BRPI0616466A2 - composição de enzimas de ácido nucléico multicomponentes (mnazima), métodos para detectar a presença de pelo menos um facilitador de combinação, um alvo, uma variante de seqüencia de ácidos nucléicos, para detectar a presença de pelo menos um ácido nucléico metilado e para detectar pelo menos um facilitador de combinação usando uma cascata de ampliação, métodos para fabricar uma pluralidade de enzimas de ácido nucléico multicomponentes (mnazima), e uso de pelo menos um oligonucleotìdeo - Google Patents

composição de enzimas de ácido nucléico multicomponentes (mnazima), métodos para detectar a presença de pelo menos um facilitador de combinação, um alvo, uma variante de seqüencia de ácidos nucléicos, para detectar a presença de pelo menos um ácido nucléico metilado e para detectar pelo menos um facilitador de combinação usando uma cascata de ampliação, métodos para fabricar uma pluralidade de enzimas de ácido nucléico multicomponentes (mnazima), e uso de pelo menos um oligonucleotìdeo Download PDF

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BRPI0616466A2 BRPI0616466-8A BRPI0616466A BRPI0616466A2 BR PI0616466 A2 BRPI0616466 A2 BR PI0616466A2 BR PI0616466 A BRPI0616466 A BR PI0616466A BR PI0616466 A2 BRPI0616466 A2 BR PI0616466A2
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nucleic acid
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BRPI0616466-8A
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Elisa Mokany
Donald John Birkett
Tram Bich Doan
Alison Velyian Todd
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Johnson & Johnson Res Pty Ltd
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Abstract

COMPOSIçãO DE ENZIMAS DE áCIDO NUCLéICO MULTICOMPONENTES (MNAZIMA), METODOS PARA DETECTAR A PRESENçA DE PELO MENOS UM FACILITADOR DE COMBINAçãO, UM ALVO, UMA VARIANTE DE SEQUêNCIA DE áCIDOS NUCLéICOS, PARA DETECTAR A PRESENçA DE PELO MENOS UM áCIDO NUCLEICO METILADO E PARA DETECTAR PELO MENOS UM FACILITADOR DE COMBINAçãO USANDO UMA CASCATA DE AMPLIAçãO, MéTODOS PARA FABRICAR UMA PLURARIDADE DE ENZIMAS DE áCIDO NUCLéICO MULTICOMPONENTES (MNAZIMA), E USO DE PELO MENOS UM OLIGONUCLEOTIDEO. A presente invenção refere-se a Enzimas de ácido Nucléico Muiticomponentes (MNAzimas) e métodos para seu uso. AS MNAzimas compreendem dois ou mais componentes oligonucleotideos que se autocombinam na presença de uma ou mais moléculas facilitadoras de combinação de MNAzimas, para formar uma estrutura cataliticamente ativa. São fornecidos também métodos para usar MNAzimas na detecção, identificação e/ou quantificação de um ou mais alvos. Os métodos podem ser praticados em ensaios baseados em solução ou em ensaios nos quais um ou mais componentes da reação estão afixados a uma estrutura de suporte. Os métodos permitem multiplexar a detecção de MNAzimas para detectar múltiplos alvos em uma única reação. São fornecidos também kits para fabricar as composições, e para praticar os métodos aqui fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO DE ENZIMAS DE ÁCIDO NUCLÉICO MULTICOMPONENTES (MNA-ZIMA), MÉTODOS PARA DETECTAR A PRESENÇA DE PELO MENOSUM FACILITADOR DE COMBINAÇÃO, UM ALVO, UMA VARIANTE DESEQÜÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLÉICOS, PARA DETECTAR A PRESENÇADE PELO MENOS UM ÁCIDO NUCLÉICO METILADO E PARA DETEC-TAR PELO MENOS UM FACILITADOR DE COMBINAÇÃO USANDO UMACASCATA DE AMPLIAÇÃO, MÉTODOS PARA FABRICAR UMA PLURA-RIDADE DE ENZIMAS DE ÁCIDO NUCLÉICO MULTICOMPONENTES(MNAZIMA), E USO DE PELO MENOS UM OLIGONUCLEOTÍDEO".REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADA
Este pedido de patente reivindica o benefício dos pedidos depatente provisórios nos 60/726.291, depositado em 13 de outubro de 2005, e60/724.567, depositado em 7 de outubro de 2005, respectivamente, que sãoaqui incorporados como referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a ácidos nucléicos multicompo-nentes catalíticos e métodos para seu uso. Mais particularmente, a invençãorefere-se a composições que compreendem enzimas de ácidos nucléicosmulticomponentes autocombinativos, métodos para fabricar tais composi-ções, e métodos para usar tais composições, incluindo para detectar, identi-ficar e/ou quantificar alvos tais como facilitadores de combinação e outrasentidades para detectar uma modificação catalítica de substratos pelas ditasenzimas de ácidos nucléicos multicomponentes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Várias publicações, que podem incluir patentes, pedidos de patentepublicados, artigos técnicos e artigos científicos, são citados neste relatóriodescritivo inteiro entre parenteses, e as citações completas de cada um delespodem ser encontradas no final deste relatório descritivo. Cada uma dessaspublicações citadas é aqui incorporada como referência em sua totalidade.
As moléculas de ácidos nucléicos podem adotar configuraçõesestruturais secundárias que podem conferir atividade enzimática ou catalíti-ca. A tecnologia de evolução in vitro facilitou a descoberta e o desenvolvi-mento desses ácidos nucléicos catalíticos, freqüentemente referidos como"DNAzimas" ou "ribozimas", que são capazes de catalisar uma ampla sériede reações, incluindo a clivagem de ácidos nucléicos (Carmi et ai, 1996;Raillard e Joyce, 1996; Breaker1 1997; Santoro e Joyce, 1998), ligação deácidos nucléicos (Cuenoud e Szostak, 1995), metalação da porfirina (Li eSen, 1996), e a formação de ligações carbono-carbono (Tarasow et al.,1997), ligações éster (lllangasekare et al., 1995) ou ligações amida (Lohse eSzostak, 1996).
Particularmente, foram identificadas DNAzimas e ribozimas queclivam especificamente seqüências de ácidos nucléicos distintas depois dahibridização por intermédio do pareamento de bases de Watson Crick. AsDNAzimas são capazes de clivar moléculas de RNA (Breaker e Joyce, 1994;Santoro e Joyce, 1997) ou DNA (Carmi et al., 1996). As moléculas de RNAcatalíticas (ribozimas) também são capazes de clivar seqüências de RNA(Haseloff e Gerlach, 1988) e DNA (Raillard e Joyce, 1996). A taxa de cliva-gem catalítica da maioria das enzimas de ácidos nucléicos é dependente dapresença e da concentração de ions de metais bivalentes tais como Ba2+,Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, e Pb2+ (Santoro e Joyce, 1998;Brown et ai, 2003).
Os ácidos nucléicos catalíticos, tais como a ribozima Hamme-rhead e as DNAzimas 10:23 e 8:17, têm múltiplos domínios. Eles têm umdomínio catalítico conservado (núcleo catalítico) flanqueado por dois domí-nios de ligação do substrato, não-conservados ("braços hibridizantes"), quesão regiões de seqüência que se ligam especificamente ao substrato. Hase-loff e Gerlach prepararam por engenharia genética a ribozima Hammerhead,que foi assim denominada devido à estrutura em forma de alça ("stern-loop")que traz os dois domínios conservados juntos, que formam o núcleo catalíti-co (Haseloff e Gerlach, 1988). As DNAzimas "10:23" e "8:17" são capazesde clivar substratos de ácidos nucléicos em ligações fosfodiéster específicasdo RNA (Santoro e Joyce, 1997). A DNAzima 10:23 tem um domínio catalíti-co de 15 desoxinucleotídeos, flanqueado por dois braços de reconhecimentode substrato. A DNAzima 8:17 tem um domínio catalítico de 14 desoxinucle-otídeos, que também é flanqueado por dois braços de reconhecimento desubstrato.
Um ácido nucléico catalítico pode clivar um substrato de ácidonucléico com uma seqüência-alvo que atende aos requisitos mínimos. A se-qüência do substrato deve ser substancialmente complementar aos braçoshibridizantes do ácido nucléico catalítico, e o substrato deve conter uma se-qüência específica no sítio de clivagem. Os requisitos específicos da se-qüência no sítio de clivagem incluem, por exemplo, uma seqüência de ribo-nucleotídeo purina:pirimidina para clivagem pela DNAzima 10:23 DNAzima(Santoro e Joyce, 1997), e a seqüência uridina:X para as ribozimas Hamme-rhead (Perriman et aí., 1992), onde X pode ser A, C, ou U, mas não G.
Os ácidos nucléicos catalíticos demonstraram tolerar apenascertas modificações na área que forma o núcleo catalítico (Perreault et al.,1990; Perreault et al., 1991; Zaborowska et al., 2002; Cruz et al., 2004; Sil-verman, 2004)). Os exemplos de seqüências responsáveis pela atividadecatalítica de DNAzimas estão listadas na Tabela 1.
Tabela 1: Seqüências Exemplificativas para Algumas DNAzimas Ativase seus Substratos
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A substituição de certos ribonucleotídeos por certos desoxirribi-nucleotídeos em ribozimas conhecidas foi tentada sob certas condições(McCaII et al., 1992). As ribozimas que foram convertidas inteiramente emDNA não têm atividade em virtude das diferenças de conformação de RNA eDNA (Perreault et ai, 1990). Estes estudos demonstram que as enzimas deRNA não podem ser modificadas para dar enzimas de DNA funcionais me-ramente substituindo ribonucleotídeos por desoxirribonucleotídeos.
Foram realizados alguns estudos que tentaram desenvolver cer-tas ribozimas homodiméricas e heterodiméricas para aplicações terapêuticas(Kuwabara et ai, 1999; Kuwabara etal., 2000; Oshima etal., 2003). Nessesestudos, o núcleo catalítico da ribozima compreendia unicamente ribonucleo-tídeos. Além disso, a capacidade para as DNAzimas funcionarem em forma-tos diméricos ou mutiméricos não foi considerada, nem foi fornecida qual-quer informação sobre como extrapolar de uma ribozima dimérica para umaDNAzima dimérica em termos de uma estrutura possível de uma DNAzimadimérica e a atividade resultante.
Os ácidos nücléicos catalíticos foram usados em combinaçãocom protocolos de ampliação in vitro como um meio para gerar um sinal de-tectável, primitindo assim o monitoramente em tempo real de seqüências-alvo de ácidos nücléicos ampliadas (Todd et al., 2000) (US 6,140,055; US6,201,113; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO 99/50452). Zymogene de-tection (US 6,140,055; US 6,201,113; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO99/50452), também conhecido com detecção de DzyNA (Todd et al., 2000),resulta em alvo concomitante e ampliação do sinal. Isto ocorre porque asDNAzimas ou ribozimas catalíticas co-ampliam junto com seqüências-alvopara produzir amplicons que funcionam como enzimas verdadeiras capazesde rotatividade múltipla. Assim sendo, cada amplicon de ácido nucléico cata-lítico cliva múltiplos substratos repórteres. As DNAzimas e ribozimas sãointroduzidas nos amplicons usando iniciadores com rotuladores de 5' quesão inativos, seqüências anti-sentido de ácidos nücléicos catalíticos. Quandoestas seqüências são copiadas durante a ampliação in vitro, as seqüênciassense cataliticamente ativas são co-ampliadas junto com a seqüência-alvo.A abordagem zimogênio/DzyNA é muito flexível pois a ampliação catalíticado sinal pode estar ligada a métodos de ampliação-alvo, incluindo PCR (rea-ção de polimerase em cadeia), ampliação por deslocamento de filamento("SDA"), ou ampliação rotação circular ("RCA"-Rolling circle), produzindoamplicons de DNAzimas; e ampliação baseada em seqüências de ácidosnucléicos ("NASBA"), replicação de seqüências auto-sustentada ("3SR"), ouampliação mediada por transcrição ("TMA"), produzindo amplicons de ribo-zimas. Além disso, como inúmeras moléculas de ácidos nucléicos catalíticoscom uma ampla faixa de atividades catalíticas foram descobertas ou surgi-ram, a abordagem de zimogênio pode usar um substratorepórter diferente deum ácido nucleico, onde a leitura do ensaio é dependente de uma modifica-ção química diferente de clivagem de um substrato de ácido nucléico. A a-bordagem zimogênio/DzyNA (Todd et al., 2000) ou NASBA/ribozima (WO00/58505) pode ser considerada sensível e útil, mas há o potencial de inter-ferência devido à ampliação de seqüências iniciadoras.
NASBA foi usada para produzir amplicons de RNA que contêm oácido nucléico-alvo e uma seção do núdeo catalítico da ribozima Hamme-rhead (GAArA), introduzida como seqüência anti-sentido anexada com rotu-lador a um iniciador e depois copiada (WO 00/58505). A seqüência adicionalnecessária para a atividade catalítica (CUrGANrGrA) foi introduzida comoseqüência sense sequence em uma segunda molécula, que foi rotulada comum fluoróforo e quencher, e que também serviu como substratorepórter. Cer-tas bases de ribonucleotídeos (rN acima) devem permanecer como ribonu-cleotídeos, senão a atividade catalítica da ribozima é perdida. Duas molécu-las que consistiam inteiramente em DNA foram consideradas incapazes deformar enzimas heterodiméricas cataliticamente ativas (WO 00/58505).
Os ácidos nucléicos catalíticos foram usados também para adetecção de polimorfismos de nucleotídeos individuais ("SNPs"). O requisitoestrito para pareamento de bases de Watson Crick entre os braços de liga-ção de ácidos nucléicos catalíticos e o substrato permitiu o desenvolvimentode métodos que permitem a discriminação de seqüências curtas intimamen-te relacionadas. As DNAzimas e ribozimas demonstraram discriminar entreduas seqüências que diferem em tão pouco quanto uma única base (Cairnset al., 2000) (WO 99/50452).
As DNAzimas têm propriedades que proporcionam vantagenssobre as ribozimas para certas aplicações in vitro. O DNA é inerentementemais estável do que o RNA, e assim sendo, é mais robust com prazo de va-lidade mais longo. O DNA pode ser estocado por longos períodos à tempera-tura ambiente, seja em solução ou em uma forma liofilizada. As DNAzimastambém são preferíveis sobre a maioria de enzimas protéicas em certas a-plicações porque, por exemplo, elas não são desnaturadas irreversivelmentepor exposição a altas temperaturas durante a ampliação.
Assim sendo, existe uma necessidade presentemente nessastécnicas de obter métodos simples, rápidos, e econômicos para detectar,identificar e quantificar seqüências de ácidos nucléicos e outras entidades,que, de preferência, fornecem ácidos nucléicos catalíticos baseados emDNAzimas e/ou ribozimes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo còm um primeiro aspecto da presente invenção, for-nece-se uma composição que compreende pelo menos dois ou mais com-ponentes oligonucleotídeos, onde pelo menos um primeiro componente oli-gonucleotídeo e um segundo componente oligonucleotídeo se autocombi-nam na presença de um facilitador de combinação de MNAzima, para formaruma enzima de ácido nucléico multicomponente cataliticamente ativa (MNa-zima), onde cada um dos ditos pelo menos primeiro e dito segundo compo-nentes oligonucleotídeos compreendem uma parte ramificada de substrato,uma parte de núcleo catalítico, e uma parte ramificada de sensor;onde depois da autocombinação, a parte ramificada de sensor dos ditos pri-meiro e segundo componentes oligonucleotídeos atuam como braços senso-res da MNAzima, a parte do braço substrato dos primeiro e segundo compo-nentes oligonucleotídeos atuam como braços substratos da MNAzima, e aparte nuclear catalítica dos primeiro e segundo componentes oligonucleotí-deos atuam como um núcleo catalítico de MNAzima;e onde os braços sensores da MNAzima interagem com o dito facilitador decombinação de MNAzima de modo a manter o primeiro e o segundo compo-nentes oligonucleotídeos em proximidade para associação das suas respec-tivas partes nucleares catalíticas, para formar o núcleo catalítico da MNAzi-ma, sendo o dito núcleo catalítico capaz de modificar pelo menos um subs-trato, e onde as ditas ramificações de substrato da dita MNAzima engatamem um substrato, de tal modo que o dito núcleo catalítico da dita MNAzimapossa modificar o dito substrato.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeos,facilitador de combinação ou substrato pode compreender DNA ou um seuanálogo.
O facilitador de combinação pode ser um alvo a ser identificado,detectado ou quantificado. O alvo pode compreender um ácido nucléico. Oácido nucléico pode ser selecionado no grupo que compreende DNA, DNA metilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA,tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré- e primicroRNA, outros RNAsnão-codificadores, RNA ribossômico, derivados deles, amplicons, ou qual-quer combinação deles. O RNA ribossômico pode ser RNA ribossômico 16S.
A fonte do ácido nucléico pode ser selecionada no grupo quecompreende uma fonte sintética, mamífera, humana, animal, vegetal, fúngi-ca, bacteriana, Archaea, ou qualquer combinação delas.
O ácido nucléico pode ser ampliado. A ampliação pode compre-ender uma ou mais entre PCR (reação de polimerase em cadeia), ampliaçãopor deslocamento de filamento ("SDA"), ampliação isotérmica mediada poralça (LAMP), ampliação rotação circular ("RCA"), ampliação mediada portranscrição (TMA), replicação de seqüências auto-sustentada ("3SR"), ouampliação baseada em seqüências de ácidos nucléicos (NASBA), ou reaçãode polimerase em cadeia com transcrição reversa (RT-PCR).
A composição pode compreender ainda pelo menos um terceirocomponente oligonucleotídeo que atua para estabilizar pelo menos um entreas ditas partes de braços de substrato ou partes ramidicada de sensor.
Pelo menos um entre o dito facilitador de combinação, os ditoscomponentes oligonucleotídeos ou substrato, ou uma combinação deles,pode compreender mais do que uma molécula.
As partes do núcleo catalítico do primeiro componente oligonu-cleotídeo podem ser selecionadas no grupo que compreende SEQ ID Nos:149 - 153, 155 - 157, 159 e 161, e as partes do núcleo catalítico do segun-do componente catalítico podem ser selecionadas no grupo que compreendeSEQ ID Nos: 166 - 170 e 172.
A composição pode compreender ainda pelo menos um inibidorda dita autocombinação da dita MNAzima.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeosou facilitador de combinação ou substrato ou uma combinação deles podecompreender ainda pelo menos um aptâmero ou parte dele. O aptâmero ouparte dele pode compreender pelo menos um ácido nucléico, peptídeo, poli-peptídeo ou proteína ou um seu derivado ou combinação.
A composição pode compreender ainda pelo menos um inibidorda dita autocombinação da dita MNAzima.
Pelo menos um entre o dito primeiro ou o dito segundo compo-nentes oligonucleotídeos ou o dito facilitador de combinação ou o dito subs-trato pode compreender ainda pelo menos uma parte de uma seqüência au-tocomplementar capaz de formar uma estrutura de grampo. A estrutura degrampo pode inibir a autocombinação da dita MNAzime. A inibição da auto-combinação pode ser removida após o contato de um aptâmero com um al-vo. O aptâmeto ou parte dele pode se ligar a um alvo selecionado no grupoque compreende ácidos nucléicos, proteínas, glicoproteínas, lipídeos, Iipo-proteínas, células, vírus, bactérias, Archaea, fungos, anticorpos, metabólitos,patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequenas, políme-ros, íons metálicos, sais metálicos, príons ou quaisquer derivados, partes oucombinações deles.
O substrato pode compreender um ácido nucléico ou uma proteína.O ácido nucléico pode compreender pelo menos um entre um ácido nucléicorotulado, RNA, DNA, análogo de ácido nucléico, ácido nucléico peptídico,ácido nucléico bloqueado, quimera peptídeo-ácido nucléico, ou qualquercombinação deles. A proteína pode compreender pelo menos um entre umanticorpo, polipeptídeo, glicoproteína, lipoproteína, ou qualquer combinaçãodeles. O substrato pode compreender ainda pelo menos uma nanopartículaou micropartícula ou uma combinação delas. O substrato pode ser afixado aum suporte insolúvel ou estar livre em solução. O substrato pode compreen-der uma parte detectável e uma parte quencher, onde depois da modificaçãodo dito substrato pela dita MNAzima, um efeito detectável proporcionadopela dita parte detectável é aumentado ou diminuído.
Os braços do substrato podem engatar no dito substrato através depareamento de bases complementares.
A modificação do dito substrato pela dita MNAzima pode propor-cionar um efeito detectável. A modificação do dito substrato pode ser sele-cionada no grupo que compreende clivagem, ligação, metalação da porfirina,formação de ligações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida, ouqualquer combinação delas. O efeito detectável pode ser detectado por es-pectroscopia de fluorescência, ressonância de plasmônios superficiais, es-pectroscopia de massas, RMN, ressonância spin de elétrons, espectroscopiade polarização da fluorescência, dicroísmo circular, imunoensaio, cromato-grafia, radiometria, fotometria, cintilografia, métodos eletrônicos, UV, espec-troscopia em luz visível ou no infravermelho, métodos enzimáticos, ou qual-quer combinação deles. O efeito detectável pode ser medido, onde a magni-tude da dita medição é indicativa da quantidade de um alvo.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeos, o ditofacilitador de combinação ou o dito substrato pode ser selecionado no grupoque compreende DNA, RNA, análogos de ácidos nucléicos, ácidos nucléicospeptídicos, ácidos nucléicos bloqueados, quimeras peptídeos-ácidos nucléi-cos, ou uma combinação deles. O facilitador de combinação e o dito substra-to podem compreender ácidos nucléicos que são completamente ou parci-almente complementares a pelo menos uma parte dos ditos primeiro ou se-gundo componentes oligonucleotídeos. Pelo menos um entre os ditos com-ponentes oligonucleotídeos, o dito facilitador de combinação ou o dito subs-trato pode compreender pelo menos uma substituição ou adição de nucleotí-deo selecionada no grupo que compreende 4-acetilcitidina, 5-(carbóxi-hidróxi-metil)-uridina, 2D-0-metil-guanosina, inosina, N6-isopentenil-adenosina, 1-metil-adenosina, 1-metil-pseudouridina, 1-metil-guanosina, 1-metil-inosina, 2,2-dimetil-guanosina, 2-metil-adenosina, 2-metil-guanosina, 3-metil-citidina, 5-metil-citidina, N6-metil-adenosina, 7-metil-guanosina, 5-metil-amino-metil-uridina, 5-metóxi-amino-metil-2-tiouridina, beta-D-manosil-metil-uridia, 5-metóxi-carbonil-metil-uridina, 5-metóxi-uridina, 2-metil-tio-N6-isopentenil-adenosina, N-((9-beta-ribofuranosil-2-metil-tiopurin-6-il)-carbamoil)-treonina, N-((9-beta-ribofuranosil-purin-6-il)-N-metil-carbamoil)-treonina, uridino-5-oxoacetato de metila, ácido uridino-5-oxiacético (v), wibu-tosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metil-uridina, N-((9-beta-ribofuranosil-purin-6-il)-carbamoil)-treonina, 2D-0-metil-5-metil-uridina, 2 D-Ometil-Uridina, wybuto-sina, 3-(3-amino-carbóxi-propil)-uridina, beta-D-arabinosil-uridina, beta-D-arabinosil-timidina.
A composição pode compreender ainda pelo menos um terceirocomponente oligonucleotídeo e um quarto comoponente oligonucleotídeoque se autocombinam nà presença de pelo menos um facilitador de combi-nação adicional, para formar pelo menos uma MNAzima cataliticamente ati-va adicional, onde cada um dos ditos pelo menos terceiro e quarto compo-nentes oligonucleotídeos compreendem uma parte de braços de substrato,uma parte de núcleo catalítico e uma parte ramificada de sensor;onde depois da autocombinação de pelo menos um terceiro componenteoligonucleotídeo e um quarto componente oligonucleotídeo, a parte do braçosensor dos ditos pelo menos terceiro e o dito pelo menos quarto componen-tes oligonucleotídeos formam os braços sensores da dita pelo menos umaMNAzima cataliticamente ativa adicional, a parte dos ditos braços de subs-trato do dito pelo menos terceiro e do dito pelo menos quarto componentesoligonucleotídeos formam os braços de substrato da dita pelo menos umaMNAzima cataliticamente ativa adicional, e a parte dos braços do núcleo ca-talítico do dito pelo menos terceiro e do dito pelo menos quarto componentesniinnnnHeotídeos formam um núcleo catalítico da dita pelo menos umaMNAzima cataliticamente ativa adicional;
e onde os braços sensores da dita pelo menos um MNAzima adicional inte-ragem com o dito pelo menos um facilitador de combinação adicional demodo a manter os dito pelo menos terceiro e o dito pelo menos quarto com-ponentes oligonucleotídeos próximos um do outro para associação de duaspartes do núcleo catalítico, para formar o núcleo catalítico da dita pelo me-nos MNAzima adicional, sendo o dito núcleo catalítico capaz de atuar sobrepelo menos um substrato adicional, e onde os braços do substrato da ditapelo menos uma MNAzima adicional engatam em pelo menos um substratoadicional, de tal modo que o núcleo catalítico da dita pelo menos uma MNA-zima adicional atue sobre o dito pelo menos um substrato adicional.
Os substratos adicionais podem ser iguais, diferentes ou umacombinação deles.
De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, for-nece-se um método para detectar a presença de peo menos um facilitadorde combinação, compreendendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,onde pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segundocomponente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de um facilita-dor de combinação, para formar pelo menos uma enzima de ácido nucleicomulticomponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma mostra que putativamente contém o facilitador de combi-nação sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da dita pelo menos uma MNAzima cataliticamente ativa, e
(2) a atividade catalítica da dita MNAzima; e
(c) determinar a presença da atividade da atividade catalítica dadita pelo menos uma MNAzima, onde a presença da atividade catalítica éindicativa da presença do dito pelo menos um facilitador de combinação.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeosou facilitador de combinação pode compreender DNA ou um seu análogo.
O facilitador de combinação pode ser um alvo a ser identificado,detectado ou quantificado. O alvo pode compreender um ácido nucléico. Oácido nucléico pode ser selecionado no grupo que compreende DNA, DNAmetilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA,mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré- e primicroRNA, outros RNAsnão-codificadores, RNA ribossômico, derivados deles, amplicons deles, ouqualquer combinação deles. O RNA ribossômico pode ser RNA ribossômico16S.
A fonte do ácido nucléico pode ser selecionada no grupo quecompreende uma fonte sintética, mamífera, humana, animal, vegetal, fúngi-ca, bacteriana, Archaea, ou qualquer combinação delas.
O método pode compreender ainda uma etapa de ampliar 0 faci-litador de combinação. A etapa de ampliação pode compreender uma oumais entre: reação de polimerase em cadeia (PCR), ampliação por desloca-mento de filamento ("SDA"), ampliação isotérmica mediada por alça (LAMP),ampliação rotação circular ("RCA"), ampliação mediada por transcrição(TMA), replicação de seqüências auto-sustentada ("3SR"), ou ampliação ba-seada em seqüências dé ácidos nucléicos (NASBA), ou reação de polimera-se em cadeia com transcrição reversa (RT-PCR).
Pelo menos um entre o dito facilitador de combinação, os ditoscomponentes oligonucleotídeos ou substrato, ou uma combinação deles,pode compreender mais do que uma molécula.
O método pode compeender ainda a determinação da presençada dita atividade catalítica durante ou depois da dita ampliação.
A autocombinação da MNAzima pode requerer o contato do faci-litador de combinação com um ou ambos entre os ditos primeiro e segundocomponentes oligonucleotídeos.
O método pode compreender ainda pelo menos um terceirocomponente oligonucleotídeo que fica em contato com pelo menos uma par-te de qualquer um dos dois ou ambos entre o primeiro e o segundo compo-nentes oligonucleotídeos, para autocombinar a MNAzima. O terceiro compo-nente oligonucleotídeo pode compreender mais do que uma molécula.
De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, for-nece-se um método para detectar a presença de pelo menos um facilitadorde combinação, compreendendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,onde pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segundocomponente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de pelo menosum primeiro facilitador de combinação, para formar pelo menos uma primeiraenzima de ácido nucléico multicomponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) disponibilizar pelo menos um primeiro substrato, sendo o ditoprimeiro substrato capaz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, on-de a dita modificação do ditto substrato pela dita MNAzima proporciona umefeito detectável;
(c) colocar os ditos dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que putativamente contém o dito pelo menos pri-meiro facilitador de combinação sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da dita pelo menos primeira MNAzima, e
(2) a atividade catalítica da dita pelo menos primeira MNAzima; e
(d) detectar o dito efeito detectável.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeosou facilitador de combinação pode compreender DNA ou um seu análogo.
O facilitador de combinação pode ser um alvo a ser identificado,detectado ou quantificado. O alvo pode compreender um ácido nucléico. Oácido nucléico pode ser selecionado no grupo que compreende DNA, DNAmetilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA,tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré- e primicroRNA, outros RNAsnão-codificadores, RNA ribossômico, derivados deles, amplicons deles, ouqualquer combinação deles. O RNA ribossômico pode ser RNA ribossômico16S.
A fonte do ácido nucléico pode ser selecionada no grupo quecompreende uma fonte sintética, mamífera, humana, animal, vegetal, fúngi-ca, bacteriana, Archaea, ou qualquer combinação delas.
O método pode compreender ainda uma etapa de ampliar o áci-do nucléico. A etapa de ampliação pode compreender uma ou mais entre:reação de polimerase em cadeia (PCR), ampliação por deslocamento defilamento ("SDA"), ampliação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplia-ção rotação circular ("RCA"), ampliação mediada por transcrição (TMA), re-plicação de seqüências auto-sustentada ("3SR"), ou ampliação baseada emseqüências de ácidos nucléicos (NASBA), ou reação de polimerase em ca-deia com transcrição reversa (RT-PCR).
Pelo menos um entre o dito facilitador de combinação, os ditoscomponentes oligonucleotídeos ou substrato, ou uma combinação deles,pode compreender mais do que uma molécula.
O método pode compreender ainda detectar o dito efeito detec-tável durante ou depois da ampliação. O efeito detectável pode ser indicativoda presença do dito facilitador de combinação. O efeito detectável pode sermedido quantitativamente ou qualitativamente.
Cada um dos substrato pode ser um ácido nucléico ou uma pro-teína. O ácido nucléico pode compreender pelo menos um entre um ácidonucléico rotulado, RNA, DNA, análogo de ácido nucléico, ácido nucléico pep-tídico, ácido nucléico bloqueado, quimera peptídeo-ácido nucléico, ou qual-quer combinação deles. A proteína pode compreender pelo menos um entreum anticorpo, polipeptídeo, glicoproteína, lipoproteína, ou qualquer combina-ção deles. O substrato pode compreender ainda pelo menos uma nanopartí-cula ou micropartícula ou uma combinação delas. O substrato pode ser afi-xado a um suporte insolúvel ou estar livre em solução.
O substrato pode compreender um ácido nucléico e os braçosdo dito substrato podem engatar no dito substrato atravé de pareamento debases complementares.
O substrato pode compreender uma parte detectável e uma par-te quencher, onde depois da modificação do substrato pela MNAzima, umefeito detectável proporcionado pela parte detectável é aumentado ou dimi-nuído. O efeito detectável pode ser detectado por espectroscopia de fluores-cência, ressonância de plasmônios superficiais, espectroscopia de massas,RMN, ressonância spin de elétrons, espectroscopia de polarização da fluo-rescência, dicroísmo circular, imunoensaio, cromatografia, radiometria, foto-metria, cintilografia, métodos eletrônicos, UV, espectroscopia em luz visívelou no infravermelho, métodos enzimáticos, ou qualquer combinação deles.
O método pode compreender ainda a ampliação do efeito detec-tável pelo uso de uma cascata de ampliação de efeitos detectáveis. A casca-ta de ampliação de efeitos detectáveis pode compreender uma ou mais entreuma cascata de ribozima/ligase, uma cascata circular de enzimas de ácidosnucléicos, uma cascata de enzimas protéicas, ou uma ou mais enzimas afi-xadas a um suporte, ou qualquer combinação delas.
A modificação do dito substrato pode ser selecionada no grupoque compreende clivagem, ligação, metalação da porfirina, formação de li-gações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida.
O método pode compreender ainda disponibilizar pelo menosum terceiro e quarto componentes oligonucleotídeos, sendo os ditos pelomenos terceiro e o pelo menos quarto componentes oligonucleotídeos capa-zes de se autocombinarem na presença de pelo menos um facilitador decombinação adicional, para formar pelo menos uma MNAzima cataliticamen-te ativa adicional, e onde pelo menos um substrato adicional está presentena amostra, sendo o dito substrato adicional capaz de ser modificado pelaMNAzima adicional, onde a dita modificação proporciona o dito efeito detec-tável adicional.
O pelo menos um efeito detectável adicional pode ser detectávelindependentemente.
Pelo menos um entre cada substrato adicional pode ser afixadoa um suporte insolúvel, de tal modo que apenas uma entre uma parte detec-tável e uma parte quencher do substrato adicional permaneça afixada aosuporte quando o dito substrato adicional é modificado pela dita MNAzimaadicional.
Um substrato adicional pode ser afixado a pelo menos um supor-te insolúvel, de tal modo que um efeito detectável seja produzido quandoeste substrato é modificado por sua resepctiva MNAzima.
De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, forne-ce-se um método para detectar a presença de pelo menos um alvo, compre-endendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,onde pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e pelo menosum segundo componente oligonucleotídeo são capazes de se autocombina-rem na presença do dito alvo, para formar uma enzima de ácido nucléicomulticomponente cataliticamente ativa (MNAzima); e onde pelo menos umentre o dito primeiro e o dito segundo componentes oligonucleotídeos com-preende pelo menos uma parte de aptâmero;
(b) colocar os ditos componentes oligonucleotídeos em contatocom uma amostra que putativamente contém o dito pelo menos um alvo, sobcondições que permitem:
(1) ligar o dito alvo às ditas partes de aptâmero, e
(2) a atividade catlítica da MNAzima; e
(c) determinar a presença da atividade catalítica da MNAzima, onde apresença da atividade catalítica é indicativa da presença do dito alvo.
Pelo menos um dos ditos componentes oligonucleotídeos podeser afixado a um suporte sólido.
Pelo menos um dos ditos componentes oligonucleotídeos podecompreender DNA ou um seu análogo.
O alvo pode ser identificado, detectado ou quantificado.
O método pode compreender ainda disponibilizar pelo menosum terceiro e um quarto componentes oligonucleotídeos, sendo que pelomenos o terceiro e pelo menos o quarto componentes oligonucleotídeos sãocapazes de se autocombinarem na presença de pelo menos um alvo adicio-nal, para formar pelo menos uma MNAzima cataliticamente ativa adicional,e onde pelo menos um entre o dito terceiro ou quarto componentes oligonu-cleotídeos compreende pelo menos uma parte de aptâmero adicional que seliga ao dito pelo menos um alvo adicional.
De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, forne-ce-se um método para detectar a presença de pelo menos um alvo, compre-endendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,onde pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segundocomponente oligonucleotídeo são capazes de se autocombinarem na pre-sença de pelo menos um facilitador de combinação e do dito pelo menos umalvo, para formar pelo menos uma enzima de ácido nucléico multicomponen-te cataliticamente ativa (MNAzima); e onde pelo menos um entre o dito pri-meiro ou segundo componentes oligonucleotídeos ou o dito pelo menos umfacilitador de combinação compreende ainda pelo menos um aptâmero ouparte dele, e onde o dito alvo é capaz de se ligar ao dito pelo menos um ap-tâmero ou parte dele;
(b) disponibilizar pelo menos um inibidor da dita autocombinaçãoda dita MNAzima;
(c) colocar os ditos componentes oligonucleotídeos, o facilitadorde combinação, e o dito inibidor em contato com uma amostra que putativa-mente contém o dito pelo menos um alvo, sob condições que permitem:
(1) ligar o dito alvo ao dito pelo menos um aptâmero ou partedele, e
(2) a atividade catalítica da dita pelo menos uma MNAzima; e
(3) a remoção da dita inibição da dita autocombinação da dita MNAzi-ma cataliticamente ativa; e
(d) determinar a presença da atividade catalítica da dita MNAzi-ma, onde a presença da dita atividade catalítica é indicativa da presença dodito alvo.
O pelo menos um alvo pode ser selecionado no grupo que com-preende proteínas, glicoproteínas, lipídeos, Iipoproteínas, células, vírus, bac-térias, Archaea, fungos, anticorpos, metabólitos, patógenos, toxinas, conta-minantes, venenos, moléculas pequenas, polímeros, íons metálicos, saismetálicos, príons, ácidos nucléicos ou quaisquer derivados, partes ou com-binações deles.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeos,facilitador de combinação ou inibidor pode estar afixado a um suporte insolúvel.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeos,facilitador de combinação, aptâmero ou parte de aptâmero pode compreen-der ainda o dito inibidor.
Pelo menos um entre o dito primeiro ou o dito segundo compo-nentes oligonucleotídeos ou facilitador de combinação pode compreenderainda uma parte de uma seqüência autocomplementar capaz de formar umestrutura de grampo. A estrutura de grampo pode inibir a autocombinação dadita MNAzima cataliticamente ativa.
O aptâmero ou parte dele pode compreender pelo menos umácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou um derivado ou combi-nação deles.
A inibição da autocombinação da dita MNAzima cataliticamenteativa pode ser removida depois do contato do dito aptâmero ou parte do ap-tâmero com o alvo.
O inibidor pode ser capaz de se ligar a pelo menos um no grupoque compreende o dito aptâmero ou parte dele.
O inibidor pode ser selecionado no grupo que compreende RNA,DNA, análogos de ácidos nucléicos, ácidos nucléicos peptídicos, ácidos nu-cléicos bloqueados, quimeras peptídeos-ácidos nucléicos, ou uma combinação deles.
O método pode compreender ainda disponibilizar um substratoque pode ser modificado pela dita MNAzima para proporcionar um efeito de-sejável. A modificação pode ser selecionada no grupo que compreende cli-vagem, ligação, metalação da porfirina, formação de ligações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida. O substrato pode não ser modifi-cado pelos ditos primeiro ou segundo componentes oligonucleotídeos indivi-dualmente ou por ambos dos ditos primeiro e segundo componentes oligo-nucleotídeos na ausência do dito facilitador de combinação e o dito alvo.
O substrato pode compreender um ácido nucléico ou uma prote-ína. O ácido nucléico compreende pelo menos um entre ácido nucléico rotu-lado, RNA, DNA, análogo de ácido nucléico, ácido nucléico peptídico, ácidonucléico bloqueado, quimera peptídeo-ácido nucléico, ou qualquer combina-ção deles. A proteína pode compreender pelo menos um entre um anticorpo,polipeptídeo, glicoproteína, lipoproteína, ou qualquer combinação deles.
O substrato pode compreender ainda pelo menos uma nanopar-tícula ou micropartícula ou uma combinação delas.
A detecção do efeito detectável pode ser indicativa da dita ativi-dade catalítica da dita MNAzima cataliticamente ativa, e onde a dita ativida-de catalítica é indicativa do dito alvo. O efeito detectável pode ser medidoquantitativamente ou qualitativamente. O efeito detectável pode ser detecta-do por espectroscopia de fluorescência, ressonância de plasmônios superfi-ciais, espectroscopia de massas, RMN, ressonância spin de elétrons, espec-troscopia de polarização da fluorescência, dicroísmo circular, imunoensaio,cromatografia, radiometria, fotometria, cintilografia, métodos eletrônicos, es-pectroscopia em UV, luz visível ou no infravermelho, métodos enzimáticos,ou qualquer combinação deles.
O substrato pode compreender uma parte detectável e uma par-te quencher, onde depois da modificação do dito substrato pela dita MNAzi-ma, um efeito detectável proporcionado pela dita parte detectável é aumen-tado ou diminuído.
De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, forne-ce-se um método para detectar a presença de pelo menos um alvo, compre-endendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,onde pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segundocomponente oligonucleotídeo são capazes de se autocombinarem na pre-sença de pelo menos um facilitador de combinação e do dito pelo menos umprimeiro alvo, para formar pelo menos uma primeira enzima de ácido nucléi-co multicomponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) disponibilizar pelo menos um primeiro substrato, sendo o dito pri-meiro substrato capaz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, onde adita modificação do dito substrato pela dita MNAzima proporciona um efeitodetectável;
(c) onde pelo menos um entre o dito primeiro ou o dito segundo com-ponentes oligonucleotídeos ou o dito pelo menos primeiro facilitador decombinação ou o dito pelo menos primeiro substrato compreende ainda umaptâmero e onde o ditto alvo é capaz de se ligar a pelo menos uma parte doditto aptâmero, produzindo pelo menos um primeiro inibidor que é capaz deinibir a dita autocombinação da dita MNAzima cataliticamente ativa na au-sência do dito alvo;
(d) colocar os ditos componentes oligonucleotídeos, o dito facilitador decombinação, o dito substrato, e o dito inibidor em contato com uma amostraque putativamente contém o dito alvo, sob condições que permitem:
(1) a ligação do dito alvo ao dito aptâmero, e
(2) a remoção da dita inibição da dita autocombinação da ditaMNAzima cataliticamente ativa,
(3) a atividade catalítica da MNAzima; e
(e) determinar a presença do dito efeito detectável, detectando destaforma a presença do dito alvo.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeosou facilitador de combinação pode compreender DNA ou um análogo dele.
O aptâmero ou parte dele pode ser ligar a um alvo selecionadono grupo que compreende ácidos nucléicos, proteínas, glicoproteínas, lipí-deos, Iipoproteínas, células, vírus, bactérias, Archaea, fungos, anticorpos,metabólitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas peque-nas, polímeros, íons metálicos, sais metálicos, príons ou quaisquer deriva-dos, partes ou combinações deles.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeosou facilitador de combinação, substrato, ou inibidor pode ser afixado a umsuporte insolúvel.
Pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeos,facilitador de combinação, aptâmero ou parte dele pode compreender aindao dito inibidor.
O aptâmero ou parte dele pode compreender pelo menos umentre um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou proteína, ou um derivadoou combinação deles.
Pelo menos um entre o dito primeiro ou o dito segundo compo-nentes oligonucleotídeos, facilitador de combinação ou substrato pode com-preender ainda uma parte de uma seqüência autocomplementar capaz deformar uma estrutura de grampo. A estrutura de grampo pode inibir a auto-combinação da dita MNAzima cataliticamente ativa. A inibição da autocom-binação da dita MNAzima cataliticamente ativa pode ser removida depois docontato do dito aptâmero ou parte do aptâmero com o alvo.
O inibidor pode ser capaz de se ligar a pelo menos um no grupoque compreende o dito aptâmero ou parte dele. O inibidor pode ser selecio-nado no grupo que compreende RNA, DNA, análogos de ácidos nucléicos,ácidos nucléicos peptídicos, ácidos nucléicos bloqueados, quimeras peptí-deos-ácidos nucléicos, ou uma combinação deles.
O substrato pode compreender um ácido nucléico ou uma prote-ína. O ácido nucléico pode compreender pelo menos um entre um ácido nu-cléico rotulado, RNA, DNA, análogo de ácido nucléico, ácido nucléico peptí-dico, ácido nucléico bloqueado, quimera peptídeo-ácido nucléico, ou qual-quer combinação deles. A proteína pode compreender pelo menos um entreum anticorpo, polipeptídeo, glicoproteína, lipoproteína, ou qualquer combina-ção deles.
O substrato pode compreender ainda pelo menos uma nanopar-tícula ou micropartícula ou uma combinação delas.
A detecção do dito efeito detectável pode detectar a presença dodito alvo. O efeito detectável pode ser medido quantitativamente ou qualitati-vamente. O efeito detectável pode ser detectado por espectroscopia de fluo-rescência, ressonância de plasmônios superficiais, espectroscopia de mas-sas, RMN, ressonância spin de elétrons, espectroscopia de polarização dafluorescência, dicroísmo circular, imunoensaio, cromatografia, radiometria,fotometria, cintilografia, métodos eletrônicos, espectroscopia em UV, luz vi-sível ou no infravermelho, métodos enzimáticos, ou qualquer combinaçãodeles.
O substrato pode compreender uma parte detectável e uma par-te quencher, onde depois da modificação do dito substrato pela dita MNAzi-ma, um efeito detectável proporcionado pela dita parte detectável é aumen-tado ou diminuído. A modificação do dito substrato pode ser selecionada nogrupo que compreende clivagem, ligação, metalação da porfirina, formaçãode ligações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida.
O método pode compreender ainda disponibilizar pelo menosum terceiro e quarto componentes oligonucleotídeos, sendo os ditos pelomenos terceiro e o pelo menos quarto componentes oligonucleotídeos capa-zes de se autocombinarem na presença de pelo menos um facilitador decombinação adicional e pelo menos um alvo adicional, para formar pelo me-nos uma MNAzima cataliticamente ativa adicional; e
onde pelo menos um substrato adicional está presente na amostra, sendo odito substrato adicional capaz de ser modificado pela MNAzima adicional,onde a dita modificação proporciona o dito efeito detectável adicional; eonde pelo menos um entre os ditos terceiro ou quarto componentes oligonu-cleotídeos ou o ditto facilitador de combinação adicional ou o dito subtratoadicional compreende ainda pelo menos um aptâmero adicional que se ligaao dito pelo menos um alvo adicional;
onde pelo menos uma molécula inibidora adicional entra em contato comuma parte do dito aptâmero adicional, inibindo desta forma a dita autocombi-nação da dita MNAzima cataliticamente ativa adicional na ausência do ditoalvo adicional; e
onde o dito pelo menos um facilitador de combinação entra em contato compelo menos uma parte dos ditos componentes oligonucleotídeos adicionais.
O pelo menos um efeito detectável adicional pode ser detectávelindependentmente.
Cada dos substratos adicionais podem ser iguais, diferentes ouuma combinação deles.
Pelo menos um de cada substrato adicional pode ser afixado aum suporte insolúvel, de tal modo que apenas uma entre uma parte detectá-vel e uma parte quencher do substrato adicional permaneça afixada ao su-porte quando o dito suporte é modificado pela dita MNAzima adicional.
De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção, forne-ce-se um método para detectar a presença de pelo menos uma seqüênciade ácidos nucléicos, compreendendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,onde pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segundocomponente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de uma varian-te de seqüência de um ácido nucléico, para formar uma enzima de ácidonucléico multicomponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) disponibilizar pelo menos um substrato, sendo o dito substrato ca-paz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, onde a dita modificaçãodo dito substrato pela dita MNAzima proporciona um efeito detectável;
(c) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos em contatocom uma amostra que putativamente contém a dita variante de seqüência,sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da dita MNAzima cataliticamente ativa, e
(2) a atividade catalítica da dita MNAzima; e
(d) determinar a presença do dito efeito detectável, detectandodesta forma a presnça da dita pelo menos uma variante de seqüência.
A variante de seqüência pode ser selecionada no grupo quecompreende polimorfismos de nucleotídeos singulares, múltiplos polimorfis-mos de nucleotídeos, inserções, deleções, duplicações, translocações, vari-antes de seqüências com deslocamento de estrutura, variantes de seqüên-cias sem sentido, ou qualquer combinações deles. A variante de seqüênciapode estar presente em DNA ou RNA.
Qualquer um dos dois ou ambos entre os dito primeiro e o ditosegundo componentes oligonucleotídeos podem compreender mais do queuma molécula.
A amostra que contém a dita variante de seqüência pode serselecionada no grupo que compreende DNA metilado ou não-metilado modi-ficado com bissulfito, RNA metilado ou não-metilado modificado com bissulfi-to, pelo menos um amplicon do DNA metilado ou não-metilado modificadocom bissulfito, pelo menos um amplicon do RNA metilado ou não-metiladomodificado com bissulfito, ou uma combinação deles.
A autocombinação da enzima de ácido nucléico multicomponen-te pode requerer o contato de pelo uma parte de qualquer um dos dois ouambos entre o primeiro e segundo componentes oligonucleotídeos com oácido nucléico que compreende a dita variante de seqüência.
O método pode compreender ainda uma etapa de ampliar o áci-do nucléico que contém a dita variante de seqüência. A etapa de ampliarpode compreender uma ou mais entre: reação de polimerase em cadeia (P-CR), ampliação por deslocamento de filamento (SDA), ampliação isotérmicamediada por alça (LAMP)1 ampliação rotação circular (RCA), ampliação me-diada por transcrição (TMA)1 replicação de seqüências auto-sustentada(3SR), ampliação baseada em seqüências de ácidos nucléicos (NASBA), oureação de polimerase em cadeia com transcrição reversa (RT-PCR). O mé-todo pode compreender ainda a determinação da presença da dita variantede seqüência de ácidos nucléicos durante ou depois da dita ampliação.
O efeito detectável pode ser detectado por espectroscopia defluorescência, ressonância de plasmônios superficiais, espectroscopia demassas, RMN, ressonância spin de elétrons, espectroscopia de polarizaçãoda fluorescência, dicroísmo circular, imunoensaio, cromatografia, radiometri-a, fotometria, cintilografia, métodos eletrônicos, espectroscopia em UV, luzvisível ou no infravermelho, métodos enzimáticos, ou qualquer combinaçãodeles.
O substrato pode compreender uma parte detectável e uma par-te quencher, onde depois da modificação do dito substrato pela dita MNAzi-ma, um efeito detectável é proporcionado pela dita parte detectável é au-mentado ou diminuído.
O substrato pode ser afixado a um suporte insolúvel ou ficar livreem solução.
A modificação pode ser selecionada no grupo que compreendeclivagem, ligação, metalação da porfirina, formação de ligações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida.
O método pode compreender ainda
(a) disponibilizar pelo menos um terceiro componente oligonu-cleotídeo e pelo menos um quarto componente oligonucleotídeo que se au-tocombinam na presença de pelo menos uma variante de seqüência de áci-dos nucléicos adicional, para formar pelo menos uma enzima de ácido nu-cléico multicomponente cataliticamente ativa (MNAzima) adicional;
(b) colocar os ditos pelo menos terceiro e pelo menos quartocomponentes oligonucleotídeos em contato com uma amostra que putativa-mente contém pelo menos uma variante de seqüência de ácidos nucléicosadicional, na presença de pelo menos um substrato adicional capaz de sermodificado pela dita pelo menos uma MNAzima adicional, onde a dita modi-ficação do dito pelo menos um substrato adicional proporciona pelo menosum efeito detectável adicional, sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da pelo meos uma MNAzima, e
(2) a atividade catalítica da pelo menos uma MNAzima; e
(c) detectar o dito pelo menos um efeito detectável adicional,detectando desta forma a presença da dita pelo menos uma variante de se-qüência adicional.
O pelo menos um efeito detectável adicional pode ser detectávelindependentemente.
Os substratos adicionais podem ser iguais, diferentes ou umacombinação deles.
O método compreende ainda disponibilizar um suporte insolúvelque tem o dito substrato afixado a ele.
Pelo menos um entre cada substrato adicional pode ser afixadoa um suporte insolúvel, de tal modo que apenas uma entre uma parte detec-tável e uma parte quencher do substrato adicional permaneça afixada aosuporte quando o dito substrato adicional é modificado pela dita MNAzimaadicional.
De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção, forne-ce-se um método para detectar a presença de uma variante de seqüência deum ácido nucléico, compreendendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeosque compreendem pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo eum segundo componente oligonucleotídeo capazes de se autocombinaremna presença de um ácido nucléico, para formar pelo menos uma primeiraenzima de ácido nucléico multicomponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que putativamente contém o ácido nucléico, napresença de pelo menos um primeiro substrato modificável pela dita pelomenos primeira MNAzima, onde o substrato compreende uma parte detectá-vel capaz de proporcionar pelo menos um primeiro efeito detectável após amodificação do substrato pela dita pelo menos primeira MNAzima, sob con-dições que permitem:
(1) a autocombinação da MNAzima, e
(2) a atividade catalítica da MNAzima; e
(c) onde a ausência da atividade catalítica é indicativa da presença deuma variante de seqüência no dito ácido nucléico.
De acordo com um nono aspecto da presente invenção, fornece-se um método para detectar a presença de pelo menos um ácido nucléicometilado, compreendendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,em que pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segun-do componente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de um ácidonucléico metilado, para formar pelo menos uma enzima de ácido nucléicomulticomponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) disponibilizar pelo menos um primeiro substrato, sendo o ditoprimeiro substrato capaz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, on-de a dita modificação do dito substrato pela dita MNAzima proporciona umefeito detectável;
(c) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que putativamente contém a o ácido nucléico me-tilado, sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da MNAzima, cataliticamente ativa e
(2) a atividade catalítica da MNAzima; e
(d) detectar a presença do dito pelo menos um efeito detectável,detectando desta forma a presença do dito pelo menos um ácido nucléicometilado.
As condições podem compreender ainda uma temperatura quefacilita a hibridização da dita MNAzima com o dito ácido nucléico metilado,mas não com o ácido nucléico não-metilado.O método pode compreender ainda ampliar o efeito detectávelpelo uso de uma cascata de ampliação de efeitos detectáveis. A cascata deampliação de efeitos detectáveis pode compreender uma ou mais entre umcascata de ribozima/ligase, uma cascata circular de enzimas de ácido nu-cléicos, uma cascata de enzimas protéicas, ou uma ou mais enzimas afixa-das a um suporte, ou qualquer combinação delas.
A fonte do ácido nucléico metilado pode ser selecionada no gru-po que compreende uma fonte sintética, mamífera, humana, animal, vegetal,fúngica, bacteriana, Archaea, ou qualquer combinação delas.
O ácido nucléico metilado pode ser selecionado no grupo quecompreende RNA metilado ou DNA metilado.
A autocombinação da enzima de ácido nuléico multicomponentepode requerer o contato do ácido nucléico metilado com um ou ambos entreos ditos primeiro e segundo componentes oligonucleotídeos.
O método pode compreender ainda disponibilizar um suporteinsolúvel que tem pelo menos um entre o dito substrato ou os ditos primeiroou segundo componentes oligonucleotídeos, ou uma combinação deles afi-xado a ele.
A detecção do dito efeito detectável pode ser detectada por es-pectroscopia de fluorescência, ressonância de plasmônios superficiais, es-pectroscopia de massas, RMN, ressonância spin de elétrons, espectroscopiade polarização da fluorescência, dicroísmo circular, imunoensaio, cromato-grafia, radiometria, fotometria, cintilografia, métodos eletrônicos, espectros-copia em UV, luz visível ou no infravermelho, métodos enzimáticos, ou qual-quer combinação deles.
O substrato pode compreender uma parte detectável e uma par-te quencher, onde depois da modificação do dito substrato pela dita MNAzi-ma, um efeito detectável é proporcionado pela dita parte detectável é au-mentado ou diminuído.
A modificação pode ser selecionada no grupo que compreendeclivagem, ligação, metalação da porfirina, formação de ligaçõescarbono-carbono, ligações éster ou ligações amida.O método pode compreender ainda disponibilizar pelo menosum terceiro e quarto componentes oligonucleotídeos, sendo os ditos pelomenos terceiro e o pelo menos quarto componentes oligonucleotídeos capa-zes de se autocombinarem na presença de pelo menos um ácido nucléicometilado adicional, para formar pelo menos uma MNAzima cataliticamenteativa adicional, e
onde pelo menos um substrato adicional está presente na amostra, sendo odito substrato adicional capaz de ser modificado pela dita MNAzima adicio-nal, onde a dita modificação proporciona o dito efeito detectável adicional.
O pelo menos um efeito detectável adicional pode ser detectávelindependentemente.
Cada um dos substratos adicionais podem ser iguais, diferentesou uma combinação deles.
Pelo menos um entre o dito substrato adicional pode ser afixadoa um suporte insolúvel, de tal modo que apenas uma entre uma parte detec-tável e uma parte quencher do substrato adicional permaneça afixada aosuporte quando o dito substrato adicional é modificado pela dita MNAzimaadicional.
De acordo com um décimo aspecto da presente invenção, forne-ce-se um método para detectar pelo menos um facilitador de combinação,usando uma cascata de ampliação, compreendendo
(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeosque compreendem pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo eum segundo componente oligonucleotídeo que se autocombinarem na pre-sença de um primeiro facilitador de combinação, para formar pelo menosuma primeira enzima de ácido nucléico multicomponente cataliticamente ati-va (MNAzima);
(b) disponibilizar um suporte insolúvel que tem pelo menos umprimeiro substrato afixado a ele, sendo o dito primeiro substrato capaz de sermodificado pela dita MNAzima, onde o dito primeiro substrato compreendepelo menos uma terceira molécula que compreende pelo menos uma primei-ra enzima cataliticamente ativa que é liberada depois da modificação do ditoprimeiro substrato pela dita primeira MNAzima;
(c) colocar os ditos dois ou mais componentes oligonucleotídeosem contato com uma amostra que putativamente contém o dito facilitador decombinação, na presença do dito suporte insolúvel que tem o dito primeirosubstrato afixado a ele, sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da MNAzima, e
(2) a atividade catalítica da MNAzima; e
(d) disponibilizar um suporte insolúvel que tem pelo menos umsegundo substrato afixado a ele, sendo o dito segundo substrato clivávelpela dita primeira enzima cataliticamente ativa, onde o dito segundo substra-to compreende pelo menos uma quarta molécula que compreende pelo me-nos uma porção detectável que é liberado depois da modificação do dito se-gundo substrato pela dita primeira MNAzima;
(e) onde a dita primeira enzima cataliticamente ativa modificauma pluralidade de ditos segundo substratos, liberando desta forma uka plu-ralidade de porções detectáveis,
(f) onde as ditas porções detectáveis são detectáveis depois damodificação do dito segundo substrato pela dita primeira enzima catalitica-mente ativa; e
(g) onde a detecção das ditas porções detectáveis é indicativada presença do dito facilitador de combinação.
As porções detectáveis podem compreender ainda uma segundaenzima cataliticamente ativa adicional capaz de modificar o dito primeirosubstrato, liberando desta forma a enzima cataliticamente ativa adicional.Pelo menos entre uma das ditas primeira ou segunda enzima cataliticamenteativa pode ser selecionada no grupo que compreende MNAzimas, DNAzi-mas, ribozimas, enzimas hidrolíticas, endonucleases de restrição, exonucle-ases, proteases, proteinases, hidrolases, liticases, peptidases, dipeptidases,esterases, caspases, catepsinas, dessulfidrases, amidases, glicosidases.
O facilitador de combinação pode compreender um alvo a seridentificado, detectado ou quantificado. O alvo pode ser selecionado no gru-po que compreende ácidos nucléicos, proteínas, glicoproteínas, lipídeos,lipoproteínas, células, vírus, bactérias, Archaea, fungos, anticorpos, metabó-litos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequenas, po-límeros, íons metálicos, sais metálicos, príons ou quaisquer derivados, par-tes ou combinações deles.
O ácido nucléico pode ser selecionado no grupo que compreen-de DNA, DNA metilado, DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA,SiRNA1 shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré- e primicroRNA,outros RNAs não-codificadores, RNA ribossômico, derivados deles, ampli-cons deles, ou qualquer combinação deles. De acordo com um décimo pri-meiro aspecto da presente invenção, fornece-se um método para detectarum alvo usando uma cascata de ampliação sinais mediada pela MNAzima,compreendendo
(a) disponibilizar primeiro componente oligonucleotídeo e umsegundo componente oligonucleotídeo que se autocombinam na presençado dito alvo, para formar uma primeira enzima de ácido nucléico multicom-ponente cataliticamente ativa (MNAzima);
(b) disponibilizar um suporte insolúvel que tem um primeiro subs-trato e um segundo substratos afixados a ele, sendo que os ditos primeiro esegundo substratos são capazes de serem modificados pela dita primeiraMNAzima, onde os ditos primeiro e segundo substratos compreendem pelomenos um terceiro e um quarto componentes oligonucleotídeos, respectiva-mente, capazes de formar uma segunda MNAzima cataliticamente ativa, on-de os ditos terceiro e quarto componentes oligonucleotídeos são liberadosdepois da modificação do ditos primeiro e segundo substratos pela dita pri-meira MNAzima; e
(c) Proporcionar um dito suporte insolúvel que tem um terceiro eum quarto substratos afixados a ele, sendo que os ditos terceiro e quartosubstratos são capazes de serem modificados pela diat segunda Maazima,onde os ditos terceiro e quarto substratos compreendem pelo menos umquinto e um sexto componente oligonucleotídeoo respectivamente, capazesde formar uma técnica MNAzima cataliticamente ativa, onde os ditos quinto esexto componentes oligonucleotídeos são liberados depois da modificaçãodos ditos terceiro e quarto substratos pela dita segunda MNAzima1 e;
(d) disponibilizar um facilitador de combinação capaz de facilitara combinação da dita segunda e da dita terceira MNAzima, e(e) disponibilizar um quinto substrato que é capaz de ser modificado peladita segunda MNAzima para proporcionar um efeito detectável;
(f) colocar os ditos primeiro e segundo componentes oligonu-cleotídeos em contato com uma amostra que putativamente contém o ditoalvo, na presença do dito facilitador de combinação, e na presença do ditosuporte insolúvel que tem os ditos primeiro, segundo, terceiro e quarto subs-tratos afixados a ele, sob condições que permitem:
(1) a autocombinação da dita primeira, segunda e terceira MNAzimas, e
(2) a atividade catalítica das ditas primeira, segunda e terceira MNAzimas; e
(g) onde a dita terceira MNazima modifica os ditos primeiro esegundo substratos, para desta forma produzir ainda a dita segunda MNA-zima, onde a dita segunda MNAzima modifica ainda pelo menos um entre osditos terceiro, quarto e quinto substratos, para desta forma produzir a ditaterceira MNAzima, para desta forma proporcionar ainda o dito efeito detectá-vel, e
(h) onde a detecção do dito efeito detectável é indicativa da pre-sença do dito alvo.
O alvo pode ser identificado, detectado ou quantificado. O alvopode ser selecionado no grupo que compreende ácidos nucléicos, proteínas,glicoproteínas, lipídeos, Iipoproteínas, células, vírus, bactérias, Archaea,fungos, anticorpos, metabólitos, patógenos, toxinas, contaminantes, vene-nos, moléculas pequenas, polímeros, íons metálicos, sais metálicos, príonsou quaisquer derivados, partes ou combinações deles. O ácido nucléico po-de ser selecionado no grupo que compreende DNA, DNA metilado, DNA al-quilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA,snoRNA, stRNA, smRNA, pré- e primicroRNA, outros RNAs não-codificadores, RNA ribossômico, derivados deles, amplicons, ou qualquercombinação deles.
O quinto substrato pode ser igual ou diferente a qualquer um dosditos primeiro, segundo, terceiro ou quarto substratos.
Cada um dos ditos primeiro, segundo, terceiro ou quarto substra-tos pode estar presente no mesmo suporte sólido ou em suportes sólidosdiferentes, ou qualquer combinação deles.
A modificação de pelo menos um entre os ditos primeiro, segun-do, terceiro ou quarto substratos pode proporcionar ainda um efeito detectá-vel.
De acordo com um décimo segundo aspecto da presente inven-ção, fornece-se um método para produzir uma pluralidade de de enzimas deácidos nucléicos multicomponentes (MNAzimas) que reconhecem pelo me-nos um facilitador de combinação e modificam um substrato, sendo que ométodo compreende:
(a) disponibilizar uma pluralidade de facilitadores de combinação a seremidentificados, detectados ou quantificados,
(b) desenhar dois ou mais componentes oligonucleotídeos, onde pelo menosum primeiro componente oligonucleotídeo e um segundo componente oligo-nucleotídeo se autocombinam na presença de um facilitador de combinação,para formar uma enzima de ácido nucléico multicomponente cataliticamenteativa (MNAzima), onde cada um entre o pelo menos primeiro e segundocomponentes oligonucleotídeos compreendem uma parte ramificada desubstrato, uma parte de núcleo catalítico, e uma parte ramificada de sensor,onde depois da autocombinação, a parte do braço sensor do primeiro e se-gundo componentes oligonucleotídeos formam braços sensores da MNAzi-ma, a parte ramificada de substrato do primeiro e segundo componentesoligonucleotídeos formam os braços de substrato da MNAzima, e a parte donúcleo catalítico do primeiro e segundo componentes oligonucleotídeo for-mam um núcleo catalítico da MNazima;
e onde os braços sensores da MNAzima interagem com um facilitador decombinação de modo a manter o primeiro e segundo componentes oligonu-cleotídeos próximos para associação das suas respectivas partes de núcleocatalítico, para formar o núcleo catalítico da MNAzima, sendo o dito núcleocatalítico capaz de atuar sobre pelo menos um substrato, e onde os braçosde substrato da MNAzima engatam um substrato de tal modo que o núcleocatalítico da MNAzima possa modificar o dito substrato;
(c) alterar os ditos dois ou mais componentes oligonucleotídeos, de tal modoque a parte ramificada de substrato e a parte do núcleo catalítico do primeiroe segundo componentes oligonucleotídeos sejam constantes, e a parte rami-ficada de sensor de pelo menos um entre o primeiro e o segundo componen-tes oligonucleotídeos seja adaptada para reconhecer outro entre uma plura-lidade de facilitadores de combinação, e
(d) repetir a etapa de alterar para cada um da pluralidade de facilitadores decombinação.
De acordo com um décimo terceiro aspecto da presente inven-ção, fornece-se um kit para detectar a presença de uma pluralidade de al-vos, compreendendo uma pluralidade de componentes oligonucleotídeosdesenhados para combinar uma pluralidade de MNAzimas, cada uma cor-respondente a pelo menos um entre uma pluralidade de alvos, e pelo menosum substrato.
De acordo com um décimo quarto aspecto da presente inven-ção, fornece-se um kit para combinar uma pluralidade de MNAzimas, com-preendendo uma pluralidade de facilitações de combinação,uma pluralidadede componentes desenhados para combinar uma pluralidade de MNAzimas,cada uma correspondendo a cada da pluralidade de facilitadores de combi-nação, e pelo menos um substrato.
De acordo com um décimo quinto aspecto da presente invenção,fornece-se um kit para detectar um alvo, compreendendo uma pluralidade decomponentes oligonucleotídeos desenhados para combinar uma MNAzimacorrespondente ao alvo, e um substrato.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Uma modalidade preferida da presente invenção será agoradescrita apenas a título exemplificativo, fazendo referência aos desenhosanexos, onde:
A Figura 1 é um desenho de uma MNAzima ilustrada em umarepresentação de de um desenho exemplificativo de uma MNAzima, onde aspartes ramidicada de substrato (A) de partizimas A e B se ligam a um subs-trato repórter, ao qual está afixado um rotulador fluorescente (à esquerda) eum quencher (à direita). As partes do núcleo catalítico (C) ficam localizadasentre as partes ramidicada de substrato (A) e as partes ramidicada de sen-sor (B). Depois da ligação das partes ramidicada de sensor (B) a um Alvo, osubstrato repórter é clivado no Sítio de Clivagem da MNAzima, aumentandodesta forma a fluorescência.
A Figura 2 indica as estratégias para a detecção de alvos medi-ada pela MNAzima, e ilustra um fluxograma que indica as aplicações exem-plificativas de métodos para a detecção de alvos, usando MNAzimas. AsMNAzimas podem ser usadas para (1) detecção direta; (2) detectar ampli-cons gerados, por exemplo, por PCR, SDA, LAMP, RCA, TMA, 3SR ouNASBA durante ou após a ampliação; e (3) iniciar uma cascata de ampliaçãode sinais.
A Figura 3 ilustra o método para detecção de alvos, usando umaMNAzima e substratos genéricos ancorados, indicando uma representaçãode MNAzimas exemplificativas e um método para a detecção de alvos usan-do MNAzimas que clivam substratos amarrados a um suporte. Nesta moda-lidade, a MNAzima se forma apenas na presença de um facilitador de com-binação (alvo). Quando a MNAzima cliva o substrato amarrado entre um flu-oróforo e um quencher, um sinal é gerado. Como ilustrado neste caso, de-pois da clivagem entre o fluoróforo Feo quencher Q, há um aumento resul-tante na fluorescência. Geralmente, o método pode ser desenhado de talmodo que o fluoróforo F ou o quencher Q possa ficar afixado ao suporte de-pois de ocorrer a clivagem. Quadro (i): O suporte ilustrado tem apenas umsubstrato amarrado a ele. Quadro (ii): Pode haver múltiplos substratos amar-rados em diferentes posições. Cada substrato pode ser clivado apenas poruma MNAzima formada na presença de uma molécula facilitadora de combi-nação da MNAzima específica - neste caso, os Alvos 1 e 2 facilitam a auto-combinação das MNAzimas 1 e 2, respectivamente. Assim sendo, neste e-xemplo, a MNAzima 1 apenas se autocombina na presença do Alvo 1 e clivaapenas o Substrato 1. Similarmente, a MNAzima 2 apenas se autocombinana presença do Alvo 2 e cliva apenas o Substrato 2. O sinal pode ser locali-zado pelo posicionamento do substrato sobre a superfície, permitindo assima detecção de diferentes facilitadores de combinação.
A Figura 4 representa métodos exemplificativos para detecçãode alvos; estão ilustrados exemplos de métodos que usam uma MNAzimapara detectar analisado-alvo (An), por exemplo, incluindo, porém sem limita-ções, uma proteína ou molécula pequena. Este exemplo ilustra a geração deum sinal pela clivagem pela MNazima de um substrato rotulado com um fluo-róforo (F) e um quencher (Q). Desenhos gerais poderiam ser usados em ou-tros formatos, pelos quais o sinal é gerado por uma modificação diferente daclivagem e/ou os quais a leitura não é fluorescente, mas, por exemplo, é clo-rimétrica, radioativa etc. Três estratégias genéricas estão ilustradas nestafigura, (i) Um aptâmero para ligar um analisado-alvo é ligado a uma partizi-ma (uma apta-partizima). Esta molécula tem autocomplementaridade, e nãocosegue contribuir para ativar a a combinação da MNAzima na ausência doanalisado-alvo. Uma segunda partizima, um substrato e um facilitador decombinação também são fornecidos. Quando um analisado-alvo específicose liga ao domínio do aptâmero, as bases complementares dentro da apta-partizima se separam, permitindo que a apta-partizima adote uma conforma-ção pela qual ela pode contribuir para a combinação da MNAzima ativa. AMNAzima ativa pode clivar o substrato e gerar fluorescência. (ii) Um aptâme-ro para ligar um analisado-alvo é ligado a um facilitador de combinação. Estamolécula tem autocomplementaridade, e não consegue direcionar as parti-zimas para se alinharem e combiner uma MNAzima ativa na ausência doanalisado-alvo. Duas partizimas e um substrato também são fornecidos.Quando um analisado-alvo específico se liga ao domínio do aptâmero, asbases complementares dentro do facilitador de combinação se separam,permitindo que o facilitador de combinação adote uma conformação pelaqual ele consegue direcionar a combinação das MNAzimas ativas. As MNA-zimas ativas podem clivar o substrato e gerar fluorescência. (iii) Duas apta-partizimas, cada uma contendo uma parte de um aptâmero, são incubadasna presença de um substrato. Na ausência do analisado-alvo, as duas apta-partizimas não conseguem se combinar para formar uma MNAzima ativa.Quando um analisado-alvo específico está presente, e se liga a ambos do-mínios que contêm uma parte do aptâmero.as duas apta-partizimas são a-proximadas e podem se combinar em uma MNAzima ativa. A MNAzima ativapode clivar o substrato e gerar fluorescência.
A Figura 5 ilustra a ampliação por PCR de microRNAs e a de-tecção usando MNAzimas1 ilustrando uma representação de de uma estra-tégia de MNAzima para ampliação e detecção de seqüências curtas, taiscomo espécies micro-RNA (miR). O método usa um iniciador 3' que se ligaao miR na extremidade 3' e que tem uma seqüência de extensão não-relacionada (ilustrada nos quadros tracejados) que pode (partes (i) e (ii), Ini-ciador de Alça, à esquerda), ou não pode (partes (iii) e (iv), iniciador Rotula-do, à direita), formar uma estrutura tronco-alça na extremidade 5'. O iniciador3' miR é estendido na presença de transcriptase reversa (partes (i) e (iii), eem seguida, ampliação por intermédio de PCR usando iniciadores 5'e 3' coma seqüência específica de miR nas extremidades 3' e a seqüência de exten-são não-relacionada nas extremidades 5' (partes (ii) e (iv)). Os ampliconspodem ser detectados por MNAzimas, que hibridizam para o amplicon, inclu-indo a região entre os iiciadores de 5' e 3'. Um requisito para a complemen-taridade estrita dos braços sensores das MNAzimas e o ácido nucléico alvopermite a discriminação de seqüências intimamente relacionadas. F: fluoró-foro; Q: quencher.
A Figura 6 representa a detecção de MNAzima acoplada à am-pliação de sinais mediada por enzima, ilustrando uma representação de umaMNAzima para iniciar uma cascata de ampliação de sinais. Nesta modalida-de, as MNAzimas disparam uma cascata de geração de sinais a jusante,onde (da esquerda para a direita, quadro de cima) uma MNAzima se formaapenas na presença de um alvo e depois libera uma enzima a partir de umaposição de amarração sobre um suporte. Como ilustrado no quadro de bai-xo, a enzima liberada, então, cliva uma molécula de substrato fluorescente.O substrato fluorescente é detectado facilmente. F: fluoróforo; Q: quencher.
A Figura 7 representa a detecção de analisados usando MNAzi-mas e ampliação de sinais, onde uma MNAzima pode disparar uma cascatagerada usando DNAzimas espacialmente separadas. Como ilustrado nasetapas numeradas seqüencialmente, um episódio de clivagem inicial pelaMNAzima, que ocorre apenas na presença de um alvo, pode clivar o subs-trato imobilizado, liberando uma primeira DNAzima amarrada A ("A") (etapas1-3). DNAzima A, depois de liberada, cliva e libera a segunda DNAzima a-marrada B ("B") (rotulada com fluoróforo) (etapas 4-6) que, por sua vez, clivae libera uma DNAzima A adicional (etapas 7-8), resultando na iniciação deuma cascata. A ampliação exponencial dos sinais torna fácil a medição, poisa DNAzima B com fluoróforo é liberada na cascata ulterior. F: fluoróforo; Q:quencher.
A Figura 8 ilustra o desenho de MNAzimas para o alvo RPLPO:Quadro (i): Seqüências exemplificativas para os desenhos 1 (quadro superi-or) e 2 (quadro inferior) para MNAzimas; Quadro (ii): Resultados da clivagemdependente do alvo de um substratorepórter pela MNAzima dos desenhos 1(quadro superior) e 2 (quadro inferior). N=A, G, C, T ou qualquer análogo;N'=qualquer nucleotídeo complementar a Ν; (N ou N')x= qualquer número dede nucleotídeos ou análogos; K=A, G ou AA; W=A ou T; rN= qualquer ribo-nucleotídeo e/ou qualquer número de ribonucleotídeos; *= base com oscila-ção (" wobble") no pareamento de bases.
A Figura 9 ilustra o desenho de MNAzimas para o alvo RPLPO:Quadro (i): Seqüência exemplificativa para o desenho 3 para uma MNAzima;Quadro (ii): Resultados para a clivagem dependente do alvo de um substra-torepórter. As reações de controle ilustradas incluem controle de hibridizaçãosem alvo, dois controles fora do alvo e reações que contêm os oligonucleotí-deos da partizima A ou a partizima B, mas não ambas. N=A, G, C, T ouqualquer análogo; N'= qualquer nucleotídeo complementar a Ν; (N ou N')x=qualquer número de nucleotídeos ou análogos; K=A, G ou AA; W=A ou T;rN= qualquer ribonucleotídeo e/ou qualquer número de ribonucleotídeos; * =base wobble.
A Figura 10 ilustra o desenho de MNAzima para o alvo RPLPO:Quadro (i): Seqüência exemplificativa para o desenho 4 para uma MNAzima;Quadro (ii): Eficiência da clivagem dependente do alvo para os desenhos 3 e4. Os resultados estão ilustrados para reações que contêm os oligonucleotí-deos-alvo RPLPO, e os controles sem alvo. N=A, G, C, T ou qualquer análo-go; N'= qualquer nucleotídeo complementar a Ν; (N ou N')x= qualquer núme-ro de nucleotídeos ou análogos; K=A, G ou AA; W=A ou T; rN= qualquer ri-bonucleotídeo e/ou qualquer número de ribonucleotídeos; *= base wobble.
A Figura 11 ilustra o uso de MNAzimas para discriminar entreseqüências intimamente relacionadas: Quadro (i): Seqüências de DNA, ho-mólogos de seqüências de hsa-miR-20 e miR relacionadas, usadas comoseqüência-alvo nos experimentos nas Figuras 11 e 12 estão ilustradas. Asdiferenças em seqüência entre D-20 D-miRs relacionadas estão sublinha-das. A linha tracejada vertical em negrito separa as regiões dos oligonucleo-tídeos reconhecidos pelos dois braços sensores. Quadro (ii): Representaseqüências exepificativas para uma MNAzima do desenho 4 para detecçãode miR-20. Quadro (iii): Resultados para a clivagem dependente do alvo pelaMNAzima D-20 de um substratorepórter. Reações de controle ilustradas:oligonucleotídeos "fora do alvo" (D-17-5p, D-106a, D-106b, D-93), e reaçõesde controle "nenhum alvo" (dH20).
A Figura 12 ilustra a otimização com MgCI2 do sistema de MNA-zima MiR-20: Resultados obtidos usando um sistema de MNAzima com de-senho exemplificativo 4 para detecção de miR-20. A clivagem dependentedo alvo (D-20) de um substratorepórter. As reações de controle que contêmseqüências "fora do alvo" (D-17-5p, D-106a, D-106b, D-93) ou "sem alvo"(dH20), estão ilustradas para reações que contêm MgCI2 (i) 5 mM, (ii) 25 mMou (iii) 100 mM, respectivamente.
A Figura 13 ilustra o desenho de MNAzima para o alvo RPLPO:Quadro (i): Seqüências exemplificativas para os desenhos 5 e 6 para MNA-zimas. Quadro (ii): Resultados para clivagem dependente do alvo de umsubstratorepórter, usando os desenhos 5 e 6, e seus controles "sem alvo".N=A, G, C, T ou qualquer análogo; N'= qualquer nucleotídeo complementara Ν; (N ou N')x= qualquer número de nucleotídeos ou análogos; R=A ou G;Y=C ou U; rN= base de ribonucleotídeo.A Figura 14 ilustra a detecção de RPLPO ampliado por PCR:Resultados para a clivagem dependente do alvo de um substratorepórter evárias reações de controle pelo sistema de MNAzima do desenho 4 que as-sesta o gene de RPLPO humano. A reação de MNAzima de RPLPO conti-nha (i) oligonucleotídeos RPLPO de controle, (ií) amplicons da PCR de R-PLPO (5 μΙ) produzidos por ampliação do DNA genômico humano (100 ng),usando iniciadores complementares ao gene de RPLPO, (iii) reações dePCR de RPLPO "sem alvo" que carecem do DNA genômico ou (iv) DNA ge-nômico humano não-ampliado (500 ng).
A Figura 15 ilustra a detecção de seqüências curtas ampliadas(22 meros): Quadro (i): Resultados para a clivagem dependente do alvo deum substratorepórter por um sistema de MNAzima do desenho 4 que asses-ta a seqüência de miR-20 humano. As reações da MNAzima MiR-20 foramrealizadas com (i) 1012 (1 E+12) cópias do oligonucleotídeo de controle do Alvo D-20 (não ampliado); (ii) amplicons de PCR (5 μί) produzidos por am-pliação de 2 χ 107 (2 E+7) cópias do oligonucleotídeo-alvo D-20, usando ini-ciadores complementares às seqüências de miR-20; (iii) reações de PCR"sem alvo" que carecem do oligonucleotídeo-alvo D-20; (iv) 10® (1 E+8) có-pias do oligonucleotídeo-alvo D-20 (não ampliado); e (v) um alvo-controle"fora do alvo" D-17-5p (2 χ 107 (2 E+7) cópias ampliadas or PCR). Quadro(ii): Comparação da seqüência do Alvo D-20 e a seqüência fora do alvo, D-17-5p. O oligonucleotídeo D-17-5p tem um desemparelhamento na região deligação do iniciador da PCR em relação à seqüência do Alvo D-20, e um de-semparelhamento na região (localizada entre os iniciadores) que é interro-gada pelos braços sensores das MNAzimas.
A Figura 16 ilustra a detecção de amplicons de miR-20 amplia-dos: Exemplo da detecção no ponto final de amplicons, usando MNAzimasapós ampliação por PCR. A PCR foi usada para ampliar microRNA mir-20presente no RNA total de células do timo humano, e detectados usando a metodologia de MNAzimas. As amostras ampliadas e os controles são comoilustrados.
A Figura 17 representa a análise quantitativa por PCR em temporeal do éxon 5 de RPLPO pela MNAzima do desenho 6: Exemplo da detec-ção em tempo real e quantificação usando a metodologia de MNAzima, ondeo gene de RPLPO foi detectado usando MNAzimas para monitorar a acumu-lação do éxon 5 de RPLPO. Quadro (i): desenho da MNAzima 6; Quadro (ii):sinal de fluorescência que indica a PCR em tempo real para diferentes quan-tidades do modelo, como indicado; Quadro (iii): curva-padrão e quantificaçãodo material ampliado. Os resultados indicam o aumento dependente do tem-po na fluorescência para detecção por MNAzima do DNA genômico humanoampliado por intermédio de PCR. R2=0,995; inclinação =-3,698.
A Figura 18 é uma representação esquemática de uma análisemultiplex exemplificativa de múltiplos alvos: Dois ou mais alvos podem serdetectados simultaneamente usando dois ou mais substratos, cada um es-pecífico para uma MNAzima. Os substratos são rotulados, de preferência,com fluoróforos diferentes. Neste exemplo, o alvo 1 pode ser detectado mo·nitorando o aumento na fluorescência FAM, e o Alvo 2 pode ser detectadomonitorando o aumento na florescência JOE. Q: quencher, FAM, JOE: fluo-róforos.
A Figura 19 representa a detecção única e multiplex de seqüên-cias de RPLPO e D-20: A detecção de RPLPO foi monitorada um substratorotulado com JOE, e a detecção do Alvo D-20 foi monitorada usanso umsubstrato rotulado com FAM. Quadro (i): MNAzima do desenho 6 compreen-de partizimas para apenas um sistema de MNAzima, para RPLPO (quadrosuperior) ou D-20 (quadro inferior); Quadro (ii): MNAzima desenho 6 contémpartizimas para MNAzimas que assestam RPLPO e também D-20.
A Figura 20 representa a detecção com MNAzima de alvos, u-sando um aptâmero: Uma estratégia exemplificativa para a detecção de umalvo está representada. Nesta estratégia, uma seqüência de aptâmero é in-corporada na extremidade de uma partizima (apta-partizima) em uma confi-guração pela qual uma MNAzima ativa é formada apenas na presença doalvo. Os componentes oligonucleotídeos necessários para a estratégia dedetecção com MNAzima ilustrada incluem: (a) uma partizima-padrão; (b)uma apta-partizima que é uma partizima com um aptâmero incorporado emuma das suas extremidades; (c) um facilitador de combinação que se liga àapta-partizima e também à partizima, permitindo a combinação de umaMNAzima ativa (na presença do alvo); (d) uma sonda de substratorepórter; e(e) um inibidor de combinação que hibridiza para a apta-partizima em umaregião que cobre pelo menos parte da seqüência do aptâmero e parte dobraço de ligação do substrato da seqüência da partizima. Na ausência de umanalisado-alvo (Quadro (i)), o inibidor de combinação se liga à apta-partizima, bloqueando assim a ligação (e a clivagem) do substrato de sondarepórter. Na presença de um analisado-alvo (Quadro (II)), o alvo se liga àseqüência do aptâmero da apta-partizima, impedindo a ligação do inibidor decombinação e permitindo a ligação e a clivagem do substrato da sonda re-pórter. Assim sendo, as MNAzimas apenas conseguem se formar e causar ageração de sinais fluorescente na presença do alvo.
A Figura 21 ilustra a detecção com MNAzima de moléculas pe-quenas usando um aptâmero: Um exemplo do uso de MNAzimas para a de-tecção de alvos, especificamente ATP, está representado. A estratégia ilus-trada na Figura 20 foi demonstrada usando o exemplo de detecção de umamolécula pequena, ATP. O Quadro (i) ilustra as seqüências dos componen-tes oligonucleotídeos que foram usados para a detecção de ATP. Eles com-preendem uma partizima, uma apta-partizima (que incorpora um aptâmeropara ligar ATP), um inibidor da combinação aptâmero/MNAzima, um substra-torepórter e um facilitador de combinação. Quadro (ii) Análise da ClivagemSubBi-1-FB ilustra os resultados obtidos depois da incubação dos compo-nentes oligonucleotídeos na presença, ou ausência, de ATP e outros nucleo-tídeos. Um aumento na fluorescência no decorrer do tempo foi observado napresença de ATP, e dATP, mas não na presença de GTP ou CTP. Além dis-so, nenhum aumento na fluorescência foi observado na ausência de qual-quer alvo (controle com apenas água).
A Figura 22 ilustra a detecção de desemparelhamentos de ape-nas uma base usando MNAzimas: Está representado um exemplo do uso deMNAzimas para a detecção de desemparelhamentos de uma única base. OQuadro (i) ilustra as seqüências dos componentes oligonucleotídeos queforam usados para a detecção de desemparelhamentos de uma única baseem uma seqüência-alvo éxon 5 de RPLPO. O oligonucleotídeo ilustradocompreendia duas partizimas (A5 e B6), que são baseadas na MNAzima dodesenho 7 (por exemplo, Exemplo 20), e um substratorepórter. A terceirabase (X) no braço sensor da partizima B é emparelhada ou desemparelhadacom a seqüência-alvo. When X = G, a partizima e o alvo estão completa-mente emparelhados. Quando X= C, há um desemparelhamento entre obraço sensor e o alvo RPLPO. O Quadro (II) indica os resultados obtidosdepois da ampliação por PCR e a detecção em tempo real em reações quecontêm uma partizima B que é completamente emparelhada, ou é desempa-relhada, em relação ao alvo RPLPO.
A Figura 23 representa a estratégia com MNAzima e os resulta-dos para a detecção de SNP: O método usa um braço sensor da partizima Btruncada é completamente emparelhada a uma versão de SNP, e um oligo-nucleotídeo estabilizador que facilita a combinação da MNAzima na presen-ça do alvo completamente emparelhado. O requerimento para estrita com-plementaridade da braço sensor da partizima Beo ácido nucléico-alvo per-mite a discriminação de seqüências intimamente relacionadas. Quadro (i):Braço sensor de 5 bases completamente emparelhado mais oligonucleotídeoestabilizador; Quadro (ii): Braço sensor de 5 bases desemparelhado maisoligonucleotídeo estabilizador; Quadro (iii): Nenhum controle do estabiliza-dor; Quadro (iv): No controle do alvo; Quadro (v): Resultados da detecção daMNAzima SNP com alvo completamente emparelhado, alvo desemparelha-do, nenhum controle do estabilizador e nenhum controle do alvo.
A Figura 24 representa uma adaptação da detecção com MNA-zima para produzir uma reação de mudança de cor: O método usa partículasde outro nanométricas com oligonucleotídeos anexados, as quais, quandoligadas por oligonucleotídeos em ponte, formam um agregado azul (quadroi). Os oligonucleotídeos em ponte incorporam uma seqüência de substrato.Na presença do alvo (quadro ii), a MNAzima se combina e cliva a seqüênciado substrato, liberando partículas de ouro individuais, e resultando em umamudança de cor de azul para vermelho que é visível a olho nu.A Figura 25 é um exemplo de uma cascata de MNAzimas, usan-do partizimas amarradas: MNAzimas podem ser usadas para iniciar casca-tas de ampliação de sinais, como ilustrado neste diagrama. A reação contémos seguintes elementos: (i) partizimas para a MNAzima 1 que estão livresem solução; (ii) um facilitador de combinação para as MNAzimas 2 e 3 (quetêm os mesmos braços sensores), que está livre em solução (como ilustra-do) ou amarrado a um suporte insolúvel pelo substrato, Sub 1; (iii) partizimaspara a MNAzima 2, que estão amarradas a um suporte insolúvel pelo subs-trato, Sub 1. Sub 1 pode ser clivado pela MNAzima 1 (na presença de umalvo) ou MNAzima 3 (na presença de um facilitador de combinação), e a cli-vagem resulta na liberação das partizimas para MNAzima 2 em solução; (iv)partizimas para a MNAzima 3, que estão amarradas a um suporte insolúvelpelo substrato, Sub 2. Sub 2 pode ser clivado pela MNAzima 2 (na presençade um facilitador de combinação) e a clivagem resulta na liberação das parti-zimas para a MNAzima 3 em solução; (v) Sub 2-FQ, que tem a mesma se-qüência que Sub 2, mas está livre em solução e é duplamente rotulado comum fluoróforo (F) e um quencher (Q). Sub 2-FQ pode ser clivado pela MNA-zima 2 para gerar um sinal fluorescente. Na presença do alvo, a MNAzima 1ativa se forma a partir de partizimas que estão livres em solução. A MNAzi-ma 1 cliva seu Sub 1, liberando assim as partizimas para a MNAzima 2. De-pois de livres, estas partizimas hibridizam com o facilitador de combinação eformam a MNAzima 2, que cliva Sub 2-FQ livre (gerando um sinal fluores-cente), ou Sub 2 amarrado (liberando as partizimas para a MNAzima 3).Como a MNAzima 3 cliva os mesmos braços de substrato que a MNAzima 1,ela pode clivar também Subi amarrado, liberando assim mais partizimaspara MNAzima 2. Isto resulta em uma cascata de geração enzimática doscomponentes (partizimas) para mais enzimas (MNAzimas) e uma concomi-tante cascata de ampliação de sinais.
DEFINIÇÕES
São utilizados aqui certos termos cujos significados estão enun-ciados abaixo.
O termo "compreendendo" significa "incluindo principalmente,mas não necessariamente unicamente". Além disso, as variações da palavra"compreendendo", tais como "compreender" e "compreende", têm significa-dos correspondentemente variados.
Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucléico" e "oligonucleotí-deo" podem ser utilizados de forma intercambiável e referem-se a um polí-mero de filamento único ou filamento duplo de bases de desoxirribonucleotí-deo ou ribonucleotídeo, ou análogos, derivados, variantes, fragmentos oucombinações deles, incluindo, porém sem limitações, DNA, DNA metilado,DNA alquilado, RNA, RNA metilado, microRNA, siRNA, shRNA, tRNA, mR-NA, snoRNA, stRNA, smRNA, pré- e primicroRNA, outros RNAs não-codificadores, RNA ribossômico, derivados deles, amplicons deles, ou qual-quer combinação deles. A título exemplificativo não-limitativo, a fonte de umácido nucléico pode ser selecionada no grupo que compreende uma fontesintética, mamífera, humana, animal, vegetal, fúngica, bacteriana, Archaea,ou qualquer combinação delas.
Os termos "oligonucleotídeo" e "iniciador" denotam tipicamenteum segmento de DNA ou uma molécula de ácido nucléico que contém DNA,ou RNA ou molécula que contém RNA, ou uma combinação deles. Os e-xemplos de oligonucleotídeos incluem alvos de ácidos nucléicos; substratos,por exemplo, aqueles que podem ser modificados por uma MNAzima; inicia-dores tais como aqueles usados para ampliação do alvo in vitro por métodostais como PCR; e componentes de MNAzimas. Os facilitadores de combina-ção de MNAzimas, em certas modalidades, podem compreender oligonucle-otídeos como aqui definidos. As partizimas, como aqui utilizadas, tambémpodem compreender oligonucleotídeos.
Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucléico" e "oligonucleotí-deo" incluem referência a qualquer seqüência especificada, bem como a se-qüência complementar a ela, a menos que diferentemente indicado. Os oli-gonucleotídeos podem compreender pelo menos uma adição ou substitui-ção, incluindo, porém sem limitações, o grupo que compreende 4-acetilcitidina, 5-(carbóxi-hidróxi-metil)-uridina, 2D-0-metil-guanosina, inosina,N6-isopentenil-adenosina, 1-metil-adenosina, 1-metil-pseudouridina, 1-metil-guanosina, 1-metil-inosina, 2,2-dimetil-guanosina, 2-metil-adenosina, 2-metil-guanosina, 3-metil-citidina, 5-metil-citidina, N6-metil-adenosina, 7-metil-guanosina, 5-metil-amino-metil-uridina, 5-metóxi-amino-metil-2-tiouridina,beta-D-manosil-metil-uridia, 5-metóxi-carbonil-metil-uridina, 5-metóxi-uridina,2-metil-tio-N6-isopentenil-adenosina, N-((9-beta-ribofuranosil-2-metil-tiopurin-6-il)-carbamoil)-treonina, N-((9-beta-ribofuranosil-purin-6-il)-N-metil-carbamoil)-treonina, uridino-5-oxoacetato de metila, ácido uridino-5-oxiacético (v), wibutosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metil-uridina, N-((9-beta-ribofuranosil-purin-6-il)-carbamoil)-treonina, 2D-0-metil-5-metil-uridina, 2D-0-metil-uridina, wybutosina, 3-(3-amino-carbóxi-propil)-uridina, beta-D-arabinosil-uridina, beta-D-arabinosil-timidina.
Os termos "molécula de ácido nucléico catalítico", "ácido nucléi-co catalítico", "enzima de ácido nucléico" e "seqüência de ácido nucléico ca-talítico" são aqui utilizados de forma intercambiável e devem significar umamolécula de DNA ou molécula que contém DNA (conhecida também nessastécnicas como "enzima de DNA", "desoxirribozima" ou "DNAzima"), ou umRNA ou molécula que contém RNA (conhecida nessas técnicas tambémcomo uma "enzima de RNA" ou "ribozima"), ou uma combinação deles, sen-do uma molécula híbrida de DNA-RNA, que pode reconhecer um substrato ecatalisam uma modificação do substrato. Os resíduos de nucleotídeos nosácidos nucléicos catalíticos podem incluir as bases A, C, G, T, e U, bem co-mo derivados e análogos deles.
O termo "derivado", quando utilizado com relação a um ácidonucléico ou nucleotídeo da presente invenção inclui quaisquer ácidos nucléi-cos ou nucleotídeos funcionalmente equivalentes, incluindo quaisquer molé-culas de fusão produzidas integralmente (por exemplo, por meios recombi-nantes) ou adicionadas após a síntese (por exemplo, por meios químicos).Tais fusões podem compreender oligonucleotídeos da invenção com RNAou DNA adicionados a elas ou conjugados a a um polipeptídeo (por exem-plo, puromicina our outro polipeptídeo), uma molécula pequena (por exem-plo, psoraleno) ou um anticorpo.O termo "análogo", quando utilizado com relação a um ácido nu-cléico ou nucleotídeo inclui um composto que tem uma estrutura física queestá relacionada a uma molécula ou resíduo de DNA ou RNA1 pode ser ca-paz de formar uma ponte hidrogênio com um resíduo de DNA ou RNA ou umanálgo dele (isto é, ele é capaz de anelar com um resíduo de DNA ou RNAou um seu análogo para formar um par de bases), mas tal ligação não é ne-cessária para que o dito composto esteja englobado dentro do termo "análo-go". Tais análogos podem possuir propriedades químicas e biológicas dife-rentes do resíduo de ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo ao qual elesestão estruturalmente relacionados. Os resíduos metilados, iodados, broma-dos ou biotinilados são exemplos de análogos. Foram descritas DNAzimasativas que contêm análogos de nucleotídeos, incluindo desoxiinosina, C-5-imidazol desoxiuridina, 3-(amino-propinil)-7-desaza-dATP, 2'-0-metil-RNA, 2'O-metil cap (Warashina et al., 1999; Cairns et al., 2003; Schubert et ai,2004; Sidorov et al., 2004). Outros análogos são compatíveis com a ativida-de catalítica de DNAzimas. A alteração de uma seqüência de ácido nucléicocatalítico, por exemplo, pela substituição de uma base por outra, pela substi-tuição de uma base por um análogo, ou alteração do componente açúcar ouda cadeia principal fosfodiéster, pode ser simples para os versados nessastécnicas. Por exemplo, alterações podem ser feitas durante a síntese, ou pormodificação de bases específicas depois da síntese. Testes empíricos deácidos nucléicos catalíticos que incorporam alterações, tais como mudançasou análogos de bases permitem a avaliação do impacto das seqüências alte-radas, ou análogos específicos, sobre a atividade catalítica. Os análogos dasbases A, C, G, T e U são conhecidos nessas técnicas, e um subconjuntoestá listado na Tabela 2.Tabela 2
Exemplos análogos de nucleotídeos úteis nesta invenção
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O termo "fragmento", quando utilizado com relação a um ácidonucléico refere-se a um constituente deste ácido nucléico. Tipicalmente, ofragmento possui atividade biológica qualitativa em comum com o ácido nu-cléico, embora isto não tenha de ser necessariamente o caso. Os fragmen-tos de um ácido nucléico não precisam necessariamente codificar polipeptí-deos que retêm atividade biológica. Ao invés disso, um fragmento de ácidonucléico pode, por exemplo, ser útil como uma sonda de hibridização ou oli-gonucleotídeo de PCR. O fragmento pode ser derivado de um ácido nucléicoda invenção ou alternativamente pode ser sintetizado por algum outro meio,por exemplo, síntese química.O termo "variante", como aqui utilizado, refere-se a seqüênciasde ácidos nucléicos ou polipeptídeos substancialmente similares. Geralmen-te, as variantes de seqüências possuem atividade biológica em comum. A-lém disso, tais variantes de seqüências podem compartilhar pelo menos50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade de seqüências. Estão incluídos também dentro do signifi-cado do termo "variante" os homógos, que são tipicamente um polipeptídeoou ácido nucléico de species diferentes, mas que compartilham subtancial-mente a mesma função ou atividade biológica que o polipeptídeo ou ácidonucléico correspondente aqui descrito.
O termo "alta severidade", como aqui utilizado, refere-se às con-dições sob as quais dois ácidos nucléicos podem ser hibridizados, e podemincluir, por exemplo, a concentração de sais e/óu detergentes em uma solu-ção, a temperatura de uma solução que é usada durante a hibridização dosdois ácidos nucléicos e o período de tempo da hibridização. Conseqüente-mente, o termo "alta severidade", como aqui utilizado, refere-se a condiçõesem uma solução, que levam à hibridização de dois ácidos nucléicos apenasquando tais ácidos nucléicos compartilham um alto grau de complementari-dade. O grau de complementaridade pode incluir, porém sem limitações,uma faixa entre cerca de 50% e 99%. Assim sendo, as condições de "altaseveridade" podem envolver, porém sem limitações, o uso de temperaturavariada e um tampão que compreende várias concentrações de detergentes,sais, e cátions bivalentes.
Os termos "molécula facilitadora de combinação", "facilitador decombinação", "molécula facilitador de combinação de MNAzima", "facilitador"e "facilitador de combinação de MNAzima", como aqui utilizados, referem-sea entidades que podem facilitar a autocombinação de partizimas componen-tes para formar uma MNAzima cataliticamente ativa. Em modalidades prefe-ridas, um facilitador de combinação é necessário para a autocombinação deuma MNAzima. Um facilitador de combinação, em algumas modalidades,compreende um alvo tal como um ácido nucléico ou analisado diferente deácido nucléico. As moléculas facilitadoras de combinação podem compreen-der uma ou mais regiões ou moléculas que podem formar um par ou se ligara uma ou mais "partizimas" de oligonucleotídeos, que constituem componen-tes ou partes de uma "MNAzima". Não é necessário que o facilitador decombinação interaja com, forme par com, ou se ligue a cada componentepartizima ou oligonucleotídeo, desde que ele interaja com, forme par com, ouse ligue a pelo menos um dos componentes partizimas de uma MNAzima.
Como aqui utilizadas, pretende-se que as moléculas faciliadoras de combi-nação de MNAzimas englobem a mais ampla faixa de constituintes que po-dem facilitar a autocombinação de uma MNAzima. Em algumas modalida-des, um facilitador de combinação pode compreender um ácido nucléico. Emoutras modalidades, um facilitador de combinação pode compreender qual-quer célula ou qualquer parte dela, por exemplo, qualquer célula eucarióticaou procariótica, umm vírus, príon, levedura ou fungo, ou qualquer outra mo-lécula, incluindo, porém sem limitações, uma proteína, polipeptídeo, peptí-deo ou ácido nucléico. Em outras modalidades, um facilitador de combina-ção pode compreender um vírus, príon, levedura ou fungo, ou qualquer outramolécula, incluindo, por exemplo, porém sem limitações, glicoproteínas, lipí-deos, Iipoproteínas, organismos inteiros , células, vírus, bactéria, Archaea,fungos, anticorpos, metabólitos, patógenos, toxinas, contaminantes, vene-nos, moléculas pequena, polímeros, íons metálicos, sais metálicos, príonsou quaisquer derivados, partes ou combinações deles.
O termo "alvo", como aqui utilizado, inclui qualquer entidade,constituinte, ou analisado natural ou sintético que se busca detectar, identifi-car ou quantificar por uma ou mais MNAzimas específicas. Os alvos, portan-to, englobam a mais ampla faixa de entidades, cinstituintes, ou analisadosdetectáveis para os quais os métodos de detecção, identificação e/ou quanti-ficação sensível são desejáveis. Em algumas modalidades, um alvo com-preende um facilitador de combinação. Alguns alvos exemplificativos inclu-em, porém sem limitações, proteínas, polipeptídeos, peptídeos ou ácidosnucléicos, glicoproteínas, lipídeos, Iipoproteínas, organismos inteiros, célu-las, vírus, bactérias, Archaea, leveduras, fungos, anticorpos, metabólitos,patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, molécuías pequenas, políme-ros, íons metálicos, sais metálicos, príons ou quaisquer derivados, partes oucombinações deles. Outros alvos também são considerados para o uso emquestão.
Os termos "substrato", "molécula de substrato" e "substrato quí-mico", como aqui utilizados, incluem qualquer molécula que é capaz de serreconhecida, e atuada ou quimicamente modificada por uma molécula catalí-tica. Em modalidades específicas, o substrato pode ser reconhecido e modi-ficado por uma enzima. Em outras modalidades, um substrato pode ser re-conhecido e modificado por uma molécula de ácido nucléico catalítico. Amodificação química de um substrato pode ser medida pelo aparecimentode, ou um aumento em um produto da reação de modificação, ou pelo desa-parecimento de, ou decrésimo em um substrato da reação ou reações demodificação. Uma molécula catalítica específica pode reconhecer uma oumais moléculas de substrato diferentes, desde que cada molécula de subs-trato tenha pelo menos uma estrutura minima que é reconhecível quanto àatividade catalítica pela molécula catalítica.
Um "substratorepórter", "sonda-repórter" ou "substrato de sonda-repórter", como aqui utilizado, é um substrato que é particularmente adapta-do para facilitar a medição do desaparecimento de um substrato ou do apa-recimento de um produto com relação a uma reação catalisada. Os substra-tos-repórteres podem estar livres em solução ou ligados (ou "amarrados"),por exemplo, a uma superfície ou a outra molécula. Um substratorepórterpode ser rotulado por qualquer um entre uma grande série de meios, incluin-do, por exemplo, fluoróforos (com ou sem um ou mais componentes adicio-nais, tais como quenchers), rotuladores radioativos, marcação com biotina(por exemplo, biotiniíação) ou rotuladores quimioluminescentes. Os substra-tos-repórteres pára ácidos nucléicos para ácidos nucléicos catalíticos podemincluir também enzimas protéicas ou de ácidos nucléicos, por exemplo, afi-xadas de forma covalente aos seus terminais.
Como aqui utilizados, subatratos "genéricos" ou "universais" são,por exemplo, substratos-repórteres, que são reconhecidos e atuados cataiti-camente por uma pluralidade de MNAzimas, cada uma das quais podendoreconhecer um alvo diferente. O uso de tais substratos possibilita o desen-volvimento de enaios separados para a detcção, identificação ou quantifica-ção de uma ampla série de alvos, usando MNAzimas estruturalmente rela-cionadas, sendo que todas elas reconhecem um substrato universal. Estesubstratos universais podem ser rotulados independentemente com um omais rotuladores. Em modalidades preferidas, são usados rotuladores detec-táveis independentemente para marcar um ou mais substratos genéricos afim de permitir a criação de um sistema conveniente para detectar indepen-dentemente ou simultaneamente uma série de alvos usando MNAzimas.
Como aqui utilizados, òs termos "partizima", "componente parti-zima" e "componente oligonucleotídeo" referem-se a um oligonucleotídeoque contém DNA ou que contém RNA ou que contém DNA-RNA, dois oumais dos quais, apenas na presença de uma molécula facilitadora de combi-nação de MNAzima, podem em conjunto formar uma "MNAzima". Em certasmodalidades preferidas, um ou mais componentes partizimas, e de preferên-cia pelo menos dois, podem compreender três regiões ou domínios: um do-mínio "catalítico", que forma parte do núcleo catalítico da MNAzima que ca-talisa uma modificação química; um domínio de "braço sensor", que pode seassociar e/ou se ligar a um facilitador de combinação (por exemplo, um al-vo); e um domínio de "braço de substrato", que pode se associar e/ou seligar a um substrato. Uma representação destas regiões ou domínios podeser obsrvada, por exemplo, na Figura 1. Uma partizima pode compreenderuma ou mais moléculas. As partizimas podem compreender pelo menos umcomponente adicional, incluindo, porém sem limitações, um aptâmero, aquireferido como "apta-partizima". Uma partizima pode incluir também um subs-trato, como pode ser obsevado, por exemplo, na Figura 25.
O termo "MNAzima", como aqui utilizado, refere-se a duas oumais seqüênicas de oligonucleotídeo (por exemplo, partizimas) que, apenasna presença de uma molécula facilitadora da combinação de MNAzima (porexemplo, um alvo), formam uma enzima de ácido nucléico ativa que é capazde modificar cataliticamente um substrato. Uma MNAzima exemplificativa,que compreende a partizima Aea partizima B1 está representada na Figura1. Fazendo referência à Figura 1, as partizimas de DNA A e B se ligam a umalvo (por exemplo, através do pareamento de bases de Watson-Crick comum ácido nucléico-alvo). A MNAzima se forma apenas quando os braçossensores das partizimas AeB hibridizam proximamente uma da outra noalvo. Os braços de substrato da MNAzima engatam no substratorepórter,cuja clivagem é catalisada pelo núcleo catalítico da MNAzima1 formada pelainteração dos domínios catalíticos das partizimas A e Β. A MNAzima cliva osubstrato entre um par de corantes fluoróforo e quencher, gerando assim umsinal. A clivagem de uma quimera DNA/RNA (substratorepórter) está exem-plificada no desenho. Os termos "enzimas de ácido nucléico multicomponen-tes" e "MNAzima" são aqui utilizados de forma intercambiável e compreen-dem estruturas bipartidas, constituídas de duas moléculas, ou estruturas tri-partidas constituídas de três moléculas de ácidos nucléicos, ou outras estru-turas multipartidas, por exemplo, aquelas formadas por quarto ou mais mo-léculas de ácidos nucléicos. Uma MNAzima pode compreender também umoligonucleotídeo estabilizador que proporciona estabilidade da MNAzimainteragindo com um facilitador de combinação ou substrato. É evidente que aformação de uma MNAzima requer a combinação de pelo menos os compo-nentes partizimas com o facilitador de combinação, bem como a ligação deum substrato, para que a atividade cataiítica seja detectável, e que a ausên-cia de qualquer um destes componentes resulte em uma falta de atividadecatalítica.
Como aqui utilizado, o termo "aptâmero" pode compreender umaestrutura que tem a capacidade de reconhecer um ou mais ligantes. Por e-xemplo, o reconhecimento pode ter um alto grau de especificidade devido auma estrutura de nível mais alto do aptâmero, tal como um domínio ou bolsade ligação tridimensional. Os aptâmeros podem, portanto, se ligar a umaproteína, polipeptídeo, peptídeo ou ácido nucléico, glicoproteínas, lipídeos,Iipoproteínas, células, vírus, bactérias, Archaea, fungos, antibocorpos, meta-bólitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, organismos inteiros,moléculas pequenas, polímeros, íons metálicos, sais metálicos, príons ouqualquer derivado, parte ou combinação deles, ou qualquer outra entidade.Os aptâmeros preferidos neste caso podem compreender oligômeros deDNA ou RNA curtos de filamento único, que podem ser isolados a partir debibliotecas complexas de ácidos nucléicos sintéticos por um processo iterati-vo de adsorção, recuperação, e reampliação. Os aptâmeros podem, portan-to, ser gerados contra qualquer alvo, desde moléculas pequenas tais comoaminoácidos, ou antibióticos até estruturas de proteínas e ácidos nucléicos.
Como aqui utilizado, o termo "cascata" refere-se a sucessão deprocessos ou operações que ocorrem en estágios sucessivos, onde a ocor-rência de cada estágio é tipicamente dependente da ocorrênia de um estágioprecedente. Uma cascata pode, portanto, incluir, porém sem limitações, umacascata enzimática ou qualquer outra cascata de transdução de sinais. Emalgumas modalidades, uma cascata pode compreender a ampliação de umsinal resultante da atividade catalítica de uma MNAzima. Em modalidadespreferidas, tal cascata de ampliação pode envolver a ampliação repetida, eportanto, cíclica, de um sinal, onde a atividade catalítica de uma primeiraMNAzima torna disponível uma molécula requerida para a atividade catalíti-ca de uma segunda MNAzima, a qual, por sua vez, torna disponível umamolécula requerida para a atividade catalítica da primeira MNAzima. Em al-gumas modalidades, a molécula requerida pode compreender uma partizi-ma, uma enzima, um facilitador de combinação, um substrato, um alvo, umaparte ou fragmento deles ou uma combinação deles. Em algumas modalida-des, uma cascata pode, portanto, envolver a produção de um efeito cumula-tivo, e assim sendo, detectar um alvo de baixa abundância, gerando um sinalaté um nível no qual el epode ser detectado. Em outras modalidades, maisdo que dois estágios catalíticos podem ser empregados. A cascata pode serlinear. Em um modalidade preferida, a cascata pode ser exponencial.
Como aqui utilizados, os termos "inibidor" ou "inibidor de combi-nação" incluem, porém sem limitações, qualquer proteína, polipeptídeo, pep-tídeo ou ácido nucléico, RNA, DNA, análogos de ácidos nucléicos, ácidosnucléicos peptídicos, ácidos nucléicos bloqueados, quimeras de peptídeos-ácidos nucléicos, glicoproteínas, lipídeos, lipoproteínas, células, vírus, bacté-riaa, Archaea, fungos, anticorpos, metabólitos, patógenos, toxinas, contami-nantes, venenos, organismos inteiros, moléculas puquenas, polímeros, íonsmetálicos, sais metálicos, príons ou qualquer derivado, parte ou combinaçãodeles, ou qualquer entidade ou molécula que interage com um ou mais com-ponentes de uma MNAzima como aqui definida, ou que interage com umsubstrato ou facilitador de combinação, de modo a impedir a combinação deuma MNAzima. Um "inibidor" ou "inibidor de combinação" não precisa estarum promidade física de uma MNAzima, mas, a título exemplicativo não-limitativo, pode se ligar competitivamente a uma parte componente de umaMNAzima, substrato ou facilitador de combinação, impedindo desta forma deficarem disponíveis para a combinação da MNAzima. Tal ligação pode inclu-ir, por exemplo, um ácido nucléico inibitório que é complementar a um oligo-nucleotídeo que compreende uma parte componente de uma MNAzima.
As seguintes abreviaturas são aqui utilizadas e neste relatóriodescritivo inteiro:
MNAzima: enima de ácido nucléico multicomponente, ou enzima de ácidonucléico multipartida;
DNAzima: enzima de ácido desoxirribonucléico;
RNAzima: enzima de ácido ribonucléico, ou ribozima;
PCR: reação de polimerase en cadeia;
SDA: ampliação por deslocamento de filamento;
LAMR. ampliação isotérmica mediada por alça;
RCA: ampliação rotação circular,
TMA: ampliação mediada por transcrição;
3SR: replivação de seqüências auto-sustentada;
NASBA: ampliação baseada em seqüências de ácidos nucléicos;
ClH2O: água destilada desmineralizada;
LNA: locked nucléico acid;
PNA: ácido nucléico peptídico;
bDNA: ensaio de DNA ramificado;
FCS: espectroscopia por correlação de fluorescência;
TSA: ampliação poe sinal de tiramida;
An: analisado ou alvo;F: fluoróforo;O: quencher,miR: microRNA;
N= A, C, T, G, ou qualquer análogo deles;
N= qualquer nucleotídeo complementar a N, ou capaz de parear bases com N;
(N)x: qualquer número de N;(N%: qualquer número de N';W: A ou T;K: A1 G, ou AA;
r/V: qualquer base de ribonucleotídeo;
(rN)x: qualquer número de rN;
rR: A ou G;
rY: C ou U;
Μ: A ou C;
H: A, C1 ou T;
D: G1 A1 ou T;
JOE ou 6-JOE: 6-carbóxi-4,,5'-dicloro-2,,7'-dimetóxi-fluoresceína;FAMou 6-FAM: 6-carbóxi-fIuoresceína.BHQ1: Black Hole Quencher 1BHQ2: Black Hole Quencher 2
M-MLV RT (H-): Transcriptase Reversa do Virs da Leucemia Murina de Mo-
loney, RNase H Menos
shRNA: RNA grampo curto
siRNA: RNA interferente curto
mRNA: RNA mensageiro
tRNA: RNA de transferência
snoRNA: RNA nucleolar pequeno
stRNA: RNA temporal pequeno
smRNA: RNA modulador pequeno
pre-microRNA: microRNA precursor
primicroRNA: microRNA primárioDESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS
Deve-se entender ao final que as figuras e os exemplos aqui for-necidos são para exemplificar e não para limitar a invenção e suas váriasmodalidades.
De acordo com a presente invenção, as composições, métodose kits são fornecidos para a detecção, identificação e/ou quantificação de umalvo. Os métodos compreendem geralmente o uso de composições quecompreendem enzimas de ácidos nucléicos multicomponentes ou multiparti-das que são formadas, de preferência, enzimas de ácidos nucléicos que sãoformadas, de preferência, por múltiplos componentes ácidos nucléicos quese autocombinam para formar uma enzima de ácido nucléico ativa na pre-sence de um facilitador de combinação. Em modalidades preferidas, o facili-tador de combinação é o alvo, e portanto, as enzimas de ácidos nucléicosmulticomponentes se formam apenas na presence do alvo.
1. Composições - MNAzimas
As enzimas de ácidos nucléicos multicomponentes (referidasaqui também igualmente como enzimas de ácidos nucléicos multipartidas ou"MNAzimas") são capazes de se autocombinar a partir de dois ou mais com-ponentes oligonucleotídeos, aqui referidos também como partizimas. Os oli-gonucleotídeos partizimas se autocombinam na presença de um facilitadorde autocombinação de MNAzima para formar uma MNAzima. As MNAzimassão, portanto, enzimas de ácidos nucléicos cataliticamente ativas. Em algu-mas modalidades, a presença de uma MNAzima pode ser detectada, e éindicativa da preseça de um alvo, porque a MNAzima se forma apenas napresença do alvo, onde o alvo compreende o facilitador de combinação. Vá-rios ensaios baseados nos princípios básicos delineados acima são aqui for-necidos. As composições que compreendem oligonucleotídeos capazes deformar MNAzimas, e MNAzimas com várias seqüências são também aquifornecidas. Em algumas modalidades pelo menos um entre os componentesoligonucleotídeos, o facilitador de combinação ou o substrato pode inclu-ir/compreender também um aptâmero que é capaz de se ligar a um alvo.
Em modalidades preferidas, as estruturas de MNAzimas se ba-seiam em uma ou mais DNAzimas e/ou ribozimas. As mais preferidas sãoaquelas estruturas de MNAzimas que se baseiam em uma estrutura deDNAzima específica. As estruturas preferidas atualmente se baseiam emDNAzimas que incluem as DNAzimas 10:23 e 8:17. Em várias modalidades,as MNAzimas compreendem bases de ribonucleotídeos e também de deso-xirribonucleotídeos. Em modalidades mais preferidas, uma estrutura deMNAzima baseia-se, pelo menos em parte, na estrutura de uma DNAzima.Em outras modalidades preferidas, as MNAzimas compreendem pelo menosalgumas bases de desoxirribonucleotídeos ou seus análogos. Em modalida-des mais preferidas, o núcleo catalítico de uma MNAzima compreende umaou mais bases de desoxirribonucleotídeos ou seus análogos. Em modalida-des ainda mais preferidas, uma ou mais bases de desoxirribonucleotídeosou seus análogos estão envolvidos na catálise de um substrato. Em outrasmodalidades, pelo menos uma base de desoxirribonucleotídeo. ou seu aná-logo, no núcleo catalítico, melhora a atividade catalítica. Em ainda outrasmodalidades, há um requisito estrito para pelo menos uma base de desoxir-ribonucleotídeo, ou seu análogo, no núcleo catalítico da MNAzima, que acatálise ocorra em uma taxa mensurável, em relação àquela de uma MNa-zjma comparável sem a base de desoxirribonucleotídeo presente.
Como aqui estabelecido, as MNAzimas podem conter uma oumais substituições, tais como análogos, derivados, bases modificadas oualteradas, ribonucleotídeos, alterações da cadeia principal de açúcares oufosfatos, várias deleções, inserções, substituições ou outras modificações,ou qualquer combinação delas, bem-conhecidas pelos versados nessas téc-nicas. Tais modificações, substituições, deleções, inserções, etc., podem serfeitas nos braços sensores e/ou do substrato e/ou nas partes do núcleo cata-lítico, como aqui demonstrado, de tal modo que a molécula retenha a ativi-dade catalítica. As substituições e modificações nos braços que ligam osubstrato ou o facilitador de combinação podem ser bem-toleradas e, de fa-to, são a base para permitir a individualização das moléculas para diferentessubstratos/facilitadores de combinação. Por exemplo, uma modificação dosbraços sensores permitirá individualizar para diferentes facilitadores de com-binação, enquanto que a modificação dos braços do substrato permitirá aindividualização para diferentes substratos.
Portanto, em certas modalidades preferidas, a invenção englobaMNAzimas com atividade cataiítica, que compreendem desoxirribonucleotí-deos, ou que são derivadas a partir dessas moléculas por certas modifica-ções/substituições, etc. Como regra geral, a substituição da molécula inteira,por exemplo, por ribonucleotídeos, tornará a molécula inativa porque suaatividade depende de certos desoxirribonucleotídeos fundamentais. De umamaneira correspondente, alguns ribonucleotídeos em uma ribozima podemser substituídos por desoxirribonucleotídeos, mas a substituição da moléculainteira, por exemplo, por desoxirribonucleotídeos, tornará a molécula inativa.
Os versados nessas técnicas devem avaliar que as MNAzimascompreendem desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou mesmo am-bos. Estas MNAzimas que compreendem pelo menos um, e mais preferivel-mente, todos oligonucleotídeos de componentes desoxirribonucleotídeos,são atualmente preferidos. São também preferidas as MNAzimas que com-preendem pelo menos uma desoxirribonucleotídeo, ou seu análogo, dentrodo núcleo catalítico da MNAzima. São ainda mais preferidas as modalidadesnas quais essa base é necessária para a atividade catalítica.
Os versados nessas técnicas devem avaliar também que asDNAzimas multipartidas têm vantagens sobre ribozimas multipartidas, porexemplo, com relação à estabilidade e facilidade de uso. Assim sendo, asMNAzimas multicomponentes aqui fornecidas podem proporcionar uma al-ternativa atualmente preferida a ribozimas multicomponentes, que tambémsão fornecidas de acordo com várias modalidades. Deve-se avaliar tambémque, em certas modalidades, as MNAzimas oferecem vantagens sobre en-zimas de ácidos nucléicos monomoleculares, por exemplo DNAzimas, quepodem reconhecer apenas um substrato, enquanto que uma única MNAzimapode reconhecer duas moléculas, a saber, um facilitador de combinação (porexemplo, um alvo) e um substrato. Por exemplo, estas propriedades deMNAzimas as tomRNa adaptáveis, por exemplo, para a detecção de alvos,incluindo detecção in situ, in vivo ou in vitro.2. Métodos que usam MNAzimas para detectar, identifivar ouquantificar alvos
A presente invenção fornece vários métodos que empregam ouso de uma ou mais MNAzimas para a detecção, identificação ou quantifica-ção de pelo menos um alvo. Em uma modalidade, o primeiro e o segundocomponentes oligonucleotídeos se autocombinam apenas quando entramem contato com uma amostra que contém um facilitador de combinação,sendo que a dita autocombinação da MNAzima cataliticamente ativa indicadesta forma a presença do facilitador de combinação, onde o facilitador decombinação é o alvo. Em outras modalidades, tais como, por exemplo, aque-las que enolvem um aptâmero, o facilitador de combinação pode não ser oalvo, e assim sendo pode compreender apenas um elemento necessáriopara a autocombinação da MNAzima.
Muitas das várias modalidades da invenção podem ser maisbem-entendidas por meio de representações pictóricas. Portanto, fazendoreferência às figuras, e de acordo com as composições e métodos aqui e-nunciados, são fornecidos geralmente métodos baseados em MNAzimas,que permitem a detecção de pelo menos um alvo, usando apenas enzimasde ácidos nucléicos (por exemplo, Figuras 1, 3, 4, 7 - 13, 20, 21, 24, 25)sem a necessidade de enzimas protéicas tais como polimerases. Embora ouso de enzimas protéicas em conjunto com MNAzimas não esteja aqui ex-cluído, e em certas modalidades desta inveção a inclusão de enzimas pro-téicas seja permissível, ou mesmo preferido, as condições de reação para osmétodos que não requerem enzimas protéicas são geralmente menos restri-tivas e mais facilmente otimizadas, por exemplo, quanto à eficiência da cli-vagem da MNAzima. A falta de necessidade de enzimas protéicas dminuitambém geralmente o custo de reagentes.
Como aqui ainda fornecidos, alguns métodos de emprego deMNAzimas para a detecção de alvos não requerem termociclagem e/ou des-naturação de um alvo. Os métodos isotérmicos são mais flexíveis do que osmétodos que requirem termociclagem e permitem também a diferenciaçãoentre alvos que compreendem ácido nucléico de filamento único e filamentoduplo. Além disso, a falta de necessidade de termociclagem pode tornar es-ses métodos mais fáceis e menos onerosos. Os métodos fornecidos de a-cordo com esta invenção são métodos simples, rápidos, produtivos, isotér-micos, e flexíveis em termos procedimentais para detectar alvos de interesseem uma amostra, que pode ser sintética ou natural.
Certos exemplos aqui fornecidos demonstram a detecção de umácido nucléico alvo pela combinação específica de alvo de uma MNAzima,levando à clivagem, mediada pela MNAzima, de, por exemplo, um substrato-repórter fluorescente. Além disso, devido à natureza da molécula da MNA-zima, as reações podem ser realizadas em uma ampla faixa de temperatu-ras, sujeitas apenas aos requisitos para a combinação da MNAzima e damodificação catalítica (por exemplo, clivagem) do substrato utilizado.
Um exemplo básico da estrutura de uma MNAzima está repre-sentado na Figura 1. A estrutura ilustrada compreende a partizima Aea par-tizima B que têm pareamento de bases com um molécula de facilitador decombinação de MNAzima, aqui ilustrada simplesmente como "ALVO". Aspartizimas A e B, ao interagirem com o 'ALVO", permitiram que o núcleo ca-talítico ficasse em estreita proximidade e desta forma se formasse. Os bra-ços de substrato da MNAzima interagiram e parearam bases com um subs-trato, neste caso substratorepórter. Assim sendo, a MNAzima se autocombi-nou e este processo é facilitado através da presença da molécula do facilita-dor de combinação, o "ALVO". Na ausência do "ALVO", nenhuma MNAzimase formará. A modificação (neste caso, a clivagem) do substrato é catalisadapelo núcleo catalítico da MNAzima no Sítio de Clivagem de MNAzima dentrodo substrato, denotado pela seta vertical. O substrato nesta modalidade es-pecífica da invenção compreende uma parte detectável que tem um sinaldetectável, por exemplo, o fluoróforo F, e uma parte quencher que tem umefeito ocultador sobre o sinal detectável F através da ação do quencher Q.Depois da clivagem no Sítio de Clivagem da MNAzima, há um aumentosubstancial no sinal detectável, neste caso a fluorescência, que é facilmentedetectável ou quantificado.
A Figura 1 pode ser entendida ainda como representando umexemplo de um método básico que usa MNAzimas para detectar um alvo, oqual, em algumas modalidades, compreende um facilitador de combinação.
A Estratégia 1 (vide Figura 2) usa MNAzimas adaptadas para a detecçãodos alvos que incluem DNA1 RNA e proteínas. O substratorepórter pode es-tar livre em solução (Figura 1) ou ligado a um suporte (Figura 3). O sinal po-de ser gerado por vários meios, tais como separação dos pares de corantes,fluoróforo F e quencherQ (Figuras 1 e 3).
Mais especificamente, a partizima Aea partizima B estão ilus-tradas na Figura 1, cada uma compreendendo uma parte ramificada desubstrato, uma parte de núcleo catalítico, e uma parte ramificada de sensor.
Na presença de um alvo, as partes de braços sensores da partizima A e dapartizima B podem começar a hibridizar e parear bases com partes comple-mentares do alvo, por exemplo, uma seqüência de DNA ou RNA. Depois deentrar em contato com o alvo desta maneira, a MNAzima se autocombina,formando um núcleo catalítico que pode modificar um substrato que estáligado pelos braços de substrato. De preferência, a presença da MNAzima édetectada através da detecção ou medição da sua atividade cataiítica. Osbraços de substrato da MNAzima assim combinada podem engatar um subs-trato, por exemplo, o substratorepórter ilustrado na Figura 1, através da inte-ração das seqüências complementares nos braços de substrato e no subs-trato. Depois que o substrato está assim engatado nos braços de substrato,o núcleo catalítico pode promover a modificação (por exemplo, a clivagem)do substrato, a qual, por sua vez, pode ser medida ou detectada, direta ouindiretamente.
Fazendo referência adicional às figuras, a Figura 2 fornece umavisão geral estilizada de várias aplicações exemplificativas de um ensaio deMNAzima. A Estratégia 1 exemplifica uma aplicação básica do ensaio deMNAzima, como descrito acima. Uma MNAzima constituída de dois oligonu-cleotídeos separados com seqüências de reconhecimento para um alvo etambém um substrato se forma quando os oligonucleotídeos reconhecem ese ligam a um alvo. O substrato, por exemplo, substratorepórter, é modifica-do pela ação catalítica da MNAzyma e causa a geração de um sinal detectá-vel, seja diretamente (Estratégia 1), durante ou após a ampliação do alvo(Estratégia 2) ou por uma cascata de sinais (Estratégia 3). Em algumas mo-dalidades, a ampliação do alvo e do sinal ocorrem simultaneamente.
Os versados nessas técnicas devem reconhecer que as MNAzi-mas podem ser usadas em estratégias para a detecção, identificação ouquantificação de facilitadores de combinação que cobrem uma ampla faixade áreas de aplicação. Estas áreas incluem, porém sem limitações, aplica-ções médicas, veterinárias, agrícolas, de tecnologia de alimentos, de repro-dução de imagens e bioterrorismo.
Deve ficar facilmente evidente para os versados nessas técnicasque as MNAzimas podem ser usadas para detectar, identificar e/ou quantifi-car alvos em solução. Por exemplo, estratégias que envolvem a detecção,identificação e/ou quantificação de alvos individuais, usando um único subs-trato, são aplicáveis para tal detecção. Em algumas modalidades, isto podeenvolver o uso de um substrato genérico. Múltiplos alvos também podem serdetectados em solução, usando múltiplas MNAzimas que modificam umasérie de substratos genéricos, sendo que a modificação de cada substratoresulta em um sinal detectável distintamente, por exemplo, fluorescênciasdiferentes.
3. Métodos que Usam Múltiplas MNAzimas
Os versados nessas técnicas devem reconhecer que os váriosensaios aqui fornecidos podem ser usados geralmente para detectar um úni-co alvo por reação ou ensaio, ou para detectar múltiplos alvos em uma únicareação ou ensaio. Quando múltiplos alvos vão ser detectados, uma ou maisMNAzimas podem ser usadas, dependendo do ensaio e do que vai ser de-tectado. Por exemplo, uma única MNAzima pode ser suficiente quando vãoser detectadas múltiplas esruturas relacionadas, por exemplo, um grupo deseqüências que compartilham uma seqüência crítica (reconhecida pelaMNAzima) e que variam apenas, por exemplo, no comprimento ou em se-qüência fora da seqüência crítica. Qualquer seqüência com a seqüência crí-tica poderia ser detectada. Múltiplas MNAzimas seriam úteis quando vão serdetectadas seqüências relacionadas que diferem minimamente, tal como emapenas um único nucleotídeo ou mesmo quando alvos vastamente diferen-tes estão sendo detectados, e é desejável conhecer a presença ou ausênciade cada um. Similarmente, em algumas modalidades, um único substratoserá suficiente, enquanto que em outras, um substrato singular é necessáriopara detectar cada um entre vários alvos. Em alguns casos, para multiplex, ométodo requer o uso de um sinal detectável distinto ou singular para cadasubstrato, a fim de facilitar o desenho do método. Um sinal detectável distin-to ou singular para cada substrato pode não ser necessário quando os subs-tratos são afixados a um suporte ou suporte e pode ser distinguido em virtu-de da sua localização sobre o suporte ou suportes. Estas características dodesenho devem ser facilmente entendidas pelos versados nessas técnicas.Em algumas modalidades, os métodos permitem a detecção de uma sériede tipos diferentes de alvo em uma reação, por exemplo, um alvo ácido nu-cléico e uma proteína.
4. Métodos que Usam Ampliação de Alvos
Os versados nessas técnicas devem avaliar facilmente que osmétodos aqui descritos podem envolver a ampliação de um alvo antes, du-rante ou depois da atividade catalítica da MNAzima. Tal ampliação de alvoencontra aplicação específica em modalidades da presente invenção nasquais a quantidade do alvo que se busca ser detectado, identificado ouquantificado é de um valor tat de modo a proporcionar um sinal que de outraforma não seria detectável. Tal ampliação pode compreender uma ou maisentre; reação de polimerase em cadeia (PCR), ampliação por deslocamentode filamento ("SDA"), ampliação isotérmica mediada por alça (LAMP), ampli-ação rotação circular ("RCA"), ampliação mediada por transcrição (TMA),replicação de seqüências auto-sustentada ("3SR"), ou ampliação baseadaem seqüências de ácidos nucléicos (NASBA), ou reação de polimerase emcadeia com transcrição reversa (RT-PCR).
A Estratégia 2 (Figura 2) exemplifica o uso de uma MNAzimaadaptada para monitorar a acumulação de amplicons durante, ou após aampliação in vitro de alvos ácidos nucléicos. As técnicas para ampliação invitro de seqüências de ácidos nucléicos são bem-conhecidas nesse campo.Elas incluem técnicas mediadas por uma DNA polimerase, tal como a reaçãode polimerase em cadeia ("PCR") (vide, por exemplo, patente n2 US4.683.202; patente n- US 4.683.195; patente n2 US 4.000.159; patente n2 US4.965.188; patente n2 US 5.176.995) (Saiki et ai, 1985; Chehab etal., 1987),ampliação por deslocamento de filamento ("SDA") (Walker et al., 1992), am-pliação rotação circular ("RCA") (Lizardi et al., 1998), reação de polimeraseem cadeia com transcrção reversa (RT-PCR) e ampliação isotérmica media-da com alça ("LAMP") (Notomi et al., 2000; Nagamine et al., 2002). Outrastécnicas de ampliação de alvos são mediadas por uma RNA polimerase, porexemplo, ampliação mediada por transcrição ("TMA") (Jonas et al., 1993),replicação de seqüências auto-sustentada ("3SR") (Fahy et al., 1991) e am-pliação baseada em replicação de seqüências de ácidos nucléicos ("NAS-BA") (Compton, 1991).
Os produtos da ampliação ("amplicons") produzidos por PCR,RT-PCR, SDA, RCA e LAMP são constituídos de DNA, enquanto que osamplicons de RNA são produzidos por TMA, 3SR e NASBA.
Fazendo referência adicional à Estratégia 2, como exemplificadona Figura 2, em um dos seus vários aspectos, a invenção fornece métodospara usar MNAzimas em conjunto com métodos de ampliação de alvos, queincluem, por exemplo, as PCR, RT-PCR, SDA, RCA, LAMP, TMA, 3SR andNASBA supramencionadas. Os Exemplos 4, 5, 6, e 9 demonstram a detec-ção de amplicons de PCR. Nos Exemplos 4, 5, 6, e 9, o ponto final da análi-se após a PCR facilitou a rápida determinação da presença ou ausência dosácidos nucléicos-alvos. Os Exemplos 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 19, e 20 e-xemplificam o monitoramento em tempo real da ampliação por PCR, permi-tindo assim a quantificação do ácido-nucléico-alvo. A acumulação de ampli-cons produzidos por PCR, usando razões assimétricas ou simétricas de ini-ciadores, pode ser monitorada usando MNAzimas.
Como pode ser observado na Figura 2 (Estratégia 2), um ácidonucléico-alvo é ampliado de acordo com um procedimento para ampliar esteácido nucléico (isto é, DNA ou RNA). De preferência, são usados métodospadronizados para ampliação in vitro. Os amplicons gerados durante a am-pliação servem como alvos para uma MNAzima, e assim sendo, a atividadeda MNAzima é indicativa da presença do alvo. Os versados nessas técnicasdevem avaliar que essa monitoração pode ser conduzida em um único vasosob condições que permitem a ampliação e a combinação e atividade catalí-tica da MNAzima, ou o ensaio de MNAzima pode ser conduzido subseqüen-temente ou pontualmente no tempo durante a ampiação inteira, removendoamostras no final ou durante o curso das reações de ampliação.
Deve-se avaliar também que os métodos ou protocolos, quecombinam ampliação de alvos com atividade catalítica de ácidos nucléicos,podem requerer condições específicas da reação. De preferência, as condi-ções da reação são compatíveis com a atividade de polimerase (para ampli-ação), e com a modificação catalítica de ácidos nucléicos de um substrato(para detecção). Os protocolos para determinar as condições para a ativida-de catalítica e atividade de polimerase concomitantes em alta temperatura,tais como durante a PCR, foram descritas para DNAzimas (Impey et al.,2000). A influência de fatores que incluem comprimento dos braços de DNA-zimas, tampão, temperatura, concentração de íons bivalentes, e os efeitosde aditivos, foram demonstrados neste trabalho. As enzimas de DNA sãoapropriadas para uso em combinação com estratégias de ampliação in vitro.Por exemplo, elas não são desnaturadas irreversivelmente por exposição aaltas temperaturas durante a ampliação.
5. Métodos que Usam Suportes Insolúveis e Sólidos
Deve-se entender também que geralmente os métodos, sejameles multiplexados ou não, são aplicáveis em solução, ou combinados comum suporte insolúvel ou um suporte sólido, sobre o qual um ou mais entre osubstrato, a enzima ou parte deles, o facilitador de combinação de MNAzimae/ou o alvo estão ligados, afixados ou amarrados. Novamente, as caracterís-ticas desses sistemas de ensaios serão entendidas geralmente pelos versa-dos nessas técnicas munidos dos métodos e variações aqui exemplificadase nos exemplos experimentais. Assim sendo, a invenção não deve ser con-siderada como estando limitada aos ensinamentos literais aqui fornecidos,mas é capaz de ser modificada e variada consistentemente com os princí-pios e com o âmbito dos ensinamentos aqui fornecidos e com os conheci-mentos nessas técnicas.
Fazendo referência à Figura 3, no Quadro (i) está representadoum método exemplificativo para detectar alvos usando uma MNAzima e umsubstrato amarrado a um suporte. Nesta modalidade, o substrato é, de pre-ferência, um substrato como ilustrado com uma parte detectável que com-preende um sinal detectável, por exemplo, um fluoróforo, e uma parte quen-cher que diminui ou elimina o sinal detectável enquanto a parte detectável ea parte quencher do substrato permanecem em estreita proximidade, porexemplo, até que o substrato seja modificado, por exemplo, por clivagem. Osubstrato é afixado a um suporte. De preferência, o suporte é um materialinsolúvel, ou uma matriz que retém o substrato e o impede de se mover li-vremente no volume da mistura reativa. Tais suportes são bem-conhecidosnessas técnicas para imobilizar ou localizar substratos, incluindo ácidos nu-cléicos-alvo. Os versados nessas técnicas devem avaliar que o suporte podeser selecionado entre uma ampla série de matrizes, polímeros, e similares,em uma série de formas, incluindo pérolas convenientes para uso em micro-ensaios, bem como outros materiais compatíveis com as condições da rea-ção. Em certas modalidades preferidas, o suporte pode ser um material plás-tico, tais como pérolas ou bolachas de plástico, ou aquele da cavidade outubo no qual um ensaio específico é conduzido.
A afixação do substrato ao suporte é desenhada de tal modoque, depois da modificação, por exemplo, por clivagem, do substrato pelaMNAzima, a parte detectável ou a parte quencher, porém não ambas, per-maneça afixada ao suporte, enquanto que a outra é liberada para se moverdentro do volume da mistura reativa, longe da parte remanescente afixada.
Assim sendo, em um exemplo de clivagem, o sinal detectável aumenta e-normemente à medida que a parte quencher e a parte detectável são sepa-radas depois da clivagem. Na modalidade ilustrada na Figura 3, no Quadro(i), a parte detectável que contém fluoróforo permanece afixada depois daclivagem. Isto tem o benefício de permitir a localização do sinal sobre o su-porte, mas em certos casos, o(s) fluoróforo(s) pode(m) ser liberado(s) paradentro da solução. Em outra modalidade na qual, por exemplo, a ligação o-corre, o quencher pode ser ligado a um fluoróforo, diminuindo desta forma osinal detectável.
Fazendo referência à Figura 3, no Quadro (ii), está ilustrado ummétodo multiplexado que compreende múltiplos componentes de MNAzimaspara produzir múltiplas MNAzimas (duas ilustradas) específicas para alvosdiferentes. Esta modalidade engloba uma estrutura que compreende umsubstrato em uma posição específica conhecida, por exemplo, um "chip",onde múltiplas posições estão disponíveis para ligar inúmeros substratos,por exemplo, Substrato 1, Substrato 2. A parte detectável de cada substratopode ser rastreada até sua posição e está amarrada nesse local. Para cadaMNAzima, por exemplo, MNAzima 1, MNAzima 2, caso o alvo, por exemplo,Alvo 1, Alvo 2, esteja presente, por exemplo, em uma solução de teste, aMNAzima correspondente e específica para esse alvo se autocombinará eserá capaz de catalisar a clivagem do seu substrato correspondente, resul-tando na produção de um sinal nesse local. A posição do sinal detectávelidentificará, assim, qual MNAzima clivou seu substrato, e assim sendo, qualou quais alvos estão presentes na solução do teste. Nesta modalidade, amodificação do substrato resulta em um sinal identificável em virtude da sualocaização. O substrato não precisa de um mecanismo de detecção inde-pendentemente identificável, por exemplo, um fluoróforo diferente, emboraos versados nas técnicas os versados nessas técnicas devam reconhecerque tal consideração está dentro do âmbito da presente invenção.
As modalidades da presente invenção que englobam um suporteinsolúvel na forma de um "chip", conhecida de outra forma como um arranjoou microarranjo compreendem tipicamente uma pluralidade de substratosacoplados, amarrados ou afixados de outra forma ao chip. Em modalidadesespecíficas, os substratos compreendem um ácido nucléico. Uma pluralida-de de ácidos nucléicos pode ser posicionada em cima do chip por qualquermétodo apropriado nessas técnicas, por exemplo, por pipeta, impressão comjato de tinta, impressão por contato ou fotolitografia. O chip pode compreen-der pelo menos um elemento, sendo que cada elemento compreende pelomenos um ácido nucléico. Pelo menos um elemento pode compreender umapluralidade de ácidos nucléicos com a mesma seqüência. O número de ele-mentos que comprendem um chip pode ser qualquer número, e quando umapluralidade de elementos está posicionada sobre um chip, os elementos po-dem ficar espaçados entre si em uma distância uniforme ou variável, ou umacombinação delas. Em algumas modalidades, os elementos podem ficar po-sicionados aleatoriamente, e a localização de cada elemento é então deter-minada. O tamanho e o formato dos elementos dependerão da aplicaçãoespecífica da presente invenção, e elementos com tamanhos e formatos di-ferentes podem ser combinados em um único chip. A superfície do chip podeser substancialmente plana ou pode ter características tais como depressõesou protuberâncias, e os elementos podem ficar posicionados dentro das de-pressões ou em cima das protuberâncias. Tais depressões podem propor-cionar um reservatório para soluções dentro das quais os elementos sãoimergidos, ou tais protuberâncias podem facilitar a secagem dos elementos.Por exemplo, os elementos podem ser colocados dentro de cada cavidadede uma placa de 96 cavidades. Em algumas modalidades, o chip pode incluiridentificadores singulares tais como inscrições, rotuladores de radiofreqüên-cia, dispositivos integrados tais como microprocessadores, códigos de barraou outras marcações para identificar cada um dos elementos. Os identifica-dores singulares podem compreender adicionalmente ou alternativamente asdepressões ou protuberâncias sobre a superfície do array. Além disso, osidentificadores singulares podem proporcionar a orientação ou identificaçãocorreta do chip. Os identificadores singulares podem ser lidos diretamentepor um dispositivo de captura de dados ou por um escaneador ou detectaróptico.
6. Sistemas de Substratos-repórteres Usados nos Métodos
São fornecidos também de acordo com a presente invenção sis-temas de substratos repórteres genéricos, que permitem o desenvolvimentorápido de ensaios, permitindo que mudanças fáceis de desenho criem novasMNAzimas que reconhecem diferentes alvos. Como aqui discutido, a partedos braços de substrato e a parte do núcleo catalítico das partizimas podempermanecer inalteradas, com mudanças apenas na parte dos braços senso-res de uma ou mais partizimas necessárias para novos alvos. As seqüênciasde substratos genéricos são fornecidas e o mesmo substrato pode, portanto,ser incorporado em ensaios para muitos alvos diferentes. Além disso, omesmo substrato pode ser incorporado nos métodos em várias modalidadesdesta invenção, incluindo ensaios nos quais o substrato está livre em solu-ção ou está amarrado ou afixado a um suporte. Vários substratos genéricospodem ser usados um uma reação multiplex, permitindo a detecção simultâ-nea de múltiplos alvos.
As estratégias com MNAzimas, usando substratos genéricos,oferecem uma vantagem importante sobre tecnologias tais como TaqMan®ou Beacons que requerem o desenho e o uso de sondas específicas paracada novo alvo.
7. Substratos Usados nos Métodos
Como descrito mais detalhadamente abaixo, as MNAzimas têmuma propriedade vantajosa em certas modalidades de serem capazes deutilizar um substrato universal ou genérico. Tal substrato está ilustrado naFigura 1 em uma configuração atualmente preferida, onde o substrato com-preende uma parte detectável e uma parte quencher. A parte quencher éadaptada para diminuir ou eliminar um sinal detectável a partir da parte de-tectável do substrato até que o substrato seja clivado pela MNAzima. Porexemplo, a parte quencher pode compreender "Black Hole Quencher 1"(BHQ1) ou "Black Hole Quencher 2" (BHQ2).
Assim sendo, a MNAzima cliva o substrato entre a parte detec-tável e a parte quencher, permitindo que as duas partes se separem em so-lução, permitindo desta forma que o sinal detectável apareça ou aumente àmedida que a parte quencher é distanciada ou efetivamente removida doambiente local da parte detctável.
O uso do substrato genérico ou universal é habilitado através dodesenho das partizimas componentes da MNAzima. Alterando apenas osbraços sensores das partizimas, mas deixando os braços do substrato inalte-rados, uma grande variedade de MNAzimas específicas para cada um entreuma pluralidade de alvos pode ser desenhada, todas utilizando um substratouniversal para a detecção. Os versados nessas técnicas devem avaliar asvantagens que isto oferece em termos de eliminar a necessidade de substra-tos individualizados ou singulares para cada alvo. Cada novo alvo requerapenas uma ou mais mudanças em uma ou mais das partes de braços sen-sores; a parte ramificada de sensor e a parte do núcleo catalítico podempermanecer constantes. Assim sendo, um único substratorepórter pode serusado para um único alvo, usando uma MNAzima, e múltiplos alvos em umasérie de ensaios, usando MNAzimas alteradas. Uma pluralidade de substra-tos-repórteres permite multiplexar para detectar múltiplos alvos em um únicoensaio, usando múltiplas MNAzimas, uma para cada alvo. Tais métodos mul-tiplexados de usar MNAzimas são realizados facilmente em solução (Figura18) ou èom afixação a um sistema de suporte (Figura 3). Contempla-se aquique os ensaios multiplexados podem ser, assim, realizados em sistemas queenvolvem afixar um ou mais entre o substrato, ou as partizimas da MNazimaou o facilitador de combinação, ou atividades enzimáticas adicionais, a umsuporte como aqui descrito.
Além disso, os substratos podem incorporar entidades adicio-nais, tais como ácidos nucléicos rotulados, nanopartículas, micropartículas,proteínas, anticorpos, RNA, DNA, análogos de ácidos nucléicos, proteínas,glicoproteínas, Iipoproteínas, ácidos nucléicos peptídicos, ácidos nucléicosbloqueados, qimeras de peptídeos-ácidos nucléicos, ou qualquer combina-ção deles. Por exemplo, as nanopartículas podem ser naopartículas de ouro,onde estas nanopartículas de ouro estão associadas com um pluralidade dealvos, tais como ácidos nucléicos.
Os substratos podem ser modificados por uma MNAzima, pro-duzindo desta forma um efeito detectável. No processo de detecção, a modi-ficação do substrato por uma MNAzima pode envolver, por exemplo, cliva-gem, ligação, metalação da porfirina, formação de ligações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida. Como uma conseqüência da mo-dificação do substrato por uma MNAzima, um efeito detectável é gerado e amagnitude do efeito pode ser, portanto, indicativa da quantidadedo alvo quese busca medir. O efeito detectável pode ser detectado por uma série demétodos, incluindo espectroscopia de fluorescência, ressonância de plas-mônios superficiais, espectroscopia de massas, RMN, ressonância spin deelétrons, espectroscopia de polarização da fluorescência, dicroísmo circular,imunoensaio, cromatografia, radiometria, fotometria, cintilografia, métodoseletrônicos, UV, espectroscopia em luz visível ou no infravermelho, métodosenzimáticos, ou qualquer combinação deles.
Vários grupos relataram a detecção de ácidos nucléicos-alvo, e outros anali-sados com leituras colorimétricas (Elghanian et al., 1997, Mirkin et al, 1996,e Liu e Lu, 2004). A estratégia envolve a preparação de bateladas de nano-partículas de ouro, cada uma das quais tendo uma seqüência de oligonucle-otídeos de DNA distinta afixada à sua superfície. As partículas de ouro po-dem ser então agregadas pela adição de um "oligonucleotídeo-ponte", quetem complementaridade com as seqüências que estão afixadas às partículasde ouro. A agregação das partículas resulta em uma mudança concomitanteda cor de vermelho para azul (Mirkin et al, 1996). Um trabalho mais recentedemonstrou que a inclusão de uma seqüência de DNAzima do substratodentro do oligonucleotídeo-ponte pode proporcionar um mecanismo parareverter a agregação das partículas de ouro (Liu e Lu, 2004). A ativação dasDNAzimas, e a subseqüente clivagem do substrato/oligonucleotídeo-ponte,resultou na dissociação das partículas de ouro e uma mudança de cor deazul para vermelho.
Foi desenvolvido um detector simples de condução, baseado noconceito acima, que funcionava explorando a dependência de uma DNAzimasobre a condução para sua atividade catalítica. A DNAzima foi desenhadapara clivar um oligonucleotídeo-ponte usado para agregar partículas de ouro(Liu e Lu, 2004). Similarmente, uma aptazima que contém um aptâmero es-pecífico para adenosina, e uma DNAzima capaz de clivar um oligonucleotí-deo-ponte apenas na presença de adenosina, permitiu a detecção de ade-nosina em um formato colorimétrico.8. Otimização dos Métodos
Os versados nessas técnicas devem entender facilmente que osmétodos aqui descritos podem ser otimizados usando uma série de parâme-tros experiementais, para otimizar a detecção, identificação e/ou quantifica-ção de um alvo. Os parâmetros experimentais específicos que são otimiza-dos, e o nível de tal otimização, dependerão do método específico que estásendo empregado e do alvo específico que se busca detectar, identificare/ou quantificar. Tais parâmetros incluem, porém sem limitações, o tempo,temperatura, concentração de sais, detergentes, cátions e outros reagentesque incluem, porém sem limitações, sulfóxido de dimetila (DMSO), e com-primento, complementaridade, teor de GC e ponto de fusão (Tm) de ácidosnucléicos.
Em algumas modalidades, por exemplo, os métodos que envol-vem a detecção de variação de seqüências e/ou a detecção de DNA metila-do, os parâmetros experimentais, e de preferência, incluindo a temperaturana qual o método é realizado, podem ser otimizados de modo a discriminarentre a ligação de um componente ácido nucléico da MNAzima para um áci-do nucléico-alvo, que compreende ou não uma variação de seqüência ou umnucleotídeo metilado, respectivamente. A temperatura na qual esses méto-dos podem ser realizados pode ficar na faixa entre cerca de 20 °C e cercade 96 °C, cerca de 20°C a cerca de 75 °C, 20 °C a cerca de 60 °C ou cercade 20 a cerca de 55 °C.
Em uma modalidade preferida, são aqui fornecidas as reaçõesotimizadas para praticar os métodos para usar MNAzimas. Nessas reaçõesotimizadas, a atividade catalítica é aumentada em até cerca de 10, 20, ou30% acima das reações não-otimizadas. As condições mais preferidas dareação melhoram a atividade catalítica em pelo menos 35% ou 40%, e maispreferivelmente, em até 50% ou mais. Em modalidades ainda mais preferi-das, as reações otimizadas têm um aumento da atividade catalítica de maisdo que 50%, e até 66%, 75% ou mesmo 100%. Em modalidades ainda maispreferidas, um método de reação completamente otimizado deve proporcio-nar um aumento de 100, 200 ou mesmo 300% ou mais na atividade catalíti-ca. Outras condições preferidas da reação podem melhorar a atvidade cata-lítica em até 1.000% ou mais em comparação com os métodos praticadoscom condições da reação não-otimizadas. Uma condição de reação alta-mente preferida para otimizar os métodos aqui fornecidos é a inclusão decertos cátions bivalentes. A atividade catalítica da maioria das enzimas deácidos nucléicos pode ser influenciada de uma maneira dependente da con-centração pela concentração de cátions bivalentes. As reações otimizadaspreferidas são otimizadas para um ou mais entre Ba2+, Sr2+, Mg2+, Ca2+, Ni2+,Co2+, Mn2+, Zn2+, e Pb2+.
9. Métodos que Usam Aptâmeros
Os versados nessas técnicas devem avaliar facilmente que osmétodos aqui descritos podem ser realizados com aptâmeros, onde os ditosaptâmeros podem facilitar a detecção, identificação e/ou quantificação dealvos, incluindo alvos diferentes de ácidos nucéicos.
Fazendo referência às Figuras 4 e 20, lá está exemplificado ummétodo para usar MNAzimas para detectar alvos, incluindo entidades dife-rentes de ácidos nucléicos. Este método usa aptâmeros que podem com-preender um ácido nucléico ou proteína, polipeptídeo, ou peptídeo ou com-binação deles, que tem a capacidade de reconhecer um ou mais ligantes. Osaptâmeros podem ligar, por exemplo, proteínas, polipeptídeos, peptídeos ouácidos nucléicos, glicoproteínas, lipídeos, lipoproteínas, células, vírus, bacté-ria, Archaea, fungos, anticorpos, metabólitos, patógenos, toxinas, contami-nantes, venenos, organismos inteiros, moléculas pequenas, polímeros, íonsmetálicos, sais metálicos, príons ou quaisquer derivados, partes ou combi-nações deles, ou qualquer outra entidade (Lee et ai, 2004).
Os aptâmeros preferidos em questão podem compreender DNAcurto de filamento único ou oligômeros de RNA ou peptídeos que podem serisolados a partir de bibliotecas complexas de ácidos nucléicos ou peptídeossintéticos por processo interativo de adsorção, recuperação, e reampliação.Os aptâmeros podem ser, portanto, gerados contra quase qualquer alvo,desde moléculas pequenas, tais como aminoácidos ou antibióticos, até es-truturas de proteínas e ácidos nucléicos. Em modalidades preferidas, os ap-tâmeros incluem, por exemplo, moléculas ligantes de ácidos nucléicos, quesão geradas, de preferência, por técnicas de evolução e seleção. De prefe-rência, os aptâmeros podem compreender moléculas de DNA ou RNA, ouuma combinação de ambas, incluindo, porém sem limitações, análogos denucleotídeos, como por exemplo, indicado na Tabela 2 acima.
As estratégias para combinar o uso de aptâmeros com MNAzi-mas estão ilustradas nas Figuras 4 e 20. Fazendo referência à Figura 4,
Quadro (i), os oligonucleotídeos de ácidos nucléicos necessários para estaestratégia de detecção de MNAzimas podem incluir: (a) uma partizima-padrão; (b) uma apta-partizima que é uma partizima que incorpora um aptâ-mero (seqüência em negrito), bem como uma seqüência complementar ca-paz de formar um grampo e, portanto, inibir a combinação da MNAzima; (c)um facilitador de combinação que pode se ligar à apta-partizima e à partizi-ma, permitindo assim a combinação de uma MNAzima ativa; e (d) um subs-trato. Na ausência de um analito-alvo (An), a apta-partizima adota uma es-trutura de grampo que inibe a combinação de uma MNAzima ativa. Na pre-sença do analisado-alvo, o analisado-alvo se liga ao domínio do aptâmeroda apta-partizima, rompendo assim a estrutura de grampo e permitindo quea apta-partizima participe na combinação de uma MNAzima ativa. A MNAzi-ma ativa pode então modificar um substrato, causando, por exemplo, a ge-ração do sinal fluorescente.
Fazendo referência à Figura 4, Quadro (ii), os oligonucleotídeosde ácidos nucléicos para esta estratégia de detecção de MNAzima podemincluir; (a) duas partizimas-padrão; (b) um facilitador de combinação que in-coorpora um aptâmero (seqüência em negrito), bem como uma seqüênciainibidora complementar capaz de formar uma estrutura de grampo; e (c) umsubstrato. Na ausência de um analisado-alvo, o facilitador de combinaçãoadota uma estrutura de grampo que inibe a capacidade deste componentede direcionar a combinação de MNAzimas ativas. Na presença do analisado-alvo, o analisado-alvo se liga ao domínio do aptâmero do facilitador de com-binação, rompendo assim a estrutura de grampo e permitindo que o compio-nente direcione a combinação de uma MNAzima ativa. A MNAzima ativa po-de então modificar um substrato, causando, por exemplo, a geração do sinalfluorescente.Os versados nessas técnicas devem avaliar que o aptâmero po-de ser incorporado em qualquer uma das duas extremidades da molécula oumoléculas do facilitador de combinação. Além disso, deve-se avaliar quemúltiplos aptâmeros poderiam ser incorporados em um ou mais dos compo-nentes oligonucleotídeos de partizimas. O facilitador de combinação nas es-tratégias ilustradas na Figura 4, Quadros (i) e (ii) pode compreender DNA1RNA1 LNA, PNA ou uma seqüência que contém um ou mais análogos debases de nucleotídeos. Em outras modalidades, o alvo An é um ácido nu-cléico. Nessas modalidades, uma seqüência complementar ao ácido nucléi-co-alvo e substitui a seqüência de aptâmero em negrito na Figura 4.
Fazendo referência à Figura 4, Quadro (iii), os oligonucleotídeosde ácidos nucléicos necessários para esta estratégia de detecção de MNA-zimas podem incluir duas apta-partizimas, cada uma das quais contendouma parte de um aptâmero. Na ausência de um analisado-alvo, as MNAzi-mas ativas não podem se combinar. Na presença do analisado-alvo, o anali-sado-alvo serve como facilitador de combinação, juntando os componentesoligonucleotídeos, direcionando assim a combinação de uma MNAzima ati-va. A MNAzima ativa pode então modificar um substrato, causando, por e-xemplo, a geração do sinal fluorescente.
Uma estratégia afim, que combina ligação de aptâmero e combi-nação de MNAzima, está ilustrada na Figura 20. Nesta estratégia, uma se-qüência de aptâmero é incorporada na extremidade de uma partizima (apta-partizima) em uma configuração pela qual uma MNAzima ativa é formadaapenas na presença do analisado-alvo. Os componentes oligonucleotídeosnecessários para a estratégia ilustrada de detecção de MNAzimas, incluem:(a) uma partizima-padrão; (b) uma apta-partizima que é uma partizima comum aptâmero incorporado em uma das suas extremidades; (c) um facilitadorde combinação que se liga à apta-partizima e também à partizima, permitin-do a combinação de uma MNAzima ativa (na presença do alvo); (d) umasonda de substratorepórter; e (e) um inibidor de combinação que hibridizapara a apta-partizima em uma região que cobre pelo menos parte da se-qüência do aptâmero e parte do braço de ligação do substrato da seqüênciada partizima. Na ausência de um alvo (quadro do lado esquerdo), o inibidorde combinação se liga à apta-partizima, bloqueando assim a ligação (e aclivagem) da sonda de substratorepórter. Na presença de um alvo (quadrodo lado direito), o alvo se liga à seqüência de aptâmero da apta-partizima,impedindo a ligação do inibidor de combinação e permitindo a ligação e aclivagem da sonda de substratorepórter. Assim sendo, uma MNazima ativapode apenas se formar e causar a geração do sinal fluorescente na presen-ça do alvo.
Além disso, deve ser avaliado pelos versados nessas técnicasque a estratégia ilustrada na Figura 20 é similar àquela ilustrada na Figura 4,Quadro (i), a diferença sendo que a seqüência inibidora complementar, queimpede a formação da MNAzima ativa, é incorporada em um componenteoligonucleotídeo da partizima (Figura 4, Quadro (i)) ou em uma moléculaseparada (Figura 20). Assim sendo, uma seqüência inibidora pode ser umamolécula separada ou pode ser incorporada em um dos componentes queparticipam no complexo da MNAzima.
Os versados na técnicas devem avaliar também que um ou maisaptâmeros poderiam ser incorporados em qualquer um dos componentesoligonucleotídeos, incluindo as partizimas, o facilitador de combinação ou osubstrato. Além disso, o aptâmero poderia ser incorporado em qualquer umadas duas extremidades de qualquer um desses oligonucleotídeos.
A invenção pode ser mais bem entendida fazendo referência aosExemplos 18 e 21, onde a estratégia aptâmero/MNAzima é usada para de-tectar uma molécua pequena (ATP) e uma proteína (Taq polimerase), res-pectivamente.
10. Métodos para a Detecção, Identificação e Quantificação demicroRNA
Os versados na técnica devem entender que a detecção, identi-ficação e/ou quantificação de microRNA representa uma modalidade especí-fica dos métodos aqui descritos. Fazendo referência à Figura 5, lá está e-xemplificada uma estratégia para a ampliação de seqüências curtas de áci-dos nucléicos (por exemplo, microRNAs (miRs)) e a detecção de amplicons,usando MNAzimas.
A detecção de seqüências curtas de ácidos nucléicos, tais comomicroRNAs (miRs) requer estratégias adicionais principalmente em virtudedo tamanho pequeno desses alvos. Os MiRs são moléculas de RNA não-codificadoras com um comprimento de aproximadamente 22 nucleotídeos.Elas podem ser detectadas clonando ou por análise Northern blot, mas estesmétodos são laboriosos e requerem quantidades maiores do RNA total doque as técnicas tais como RT-PCR. O tamanho pequeno de miRs forneceseqüência insuficiente para acomodar dois iniciadores de PCR com dese-nho-padrão. Além disso, mesmo se a ampliação de miR for realizada, é difí-cil distinguir amplicons genuínos de dímeros de iniciadores usando qualquertamanho (determinado por eletroforese), ou fluorescência a partir da interca-lação de corantes inespécíficos, tais como Sybr Green ou Brometo de Etídio.Esta limitação poderia ser superada sondando os amplicons de miR comsondas de hibridização internas, tais como as sondas TaqMan® ou Beacon;entretanto, novamente o tamanho pequeno dos amplicons proíbe o uso desondas com desenhos-padrão.
Um método de RT-PCR com TaqMan® modificado (Chen et ai,2005) para análise de miR inicia a transcrição reversa usando iniciadores 3'que têm terminais 3' específicos de miR e seqüências não-relacionadas adi-cionais en seus terminais 5' que podem formar em forma de alça ("stern-loop")s. O cDNA gerado é ampliado usando estes iniciadores 3' e iniciadores5', que também têm terminais 3* específicos de miR e seqüências não-relacionadas adicionais nos seus terminais 5'. A ampliação é monitorada emtempo real usando sondas TaqMan® que se ligam a seqüências de miR eseqüências não-relacionadas introduzidas pelos iniciadores. Entretanto, emvirtude do desenho dos iniciadores, e do tamanho e posicionamento da son-da TaqMan®, há ainda a possibilidade de que miR's específicos possam nãoser distinguidos de seqüências intimamente relacionadas.
Como ilustrado na Figura 5, o método aqui empregado emprega,de preferência, um iniciador 3' que se liga a um miR na sua extremidade 3' etem uma seqüência de prolongamento, não-relacionada ao miR, que podeou não formar um em forma de alça ("stern-loop") na extremidade 5'. Comoestá representado na Figura 5, a seqüência não-relacionada do iniciador po-de criar uma estrutura de alça (Figura 5, lado esquerdo) ou pode meramentecriar uma estrutura de rotulador (Figura 5, lado direito). Em qualquer um dosdois exemplos, o iniciador 3' de miR é prolongado na presença de transcrip-tase reversa, e em seguida, por ampliação por PCR, usando iniciadores 5' e3' com seqüência específica de miR na extremidade 3' com seqüência deprolongamento não-relacionada nas extremidades 5'. Os amplicons são de-tectados facilmente por MNAzimas, que reconhecem e hibridizam para oamplicon, incluindo a região entre os iniciadores 5' e 3'. O requerimento es-trito de complementaridade entre o braço sensor da MNAzima e o ácido nu-cléico-alvo permite a discriminação de seqüências mesmo intimamente rela-cionadas. O Exemplo 5 e o Exemplo 10 nos Exemplos abaixo demonstramos resultados de usar MNAzimas para detectar amplicons gerados por am-pliação de seqüências curtas de ácidos nucléicos (vide também Estratégia 2na Figura 2 acima). Além disso, o Exemplo 5 demonstra a capacidade dosmétodos que usam MNAzimas para distinguir entre duas seqüências quetêm apenas uma única diferença de nucleotídeos. Isto proporciona um van-tagem importante pelo fato de que, mesmo quando o processo de ampliaçãoé incapaz de discriminar entre seqüências intimamente relacionadas, asMNAzimas permitem a discriminação entre variações mínimas de seqüên-cias nos amplicons resultantes.
11. Métodos que Usam Cascatas
Os versados nessas técnicas devem avaliar que os métodos a-qui descritos podem ser usados para realizar uma cascata, como aqui defi-nido. As modalidades específicas para realizar tais métodos, como aqui des-crito, incluem, porém sem limtações, (1) o uso de uma MNAzima para clivarum substrato apenas na presença de um alvo, onde o dito substrato é entãotornado disponível para envolvimento em um Segundo episódio, tal como ageração de um sinal detectável, como representado na Figura 6, onde a cli-vagem disponibiliza uma enzima que pode então clivar uma âncora, resul-tando desta forma em um rotulador fluorescente que se dissocia de umquencher, ou (2) o uso de uma MNAzima para clivar um substrato apenas napresença de um alvo, onde o dito substrato é então tornado disponível paraenvolvimento em um Segundo episódio, onde o desempenho do dito segun-do episódio, por sua vez, torna disponível um outro substrato para envolvi-mento em inúmeros episódios subseqüentes, de tal modo que um episódiosubseqüente disponibilize um substrato para envolvimento no desempenhode um episódio anterior, criando desta forma uma cascata cíclica, tal comorepresentado nas Figuras 7 e 25, onde tais cascatas cíclicas podem ser em-pregadas para ampliar um sinal, por exemplo, em aplicações nas quais abaixa abundância de um alvo pode não proporcionar de outra forma um sinalque é detectável.
Uma cascata de ampliação de efeito detectável pode compreen-der uma ou mais cascatas de ribozima/ligase, uma cascata de enzimas deácidos nucléicos circular, uma cascata de enzimas protéicas, ou uma ou15 mais enzimas afixadas a um suporte, ou qualquer combinação delas.
Fazendo referência à Figura 2, a Estratégia 3 ilustra uma visãogeral de um método para usar uma MNAzima para ampliar um sinal atravésdo uso de uma cascata de sinais. Isto está discutido mais detalhadamentecom relação às Figuras 6, 7 e 25.
A Figura 6 representa um método exemplificativo para a detec-ção por MNAzima de um alvo acoplado com ampliação de sinais mediadapor enzimas. Como discutido acima, a invenção fornece métodos para usara detecção por MNAzima, onde um alvo é ampliado, bem como métodos nosquais um sinal gerado é ampliado. Em algumas modalidades, combinando atecnologia de MNAzima com estratégias de ampliação de sinais proporcionauma alternativa aos ensaios de MNAzimas combinados com ampliação dealvos, embora em alguns casos a ampliação do alvo e também a ampliaçãodo sinal possam ser usadas conjuntamente. Os métodos preferidos paraampliar sinais envolvem mecanismos de cascata, os quais os versados nes-sas técnicas devem avaliar estão freqüentemente envolvidos em ampliaçãode sinais em sistemas biológicos.
Vários exemplos de cascatas de ampliação, que usam ácidosnucléicos catalíticos, são conhecidos nessas técnicas e estão contempladospara o uso em questão. As cascatas de ligação (Paul e Joyce, 2004) usamuma primeira ribozima (A) que liga dois oligonucleotídeos que contêm RNA,para formar uma segunda ribozima (Β). A ribozima (B)1 então, liga dois ou-tros oligonucleotídeos que contêm RNA, para formar uma nova primeira ri-bozima (A), disparando assim uma reação em cascata.
Uma segunda cascata de ampliação, apropriada para o uso emquestão, usa moléculas de DNAzima/substrato circularizadas (Levy e Elling-ton, 2003). Uma DNAzima (A) é inativa quando circular, mas torna-se ativa-da por linearização por uma segunda DNAzima (B), que cliva a DNAzima (A)circular. Uma DNAzima (A) linear ativa, então, cliva as moléculas de DNAzi-ma (B) circulares, e desta forma, linearizando-as e ativando-as. As duasDNAzimas capazes de clivar/linearizar reciprocamente resultam em umacascata de atividade de ácidos nucléicos catalíticos.
Os versados nessas técnicas devem entender que outras abor-dagens estão disponíveis - por exemplo, combiner o uso de DNAzimas coma versatilidade de aptâmeros e/ou com a potência catalítica de enzimas pro-téicas tradicionais (vide, por exemplo, Zhang et ai, 2005). O método deZhang resulta na liberação de uma enzima protéica que pode, por sua vez,catalisar a formação de moléculas detectáveis, e desta forma gerando e am-pliando o sinal. A abordagem de Zhang permite a detecção sensível, mas elaé onerosa pois ela requer moléculas altamente individualizadas para cadaensaio. Os métodos para acoplar peptídeos a ácidos nucléicos são conheci-dos nessas técnicas (vide, por exemplo, Cheng et ai, 1993), pois são méto-dos para afixar DNA a estruturas de suporte. Por exemplo, Asher(PCT/US96/02380) descreveu a amarração de uma enzima (ribozima) a umsuporte insolúvel, o qual, depois da liberação, clivou um substrato, iniciandodesta forma a ampliação de um sinal, usando duas ribozimas especialmenteseparadas.
Outros exemplos de ampliação de sinais para métodos in vitrosão conhecidos nessas técnicas, e ainda outras estratégias para ampliarsinais podem ser criadas, usando técnicas similares àquelas que demonstra-ram ser exitosas. Por exemplo, o ensaio de DNA ramificado) (Urdea, 1993)amplia um sinal empregando uma molécula-repórter secundária (por exem-plo, fosfatase alcalina) afixada a sondas rotuladas que medeiam a reação. Aespectroscopia de correlação com fluorescência (FCS) emprega ampliaçãoeletrônica do sinal (Eigen e Rigler, 1994). A ampliação de sinais com tirami-da (TSA) (Bobrow et ai, 1989; Adams, 1992; Raap et ai, 1995; van Gijlswijket ai, 1997), usa peroxidase de raiz-forte, para converter tiramisida em suaforma ativa, que se liga a resíduos de tirosina em proteínas. TSA é usadapara várias aplicações de imunoquímica de células. O ensaio Invader (Hall etai, 2000) emprega dois oligonucleotídeos que se ligam a uma seqüência-alvo de uma maneira que permite a clivagem de nucleases, levando a maisdo que 1.000 episódios de clivagem por molécula-alvo no decorrer do tempo,e a reação de clivagem pode ser acoplada a uma sonda fluorescente. Entre-tanto, há limitações aos métodos de ampliação de sinais conhecidos. Porexemplo, o ensaio de bDNA não é tão sensível quanto os métodos de ampli-ação de alvos.
Assim sendo, prestando mais atenção à Figura 6, lá está repre-sentado um exemplo de um método que emprega uma enzima liberada porMNAzimas como parte de uma estratégia de ampliação de sinais. O sinalpode ser gerado, por exemplo, por clivagem por enzima de um substratoentre uma porção fluoróforo e uma porção quencher, permitindo assim queum sinal seja gerado. As enzimas contempladas para uso em questão inclu-em, porém sem limitações, DNAzimas, MNAzimas, ribozimas, e enzimasprotéicas com atividade mensurável, tais como proteases, endonucleases derestrição e outras enzimas hidrolíticas. Os alvos preferidos são seqüênciasde ácidos nucléicos que incluem, porém sem limitações, DNA ou RNA hu-mano, animal, vegetal, viral, bacteriano. Outros alvos preferidos podem in-cluir príon, levedura ou fungo, ou qualquer outra molécula, por exemplo, in-cluindo, porém sem limitações, glicoproteínas, lipídeos, lipoproteínas, orga-nismos inteiros, células, vírus, bactérias, Archaea, fungos, anticorpos, meta-bólitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequenas,polímeros, íons metálicos, sais metálicos, príons ou quaisquer derivados,parte ou combinações deles.
Como pode ser observado na Figura 6, uma enxima exemplifica-tiva, neste caso designada "Enzima" é afixada a um primeiro suporte insolú-vel, através de uma molécula clivável, de prefrência um ácido nucléico. Co-mo ilustrado no exemplo da Figura 6, a molécula clivável que atua como fi-xação para a enzima "Enzima" é um substrato genérico ou universal deMNAzima. Está também afixado a um suporte insolúvel não em contato como primeiro suporte insolúvel um substrato "âncora clivável" para a enzima"Enzima". A "Enzima" é uma enzima com uma atividade detectável, por e-xemplo, uma MNAzima, DNAzima, ribozima, ou enzima protéica, como des-crito acima. Em modalidades preferidas, as MNAzimas ou DNAzimas sãoparticularmente úteis. Na presença dos componentes oligonucleotídeos, oupartizimas, que se autocombinam para formar uma MNAzima capaz de clivaro substrato universal ou genérico, e na presença do alvo para a MNAzima, aMNAzima forma e cliva cataliticamente a "Enzima" do suporte, e desta formaliberando-a e permitindo que ela acesse o substrato "âncora clivável" e clive-o. A clivagem da "âncora clivável" libera a fluoróforo do substrato afixado. Ofluoróforo é detectado e medido facilmente.
A separação física de uma enzima imobilizada ou afixada do seusubstrato, que está, de preferência, imobilizado ou afixado a um suporte, éaqui algumas vezrs referida como "separação espacial". Uma ou mais enzi-mas podem ser "separadas espacialmente" dos seus respectivos substratos,e umas das outras. Pode resultar uma cascata de ampliação de sinais, parti-cularmente quando a clivagem do substrato para a primeira enzima libera asegunda enzima, a qual, por sua vez, libera mais primeira enzima quando osubstrato para a segunda enzima é clivado (vide Figura 7).
Em modalidades preferidas, o substrato para a enzima "Enzima"é um substrato bifuncional como ilustrado, compreendendo uma parte quen-cher e também uma parte detectável. As modalidades particularmente prefe-ridas são aquelas nas quais o substrato para a enzima "Enzima" é uma mo-lécula sem qualquer sinal detectável, enquanto que no substrato não clivado,e cujo sinal detectável aumenta em muitas ordens de grandeza depois daclivagem.
Fazenda referência agora à Figura 7, está ilustrado um exemplode um ensaio que usa MNAzimas e uma ampliação de sinal, usando duasenzimas "espacialmente separadas". Uma cascata de ampliação de sinais também pode ser gerada usando tais DNAzimas, como descrito acima. Umepisódio inicial de clivagem por MNAzima cliva um substrato amarrado imo-bilizado, liberando desta forma a DNAzima A. A DNAzima A, então, migrapara uma segunda onde uma segunda DNAzima B é amarrada. A DNAzimaA libera a DNAzima B, a qual, por sua vez, libera mais DNAzima A. Uma cascata é iniciada , resultando em uma ampliação de sinal. Em várias moda-lidades, o alvo pode ser seqüências de ácidos nucléicos, incluindo, porémsem limitações, DNA ou RNA humano, viral, bacteriano; ou o alvo pode serproteínas, vírus, venenos, anticorpos, células inteiras ou moléculas peque-nas.
Particularmente, pode-se observer a partir do exemplo na Figura7 que a DNAzima A está afixada a um suporte através de um primeiro subs-trato universal ou substrato generic de MNAzima, que também é clivado pelaDNAzima Β. A DNAzima B está afixada a um suporte insolúvel através deum segundo substrato genérico que é um substrato para a DNAzima A. Am- bas DNAzimas ficam retidas, de tal modo que seus respectivos substratossejam inacessíveis a elas. Na presença das partizimas que se autocombi-nam para formar uma MNAzima que cliva o substrato universal, e na pre-sença adicional do alvo, a MNAzima é formada e cliva o substrato universalda MNAzima, retendo a DNAzima A, liberando desta forma a DNAzima A. ADNAzima A pode agora migrar para o segundo substrato genérico. Depoisda clivagem do segundo substrato genérico pela DNAzima A, a DNAzima Bé liberada junto com seu sinal detectável afixado, ilustrado neste caso comoo fluoróforo F. O fluoróforo F é agora detectável pois ele se separa de umaparte quencherQ retida. A DNAzima B liberada, agora capaz de acessar seusubstrato assim o faz, clivando-o (o primeiro substrato genérico), e destaforma liberando mais DNAzima A, a qual, por sua vez, libera mais DNAzimaBeo sinal detectável F. Assim sendo, uma cascata de ampliação de sinaispotente é estabelecida, com quantidades exponencialmente crescentes dosinal detectável F.
Um exemplo de uma cascata de MNAzima, que usa partizimasamarradas pode ser mais bem entendido fazendo referência à Figura 25. AsMNAzimas podem ser usadas para iniciar cascatas de ampliação de sinais,como ilustrado neste diagrama. A reação contém os seguintes elementos: (i)partizimas para a MNAzima 1, que estão livres em solução; (ii) um facilitadorde combinação para as MNAzimas 2 e 3 (que têm os mesmos braços senso-res), que está livre em solução (como ilustrado) ou amarrado a um substratoinsolúvel, Sub 1; (iii) partizimas para a MNAzima 2, que estão amarradas aum suporte insolúvel pelo substrato, Sub 1. Sub 1 pode ser clivado pelaMNAzima 1 (na presença de um analisado-alvo) ou pela MNAzima 3 (napresença de um facilitador de combinação), e a clivagem resulta na libera-ção das partizimas para a MNAzima 2 dentro da solução; (iv) partizimas paraa MNAzima 3, que estão amarradas a um suporte insolúvel pelo substrate,Sub 2. Sub 2 pode ser clivado pela MNAzima 2 (na presença de um facilita-dor de combinação) e a clivagem resulta na liberação das partizimas para aMNAzima 3 dentro da solução; (v) Sub 2-FQ, que tem a mesma seqüênciaque Sub 2, mas está livre em solução e rotulado duplamente com um fluoró-foro (F) e um quencher (Q). Sub 2-FQ pode ser clivado pela MNAzima 2 pa-ra gerar um sinal fluorescente.
Na presença do analisado-alvo, a MNAzima 1 ativa forma aspartizimas que estão livres em solução. A MNAzima 1 cliva seu Sub 1, libe-rando assim as partizimas para a MNAzima 2. Depois de livres, estas parti-zimas hibridizam com o facilitador de combinação e formam a MNAzima 2,que cliva liberando Sub 2-FQ (gerando um sinal fluorescente), ou Sub 2 a-marrado (liberando partizimas para a MNAzima 3). Como a MNAzima 3compartilha os mesmos braços de substrato que a MNAzima 1, ela tambémpode clivar Subi amarrado, liberando assim mais partizimas para a MNAzi-ma 2. Isto resulta em uma cascata de geração enzimática dos componentes(partizimas) para mais enzimas (MNAzimas) e uma cascata concomitante deampliação de sinais.12. Métodos para a Detecção, Identificação e Quantificação de
Ácido Nucléico Metilado
A geração de sinais mediada por MNAzima permite a discrimi-nação entre seqüências de ácidos nucléicos completamente emparelhadas eaquelas que contêm desemparelhamentos. Esta capacidade permite que asMNAzimas sejam usadas para a detecção, identificação e quantificação deácido nucléico metilado.
Alterações no padrão de metilação ocorrem freqüentemente emassociação com doenças tais como câncer, diabetes, doenças auto-imunes,e distúrbios psiquiátricos. A vasta maioria de protocolos usados atualmentepara análise de metilação começa com modificação por bissulfito de DNAgenômico. A modificação com bissulfito converte citidinas não-metiladas,mas não as metiladas, ém uridinas. Caso o ácido nucléico modificado combissulfito venha a ser então ampliado, por exemplo, por PCR, as uridinas sãosubstituídas por timidinas e a citidina metilada é substituída por citidina. Osamplicons modificados podem ser analisados por vários métodos que permi-tem a discriminação das seqüências que contêm T (em posições que origi-nalmente contêm C não-metilado) e C (em posições que originalmente con-têm C metilado).
A capacidade de as MNAzimas para discriminarem entre varian-tes de seqüências intimamente relacionadas torna esta tecnologia bem a-propriada para discriminar entre seqüências modificadas com bissulfito, queeram originalmente metiladas ou não-metiladas. A abordagem pode ser maisbem entendida fazendo referência ao Exemplo 11.
Além disso, as MNAzimas podem proporcionar uma nova abor-dagem que permite a análise direta de DNA metilado e não-metilado, sem anecessidade de modificação com bissulfito. Isto proporciona uma vantagemsignificativa porque a modificação com bissulfito é laboriosa, morosa e des-trutiva para o ácido nucléico a ser analisado.
O uso de um braço estabilizador com uma partizima que tem umbraço sensor truncado foi realizado para demonstrar a capacidade de MNA-zimas detectarem polimorfismos de nucleotídeos individuais presentes emfacilitadores de combinação (Exemplo 22). Sob as condições experimentaisusadas nesse exemplo, uma partizima com um braço sensor truncado (cincobases) foi funcional em uma temperatura bem acima da sua temoeratura defusão esperada. Os sistemas com braços estabilizadores, e com partizimasque têm braços sensores truncados, são muito sensíveis a pequenas mu-danças no alvo, e agüentam o uso em temperaturas altamente severas. Estaestratégia de detecção pode ser estendida ainda mais para discriminar dire-tamente entre alvos, que são metilados ou não-metilados em resíduos espe-cíficos de citosinas, sem a necessidade de modificação prévia com bissulfito.
A presença de 5-metil-citosina(s) aumenta a temperatura de fu-são do DNA em 1,3°C por base metilada, em relação a citosina(s) não-metilada(s). Quando partizimas, um braço estabilizador, e um substrato sãoincubados em uma temperatura que é apropriada para hibridização e combi-nação de MNAzima ativa na presença de um alvo metilado, mas que é altademais para a combinação da MNAzima na presença de um alvo não-metilado, um sinal seria gerado apenas na presença do alvo metilado. Istoproporciona uma nova estratégia para a análise direta de padrões de metila-ção que podem proporcionar um método para a detecção de bases metila-das como rotuladores de câncer e outras doenças.
Os versados nessas técnicas devem, portanto, avaliar e enten-der facilmente que a otimização de parâmetros experimentais, incluindo atemperatura, como aqui descrito, é contemplada como estando dentro doâmbito dos métodos da presente invenção, e que tal otimização encontraparticular aplicação no desempenho de métodos referentes à detecção deDNA metilado, seja diretamente ou depois de modificação com bissulfito.13. Métodos para a Detecção e Identificação de Variantes de
Ácidos Nucléicos
A presente invenção fornece ainda métodos para a detecção eidentificação de variantes de seqüências na base de que a geração de sinaismediada por MNAzimas permite a discriminação entre seqüências de ácidosnucléicos completamente emparelhadas e aquelas que contêm desempare-Ihamentos.As variações de seqüências capazes de detcção pelos métodosda presente invenção incluem, porém sem limitações, adições, deleções,substituições, conversões, duplicações, translocações, variantes de seqüên-cias com deslocamento de estrutura, variantes de seqüências sem sentido,ou qualquer combinação delas.
Os métodos podem ser aplicados em qualquer situação na qualé desejável detectar e/ou identificar variação de seqüência de ácido nucléi-co, incluindo, porém sem limitações, o diagnóstico de doenças ou predispo-sições a elas, identificação de polimorfismos, ou avaliação da exatidão dareplicação de ácidos nucléicos. Além disso, alterações maiores tais comotranslocações associadas com vários tipos de câncer, que resultam emtranscritos de fusão, também podem ser detectadas. Elas ocorrem freqüen-temente em associação com leucemia. Por exemplo, transcritos da fusãoPML/RARD estão associados com leucemia promielocítica aguda e transcri-tos da fusão bcr/abl estão associados com leucemia granulocítica crônica.
A detecção de alvos mediada por MNAzimas pode ocorrer porinermédio do reconhecimento de bases de Watson-Crick dos braços senso-res de partizimas e do facilitador de combinação. O requisito de complemen-taridade pode ser explorado para detectar pequnas variações de seqüên-cias, incluindo, porém sem limitações, desemparelhamentos de bases indivi-duais entre o braço sensor de partizima e o facilitador de combinação. A ca-pacidade de discriminação de variantes de seqüências pode ser mais bementendida fazendo referência aos Exemplos 5, 19 e 22.
Esses exemplos todos demonstraam a capacidade de as MNA-zimas discriminarem entre situações nas quais o braço sensor e o facilitadorde combinação estão completamente emparelhados, e situações nas quaishá pelo menos um desemparelhamento ou polimorfismo de bases individu-ais.
A capacidade de discriminar desemparelhamentos de bases in-dividuais depende de vários fatores, incluindo (a) a severidade das condi-ções da reação, que podem ser influenciadas por mitos fatores, incluído atemperatura, concentração de sais, concentração de cátions, (b) o tipo dedesemparelhamento, (c) a posição do desemparelhamento dentro do braçoda partizima, e (d) o comprimento do braço da partizima. Dependendo daaplicação, a severidade da reação pode ser individualizada para ser intole-rante, ou tolerante, até algum grau de desemparelhamento entre o braçosensor e o facilitador de combinação. As condições severas permitem a dis-criminação de variantes de seqüências intimamente relacionadas, tais comouma diferença de um único nucleotídeo. As condições de mais baixa severi-dade podem não discriminar entre facilitadores de combinação e seqüênciasintimamente relacionadas. Portanto, isto poderia ser explorado para detectarsimultaneamente um grupo de seqüências intimamente relacionadas emuma única reação com uma uma única MNAzima.
A discriminação de polimorfismos de um único nucleotídeo podeser estendida pelo uso de partizimas com braços sensores truncados (Figura23 e Exemplo 22). Os braços sensores truncados podem ser estabilizadospor um componente oligonucleotídeo estabilizador, o qual, embora seja umamolécula separada, pode ser considerado como um segundo componenteda partizima truncada, ao qual ele se liga adjacentemente.14. MNAzimas para a Detecção, Identificação e/ou Quantificação
de Bactérias e Vírus
A presente invenção engloba métodos para a detecção de bac-tériaa, vírus ou qualquer outro microorganismo, por exemplo, através do de-senho de braços sensores de MNAzimas1 que são adaptados para hibridizarqualquer molécula, tal como um ácido nucléico que é singular para o micro-organismo que se procura detectar, identificar e/ou quantificar. Adicional-mente ou alternativamente, uma classe de microorganismo pode ser detec-tada, por exemplo, incluindo, porém sem limtações, bactérias gram-positivasou gram-negativas. Além disso, variações dos métodos, que estão dentro doâmbito da avaliação pelos versados na técnica, incluem, porém sem limita-ções, o uso de um aptâmero adaptado para se ligar a uma proteína, molécu-la pequena, célula, componente celular ou produto celular, tal como umatoxina que é singular para o microorganismo que se procura detectar, identi-ficar e/ou quantificar.As bactérias e vírus contêm DNA e/ou RNA que podem propor-cionar um modelo para sua rápida e sensível identificação, detecção e/ouquantificação, usando a tecnologia de MNAizmas. A variação de seqüênciaentre espécies e cepas bacterianas e virais pode ser usada para permitir adiscriminação sensível entre espécies e cepas individuais. As abordagenscom MNAzimas multiplex são particularmente preferidas para a detecçãoe/ou identificação simultânea de múltiplas espécies, cepas ou isolados bac-terianos ou virais.
Alternativamente, as regiões com similaridade de seqüência natotalidade de espécies e cepas bacterianas ou virais podem ser usadas paraidenticar a presença ou ausência de qualquer grupo de espécies ou cepasindividuais em um único ensaio de MNAzima. Esta última abordagem estáexemplificada no Exemplo 15, onde uma região conservada encontrada naseqüência ribossômica 16S bacteriana foi usada como a base de um ensaiopara um ensaio para substituir o teste bacteriano de uma cepa gram por umteste de liberação rápida quanto à esterilidade e/ou contaminação com mi-coplasma.
O Exemplo 16, que ilustra o uso de MNAzimas para a detecçãoe quantificação do RNA viral de HIV-1, demonstra o uso de MNAzimas comouma ferramenta sensível para a detecção e quantificação viral.
15. Kits
A presente invenção fornece também kits para praticar os méto-dos aqui descritos. Tipicalmente, os kits para conduzir os métodos da pre-sente invenção contêm todos os reagentes necessaries para conduzir o mé-todo. Por exemplo, em uma modalidade, um kit pode compreender um pri-meiro recipiente que contém pelo menos um primeiro e um segundo compo-nentes oligonucleotídeos que compreendem uma primeira e uma segundapartizima, e um segundo recipiente que compreende um substrato, onde aautocombinação da primeira e segunda partizimas, e do substrato, em umaMNAzima requer associação de um facilitador de combinação presente emuma amostra do teste. Conseqüentemente, nessa modalidade, a primeira esegunda partizimas, e o substrato, pode ser aplicada à amostra do teste pa-ra determinar a presença do facilitador de combinação,onde o facilitador decombinação compreende o alvo.
Tipicamente, os kits da presente invenção devem compreendertambém um ou mais recipientes, que contêm, por exemplo, reagentes delavagem, e/ou outros reagentes conforme necessário para o desempenhodos métodos da invenção.
No contexto da presente invenção, um kit compartimentalizadoinclui qualquer kit no qual os reagentes ficam contidos em recipientes sepa-rados, e pode incluir pequenos recipientes de vidro, recipientes de plásticoou tiras de plástico ou papel. Tais recipientes podem possibilitar a transfe-rência eficiente de reagentes de um compartimento para outro compartimen-to, e ao mesmo tempo, evitando contaminação cruzada das amostras e rea-gentes, e a adição de agentes ou soluções de cada recipiente de um com-partimento para outro de uma maneira quantitativa. Tais kits podem incluirtambém um recipiente que deve comportar a amostra do teste, um recipienteque comtém os reagentes usados no ensaio, recipientes que contêm rea-gentes de lavagem, e recipientes que contêm um reagente de detecção. Ti-picalmente, um kit da presente invenção deve incluir também instruções,usando os componentes do kit components para conduzir os métodos apro-priados. Os kits e métodos da invenção podem ser usados em conjunto comequipamentos e sistemas analíticos automatizados, incluindo, por exemplo,porém sem limitações, aparelhos de PCR em tempo real.
Para aplicação para detecção, identificação ou quantificação dediferentes alvos, um único kit da invenção pode ser aplicável, ou alternati-vamente, diferentes kits, por exemplo, contendo reagentes específicos paracada alvo, podem ser necessários. Os métodos e kits da presente invençãoencontram aplicação em qualquer circunstância na qual é desejável detectar,identificar ou quantificar qualquer entidade.
A presente invenção será agora descrita adicionalmente commais detalhe fazendo referência aos exemplos específicos que se seguem,que não devem ser interpretados de forma alguma como Iimitativos do âmbi-to da invenção.EXEMPLOS
Nos exemplos que se seguem, vários desenhos de MNAzimas,baseados na divisão do núcleo catalítico da DNAzima 10:23 ou 8:17, foramadaptados para uma série de ácidos nucléicos-alvo e substrates-alvo (Tabe-la 3). Estes sistemas com substratos-alvo foram testados sob uma série decondições de reação e se comprovaram robustos.
Os desenhos exemplificativos de MNAzimas e as partizimas es-pecíficas usadas nos exemplos que se seguem estão listados na Tabela 3.
As partizimas são denominadas de tal modo que o nome (por exemplo,R04A1/1) incorpore a referência ao domínio do alvo (por exemplo, R04 paraRPLPO éxon 4), ao domínio necessário para a atividade catalítica da MNA-zima (por exemplum A1) e ao domínio do substrato domain (por exemplo, 1para SubBi-1).
Tabela 3: MNAzimas e Substratos Exemplificativos. Partizimas Especí-ficas Usadas nos Exemplos Experimentais
<table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table>Tabela 3 (continuação): MNAzimas e Substratos Exemplificativos. Par-tizimas Específicas Usadas nos Exemplos Experimentais.
<table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>Tabela 3 (continuação): MNAzimas e Substratos Exemplificativos. Par-tizimas Específicas Usadas nos Exemplos Experimentais.
<table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table>
Exemplo 1: Aplicação de MNAzimas para a Detecção de um Ácido Nu-cléico-alvo (seqüência RPLPO humana).
1.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Quatro desenhos de MNAzimas (Figuras 8-10), baseados naDNAzima 8:17, foram testados. Os versados nessas técnicas devem avaliarque as seqüências dos braços sensores (ligação do alvo) designadas por"N" podem ser substituídas por seqüências específicas do alvo para qual-quer ácido nucleico-alvo (Figuras 8-10). As seqüências de braços de subs-trato, que se ligam ao substratorepóter, podem ser genéricas e usadas paramuitos alvos. Os versados nessas técnicas devem avaliar que as seqüênciasde substrato designadas por "N'" nas Figuras 8-10 podem ser substituídaspor seqüências de DNA1 RNA ou quiméricas de DNA/RNA, e aquelas desig-nadas por "r" podem ser substituídas por outras seqüências e/ou um númerodiferente de seqüências de ribonucleotídeos.
Nos experimentos conduzidos para medir a atividade catalíticadas MNAzimas RPLPO descritas nas Figuras 8-10, as partizimas de oligo-nucieotídeos AeB foram desenhadas para alvejar éxon 4 do gene de RPL-PO. As seqüências das partizimas AeB estão listadas abaixo a partir de 5'até 3', onde as bases sublinhadas formam pelo menos parte do núcleo cata-lítico ativo da MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam com oalvo, e as bases em itálico hibridizam para o substrato.SEQ ID N0:1: Partizima A1 R04A1/1: GCTGGTCATCCAGCACGGTCGA-AATAGTGAGT
SEQ ID N0:2: Partizima A2 R04A2/1: GCTGGTCATCCAGCAGCGGTC-GAA ATAGTGAGT
SEQ ID N0:3: Partizima B1 R04B1/1: CA TCTCTTCTCCGTCGk-AGTGTTCGACAATGGC
SEQ ID N0:4: Partizima B2 R04B2/1: CA7C7C7TC7CCGGTGTTCG AC A-ATGGC
SEQ ID N0:5: Partizima B3 R04B3/1: CATCTCTTCTCCGAGCGTGTTC-GACAATGGC
1.2. Substratorepórter
A atividade da MNAzima é monitorada pela clivagem de umsubstratorepórter de ácido nucléico rotulado duplamente. A seqüência dosubstrato é uma seqüência quimérica que contém bases de RNA e tambémde DNA, que foi usada anteriormente como um substrato da DNAzima 8:17(Li et ai, 2000). No presente exemplo, o substratorepórter é designado Sub-Bi-1-FB e tem rotuladores internos, a saber, 6-carbóxi-fluoresceína ("6-FAM") afixada a um nucleotídeo 5' em relação à base de RNA, e um e por-ção Black Hole Quencher 1 ("BHQt") afixado a um nucleotídeo 3' em rela-ção à base de RNA. A clivagem de SubBi-1-FB por MNAzimas foi monitora-da a 530 nm (comprimento de onda de emissão FAM) com excitação em 485nm (comprimento de onda FAM). A seqüência de SubBi-1-FB rotulada é co-mo se segue, de 5' para 3', sendo que as bases sublinhadas indicam a posi-çãodos porções 6-FAM e BHQ1. As bases em letra minúscula representam oRNA e as bases em letra maiúscula representam o DNA.
SEQ ID NO: 6: SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
1.3. Seqüência de MNAzima de Controle
O controle da hibridização (MNAzima inativa) foi inativado mu-dando uma única base no oligonucleotídeo A1 que é essencial para a forma-ção do núcleo catalítico. Embora as seqüências do substratorepórter e doalvo ainda possam se ligar às MNAzimas1 o substrato não pode ser clivadodevido à modificação no núcleo catalítico da MNAzima. A ligação do substra-torepórter às moléculas de partizima poderia em si gerar uma medida defluorescência devido à mudança de conformação do substratorepórter de-pois da hibridização. Um controle que usa uma molécula de partizima A1mutada (R04A1mut) foi incluído e designado Controle de Hibridização. Aseqüência de MNAzima mutada está ilustrada abaixo e a posição da base Gque foi mudada está sublinhada.SEQ ID NO: 7: Mutant Partizima A
R04A1 mut/1 :GCTGGTCATCCAGCACGGTCTAAATAGTGAGT
1.4. Alvo
A seqüência do alvo para este exemplo foi um oligonucleotídeo,R04/1 Target, que tem a mesma seqüência que uma seção de éxon 4 dogene de RPLPO humano. A seqüência de R04/1 Target é a seguinte, escritade 5' para 3'.
SEQ ID NO: 8 R04/1 Target: GCCATTGTCGAACACCTGCTGGAT-GACCAGC
Para assegurar que um sinal não possa ser detectado quandouma seqüência de alvo incorreta está presente, o efeito "fora do alvo" foi de-terminado usando 3 pg de Iambda DNA (PROMEGA) ou um oligonucleotí-deo de controle negativo sintético com seqüência não-relacionada(R04/1mutTarget).
SEQID NO: 9 R04/1 mutTarget: CGACCATTAGGTCGTCCACA-AGCTGTTACCG1.5. Componentes da Reação
A detecção da seqüência do alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado por clivagem do substratorepórter pela MNAzimacataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substrato, eo volume total de todas as reações foi de 25 μL. Todas reações foram con-duzidas a 40°C em um termociclador SmartCycler® System (Cepheid). Afluorescência de cada reação foi lida a cada 7 segundos por um total de 10minutos. Todas reações na Tabela 4 continham a mistura em massa de 1μΜ SubBi-1-FB 1 μΜ em Tris HCI (pH 9,0 a 25°C) e MgCI2 25 mM.
Tabela 4: Componentes da Reação para a Detecção de um ácido nucléico
<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table>
Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycIe r® Sys-tem (Cepheid) utilizado durante um experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da flúorescência, pois isto reconhecidamentevaria entre cavidades. Isto foi medido lendo a flúorescência da mistura emmassa sozinha. Este valor foi então subtraído de todas as outras reaçõesrealizadas nessa cavidade para permitir comparações entre cavidades.
1.6. Resultados: Detecção da Clivagem do SubstratorepórterSubBM-FB
As MNAzimas com Desenhos 1 e 2 apresentaram pouca evidên-cia de clivagem dependente do alvo do substratorepórter sob as condiçõesdeste experimento (Figura 8). A flúorescência foi similar para reações com esem alvo oligonucleotídeo RPLPO-alvo. A adição do oligonucleotídeo RPL-PO-alvo resultou em um aumento de flúorescência para o desenho 3 (Figu-ras 9 e 10) e desenho 4 (Figura 10). Isso é consistente com a formação deMNAzimas ativas na presença do ácido nucléico-alvo, resultando na cliva-gem do substratorepórter entre o para de corantes fluoróforo e quencher,causando um aumento na flúorescência. A flúorescência dos controles semalvo foi mais baixa do que nas reações que contêm alvo, e nenhuma dasreações de controle apresentou um aumento na fluorescência no decorrer dotempo (Figuras 8-10). Isto demonstra que o aumento na fluorescência pro-duzido em reações que contêm alvo se deve à combinação dependente doalvo de uma MNAzima cataliticamente ativa que então clivou o substratore-pórter. A eficiência da clivagem do desenho 4 foi maior do que o desenho 3para o sistema de RPLPO (Figura 10).
As reações de controle fora do alvo, de hibridização, apenasPartizima A e apenas Partizima B estão ilustradas para o desenho 3 (Figura9). Os níveis de fluorescência destes controles foram mais baixos ou simila-res àquele das reações sem alvo. Nenhuma das reações de controle apre-sentou um aumento na fluorescência no decorrer do tempo. Estes resultadosdemonstram ainda mais que a clivagem do substratorepórter é dependenteda presença dos oligonucleotídeos da Partizima A e da Partizima B que sãonecessários para a combinação de uma MNAzima ativa, bem como da se-qüência do ácido nucléico-alvo.
Exemplo 2: MNAzimas para a Detecção de miR-20 ou Seqüências de
DNA Curtas Homólogas a miR-20.
2.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
A detecção que usa MNAzimas pode ser usada também para aanálise de miRs. Neste exemplo, a MNAzima se forma apenas quando aseqüência correta de miR está presente. Esta MNAzima pode distinguir entreseqüências de miR relacionadas, como por exemplo, hsa-miR-20 e hsa-miR-93.
Nos experimentos conduzidos para medir a atividade catalíticada MNAzima descrita na Figura 11, os oligonucleotídeos das partizimas A eB foram desenhados para acertar hsa-miR-20. As seqüências dos oligonu-cleotídeos das partizimas AeB estão listadas abaixo de 5' para 3'. Nas se-qüências que se seguem, as bases sublinhadas fazem parte do núcleo cata-lítico da MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam com o alvo, eas bases em itálico hibridizam para o substrato.
SEQ ID NO: 10: Partizima A2:miR20A2/1 :T ACCTGC ACT ACGGTCGAAATAGTGAGT
SEQ ID NO: 11: Partizima B3:
miR20B3/1: CA TCTCTTCTCCG AGCTAAGC ACTTTA
2.2. Substratorepórter
A atividade da MNAzima é monitorada pela clivagem de umsubstratorepórter de ácido nucléico duplamente rotulado. O substratorepórterpara este exemplo é SubBi-1-FB com a seqüência, de 5' para 3', como abai-xo. As bases em letras minúsculas representam RNA e as bases em letrasmaiúsculas representam DNA. As bases sublinhadas indicam a posição deuma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade3'. As mudanças na fluorescência em virtude da clivagem de SubBi-1-FB noribonucleotídeo entre FAM e BHQ1 foram monitoradas a 530 nm (compri-mento de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm (comprimentode onda de excitação FAM).SEQ IO NO: 6: SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
2.3. Alvo
A seqüência do alvo para este exemplo foi um oligonucleotídeode DNA, D-20, que tem uma seqüência homóloga à espécie RNA hsa-miR-(Figura 11 (i)). A seqüência de D-20Target é a seguinte, escrita de 5' para3':
SEQ ID NO: 12: D-20Target:TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
2.4. Seqüencias de Controle
Qualquer ensaio desenvolvido para detectar microRNAs deve distinguir es-pecificamente a seqüência de miR desejada, por exemplo, hsa-miR-20, deseqüências relacionadas, tal como hsa-miR-17-5p, que pode diferir do miR-alvo em uma ou mais bases (Figura 11(i)). Os oligonucleotídeos de miR "forado alvo" relacionado a hsa-miR-20, 17-5p, 93, 106a e 106b miR também fo-ram sintetizados como DNA e estão escritos de 5' para 3' abaixo.SEQ ID NO: 13: D-17-5pTarget:CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTSEQ ID NO: 14: D-93Target:
AAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAG
SEQ ID NO: 15: D-106aTarget:
AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGC
SEQ ID NO: 16: D-106bTarget:
TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT
2.5. Condições de Reação
A detecção da seqüência do alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNAzi-ma cataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substra-to, e o volume total de todas reações foi de 25 μL. Todas reações foramconduzidas a 40°C em um termociclador SmartCyclei® System (Cepheid). Afluorescência para cada reação foi lida a cada 7 segundos por um total de 4minutos. Todas reações na Tabela 5 continham a mistura em massa queconsiste em 1 μΜ SubBi-1-FB 1 μΜ, Tris HCI (pH 9,0 a 25°C) e MgCI2 25 mM.
Tabela 5: Componentes das Reações para a Detecção de um Ácido Nucléico-alvo como Ilustrado na Figura 11
<table>table see original document page 106</column></row><table>
Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycler® Sys-tem (Cepheid) utilizado durante o experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da fluorescência, pois isto reconhecidamentevaria entre cavidades. Isto foi medido lendo a fluorescência da mistura emmassa sozinha. Este valor foi então subtraído de todas as outras reaçõesrealizadas nessa cavidade para permitir comparações entre cavidades.
As reações que contêm alvo, "nenhum alvo" e "fora do alvo" fo-ram realizadas na presença de concentrações 5 mM e 100 mM de MgCb ecomparadas com MgCI2 25 mM (Figura 12).
2.6. Resultados: Detecção da Clivagem do SubstratorepórterSubBM-FB
Os oligonucleotídeos das partizimas A e B da MNAzima se com-binam para dar uma MNAzima cataliticamente ativa para clivar o substrato-repórter apenas na presença da seqüência do alvo. Neste exemplo os con-troles fora do alvo têm tão poucas quanto duas bases desemparelhadas comos braços sensores (seqüência de ligação do alvo miR-20). O "fora do alvo"D-17-5p tem duas bases desemparelhadas, sendo que apenas uma delasocorre na região mais discriminatória localizada no meio da seqüência demiR-20. A reação de clivagem que contém a seqüência do alvo D-20 deu umaumento de 26 vezes no sinal em comparação com o controle nenhum alvo(Figura 11 (iii)). Isto se compara com os controles fora do alvo, D-17-5p e D-106a, que dão um aumento de 3,5 vezes no sinal em comparação com con-trole nenhum alvo, e D-93 e D-106b que dão nenhum aumento no sinal emcomparação com o controle nenhum alvo (Figura 11 (iii)). Assim sendo, adiferenciação de D-20 de seqüências relacionadas demonstra a capacidadede o sistema de MNAzima discriminar seqüências que diferem em apenaspoucas bases. Estudos anteriores que usam DNAzimas monomolecularesdemonstraram que as DNAzimas têm a capacidade de distinguir mutaçõesde bases individuais (Impey et al., 2000). As MNAzimas permitem também adiscriminação de mudanças de bases singulares (vide Exemplo 5 abaixo).
Os controles "partizima A apenas" e "partizima B apenas" tive-ram uma fluorescência similar àquela da fluorescência do fundo (dados nãoilustrados).
O uso de enzimas protéicas requer que outros reagentes na rea-ção para estejam em concentrações ideais para a atividade de enzimas pro-téicas. Por exemplo, a concentração do cofator íon metálico que ajuda umaDNAzima na clivagem do substratorepórter é mantida em um mínimo emprotocolos que utilizam enzimas, tais como polimerases. A detecção diretaque usa MNAzimas não requer quaisquer enzimas protéicas, e portanto, ascondições da reação podem ser otimizadas para a clivagem rápida do subs-trato. Nestas reações o cofator íon metálico, por exemplo, Mg2+, pode seraumentado para otimizar a taxa catalítica da da MNAzima. A Figura 12 ilus-tra como a concentração de MgCI2 pode ser aumentada até níveis que nãopodem ser normalmente tolerados em protocolos de detecção de alvos. Emaltas concentrações de MgCI2 (100 mM) a eficiência catalítica da MNAzima émais alta. Além disso, quando se detecta D-20Target, um aumento no MgCI2não afetou a especificidade da reação, pois D-20Target ainda é claramentedistinguível das seqüências relacionadas D-17-5p, Target D-106aTarget, D-93Target e D-106bTarget.
Exemplo 3: MNAzimas (desenhos 5 e 6) para Detecção Direta de umÁcido Nucléico-alvo
3.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Os desenhos 5 e 6 para MNAzimas, baseados na DNAzima10:23, foram testados quanto à atividade catalítica (Figura 13). Os versadosna técnica devem avaliar que as seqüências dos braços sensores (ligaçãodo alvo) designadas por "N" podem ser substituídas por seqüências especí-ficas do alvo para qualquer ácido nucléico-alvo. As seqüências dos braçosde substrato, que se ligam ao substratorepórter, podem ser genéricas e usa-das para muitos alvos. Os versados nessas técnicas devem avaliar que asseqüências do substrato designadas por "N" na Figura 13 podem ser substi-tuídas por seqüências de DNA, RNA ou quiméricas de DNA/RNA.
Nos experimentos conduzidos para medir a atividade catalíticadas MNAzimas RPLPO MNAzimas descritas na Figura 13, as partizimas deoligonucleotídeos AeB foram desenhadas para acertar éxon 5 do gene deRPLPO. As seqüências das partizimas AeB partizimas estão listadas abai-xo de 5' até 3', onde as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalíticoda MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam com o alvo, e asbases em itálico hibridizam para o substrato. As seqüências não estão nemsublinhadas, nem negritadas ou nem italicizadas em SEQ ID NO: 17 e SEQID NO: 18 formam, de preferência, uma estrutura em forma de alça, tal comoaquela representada na Figura 13 (vide, po exemplo, Desenho 5).SEQ ID NO: 17 partizima A3 R05A3/2: CAAAC-GAGTCCTGGCCTTGTCCGCACAACGAGAGGAAACCTTSEQ ID NO: 18 partizima B4 R05B4/2: TGCCCA GGGAGGQzTAGCTGCGGTGGAGACGGATTACACCTTCSEQ ID NO: 19 partizima A4 R05A4/2: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTC-AQAAÇGAGAGGAAACCTTSEQ ID NO: 20 partizima B5 R05B5/2: TGCCCAGGGAGGCTAGCTGTG-AGACGGATTACACCTTC
3.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-2 com a seqüên-cia, 5' até 3', como abaixo. No presente exemplo, SubBi-2 foi rotulado naextremidade com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1na extremidade 3' e foi designado SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FB foimonitorada a 530 nm (comprimento de onda de emissão FAM) com excita-ção em 485 nm (comprimento de onda de excitação FAM). As bases em le-tras minúsculas representam RNA e as bases em letras maiúsculas repre-sentam DNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
3.3. Seqüências-alvo
A seqüência do alvo para este exemplo foi um oligonucleotídeosintético R05/1 Target com a seqüência, de 5' até 3', como abaixo. Esta se-qüência-alvo tem a mesma seqüência que uma seção do gene de RPLPO,éxon 5.
SEQ ID NO: 22 R05/1 Target: GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACA-AGGCCAGGACTCGTTTG
3.4. Componentes da Reação
A detecção da seqüência-aivo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNAzi-ma cataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substra-to, e o volume total de todas reações foi de 25 μΙ_. Todas reações foramconduzidas a 55°C em um termociclador SmartCycler® System (Cepheid). Afluorescência para cada reação foi lida a cada 7 segundos por um total de 5minutos. Todas reações na Tabela 6 continham 1 μΜ SubBi-2-FB 1 μΜ, TrisHCI (pH 9,0 a 25°C) e MgCI2 25 mM.
Tabela 6: Componentes de Reações para a Detecção de um Ácido Nucléico-alvo como ilustrado na Figura 13
<table>table see original document page 110</column></row><table>
Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycler® Sys-tem (Cepheid) utilizado durante o experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da fluorescência, pois isto reconhecidamentevaria entre cavidades. Isto foi medido lendo a fluorescência da mistura emmassa sozinha. Este valor foi então subtraído de todas as outras reaçõesrealizadas nessa cavidade para permitir comparações entre cavidades.
3.5. Resultados: Detecção e Clivagem do Substrato
As reações que contêm o alvo, com as MNAzimas com os dese-nhos 5 e 6, apresentaram um aumento na fluorescência no decorrer do tem-po em comparação com o controle sem alvo (Figura 13ii), quadros superior einferior, respectivamente. Isto demonstra que os oligonucleotídeos de parti-zimas se combinam em uma MNAzima cataliticamente ativa e clivam o subs-tratorepórter apenas na presença da seqüência do alvo. Os controles semalvo não apresentaram um aumento na fluorescência, indicando que ne-nhuma divagem estava ocorrendo. A taxa da clivagem para o desenho 6 foiconsideravelmente mais rápida do que para o desenho 5.
Exemplo 4: Detecção de Amplicons a partir da Ampliação in vitro porPCR de uma seqüência de Ácidos Nucléicos Usando MNAzimas
4.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
As MNAzimas podem ser usadas também para detectar ampli-cons a partir de seqüência de ácido nucléico ampliada in vitro. Para este e-xemplo, a detecção de amplicons é realizada como um processo de duasetapas, mas pode ser realizada também em uma única reação. Neste caso,os oligonucleotídeos usados para detectar os amplicons basearam-se nodesenho 4, usando os oligonucleotídeos R04A2/1 e R04B3/1 (Figura 10),que detectam o gene de RPLPO humano. Os oligonucleotídeos das partizi-mas AeB estão listados abaixo. Nas seqüências que se seguem, as basessublinhadas fazem parte do núcleo catalítico da MNAzima combinada, asbases em negrito hibridizam com o alvo, e as bases em itálico hibridizampara o substrato.
SEQ ID NO: 2 Partizima A2 R04A2/1: GCTGGTCATCCAGCAGCGGTC-G ΑΑΛ TA G TGA G T
SEQ ID NO: 5 Partizima B3 R04B3/1: CATC7"C7TC7CCGAGCGTGTTC-GACAATGGC
4.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-1-FB com a se-qüência, de 5' para 3', como abaixo. As bases em letras minúsculas repre-sentam RNA e as base em letras maiúsculas representam DNA. As basessublinhadas indicam a posição de uma porção 6-FAM na extremidade 5' euma porção BHQ1 na extremidade 3'. A clivagem de SubBi-1-FB foi monito-rada a 530 nm (comprimento de onda de emissão FAM) com excitação em485 nm (comprimento de onda de excitação FAM).SEQ ID NO: 6 SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
4.3. Iniciadores para a Ampliação do gene de RPLPO humanopor PCR
A seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliaçãopor PCR in vitro da seqüência a partir do éxon 4 do gene de RPLPO do DNAgenômico humano extraído da linhagem de células K562 (PROMEGA), u-sando os iniciadores de PCR listados abaixo.
SEQ ID NO: 23 Iniciador 5R04/3:CAAGACTG GAGACAAAGTGSEQ ID NO: 24 Iniciador 3R04/2:GCAGAGTTTCCTCTGTGATA
4.4. Oligonucleotídeo-alvo de Controle
Um oligonucleotídeo foi sintetizado e usado como um controlepositivo para a seqüência RPLPO. O oligonucleotídeo de controle não foiampliado por PCR nestes experimentos.
SEQ ID NO: 8 R04/1 Target:
GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
4.5. Componentes da Reação: Ampliação por PCR do Gene deRPLPO
A ampliação por PCR do gene de RPLPO foi realizada no volu-me total da reação de 25 μL. Todas as reações de ampliação foram condu-zidas em um termociclador GeneAmpD PCR System 9700 (Applied Biosys-tems). Os parâmetros da ciclagem foram 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de95°C por 5 segundos e 65°C por 30 segundos (com um decréscimo de 1°Cna temperatura por ciclo), e finalmente 50 ciclos de 95°C por 5 segundos e55°C por 30 segundos. Todas reações continham 5R04/3 40 nM e 200 nMde 3R04/2, MgCI2 3 mM, 200 μΜ de cada dNTP, 1x Immobuffer (BioIine) e 1unidade de Immolase (BioIine) com ou sem 500 ng de DNA genômico hu-mano K562 (PROMEGA).
4.6. Componentes da Reação: Detecção de Seqüência-alvo
A detecção da seqüência-alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNzimacataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substrato, eo volume total de todas reações foi de 25 μL. Todas reações foram conduzi-das a 40°C em um termociclador SmartCycler® System (Cepheid). A fluo-rescência para cada reação foi lida a cada 7 segundos por um total de 10minutos. Todas reações na Tabela 7 continham a mistura em massa de 1μΜ SubBi-1-FB, Tris HCI (pH 9,0 a 25°C) e MgCI2 25 mM. As concentraçõesde oligonucleotídeo PartizimasA e B são 1 μΜ.
Tabela 7: Componentes da Reação para a Detecção de Amplicons doDNA de RPLPO após PCR In vitro. Os Sistemas de MNAzIma Usaram o
Desenho 4 (R04A2/1:R04B3/1) Reação da MNazima RPLPO AlvoAlvo-oligo (Controle Positivo RPLPO) 1012 cópias R04/1 Alvo OligoProdutoálvo da PCR RPLPO (Teste) 5 μΐ de produto da PCR R- PLPO (equivalente a 100 ng do DNA genômico)Nenhum Alvo (Controle Negativo RPLPO) 5 μί de H2ODNA genômico não-ampliado (Controle Negativo) 5 μί contendo 500 ng de DNA genômico
Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycler® Sys-tem (Cepheid) utilizado durante um experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da fluorescência, pois isto reconhecidamentevaria entre cavidades. Isto foi medido lendo a fluorescência da mistura emmassa sozinha. Este valor foi então subtraído de todas as outras reaçõesrealizadas nessa cavidade para permitir comparações entre cavidades.4.7. Resultados: Detecção de Clivagem do Substratorepórter
SubBM-FB
O desenho 4 de MNAzima para a detecção de RPLPO, éxon 4,apresentou um aumento na fluorescência no decorrer do tempo quando aseqüência-alvo RPLPO foi ampliada a partir do DNA genômico humano porPCR (Figura 14). O aumento na fluorescência observado para os ampliconsRPLPO foi similar àquele observado para 1012 cópias dos oligonucleotídeosde controle positivo R04/1 Target. A fluorescência dos controles sem alvo foimais baixa do que aquela nas reações que contêm alvo, e nenhuma das re-ações de controle negativo apresentou um aumento na fluorescência no de-correr do tempo. Isto demonstra que o aumento na fluorescência produzidonas reações que contêm alvo deve-se à combinação dependente do alvo deuma MNAzima cataliticamente ativa que depois clivou o substratorepórter.Exemplo 5: Uso de MNAzimas para a Detecção de Amplicons Produzi-dos por Ampliação por PCR in vitro de Seqüências de Ácidos NucléicosCurtas.
5.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
As MNAzimas podem ser usadas para detectar amplicons a par-tir de seqüência de ácidos nucléicos ampliada in vitro. Neste exemplo, a am-pliação e a detecção são realizadas em um processo de três etapas (Figura5), mas transcrição reversa, ampliação por PCR e detecção poderiam serrealizadas também concomitantemente em um único tubo de reação. Paraeste exemplo, os oligonucleotídeos usados para detectar os amplicons usa-ram o desenho 4, oligonucleotídeos miR de partizimas AeB (Figura 11), quesão desenhados para detectar hsa-miR-20. Os oligonucleotídeos de partizi-mas da MNAzima estão listados abaixo, de tal modo que as bases sublinha-das façam parte do núcleo catalítico da MNAzima combinada, as bases emnegrito hibridizem com o alvo, e as bases em itálico hibridizem para o subs-trato.
SEQ ID NO: 10 Partizima A2 miR20A2/1:TACCTGCACTACGGTCGAA^r>4GrG^GrSEQ ID NO: 11 Partizima B3 miR20B3/1:CA 7CTC7TC7OCGAGCTAAGCACTTTA
5.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-1-FB com a se-qüência, de 5' para 3', abaixo. As bases em letras minúsculas representamRNA e as bases em letras maiúsculas representam DNA. As bases subli-nhadas indicam a posição de uma porção 6-FAM na extremidade 5' e umaporção BHQ1 na extremidade 3'. A clivagem de SubBi-1-FB foi monitorada a530 nm (comprimento de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm(comprimento de onda de excitação FAM).SEQ ID NO: 6 SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
5.3. Iniciadores da PCR para Ampliação de Seqüências-alvo de Oligo-nucleotídeos D-20 com 22 MerosA seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliação invitro do oligonucleotídeo D-20, usando os iniciadores de PCR oligonucleotí-deos listados abaixo.
SEQ ID NO: 25 Iniciador 5miR20/1:ACGTGACGCTAAAGTGCTSEQ ID NO: 26 Iniciador 3miR20/L1:CGTCCGAATGACGTACCTGCACSEQ ID NO: 27 Iniciador 3miR20/P1:CGAATGACGTACCTGCAC
5.4. Seqüências-alvo e Controles
A seqüência de DNA (D-20Target) com homologia a miR-20 foiusada como modelo para demonstrar a ampliação e detecção de uma se-qüência curta usando PCR e MNAzimas.
SEQ ID NO: 12 D-20Target:
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
Além disso, para assegurar que quaisquer seqüências "fora doalvo" intimamente relacionadas ampliadas erroneamente não possam serdetectadas com o sistema miR-20, o oligonucleotídeo de DNA-alvo de con-trole D-17-5pTarget também foi estado com o sistema de oligonucleotídeosmiR-20 de partizimas AeB.
SEQ ID NO: 13 D-17-5pTarget:
CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGT
5.5 Componentes da Reação: Ampliação de Seqüência-alvo
A ampliação da seqüência-alvo foi realizada em um volume totalda reação de 25 μι.. Todas reações de ampliação foram conduzidas em umtermociclador GeneAmpD PCR System 9700 (Applied Biosystems). Os pa-râmetros da ciclagem para as etapas 1 e 2 (transcrição reversa e PCR) fo-ram 42°C por 30 minutos, 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 5 se-gundos e 30°C por 30 segundos (mais 2°C por ciclo), e finalmente 50 ciclosde 95°C por 5 segundos e 50°C por 30 segundos. As reações inicialmentecontinham apenas 3miR20/L1 10 nM, depois 42°C por 30 minutos, a reaçãofoi pausada e adicionou-se 3miR20/P1 30 nM e 200 nM de 5miR20/1. Todosos outros reagentes listados estavam na mistura de reação inicial, MgCb 3mM, 200 μΜ de cada dNTP, 1 χ Immobuffer (BioIine) e 1 unidade de Immo-Iase (Bioline), e (a) 108 cópias de D-20Target, ou (b) nenhum alvo (dH20) ou(c) 108 cópias de DNA fora do alvo (D-17-5pTarget).
5.6. Componentes da Reação: Detecção de Seqüência-alvo
A detecção da seqüência-alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNzimacataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substrato, eo volume total de todas reações foi de 25 μΙ_. Todas reações foram conduzi-das a 40°C em um termociclador SmartCycler® System (Cepheid). A fluo-rescência para cada reação foi lida a cada 7 segundos por um total de 10minutos. Todas reações na Tabela 8 continham a mistura em massa de 1μΜ SubBi-1-FB, Tris HCI (pH 9,0 a 25°C) e MgCI2 25 mM. As concentraçõesde Partizimas AeB foram 1 μΜ.
Table 8: Componentes da Reação para a Detecção de Seqüências deÁcidos Nucléicos Curta (20-25 meros) Ampliadas in vitro. O Sistema de
<table>table see original document page 116</column></row><table>Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycler® Sys-tem (Cepheid) utilizado durante um experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da fluorescência. Este valor foi então subtraídode todas as outras reações realizadas nessa cavidade para permitir compa-rações entre cavidades.
5.7. Resultados: Detecção da Clivagem do Substratorepórter
SubBi-1-FB
O desenho 4 de MNAzima para a detecção de miR-20 apresen-tou um aumento na fluorescência no decorrer do tempo quando a seqüência-alvo usda foi D-20Target ampliada por PCR (Figura 15(i)).
A fluorescência dos controles sem alvo foi mais baixa do quenas reações que contêm alvo, e nenhuma das reações de controle negativoapresentou um aumento na fluorescência no decorrer do tempo. Isto de-monstra que o aumento na fluorescência produzido em reações que contêmalvo se deve à combinação dependente do alvo de MNAzimas cataliticamen-te ativas que então clivaram o substratorepórter.
O controle fora do alvo (D-17-5p) neste exemplo também foi am-pliado com os iniciadores miR-20 pois ele tem apenas um desemparelha-mento na posição terminal dentro das regiões que hibridizam com os inicia-dores miR-20. A ampliação de D-20Target e D-17-5pTarget foi confirmadapor eletroforese. Como ambos amplicons incorporam as seqüências dos ini-ciadores nos seus terminais, eles agora diferem apenas em uma única baseno meio dos amplicons. A MNAzima discriminou exitosamente entre os am-plicons D-20 e D-17-5p. Esta discriminação é um resultado da diferença doúnico nucleotídeo nos amplicons D-20 e D-17-5p na região que fica entre osiniciadores, como ilustrado na Figura 15(ii). A MNAzima requer que as quatrobases entre os iniciadores estejam presentes (permitindo assim a discrimi-nação entre dímero de iniciador e amplicons genuínos) e estas quatro basesdevem ser exatas com nenhuma substituição tolerada. Este exemplo ilustraa capacidade de as MNAzimas discriminarem entre seqüências intimamenterelacionadas, incluindo aquelas que diferem em apenas um único polimor-fismo de nucleotídeo.Exemplo 6: Uso de MNAzimas para a Detecção de Amplicons de mi-croRNA Produzidos por Ampliação por PCR in vitro do RNA total
6.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
As MNAzimas podem ser usadas para detectar amplicons a par-tir de seqüências de ácidos nucléicos ampliadas in vitro. Neste exemplo, aampliação e a detecção são realizadas em um processo de duas etapas (Fi-gura 5), onde a transcrição reversa e a ampliação por PCR ocorrem em umprimeiro tubo, e em seguida, por detecção mediada por MNAzimas em umsegundo tubo. Para este exemplo os oligonucleotídeos usados para detectaros amplicons foram do Desenho 4, oligonucleotídeos miR de partizimas A eB (Figura 11), que são desenhados para detectar hsa-miR-20. Os oligonu-cleotídeos de partizimas de MNAzima estão listados abaixo, de tal modo queas bases sublinhadas façam parte do núcleo catalítico da MNAzima combi-nada, as bases em negrito hibridizem com o alvo, e as bases em itálico hi-bridizem para o substrato.
SEQ ID NO: 10 Partizima A2 miR20A2/1:TACCTGCACTACGGTCGAA/\ TAGTGAGTSEQ ID NO: 11 Partizima B3 miR20B3/1:CA rcrC7TC7CCGAGCTAAGCACTTTA
6.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-1 -FB com a se-qüência, de 5' para 3', abaixo. As bases em letras minúsculas representamRNA e as bases em letras maiúsculas representam DNA. As bases subli-nhadas indicam a posição de uma porção 6-FAM na extremidade 5' e umaporção BHQ1 na extremidade 3'. A clivagem de SubBi-1-FB foi monitorada a530 nm (comprimento de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm(comprimento de onda de excitação FAM).
SEQ ID NO: 6 SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
6.3. Iniciadores da PCR para Ampliação de hsa-miR-20
A seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliação invitro do RNA total do timo humano (Ambion), usando os iniciadores de PCRoligonucleotídeos listados abaixo.
SEQ ID NO: 25 Iniciador 5miR20/1:
ACGTGACGCTAAAGTGCT
SEQ ID NO: 26 Iniciador 3miR20/L1:
CGTCCGAATGACGTACCTGCAC
6.4. Seqüências-alvo e controles
O RNA total do timo humano (Ambion) foi usado como modelopara a ampliação de miR-20, e os amplicons foram detectados subseqüen-temente usando MNAzimas (seção 6.6).
A seqüência de RNA (R-20Target) com homologia a miR-20 foiusada como um controle positivo para demonstrar a ampliação de seqüên-cias curtas, e em seguida, por detecção dos amplicons resultantes usandoMNAzimas.
SEQ ID NO: 28 R-20Target:uaaagugcuuauagugcaggua
6.5. Componentes da Reação: Ampliação de Seqüência-alvo
A transcrição reversa e a ampliação por PCR da seqüência-alvofoi realizada em um volume total da reação de 25 pL. Todas reações de am-pliação foram conduzidas em um termociclador GeneAmpD PCR System9700 (Applied Biosystems). Os parâmetros da ciclagem foram 40°C por 30minutos, 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 5 segundos e 30°C por30 segundos (com um aumento de 2°C na temperatura por ciclo), e final-mente 50 ciclos de 95°C por 5 segundos e 50°C por 30 segundos. As rea-ções continham 3miR20/L1 40 nM e 200 nM de 5miR20/1, MgCI2 3 mM, 200μΜ de cada dNTP, 10 unidades de RNAsina (Promega), 30 unidades de T-transcriptase Reversa MMLV(-H) (Promega), 1 χ Immobuffer (BioIine) e 0,5unidade de Immolase (Bioline), e (a) 1 μg de RNA total, ou (b) nenhum alvo(dH20) ou (c) 1014 cópias (5 μΜ) de oligonucleotídeo R-20Target.
6.6. Componentes da Reação: Detecção de Seqüência-alvo
A detecção da seqüência-alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNzimacataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substrato, eo volume total de todas reações foi de 25 μ!_. Todas reações foram conduzi-das a 40°C em um termociclador SmartCycIertB) System (Cepheid). A fluo-rescência para cada reação foi lida a cada 30 segundos por um total de 5minutos. Todas reações na Tabela 9 continham a mistura em massa de 1μΜ SubBi-1-FB, partizima A 1 μΜ, partizima B 1 μΜ, Tris HCI 50 mM (pH 9,0a 25°C), MgCI2 25 mM e alvo (como indicado na Tabela 9).
Tabela 9: Componentes da Reação para a Detecção do RNA total Am-pliado in vitro. O Sistema de MNAzima Usou o Desenho 4(miR20A2/1:miR20B3/1).
<table>table see original document page 120</column></row><table>
O nível de fundo da fluorescência foi medido para cada cavidadeda reação no termociclador SmartCycler® System (Cepheid). Este valor foientão subtraído de todas as outras reações realizadas nessa cavidade parapermitir comparações entre cavidades.
6.7. Resultados: Detecção da Clivagem do SubstratorepórterSubBi-1-FB
O Desenho 4 de MNAzima para a detecção de miR-20 apresen-tou um aumento na fluorescência no decorrer do tempo quando a seqüência-alvo usada era RNA total ampliado por PCR (Figura 16).
A fluorescência do controle sem alvo RNA foi mais baixa do queaquela nas reações que contêm alvo RNA, e nenhuma das reações de con-trole negativo apresentou um aumento na fluorescência no decorrer do tem-po. Isto demonstrata que o aumento na fluorescência produzido em reaçõesque contêm alvo se deve à combinação dependente do alvo ampliado porPCR de MNAzimas cataliticamente ativas que então clivaram o substratore-pórter. Embora este experimento tivesse sido realizado em duas etapas(transcrição reversa/PCR e depois detecção final da MNAzima), todas eta-pas poderiam ser realizadas concomitantemente em um único tubo de rea-ção, permitindo que a reação fosse monitorada em tempo real.
Exemplo 7: Detecção de Alvos por MNAzimas Acopladas a uma Casca-ta de Sinais de Ácidos Nucléicos.
7.1. Cascatas de Ampliação de Sinais Iniciada por MNAzimas
É possível baixar o limite de detecção de ácidos nucléicos aco-plando a detecção por MNAzima a uma reação de cascata de ampliação desinais, como ilustrado na Figura 7. As MNAzimas possibilitam também ummecanismo disparador altamente específico para iniciação de uma cascata.
7.2. Cascata de DNAzimas Espacialmente Separadas
As DNAzimas podem ser amarradas a um suporte, usando umasérie de métodos que incluem a afixação de bolachas de plástico revestidascom estreptavidina que permitem a afixação de DNAzimas rotuladas combiotina. As seqüências usdas para a afixação podem server também comosubstratos genéricos de MNAzymas/DNAzimas. Os alvos (por exemplo, se-qüências de ácidos nucléicos) podem ser detectados depois da hibridizaçãopara seqüências de partizimas que permitem a formação de MNAzimas ati-vas. As MNAzimas podem então clivar substratos genéricos amarrados, libe-rando assim a DNAzima A. A DNAzima A pode então migrar para uma se-gunda seqüência genérica sobre uma segunda superfície sólida, onde aDNAzima B está amarrada. A DNAzima A pode então clivar a segunda se-qüência genérica, liberando assim a DNAzima Β. A clivagem deste substratoentre os pares de corantes í\uoróforo/quencher poáe resultar em maior fluo-rescência. A DNAzima B liberada, por sua vez, pode clivar mais do primeirosubstrato, liberando assim mais da DNAzima A, e iniciando uma cascata desinais que resulta na ampliação do sinal (Figura 7).
Este exemplo descreve um mecanismo para gerar uma cascatade sinais, usando DNAzimas espacialmente separadas; entretanto, existemoutros métodos que também possibilitariam a ampliação de sinais usandoácidos nucléicos catalíticos. Os versados nessas técnias devem avaliar quequalquer um desses métodos poderia ser inteiramente funcional neste caso,desde que por algum meio de afixação ou separação física, um substratoseja mantido "inacessível" para uma enzima que poderia atuar sobre ele.Outros exemplos de ampliação de sinais de ácidos nucléicos que poderiamser acoplados a reações iniciadas por MNAzimas incluem, porém sem limi-tações, cascatas de ligação (Paul e Joyce, 2004) e cascatas circulares deDNAzimas (Levy e Ellington, 2003), cada um dos quais envolvendo o princí-pio básico de manter uma "separação" de uma enzima do seu substrato,após o que a enzima e o substrato se conectam, de tal modo que a atividadecatalítica possa resultar, direta ou indiretamente, em um sinal ampliado, orresulte em uma cascata de sinais.
Exemplo 8: Uso de MNAzimas para a Quantificação de um Ácido Nu-cléico-alvo.
8.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
As MNAzimas podem ser usadas para monitorar a ampliação deácidos nucléicos-alvo em tempo real, usando métodos de ampliação de al-vos in vitro, tal como PCR. Além disso, o monitoramento em tempo real per-mite que a quantidade de alvo inicialmente presente na reação seja quantifi-cada. Neste exemplo, a ampliação e a detecção são realizadas em um pro-cesso de uma etapa, onde a ampliação por PCR e a detecção mediada porMNAzima ocorrem simultaneamente em um único tubo. Os oligonucleotí-deos A e B de partizimas usaram o Desenho 6 com braços sensores com-plementares a éxon 5 do gene de RPLPO humano (Figura 17(i)). Os oligo-nucleotídeos de partizimas estão listados abaixo, sendo que o "-P" indicafosforilação de 3' do oligonucleotídeo.
SEQ ID NO: 29 Partizima A4 R05A4/3-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTC-TACAACGAGGTTGTGCTG-P
SEQ ID NO: 30 Partizima B5 R05B5/3-P: CGG TTGG TGAGGQzTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-P
8.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-3 com a seqüên-cia, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo, SubBi-3-FB foi rotulado naextremidade com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1na extremidade 3'. A clivagem de SubBi-3-FB foi monitorada a 530 nm(comprimento de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm (com-primento de onda de excitação FAM). As bases em letras minúsculas repre-sentam RNA e as bases em letras maiúsculas representam DNA.SEQ ID NO: 31 SubBi-3-FB:CAGCACAACCguCACCAACCG
8.3. Iniciadores da PCR para a Ampliação de RPLPO éxon 5
A seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliação invitro do DNA genômico humano, usando os iniciadores de PCR oligonucleo-tídeos listados abaixo.SEQ ID NO: 32 Iniciador 5R05/1:CATTCTATCATCAACGGGTASEQ ID NO: 33 Iniciador 3R05/1:CAAAGGCAGATGGATCAG
8.4. Seqüência-alvo
O DNA genômico humano extraído da linhagem de células K562(Promega) foi usado como modelo para a ampliação do gene de RPLPO.
8.5. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Se-qüência-alvo
A ampliação e a quantificação em tempo real da seqüência-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 μΙ_. Todas reaçõesforam conduzidas em um termociclador ABI7700 (Applied Biosystems). Osparâmetros da ciclagem foram 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 5segundos e 60°C por 30 segundos (com decréscimo de 10C na temperaturapor ciclo), e finalmente 50 ciclos de 95°C por 5 segundos e 50°C por 30 se-gundos. As reações continham 5R05/1 40 nM e 200 nM de 3R05/1,R05A4/3-P 200 nM e R05B5/3-P 200 nM, SubBi-3-FB 200 nM, MgCI2 10mM, 200 μΜ de cada dNTP, 10 unidades de RNAsina (Promega), 1 χ refe-rência ROX (Invitrogen), 1 χ Immobuffer (BioIine) e 0,25 unidade de Immola-se (Bioline), e modelo de DNA genômico (20.000 pg, 4.000 pg, 800 pg, 160pg, 32 pg e 6,4 pg) ou nenhum alvo (dH20).
8.6. Resultados: Ampliação de Alvo e Clivagem do Substratore-pórter SubBi-3-FB
O desenho 6 de MNazima para a detecção e quantificação emtempo real de RPLPO éxon 5 apresentou um aumento na fluorescência nodecorrer do tempo quando a seqüência-alvo usada foi o DNA genômico hu-mano ampliado por PCR (Figura 17(ii)).
A fluorescência do controle sem alvo de DNA foi mais baixa doque nas reações que contêm alvo de DNA e não aumentou durante a rea-ção. Isto demonstra que o aumento na fluorescência produzido nas reaçõesque contêm alvo deve-se à combinação dependente do alvo de MNAzimascataliticamente ativas, que então clivaram o substratorepórter. Uma curva-padrão foi gerada plotando o Iog das concentrações de DNA contra o ciclo-limite, resultando em uma plotagem linear com um coeficiente de correlaçãode 0,995. Na reação que contém 6,4 pg de DNA genômico, aproximadamen-te 10 cópias do alvo estariam presentes. Este exemplo demonstra a altasensibilidade desta abordagem.
Embora este experimento tenha usado razões assimétricas deiniciadores, os experimentos subseqüentes com PCR em tempo real (dadosnão ilustrados) demonstraram que a detecção por MNAzimas foi compatíveltambém com PCR que usa razões assimétricas de iniciadores.Exemplo 9: Reação Multiplex com Múltiplas MNAzimas que AssestamMúltiplos Alvos Simultaneamente.9.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Múltiplos alvos podem ser detectados simultaneamente em umareação multiplexada que compreende múltiplas MNAzimas singulares. CadaMNAzima tem braços sensores específicos para um alvo e braços de subs-trato específicos para um membro singular de uma série de substratos gené-ricos, cada um deles sendo rotulado com um fluoróforo diferente (Figura 18).No exemplo que se segue, as MNAzimas foram desenhadas para detectardois alvos diferentes, a saber, as seqüências de RPLPO e D-20. Deve-seavaliar que inúmeros alvos podem ser usados de acordo com o método. Asseqüências das partizimas AeB estão listadas abaixo, de 5' até 3'. Nas se-qüências que se seguem as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalí-tico da MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam com o alvo eas bases em itálico hibridizam para o substrato.
SEQ ID NO: 29 Partizima A4 R05A4/3-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTC-JACAACGAGGTTGTGCTG-P
SEQ ID NO: 30 Partizima B5 R05B5/3-P: CGGTTGGTGAGGC-TAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-P
SEQ ID NO: 34 Partizima A4 miR20A4/2: TACCTGCACTAACAACGAG/4G-GAAACCTT
SEQ ID NO: 35 Partizima B5 miR20B5/2: TGCCCAGGGAGGCTAGCTTA-AGCACTTTA
9.2. Substratos-repórter
Os dois substratos-repórter usados neste exemplo foram SubBi-2 e SubBi-3 com as seqüências, de 5' para 3', como abaixo. No presenteexemplo, SubBi-2 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-FAM naextremidade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado Sub-Bi-2-FB. SubBi-3 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-JOE naextremidade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado Sub-Bi-3-JB.
A clivagem de SubBi-2-FB foi monitorada a 530 nm (comprimen-to de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm (comprimento deonda de excitação FAM) e a clivagem de SubBi-3-JB foi monitorada a 548nm (comprimento de onda de emissão JOE) com excitação em 520 nm(comprimento de onda de excitação JOE). As bases em letras minúsculasrepresentam RNA e as bases em letras maiúsculas representm DNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO: 36 SubBi-3-JB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
9.3. Seqüências-alvo
As seqüências-alvo para este exemplo foram os oligonucleotí-deos sintéticos R05/1 Target e D-20Target com as seqüências, de 5' para 3',como abaixo. A seqüência de R05/1 Target tem a mesma seqüência queuma seção do gene de RPLPO1 éxon 5, e a seqüência de D-20Target é umhomólogo de DNA do RNA hsa-miR-20.
SEQ ID NO: 22 R05/1 Target:
GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
SEQ ID NO: 12 D-20Target:
TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTA
9.4. Condições da Reação
A detecção das seqüências-alvo foi medida monitorando o au-mento no sinal fluorescente causado pela clivagem dos substratos-repórterpelas MNAzimas cataliticamente ativas. As reações foram iniciadas pela adi-ção de substrato, e o volume total de todas reações foi de 25 μΙ_. Todas rea-ções foram conduzidas a 55°C em um termociclador SmartCycler® System(Cepheid). A fluorescência para cada reação foi lida a cada 7 segundos porum total de 5 minutos. Todas reações na Tabela 10 continham o tampãoPCRII (Applied Biosystems) e MgCI2 25 mM.Tabela 10: Componentes de Reações para a Detecção Simultânea deDois Ácidos Nucléicos-alvo Diferentes.
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycIertS) Sys-tem (Cepheid) utilizado durante um experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da fluorescência, pois isto reconhecidamentevaria entre cavidades. Isto foi medido lendo a fluorescência da mistura emmassa sozinha. Este valor foi então subtraído de todas as outras reaçõesrealizadas nessa cavidade para permitir comparações entre cavidades.9.5. Resultados: Detecção e Clivagem do Substrato
As reações "uniplex" que contêm o alvo D-20 ou RPLPO apre-sentaram um aumento na fluorescência no decorrer do tempo em compara-ção com o controle sem alvo (Figura 19 (i)). Isto demonstra que as partizi-mas se combinam em uma MNAzima cataliticamente ativa e clivam o subs-tratorepórter apenas na presença da seqüência-alvo. Os controles "sem al-vo" (dH20) não aumentaram em fluorescência, indicando que nenhuma cli-vagem ocorreu na ausência do alvo. A reação multiplex para a detecção si-multânea de RPLPO e D-20 (Figura 19 (ii)) produziu resultados similarespara cada alvo àqueles observados nas reações uniplex para cada alvo. Ne-nhum aumento na fluorescência foi observado na reação de controle "semalvo". Estes resultados demonstram a detecção simultânea de múltiplos al-vos em uma única reação, sem perda de especificidade.Exemplo 10: Uso de MNAzimas para a Quantificação de AmpliconsProduzidos por Ampliação in vitrode microRNA.10.1. Partizima Oligonucleotídeos de Partizimas
As MNAzimas podem ser usadas para monitorar a ampliação deácidos nucléicos-alvo em tempo real, usando métodos de ampliação de al-vos in vitro, tal como RT-PCR. Além disso, o monitoramento em tempo realpermite que a quantidade de alvo inicialmente presente na reação seja quan-tificada. Neste exemplo, a ampliação e a detecção são realizadas em umprocesso de duas etapas, onde a primeira etapa envolve a produção de cD-NA por intermédio de transcrição reversa, e depois a ampliação por PCR e adetecção mediada por MNAzima do cDNA ocorrem simultaneamente na se-gunda etapa. Os oligonucleotídeos de partizimas AeB usaram o desenho 6com braços sensores complementares ao microRNA humano hsa-let-7a. Osoligonucleotídeos de partizimas estão listados abaixo, sendo que "-P" indicaa fosforilação em 3' do oligonucleotídeo. Nas seqüências que se seguem asbases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico da MNAzima combinada,as bases em negrito hibridizam com o alvo, e as bases em itálico hibridizampara o substrato.
SEQ ID NO: 37 Partizima A4 PCR7aA4/2-P: GACCGTGAGGTAGTAACA-ACGA GA GGAAA CCTT-P
SEQ ID NO: 38 Partizima B5 PCR7aB5/2-P: TGCCCAGGGAGGC-TAGCTGGTTGTATAGTTGTC-P
10.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-2 com a seqüên-cia, de 5' para 3', como abaixo. No presente exemplo, SubBi-2 foi rotuladonas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porçãoBHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FB foi monitorada a 516 nm (comprimento de onda de emissão FAM) comexcitação em 492 nm (comprimento de onda de excitação FAM). Na se-qüência que se segue as bases em letras minúsculas representam RNA e asbases em letras maiúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA10.3. Seqüências-alvo
A curva-padrão para este exemplo foi gerada por uma RT-PCRem duas etapas de um oligonucleotídeo de RNA sintético, R-let7a, que temuma seqüência homóloga à espécie RNA hsa-let-7a. A seqüência de R-Iet7a, escrita de 5' para 3', é a seguinte:SEQ ID NO: 39 R-let7a:ugagguaguagguuguauaguu
As amostras do RNA total humano de células do cólon (Ambion)lcélulas leucêmicas K562, células de câncer cervical HeLa (Ambion) e célulasdo baço (CIontech) foram ampliadas e analisadas quanto à abundância dehsa-let-7a.
10.4. Iniciadores de PCR para Ampliação de hsa-let-7a
Os iniciadores que se seguem foram usados para a ampliaçãode hsa-let-7a. O iniciador 3let7a foi usado para a transcrição reversa, e osiniciadores 5let7a e 3PCR7a foram usados para a ampliação por PCR.SEQ ID NO: 40 Iniciador 3let7a:AGCGAAGCTGAGACAACTATACAASEQ ID NO: 41 Iniciador 5let7a:CGACGTGACCGTGAGGTAGSEQ ID NO: 42 Iniciador 3PCR7a:CATGGCACAAGCGAAGCTGA
10.5. Componentes da Reação: Transcrição Reversa de Seqüên-cia-alvo
A transcrição reversa da seqüência-alvo foi realizada em um vo-lume total da reação de 25 pL. As reações foram incubadas em um termoci-clador 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems) por 20 minutos a 20°C, eem seguida 20 minutos a 30°C, e depois 20 minutos a 40°C. As reaçõescontinham 3let7a 10 nM, MgCI2 5 mM, 300 μΜ de cada dNTP, 20 unidadesde RNAsina (Promega), 1 χ Immobuffer (Bioline), 100 unidades de M-MLVRT(H-) e 5 pL de R-let7a (6 χ 1011 cópias) ou RNA total humano do cólonnormal (0,1 μg), K562 (0,1 μg), HeLa (0,2 μg) ou baço (0,2 μg ). Uma reaçãode controle continha todos reagentes acima, mas sem RNA-alvo, contendoem vez dele 5 μL de dH20 apenas.
10.6. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Seqüência-alvo
A ampliação e quantificação em tempo real da seqüência-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 μL. Todas reaçõesforam conduzidas em um Sistema Mx3005P® QPCR (Stratagene). Os parâ-metros da ciclagem foram 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 15 se-gundos e 40°C por 30 segundos (com um aumento de 1 cC na temperaturapor ciclo), e finalmente 50 ciclos de 95°C por 15 segundos e 50°C por 30segundos. As reações continham 200 nM 3PCR7a e 40 nM de 5let7a,400nM PCR7aA4/2-P e 400nM PCR7aB5/2-P, 200 nM SubBi-2-FB, 10 mMMgCI2, 200 μΜ de cada dNTP, 20 unidades de RNAsina (Promega)1 1 χ Im-mobuffer (Bioline), 1 unidade de Immolase (BioIine) e 5 μΙ_ de cDNA de R-let7a (contendo 5 χ 10®, 5 χ 107, 5 χ 106, 5 χ 105, 5 χ 104 cópias) ou modelode RNA total humano (cólon normal, 0,5 μg; K562, 0,5 μg; HeLa, 1 μg; baço,1 μg) ou nenhum alvo (dH20).
10.7. Resultados: Ampliação de Alvo e Clivagem do Substratore-pórter SubBi-2-FB
A MNAzima para a detecção e quantificação em tempo real dehsa-let-7a apresentou um aumento na fluorescência no decorrer do tempoquando a seqüência-alvo usada foi o cDNA gerado a partir do oligonucleotí-deo de RNA sintético ou o RNA total humano. Não houve qualquer sinal de-tectado no caso da reação de controle sem alvo (Tabela 11). Isto demonstraque o aumento na fluorescência produzido em reações que contêm alvo de-veu-se à combinação dependente do alvo de MNAzimas cataliticamente ati-vas que depois clivaram o substratorepórter. Uma curva-padrão foi geradaplotando o Iog das concentrações iniciais do RNA contra o ciclo limite, resul-tando em uma plotagem linear com um coeficiente de correlação de 0,999.Quatro amostras do RNA total humano também foram ampliadas e a quanti-dade de hsa-let-7a em cada uma foi estimada extrapolando a partir da curva-padrão (Tabela 11).Tabela 11: Resultados de Reações para a Ampliação e Detecção de
<table>table see original document page 131</column></row><table>
Este exemplo demonstra a capacidade de as MNAzimas detec-tarem e quantificarem amplicons gerados pela ampliação por RT-PCR deespécies de microRNA humano. Os MicroRNA1S são difíceis de ampliar edetectar em virtude do seu tamanho pequeno de cerca de 22 bases. AsMNAzimas são apropriadas para esta aplicação.Exemplo 11: Uso de MNAzimas para Detectar Metilação de DNA11.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Está demonstrado no Exemplo 19 que a PCR em tempo real e ageração de sinal mediada pela MNAzima possibilitam a discriminação entreseqüências de ácidos nucléicos completamente emparelhadas e aquelasque contêm desemparelhamentos com C oposto a C. Esta capacidade pos-sibilita que as MNAzimas sejam usadas para a análise do estado da metila-ção de células. As alterações no padrão de metilação ocorrem freqüente-mente em associação com câncer. A maioria dos protocolos para a análiseda metilação começa com a modificação por bissulfito do DNA genômico,que converte citidinas não-metiladas, porém não as metiladas, em uridinas.
A ampliação por PCR do DNA modificado, então, substitui as uridinas portimidinas, e vários métodos podem ser usados para distinguir as seqüênciasque contêm T (originalmente C não-metilado) e C (originalmente C metilado).No exemplo que se segue, uma MNAzima foi usada para determinar o esta-do de metilação de supletos de CpG específicos na região promotora do ge-ne p16 no DNA modificado com bissulfito.
Neste exemplo, as partizimas foram designadas para eqüivaler àseqüência produzida depois da modificação com bissulfito de um gene p16metilado. As seqüências das partizimas estão listadas abaixo (de 5' para 3').Nas seqüências que se seguem, as bases sublinhadas fazem parte do nú-cleo catalítico da MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam como alvo modificado por bissulfito, e as bases em itálico hibridizam para o subs-trato. O "-P" indica a fosforilação em 3' do oligonucleotídeo.
SEQ ID NO: 43 Partizima A5 p16A5/3-P: GCCCCCGCCTCCAACTACAAC-GkGGTTGTGCTG-P
SEQ ID NO: 44 Partizima B6 p16B6/3-P: CGGTTGGTGAGGCTAGCA-ACGCCCGCACCTC-P
11.2. Substratorepórter
O substratorepórter usado neste exemplo foi SubBi-3. No pre-sente exemplo, SubBi-3 foi rotulado nas extremidades com um grpamento 6-FAM na extremidade 5', e uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi desig-nado SubBi-3-FB. A clivagem de SubBi-3-FB foi monitorada a 530 nm (com-primento de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm (comprimentode onda de excitação FAM). A seqüência de SubBi-3-FB está ilustrada abai-xo (de 5' para 3'); as bases em letras minúsculas representam RNA e as ba-ses em letras maiúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 31 SubBi-3-FB:CAGCACAACCguCACCAACCG
11.3. Iniciadores de PCR iniciadores para Ampliação de p16 modi-ficado com bissulfito
Neste exemplo, os iniciadores da PCR foram desinados paraeqüivaler ao alvo modificado com bissulfito, que era originalmente metilado.A seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliação in vitro doDNA genômico humano modificado com bissulfito, usando os iniciadores dePCR oligonucleotídeos listados abaixo (de 5' para 3').
SEQ ID NO: 45 Iniciador 5p16:GTTGGTTACGGTCGCGGTTCSEQ ID NO: 46 Iniciador 3p16:CCGACCGTAACTATTCGATACG
11.4. Seqüências-alvo e Controles.
O DNA genômico humano extraído da linhagem de células K562foi usado como um DNA genômico de controle negativo que contém umpromotor do gene p16 não-metilado. O DNA genômico metilado CpG univer-sal (Chemicon) foi usado como um controle para o promotor do gene p16metilado. O DNA genômico foi modificado com bissulfito de um dia para ooutro, usando o kit MethyIEasy (Human Genetic Signatures), de acordo comas instruções do fabricante. O DNA metilado e o DNA não-metilado foramentão diluídos serialmente para produzir amostras que contêm proporçõesvariadas de DNA metilado no promotor do gene p16, a saber: 100%, 20%,4%, 0,8%, 0,16% e 0,032%. Usou-se dH20 isenta de nuclease no lugar doDNA genômico como um controle sem alvo.
11.5. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Se-qüência-alvo
A ampliação e quantificação em tempo real da seqüência-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 μΙ. Todas reações fo-ram conduzidas em um Sistema Stratagene MX3005p QPCR. Os parâme-tros da ciclagem foram 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 15 segun-dos e 56°C por 30 segundos, e finalmente 50 ciclos de 95°C por 15 segun-dos e 52°C por 30 segundos. As reações continham 5p16 200 nM e a40 nMde 3p16, p16A5/3-P 200 nM e p16B6/3-P 200 nM, SubBi-3-FB 200 nM, Mg-Cl2 7,5 mM, 200 μΜ de cada dNTP, 10 unidades de RNAsina (Promega), 1 χImmobuffer (Bioline), 1 unidade de Immolase (BioIine) e 150 ng de DNA ge-nômico modificado com bissulfito (contendo 100%, 20%, 4%, 0,8%, 0,16%ou 0,032% de DNA metilado) ou dH20 apenas (nenhuma reação de controledo alvo). Todas reações foram realizadas em duplicata.
11.6. Resultados: Detecção da Metilação por uma MNAzima
A MNAzima específica de metilação apresentou um aumento nafluorescência no decorrer do tempo quando a amostra-alvo continha 100%descendo até 0,16 % de DNA metilado (Tabela 12). Em contraste, quando aamostra-alvo continha 0,032% e 0% de DNA metilado, a reação apresentouum baixo nível de fluorescência, similar àquele observado no controle semalvo, e a fluorescência não aumentou no decorrer do tempo. Como a percen-tagem de alvo metilado diminuiu, o Ct da reação aumentou e uma cruva-padrão foi plotada com um valor de R2 de 0,996. Os resultados experimen-tais estão resumidos na Tabela 12 abaixo.15 Tabela 12. Uso de MNAzimas para Detectar a Metilação de DNA em A-mostras de DNA Genômico Modificado com Bissulfito.
<table>table see original document page 134</column></row><table>
Os iniciadores específicos de p16 metilado e a MNAzima foramcapazes de discriminar entre um alvo metilado e não-metilado, sob as condi-ções usadas neste exemplo. Além disso, o sistema permitiu a detecção dealvo 0,16% metilado em um fundo de alvo não-metilado. 100% de eficiênciaem uma reação de PCR infere uma duplicação em cada ciclo. A eficiênciaobservada neste experimento de 133% indica que há ampliação do alvo (porPCR) e também detecção de amplicons ampliada pela atividade catalítica daMNAzima.
Exemplo 12: MNAzimas que se Combinam a Partir de Partizimas queTêm Braços Sensores que Formam Estruturas Grampo.
A estrutura de partizimas, que são capazes de se combinarempara dar MNAzimas ativas, é flexível. Este exemplo demonstra estruturasadicionais que são compatíveis com a atividade de MNAzima.
12.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
A detecção usando MNAzimas pode ser realizada tambémquando a região dos braços sensores da partizima A, ou da partizima B1 ouda partizima A e também da B, é seguida de uma seqüência grampo arbitrá-ria. Nos experimentos que se seguem, as partizimas AeB foram desenha-das para acertar a seqüência de um microRNA humano, hsa-miR-143. Asseqüências dos oligonucleotídeos da partizima A e da partizima B estão lis-tadas abaixo, de 5' para 3'. Nas seqüências que se seguem, as bases subli-nhadas fazem parte do núcleo catalítico da MNAzima combinada, as basesem negrito hibridizam com o alvo, as bases em itálico hibridizam para osubstrato e as bases em letras normais formam a grampo.
SEQ ID NO: 142 Partizima A2 miR143 A2/1: TGAGCTACAGTCGGTC-GkkATAGTGAGT
SEQID NO: 143 Partizima B3 miR143 B3/1: CATCTCTTCfOQzGAGCGCTTCATCTCA
SEQ ID NO: 144 Partizima A2 miR143 A2H/1: GGCACTAACGTGCCT-GAGCTACAGTCGGTCGAA^ TAGTGAGT
SEQID NO: 145 Partizima B3 miR143 B3H/1: CATCTCTTCTCC-GAGCGCTTCATCTCACGACGATAACGTCG
12.2. Substratorepórter
A atividade da MNAzima foi monitorada pela clivagem de umsubstratorepórter de ácidos nucléicos rotulado duplamente. O substratore-pórter para este exemplo foi SubBi-1-FB com a seqüência, de 5' para 3', a-baixo. As bases em letras minúculas representam RNA e as bases em letrasmaiúsculas representam DNA. As bases sublinhadas indicam a posição deuma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade3'. As mudanças na fluorescência em virtude da clivagem de SubBi-1-FB nodesoxirribonucleotídeo entre FAM e BHQ1 foram monitoradas a 530 nm(comprimento de onda de emissão FAM) com excitação em 485 nm (com-primento de onda de excitação FAM).
SEQ ID NO: 6 SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
12.3. Alvo
A seqüência do alvo para este exemplo foi um oligonucleotídeode DNA, D-143Target, que tem uma seqüência homóloga ao microRNA hu-mano, hsa-miR-143. A seqüência de D-143Target foi a seguinte, de 5' para 3':
SEQ ID NO: 146 D-143Target:TGAGATGAAGCACTGTAGCTCA
12.4 Condições da Reação
A detecção da seqüência-alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNAzi-ma cataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substra-to, e o volume total de todas reações foi de 25 μΙ_. Todas reações foramconduzidas a 40°C em um termociclador SmartCycler® System (Cepheid). Afluorescência para cada reação foi lida a cada 7 segundos por um total de 10minutos. Todas reações na Tabela 13 continham a mistura em massa queconsiste em SubBi-1-FB 1 μΜ, Tris HCI 10 mM (pH 9,0 a 25°C) e MgCI2 25 mM.Tabela 13: Componentes de Reações para a Detecção de um Ácido Nu-cléico-alvo.
<table>table see original document page 137</column></row><table>
Cada cavidade da reação no termociclador SmartCycler® Sys-tem (Cepheid) utilizado durante um experimento foi primeiramente testadoquanto a seu nível de fundo da fluorescência, pois isto reconhecidamentevaria entre cavidades. Isto foi medido lendo a fluorescência da mistura emmassa sozinha. Este valor foi então subtraído de todas as outras reaçõesrealizadas nessa cavidade para permitir comparações entre cavidades.
12.5. Resultados: Detecção da Clivagem do SubstratorepórterSubBi-1-FB
As várias combinações de desenhos das partizimas AeB foramtodas capazes de serem combinadas para dar MNAzimas ativas. Estas últi-mas clivaram o substratorepórter, como evidenciado por um aumento na flu-orescência, apenas na presença da seqüência-alvo. Neste exemplo, os bra-ços sensores das partizimas tinham sido estendidos com a seqüência queformou um grampo. As reações, que continham uma partizima com umgrampo (partizima A ou partizima B), ou onde ambas partizimas (A e B) con-tinham grampos, deram sinais fluorescentes similares àquele observadoquando as partizimas que careciam de grampos foram usadas. Nenhum au-mento no sinal foi observado em qualquer uma das reações de controle quecareciam de alvo.
O desenho de partizimas que contêm grampos proporciona umaestratégia apropriada para a detecção de seqüências curtas, tal como mi-croRNA. O oligonucleotídeo de DNA detectado neste experimento tinha a-penas 22 bases. Esta seqüência foi detectada usando partizimas, as quaiscontêm ou não grampos. O desenho de grampo proporciona uma estruturamais estável e proporciona flexibilidade adicional no desenho de partizimasque reconhecidamente são compatíveis com a combinação e a atividadecatalítica da MNAzima.
Exemplo 13: Uso de MNAzimas para a Quantificação Simultânea déQuatro Seqüências de Ácidos Nucléicos por Intermédio de RT-PCR13.1. Oligonucleotídeos de Partizimas para um Ensaio Quádruplode RT-PCR
Múltiplos alvos podem ser ampliados simultaneamente em tem-po real, usando métodos de ampliação de alvos in vitro, tal como RT-PCR.Além disso, a ampliação dos alvos pode ser monitorada simultaneamenteem tempo real, em uma reação multiplexada que compreende múltiplasMNAzimas singulares. Cada MNAzima tem braços sensores específicos pa-ra um alvo, e braços de substrato específicos para um membro singular deuma série de substrates genéricos, cada um deles sendo rotulado com umfluoróforo diferente (Figura 18). Neste exemplo, as MNAzimas foram dese-nhadas para detectar quarto alvos diferentes, a saber, transcritos de BCRhumano, RPLPO, β-actina e HPRT. Deve-se avaliar que inúmeros alvos po-dem ser usados de acordo com o método. As seqüências das partizimas A eB para cada alvo estão listadas abaixo, de 5' para 3'. Nas seqüências que seseguem as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico da MNAzimacombinada, as bases em negrito hibridizam com o alvo, e as bases em itáli-co hibridizam para o substrato.
SEQ ID NO: 51 Partizima A4 BaA4/2-P: AGATCAAGATCATTGCTCCACA-ACGA GA G GAAA CC TT- P
SEQ ID NO: 52 Partizima B5 BaB5/2-P: TGCCCAGGG/AGGÇTAGÇTTCCT-GAGCGCAAGTACTC-P
SEQ ID NO: 29 Partizima A4 R05A4/3-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTC-TACAACGAGGTTGTGCTG-P
SEQ ID NO: 30 Partizima B5 R05B5/3-P: CGGTTGGTGAGGC-TAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-P
SEQ ID NO: 55 Partizima A4 BCRA4/6-P: AGTTCAAATCTGTACTGCAC-CACAACGAGAGGCGTGA T- P
SEQ ID NO: 56 Partizima B5 BCRB5/6-P: CTGGGAGGAAGG C-TAGCTCTGGAGGTGGATTCCTTTGG-P
SEQ ID NO: 57 Partizima A4 HPRTA4/7-P: ACTGAATAGAAATAGTGA-TAG ATAC A AC G A G TGCCA TG TTAA-P
SEQ ID NO: 58 Partizima B5 HPRTB5/7-P: TATCACAGCCAAGGC-
TAGCTCCATTCCTATGACTGTAGATT-P
13.2. Substratos-repórter
Para este exemplo, foram usados quatro substratos repórter di-ferentes, cada um rotulado com um fluoróforo diferente. As seqüências dossubstratos estão indicadas, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo,SubBi-2 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-JOE na extremi-dade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-2-JB.
A clivagem de SubBi-2-JB foi monitorada a 555 nm com excitação em 535nm. SubBi-3 foi rotulado nas extremidades com uma porção Quasar 670 naextremidade 5' e uma porção BHQ2 na extremidade 3', e foi designado Sub-BÍ-3-Q6B2. A clivagem de SubBi-3-Q6B2 foi monitorada a 665 nm com umaexcitação em 635 nm. SubBi-6 foi rotulado nas extremidades com uma por-ção Texas Red na extremidade 5' e uma porção BHQ2 na extremidade 3', efoi designado SubBi-6-TRB2. A clivagem de SubBi-6-TRB2 foi monitorada a610 nm com excitação em 585 nm. O quarto substrato, SubBi-7, foi rotuladonas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porçãoBHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-7-FB. A clivagem de SubBi-7-FB foi monitorada a 516 nm com uma excitação em 492 nm. As bases emletras minúsculas representam RNA e as bases em letras maiúsculas repre-sentam DNA.SEQ ID NO: 59 SubBi-2-JB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO: 60 SubBi-3-Q6B2:CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO: 61 SubBi-6-TRB2:ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 62 SubBi-7-FB:TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
13.3. Seqüências-alvo e Iniciadores de PCR para a Ampliação dosQuatro Amplicons
O RNA total humano de células leucêmicas K562 foi usado co-mo modelo para a ampliação in vitro de todos quatro transcritos do alvo. Osamplicons foram gerados por RT-PCR usando os iniciadores de PCR oligo-nucleotídeos listados abaixo.
SEQ ID NO: 32 5' Iniciador 5R05/1:CATTCTATCATCAACGGGTA
SEQ ID NO: 33 3' Iniciador 3R05/1:C AAAG GCAG ATG G ATCAG
SEQ ID NO: 63 5' Iniciador 5Bactin:CATTGCCGACAGGATGCAGA
SEQ ID NO: 64 3' Iniciador 3Bactin:GAGCCGCCGATCCACACG
SEQ ID NO: 65 5' Iniciador 5BCR14:CACTCAGCCACTGGATTTAA
SEQ ID NO: 66 3' Iniciador 3BCR15/6:GCGCGTCTTTGCTTTATTC
SEQ ID NO: 67 5' Iniciador 5HPRT/5:CTTTGCTGACCTGCTGGATTA
SEQ ID NO: 68 3' Iniciador 3HPRT/8:CCTGTTGACTGGTCATTACAA
13.4. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Se-qüência-alvoA ampliação e quantificação em tempo real das seqüências-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 μι. Todas reaçõesforam conduzidas em um Sistema Mx3005P® QPCR (Stratagene). Os pa-râmetros da ciclagem foram 50°C por 30 minutos, 95°C por 7 minutos, 10ciclos de 95°C por 15 segundos e 65°C por 30 segundos (com um decrésci-mo de 1°C na temperatura por ciclo), e finalmente 40 ciclos de 95°C por 15segundos, e 54°C por 30 segundos. As reações continham 40 nM.de cadainiciador 5' e 200 nM de cada iniciador 3', 200 nM de cadai partizima A e 200nM de cada partizima B, 200 nM de cada substrato, MgCI2 10 mM, 200 μΜde cada dNTP, 10 undades de RNAsina (Promega), 20 unidades de M-MLVRT (H-), 1 χ Immobuffer (Bioline), 1,5 unidade de Immolase (Bioline), e mo-delo de RNA total (100 ng, 20 ng, 4 ng, 800 pg, 160 pg ou 32 pg) ou nenhumalvo (dH20).
Tabela 14: Componentes de Reações para a Detecção Simultânea deQuatro Ácidos Nucléicos-alvo.
<table>table see original document page 141</column></row><table>
13.5. Resultados: Ampliação Simultânea de Quatro Seqüências-alvo Diferentes e Detecção por Intermédio da Clivagem de Quatro Subs-tratos-repórter DiferentesAs quatro MNAzimas usadas para a detecção e quantificaçãoem tempo real de transcritos de β-actina, RPLPO, BCR1 e HPRT apresenta-ram um aumento na fluorescência no decorrer do tempo quando a seqüên-cia-alvo usada era RNA total humano ampliado por intermédio de RT-PCR(Tabela 15). A fluorescência do controle do alvo sem RNA para todas asquatro reações foi mais baixa do que aquela nas reações que contêm alvoRNA e não aumentou durante a reação (Tabela 15). Isto demonstra que oaumento na fluorescência produzido em reações que contêm o alvo deveu-se à combinação dependente do alvo de MNAzimas cataliticamente ativas que então clivaram o substratorepórter.
Foram geradas curvas-padrão para todos os quatro alvos, plo-tando o Iog das concentrações de RNA contra o ciclo limite, resultando emuma plotagem linear. O limite (Ct) de cada padrão está indicado na Tabela15. Os valores de Ct indicados na tabela são uma media dos resultados parareações em duplicata. O coeficiente de correlação (R2)1 a inclinação e a efi-ciência da reação para cada alvo também estão indicados na Tabela 15.
Tabela 15: Resultados de Reações para a Ampliação e Detecção Simul-tânea de Quatro Ácidos Nucléicos-alvo Diferentes
<table>table see original document page 142</column></row><table>A reação da MNAzima RTPCR neste exemplo permitiu a detec-ção e geração simultânea de curvas-padrão para a quantificação de quatroalvos em uma única reação multiplex que incluiu quatro substrates genéri-cos. Estes substratos genéricos são apropriados para monitorar outras com-binações de quatro alvos em uma única reação.
Exemplo 14: Uso de MNAzimas para a Quantificação de Cinco Seqüên-cias de Ácidos Nucléicos em uma RT-PCR Multiplex em Tempo Real14.1. Oligonucleotídeos de Partizimas para um Ensaio Quíntuplode RT-PCR
Múltiplos alvos podem ser ampliados simultaneamente em tem-po real, usando métodos de ampliação de alvos in vitro, tal como RT-PCR.Aém disso, a ampliação dos alvos pode ser monitorada simultaneamente emtempo real, em uma reação multiplexada que compreende múltiplas MNAzi-mas singulares. Cada MNAzima tem braços sensores específicos para umalvo, e braços de substrato específicos para um membro singular de umasérie de substrates genéricos, cada um deles sendo rotulado com um fluoró-foro diferente (Figura 18). Neste exemplo, as MNAzimas foram desenhadaspara detectar cinco alvos diferentes, a saber, BCR, RPLPO éxon 4, β-actina,RPLPO éxon 5 e seqüências de RNMm HPRT. Deve-se avaliar que inúme-ros alvos podem ser usados de acordo com o método. As seqüências daspartizimas AeB estão listadas abaixo, de 5' para 3'. Nas seqüências que seseguem, as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalíticoda MNAzimacombinada, as bases em negrito hibridizam com o alvo, e as bases em itáli-co hibridizam para o substrato.
SEQ ID NO: 69 Partizima A4 BaA4/7-P: AGATCAAGATCATTGCTCCACA-ACGAG TGCCA TG TTAA-P
SEQ ID NO: 70 Partizima B5 BaB5/7-P: TA TCACAGCCAAGGC-TAGCTTCCTGAGCGCAAGTACTC-P
SEQ ID NO: 71 Partizima A4 R05A4/4-P: CAAACGAGTCCTGGCCTTGTC-TACAACGA G TGCGCCA TG- P
SEQ ID NO: 72 Partizima B5 R05B5/4-P: TACTTCTCCCAAGGC-TAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC-PSEQ ID NO: 55 Partizima A4 BCRA4/6-P: AGTTCAAATCTGTACTGCAC-CACAACGA GAGGCGTGA T- P
SEQ ID NO: 56 Partizima B5 BCRB5/6-P: CTGGGAGGAAGGC-TAGCTCTGGAGGTGGATTCCTTTGG-P
SEQ ID NO: 75 Partizima A4 HPRTA4/2-P: ACTGAATAGAAATAGTGA-TAG AT AQAAQGAGAGGAAACCTT-P
SEQ ID NO: 76 Partizima B5 HPRTB5/2-P: TGCCCAGGGAGGCTAGCTC-CATTCCT ATGACTGTAGATT-P
SEQ ID NO: 77 Partizima A4 R04A4/3-P: GCTGGTCATCCAGCAGACA-ACGAGGTTGTGCTG-P
SEQ ID NO: 78 Partizima B5 R04B5/3-P CGGTTGGTGAGGC-TAGCTGTGTTCGACAATGGC-P
14.2. Substratos-repórter
Para este exemplo, foram usados cinco substratos-repórter dife-rentes, cada um deles tendo sido rotulados com um entre cinco fluoróforosdiferentes. As seqüências dos substratos estão grafadas de 5' para 3'. Nopresente exemplo, SubBi-2 foi rotulado nas extremidades com uma porçãoAlexa 350 na extremidade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foidesignado SubBi-2-A350B. A clivagem de SubBi-2-A350B foi monitorada a440 nm com excitação em 350 nm. SubBi-3 foi rotulado nas extremidadescom uma porção Quasar 670 na extremidade 5' e uma porção BHQ2 na ex-tremidade 3', e foi designado SubBi-3-Q6B2. A clivagem de SubBi-3-Q6B2foi monitorada a 665 nm com excitação em 635 nm. SubBi-6 foi rotulado nasextremidades com uma porção Texas Red na extremidade 5' e uma porçãoBHQ2 na extremidade 3', e foi designado SubBi-6-TRB2. A clivagem deSubBi-6-TRB2 foi monitorada a 610 nm com excitação em 585 nm. SubBi-7foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' euma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-7-FB. A cliva-gem de SubBi-7-FB foi monitorada a 516 nm com excitação em 492 nm.SubBi-4 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-JOE na extremi-dade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-4-JB.A clivagem de SubBi-4-J8 foi monitorada a 555 nm com excitação em 535nm. As bases em letras minúsculas representam RNA e as bases em letrasmaiúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 79 SubBi-2-A350B:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO: 60 SubBi-3-Q6B2:
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO: 61 SubBi-6-TRB2:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 62 SubBi-7-FB:
TTAACATGGCACguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO: 83 SubBi-4-JB:
CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA
14.3. Seqüências-alvo e Iniciadores de PCR para Ampliação deCinco Seqüências-alvo de MRNa.
O RNA total humano extraído de células K562 foi usado comomodelo para a ampliação in vitro de todos os cinco alvos. Os amplicons fo-ram gerados por ampliação in vitro, usando os iniciadores de PCR oligonu-cleotídeos listados abaixo.
SEQ ID NO: 32 5' Iniciador 5R05/1:CATTCTATCATC A ACG GGTASEQ ID NO: 33 3' Iniciador 3R05/1:CAAAGGCAGATGGATCAGSEQ ID NO: 63 5' Iniciador 5Bactin:CATTGCCGACAGGATGCAGASEQ ID NO: 64 3' Iniciador 3Bactin:GAGCCGCCGATCCACACGSEQ ID NO: 65 5'Iniciador 5BCR14:CACTCAGCCACTGGATTTAASEQ ID NO: 66 3' Iniciador 3BCR15/6:GCGCGTCTTTGCTTTATTCSEQ ID NO: 67 5' Iniciador 5HPRT/5:CTTTGCTGACCTGCTGGATTASEQ ID NO: 68 3' Iniciador 3HPRT/8:CCTGTTGACTGGTCATTACAASEQ ID NO: 84 5' Iniciador 5R04/3:CAAGACTGGAGACAAAGTGSEQ ID NO: 85 3' Iniciador 3R04/2:GCAGAGTTTCCTCTGTGATA
14.4. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Se-qüência-alvo
A ampliação e quantificação em tempo real das seqüências-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 pL. Todas as reaçõesforam conduzidas em um Sistema Mx3005P® QPCR (Stratagene). Os pa-râmetros da ciclagem foram 50°C por 30 minutos, 95°C por 7 minutos, 10ciclos de 95°C por 15 segundos e 65°C por 30 segundos (com um decrésci-mo de 10C na temperatura por ciclo), e finalmente 40 ciclos de 95°C por 15segundos e 54°C por 30 segundos. As reações continham 40 nM de 5Bactin,5BCR14, 5HPRT/5 e 80 nM 5R04/3, 5R05/1 e 200 nM 3Bactin, 3BCR15/6,3HPRT/8 e 400 nM 3R04/2 e 3R05/1. Havia 200 nM de cada partizima A epartizima B para Dactin, BCR, RPLPO éxon 4 e HPRT e 400 nM de cadapartizima A e partizima B para RPLPO éxon 5. Havia 200 nM de SubBi-2-A350B, SubBi-3-Q6B2, SubBi-6-TRB2 e SubBi-7-FB, e 400 nM de SubBi-4-JB. Além disso, havia 10 mM MgCI2, 200 μΜ de cada dNTP, 10 unidades deRNAsina (Promega), 20 unidades de M-MLV RT (H-) (Promega), 1 χ Immo-buffer (Bioline), 2 unidades de Immolase (BioIine) e 5 μΙ de modelo de RNAtotal (100ng, 20 ng, 4 ng, 800 pg, ou 160 pg) ou nenhum alvo (dH20).Tabela 16: Componentes de Reações para a Detecção Simultânea deCinco Ácidos Nucléicos-alvo Diferentes
<table>table see original document page 147</column></row><table>
14.5. Resultados: Ampliação Simultânea de Cinco Seqüências-alvo Diferentes e Detecção por Intermédio da Clivagem de Cinco Subs-tratos-repórter Diferentes
As cinco MNAzimas usadas para a detecção e quantificação emtempo real de seqüências de RNA dentro de RPLPO éxon 4, BCR, β-actina,RPLPO éxon 5 e HPRT apresentaram um aumento na fluorescência no de-correr do tempo quando a seqüência-alvo usada foi o RNA total humanoampliado por RT-PCR (Tabela 17). A fluorescência do controle sem alvoRNA para todas as cinco reações foi mais baixa do que aquela nas reaçõesque contêm o alvo de RNA e não aumentou durante a reação (Tabela 17).Isto demonstra que o aumento na fluorescência em reações que contêm alvodeveu-se à combinação dependente do alvo de MNAzimas cataliticamenteativas que então clivaram o substratorepórter.Curvas-padrão foram geradas para todos os cinco alvos plotan-do o Iog das concentrações de RNA contra o ciclo limite, resultando em umaplotagem linear. O limite (Ct) de cada padrão está indicado na Tabela 17. Osvalores de Ct são a média das reações em duplicata. O coeficiente de corre-lação (R2), a inclinação e a eficiência da reação para cada alvo também es-tão indicadas na Tabela 17.
Tabela 17: Resultados de Reações para a Ampliação e Detecção Simul-tânea de Cinco Ácidos Nucléicos-alvo Diferentes
<table>table see original document page 148</column></row><table>
A reação RT-PCR de MNAzima neste exemplo possibilitou a de-tecção e geração simultânea de curvas-padrão para a quantificação de cincoalvos em uma única reação multiplex que incluiu cinco substratos genéricos.
Estes substratos genéricos são apropriados para monitorar outras combina-ções de cinco alvos em uma única reação.
Exemplo 15: Uso de MNAzimas para a Quantificação de 16S Ribossô-mico em Bactérias
Para substituir o teste bacteriano de uma mancha de Gram,MNAzimas podem ser usadas para um teste de liberação rápida quanto àesterilidade e/ou contaminação micoplasmática, baseado em seqüências deácidos nucéicos conservadas encontradas em espécies bacterianas. AsMNAzimas podem ser usadas para monitorar a ampliação de ácidos nucléi-cos-alvo bacterianos em tempo real, usando métodos de ampliação de alvosin vitro, tal como RT-PCR. Neste exemplo, uma região conservada na se-qüência de 16S ribossômico bacteriano é usada, onde a transcrição reversa,a ampliação por PCR e a detecção mediada por MNAzima ocorrem simulta-neamente no único tubo.
Foi desenhado um sistema para acertar uma região da seqüên-cia de 16S ribossômico que é comum a várias espécies bacterianas, incluin-do Staphylococcus eapitis, Staphylococcus epidermidis, Staphyloeoeeuswarneri, Staphyloeoeeus aureus, Baeillus subtilis, Streptoeoeeus pyogenes,Clostridium sporogenes, Aeinetobaeter woffii, Propionibacterium aenes,Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas fluoreseens.
15.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Os oligonucleotídeos de partizimas AeB usaram o desenho 7com braços sensores complementares a uma região conservada entre espé-cies bacterianas. Os oligonucleotídeos de partizimas estão listados abaixo,sendo que "-P" indica fosforilação em 3' do oligonucleotídeo. Nas seqüên-cias que se seguem as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalíticoda MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizan com o alvo, e asbases em itálico hibridizam para o substrato.
SEQ ID NO: 86 Partizima A5 16S1A5/2-P: GGTTGTCGTCAGCTCGTGTA-CAACGAGAGGAAACCTT-P
SEQ ID NO: 87 Partizima B6 16S1B6/2-P: TGCCCAGGGAGGC-TAGCTCGTGAGATGTTGGGTTAAG-P
15.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-2 com a seqüên-cia, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo, SubBi-2 foi rotulado nas ex-tremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1na extremidade 3', e foi designado SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FBfoi monitorada a 516 nm (comprimento de onda de emissão FAM) com exci-tação em 492 nm (comprimento de onda de excitação FAM). As bases emletras minúsculas representam RNA e as bases em letras maiúsculas repre-sentam DNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
15.3. Iniciadores de PCR para Ampliação de 16S Ribossômico emBactérias
A seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliação invitro de Baclllus Subtilis usando os iniciadores de PCR oligonucleotídeoslistados abaixo.
SEQ ID NO: 88 5' Iniciador 516S1 -1:TG GTG CATG GTTGTCGTC
SEQ ID NO: 89 3' Iniciador 316S1 -1:TTGCGCTCGTTGCGGGA
15.4. Seqüência-alvo e Controle
O RNA ribossômico bacteriano foi extraído de células de BacillusSubtilis e foi usado como modelo para a ampliação da região de 16S. Usou-se dH20 isenta de nuclease no lugar de RNA como um controle sem alvo.
15.5. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Se-qüência-alvo
A ampliação e quantificação em tempo real da seqüência-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 μL. Todas as reaçõesforam conduzidas em um Sistema Mx3005p QPCR (Stratagene). Os parâ-metros da ciclagem foram 50°C por 30 minutos, 95°C por 7 minutos, 10 ci-clos de 95°C por 15 segundos e 65°C por 30 segundos (com um decréscimode 1°C na temperatura por ciclo), e finalmente 40 ciclos de 95°C por 5 se-gundos e 55°C por 30 segundos. As reações continham 40 nM 516S1-1 e200 nM de 316S1-1, 200 nM 16S1A5/2-P e 200 nM 16S1B6/2-P, 200 nMSubBi-2-FB, 7,5 mM MgCI2, 200 μΜ de cada dNTP, 10 unidades de RNAsina(Promega), 1 χ Immobuffer (Bioline), 1 unidade de Immolase (BioIine) e mo-delo de RNA (500 ng, 50 ng, 5 ng ou 500 pg) ou nenhum alvo (dH20).15.6. Resultados: Ampliação de Alvo e Clivagem do Substratore-pórter SubBi-2-FB
A MNAzima para a detecção e quantificação em tempo real de16S ribossômico bacteriano apresentou um aumento na fluorescência nodecorrer do tempo quando a seqüência-alvo usada foi o RNA bacterianoampliado por RT-PCR. A fluorescência do controle sem modelo foi mais bai-xa do que aquela nas reações que contêm RNA e não aumentou durante areação. Isto demonstra que o aumento na fluorescência em reações quecontêm alvo deve-se à combinação dependente do alvo de MNAzimas catali-ticamente ativas que depois clivaram o substratorepórter. Uma curva-padrãofoi gerada plotando o Iog das concentrações de RNA contra o ciclo limite,resultando em uma plotagem linear com um coeficiente de correlação de0,992.
Tabela 18: Resultados de Reações para a Ampliação e Detecção deAmplicons de 16S Ribossômico Bacteriano
<table>table see original document page 151</column></row><table>
Este exemplo demonstra a capacidade de MNAzimas detecta-rem e quantificarem amplicons gerados pela ampliação por RT-PCR do RNAde 16S ribossômico bacteriano. As MNAzimas usadas neste exemplo asses-tam uma região de 16S bacteriano que é 100% conservada entre Staphylo-coccus capitis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus warneri, Staph-ylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes, Clostridiumsporogertes, Acinetobaeter woffii, Propionibaeterium aenes, Pseudomonasaeruginosa e Pseudomonas fluoreseens. Assim sendo, tal única MNAzima esubstratorepórter poderiam ser usados para triar uma amostra quanto à pre-sença de qualquer uma dsa bactérias acima. A detecção de um sinal (poexemplo, FAM) seria indicativa da presença de uma ou mais destas espé-cies bacterianas na amostra.
Exemplo 16: Uso de MNAzimas para a Detecção e Quantificação deRNA Viral por Intermédio de RT-PCR em um Único Tubo
As MNAzimas podem ser usadas para monitorar a ampliação deácidos nucléicos-alvo em tempo real, usando métodos de ampliação de al-vos in vitro, tal como RT-PCR. Além disso, o monitoramento em tempo realpermite que a quantidade de alvo inicialmente presente na reação seja quan-tificada. Este exemplo ilustra o uso de MNAzima para a detecção e quantifi-cação do RNA viral de HIV. A transcrição reversa, a ampliação por PCR e adetecção por MNAzima foram realizadas em uma reação em um tubo.
16.1. Oligonucleotideos de Partizimas
As partizimas foram desenhadas parasestar especificamente ogene Nef de HIV-1. Nas seqüências que se seguem as bases sublinhadasfazem parte do núcleo catalítico da MNAzima combinada, as bases em ne-grito hibridizam com o alvo, e as bases em itálioc hibridizam para o substra-to. O "-P" indica a fosforilação em 3' do oligonucleotídeo.SEQ ID NO: 90 Partizima A4 NefA4/6-P: GAAGAGGCCAATAAAGGAGA-G AC AACG A GA GGCG TGA T- P
SEQ ID NO: 91 Partizima B5 NefB5/6-P: CTGGGAGGAAGGCTAGCTAA-CACCAGCTTGTT ACACC-P
16.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-6 com a seqüên-cia, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo, SubBi-6 foi rotulado nas ex-tremidades com uma porção Texas Red na extremidade S' e uma porçãoBHQ2 na extremidade 3', e foi designado SubBi-6-TRB2. A clivagem deSubBi-6-TRB2 foi monitorada a 610 nm (comprimento de onda de emissãode Texas Red) com excitação em 585 nm (comprimento de onda de excita-ção de Texas Red). Na seqüência que se segue as bases em letras minús-culas representam RNA e as bases em letras maiúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 61 SubBi-6-TRB2:ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
16.3. Seqüências-alvo
A curva-padrão neste experimento foi gerada pela ampliação porRT-PCR do RNA viral de HIV-1. Um kit QIAGEN Ultrasens Virus Kit HIV-1 foiusado para isolar o RNA viral do meio coletado a partir de células CEMT4humanas infectadas com HIV-1. Usou-se água isenta de nuclease (NF) nolugar de RNA viral como um controle sem alvo.
16.4. Iniciadores de PCR para Ampliação dos Transcritos de Nefde HIV-1
Os iniciadores que se seguem foram usados para a ampliaçãode transcritos de Nef de HIV-1. O iniciador em 3', Nef/3PCR, foi usado paraa transcrição reversa e depois este iniciador e o iniciador em 5', Nef/5PCR,possibilitaram a ampliação por PCR.
SEQ ID NO: 92 Iniciador Nef/3PCR:CAG G GTC ATCC ATTCCATGCAGSEQ ID NO: 93 Iniciador Nef/5PCR:GCTAGTACCAGTTGAGCCAG
16.5. Componentes da Reação: Ampliação e Quantificação de Se-qüência-alvo
A ampliação e quantificação em tempo real da seqüência-alvoforam realizadas em um volume total da reação de 25 pL. Todas as reaçõesforam conduzidas em um Sistema Mx3005p QPCR (Stratagene). Os parâ-metros da ciclagem foram 50°C por 30 minutos, 95°C por 7 minutos, 10 ci-clos de 95°C por 15 segundos e 65°C por 30 segundos {com um decréscimode 1°C na temperatura por ciclo), e finalmente 50 ciclos de 95°C por 15 se-gundos e 55°C por 30 segundos. As reações continham 200 nM do iniciadorde 3' Nef/3PCR e 40 nM do iniciador de 5' Nef/5PCR, 200nM da partizimaNefA4/6-P e 200nM da partizima NefB5/6-P, 200 nM SubBi-6-TRB2, 10 mMMgCI2, 200 μΜ de cada dNTP, 10 unidades de RNAsina (Promega), 1 χ Im-mobuffer (BioIine)j 0,5 unidade de Immolase (Bioline), 10 unidades de MMLVRT (H-) e 5 \jL de modelo de RNA total (contendo 45.000 pg, 4.500 pg, 450pg, 45 pg, 4,5 pg, ou 0,45 pg) ou nenhum alvo (apenas água).
16.6. Resultados: Ampliação de Alvo e Clivagem do Substratore-pórter SubBi-6-TRB2
A MNAzima para a detecção e quantificação em tempo real detranscritos de Nef de HIV-1 apresentou um aumento na fluorescência no de-correr do tempo quando a seqüência-alvo usada foi o RNA viral de HIV-1ampliado por RT-PCR. Não houve aumento no sinal para a reação de con-trole sem alvo (apenas água). Isto demonstra que o aumento na fluorescên-cia em reações que contêm alvo deve-se à combinação dependente do alvode MNAzimas cataliticamente ativas que depois clivaram o substratorepórter.
Uma curva-padrão foi gerada plotando o Iog da quantidade demodelo de RNA em cada reação contra o ciclo limite (Ct), resultando emuma plotagem linear. O Ct de cada padrão, junto com o coeficiente de corre-lação (R2), a inclinação e a eficiência da reação indicados na Tabela 19.
Tabela 19: Resultados da Ampliação e Detecção de Transcritos de Nefde HIV
<table>table see original document page 154</column></row><table>
Este exemplo demonstra a capacidade dasMNAzimas seremusadas para a detecção e quantificação de seqüências virais, incluindo HIV-1.
Exemplo 17: Requisitos de Seqüencias da Atividade Catalítica de MNA-zimas.
17.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
O núcleo catalítico da DNAzima 10:23, como originalmente des-coberta, compreende 15 nucleotídeos (Santoro & Joyce, 1997). Estudos pos-teriores das bases críticas dentro do núcleo catalítico demonstraram quecertas substituições de bases específicas diminuíram significativamente aatividade catalítica, enquanto que outras são bem-toleradas (Zaborowska etal).
Neste exemplo, várias partizimas foram desenhadas e testadaspara investigar a tolerância do núcleo catalítico das MNAzimas a uma varia-ção de seqüência dentro dos núcleos parciais das duas partizimas. As parti-zimas AeB não-modificadas para a MNAzima detectar o gene de RPLPOhumano foram usadas como controle e foram comparadas com várias se-qüências de partizimas mutadas nas quais uma substituição de uma únicabase tinha sido feita na região do núcleo catalítico parcial. Os oligonucleotí-deos de partizimas usados para detectar o alvo basearam-se no desenho 7(vide Exemplo 20) e estão listados abaixo, de 5' para 3'. Nas seqüências quese seguem as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico da MNA-zima combinada, as bases que estão sublinhadas, em itálico e em negritosão mutadas em comparação com as seqüências do núcleo parcial de con-trole (não-mutadas), as bases em negrito hibridizam com o alvo e as basesem itálico hibridizam para o substrato.
SEQ ID NO: 94 partizima A5 R04A5/2: GGGCTGGTCATCCAGCAGTACA-ACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 95 partizima A5 R04A5/2-G14A: GGGCTGGTCATCCAGCAG-TACAACAAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 96 partizima A5 R04A5/2-A9T: GGGCTGGTCATCCAG-CAGT TC AACG AGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 97 partizima A5 R04A5/2-A12T: GGGCTGGTCATCCAGCAG-JACATCGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 98 partizima A5 R04A5/2-A11T: GGGCTGGTCATCCAGCAG-TAC TACG A GA GGAAA CCTT
SEQ ID NO: 99 partizima B6 R04B6/2: TGCCCAGGGAGGC-TAGCGTGTTCGACAATGGCAGCA
SEQ ID NO: 100 partizima B6 R04B6/2-C7A: TGCCCAGGGAGGC1A-G>4GTGTTCGACAATGGCAGCA
SEQ ID NO: 101 partizima B6 R04B6/2-T4C: TGCCCAGGGAGGC-CAGCGTGTTCGACAATGGCAGCA
17.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-2 com a seqüên-cia, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo, SubBi-2 foi rotulado nas ex-tremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1na extremidade 3', e foi designado SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FBfoi monitorada a 530 nm (comprimento de onda de emissão de FAM) comexcitação em 485 nm (comprimento de onda de excitação de FAM). Na se-qüência que se segue as bases em letras minúsculas representam RNA e asbases em letras maiúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
17.3. Seqüência-alvo
Um oligonucleotídeo de DNA sintético foi usado como modelo dealvo neste experimento. A seqüência do alvo está indicada abaixo, de 5' para 3'.
SEQ ID NO: 102 R04/2Target: ATGCTGCCATTGTCGAACACCTGCTG-GATGACCAGCCCAA
17.4. Condições da Reação
A análise da atividade catalítica de vários pares de partizimas foirealizada usando um termociclador SmartCycIer System (Cepheid). As rea-ções foram iniciadas pela adição de substrato,e o volume total de todas rea-ções foi de 25 μΙ_. Cada reação continha 1 χ Tampão Il de PCR (Applied Bi-osystems), 10 mM MgCI2, 0,2 μΜ de SubBi-2FB, 2 μΜ de R04/2Target e umpar de partizimas A e B1 cada uma a 2 μΜ. Os pares de partizimas em cadareação foram como indicados na Tabela 20 abaixo.
Tabela 20: Componentes de Reações para a Detecção de um Ácido Nu-cléico-alvo
<table>table see original document page 157</column></row><table>
As reações foram incubadas a 54 DC por 20 minutos e os dadosfluorescentes foram coletados em intervalos de 12 segundos. Como a fluo-rescência inicial pode variar entre cavidades individuais no termocicladorSmartCycIer System, o valoer da fluorescência inicial foi subtraído da fluo-rescência em cada ponto no tempo para cada reação, a fim de permitir acomparação entre reações em cavidades diferentes. As médias de reaçõesreplicadas, contendo uma partizima A mutada ou uma partizima B mutada,foram então expressas como uma porcentagem da fluorescência para asreplicações de controle.17.5. Resultados: Detecção da Clivagem do SubstratorepórterSubBi-2-FB.
A clivagem do substrato pelos vários pares de partizimas foi me-dida pelamudança na fluorescência no decerrer do tempo. Os valores fluo-rescentes normalizados para cada reação foram então expressos como umaporcentagem da fluorescência observada em reações de controle no pontono tempo equivalente (Tabela 21).<table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table>O experimento ilustra que várias substituições no núcleo catalíti-co parcial da partizima A ou B foram compatíveis com a formação de MNA-zima ativa. Em contraste, outras substituições não foram bem-toleradas eproduziram estruturas com pouca ou nenhuma atividade cataiítica. Quandoos resultados obtidos usando MNAzimas foram compados com aqueles rela-tados para a substituição equivalente dentro do núcleo catalítico da DNAzi-ma 10:23 (Zaborowska et ai), um padrão similar foi observado (Tabela 21)acima. Por exemplo, uma substituição de A por G na posição 14 (G14A)dentro da partizima A, ou dentro do núcleo de 10:23, resultou em > 90% deperda de atividade de clivagem. Em contraste, a substituição de T por A naposição 12 (A12T) dentro da partizima A, ou dentro do núcleo de 10:23, re-sultou em moléculas que retinham aproximadamente 80% da atividade declivagem em comparação com as seqüências de controle.
Assim sendo, as informações na literatura sobre outras substitui-ções de seqüências, que são compatíveis com a atividade de DNAzima (porexemplo, DNAzima 10:23 ou DNAzimas 8:17), pderiam predizer a atividadecatai ítica esperada quando a mesma varação de seqüência é introduzida emuma das partizimas. Além disso, os versados nessas técnicas poderiam usartestes empíricos para identificar variantes adicionais do núcleo catalítico par-cial de partizimas, que são compatíveis com a formação de MNAzimas ati-vas.
Exemplo 18: Aplicação de MNAzimas para Detectar Alvos que IncluemMoléculas Pequenas tal como 5'-trifosfato de adenosina
Os aptâmeros são moléculas de DNA ou RNA de filamento únicodesenvolvidas in vitro a partir de grandes coleções de oligonucleotídeos comseqüências aleatórias quanto à sua capacidade de se ligarem a alvos comalta afinidade e especificidade. Os aptâmeros foram selecionados quanto àsua capacidade de se ligarem especificamente a muitos tipos de alvos, inclu-indo proteínas, carboidratos, lipídeos, nucleotídeos, células inteiras e vírus.Neste exemplo, uma seqüência de aptâmero foi incorporada na extremidadede uma partizima (apta-partizima) em uma configuração pela qual umaMNAzima ativa se formou apenas na presença do alvo. Há várias maneiraspara atingir este objetivo, incluindo as estratégias delineadas na Figura 4 e aestratégia usada no exemplo que se segue que está ilustrado na Figura 20.
Os oligonucleotídeos de ácidos nucléicos, necessários para aestratégia de detecção de MNAzimas, ilustrada na Figura 20, incluem: umapartizima-padrão;
a) uma apta-partizima que é uma partizima com um aptâmero in-corporado em uma das suas extremidades;
b) um facilitador de combinação que é um oligonucleotídeo que seliga à apta-partizima e também à partizima, permitindo a combinação de umaMNAzima ativa;
c) Um substrato de sonda repórter; e
d) um oligonucleotídeo inibidor que hibridiza para a apta-partizimaem uma região que cobre pelo menos parte da seqüência do aptâmero eparte do braço Iigante de substrato da seqüência da partizima.
Na ausência de um alvo que se liga ao aptâmero (quadro à es-querda na Figura 20), o oligonucleotídeo inibidor se liga à apta-partizima,bloqueando assim a ligação (e a clivagem) do substrato de sonda repórter.Na presença de um alvo que se liga ao aptâmero (quadro à direita na Figura20), o alvo se liga à seqüência do aptâmero da apta-partizima, impedindo aligação do oligonucleotídeo inibidor e permitindo a ligação e a clivagem dosubstrato de sonda repórter. Assim sendo, as MNAzimas podem se formar ecausar a geração de sinal fluorescente apenas na presença do alvo.
A estratégia foi demonstrada usando a detecção de uma molé-cula pequena, ATP. A seqüência de aptâmero com 27 nucleotídeos de com-primento, usada neste exemplo, foi relatada anteriormente como sendo al-tamente específica para a ligação de ATP e dATP (Achenbach, 2005; Hui-zenga e Szostak, 1995).
18.1. Oligonucleotídeos de Partizimas, Combinação e Oligonucle-otídeos Inibitórios
Neste exemplo a seqüência de aptâmero de ATP foi colocadaadjacente ao braço de substrato da apta-partizima A (Figura 20). Os braçossensores da apta-partizima A e partizima B foram desenhados para se liga-rem a um facilitador de combinação. As seqüências da apta-partizima At-pA2/1 e partizima Atp B3/1 (Figura 21) estão indicadas abaixo (de 5' para 3').Nas seqüências que se seguem as bases em negrito hibridizam com o facili-tador de combinação, as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalíticoda MNAzima combinada, e as bases em itálico hibridizam para o substrato.
Além disso, as bases em letras normais na partizima AtpA2/1 indicam se-qüências de aptâmero de DNA, que se ligam a ATP ou dATP.
SEQ ID NO: 103 Apta-Partizima A2 AtpA2/1:AACGTACACJGCACGCGGTCGAAATAGTGAGTACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
SEQ ID NO: 104 Partizima B3 AtpB3/1: CATCTCTTCTCCGAGCGTCTG-TACCGTGTAC
A seqüência do facilitador de combinação está indicada abaixo(de 5' para 3'):
SEQ ID NO: 105 Assembly facilitator AtpC/1: GTACACGGTACA-GACCGTGCAGTGTACGTT
A seqüência do oligonucleotídeo inibidor está indicada abaixo(de 5'para 3'):
SEQ ID NO: 106 Inibidor AtpR/1:CCAGGTACTCACTATTT
18.2. Substratorepórter
Aatividade da MNAzima foi monitorada pela clivagem do subs-tratorepórter de ácido nucleico rotulado duplamente. O substratorepórter pa-ra este exemplo é SubBi-1-FB com a seqüência, de 5' para 3', abaixo. Asbases em letras minúsculas representam RNA e as bases em letras maiús-culas representam DNA. As bases sublinhadas indicam a posição de umaporção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1 na extremidade 3'. Asmudanças na fluorescência em virtude da clivagem de SubBi-1-FB no ribo-nucleotídeo entre FAM e BHQ1 foram monitoradas a 520 nm (comprimentode onda de emissão de FAM) com excitação em 490 nm (comprimento deonda de excitação de FAM).
SEQ ID NO: 6 SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
18.3. Alvos
As moléculas-alvo para este exemplo foram 5'-trifosfato de ade-nosina(ATP) e 5'-trifosfato de desoxiadenosina (dATP). 5'-trifosfato de gua-nosina (GTP) e 5'-trifosfato de citosina (CTP) foram usados como controlesnegativos. Todas moléculas foram adquiridas na Bioline. Água isenta de nu-clease foi usada como um controle sem alvo.
18.4. Condições da Reação
A detecção do alvo foi medida por um aumento no sinal fluores-cente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNAzima catalitica-mente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substrato, e o volu-me total de todas reações foi de 50 μΐ_. Antes da injeção do substrato, todasreações foram pré-incubadas a 60°C por 5 minutos (para reduzir a estruturasecundária). As reações foram conduzidas a 47°C em um FLUOstar OPTI-MA (BMG Biotech). A fluorescência para cada reação foi lida a cada 3 se-gundos por um total de 10 minutos. Cada reação continha uma concentraçãofinal 200 nM de AtpA2/1, 200 nM de AtpB3/1, 200 nM de AtpC/1, 200 nM deAtpR/1, 200 nM de SubBi-1-FB, 25 mM de MgCI2, 50 mM de Tris HCI pH 7,5e 2 mM de ATP, dATP, GTP, CTP, ou nenhum alvo (água).
18.5. Resultados : Detecção e Clivagem do SubstratorepórterSubBi-1-FB
Na ausência de ATP ou dATP, foi observado um baixo nível defluorescência que não aumentou no decorrer do tempo, demonstrando que ooligonucleotídeo inibidor foi capaz de impeder a combinação de uma MNA-zima ativa (Figura 21). Na presença de ATP ou dATP, o sinal fluorescente foimais alto e ele aumentou no decorrer do tempo. Isto indica que o oligonucle-otídeo inibidor foi deslocado por dATP e ATP, e formou-se uma MNAzimaativa. A combinação da MNAzima foi dependente do alvo, pois o sinal fluo-rescente na presença de GTP e CTP foi igual àquele na ausência de ATP oudATP, isto é, no controle com água sem analisado. Este exemplo demonstraque as MNAzimas podem ser acopladas a aptâmeros para a detecção dealvos que incluem alvos ácidos nucléicos e diferentes de ácidos nucléicos,em uma abordagem que é altamente específica para o alvo.
Os versados nessas técnicas devem reconhecer que o desenhodesta estratégia pode ser flexível. O aptâmero pode ser incorporado emqualquer uma das duas extremidades (5' ou 3') de qualquer uma das duaspartizimas qe contêm seqüências de núcleos catalíticos parciais. Assim sen-do, o oligonucleotídeo inibidor pode se ligar à região do aptâmero e ao braçode substrato (que se liga ao substratorepórter) ou ao braço sensor (que seliga ao facilitador de combinação). No primeiro desenho (Figura 20; este e-xemplo), o inibidor bloqueia a ligação do substratorepórter. No último dese-nho, o inibidor impediria a ligação do facilitador de combinação com as parti-zimas, e portanto, impediria a formação da MNAzima ativa.
A literatura contém seqüências para inúmeros aptâmeros capa-zes de detector muitos tipos de alvos. Eles incluem proteínas, carboidratos,lipídeos, príons, nucleotídeos, células inteiras e vírus. Os aptâmeros paratodos estes tipos de alvos poderiam ser ligados a partizimas para detectaruma faixa muito diversa de moléculas. As condições da reação (tampão,temperatura, concentação de cátion bivalente, etc.), que são compatíveiscom a ligação de alvos a aptâmeros (ou apta-partizimas) e com a clivagemde um substratorepórter por uma MNAzima, podem ser determinadas portestes empíricos. Além disso, como os aptâmeros são desenvolvidos in vitrosob condições de reação selecionadas pelo pequisador,seria possível indivi-dualizar o desenvolvimento molecular para permitir o desenvolvimento deaptâmeros para qualquer alvo desejado que se ligará sob sob condiçõescompatíveis com a clivagem por MNAzimas. Como as MNAzimas são ativasem uma faixa muito ampla de condições, os versados nessas técnicas pode-riam determinar facilmente as condições compatíveis com a clivagem porMNAzimas.
Exemplo 19: Uso de MNAzimas para a Detecção de Dsemparelhamen-tos de uma Única Base
As MNAzimas podem ser usadas para detectar e quantificar áci-dos nucléicos-alvo em tempo real, usando métodos de ampliação de alvos invitro, tal como PCR. As MNAzimas podem ser usadas tambémpara gerarresultados qualitativos, por exemplo, detectando mudanças em seqüênciasde ácidos nucléicos. A detecção de alvos mediada por MNAzimas pode o-correr por reconhecimento de bases de Watson-Crick dos braços sensores eda seqüência-alvo. Neste exemplo, as MNAzimas são usadas para detectarum desemparelhamento de uma única base explorando este requisito paracomplementaridade entre o braço sensor da partizima e a seqüência de áci-dos nucléicos-alvo.
19.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Os oligonucleotídeos de partizimas foram desenhados para se-rem completamente complementares à seqüência-alvo, ou desemparelhadosem relação à seqüência-alvo (Figura 22(i)). As seqüências da partizima Acompletamente emparelhada (R05A5/2(22)-P), da partizima B completa-mente emparelhada (R05B6/2(11G)-P) e da partizima B desemparelhada(R05B6/2(11C)-P) estão listadas abaixo (de 5' para 3'). Nas seqüências quese seguem as bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico da MNA-zima combinada, as bases em negrito hibridizam com o alvo, e as bases emitálico hibridizam para o substrato. A base desemparelhada na partizimaR05B6/2(11C)-P está em negrito e sublinhada. O "-P" indica a fosforilaçãoem 3' do oligonucleotídeo.
SEQ ID NO: 107 Partizima A5 R05A5/2(22)-P:
C A A ACG AGTC CTGG C CTTGTCTTAC A ACG A GA G GAAA CCTT-PSEQ ID NO: 108 Partizima B6 R05B6/2(11G)-P:TGCCC/4GGG/4GGCTAGCGTGGAGACGGA-PSEQ ID NO: 109 Partizima B6 R05B6/2(11C)-P:TGCCCAGGGAGGÇTAGÇGTÇGAGACGGA-P
19.2. Substratorepórter
O substratorepórter usado neste exemplo foi SubBi-2. No pre-sente exemplo, SubBi-2 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5', e com uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foidesignado SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FB foi monitorada a 530 nm(comprimento de onda de emissão de FAM) com excitação em 485 nm(comprimento de onda de excitação de FAM). A seqüência de SubBi-2-FBestá listada abaixo (de 5' para 3'); as bases em letras minúsculas represen-tam RNA e as bases em letras maiúsculas representam DNA.SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
19.3. Iniciadores de PCR para Ampliação de RPLPO éxon 5
A seqüência-alvo para este exemplo foi gerada por ampliação 7/7vitro do DNA genômico humano, usando os iniciadores de PCR oligonucleo-tídeos listados abaixo (de 5' para 3').SEQ ID NO: 32 Iniciador 5R05/1:CATTCTATCATCAACGGGTASEQ ID NO: 110 Iniciador 3R05/2:AGCAGCCACAAAGGCAGA
19.4. Seqüências-alvo e Controles
O DNA genômico humano extraído da linhagem de células K562humanas foi usado como modelo para ampliação do gene de RPLPO. Águaisenta de nuclease (NF) foi usada no lugar do DNA genômico como um con-trole sem alvo.
19.5. Componentes da Reação: Ampliação e Detecção de Se-qüência-alvo
A ampliação e detecção em tempo real da seqüência-alvo foramrealizadas em um volume total de reação de 25 μΙ. Todas reações foramconduzidas em um termociclador ABI 7700 (Applied Biosystems). Os parâ-metros da ciclagem foram 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 15 se-gundos e 65°C por 30 segundos (com um decréscimo de 10C na temperatu-ra por ciclo), e finalmente50 ciclos de 95°C por 15 segundos e 47°C por 30segundos. As reações continham 40 nM 5R05/1, 200 nM de 3R05/2, 200nM R05A5/2(22)-P e 200 nM R05B6/2(11G)-P ou 200 nM R05B6/2(11C)-P,200 nM SubBi-2-FB, 10 mM MgCI2, 200 μΜ de cada dNTP, 10 unidades deRNAsina (Promega), 1 χ ROX referência (Invitrogen), 1 χ Immobuffer (Bioli-ne), 1 unidade de Immolase (BioIine) e 100 ng de modelo de DNA genômicoou água isenta de nuclease.
19.6. Resultados: Detecção de um Único Desemparelhamento deBases Usando uma MNAzima
A MNAzima que compreende o braço sensor B completamenteemparelhado apresentou um aumento na fluorescência no decorrer do tem-po quando a seqüência-alvo foi o DNA genômico umano ampliado por PCR(Figura 22(ii)). Em contraste, a MNAzima que contém o braço sensor B de-semparelhado apresentou um baixo nível de fluorescência com o alvo ge-nômico, similar àquele observado no controle sem alvo, e a fluorescêncianão aumentou no decorrer do tempo. Assim sendo, o único desemparelha-mento, três bases da junção das partizimas AeB, foi suficiente para impe-der a formação da MNAziyma ativa.
Este exemplo demonstra que as MNAzimas podem ser usadaspara detectar desemparelhamentos de bases individuais entre o alvo e osbraços sensores. Como as MNAzimas são capazes de detector alteraçõestão pequenas quanto mudanças de uma única base, ficaria óbvio para osversados nessas técnicas que as MNAzimas poderiam ser usadas tambémpara discriminar seqüências que diferem em pequenas deleções ou peque-nas inserções. Além disso, alterações maiores tais como translocações as-sociadas com vários tipos de câncer, que resultam em transcritos de fusão,também poderiam ser detectadas. Elas ocorrem freqüentemente em associ-ação com leucemia, por exemplo, transcritos de fusão de PMURARD e es-tão associadas com leucemia promielocítica aguda, e transcritos de fusão debcr/abl associados com leucemia granulocítica crônica.
Embora este exemplo demonstre que desemparelhamentos indi-viduais podem ser suficientes para impedir a combinação de MNAzima ativa,experimentos adicionais demonstraram que nem todos desemparelhamentosde bases individuais rompem completamente a combinação de MNAzimaativa sob todas condições. A capacidade de discriminar desemparelhamen-tos de bases individuais depende de vários fatores, incluindo: (a) a severida-de das condições da reação, que podem ser influenciadas por muitos fatoresque incluem temperatura, concentração de sais, concentração de cátions, (b)o tipo de desemparelhamento, por exemplo, desemparelhamentos G/T ver-sus C/C, (c) a posição do desemparelhamento dentro do braço de partizima,(d) o comprimento do braço de partyzima.
Estratégias adicionais podem ser usadas para aumentar a capa-cidade de a MNAzima detector polimorfismos de bases individuais. Elas in-cluem, por exemplo, o uso de um braço sensor de partizima truncado, comodemonstrado no Exemplo 22.
Exemplo 20: Teste da Atividade de MNAzima a Partir de uma Série dePares de Partizimas que Contêm Seqüências de Núcleos CatalíticosParciais Variantes Derivadas do Núcleo Catalítico 10:23
Podem ser produzidas enzimas de ácidos nucléicos multicom-ponentes (MNAzimas) que incorporam seqüências parciais de uma série deDNAzimas desenvolvidas in vitro. As MNAzimas ativas, baseadas em se-qüências paciais das DNAzimas 8:17 e 10:23, foram demonstradas. Alémdisso, vários desenhos alternativos de partizimas baseados em DNAzimas8:17 e 10:23 demonstraram ter (Exemplos 1, 3, Figuras 9, 10 e 13), ou nãoter (Exemplo 1, Figura 8), atividade. Este exemplo estende ainda mais estesestudos e identifica seqüências de partizimas ativas e inativas, baseadas emseqüências de núcleos catalíticos parciais a partir da DNAzima 10:23. Alémdisso, o exemplo fornece um protocolo genérico para as etapas necessáriaspara identificar o lugar ou lugares ideais para dividir uma seqüência de nú-cleo catalítico de tal modo que, quando as seqüências de núcleos catalíticosparciais são incorporadas em partizimas, sejam geradas MNAzimas ativasfuncionais.
20.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
O método neste exemplo foi usado para investigar quais posi-ções dentro da seqüência do núcleo catalítico são apropriadas para se dividirem seqüências de núcleos catalíticos parciais, as quais, depois da incorpo-ração em partizimas, resultam em MNAzimas funcionalmente ativas. A se-qüência 10:23 foi dividida em vários pontos e depois as duas seqüênciasparciais foram incorporadas em uma série de pares de partizimas que foramdesenhadas para clivar um substrato na presença do alvo (gene de RPLPOhumano). Os núcleos catalíticos parciais para cada par de partizimas queforam testados estão indicados na Tabela 22 com referência à seqüência donúcleo catalítico completo da DNAzima 10:23 (Santoro e Joyce, 1997).
Tabela 22: Bases e posição na DNAzima 10:23 eem uma série de paresde partizimas variantes onde as bases nas posições 1 a 15 do núcleoforam distribuídas diferentemente entre duas partizimas Ae B._
<table>table see original document page 170</column></row><table>
Todas seqüências estão grafadas de 5' para 3'. O desenho das MNAzimas ea nomenclatura das partizimas é continuada a partir da série na Tabela 3 eestendida nesta tabela para identificar a localização da divisão dentro donúcleo. Por exemplo, o Desenho 6 é uma MNAzima derivada de 10:23 como desenho da partizima A4 e partizima B5 (A4:B5), onde o núcleo foi divididoentre T na posição 8 e A na posição 9 (T8-A9).
Neste experimento, os vários pares de partizimas foram todossintetizados com braços sensores desenhados para hibridizar para éxon 5de gene de RPLPO humano, e com braços de substrato direcionados contrao substrato, SubBi-2. Os pares de partizimas usados neste experimento fo-ram sintetizados por Sigma-Proligo e suas seqüências estão listadas abaixo(de 5' para 3'). As bases sublinhadas fazem parte do núcleo catalítico daMNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam com o ácido nucléico-alvo e as bases em itálico hibridizam para o substrato. O "-P" indica a fosfori-lação em 3' do oligonucleotídeo.Par de Partizimas RPLPO A4:B5SEQ ID NO: 147 R05A4/2-P
CAAACG AGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAG>4GGA4/4CC7"7"-PSEQ ID NO: 112 R05B5(16)/2-PrGCCC/4GGG>4GGCTAGCTGTGGAGACGGATTACA -PPae de Partizimas RPLPO A5:B6SEQ ID NO: 107 R05A5/2(22)-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTTACAACGAGAGGAAACCTT-PSEQ ID NO: 114 R05B6(16)/2-PTGCCC^GGG/AGGCTAGCGTGGAGACGGATTACA -PPar de Partizimas RPLPO A6:B7SEQ ID NO: 115 R05A6(22)/2-P
CAAAC G AGTCCTGG CCTTGTCTAÇGA GA GGAAA CC7T -PSEQ ID NO: 116 R05B7(16)/2-P
TGCCC^GGGyAGGCTAGCTACAGTGGAGACGGATTACA -PPar de Partizimas RPLPO A7:B8SEQ ID NO: 117 R05A7(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTCAACGAG/1GG>W\CC7T-PSEQ ID NO: 118 R05B8(16)/2-P
TGCCC/AGGG/AGGCTAGCTAGTGGAGACGGATTACA -PPar de Partizimas RPLPO A8:B9SEQ ID NO: 119 R05A8(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTCTACAACGAGAGGAAACCTT-PSEQ ID NO: 120 R05B9(16)/2-P7GCCC>AGGG/AGGCTAGGTGGAGACGGATTACA -PPar de Partizimas RPLPO A9:B10SEQ ID NO: 121 R05A9(22)/2-P
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTGCTACAACGAG>4GG/W\CC7T-P
SEQ ID NO: 122 R05B10(16)/2-P
TGCCC/4 GGG/4GGCTAGTGG AG ACGG ATTAC A -P
20.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo é SubBi-2 com a seqüên-cia, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo, SubBi-2 fi rotulado nas ex-tremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e uma porção BHQ1na extremidade 3', e foi designado SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FBfoi monitorada a 530 nm (comprimento de onda de FAM) com excitação em485 nm (comprimento de onda de excitação de FAM). As bases em letrasminúsculas representam RNA e as bases em letras maiúsculas representamDNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FBAAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
20.3. Iniciadores de PCR para a Ampliação de éxon 5 do Gene deRPLPO humano.
As seqüências dos iniciadores estão ilustradas, de 5' para 3',
abaixo.
SEQ ID NO: 123 5' Iniciador 5R05/2GCTACCCAACTGTTGCATCSEQ ID NO: 110 3' Iniciador 3R05/2AGCAGCCACAAAGGCAGA
20.4. Modelo do Alvo
O DNA genômico humano extraído de células K562 foi usadocomo modelo na reação de PCR.
20.5. Condições da Reação
A ampliação em tempo real da seqüência-alvo e a detecção daatividade catalítica dos pares de partizimas foram conduzidas em uma rea-ção de 25 μΙ_ em um termociclador ABI 7700 (Applied Biosystems). Os pa-râmetros da ciclagem foram 95°C por 7 minutos, 10 ciclos de 95°C por 15segundos e 65°C por 30 segundos (com um decréscimo de 1 0C na tempera-tura por ciclo), e finalmente 50 ciclos de 95°C por 15 segundos e 50°C por30 segundos. Cada reação continha 0,04 μΜ 5R05/1 e 0,2 μΜ de3R05/2.10 mM MgCI2, 50 μΜ de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1xImmobuffer (Bioline), 0,2 μΜ SubBi-2-FB, 1x corante referencial Rox (Invitro-gen), 10 Unidades de RNAsina (Progema) e 1 Unidade de Immolase Polime-rase (Bioline) e 100 ng de DNA genômico. Além disso, cada reação continhaum par de partizimas, 0,2 μΜ de partizima A e 0,2 μΜ de partizima B (Par dePartizimas RPLPO A4:B5 ou A5:B6 ou A6:B7 ou A7:B8 ou A8:B9 ouA9:B10).
20.6. Resultados
Usando um método de PCR de MNAzima em tempo real, foi de-tectada a atividade catalítica de três dos seis pares de partizimas RPLPO. Opar de partizimas A4:B5 e A5:B6 apresentou altos níveis de atividade catalí-tica, permitindo a detecção do alvo em □ 22 ciclos (Tabela 23). O par de par-tizimas A7:B8 também era ativo, embora menos ativo do que A4:B5 e A5:B6.Nenhuma atividade catalítica foi detectada a partir dos pares de partizimasA6:B7, A8:B9 ou A9:B10 sob as condições deste experimento.
Tabela 23: Valores do Ciclo Limite (Ct) Obtidos Usando Vários Pares dePartizimas
<table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table>
Os valores de Ct volumes são a média de reações em triplicata, quando onível de fluorescência limite foi estabelecido em 0,2 e a fluorescência refe-rencial do fundo foi subtraída entre os ciclos 1 e 14.
Exemplo 21: Aplicação de MNAzimas para Detectar Proteínas-alvo.
Como demonstrado no Exemplo 18, as MNAzimas podem serusadas para detectar alvos incorporando seqüências sobre a extremidade deuma partizima (apta-partizima). Neste exemplo, foi usada a mesma estraté-gia de detecção de MNAzimas (Figura 20) para detectar a proteína Taq po-limerase, usando uma seqüência de aptâmero com um comprimento de 46nucleotídeos, que foi relatada como se ligando a Taq polimerase com altaespecificidade (Yakimovich, 2003). O facilitador de combinação e o oligonu-cleotídeo da partizima B foram iguais àqueles usados no Exemplo 18, ondeATP foi detectado usando uma MNAzima.
21.1. Oligonucleotídeos de Partizimas, Combinação e Oligonucle-otídeos Inibidores
Neste exemplo a seqüência de aptâmero de Taq polimerase foicolocada adjacente ao braço de substrato da apta-partizima A (Figura 20).Os braços sensores da apta-partizima A e partizima B foram desenhadospara se ligarem a um facilitador de combinação. As seqüências da apta-partizima TaqA2/1 e partizima AtpB3/1 estão indicadas abaixo <de 5' para3'). Nas seqüências que se seguem as bases em negrito hibridizam com ofacilitador de combinação, as bases sublinhadas fazem parte do núcleo cata-lítico da MNAzima combinada, e as bases em itálico hibridizam parao subs-trato. Além disso, as bases em letras normais na apta-partizima A2 TaqA2/1indicam seqüências de aptâmero de DNA que se ligam a Taq polimerase.SEQ ID NO: 124 Apta-Partizima A2 TaqA2/1:
AACGT AC ACTGC ACGQGGTÇGAAATAGTGAGTGCGGTCGGCJCGGGGCATTCTTAGCGTTTTGCCCCGAGCCGACCGCSEQ ID NO: 104 Partizima B3 AtpB3/1:CA 7"C7"C7TC7CCGAGCGTCTGTACCGTGTAC
A seqüência do facilitador de combinação está indicada abaixo(de 5' para 3'):
SEQ ID NO: 105 Facilitador de combinação AtpC/1:GTACACGGTACAGACCGTGCAGTGTACGTT
A seqüência do oligonucleotídeo inibidor está indicada abaixo(de 5' para 3'):
SEQ ID NO: 125 Inibidor TaqR/1:TGCCCCGAGCCGACCGAACTCACTATTT
21.2. Substratorepórter
A atividade da MNAzima é monitorada pela clivagem de umsubstratorepórter de ácido nucléico duplamente rotulado. O substratorepórterpara este exemplo é SubBi-1-FB com a seqüência, de 5' para 3', abaixo. Asbases em letras minúsculas representam RNA e as bases em letras maiús-culas representam DNA. As bases sublinhadas indicam a posição de umaporção 6-FAM na extremidade 5' e de uma porção BHQ1 na extremidade 3'.As mudanças na fluorescência em virtude da clivagem de SubBi-1-FB noribonucleotídeo entre FAM e BHQ1 foram monitoradas a 520 nm (compri-mento de onda de emissão de FAM) com excitação em 490 nm (comprimen-to de onda de excitação de FAM).SEQ ID NO: 6 SubBi-1-FB:ACTCACTATaGGAAGAGATG
21.3. AlvoA molécula-alvo neste exemplo foi Taq DNA Polimerase (Amer-sham Biosciences), e a polimerase Klenow (Amersham Biosciences) foi usa-da como um controle negativo. Usou-se água isenta de nuclease como umcontrole "sem alvo".
21.4. Condições da Reação
A detecção da seqüência-alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNAzi-ma cataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substra-to, e o volume total de todas reações foi de 50 pL. As reações foram condu-zidas a 40°C em um FLUOstar OPTIMA (BMG Biotech). A fluorescência paracada reação foi lida a cada 6 segundos por um total de 15 minutos. Cadareação continha uma concentração final 200 nM de TaqA2/1, 200 nM deAtpB3/1, 200 nM de AtpC/1, 200 nM de TaqR/1, 200 nM de SubBi-1-FB, 25mM de MgCI2, 25 mM de Tris HCI pH 6,8 e 5 Unidades de Taq DNA polime-rase ou 5 Unidades de polimerase Klenow ou nenhuma proteína (apenas água).
21.5. Resultados : Detecção e Clivagem do SubstratorepórterSubBi-1-FB
Na ausência de Taq polimerase, foi observado um baixo nível defluorescência que aumentou apenas ligeiramente no decorrer do tempo, de-monstrando que o oligonucleotídeo inibidor foi capaz de impeder a combina-ção de uma MNAzima ativa. Na presença de Taq polimerase, o sinal fluores-cente foi mais alto e aumentou no decorrer do tempo. Isto indica que o oligo-nucleotídeo inibidor foi deslocado pela Taq polimerase e formou-se umaMNAzima ativa. A combinação da MNAzima foi dependente do alvo, pois osinal fluorescente na presença da polimerase Klenow foi similar ao sinal naausência de Taq polimerase, isto é, no controle com água "sem alvo". Isso éconsistente com as observações de Yakimovich et ai (2003) que demonstra-ram que a seqüência de aptâmero de Taq polimerase é específica para Taqpolimerase e não se liga a Klenow. Este exemplo de MNAzima acima de-monstra que as MNAzimas podem ser acopladas a aptâmeros para a detec-ção de proteínas específicas.Exemplo 22: Detecção de um Único Polimorfismo de Nucleotídeo (SNP)Usando uma Partizima Truncada e um Oligonucleotídeo Estabilizador
A detecção de alvos mediada por MNAzimas pode ocorrer porintermédio do reconhecimento com bases de Watson-Crick dos braços sen-sores das partizimas e da seqüência-alvo. No Exemplo 19, este requisito decomplementaridade foi usado para detectar um único desemparelhamentode bases entre o braço sensor da partizima e a seqüência de ácidos nucléi-cos do alvo. No exemplo que se segue, o requisito de complementaridade foiexplorado novamente para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo(SNP), usando uma estratégia que utilizou uma partizima com um braçosensor truncado, que pode se estabilizado por um oligonucleotídeo estabili-zador. A estratégia de detecção com MNAzima e usada neste exemplo estáilustrada na Figura 23 e os oligonucleotídeos requeridos estão descritos a-baixo:
a) partizima-padrão;
b) uma partizima com um braço sensor truncado (por exemplo, 5bases) que é desenhado para emparelhar competamente com uma forma doSNP, mas não com a outra;
c) um oligonucleotídeo estabilizador (por exemplo, 15 bases),que hibridiza para o alvo adjacente ao braço sensor truncado da partizima. Oestabilizador é desenhado para facilitar a combinação da MNAzima quandoo braço sensor com 5 nucleotídeos é hibridizado para o alvo; e
d) um substrato de sonda repórter.
22.1. Oligonucleotídeos de Partizimas e Oligonucleotídeo Estabi-lizador
Neste exemplo, o braço sensor da partizima B foi desenhadopara ter um comprimento de apenas 5 nucleotídeos para discriminar umSNP que ocorre no oligonucleotídeo-alvo. O braço sensor da partizima B foidesenhado para hibridizar para a forma "T' do SNP, mas não para a forma"C" do SNP. As seqüências das partizimas AeBeo oligonucleotídeo estabi-lizador estão ilustrados abaixo (de 5' para 3'). Nas seqüências que se se-guem as bases em negrito hibridizam com o alvo, as bases sublinhadas fa-zem parte do núcleo catalítico da MNAzima combinada, e as bases em itáli-co hibridizam para o substrato. O "-P" indica a fosforilação em 3'do oligonu-cleotídeo.
SEQ ID NO: 126 Partizima A4 XdA4/2-P:
ACTGG ATGTCC ATCTGTCTG ACAACG A G/4GG/4A4CC7T-P
SEQ ID NO: 127 Partizima B5 XdB5/2-P:
TGCCCA GGG/\GGCTAGCTTATAC-P
SEQ ID NO: 128 Stabiliser XdF/2-Ρ:
CTTCGTGAGGGTGAG-P
22.2. Substratorepórter
O substratorepórter usado neste exemplo foi SubBi-2. No pre-sente exemplo, SubBi-2 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5', uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designa-do SubBi-2-FB. A clivagem de SubBi-2-FB foi monitorada a 520 nm (com-primento de onda de emissão de FAM) com excitação em 490 nm (compri-mento de onda de excitação de FAM). A seqüência de SubBi-2-FB está lis-tada abaixo (de 5' para 3'); as bases em letras minúsculas representam RNAe as bases em letras maiúsculas representam DNA.
SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
22.3. Alvo
As moléculas do alvo para este exemplo foram oligonucleotídeossintéticos derivados do gene Xd. Um dos alvos correspondia à forma "T" doSNP (XdC/2(52)) e era completamente emparelhada com o braço sensor dapartizima Β. O outro alvo correspondia à forma "C" do SNP e era desempa-relhado com o braço sensor da partizima B. Os oligonucleotídeos sintéticosforam ordenados a partir de Sigma-Proligo, e usou-se água isenta de nucle-ase no lugar do alvo como um controle "sem alvo". As seqüências de ambosalvos estão listadas abaixo (de 5' para 3') com o SNP sublinhado.
SEQ ID NO: 129 Alvo XdC/2{52):TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGTATACAGACAGATGGACATCCAGTTGGTGASEQ ID NO: 130 Alvo (desemparelhamento) XdC/2(1M52):
TGCCCCCTCACCCTCACGAAGGÇATACAGACAGATGGACATCCAGTTG
GTGA
22.4. Condições da Reação
A detecção da seqüência do alvo foi medida por um aumento nosinal fluorescente causado pela clivagem do substratorepórter pela MNAzi-ma cataliticamente ativa. As reações foram iniciadas pela adição de substra-to, e o volume total de todas reações foi de 50 μΙ_. As reações foram condu-zidas a 55°C em um FLUOstar OPTIMA (BMG Biotech). A fluorescência paracada reação foi lida a cada 2 segundos por um total de 5 minutos. Todasreações continham 200 nM XdA4/2-P, 200 nM XdB5/2-P, 1x Tampão Il dePCR (Applied Biosystem) e MgCI2 25 mM. Além disso, a reação continha osoligonucleotídeos listados na Tabela 24.
Tabela 24. Reagentes Adicionais em Reações de MNAzimas.
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22.5. Resultados : Detecção e Clivagem do SubstratorepórterSubBi-2-FB
A MNAzima apresentou um aumento na fluorescência no decor-rer do tempo quando o modelo de SNP completamente emparelhado foi u-sado (Reação A: Figura 23). Em contraste, quando o modelo era desempa-relhado (continha um SNP), o sinal fluorescente não aumentou no decorrerdo tempo (Reação B: Figura 23). Similarmente, não houve qualquer aumentona fluorescência na ausência do oligonucleotídeo-alvo (Reação D: Figura23). A presença do oligonucleotídeo estabilizador demonstrou ser essencialpara estabilizar o complexo de MNAzima. Uma reação que contém todos oscomponentes da reação, incluindo o alvo completamente emparelhado, masna qual faltava o oligonucleotídeo estabilizador, não deu qualquer aumentona fluorescência no decorrer do tempo (Reação C: Figura 23). Assim sendo,5 bases do braço sensor foram insuficientes para formar um complexo deMNAzima estável, mas a presença de um oligonucleotídeo estabilizador pô-de compensar o comprimento curto do braço sensor da partizima (5 bases) epermitir a formação da MNAzima estável sob condições severas de tempera-tura (55 0C neste exemplo). O oligonucleotídeo estabilizador pode ser consi-derado uma terceira partizima neste sistema, pois ele é necessário para aformação da MNAzima estável.
Este exemplo demonstra que as MNAzimas podem ser usadaspara discriminar entre dois alvos que diferem que diferem em apenas umSNP. Além disso, ele demonstra a aplicação de partizimas com braços sen-sores truncados, e seu uso na combinação com oligonucleotídeos estabili-zadores.
Exemplo 23: Atividade Catalítica de MNAzimas com Substituições deRibonucleotídeos.
Diferentemente de ribozimas, as DNAzimas não foram descober-tas na natureza. As DNAzimas são desenvolvidas in vitro a partir de grandesbibliotecas de oligonucleotídeos. A substituição de certos ribonucleotídeospor certos desoxirribonucleotídeos em ribozimas conhecidas foi tentada sobcertas condições (McCaII et ai, 1992). As ribozimas que foram completa-mente convertidas em DNA não têm qualquer atividade em virtude de dife-renças de conformação de RNA e DNA (Perreault et al., 1990). Estes estu-dos demonstram que enzimas de RNA não podem ser transformadas emenzimas de DNA funcionais meramente substituindo ribonucleotídeos pordesoxirribonucleotídeos. Os experimentos foram realizados para investigar atolerância de MNAzimas à substituição de ribonucleotídeos por desoxirribo-nucleotídeos.
23.1. Oligonucleotídeos de Partizimas
Neste exemplo, várias partizimas foram sintetizadas, onde umou mais desoxirribonucleotídeos foram substituídos por ribonucleotídeosdentro das regiões que constituem o núcleo catalítico parcial. Foram sinteti-zadas partizimas que tinham uma única substituição de ribonucteotídeo, ouque tinham a região do núcleo catalítico parcial inteira substituída por ribo-nucleotídeos. Os oligonucleotídeos das partizimas AeB tinham braços sen-sores complementares a uma região de éxon 4 do gene RPLPO humano. Osoligonucleotídeos de partizimas estão listados abaixo, de 5' para 3'. Nas se-qüências que se seguem, as bases sublinhadas fazem parte do núcleo cata-lítico da MNAzima combinada, as bases em negrito hibridizam para o alvo, eas baem itálico hibridizam para o substrato. As bases em letras minúsculasrepresentam bases de RNA que substituíram bases de DNA.SEQ ID NO: 131 partizima A (ControI) R04A5(18)/2-PGGGCTGGTCATCCAGCAGTACAACGAGAGGAAACCTT-PSEQ ID NO: 132 partizima B (Contrai) R04B6 (19)/2-P7"GCCC/4GGG/4GGCTAGCGTGTTCGACAATGGCAGCA-PSEQ ID NO: 133 Partizima A (ribo-14g): R04A5(18)/2-rG14-PGGGCTGGTCATCCAGCAG TAQAAQaAGAGGAAACCTT-PSEQ ID NO: 134 Partizima A (ribo-9a): R04A5(18)/2-rA9-PGGGCTGGTCATCCAGCAGTaCAACGAG>4GGAMCC7T-PSEQ ID NO: 135 Partizima A (ribo χ 8): R04rA5(18)/2GGGCTGGTCATCCAGCAGuacaacqaG/4GGAV\CC7TSEQ ID NO: 136 Partizima B (ribo χ 7): R04rB6(19)/2rGCCC^GGGyAgacuaacGTGTTCGACAATGGCAGCA
23.2. Substratorepórter
O substratorepórter para este exemplo foi SubBi-2 com a se-qüência, de 5' para 3', abaixo. No presente exemplo, SubBi-2 foi rotuladonas duas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' e comuma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-2-FB. A cliva-gem de SubBi-2-FB foi monitorada a 530 nm (comprimento de onda de e-missão de FAM) com excitação em 485 nm (comprimento de onda de exci-tação de FAM). Na seqüência que se segue as bases em letras minúsculasrepresentam RNA e as bases em letras maiúsculas representam DNA.SEQ ID NO: 21 SubBi-2-FB:AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
23.3. Seqüência-alvoUm oligonucleotídeo de DNA sintético foi usado como o modelode alvo neste experimento. A seqüência do alvo está indicada abaixo, de 5'para 3'.
SEQ ID NO: 8 R04/1 TargetGCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC
23.4. Condições da Reação
A análise da atividade cataiítica de vários pares de partizimas foirealizada usando um termociclador SmartCycIer System (Cepheid). Os vo-lumes totais das reações foram de 25 μΙ_, e cada reação continha 1 X Tam-pão Il de PCR (Applied Biosystems), 10 mM MgCI2, 0.2 μΜ de SubBi-2-FB, 2μΜ de R04/1 Target e um par de partizimas A e B, cada uma 2 μΜ. Os paresde partizimas em cada reação estão indicados na Tabela 24.
Tabela 24: Partizimasem Várias Reações.
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As reações foram incubadas a 54°C por 20 minutos e es dadosde fluorescência foram coletados em intervalos de 12 segundos.
Visto que início da fluorescência pode variar por cavidades indi-viduais no sistema termociclo Smartcycler, a valor da fluorescência inicial foisubtraído da fluorescência de cada pnto de tempo para cada reação parapermitir a comparação entre as reação em diferentes cavidades.
23.5. Resultados: Atividade Catalítica de MNAzimas com Substi-tuições de Ribonucleotídeos Dentro das Seqüências de Núcleos Catalí-ticos Parciais de Partizimas.
A clivagem catalítica do substrato por MNAzimas constituídas devários pares de partizimas foi monitorada como uma mudança na fluores-cência no decorrer do tempo (Tabela 25).
Tabela 25: Resultados Obtidos Usando Várias Combinações de Parti-zimas.
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O experimento demonstra que algumas substituições de ribonu-cleotídeos dentro do núcleo catalítico das partizimas são compatíveis com aformação de MNAzimas ativas. Embora uma única substituição (partizima A(ribo 14g)) tivesse tido atividade similar àquela de partizimas inteiramente deDNA sob estas condições, uma única substituição alternativa (partizima A(ribo9a)), ao mesmo tempo ainda compatível com a formação de MNAzimasativas, clivou o substrato em uma velocidade mais lenta do que o controle. AMNAzima não tolerou a substituição de todos nucleotídeos no domínio donúcleo catalítico parcial da partizima A e/ou partizima B.
Exemplo 24: Ativação de uma MNAzima pela Liberação de PartizimasAmarradas como um Mecanismo para Iniciar uma Cascata de Amplia-ção de Sinais.
24.1. Cascatas de Ampliação de Sinais Mediadas por MNAzimas
As MNAzimas podem ser usadas para iniciar cascatas de ampli-ação de sinais. Uma estratégia para essa cascata de ampliação de sinaisestá ilustrada na Figura 25. Na presença do alvo, a MNAzima 1 ativa se for-ma a partir de partizimas que estão livres em solução. A MNAzima 1 clivaseu substrato amarrado, Subi, liberando assim componentes partizimas pa-ra a MNAzima 2. Uma vez liberadas, estas partizimas hibridizam com o facili-tador de combinação e formam a MNAzima 2 que cliva o substrato Sub 2.Sub 2 rotulado duplamente, que está livre em solução, é clivado pela MNA-zima 2 e um sinal fluorescente é gerado. Além disso, a MNAzima 2 cliva Sub2 amarrado, liberando partizimas, que têm os mesmos braços sensores quea MNAzima 2 e quando hibridizadas para o facilitador de combinação, for-mam a MNAzima 3 (o facilitador de combinação pode estar amarrado oupode estar livre em solução). Como a MNAzima 3 compartilha os mesmosbraços de substrato que a MNazima 1, ela pode clivar também Subi amar-rado, liberando assim mais componentes partizimas para a MNAzima 2. Istoresulta em uma cascata de geração enzimática dos componentes (partizi-mas) para mais enzimas (MNAzimas) e concomitante ampliação de sinal.
24.2. Ativação de MNAzima Amarrada Capaz de Clivar SubstratosRotulados de Forma Fluorescente
Este exemplo demonstra a primeira etapa da cascata de amplia-ção de sinais, como ilustrado na Figura 25. Nesta etapa iniciadora, o alvo seliga a partizimas, que estão livres em solução, e forma a MNAzima 1 ativa. AMNAzima 1 cliva seu substrato amarrado, Sub 1, liberando assim os compo-nentes partizimas para a MNAzima 2. Uma vez liberadas, estas partizimashibridizam com o facilitador de combinação e formam a MNAzima 2. Sub 2 -FQ rotulado duplamente (especificamente SubBi-3-FB neste exemplo), queestá livre em solução, é clivado pela MNAzima 2, e um sinal fluorescente égerado.
24.3. Oligonucleotídeos de Partizimas
Nas seqüências que se seguem, as bases sublinhadas fazemparte do núcleo catalítico da MNAzima combinada, as bases em negrito hi-bridizam com o alvo, e as bases em itálico hibridizam para o substrato. Asbases que estão em itálico e também sublinhadas representam as seqüên-cias de substrato que estão acopladas a partizimas a serem amarrar. O "-P"indica a fosforilação do oligonucleotídeo e "(Biotin)" indica biotinilação dooligonucleotídeo. As bases em letras minúsculas representam RNA e as ba-ses em letras maiúsculas representam DNA. Todas seqüências listadas a -baixo estão grafadas de 5' para 3'.
As partizimas da MNAzima 1 livres em solução foram desenha-das para se ligarem especificamente ao éxon 5 do gene RPLPO humano, eas partizimas da MNAzima 2 amarradas foram desenhadas para hibridiza-rem para o facilitador de combinação.SEQ ID NO: 147 Partizima A4 R05A4/2-P:CAAACGAGJCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGAAACCTT-PSEQ ID NO: 148 Partizima B5 R05B5/2-P:TGCCC/IGGG^GGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC -PSEQ ID NO: 138 Substrato 1 amarrado/Partizima A4 R04A4/3-5b:(Bio-
Wr\)AAAAAAAAGGTTTCCTCguCCCTGGGCAGCTGGTCATCCAGCAGACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO: 139 Substrato 1 Amarrado/Partizima B5 R04B5/3-3b:CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGTTCGACAATGGCAAGGTTTCCTCauCCCTGGGCAAAAAAA(BloWn)24.4. Substrat-repórter
O substràtorepórter (Sub 2; Figura 25) para este exemplo éSubBi-3 com a seqüência, de 5' para 3', abaixo. No prsente exemplo, SubBi-3 foi rotulado nas extremidades com uma porção 6-FAM na extremidade 5' ecom uma porção BHQ1 na extremidade 3', e foi designado SubBi-3-FB. Aclivagem de SubBi-3-FB foi monitorada a 516 nm (comprimento de onda deemissão de FAM) com excitação em 492 nm (comprimento de onda de exci-tação de FAM). As bases em letras minúsculas representam RNA e as ba-ses em letras maiúsculas representam DNA.SEQ ID NO: 31 SubBi-3-FB:CAGCACAACCguCACCAACCG4.5. Alvo Sintético e Seqüências Facilitatadoras
Nas seqüências qu se seguem, "(Biotin)" indica biotinilação dooligonucleotídeo.
SEQ ID NO: 140 FaciIitadorde combinação R04/2-3b:GCCATTGTCGAACACCTGCTGGATGACCAGC-(Biotin)SEQ ID NO: 141 RPLPO 5 alvo sintético (R05):GAAGGTGTAATCCGTCTCCACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTG
24.6. Amarração de Partizimas Biotiniladas a Placas de Microtitu-lação Revestidas com Estreptavidina
A amarração de partizimas biotiniladas e facilitador de combina-ção foi conduzida à temperatura ambiente em um volume total da reação de100 μΙ. A mistura de ligação continha 200 nM de partizima R04A4/3-5b,200nM de partizima R04B5/3-3b e 200nM do facilitador de combinaçãoR04/2-3b em solução de PBS Amressco (sem Ca+ e Mg+). A mistura deligação (100 μΙ) foi fracionada em cada cavidade de uma placa de microtitu-lação revestida com estreptavidina (Roche Diagnostics). O tempo de ligaçãofoi de 30 minutos, e em seguida, 3 lavagens usando PBS, cada uma com 15minutos de incubação antes da lavagem.
24.7. Clivagem de MNAzima Amarrada e Detecção de SubstratoRotulado de Forma Fluorescente
A clivagem do substrato rotulado de forma fluorescente, SubBi-3-FB, foi monitorada isotermicamente a 55 DC por 4 minutos no fluorômetroFIuoStar Optima (BMG LabTech) em um volume total da reação de 100 pL.As reações continham 200 nM de partizima R05A4/2-P, 200 nM da partizimaR05B5/2-P, 200 nM do substrato SubBi-3-FB, 25 mM MgCI2,1x Tampão Ilde PCR (Applied Biosystems) e 200 nM de alvo sintético R05. Usou-se águaisenta de nuclease em vez do alvo sintético R05 nos controles "sem alvo"controls. A reação foi iniciada com adição do substrato SubBi-3-FB.
24.8. Resultados: Mudança no Nível de Fluorescência na Presen-ça do Alvo R05 Versus Controle "sem alvo"
Há um aumento na fluorescência na presença do alvo R05 emcomparação com reações sem alvo (controle com água). A mudança na fluo-rescência depois de 4 minutos foi de cerca de 36.000 unidades na presençado alvo, comparado com < 1.000 unidades para o controle sem alvo. Istodemonstra a capacidade de a MNAzima 1 (constituída das partizimasR05A4/2-P e R05B5/2-P) clivar o substrato amarrado e liberar as partizimasque constituem a MNAzima 2. Além disso, adicionalmemente, isto demons-tra que uma vez liberadas, as partizimas podem formar um complex deMNAzima ativa com o facilitador de combinação que é capaz de clivar osubstrato, levando à geração do sinal.
Exemplo 25: Disciminação Direta entre Citosinas Metiladas e Citosinasem DNA.
O uso de um braço estabilizador com uma partizima que tembraços sensores truncados foi utilizado para demonstrar a capacidade de asMNAzimas detectarem polimorfismos de nucleotídeos individuais (SNPs)presentes em facilitadores de combinação de alvos (Exemplo 22). Sob acondição experimental usada nessa exemplo, um braço sensor com cincobases foi usado como uma sonda para SNPs a 55 0C1 bem acima da suatemperatura de fusão esperada. Os sistemas com braços estabilizadores, epartizimas que têm braços sensores truncados, são muito sensíveis a pe-quenas mudanças no alvo. Esta estratégia de detecção pode ser estendidaainda mais para discriminar diretamente entre alvos, que são metilados ounão-metilados em resíduos de citosina específicos, sem a necessidade demodificação anterior com bissulfito (vide Exemplo 11).
A presença de 5-metil-citosina(s) aumenta a temperatura de fu-são do DNA em 1,3°C por base metilada, em relação a citosina(s) mão-metilada(s). Assim sendo, uma partizima com, por exemplo, um braço sen-sor com um comprimento de cinco nucleotídeos seria capaz de se ligar a umalvo que contém três 5-metil-citosinas em uma temperatura quase 4 °C maisalta do que do que ele seria capaz de se ligar a um alvo não-metilado damesma seqüência.
Quando partizimas, um braço estabilizador, e um substrato sãoincubados em uma temperatura, que é apropriada para hibridização e for-mação de MNAzima na presença de um alvo metilado, mas que é alta de-mais para a formação de MNAzima na presença de um alvo não-metilado,um sinal seria gerado apenas na presença do alvo metilado.
isto proporciona uma nova estratégia para a análise de padrõesde metilação que pode fornecer um método para a detecção de bases demetilação como rotuladores de câncer e outras doenças.Exemplo 26: Uso de MNAzim a para Induzir uma Mudança de Core m
Resposta a um Alvo
Uma estratégia para usar MNAzimas em um formato colorimétri-co está ilustrada na Figura 24. Nesta abordagem, um substrato de MNAzimaseria incorporado em um oligonucleotídeo-ponte. O oligonucleotídeo-pontetem complementaridade a oligonucleotídeos afixados a partículas de ouro.Caso nenhum facilitador de combinação esteja presente, o oligonucleotídeo-ponte permaneceria intacto e as partículas de ouro se agregariam tornandoa reação azul. Caso um facilitador de combinação, por exemplo, um ácidonucléico-alvo, estivesse presente, então MNAzimas ativas se combinariam apartir de partizimas presentes em solução, e clivariam o substrato (e assimsendo, o oligonucleotídeo-ponte). Isto levaria à dispersão dos agregados departículas de ouro, o que, por sua vez, causaria uma mudança na cor de a-zul para vermelho.
Esta estratégia de MNAzima proporciona um sistema que incor-pora vários componentes genéricos, e assim sendo, ela fornece um métodoque pode ser rapidamente adaptado para qualquer alvo novo. Isto propor-ciona uma vantagem sobre outros sistemas que usam DNAzimas e partícu-las de ouro que requerem moléculas mais more complexas. Nesta estratégiacom MNAzimas, o substrato de MNAzima e as partículas de ouro com oligo-nucleotídeos afixados poderiam ser genéricas e usadas para a análise dequalquer ácido nucléico-alvo. Novos sistemas analíticos requereriam mera-mente a síntese de novas partizimas com braços sensores complementaresao novo alvo. Além disso, a reação colorimétrica pode ser usada também emconjunto com sistemas de MNAzimas sensíveis à ativação por ácidos nucléi-cos, proteínas ou outros alvos.REFERÊNCIAS
Patentes e Publicações de Patentes:
Publicação Internacional PCT Ne WO 99/45146
Publicação Internacional PCT Ne IB99/00848
Publicação Internacional PCT Ns WO 99/50452
Publicação Internacional PCT N9 WO 00/58505
Pedido PCT PCT/US96/02380 ("Asher")
Pedido U.S. Ns 4.683.202
Pedido U.S. Ne 4,683,195
Pedido U.S. Ns 4,000,159
Pedido U.S. Ns 5,176,995
Pedido U.S. N2 4,965,188
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<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> Sintético
<400> 1
gctggtcatc cagcacggtc gaaatagtga gt 32
<210> 2<211> 33<212> DNA<213> Sintético<400> 2
gctggtcatc cagcagcggt ogaaatagtg agt 33
<210> 3<211> 33<212> DNA<213> Sintético<400> 3
catctcttct ccgtcgaagt gttcgacaat ggc 33
<210> 4<211> 28<212> DNA<213> Sintético<400> 4
catctcttct ccggtgttcg acaatggc 28
<210> 5<211> 31<212> DNA<213> Sintético<400> 5
catctcttct ccgagcgtgt tcgacaatgg c 31
<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Sintético<220><221> RNA<222> (10).. (10)<400> 6
actcactata ggaagagatg 20
<210> 7<211> 32<212> DNA<213> Sintético<400> 7
gctggtcatc cagcacggtc taaatagtga gt 32
<210> 8<211> 31<212> DNA<213> Sintético<400> 8
gccattgtcg aacacctgct ggatgaccag c 31<210> 9<211> 31<212> DNA<213> Sintético<400> 9
cgaccattag gtcgtccaca agctgttacc g
<210> 10<211> 28<212> DNA<213> Sintético<400> 10
tacctgcact aeggtcgaaa tagtgagt
<210> 11<211> 27<212> DNA<213> Sintético<400> 11
catctcttct ccgagctaag cacttta
<210> 12<211> 22<212> DNA<213> Sintético<400> 12
taaagtgctt atagtgcagg ta
<210> 13<211> 24<212> DNA<213> Sintético<400> 13
caaagtgctt acagtgcagg tagt
<210> 14<211> 22<212> DNA<213> Sintético<400> 14
aaagtgctgt tcgtgcaggt ag
<210> 15<211> 24<212> DNA<213> Sintético<400> 15
aaaagtgctt acagtgcagg tagc
<210> 16<211> 21<212> DNA<213> Sintético<400> 16
taaagtgctg acagtgcaga t
<210> 17<211> 42<212> DNA<213> Sintético<400> 17
caaacgagtc ctggccttgt ccgcacaacg agaggaaacc
<210> 18<211> 42<212> DNA<213> Sintético<400> 18
tgcccaggga ggctagctgc ggtggagacg gattacacct tc
<210> 19<211> 40<212> DNA<213> Sintético<400> 19
caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggaaacctt
<210> 20<211> 39<212> DNA<213> Sintético<400> 20
tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat tacaccttc
<210> 21<211> 22<212> DNA<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (12)..(13)<400> 21
aaggtttcct cguccctggg ca 22
<210> 22<211> 43<212> DNA<213> Sintético<400> 22
gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg
<210> 23<211> 19<212> DNA<213> Sintético<400> 23
caagactgga gacaaagtg 19
<210> 24<211> 20<212> DNA<213> Sintético<400> 24
gcagagtttc ctctgtgata 20
<210> 25<211> 18<212> DNA<213> Sintético<400> 25
acgtgacgct aaagtgct 18
<210> 26<211> 22<212> DNA<213> Sintético<400> 26
cgtccgaatg acgtacctgc ac 22
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cgaatgacgt acctgcac
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uaaagugcuu auagugcagg ua
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (39)..(39)<400> 29
caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag gttgtgctg
<210> 30<211> 39<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (39)..(39)<400> 30
cggttggtga ggctagctgt ggagacggat tacaccttc
<210> 31<211> 21<212> DNA<213> Sintético
<220><221> FiNA<222> (11)..(12)<400> 31
cagcacaacc gucaccaacc g
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cattctatca tcaacgggta
<210> 33<211> 18<212> DNA<213> Sintético<400> 33
caaaggcaga tggatcag
<210> 34<211> 29<212> DNA<213> Sintético<400> 34
tacctgcact aacaacgaga ggaaacctt
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tgcccaggga ggctagctaa gcacttta 28
<210> 36<211> 21
<212> DNA
<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (11) .. (12)<400> 36
cagcacaacc gucaccaacc g 21
<210> 37<211> 33<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Phosphorylation<222> (33) . . (33)<400> 37
gaccgtgagg tagtaacaac gagaggaaac ctt 33
<210> 38<211> 33<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (33) . . (33)<400> 38
tgcccaggga ggctagctgg ttgtatagtt gtc 33
<210> 39<211> 22<212> RNA<213> Sintético<400> 39
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 40<211> 24<212> DNA<213> Sintético<400> 40
agcgaagctg agacaactat acaa 24
<210> 41<211> 19<212> DNA<213> Sintético<400> 41
cgacgtgacc gtgaggtag 19
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catggcacaa gcgaagctga 20
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<220>
<221> Fosforilação<222> (33) .. (33)<400> 43
gcccccgcct ccaactacaa cgaggttgtg ctg
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (31)..(31)<400> 44
cggttggtga ggctagcaac gcccgcacct c
<210> 45<211> 20<212> DNA<213> Sintético<400> 45
gttggttacg gtcgcggttc
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ccgaccgtaa ctattcgata cg
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<210> 51<211> 37<212> DNA<213> Sintético<220>
<221> Fosforilação<222> (37)..(37)<400> 51
agatcaagat cattgctcca caacgagagg aaacctt
<210> 52<211> 36<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (36).. (36)<400> 52
tgcccaggga ggctagcttc ctgagcgcaa gtactc
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<220>
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agttcaaatc tgtactgcac cacaacgaga ggcgtgat
<210> 56<211> 38<212> DNA<213> Sintético
<220>
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ctgggaggaa ggctagctct ggaggtggat tcctttgg
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<220>
<221> Fosforilação<222> (42). . (42)<400> 57
actgaataga aatagtgata gatacaacga gtgccatgtt
<210> 58<211> 41
<212> DNA
<213> Sintético
<220>
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tatcacagcc aaggctagct ccattcctat gactgtagat
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aaggtttcct cguccctggg ca<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Sintético
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<400> 60
cagcacaacc gucaccaacc g
<210> 61<211> 21<212> DNA<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (11) . . (12)<400> 61
atcacgcctc gutcctccca g
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (13) . . (14)<400> 62
ttaacatggc acgutggctg tgata
<210> 63<211> 20<212> DNA<213> Sintético<400> 63
cattgccgac aggatgcaga
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gagccgccga tccacacg
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cactcagcca ctggatttaa
<210> 66<211> 19<212> DNA<213> Sintético<400> 66
gcgcgtcttt gctttattc
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ctttgctgac ctgctggatt a<210> 68<21Χ> 21<212> DNA<213> Sintético<400> 68
cctgttgact ggtcattaca a
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<220>
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agatcaagat cattgctcca caacgagtgc catgttaa
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<220>
<221> Fosforilação<222> (38)..(38)<400> 70
tatcacagcc aaggctagct tcctgagcgc aagtactc
<210> 71<211> 39<212> DNA<213> Sintético
<220>
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caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag tgcgccatg
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<220>
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tacttctccc aaggctagct gtggagacgg attacacctt
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actgaataga aatagtgata gatacaacga gaggaaacct
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<221> Fosforilação<222> (33) . . (33)<400> 78
cggttggtga ggctagctgt gttcgacaat ggc
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aaggtttcct cguccctggg ca
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<220>
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caagactgga gacaaagtg
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gcagagtttc ctctgtgata
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<220>
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ggttgtcgtc agctcgtgta caacgagagg aaacctt
<210> 87
<211> 37
<212> DNA
<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (37) . . (37)<400> 87
tgcccaggga ggctagctcg tgagatgttg ggttaag
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ttgcgctcgt tgcggga
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gaagaggcca ataaaggaga gacaacgaga ggcgtgat
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<220>
<221> Fosforilação<222> (37)..(37)<400> 91
ctgggaggaa ggctagctaa çaccagcttg ttacacc
<210> 92<211> 22<212> DNA<213> Sintético<400> 92
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gggctggtca tccagcagtt caacgagagg aaacctt
<210> 97
<211> 37
<212> DNA
<213> Sintético
<400> 97
gggctggtca tccagcagta catcgagagg aaacctt
<210> 98<211> 37<212> DNA<213> Sintético<400> 98
gggctggtca tccagcagta ctacgagagg aaacctt
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tgcccaggga ggctagcgtg ttcgacaatg gcagca
<210> 100<211> 36<212> DNA<213> Sintético<400> 100
tgcccaggga ggctagagtg ttcgacaatg gcagca 36
<210> 101<211> 36<212> DNA<213> Sintético<400> 101
tgcccaggga ggccagcgtg ttcgacaatg gcagca 36
<210> 102<211> 40<212> DNA<213> Sintético<400> 102
atgctgccat tgtcgaacac ctgctggatg accagcccaa 40
<210> 103<211> 59<212> DNA<213> Sintético<400> 103
aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtacctgggg gagtattgcg gaggaaggt
<210> 104<211> 31<212> DNA<213> Sintético<400> 104
catctcttct ccgagcgtct gtaccgtgta c 31
<210> 105<211> 30<212> DNA<213> Sintético<400> 105
gtacacggta cagaccgtgc agtgtacgtt 30
<210> 106<211> 17<212> DNA<213> Sintético<400> 106
ccaggtactc actattt 17
<210> 107<211> 41<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (41).. (41)<400> 107
caaacgagtc ctggccttgt cttacaacga gaggaaacct t 41
<210> 108<211> 28<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (28)..(28)<400> 108
tgcccaggga ggctagcgtg gagacgga 28<210> 109<211> 28<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Phosphorylation<222> (28)..(28)<400> 109
tgcccaggga ggctagcgtc gagacgga
<210> 110<211> 18<212> DNA<213> Sintético<400> 110
agcagccaca aaggcaga
<210> 111<400> 111000
<210> 112<211> 34<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (34)..(34)<400> 112
tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat taca
<210> 113<400> 113000
<210> 114<211> 33<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (33) . . (33)<400> 114
tgcccaggga ggctagcgtg gagacggatt aca
<210> 115<211> 37<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (37)..(37)<400> 115
caaacgagtc ctggccttgt ctacgagagg aaacctt
<210> 116<211> 37<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (37)..(37)<400> 116
tgcccaggga ggctagctac agtggagacg gattaca
<210> 117<211> 39<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (39) .. (39)<400> 117
caaacgagtc ctggccttgt ctcaacgaga ggaaacctt
<210> 118<211> 35<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (35) .. (35)<400> 118
tgcccaggga ggctagctag tggagacgga ttaca
<210> 119<211> 42<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (42)..(42)<400> 119
caaacgagtc ctggccttgt ctctacaacg agaggaaacc tt
<210> 120<211> 32<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (32).. (32)<400> 120
tgcccaggga ggctaggtgg agacggatta ca
<210> 121
<211> 43
<212> DNA
<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (43) .. (43)<400> 121
caaacgagtc ctggccttgt ctgctacaac gagaggaaac ctt
<210> 122<211> 31<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (31)..(31)<400> 122tgcccaggga ggctagtgga gacggattac a 31
<210> 123<211> 19<212> DNA<213> Sintético<400> 123
gctacccaac tgttgcatc 19
<210> 124<211> 78<212> DNA<213> Sintético<400> 124
aacgtacact gcacgcggtc gaaatagtga gtgcggtcgg ctcggggcat tcttagcgttttgccccgag ccgaccgc 78
<210> 125<211> 28<212> DNA<213> Sintético<400> 125
tgccccgagc cgaccgaact cactattt 28
<210> 126<211> 38<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (38)..(38)<400> 126
actggatgtc catctgtctg acaacgagag gaaacctt 38
<210> 127<211> 23<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (23)..(23)<400> 127
tgcccaggga ggctagctta tac 23
<210> 128<211> 15<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (15) . .(15)<400> 128
cttcgtgagg gtgag 15
<210> 129<211> 52<212> DNA<213> Sintético<400> 129
tgccccctca ccctcacgaa ggtatacaga cagatggaca tccagttggt ga 52
<210> 130<211> 52<212> DNA<213> Sintético<400> 130
tgccccctca ccctcacgaa ggcatacaga cagatggaca tccagttggt ga
<210> 131<211> 37<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (37).. (37)<400> 131
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37
<210> 132<211> 36<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (36) . . (36)<400> 132
tgcccaggga ggctagcgtg ttcgacaatg gcagca 36
<210> 133<211> 37<212> DNA<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (25) .. (25)<220>
<221> Fosforilação<222> (37). . (37)<400> 133
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37
<210> 134<211> 37<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> RNA
<222> (20)..(20)<220>
<221> Fosforilação
<222> (37).. (37)
<400> 134
gggctggtca tccagcagta caacgagagg aaacctt 37
<210> 135<211> 37<212> DNA<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (19)..(26)<400> 135
gggctggtca tccagcagua caacgagagg aaacctt 37
<210> 136<211> 36<212> DNA<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (11)..(17)<400> 136
tgcccaggga ggcuagcgtg ttcgacaatg gcagca 36
<210> 137<400> 137000
<210> 138<211> 61<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Biotina<222> (1)..(1)<220>
<221> RNA
<222> (18)..(19)
<400> 138
aaaaaaaagg tttcctcguc cctgggcagc tggtcatcca gcagacaacg aggttgtgct g 61
<210> 139<211> 61<212> DNA<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (45)..(46)<220>
<221> Biotina<222> (61)..(61)<400> 139
cggttggtga ggctagctgt gttcgacaat ggcaaggttt cctcguccct gggcaaaaaa a 61
<210> 140<211> 31<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Biotin<222> (31)..(31)<400> 140
gccattgtcg aacacctgct ggatgaccag c 31
<210> 141<211> 43<212> DNA<213> Sintético<400> 141
gaaggtgtaa tccgtctcca cagacaaggc caggactcgt ttg 43
<210> 142<211> 28<212> DNA<213> Sintético<400> 142
tgagctacag tcggtcgaaa tagtgagt 28
<210> 143<211> 27<212> DNA<213> Sintético<400> 143
catctcttct ccgagcgctt catctca
<210> 144<211> 42<212> DNA<213> Sintético<400> 144
ggcactaacg tgcctgagct acagtcggtc gaaatagtga gt
<210> 145<211> 41<212> DNA<213> Sintético<400> 145
catctcttct ccgagcgctt catctcacga cgataacgtc g
<210> 146<211> 22<212> DNA<213> Sintético<400> 146
tgagatgaag cactgtagct ca
<210> 147<211> 40<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (40)..(40)<400> 147
caaacgagtc ctggccttgt ctacaacgag aggaaacctt
<210> 148<211> 39<212> DNA<213> Sintético
<220>
<221> Fosforilação<222> (39) .. (39)<400> 148
tgcccaggga ggctagctgt ggagacggat tacaccttc
<210> 149<211> 8
<212> DNA
<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (2) . . (2)<400> 149
tacaacga 8
<210> 150<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 150
cggtcgaa 8<210> 151<211> 7<212> DNA<213> Sintético<400> 151
acaacga
<210> 152<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 152tacaacga
<210> 153<211> 8
<212> DNA
<213> Sintético
<220><221> RNA<222> (7)..(7)<400> 153tacaacga
<210> 154<400> 154000
<210> 155<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 155tacaacaa
<210> 156<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 156ttcaacga
<210> 157<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 157tacatcga
<210> 158<400> 158000
<210> 159<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 159tactacga
<210> 160<400> 160000
<210> 161<211> 6<212> DNA<213> Sintético<400> 161caacga
<210> 162<400> 162000
<210> 163<400> 163000
<210> 164<400> 164000
<210> 165<400> 165000
<210> 166<211> 6<212> DNA<213> Sintético<400> 166ccgagc
<210> 167<211> 8<212> DNA<213> Sintético<400> 167ggctagct
<210> 168<211> 7<212> DNA<213> Sintético<400> 168ggctagc
<210> 169<211> 7<212> DNA<213> Sintético<400> 169ggctaga
<210> 170<211> 7<212> DNA<213> Sintético<400> 170ggccagc
<210> 171
<400> 171000
<210> 172<211> 9<212> DNA<213> Sintético<400> 172ggctagcta

Claims (61)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelomenos dois ou mais componentes oligonucleotídeos, em que pelo menos umprimeiro componente oligonucleotídeo e um segundo componente oligonu-cleotídeo se autocombinam na presença de um facilitador de combinaçãoMNAzima para formar uma enzima de ácido nucléico multicomponente cata-Iiticamente ativa (MNAzima)1 em que cada um do dito pelo menos primeiro edito segundo componentes oligonucleotídeos compreendem uma parte rami-ficada de substrato, uma parte nuclear catalítica, e uma parte ramificada desensor;em que após a autocombinação, a parte ramificada de sensordos ditos primeiro e segundo componentes oligonucleotídeos atuam comoramificações de sensores da MNAzima, a parte ramificada de substrato dosprimeiro e segundo componentes oligonucleotídeos atuam como ramifica-ções de substrato da MNAzima, e a parte nuclear catalítica dos primeiro esegundo componentes oligonucleotídeos atuam como um núcleo catalíticode MNAzima;e em que as ramificações de sensores da MNAzima interagemcom o dito facilitador de combinação de MNAzima de modo a manter o pri-meiro e o segundo componentes oligonucleotídeos em proximidade paraassociação das suas respectivas partes nucleares catalíticas para formar onúcleo catalítico da MNAzima, sendo o dito núcleo catalítico capaz de modi-ficar pelo menos um substrato, e em que as ditas ramificações de substratosda dita MNAzima engatam em um substrato, de tal modo que o dito núcleocatalítico da dita MNAzima possa modificar o dito substrato.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o dito facilitador de combinação é um alvo a ser identificado,detectado ou quantificado.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que o dito alvo é um ácido nucléico.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um ter-ceiro componente oligonucleotídeo que atua para estabilizar pelo menos umentre as ditas partes ramificadas de substrato ou partes ramificadas de sen-sor.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 4, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o dito facilitadorde combinação, os ditos componentes oligonucleotídeos ou substratos ouuma combinação dos mesmos, compreende mais do que uma molécula.
6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, caracterizada pelo fato de que as partes de núcleo catalítico do primei-ro componente oligonucleotídeo são selecionadas a partir do grupo quecompreende SEQ ID NOs: 149- 153, 155- 157, 159 e 161, e as partes denúcleo catalítico do segundo componente oligonucleotídeo são selecionadasa partir do grupo que compreende SEQ ID NOs: 166 - 170 e 172.
7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 6, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre os ditos compo-nentes oligonucleotídeos ou facilitador de combinação ou substrato ou umacombinação dos mesmos compreende ainda pelo menos um aptâmero ouparte do mesmo.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizadapelo fato de que o dito aptâmero ou parte do mesmo compreende pelo me-nos um entre ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína, ou um deri-vado ou combinação dos mesmos.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um ini-bidor da dita autocombinação da dita MNAzima.
10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 9, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre o dito pri-meiro ou o dito segundo componente oligonucleotídeo, ou o dito facilitadorde combinação, ou o dito substrato, compreende ainda pelo menos uma par-te de seqüência autocomplementar capaz de formar uma estrutura do tipoprendedor de cabelo (hairpin).
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o dito facilitador de combinaçãoé um ácido nucléico ou uma proteína.
12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre os ditoscomponentes oligonucleotídeos, facilitador de combinação, substrato, ouinibidor é afixado a um suporte insolúvel.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracteriza-da pelo fato de que o dito suporte insolúvel compreende pelo menos umananopartícula ou micropartícula, ou uma combinação das mesmas.
14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o dito substrato compreendeuma parte detectável e uma parte bloqueadora (quencher), em que após amodificação do dito substrato pela dita MNAzima, um efeito detectável pro-porcionado pela dita parte detectável é aumentado ou diminuído.
15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-da pelo fato de que a dita modificação do dito substrato pela dita MNAzimaproporciona um efeito detectável.
16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o dito facilitador de combinaçãoe o dito substrato são ácidos nucléicos que são completa ou parcialmentecomplementares a pelo menos parte dos ditos primeiro ou segundo compo-nentes oligonucleotídeos.
17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda pelo menos um terceiro componente oligonucleotídeo e um quarto componente oligonu-cleotídeo que se autocombinam na presença de pelo menos um facilitadorde combinação adicional para formar pelo menos uma MNAzima catalitica-mente ativa adicional, em que cada um dos ditos pelo menos terceiro e quar-to componentes oligonucleotídeos compreende uma parte ramificada desubstrato, uma parte de núcleo catalítico, e uma parte ramificada de sensor;em que, após a autocombinação de pelo menos um terceirocomponente oligonucleotídeo e um quarto componente oligonucleotídeo, aparte ramificada de sensor do dito pelo menos terceiro e do dito pelo menosquarto componentes oligoncleotídeos formam ramificações de sensores dadita pelo menos uma MNAzima cataliticamente ativa adicional, a parte rami-ficada de substrato do dito pelo menos terceiro e do dito pelo menos quartocomponentes oligoncleotídeos formam ramificações de substrato da dita pe-lo menos uma MNAzima cataliticamente ativa adicional, e a parte de núcleocatalítico do dito pelo menos terceiro e do dito pelo menos quarto componen-tes oligoncleotídeos formam um núcleo catalítico da dita pelo menos umaMNAzima cataliticamente ativa adicional;e em que as ramificações de sensores da dita pelo menos umaMNAzima adicional interagem com o dito pelo menos um facilitador de com-binação adicional de modo a manter o dito pelo menos terceiro e o dito pelomenos quarto componentes oligoncleotídeos em proximidade para associa-ção das suas respectivas partes de núcleo catalítico para formar o núcleocatalítico da dita pelo menos uma MNAzima adicional, sendo o dito núcleocatalítico capaz de atuar sobre pelo menos um substrato adicional, e em queas ramificações de substrato da dita pelo menos uma MNAzima adicionalengatam pelo menos um substrato adicional, de tal modo que o núcleo cata-lítico da dita pelo menos uma MNAzima adicional possa atuar sobre o ditopelo menos um substrato adicional.
18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracteriza-da pelo fato de que cada um dos substratos adicionais são iguais, diferentesou uma combinação dos mesmos.
19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 18, caracterizada pelo fato de que pelo menos um entre os ditoscomponentes oligonucleotídeos, facilitador de combinação, substrato, ouinibidor, é selecionado do grupo compreendendo DNA, RNA, análogos deácido nucléico, ácidos nucléicos peptídicos, ácidos nucléicos bloqueados,quimeras de ácidos nucléicos peptídicos, ou uma combinação dos mesmos.
20. Método para detectar a presença de pelo menos um facilita-dor de combinação, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,em que pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segun-do componente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de pelo me-nos um primeiro facilitador de combinação, para formar pelo menos uma en-zima de ácido nucléico multicomponente (MNAzima) cataliticamente ativa;(b) disponibilizar pelo menos um primeiro substrato, sendo o ditoprimeiro substrato capaz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, emque a dita modificação do dito substrato pela dita MNAzima proporciona umefeito detectável;(c) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que contém putativamente o dito pelo menos pri-meiro facilitador de combinação sob condições que permitem:(i) a autocombinação da dita pelo menos primeira MNAzima; e(ii) a atividade catalítica da dita pelo menos primeira MNAzima;e(d) detectar o dito efeito detectável, deste modo detectando apresença do dito pelo menos um facilitador de combinação.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda disponibilizar pelo menos um terceiro e umquarto componentes oligonucleotídeos, em que o dito pelo menos terceiro eo pelo menos quarto componentes oligonucleotídeos são capazes de se au-tocombinarem na presença de pelo menos um facilitador de combinaçãoadicional para formar pelo menos uma MNAzima cataliticamente ativa adi-cional, eem que pelo menos um substrato adicional está presente naamostra, sendo o dito substrato adicional capaz de ser modificado apenaspela MNAzima adicional, em que a dita modificação proporciona um efeitodetectável adicional.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pe-lo fato de que um substrato adicional é afixado a pelo menos um suporteinsolúvel, de tal modo que um efeito detectável seja produzido quando estesubstrato é modificado por sua respectiva MNAzima.
23. Método para detectar a presença de pelo menos um alvo,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) disponibilizar um substrato e dois ou mais componentes oli-gonucleotídeos, em que pelo menos um primeiro componente oligonucleotí-deo e pelo menos um segundo componente oligonucleotídeo são capazesde se autocombinarem na presença do dito alvo, para formar uma enzima deácido nucléico multicomponente (MNAzima) cataliticamente ativa; e em quepelo menos um entre o dito primeiro e o dito segundo componentes oligonu-cleotídeos compreende ainda pelo menos uma parte de aptâmero;(b) olocar os ditos componentes oligonucleotídeos em contatocom uma amostra que contém putativamente o dito pelo menos um alvo, sobcondições que permitem:(i) a ligação do dito alvo à dita pelo menos uma parte de aptâmero; e(ii) a modificação catalítica do dito substrato através da ditaMNAzima; e(c) determinar a presença da modificação catalítica através daMNAzima, em que a presença da modificação catalítica é indicativa da pre-sença do dito alvo.
24. Método para detectar a presença de pelo menos um alvo,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) disponibilizar pelo menos um substrato, pelo menos um pri-meiro facilitador de combinação e dois ou mais componentes oligonucleotí-deos, em que pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e umsegundo componente oligonucleotídeo são capazes de se autocombinaremna presença do dito primeiro facilitador de combinação e o dito alvo, paraformar uma enzima de ácido nucléico multicomponente (MNAzima) cataliti-camente ativa; eem que pelo menos um entre o dito primeiro ou o dito segundocomponentes oligonucleotídeos ou o dito primeiro facilitador de combinaçãoou o dito substrato compreende ainda um aptâmero ou parte do mesmo eem que o dito alvo é capaz de se ligar a pelo menos uma parte do dito aptâ-mero ou parte do mesmo; eem que o dito substrato é capaz de ser modificado pela dita pelomenos primeira MNAzima, em que a dita modificação do dito substrato atra-vés da dita MNAzima disponibiliza um efeito detectável;(b) disponibilizar pelo menos um primeiro inibidor o qual é capazde inibir a dita autocombinação da dita MNAzima cataliticamente ativa naausência do dito alvo;(c) colocar os ditos componentes oligonucleotídeos, o dito facili-tador de combinação, o dito substrato e o dito inibidor em contato com umaamostra que contém putativamente o dito alvo, sob condições que permitem:(i) a ligação do dito alvo ao dito aptâmero ou parte do mesmo; e(ii) a remoção da dita inibição da dita autocombinação da ditaMNAzima cataliticamente ativa; e(iii) a atividade catalítica da MNAzima; e(e) determinar a presença do dito efeito detectável de modo adetectar a presença do dito alvo.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pe-lo fato de que pelo menos um entre os ditos componentes oligonucleotídeos,facilitador de combinação, aptâmero, ou parte de aptâmero compreende ain-da o dito inibidor.
26. Método de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracteri-zado pelo fato de que a dita inibição da autocombinação da dita MNAzimacataliticamente ativa é removida após o contato do dito aptâmero ou parte deaptâmero com o alvo.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24a 26, caracterizado pelo fato de que o dito inibidor é capaz de se ligar a pelomenos um do dito aptâmero ou parte do mesmo.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 22, ou 24 a 27, caracterizado pelo fato de que o dito efeito detectável émedido quantitativamente ou qualitativamente.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24a 28, caracterizado pelo fato de que compreende ainda disponibilizar pelomenos um facilitador de combinação adicional e pelo menos um terceiro eum quarto componente oligonucleotídeo, em que o dito pelo menos terceiroe pelo menos quarto componente oligonucleotídeo são capazes de se auto-combinarem na presença do dito pelo menos um facilitador de combinaçãoadicional e pelo menos um alvo adicional, para formar pelo menos umaMNAzima cataliticamente ativa adicional, eem que pelo menos um substrato adicional está presente naamostra, sendo o dito substrato adicional capaz de ser modificado pelaMNAzima adicional, em que a dita modificação proporciona um efeito detec-tável adicional;e em que pelo menos um dos ditos terceiro ou quarto compo-nentes oligonucleotídeos ou o dito facilitador de combinação adicional ou odito substrato adicional compreende ainda pelo menos um aptâmero adicio-nal ou parte do mesmo que se liga a pelo menos um alvo adicional;em que pelo menos uma molécula inibidora adicional entra emcontato com uma parte do dito aptâmero adicional, inibindo desta forma adita autocombinação da dita MNAzima cataliticamente ativa adicional na au-sência do dito alvo adicional; eem que o dito pelo menos um facilitador de combinação adicio-nal entra em contato com pelo menos uma parte dos ditos componentes oli-gonucleotídeos adicionais.
30. Método para detectar a presença de pelo menos uma varian-te de seqüência de ácidos nucléicos, caracterizado pelo fato de que compre-ende:(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,em que pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segun-do componente oligonucleotídeo são capazes de se autocombinarem na pre-sença de uma variante de seqüência de um ácido nucléico para formar umaenzima de ácido nucléico multicomponente (MNAzima) cataliticamente ativa;(b) disponibilizar pelo menos um substrato, sendo o dito substra-to capaz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, em que a dita modi-ficação do dito substrato pela dita MNAzima proporciona um efeito detectá-vel;(c) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que contém putativamente a dita variante de se-qüência, sob condições que permitem:(i) a autocombinação da dita MNAzima cataliticamente ativa; e(ii) a atividade catalítica da dita MNAzima; e(d) determinar a presença do dito efeito detectável, detectandodesta forma a presença da dita pelo menos uma variante de seqüência.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pe-lo fato de que a variante de seqüência é selecionada a partir do grupo quecompreende polimorfismos de nucleotídeos individuais, múltiplos polimorfis-mos de nucleotídeos, inserções, deleções, duplicações, translocações, vari-antes de seqüências com deslocamento de estrutura, variantes de seqüên-cia sem sentido, ou qualquer combinação das mesmas.
32. Método de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracteriza-do pelo fato de que qualquer um dos dois ou ambos entre o dito primeirocomponente oligonucleotídeo e o dito segundo componente oligonucleotídeocompreendem mais do que uma molécula.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30a 32, caracterizado pelo fato de que a dita amostra que contém a dita varian-te de seqüência é selecionada a partir do grupo que compreende DNA não-metilado ou metilado modificado com bissulfito, RNA não-metilado ou meti-Iado modificado com bissulfito, pelo menos um amplicon de DNA não-metilado ou metilado modificado com bissulfito, pelo menos um amplicon deRNA não-metilado ou metilado modificado com bissulfito, ou uma combina-ção dos mesmos.
34. Método para detectar a presença de uma variante de se-qüência de um ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,compreendendo pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e umsegundo componente oligonucleotídeo capazes de se autocombinarem napresença de um ácido nucléico, para formar pelo menos uma primeira enzi-ma de ácido nucléico multicomponente (MNAzima) cataliticamente ativa;(b) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que contém putativamente o ácido nucléico, napresença de pelo menos um primeiro substrato modificável através da ditapelo menos uma primeira MNAzima1 em que o substrato compreende umaparte detectável capaz de proporcionar pelo menos um primeiro efeito detec-tável após a modificação do substrato através da dita pelo menos primeiraMNAzima, sob condições que permitem:(i) a autocombinação da MNAzima; e(ii) a atividade catalítica da MNAzima; e(c) em que a ausência da atividade catalítica é indicativa da pre-sença de uma variante de seqüência no dito ácido nucléico.
35. Método para detectar a presença de pelo menos um ácidonucléico metilado, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,em que pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segun-do componente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de um ácidonucléico metilado, para formar pelo menos uma enzima de ácido nucléicomuIticomponente (MNAzima) cataliticamente ativa;(b) disponibilizar pelo menos um primeiro substrato, sendo o ditoprimeiro substrato capaz de ser modificado pela dita primeira MNAzima, emque a dita modificação do dito substrato pela dita MNAzima proporciona pelomenos um primeiro efeito detectável;(c) colocar os dois ou mais componentes oligonucleotídeos emcontato com uma amostra que contém putativamente o ácido nucléico meti-lado, sob condições que permitem:(i) autocombinação da MNAzima cataliticamente ativa; e(ii) a atividade catalítica da MNAzima; e(d) determinar a presença do dito pelo menos um efeito detectá-vel, detectando desta forma a presença do dito pelo menos um ácido nucléi-co metilado.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pe-lo fato de que as ditas condições compreendem ainda uma temperatura quefacilita a hibridização da dita MNAzima com o dito ácido nucléico metilado,mas não com o ácido nucléico não-metilado.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 22 ou 24 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende ainda ampliar oefeito detectável pelo uso de uma cascata de ampliação de efeitos detectá-veis.
38. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pe-lo fato de que a cascata de ampliação de efeitos detectáveis compreendeuma ou mais entre uma cascata de ribozima/ligase, uma cascata enzimáticade ácidos nucléicos circular, uma cascata enzimática de proteínas, ou umaou mais enzimas afixadas a um suporte, ou qualquer combinação das mes-mas.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 38, caracterizado pelo fato de que o dito substrato compreende uma partedetectável e uma parte bloqueadora (quencher), em que após a modificaçãodo dito substrato pela dita MNAzima, um efeito detectável proporcionadopela dita parte detectável é aumentado ou diminuído.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 39, caracterizado pelo fato de que a dita modificação é selecionada a partirdo grupo que compreende clivagem, ligação, metalação da porfirina, forma-ção de ligações carbono-carbono, ligações éster ou ligações amida.
41. Método de acordo com a reivindicação 21, 22, ou 29, carac-terizado pelo fato de que o dito pelo menos um efeito detectável adicional édetectável independentemente.
42. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 29, caracteri-zado pelo fato de que cada um dos ditos substratos adicionais é igual, dife-rente ou uma combinação dos mesmos.
43. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 29, caracteri-zado pelo fato de que pelo menos um entre o dito substrato adicional é afi-xado a um suporte insolúvel, de tal modo que apenas uma entre uma partedetectável e uma parte bloqueadora (quencher) do substrato adicional per-manece afixada ao suporte quando o dito substrato adicional é modificadopela dita MNAzima adicional.
44. Método para detectar pelo menos um facilitador de combina-ção usando uma cascata de ampliação, caracterizado pelo fato de que com-preende:(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,compreendendo pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo epelo menos um segundo componente oligonucleotídeo que se autocombi-nam na presença de pelo menos um primeiro facilitador de combinação, pa-ra formar pelo menos uma primeira enzima de ácido nucléico multicompo-nente (MNAzima) cataliticamente ativa;(b) disponibilizar um suporte insolúvel que tem pelo menos umprimeiro substrato afixado a ele, sendo o dito primeiro substrato capaz de sermodificado pela dita MNAzima, em que o dito primeiro substrato compreendepelo menos uma terceira molécula que compreende pelo menos uma primei-ra enzima cataliticamente ativa, que é liberada após a modificação do ditoprimeiro substrato pela dita primeira MNAzima;(c) colocar os ditos dois ou mais componentes oligonucleotídeosem contato com uma amostra que contém putativamente o dito facilitador decombinação, na presença do dito suporte insolúvel que tem o dito primeirosubstrato afixado a ele, sob condições que permitem:(i) autocombinação da dita MNAzima; e(ii) a atividade catalítica da dita MNAzima; e(d) disponibilizar um suporte insolúvel que tem pelo menos umsegundo substrato afixado a ele, sendo o dito segundo substrato clivávelpela dita primeira enzima cataliticamente ativa, em que o dito segundo subs-trato compreende pelo menos uma quarta molécula que compreende pelomenos uma porção detectável que é liberada após a modificação do dito se-gundo substrato pela dita primeira enzima; e(e) em que a dita primeira enzima cataliticamente ativa modificauma pluralidade de ditos segundos substratos, liberando desta forma umapluralidade de porções detectáveis.(f) em que as ditas porções detectáveis são detectáveis após amodificação do dito segundo substrato pela dita primeira enzima catalitica-mente ativa; e(g) em que a detecção das ditas porções detectáveis é indicativada presença do dito facilitador de combinação.
45. Método para detectar pelo menos um facilitador de combina-ção, usando uma cascata de ampliação, caracterizado pelo fato de quecompreende:(a) disponibilizar dois ou mais componentes oligonucleotídeos,compreendendo pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo epelo menos um segundo componente oligonucleotídeo que se autocombi-nam na presença de pelo menos um primeiro facilitador de combinação, pa-ra formar pelo menos uma primeira enzima de ácido nucléico multicompo-nente (MNAzima) cataliticamente ativa;(b) disponibilizar um suporte insolúvel que tem pelo menos umprimeiro substrato afixado a ele, sendo o dito primeiro substrato capaz de sermodificado pela dita MNAzima1 em que o dito primeiro substrato compreendepelo menos uma terceira molécula que compreende pelo menos uma primei-ra enzima cataliticamente ativa, que é liberada após a modificação do ditoprimeiro substrato pela dita primeira MNAzima;(c) colocar os ditos dois ou mais componentes oligonucleotídeosem contato com uma amostra que contém putativamente o dito facilitador decombinação, na presença do dito suporte insolúvel que tem o dito primeirosubstrato afixado a ele, sob condições que permitem:(i) autocombinação da dita MNAzima; e(ii) a atividade catalítica da dita MNAzima;(d) em que a atividade catalítica da dita MNAzima é indicativa dapresença do dito pelo menos um facilitador de combinação.
46. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pe-lo fato de que as ditas porções detectáveis compreendem ainda uma segun-da enzima cataliticamente ativa adicional capaz de modificar o dito primeirosubstrato, liberando desta forma a enzima cataliticamente ativa adicional.
47. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pe-lo fato de que pelo menos uma entre a dita primeira ou a dita segunda enzi-ma cataliticamente ativa é selecionada a partir do grupo que compreendeMNAzimas, DNAzimas1 ribozimas, enzimas hidrolíticas, endonucleases derestrição, exonucleases, proteases, proteinases, hidrolases, liticases, pepti-dases, dipeptidases, esterases, caspases, catepsinas, dessulfidrases, ami-dases, glicosidases.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23a 27 ou 29, caracterizado pelo fato de que o dito alvo é para ser identificado,detectado ou quantificado.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23a 27 ou 29 ou 48, caracterizado pelo fato de que o dito alvo é selecionado apartir do grupo que compreende ácidos nucléicos, proteínas, glicoproteínas,lipídeos, lipoproteínas, células, vírus, bactérias, Archaea, fungos, anticorpos,metabólitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas peque-nas, polímeros, íons de metais, sais de metais, príons, ácidos nucléicos ouquaisquer derivados, partes, ou combinações dos mesmos.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda uma etapa de amplificar o ácido nucléico.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda detectar um efeito detectável durante ouapós a dita amplificação.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30a 34, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de ampli-ficar o ácido nucléico contendo a dita variante de seqüência.
53. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda a determinação da presença da dita varian-te de seqüência de ácido nucléico durante ou após a amplificação.
54. Método para fabricar uma pluralidade de enzimas de ácidonucléico multicomponentes (MNAzimas), em que cada uma reconhece pelomenos um facilitador de combinação e modifica um substrato, caracterizadopelo fato de que compreende:(a) disponibilizar uma pluralidade de facilitadores de combinaçãoa serem identificados, detectados ou quantificados;(b) projetar dois ou mais componentes oligonucleotídeos, emque pelo menos um primeiro componente oligonucleotídeo e um segundocomponente oligonucleotídeo se autocombinam na presença de um facilita-dor de combinação para formar uma enzima de ácido nucléico multicompo-nente (MNAzima) cataliticamente ativa, em que cada um dos pelo menosprimeiro e segundo componentes oligonucleotídeos compreende uma parteramificada de substrato, uma parte de núcleo catalítico, e uríia parte ramifi-cada de sensor;em que, após a autocombinação, a parte ramificada de sensordo primeiro e segundo componentes oligonucleotídeos forma ramificaçõesde sensores da MNAzima, a parte ramificada de substrato do primeiro e se-gundo componentes oligonucleotídeos formam ramificações de substrato daMNAzima, e a parte de núcleo catalítico do primeiro e segundo componentesoligonucleotídeos formam um núcleo catalítico da MNAzima;e em que as ramificações sensores da MNAzima interagem comum facilitador de combinação de modo a manter o primeiro e o segundocomponentes oligonucleotídeos em proximidade para associação de suasresepctivas partes de núcleo catalítico para formar o núcleo catalítico daMNAzima, sendo o dito núcleo catalítico capaz de atuar sobre pelo menosum substrato, e em que as ramificações de substrato da MNAzima engatamem um substrato de tal modo que o núcleo catalítico da MNAzima possamodificar o dito substrato;(c) alterar os ditos dois ou mais componentes oligonucleotídeosde tal modo que a parte ramificada de substrato e a parte de núcleo catalíti-co do primeiro e segundo componentes oligonucleotídeos sejam constantes,e a parte ramificada de sensor de pelo menos um entre o primeiro e o se-gundo componentes oligonucleotídeos seja adaptado para reconhecer outraentre a pluralidade de facilitadores de combinação, e(d) repetir a etapa de alteração para cada um da pluralidade defacilitadores de combinação.
55. Uso de pelo menos um oligonucleotídeo, caracterizado pelofato de que é como um substrato da enzima de ácido nucléico multicompo-nente (MNAzima)1 em que o dito substrato é modificado pela da dita MNAzi-ma seguindo o encaixe do dito substrato pela ramificação do substrato dadita MNAzima.
56. Método para fabricar MNAzimas que incorpora seqüênciasparciais de uma DNAzima1 caracterizado pelo fato de que compreende asseguintes etapas:(a) selecionar posições no interior da dita seqüência de DNAzi-ma para dividir em seqüências de núcleo catalítico parcial;(b) incorporar as ditas seqüências de núcleo catalítico parcial empartzimas; e(c) detectar a atividade catalítica dos pares de partzima para de-terminar qual combinação das ditas seqüências de núcleo catalítico parcialnas ditas partizimas é compatível com a formação de MNAzimas ativas.
57. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende umsubstrato de MNAzima, o dito substrato compreendendo ácidos nucléicosque são completa ou parcialmente complementares a pelo parte do primeiroou segundo componente de oligonucleotídeo de uma MNAzima como defini-da em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
58. Composição de acordo com a reivindicação 57, caracteriza-da pelo fato de que o dito substrato é um substrato universal.
59.
Composição
de acordo com a reivindicação 57, caracteriza-da pelo fato de que o dito substrato tem uma seqüência selecionada do gru-po consistindo em SEQ ID NO: 79, SEQ ID N0:60, SEQ ID NO: 61, SEQ IDNO: 62 e SEQ ID NO: 83.
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