BRPI0616712A2 - método para amidar polipeptìdeos com terminais c de aminoácido básicos por meio de endoproteases especìficas - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA AMIDAR POLIPEPTìDEOS COM TERMINAIS C DE AMINOáCIDO BáSICOS POR MEIO DE ENDOPROTEASES ESPECìFICAS. A presente invenção refere-se a um método para produzir peptideos dibásicos ou polibásicos amidados de terminal C, consistindo na reação de dois peptídeos na presença de enzimas biologicamente ativas de tripsina e, se necessário, na purificação dos compostos de fórmula (1) desse modo obtidos, por meio de química de proteína.
Description
Relatorio Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA AMIDAR POLIPEPTÍDEOS COM TERMINAIS C DE AMINOÁCIDOBÁSICOS POR MEIO DE ENDOPROTEASES ESPECÍFICAS".
A presente invenção refere-se a um processo para preparo depeptídeos di ou polibásicos C-terminalmente amidados, em particular aque-les possuindo a atividade biológica de GLP-1 ou análogos ou derivados dosmesmos.
A estabilidade, disponibilidade biomédica e duração de ação depeptídeos e proteínas farmaceuticamente relevantes depende em grandeparte da natureza da extremidade do terminal N ou C da molécula. A meia-vida das biomoléculas é influenciada acentuadamente pela extensão doterminal C com aminoácidos básicos. Atividades farmacêuticas particular-mente boas podem ser alcançadas se na extensão de terminal C com maisdo que um aminoácido básico, o aminoácido na extremidade do terminal Cfor uma amida de amino.
Tais substâncias ativas com base em peptídeo podem ser pre-paradas, se os peptídeos forem suficientemente pequenos, diretamente poruma síntese química completa de acordo com um protocolo de síntese deMerrifield modificado. No entanto, limitações emergem quando um tal peptí-deo é requerido em grandes quantidades. Desta forma, os aminoácidos aserem empregados na síntese devem inicialmente ser preparados e purifi-cados a fim de subseqüentemente serem adequados após de modificaçãoquímica como reagentes na síntese de peptídeo. Depois de remoção dosgrupos protetores no término da síntese, o peptídeo ou produto alvo podeentão ser purificado e formulado como produto farmacêutico. Dependendoda composição do peptídeo, além disso, efeitos subjacentes podem originar-se durante a síntese em rendimentos restritos, racemização ou formação desubproduto por meio de acoplamento defeituoso em etapas de acoplamentoindividuais, desta forma possivelmente possuindo um efeito adverso no ren-dimento total ou a pureza do produto. A síntese total é muito complicadapara preparo de quantidades maiores de produto requerido. Preparação pormeio de processos alternativos, especialmente biotecnológicos, portantoseria desejável.
Enzimas capazes de amidação de terminal C de peptídeos sãoconhecidas a muito tempo têm sido conhecidas durante um longo tempo.Estas enzimas são designadas (Eipper e outros Mol. Endocrinol.1987 Nov; 1(11): 777) como enzimas de alfa-amidação de peptidilglicina (PAM). A pre-paração e purificação de tais enzimas de PAM é familiar ao versado e foidescrita em detalhes (M. Nogudi e outros Prot. Expr. Purif. 2003, 28: 293).No entanto, a preparação é cara em relação à preparação de outras enzi-mas industriais tais como, por exemplo, tripsina ou carboxipeptidase.
Uma alternativa à amidação in vitro por meio de mecanismo dePAM emerge quando a enzima é coexpressada na mesma célula hospedei-ra com a proteína precursora a ser amidada. Isto é alcançado por introduçãode uma seqüência de gene que codifica para uma atividade de PAM na cé-lula hospedeira sob o controle de uma seqüência reguladora específica dehospedeiro. Esta seqüência de expressão pode ou ser incorporada estavel-mente na respectiva seqüência de DNA cromossômico, ou estar presenteem um segundo plasmídeo paralelo ao plasmídeo de expressão para a pro-teína alvo, ou ser integrada como segundo cassete de expressão no mesmovetor, ou ser clonada em um método de expressão policistrônica em fasecom a seqüência de gene que codifica a proteína alvo sob o controle damesma seqüência promotora. Entretanto, os rendimentos descritos são bai-xos, de modo que a preparação de grandes quantidades possa ser alcança-da apenas por meio de volumes de fermentação correspondentes. Isto levaa uma complexidade mais oneração de purificação. Além disso, a amidaçãonão ocorre quantitativamente, de modo que é necessário separar proteínarequerida amidada de não amidada. Uma decisão em favor de um processode preparação secretório (por exemplo Hong e outros, Appl Biochem Biote-chnol. 2003;110, p.113-23) deve levar em conta o fato que proteínas comterminal C polibásico são secretadas a apenas um nível muito pequeno ounão na totalidade.
Um outro método para amidação é com base no uso de meca-nismos de autoclivagem específica de proteína (Cottingham e outros NatureBiotech. Vol. 19, 974-977, 2001). Entretanto, não é fácil controlar esta rea-ção, e transtioesterificação e desta forma a formação de produtos indesejá-veis pode ocorrer. A contribuição relativamente grande da proteína de fusãopode ter efeitos adversos sobre o rendimento.
Os processos de amidação descritos acima iniciam de um ter-minal C do peptídeo alvo que é estendido em pelo menos um aminoácidoglicina ou alternativamente peptídeo de inteína. Peptídeos com Iisina determinal C podem, no entanto, se eles não compreenderem nenhuma Iisinaou arginina adicional subseqüentemente na seqüência, ser preparados co-mo uma estrutura multimérica que pode subseqüentemente ser convertidapor digestão com tripsina ou enzimas do tipo tripsina na unidade monoméri-ca. Rendimentos altos podem ser alcançados deste modo. Isto não é possí-vel no caso dos processos descritos acima.
Os processos de preparação biotecnológicos conhecidos estãodesse modo associados com desvantagens, e o objetivo de preparo de pep-tídeos ou proteínas que possuam mais do que um aminoácido Iisina ou argi-nina básica no terminal C e sejam terminalmente amidados em grandesquantidades em custo razoável não pode ainda ser considerado como satis-fatoriamente resolvido.
Um processo alternativo de preparação emergeria se fosse pos-sível preparar em grandes quantidades um precursor do peptídeo alvo que étruncado por pelo menos um aminoácido básico, e subseqüentemente es-tender este precursor em uma semisíntese catalisada por enzima com Iisi-namida ou argininamida.
Levin e outros (Biochemical Journal 63: 308-16; 1956) descreveo efeito de tripsina em Iisinamida e vários peptídeos de polilisinamida. Osresultados dos autores mostram que derivados de Iisinamida não podem serconvertidos sob a influência de tripsina em derivados de Iisinamida de pesomolecular elevado porque hidrólise das amidas intermediariamente forma-das para o ácido livre ocorre rapidamente por comparação com a reação deacoplamento. Deve ser concluído a partir disso que processos semi-sintéti-cos catalisados por tripsina fornecendo a preparação de peptídeos com se-qüências mistas de polilisinamida ou poliargininamida ou poli-Lys/Arg ligada porC são malsucedidos ou bem-sucedidos apenas com baixos rendimentos.
Um processo químico de peptídeo que surpreendentementepermite ligação catalisada por aminoácidos tripsina básica amidada, análo-gos ou derivados destes, a peptídeos que possuem um aminoácido básico determinal C com altos rendimentos (isto é, >30%) atualmente foi constatado.
Adicionalmente foi possível observar para o processo da inven-ção, surpreendentemente, que introdução de grupos protetores (cf. Pitras-chke e outros, Tetrahedron: Asymmetry 9, ρ 1505-1518, 1998) tais como,por exemplo, -Boc (t-butiloxicarbonila), -Z (benziloxicarbonila) ou -DDZ (di-metilfenilpropiloxicarbonila) nos aminoácidos básicos amidados (lisinamida,argininamida) não resultam em uma melhora em relação à eficiência e sele-tividade da reação de ligação. Ό processo da invenção desta forma tem avantagem de que é possível aplicar com mascaramento com grupos proteto-res, desta forma evitando perdas de rendimento por meio de remoção dogrupo protetor e a remoção de reagentes tóxicos. Isto resulta no processopossuindo enormes vantagens de custo sobre síntese química total.
Um aspecto da invenção é desta forma um processo para pre-paro de peptídeos di ou polibásicos amidados C-terminalmente da fórmulageral I
(AA)n-Xm-NH2 (I),
onde
(AA)n é um peptídeo consistindo em η aminoácidos do mesmoou diferente tipo, no qual
AA é um aminoácido ou análogos ou derivados deste;
η é um número inteiro entre 3 e 2000; e
X é um aminoácido básico ou análogos ou derivados deste;
m é um número inteiro entre 2 e 15,
no qual
um composto da fórmula geral Il
(AA)n-Xp (II)
é reagido com um composto da fórmula geral Ill(X)q-NH2 (III)na qual AA, η e X são tal como definido acima, eρ e q são números inteiros, eρ + q = m,
na presença de uma enzima possuindo a atividade biológica detripsina, e
onde apropriado o composto resultante da fórmula I é submetidoà purificação química de proteína;
em particular em que m é um número inteiro entre 2 e 10, ou emque m é um número inteiro entre 2 e 6.
Um aspecto adicional da invenção é um processo descrito acimaem que η é um número inteiro entre 10 e 1000, ou entre 15 e 500, ou entre20 e 400.
Um aspecto adicional da invenção é um processo descrito acimaem que
a) um peptídeo de fusão o qual compreende um ou mais com-postos da fórmula Il como parte do peptídeo de fusão é expresso;
b) os compostos da fórmula Il são liberados do referido peptídeode fusão através de clivagem química ou enzimática;
c) o intermediário da etapa b) é, onde apropriado depois de puri-
ficação química de proteína, reagido na presença de uma enzima possuindoa atividade biológica de tripsina com um composto da fórmula III; e
d) onde apropriado o composto resultante da fórmula I é subme-tido à purificação química de proteína e isolamento;
em que em particular a eliminação do composto da fórmula Il da
proteína de fusão ocorre através de mecanismo de haleto de cianogênio,enterocinase, fator Xa, Genenase, trombina ou tripsina; e também preferido,a proteína de fusão é expressa em um sistema de expressão selecionadodo grupo compreendendo E. coli, S. carnosus, Salmonella, Bacillus subtilis,
Pseudomonas fluorescens, K. lactis, P. pastoris, Schizosaccharomycespombe e S. cerevisiae.
Um aspecto adicional da invenção é um processo descrito acimano qual os referidos peptídeos da fórmula geral I possuem a atividade bioló-gica de GLP-1 ou derivados ou análogos deste.
Um aspecto adicional da invenção é um processo descrito acimano qual o composto da fórmula I é caracterizado pela fórmula IV:
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPS(X)m-NH2 (IV);
em que sucessivamente pode em particular ser caracterizadopelas seqüências:
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2(SEQ ID N°.1);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ IDN°. 2);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ IDN°. 3);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2(SEQ ID N°. 4) ou
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ IDN°. 5).
A invenção também refere-se a compostos da fórmula I caracte-rizados pelas seqüências:
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ IDN°. 2);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ IDN°. 3);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2(SEQ ID N°. 4) ou
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ IDN°. 5);
seu uso, especialmente em formulações de depósito.
Um aspecto adicional da invenção é um medicamento compre-endendo um ou mais dos compostos da fórmula I caracterizado pelas se-qüências:
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ IDΝ°. 2);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ IDN°. 3);
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2(SEQ ID N°. 4) ou
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ IDN°. 5).
Os significados para os propósitos da presente invenção são:
O termo "análogo" de um aminoácido quer dizer um aminoácidode ocorrência natural que não está codificado no código genético mas é a -dequado para incorporação em uma cadeia de peptídeo. Exemplos de aná-logos de um aminoácido são ornitina e citrulina, e também todos os outrosaminoácidos de ocorrência não-natural que possuem qualquer função bási-ca na cadeia lateral, tais como, por exemplo, ácido 2,4-diaminobutanóico; 3-metilornitina; 4-metilornitina, 5-aminoleucina; 4-aminoleucina; 3-aminoleucina; 5-aminonorleucina; 4-aminonorleucina; 3-aminonorleucina; 4-aminonorvalina; 3-aminonorvalina; 6-metillisina; 5-metillisina; 4-metillisina; 3-metillisina.
O termo "derivado" de um aminoácido quer dizer um aminoácidoou um análogo de um aminoácido o qual é substituído por um ou mais gru-pos químicos. Exemplos de tais grupos químicos são grupos protetores ha-bituais em química de peptídeo, tal como -Boc (t-butiloxicarbonila), -Z (benzi-loxicarbonila), -DDZ (dimetilfenilpropilóxi-carbonila), -Fmoc (N-alfa-(9-fluore-nilmetiloxicarbonila), -2-bromo-Z, -2-cloro-Z, -Tfa (trifluoroacetila), -nicoti-noíla, -4-nitro-Z, -2-picolinoíla, -Tos (4-toluenosulfonila), -For (formila), -bio-tinila, -dansila, -Dnp (dinitrofenila), -Mca (monocloracetila), -Mtt (N-metiltri-tila), -Nde (N-1-(4-nitro-1,3-dioxoindan-2-ilideno)etila), -acetimidoila, -acetila,-miristoíla, -palmitoíla, N-litocolil-Y-glutamila ou -ω-carboxiheptadecanoíla.
Um tal grupo é além disso um grupo C(0)-(C6-C24)alquila, umgrupo C(0)-(C6-C24)alquenila, um grupo C(0)-(C6-C24)alcanodienila, ou umgrupo C(0)-(C6-C24)alcanotrienila, onde grupos alquila, alquenila, alcanodie-nila e alcanotrienila onde presentes podem sercadeia ramificada ou linear.(Ci-C6)AIquiIa significa um radical de hidrocarboneto possuindo 1, 2, 3, 4, 5ou 6 átomos de C. Exemplos de radicais de (C1-C6)alquila são metila, etila,n-propila, isopropila, (1-metiletila), n-butila, isobutila (2-metilpropila), sec-butila (1-metilpropila), terc-butila (1,1 -dimetiletila), n-pentila, isopentila, terc-pentila, neopentila, hexila. (C6-C24)alquila correspondentemente significa umradical de hidrocarboneto possuindo 6 a 24 átomos de C. Radicais de alquilapodem ser cadeia linear ou ramificada. Radicais de (C6-C2 alquila preferi-dos são resíduos de ácido graxo, por exemplo hexila, octila, decanila, unde-canila, dodecanila, tridecanila, tetradecanila (miristila), pentadecanila, hexa-decanila, heptadecanila, octadecanila (estearila), nonadecanila, eicosanila,dicosanila, 9,11 -dimetiltridecanila, 11 -metiltridecanila.
Um tal grupo é além disso um grupo C(0)-fenil-(C5-C8)heteroaril-fenila, C(0)-bifenila ou C(0)-terfenila, onde os grupos fenila, bifenila, terfeni-Ia ou heteroarila são não substituídos ou são substituídos por um ou doisgrupos selecionados do grupo de (C1-C10)alquila ou O(C1-C10)alquila. Emradicais de fenila monosubstituída, o substituinte pode estar presente naposição 2, na posição 3 ou na posição 4. Fenila disubstituída pode ser subs-tituída na posição 2,3, posição 2,4, posição 2,5, posição 2,6, posição 3,4 ouposição 3,5. Em radicais de fenila trissubstituída, os substituintes podemestar presentes na posição 2,3,4, posição 2,3,5, posição 2,4,5, posição2,4,6, posição 2,3,6 ou posição 3,4,5. Heteroarila significa, por exemplo, fu-ranila, tienila, pirrolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, tetrazolila, oxazolila,isoxazolila, tiazolila, isotiazolila, piridila, pirazinila, pirimidinila, piridazinila,indolila, indazolila, quinolila, isoquinolila, ftalazinila, quinoxalinila, quinazolini-Ia e cinolinila.
O termo "aminoácido básico" quer dizer lisina, arginina ou deri-vados ou análogos destas, tais como, por exemplo, ornitina ou citrulina, depreferência lisina ou arginina, especialmente lisina. Neste contexto, lisina ouarginina pode, no lugar do grupo carboxamida, ser derivada por um ou maisde outro grupo reativo, em particular selecionada do grupo de éster de ami-no, éster de peptídeo, anidrido e haleto, e ser correspondentemente empre-gada no processo da invenção.
O termo "enzima possuindo a atividade biológica de tripsina"quer dizer, além das tripsinas conhecidas e comercialmente disponíveis dasfontes convencionais tais como rato, gado, porco, ser humano, cão, camun-dongo, as isoenzimas, derivados ou variantes destes, também enzimas pos-suindo propriedades bioquímicas altamente relacionada tais como, por e-xemplo, catepsina, tripsina de Fusarium oxysporum e de Streptomyces (S.griseus, S. exfoliatus, S. erythraeus, S. fradiae e S. albidoflavus), triptase,mastina, acrosina, calicreína, hepsina, prostasina I, endopeptidase de Iisila(Lys-C) e endoproteinase-Arg-C (clostripaína).
Está claro à pessoa versada neste contexto que esta lista não édefinitiva, e outras enzimas, isoenzimas, derivados ou variantes capazesespecificamente de clivar-se C-terminalmente a aminoácidos básicos estãocontinuamente sendo encontrados durante pesquisa biotecnológica. Alterna-tivamente, a especificidade de enzimas pode ser alterada através de modifi-cação química de peptídeo ou mutação ao nível de DNA (muteínas). Alémdisso, a especificidade e atividade de enzimas podem ser acentuadamentemodificadas através de escolha adequada das condições de reação.
Na modalidade preferida do processo da invenção, a capacida-de de microorganismos para preparar peptídeos heterólogos é utilizada. Pa-ra este propósito, a seqüência de peptídeo desejada é transladada na se-qüência de DNA correspondente, que é acoplada a uma seqüência promoto-ra específica de hospedeiro. É possível neste caso, dependendo da estraté-gia de expressão, expressar o peptídeo alvo a fim de que ele seja formadopela célula diretamente ou indiretamente como peptídeo de fusão remanes-cente dentro das células.
Se uma estratégia de fusão usando um peptídeo de fusão ade-quado for escolhida, estará então claro para o versado que os parceiros defusão devem ser conectados juntos por um ligador, que a divisão específicados parceiros de um modo que permita a fim de que o terminal N desejadodo peptídeo alvo esteja disponível depois do processo. Para os propósitosda presente invenção, o peptídeo alvo é um composto da fórmula II. Umgrande número de possibilidades, que são conhecidas ao versado e sãocontinuamente expandidas, é disponível para o projeto de ligadores ade-quados. Se, por exemplo, o aminoácido metionina for escolhido, uma cliva-gem química com haleto de cianogênio é possível. Se, por exemplo, umpentapeptídeo da seqüência DDDDK é escolhido como ligador, uma cliva-gem com enterocinase é possível. Se, por exemplo, a seqüência de tetra-peptídeo IEGR é escolhida, a clivagem pode ocorrer com fator Xa. Com umprojeto apropriado, Genenase® pode ser usada como enzima de processopara peptídeos cujo terminal N começa com histidina. Se o terminal N é ca-racterizado pelo dipeptídeo Gly-Ser, é possível escolher o tetrapeptídeo LV-PR como ligador, a fim de que um reconhecimento e sítio de clivagem paratrombina origine-se. Ainda que uma enzima possuindo a atividade biológicade tripsina seja empregada de acordo com a invenção para o acoplamentode peptídeo, o uso de uma tal enzima é possível em princípio até neste pon-to no processo da invenção. Desta forma, tripsina pode inicialmente ser u-sada em meio aquoso para eliminação da parte de fusão do peptídeo defusão uma vez que Iisina ou arginina é inserida como ligador entre parte defusão e peptídeo alvo.
No entanto, é também possível alternativamente para o peptídeoalvo, se ele for de exportação compatível, ser secretado no meio de culturacelular ou na forma de um peptídeo de fusão ou em sua forma nativa. Épossível usar para este propósito células hospedeiras recombinantes, espe-cialmente aquelas de microorganismos, de preferência de bactérias ou leve-duras. Se células bacterianas são escolhidas como sistema de expressão,há a opção adicional do peptídeo alvo ou um peptídeo correspondente defusão que inclui o peptídeo alvo, isto é um composto da fórmula Il para ospropósitos da invenção, sendo diretamente secretado no periplasma ou nomeio de cultura. Está claro à pessoa versada neste contexto que a exporta-ção é freqüentemente restrita se a extremidade de terminal C consistisse emmais do que um aminoácido básico.
Os organismos e métodos hospedeiros disponíveis em princípiopara este propósito são conhecidos ao versado (cf., por exemplo, Gellissen,Gerd (ed.) Production of Recombinant Proteins, ISBN 3-527-31036-3). Elessão também a um grande nível comercialmente disponível de um grandenúmero de fornecedores. Representantes que podem ser mencionados sãoas companhias New England Biolabs, Invitrogen e Roche. As descrições decatálogo de tais companhias incluem referências à literatura fornecendouma visão geral da tecnologia. Está também claro ao versado neste contex-to que a faixa de microorganismos a ser usada está continuamente expan-dindo, tal como é o repertório dos métodos biotecnológicos. Modalidades asquais são mais específicas neste respeito são também incluídas no tema dapresente invenção.
Exemplos de sistemas de hospedeiros/vetor mencionados comorepresentantes são os seguintes: bactérias do tipo de E. coli, S.carnosus,Salmonella, Bacillus subtilis ou Pseudomonas, especialmente Pseudomonasfluorescens, e leveduras do tipo de K. lactis, P. pastoris, Schizosaccharomy-ces pombe e S. cerevisiae.
No entanto, o versado está ciente que estes sistemas mencio-nados como exemplos oferecem um grande número de possíveis variaçõesque emergem, por exemplo, da escolha de promotores adequados ou outrasseqüências de ácido nucléico reguladoras, das propriedades genéticas dacélula hospedeira e dos vetores usados (por exemplo, em relação ao núme-ro de cópia de DNA, a escolha dos mecanismos de seleção etc.).
O versado está também ciente que um processo de purificaçãoespecífica deve ser adaptado para cada peptídeo alvo, por causa de suaspropriedades físico-químicas, quando ele pretende-se ser fornecido em for-ma isolada. Isto é alcançado em princípio por meio de combinação adequa-da de métodos de separação bioquímica e biofísica conhecidos. Está tam-bém claro neste contexto que novas possibilidades estão continuamente sendoabertas para obtenção ou otimização da purificação bem-sucedida desejadacom base em novos materiais (por exemplo, para a cromatografia).
Pode ser vantajoso para os propósitos da presente invençãofundir o peptídeo precursor com uma seqüência de peptídeo que, por exem-pio, permite purificação através de cromatografia por afinidade.
Para desenvolvimento adicional da invenção, derivados de e-xendina tais como descritos em US 2004/0106547 foram preparados a títulode exemplo. Tais peptídeos derivados de exendina podem, por causa deseu efeito de redução de glicose sangüínea, desempenhar um importantepapel no desenvolvimento do medicamento no tratamento de diabetes ououtros distúrbios metabólicos que levam por exemplo, a obesidade. É poresse motivo vantajoso para propósitos farmacêuticos possuir tais peptídeosdisponíveis em forma apropriada.
O pedido dé patente internacional WO 02/066628 descreve umderivado de hirudina que possui os aminoácidos Lys-Arg na extremidade determinal C. O perfil de efeito antitrombótico pode ser modificado através deamidação da arginina de terminal C. Para este propósito, o precursor comIisina de terminal C é preparado e subseqüentemente uma reação de aco-plamento com argininamida é realizada de acordo com a invenção para re-sultar no derivado de hirudin amidado. Os precursores podem ser prepara-dos tal como descrito no pedido por meio de secreção de levedura. Paraeste propósito, por exemplo, a seqüência de gene para Leu-hirudin descritaem EP-A 0 324 712 é estendida por um códon para lisina, e o procedimentodescrito a título de exemplo na patente é continuado para preparar o hirudinestendido com lisina. Alternativamente, é também possível seguir a rotina desecreção do precursor por bactérias. A tecnologia descrita no pedido de pa-tente EP-A 1 216 259 pode ser usada para este propósito, por exemplo.
Os seguintes exemplos servem para ilustrar a presente invençãoe de modo algum devem ser interpretados como Iimitantes em relação aostemas da presente invenção.
Exemplo 1: Síntese de uma seqüência de DNA específico de E. coli codifi-cando para AVE (1-43)
Primeiramente, a seqüência de gene SEQ ID N°. 6 codificandopara o peptídeo AVE (1-43) (SEQ ID N°. 7) foi preparada:SEQ ID N°. 6:
TTTTTTAAGCTTGCACGGTGAAGGTACCTTCACCTCCGACCTGTCCAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGTGGTCCGTCCTCCGGTGCTCCGCCTTCGAAAAAGAAGAAAAAGTGATAATAGCATGCACGTGCGGCCGCACCTGGTCGACGAATTCAAA AAAASEQ ID Ν°. 7:
HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKK
A seqüência de gene foi sintetizada através de mecanismo detecnologia de PCR. Para este propósito, os seguintes 5 iniciadores forampreparados através de síntese de DNA química. Esta síntese ocorreu usan-do o sistema de síntese de DNA Expedite® (de Applied Biosystems).
a) Iniciador zp5u possui a seqüência (SEQ ID N°. 8):
5'-TTTTTTAAGCTTGCACGGTGAAG -3'
SEQ ID N°. 8 inclui a região 1-23 do filamento de sentido ("sen-tido"). O tripleto de CAC codifica histidina como primeiro aminoácido do pep-tídeo alvo.
b) Iniciador zp3a possui a seqüência (SEQ ID N°. 9):5'-CTTCCATCTGTTTGGACAGGTCGGAGGTGAAGGTACCTTCACCGTGCAAG CTTAAAAAA-3'
SEQ ID N°. 9 inclui a região 1-59 da cepa complementar ("anti-sentido").
c) Iniciador zp3b possui a seqüência (SEQ ID N°. 10):5'-GGACGGACCACCGTTTTTCAGCCATTCGATGAACAGACGAACAGCTTCTTCTTCCATCTGTTTGG ACAG-3'
SEQ ID N°. 10 inclui a região 40-108 do filamento complementar("anti-sentido").
d) Iniciador zp3c possui a seqüência (SEQ ID N°. 11):5-CGTGCATGCTATTATCACTTTTTCTTCTTTTTCGAAGGCGGAGCACCGGAGGACGGACCACCG I IIII0—3'
SEQ ID N°. 11 inclui a região 91-159 do filamento complementar("anti-sentido").
O tripleto anti-sentido CTT codifica o último aminoácido (AA43)do peptídeo alvo.
e) Iniciador zp3d possui a seqüência (SEQ ID N°. 12):
5 '-TTTTTTG AATTCGTCGACCAGGTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCACTT-3'
SEQ ID N°. 12 inclui a região remanescente do filamento com-plementar ("anti-sentido").
Usando os iniciadores, 4 reações PCR foram subseqüentementerealizadas sob condições padrões em 54°C. Na reação 1, 100 ng de cadaum dos iniciadores zp3a e zp5u foram empregados. O número de ciclos naPCR foi 5. Na segunda reação, 1/40 da reação foi reagido com 100 ng decada um dos iniciadores zp5u e zp3b em 10 ciclos. Na reação 3, 1/40 doproduto de reação 2 foram reagidos com 100 ng de cada um dos iniciadoreszp5u e zp3c em um adicional de 10 ciclos. Finalmente, o fragmento de DNAdesejado foi sintetizado em 25 ciclos de PCR com 1/40 do rendimento dereação 3 e os iniciadores zp5u e zp3d, e seu comprimento foi checado atra-vés de eletroforese de gel. O fragmento de DNA desejado foi purificado ereagido com as enzimas de restrição EcoRI e subseqüentemente comHind3 de acordo com a informação do fabricante (New England Biolabs).
Em paralelo, o DNA do plasmídeo pUC19 (New England Bio-labs) foi reagido com as enzimas EcoRI e Hind3. Os fragmentos das mistu-ras de clivagem foram separados em um gel de agarose a 1,2% e em se-guida o fragmento de vetor remanescente de pUC19 e o produto desejadoda reação 4 foram isolados. Os fragmentos purificados foram ligados juntosem uma reação de T4 Iigase em 16°C durante a noite. Subseqüentemente,células de E. coli competentes (Stratagene, strain E. coli XL10 Gold) foramtransformadas com a mistura de ligação e semeadas em placas de ágarcompreendendo 25 mg/l de ampicilina. DNA de plasmídeo foi isolado dosclones individuais e caracterizado através de análise de seqüência de DNA.
O DNA de plasmídeo do fragmento desejado recebeu a desig-nação pSCHPUCZP1-43 e serviu como material de partida para preparo devetores de expressão para sintetização dos compostos da fórmula I em célu-las de E.coli K12.
Exemplo 2: construção de um vetor de expressão para AVE (1-43)
US 5496924, os conteúdos dos quais são por meio deste ex-pressamente incluídos no presente pedido através de referência, sugeremum sistema de expressão que em princípio permite a preparação de proteí-nas de fusão talhadas. A vantagem do sistema é que proteínas de fusãocom uma pequena parte balastro podem ser preparadas. O sistema de ex-pressão é usado a título de exemplo no pedido. Fusão dos segmentos deseqüência A-B por meio da seqüência de reconhecimento de enterocinaseDDDDK com AVE (1-43) resulta em uma proteína de fusão possuindo a seguin-te seqüência de gene e seqüência de aminoácido (SEQ ID N°. 13 e No. 14):SEQ ID N°. 13:
5^-GGAAACAGAATTCATGGCGCCGACCTCTTCTTCTACCAAAAAGCTCAACTGCAACTGGAACACCTGCTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGTATCAACAACTACAAAAACCCGAAACTGACGCGTATCGACGATGACGATAAACACGGTGAAGGTACCTTCACCTCCGACCTGTCCAAACAGATGGAAGAAGAAGCTGTTCGTCTGTTCATCGAATGGCTGAAAAACGGTGGTCCGTCCTCCGGTGCTCCGCCTTCGAAAAAGAAGAAAAAGTGATAATAGCATGC ACGTG CG GCCG C AAG CTTAAAAAA-3'
Os códons ATG e AAG marcam o primeiro e último aminoácidodo peptídeo de fusão.SEQ ID N°. 14:
MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRI DDDDKHGEGTFTSDLSKQME EEAVRLFIEW LKNGGPSSGA PPSKKKKK
A seqüência de gene codificada foi preparada através de meca-nismo de tecnologia de PCR. Para este propósito, os seguintes iniciadoresforam sintetizados:
1) Iniciador psw3_zpcolf (SEQ ID N0. 15):5'-CGTATCGACGATGACGATAAACACGGTGAAGGTACCTTC-3'
A seqüência do iniciador neste caso abrange o sítio de reconhe-cimento de enterocinase e o início da seqüência de codificação de AVEv43 ·
2) Iniciador psw3_zpcolrev (SEQ ID N°. 16):5'-GTGTTTATCGTCATCGTCGATACGCGTCAGTTTCGG-3'
A seqüência neste caso corresponde a um derivado de seqüên-cia sintética de interleucina2 que, tal como mostrado na Tabela I de US5496924, abrange aminoácidos 34-38 e 2/3 do códon para o aminoácidometionina. O restante da seqüência do iniciador sobrepõe-se com iniciadorpsw3_zpcolf.3) pBprimefl (SEQ ID N°. 17):
5 '-TG AGCGGATAACAATTTCACAC-3'
O iniciador hibridiza-se a montante com o sítio de clivagem deEcoRI que está presente no plasmídeo pK50 (cf. figura 33 em US 5496924).
4) psw3_ave_1-43_rev com sítio de clivagem de Hind3 (SEQ IDN°. 18):
5'-TTTTTTAAGCTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCACTT
Duas PCRs foram realizadas em paralelo. Uma foi realizada emDNA do plasmídeo pK50 com o par de iniciador pBprimefl e psw3_zpcolrevem 50°C e a outra reação foi realizada com o par de iniciador psw3_zpcolf epsw3_ave_1-43_rev em 54°C em DNA do plasmídeo pSCHPUCZP1-43. Osrendimentos de PCR foram purificados depois de fracionamento através deeletroforese de gel, e uma alíquota de cada um foram misturadas na relação1:1 e em seguida reagidas em uma terceira PCR com o par de iniciador pB-primefl e psw3_ave_1 -43_rev. O rendimento de PCR foi reagido com asenzimas EcoRI e Hind3 e empregado em uma reação de Iigase T4 noplasmídeo pK50 que foi aberto em paralelo com estas enzimas. Células E.coli BL21 competentes são transformadas com a mistura de ligação e se-meadas em ágar seletivo compreendendo 25 mg/l de ampicilina. DNA deplasmídeo foi reisolado de alguns clones e analisado através de PCR e sub-seqüente análise de seqüência de DNA. Plasmídeos corretos recebem onome pBZP43. Clones de E. coli BL21:pBZP43 são checados quanto à ex-pressão da proteína de fusão. Isto ocorre de uma maneira análoga ao e-xemplo 14 de US patente 5496924. Os produtos de expressão foram anali-sados através de espectrometria de massa e através de SDS-PAGE, e oterminal N foi determinado através de análise de seqüência de proteína. Umclone adequado para fermentação de maiores quantidades de material foiselecionado.
Exemplo 3: Construção de um vetor de expressão para AVE Π-39)
Plasmídeo pBZP43 serve como padrão para a reação PCR rea-lizada com os iniciadores pBprimefl (exemplo 2) e psw3_ave_39rev. O pro-duto de PCR é reagido com enzimas de restrição EcoRI e Notl de acordocom a informação do fabricante da enzima, e inserido em uma reação deIigase T4 no plasmídeo pBZP43 aberto com Ecorl/NotI. O resultado é oplasmídeo pBZP39, com o qual, o procedimento descrito no Exemplo 2 écontinuado.
psw3_ave_39rev (SEQ ID N0. 19):
5'-TTTTTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCATTTCGAAGGCGGAGCACC-3'
O tripleto TTT codifica Iisina na posição 39.Exemplo 4: construção de um vetor de expressão para AVE (1-38-Arq)
Plasmídeo pBZP43 serve como padrão para a reação PCR rea-lizada com os iniciadores pBprimefl (Exemplo 2) e psw3_ave38_argrev. Oproduto de PCR é reagido com enzimas de restrição EcoRI e Notl de acordocom a informação do fabricante da enzima, e inserido em uma reação deligase T4 no plasmídeo pBZP43 aberto com EcoRI/Notl. O resultado é oplasmídeo pBZP38arg, com o qual, o procedimento descrito no Exemplo 2 écontinuado.
Iniciador: psw3_ave38_argrev (SEQ ID N°. 20):
5'-TTTTTTGCGGCCGCACGTGCATGCTATTATCATACGCGAAGGCGGAGCACCG-3*
O tripleto AGG codifica arginina na posição 39.
Exemplo 5: fermentação das cepas construídas no Exemplo 2-4
A fermentação ocorreu tal como descrito no pedido de patenteAlemã DE 10 2004 058306.4, Exemplo 3, com leves diferenças. Células deE. coli BL21 transformadas com vários vetores de plasmídeo codificandopara derivados alvo de peptídeo (proteína de fusão) foram cultivadas emmeio de sal mineral ou meio de complexo (vide Exemplo 1) em 30°C ou37°C e pH de 7,0 em um fermentador. O pH foi ajustado com uma soluçãode NH4+ (26% em água). A aeração da cultura foi assegurada por uma estra-tégia de controle que mantinha o oxigênio dissolvido no caldo de culturaconstante em 30%. Para processos de batelada de alimentação em mineralsal médio, uma solução de glicose (60% em peso/volume) foi alimentada (8g/L/h a 26g/L/h). Expressão de proteína foi induzida através de adição deIPTG (1-4 mM de conc. final (f.c.)). A duração de indução foi 6 a 8 h. Ex-pressão das proteínas alvo foi detectada através de eletroforese de gel deSDS poliacrilamida (SDS-PAGE).
Expressão de proteína de fusão de precursor de AVE em E. coliBL21/pBZP43 foi realizada tal como descrito abaixo:
100 μΙ_ de suspensão de célula foram removidos da cultura con-tínua de células de E. coli BL21 armazenadas em -80°C e incubados em 0,5L de meio de pré-cultura com agitação em 37°C durante 10 a 16 h. A culturaprincipal no fermentador foi inoculada com uma quantidade apropriada depré-cultura para uma densidade de inoculação de 0,01 a 0,05 OD6oo-Meio de pré-cultura:5 g/L de Bacto triptona10 g/L de extrato de levedura5 g/L de NaCIMeio de cultura principal:
Meio de sal mineral definido (meio mínimo) com base de glicosecomo fonte de carbono (Jeffrey H. Miller: Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory (1972)).
Depois que a glicose inicialmente presente no meio de culturaprincipal tinha sido consumida, uma solução de glicose foi alimentada. Ex-pressão de proteína foi induzida através de adição de IPTG (1 mM de f.c.), ea expressão máxima da proteína de fusão depois de indução foi observada.O sistema analítico de SDS-PAGE de Novex (NuPage® Novex 12% gel sys-tem, Invitrogen®) foi usado por exemplo, de acordo com informação do fabri-cante para analisar na fermentação em cada caso 0,02 OD6oonm de suspen-são de célula removida do fermentador em vários tempos de cultivo.Exemplo 6: purificação das proteínas de fusão preparadas no Exemplo 5
1000 g de biomassa de cepa de E. coli recombinante foram res-suspensos em 1000 ml de tampão de Tris (50 mM de Tris/HCI, pH 7,4). Ascélulas foram rompidas por homogenização de alta pressão (homogenizadorde alta pressão Rannie, 100 MPa (1000 bar) duas vezes. O DNA genômicofoi digerido através de adição de Benzonase (1000 U/L) e cloreto de magné-sio (10 mM) durante 1,5 horas. A proteína de fusão foi purificada através decromatografia de leito expandido. Para este propósito, o homogeneizado decélula foi diluído a 10 litros com tampão (50 mM de Tris/HCI, pH 7,4) e dire-tamente carregado em uma coluna de cromatografia (Streamline SP XL, GEHealthcare) previamente equilibrada com tampão (50 mM de Tris/HCI pH7,4). Carregamento de amostra foi seguido por uma etapa de lavagem comtampão de equilíbrio (6 volumes de coluna), seguido por uma outra etapa delavagem com tampão de sal elevado a 7% (50 mM de Tris/HCI pH 7,4; 1 Mde NaCI). Eluição ocorreu por lavagem com 10 volumes de coluna de tam-pão de sal elevado a 20%. A mistura de eluição foi checada através de ele-troforese de gel de SDS (NuPage® Novex 12% gel system, Invitrogen) e H-PLC. A mistura de proteína de fusão foi empregada para a reação de cliva-gem de protease depois de diafiltragem em tampão de enterocinase (50 mMde Tris/HCI pH 7,4; 50 mM de NaCI, 2mM de CaCI2). As proteínas de fusãoforam clivadas por enterocinase (Invitrogen) em tampão de enterocinase (20mM de Tris/HCI, 50 mM de NaCI, 2 mM de CaCI2 pH 7,4) de acordo com ainformação do fabricante.
Exemplo 7: separação dos produtos de clivaaem da reação de clivaaem deenterocinase
Separação dos produtos de clivagem ocorre de acordo com E-xemplo 6 de pedido de patente Alemã DE102004058306.4. Clivagem dasproteínas de fusão por enterocinase foi seguida por separação dos produtosde clivagem um do outro através de cromatografia de permuta de íon (fonte30S, Amersham Biosciences). A intensidade iônica da solução foi levada acerca de 7 mS/cm por diluição com H2O. Depois que a solução de proteínatinha sido carregada na coluna previamente equilibrada (20 mM de Tris/HCI,pH 7,4; ajustada a uma condutividade de cerca de 7 mS/cm com NaCI), ma-terial não ligado foi lavado com tampão B a 15% (20 mM de Tris/HCI, pH7,4; 500 mM de NaCI). Eluição dos precursores de peptídeo de AVE ocorreuatravés de aplicação de um gradiente sobre 10 volumes de coluna a tampãoB a 100%. Frações contendo precursor de AVE foram identificadas atravésde eletroforese de gel de SDS, HPLC e espectrometria de massa. As fra-ções correspondentes foram combinadas, dessalinizadas e, depois de re-moção de solvente orgânico, liofilizadas.
Exemplo 8: acoplamento de peptídeo de AVE (1-39) com H-Lvs(Boc)-NHp
0,2 mg de AVE (1-39) (PM 4218; 0,047 μmol; 1 g/L de concen-tração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno de 1,5 mL.11 μl de tampão de acetato de piridina a 0,1 M de pH 5,6, 60 μl de umasolução a 129 g/L de H-Lys(Boc)-NH2-HCI em tampão de acetato de piridinaa 0,1 M de pH 5,6 (contém 7,75 mg de H-Lys(Boc)-NH2-HCl = 27,5 pmols =585 mois de H-Lys(Boc)-NH2-HCl por mol de AVE (1-39)) e 119 pL de DMFsão adicionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação é iniciadaatravés de adição de 10 pL de uma solução de tripsina a 2 g/L em água(contém 0,02 mg de tripsina = 0,002 g de tripsina por g de AVE (1-39)). Asolução de reação é incubada em 12°C durante agitação em 1000 min"1.Amostras para controle de processo são tiradas regularmente e paradasatravés de diluição com 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de ace-tonitrila e 64% de ácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguidopor LC-MS. Depois que o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidi-ficada a um pH abaixo de 2,5 através de adição de ácido trifluoroacético e épurificado através de cromatografia.
Exemplo 9: Acoplamento de peptídeo de AVE (1-43) com H-Lvs-NHg
3,85 mg de AVE (1-43) (PM 4731; 0,814 μηιοΙ; 20 g/L de con-centração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno de 1,5ml. 41 μl de uma solução de 620 g/L de H-Lys-NH2.2HCI em tampão de a-cetato de sódio a 0,1 M de pH 5,8 (contém 25,6 mg de H-Lys-NH2.2HCI =117,5 pmols = 144 mois de H-Lys-NH2.2HCl por mol de AVE (1 -43)), 116 μlde DMF e 32 pL de tampão de acetato de sódio a 0,1 M de pH 5,8 são adi-cionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação é iniciada atra-vés de adição de 2,9 pL de uma solução de tripsina de 20 g/L em água (con-tém 0,06 mg de tripsina = 0,015 g de tripsina por g de AVE (1-43)). A solu-ção de reação é incubada em 12°C durante agitação em 900 min'1. Amos-tras para controle de processo são tiradas regularmente e paradas por dilui-ção com 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de acetonitrila e 64%de ácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguido por LC-MS. De-pois que o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidificada a um pHabaixo de 2,5 através de adição de ácido trifluoroacético, e é purificado atra-vés de cromatografia.
Exemplo 10: acoplamento de peptídeo de AVE (1-39) com H-Lvs-NHp
0,2 mg de AVE (1-39) (PM 4218; 0,047 pmol; 1 g/L de concen-tração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno de 1,5 mL.11 pL de tampão de acetato de piridina a 0,1 M de pH 5,6, 60 pL de umasolução a 100 g/L de H-Lys-NH2.2HCI em tampão de acetato de piridina a0,1 M de pH 5,6 (contém 6,0 mg de H-Lys-NH2.2HCI = 27,5 pmols = 585mois de H-Lys-NH2.2HCI por mol de AVE (1-39)) e 119 pL de DMF são adi-cionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação é iniciada atra-vés de adição de 10 pL de uma solução a 2 g/L de tripsina em água (contém0,02 mg de tripsina = 0,002 g de tripsina por g de AVE (1-39)). A solução dereação é incubada em 12°C durante agitação em 1000 min"1. Amostras paracontrole de processo são tiradas regularmente e paradas através de diluiçãocom 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de acetonitrila e 64% deácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguido por LC-MS. Depoisque o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidificada a um pH a-baixo de 2,5 através de adição de ácido trifluoroacético e é purificada atra-vés de cromatografia.
Exemplo 11: acoplamento de peptídeo de AVE (1-39) com H-Arg-NH9
0,2 mg de AVE (1-39) (PM 4218; 0,047 pmol; 1 g/L de concen-tração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno a 1,5 mL.11 pL de tampão de acetato de piridina a 0,1 M de pH 5,6, 60 pL de umasolução a 113 g/L de H-Arg-NH2.2HCI em tampão de acetato de piridina a0,1 M de pH 5,6 (contém 6,77 mg de H-Arg-NH2.2HCI = 27,5 pmols = 585mois de H-Arg-NH2.2HCI por mol de AVE (1-39)) e 119 pL de DMF são adi-cionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação é iniciada atra-vés de adição de 10 pL de uma solução a 2 g/L de tripsina em água (contém0,02 mg de tripsina = 0,002 g de tripsina por g de AVE (1-39)). A solução dereação é incubada em 12°C durante agitação em 1000 min"1. Amostras paracontrole de processo são tiradas regularmente e paradas através de diluiçãocom 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de acetonitrila e 64% deácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguido por LC-MS. Depoisque o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidificada a um pH a-baixo de 2,5 através de adição de ácido trifluoroacético e é purificado atra-vés de cromatografia.
Exemplo 12: acoplamento de peptídeo de AVE (1-43) com H-Arg-NHg
0,25 mg de AVE (1-43) (PM 4731; 0,047 μιηοΙ; 1,1 g/L de con-centração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno de 1,510 mL. 11 μΙ_ de tampão de acetato de piridina a 0,1 M de pH 5,6, 60 μΙ_ deuma solução a 113 g/L de H-Arg-NH2.2HCI em tampão de acetato de piridi-na a 0,1 M de pH 5,6 (contém 6,77 mg de H-Arg-NH2.2HCI = 27,5 pmols =585 mois de H-Arg-NH2.2HCI por mol de AVE (1-43)) e 119 μί de DMF sãoadicionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação é iniciada a -través de adição de 10 μί de uma solução a 2 g/L de tripsina em água (con-tém 0,02 mg de tripsina = 0,002 g de tripsina por g de AVE (1-43)). A solu-ção de reação é incubada em 12°C durante agitação em 1000 min"1. Amos-tras para controle de processo são tiradas regularmente e paradas atravésde diluição com 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de acetonitrilae 64% de ácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguido por LC-MS. Depois que o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidificada aum pH abaixo de 2,5 através de adição de ácido trifluoroacético e é purifica-da através de cromatografia.
Exemplo 13: acoplamento de peptídeo de AVE (1-38)-Arq com H-Lvs-NHg.0,2 mg de AVE (1-38)-Arg (PM 4246; 0,047 μηιοΙ; 1 g/L de con-
centração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno de 1,5mL. 11 μί de tampão de acetato de piridina a 0,1 M de pH 5,6, 60 μί deuma solução a 100 g/L de H-Lys-NH2.2HCI em tampão de acetato de piridi-na a 0,1 M de pH 5,6 (contém 6,0 mg de H-Lys-NH2.2HCI = 27,5 μηιοίε =585 mois de H-Lys-NH2.2HCI por mol de AVE (1-38)-Arg) e 119 μί de DMFsão adicionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação é iniciadaatravés de adição de 10 μί de uma solução a 2 g/L de tripsina em água(contém 0,02 mg de tripsina = 0,002 g de tripsina por g de AVE (1-38)-Arg).
A solução de reação é incubada em 12°C durante agitação em 1000 min"1.Amostras para controle de processo são tiradas regularmente e paradasatravés de diluição com 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de ace-tonitrila e 64% de ácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguidopor LC-MS. Depois que o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidi-ficada a um pH abaixo de 2,5 através de adição de ácido trifluoroacético e épurificado através de cromatografia.
Exemplo 14: acoplamento de peptídeo de AVE (1-43) com H-Lvs(Boc)-NHp
20 mg de AVE (1 -43) (PM 4731; 1,058 Mmols; 20 g/L de concen-tração final) são pesados em um vaso de reação de polipropileno de 2 mL.370 μί de uma solução a 482 g/L de H-Lys(Boc)-NH2-HCI em tampão decitrato de sódio a 0,1 M de pH 5,5 (contém 155 mg de H-Lys(Boc)-NH2-HCI =550 pmols = 130 mols H-Lys(Boc)-NH2-HCI por mol de AVE (1-43)) e 600 μίde DMF são adicionados. A solução clara é equilibrada em 12°C. A reação éiniciada através de adição de 30 μί de uma solução a 3,3 g/L de tripsina emágua (contém 0,1 mg de tripsina = 5 mg de tripsina por g de AVE (1-43)). Asolução de reação é incubada em 12°C durante agitação em 1000 min'1.
Amostras para controle de processo são tiradas regularmente e paradas pordiluição com 9 vol de uma solução de 17% de água, 17% de acetonitrila e64% de ácido trifluoroacético. O progresso da reação é seguido por LC-MS.Depois que o rendimento máximo é alcançado, a reação é acidificada atravésde adição de ácido trifluoroacético a uma concentração final de 50% (v/v). Istopara a reação e no mesmo tempo quantitativamente remove o grupo protetorBoc. O produto de reação é purificado através de cromatografia.
Exemplo 15: purificação dosderivados de AVE amidados.
A mistura de reação das reações de acoplamento é subseqüen-temente separada através de cromatografia de RP usando AmberchromCG300 XT 20 como material de suporte, e o peptídeo alvo amidado é sub-seqüentemente isolado da fração eluída apropriada através de uma etapade permuta de íon com fonte 30S como suporte. Depois de dessalinizaçãoem colunas Amberchrom, o produto é disponível para formulação como me-dicamento. A identidade da estrutura do produto foi demonstrada através deanálise de MALDI-MS e RMN.
Exemplo 16: preparação de Leu-hirudim -as Lys-Arq-NΗ2.
O Exemplo 1 do pedido de patente EP-A 1 216 259 descreve apreparação de um plasmídeo de expressão que permite a secreção de Leu-hirudin em sobrenadantes bacterianos. DNA do plasmídeo é empregadocomo padrão em uma PCR padrão. O iniciador dianteiro usado na reação éa seqüência smompaf2 descrita no exemplo. O iniciador reverso usado é umoligonucleotídeo hir_lys66_rev (SEQ ID N0.: 21) que possui a seguinte se-qüência:
5 ' - Illll TAAGC TTCTATTATT TCTGAAGGTA TTCCTCAGGG - 3'
Hind3
O códon sublinhado na mesma codifica para lisina. A seqüênciade posição 22 a posição 40 (extremidade) é complementar o segmento deseqüência 178-195 da seqüência representada na Tabela 1 do pedido EP-A1 216 259.
Tal como descrito no exemplo, a PCR é realizada e o produto édigerido com as enzimas de restrição EcoRI e Hind3 e inserido no vetor cor-respondentemente aberto pJF118. Depois da caracterização, DNA é trans-formada em E. coli K12 tal como no Exemplo 11 do pedido de patente EP-A1 216 259, e o produto intermediário é expressado e purificado. Em seguida,correspondendo ao Exemplo 13 do presente pedido, correspondendo àsmolaridades, a reação ocorre com argininamida para produzir Leu-hirudin^esLys-Arg-NH2. Se a expressão é realizada diretamente na cepa MC1061 u-sada como cepa hospedeira intermediária, o produto é encontrado tambémno espaço periplasmático. Isto torna necessário uma ruptura de célula deacordo com métodos conhecidos como etapa de preparação adicional paraisolamento do produto intermediário.
Exemplo 17: análise de reações de acoplamento de peptídeo em derivadosde AVE.
As reações de acoplamento de acordo com os Exemplos 8 a 14são seguidas analiticamente através de RP-HPLC em uma coluna de Wa-ters de 5 μM, 150 χ 4,6 mm, Symmetry 300. Ácido fórmico (eluente A) a0,1% (v/v) e acetonitrila com ácido fórmico (eluente B) a 0,1% servem comoeluentes. Um gradiente linear de 20 a 50% de B durante 15 min em umatemperatura de coluna de 60°C e uma taxa de fluxo de 1 mL/min é usadapara eluição. Detecção ocorre em 215 nm. Normalmente 5 μL de uma a-mostra de reação diluída de 1:25 são injetados. Os derivados de AVE des-protegidos são detectados em tempos de retenção entre 7 e 10 min.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH
<120> Método para amidação de polipeptídeos com C-terminais deaminoácido básico por meio de mecanismo de endoproteases específ
<130> DE 2005/042
<140>
<141>
<160> 21
<170> PatentIn vide 2.1<210> 1<211> 44<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
derivado de exendina-4<400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
15 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys35 40
<210> 2<211> 40<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
derivado de exendina-4<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys35 40
<210> 3<211> 40<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
derivado de exendina-4<400> 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Arg35 40
<210> 4<211> 44<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
derivado de exendina-4<400> 4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Arg35 40
<210> 5<211> 40<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
derivado de exendina-4<400> 5
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Arg Lys35 40
<210> 6<211> 192<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: gene para
seqüência ID No. 7<400> 6
ttttttaagc ttgcacggtg aaggtacctt cacctccgac ctgtccaaac agatggaaga 60agaagctgtt cgtctgttca tcgaatggct gaaaaacggt ggtccgtcct ccggtgctcc 120gccttcgaaa aagaagaaaa agtgataata gcatgcacgt gcggccgcac ctggtcgacg 180aattcaaaaa aa 192
<210> 7<211> 44<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
derivado de exendina-4<400> 7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys35 40
<210> 8<211> 23<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 8
ttttttaagc ttgcacggtg aag 23
<210> 9<211> 59<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 9
cttccatctg tttggacagg tcggaggtga aggtaccttc accgtgcaag cttaaaaaa 59<210> 10<211> 69<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 10
ggacggacca ccgtttttca gccattcgat gaacagacga acagcttctt cttccatctg 60tttggacag 69
<210> 11<211> 69<212> DNA
<213> seqüência artificial<220><223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 11
cgtgcatgct attatcactt tttcttcttt ttcgaaggcg gagcaccgga ggacggacca 60ccgtttttc 69
<210> 12<211> 52<212> DNA
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<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 12
ttttttgaat tcgtcgacca ggtgcggccg cacgtgcatg ctattatcac tt 52<210> 13<211> 314<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: gene para
seqüência ID No.14<400> 13
ggaaacagaa ttcatggcgc cgacctcttc ttctaccaaa aagctcaact gcaactggaa 60cacctgctgc tggacctgca gatgatcctg aacggtatç.a acaactacaa aaacccgaaa 120ctgacgcgta tcgacgatga cgataaacac ggtgaaggta ccttcacctc cgacctgtcc 180aaacagatgg aagaagaagc tgttcgtctg ttcatcgaat ggctgaaaaa cggtggtccg 240tcctccggtg ctccgccttc gaaaaagaag aaaaagtgat aatagcatgc acgtgcggcc 300gcaagcttaa aaaa 314
<210> 14<211> 88<212> PRT
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial:
proteína de fusão<400> 14Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu
35 40 45
Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val
50 55 60
Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala65 70 75 80
Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys85
<210> 15<211> 39<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 15
cgtatcgacg atgacgataa acacggtgaa ggtaccttc 39
<210> 16<211> 36<212> DNA
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<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 16
gtgtttatcg tcatcgtcga tacgcgtcag tttcgg 36
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<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 17
tgagcggata acaatttcac ac 22
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<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüencia ciirtif icicil: íníciadoir<400> 18
ttttttaagc ttgcggccgc acgtgcatgc tattatcact t 41
<210> 19<211> 50<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 19
ttttttgcgg ccgcacgtgc atgctattat catttcgaag gcggagcacc<210> 20<211> 52<212> DNA
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ttttttgcgg ccgcacgtgc atgctattat catacgcgaa ggcggagcac<210> 21<211> 40<212> DNA
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<223> descrição da seqüência artificial: iniciador<400> 21
ttttttaagc ttctattatt tctgaaggta ttcctcaggg 40
Claims (15)
1. Processo para preparo de peptídeos di ou polibásicos C-terminalmente amidados da fórmula geral I(AA)n-Xm-NH2 (I),onde(AA)n é um peptídeo consistindo em η aminoácidos do mesmo oudiferente tipo, no qualAA é um aminoácido ou análogos ou derivados do mesmo;η é um número inteiro entre 3 e 2000; eX é um aminoácido básico ou análogos ou derivados do mesmo;m é um número inteiro entre 2 e 15,no qualum composto da fórmula geral II(AA)n-Xp (II) é reagido com um composto da fórmula geral III(X)q-NH2 (III)na qual AA1 η e X são tais como definidos acima, eρ e q são números inteiros, eρ + q = m,na presença de uma enzima possuindo a atividade biológica de tripsina, eonde apropriado o composto resultante da fórmula I é submetido à purifica-ção química de proteína.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que m é umnúmero inteiro entre 2 e 10.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que m é umnúmero inteiro entre 2 e 6.
4. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a-3, em que η é um número inteiro entre 10 e 1000.
5. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a-4, em que η é um número inteiro entre 15 e 500.
6. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a-5, em que η é um número inteiro entre 20 e 400.
7. Processo de acordo com quaisquer das reivindicações de 1 a-6, em quea) um peptídeo de fusão que compreende um ou mais compos-tos da fórmula Il como parte do peptídeo de fusão é expressado;b) os compostos da fórmula Il são liberados do referido peptídeode fusão através de clivagem química ou enzimática;c) o intermediário de etapa b) é, onde apropriado depois de puri-ficação química de proteína, reagido na presença de uma enzima possuindoa atividade biológica de tripsina com um composto da fórmula III; ed) onde apropriado o composto resultante da fórmula I é subme-tido à purificação química de proteína e isolamento.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a elimina-ção do composto da fórmula Il da proteína de fusão ocorre através de me-canismo de haleto de cianogênio, enterocinase, fator Xa, Genenase, trombi-na ou tripsina.
9. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a proteínade fusão é expressada em um sistema de expressão selecionado do grupocompreendendo E. coli, S. carnosus, Salmonella, Bacillus subtilis, Pseudo-monas fluorescens, K. lactis, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe e S.cerevisiae.
10. Processo para preparo peptídeos de di ou polibásicos C-terminalmente amidados da fórmula geral I de acordo com uma ou mais rei-vindicações de 1 a 2, em que os referidos peptídeos da fórmula geral I pos-suem a atividade biológica de GLP-1 ou derivados ou análogos do mesmo.
11. Processo de acordo com quaisquer reivindicações de 1 a 10,em que o composto da fórmula I é caracterizado pela fórmula IV:HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPS(X)m-NH2 (IV).
12. Processo de acordo com quaisquer reivindicações de 1 a 11,em que o composto da fórmula I é caracterizado pela seqüência:HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2(SEQ ID N°.1);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ IDΝ°. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ IDN°. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2(SEQ ID N°. 4) ouHGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ IDN°. 5).
13. Composto da fórmula I caracterizado pela seqüência:HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ IDN°. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ IDN°. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2(SEQ ID N°. 4) ouHGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ IDN°. 5).
14. Uso de um composto como definido na reivindicação 12 co-mo medicamento, especialmente em formulações de depósito.
15. Medicamento compreendendo um ou mais dos compostosda fórmula I caracterizado pelas seqüências:HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK-NH2 (SEQ IDN°. 2);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKR-NH2 (SEQ IDN°. 3);HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKR-NH2(SEQ ID N°. 4) ouHGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSRK-NH2 (SEQ IDN°. 5).
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