BRPI0616375A2 - métodos de obtenção de uma planta de milho duplo-haplóide, de semente duplo-haplóide, de um set de grãos com embriões duplo-haplóides, de um set de grãos de milho duplo-haplóide em uma espiga de milho, de um embrião de milho duplo-haplóide set de grãos com embriões duplo-haplóides - Google Patents
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Classifications
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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Abstract
MéTODOS DE OBTENçãO DE UMA PLANTA DE MILHO DUPLO-HAPLóIDE, DE SEMENTE DUPLO-HAPLóIDE, DE UM SET DE GRãOS COM EMBRIõES DUPLO-HAPLóIDES, DE UM SET DE GRãOS DE MILHO DUPLO-HAPLóIDE EM UMA ESPIGA DE MILHO, DE UM EMBRIãO DE MILHO DUPLO-HAPLóIDE E SET DE GRãOS COM EMBRIõES DUPLO-HAPLóIDES. São fornecidos métodos para produzir plantas, sementes, e células vegetais de milho duplo-haplóide (Zea mays).
Description
MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO DUPLO-HAPLÓIDE,DE SEMENTE DUPLO-HAPLÓIDE, DE UM SET DE GRÃOS COM EMBRIÕESDUPLO-HAPLÓIDES, DE UM SET DE GRÃOS DE MILHO DUPLO-HAPLÓIDEEM UMA ESPIGA DE MILHO, DE UM EMBRIÃO DE MILHO DUPLO-HAPLÓIDE E SET DE GRÃOS COM EMBRIÕES DUPLO-HAPLÓIDES
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo de melhoramentovegetal e de produção de plantas duplo-haplóides.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Plantas homozigotas são básicas para desenvolvimento deprodutos e comercialização de plantas. Obter plantashomozigotas requer diversas gerações de auto-polinização eanálise de segregação. Isso é uma utilização ineficiente detrabalho e tempo. Seria útil, portanto, desenvolver ummétodo para reduzir as etapas de polinização manualnormalmente necessárias para se obter uma planta homozigotae reduzir a quantidade de tempo necessária para obter umapopulação de plantas homozigotas. Um meio de obter plantashomozigotas sem a necessidade de autopolinizar múltiplasgerações é produzir haplóides e, então, duplicar oscromossomos para formar duplo-haplóides.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Métodos para produzir plantas, sementes, e célulasvegetais duplo-haplóides são providos. Os métodosapresentados aumentam a eficiência do processo de duplo-haploidia aumentando o número de duplo-haplóides obtidos ediminuindo a quantidade de tempo requerida para produzir osduplo-haplóides.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Uma planta haplóide possui um único grupo (genoma) decromossomos e o número reduzido de cromossomos (n) na plantahaplóide é igual àquele do gameta.
Uma planta diplóide possui dois grupos (genomas) decromossomos e o número de cromossomos (2n) é igual àquele dozigoto.
Um duplo-haplóide, ou planta duplo-haplóide, ou célula,é aquele que é desenvolvido pela duplicação de um grupohaplóide de cromossomos. Uma planta ou semente que é obtidaa partir de uma planta duplo-haplóide que é auto-polinizadapor qualquer número de gerações pode ser ainda identificadacomo uma planta duplo-haplóide. Uma planta duplo-haplóide éconsiderada uma planta homozigota. Uma planta é consideradacomo duplo-haplóide se ela é fértil, mesmo que toda a partevegetativa da planta não consista das células com o grupoduplicado de cromossomos. Por exemplo, uma planta seráconsiderada uma planta duplo-haplóide se contiver gametasviáveis, mesmo se for quimérica.
Um "embrião haplóide imaturo" é definido como o embriãoformado após um núcleo de esperma de um grão de pólen sefundir com os núcleos polares no saco embrionário para criarum endosperma triplóide (3N) e antes de secar.
A "embrião duplo-haplóide" é um embrião que possui umaou mais células que contém 2 grupos de cromossomoshomozigotos.
"Calo" refere-se a uma massa de células ou tecidosdiferenciada em proliferação.
Os termos "promover o contato", "entra em contato com"ou "colocado em contato com" pode ser usado para significar"contato direto" ou "contato indireto". Por exemplo, o meiocompreendendo um agente de duplicação pode ter contatodireto com a célula haplóide, ou o meio compreendendo oagente de duplicação pode ser separado da célula haplóidepor filtro de papel, tecidos vegetais, ou outras células,assim o agente de duplicação é transferido através do filtrode papel ou células para a célula haplóide.
0 termo "meio" inclui compostos em estado liquido,gasoso ou sólido.
Como aqui usado, o termo "planta" inclui referência aplantas inteiras, órgãos vegetais (e.g., folhas, caules,raízes, etc.), sementes e células vegetais e progênie damesma. "Célula vegetal", como aqui usado inclui, semlimitação, sementes, culturas em suspensão, embriões,regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes,brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. Aclasse de plantas que pode ser usada nos métodos providosincluem ambas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.
Providos estão métodos para 1) identificar embriõeshaplóides em um estágio inicial com alta precisão, 2)protocolos de duplicação de cromossomos em um estágioinicial de desenvolvimento do embrião, 3) geração de plantaa partir de embriões de estágio inicial. Os métodos são,geralmente, independentes de genótipo, estendendo, assim, oescopo de plantas que podem ser usadas para produzir duplo-haplóides. Os métodos geralmente produzem uma altafreqüência de plantas duplo-haplóides que são férteis.
Um método provido compreende obter um embrião duplo-haplóide, semente, ou planta promovendo o contato de umembrião haplóide com um agente de duplicação, obtendo umembrião duplo-haplóide, semente, ou planta.
Outro método provido é obter uma planta duplo-haplóidecompreendendo as seguintes etapas: a) polinizar óvulos, ouestigmas, de uma planta com pólen de uma linha indutora,caracterizado pelo fato de que a linha indutora possui umgene marcador que é expressado em embriões e/ou tecido deendosperma; b) selecionar um embrião haplóide que nãoexpressa um gene marcador; c) promover o contato do embriãohaplóide com um gás, solução ou sólido compreendendo umagente de duplicação; e d) regenerar aquele embrião em umaplanta duplo-haplóide.Outro método é obter uma semente duplo-haplóidecompreendendo as seguintes etapas: a) obter uma sementehaplóide polinizando um óvulo com uma linha indutora,caracterizado pelo fato de que o óvulo compreende um grupode cromossomos maternos, caracterizado pelo fato de que alinha indutora compreende um grupo de cromossomos paternos;b) promover o contato da semente haplóide com um meiocompreendendo um agente de duplicação; c) selecionar umasemente duplo-haplóide, caracterizado pelo fato de que asemente duplo-haplóide compreende um endosperma triplóide emum embrião duplo-haplóide. A semente duplo-haplóideproduzida por um método pode ser produzida, caracterizadapelo fato de que o endosperma triplóide compreende doisgrupos de cromossomos maternos e um grupo de cromossomospaternos, e caracterizado pelo fato de que o embrião duplo-haplóide possui um primeiro e um Segundo grupo decromossomos maternos, e caracterizado pelo fato de que oprimeiro grupo de cromossomos maternos é homozigoto aosegundo grupo de cromossomos maternos. Também incluído estáum método de determinar a origem dos cromossomos com o usode um marcador que é expressado durante o desenvolvimentoinicial da semente.
Provido está um método de obter uma população deplantas de milho duplo-haplóides compreendendo as seguintesetapas: a) obter um grupo de sementes haplóides polinizandouma espiga com uma linha indutora caracterizado pelo fato deque a espiga compreende um grupo de cromossomos maternos ecaracterizado pelo fato de que a linha indutora compreendeum grupo de cromossomos paternos; b) promover o contato dedito grupo de sementes haplóides com um meio compreendendoum agente de duplicação; c) eleger um grupo de sementesduplo-haplóides, caracterizado pelo fato de que cada sementede dito grupo de sementes duplo-haplóides compreende umendosperma triplóide e um embrião duplo-haplóide; d)cultivar dito grupo de sementes duplo-haplóides em umapopulação de plantas de milho duplo-haplóides. 0 grupo desementes duplo-haplóides produzido possui endospermatriplóide e o endosperma triplóide compreende dois grupos decromossomos maternos e um grupo de cromossomos paternos. 0embrião duplo-haplóide também possui dois grupos decromossomos maternos. Esses dois grupos de cromossomos sãohomozigotos. 0 primeiro grupo de cromossomos é replicadopara formar o segundo grupo de cromossomos. Os váriosgrupos obtidos a partir desses métodos podem incluir o grupode embriões em uma espiga de milho, o grupo de sementes emuma espiga de milho, e o grupo de plantas de milho duplo-haplóides.
Outro aspecto do método é obter uma planta de milhoduplo-haplóide compreendendo: a) polinizar estilos-estigmasde uma espiga de milho com uma linha indutora; b) promover ocontato da espiga de milho com um meio compreendendo umagente de duplicação; c) gerar um embrião a partir da espigade milho em uma planta de milho duplo-haplóide. Outrosaspectos do método incluem remover a espiga de milho daplanta com ou sem o talo ou alguma porção do talo anexado.
A espiga pode ser removida antes, durante, ou após apolinização e colocadas em uma solução. A espiga pode sercolocada em uma solução de 6 horas a 21 dias após apolinização e até 35 dias após a polinização. A soluçãopode compreender água ou água e nutrientes. A solução podevir ao contato com a espiga diretamente ou indiretamente,por exemplo via filtro de papel ou algodão. 0 agente deduplicação pode vir ao contato com a espiga após apolinização e antes ou depois da espiga ser removida daplanta. O agente de duplicação cromossômico podem vir aocontato com a espiga diretamente ou indiretamente, porexemplo, via filtro de papel ou algodão.
Outro método provido é obter um grupo de embriões demilho duplo-haplóides compreendendo as seguintes etapas: a)obter um grupo de embriões haplóides polinizando uma espigacom uma linha indutora; caracterizado pelo fato de que aespiga compreende um grupo de cromossomos maternos de umaplanta de milho Fl; e caracterizado pelo fato de que a linhaindutora compreende um grupo de cromossomos paternos; b)promover o contato de dito grupo de embriões haplóides comum meio compreendendo um agente de duplicação; c) selecionarum grupo de embriões de milho duplo-haplóides caracterizadopelo fato de que cada embrião de milho duplo-haplóide dedito grupo de embriões de milho duplo-haplóides égeneticamente diferente de cada dos outros embriões de milhoduplo-haplóides de dito grupo de embriões de milho duplo-haplóides; d) cultivar dito grupo de embriões de milhoduplo-haplóides em uma população de plantas de milho duplo-haplóides. Esse método desenvolve um único grupo deembriões de milho duplo-haplóides. Esse grupo único deembriões é derivado diretamente de uma espiga de milho,caracterizado pelo fato de que "ser derivado diretamente"indica que uma geração filha não ocorre entre odesenvolvimento dos embriões haplóides e ou desenvolvimentodo grupo de embriões duplo-haplóides.
Um método de seleção intercruzada é providocompreendendo as seguintes etapas: a) polinização cruzada deduas plantas de milho intercruzadas; b) cultivar a sementeFl; c) polinizar a planta Fl com uma linha indutora paraproduzir embriões haplóides; d) promover o contato dosembriões haplóides com um agente de duplicação cromossômicopara produzir embriões duplo-haplóides;
e) gerar plantas duplo-haplóides; f) avaliar ditas plantasduplo-haplóides para desempenho agrícola e habilidadecombinada. 0 desenvolvimento de etapa de haplóides pode serfeito em gerações mais tardias, F2, F3, F4, etc. Produzirhaplóides a partir de gerações mais tardias permiteoportunidades adicionais para recombinação.
Os métodos providos podem incluir o uso de recuperaçãode embrião. A recuperação de embrião é efetuado promovendoo contato de um embrião com um meio contendo nutrientes egerando uma planta. Fito-hormônios podem ou não estarincluídos no meio de recuperação de embrião.
Outro método de obter um embrião transgênico duplo-haplóide pode compreender isolar um embrião haplóide,transformar o embrião haplóide, colocar o embrião haplóideem um meio compreendendo um agente de duplicaçãocromossômico, e selecionar um embrião transgênico duplo-haplóide.
Em qualquer desses métodos, marcadores podem ser usadosnesse processo de distinguir os embriões haplóides dosembriões obtidos a partir de polinização normal (2N).
Em qualquer desses métodos, os cromossomos podem serduplicados no estágio de embrião imaturo, no estágio desemente madura, ou em qualquer momento entre a polinizaçãoda planta e antes da germinação da semente haplóide.
Em qualquer desses métodos, o embrião haplóide quepassa por duplicação cromossômica pode ser isolado, podeestar na semente ou grão, pode estar na espiga em uma fatiade sabugo, pode estar na espiga ou espigão, ou o embriãohaplóide pode estar no grão que está na espiga e em umaplanta. O agente de duplicação pode alcançar o embriãohaplóide enquanto a espiga está na planta e a planta estáintacta. Por exemplo, o agente de duplicação pode serlevado ao contato diretamente ou indiretamente com o embriãohaplóide. Em alguns casos, o agente de duplicação pode sertransportado pela planta. A planta pode ser cultivadahidroponicamente e o agente de duplicação pode ser absorvidoatravés das raízes da planta e transportado para o embriãohaplóide. A planta pode começar for a sendo cultivada emsolo ou um meio de crescimento e, então, transferido parauma solução hidropônica onde o agente de duplicação pode seradicionado. Em outro aspecto do método, a planta pode sercultivada em solo ou um meio de crescimento e, então, oagente de duplicação é adicionado ao solo ou meio decrescimento, de forma que possa ser transportado para oembrião haplóide.
Métodos para obter plantas homozigotas, célulasvegetais, e sementes são providos. Também providos estãométodos para obter embriões haplóides e sementes e métodospara aumentar a duplicação de cromossomos. Os métodoscompreendem promover o contato de células haplóides com umagente de duplicação cromossômico. Os métodos tambémcompreendem cruzar uma planta selecionada e uma linhaindutora para produzir embriões haplóides ou sementes.Outros métodos compreendem cruzar uma planta selecionada euma linha indutora para produzir uma célula haplóide, etratar a célula haplóide com um agente de duplicaçãocromossômico. Os métodos provêm células vegetais duplo-haplóides que podem ser geradas em uma planta contendo geneshomozigotos.
Os métodos evitam métodos de autopolinização ecruzamento dispendiosos de tempo para obter um traçohomozigoto de interesse ou uma planta essencialmentehomozigota. Os métodos apresentados podem ser usados paraproduzir populações duplo-haplóides que não contêm aheterozigosidade residual de intercruzados obtidos atravésdo método tradicional de auto polinização. Os métodos podemser úteis para genômica funcional, tais como análise deknock-out, análise funcional de genes recessivos,substituição de genes, recombinação homóloga, direcionamentode genes, estacamento de transgene, e análise de avaliaçãoletal versus não letal de genes. Com os sistemas diplóidespreviamente conhecidos, essas análises são muito complicadase caras.
Sistemas de indução de haplóides foram desenvolvidospara várias plantas para produzir tecidos, plantas esementes haplóides. 0 sistema de indução haplóide podeproduzir plantas haplóides de qualquer genótipo cruzando umalinha selecionada (como fêmea) com uma linha indutora. Taislinhas indutoras para milho incluem Stock 6 (Coe, 1959, Am.Nat. 93:381-382; Sharkar and Coe, 1966, Genetics 54:453-464)RWS (Roeber and Geiger 2001, submitted to Crop Science),KEMS (Deimling, Roeber, and Geiger, 1997, Vortr.Pflanzenzuchtg 38:203-224), ou KMS e ZMS (Chalyk, Bylich &Chebotar, 1994, MNL 68:47; Chalyk & Chebotar, 2000, PlantBreeding 119:363-364), e mutação de gametófito indeterminado(ig) (Kermicle 1969 Science 166:1422-1424). As revelaçõesdas quais são aqui incorporadas por referência.
Amplos cruzamentos de hibridização podem ser tambémusados para produzir haplóides. Esse método é, às vezes,referido como o método de bulbosum (Kasha and Kao, 1970,Nature 225:874-876). Esse método de produção de haplóidesocorre devido à eliminação dos cromossomos do parentalpolinizador.
Métodos para obter plantas haplóides são tambémdescritos em Kobayashi, M. et al., J. of Heredity 71(1) : 9-14, 1980, Pollacsek, M., Agronomie (Paris) 12(3):247-251,1992; Cho-Un-Haing et al., J. of Plant Biol., 1996,39 (3) : 185-188; Verdoodt, L., et al. , Feb. 1998, 96(2):294-300; Genetic Manipulation in Plant Breeding, ProceedingsInternational Symposium Organized by EUCARPIA, Sept. 8-13,1985, Berlin, Germany; Chalyk et al., 1994, Maize GenetCoop. Newsletter 68:47; Chalyk, S. T., 1999, Maize Genet.Coop. Newsletter 73:53-54; Coe, R.H., 1959, Am. Nat. 93:381-382; Deimling, S. et al., 1997, Vortr. Pflanzenzuchtg38:203-204; Kato, A., 1999, J. Hered. 90:276-280; Lashermes,P. et al., 1988, Theor. Appl. Genet. 76:570-572 e 76:405-410; Tyrnov, V.S. et al., 1984, Dokl. Akad. Nauk. SSSR276:735-738; Zabirova, E. R. et al., 1996, Kukuruza I SorgoN4, 17-19; Aman, M.A., 1978, Indian J. Genet Plant Breed38:452-457; Chalyk S.T., 1994, Euphytiea 79:13-18; Chase,S.S., 1952, Agron. J. 44:263-267; Coe, E.H., 1959, Am. Nat.93:381-382; Coe, E.H., and Sarkar, K.R., 1964 J. Hered.55:231-233; Greenblatt, I.M. and Bock, M., 1967, J. Hered.58:9-13; Kato, A., 1990, Maize Genet. Coop. Newsletter65:109-110; Kato, A., 1997, Sex. Plant Reprod. 10:96-100;Nanda, D. K. and Chase, S.S., 1966, Crop Sei. 6:213-215;Sarkar, K.R. and Coe, E.H., 1966, Geneties 54:453-464;Sarkar, K.R. and Coe, E.H., 1971, Crop Sei. 11:543-544;Sarkar, K. R. and Saehan J.K.S., 1972, Indian J. Agric. Sei.42:781-786; Kermiele J.L., 1969, Mehta Yeshwant, M. R.,Geneties and Molecular Biology, September 2000, 23(3):617-622; Tahir, M.S. et al. Pakistan Journal of Seientific andIndustrial Research, August 2000, 43 ( 4) :258-261; Knox, R. E .et al. Plant Breeding, August 2000, 119 (4) :289-298; e US5.639.951, as revelações das quais são aqui incorporadas porreferência.Quando uma linha indutora é usada para polinizar umaplanta diplóide, embriões haplóides são derivados. Umnúcleo de esperma do pólen se funde com os núcleos polaresno saco embrionário para criar um endosperma triplóide (3N).O endosperma triplóide conterá 2 grupos de cromossomos dafêmea e 1 grupo de cromossomos do macho, o que, nesse caso,é a linha indutora. 0 embrião haplóide contém um únicogrupo de cromossomos, que são derivados da planta fêmea.
Células haplóides, embriões haplóides, sementeshaplóides, plântulas haplóides ou plantas haplóides podemser tratadas com um agente de duplicação cromossômico.Plantas homozigotas podem ser regeneradas a partir decélulas haplóides promovendo o contato das célulashaplóides, tais como células de embrião haplóide, comagentes de duplicação cromossômicos. As células haplóidespodem vir ao contato com o agente de duplicação no momentoda polinização, em qualquer hora após a polinização,tipicamente de 6 horas a 21 dias após a polinização, de 6horas a 15 dias após a polinização, no estágio de sementemadura, no estágio de plântula, ou no estágio de planta. 0embrião haplóide pode vir ao contato com o agente deduplicação quando um núcleo de esperma de um grão de pólense funde com os núcleos polares no saco embrionário paracriar um endosperma triplóide (3N) (quando o embriãohaplóide é formado), a qualquer hora após a polinização,tipicamente de 6 horas a 21 dias após a polinização, de 6horas a 15 dias após a polinização, ou no estágio de sementemadura. 0 embrião haplóide pode ser isolado. Isso podeestar contido no grão, óvulo ou semente. Isso pode estartambém na espiga, no caso de milho, ou no espigão, no casode outros grãos, tais como trigo. E espiga compreendendo oembrião haplóide pode estar na planta ou isolada da planta.A espiga pode ser também seccionada. Após a duplicaçãocromossômica, o embrião duplo-haplóide conterá 2 cópias decromossomos derivados maternalmente. A eficiência do
processo para obter plantas duplo-haplóides a partir deembriões haplóides pode ser maior do que 10%, 20%, 30%, 50%,60%, 70%, 80%, ou 90%.
Métodos de duplicação de cromossomos são descritos emAntoine-Michard, S. et al., Plant cell, tissue organ cult.,Cordrecht, the Netherlands, Kluwer Academic Publishers,1997, 48 (3) :203-207; Kato, A., Maize Genetics CooperationNewsletter 1997, 36-37; e Wan, Y. et al. , TAG, 1989, 77:889-892. Wan, Y. et al., TAG, 1991, 81: 205-211. Asrevelações das quais são aqui incorporadas por referência.Métodos típicos envolvem promover o contato das células comcolchicina, agentes anti-microtúbulos ou herbicidas anti-microtúbulos, pronamida, óxido nitroso, ou qualquer inibidormitótico para células homozigotas duplo-haplóides. A
quantidade de colchicina usada no meio é geralmente 0,01% -
0.2% ou aproximadamente 0,05% ou APM (5 -225 μΜ) . Aquantidade de colchicinas pode variar de aproximadamente400-600mg/L ou aproximadamente 500mg/L. A quantidade depronamida no meio é de aproximadamente 0,5 - 2 0 μΜ. Exemplosde inibidores mitóticos conhecidos estão incluídos na Tabela
1. Outros agentes podem ser usados com os inibidoresmitóticos para melhorar a eficiência de duplicação. Taisagentes podem ser dimetil sulfóxido (DMSO), adjuvantes,surfactantes, e similares.
TABELA 1
<table>table see original document page 16</column></row><table><table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>
O agente de duplicação cromossômico pode vir emcontacto com o embrião em vários momentos. Se o embrião éisolado, o agente de duplicação pode vir em contatoimediatamente após o isolamento e antes da germinação. Se oembrião está contido na semente, ele pode vir ao contato como agente de duplicação em qualquer hora após a polinização eantes de secar. 0 embrião, tanto isolado como não, pode virao contato com o agente de duplicação a qualquer momentoentre 6 horas após a polinização e 21 dias após apolinização. A duração de contato entre o agente deduplicação cromossômico pode variar. O contato pode ser demenos de 24 horas, por exemplo 4-12 horas, a cerca de umasemana. A duração de contato é geralmente de cerca de 24horas a 2 dias.Métodos providos podem ou não passar pelo estágio deformação de calo. Os embriões haplóides podem ser colocadosem um "meio não promotor de calo". O termo "meio nãopromotor de calo" refere-se a um meio que não suportaproliferação de massas diferenciadas de células ou tecido.
Um "meio não promotor de calo" preferencial é usado pararecuperação de embrião, contendo típicas formulações de saise vitaminas bem conhecidas na arte. Tais meios derecuperação de embrião, ou de cultura de embrião, contêmpouca ou nenhuma auxina [para revisão, veja Raghaven, V.,1966. Biol. Rev. 41:1-58]. 0 meio de amadurecimento deembrião também representa outro "meio não promotor de calo"preferencial. Meio de amadurecimento de embrião é usadopara promover o desenvolvimento de embriões cultivados invitro, prevenindo germinação precoce, e tipicamente contémformulações de sais/vitaminas padrão (dependendo daespécie), níveis de açúcar aumentados e/ou ácido absísicoexogenamente adicionado, com pouca o nenhuma auxina. Outrotipo de meio é usado para cultivo de brotos, ou proliferaçãode brotos múltiplos. Esse meio de brotos múltiplos pode,novamente, conter pouca ou reduzida auxina, mas, ao invés,contém níveis elevados de citoquinina que promovemproliferação e crescimento de meristemas.
Uma auxina é definida como um hormônio vegetalendógeno, tal como ácido índole acético (IAA), derivados deIAAr tais como ácido índole-3-butérico, assim como compostoscom atividade tipo auxina, tais como 2,4-D, picloram,dicamba, 3,4-D, 2,4,5-T e ácido acético naftaleno (NAA).Uma citoquinina é definida como hormônio vegetalnaturalmente ocorrente, tais como 2-isopentinel adenina(2iP), zeatina e hididrozeatina, ou um composto sintéticocom atividade tipo citoquinina, tais como quinetina e BAP(beinzilaminopurina).
Polinucleotideos ou polipeptideos envolvidos noestimulo de crescimento ou estimulo de ciclo celular podemser usados para aumentar a freqüência de embriões haplóidesproduzidos por espiga, aumentar a recuperação de plantashaplóides, e/ou estimular a eficiência de duplicação decromossomos. O polinucleotideo estimulo de crescimento podeser provido tanto pela fêmea como pelo macho parental. Opolinucleotideo ou polipeptideo de estimulo de crescimentopode ser provido por transformação estável ou transiente.Polinucleotideos cuja sobre-expressão foi mostrada porestimular o ciclo celular incluem Ciclina A, Ciclina B,Ciclina C, Ciclina D, Ciclina E, Ciclina F, Ciclina G, eCiclina H; Pinl; E2F; Cdc25; RepA e polinucleotideosvegetais virais similares codificando proteínas associadascom a replicação. Ver U.S. Patent Publication No.2002/0188965.
Após a duplicação bem-sucedida de cromossomoshaplóides, pode ser desejável para remover ospolinucleotideos de estimulo de crescimento. Isso pode serconseguido usando vários métodos de excisão gênica, taiscomo o uso de sítios de recombinação e recombinases.Um gene marcador de pontuação pode ser usado nosmétodos, por exemplo, marcadores coloridos no endosperma ouembrião podem ser utilizados. Tais marcadores incluem GUS(US 5.599.670 e US 5.432.081), GFP (US 6.146.826; US5.491.084; e WO 97/41228), luciferase (US 5.674.713 e Ow etal. 1986 Science 234 (4778) 856-859), YFP, CFP, CRC (Ludwiget al., 1990), proteínas de recifes de coral ou genes deantocianina, tais como alelos A, C, R-nj, Rl-scm, Rl-mb(aleurona perolada) , Rl-r:standard, Rl-Randolph, Rl-ch:Stadler, Rl-d:Catspaw, Rl-d:Arapaho, Rl-nj, Rl-nj:Cudu,Rl-nj:Chase, Rl-scm2, Rl-sc:124, Rl-sup-Rl-suppressible, RlK10-II; Rl rl-Xl, Rl-ch, Rl-g, Rl-lsk, Rl-r, Rl-scl22, Rl-sc*5691, Rl-sc:ml22, Rl-sc:m2, Rl-scm:3, Rl-sk:nc-2, Rl-sk,Rl-st, etc., e outros conhecidos na arte. As revelações dasquais são aqui incorporadas por referência.
Para que um marcador de antocianina funcione em milho,vários alelos têm de ser levados em consideração. A produçãode pigmentos de antocianina em tecidos de milho inclui osprodutos de ambos genes estruturais e reguladores. Genesestruturais, tais como Al, A2, Bzlr Bz2 e Cl, codificam asenzimas biossintéticas da via metabólica. Os genesreguladores de antocianina caem em duas classes de fatoresde transcrição, Cl/Pll e Rl/Bl, os quais interagem paraativar a transcrição dos genes estruturais.
Mais especificamente, a expressão de antocianina nogrão requer um alelo determinador de coloração no lócus Cl,tal como Cl ou Cl-S. Cl-S é dominante ao alelo (Cl) de tiposelvagem e apresenta pigmentação intensificada (Cone, KC, etal. 1986. Molecular analysis of the maize anthocyaninregulatory locus Cl. Proc. Natl. Acad. Sei. 83:9631-9635.;Scheffler, B., et al. 1994. Molecular analysis of Cl allelesin Zea mays defined regions involved in the expression ofthis regulatory gene. Mol. Gen. Genet. 242:40-48). Aexpressão de Cl, ao contrário, é dependente do gene Vpl; Vplcodifica um fator de transcrição que está envolvido naexpressão de genes durante a germinação de semente. Aespecificidade de grão de expressão de Cl resulta, porque aexpressão de Vpl é limitada ao endosperma (aleurona) eembrião (Hattori T, et al. 1992. The Viviparous-I gene andabscisic acid activate the Cl regulatory gene foranthocyanin biosynthesis during seed maturation in maize.Genes & Dev. 6:609-618).
Além disso, a expressão de antocianina no grão de milho(endosperma e/ou embrião) requer certos alelos Rl/Bl. Paraser útil no rastreamento haplóide/diplóide, um alelo deveconferir coloração em ambos endosperma (aleurona) e embrião.(Coe et al. 1988, The geneties of corn. pp. 81-258. In:Sprague GF, Dudley JW (eds) Corn and Corn Improvement, 3rded. Amer. Soe. Agronomy, Madison.) listaram três tipos dealelos que conferem coloração em ambos aleurona e escutelo(embrião): R-nj, R-scm e B-peru.
Rnj é o alelo mais comumente usado para rastreamentohaplóide/diplóide de sementes maduras (Nanda and Chase,1966. An embryo marker for detecting monoploids of maize(Zea mays L) . Crop Sei. 6:213-215; Greenblatt and Bock,1967. A commercially desirable procedure for detection ofmonoploids in maize. J. Hered. 58:9-13). Como foimencionado em relação a Cl, níveis de expressão de R-njforam mostrados por estarem correlacionados com parâmetrosde maturação de grão (Alexander and Cross, 1983. Grain fillcharacteristics of early maize (Zea mays) strains selectedfor variable R-nj expression. Euphytica 32:839-844.). Maisrecentemente, R-scm2 foi também usado (Kato A. 2002.Chromosome doubling of haploid maize seedlings using nitrousoxide gas at the flower primordial stage. Plant breeding121:370-377; e Kato A. 2003. Chromosome doubling method.U.S. Patent Application 20030005479).
Algumas linhas indutoras também contêm um marcador decoloração. Por várias razões pode ser desejável expressar ogene marcador no embrião. Em particular, pode ser desejávelexpressar o gene marcador no estágio inicial dedesenvolvimento, cerca de 10 horas - 15 dias após apolinização. Se o marcador é um transgene, usar um promotorapropriado, tal como um promotor de oleosina ou Lecl podeser benéfico. Embriões haplóides podem, então, ser
distintos de embriões normalmente polinizados, pois osembriões haplóides não contêm o gene marcador.
Marcadores selecionáveis, pontuáveis, negativos,positivos podem ser usados nos métodos. Marcadores podemvir através da planta feminina ou masculina. 0 métodopreferível é ter os marcadores virem através da plantamasculina.Células haplóides de embriões, sementes, plantas, etc.podem ser identificadas por diversos métodos, tais como, porcontagem de cromossomos, medição do comprimento de célulasguardas, ou pelo uso de um Citômetro de Fluxo.
Marcadores moleculares PCR quantitativo podem serusados para determinar se um tecido ou planta é feito decélulas duplo-haplóides ou é feito de células diplóides(células obtidas através de polinização normal).
Transformação do embrião haplóide pode ser usada nosmétodos. O tipo de transformação não é critico para osmétodos; vários métodos de transformação estão atualmentedisponíveis. Como métodos mais novos estão disponíveis paratransformar células hospedeiras, eles podem ser diretamenteaplicados. Conseqüentemente, uma ampla variedade de métodosfoi desenvolvida para inserir uma seqüência de DNA no genomade uma célula hospedeira para obter a transcrição e/outradução da seqüência. Assim, qualquer método que provenhatransformação/transfecção eficiente pode ser empregado.
Métodos para transformar várias células hospedeiras sãodescritas em Klein et al. "Transformation of microbes,plants and animais by particle bombardment", Bio/Technol.
New York, N.Y., Nature Publishing Company, March 1992,10 (3) : 286-291. Técnicas para transformar uma amplavariedade de espécies de plantas superiores são bemconhecidas e descritas na literatura técnica, científica, ede patentes. Ver, por exemplo, Weising et al. , Ann. Rev.Genet. 22:421-477 (1988).Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzidodiretamente no DNA genômico de célula vegetal usandotécnicas, tais com eletroporação, transfecção induzida porPEG, bombardeamento de partículas, distribuição de fibra desilicone, ou microinjeção de protoplastos de célula vegetalou calo embriogênico. Ver, e.g., Tomes et al., Direct DNATransfer into Intact Plant Cells Via MicroprojectileBombardment. pp.197-213 in Plant Cell, Tissue and OrganCulture, Fundamental Methods. eds. O. L. Gamborg and G.C.Phillips. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995.
A introdução de construtos de DNA usando precipitação depolietileno glicol é descrita em Paszkowski et al., Embo J.3:2717-2722 (1984). Técnicas de eletroporação são descritasem Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:5824 (1985).Técnicas balísticas de transformação são descritas em Kleinet al., Nature 327:70-73 (1987).
Alternativamente, os construtos de DNA podem sercombinados com regiões flanqueado T-DNA e introduzidos em umvetor hospedeiro Agrobacterium tumefaciens. As funções devirulência de Agrobacterium tumefaciens hospedeiro irãodirecionar a inserção do construto e marcador adjacente noDNA de célula vegetal quando a célula é infectada pelabactéria. Técnicas de transformação mediadas porAgrobacterium tumefaciens são bem descritas na literaturacientífica. Ver, por exemplo Horsch et al., Science233:496-498 (1984), e Fraley et al. , Proc. Natl. Acad. Sei.80:4803 (1983). Por exemplo, transformação de milho porAgrobacterium é descrita em U.S. Patent No. 5.981.840.Transformação de monocotiledôneas por Agrobacterium éencontrada na U.S. Patent No. 5.591.616. Transformação defeijões de soja por Agrobacterium é descrita em U.S. PatentNo. 5.563.055.
Outros métodos de transformação incluem (1)transformação induzida por Agrobacterium rhízogenes (ver,e.g., Lichtenstein and Fuller In: Genetic Engineering, vol.6, PWJ Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987; eLichtenstein, C. P., and Draper, J,. In: DNA Cloning, Vol.II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985), ApplicationPCT/US87/02512 (WO 88/02405 publicada em 7 de abril de 1988)descreve o uso de linhagem A4 de A. rhizogenes e seuplasmídio Ri junto com os vetores pARC8 ou pARC16 de A.tumefaciens (2) absorção de DNA induzida por lipossomo (ver,e.g., Freeman et al. , Plant Cell Physiol. 25:1353, 1984),(3) o método de vortexing (ver, e.g., Kindle, Proc. Natl.Acad. Sci., USA 87:1228, (1990).
DNA pode ser também introduzido em plantas portransferência direta de DNA em pólen como descrito por Zhouet al., Methods in Enzymology 101:433 (1983); D. Hess,Intern Rev. Cytol. 107:367 (1987); Luo et al. , Plant Mol.Biol. Repórter, 6:165 (1988). Expressão de ácidos nucléicoscodificando polipeptideos pode ser obtida por injeção de DNAem órgãos reprodutivos de uma planta como descrito por Penaet al., Nature 325:274 (1987). Transformação pode sertambém alcançada através de eletroporação de DNA estrangeiroem células espermáticas, então microinjetar as célulasespermáticas transformadas em sacos embrionários isoladoscomo descrito em U.S. Patent 6.300.543 por Cass et al. DNApode ser também injetado diretamente nas células de embriõesimaturos e reidratação de embriões dissecados como descritopor Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75:30 (1987); eBenbrook et al. , in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth,Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986).
Embriões haplóides transformados que são derivados porqualquer das técnicas de transformação acima podem sercultivados para regenerar uma planta inteira que possua ogenótipo transformado. Tais técnicas de regeneração sãochamadas recuperação de embrião. Meio de recuperação deembrião pode compreender certos fito-hormônios e fontes deenergia ou apenas fontes de energia. 0 meio de crescimento pode também conter um agente de seleção, tal como um biocidae/ou herbicida. Esse agente de seleção pode ser usado paraindicar um marcador que foi introduzido através do processode transformação. Para transformação e regeneração demilho, ver, Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2:603-618(1990) .
Os métodos providos podem ser praticados com qualquerplanta. Tais plantas incluem, mas não se limitam a, Zeamays (também identificada como milho), soja, Brassicafalfafa, arroz, centeio, sorgo, girassol, tabaco, batata,amendoim, algodão, batata-doce, mandioca, cana-de-açúcar,tomate, aveia, cevada, e trigo.
A geração de embriões em plantas é bem conhecida naarte. Técnicas de recuperação de embrião podem ser usadaspara gerar embriões duplo-haplóides imaturos em plantas(Recent Research Developments in Genetics & Breeding. Vol.1, Part II, 287-308 2004) . A revelação da mesma é aquiincorporada por referência.
A temperatura na qual os métodos podem ser efetuadospodem variar. Os métodos providos podem ser praticados emqualquer temperatura que não mate a célula vegetal ou plantaou a partir de cerca de 16 graus Celsius a 32 graus Celsius.
Qualquer ou todas ou quaisquer combinações das várias etapasda invenção: isolamento de embrião, cultivo, duplicação decélula embrionária pode ser efetuado no claro ou escuro.
Todas as publicações e aplicações de patentesmencionadas nesta especificação são aqui incorporadas porreferência na mesma extensão como se cada publicação oaplicação de patente individual fosse especificamente eindividualmente indicadas a serem incorporadas porreferência.
Os seguintes exemplos são oferecidos por meio deilustração e não por meio de limitação.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: Obtendo uma População de Plantas de MilhoDuplo-Haplóides
Sementes de uma planta de milho Fl são plantadas eas plantas resultantes são usadas como plantas parentaisfêmeas (receptoras de pólen). Sementes de linhagensindutoras de haploidia, como Stock 6, RWS, KEMS, KMS ouZMS, são plantadas e as plantas resultantes são usadascomo plantas parentais machos (doadoras de pólen). Asespigas das plantas parentais fêmeas são ensacadas antesda emergência dos estilos-estigmas. Os estilos-estigmasdas espigas nas plantas parentais fêmeas são polinizadoscom grãos de pólen viáveis coletados das anteras deplantas parentais masculinas (plantas indutoras dehaploidia). Esta polinização é controlada pelo métodoregularmente utilizado em programas de melhoramento demilhos para evitar a contaminação por qualquer pólenextrangeiro. 0 método de polinização resulta na produçãode uma freqüência de cerca de 5-12% de embriões haplóidesem cada espiga. Em aproximadamente 9-14 dias após apolinização, as espigas imaturas são colhidas. As espigastêm suas superfícies esterilizadas com alvejante Clorox30% adicionado de detergente Micro 0,5% por 20 minutos, elavado duas vezes com água estéril. Os embriões haplóidessão isolados baseados na identificação do gene marcadorvisível nas linhagens indutoras. Por exemplo, se alinhagem indutora contiver o gene GFP ou gene CRCinduzidos por um promotor que permite a expressão gênicade GFP ou CRC nos embriões no estágio precoce dedesenvolvimento. Promotores típicos que são úteis incluemo promotor de oleosina de milho ou promotor Lecl de milhoetc. 0 haplóide produzido por este sistema é um haplóidematerno que tem apenas um conjunto de cromossomos daparental fêmea nas células do embrião e tem 3 conjuntosde cromossomos nas células do endosperma, dois deles doparental fêmea e um deles do parental macho. Se a linhaindutora tem um marcador gênico visível, tal como GFP ouCRC, este marcador gênico será incluído apenas nascélulas do endosperma, mas não nas células embrionárias5 nos grãos haplóides. Através do uso desse tipo demarcador visível, embriões haplóides sem expressão de GFPou CRC podem ser facilmente identificados a partir dosembriões com expressão de GFP ou CRC.
Os embriões haplóides de milho são isolados usandoum escalpelo e colocados em um meio contendo colchicina.Após aproximadamente 24 horas, os embriões sãotransferidos para um meio sem colchicina e colocados noescuro. Estes embriões duplo-haplóides serão umapopulação heterogênea de embriões homozigotos. Apósaproximadamente 6-10 dias, as plântulas podem sertransferidas para uma sala de cultivo iluminada.Aproximadamente 7-14 dias mais tarde, as plântulas sãotransferidas para superfícies contendo terra e cultivadas por 1 semana em uma câmara de crescimento,subseqüentemente crescidas por 1-2 semanas adicionais emuma estufa, depois transferidas para potes e crescidasaté maturidade. Essas plantas serão uma populaçãoheterogênea de plantas duplo-haplóides. Estas plantasférteis de milho duplo-haplóides podem ser auto-fertilizadas e avaliadas para propósitos de reprodução.
EXEMPLO 2: Obtendo plantas de milho duplo-haplóidespela duplicação de cromossomos em embriões imaturos.Métodos
Uma planta de milho diplóide, "A", foi polinizadacom uma linha haplóide indutora contendo GFP. Embriõesimaturos foram isolados 12 dias após a polinização e otamanho do embrião variou entre 1,9-2,0 mm decomprimento. Os embriões diplóides, embriões expressandoGFP, foram descartados. Os embriões haplóides, baseado naausência de expressão do marcador GFP, foram cultivadosem um meio contendo sais MS, vitaminas MS, tiamina,asparagina, BAP, sacarose, gelrite, e colchicina 0,05%com o escutelo virado para cima por 24 horas a 26C noescuro. Estes embriões foram, então, cultivados com oescutelo virado para baixo por 6-10 dias a 26C no escuroem um meio que não continha agente de duplicação. 0 meiocontinha sais MS, vitaminas MS, mio-inositol, sacarose, egelrite. As plântulas germinadas destes embriões tratadosforam transferidas para uma sala de cultura iluminada a26C por mais 2-3 semanas até que se desenvolvessemplântulas saudáveis com boas raízes. Estas plântulasforam transferidas para solo e crescidas em uma estufacomum até maturação. As plantas foram autopolinizadas eas sementes maduras serão colhidas. As sementes colhidasde cada planta serão cultivadas como de uma fila deespigas e as plantas serão examinadas para a uniformidadede morfologia da planta em cada fileira de espigas.
Resultados
<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table>
Uma planta neste grupo apresenta parte do corutodesprendendo pólen.
EXEMPLO 3: Obtendo Plantas de Milho Duplo-Haplóides
Métodos
Duas linhas diferentes de milho diplóide, "B" e "C",foram polinizadas com uma linha indutora haplóide, contendoGFP homozigoto. Embriões imaturos foram isolados 11 diasapós a polinização e o tamanho do embrião variou de 1,5-1,6mm em comprimento. Os embriões diplóides, embriõesapresentando expressão de GFP, foram descartados. Osembriões haplóides, embriões não expressando GFP, foramcultivados em um meio MS modificado contendo pronamida 5uMcom o escutelo voltado para cima por 48 horas a 26C noescuro. Após aproximadamente 48 horas os embriões foramtransferidos para um meio MS modificado sem o agente deduplicação. Embriões foram colocados com o escutelo voltadopara baixo por 6-10 dias a 26C no escuro. As plântulasgerminadas destes embriões tratados foram movidas para umasala de cultura iluminada a 26C por outras 3 semanas até queplântulas saudáveis com boas raízes se desenvolvessem.Essas plântulas eram então transferidas para solo ecrescidas em estufas comuns até a maturação. As plantasforam autopolinizadas e as sementes maduras serão colhidas.
As sementes colhidas serão plantadas como de uma fileira deespigas. As platas com uma fileira serão examinadas parauniformidade de morfologia da planta.
Resultados
<table>table see original document page 35</column></row><table>
Uma planta neste grupo apresenta parte do corutodesprendendo pólen.
EXEMPLO 4: Sementes duplo-haplóides e linhagens duplo-haplóides derivadas da duplicação de cromossomos em embriõesimaturos.
Sementes duplo-haplóides são obtidas através de métodosdescritos nos Exemplos 1, 2 e 3. As plantas duplo-haplóidesnos exemplos 1, 2 e 3 são auto-polinizadas e as sementesduplo-haplóides são formadas em cada planta duplo-haplóide.
As sementes produzidas em cada espiga são sementeshomozigotas. Esta tabela demonstra um exemplo de sementescolhidas de 10 destas plantas duplo-haplóides.<table>table see original document page 36</column></row><table>
Para verificar a homozigosidade destas linhas duplo-haplóides produzidas pela duplicação de cromossomos noestágio de embrião imaturo, as sementes produzidas de cadaespiga duplo-haplóide são plantadas como de uma fileira deespiga no campo. As plantas em cada fileira da espiga sãoavaliadas por seus fenótipos, tais como, altura da planta,altura da espiga, número de folhas, forma da planta, formado coruto, número de ramos do coruto, coloração da antera,coloração dos estilos-estigmas, tempo de floração, etc.Todas essas informações são usadas para verificar auniformidade das plantas em cada fileira da espiga. Por meiodestas avaliações, estas linhas duplo-haplóides sãoconfirmadas como homozigotas. Para confirmar ainda mais ahomozigosidade destas linhas duplo-haplóides, tecnologia demarcadores moleculares é empregada.EXEMPLO 5: Descrição de Tratamento de Espigas Imaturaspara Duplicação Haplóide.
Uma espiga de milho é polinizada com uma linhagemindutora que é homozigota para o gene marcador R-nj. Aespiga é colhida em torno de 6 horas a 35 dias após apolinização pelo corte da planta acima e abaixo da espiga. Aextremidade inferior do talo é imersa em um grande contêinerde água. As espigas são levadas para uma câmara estéril nolaboratório. O talo é cortado muitas polegadas abaixo daespiga com uma faca estéril. O terço inferior da espiga ésubmersa em Chlorox (hipoclorito de sódio) 2,5% por 10minutos. Toda a superfície da espiga e do talo é esfregadacom etanol 70% ou uma solução de Chlorox 5%. A extremidadesuperior cortada do talo é vedada com lanolina estéril. Aterça parte inferior da espiga é colocada em água destiladaestéril para lavagem por 10 minutos. A espiga é colocada emum frasco estéril de 250 ml com abertura lateral contendomeio estéril que inclui um agente duplicador como colchicinaou pronamida. 0 contêiner pode ser qualquer um que sejaapropriado às necessidades de aplicações de pequena escalaou grande escala. 0 papel toalha estéril pode ser usado paravedar as brechas entre o frasco e a espiga. 0 papel toalha eo frasco podem ser embrulhados com parafilme de modo a selaro contêiner. A abertura lateral do frasco é conectada portubulação estéril a uma bureta estéril ou contêiner separadopara fornecer meio adicional ou mudar para meio novo. 0fluxo de meio é controlado por um grampo no tubo. A espiga ésubmersa em meio líquido contendo agente duplicador por 10 a48 horas e então cultivado em meio líquido se agente deduplicação pelo resto do tempo. A espiga é cultivada no meioaté a maturação do coruto. A espiga é seca e as sementescolhidas. As sementes duplo-haplóides e haplóides sãoidentificadas com base no marcador. Por exemplo, quando omarcador R-nj vem da linha indutora, as sementes resultanteshaplóide e duplo-haplóides terão um embrião incolor eendosperma colorido. As sementes que são submetidas apolinização normal teriam endosperma colorido e embriãocolorido. Plante as sementes duplo-haplóides e auto-polinizeestas plantas para produzir a próxima geração de sementes.Plante as sementes produzidas destas plantas como fileira deespiga. Cheque a uniformidade em cada fileira de espiga.
EXEMPLO 6: Segunda Descrição de Tratamento deEspigas Imaturas para Haplóides.
Plantas híbridas de milho foram polinizadas por plantashaplóides indutoras. As espigas com parte do talo anexadasforam colhidas de plantas híbridas 4-6 dias após apolinização (comprimento do embrião menor que 0,4 mm) . Ostalos eram em torno de 4-8 polegadas de comprimento paracada lado de onde as espigas estavam anexadas. As espigas eos talos anexados são esterilizados em suas superfícies cometanol 70% ou Chlorox 5%. As extremidades inferiores dostalos contendo as espigas foram submersos em meio líquidocontendo meio MS, vitaminas MS, sacarose, etc. e pronamida 5uM, DMSO 0,5% por um dia a 26C. Em seguida, as espigas aindacontidas nos talos foram movidas para meio fresco contendomeio MS, vitaminas MS, sacarose etc. sem o agente duplicadorpara permitir o desenvolvimento dos embriões e grãos. Osembriões dentro das espigas podem ser isolados a qualquermomento após a duplicação. A recuperação dos embriões podeser, então, usada para germinar embriões imaturos nasplantas. As plantas germinadas foram crescidas para exame defertilidade.
Resultados
<table>table see original document page 39</column></row><table>
EXEMPLO 7: Descrição do Tratamento de Espigas Imaturaspara Duplicação de Haplóide Enquanto a Espiga está naPlanta.
Uma espiga de milho é polinizada com uma linhaindutora. Em torno de 6 horas a 35 dias após a polinização,a planta é recolhida e as raízes da planta são imersas em umrecipiente de solução de nutrientes contendo agente deduplicação. As raízes da planta são submersas em meiolíquido contendo o agente de duplicação por 10 a 48 horas eentão movidas para nova solução nutriente hidropônica peloresto do tempo. Exemplos de agentes de duplicação incluem,mas não estão limitados a, pronamida, carbetamida, orizalinae colchicinas. É permitido que a espiga se desenvolva. Osembriões duplo-haplóides podem ser isolados a qualquermomento após o tratamento duplicador. A recuperação dosembriões pode se realizada ou a espiga pode ser desenvolvidaaté a maturação dos grãos. É permitida à espiga a maturaçãodas sementes podem ser secas e as sementes colhidas. Assementes duplo-haplóides e haplóides podem ser identificadascom base no marcador. Por exemplo, se o marcador R-nj vierda linhagem indutora as sementes haplóides e duplo-haplóidesresultantes terão embrião incolor e endosperma colorido. Assementes que sofrerem polinização normal teriam endospermacolorido e embrião colorido. Plante as sementes duplo-haplóides e autopolinize estas plantas para produzir a novageração de sementes. Plante as sementes produzidas destasplantas como fileira de espiga. Verifique a uniformidade emcada fileira de espiga.
EXEMPLO 8: Descrição da Obtenção de Plantas Duplo-Haplóides por Indução de Broto
Um embrião haplóide é isolado 6-12 dias após apolinização. 0 embrião haplóide é colocado com o eixo viradopara cima em meio contendo agente de duplicação cromossomalpor 24 a 48 horas. 0 embrião haplóide duplicado (ou umaplanta excisada contendo o meristema apical) é entãocolocado em um meio de proliferação de broto (meio SP) com oeixo voltado para cima (escutelo voltado para baixo) . Meiode proliferação de broto contém sais MS e vitaminas com 2-benziladenina 2 mg/L, sacarose 2% e ágar TC 9 g/L (ver Loweet al., 1995, Biotechnology 13:677-682), mas além deelevados níveis de citoquinina tal meio SP pode conterbaixos níveis de auxinas como 2,4-D ou IBA (como em Zhong etal., 1992, Planta 187:483-489). Depois da formação demúltiplos brotos no meio SP, eles são transferidos para ummeio de regeneração de brotos (também denominado meio dealongamento de brotos) , que consiste de meio MS com um nívelótimo de citoquinina. Para alguns genótipos, nenhumacitoquinina é o ótimo para alongamento de broto, enquantopara outros genótipos alguma citoquinina é necessária (i.e.zeatina 10 mg/l) . Uma vez que a regeneração do brotoacontece, os brotos são transferidos para meio de iniciaçãode raiz, por exemplo um meio MS não contendo auxinas oucitoquininas. Se as plântulas tiverem dificuldade de formarraízes na ausência de auxina, o enraizamento é promovidopela cultura em meio MS (Murashige e Skoog) ou SH (Shenk eHildebrandt) com NAA 1 mg/l, ou por entalhamento na base dotalo com um escalpelo e imersão do broto em solução de NAA 1mg/l. Plântulas duplo-haplóides são então transferidas parauma câmara de crescimento e finalmente transplantadas parauma estufa para crescimento até maturidade e produção desementes. Sementes de plantas duplo-haplóides são crescidase testadas para homozigosidade usando análise com marcadoresmoleculares e observações fenotípicas.Como alternativa ao uso do agente de duplicação noembrião haplóide antes do cultivo, embriões ou explantes deembriões contendo o meristema apical podem ser colocados emmeio SP, e uma vez iniciada a proliferação do broto acultura de múltiplos brotos pode ser exposta ao agente deduplicação de cromossomo por 24-48 horas. 0 tecido é entãotransferido para meio SP fresco para continuar aproliferação do meristema ou pode ser movido para meio deiniciação de raiz.
EXEMPLO 9; Testando Diferentes Híbridos e Tempo doAgente Duplicador
Uma linha de milho materna haplóide indutora foiutilizada para polinizar 4 plantas híbridas diferentes. Osembriões imaturos híbridos derivados destes cruzamentosforam isolados e colocados diretamente em meio derecuperação de embriões contendo pronamida 5uM. Embriõesforam mantidos no meio de pronamida por aproximadamente 3 6ou 48 horas antes de serem transferidos para novo meio sem oagente de duplicação.
As plântulas germinadas destes embriões tratados foramentão transferidas para tubos até o desenvolvimento deplântulas saudáveis com boas raízes. Estas plântulas foramentão transferidas para solo e cultivadas em estufa comumaté o amadurecimento. As plantas foram autopolinizadas e assementes maduras foram colhidas. A progênie de uma amostrade plantas duplo-haplóides foi analisada usando 120marcadores moleculares e confirmada para homozigosidade.
Resultados
<table>table see original document page 43</column></row><table>
Claims (17)
1. Método de obtenção de uma planta de milho duplo-haplóide caracterizado por compreender: «a) polinizar estigmas de uma espiga de milho com umalinhagem indutora para produzir pelo menos um embriãohaplóide;b) colocar em contato o referido embrião haplóide com umagente duplicador de cromossoma para produzir pelo menosuma célula embrionária duplo-haplóide;c) gerar uma planta de milho duplo-haplóide a partir dareferida célula embrionária duplo-haplóide, e;d) onde a etapa (b) ocorre 4-21 dias após a etapa (a).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato que a linhagem indutora contém um gene marcadorque é expresso em tecido embrionário.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato que o referido gene marcador é R-nj .
4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato que o gene marcador é GFP.
5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato que o gene marcador é expresso em 4 ou mais diasapós a polinização.
6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato que o referido gene marcador expressa pigmentosde antocianinas.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado,pelo fato de que o embrião haplóide da etapa (b) tem de 0,4mm a 3 mm de comprimento.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato que o agente duplicador de cromossoma compreendeuma agente anti-microtúbulo.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato que o referido agente duplicador de cromossoma éselecionado de um grupo consistindo de colchicina,pronamida, "dithipyr", e trifluralina.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o embrião haplóide da etapa (b) é colocadoem contato com o agente duplicador por 4 a 48 horas.
11. Método de obtenção de semente duplo-haplóide,caracterizado por compreender:a) obter uma semente haplóide ao polinizar um óvulo comuma linhagem indutora;b) colocar em contato a referida semente haplóide com umagente duplicador de cromossoma; ec) obter uma semente duplo-haplóide.
12. Método de obtenção de um set de grãos com embriõesduplo-haplóides, caracterizado por compreender:a) obter um set de grãos haplóides ao polinizar ^umaespiga com uma linhagem indutora;b) colocar em contato o referido set de grãos haplóidescom um agente duplicador de cromossoma para obter um set degrãos com embriões duplo-haplóides.
13. Set de grãos com embriões duplo-haplóides de acordocom a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que cadagrão do set compreende uma célula de endosperma com pelomenos um set de cromossoma proveniente de um parentepaterno e dois sets de cromossomas de um parente materno; eonde cada grão do set compreende um embrião com um set decromossomas homozigotos do referido parente materno.
14. Método de obtenção de um set de grãos de milho duplo-haplóide em uma espiga de milho, caracterizado porcompreender:a) obter um set de embriões haplóides ao polinizar umaespiga com uma linhagem indutora; eb) colocar em contato o referido set de embriõeshaplóides com o agente duplicador de cromossoma para obterum set de grãos duplo-haplóides em uma espiga de milho.
15. Método de obtenção de uma planta de milho duplo-haplóide, caracterizado pelo fato de que compreende colocarem contato um embrião haplóide com um meio não formador decalo compreendendo um agente duplicador de cromossoma paraproduzir um embrião duplo-haplóide e gerar uma planta demilho duplo-haplóide a partir do referido embrião duplo-haplóide.
16. Método de obtenção de um embrião de milho duplo-haplóide, caracterizado pelo fato de que compreende colocarem contato um embrião haplóide com um meio não formador decalo compreendendo um agente duplicador de cromossoma paraproduzir um embrião duplo-haplóide.
17. Método de obtenção de uma planta de milho duplo-haplóide, caracterizado por compreender:a) colocar em contato a célula embrionária haplóide comum agente duplicador de cromossoma para produzir uma célulaembrionária duplo-haplóide;b) colocar em contato a referida célula embrionáriahaplóide com um meio de formação de múltiplas gemas paragerar um ápice aéreo;c) gerar uma planta de milho duplo-haplóide a partir doreferido ápice aéreo;
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