidase(por exemplo, acarbose ou miglitol) ou um composto anti-sentido não dire-cionado para GCGR. São também incluídos agonistas duais de PPAR (porexemplo, muraglitazar, que é desenvolvido pela Bristol-Myers Squibb ou te-saglitazar, que é desenvolvido pela Astra-Zeneca). São também incluídosoutros tratamentos para diabetes em desenvolvimento (por exemplo,LAF237, sendo desenvolvido pela Novartis; MK-0431, sendo desenvolvidopela Merck; ou rimonabant, sendo desenvolvido pela Sanofi-Aventis). Osagentes anti-obesidade incluem, mas não estão limitados a supressores deapetite (por exemplo, fentermina ou Meridia®), inibidores da absorção degordura tal como orlistat (por exemplo, Xenical®) e formas modificadas dofator neurotrófico ciliar que inibem sinais de fome que estimulam o apetite.Os agentes de diminuição de lipídeos incluem, mas não estão limitados aresinas que seqüestram sais biliares (por exemplo, colestiramina, colestipole cloridrato de colesevelam), inibidores da HMGCoA-reductase (por exem-plo, lovastatina, pravastatina, atorvastatina, simvastatina e fluvastatina), áci-do nicotínico, derivados do ácido fíbrico (por exemplo, clofibrato, gemfibrozil,fenofibrato, bezafibrato e ciprofibrato), probucol, neomicina, dextrotiroxina,ésteres de estanol vegetais, inibidores da absorção de colesterol (por exem-plo, ezetimibe), inibidores de CETP (por exemplo, torcetrapib e JTT-705)inibidores de MTP (por exemplo, implitapide), inibidores de transportadoresdo ácido biliar (transportadores do ácido biliar dependente de sódio apical),reguladores de CYP7a hepático, inibidores de ACAT (por exemplo, Avasimi-be), agentes terapêuticos de reposição de estrogênio (por exemplo, tamoxi-gen), HDL sintético (por exemplo, ETC-216), antiinflamatórios (por exemplo,glicocorticóides) ou um composto anti-sentido não direcionado para GCGR.Um ou mais destes fármacos podem ser combinados com um ou mais dosinibidores anti-sentido de GCGR para atingir um efeito terapêutico aditivo.

Síntese de Oliqômeros

A oligomerização de nucleosídeos modificados e não modifica-dos pode ser rotineiramente realizada de acordo com procedimentos da lite-ratura para DNA (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal(1993), Humana Press) e/ou RNA (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217.Gait e outros, Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Proteinlnteractions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo e outros, Tetrahedron (2001), 57,5707-5713) e Publicação US N2 US2005-0164271, que é incorporada aquicomo referência.

Os compostos oligoméricos da presente invenção podem serconvenientemente e rotineiramente produzidos através da técnica bem-conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para tal síntese é ven-dido por vários fornecedores, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City,CA). Quaisquer outros meios para tal síntese conhecidos na técnica podemser adicionalmente ou alternativamente empregados. É bem-conhecido ouso de técnicas similares para preparar oligonucleotídeos tais como fosforo-tioatos e derivados alquilados.

Purificação e Análise dos Oliqômeros

Os métodos de purificação e de análise dos oligonucleotídeossão conhecidos pelos versados na técnica. Os métodos de análise incluemeletroforese por capilaridade (CE) e espectroscopia de massa por eletros-pray. Tais métodos de síntese e de análise podem ser realizados em placascom várias cavidades.

Descrição não Iimitante e incorporação como referência

Embora certos compostos, composições e métodos da presenteinvenção tenham sido descritos com especificidade de acordo com certasmodalidades, os exemplos contidos aqui servem apenas para ilustrar oscompostos da invenção e não é pretendido que limitem a mesma. Cada umadas referências, números de acesso do GENBANK® e similares citados nopresente pedido de patente é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

Exemplo 1

Análise da Modulação da Expressão

A modulação da expressão de GCCR pode ser analisada de vá-rias maneiras conhecidas na técnica. Os níveis de mRNA de GCCR podemser quantificados, por exemplo, através da análise de Northern blot, da rea-ção em cadeia da polimerase (PCR) competitive ou da PCR em tempo real.A análise de RNA pode ser realizada no RNA celular total ou no mRNA po-li(A)+ através de métodos conhecidos na técnica. Os métodos de isolamentode RNA são ensinados, por exemplo, em Ausubel, F.M. e outros, CurrentProtQCQls in Molecular Bioiogy, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 e 4.5.1-4.5.3, JohnWiley & Sons, Inc., 1993.

A análise de Northern blot é rotineira na técnica e é ensinada,por exemplo, em Ausubel, F.M. e outros, Current Protocols in Molecular Bio-logy, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. A reação emcadeia da polimerase (PCR) em tempo real quantitativa pode ser convenien-temente realizada utilizando o ABI PRISM® 7700 Sequence Detection Sys-tem disponível comercialmente, disponível na PE-AppIied Biosystems, Fos-ter City, CA e utilizado de acordo com as instruções do fabricante.

Os níveis de proteínas codificados por GCCR podem ser quanti-ficados de várias maneiras bem-conhecidas na técnica, tal como imunopre-cipitação, análise de Western blot (immunoblotting), ELISA ou separação decélulas ativada por fluorescência (FACS). Anticorpos direcionados para umaproteína codificada por GCCR podem ser identificados e obtidos partindo devárias fontes, tal como o catálogo MSRS de anticorpos (Aerie Corporation,Birmingham, Ml) ou podem ser preparados através de métodos de produçãode anticorpos convencionais. Os métodos para a preparação de anti-sorospoliclonais são ensinados, por exemplo, em Ausubel, F.M. e outros, CurrentProtocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley &Sons, Inc., 1997. A preparação de anticorpos monoclonais é ensinada, porexemplo, em Ausubel, F.M. e outros, Current Protocols in Molecular Biology,Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Os métodos de imunoprecipitação são padronizados na técnicae podem ser encontrados, por exemplo, em Ausubel, F.M. e outros, CurrentProtocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley& Sons, Inc., 1998. A análise de Western blot (immunoblot) é padronizada natécnica e pode ser encontrada, por exemplo, em Ausubel, F.M. e outros,Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, JohnWiley & Sons, Inc., 1997. Os ensaios imunoabsorventes ligados à enzima(ELISA) são padronizados na técnica e podem ser encontrados, por exem-plo, em Ausubel, F.M. e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Vo-lume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.

O efeito dos compostos oügoméricos da presente invenção so-bre a expressão do ácido nucléico alvo pode ser testado em qualquer um deuma variedade de tipos celulares contanto que o ácido nucléico alvo estejapresente em níveis mensuráveis. O efeito dos compostos oligoméricos dapresente invenção sobre a expressão do ácido nucléico alvo pode ser roti-neiramente determinado utilizando, por exemplo, PCR ou análise de Nor-thern blot. As linhagens de células são derivadas tanto de tecidos e tipos decélulas normais quanto de células associadas com vários distúrbios (por e-xemplo, distúrbios hiperproliferativos). As linhagens de células derivadas devários tecidos e espécies podem ser obtidas na American Type Culture Col-Iection (ATCC, Manassas, VA), no Japanese Câncer Research ResourcesBank (Tóquio, Japão) ou no Centre for Applied Microbiology and Research(Wiltshire, Reino Unido).

As células primárias e as células que são isoladas de um animale não são submetidas à cultura contínua, podem ser preparadas de acordocom métodos conhecidos na técnica ou obtidas em vários fornecedores co-merciais. Adicionalmente, as células primárias incluem as obtidas de indiví-duos humanos doadores em uma unidade clínica (isto é, doadores de san-gue, pacientes cirúrgicos).Tipos de células

Os efeitos dos compostos oligoméricos sobre a expressão doácido nucléico alvo foram testados em células HepG2 e em hepatócitos pri-mários de rato.

Células HepG2:

A linhagem de células de hepatoblastoma humano HepG2 foiobtida na American Type Culture Collection (Manassas, VA). As célulasHepG2 foram cultivadas rotineiramente em MEM de Eagle suplementadocom 10% de soro fetal bovino, 1 mM de aminoácidos não essenciais e 1 mMde piruvato de sódio (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). As célulasforam rotineiramente passadas através de tratamento com tripsina e diluiçãoquando atingiam uma confluência de aproximadamente 90%. As placas decultura com várias cavidades são preparadas para o cultivo de células atra-vés do revestimento com uma diluição de 1:100 de colágeno de cauda derato do tipo 1 (BD Biosciences, Bedford, MA) em solução salina tamponadacom fosfato. As placas contendo colágeno foram incubadas a 37°C duranteaproximadamente 1 hora, após a qual o colágeno foi removido e as cavida-des foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato.As células foram semeadas em placas de 96 cavidades (Falcon-Primarianúmero 353872, BD Biosciences, Bedford, MA) a uma densidade de aproxi-madamente 8.000 células/cavidade para uso nos experimentos de transfec-ção com o composto oligomérico.

Hepatócitos primários de rato:

Os hepatócitos primários de rato são preparados partindo deratos Sprague-Dawley obtidos nos Charles River Labs (Wilmington, MA) esão rotineiramente cultivadas em DMEM, com alta concentração de glicose(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de so-ro fetal bovino (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), 100 unidadespor mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (Invitrogen Life Techno-logies, Carlsbad, CA). As células são semeadas em placas de 96 cavidades(Falcon-Primaria número 353872, BD Biosciences, Bedford, MA) a uma den-sidade de aproximadamente 4.000-6.000 células/cavidade de tratamentocom os compostos oligoméricos da invenção.

Tratamento com compostos oliqoméricos

Quando as células atingiram a confluência apropriada, foramtratadas com o oligonucleotídeo utilizando um método de transfecção comodescrito. Outros reagentes de transfecção adequados conhecidos na técnicaincluem, mas não estão limitados a LIPOFECTAMINE®, OLIGOFECTAMI-NE® e FUGENE®. Outros métodos de transfecção adequados conhecidos natécnica incluem, mas não estão limitados à eletroporação.LIPOFECTIN®

Quando as células atingem 65-75% de confluência, são tratadascom o oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo é misturado com LIPOFECTIN®(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) em meio com soro reduzidoOpti-MEM®-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para atingir aconcentração desejada do oligonucleotídeo e uma concentração de LIPO-FECTIN® de 2,5 ou 3 μg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo. Esta misturade transfecção é incubada à temperatura ambiente durante aproximadamen-te 0,5 hora. Para as células cultivadas em placa de 96 cavidades, as cavida- des são lavadas uma vez com 100 μί de OPTI-MEM®-1 e então tratadascom 130 μί da mistura de transfecção. As células cultivadas em placas de24 cavidades ou em outras placas de cultura de tecido padronizadas sãotratadas similarmente, utilizando volumes apropriados de meio e do oligonu-cleotídeo. As células são tratadas e os dados são obtidos em duplicata ouem triplicata. Após aproximadamente 4-7 horas de tratamento a 37°C, omeio contendo a mistura de transfecção é substituído por meio de culturafresco. As células são coletadas 16-24 horas após o tratamento com o oligo-nucleotídeo.CYTOFECTIN®

Quando as células atingem 65-75% de confluência, são tratadascom o oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo é misturado com CYTOFECTIN®(Gene Therapy Systems, San Diego, CA) em meio com soro reduzido OPTI-MEM®-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) para atingir a concen-tração desejada do oligonucleotídeo e uma concentração de CYTOFECTIN®de 2 ou 4 μg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo. Esta mistura de transfec-ção é incubada à temperatura ambiente durante aproximadamente 0,5 ho-ras. Para as células cultivadas em placas de 96 cavidades, as cavidades sãolavados uma vez com 100 μL de OPTI-MEM®-1 e então tratadas com 130 μLda mistura de transfecção. As células cultivadas em placas de 24 cavidadesou em outras placas de cultura de tecido padronizadas são tratadas similar-mente, utilizando volumes apropriados de meio de do oligonucleotídeo. Ascélulas são tratadas e os dados são obtidos em duplicata ou em triplicata.Após aproximadamente 4-7 horas de tratamento a 37°C, o meio contendo amistura de transfecção é substituído por meio de cultura fresco. As célulassão coletadas 16-24 horas após o tratamento com o oligonucleotídeo.

Oligonucleotídeos de controle

Os oligonucleotídeos de controle são utilizados para determinara concentração ótima do composto oligomérico para uma linhagem de célu-las particular. Além disso, quando os compostos oligoméricos da invençãosão testados em experimentos de seleção de compostos oligoméricos ou emensaios fenotípicos, os oligonucleotídeos de controle são testados em para-leio aos compostos da invenção. Em algumas modalidades, os oligonucleo-tídeos de controle são utilizados como oligonucleotídeos de controle negati-vo, isto é, como um meio para medir a ausência de um efeito sobre a ex-pressão gênica ou o fenótipo. Em modalidades alternativas, os oligonucleo-tídeos de controle são utilizados como oligonucleotídeos de controle positivo,isto é, como oligonucleotídeos conhecidos por afetarem a expressão gênicaou o fenótipo. Os oligonucleotídeos de controle são mostrados na Tabela 2."Nome do Alvo" indica o gene ao qual o oligonucleotídeo é direcionado. "Es-pécie do Alvo" indica a espécie em que o oligonucleotídeo é perfeitamentecomplementar ao mRNA alvo. "Motivo" é um indicativo de regiões quimica-mente distintas que compreendem o oligonucleotídeo. Certos compostos naTabela 2 são oligonucleotídeos quiméricos, compostos de uma região de"gap" central que consiste em 2'-desoxinucleotídeos, que é flanqueada emambos os lados (a 5' e a 3') por "asas". As asas são compostas de 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, também conhecidos como 2'-MOE nucleotídeos. O"motivo" de cada oligonucleotídeo do gapmer é ilustrado na Tabela 2 e indi-ca o número de nucleotídeos em cada região de gap e na asa, por exemplo, "5-10-5" indica um gapmer que possui uma região de gap de 10 nucleotí-deos flanqueada por asas de 5 nucleotídeos. ISIS 29848 é uma mistura decomposto oligomérico aleatória; sua seqüência é mostrada na Tabela 2, emque N pode ser A, T, C ou G. As ligações internucleosídeos (estrutura princi-pal) são fosforotioato em todos os oligonucleotídeos na Tabela 2. As citosi-nas não modificadas são indicadas por ,IÜC" na seqüência de nucleotídeos;todas as outras citosinas são 5-metilcitosinas.<table>table see original document page 37</column></row><table>A concentração do oligonucleotídeo utilizado varia de linhagemde células para linhagem de células. Para determinar a concentração ótimado oligonucleotídeo para uma linhagem de células particular, as células sãotratadas com um oligonucleotídeo de controle positivo em uma faixa de con-centrações. Os controles positivos são mostrados na Tabela 2. Por exemplo,para as células de humanos e de primatas sem ser humanos, o oligonucleo-tídeo de controle positivo pode ser selecionado de ISIS 336806 ou ISIS18078. Para células de camundongo ou de rato o oligonucleotídeo de contro-le positivo pode ser, por exemplo, ISIS 15770. A concentração de oligonu-cleotídeo de controle positivo que resulta em 80% de redução do mRNA al-vo, por exemplo, Raf quinase C de rato para ISIS 15770, é então utilizadacomo a concentração de seleção de novos oligonucleotídeos em experimen-tos subseqüentes para tal linhagem de células. Se os 80% de redução nãoforem atingidos, a menor concentração do oligonucleotídeo de controle posi- tivo que resulta em 60% de redução do mRNA alvo é então utilizada como aconcentração de seleção de oligonucleotídeos em experimentos subseqüen-tes para tal linhagem de células. Se os 60% de redução não forem atingidos,tal linhagem de células particular é considerada como inadequada para osexperimentos de transfecção de oligonucleotídeo. As concentrações de oli- gonucleotídeos anti-sentido utilizados aqui são de 50 nM até 300 nM quandoo oligonucleotídeo anti-sentido é transfectado utilizando um reagente de Ii-possomo e de 1 μM até 40 μΜ quando o oligonucleotídeo anti-sentido étransfectado por eletroporação.

Exemplo 2

Análise de PCR Quantitativa em Tempo Real dos Níveis demRNA de GCCR

A quantificação dos níveis de mRNA de GCCR foi realizada pelaPCR quantitativa em tempo real utilizando o ABI PRISM® 7600, 7700 ou7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)de acordo com instruções do fabricante.

As quantidades do gene alvo obtidas pela PCR em tempo realRT foram normalizadas utilizando o nível de expressão de GAPDH, um genecuja expressão é constante ou através da quantificação do RNA total utili-zando RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). O RNA total foiquantificado utilizando o reagente de quantificação de RNA RiboGreen®(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). 170 μL do reagente de trabalho deRiboGreen® (reagente RiboGreen® diluído 1:350 em 10 mM de Tris-HCI, 1mM de EDTA, pH 7,5) foram pipetados em uma placa de 96 cavidades con-tendo 30 μL do RNA celular purificado. A placa foi lida em um CytoFIuor4000 (PE Applied Biosystems) com excitação em 485 nm e emissão em530 nm.

A expressão de GAPDH foi quantificada pela PCR em temporeal RT, simultaneamente à quantificação do alvo ou separadamente. Para amedida simultânea à medida dos níveis de alvo, conjuntos de iniciadores-sondas específicos ao gene alvo que está sendo medido foram avaliados emrelação a sua capacidade de serem "multiplexados" com uma reação deamplificação de GAPDH antes da análise de PCR quantitativa. A "multiple-xação" se refere à detecção de várias espécies de DNA. neste caso o alvo eo controle de GAPDH endógeno, em um único tubo, que requer que o con-junto de iniciadores-sonda para GAPDH não interfira na amplificação do alvo.

As sondas e os iniciadores para uso na PCR em tempo real fo-ram planejados para se hibridizarem com seqüências específicas do alvo.Os métodos de planejamento dos iniciadores e das sondas são conhecidosna técnica. O planejamento dos iniciadores e das sondas para uso na PCRem tempo real pode ser realizado utilizando um software disponível comerci-almente, por exemplo, Primer Express®, PE Applied Biosystems, FosterCity, CA. Os iniciadores e as sondas e as seqüências do ácido nucléico comas quais se hibridizam são apresentados na Tabela 4. As sondas da PCRespecíficas ao alvo possuem FAM ligado covalentemente à extremidade a 5'e TAMRA ou MGB ligado covalentemente à extremidade a 3', em que FAM éo corante fluorescente e TAMRA ou MGB é o corante de decaimento.

Após o isolamento, o RNA é submetido à reação com a trans-criptase reversa (RT) seqüencial e à PCR em tempo real, as quais ambassão realizadas na mesma cavidade. Os reagentes de RT e de PCR foramobtidos na Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). A PCR em temporeal RT foi realizada na mesma cavidade através da adição de 20 μΙ_ do co-quetel da PCR (2,5x tampão da PCR menos MgCI2l 6,6 mM de MgCI2, 375 μΜde cada um de dATP, dCTP, dCTP e dGTP, 375 nM de cada do iniciadorpara frente e do iniciador para trás, 125 nM da sonda, 4 Unidades de inibidorda RNAse, 1,25 Unidades de PLATINUM® Taq, 5 Unidades de MuLV rever-se transcriptase e 2,5x corante ROX) em placas de 96 cavidades contendo30 μί da solução de RNA total (20-200 ng). A reação de RT foi realizadaatravés da incubação durante 30 minutos a 48°C. Após uma incubação de10 minutos a 95°C para inativar a PLATINUM® Taq, foram realizados 40ciclos de um protocolo de PCR em duas etapas: 95°C durante 15 segundos(desnaturação) seguidos por60°C durante 1,5 minuto (anelamento/extensão).

Os compostos da invenção foram avaliados em relação ao seuefeito sobre os níveis de mRNA alvo humano pela PCR em tempo real quan-titativa como descrito em outros exemplos contidos aqui, utilizando um con-junto de iniciadores-sonda planejado para a hibridização com GCCR huma-no. Por exemplo:

Iniciador para frente: TTGACA ι ι ι ι GCAGGATTTGGA (incorpo-rado aqui como a SEQ ID NO: 17)

Iniciador para trás: CCAAGGACTCTCATTCGTCTCTTT (incor-porado aqui como a SEQ ID NO: 18)E a sonda da PCR:

FAM-TTTCTTCTGGGTCCCC-MGB (incorporada aqui como aSEQ ID NO: 19), em que FAM é o corante fluorescente e MGB é um corantede decaimento não fluorescente.

Os compostos da invenção foram avaliados em relação ao seuefeito sobre os níveis de mRNA alvo de rato pela PCR em tempo real quanti-tativa como descrito em outros exemplos contidos aqui, utilizando um con-junto de iniciadores-sonda planejado para a hibridização com GCCR de rato.Por exemplo:

Iniciador para frente: AAACAATAGTTCCTGCAGCATTACC (in-corporado aqui como a SEQ ID NO: 20)

Iniciador para trás: CATACAACACCTCGGGTTCAATC (incorpo-rado aqui como a SEQ ID NO: 21)E a sonda da PCR:

FAM-ACCCCTACCTTGGTGTCACTGCT-TAMRA (incorporada aquicomo a SEQ ID NO: 22), em que FAM é o corante fluorescente e TAMFlA é ocorante de decaimento.

Os compostos da invenção podem ser avaliados em relação aoseu efeito sobre os níveis de mRNA alvo de camundongo pela PCR em tem-po real quantitativa como descrito em outros exemplos contidos aqui, utili-zando um conjunto de iniciadores-sonda planejado para a hibridização comGCCR de camundongo. Por exemplo:

Iniciador para frente: GACATCTTGCAGGATTTGGAGTT (incor-porado aqui como a SEQ ID NO: 23)

Iniciador para trás: AACAGGTCTGACCTCCAAGGACT (incorpo-rado aqui como a SEQ !D NO: 24)E a sonda da PCR:

FAM-CGGGTCCCCAGGTAAAGAGACAAACGA-TAMRA (incor-porada aqui como a SEQ ID NO: 25), em que FAM é o corante fluorescentee TAMRA é o corante de decaimento.

Exemplo 3

Inibicão anti-sentido da expressão de GCCR humano por aao-mers 5-10-5

Uma série de compostos oligoméricos foi planejada para se di-recionarem a regiões alvos diferentes do GCCR humano, utilizando seqüên-cias publicadas citadas na Tabela 1. Os compostos são mostrados na Tabe-la 3. Todos os compostos na Tabela 3 são oligonucleotídeos quiméricos("gapmers") de 20 nucleotídeos de comprimento, compostos de uma regiãode "gap" central que consiste em 2'-desoxinucleotídeos, que é flanqueadaem ambos os lados (a 5' e a 3') por "asas" de cinco nucleotídeos. As asassão compostas de 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, também conhecidos co-mo 2'-MOE nucleotídeos. As ligações internucleosídeos (estrutura principal)são fosforotioato ao longo de todo o oligonucleotídeo. Todos os resíduos decitidina são 5-metilcitidinas. É mostrada na Tabela 3 a seqüência do oligonu-cleotídeo e o sítio alvo que é a primeira posição (mais a 5') na seqüênciaalvo ao qual o composto se liga. Os compostos foram analisados em relaçãoao seu efeito sobre os níveis de mRNA do gene alvo pela PCR em temporeal quantitativo como descrito nos outros exemplos contidos aqui, utilizandoum conjunto de iniciadores-sonda planejado para a hibridização com GCCRhumano.

Os dados são médias de três experimentos em que as célulasHepG2 foram testadas com 50 nM dos compostos oligoméricos divultadosutilizando LIPOFECTIN®. Uma redução na expressão é expressa como aporcentagem de inibição na Tabela 3. Se presente, "N.D." indica "não deter-minado". As regiões alvos as quais estes compostos oligoméricos são inibi-dores são referidas aqui como "segmentos alvos validados".

Tabela 3

inibição dos níveis de mRNA de GCOR humano por gapmers5-10-5

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 44</column></row><table>

São preferidos os oligonucleotídeos de gapmer 5-10-5 mostra-dos na Tabela 3 que reduziam a expressão de GCCR em pelo menos 30%.Os segmentos alvos aos quais estas seqüências preferidas são complemen-tares são referidos aqui como "segementos alvos preferidos" e são, portanto,preferidos como alvos pelos compostos da presente invenção. Um outro as-pecto da presente invenção é um composto anti-sentido direcionado paraGCCR que compreende uma parte de 8 nucleobases das SEQ ID N-: 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ou 113 em que o dito composto sehibridiza especificamente com e reduz a expressão de GCCR. Em uma mo-dalidade o composto anti-sentido é um oligonucleotídeo anti-sentido, de 20nucleobases de comprimento caracterizado por uma região de região de 10desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3' com cinco2'-O-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em uma modalidade, todas as ligações in-ternucleosídeos são ligações fosforotioato. Em uma modalidade, todas ascitosinas são 5-metilcitosinas.

Exemplo 4Inibicão anti-sentido da expressão de GCCR humano por oliao-nucleotídeos qap-alados

De acordo com a presente invenção, os oligonucleotídeos gap-alados que possuem as mesmas seqüências que os compostos descritos naTabela 4 também foram testados. Todos os compostos na Tabela 4 são oli-gonucleotídeos quiméricos ("gapmers") de 20 nucleotídeos de comprimento,compostos de uma região de "gap" central que consiste em 16 2'-desoxi-nucleotídeos, que é flanqueada em ambos os lados (a 5' e a 3') por "asas"de dois nucleotídeos. As asas são compostas de 2'-0-(2-metoxietil) nucleo-tídeos, também conhecidos como 2'-MOE nucleotídeos. As ligações internu-cleosídeos (estrutura) são fosforotioato ao longo de todo o oligonucleotídeo.Todos os resíduos de citidina são 5-metilcitidinas. É mostrada na Tabela 4 aseqüência do oligonucleotídeo e o sítio alvo que é a primeira posição (mais a5') na seqüência alvo a qual o composto se liga. Os compostos do motivo 2-16-2 foram analisados em relação ao seu efeito sobre os níveis de mRNA dogene alvo pela PCR em tempo real quantitativa como descrito aqui.

Os dados são médias de três experimentos em que as célulasHepG2 foram tratadas como 50 nM dos compostos oligoméricos divulgadosutilizando LIPOFECTIN®. Uma redução na expressão é expressa como aporcentagem de inibição na Tabela 4. Se presente, "N.D." indica "não deter-minado". As regiões alvos as quais estes compostos oligoméricos são inibi-dores são referidas aqui como "segmentos alvos validados".

Tabela 4

<table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>ContinuacAO

<table>table see original document page 47</column></row><table>

São preferidos os oligonucleotídeos 2-16-2 mostrados na Tabela4 que reduziam a expressão de GCCR em pelo menos 30%. Os segmentosalvos aos quais estas seqüências preferidas são complementares são referi-dos aqui como "segmentos alvos preferidos" e são, portanto, preferidos parao direcionamento pelos compostos da presente invenção.

Um outro aspecto da presente invenção é um composto anti-sentido direcionado para GCCR que compreende uma parte de 8 nucleoba-ses das SEQ ID N25: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100,101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ou 113 em que odito composto se hibridiza especificamente com e reduz a expressão deGCCR. Em uma modalidade o composto anti-sentido é um oligonucleotídeoanti-sentido, de 20 nucleobases de comprimento caracterizado por uma re-gião de 16-desoxinucleotídeos flanqueada em suas extremidades a 5' e a 3'com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em uma modalidade, todas asligações internucleosídeos são ligações fosforotioato. Em uma modalidade,todas as citosinas são 5-metilcitosinas.

Exemplo 5

Oligonucleotídeos de espécies cruzadas que se direcionam ao GCCR

Alguns oligonucleotídeos descritos no exemplo anterior sãocomplementares ao longo das espécies e, portanto, é esperado que redu-zam a expressão do receptor de glicocorticóide ao longo das espécies. Émostrada na Tabela 5 a seqüência de tais oligonucleotídeos de espéciescruzadas e os números de ISIS da versão do motivo 5-10-5 e da versão domotivo 2-16-2 ao oiigonucieotídeo. É também indicado para cada seqüênciao sítio alvo que é a primeira posição (mais a 5') na seqüência alvo humana(NM_000176.1, incorporado aqui como a SEQ ID NO: 1) a qual o compostose liga. É indicada a complementaridade para o mRNA de GCCR humano,de macaco cinomolgo, de rato e de camundongo ("sim" significa complemen-taridade perfeita e "1 mm" significa um pareamento errado partindo da com-plementaridade perfeita).<table>table see original document page 49</column></row><table>Exemplo 6

Inibição anti-sentido dos níveis de mRNA de GCCR humano ede rato - estudos de resposta à dose com qapmers 5-10-5

Em uma modalidade adicional da presente invenção, onzeoligonucleotídeos foram selecionados para estudos de resposta à doseadicionais. Os hepatócitos primários de rato foram tratados com 5, 10, 25,50, 100 ou 200 nM de ISIS 180274, ISIS 180275, ISIS 180276, ISIS 180281,ISIS 180304, ISIS 361137, ISIS 361141, ISIS 361151, ISIS 361156, ISIS345198, ISIS 361137 ou do oligonucleotídeo de controle negativo ISIS141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, incorporado aqui como a SEQ IDNO: 114) e os níveis de mRNA foram medidos como descrito em outrosexemplos contidos aqui. ISIS 141923 é um gapmer 5-10-5 que compreendeum gap de dez desoxinucleotídeos flanqueado por asas de 2'-MOE e umaestrutura principal de fosforotioato. Todas as citosinas são 5-metilcitosinas.

As células na tratadas serviam como o controle em relação ao qual os dadosforam normalizados.

Os resultados destes estudos são mostrados na Tabela 6. Osníveis de mRNA alvo foram medidos pela PCR em tempo real como descritoaqui. Os dados são médias partindo de três experimentos e são expressoscomo a porcentagem de inibição em relação ao controle não tratado.

Tabela 6

Inibição dependente da dose da expressão do GCCR em hepa-tócitos primários de rato

<table>table see original document page 50</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Em uma modalidade adicional da presente invenção, os mesmosoligonucleotídeos foram testados na linhagem de células de HepG2 humanaem relação a sua capacidade de reduzir a expressão do mRNA de GCCRnas doses indicadas. As células não tratadas serviram como o controle emrelação ao qual os dados foram normalizados.

Os resiultados destes estudos são mostrados na Tabela 7. Osníveis de mRNA alvo são medidos pela PCR em tempo real como descritoaqui. Os dados são médias partindo de três experimentos e são expressoscomo a porcentagem de inibição em relação ao controle não tratado.

Tabela 7

Inibicão dependente da dose da expressão de GCCR em célulasHeoG2

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 6 e na Tabela 7, os oligonucleotídeosanti-sentido direcionados para GCCR são eficientes na redução dos níveisde mRNA alvo tanto humanos quanto de rato de uma maneira dependenteda dose.Exemplo 7

Inibição anti-sentido dos níveis de mRNA de GCCR de rato -estudos de resposta à dose in vivo com gapmers 5-10-5

Cinco dos oligonucleotídeos com motivo do gapmer 5-10-5 (ISIS180281, ISIS 361137, ISIS 345198, ISIS 180304 e ISIS 361141) foram avali-ados em várias doses em ratos em relação a sua capacidade de reduzir osníveis de mRNA de mRNA no fígado. Ratos Sprague Dawley com 8 sema-nas de idade foram divididos em grupos de tratamento que receberam dosesde 50, 25 ou 12,5 mg/kg de um dos oligonucleotídeos indicados através deinjeção. Cada grupo de tratamento era compreendido de quatro animais erecebeu as doses duas vezes por semana durante 3 semanas. Os animaisque receberam injeção com solução salina isolada serviram como um grupode controle. Os animais foram avaliados semanalmente em relação aos pa-râmetros padronizados de sangue (ALT/AST, cholesterol, triglicerídeos eglicose). Os animais foram sacrificados no final do estudo e o tecido do fíga-do foi coletado e anaiisado em relação à redução alvo utilizando métodos ueanálise pela PCR em tempo real descidos aqui. Os resultados são mostra-dos nas Tabelas 8a e 8b (experimentos separados) como a porcentagem deredução no mRNA de GCCR medida após o tratamento com as doses indi-cadas dos oligonucleotídeos indicados.Tabela 8a

Seleção de ratos in vivo - oligonucleotídeos anti-sentido para GCCR

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Tabela 8b Seleção de rato in vivo - oligonucleotídeos anti-sentido para GCCR

<table>table see original document page 52</column></row><table>Os dados nas Tabelas 8a e 8b mostram que os oligonucleotí-deos anti-sentido direcionados para GCCR são eficientes na redução da ex-pressão in vivo de uma maneira dependente da dose. ISIS 345198 (GTCA-AAGGTGCTTTGGTCTG; SEQ ID NO: 37) foi escolhido para a avaliaçãoadicional nos experimentos de estrutura-atividade focalizados na otimizaçãode gap. Este composto é perfeitamente complementar ao RNA do receptorde glicocorticóide de camundongo, rato, ser humano, macaco, Coelho e por-quinho-da-índia.Exemplo 8

Inibicão anti-sentido dos níveis de mRNA de GCCR in vivo - es-tudo de otimização de gap

Uma série de compostos oligoméricos foi planejada para se di-recionar ao GCCR alvo com tamanhos variáveis do gap de desoxinucleotí-deos e asas de 2'-MOE. Cada um dos oligonucleotídeos testados possui amesma seqüência de nucleobases (GTCAAAGGTGCTTTGGTCTG, incorpo-rada aqui como a SEQ ID NO: 37) e, portanto, se direciona ao mesmo seg-mento da SEQ ID NO: 1 (nucleobases 689 até 709). Como mostrado no E-xemplo 5, este oligonucleotídeo é também perfeitamente complementar aGCCR de rato.

Os compostos são mostrados na Tabela 9. O texto comum indi-ca um desoxinucleotídeo e as nucleobases designadas com texto sublinhadoem negrito são 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. As ligações internucleosí-deos são fosforotioato ao longo de todos e todas as citosinas são 5-metilcitosinas. É indicado na Tabela 9 o "motivo" de cada composto indicati-

ve de regiões quimicamente distintas que compreendem o oligonucleotídeo.Tabela 9

Compostos anti-sentido direcionados para GCCR de rato

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Ratos Sprague-Dawley machos com nove semanas de idadeforam tratados duas vezes por semana durante três semanas com doses de50, 25, 12,5 e 6,25 mg/kg dos oligonucleotídeos apresentados na Tabela 9.

Os animais que receberam injeção com solução salina isoladamente servi-ram como os controles. Cada grupo de tratamento era compreendido dequatro animais e os animais foram monitorados semanalmente em relaçãoaos níveis de transaminases, lipídeos, glicose no plasma e ao ganho de pe-so corporal. Como esperado para os animais normais, não foram observa-das alterações substanciais na glicose. Os níveis de colesterol (CHOL) e detriglicerídeo (TRIG) no plasma na linha de base (antes do início do tratamen-to) e os níveis medidos na semana 3 são mostrados na Tabela 10 em mg/dLcomo a média para cada grupo tratamento.

Tabela 10

Efeito dos oligonucleotídeos direcionados para GCCR sobre os níveisde lipídeos no plasma em ratos normais

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 10, o tratamento com os oligonucleo-tídeos anti-sentido direcionados para GCCR causou decréscimos dependen-tes da dose nos níveis de colesterol e de triglicerídeos. Portanto, uma moda-lidade da presente invenção é um método de diminuição dos níveis de lipí-deos no sangue em um animal que compreende a administração ao dito a-nimal de um oligonucleotídeo com gap-alado. Em uma modalidade preferida,o oligonucleotídeo gap-alado possui a seqüência da SEQ ID NO: 37. Emoutras modalidades preferidas, o oligonucleotídeo gap-alado é ISIS 372339,ISIS 377130 ou ISIS 377131.

No final do estudo, os animais foram sacrificados, os pesos dosórgãos foram medidos e os tecidos foram coletados para a determinação daredução do alvo e da concentração do oligonucleotídeo.

O tecido adiposo branco foi analisado em relação à redução doalvo utilizando métodos de análise de PCR em tempo real descritos aqui. Osresultados são mostrados nas Tabelas 11a, 11b e 11c (experimentos sepa-rados) na forma da porcentagem de redução no mRNA de GCCR medidaapós o tratamento com as doses indicadas dos oligonucleotídeos indicados.Os tecidos dos animais tratados com cada oligonucleotídeo gap-alado foramanalisados em relação à redução do alvo lado a lado com os tecidos de ani-mais tratados com o oligonucleotídeo com o motivo 5-10-5 para compara-ção.

Tabela 12a

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Tabela 11b

<table>table see original document page 55</column></row><table>Tabela 11c

Redução in vivo dos níveis de GCCR no tecido adiposo branco comoligonucleotídeos 4-12-4

<table>table see original document page 56</column></row><table>

O tecido do fígado também foi analisado em relação à reduçãodo alvo utilizando métodos de análise de PCR em tempo real descritos aqui.

Os resultados são mostrados nas Tabelas 12a, 12b e 12c (experimentosseparados) na forma da porcentagem de redução no mRNA de GCCR medi-da após o tratamento com as doses indicadas dos oligonucleotídeos indica-dos. Os tecidos de animais tratados com cada oligonucleotídeo gap-aladoforam analisados em relação à redução do alvo lado a lado com os tecidosde animais tratados com o oligonucleotídeo com o motivo 5-10-5 para com-paração.

Tabela 12a

Redução in vivo dos níveis de GCCR no fígado com os oligonucleotí-deos 2-16-2

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 12b

Redução in vivo dos níveis de GCCR no fígado com os oligonucleotí-deos 3-14-3

<table>table see original document page 56</column></row><table>Tabela 12c

Redução in vivo dos níveis de GCCR no fígado com os oligonucleotí-deos 4-12-4

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Como mostrado nas Tabelas 11a, 11b e 11c, todos os oligonu-cleotídeos gap-alados eram eficientes na redução dos níveis de GCCR deuma maneira dependente da dose in vivo. Em adição, os oligonucleotídeosgap-alados exibem uma tendência em direção a uma maior potência que ogapmer 5-10-5 no fígado.

Em adição, para determinar os efeitos da alteração do tamanhode gap sobre a farmacocinética, foi determinada a concentração do oligonu-cleotídeo nos rins e no fígado. Os métodos para a determinação da concen-tração do oligonucleotídeo nos tecidos são conhecidos na técnica (Geary eoutros, Anal Biochem, 1999, 274, 241-248). O oligonucleotídeo total é a so-ma de todos os metabólitos de oligonucleotídeos detectados no tecido. Sãomostradas na Tabela 12 a concentração total e a concentração do oligonu-cleotídeo de comprimento completo (em pg/g) no fígado dos animais trata-dos com o oligonucleotídeo indicado na concentração indicada.Tabela 12

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 12, os níveis de oligonucleotídeo decomprimento completo no fígado são comparáveis ou reduzidos para ISIS372339 e ISIS 377130 quando comparados com ISIS 345198. Acopladoscom a redução do alvo que é mostrada na Tabela 11, estes dados mostramque a maior potência dos compostos gap-alados não é causada pelo maioracúmulo do composto no fígado. Assim, os oligonucleotídeos preferidos dapresente invenção incluem oligonucleotídeos gap-alados que exibem potên-cia maior ou comparável em relação à redução do alvo ao gapmer 5-10-5correspondente sem maior acúmulo do composto em um tecido alvo. Emalgumas modalidades, o tecido alvo é o adiposo e em algumas modalidades,o tecido alvo é o fígado.LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110>

<120>

<130>

<150><151>

<160>

<170>

<210><211><212><213>

Isis Pharmaceuticals, Inc.

Monia, Brett P.

McKay, Robert

Freier, Susan M.

Bhanot, Sanj ay

Watts, Lynnetta

MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTOR DE GLICOCORTICÓIDE

BIOLOO65W0

60/718,6852005-09-19

114

FastSEQ para versão windows 4.01

4788DNA

H. sapiens

<400> 1

tttttagaaa

ttatctcggc

tgatattcac

agtgtgcttg

gctactgtga

aagcagcgaa

gatctgtcca

gtgatgggaa

acagacttaa

gagaacccca

ccaaaaactc

aacggtggca

ttggagtttt

ctgttgatag

ttggaaggaa

attaaggata

aaaacagaaa

ctgggcacag

tctgccattt

aatacagcat

attcccgttg

tctctgggga

agcatgagac

cctcccaaac

acttgtggaa

tgtgctggaa

cgctatcgaa

ataaaaggaa

aacaaaacaa

gaggttattg

tggaggatca

tgggcaaagg

cagtactcct

agtgcaaacc

ccctgcatgt

caggtatctt

aaggacggtc

ctaggaaaag

aaaaaaatattgcggcgggatgatggactcctcaggagagaggtttctgcgacttttggtaagcagtttcatgacctgggagcttttggaagagttcagcactctgatgtatgtgaaattcttctgggtcatgaaaactgactcgaatgaatggagatctaagaagattttttactgtcactgttcatggccctttctcagttccgaaaactctgaacttcagatgtaagtctgcctggtgctgtaaagtggaatgattgaatgtcttcattcagcaggctagttcctgcaacctgaagttgactácgctcaataccaggggatgtttcttgctgtgtttacgaccaatgatgaagagtatgaagagccaccattgtcaa

atttccctccactgcggacgcaaagaatcagggagatgtggtcttcaccctgattttccaactctcaatgattcccacagagaaagcattatccactgctatcttcagaagtataccacacccaggtaaatttgcfct.t-etggactgcaagggttttgtcacatcgaactcggcaagcttttgtgagtaccacagcaggatttggaataggccctggtcgactctcctccagtgctctgattttcttcaaacatcatcgatggctggaatgcactacaggaaacgttaccagttatatgcacaacatgttatttcaggaactatggcattttgctcctgattaaacacatgtctctgtatgagagctatttgagggaagga

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gcgttcacaaagcggctcctgtagagaagaataaaaccct-tcgcttctcataagcaatgctgggagagactcagcctttcataggtcgaccccccacagatgaagggccacctttgacatagagtccttggagaagacgataccggacacatgtaacactgggtaattaaatataattggagatgtaccatttttaatgtctggagatgactaatggctacaacagcaacgatgtcattaaaggacagcagaaaaaactgctcgaaaaacaaacctctgactaccctggtgctctgttccaagtgattgcatgaccaaatggagatcataatgagcagagcctctgagtttgcttctctcgaatgacctaagaactggca

gctaagttgtctgccagagtaaaccccagcaagaggaggaatcagactccgcagcagccaagaaacaaaactcgggggaacagtgttccagaaggagtttgactggcacctttgcaggatgagatcagacttcattcctttaaacccaaagccccaagtggcaagagaaataataaaatgctatgacatgcattccaccacaacttgactttcaagccccaacaggaccatggágtcttacaattacctacccagcatgcaaagaaaaaaaaatcctggtgtcactgttgagactcaactagcagtgaaagaccctactgtagacaatcaaatgactctaacacaggcttttcagttcctcatcaaagaggcggttttat

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<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 13gccctccatg ctggcacagg

20-

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 14agcaaaagat caatccgtta

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 15tacagaaggc tgggccttga

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 16atgcattctg cccccaagga

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 17

ttgacatttt gcaggatttg ga

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 18

ccaaggactc tcattcgtct cttt

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Sonda PCR

<400> 19tttcttctgg gtcccc<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 20

aaacaatagt tcctgcagca ttacc

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 21

catacaacac ctcgggttca ate

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Sonda PCR

<400> 22

acccctacct tggtgtcact gct

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 23

gacatcttgc aggatttgga gtt

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 24

aaeaggtctg acctccaagg act

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Sonda PCR

<400> 25

egggtcccca ggtaaagaga caaacga<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 26tctgtctctc ccatatacag

<210 > 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 27tgtttctgtc tctcccatat

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 28cttttgtttc tgtctctccc

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 29atcacttttg tttctgtctc

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 30gtttgcaatg ctttcttcca

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 31tgaggtttgc aatgctttct<210> 32<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 32ctattgaggt ttgcaatgct

20

<210> 33<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 33cgacctattg aggtttgcaa

20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 34ctggtcgacc tattgaggtt

20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 35ctgtggtata caatttcaca

20

<210> 36<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 36ctttggtctg tggtatacaa

20

<210> 37<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 37gtcaaaggtg ctttggtctg

20<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 38ggtttagtgt ccggtaaaat

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 39ctttttctgt tttcacttgg

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 40ttctcttgct taattacccc

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 41cagtttctct tgcttaatta

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 42gcccagtttc tcttgcttaa

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 43tttattacca attatatttg<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência. artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 44

acattttatt accaattata

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 45gcagacattt tattaccaat

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 46aatggcagac attttattac

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 47cagaaatggc agacatttta

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 48tgaacagaaa tggcagacat

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 49ccatgaacag aaatggcaga<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 50cacaccatga acagaaatgg

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 51tactcacacc atgaacagaa

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 52gaggtactca caccatgaac

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 53tccagaggta ctcacaccat

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 54gtcctccaga ggtactcaca

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 55atctgtcctc cagaggtact<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 56gtacatctgt cctccagagg

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 57agtggtacat ctgtcctcca

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 58tcatagtggt acatctgtcc

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 59catgtcatag tggtacatct

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 60tattcatgtc atagtggtac

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 61gctgtattca tgtcatagtg<210> 62<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 62ggatgctgta ttcatgtcat

20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 63aaagggatgc tgtattcatg

20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 64tgagaaaggg atgctgtatt

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 65tggtggaatg acattaaaaa

20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 66gaattggtgg aatgacatta

20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 67gagcttacat ctggtctcat

20<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 68aggagagctt acatctggtc

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 69atggaggaga gcttacatct

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 70ctggatggag gagagcttac

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 71gagctggatg gaggagagct

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 72tgtccttcca ctgctctttt

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 73gtgctgtcct tccactgctc<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico

<400> 74

aattgtgctg tccttccact 20

<210> 75<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico

<400> 75

aggtaattgt gctgtccttc 20

<210> 76<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico

<400> 76

cggcatgctg ggcagttttt 20

<210> 77<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico

<400> 77

atagcggcat gctgggcagt 20

<210> 78<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico

<400> 78

cgatagcggc atgctgggca 20

<210> 79<211> 20<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico

<400> 79attccagcct gaagacattt<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 80

gttcattcca gcctgaagac

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 81ttctttgttt ttcgagcttc

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 82

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 83caggaactat tgttttgtta

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 84tgcaggaact attgttttgt

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 85gagctatcat atcctgcata<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 86

aacagagcta tcatatcctg

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 87ctggaacaga gctatcatat

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 88

t uCdCt^Ct^ CââuCâCtlu^

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 89ccatttcact gctgcaatca

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 90ttgcccattt cactgctgca

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 91ataatcagat caggagcaaa<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 92attaataatc agatcaggag

20

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 93gctcattaat aatcagatca

20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 94ctctgctcat taataatcag

20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 95cattctctgc tcattaataa

20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 96agcatgtgtt tacattggtc

20

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 97aaggttttca tacagagata

20<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 98

cagtaaggtt ttcatacaga

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 99gaagcagtaa ggttttcata

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 100gagagaagca gtaaggtttt

<210> 101

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 101gcttttccta gctctttgat

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 102atggcttttc ctagctcttt

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 103atggtcttat ccaaaaatgt< 210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 104actcatggtc ttatccaaaa

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 105caatactcat ggtcttatcc

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 106aattcaatac tcatggtctt

<210> 107

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 107atgatttcag ctaacatctc

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 108gtgatgattt cagctaacat

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 109gaatattttg gtatctgatt<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 110

atttgaatat tttggtatct

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 111ttccatttga atattttggt

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 112atatttccat ttgaatattt

<210> 113

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 113tttttgatat ttccatttga

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 114ccttccctga aggttcctcc

Claims

1. Oligonucleotídeo anti-sentido com 20 nucleobases de com-primento direcionado para uma molécula de ácido nucléico que codifica GC-CR e que compreende pelo menos uma parte de 8 nucleobases da SEQ IDNO: 34, 33, 35, 36, 37, 42, 45, 56, 61, 63 ou 96, em que o oligonucleotídeocompreende uma região de desoxinucleotídeo com 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou- 18 nucleobases de comprimento que é flanqueada em suas extremidades a- 5' e a 3' com 1 até 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos e em que o oligonucleo-tídeo se hibridiza especificamente com e reduz a expressão de GCCR.

2. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1em que o número de nucleotídeos que flanqueiam a região de desoxinucleo-tídeo nas extremidades a 5' e a 3' é o mesmo.

3. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, em que o número de nucleotídeos que flanqueiam a região de desoxinu-cleotídeo nas extremidades a 5' e a 3' não é o mesmo.

4. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação de fosfo-rotioato.

5. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

6. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, que possui a seqüência de nucleobases da SEQ ID NO: 37.

7. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por uma região de 16 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

8. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 7, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforoti-oato.

9. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 7, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

10. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por uma região de 14 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

11. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-10, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

12. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-10, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

13. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação6, caracterizado por uma região de 12 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

14. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-13, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

15. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-13, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

16. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-6, caracterizado por uma região de IS desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

17.Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-16, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

18. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-16, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

19. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-6, caracterizado por uma região de 17 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotí-deos.

20. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-19, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato

21. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-19, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

22. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-1, que possui uma seqüência de nucleobases da SEQ ID NO: 33.

23. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-22, caracterizado por uma região de 16 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

24. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-23, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

25. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-23, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

26. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-22, caracterizado por uma região de 14 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

27. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-26, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

28. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-26, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

29. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-22, caracterizado por uma região de 12 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

30. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-29, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

31. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação- 29, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

32. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-22, caracterizado por uma região de 18 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

33. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação-32, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

34. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação- 32, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

35. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por uma região de 17 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

36. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 35, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

37. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 35, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

38. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, que possui uma seqüência de nucleobases da SEQ ID NO: 45.

39. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 38,caracterizado por uma região de 16 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

40. Oligonucleotideo anti-sentido de acordo com a reivindicação 39, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

41. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 39, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

42. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por uma região de 14 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

43. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 42,em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

44. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 42, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

45. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por uma região de 12 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

46. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação- 45, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

47. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 45, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

48. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por uma região de 18 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

49. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 48, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

50. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 48, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

51. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por uma região de 17 desoxinucleotídeos flanqueada emsuas extremidades a 5' e a 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotí-deos.

52. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 51, em que pelo menos uma ligação internucleosídeo é uma ligação fosforo-tioato.

53. Oligonucleotídeo anti-sentido de acordo com a reivindicação 51,em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

54. Composição farmacêutica que compreende o oligonucleotí-deo anti-sentido como definido na reivindicação 1 e opcionalmente um veícu-lo, um diluente, um intensificador ou um excipiente farmaceuticamente acei-tável.

55. Processo de redução da expressão do receptor de glicocorti-cóide em uma célula ou um tecido que compreende o contato da dita célulaou do dito tecido com a composição farmacêutica como definido na reivindi-cação 54.

56. Processo de acordo com a reivindicação 55, em que o tecidoé tecido adiposo ou de fígado.

57. Processo de tratamento de uma doença ou um estado desaúde mediado pela expressão de glicocorticóide em um animal que com-preende o contato do dito animal com uma quantidade eficiente da composi-ção farmacêutica como definido na reivindicação 54.

58. Processo de acordo com a reivindicação 57, em que a doen-ça ou o estado de saúde é diabetes, obesidade, síndrome metabólica X, hi-perglicemia ou hiperlipidemia.

59. Processo de acordo com a reivindicação 57, em que a doen-ça é diabetes do Tipo 2.

60. Processo de acordo com a reivindicação 57, em que a doen-ça é hiperlipidemia associada com níveis elevados de colesterol no sangueou elevados de triglicerídeos no sangue.

61. Processo de acordo com a reivindicação 57, em que o esta-do de saúde é esteatose hepática.

62. Processo de acordo com a reivindicação 61, em que a estea-tose é esteatohepatite.

63. Processo de acordo com a reivindicação 61, em que a estea-tose é esteatohepatite não alcoólica.

64. Processo de diminuição dos níveis de glicose no sangue emum animal que compreende a administração ao dito animal de uma quanti-dade terapeuticamente eficiente da composição farmacêutica como definidana reivindicação 54.

65. Processo de acordo com a reivindicação 64, em que o ani-mal é um ser humano.

66. Processo de acordo com a reivindicação 64, em que os ní-veis de glicose no sangue são níveis de glicose no sangue em jejum.

67. Processo de diminuição dos níveis de lipídeos no sangue emum animal que compreende a administração ao dito animal de uma quanti-dade terapeuticamente eficiente da composição farmacêutica como definidana reivindicação 54.

68. Processo de acordo com a reivindicação 67, em que os ní-veis de lipídeos no sangue são níveis de colesterol no sangue.

69. Processo de acordo com a reivindicação 67, em que os ní-veis de lipídeos no sangue são níveis de triglicerídeos no sangue.

70. Processo de diminuição dos níveis de triglicerídeos no fígadoem um animal que compreende a administração ao dito animal de umaquantidade terapeuticamente eficiente da composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 54.

71. Processo de redução da massa de gordura corporal em umanimal que compreende a administração ao dito animal de uma quantidadeterapeuticamente eficiente da composição farmacêutica como definida nareivindicação 54.

72. Processo de redução do aumento da sensibilidade à insulinaem um animal que compreende a administração ao dito animal de umaquantidade terapeuticamente eficiente da composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 54.

73. Processo de inibição da saída de glicose hepática em umanimal que compreende a administração ao dito animal de uma quantidadeterapeuticamente eficiente da composição farmacêutica como definida nareivindicação 54.

74. Processo de retardo ou de prevenção do início de um au-mento nos níveis de lipídeos no sangue ou de glicose no sangue em um a-nimal que compreende a administração ao dito animal de uma quantidadeterapeuticamente eficiente da composição farmacêutica como definida nareivindicação 54.

75. Processo de tratamento de um animal que possui uma doen-ça ou um estado de saúde metabólico que compreende a administração aodito animai de um composto como definida na reivindicação 1 em combina-ção com um agente antidiabético selecionado do grupo que compreendeagonistas de PPAR incluindo agonistas de PPAR-gama, dual-PPAR ou pan-PPAR, inibidores da dipeptidil peptidase (IV), análogos de GLP-1, insulina eanálogos de insulina, secretagogos de insulina, inibidores de SGLT2, análo-gos da amilina humana incluindo pramlintida, ativadores da glucoquinase,inibidores de biguanidas e alfa-glicosidase para atingir um efeito terapêuticoaditivo.