BRPI0616720A2

BRPI0616720A2 - método para o diagnóstico ou prognóstico de sepse em um paciente, kit para diagnóstico ou prognóstico, ou monitoração, de sepse em um paciente, e, dispositivo para o diagnóstico ou prognóstico de sepse

Info

Publication number: BRPI0616720A2
Application number: BRPI0616720-9A
Authority: BR
Inventors: Song Shi; Thomas Gentle; Richard Moore
Original assignee: Becton Dickinson Co
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2011-06-28
Also published as: DE602006021768D1; EP1940231B1; AU2006294481A1; US20070111316A1; AU2006294481B2; WO2007038758A3; JP2009510450A; EP1940231A4; CA2623523C; US8183050B2; EP1940231A2; ATE507720T1; KR20080068824A; JP5183480B2; WO2007038758A2; US20120301910A1; CA2623523A1; KR101281298B1

Abstract

MéTODO PARA O DIAGNóSTICO OU PROGNóSTICO DE SEPSE EM UM PACIENTE, KIT PARA DIAGNóSTICO OU PROGNóSTICO, OU MONITORAçãO, DE SEPSE EM UM PACIENTE, E, DISPOSITIVO PARA O DIAGNóSTICO OU PROGNóSTICO DE SEPSE. A presente invenção provê métodos e composições úteis para o diagnóstico ou prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica, tal que sepse.

Description

"MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO DE SEPSE EMUM PACIENTE, KIT PARA DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO, OUMONITORAÇÃO, DE SEPSE EM UM PACIENTE, E, DISPOSITIVOPARA O DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO DE SEPSE"

1. Campo da Invenção:

A presente invenção refere-se a métodos e a composiçõesúteis, por exemplo, para o diagnóstico ou prognóstico de uma condiçãoinflamatória sistêmica em um paciente. A condição inflamatória sistêmicapode ser, por exemplo, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, sepse,sepse severa, choque séptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade.

2. Fundamentos da Invenção:

A detecção precoce de uma condição de doença possibilita, demodo típico, um tratamento terapêutico mais efetivo, com um resultadoclínico correspondentemente mais favorável. Em muitos casos, no entanto, adetecção precoce de sintomas de doença é problemática, devido àcomplexidade da doença; portanto, uma doença pode ter se tornadorelativamente avançada, antes que o seu diagnóstico seja possível. Condiçõesinflamatórias sistêmicas representam uma tal classe de doenças. Estascondições, de modo particular a sepse, de modo típico, mas não sempreresultam de uma interação entre um microorganismo patogênico e o sistemade defesa do hospedeiro, que dispara uma resposta inflamatória excessiva edesregulada no hospedeiro. A complexidade da resposta do hospedeirodurante a resposta inflamatória sistêmica tem complicado os esforços emdireção ao entendimento da patogênese da doença (revisto em Healy, 2002,Ann. Pharmacotehr. 36: 648- 54). Um entendimento incompleto dapatogênese da doença, por sua vez, contribui para a dificuldade em que sejamencontrados biomarcadores de diagnóstico úteis. O diagnóstico precoce econfiável é imperativo, no entanto, devido à progressão bastante rápida dasepse em uma condição que ameaça a vida.

O desenvolvimento da sepse em um paciente segue um cursobem descrito, progredindo a partir da síndrome de resposta inflamatóriasistêmica ("SIRS") negativa para ("SIRS") para positiva para ("SIRS"), eentão para a sepse, que pode então progredir para a sepse severa, choqueséptico, disfunção orgânica múltipla ("MOD") e, finalmente, a mortalidade.

Documentar a presença dos microorganismos patogênicos, quesão clinicamente relevantes para a sepse, foi verificado como sendo difícil. Osmicroorganismos causadores são detectados, de modo típico, através dacultura do sangue do paciente, saliva, urina, secreção de ferida, superfícies decateter em linha na residência, etc. Os microorganismos causadores noentanto, podem resistir apenas em certos microorganismos do corpo, de talmodo que o material específico, que é cultivado, pode não conter osmicroorganismos contaminantes. A detecção pode ser ainda adicionalmentecomplicada devido a baixos números de microorganismos no sítio deinfecção. Baixos números de patógenos no sangue representam um problemaparticular para o diagnóstico da sepse através da cultura do sangue. Em umestudo por exemplo, resultados de cultura positivos foram obtidos em apenas17% dos pacientes que apresentam manifestações clínicas de sepse (Rangel-Frausto et al., 1995, JAMA 273: 117-123). O diagnóstico pode ser aindaadicionalmente complicado através da contaminação das amostras pormicroorgamismos não-patogênicos. Por exemplo, apenas 12, 4% dosmicroorganismos detectados foram clinicamente significativos em um estudode 707 pacientes com septicemia (Wenstein et al., 1997, Clinicai InfectiousDiseases, 24: 584- 602).A dificuldade no diagnóstico precoce da sepse é refletida pelaalta morbidez e pela mortalidade associadas com a doença. A sepse é, demodo corrente, a décima causa principal de morte nos Estados Unidos e é, demodo especial, prevalecente entre pacientes hospitalizados em unidades detratamento intensivo não-coronárias (ICUs), onde ela é a causa de morte maiscomum. A taxa de mortalidade total é tão elevada quanto de 35%, com umaestimativa de 750.00 casos por ano ocorrendo apenas nos Estados Unidos. Ocusto anual para o tratamento de sepse, apenas nos Estados Unidos, é daordem de bilhões de dólares.

A maior parte dos sistemas de classificação de sepse existentesou modelos de prognóstico predizem apenas o risco de complicações emúltimo estágio, incluindo a morte, em pacientes que já são consideradossépticos e que prognosticam o desenvolvimento da sepse em si mesmo.

Muitas vezes, o diagnóstico de sepse é baseado na suspeita clínica com umsistema de classificação empírico, tal que o APACHE II (Knaus et al., 1985,Crit. Care Med., 13: 818 -829), seguido pela cultura do sangue. Pode levar48 horas ou mais para que sejam confirmadas quaisquer infecções sistêmicas.

A esta altura, e muitas vezes muito tarde para que muitos pacientes sejamsalvos. Se o diagnóstico ou prognóstico de sepse puder ser efetuado de ummodo precoce, o tratamento pode ser tornado disponível, de modo a prevenirou a retardar o progresso da sepse a uma sepse severa ou ao choque séptico.

Existe, portanto, uma necessidade quanto a métodos dediagnóstico sistêmico de condições inflamatórias, incluindo a sepse, usandotécnicas que apresentam especificidade e sensibilidade satisfatória, de modosuficientemente precoce para permitir a intervenção e a prevenção efetivas.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção é baseada, em parte, nadescoberta de que a quantidade de lisofosfatidilcolina total em uma amostra apartir de um paciente pode ser usada para o diagnóstico ou prognósticorápido, sensível e preciso de uma condição inflamatória sistêmica em umpaciente. Em alguns aspectos da invenção, a lisofosfatidilcolina total em umaamostra a partir de um paciente é usada para avaliar a presença de, ou o risco,quanto a uma condição inflamatória sistêmica. Como mostrado nos exemplosabaixo, os métodos e as composições da invenção podem ser usados para odiagnóstico ou prognóstico da condição inflamatória sistêmica. A condiçãoinflamatória sistêmica pode ser qualquer condição inflamatória sistêmicaconhecida daqueles versados na arte, incluindo a síndrome da respostainflamatória sistêmica ("SIRS"), sepse, sepse severa, choque séptico,disfunção orgânica múltipla ("MOD") e mortalidade.

Em certas modalidades, a lisofosfatidilcolina total em umaamostra do paciente é avaliada, de modo a avaliar a presença, ou o risco,quanto a uma condição inflamatória sistêmica. Conforme aqui descrito, foidescoberto que a quantidade de lisofosfatidilcolina total em uma amostra deum paciente pode estar correlacionada com o início de uma condiçãoinflamatória sistêmica, e pode até mesmo indicar a condição antes de seuinício. Como um resultado, em certas modalidades, a lisofosfatidilcolina totalem uma amostra a partir do paciente pode ser usadas como um prognósticopara uma condição inflamatória sistêmica. A avaliação pode ocorrer deacordo com qualquer técnica para a avaliação da lisofosfatidil colina totalconhecida daqueles versados na arte. Técnicas exemplares são aqui descritas.No entanto, a presente invenção provê métodos baseados em qualquer técnicade avaliação da lisofosfatidilcolina total, evidente para aqueles versados naarte.

Em um outro aspecto, a presente invenção é baseada, em parte,na descoberta de uma classe de biomarcadores de lisofosfatidilcolina, que sãoúteis para o diagnóstico ou prognóstico rápido, sensível e preciso de umacondição inflamatória sistêmica em um paciente. Em aspectos da invenção, aavaliação de um biomarcador da invenção no paciente é usada de modo aavaliar a presença, ou o risco, quanto à condição inflamatória sistêmica.Como mostrado nos exemplos abaixo, os métodos e composições da invençãopodem ser usados para o diagnóstico ou prognóstico de uma condiçãoinflamatória sistêmica, com a precisão de até 80%, ou mais, em um períodotão curto quanto, por exemplo, ou de até mesmo, seis horas. A condiçãoinflamatória sistêmica pode ser qualquer condição inflamatória sistêmicaconhecida daqueles de habilidade na arte, incluindo a síndrome de respostainflamatória sistêmica "SIRS"), sepse, sepse severa, choque séptico edisfiinção orgânica múltipla ("MOD").

Em certas modalidades, o biomarcador é uma l-O-acil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina. O grupo acila pode ser qualquer grupo acilaconhecido daqueles versados na arte. Em certas modalidades, o grupo acila éacila C14-22. Em outras modalidades, o grupo acila é acila C16-18· Emmodalidades particulares, o grupo acila é acila C16- Em uma modalidadepreferida, o grupo acila é palmitoíla. Em outras modalidades particulares, ogrupo acila é acila C18- Em uma modalidade preferida, o grupo acila éestearoíla. O biomarcador pode ser qualquer forma de biomarcador a partir deum paciente, por exemplo, qualquer sal ou solvato do biomarcador pode seridentificado por aqueles versados na arte.

Em certas modalidades, o biomarcador é um composto deacordo com a fórmula (I):

<formula>formula see original document page 6</formula>

ou um sal ou solvato do mesmo. Na fórmula (I), R pode serqualquer grupo acila conhecido daqueles de habilidade na arte. Em certasmodalidades, R é acila C14.22· Em ouras modalidades, R é acila Ciô-is· Emmodalidades particulares, R é acila Ri6. Em uma modalidade preferida, R épalmitoíla. Em outras modalidades particulares, R é acila Cis- Em umamodalidade preferida, R é estearoíla.

Sais exemplares da fórmula (I) são providos pela fórmula (Ia):

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que o referido sal pode ser coordenado com qualquer ânionorgânico ou inorgânico fisiológico, ou qualquer cátion orgânico ou inorgânicofisiológico, ou ambos, conhecidos daqueles versados na arte. Ânionsfisiológicos exemplares incluem cloreto, brometo, fosfato, acetato, carbonato,bicarbonato e sulfato. Cátions fisiológicos exemplares incluem sódio,potássio, cálcio, magnésio e amônio.

Em certos aspectos, o biomarcador no paciente é avaliado demodo a avaliar a presença, ou o risco, quanto à condição inflamatóriasistêmica. A avaliação pode ocorrer de acordo com qualquer método paraavaliar um biomarcador, conhecido daqueles versados na arte. Em certasmodalidades,

a quantidade do biomarcador é medida em um fluido de umpaciente. No entanto, a presente invenção provê métodos baseados emqualquer técnica de avaliação de um biomarcador da invenção, evidente paraaqueles de habilidade na arte.

Na descrição que se segue, o termo lisofosfatidilcolina podereferir-se à lisofosfatidilcolina total ou a um marcador de lisofosfatidilcolina,a não ser que especificado de outro modo. Naturalmente, a presente invençãoprovê o prognóstico ou diagnóstico com base na lisofosfatidilcolina total, oprognóstico ou diagnóstico com base em um ou mais biomarcadores delisofosfatidilcolina da invenção, e o prognóstico ou diagnóstico com base nalisofosfatidilcolina total, junto com um ou mais biomarcadores delisofosfatidilcolina da invenção.

Em algumas modalidades, uma pluralidade de medições delisofosfatidilcolina no paciente são efetuadas ao longo do tempo. Osintervalos de tempo podem ser, por exemplo, de 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12horas, 24 horas ou outros intervalos de acordo com o julgamento daqueleversados na arte. Nestas modalidades, as quantidades relativas delisofosfatidilcolina são avaliadas para o diagnóstico ou prognóstico dacondição inflamatória sistêmica por aquele de habilidade ordinária na arte.

Em modalidades particulares, quantidades decrescentes de lisofosfatidilcolinaindicam o risco quanto à condição inflamatória sistêmica, e quantidadescrescentes de lisofosfatidilcolina total indicam o risco decrescente quando àcondição inflamatória sistêmica.

Em modalidades vantajosas, uma única amostra a partir dopaciente pode ser suficiente para o diagnóstico ou o prognóstico da condiçãoinflamatória sistêmica. A quantidade de lisofosfatidilcolina pode sercomparada a um ou mias biomarcadores presentes na amostra, que sãoconhecidos daqueles versados na arte como devendo ser mantidos em umaquantidade relativamente constante na amostra em indivíduos similares aopaciente. A quantidade de lisofosfatidilcolina da invenção pode sedeterminada contra este padrão interno para o diagnóstico ou o prognóstico dacondição inflamatória sistêmica por aquele versado na arte. Em modalidadesparticulares, baixas quantidades de lisofosfatidilcolina indicam o riscoaumentado quando à condição inflamatória sistêmica, e altas quantidades delisofsfatidilcolina indicam o risco reduzido quanto à condição inflamatóriasistêmica.

Em ainda outras modalidades, a avaliação é baseada em umacomparação da quantidade de lisofosfatidilcolina a uma quantidadereferencial de lisofosfatidilcolina. A quantidade referencial pode ser, porexemplo, a quantidade de lisofosfatidilcolina em um indivíduo referencial quemanifesta, ou que irá manifestar, dentro de um período de tempo definido, umou mais sintomas da condição inflamatória sistêmica conhecida. A quantidadepode ser, por exemplo, um valor absoluto ou um valor absoluto com umamargem de erro ou uma faixa de valores, conforme determinado por aquelesversados na arte. Em certas modalidades, o indivíduo referencial exibe, ou iráexibir sintomas de SIRS, sepse, sepse severa, choque séptico, ou MOD ousem sintomas de uma condição inflamatória sistêmica. Em modalidadesparticulares, baixas quantidades de lisofosfatidilcolina (por exemplo, relativasa uma quantidade referencial) indicam um risco aumentado quanto à condiçãoinflamatória sistêmica, e altas quantidades de lisfosfatidilcolina indicam orisco reduzido quando à condição inflamatória sistêmica.

De um modo vantajoso, a quantidade referencial não precisaser determinada per aquele que executa um método da invenção. Em vezdisso, a quantidade referencial de lisofosfatidilcolina pode ser identificadaatravés da consulta de dados disponíveis para aqueles versados na arte. Taisdados podem ser obtidos a partir de qualquer fonte disponível para aquelesversados na arte. Em certas modalidades, as fontes podem ser desenvolvidascom quantidades referenciais de lisofosfatidilcolina coletadas por aqueles dehabilidade na arte, de acordo com os métodos aqui descritos.

Em certas modalidades, a quantidade referencial é de umindivíduo referencial, que apresenta sintomas da condição inflamatóriasistêmica. O indivíduo referencial pode apresentar sintomas de SIRS, sepse,sepse severa, choque séptico, MOD ou mortalidade, ou não apresenta rsintomas de uma condição inflamatória sistêmica. Em certas modalidades, aquantidade referencial pode ser avaliada em um período de tempo, antes ouapós a apresentação dos sintomas. Por exemplo, em uma modalidadevantajosa, uma quantidade referencial pode ser a quantidade medida em umindivíduo positivo para SIRS, 12, 24, 36 ou 48 horas antes do início da sepse.A medição de tais quantidades referenciais está dentro da habilidade daquelesversados na arte.

Em outras modalidades, as quantidades referenciais são deuma pluralidade de indivíduos, que apresentam sintomas de uma ou maiscondições inflamatórias sistêmicas. As quantidades referenciais podem sercalculadas de acordo com quaisquer métodos estatísticos conhecidos daquelesde habilidade na arte. Por exemplo, as quantidades referenciais podem serbaseadas na média estatística de quantidades referenciais a partir deindivíduos referenciais, que apresentam uma condição inflamatória sistêmica.Em modalidades vantajosas, a comparação é efetuada em um valor, ou faixade valores, em relação à quantidade de lisofosfatidilcolina. O valor, ou faixade valores, podem ser obtidos, como aqui descrito, e tornados disponíveispara aquele versado na arte dos métodos da invenção. Em modalidadesparticulares, as baixas quantidades de lisofosfatidilcolina (por exemplo,relativas a uma quantidade referencial) indicam o risco aumentado quanto àcondição inflamatória sistêmica, e altas quantidades de lisofosfatidilcolinaindicam o risco reduzido quanto à condição inflamatória sistêmica.

A comparação pode ser efetuada de acordo com qualquertécnica para comparar quantidades de biomarcadores conhecidas daqueles dehabilidade na arte. Em uma modalidade, o diagnóstico ou o prognóstico deuma condição inflamatória sistêmica é baseado na diferença entre aquantidade de lisofosfatidilcolina no paciente e a quantidade referencial. Emcertas modalidades, a diferença entre a quantidade de lisofosfatidilcolina nopaciente e a quantidade referencial está correlacionada inversamente com orisco quanto à condição inflamatória sistêmica. Ainda em outras modalidades,a quantidade referencial é um corte - em outras palavras, o paciente pode seravaliado como tendo ou como tendo um risco para a condição inflamatóriasistêmica se a quantidade de lisofosfatidilcolina no paciente for inferior a umaquantidade referencial de corte. Tais quantidade referenciais de corte podemser calculadas de acordo com os métodos aqui descritos.

A quantidade de lisofosfatidilcolina total no paciente pode serdeterminada de acordo com qualquer técnica conhecida daquele de habilidadena arte, sem qualquer limitação. Em certas modalidades, aquele de habilidadepode medir uma quantidade, que está correlacionada à quantidade delisofosfatidilcolina total em uma amostra. Por exemplo, em modalidadesparticulares, aquele de habilidade na arte pode medir a lisfosfatidilcolina livretotal, a lisofosfatidilcolina ligada total, ou a lisofosfatidilcolina livre e ligadatotais na amostra, de modo a indicar a quantidade de lisofosfatidilcolina totalna amostra. Em outras palavras, em certas modalidades, a medição delisofosfatidilcolina livre ou ligada, ou tanto livre como ligada, pode sercorrelacionada à quantidade de lisofosfatidilcolina total. Em certasmodalidades, a técnica para avaliar a lisofosfatidilcolina total não é críticapara a invenção e não precisa ser executada por aquele que pratique osmétodos nesta. Por exemplo, em modalidades particulares, os métodos dainvenção podem compreender o estágio único de comparar a quantidade delisofosfatidilcolina total em um paciente à quantidade de lisofsofatidilcolinatotal referencial, de modo a avaliar o risco quanto à uma condiçãoinflamatória sistêmica, sem considerar como qualquer outra quantidade émedida. Em outras modalidades, a lisosfatidilcolina total do paciente éavaliada através de uma técnica aqui descrita, seguida pela comparação a umalisofosfatidilcolina total referencial, de modo a avaliar o risco quanto a umacondição inflamatória sistêmica. Em certas modalidades, a lisfosfatidilcolinatotal é avaliada através de espectrometria, cromatografia, imunoensaio,eletroforese ou ensaio enzimático, tal como descrito, de modo detalhado,abaixo.

Em um aspecto, a presente invenção provê métodosfluorescentes para testar a lisofosfatidilcolina total em uma amostra de umpaciente. Em certas modalidades, os métodos compreendem contatar aamostra do paciente com um ou mais reagentes, capazes de gerar um produtofluorescente, indicativo da lisofosfatidilcolina total na amostra. Os métodospodem ser usados para detectar a presença de lisofosfatidilcolina total ou paradetectar a quantidade de lisofosfatidilcolina total, ou ambos, na amostra. Emmodalidades particulares, a amostra é colocada em contato com um substratofluorogênico de um ou mais reagentes. Este substrato fluorogênico pode serconvertido ao produto fluorescente, indicando a lisofosfatidilcolina total. Emmodalidades vantajosas, os reagentes compreendem peroxidase, colinaoxidase, glicerofosfatidilcolina diesterase e lisofosfolipase. Um substratofluorogênico útil é 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina, um composto que podeser convertido ao produto fluorescente 7-hidróxi-3H- fenoxazin-3-ona. Demodo vantajoso, tais métodos podem prover a sensibilidade necessária para adetecção de baixas quantidades de lisofosfatidilcolina total em pacientestendo, ou em risco de, uma condição inflamatória sistêmica.

A quantidade do biomarcador no paciente pode serdeterminada de acordo com qualquer técnica conhecida daqueles dehabilidade na arte, sem limitação. Em certas modalidades, a técnica paraavaliar o biomarcador não é crítica para a invenção e não precisa serexecutada por aquele que pratique os métodos nesta. Por exemplo, emmodalidades particulares, os métodos da invenção podem compreender oestágio único de comparar o biomarcador em um paciente a um biomarcadorreferencial, de modo a avaliar o risco quanto a uma condição inflamatóriasistêmica, sem condição a que biomarcadores estejam sendo medidos. Emmodalidades adicionais, o biomarcador do paciente é avaliado através de umatécnica aqui descrita, seguida pela comparação do biomarcador em umpaciente a um biomarcador referencial, de modo a avaliar o risco quanto auma condição inflamatória sistêmica. Em certas modalidades, o biomarcadoré avaliado através de espectrometria, cromatografia, imunoensaio oueletroforese, tal como descrito de modo detalhado, abaixo.

A quantidade de lisofosfatidilcolina pode ser medida emfluidos ou tecidos do paciente, como aqui provido. Processos para preparar ofluido ou o tecido, por exemplo, processos para a extração ou purificação delisofosfatidilcolina são aqui descritos. Além disso, técnicas para a medição delisofosfatidilcolina são aqui providas.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos paramonitorar uma condição inflamatória sistêmica em um paciente. Em taismétodos, a avaliação de lisofosfatidilcolina é usada para monitorar umacondição inflamatória sistêmica no paciente. Em tais métodos, as alteraçõesna quantidade de lisofosfatidilcolina indicam alterações na condiçãoinflamatória sistêmica. Por exemplo, em certas modalidades, quantidadescrescentes de lisofosfatidilcolina indicam severidade diminuída ou menosrisco para a condição inflamatória sistêmica, e quantidades decrescentes delisofosfatidilcolina indicam severidade aumentada ou o risco aumentado paraa condição inflamatória sistêmica. Em algumas modalidades, a avaliação delisofosfatidilcolina pode indicar a conversão a partir de uma condiçãoinflamatória sistêmica para outra, tal que SIRS, sepse, sepse severa, choqueséptico, MOD ou mortalidade, ou sem uma condição inflamatória sistêmica.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos paramonitorar o tratamento de uma condição inflamatória sistêmica em umpaciente. Em tais métodos, a avaliação de lisofosfatidilcolina é usada paramonitorar a condição inflamatória sistêmica no paciente. Em tais métodos, asalterações na quantidade de lisofosfatidilcolina indicam alterações nacondição inflamatória sistêmica. Por exemplo, em certas modalidades, oaumento das quantidades de lisofosfatidilcolina indicam a severidadediminuída ou menos risco para a condição inflamatória sistêmica, equantidades decrescentes de lisofosfatidilcolina total indicam a severidadeaumentada o rico aumentado quanto à condição inflamatória sistêmica.

De modo vantajoso, o tratamento da condição inflamatóriasistêmica pode ser ajustado com base na monitoração. Em algumasmodalidades, a avaliação da lisofosfatidilcolina pode indicar a conversão aparir de uma condição inflamatória sistêmica para outra, tal que SIRS, sepse,sepse severa, choque séptico, MOD, mortalidade ou sem condiçãoinflamatória sistêmica. Em modalidades preferidas, um paciente, que énegativo para SIRS pode ser monitorado para a conversão para SIRS ou sepseou outra condição inflamatória. Em outras modalidades preferidas, umpaciente que pode positivo para SIRS pode ser monitorado para a conversãopara sepse ou outra condição inflamatória sistêmica, ou para a conversão paranegativo para SIRS.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê kits para odiagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica. Emalgumas modalidades, os kits compreendem uma composição adequada para aavaliação de lisofosfatidil colina. Os kits podem ainda compreender um rótuloou rotulação com instruções para o uso na avaliação de lisofosfatidilcolinatotal para o diagnóstico ou o prognóstico de uma ou mais condiçõesinflamatórias sistêmicas. Em certas modalidades, o kit pode compreender umrótulo ou rotulação com quantidade referenciais, ou citações em relação a taisquantidades referenciais, de lisofosfatidilcolina, de modo a facilitar oprognóstico ou o diagnóstico de uma condição inflamatória sistêmica com acomposição do kit.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

A Figura 1 provê um sistema exemplar da invenção;

A Figura 2 provê análises de curso de tempo do biomarcador496.3;

A Figura 3 provê análises de curso de tempo do biomarcador

518.3;

A Figura 4-1 ilustra a sensibilidade e a especificidade contra olimite em um modelo de desempenho de acordo com a invenção;

A Figura 4-2 ilustra a evolução de parâmetros de inclusão decaracterística durante a otimização de métodos da invenção.

A Figura 4-3 ilustra a sensibilidade e a especificidade contra olimite em um modelo de desempenho de acordo com a invenção.

As Figuras 4-4 e 4-5 ilustram a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização de métodos da invenção.

A Figura 4-6 ilustra a sensibilidade e a especificidade contra olimite em um modelo de desempenho de acordo com a invenção.

As Figuras 4-7 a 4-9 ilustra a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização de métodos da invenção.

A Figura 5-1 ilustra a sensibilidade e a especificidade contra olimite em um modelo de desempenho de acordo com a invenção.

A Figura 5-2 ilustra a evolução de parâmetros de inclusão decaracterística durante a otimização de métodos da invenção.

A Figura 5-3 ilustra a sensibilidade e a especificidade contra olimite em um modelo de desempenho de acordo com a invenção.

As Figuras 5-4 e 5-5 ilustram a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização de métodos da invenção.

A Figura 5-6 ilustra a sensibilidade e a especificidade contra olimite em um modelo de desempenho de acordo com a invenção;

As Figuras 5-7 a 5-9 ilustram a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização de métodos da invenção.

A Figura 6 provê um esquema para a detecção delisofosfatidilcolina de acordo com as modalidades da invenção; eA Figura 7 provê lisofosfatidilcolina detectada de modofluorescente em amostras a partir de pacientes, que apresentaram sintomas deSIRS ou sepse.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

5.1.Definições

Como aqui usados, os termos que se seguem terão ossignificados que se seguem:

O termo "paciente" refere-se a animais, tais que mamíferos,incluindo, mas não limitados a, primatas (por exemplo, humanos), vacas,ovelhas, cabras, cavalos, cachorros, gatos, coelhos, ratos, camundongos e ossimilares. Em modalidades preferidas, o paciente é humano. O termo"paciente" é intercambiável com um paciente humano, a não ser quemencionado de outro modo.

"Síndrome de resposta inflamatória sistêmica", ou "SIRS",refere-se a uma resposta clínica a uma variedade de insultos clínicos severos,conforme manifestado por duas ou mais das condições que se seguem, dentrode um período de 24 horas:

temperatura do corpo superior a 38°C (100, 4 0F), ou inferior a36°C (96,8°F);

freqüência cardíaca (HR) superior a 90 batimentos/minuto;taxa respiratória (RR) superior a 20 respirações/minuto, ouPCo2 inferior a 32 mmHg, ou que requeira ventilação mecânica; e

- contagem de células brancas sangüíneas (WBC) ou superiora 12,0 χ 10 L ou inferior a 4,0 χ 109/L ou tendo mais do que 10% de formasde faixa imaturas.

Estes sintomas de SIRS representam uma definição deconsenso de SIRS, que pode ser modificada ou suplantada por outrasdefinições no futuro. A presente definição é usada para esclarecer a práticaclínica corrente e não representa um aspecto crítico da invenção (vide, porexemplo, American College of Chest Physicians/Society of Criticai CareMedicine Consensus Conference: Definitions for Sepsis and Organ Failureand Guidelines for the Use of Innovative Therapies in Sepsis, 1992, Crit. CareMed., 20, 864 - 874, cuja totalidade dos conteúdos são incorporados a este, atítulo referencial).

Um paciente com SIRS tem uma apresentação clínica, que éclassificada como SIRS, como acima definido, mas não é considerado, a partirde um ponto de vista clínico, como sendo séptico. Os métodos paradeterminar que pacientes estão em risco de desenvolver a sepse são bemconhecidos por aqueles versados na arte. Tais pacientes incluem, porexemplo, aqueles na unidade de tratamento intensivo ("ICU") e aqueles que,por outro lado, sofreram um trauma fisiológico, tal que uma queimadura, umacirurgia, ou outra injúria. Uma marca específica de SIRS é a criação de umestado pró-inflamatório, que pode ser marcado por taquicardia, taquipnéia ouhipernéia, hipotensão, hipoperfusão, oligúria, leucocitose ou leucopenia,pirexia ou hipotermia e a necessidade de infusão de volume. SIRS não inclui,de modo característico, uma fonte documentada de infecção (por exemplo,bacteremia).

"Sepse" refere-se a uma resposta de hospedeiro sistêmica àinfecção com SIRS, além de uma infecção documentada (por exemplo, umaconfirmação laboratorial subseqüente de uma infecção clinicamentesignificativa, tal que uma cultura positiva para um organismo). Deste modo, asepse refere-se a respostas inflamatórias sistêmicas a uma infecçãodocumentada (vide, por exemplo, American College of Chest PhysiciansSociety of Criticai Care Medicine, Chest, 1997, 101: 1644 - 1655, cujosconteúdos totais são incorporados a este a título referencial). Como aquiusado, "sepse" inclui todos os estágios de sepse incluindo, mas não limitados,ao início de sepse, sepse severa, choque séptico e disfunção orgânica múltipla("MOD") associada com os estágios finais de sepse.O "início da sepse" refere-se a um estágio precoce de sepse,por exemplo, anterior a um estágio quando as manifestações clínicasconvencionais são suficientes para suportar uma suspeita clínica de sepse.

Como os métodos da presente invenção podem ser usados para detectar asepse antes de um momento, em que a sepse seria suspeitada usando técnicasconvencionais, em certas modalidades, o estado de doença do paciente emsepse precoce é confirmado retrospectivamente, quando a manifestação dasepse é mais óbvia clinicamente. O mecanismo exato, pelo qual um pacientese torna séptico, não constitui um aspecto crítico da invenção. Os métodos dapresente invenção podem detectar o início da sepse, independentemente daorigem do processo infeccioso.

"Sepse severa" refere-se à sepse associada com a disfunçãoorgânica, anormalidades de hipoperfusão, ou a hipotensão induzida por sepse.As anormalidades de hipoperfusão incluem, mas não estão limitadas a,acidose láctica, oligúria, ou uma alteração aguda no estado mental.

"Choque séptico" refere-se à hipotensão induzida por sepse,que não responde à provocação com fluido intravenoso adequada e commanifestações de hipoperfusão periférica.

um" conversor "ou um "paciente conversor" refere-se a umpaciente positivo para SIRS, que progride para a suspeita clínica de sepsedurante o período em que o paciente é monitorado, de modo típico duranteuma estadia em UTI.

Um "não-conversor" ou "paciente não-conversor" refere-se aum paciente positivo para SIRS, que não progride para a suspeita clínica desepse durante o período em que o paciente é monitorado, de modo típicodurante uma estadia em UTI.

Um "biomarcador" é um composto que está presente em, ou éderivado a partir de uma amostra biológica. "Derivado de", conforme usadoneste contexto, refere-se a um composto que, quando detectado, é indicativode que uma molécula particular esteja presente na amostra biológica. Porexemplo, a detecção de um fragmento particular de um composto pode serindicativa da presente do composto e si mesmo na amostra biológica. Umbiomarcador pode, por exemplo, ser isolado a partir da amostra biológica,diretamente medido na amostra biológica, ou detectado em, ou determinadocomo estando na amostra biológica. Um biomarcador pode, por exemplo, serfuncional, parcialmente funcional, ou não-funcional.

Como aqui usado, "técnicas convencionais "no contexto dodiagnóstico ou do prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica, sãoaquelas técnicas que classificam um paciente, com base em alteraçõesfenotípicas, sem que seja avaliado um biomarcador de acordo com a presenteinvenção.

"Prever o desenvolvimento de sepse" é uma determinação noque se refere a se um paciente desenvolverá a sepse. Uma tal previsão élimitada pela precisão dos meios utilizados para efetuar esta determinação. Apresente invenção provê um método, por exemplo utilizando uma regra(s) dedecisão para realizar esta determinação com uma precisão que é de 60%, ousuperior. Como aqui usado, os termos "prever o desenvolvimento de sepse" e"prever sepse" são intercambiáveis. Em algumas modalidades, o ato de prevero desenvolvimento de sepse (prever sepse) é executado através da avaliaçãode um ou mais perfis de biomarcador a partir de um paciente, usando umaregra de decisão que é indicativa do desenvolvimento de sepse, e, como umresultado desta avaliação, recebendo um resultado a partir da regra de decisão,que indica que o paciente irá se tornar séptico. Uma tal avaliação de um oumais perfis de biomarcador a partir de um paciente de teste usando uma regrade decisão, usa algumas ou todas as quantidades no um ou mais perfis debiomarcador, de modo a obter um resultado.

Como aqui usado, o termo "especificamente "e termosanálogos, no contexto de um anticorpo, referem-se a peptídeos, polipeptídeos,e a anticorpos e fragmentos dos mesmos, que se ligam, de modo específico, aum antígeno ou a uma classe de antígenos, ou a fragmentos dos mesmos e nãose ligam, de modo específico, a outros antígenos ou a outros fragmentos. Umpeptídeo ou polipeptídeo, que se liga, de modo específico, a um antígeno podese ligar a outros peptídeos ou polipeptídeos com afinidade mais baixa, talcomo determinado através de técnicas experimentais convencionais, porexemplo, através de qualquer imunoensaio, bem conhecido daqueles versadosna arte. Tais imunoensaios incluem, mas não estão limitados a,radioimunoensaios (RIAs) e ensaios imunossorventes ligados por enzima(ELISAs). Anticorpos ou fragmentos que se ligam, de modo específico, a umantígeno, pode apresentar reação cruzada com antígneos relacionados. Demodo preferido, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que se ligam, demodo específico, a um antígeno, não reagem de modo cruzado com outrosantígneos. Vide, por exemplo, Paul, ed. 2003, Fundamental Immunology, 5aEd., Raven Press, Nova Iorque, a páginas 69- 105, que é incorporado a este atítulo referencial, para uma discussão no que se refere a interações antígenO-anticorpo, especificidade e reatividade cruzada, e a métodos para determinartudo o acima mencionado.

Como aqui usado, uma "população de referência" é umapopulação de pacientes, que pode ser usada para construir uma regra dedecisão para a avaliação de um biomarcador de pacientes, que estejam emrisco de desenvolver uma condição inflamatória sistêmica.

Um "paciente referencial "é um paciente que foidiagnosticado, ou que será diagnosticado dentro de um período de tempodefinido, com uma condição inflamatória sistêmica, de acordo com os padrõesreconhecidos por aqueles versados na arte. Um paciente referencial é útil paraestabelecer uma quantidade referencial do biomarcador, que pode ser usadopara avaliar uma quantidade do biomarcador, que é um paciente de teste parao diagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica.Um "perfil de biomarcador" compreende uma pluralidade deum ou mais tipos de biomarcadores (por exemplo, um polipeptídeo, peptídeo,lipídeo, ácido nucléico, metabólito, mRNA, cDNA, e/ou um carboidrato, etc.)ou uma indicação dos mesmos, junto com uma característica, tal que umaspecto mensurável (por exemplo, abundância, nível de expressão) dosbiomarcadores. Um perfil de biomarcador compreende pelo menos dois detais biomarcadores ou indicações dos mesmos, em que os biomarcadorespodem estar na mesma ou em diferentes classes, tais que, por exemplo, umácido nucléico e um carboidrato. Um perfil de biomarcador pode aindacompreender pelo menos três, quatro, cinco, 10, 20, 30 ou maisbiomarcadores ou indicações dos mesmos. Em uma modalidade, um perfil debiomarcador compreende centenas, ou ainda milhares de biomarcadores, ouindicações dos mesmos. Um perfil de biomarcador pode ainda compreenderum ou mais controles ou padrões internos. Em uma modalidade o perfil debiomarcador compreende pelo menos um biomarcador, ou uma indicação domesmo, que serve como um padrão interno. Em uma outra modalidade, umperfil de biomarcador compreende uma indicação de um ou mais tipos debiomarcadores. O termo "indicação ", como aqui usado neste contexto refere-se meramente a uma situação, em que o perfil do biomarcador contémsímbolos, dados, abreviações ou outros indícios similares para umbiomarcador, preferivelmente que a entidade molecular biomarcador em simesma.

Cada biomarcador em um perfil de biomarcador inclui uma"característica" correpsonente. Uma "característica ", como aqui usado,refere-se a um aspecto mensurável de um biomarcador. Uma característicapode incluir, por exemplo, a presença ou a ausência do biomarcador naamostra biológica, a abundância ou a quantidade de biomarcador na amostra,a razão de quantidades de moléculas na amostra, etc. Uma característica podeser também a diferença entre um aspecto mensurável do biomarcadorcorrespondente, que é tomado a partir de duas amostras, em que as duasamostras são coletadas a partir de um paciente em dois pontos diferentes.

Aqueles de habilidade na arte irão apreciar que outros métodos decomputação de uma característica podem ser projetados e que todos taismétodos estão dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, umacaracterística pode representar a média de uma abundância de umbiomarcador através de amostra biológicas coletadas a partir de um pacienteem dois ou mais pontos no tempo. Além disso, uma característica pode ser adiferença ou a razão da abundância de dois ou mais biomarcadores a partir deuma amostra biológica, obtida a partir de um paciente em um único ponto notempo. Um perfil de biomarcador pode também compreender pelo menos três,quatro, cinco, 10, 20, 30 ou mais características. Em uma modalidade, umperfil de biomarcador compreende centenas, ou até mesmo milhares decaracterísticas.

Uma "alteração fenotípica" é uma alteração detectável em umparâmetro associado com um determinado estado do paciente. Por exemplo,uma alteração fenotípica pode incluir um aumento ou diminuição de umbiomarcador em um fluido corpóreo, em que a alteração é associada comSIRS, sepse, o início de sepse ou com um estágio particular na progressão desepse. Uma alteração fenotípica pode ainda incluir uma alteração em umaspecto detectável de um dado estado do paciente, que não é uma alteraçãoem um aspecto mensurável de um biomarcador. Por exemplo, uma alteraçãono fenótipo pode incluir uma alteração detectável na temperatura do corpo,taxa de respiração, pressão sangüínea, ou outro parâmetro fisiológico. Taisalterações podem ser determinadas através da observação clínica e damedição usando técnicas convencionais, que são bem conhecidas para aqueleversado na arte.

Uma "regra de decisão "é um método usado para avaliar perfisde biomarcador. Tais regras de decisão podem assumir uma ou mais formas,que são conhecidas na arte, tal como exemplificado em Hastie et al., 2001,The Elements of Statistical Learning, Springer - Verlag, Nova Iorque, que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. Uma regra dedecisão pode ser usada para atuar sobre um conjunto de dados decaracterísticas para, inter alia, prever o início da sepse, para determinar aprogressão da sepse, ou para diagnosticar a sepse. Regras de decisãoexemplares, que podem ser usadas em algumas modalidades da presenteinvenção, são descritas, de modo detalhado, na Seção 5.5, abaixo.

Prever o desenvolvimento de sepse" é uma determinação de seo paciente desenvolverá a sepse. Uma tal previsão está limitada pela precisãodos meios usados para efetuar esta determinação. A presente invenção provêum método, por exemplo, através da utilização de uma regra(s) de decisão,para a produção desta determinação com uma precisão, que é de 60% oumaior. Como aqui usado, os termos "prever o desenvolvimento de sepse" e"prever sepse" são intercambiáveis. Em algumas modalidades, o ato deprever o desenvolvimento de sepse (prever a sepse) é executado através daavaliação de um ou mais perfis de biomarcador a partir de um paciente, queutiliza uma regra de decisão que é indicativa do desenvolvimento de sepse e,como um resultado desta avaliação, recebe um resultado a partir da regra dedecisão, que indica que o paciente se tornará séptico. Uma tal avaliação de umou mais perfis de biomarcador a partir de um paciente de teste usando umaregra de decisão utiliza algumas ou todas as características no um ou maisperfis de biomarcador, de modo a que seja obtido um tal resultado.

Como aqui usado, uma "população de treinamento" é umconjunto de amostras a partir de uma população de pacientes, usado paraconstruir uma regra de decisão, usando um algoritmo de análise de dados,para a avaliação dos perfis de biomarcador de pacientes que estejam em riscode desenvolver a sepse. Em uma modalidade preferida, uma população detreinamento inclui amostras de pacientes, que são conversores e de pacientesque são não-conversores.

Como aqui usado, um "algoritmo de análise de dados" é umalgoritmo usado para construir uma regra de decisão suando perfis debiomarcador de pacientes de uma população de treinamento. Algoritmos deanálise de dados representativos são descritos na Seção 5.5. Uma "regra dedecisão "é o produto final de um algoritmo de análise de dados, e écaracterizado por um ou mais conjuntos de valor, cada um dos quais éindicativo de um aspecto de SIRS, do início de sepse, de sepse, ou de umaprevisão de que o paciente irá adquirir a sepse. Em um exemplo específico,um conjunto de valores representa uma previsão de que um paciente irádesenvolver a sepse. Em um outro exemplo, um conjunto de valor representauma previsão de que um paciente não irá desenvolver a sepse.

Como aqui usado, um "conjunto de valor" é uma combinaçãode valores, de faixas de valores para características em um perfil debiomarcador. A natureza deste conjunto de valor e dos valores no mesmodepende do tipo de características presentes no perfil do biomarcador e doalgoritmo de análise de dados, usado para construir a regra de decisão que ditao conjunto de valor. Por exemplo, um perfil de biomarcador de cada membrode uma população de treinamento pode ser obtido. Cada tal perfil debiomarcador inclui uma característica medida para cada biomarcador. Estesvalores característicos podem ser usados por um algoritmo de análise dedados para construir uma regra de decisão. O algoritmo de análise de dadospode ser uma árvore de decisão, abaixo descrito. Uma regra de decisão defineos conjuntos de valor. Um tal conjunto de valor prevê o início da sepse. Umpaciente, cujos valores caraterísticos de biomarcador satisfazem a esteconjunto de valor, tem a probabilidade de se tornar séptico. Por exemplo, umconjunto de valor pode compreender a quantidade de biomarcador A sedoinferior a um primeiro valor e a quantidade de biomarcador B sendo inferior aum segundo valor. Um outro tal conjunto de valor prevê um estado isento desepse. Um paciente, cujos valores característicos de biomarcador satisfaçam aeste conjunto de valor, não tem a probabilidade de se tornar séptico. Umconjunto de valor exemplar disto poderia compreender que um biomarcador Afosse maior do que o primeiro valor e que um biomarcador B fosse maior doque um terceiro valor.

Quando o algoritmo de análise de dados é uma análise de redeneural e que o produto final desta análise de rede neural é uma rede neuralapropriadamente balanceada, um conjunto de valor é constituídos por aquelasfaixas de valores característicos do perfil do biomarcador, que irão causarcom que a rede neural balanceada indique que o início da sepse é provável.

Um outro conjunto consiste naquelas faixas de valores característicos de perfilde biomarcador, que irão causar com que a rede neural balanceada indiqueque o início da sepse não é provável.

"Prevenir" ou "prevenção" refere-se ao risco de adquirir umadoença ou distúrbio (isto é, causando com que pelo menos um dos sintomasclínicos da doença não se desenvolva em um paciente, que pode estar expostoou predisposto à doença, mas que ainda não experimenta ou exibe os sintomasda doença). De modo preferido, a prevenção refere-se ao uso de umcomposto ou composição em um paciente ainda não afetado pela doença oudistúrbio ou que ainda não exiba um sintoma da doença ou distúrbio, porexemplo um paciente ainda não afetado ou que ainda não exiba os sintomasde infecção.

"Tratar" ou "tratamento "de qualquer doença ou distúrbiorefere-se, em uma modalidade, à melhora da doença ou distúrbio (porexemplo, detendo ou reduzindo o desenvolvimento da doença ou de pelomenos um dos sintomas clínicos da mesma) que existe em um paciente. Emuma outra modalidade, "tratar" ou "tratamento" refere-se à melhora de pelomenos um parâmetro físico, que pode ser não discernível pelo paciente. Emainda uma outra modalidade, "tratar" ou "tratamento" refere-se à modulaçãoda doença ou distúrbio, seja fisicamente (por exemplo, através daestabilização de um sintoma discernível) ou fisiologicamente (através daestabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em ainda uma outramodalidade, "tratar "ou "tratamento" refere-se ao retardo do início da doençaou distúrbio.

O termo "rótulo" refere-se à exibição de um material escrito,impresso ou gráfico sobre o recipiente imediato de um artigo, por exemplo omaterial escrito exibido sobre um frasco contendo um agentefarmaceuticamente ativo.

O termo "rotulação" refere-se a todos os rótulos e a outromaterial escrito, impresso ou gráfico sobre qualquer artigo ou qualquer deseus recipientes ou invólucros ou que acompanham um tal artigo, porexemplo uma inserção de embalagem ou áudios ou vídeos instrutivos, porexemplo videotapes ou DVDs, que acompanham ou que estão associados comum recipiente de um agente farmaceuticamente ativo.

"Acila" refere-se a um radical -C(O)R, em que R é alquila.

"Alquila", em si mesmo ou como parte de outro substituinte,significa, a não ser que mencionado de outro modo, um radicalhidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada, que pode ser totalmentesaturado, mono- ou poliinsaturado, tendo o número de átomos de carbonodesignado (isto é, C1.22 significa de um a vinte de dois átomos de carbono).Exemplos de radicais hidrocarboneto saturados incluem grupos, tais quemetila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, cicleoxila,(cicloexil) metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros de, por exemplo,n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila, e os similares. Um grupo alquilainsaturado é um tendo uma ou mais ligações duplas ou ligações triplas.Exemplos de grupos alquila insaturados incluem vinila, 2-propenila, crotila,2-isopentenila, 2- (butadienila), 2, 4-pentadienila, 3-(l,4-pentadienila), etinila,1-e 3-propinila, 3-butinila, e homólogos e isômeros superiores."Sal fisiologicamente aceitável "refere-se a um sal ou a umcomposto da invenção, que é farmaceuticamente aceitável e que possui aatividade farmacológica desejada do composto de origem. Outros saisincluem: (1) sais de adição de ácido formados com ácidos orgânicos ouinorgânicos, tais que ácidos clorídrico, bromídrico, sulfurico, nítrico,fosfórico, acético, trífluoroacético, tricloroacético, propiônico, hexanóico,ciclopentilpropiônico, glicólico, glutárico, pirúvico, láctico, malônico,succínico, sórbico, ascórbico, málico, maléico, fumárico, tartárico, cítrico,benzóiço, 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, pícrico, cinâmico, mandélico, ftálico,láurico, metanossulfônico, etanossulfônico, 1,2-etano-dissulfônico, 2-hidroxietanossulfônico, benzenossulfônico, 4-clorobenzenossulfônico, 2-naftalenossulfônico, 4-toluenossulfônico, canfórico, canforsulfônico, 4-metilbiciclo [2.2.]-oct-2-eno-l-carboxílico, glucoeptônico, 3-fenilpropiônico,trimetilacético, terc-butilacético, lauril sulfurico, glucônico, benzóico,glutâmico, hidroxinaftóico, salicílico, esteárico, mucônico e os ácidossimilares; ou (2) sais formados quando um próton ácido presente no compostode origem ou (a) é substituído por um íon metálico, por exemplo, um íon demetal alcalino, um íon alcalino terroso ou um íon de alumínio, ou hidróxidosde metal alcalino ou de metal alcalino terroso, tais que hidróxido de sódio,potássio, cálcio, magnésio e bário, amônia ou (b) coordenados com uma baseorgânica, tais que aminas alifática, alicíclica, ou aminas orgânicas aromáticas,tais que metilamina, dimetilamina, dietilamina, picolina, etanolamina,dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina e os similares.

Outros sais incluem, apenas a título de exemplo, sódio,potássio, cálcio, magnésio, amônio, tetraalquilamônio e os similares, e quandoo composto contém uma funcionalidade básica, sais de ácidos orgânicos ouinorgânicos não-tóxicos, tais que hidrocloreto, hidrobrometo, tartarato,mesilato, acetato, maleato, oxalato e os similares. O termo "cátionfisiologicamente aceitável "refere-se a um contra-íon catiônicofisiologicamente aceitável, não-tóxico, de um grupo funcional ácido. Taiscátions são exemplificados por cátions de sódio, potássio, cálcio, magnésio,amônio e tetralaquilamônio, e os similares.

"Solvato" refere-se a um composto da presente invenção ou aum sal do mesmo, que inclui ainda uma quantidade estequiométrica ou não-estequiométrica de um solvente ligado por forças intermoleculares não-covalentes. Quando o solvente é água, o solvato é um hidrato.

Deve ser entendido que os compostos tendo a mesma fórmulamolecular, mas diferindo na natureza ou seqüência de ligação de seus átomosou no arranjo de seus átomos no espaço são denominados "isômeros". Osisômeros que diferem no arranjo de seus átomos no espaço são denominados"estereoisômeros".

Os estereoisômeros, que não são imagens especulares um dooutro, são denominados "diastereômeros" e aqueles, que são imagensespeculares, que não podem ser superpostas de cada um dos outros sãodenominados "enanciômeros". Quando um composto possui um centroassimétrico, por exemplo, quanto ele está ligado a quanto grupos diferentes,um par de enanciômeros é possível. Um enanciômero pode ser caracterizadopela configuração absoluta de seu centro assimétrico e é designado por (R) ou(S) de acordo com as regras de Cahn e Prelog (Cahn et al., 1966, Angew.Chem. 78: 413- 447, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5: 385 - 414 (errata:Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5: 511); Prelog and Helmchen, 1982, Angew.Chem. 94: 614 - 631, Angew. Chem. Internat. Ed. Eng. 21: 567 - 583; Mataand Lobo, 1993, Tetrahedron: Assymmetry 4: 657 - 668) ou pode sercaracterizado pelo modo pelo qual a molécula gira no plano de luz polarizadae é designado como dextrorrotativo ou levorrotativo (isto é, como isômeros(+) ou (-), respectivamente). Um composto quiral pode existir ou como oenanciômero individual ou como uma mistura dos mesmos. Uma misturacontendo iguais proporções de enqanciômeros é denominada uma "misturaracêmica".

Em certas modalidades, os compostos desta invenção podempossuir um ou mais centros assimétricos; tais compostos podem, portanto, serproduzidos como o enanciômero (R) ou (S) individual, ou como uma misturados mesmos. A não ser que indicado de outro modo, por exemplo através dedesignação de estereoquímica em qualquer posição de uma fórmula, adescrição ou nomeação de um composto particular na especificação e nasreivindicações tem a intenção de incluir tanto enaniômeros e misturasindividuais, racêmicas ou outras, dos mesmos. Os métodos para adeterminação da estereoquímica e separação de estereoisômeros são bemconhecidos na arte. Em modalidades particulares, a presente invenção provêos estereoisômeros dos compostos aqui ilustrados mediante tratamento combase.

5.2. Modalidades da Invenção

A presente invenção permite o diagnóstico ou o prognósticorápido e preciso de uma condição inflamatória sistêmica através da avaliaçãode lisofosfatidilcolina em um paciente. Quantidades de lisofosfatidilcolinapodem ser construídas a partir de uma ou mais amostras biológicas depaciente em um único ponto do tempo ("snapshot"), ou em múltiplos pontosdo tempo, durante cujo curso de tempo o paciente está em risco dedesenvolver uma condição inflamatória sistêmica.

De modo vantajoso, a condição inflamatória sistêmica pode serdiagnosticada ou prevista antes do início dos sintomas clínicos convencionais,deste modo permitindo uma intervenção terapêutica mais efetiva.

5.2.1. Pacientes

Em certas modalidades da invenção, o paciente é um animal,de modo preferido um mamífero, de modo mais preferido um primata não-humano. Nas modalidades mais preferidas, o paciente é um humano.

Embora os métodos da invenção possam ser usados para odiagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica emqualquer paciente, pacientes particularmente úteis incluem aqueles, que estãoem risco quanto a uma condição inflamatória sistêmica. O paciente pode estarem risco da condição inflamatória sistêmica de acordo com quaisquer critériosconhecidos para aquele de habilidade na arte.

Em certas modalidades, paciente é negativo para SIRS. Nocontexto desta invenção, pacientes negativos para SIRS incluem pacientessaudáveis que, devido a qualquer razão de acordo com o julgamento daqueleversado na arte, estão em necessidade de diagnóstico ou prognóstico de sepse.Tais pacientes incluem, mas não estão limitados a, pacientes negativos paraSIRS em unidades de tratamento intensivo hospitalares e pacientes emsituação similar. Os métodos da invenção podem ser usados para odiagnóstico ou o prognóstico de SIRS, sepse, sepse severa, choque séptico,disfunção orgânica múltipla ou mortalidade. Em modalidades particulares, opaciente é um paciente que pode estar em risco quanto a uma condiçãoinflamatória sistêmica, tal que um paciente de uma unidade de tratamentointensivo.

Em outras modalidades, o paciente é positivo para SIRS. Osmétodos da invenção podem ser usados para o diagnóstico ou o prognósticode sepse, sepse severa, choque séptico, disfunção orgânica múltipla oumortalidade, ou eles podem ser ainda usados para o diagnóstico ou oprognóstico de conversão para negativo para SIRS. Métodos adicionais dainvenção podem ser usados para monitorar um tratamento ou prevençãoquanto ao risco aumentado ou diminuído de sepse, sepse severa, choqueséptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade, ou para monitorarquanto à possível conversão para negativo para SIRS.

Em modalidades adicionais, o paciente tem sepse. Os métodosda invenção podem ser usados para o diagnóstico ou o prognóstico de sepsesevera, choque séptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade, ou elespodem ser suados para o diagnóstico ou o prognóstico de conversão parapositivo para SIRS (negativo para sepse) ou conversão para negativo paraSIRS. Outros métodos da invenção podem ser usados para monitorar umtratamento ou prevenção quanto a um risco aumentado ou diminuído de sepsesevera, choque séptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade, de modoa monitorar uma possível conversão para positivo para SIRS (e negativo parasepse) ou conversão para negativo para SIRS.

Em modalidades adicionais, o paciente apresenta sepse severa.

Os métodos da invenção podem ser usados para o diagnóstico ou oprognóstico de choque séptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade,ou eles podem ser usados para o diagnóstico ou o prognóstico de conversãopara sepse ou para positivo para SIRS (e negativo para sepse) ou negativopara SIRS. Métodos adicionais da invenção podem ser usados par monitorarum tratamento ou prevenção quanto a um risco aumentado ou diminuído dechoque séptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade, ou de modo amonitorar quanto à possível conversão para sepse ou para positivo para SIRS(e negativo para sepse) ou para negativo para SlRS.

Em outras modalidades, o paciente apresenta choque séptico.Os métodos da invenção podem ser usados para o diagnóstico ou oprognóstico de disfunção orgânica múltipla ou mortalidade, ou eles podem serusados para o diagnóstico ou o prognóstico de conversão para sepse severa,para sepse, para positivo para SIRS (e negativo para sepse) ou para negativopara SIRS. Outros métodos da invenção podem ser usados para monitorar otratamento ou a prevenção quanto ao risco aumentado ou diminuído dedisfunção orgânica múltipla ou de mortalidade, ou de modo a monitorarquanto à conversão possível para sepse severa, para sepse, para positivo paraSIRS (e negativo para sepse) ou negativo para SlRS.

Em outras modalidades, o paciente apresenta disfunçãoorgânica múltipla. Os métodos da presente invenção podem ser usados para odiagnóstico ou o prognóstico de mortalidade, ou eles podem ser usados para odiagnóstico ou o prognóstico de conversão para choque séptico, sepse severa,para sepse, para positivo para SIRS (e negativo para sepse) ou para negativopara SIRS. Outros métodos da invenção podem ser usados para monitorar umtratamento ou prevenção quanto ao risco aumentado ou diminuído demortalidade, ou de modo a monitorar quanto a possível conversão parachoque séptico, sepse severa, para sepse, para positivo para SIRS (e negativopara sepse) ou para negativo para SIRS.

Em modalidades preferidas, o paciente é negativo para SIRS(isto é, o paciente pode ser saudável), mas precisa de diagnóstico ouprognóstico de uma condição infLamatória sistêmica de acordo com ojulgamento daquele versado na arte. O paciente poderia ser, por exemplo, umpaciente em uma unidade de tratamento intensivo. De modo similar, emmodalidades preferidas, os pacientes são negativos para SIRS, e os métodosda invenção são usados para monitorar a prevenção de uma condiçãoinflamatória sistêmica. Por exemplo, em um paciente negativo para SIRS,julgado como estando em risco de uma condição inflamatória sistêmica, porexemplo de acordo com um método da invenção, um curso de intervençãopoderia ser administrado ao paciente, de modo a evitar uma condiçãoinflamatória sistêmica. Uma tal prevenção de uma condição inflamatóriasistêmica pode ser monitorada com um método de acordo com a invenção.

Em outras modalidades preferidas, os pacientes são positivospara SIRS, e os métodos da invenção são usados para o diagnóstico ou oprognóstico de uma condição inflamatória sistêmica adicional. De modosimilar, em modalidades preferidas, os pacientes são positivos para SIRS, e osmétodos da invenção são usados para monitorar o tratamento de SIRS ou aprevenção da condição inflamatória sistêmica adicional. Por exemplo, umpaciente positivo para SIRS, julgado como estando em risco quanto a umacondição inflamatória sistêmica adicional, por exemplo de acordo com ummétodo da invenção, um curso de intervenção poderia ser administrado aopaciente, de modo a prevenir a condição inflamatória sistêmica. Uma talprevenção da condição inflamatória sistêmica pode ser monitorada com ummétodo de acordo coma invenção.

Em modalidades específicas da invenção, os pacientes emrisco de desenvolver sepse ou SIRS são testados usando os métodos dainvenção. De acordo com estas modalidades, os métodos da presente invençãopodem ser empregados para testar, por exemplo, pacientes admitidos a umaunidade de tratamento intensivo e/ou aqueles que experimentaram algum tipode trauma (tais que, por exemplo, cirurgia, acidente veicular, ferida devido atiro, etc.).

Em modalidades específicas, um paciente é testado usando osmétodos e as composições da invenção, de um modo tão freqüente quantonecessário (por exemplo, durante a sua estada em uma unidade de tratamentointensivo) para o diagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatóriasistêmica. Em uma modalidade preferida, o paciente é testado logo após a suachegada à unidade de tratamento intensivo. Em algumas modalidades, opaciente é testado diariamente após a sua chegada à unidade de tratamentointensivo. Em algumas modalidades, o paciente é testado a cada 1 a 8 horas, 8a 12 horas, 12 a 16 horas, 16 a 24 horas após a sua chegada a uma unidade detratamento intensivo.

5.3. Lisofosfatidilcolina Total

Em um aspecto, a presente invenção provê o prognóstico ou odiagnóstico de uma condição inflamatória sistêmica, com base emlisofosfatidilcolina total.

Em certas modalidades, a lisofosfatidilcolina total em umaamostra a partir de um paciente é suada para o prognóstico ou o diagnósticoda condição inflamatória sistêmica. A lisofosfatidilcolina total refere-se a umaquantidade, que corresponde à lisofosfatidilcolina total (livre ou ligada, ouambas) na amostra. Por exemplo, a lisofosfatidilcolina total pode referir-seàquelas moléculas na amostra que estão de acordo com a fórmula (I);

<formula>formula see original document page 34</formula>

ou a qualquer sal ou solvato das mesmas, em que R é qualquergrupo acila. O grupo acila pode ser qualquer grupo acila, conhecido daquelesversados na arte. Grupos acila exemplares incluem caproíla, lauroíla,miristoíla, palmitoíla, estearoíla, palmitoleíla, oleíla, araquidonila e linoleíla.De modo preferido, a lisofosfatidilcolina total inclui pelo menos I-O-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina e 1 -0-estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina. Em modalidades típicas, a lisofasfatidilcolina total é medida semconsiderar a identidade do grupo acila. Técnicas úteis são descritas neste.

Em certas modalidades, a lisofosfatidilcolina isoladamente éusada para o prognóstico ou o diagnóstico da condição inflamatória sistêmica.Em modalidades adicionais, um ou mais biomarcadores adicionais são usadospara o prognóstico ou o diagnóstico da condição inflamatória sistêmica. Emoutras modalidades, uma ou mais medições clínicas são usadas, de modoadicional, para o prognóstico ou o diagnóstico da condição inflamatóriasistêmica. Em certas modalidades, um ou mais biomarcadores adicionais euma ou mais medições clínicas são usados, de modo adicional, para oprognóstico ou o diagnóstico da condição inflamatória sistêmica.

Aquele versado na arte poderá usar qualquer técnica paramedir ou indicar a lisofosfatidilcolina total em uma amostra. Em certasmodalidades, aquele versado na arte pode medir uma quantidade ou valor apartir de uma amostra, que está correlacionado à lisofosfatidilcolina total. Porexemplo, em certas amostras a partir de pacientes, uma fração dalisofosfatidilcolina total pode estar livre de outras moléculas, enquanto queuma fração adicional de lisofsfatidilcolina total pode estar ligada por outrasmoléculas. Por exemplo, uma fração da lisofosfatidilcolina total pode estarligada por albumina. As técnicas de preparação e medição usadas por aqueleversado na arte irão afetar a quantidade de lisofosfatidilcolina efetivamentemedida. Por exemplo, as técnicas de precipitação e/ou purificação podemseparar a lisofosfatidilcolina livre a ligada. As técnicas de detecção podem sermais sensíveis à lisofosfatidilcolina livre ou à lisofosfatidilcolina ligada. Estaquantidade medida pode estar correlacionada à quantidade delisofosfatidilcolina total na amostra, de acordo com os métodos disponíveispara aquele versado na arte. Em certas modalidades, uma medição delisofosfatidilcolina livre é usada para indicar a quantidade delisofosfatidilcolina total na amostra. Em certas modalidades, uma medição dalisofosfatidilcolina ligada é usada para indicar a quantidade delisofosfatidilcolina total na amostra. Em certas modalidades, uma medição dalisfosfatidilcolina livre e ligada é usada para indicar a quantidade delisofosfatidilcolina total na amostra. Em certas modalidades, alisofosfatidilcolina livre pode ser usada para o prognóstico ou o diagnósticonos métodos da invenção. Em certas modalidades, a lisofosfatidilcolinaligada pode ser usada para o prognóstico ou para o diagnóstico nos métodosda invenção. Em certas modalidades, a lisofosfatidilcolina livre e ligada podeser usada para o prognóstico ou para o diagnóstico nos métodos da invenção.

Cada biomarcador adicional pode ser qualquer tipo debiomarcador para uma condição inflamatória sistêmica, conhecida daquelesversados na arte, que inclui biomarcadores de proteína, peptídeo, ácidonucléico, lipídeo, fosfolipídeo e metabólito (por exemplo, proteína, peptídeo,ácido nucléico, nucleosídeo, lipídeo ou metabólito de fosfolipídeo). Outrosbiomarcadores exemplares para o prognóstico ou o diagnóstico de umacondição inflamatória sistêmica e métodos para a sua avaliação, estãodescritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N°s. 20030194752,20040096917, 20040097460, 20040106142, 20040157242, e nos PedidosProvisórios U. S. de N°s. 60/671. 620, depositados em 15 de abril de 2005,60/671.941, depositado em 15 de abril de 2005, e 60/674. 046, depositado em22 de abril de 2005, cujos conteúdos são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades. Outros biomarcadores exemplares para asepse incluem endotoxina; DNA bacteriano; proteínas de fase aguda, tais quea proteína C, procalcitonina, proteína de ligação de LBP - LPS; fatores decoagulação, tais que produtos de degradação de fibrina, antitrombina III,dímero D; marcadores celulares de membrana, tais que HLA- DR, CD-64, E-selectina; hormônios, tais que cortisol, ACTH; receptores solúveis, tais queCD-14, sTNFRI, sTNF-RII; e citoquinas, tais que TNF, IL-6, IL-8, e IL-10; eoutros, tais que dímero D, tempo de protrombina, tempo de tromboplastinaparcial ativado, inibidor-1 de ativador de plasminogênio, trombomodulinasolúvel, IL-6, IL-10, IL-8, proteína C, inibidor de fibrinólise ativável portrombina, proteína S, antitrombina, TNF-α. Vide, por exemplo, Kinasewitz etal., 2004, Criticai Care 8: R82- R90, Bozza et al., 2005, Mem. Inst. OswaldoCruz 100 (s) 1: 217-221, cujos conteúdos são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades. Biomarcadores preferidos incluem a proteínaC- reativa, procalcitonina e IL-6.

Em certas modalidades, a presente invenção provê métodos deavaliação de um painel de biomarcadores a partir de um paciente para odiagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica. Opainel pode compreender qualquer número de biomarcadores, suficiente parafazer um diagnóstico ou um prognóstico da condição inflamatória sistêmica,de acordo com o julgamento daquele versado na arte. O painel devecompreender lisofosfatidilcolina total. O painel pode, em adição,compreender outros biomarcadores para a condição inflamatória sistêmica,incluindo aqueles descritos no parágrafo acima. Em algumas modalidades, opainel compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 ou maisbiomarcadores para a condição inflamatória sistêmica. Cada biomarcadordeve ser avaliado através de técnicas apropriadas para a classe debiomarcador. Técnicas exemplares são aqui descritas, e outras técnicas devemser evidentes para aqueles versados na arte. Em modalidades convenientes,biomarcadores da mesma classe, ou biomarcadores que podem ser avaliadospela mesma técnicas, podem ser avaliados de um modo conjunto no painel.Por exemplo, em uma modalidade particular, o metabólito e/oubiomarcadores de proteína podem ser avaliados através de técnicas deimunoensaio, em uma forma de conjunto ou de chip, tal como descrito abaixo.

A medição clínica para a condição inflamatória sistêmica podeser qualquer mediação clínica para a condição inflamatória sistêmica,conhecida daqueles versados na arte. Em certas modalidades, a mediçãoclínica é efetuada de acordo com um modelo de severidade clínica para asepse. Tais modelos incluem, mas não estão limitados a, the Acute Physilogyand Chronie Health Avaliation seore (APACHE, e seus refinamentosAPACHE II e III) (knaus et al., 1985, Cr/Y. Care Med. 13: 818 - 829; Knauset al., 1991, Chest 100: 16190-1636), the Mortality Prediction Model (MPM)(Lemeshow et al., 1993, JAMA 270: 2957-2963), the Simplified AcutePhysiology (SAPS) score (Le Gall et al., 1984, Crit. Care Med. 12: 975-9776), the Multiple Organ Dysfunction Score (MODS) (Marshall et al., 1995,Crit. Care Med. 23: 1638-1652), the Sequential Organ Failure Assessment(SOFA) score (Ferreira et al., 2002, JAMA 286: 1754-1758), the LogistiealOrgan Dysfunction Score (LODS) (Le Gall et al., 1996, JAMA 276: 802-810) e o conceito de predisposição, infecção, resposta e disfunção orgânica(PIRO) (Levy et al., 2003. Intensive Care Med. 29: 530 - 538) (cujosconteúdos de cada referência são incorporados a este em sua totalidade). Emcertas modalidades, a medição clínica compreende uma ou mais mediçõesusadas por aqueles versados na arte para auxiliar ao prognóstico e aodiagnóstico de sepse. Tais medições incluem, mas não estão limitadas a,temperatura, freqüência cardíaca, contagem de células brancas sangüíneas,contagem de células brancas sangüíneas diferenciais (monócitos, linfócitos,granulócitos e/ou neutrófilos), razão de neutrófilo imaturo para neutrófilototal, contagem de plaquetas, creatinina no soro, uréia, lactato, excesso debase, p02 e HCO3;

5.4. Biomarcador

Em um outro aspecto, a presente invenção provê o prognósticoou o diagnóstico de uma condição inflamatória sistêmica com umbiomarcador de lisofosfatidilcolina da invenção.

Em certas modalidades, o biomarcador é l-O-acil-2- liso-sn-glicero-3-fosfocolina. Por exemplo, em certas modalidades, o biomarcador éum composto de acordo com a fórmula (I):

<formula>formula see original document page 38</formula>

ou qualquer sal uo solvato do mesmo, m que R e um grupoacila.

Sais exemplares da fórmula (I) são providos pela fórmula (Ia):<formula>formula see original document page 39</formula>

em que o referido sal pode ser coordenado com qualquer íonou íons conhecidos daqueles versados na arte. O íon ou íons podem serfisiológicos, mas não precisam ser fisiológicos. Por exemplo, o íon ou íonspodem resultar a partir do contato do sal durante a preparação da amostra apartir do paciente, tal como descrito abaixo. Em algumas modalidades, o sal écoordenado com um ânion, por exemplo, um ânion fisiológico, conhecidodaqueles versados na arte. Os ânions exemplares incluem cloreto, brometo,fosfato, acetato, carbonato, bicarbonato e sulfato. Em algumas modalidades, osal é coordenado com um cátion, por exemplo um cátion fisiológico,conhecido daqueles versados na arte. Os cátions exemplares incluem sódio,potássio, cálcio, magnésio e amônio. Em algumas modalidades, seráreconhecido por aquele versados na arte, que o sal é coordenado com um oumais ânions e com um ou mais cátions.

O grupo acila pode ser qualquer grupo acila conhecidodaqueles versados na arte. Em certas modalidades, o grupo acila é saturado.Grupos acila saturados exemplares incluem caproíla, lauroíla, miristoíla,palmitoíla e estearoíla. Em modalidades adicionais, o grupo acila émonoinsaturado. Grupos acila monoinsaturados exemplares incluempalmitoleíla e oleíla. Em outras modalidades, o grupo acila é poliinsaturado.Grupos acila poliinsaturados exemplares incluem araquidonila e linoleíla.

De modo mais sistemático, em certas modalidades, o grupoacila é acila C10-22. Em certas modalidades, o grupo acila é acila C14-22·Grupos acila exemplares incluem 16: 0, 18: 0, 18: 1, 18: 2, 20: 4 (n-6) e 22: 6(n-3), de acordo com a nomenclatura familiar àqueles de habilidade na arte.

Em uma tal nomenclatura, o primeiro número indica o número de átomos decarbono no grupo acila, e o segundo número indica o número de ligaçõesduplas no grupo. Por exemplo, "18:1" indica um grupo acila com 18 átomosde carbono e uma ligação dupla. Os números entre parênteses, se houverem,indicam a localização da ligação dupla, e a notação "(n-x)" indica umaligação dupla χ posições afastada do terminal metila da cadeia mais longa doácido graxo. Vide Biochem. J., 1978, 171, 21-35; Chem. Phys. Lipids, 1978,21, 159- 173; Eur. J. Biochem., 1977, 79, 11-21; Hoppe -Seyler's Z PhysiolChem., 1977, 358, 617-631: J. Lipid Res., 1978, 19, 114- 128; Lipids, 1977,12, 455 - 468; Mol Cell Biochem., 1977, 17, 157-171; BiochemicalNomenclature and Related Documents, 2a Edição, Portland Press, 1992,páginas 180-190, cujos conteúdos são incorporados a este, a título referencial,em suas totalidades.

Em certas modalidades, o grupo acila é acila Ci4.22· Em certasmodalidades, o grupo acila é C16-20. Em outras modalidades, o grupo acila éacila C16-18. Em certas modalidades, o grupo acila é hexadecanoíla ouoctadecanoíla. Em modalidades particulares, o grupo acila é acila C16. Emuma modalidade preferida, o grupo acila é hexadecanoíla. Em outrasmodalidades particulares o grupo acila é acila C18. Em uma modalidadepreferida, o grupo acila é octadecanoíla.

O biomarcador pode ser qualquer forma de biomarcador apartir do paciente, por exemplo qualquer sal ou solvato do biomarcador, quepossa ser identificado por aquele de habilidade na arte. Em modalidadespreferidas, o biomarcador está sob a forma de um sal de sódio.

Em certas modalidades, o biomarcador é um metabólito de umcomposto de acordo com a fórmula (I). Por exemplo, o biomarcador pode serum precursor de um composto de acordo com a fórmula (I), conhecidodaqueles versados na arte. O precursor pode ser um ou dois ou três, ou emalgumas modalidades mais, estágios anteriores ao composto de acordo com afórmula (I), em uma via biossintética, conhecida daqueles versados na arte.

Em modalidades adicionais, o biomarcador pode ser um metabólito a jusantede um composto de acordo com a fórmula (I), em uma via biossintética,conhecida daqueles versados na arte. O metabólito a jusante pode ser um oudois ou três, ou em algumas modalidades mais, estágios segundo o compostode acordo com a fórmula (I), em uma via biossintética, conhecida daquelesversados na arte. Em certas modalidades, a via biossintética é um trajeto denovo para a síntese do fator de ativação de plaqueta, conhecido daquelesversados na arte. Em outras modalidades, a via biossintética é um trajeto deremodelação para a síntese do fator de ativação de plaqueta, conecidadaqueles versados na arte.

Em modalidades particulares, o metabólito é l-O-acil-2-O-acil-sn-glicero-3-fosfocolina. Em modalidades preferidas, o grupo 2-acila équalquer grupo acila acima descrito, ou acetila. Em modalidades particulares,o metabólito é 1 -O-acil-2-O-alquil- sn-glicero-3-fosfocolina. Em modalidadespreferidas, o grupo 2-O-alquila é qualquer grupo conhecido daqueles versadosna arte, de modo a modificar um glicero-3-fosfocolina, por exemplo qualqueralquila C14-22·

Em certas modalidades, um biomarcador único é usado para oprognóstico ou diagnóstico da condição inflamatória sistêmica. Emmodalidades adicionais, uma pluralidade de biomarcadores são usados para oprognóstico ou o diagnóstico da condição inflamatória sistêmica. Osbiomarcadores em sua pluralidade podem compreender os biomarcadores deacordo com a invenção, em conjunto com outros biomarcadores para odiagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica,conhecida daqueles de habilidade na arte. O biomarcador pode ser qualquertipo de biomarcador para uma condição inflamatória sistêmica, conhecidadaquelas de habilidade na arte, incluindo biomarcadores de proteína, peptídeo,ácido nucléico, lipídeo, fosfolipídeo e metabólito (por exemplo, proteína,peptídeo, ácido nucléico, nucleosídeo, lipídeo ou metabólito de fosfolipídeo).

Outros biomarcadores exemplares para o prognóstico oudiagnóstico de uma condição inflamatória sistêmica, e métodos para a suaavaliação são descritos na Publicação do Pedido de Patentes U.S. N°s.20030194752, 20040096917, 20040097460, 20040106142, 20040157242 e osPedidos Provisórios U.S. de N°s. 60/671.620, depositados em 15 de abril de2005, 60/671.941, depositados em 15 de abril de 2005, e 60/674.046,depositados em 22 de abril de 2005, cujos conteúdos são incorporados a este,a título referencial, em suas totalidades. Outros biomarcadores exemplarespara a sepse incluem endotoxina, DNA bacteriano; proteínas de fase aguda,tais que proteína C, procalcitonina, proteína de ligação de LBP - LPS; fatoresde coagulação, tais que produtos de degradação de fibrina, antitrombina III,dímero D; marcadores celulares de membrana, tais que HLS- DR, CD-64, E-selectina; hormônios, tais que cortisol, ACTH; receptores solúveis, tais queCD- 14, sTNFRI, sTNF-RII; e citoquinas, tais que TNF, IL-6-, IL-8, e IL-10;e outros tais que dímero D, tempo de protrombina, tempo de tromboplastinaparcial ativado, inibidor-1 de ativador de plasminogênio, trombomodulinasolúvel, IL-6, IL-10, IL-8, proteína C, inibidor de fibrinólise ativável portrombina, proteína S,antitrombina, ΤΝΡ-α. Vide, por exemplo, Kinasewitz etal., 2004, Criticai Care 8: R82 - R90, Bozza et al, 2005, Mem. Inst. OswaldoCruz 100 (s) 1: 217-221, cujos conteúdos são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades, Biomarcadores preferidos incluem a proteínaC-reativa, procalcitonina e IL-6.

Em certas modalidades, a presente invenção provê métodos deavaliar um painel de biomarcadores a partir de um paciente para o diagnósticoou o prognóstico e uma condição inflamatória

sistêmica. O painel pode compreender qualquer número debiomarcadores, suficientes para que seja efetuado um diagnóstico ouprognóstico da condição inflamatória sistêmica, de acordo com o julgamentodaquele de habilidade na arte. O painel deve compreender um ou maisbiomarcadores da invenção, por exemplo, um biomarcador de acordo com afórmula I ou fórmula Ia. O painel pode compreender, de modo adicional,outros biomarcadores para a condição inflamatória sistêmica, incluindoaqueles descritos no parágrafo acima. Em algumas modalidades, o painelcompreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 ou mais biomarcadores paraa condição inflamatória sistêmica. Cada biomarcador deve ser avaliadoatravés de técnicas apropriadas para a classe de biomarcador. Técnicasexemplares são aqui descritas e outras técnicas devem ser evidentes paraaqueles versados na arte. Em modalidades convenientes, biomarcadores damesma classe, ou biomarcadores que podem ser avaliados pela mesmatécnica, podem ser avaliados junto com o painel. Por exemplo, em umamodalidade particular, biomarcadores de metabólito e/ou proteína podem seravaliados através de técnicas de imunoensaio, em um formato de conjunto oude chip, tal como abaixo descrito.

5.5 Medição de Lisofosfatidilcolina

Nesta seção e nas seções que se seguem, a não ser queespecificado de outro modo, o termo lisofosfatidilcolina refere-se àlisofosfatidilcolina total ou a um biomarcador de lisofosfatidilcolina dainvenção.

Em certas modalidades da invenção, o método para medirlisofosfatidilcolina não é crítico. Deste modo, a presente invenção provêmétodos para o diagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatóriasistêmica, que pode compreender o estágio único de avaliar o risco quanto auma condição inflamatória sistêmica a partir de lisofosfatidilcolina.

A lisofosfatidilcolina total pode ser medida por aquele quepratique um método de acordo com a invenção de qualquer modo possível.Técnicas exemplificativas são aqui descritas. Como acima descrito, qualquertécnica que indique lisofosfatidilcolina na amostra pode ser usada nosmétodos da invenção. Em certas modalidades, os métodos são baseados nalisofsofatidilcolina livre na amostra. Em certas modalidades, os métodos sãobaseados na lisofosfatidilcolina ligada na amostra. Em determinadasmodalidades, os métodos são baseados na lisofosfatidilcolina livre e ligada naamostra.

A quantidade de biomarcador de lisofosfatidilcolina pode sermedida por aquele que pratique um método da invenção, no entanto, dequalquer modo. Técnicas exemplares são aqui descritas.

Quando uma pluralidade ou um painel de biomarcadores deveser avaliado, cada biomarcador individual deve ser avaliado de acordo comuma técnica adequada para aquele biomarcador. Em modalidades vantajosas,os biomarcadores que podem ser avaliados pela mesma ou através de técnicascompatíveis podem ser avaliados de um modo conjunto. Por exemplo,biomarcadores de proteína, peptídeo, lipídeo, fosfolipídeo e metabólito, quepodem ser avaliados através de imunoensaios, podem ser avaliados de ummodo conjunto ou em grupos, de acordo com técnicas conhecidas daquelesversados na arte.

Em uma modalidade, apenas uma amostra biológica única,tomada em um único ponto no tempo a partir do paciente é suada para efetuarum prognóstico ou diagnóstico de sepse. Em uma outra modalidade, umapluralidade de amostras biológicas, tomadas em diferentes pontos no tempo apartir do paciente são usadas para produzir um prognóstico ou diagnóstico desepse.

Em uma modalidade específica, a quantidade delisofosfatidilcolina é obtida usando amostras coletadas a partir de umpaciente, em um ponto de tempo. Em uma outra modalidade específica, aquantidade de lisofosfatidilcolina é obtida usando amostras obtidas a partir dopaciente em pontos de tempo separados. Em um exemplo, estas amostras sãoobtidas a partir do paciente seja uma única vez, ou, de modo alternativo, emuma base diária, ou de modo mais freqüente, por exemplo, a cada 2, 3, 4, 6, 8ou 12 horas.

Lisofosfatidilcolina pode ser obtida a partir de cada amostrabiológica, que pode ser, a título de exemplo e não de limitação, sangue,plasma, soro, saliva, escarro, urina, fluido espinhal cerebral, células, umextrato celular, uma amostra de tecido, uma biópsia de tecido, uma amostra defezes, ou qualquer amostra, que possa ser obtida a partir de um paciente,usando técnicas bem conhecidas daqueles de habilidade na arte. A amostrabiológica precisa, que é tomada a partir do paciente, pode variar, mas a coletade amostra é minimamente invasiva e é executada através de técnicasconvencionais.

A amostra biológica pode ser processada ou purificada deacordo com o julgamento daquele versado na arte, com base, por exemplo, notipo de biomarcador e na técnica de medição. Por exemplo, quando obiomarcador é um metabólito de lipídeo ou e fosfolipídeo, a amostra pode serprocessada através de extração e/ou de cromatografia. Quando o biomarcadoré uma proteína ou um peptídeo, por exemplo quando um painel debiomarcadores tem que ser avaliado, a amostra pode ser processada através deprecipitação, centrifugação, filtração e/ou cromatografia. Quando obiomarcador é um ácido nucléico, por exemplo quando um painel debiomarcadores tem que ser avaliado, a amostra pode ser processada de modoa isolar os ácidos nucléicos através de extração, precipitação e/oucromatografia.

Alguma porção da mistura de peptídeos, proteínas, ácidosnucléicos, fosfolipídeos, e metabólitos (por exemplo, metabólitos oupeptídeos, proteínas, fosfolipídeos ou nucleosídeos) e/ou outras moléculas daamostra, que podem ser decompostas como um perfil de biomarcador. Istopode ser executado através da medição das quantidades de biomarcadores noperfil do biomarcador. Um perfil de biomarcador compreende umapluralidade de um ou mais tipos de biomarcadores (por exemplo, umfosfolipídeo, um mRNA, um cDNA, uma proteína e/ou um carboidrato, etc.),ou uma indicação dos mesmos, junto com quantidades dos biomarcadores.

Um perfil de biomarcador pode compreender pelo menos um tal biomarcadorou uma indicação do mesmo. Biomarcadores múltiplos podem estar namesma ou em classes diferentes, tais que, por exemplo, um fosfolipídeo e umpolipeptídeo.

Estas quantidades podem ser determinadas através do uso dequalquer técnica de medição reprodutível ou combinação de técnicas demedição. Tais técnicas incluem aquelas que são bem conhecidas na arte,incluindo qualquer técnica aqui descrita. De modo típico, tais técnicas sãousadas para medir quantidades usando uma amostra biológica tomada a partirde um paciente em um ponto único do tempo ou múltiplas amostras, tomas emúltiplos pontos no tempo. Em uma modalidade preferida, uma técnicaexemplar para obter um perfil de biomarcador a partir de uma amostra tomadaa partir de um paciente é o imunoensaio. Os perfis de biomarcador podem sergerados usando um kit, tal que um kit abaixo descrito.

Em certas modalidades, os métodos de detecção dobiomarcador envolvem a sua detecção através de interação com um anticorpoespecífico para o biomarcador. Por exemplo, os anticorpos dirigidos aomarcador de acordo com a invenção. Os anticorpos podem ser gerados usandotécnicas convencionais, bem conhecidas daqueles versados na arte. Emmodalidades específicas, os anticorpos podem ser policlonais, ou de modopreferido monoclonais. Um anticorpo intacto ou um fragmento de anticorpo(por exemplo, scFv, Fab ou F(ab')2 podem, por exemplo, ser usados.

Por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de anticorpos,específicos para um biomarcador, podem ser usados de modo a detectar, demodo quantitativo ou qualitativo, a presença de um biomarcador. Isto podeser efetuado, por exemplo, através de técnicas de imunofluorescência.

Anticorpos (ou fragmentos dos mesmos) podem, de modo adicional, serempregados de um modo histológico, tal como em imunofluorescência ou emmicroscopia imunoeletrônica, para a detecção in situ de um biomarcador. Adetecção in situ pode ser efetuada através da remoção de uma amostrabiológica (por exemplo, uma amostra de biópsia) a partir de um paciente, aaplicação a esta de um anticorpo rotulado, que é dirigido a um biomarcador.

O anticorpo (ou fragmento) é aplicado, de modo preferido, pela deposição doanticorpo (ou fragmento) sobre uma amostra biológica. Através do uso de umtal procedimento, é possível determinar não apenas a presença dobiomarcador, mas também a sua distribuição, em uma amostra particular.

Uma ampla variedade de métodos histológicos bem conhecidos (tais queprocedimentos de manchamento) podem ser utilizados, de modo a alcançaruma tal detecção in situ.

Os imunoensaios para um biomarcador compreendem, demodo típico, incubar uma amostra biológica de um anticorpo rotulado demodo detectável, capaz de identificar um biomarcador, e detectar o anticorpoligado através de qualquer de um número de técnicas bem conhecidas na arte.

Como discutido abaixo em mais detalhe, o termo "rotulado" pode se referir àrotulação direta do anticorpo através de, por exemplo, acoplamento (isto é,ligação física) de uma substância detectável ao anticorpo, e pode se referirtambém à rotulação indireta do anticorpo através de reatividade com um outroagente, que seja diretamente rotulado. Exemplos de rotulação indireta incluema detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundáriorotulado de um modo fluorescente.

A amostra biológica pode ser colocada em contato com, eimobilizada sobre, um suporte ou veículo de fase sólida, tal que nitrocelulose,ou outro suporte sólido, que seja capaz de imobilizar células partículas decélula ou proteínas solúveis. O suporte pode ser então lavado com tampõesadequados, seguido pelo tratamento com o anticorpo específico para o genede impressão digital rotulado de modo detectável. O suporte de fase sólidapode ser então lavado com o tampão uma segunda vez, de modo a remover oanticorpo não ligado. A quantidade de rotulo ligado sobre o suporte sólidopode ser então detectada através de métodos convencionais.

Por "suporte ou veículo de fase sólida" é entendido qualquersuporte capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Suportes ou veículosbem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno,dextrano, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas emagnetita. A natureza do veículo pode ser ou solúvel em alguma extensão ouinsolúvel, para os propósitos da presente invenção. O material de suportepode possuir virtualmente qualquer configuração estrutural possível, desdeque a molécula acoplada seja capaz de se ligar a um antígeno ou anticorpo.

Deste modo, a configuração de suporte pode ser esférica, como no caso deuma conta, ou cilíndrica, como na superfície interior de um tubo de teste, ou asuperfície externa de uma haste. De um modo alternativo, a superfície podeser plana, tal que como uma folha, tira de teste, etc. Suportes preferidosincluem contas de poliestireno. Aqueles versados na arte reconhecerão muitosoutros veículos adequados para a ligação do anticorpo ou antígeno, ou serãocapazes de determinar o mesmo através de experimentação de rotina.

Um dos meios, pelos quais um anticorpo específico para umbiomarcador pode ser rotulado de modo detectável é através da ligação domesmo a uma enzima e uso em um imunoensaio de enzima (EIA) (Voller,1978, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", DiagnosticHorizons 2: 1-7, Microbiological Associates Quaterly Publication,Walkersville, MD; Voller et al., 1978, J. Clin. Pathol, 31: 507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol., 73: 482-523; Maggio, E. (Ed.), 1980, EnzymeImmunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL; Ishikawa, E. et al., (Eds.), 1981,Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tóquio, cada um dos quais éincorporado a este,a título referencial, em sua totalidade). A enzima que estáligada ao anticorpo irá reagir com um substrato apropriado, de modo preferidoum substrato cromogênico, de um modo tal a produzir uma porção químicaque podem ser detectada, por exemplo, através de meiosespectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. As enzimas, que podem serusadas para rotular, de modo detectável, o anticorpo, incluem, mas não estãolimitadas a, malato desidrogenase, estafilococo nuclease, delta-5-esteróideisomerase, levedura álcool desidrogenase, alfa-glicerofosfato, desidrogenase,triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina,asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidade, ribonuclease, urease,catalase, glicose-6-fosfato desidrogenase, glicoamilase acetilcolinesterase. Adetecção pode ser efetuada através de métodos colorimétricos, que empregamum substrato cromogênico para a enzima. A detecção pode ser tambémexecutada através da comparação visual da extensão de uma reaçãoenzimática de um substrato, em comparação com padrões preparados de ummodo similar.

A detecção pode ser também executada usando qualquer deuma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, através da rotulaçãoradioativa dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos, é possível detectar umbiomarcador através do uso de radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo,Wintraub B., Pirncipels of Raidoimmunoassays, Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março, 1986, que éincorporado a este a título referencial). O isótopo radiaotivo (por exemplo,125I, 131I ou 3H) podem ser detectados através de meios, tais que o uso deum contador gama ou de um contador de cintilação ou através deautorradiografia.

É também possível rotular o anticorpo com um compostofluorescente. Quando o anticorpo rotulado de modo fluorescente é exposto àluz de comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser entãodetectada devido à fluorescência. Dentre os compostos de rotulaçãofluorescentes comumente usados estão isotiocianato de fluoresceína,rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído efluorescamina.

O anticorpo pode ser também rotulado, de modo detectável,usando metais que emitem fluorescência, tais que 152Eu, ou outros da série delantanídeo. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo usando tais grupos dequelação de metal, tais que o ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) ou oácido etilenodiaminatetraacético (EDTA).

O anticorpo pode ser também rotulado de um modo detectávelatravés de seu acoplamento a um composto quimioluminescente. A presençado anticorpo rotulado de modo quimioluminescente é então determinadaatravés da detecção da presença da luminescência, que é originada durante ocurso de uma reação química. Exemplos de compostos de rotulaçãoquimioluminescentes particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster deacridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode serusado para rotular o anticorpo da presente invenção. A bioluminescência é umtipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos, nos quaisuma proteína catalítica aumenta a eficiência da reação quimioluminescente.

A presença de uma proteína bioluminescente é determinada através dadetecção da presença de luminescência. Compostos bioluminescentesimportantes para os propósitos de rotulação são luciferina, luciferase eaequorina.

Em modalidades vantajosas, os anticorpos podem estar sob aforma de um arranjo. Um tal arranjo pode ser usado para a medição ou adetecção de uma pluralidade ou de um painel de biomarcadores, de um modosimultâneo. O arranjo pode ser qualquer arranjo para anticorpos, conhecidodaqueles versados na arte. Em certas modalidades, uma pluralidade deanticorpos pode estar sob a forma de um chip de anticorpo para a detecção deuma pluralidade ou de um painel de biomarcadores. Arranjos de anticorposexemplares e chips de anticorpos são descritos na Publicação de Pedido dePatente U. S. N°s. 20050048566, 20050054015, 200 50037343,20050095591, 20050100947, 20040161748, 20040097460 e 20040096917,cujos conteúdos são incorporados a este, a título referencial, em suastotalidades. Os arranjos de anticorpo comerciais podem ser usados ouadaptados para a presente invenção, incluindo, mas não limitados àquelesdisponíveis de Whatman Schliecher & Schuell, Eurogentec, Sigma Aldrich,Novagen and Chemicon International. A ligação do antígeno ao anticorpopode ocorrer de acordo com as técnicas adequadas para o arranjo de anticorpoou o chip e anticorpo, incluindo, mas não limitados a, fluorescência,ressonância de plasmon superficial e espectrometria de massa.

Em uma outra modalidade, as moléculas de ligaçãoespecíficas, diferentes de anticorpos, tais que aptâmeros, podem ser usadaspara ligar os biomarcadores. Em ainda uma outra modalidade, o perfil dobiomarcador pode compreender um aspecto mensurável de um agenteinfeccioso (por exemplo, lipossacarídeos ou proteínas virais) ou umcomponente dos mesmos.

As quantidades de biomarcador em um perfil de biomarcadorpodem também, por exemplo, ser geradas através do uso de um ou mais dosmétodos que se seguem, abaixo descritos. Por exemplo, os métodos podemincluir espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), um métodode espectroscopia de massa, tais que ionização através de eletropulverização(ESI- MS), ESI - S/MSM ESI - MS/(MS)" (n é um inteiro maior do quezero), espectrocospia de massa de tempO-de vôo por ionização/dessorção alaser auxiliada por matriz (MALDI- TOF- MS), espectroscopia de tempo devôo or dessorção a laser/ionização com aumento superficial (SELDI - TOF -MS), dessorção/ionização em silício (DIOS), espectroscopia de massa por íonsecundário (SIMS), tempo de vôo quadripolar (Q_TOF), espectroscopia demassa por ionização química sob pressão atmosférica (APCI-MS), APPI-MS/MS, e APPI-(MS)n. Outros métodos de espectroscopia de massa podemincluir, inter alia, espectroscopia de massa por transformação de Fourier,quadripolar (FTMS) e retenção iônica. Outros métodos adequados podemincluir a divisão com extração química, cromatografia de coluna,cromatografia com troca iônica, cromatografia líquida hidrofóbica (de fasereversa), focalização isoelétrica, eletroforese com gel de poliacrilamidaunidimensional (PAGE), eletroforese com gel de acrilamida bidimensioanl(2D-PAGE), ou outra cromatografia, tal que cromatografia de camadadelgada, cromatografia gasosa ou líquida, ou qualquer combinação dasmesmas. Em uma modalidade, a amostra biológica pode ser fracionada antesda aplicação do método de separação.

Em uma modalidade, a espectroscopia de massa de tempo devôo por dessorção a laser/ionização é usada para determinar a quantidade deum biomarcador, em que o biomarcador é uma molécula, que precisa serionizada e vaporizada de um suporte de imobilização através de radiação alaser incidente. Uma variedade de técnicas de dessorção a laser/ionização sãoconhecidas na arte (vide, por exemplo, Guttman et ai., 2001, Anal. Chem. 73:1252 - 62 and Wei et al., 1999, Nature 399: 243 - 246, que são incorporadosa este a título referencial).

A espectroscopia de massa de tempo de vôo por dessorção alaser/ionização permite a geração de grandes quantidades de informação emum período de tempo relativamente curto. Uma amostra biológica é aplicada auma de várias variedades de um suporte, que liga todos os biomarcadores, oua um subconjunto dos mesmos, na amostra. As amostras ou lisados celularessão diretamente aplicados a estas superfícies, em volumes tão pequenosquanto de 0,5 μl, com ou sem purificação ou fracionamento anterior. Oslisados ou amostras podem ser concentrados ou diluídos antes da aplicaçãosobre a superfície de suporte. A dessorção a laser/ionização é então usadapara gerar espectros de massa da amostra, ou amostras, em um período tãocurto quanto de três horas.

A análise através de espectrometria de massa- cromatografialíquida produz um espectro de intensidade de massa, cujos picos representamos vários componentes da amostra, cada componente tendo uma razão demassa- para- carga característica (m/z) e um período de tempo de retenção (r.t.). A presença de um pico com o m/z e período de tempo de retenção de umbiomarcador indica que o marcador está presente. O pico que representa ummarcador pode ser comparado a um pico correspondente a partir de outroespectro (por exemplo, a partir de uma amostra de controle) de modo a queseja obtida uma medição relativa. Qualquer técnica de normalização na arte(por exemplo, um padrão interno) pode ser usado quando é desejada umamedição quantitativa. Em adição, o software de desconvoluição estádisponível para separar os picos em sobreposição. O período de tempo deretenção depende, em algum grau, das condições empregadas na execução daseparação por cromatografia líquida.

Em espectroscopia de massa MALDI (MALDI-MS), podemser usados vários analisadores de massa, por exemplo configurações deinstrumentos de deflexão magnética/setor magnético em um modoquadripolar único ou triplo (MS/MS), transformação de Fourier e tempo devôo, incluindo o tempo de vôo ortogonal (O-TOF), tal como é conhecido naarte de espectrometria de massa. Para o processo de dessorção/ionização,podem ser usadas numerosas combinações de matriz/laser. Configurações deretenção iônica e de reflectron podem ser também empregadas.

Espectrometria de massa por ionização por eletropulverização(ESI-MS) é amplamente aplicável para a análise de macromoléculas,incluindo proteínas, ácidos nucléicos, e carboidratos (Fenn et al., 1989,Science 246: 64-71; Crain et al., 1998, Curr. Opin. Biotecnol. 9:25-4; Smith etal., 1990, Anal. Chem. 62: 882-99; Han & Gross, 1994, Proc. Natl. Acad.Sci., USA 91; 10635- 10639). As técnicas de eletropulverização foram usadaspara separar e medir biomarcadores, tais que aqueles da fórmula I e dafórmula Ia (vide Petkovic et al., 2001, Anal. Biochem. 289 (2): 202 - 16;Pulfer & Murphy, 2003, Mass Spec. Rev. 22: 331 - 364; Han & Gross, 1995,J. Amer. Soe. Mass. Spec. 6: 1202 - 1210; cujos conteúdos são incorporados aeste, a título referencial, em suas totalidades).

Para as classes de metabólitos que se seguem, as seguintesfontes proporcionam

orientação quanto à análise espectral de massa de taismoléculas e são incorporadas, a título referencial, em sua totalidade: (1)lipídeos (vide, por exemplo, Fenselau, C., ACS Symp. Ser., 541: 1-7 (1994));(2) metabólitos voláteis (vide, por exemplo, Lauritsen and Lloyd, D. ASSymp. Ser. 541: 91-106 (1994)); (3) carboidratos (vide, por exemplo, Fox andBlack, ACS Symp. Ser. 541: 107-131 (1994); (4) ácidos nucléicos (vide, porexemplo, Edmonds et al., ACS Symp. Ser., 541: 147-158 (1994); e (5)proteínas (vide, por exemplo, Vorm, O. et al., Anal. Chem. 66: 3281 - 3287(1994); e Vorm and Mann., J. Am. Soe. Mass Spectrom. 5: 955-958 (1994)).Os conteúdos destas publicações são incorporados a este, a título referencial,em suas totalidades.

Em certas modalidades, as espécies na amostra biológicapodem ser separadas através de cormatografia líquida, em conjunção comqualquer das técnicas de espectrometria de massa acima descritas. Taistécnicas de cromatografia líquida/espectrometria de massa foramcomprovadas ser úteis para a separação de biomarcadores, tais que proteínas,peptídeos, ácidos nucléicos, lipídeos, fosfolipídeos e metabólitos. Porexemplo, como a separação de sensível de espécies de fosfolipídeos foialcançada com LC/MS (vide Kim et al., 1994, Anal. Chem. 66 (22): 3977 -82; Ma & Kim, 1995, Anal. Biochem. 226 (2): 293 - 301; cujos conteúdossão incorporados a este, a título referencial, em suas totalidades), tais técnicaspodem ser usadas para separar e medir um biomarcador de acordo comafórmula I ou com a fórmula Ia.

Em modalidades específicas da invenção, os biomarcadoresem uma pluralidade de biomarcadores ou de painéis são ácidos nucléicos.Tais biomarcadores e quantidades correspondentes do perfil de biomarcadorpodem ser gerados, por exemplo, através da detecção do produto de expressão(por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo) de um ou mais genes aquidescritos. Em uma modalidade específica, os biomarcadores e quantidadescorrespondentes em um perfil de biomarcadores são obtidos através dadetecção e/ou análise de um ou mais ácidos nucléicos, usando qualquermétodo bem conhecido daqueles versados na arte, mas de nenhum modolimitados a, hibridização, análise de microarranjo, RT- PC, ensaios deproteção de nuclease e análise de borrão de Northern. Como será reconhecidopor aqueles versados na arte, em modalidades convenientes, a amostrabiológica pode ser dividida, com uma porção sendo avaliada quanto abiomarcadores de ácido nucléico, e outra porção avaliada quanto a outrosbiomarcadores, tais que proteínas, peptídeos, lipídeos, fosfolipídeos emetabólitos. De fato, a amostra biológica pode ser dividida, tantas vezesquanto desejado, por aquele versado na arte, de modo a facilitar a avaliaçãoou a medição de cada biomarcador em uma pluralidade ou em um painel debiomarcadores.

Em certas modalidades da invenção, os arranjos de ácidonucléico são empregados de modo a gerar quantidades de biomarcadores emum perfil de biomarcador através da detecção da expressão de qualquer um oumais dos genes aqui descritos. Em uma modalidade da invenção, ummicroarranjo, tal que um microarranjo de cDNA, é usado para determinarquantidades de biomarcadores em um perfil de biomarcador. O uso emdiagnóstico de arranjos de cDNA é bem conhecido na arte. (Vide, porexemplo, Zou et al., 2002, Oncogene 21: 4855- 4862; assim como emDraghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman &Hall/CRC, cada um dos quais é incorporado a este, a título referencial, em suatotalidade). Métodos exemplares para a análise de microarranjo de cDNA sãodescritos abaixo, e nos exemplos na Seção 6, infra.

Em certas modalidades, as quantidades de biomarcadores emum perfil de bimarcador são obtidas através da hibridização para o conjuntode ácidos nucléicos rotulados de modo detectável, representando oucorrespondendo às seqüências de ácido nucléico em transcriptos de mRNA,presentes em uma amostra biológica (por exemplo, cDNA rotulado de modofluorescente, sintetizado a partir da amostra) a um microarranjocompreendendo um ou mais pontos de sonda.

Arranjos de ácido nucléico, por exemplo, microarranjos,podem ser produzidos em uma quantidade de modos, dos quais vários sãodescritos neste a seguir. De modo preferido, os arranjos são reprodutíveis,permitindo com que múltiplas cópias de um determinado arranjo sejamproduzidas a partir de materiais, que são estáveis sob condições ligação (porexemplo, hibridização de ácido nucléico). Aqueles versados na arte deverãoconhecer os suportes, substratos e veículos adequados para sondas de teste dehibridização para pontos de sonda em um arranjo, ou serão capazes dedeterminar os mesmos através de experimentação de rotina.

Várias técnicas cromatográficas podem ser usadas para separaros biomarcadores. Por exemplo, os produtos de amplificação podem serseparados através de eletroforese com gel de agarose, agarose-acrilamida oupoliacrilamida, usando métodos convencionais. Vide Sambrook et al., 2001.Várias técnicas para a detecção de biomarcadores de um modo quantitativo,sem eletroforese, podem ser também usadas de acordo com a invenção (vide,por exemplo, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis etal., 1990, Academic Press, Inc., N.Y., que é incorporado a este a títuloreferencial). Por exemplo, as técnicas cromatográficas podem ser empregadaspara efetuar a separação. Existem muitos tipos de cromatografia, que podemser usados na presente invenção: adsorção, divisão, troca iônica e peneiramolecular, HPLC, e muitas técnicas especializadas para o uso dos mesmos,incluindo cromatografia de coluna, de papel, gasosa e de camada delgada(Friefelder, Physical Biochemistry Applications to Biochemistry andMolecular Biology, 2aEd., Wm. Freeman and Co. Nova Iorque, N. Y., 1982,que é incorporado a este a título referencial).

Em certas modalidades, um ou mais dos biomarcadores é umaproteína. Em uma modalidade específica, um perfil de biomarcador é geradoatravés da detecção e/ou análise de uma ou mais proteínas e/ou discriminaçãode fragmentos das mesmas, usando qualquer método conhecido daquelesversados na arte para a detecção de proteínas, incluindo, mas não limitados a,análise de microarranjo de proteína, imuno-histo-química e espectrometria demassa.

Técnicas convencionais podem ser utilizadas para adeterminação da quantidade de proteína ou proteínas de interesse, presentesem uma amostra. Por exemplo, as técnicas convencionais podem serempregadas usando, por exemplo, imunoensaio, tal que, por exemplo, borrãode Western, imunoprecipitação seguida por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida, (SDS-PAGE), imunocitoquímica, e ossimilares, de modo a determinar a quantidade de proteína ou de proteínas deinteresse, presentes em uma amostra. Um agente exemplar para a detecção deuma proteína de interesse é um anticorpo capaz de ligação, d e modoespecífico, a uma proteína de interesse, de modo preferido um anticorporotulado de modo detectável, seja direta ou indiretamente.

Para tais métodos de detecção, se desejado, uma proteína apartir da amostra a ser analisada pode ser isolada facilmente através o uso detécnicas, que são bem conhecidas daqueles versados na arte. Méodos deisolamento de proteína podem, por exemplo, ser tais que aqueles descritos emHarlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold SpringHarbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, Nova Iorque), que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

Em certas modalidades, os métodos de detecção da proteína oude proteínas de interesse envolvem a sua detecção por meio de interação comum anticorpo específico para a proteína. Por exemplo, anticorpos dirigidos auma proteína de interesse. Os anticorpos podem ser gerados utilizandotécnicas convencionais, bem conhecidas daqueles versados na arte. Emmodalidades específicas, os anticorpos podem ser policlonais, ou de modomais preferido, monoclonais. Um anticorpo intacto, ou um fragmento deanticorpo (por exemplo, scFv, Fab ou F(ab')2 podem, por exemplo, serusados. Imunoensaios exemplares são tais que acima descritos.

Em algumas modalidades, um ensaio de chip de proteína (vide,por exemplo, Zhu & Snyder, 2003, Curr. Opin. Chem. Biol., 7: 55-63;Mitchell, 2002, Nature Biotechnology 20: 225- 229) é usado para medirquantidade de biomarcadores no perfil do biomarcador. Vide também, porexemplo, Lin, 2004 Modem Pathology, 1-9; Li, 2004, Journal of Urology,171, 1782 - 1787; Wadsworth, 2004, Clinicai Câncer Research, 10, 1625-1632; Prieto, 2003, Journal of Liquid Chromatography & RelatedTechnologies, 26, 2315- 2328; Coombes, 2003, Clinicai Chemistry 49, 1615-1623; Mian, 2003, Proteomics 3, 1725-1737; Lehre et al., 2003, BJUInternational 92, 223- 225; e Diamond, 2003, Journal of the American Societyfor Mass Spectrometry 14, 760-765, que são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades. De modo particular, são úteis em certasmodalidades da invenção os chips de anticorpo que facilitam a detecção deMALDI ou SELDI (vide, por exemplo, Wang et al., 2001, Int'l J. of Câncer92: 871-876; Figeys, 2002, Proteomics, 2: 373- 382: Sonksen et al., 1998,Anbal. Chem. 70: 2731-6; Glõkler & Angenendt, 2003, J. ChromatographyB, 797: 229 - 240; cujos conteúdos são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades).

5.5.1. Anticorpos Seletivos para Biomarcadores da Invenção

Anticorpos para os biomarcadores da invenção podem serproduzidos ou obtidos de acordo com qualquer técnica evidente para aquelesversados na arte. Por exemplo, anticorpos para fosfolipídeos e metabólitos dainvenção podem ser preparados ou isolados de acordo com as técnicasdescritas em Mourdjeva et al., 2005, Apoptosis 10 (1): 209-17, vonLandenberg et al., 1999, J. Autoimmun. 13: 215- 23, ou Menon et al., J.Autoimmun. 10:43 - 57, cujos conteúdos são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades. Anticorpos para polipeptídeos, oumetabólitos dos mesmos, podem ser preparados de acordo com as técnicasconvencionais.

Um fosfolipídeo isolado da invenção, ou um metabólito oufragmento do mesmo, pode ser usado como um imunógeno para geraranticorpos para gerar anticorpos usando as técnicas convencionais para apreparação de anticorpo policlonal ou monclonal. Um imunógeno é usado, demodo típico, para preparar os anticorpos através da imunização de umpaciente adequado (por exemplo, coelho, cabra, camundongo, ou outromamífero). Uma preparação imunogênica apropriada pode compreender, porexemplo, um polipeptídeo expressado de modo recombinante ouquimicamente sintetizado.

A preparação pode, além disso, incluir um adjuvante, tal queum adjuvante completo ou incompleto de Freud, ou agente imunoestimuladorsimilar. Em certas modalidades, de modo a facilitar a produção do anticorpo,o fosfolipídeo da invenção, ou um metabólito ou fragmento do mesmo, podeser acoplado a um veículo, por exemplo uma proteína, tal que hemocianina delimpeto, albumina de soro bovino, tiroglobulina, e ovalbumina.

Anticorpos policlonais podem ser preparados através daimunização de um paciente adequado com um fosfolipídeo da invenção, ouum metabólito ou fragmento do mesmo, da invenção como um imunógeno. Atitulação do anticorpo no paciente imunizado pode ser monitorado ao longodo tempo através de técnicas convencionais, tais que com um ensaio deimunossorvente ligado por enzima (ELISA) usando o polipeptídeoimobilizado. Se desejado, as moléculas de anticorpo podem ser isoladas apartir do paciente (por exemplo, a partir do sangue) e, além disso, purificadoatravés de técnicas bem conhecidas, tais que cromatografia de proteína A, demodo a obter a fração de IgG. De modo alternativo, anticorpos específicospara um fosfolipídeo da invenção, ou um metabólito ou fragmento dosmesmos da invenção podem ser selecionados para (por exemplo, parcialmentepurificado) ou purificado através de, por exemplo, cromatografia de afinidade,por exemplo, uma proteína expressada de modo recombinante e purificada(ou parcialmente purificada) da invenção é produzida como aqui descrito, eacoplada, de modo covalente ou não-covalente, a um suporte sólido, porexemplo, uma coluna de cromatografia. A coluna pode ser então usada parapurificar por afinidade anticorpos específicos para as proteínas da invenção apartir de uma amostra, que compreende os anticorpos dirigidos conta umgrande número e diferentes epítopos, deste modo gerando uma composição deanticorpo substancialmente purificada, isto é, uma que estejasubstancialmente isenta de anticorpos contaminantes. Por uma composição deanticorpo substancialmente purificada é entendido, neste contexto, que aamostra de anticorpo compreende, no máximo, apenas 30% (em peso seco) deanticorpos contaminantes dirigidos contra epítopos, outros que aqueles naproteína ou polipeptídeo desejado da invenção, e, de modo preferido, nomáximo 20%, e contudo, de modo preferido, no máximo 10%, e, de modomais preferido, no máximo 5% (em peso seco) da amostra consistem deanticorpos contaminantes. Uma composição de anticorpo purificada significaque pelo menos 99 % dos anticorpos na composição são dirigidos conta aproteína ou polipeptídeo desejado da invenção.

Em um período de tempo apropriado após a imunização, porexemplo, quando as titulações de anticorpo específicas são mais elevadas, ascélulas que produzem anticorpo podem ser obtidas a partir do paciente eusadas para preparar os anticorpos monoclonais através de técnicasconvencionais, tais que a técnica de hidridoma originalmente descrita porKohler and Milstein (1975, Nature 256: 495- 497), a técnica de hidrodoma dacélula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today, 4: 72), a técnica deEBV- hibrodoma (Cole et al., 1985, em Monoclonal Antibodies and CâncerTherapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96) ou técnicas de trioma. A tecnologiapara a produção de hibridomas é bem conhecida (Vide, por exemplo, CurrentProtocols in Immunology, Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., NovaIorque, Ν. Y. (1994)). As células de hidridoma, que produzem um anticorpomonoclonal da invenção são detectadas através de teste dos sobrenadantes dacultura de hidrodoma quanto a anticorpos, que ligam o polipeptídeo deinteresse, por exemplo, usando um ensaio de ELISA convencional.

De modo alternativo à preparação de hibridomas, que secretamanticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal dirigido contra umpolipeptídeo da invenção pode ser identificado e isolado através da varredurade uma coleção de imunoglobulina combinatória recombinante (por exemplo,uma coleção de exibição de fago de anticorpo) com o polipeptídeo deinteresse. Kits para gerar e testar coleções de exibição de fago estãocomercialmente disponíveis (por exemplo, o Pharmacia Recombinant PhaseAntibody System, Catálogo N0 27-9400- 01; e o Sratagene SurfZAP PhageDisplay Kit, Catálogo N0 240612). Em adição, exemplos de métodos dereagentes particularmente apropriados para o uso na geração e varredura deuma coleção de exibição de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo,na Pat. U. S. N0 5. 223. 409; Publicação PCT N0 WO 92/18610; PublicaçãoPCT N0 91/17271; Publicação PCT N0 WO 92/20791; Publicação PCT N0WO 92/15679; Publicação PCT N0 WO 93/01288; Publicação PCT N0 WO90/02809; Fuchs et al., 1991, BioTechnology 9: 1370-1372; Hay et al., 1992,Hum Antibod Hybridomas 3: 81 - 85; Huse et al., 1989, Science, 246: 1275 -1281: Griffiths et al.,1993, EMBO J. 12: 725 - 74.

Em adição, anticorpos recombinantes, tais que anticorposmonoclonais quiméricos e humanizados, que compreendem tanto porçõeshumanas e não-humanas, que podem ser produzidos através do uso detécnicas de DNA recombinantes convencionais estão dentro do escopo dainvenção. Um anticorpo quimérico é uma molécula, na qual diferentesporções são derivadas a partir de diferentes espécies animais, tais que aquelastendo uma região variável, derivada a partir e um murino mAb e de umaregião constante de imunoglobina humana (vide, por exemplo, Cabilly et al.,Pat. U.S. N0 4.816. 567; e Boss et al., Pat. U.S. N0 4.816. 397, que sãoincorporadas a esta, a título referencial, em sua totalidade). Anticorposhumanizados são moléculas de anticorpo de espécies não-humanas, tendouma ou mais regiões de determinação complementares (CDRs) a partir deespécies não-humanas e uma região de quadro de uma molécula deimunoglobina humana (vide, por exemplo, Queen, U.S. Pat. N0 5.585. 089,que é incorporada a esta, a título referencial, em sua totalidade). Taisanticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidosatravés de técnicas de DNA recombinantes conhecidas na arte, por exemplousando os métodos descritos na Publicação PCT N0 WQO 87/02671; Pedidode Patente Europeu 184.187; Pedido de Patente Europeu 171. 496; Pedido dePatente Europeu 173. 494; Publicação PCT N0 WO 86/01533; Pat. U.S. N04.816. 567; Pedido de Patente Europeu 125. 023; Better et al., 1988, Science240: 1041-10433; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 84: 3439 - 343; Liuet al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad.Sei. 84: 214 - 218; Nishimura et al., 1987, Câncer Res. 47: 999- 005; Wood etal., 1985, Nature 314: 446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Câncer Inst. 80:1533 - 1559; Morrisson, 1985, Science, 229: 1202- 1207; Oi et al., 1986,BioTechniques 4: 24; US. Pat. N0 5. 225. 539; Jones et al., 1986, Nature 321:552 - 525: Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1534; e Beidler et al., 1988,J. Immunol. 141: 4053 - 4060.

Anticorpos completamente humanos podem ser produzidos,por exemplo, através do uso de camundongos transgênicos, que são incapazesde expressar genes de cadeia leve e pesadas de imunoglobulina endógenas,mas que podem expressar genes de cadeia leve e pesada humanos. Oscamundongos transgênicos são imunizados de modo normal com um antígenoselecionado, por exemplo, o todo ou uma porção de um polipeptídeo dainvenção. Anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem serobtidos através do uso de tecnologia de hibridoma convencional. Ostransgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongostransgênicos são rearranjados durante a diferenciação da célula B, esubseqüentemente, são submetidos a uma troca de classe e mutação somática.Deste modo, usando uma tal técnica, é possível produzir os anticorpos IgG,IgA e IgE terapeuticamente úteis. Para uma revisão desta tecnologia para aprodução de anticorpos humanos, vide Lonberg e Huszar (1995, Int. Rev.Immunol. 13: 65-93), para uma discussão detalhada desta tecnologia para aprodução de anticorpos humanos e de anticorpos monoclonais humanos eprotocolos para a produção de tais anticorpos, vide, por exemplo, a Pat. U. S.N°s. 5.625.126; Pat. U. S. N°. 5. 633. 425; Pat. U.S. N0 5. 569. 825; Pat. U.S.N0 5. 661. 016; e Pat. U.S. N0 5.545. 806. Em adição, companhias, tais queAbgenix, Inc. (Fremont, Calif) podem ser engajadas em prover anticorposhumanos dirigidos conta um antígeno selecionado usando tecnologia similaràquela acima descrita.Anticorpos completamente humanos, que reconhecem umepítopo selecionado, podem ser gerados usando uma técnica referida como"seleção orientada". Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não-humanoselecionado, por exemplo um anticorpo de camundongo, é usado para guiar aseleção de um anticorpo completamente humano, que reconhece o mesmoepítopo. (Jespers e t al., 1994, BioTechonology 12: 899-903).

5.5.2. Ensaios Enzimáticos para Biomarcadores da Invenção

Em modalidades vantajosas, a lisofosfatidilcolina total podeser detectada, medida ou monitorada através de um ou mais ensaiosenzimáticos. Os ensaios enzimáticos podem ser quaisquer ensaios, conhecidosdaqueles versados na arte, como sendo úteis para detectar, medir ou monitorarum ou mais dos biomarcadores da invenção.

Em certas modalidades, os ensaios enzimáticos podem estar deacordo com o pedido publicado JP 2002 - 17938 (Kishimoto et al., 2002,Method od Measuring Phospholipia% ou de acordo com Kishimoto et al.,2002, Clinicai Biochem., 35: 411-416, cujos conteúdos são incorporados aeste, a título referencial, em suas totalidades.

Em certas modalidades, a lisofosfatidilcolina total pode sermedida através do contato de uma amostra da invenção com uma enzima,capaz de hidrolisar a lisofosfatidilcolina de modo a fornecerlicerofosfatidilcolina. A enzima pode ser qualquer enzima conhecida daquelesversados na arte. Enzimas exemplares incluem as lisofofolipases, tais que aEC 3.1.1. 5 (comercialmente disponível de, por exemplo, Asahi ChemicalCo.). Em certas modalidades, a lisofosfolipase hidrolisa, de modo preferido,lisofosfolipídeos com relação a outros fosfolipídeos. Em certas modalidades,a lisofosfolipase é de Bacillus. Em certas modaladides, a lisofosfolipase estáde acordo com a JP 2002 - 17938.

A glicerofosforilcolina resultante pode ser detectada, medidaou monitorada de acordo com qualquer técnica evidente para aqueles versadosna arte. Por exemplo, em certas modalidades, a glcieerofosforilcolina pode sercontatada com uma glicerofosforílcolina diesterase, conhecida daquelesversados na arte (por exemplo, a EC 3. 1. 4. 2), sob as condições adequadaspara fornecer colina. A colina resultante pode ser colocada em contato comuma colina oxidase, conhecida daqueles versados na arte (por exemplo, a EC1.1.3.17), sob condições adequadas para fornecer peróxido. O uso de colinaoxidase permite com que o método detecte a lisofosfatidilcolina, depreferência a outros lisofosfolipídeos, tais que os lisofosfolipídeos quecompreendem serina ou etanolamina. O peróxido resultante pode serdetectado através de qualquer técnica evidente para aqueles de habilidade naarte, incluindo, por exemplo, técnicas colorimétricas.

A detecção de peróxido de hidrogênio pode ser efetuadaatravés de qualquer técnica evidente para aqueles de habilidade na arte.Técnicas exemplares incluem quimioluminescência (kiba et ai., 2003,Analytical Science 19 (6): 823- 827), fluorescência (Zhang et al., 199, Talanta48 (5): 1031 - 1038; Chen et al. 2001, Analytica Chimica 434 (1): 51-58), eespectrofotometria (Pappas et al., 2002, Analytica Chimica, 455 (2): 305 -313). Outras técnicas exemplares incluem completos metálicos (Paleologos,2002, Analytieal Chemistry 74 (1): 100 - 106), assim como a detecçãoeletroquímica mediada por redox (por exemplo, medidores de glicosecomercialmente disponíveis).

Em modalidades vantajosas, a atividade de peroxidase podeser detectada com um substrato fluorogênico. Tais modalidades fornecemtécnicas rápidas e sensíveis para a detecção de lisofosfatidilcolina total naamostra. Estas técnicas fornecem, deste modo, ensaios rápidos e sensíveispara o diagnóstico ou o prognóstico de uma condição inflamatória sistêmica,tal como aqui descrito. O substrato fluorogênico pode ser qualquer substratofluorogênico conhecido daqueles versados na arte, que seja capaz deconversão para um produto fluorescente através de uma peroxidase, napresença de peróxido sob condições adequadas, por exemplo com água eoxigênio. Em modalidades particulares, o substrato fluorogênico é 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina. Estes substratos podem ser obtidos a partir defornecedores comerciais (por exemplo, Amplex, Red, Invitrogen). Aqueles dehabilidade na arte irão reconhecer que este substrato fluorogênico pode serconvertido ao produto fluorescente 7-hidróxi-3H-fenoxazina-3-ona(resorufina), detectável através de técnicas evidentes para aqueles versados naarte. Técnica de detecção úteis incluem, naturalmente, a detecção porfluorescência. De modo preferido, os métodos de detecção são executadossob condições, nas quais o produto pode ser formado e detectado. Condiçõesúteis e resultados são descritos nos exemplos operacionais abaixo.

Em certas modalidades, a glicerofosforilcolina pode sercolocada em contato com glicerofosforilcolina fosfodiesterase, conhecidadaqueles versados na arte, sob condições adequadas para fornecer glicerol-3 -fosfato. O glicerol-3- fosfato resultante pode ser colocado em contato comuma glicerol-3-fosfato oxidase, conhecida daqueles versados na arte, sobcondições adequadas para fornecer peróxido. Glicerol-3- fosfato oxidasesúteis incluem aquelas derivadas a partir de Streptococcus, Aerococcus, ePediococcus, e aquelas descritas na JP- 2002 - 17398. O peróxido resultandopode ser detectado através de qualquer técnica evidente para aqueles versadosna arte, incluindo, por exemplo, as técnicas colorimétricas.

Em certas modalidades, a glicerofosforilcolina pode sercolocada em contato com uma glicerofosforilcolina fosfodiesterase, conhecidadaqueles versados na arte, sob condições adequadas para fornecer glicerol-3 -fosfato. O glicerol-3-fosfato resultante pode ser colocado em contato comglicerol-3- fosfato desidrogenase, conhecido daqueles versados na arte, sobcondições adequadas para fornecer um produto detectável. Por exemplo, ocontato pode ocorrer na presença de NAD+ de modo a fornecer NADHdetectável. O contato pode também ocorrer na presença de NADP+, de modoa fornecer NADPH detectável.

As técnicas para a detecção, medição ou monitoração deprodutos detectáveis, tais que peróxido, NADH e NADPH são bemconhecidas daqueles versados na arte. Técnicas úteis são descritas na JP 2002-17298, Misaki, 1999, Modem Medicai Laboratory 27(8): 973 - 980, (1999),Patente Japonesa N0 15994750, Patente Japonesa Exposta a Exame N0 05-229993, e Aoyama, 1997, Journal OfMedical Technology, 14: 1014- 1019,cujos conteúdos são incorporados a este, a título referencial. Em suastotalidades.

5.6. Diagnóstico ou Prognóstico da Condição Inflamatória

Sistêmica

Em certos métodos da invenção, a lisofosfatidilcolina total nopaciente é usada para o diagnóstico ou o prognóstico da condição inflamatóriasistêmica. Conforme acima descrito, a lisofosfatidilcolina total pode sermedida diretamente, ou pode ser efetuada uma medição, que estácorrelacionada à quantidade de lisfosfatidilcolina total. Em certasmodalidades, a lisofosfatidilcolina total é medida. Em certas modalidades, alisofosfatidilcolina livre e a lisofosfatidilcolina ligada são medidas.

Em certos métodos da invenção, a quantidade de um ou maisbiomarcadores de lisofosfatidilcolina no paciente é usada para o diagnósticoou o prognóstico da condição inflamatória sistêmica.

Em certos métodos da invenção, a quantidade total delisofosfatidilcolina e um ou mais biomarcadores de lisofosfatidilcolina nopaciente são usados para o diagnóstico ou o prognóstico da condiçãoinflamatória sistêmica.

Em algumas modalidades, uma única amostra a partir dopaciente é suficiente para o diagnóstico ou prognóstico da condiçãoinflamatória sistêmica. Em tais modalidades, a quantidade delisofosfatidilcolina pode ser comparada a uma referência interna na amostrabiológica, que está presente em uma quantidade relativamente constante emindivíduos similares ao paciente. A referência interna pode ser qualquerreferência julgada estável para aquele de habilidade na arte e, de modopreferido não está relacionada ao biomarcador ou a condições inflamatóriassistêmicas. Em certas modalidades, a referência interna é fosfatidilcolina,fosfatidiletanolamina ou fosfatidilserina.

Em algumas modalidades, uma pluralidade de amostrasbiológicas a partir do paciente são avaliadas quanto ao diagnóstico ou aoprognóstico da condição inflamatória sistêmica. Em tais modalidades, aalteração na quantidade de lisofosfatidilcolina é indicativa de risco para acondição inflamatória sistêmica.

Em certas modalidades, quantidades crescentes delisofosfatidilcolina indicam um risco decrescente quanto a uma condiçãoinflamatória sistêmica. Por exemplo, em certas modalidades, uma segundaquantidade, ou seja pelo menos 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 300%,400%, ou 500% de uma quantidade prévia indica o risco diminuído quanto àcondição inflamatória sistêmica.

Em certas modalidades, quantidades decrescentes delisofosfatidilcolina indicam um risco crescente quanto a uma condiçãoinflamatória sistêmica. Por exemplo, em certas modalidades, uma segundaquantidade, que é inferior a 95%, 90%, 80%, 75%, 50%, 33%, 25%, 20% ou10% de

uma quantidade prévia indica um risco diminuído quanto àcondição inflamatória sistêmica.

Em certas modalidades, o diagnóstico ou o prognóstico dacondição inflamatória sistêmica pode ser baseado em uma comparação daquantidade de lisofosfatidilcolina em uma amostra do paciente para umaquantidade referencial de lisofosfatidilcolina. Quantidades referenciais sãodescritas na seção abaixo. De modo significativo, a quantidade da quantidadede referência não precisa ser obtida ou medida por aquele habilitado em ummétodo da invenção. Em vez disso, a quantidade de referência pode seridentificada pela consulta de quantidades de referência em populações dereferência, disponíveis para aqueles versados na arte. Tais quantidades podemser publicadas, por exemplo, na literatura científica referente a bases de dadoseletrônicas.

Em modalidades preferidas, a quantidade referencial é medidapela mesma técnica ou por uma técnica comparável, usada para medir aquantidade na amostra. Por exemplo, de modo preferido, se alisofosfatidilcolina livre for medida na amostra, a quantidade referencial podeser baseada na lisofosfatidilcolina livre em um paciente referencial ou emuma população referencial. Por exemplo, de modo preferido, se alisofosfatidilcolina ligada for medida na amostra, a quantidade referencialpode ser baseada na lisofsfatidilcolina ligada. Naturalmente, se alisofosfatidilcolina total e a quantidade referencial forem medidas através detécnicas diferentes, a correlação das duas quantidades deve estar dentro dahabilidade daquele versado na arte.

Se um biomarcador de lisofsfatidilcolina for medido naamostra, uma quantidade referencial pode ser baseada no biomarcador delisfosfatidilcolina, em um paciente referencial ou em uma populaçãoreferencial.

Quando uma quantidade referencial é usada, a diferença entrea quantidade referencial e a quantidade no paciente de teste é usada poraquele versado na arte para produzir um diagnóstico ou um prognóstico dacondição inflamatória sistêmica. Em certas modalidades, se a quantidade nopaciente de teste estiver entre 10 - 190%, 20-180%, 30-170%, 40-160%, 50-150%, 75-125%, 80-120%, 90-110% ou 95-105% da quantidade referencial, odiagnóstico ou o prognóstico da condição inflamatória sistêmica é indicado.Se uma quantidade referencial de corte for usada, a diferençaentre o corte e a quantidade no teste/paciente é usada por aquele versado naarte para produzir um diagnóstico ou prognóstico da condição inflamatóriasistêmica. Em certas modalidades, se a quantidade do paciente de teste estiverabaixo, ou substancialmente abaixo, da quantidade referencial de corte, odiagnóstico ou o prognóstico da condição inflamatórias sistêmica é indicado,e se a quantidade no paciente de teste estiver acima, ou substancialmenteacima, da quantidade referencial de teste, não seria indicado diagnóstico ouprognóstico da condição inflamatória sistêmica.

Em certas modalidades, a diferença entre a quantidade delisofosfatidilcolina no paciente de teste e a quantidade referencial estãoinversamente correlacionados com o risco quanto à condição inflamatóriasistêmica. Uma tal correlação pode ser determinada por aqueles versados naarte.

Quando as quantidades referenciais a partir de uma pluralidadede pacientes referenciais forem usadas, a avaliação pode ser baseada emqualquer técnica estatística conhecida daqueles versados na arte. De modosimilar, quanto uma pluralidade de biomarcadores for usada, o diagnóstico ouo prognóstico podem ser baseados na pluralidade de quantidades de acordocom as técnicas conhecidas daqueles versados na arte, tais que aquelasdescritas na Publicação de Pedido de Patente U. S. N°s. 20030194752,20040096917, 20040097460, 20040106142, 20040157241, e os PedidosProvisórios U. S. N°s. 60/671. 620, depositado em 15 de abril de 2005,60/671. 941, depositado em 15 de abril de 2005, e 60/674. 046, depositado em22 de abril de 2005, cujos conteúdos são incorporados a este, a títuloreferencial, em suas totalidades.

5.7.Biomarcador de Referência

Em certos métodos da invenção, a quantidade defosfatidilcolina total do paciente é comparada a uma quantidade referencial delisofosfatidilcolina total. A quantidade referencial é, de modo típico, aquantidade de lisofosfatidilcolina total em um paciente referencial (não opaciente do método) que apresenta, ou que deverá apresentar dentro de umperíodo de tempo definido, uma condição inflamatória sistêmica conhecida.

Embora não tenhamos a intenção ser estarmos limitados por qualquer teoriade operação particular, a presente invenção é baseada, em parte, na descobertade uma correlação entre a lisfosfatidilcolina total e uma condição inflamatóriasistêmica em um paciente. Deste modo, aquele que pratica um método deacordo com a invenção pode comparar a quantidade de lisofosfatidilcolinatotal em um paciente com uma quantidade referencial de lisofosfatidilcolinatotal, de modo a efetuar um prognóstico ou diagnóstico da condiçãoinflamatória sistêmica.

Em certos métodos da invenção, a quantidade do biomarcadorde lisofosfatidilcolina do paciente é comparada a uma quantidade referencialcorrespondente do biomarcador. A quantidade referencial é, de modo típico, aquantidade do mesmo biomarcador, ou de um derivado do mesmo, em umpaciente referencial (não o paciente do método), que apresenta, ou que deveráapresentar, dentro de um período de tempo definido, uma condiçãoinflamatória sistêmica conhecida. Embora não tenhamos a intenção de estarlimitados a qualquer teoria particular de operação, a presente invenção ébaseada, em parte, na descoberta de uma correlação entre um biomarcador delisofosfatidilcolina da invenção e uma condição inflamatória sistêmica em umpaciente. Deste modo, aquele que pratica um método de acordo com ainvenção pode comparar a quantidade de biomarcador de lisofosfatidilcolinaem um paciente com uma quantidade referencial do biomarcador delisofosfatidilcolina, de modo a produzir um prognóstico ou diagnóstico dacondição inflamatória sistêmica.

De modo vantajoso, para praticar os métodos da invenção, nãoé necessário reunir as quantidades referenciais de lisofosfatidilcolina empopulações referenciais. Tais quantidades referenciais podem ser identificadasem fontes disponíveis para aqueles versados na arte, tais que bases de dadoparticulares ou públicas, ou através de referência aos dados aqui providos.Como tais, nos métodos que usam uma quantidade referencial delisofosfatidilcolina, não é necessário fazer a comparação descrita no método.

Uma quantidade referencial pode ser medida de acordo comtécnicas bem conhecidas daqueles de habilidade nas arte, incluindo aquelasaqui descritas. De modo vantajoso, em certas modalidades, a quantidade delisfosfatidilcolina no paciente referencial e a quantidade de lisofosfatidilcolinano paciente de teste são obtidas através da mesma técnica.

O paciente de referência pode ser qualquer paciente queapresente, ou que irá apresentar dentro de um período de tempo definido, ossintomas da condição inflamatória sistêmica, de acordo com aquele versadona arte. Em certas modalidades, a quantidade referencial é obtida em ummomento, em que o paciente referencial está apresentando os sintomas. Emcertas modalidades, a quantidade referencial pode ser obtida em um períodode tempo antes, ou em um período de tempo após, o paciente referencialapresentar os sintomas de, ou receber o diagnóstico, da condição inflamatóriasistêmica. Por exemplo, em certas modalidades, as quantidades referenciaissão obtidas a partir de pacientes referenciais 48, 36, 24 ou 12 horas antes doinício da sepse. Aquele de habilidade na arte irá reconhecer que taisquantidades podem ser obtidas através da medição das quantidades em umapopulação referencial, que esteja em risco de sepse, e de acordo com osdiagnósticos do paciente referencial ao longo do tempo.

O paciente de referência pode apresentar qualquer condiçãoinflamatória sistêmica, ou pode estar livre de uma condição inflamatóriasistêmica. Em certas modalidades, o paciente de referência pode ser negativopara SIRS, ou apresentar os sintomas de SIRS, sepse, sepse severa, choqueséptico, disfunção orgânica múltipla, ou mortalidade. Tais quantidadesreferenciais podem ser usadas para o diagnóstico ou o prognóstico dacondição.

Os métodos para o diagnóstico da condição inflamatóriasistêmica devem ser executados de acordo com o conhecimento daqueles dehabilidade na arte. Tais métodos constituem a rotina e não serão aquidescritos.

Em certas modalidades, o diagnóstico ou o prognóstico de umacondição inflamatória sistêmica é baseado em uma quantidade referencial decorte. Uma quantidade referencial de corte é um valor absoluto para aquantidade que indica o risco quanto à condição inflamatória sistêmica. Porexemplo, uma quantidade referencial de corte de 100 para um biomarcador deacordo com a invenção pode indicar o risco quanto a uma condiçãoinflamatória sistêmica quando o paciente de teste apresenta uma quantidadedo biomarcador que é inferior a 100 (ou superior a 100 em modalidadesalternativas). As quantidades referenciais de corte podem ser determinadasusando as técnicas estatísticas bem conhecidas daqueles versados na arte, combase em quantidades referenciais obtidas a partir dos paciente referenciais.

Por exemplo, um corte para uma condição inflamatória sistêmica particularpode ser determinado, de tal modo que um paciente referencial possua umdiagnóstico ou prognóstico dentro de um intervalo de segurança adequadopara aqueles de habilidade na arte, por exemplo com 60%, 70%, 80%, 85%,90%, 95% ou 99% de segurança.

5. 8. Métodos de Monitoração do Tratamento ouPrevenção das Condições Inflamatórias Sistêmicas.

Em certos aspectos, a presente invenção provê métodos demonitorar uma condição inflamatória sistêmica, ou risco quanto à condiçãoinflamatória sistêmica, em um paciente que esteja em necessidade do mesmo.

Em certas modalidades, a quantidade de lisofosfatidilcolina é obtida a partirdo paciente e usada para avaliar a condição de um risco para a condição.Em modalidades particulares, a presente invenção provêmétodos de monitoração de um tratamento de uma condição inflamatóriasistêmica. Os métodos da invenção podem ser usados para determinar aeficácia do tratamento e alterar o tratamento, dependendo dos resultados dométodo. Tais métodos compreendem, de modo geral, o estágio de medir aquantidade de lisofosfatidilcolina, de modo a avaliar o risco quanto a umacondição inflamatória sistêmica em um paciente, que tenha recebido, ou quedeva receber, um tratamento de prevenção de uma condição inflamatóriasistêmica.

Em certas modalidades, a presente invenção provê métodos demonitorar um tratamento ou prevenção de SIRS, sepse, sepse severa, choqueséptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade. O tratamento ouprevenção pode ser qualquer tratamento ou prevenção de SIRS, sepse, sepsesevera, choque séptico, disfunção orgânica múltipla ou mortalidade,conhecido daqueles versados na arte.

Em certas modalidades, o tratamento ou prevençãocompreende a administração de antibióticos de acordo com técnicasconhecidas daqueles de habilidade na arte. O antibiótico pode ser qualquerantibiótico adequado para o tratamento ou a prevenção de uma condiçãoinflamatória sistêmica, conhecido daqueles versados na arte. Em algumasmodalidades, o antibiótico pode ser efetivo contra bactérias gram-positivas,tais que gentamicina, ceftriazona, tobramicina ou ceftazidina. Em algumasmodalidades, o antibiótico pode ser efetivo contra bactérias gram-negativas,tais que vancomicina. Em algumas modalidades, o antibiótico pode serefetivo contra bactérias anaeróbicas, tais que metrionidazol.

Em uma modalidade adicional, o tratamento ou a prevençãocompreende a administração de um esteróide, de acordo com técnicasconhecidas daqueles versados na arte. O esteróide pode ser qualquer esteróideadequado para o tratamento ou a prevenção da condição inflamatóriasistêmica, conhecido daqueles versados na arte. Em certas modalidades, oesteróide é hidrocortiosna ou dexametasona.

Em modalidades adicionais, o tratamento ou prevençãocompreende a administração de uma terapia vasopressora ou inotrópica, deacordo com técnicas bem conhecidas daqueles versados na arte. A terapiavasopressora ou inotrópica pode ser qualquer terapia vasopressora ouinotrópica adequada para o tratamento ou a prevenção da condiçãoinflamatória sistêmica, conhecida daqueles versados na arte. Em certasmodalidades, a terapia vasopressora ou inotrópica é norepinefrina, dopaminaou dobutamina.

Em modalidades adicionais, o tratamento ou a prevençãocompreende a administração de XIGRIS® (drorecogin alfa (ativado), Eli Lillyand Company), XIGRIS® é uma forma recombinante da proteína C ativadahumana, aprovada pela United States Food and Drug Administration, para aredução da mortalidade em pacientes adultos com sepse severa.

Em modalidades particulares, a presente invenção provêmétodos de tratamento ou de prevenção de uma condição inflamatóriasistêmica. Os métodos compreendem os estágios de administrar umtratamento ou prevenção da condição inflamatória sistêmica e do risco demonitoração ou severidade da condição inflamatória sistêmica, de acordo comum método da invenção. O risco ou severidade da condição inflamatóriasistêmica pode ser determinado de acordo com os métodos aqui descritos.

Em certas modalidades, a administração adicional do tratamento ou daprevenção podem ser ajustados com base em um resultado da monitoração deacordo com o julgamento daquele versado na arte.

Em uma modalidade, a presente invenção provê um método detratamento ou de prevenção de uma condição inflamatória sistêmica em umpaciente, que esteja em necessidade do mesmo, que compreende os estágiosde administrar ao paciente uma quantidade efetiva de XIGRIS® e monitorar acondição inflamatória sistêmica de acordo com um método da invenção. Emcertas modalidades, a condição inflamatória sistêmica é sepse ou sepse severa.

Em algumas modalidades, uma pluralidade de quantidades delisofosfatidilcolina são obtidas ao longo do tempo, de modo a monitorar acondição inflamatória sistêmica. Em certas modalidades, quantidadescrescentes indiciam o risco diminuído da condição inflamatória sistêmica ou aseveridade diminuída da condição. Por exemplo, em certas modalidades, umasegunda quantidade, que é de pelo menos 110%, 125%, 150%, 175%, 200%,300%, 400% ou 500% de uma quantidade prévia indica o risco diminuídoquanto à condição inflamatória sistêmica ou a severidade diminuída dacondição. Em modalidades adicionais, as quantidades decrescentes indicam orisco aumentado da condição inflamatória sistêmica ou a severidadeaumentada da condição. Por exemplo, em certas modalidades, uma segundaquantidade, que é inferior a 95%, 90%, 80%, 75%, 50%, 33%, 25%, 20% ou10% de uma quantidade prévia indica o risco aumentado quando à condiçãoinflamatória sistêmica ou a severidade aumentada da condição.

Em algumas modalidades, uma ou mais quantidades sãoobtidas ao longo do tempo. Em tais modalidades, a diferença entre aquantidade de lisofosfatidilcolina e uma quantidade referencial delisofosfatidilcolina total para uma condição inflamatória sistêmica é usadapara o diagnóstico ou o prognóstico da condição inflamatória sistêmica. Acomparação com a quantidade referencial pode ser executada como acimadescrito.

5. 9 Kits para o Diagnóstico ou Prognóstico, ouMonitoração, de uma Condição Inflamatória Sistêmica

A invenção também provê kits, que são úteis para odiagnóstico ou o prognóstico, ou a monitoração, de uma condiçãoinflamatória sistêmica em um paciente. Em algumas modalidades, os kits dapresente invenção compreendem um reagente, que liga, de modo específico, alisofosfatidilcolina total. O reagente pode constituir parte de um conjunto, ouo reagente pode ser embalado de modo separado e/ou individual. O kit podetambém compreender pelo menos um padrão interno, a ser usado na avaliaçãoda lisofosfatidilcolina total. Em modalidades particulares, os kitscompreendem um conjunto de anticorpos ou um chip de anticorpos, comespecificidade para um ou mais biomarcadores, em uma luralidade ou painelde biomarcadores da invenção.

Os kits da presente invenção contêm reagentes, que podem serusados para detectar biomarcadores contidos nas amostras biológicas, a partirdas quais os perfis de biomarcador são gerados. Em uma modalidadeespecífica, a invenção provê um kit para prever o desenvolvimento de sepseem um paciente de teste, que compreende um anticorpo, que liga, de modoespecífico, lisofosfatidilcolina total. De acordo com esta modalidade, o kitpode compreender um anticorpo ou fragmento funcional ou derivado domesmo (por exemplo, fragmentos de Fab, F(ab')2, Fv, ou scFv), que ligam, demodo preferido, lisofosfatidilcolina total. Em certas modalidades, osanticorpos podem ser rotulados de modo detectável.

Em certas modalidades, os kits compreendem reagentes úteispara a detecção da lisofosfatidilcolina total em uma amostra. Em certasmodalidades, os reagentes compreendem uma ou mais enzimas e um ou maissubstratos, úteis para a detecção de lisofosfatidilcolina. Em modalidadesparticulares, os kits compreendem um substrato fluorogênico, útil para adetecção de lisofsofatidilcolina total. Certos kits compreendem uma enzimaou reagente, capaz de reagir lisofosfatidilcolina, de modo a formarglicerofosfatidilcolina sob condições adequadas, uma enzima ou reagentecapaz de reagir glicerofosfatidilcolina para formar colina sob condiçõesadequadas, uma enzima ou reagente, capaz de reagir colina para formarperóxido sob condições adequadas, uma peroxidase e um substratofluorogênico da referida peroxidase. Certos kits compreendem umalisofosfolipases, uma glicerofosfatidilcolina diesterase, uma colina oxidase,uma peroxidase e 10-acetil- 3,7-diidroxifenoxazina. Certos kits compreendemEC 3.1.1. 5, EC 3.1.4.2, EC 1.1.3.17, peroxidase de rábano silvestre e 10-acetil-3, 7-diidroxifenoxazina. Os kits podem ainda compreender um ou maispadrões de referência para avaliar a lisofosfatidilcolina total, de acordo comos métodos da invenção.

A invenção também provê kits, que são úteis para odiagnóstico ou o prognóstico, ou a monitoração, de uma condiçãoinflamatória sistêmica em um paciente. Em algumas modalidades, os kits dapresente invenção compreendem um reagente, que liga, de modo específico,um biomarcador da presente invenção. O reagente pode fazer parte de umarranjo, ou o reagente pode ser embalado de um modo separado e/ouindividual. O kit pode também compreender pelo menos um padrão interno, aser usado na avaliação de um biomarcador da presente invenção. Emmodalidades particulares, os kits compreendem um conjunto de anticorpos,com especificidade para um ou mais biomarcadores em uma pluralildade oupainel de biomarcadores da invenção.

Os kits da presente invenção contêm reagentes, que podem serusados para detectar os biomarcadores contidos nas amostras biológicas, apartir das quais os perfis de biomarcador são gerados. Em uma modalidadeespecífica, a invenção provê um kit para prever o desenvolvimento de sepseem um paciente de teste, que compreende um anticorpo, que liga, de modoespecífico, um biomarcador da invenção. De acordo com esta modalidade, okit pode compreender um anticorpo ou fragmento funcional ou derivado domesmo (por exemplo, fragmentos de Fab, F(ab')2, Fv, u scFv), que ligam, demodo específico, um ou mais dos biomarcadores da invenção. Em certasmodalidades, os anticorpos podem ser rotulados de modo detectável.

Em outras modalidades da invenção, um kit pode compreenderum reagente de ligação de um biomarcador específico, tal que um aptâmero.Se os biomarcadores compreenderem um ácido nucléico, o kit pode proveruma sonda de oligonucleotídeo, que é capaz de formar um dúplex com obiomarcador ou com um filamento complementar de um biomarcador. Asonda do oligonucleotídeo podes ser rotulada de modo detectável.

Os kits da presente invenção podem também incluir reagentes,tais que tampões, ou outros reagentes, que podem ser usados na obtenção deuma quantidade do biomarcador. A prevenção da ação de microorganismospode ser assegurada através da inclusão de vários agentes antibacterianos eantifungicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e ossimilares. Pode ser também desejável incluir agentes isotônicos, tais queaçúcares, cloreto de sódio e os similares.

Em modalidades, que utilizam biomarcadores em adição alisofosfatidilcolina, tais que biomarcadores de ácido nucléico, os kits podemcompreender, de modo vantajoso, um microarranjo. Em uma modalidade,este microarranjo compreende uma pluralidade de pontos de sonda parabiomarcadores a serem avaliados com o kit. Em algumas modalidades, omicroarranjo consiste de entre cerca de três e cerca de uma centena de pontosde sonda sobre um substrato. Em algumas modalidades, o microarranjoconsiste de entre cerca de três e uma centena de pontos sobre um substrato.Como usado neste contexto, o termo "a cerca de" significa dentro de cincopor cento do valor mencionado, dentro de dez por cento do valor mencionado,ou dentro de vinte e cinco por cento do valor mencionado.

Em certas modalidades, os kits compreendem ainda um rótuloou rotulação com instruções para a execução de um método da invenção. Porexemplo, o rótulo ou rotulação pode prover uma quantidade referencial ouquantidades referenciais de lisofosfatidilcolina, que correspondem a uma oumais condições inflamatórias sistêmicas. O rótulo ou rotulação pode proveruma ou mais quantidades referenciais de corte de lisofosfatidilcolinacorrespondendo a uma ou mais condições inflamatórias sistêmicas. Alémdisso, o rótulo ou rotulação pode prover citações ou ligações a fontes de taisquantidades de referência.

Alguns kits da invenção podem ainda compreendem umproduto de programa de computador para o uso em conjunção com umsistema de computador, em que o produto do programa de computadorcompreende um meio de armazenamento legível por computador, em que oproduto do programa de computador compreende um meio de armazenamentolegível por computador e um mecanismos de programa de computadorembutido no mesmo. Em tais kits, o mecanismo de programa de computadorcompreende instruções para avaliar se uma ou mais quantidades delisofosfatidilcolina de um paciente de teste, em risco de desenvolver umacondição inflamatória sistêmica, satisfaz a um primeiro conjunto de valores.Satisfazer ao primeiro conjunto de valores prevê que o paciente apresenta aprobabilidade de desenvolver a condição inflamatória sistêmica. Em algunskits, o produto de programa de computador compreende ainda instruções paraavaliar se uma ou mais quantidades de lisofosfatidilcolina do pacientesatisfazem a um segundo conjunto de valores. Satisfazer a um segundoconjunto de valores prevê que o paciente de teste não apresenta aprobabilidade de desenvolver a condição inflamatória sistêmica.

5. 10. Algoritmos para o Diagnóstico ou Prognóstico, ouMonitoração, de uma Condição Inflamatória Sistêmica

A presente invenção provê biomarcadores delisofosfatidilcolina total e de lisofosfatidilcolina úteis para o diagnóstico,prognóstico e monitoração de uma condição inflamatória sistêmica. Comoacima descrito, a lisofosfatidilcolina pode ser usada isoladamente ou comoparte de uma pluralidade ou painel de biomarcadores. Uma pluralidade oupainel de biomarcadores pode compreender uma lisofosfatidilcolina dainvenção, os biomarcadores conhecidos daqueles versados na arte como sendoúteis, ou ambos. Em modalidades vantajosas, estes biomarcadores são capazesde discriminar entre os conversores e os não-conversores.

A identidade destes biomarcadores e as suas característicascorrespondentes (por exemplo, a quantidade ou valores de expressão) podemser usados para desenvolver uma regra de decisão, ou uma pluralidade deregras de decisão, que discriminam entre conversores e não-conversores. Osalgoritmos de análise de dados podem ser usados para construir um númerode tais regras de decisão. Os algoritmos de análise de dados utilizamcaracterísticas (por exemplo, a quantidade ou valores de expressão) de umsubconjunto de biomarcadores da presente invenção através de umapopulação de treinamento, que inclui conversores e não-conversores. Demodo típico, um paciente de SIRS é considerado com um não-conversorquando o paciente não desenvolve sepse em um período de tempo definido(por exemplo, período de observação). Este período de tempo definido podeser, por exemplo, doze horas, vinte e quatro horas, quarenta e oito horas, umdia, uma semana, um mês, ou mais. Algoritmos de análise de dadosespecíficos para a construção de uma regra de decisão, ou uma pluralidade deregras de decisão, que discriminam entre pacientes que desenvolvem a sepse epacientes que não desenvolvem a sepse durante um período definido serãodescritos nas subseções abaixo. Uma vez que uma regra de decisão tenha sidoconstruída usando estes algoritmos de análise de dados exemplares ou outrastécnicas conhecidas na arte, a regra de decisão pode ser usada para classificarum paciente de teste em uma das duas ou mais classes fenotípicas (porexemplo, um conversor ou um não-conversor). Isto é executado através daaplicação da regra de decisão a um perfil de biomarcador, obtido a partir dopaciente de teste. Tais regras de decisão, portanto, têm valor comoindicadores de diagnóstico.

A presente invenção provê, em um aspecto, quanto à avaliaçãode um perfil de biomarcador a partir de um paciente de teste em perfis debiomarcador obtidos a partir de uma população de treinamento. Em algumasmodalidades, cada perfil de biomarcador obtido a partir de pacientes napopulação de treinamento, assim como o paciente de teste, compreende umacaracterística de cada um de uma pluralidade de biomarcadores diferentes.Em algumas modalidades, esta comparação é executada através de (i)desenvolvimento de uma regra de decisão usando os perfis de biomarcador apartir da população de treinamento e (ii) aplicar a regra de decisão ao perfil demarcador a partir do paciente de teste. Como tais, as regras de decisãoaplicadas em algumas das modalidades da presente invenção são usadas paradeterminar se um paciente de teste, que tenha SIRS, apresentará, ou não, aprobabilidade de contrair sepse.

Em algumas modalidades da presente invenção, quando osresultados da aplicação de uma regra de decisão indicam que o paciente irá,de modo provável, contrair sepse, o paciente é diagnosticado como umpaciente de "sepse". Se os resultados de uma aplicação de uma regra dedecisão indicarem que o paciente não irá contrair sepse, o paciente serádiagnosticado como um paciente de "SIRS". Deste modo, em algumasmodalidades, o resultado da situação de decisão binária acima descritoapresenta quatro resultados possíveis:

• verdadeiramente séptica, em que a regra de decisão indicaque o paciente irá adquirir sepse e que paciente irá, de fato, adquirir sepsedurante o período de tempo definido (verdadeiramente positiva, TP);

• (ii) falsamente séptica, em que a regra de decisão indica queo paciente irá adquiri sepse e o paciente de, de fato, não adquire sepse duranteo período de tempo definido (falsamente positiva, FP);

· (iii) verdadeiramente SIRS, em que a regra de decisão indicaque o paciente não irá adquirir sepse e o paciente, de fato, não adquire sepsedurante o período de tempo definido (verdadeiramente negativo, TN); ou

• (iv) falsamente SIRS, em que a regra de decisão indica que opaciente não irá adquirir sepse e o paciente, de fato, adquire sepse durante operíodo de tempo definido(falsamente negtiva, FN).

Será apreciado que outras definições para TP, FP, TM, FNpodem ser efetuadas Por exemplo, TP poderia ser definido como casos, emque a regra de decisão indica que o paciente não irá adquirir sepse e opaciente, de fato, não adquire sepse durante o período de tempo definido.Embora todas tais definições alternativas estejam dentro do escopo dapresente invenção, para a facilidade de entendimento da presente invenção, asdefinições dadas para TP, FP, TN e FN, dadas pelas definições (i) a (iv) acimaserão aqui usadas, a não ser que mencionado de outro modo.

Como será apreciado por aqueles versados na arte, um númerode critérios quantitativos podem ser usados para comunicar o desempenho dascomparações efetuadas entre um perfil de biomarcador de teste e os perfis debiomarcador de referência (por exemplo, a aplicação de uma regra de decisãoao perfil do biomarcador a partir de um paciente de teste). Estes incluem ovalor previsto positivo (PPV), o valor negativo previsto (NPV),especificidade, sensibilidade, precisão, e certeza. Em adição outrasconstruções de tais curvas de operador de receptor (ROC) podem ser usadaspara avaliar o desempenho de regra de decisão. Como aqui usado:

• PPV = TP/(TP + FP)

• NPV = TN/(TN + FN)

• especificidade = TN/(TN + FP)

• sensibilidade = TP/(TP + FN)

• precisão — certeza - (TN + TP)/N

Aqui, N é o número de amostras comparadas (por exemplo, onúmero de amostras de teste para o qual uma determinação de sepse ou SIRSé buscada), por exemplo, considerar o caso, em que existem

Dez pacientes para os quais uma classificação de SIRS/sepse ébuscada. Perfis de biomarcador são construídos para cada um dos dezpacientes de teste. Então, cada um dos perfis de biomarcador é avaliadoatravés da aplicação de uma regra de decisão, em que a regra de decisão foidesenvolvida com base nos perfis de biomarcador, obtidos a partir de umapopulação de treinamento. Neste exemplo, N, a partir das equações acima, éigual a 10. De modo típico, N é um número de amostras, em que cada amostrafoi coletada a partir de um membro diferente de uma população. Estapopulação pode, de fato, ser constituída de dois tipos diferentes. Em um tipo,a população compreende pacientes, cujas amostras e dados fenotípicos (porexemplo, valores característicos de biomarcadores e uma indicação de se opaciente adquiriu sepse, ou não) foi usado para construir ou refinar uma regrade decisão. Uma tal população é aqui referida como uma população detreinamento. No outro tipo, a população compreende pacientes, que não foramsuados para construir a regra de decisão. Uma tal população é aqui referidacomo a uma população de validação. A não ser que mencionado de outromodo, a população representada por N é ou exclusivamente uma população detreinamento ou exclusivamente uma população de validação, em oposição auma mistura dos dois tipos de população. Será apreciado que classificações,tais que a de precisão, será mais elevadas (mais próximas da unidade) quandoelas forem baseadas em uma população de treinamento em oposição a umapopulação de validação. Contudo, a não ser que aqui expressamentemencionado explicitamente de outro modo, todos os critérios usados paraavaliar o desempenho de uma regra de decisão (ou outras formas de avaliaçãode um perfil de biomarcador a partir de um paciente de teste) incluindo acerteza (precisão) referem-se a critérios, que foram medidos através daaplicação da regra de decisão correspondendo aos critérios ou de umapopulação de treinamento ou de uma população de validação. Além disso, asdefinições para PPV, NPV, especificidade, sensibilidade e precisão, acimadefinidas, podem ser também encontradas em Draghici, Data Analysis Toolsfor DNA Microanalysis, 2003, CRC Press LLC5 Boca Raton, Flórida, págs.342- 343, que é incorporada a esta a título referencial.Em algumas modalidades, a população de treinamentocompreende não-conversores e conversores. Em algumas modalidades, osperfis de biomarcador são construídos a partir desta população usandoamostras biológicas coletadas a partir da população de treinamento em algumperíodo de tempo antes do início da sepse pelos conversores da população.Deste modo, para os conversores da população de treinamento, uma amostrabiológica pode ser coletada duas semanas antes, uma semana antes, quatrodias antes, três dias antes, um dia antes, ou qualquer outro período de tempoantes que os conversores se tornassem sépticos. Na prática, tais coleções sãoobtidas através da coleta de uma amostra biológica, em intervalos regulares,após o paciente ter sido admitido no hospital com um diagnóstico de SIRS.Por exemplo, em uma abordagem, pacientes que receberam o diagnóstico deSIRS em um hospital são usadas como uma população de treinamento. Umavez admitidos no hospital com SIRS, as amostras biológicas são coletadas apartir dos pacientes em períodos de tempo selecionados (por exemplo, a cadahora, a cada oito horas, a cada doze horas, diariamente, etc.). Uma porção dospacientes contrai sepse e uma porção dos pacientes não contrai sepse. Para ospacientes que contraem sepse, as amostras biológicas tomadas a partir dospacientes justo antes do início da sepse são denominadas amostras biológicasTj2· Todas as outras amostras biológicas a partir dos pacientes são indexadasretroativamente em relação a estas amostras biológicas. Por exemplo, quandouma amostra foi tomada a partir de um paciente em uma base diária, aamostra biológica tomada no dia antes da amostra T]2 é referida como aamostra biológica T36. Os pontos de tempo para as amostras biológicas paraum não-conversor em uma população de treinamento são identificadas pela"conjugação do tempo" do paciente não-conversor um paciente conversor. Demodo ilustrativo, considera r o caso em que um paciente em uma populaçãode treinamento se tornou clinicamente definido como séptico no sexto dia docadastro. Devido a razões ilustrativas, para este paciente, T36 é o dia quatro doestudo, e a amostra biológica T36 é a amostra biológica que foi obtida no diaquatro do estudo. De modo similar, T36 para o paciente não - conversorconjugado é considerado como o dia quatro do estudo deste paciente não-conversor conjugado.

Em algumas modalidades, N é mais do que um, mais do quecinco, mais do que dez, mais do que vinte, entre dez e 100, mais do que 100,ou menos do que 1000 pacientes. Uma regra de decisão (ou outras formas decomparação) pode ter pelo menos cerca de 99% de certeza, ou até mais, emalgumas modalidades, contra uma população de treinamento ou umapopulação de validação. Em outras modalidades, a certeza é de pelo menoscerca de 97%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 90%, pelomenos cerca de 85%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 75%, oupelo menos cerca de 70% contra uma população de treinamento ou umapopulação de validação. O grau útil de certeza pode variar, dependendo dométodo particular da presente invenção. Como aqui usado, o termo "certeza"significa "precisão". Em uma outra modalidade, a sensibilidade e/ou aespecificidade é de pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 95%, pelomenos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 80%,pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 70% contra uma populaçãode treinamento ou uma população de validação. O número de características,que pode ser usado por uma regra de decisão para classificar um paciente deteste com uma certeza adequada é, de modo típico, de cerca de quatro.

Dependendo do grau de certeza buscado, no entanto, o número decaracterísticas usado em uma rega de decisão pode ser menor, mas em todosos casos é de, pelo menos, dois. Em uma modalidade, o número decaracterísticas pode ser usado por uma regra de decisão para classificar umpaciente de teste é otimizado, de modo a permitir uma classificação de umpaciente de teste com alta segurança.

Nos exemplos abaixo, os dados abundantes referentes aometabólito foram coletados para uma pluralidade de biomarcadores em cadapaciente. Ou seja, para cada biomarcador em um perfil de biomarcador, umacaracterística, dados abundantes referentes ao metabólito, foram medidos.

As regras de decisão são desenvolvidas a partir de tais perfisde biomarcador a partir de uma população de treinamento, usando algoritmosde dados, de modo a prever os fenótipos da amostra, com base em padrões deexpressão genéticos observados. Embora novas ferramentas de classificaçãoestejam sendo desenvolvidas de um modo constante, o corpo existente dereconhecimento de padrões e de algoritmos de previsão provê algoritmos deanálise de dados efetivos para a construção de regras de decisão. Vide, porexemplo, National Research Council; Panei on Discriminant AnalysisClassification and Clustering, Discriminant Analysis and Clustering,Washington, D. C.; National Academy Press, que é incorporado a este, atítulo referencial. Além disso, as técnicas descritas em Dudoit et ai. 2002,"Comparison of discrimination methods for the classification of tumors usinggene expression data ", JASA 97: 77 -87, incorporado a este, a títuloreferencial, em sua totalidade, podem ser usados para desenvolver tais regrasde decisão.

Algoritmos de análise de dados relevantes para odesenvolvimento de uma regra de decisão incluem, mas não estão limitados a,análise discriminante, que inclui técnicas lineares, logísticas, e mais flexíveis(vide, por exemplo, Gnadadesikan, 1977, Methods for Statistical DatasAnalysis of Multivariate Observations, Nova Iorque: Wiley, 1977, que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade); algoritmos à basede árvore, tais que árvores de classificação e de regressão (CART) e variantes(vide, por exemplo, Breiman, 1984, Classification and Regression Trees,Belmont, Califórnia: Wadsworth International Group, que é incorporado aeste, a título referencial, em sua totalidade, assim como a Seção 5.1.3,abaixo); modelos de aditivo generalizados (vide, por exemplo, Tibshirani,1990. Generalized Additive Models, Londres: Chapman and Hall, que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade); e redes neurais(vide, por exemplo, Neal, 1996, Bayesian Learning for Neural Networks,Nova Iorque; Springer- Verlag; e Insua, 1998, Feedforward neural networksfor nonparametric regression In: Practical Nonparametrie andSemiparametric Bayesian Statistics, págs. 181-194, Nova Iorque; Springer,que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade, assim como aSeção 1. 6, abaixo).

Em uma modalidade, é executada uma comparação de umperfil de biomarcador de paciente de teste com perfis de biomarcador obtidosa partir de uma população de treinamento, e compreende a aplicação de umaregra de decisão. A regra de decisão é construída usando um algoritmo deanálise de dados, tal que um algoritmo de reconhecimento de padrãocomputacional. A regra de decisão é construída usando um algoritmo deanálise de dados, tal que um algoritmo de reconhecimento de um padrão decomputador. Outros algoritmos de análise de dados adequados para aconstrução de regras de decisão incluem, mas não estão limitados a, regressãologística (vide Seção 1.10, abaixo) ou um algoritmo não - paramétrico, quedetecta as diferenças na distribuição de valores característicos (por exemplo,um Teste Wilcoxon Signed Rank (ajustado e não-ajustado). A regra dedecisão pode ser baseada em duas, três, quatro, cinco, 10, 20 ou maiscaracterísticas, correspondendo a medidas observáveis a partir de um, dois,três, quatro, cinco, 10, 20 ou mais biomarcadores. Em uma modalidade, aregra de decisão é baseada em centenas de características ou mais. As regrasde decisão podem ser construídas usando um algoritmo de árvore declassificação. Por exemplo, cada perfil de biomarcador a partir de umapopulação de treinamento pode compreender pelo menos três características,em que as características são prognósticos em um algoritmo de árvore declassificação (vide Seção 1.1, abaixo). A regra de decisão prevê um conjuntodentro de uma população (ou classe) com uma precisão de pelo menos cercade 70%, de pelo menos cerca de 75%, de pelo menos cerca de 80%, de pelomenos cerca de 85%, de pelo menos cerca de 90%, de pelo menos cerca de95%, de pelo menos cerca de 97%, de pelo menos cerca de 98%, de pelomenos cerca de 99%, ou de cerca de 100%.

Algoritmos de análise de dados adequados são conhecidos naarte, alguns dos quais são revistos em Hastie et ai., supra. Em umamodalidade específica, um algoritmo de análise de dados da invençãocompreende Árvore de Classificação e Regressão [Classification andRegression Tree] (CART; Seção 1.1, abaixo); Arvore de Regressão AditivaMúltipla [Multiple Additive Regression Tree] (MART; Seção 1.4, abaixo),Análise Prognostica para Microarranjos [Prediction Analysis for Microarrays](PAM; Seção 1. 2, abaixo) ou Análise de Floresta Aleatória (Seção 1.1,abaixo). Tais algoritmos classificam espectros complexos a partir demateriais biológicos, tais que uma amostra de sangue, de modo a distinguirpacientes como normais ou como possuindo níveis de expressão debiomarcador característicos de um estado de doença particular. Em outrasmodalidades, um algoritmo de análise de dados compreende ANOVA eequivalentes não-paramétricos; análise discriminativa linear (Seção 1.10,abaixo), análise de regressão logística (Seção 1.10, abaixo), análise declassificador de vizinho mais próximo (Seção 1. 9, abaixo), redes neurais(Seção 1. 6, abaixo), análise de componente principal (Seção 1. 8, abaixo),análise discriminativa quadrática (Seção 1.11, abaixo), classificadores deregressão (Seção 1.5, abaixo, e máquinas de vetor de suporte (Seção 1.12, abaixo) Embora tais algoritmos possam ser usados para construir uma regra dedecisão e/ou para aumentar a velocidade e a eficiência de aplicação da regrade decisão e de modo a evitar vertentes de investigador, aquele de habilidadeordinária na arte irá perceber que s algoritmos à base de computador não sãorequeridos para executar os métodos da presente invenção.As regras de decisão podem ser suadas para avaliar perfis debiomarcador, independentemente do método que foi usado para gerar o perfildo biomarcador. Por exemplo, regras de decisão adequadas, que podem serusadas para avaliar perfis de biomarcador gerados através do uso decromatografia gasosa, tal como discutido em Harper iiPyrolysis and GC inPolymer Analysis ", Dekker, Nova Iorque (1985). Além disso, Wagner et al.,2002, Anal. Chem. 74:1824-1835 expõem uma regra de decisão, queaperfeiçoa a capacidade de classificar pacientes com base em espectrosobtidos através de espectrometria de massa de íon secundário de tempo devôo estático (TOF- SIMS). Em adição, Bright et al., 2002, J. Microbiol.Methods 48:127-38, incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade,expõe um método para distinguir entre cepas bacterianas com alta certeza (79-89% de taxas de classificação corretas) através de análise de MALDI- TOF -MS e espectrometria de massa por cromatografia líquida - ionização poreletropulverização) (LC/ESI- MS) de modo a classificar os perfis debiomarcadores em amostras biológicas complexas.

5.10.1. Arvores de Decisão

Um tipo de regra de decisão, que pode ser construído usandoos valores característicos dos biomarcadores identificados na presenteinvenção é uma árvore de decisão. Neste caso, o "algoritmo de análise dedados" é qualquer técnica que pode formar a árvore de decisão, embora a"árvore de decisão" final seja a regra de decisão. Uma árvore de decisão éconstruída usando uma população de treinamento e algoritmos de análise dedados específicos. As árvores de decisão são descritas, de modo geral, porDuda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque,págs. 395-396, que é incorporado a este, a título referencial. Os métodos àbase de árvore separam o espaço característico em um conjunto de retângulos,e então ajustam um modelo (tal como uma constante) em cada um.

Os dados da população de treinamento incluem ascaracterísticas (por exemplo, valores de expressão, ou alguma outraobservável) para os biomarcadores da presente invenção através de umapopulação de conjunto de treinamento. Um algoritmo específico, que pode serusado para construir uma árvore de decisão é uma árvore de classificação eregressão (CART). Outros algoritmos de árvore de decisão específicosincluem, mas não estão limitados a, ID3. C4. 5, MART, e FlorestasAleatórias. CART, ID3, e C4.5 são descritos em Duda, 2001, PatternClassification, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, págs. 396-408 e págs.4411-412, que é incorporado a este, a título referencial. CART, MART e C4.5 são descritos em Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning,Springer-Verlag, Nova Iorque, Capítulo 9, que é incorporado a este, a títuloreferencial, em sua totalidade. Florestas Aleatórias são descritas em Breiman,1999, "Randon Forests - Randon Features "Technical Report 567, StatisticsDepartment, U.C. Berkeley, Setembro de 1999, que é incorporado a títuloreferencial, em sua totalidade.

Em algumas modalidades da presente invenção, as árvores dedecisão são usadas para classificar pacientes usando características paracombinações de biomarcadores da presente invenção. Os algoritmos da árvorede decisão pertencem à classe de algoritmos de aprendizagemsupervisionados. O escopo de uma árvore de decisão é o de induzir umclassificador (uma árvore) a partir de dados exemplares do mundo real. Estaárvore pode ser usada para classificar exemplos não observados, que nãohaviam sido usados para derivar a árvore de decisão. Como tal, uma árvore dedecisão é derivada a partir de dados de treinamento. Os dados de treinamentoexemplares contêm dados para uma pluralidade de pacientes (a população detreinamento). Para cada paciente respectivo, existe uma pluralidade decaracterísticas da classe do respectivo paciente (por exemplo, sepse/SIRS).Em uma modalidade da presente invenção, os dados de treinamento são dadosde expressão para uma combinação de biomarcadores através da população detreinamento.

O algoritmo que se segue descreve uma derivação de árvore dadecisão exemplar

Arvore (Exemplos, Classe, Características)

Criar um nó de raiz

Se todos os Exemplos tiverem o mesmo Valor de Classe,fornecer este rótulo à raiz

Se não, iniciar

Calcular o ganho de informação para cada Característica

Selecionar a Característica A com o ganho de informação maisalto e produzir esta Característica de raiz

Para cada valor possível, v, desta CaracterísticaAdicionar uma nova ramificação abaixo da raiz,correspondendo a A = v,

Deixar os Exemplos (v) serem aqueles exemplos com A = νSe os Exemplos (v) estiverem vazios, fazer na novaramificação um nó de folha rotulado com o valor mais comum entre osExemplos,

Se não, deixar a nova ramificação ser a árvore criada pelaArvore (Exemplos (v), Classe, Características -{A})Fim

Uma descrição mais detalhada do cálculo do ganho deinformação é apresentada no que se segue. Se as classes possíveis vi dosexemplos apresentarem as probabilidades P(vi), então o conteúdo deinformação I da resposta efetiva é dado por:

<formula>formula see original document page 92</formula>

O valor I ostra quanta informação é requerida, de modo a queseja possível descrever o resultado de uma classificação para o conjunto dedados específico usado. Supondo que o conjunto de dados contenha osexemplos ρ positivo (por exemplo, irá desenvolver sepse) e η negativo (porexemplo, não irá desenvolver sepse) (por exemplo, pacientes), a informaçãocontida em uma resposta corrente è:

<formula>formula see original document page 93</formula>

em que log2 é o logaritmo usando a base dois. Através deteste das características singulares, a quantidade de informação requerida paraque possa ser efetuada uma classificação correta pode ser reduzida. O restantepara uma característica específica A (por exemplo, representando umbiomarcador específico) mostra quando da informação, que é requerida, podeser reduzida.

<formula>formula see original document page 93</formula>

"v" é o número de valores de atributo únicos para acaracterística A em um determinado conjunto de dados, "i" é um certo valorde atributo, "pi" é o número de exemplos para a característica A, em que aclassificação é positiva (por exemplo, irá desenvolver sepse), "ni" é o númerode exemplos para a característica A, em que a classificação é negativa (porexemplo, não irá desenvolver sepse). O ganho de informação de umacaracterística específica A é calculado como a diferença entre o conteúdo deinformação para as classes e o restante da característica A:

<formula>formula see original document page 93</formula>

O ganho de informação é usado para avaliar quão importantesas diferentes características são para a classificação (quão bem elas dividemos exemplos), e a características com a taxa de informação mais elevada.De modo geral, existe uma quantidade de diferentes algoritmosde árvore de decisão, muitos dos quais são descritos em Duda, PatternClassification, Segunda edição, 2001, John Wiley & Sons, Inc. Os algoritmosda árvore de decisão requerem muitas vezes a consideração do processamentode características, da medição de impurezas, do critério de interrupção, e desupressão. Os algoritmos de árvore de decisão específicos incluem, mas nãoestão limitados, as árvores de classificação e regressão (CART), árvores dedecisão multivariadas, ID3 e C4.5.

Em uma abordagem, quando é usada uma árvore de decisão,os dados de expressão genética para uma combinação selecionada de genesdescritos na presente invenção através de uma população de treinamento, sãopadronizados de modo a que possuam uma variância zero e unitária. Osmembros da população de treinamento são divididos, de modo aleatório, emum conjunto de treinamento e um conjunto de teste. Por exemplo, em umamodalidade, dois terços dos membros da população de treinamento sãocolocados no conjunto de treinamento e um terço dos membros da populaçãode treinamento são colocados no conjunto deteste. Os valores de expressãopara uma combinação selecionada de biomarcadores, descritos na presenteinvenção, são usados para construir a árvore da decisão. Então, a capacidadepara que a árvore de decisão classifique corretamente os membros declassificação no conjunto de teste é determinada. Em algumas modalidades,esta computação é efetuada diversas vezes para uma determinada combinaçãode biomarcadores. Em cada iteração computacional, os membros dapopulação de treinamento são atribuídos, de modo aleatório, ao conjunto detreinamento e ao conjunto de teste. Então, a qualidade da combinação debiomarcadores é tomada como a média de cada tal iteração da computação daárvore de decisão.

Em adição a árvores de decisão univariadas, nas quais cadadivisão é baseada em um valor de característica para um biomarcadorcorrespondente, dentre o conjunto de biomarcadores da presente invenção, ouos valores de característica relativos de dois tais biomarcadores, árvores dedecisão multivariadas podem ser implementadas como a regra de decisão. Emtais árvores de decisão multivariadas, algumas ou todas as decisõescompreendem, de modo efetivo, uma combinação linear de valores decaracterística para uma pluralidade de biomarcadores da presente invenção.Uma tal combinação linear pode ser treinada usando técnicas conhecidas, taisque uma descida em gradiente em uma classificação, através do uso de umcritério de soma- quadradO-erro. De modo a ilustrar uma tal árvore dedecisão, considerar a expressão:

0, 04 χ 1 + 0, 16x2 <500Neste caso, xl e x2 referem-se a duas características diferentespara os dois biomarcadores diferentes dentre os biomarcadores da presenteinvenção. Para podar a regra de decisão, os valores das características xl e x2são obtidos a partir das medições obtidas a partir do paciente não-classificado.Estes valores são então inseridos na equação. Se um valor de menos do que500 for computado, então removida uma primeira ramificação na árvore dadecisão. Se não, é removida uma Segunda ramificação na árvore da decisão.Arvores de decisão multivariadas são descritas em Duda, 2001. PatternsClassification, John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, págs. 408 - 409, que éincorproado a este, a título referencial.

Uma outra abordagem, que pode ser usada na presenteinvenção, é a de caneluras de regressão adaptativas multivariadas (MARS).MARS é um procedimento adaptativo para a regressão, e é bastante adequadopara os problemas altamente dimensionais abordados pela presente invenção.MARS pode ser considerado como uma generalização da regressão lineargradual ou uma modificação do método CART, de modo a aperfeiçoar odesempenho de CART no ajuste de regressão descrito em Hastie et al., 2001,The Elements of Statistical Learning, Springer -Verlag, Nova Iorque, págs.283- 295, que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

5.10. 2. Análise Previsiva de Microarranjos (PAM)

Uma abordagem para desenvolver uma regra de decisão usandovalores e característica de biomarcadores da presente invenção é o classificador decentróide mais próximo. Uma tal técnica computa, para cada classe (sepse eSIRS), um centróide fornecido pelos níveis de característica médios dosbiomarcadores na classe (sepse e SIRS), um centróide fornecido pelos níveis decaracterística médios dos biomarcadores na classe, e então atribui novas amostrasà classe, cujo centróide está mais próximo. Esta abordagem é similar àaglomeração de médias K, exceto que as aglomeração são substituídas por classesconhecidas. Este algoritmo pode ser sensível ao ruído quando um grande númerode biomarcadores são usados. Um aperfeiçoamento na técnica utiliza oencolhimento: para cada biomarcador, as diferenças entre os centróides da classesão ajustadas em zero, se elas forem consideradas prováveis devido a umaoportunidade. Esta abordagem é implementada em Análise Prognostica deMicroarranjo, ou PAM. Vide, por exemplo, Tibshirani et al., 2002, Proceedings ofthe National Academy of Science USA 99; 6567 - 6572, que é incorporado a este,a título referencial, em sua totalidade. O encolhimento é controlado por um limite,abaixo do qual as diferenças são consideradas ruído. Os biomarcadores, que nãoapresentam diferença acima do nível de ruído são removidos. Um limite pode serselecionado através de validação cruzada. A medida em que o limite é diminuído,mais biomarcadores são incluídos e os erros de classificação estimados diminuem,até que eles alcancem um fundo e comecem novamente a subir como umresultado de biomarcadores de ruído-um fenômeno conhecido como sobreajuste.

5. 10.3. Método de abaulamento, reforço e subespaçoaleatório

O método de abaulamento, reforço e subespaço aleatório, eárvores aditivas são algoritmos de análise de dados, conhecidos como técnicasde combinação, que podem ser usados para aperfeiçoar árvores de decisãofracas. Estas técnicas são projetadas para, e usualmente aplicadas a árvores dedecisão, tais que as árvores de decisão descritas na Seção 1.1, acima. Emadição, tais técnicas podem ser também úteis em regras de decisãodesenvolvidas usando outros tipos de algoritmos de análise de dados, tais quea análise discriminadora linear.

No abaulamento, é efetuada a amostragem do conjunto detreinamento, gerando réplicas de correias independentes aleatórias, éconstruída a regra de decisão sobre cada um destes, e os mesmos são entãoagregados através de um simples voto de maioria na regra de decisão final.

Vide, por exemplo, Breiman, 1996, Machine Learning, 24, 123-140; e Efron& Tibshirani, An introduction do Bootstrap, Chapamn & Hall, Nova Iorque,1993, que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

No reforço, as regras de decisão são construídas sobre versõesponderadas do conjunto de treinamento, que são dependentes de resultados declassificação prévios. Inicialmente, todas as características sob consideraçãopossuem pesos iguais, e a primeira regra de decisão é construída com baseneste conjunto de dados. Então, os pesos são alterados de acordo com odesempenho da regra de decisão. Características classificadas de modoerrôneo recebem pesos maiores, e a próxima regra de decisão é reforçada,com base no conjunto de treinamento novamente ponderado. Deste modo,uma seqüência de conjuntos de treinamento e de regras de decisão é obtido,que é então combinado através de voto de maioria simples ou através de votode maioria ponderada na regra de decisão final. Vide, por exemplo, Freund &Schapire, "Experiments with a new boosting algorithm ", Proceedings, 13 thInternational Conference on Machine Learning, 1996, 148- 156, que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

De modo a ilustrar o reforço, considerar o caso, em queexistem dois fenótipos exibidos pela população sob estudo, o fenótipo 1 (porexemplo, que contrai a sepse durante um período de tempo definido), e ofenótipo 2 (por exemplo, apenas SIRS, significando que o paciente contrai asepse dentro de um período de tempo definido). Dado um vetor debiomarcadores de prognóstico (por exemplo, um vetor de características querepresentam tais marcadores) a partir dos dados de conjunto de treinamento,uma regra de decisão G (X) produz uma previsão, que assume um dos valorestipo no conjunto de dois valores: { fenótipo 1, fenótipo 2}. A taxa de erro naamostra de treinamento é:

<formula>formula see original document page 98</formula>

em que N é o número de pacientes no conjunto de treinamento(a soma total dos pacientes, que possuem ou o fenótipo 1 ou o fenótipo 2). Porexemplo, se houverem 49 organismos que contraem a sepse e 72 organismosque permanecem no estado de SIRS, N é 121. Uma regra de decisão fraca éuma, em que a taxa de erro seja apenas ligeiramente melhor do que adeterminação aleatória. No algoritmo de reforço, a regra de decisão fraca éaplicada, de modo repetido, a versões modificadas dos dados, deste modoproduzindo uma seqüência de regras de decisão fracas Gm (x), m = 1,2,..., M.As previsões de todas as regras de decisão nesta seqüência são entãocombinadas através de um voto de maioria ponderado, de modo a produzir aregra de decisão final:

<formula>formula see original document page 98</formula>

Neste caso, ai, a2,..., aM são computados pelo algoritmo dereforço e o seu propósito é o de pesar a contribuição de cada regra de decisãorespectiva Gm (χ). O seu efeito é o de fornecer uma influência superior àsregras de decisão mais precisas na seqüência.

As modificações de dados em cada estágio de reforçoconsistem no estágio de aplicar os pesos wl, w 2,..., wn, a cada uma dasobservações de treinamento (xi, yi), i = 1, 2,..., N. Inicialmente, todos ospesos são ajustados para wi = 1/N,de tal modo que o primeiro estágiosimplesmente treine a regra de decisão com base nos dados, do modo usual.

Para cada iteração sucessiva, m = 2, 3,..., M, os pesos de observação sãoindividualmente modificados e a regra de decisão é reaplicada às observaçõesponderadas. No estagio m, aquelas observações, que foram mal classificadasatravés da regra de decisão Gm-l(x), induzidas no estágio prévio, tiveram osseus pesos aumentados, enquanto que os pesos foram diminuídos para aquelasque foram corretamente classificadas. Deste modo, à medida em que asiterações prosseguiram, as observações que são difíceis de serem classificadascorretamente recebem uma influência sempre crescente. Cada regra dedecisão sucessiva é, deste modo, forçada a ser concentrar naquelasobservações de treinamento, que são precedidas por aquelas prévias naseqüência.

O algoritmo de reforço exemplar é sumariado do modo que sesegue:

1. Inicializar os pesos de observação w', I=-I, 2,..., N.

2. Para m = 1 a M:

(a) Ajustar uma regra de decisão Gm(x) ao conjunto detreinamento, usando os pesos wi.

(b) Computar:

<formula>formula see original document page 99</formula>

(c) Computar am - Iog ((l-errm)/errm).

<formula>formula see original document page 99</formula>

(d)

1. Resultado:<formula>formula see original document page 100</formula>

Em uma modalidade de acordo com este algoritmo, cadaobjeto é, de fato, um fator. Além disso, no algoritmo, a regra de decisãocorrente Gm(x) é induzida com base nas observações ponderadas na linha 2a.A taxa de erro ponderado resultante é computada na linha 2b. A linha 2ccalcula o peso am atribuído a Gm(x) na produção do classificador final G (x)(linha 3). Os pesos individuais de cada uma das observações são atualizadospara a próxima iteração na linha 2 d. As observações mal classificadas porGm (x) possuem os seus pesos classificados em escala por um fator exp (am),aumentado a sua influência relativa para a indução do próximo classificadorGm + 1 (x) na seqüência. Em algumas modalidades, as modificações deFreund and Schapire, 1997, Journal of Computer and System Sciences, 55,págs. 119-139, são usados métodos de reforço. Vide, por exemplo, Hasti etal., The Elements of Statistical Learning, 2001, Springer, Nova Iorque,Capítulo 10, que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

Por exemplo, em algumas modalidades, a seção prévia da característica éexecutada usando uma técnica, tal que os métodos de avaliação não-paramétricos de Park et al., 2002, Pac. Symp. Biocomput. 6, 52- 63, que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. A seleção prévia dacaracterística é uma forma de redução de dimensionalidade, na qual os genesque discriminam entre classificações são melhor selecionados para o uso noclassificador. Então, o procedimento LogitBoost introduzido por Friedman etal., 2000, Ann. Stat 28, 337 - 407, é suado, preferivelmente ao procedimentode reforço de Freund and Schapire. Em algumas modalidades, o método dereforço e outros métodos de classificação de Ben - Dor et al. 2000, Journal ofComputational Biology 7, 559 - 583, incorporados a este, a título referencial,em sua totalidade, são usados pela presente invenção. Em algumasmodalidades, o método de reforço e outros métodos de classificação deFreund and Schapire, 1997, Journal of Computer and System Sciences 55,119- 139, incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade, sãousados.

No método de subespaço aleatório, as regras de decisão sãoconstruídas nos subespaços aleatórios do espaço de característica de dados.Estas regras de decisão são combinadas, de modo usual, pela simples votaçãoda maioria na regra de decisão final. Vide, por exemplo, Ho, "The Randomsubspace method for constructing decision forests", IEEE Trans PatternAnalysis and Machine Intelligence, 1998; 20 (8): 832 - 844, que éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

5.10.4 Arvores de Regressão Aditivas Múltiplas

Arvores de regressão aditivas múltiplas (MART) representamum outro modo para construir uma regra de decisão, que pode ser usado napresente invenção. Um algoritmo genérico para MART é:

1. Inicializar:

<formula>formula see original document page 101</formula>

(b) Ajustar uma árvore de regressão aos alvos rim fornecendoas regiões terminais Rjm, j = 1, 2,..., Jm.

(c) Paraj = 1, 2,..., Jm computa

<formula>formula see original document page 101</formula><formula>formula see original document page 102</formula>

3. Resultado

<formula>formula see original document page 102</formula>

Algoritmos específicos são obtidos através da inserção decritérios de perda diferentes L (y, f (χ)). A primeira linha do algoritmoinicializa o modelo de constante ótima, que é apenas uma árvore de nodoterminal único. Os componentes do gradiente negativo computados na linha2(a) são referidos como a pseudo resíduos generalizados, r. Os gradientes parafunções de perda comumente usados são sumariados na Tabela 10.2, deHustie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag,Nova Iorque, pág. 321, que é incorporado a este, a título referencial. Oalgoritmo para a classificação é similar e é descrito em Hastie et al., Capítulo10, que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. Osparâmetros de sintonização, associados com o procedimento MART, são onúmero de iterações M e os tamanhos de cada uma das árvores constituintesJm, m= 1,2,.., M.

5.10. 5. Regras de Decisão derivadas através de regressão

Em algumas modalidades, uma regra de decisão usada paraclassificar pacientes é formada usando a regressão. Em tais modalidades, aregra de decisão pode ser caracterizada como um classificador de regressão,de modo preferido um classificador de regressão logístico. Um talclassificador de regressão inclui um coeficiente para cada um dosbiomarcadores (por exemplo, uma característica para cada tal biomarcador)usado para construir o classificador. Em tais modalidades, os coeficientes parao classificador de regressão são computados usando, por exemplo, umaabordagem de probabilidade máxima. Em uma tal computação, ascaracterísticas para os biomarcadores (por exemplo, RT- PCR, dados demicroarranjo) são usadas. Em modalidades particulares, os dados do marcadormolecular de apenas dois subgrupos de traço são usados (por exemplo, osubgrupo de traço a: irá contrair sepse e um período de tempo definido e oreferido subgrupo b: não irá contrair sepse em um período de tempo definido)e a variável dependente é a ausência ou a presença de um traço particular nospacientes, para os quais os dados do biomarcador estão disponíveis.

Em uma outra modalidade específica, a população detreinamento compreende uma pluralidade de subgrupos de traço (porexemplo, três ou mais subgrupos de traço, quatro ou mais subgrupos de traçoespecíficos, etc.). Estes subgrupos de traço múltiplos podem corresponder aestágios discretos na progressão fenotípica a partir de saudável para SIRS,para sepse, para estágios mais avançados de sepse em uma população detreinamento. Nesta modalidade específica, uma generalização do modelo deregressão logístico, que manipula as respostas de multicategoria, que podemser usadas para desenvolver uma decisão, que discrimina entre os váriossubgrupos de traço encontrados na população de treinamento. Por exemplo, osdados medidos para os marcadores moleculares selecionados podem seraplicados a quaisquer dos modelos de logit de multicategoria descritos emAgresti, An Introduction to Categórical Data Analysis, 1996, John Wiley &Sons, Inc., Nova Iorque, Capítulo 8, incorporado a este, a título referencial,em sua totalidade, de modo a desenvolver um classificador capaz dediscriminar entre qualquer de uma pluralidade dos referidos subgrupos detraço representados em uma população de treinamento.

5.10. 6. Redes neurais

Em algumas modalidades, os dados de característica, medidospara selecionar os biomarcadores da presente invenção (por exemplo, dadosde RT- PCR, dados de espectrometria de massa, dados de microarranjo)podem ser usados para treinar uma rede neural. Uma rede neural consiste emuma regra de decisão de regressão ou classificação, em dois estágios. Umarede neural possui uma estrutura em camadas, que inclui uma camada deunidades de entrada (e as inclinações) conectadas através de uma camada depesos a uma camada de unidades de saída. Para a regressão, a camada deunidades de saída inclui, de modo típico, apenas uma unidade de saída. Noentanto, as redes neurais podem manipular respostas quantitativas múltiplasem um modo sem emendas.

Em redes neurais em várias camadas, existem unidades deentrada (camada de entrada, unidades ocultas (camada oculta), e unidade desaída (camada de saída). Existe, além disso, uma única unidade depolarização, que está conectada a cada unidade, outra que as unidades deentrada. As redes neurais são descritas em Duda et ai., 2001, PatternClassification, Segunda edição, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque; eHastle et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag,Nova Iorque, cada um dos quais é incorporado a este, a título referencial, emsua totalidade. As redes neurais são também descritas em Draghici, 2002,Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRC; e Mount,2001, Bioinformatics: sequenee and genome analysis, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, cada um dos quais éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. O que é expostoabaixo são algumas formas exemplares de redes neurais.

A abordagem básica para o uso de redes neurais é a de iniciarcom uma rede não treinada, apresentar um padrão de treinamento à camada deentrada, e passar sinais através da rede e determinar a saída na camada desaída. Estas saídas são então comparadas aos valores objetivados; qualquerdiferença corresponde a um erro. Este erro ou função de critério é algumafunção escalar dos pesos e é minimizado quando as saídas da rede sãoequipadas com as saídas desejadas. Deste modo, os pesos são ajustados demodo a reduzir esta medida de erro. Para a regressão, este erro pode ser asoma de erros ao quadrado. Para a classificação, este erro pode ser o erro aoquadrado ou de entropia cruzada (desvio). Vide, por exemplo, Hastie et al.,2001, The Elements of Statistical Leaming, Springer-Verlag, Nova Iorque,que é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

Três protocolos de treinamento comumente usados são oestocástico, em batelada, e em linha. No treinamento estocástico, os padrõessão selecionados de modo aleatório a partir do conjunto de treinamento e ospesos da rede são atualizados para cada apresentação de padrão. As redesnão-lineares em várias camadas, treinadas pelos métodos de declive emgradiente, tais como a retropropagação estocástica, efetuam uma estimativa deprobabilidade máximas dos valores de peso no classificador definido pelatopologia da rede. No treinamento em batelada, vários passes são produzidosatravés dos dados de treinamento. No treinamento em linha, cada padrão éapresentado uma vez e pelo menos uma vez à rede.

Em algumas modalidades, são tidos em consideração osvalores de partida para os pesos. Se os pesos estiverem próximo a zero, entãoa parte operativa do sigmóide comumente usado na camada oculta de umarede neural (vide, por exemplo, Hastie et al., 2001, The Elements of StatisticalLearning, Springer-Verlag, Nova Iorque, incorporado a este a títuloreferencial) é a grosso modo linear, e, portanto, a rede neural entra em colapsoem um classificador aproximadamente linear. Em algumas modalidades, osvalores de partida para os pesos são selecionados de modo a que sejamvalores aleatórios, próximos a zero. Portanto, o classificador é iniciado em ummodo quase linear, e se torna não-linear à medida em que os pesos aumentam.

As unidades individuais são localizadas a direções e introduzem não-linearidades, quando requerido. O uso de pesos zero exato conduz a derivadoszero e a uma simetria perfeita, e o algoritmo nunca se move. De modoalternativo, o início com pesos grandes conduz, de modo freqüente, a soluçõesdeficientes.

Como a graduação de entradas determina a graduação efetivade pesos na camada de base, ela pode ter um efeito sobre a qualidade dasolução final. Deste modo, em algumas modalidades, na saída, todos osvalores de expressão são padronizados de modo a que possuam uma média dezero e um desvio padrão de um. Isto assegura com que todas as entradassejam tratadas de modo igual no processo de regularização, e permite comque seja possível selecionar uma faixa significativa para os pesos iniciaisaleatórios. Com as entradas de padronização, é típico que sejam assumidospesos uniformes aleatórios na faixa de -0,7, + 0,7].

Um problema recorrente consiste no uso de redes de trêscamadas é o número ótimo de unidades ocultadas para serem suadas na rede.O número de entradas e de saídas de uma rede de três camadas é determinadopelo problema a ser resolvido. Na presente invenção, o número de entradaspara uma determinada rede neural será igual ao número de biomarcadoresselecionados a partir da população de treinamento. O número de saídas para arede neural será, de modo típico, de apenas um. No entanto, em algumasmodalidades, mais do que uma saída é usada, de tal modo que apenas doisestados possam ser definidos pela rede. Por exemplo, uma rede neural comvárias saídas pode ser usada para discriminar entre os fenótipos saudáveis,vários estágios de SIRS, e/ou vários estágios de sepse. Se unidades ocultas emexcesso forem usadas em uma rede neural, a rede deverá possuir muitos grausde liberdade e será treinada durante muito tempo, ocorrendo um perigo de quea rede neural ajuste os dados de um modo excessivo. Se existirem muitopoucas unidades ocultas, o conjunto de treinamento não pode ser aprendido.Falando de modo geral, no entanto, é melhor que existam unidades ocultas emdemasia do que em falta. Com muito poucas unidades ocultas, o classificadorpode não ter flexibilidade suficiente para capturar as não - linearidades nosdados; com unidades ocultas em demasia, o peso extra pode ser reduzida emdireção a zero, se for usada a regularização ou a poda apropriada, tal comodescrito abaixo. Em modalidades típicas, o número de unidades ocultas estána faixa de 5 a 100, este número sendo aumentado de acordo com o númerode entradas e com o número de casos de treinamento.

Uma abordagem geral para a determinação do número deunidades ocultas a ser usado é a de aplicar uma abordagem de regularização.

Na abordagem de regularização, é construída uma nova função de critério,que depende não apenas do erro de treinamento clássico, mas também dacomplexidade do classificador. De um modo específico, a nova função decritério penaliza classificadores altamente complexos; a busca quanto a ummínimo neste critério é a de balancear o erro no conjunto de treinamento como erro quando do conjunto de treinamento com o erro no conjunto detreinamento acrescido de um termo regularização, que expressa restrições oupropriedades desejáveis de soluções: J+ Jpat+ λ Jrug. O parâmetro λ é ajustadode modo a impor a regularização mais ou menos fortemente. Em outraspalavras, valores maiores para λ tenderão a reduzir os pesos em direção azero: de modo típico, a validação cruzada com um conjunto de validação éusada para estimar λ. Este conjunto de validação pode ser obtido através deque seja colocado à parte um subconjunto aleatório da população detreinamento. Outras formas de penalidade foram propostas, por exemplo, apenalidade de eliminação de peso (vide, Por exemplo, Hastie et al., 2001, TheElements of Statistical Learning, Springer - Verlag, Nova Iorque, incorporadoa este a titulo referencial).

Uma outra abordagem para determinar o número de unidadesocultas a serem usadas é o de eliminar - podar pesos que são menosnecessários. Em uma abordagem, os pesos com a menor magnitude sãoeliminados (ajustados em zero). Uma tal poda baseada na magnitude pode seroperativa, mas não é ótima; algumas vezes, pesos com magnitudes menoressão importantes para a aprendizagem e os dados de treinamento. Em algumasmodalidades, de modo preferido ao uso de uma abordagem de poda baseadana magnitude, são computadas estatísticas de Wald. A idéia fundamental nasEstatísticas de Wald é a de que elas podem ser usadas de modo a estimar aimportância de uma unidade oculta (peso) em um classificador. Então, asunidades ocultas tendo a menor importância são eliminadas (através do ajustede seus pesos de entrada e de saída para zero). Dois algoritmos a este respeitosão os algoritmos Optimal Brain Damage (OSD) e o Optimal Brain Surgeon(OBS), que utilizam a aproximação de Segunda ordem para prever como umerro de treinamento depende de um peso, e eliminar o peso que conduz a ummenor aumento no erro de treinamento.

O Optimal Brain Damage (OSD) e o Optimal Brain Surgeon(OBS) compartilham a mesma abordagem básica de treinamento de uma redepara o erro mínimo local no peso w, e então poda de um peso que conduz aomenor aumento no erro de treinamento. O aumento funcional previsto no erropara uma alteração no vetor de peso total ôw é:

<formula>formula see original document page 108</formula>

é a matriz Hessiana. O primeiro termo some em um númerolocal no erro; o terceiro e os outros termos de ordem superior são ignorados.

A solução geral para minimizar esta função, dada à restrição de suprimir umpeso é:

<formula>formula see original document page 108</formula>

Neste caso, uq é o vetor unitário ao longo da q-ésima direçãono espaço ponderai e Lq e a aproximação para a saliência do peso q - oaumento no erro de treinamento se o peso q for podado e os outros pesosatualizados para dw. Estas equações requerem o inverso de H. Um métodopara calcular esta matriz inversa é o de iniciar com um pequeno valor,

<formula>formula see original document page 109</formula>

em que α é um pequeno parâmetro - efetivamente umaconstante de peso. A seguir a matriz é atualizada com cada padrão de acordocom:

<formula>formula see original document page 109</formula>

em que os subscritos correspondem ao padrão sendoapresentado e am diminui com m. Após o treinamento total ter sidoapresentado, a matriz Hessiana é fornecida por

H"1 = Hn"1. Rm uma forma

algorítmica, o método Optimal Brain Surgeon é:começar a inicializar nH, w, θ

treinar uma rede razoavelmente grande para erro mínimo,computar H-I pela Equação 1,

<formula>formula see original document page 109</formula>

até J (w) > θretornar para wfinalizar

O método Optimal Brain Damage é computacionalmente maissimples porque o cálculo da matriz Hessiana inversa na linha 3 éparticularmente simples para uma matriz diagonal. O algoritmo acima terminaquando o erro é maior do que um critério inicializado para ser Θ.

Uma outra abordagem é a de alterar a linha 6 para terminarquando a alteração de J(w) devido à eliminação de um peso é maior do quealgum valor de critério. Em algumas modalidades, a rede neural de retro-propagação, Vide, por exemplo, Abdi, 1994, "A neural network primer", J.Biol. System, 2, 247-283, incorporado a este, a título referencial, em suatotalidade.

5.10.7. Aglomeração

Em algumas modalidades, as características para selecionar osbiomarcadores da presente invenção são usadas para aglomerar um conjuntode treinamento. Por exemplo, considerar o caso, no qual dez características(correspondendo a dez biomarcadores), descritas na presente invenção, sãousadas. Cada membro m da população de treinamento deverá ter valores detreinamento (por exemplo, valores de expressão) para cada um dos dezbiomarcadores. Tais valores a partir de um membro m na população detreinamento definem o vetor.

<formula>formula see original document page 110</formula>

em que Xim é o nível de expressão do biomarcador Ith noorganismo m. Se houverem organismos m no conjunto de treinamento, aseleção de biomarcadores i irá definir os vetores m. Observe-se que osmétodos da presente invenção não requerem que cada um dos valores deexpressão de cada biomarcador único, usado nos vetores, seja representadoem cada vetor único m. Em outras palavras, os dados a partir de um paciente,no qual um dos biomarcadores Ith não seja encontrado podem ser ainda usadospara a aglomeração. Em tais casos, o valor de expressão ausente é atribuídocomo um "zero" ou algum outro valor normalizado. Em algumasmodalidades, antes da aglomeração, os valores de característica sãonormalizados como tendo um valor médio de zero e variância unitária.Aqueles membros da população de treinamento, que exibem padrões deexpressão similares através do grupo de treinamento apresentarão a tendênciaa serem aglomerados de um modo conjunto. Uma combinação de genesparticular da presente invenção é considerada como tendo um bomclassificador neste aspecto da invenção quando os vetores são aglomeradosnos grupos traço encontrados na população de treinamento. Por exemplo, se apopulação de treinamento incluir a classe a: pacientes que não desenvolvemsepse, e classe b: pacientes que desenvolvem sepse, um classificador deaglomeração ideal irá aglomerar a população em dois grupos, com um grupode aglomeração representando unicamente a classe a e o outro grupo deaglomeração representado unicamente a classe b.

A aglomeração é descrita nas páginas 211-256 de Duda andHart, Pattern Classification and Scene Analysis, 1973, John Wiley & Sons,Inc., Nova Iorque, (a seguir denominado "Duda 1973"), que é incorporado aeste, a título referencial, em sua totalidade. Como descrito na Seção 6.7 deDuda 1973, o problema de aglomeração é descrito como aquele de encontraros agrupamentos naturais em um conjunto de dados. De modo a identificar osagrupamentos naturais, duas questões são abordadas. Em primeiro lugar, ummodo a medir a similaridade (ou a dissimilaridade) entre duas amostras édeterminado. Esta métrica (medição de similaridade) é suada para assegurarque as amostras em um aglomerado são mais similares uma à outra do que aamostras em outros aglomerados. Em segundo lugar, um mecanismo para adivisão dos dados em aglomerados usando a medida de similaridade édeterminado.

Medidas de similaridade são discutidas na Seção 6.7 e Duda1973, onde é mencionado que um modo de iniciar uma investigação deaglomeração é o de definir uma função de distância e o de computar a matrizdas distâncias entre todos os pares de amostras em um conjunto de dados. Sea distância for uma boa medida de similaridade, então a distância entre asamostras no mesmo aglomerado será significativamente menor do que adistância entre as amostras em diferentes aglomerados. No entanto, comomencionado na página 215 de Duda 1973, a aglomeração não requer o uso deuma métrica de distância. Por exemplo, uma função de similaridade nãométrica (χ, χ ') pode ser usada para comparar dois vetores χ e χ De modoconvencional, s (x, x') é uma função simétrica, cujo valor é maior do quequando χ e x' são algo "similares". Um exemplo de uma função desimilaridade não-métrica s (x, x') é provida na página 216 de Duda 1973.

Uma vez que um método para medir a "similaridade" ou a"dissimilaridade "entre pontos em um conjunto de dados que foi selecionado,a aglomeração requer uma função de critério, que mede a qualidade daaglomeração de qualquer divisão dos dados. Vide página 217 de Duda 1973.As funções de critério são discutidas na Seção 6. 8 de Duda 1973.

Mais recentemente Duda et ai. Pattern Classification, 2aEdição, John Wiley & Sons, Inc. Nova Iorque, foi publicado. As páginas 537-563 descrevem a aglomeração em detalhe. Maiores informações quanto atécnicas de aglomeração podem ser encontradas em Kaufmann andRousseeuw, 1990, Finding Groups in Data: An Introduction to ClusterAnalysis, Wiley, Nova Iorque, NY; Everitt,1993, Cluster Analysis (3 a Ed.),Wiley, Nova Iorque, NY; e Backer, 1995, Computer - Assisted Reasoning inCluster Analysis, Prentice Hall, Upper Saddler River, Nova Jérsei. Técnicasde aglomeração exemplares, que podem ser usadas na presente invenção,incluem, mas não estão limitadas a, aglomeração hierárquica (formação degrumos aglomerativa usando o algoritmo adjacente mais próximo, o algoritmoadjacente mais afastado, o algoritmo de ligação médio, o algoritmo decentróide, ou o algoritmo de soma- de- quadrados), k significandoaglomeração, k impreciso significa algoritmo de aglomeração e aglomeraçãode Jarvis - Patrick.

5.10.8. Análise do Componente Principal

A análise do componente principal (PCA) foi proposta par aanalisar os dados de expressão genética. De modo mais genérico, o PCA podeser usado para analisar dados de valor característicos dos biomarcadores dapresente invenção, de modo a construir uma regra de decisão que discrimineos conversores a parir de não-conversores. A análise do componente principalé uma técnica clássica para reduzir a dimensionalidade de um conjunto dedados através da transformação dos dados em um novo conjunto de variáveis(componentes principais) que sumariam as características dos dados. Vide,por exemplo, Jolliffe, 1986, Principal Component ANALYSIS, Springer,Nova Iorque, que é incorporado a este a título referencial. A análise docomponente principal é também descrita em Draghici, 2003, Data AnalysisTools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRC, que é incorporado a este,a título referencial. Os que se seguem constituem exemplos não limitativos daanálise de componentes principais.

Os componentes principais (PCs) são não-correlacionados eordenados de tal modo que o Icth PC possua a maior variância de Icth maiordentre os PCs. O Kth PC pode ser interpretado como a direção, que maximizaa variação das projeções dos pontos de dados, que seja ortogonal ao primeiroK-I PCs. Os primeiros poucos PCs capturam a maior variação no conjuntode dados. Em contraste, os últimos poucos PCs são freqüentemente assumidoscomo capturando apenas os "ruídos" residuais nos dados.

O PCA pode ser também usado para criar um classificador deacordo com a presente invenção.

Em uma tal abordagem, os vetores para selecionar osbiomarcadores da presente invenção podem ser construídos do mesmo modoque o descrito para a aglomeração acima. De fato, o conjunto de vetores, emque cada vetor representa os valores de característica (por exemplo, valores deabundância)(para os genes selecionados a partir de um membro particular dapopulação de treinamento, podem ser considerados como uma matriz. Emalgumas modalidades, esta matriz é representada em um método de Free-Wilson de descrição binária qualitativa de monômeros (Kubinyi, 1930, 3DQSAR in drug design theory methods and applications, Pergamon Press,Oxford, págs. 589- 638), e distribuído em um espaço maximamentecomprimido usando PCA, de tal modo que o primeiro componente principal(PC) capture a maior quantidade de informação de variância possível, osegundo componente principal (PC) capture a segunda maior quantidade deinformação de variância, e assim por diante, até que toda a informação devariância na matriz tenha sido considerada.

Então, cada um dos vetores (em que cada vetor representa ummembro da população de treinamento) é representado graficamente. Muitosdiferentes tipos de representações gráficas são possíveis. Em algumasmodalidades, uma representação gráfica unidimensional é produzida. Nestarepresentação gráfica unidimensional, o valor para o primeiro componenteprincipal de cada um dos membros da população de treinamento érepresentado graficamente. Nesta forma de representação gráfica, aexpectativa é a de que membros de um primeiro subgrupo (por exemplo,aqueles pacientes que não desenvolvem a sepse em um determinado períodode tempo) serão aglomerados em uma faixa de valores do primeirocomponente principal e membros de um segundo subgrupo (por exemplo,aqueles pacientes que desenvolvem sepse em um período de tempodeterminado) serão aglomerados em uma segunda faixa de valores doprimeiro componente principal.

Em um exemplo ideal, a população de treinamentocompreende dois subgrupos: "sepse" e "SIRS". O primeiro componenteprincipal é computado usando os valores de expressão de marcador molecularpara os biomarcadores selecionados da presente invenção através de todo oconjunto de dados da população de treinamento. Então, cada membro doconjunto de treinamento e representado graficamente como uma função dovalor para o primeiro componente principal. Neste exemplo ideal, aquelesmembros da população de treinamento, nos quais o primeiro componenteprincipal é positivo, são os que "respondem" e aqueles membros da populaçãode treinamento, nos quais o componente principal é negativo, são os"pacientes com sepse".

Em algumas modalidades, os membros da população detreinamento são representados graficamente contra mais do que umcomponente principal. Por exemplo, em algumas modalidades, os membrosda população de treinamento são representados graficamente em umarepresentação gráfica bidimensional, na qual a primeira dimensão é oprimeiro componente principal e a segunda dimensão é o segundocomponente principal. Em uma tal representação gráfica bidimensional, aexpectativa é a de que membros de cada subgrupos representados napopulação de treinamento sejam aglomerados em grupos distintos. Porexemplo, um primeiro aglomerado de membros na segunda representaçãobidimensional irá representar pacientes, que desenvolvem sepse em umdeterminado período de tempo e um segundo aglomerado de membros narepresentação gráfica bidimensional irá representar pacientes, que nãodesenvolvem a sepse em um determinado período de tempo.

5.10. 9. Análise de Vizinho Mais Próximo

Os classificadores de vizinho mais próximos são baseados namemória e não requerem com que o classificador seja ajustado. Dado umponto xO, os pontos de treinamento k χ (r), r,..., k a uma distância mais próximaa xO são identificados e então o ponto xO é classificado usando os vizinhosmais próximos de k. As ligações podem ser rompidas de um modo aleatório.

Em algumas modalidades, a distância euclidiana em um espaço decaracterística é usada para determinar a distância como:

<formula>formula see original document page 115</formula>

Em um modo típico, quando o algoritmo de vizinho maispróximo é usado, os dados de expressão usados para computar a discriminantelinear são padronizados, de modo a que possuam uma média zero e umavariância de 1. Na presente invenção, os membros da população detreinamento são divididos, de modo aleatório, em um conjunto de treinamentoe um conjunto de teste. Por exemplo, em uma modalidade, dois terços dapopulação de treinamento são colocados no conjunto de treinamento e umterço dos membros da população de treinamento são colocados no conjuntode teste. Uma combinação selecionada de biomarcadores da presenteinvenção representa o espaço de característica, no interior do qual osmembros do conjunto de teste são representados graficamente. A seguir, acapacidade do conjunto de treinamento para caracterizar, de modo correto, osmembros do conjunto de teste, é computada. Em algumas modalidades, acomputação de vizinho mais próximo é executada, várias vezes, para umadeterminada combinação de biomarcadores da presente invenção. Em cadaiteração da computação, os membros da população de treinamento sãoatribuídos, de modo aleatório, ao conjunto de treinamento e ao conjunto deteste. Então, a qualidade da combinação de biomarcadores é tomada como amedia de cada tal iteração da computação de vizinho mais próximo.

A regra de vizinho mais próximo pode ser refinada de modo atratar de questões de antecedentes de classe desiguais, custos dedesclassificação diferenciais e seleção de característica. Muitos destesrefinamentos envolvem alguma forma de votação ponderada para os vizinhos.Quanto a mais informação com referência à análise de vizinho mais próximo,vide Duda, Pattern Classification, Segunda Edição, 2001, John Wiley & Sons,Inc.; e Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, NovaIorque, cada um dos quais é incorporado a este, a título referencial, em suatotalidade.

5.10.10. Análise Discriminativa Linear

A análise discriminativa linear (LDA) tenta classificar umpaciente em uma de duas categorias baseadas em certas propriedades doobjeto. Em outras palavras, a LDA testa se os atributos de um objeto, medidosem um experimento, prevê a categorização dos objetos. A LDA requer, demodo típico, variáveis independentes contínuas e uma variável dependentecategórica dicotômica. Na presente invenção, os valores de característica paraas combinações selecionadas de biomarcadores da presente invenção atravésde um subconjunto da população de treinamento servem como as variáveisindependentes contínuas requeridas. A referida classificação de subgrupo detraço de cada um dos membros da população de treinamento serve como avariável dependente categórica dicotômica.

A LDA busca a combinação linear de variáveis, que maximizaa razão de variância entre grupos e a variância dentro do grupo, através do usoda informação de agrupamento. De um modo implícito, os pesos linearessuados por LDA dependem de como os valores de características de ummarcador molecular através do conjunto de treinamento é separado nos doisgrupos (por exemplo, um grupo a, que desenvolve sepse durante um períodode tempo definido e um grupo b, que não desenvolve sepse durante umperíodo de tempo definido) e como estes valores de característica estãocorrelacionados com os valores de característica de outros biomarcadores. Emalgumas modalidades, a LDA é aplicada à matriz de dados dos membros N,na amostra de treinamento, através de bimarcadores K, em uma combinaçãode biomarcadores descrita na presente invenção. Então, a discriminante linearde cada membro da população de treinamento é representada graficamente.

De um modo ideal, aqueles membros da população de treinamento, querepresentam um primeiro subgrupo (por exemplo, aqueles pacientes quedesenvolvem a sepse em um período de tempo definido) serão aglomeradosem uma faixa de valores discriminativos lineares (por exemplo negativos) eaqueles membros da população de treinamento que representam um segundosubgrupo (por exemplo, aqueles pacientes que não desenvolvem a sepse emum período de tempo definido) serão aglomerados em uma segunda faixa devalores discriminativos lineares (por exemplo, positivos). A LDA éconsiderada mais bem sucedida quando a separação entre os aglomerados devalores discriminativos é maior. Quando a mais informação referente àanálise discriminativa, vide Duda, Pattern Classification, Second Edição,2002, John Wiley & Sons, Inc.; e Hastie, 2001, The Elements of StatisticalLearning, Springer, Nova Iorque; e Venables & Ripley, 1997, ModemApplied Statistics with s- plus, Springer, Nova Iorque, cada um dos quais éincorporado a este, a título referencial, em sua totalidade.

5.10.11. Análise Discriminativa Quadrática

A análise discriminativa quadrática (QDA) assume os mesmosparâmetros de entrada e retorna os mesmos resultados que a LDA. QDAutiliza equações quadráticas, preferivelmente a que equações lineares, demodo a produzir os resultados. LDA e QDA são intercambiábeis, e qual delasusar é uma questão de preferência e/ou disponibilidade de software parasuportar a análise. A regressão logística assume os mesmos parâmetros deentrada e retorna os mesmos resultados que a LDA e a QDA.

5.10.12. Máquinas de Vetor de Suporte

Em algumas modalidades da presente invenção, as máquinasde vetor de suporte (SVMs) são usadas para classificar pacientes usandovalores de característica dos genes descritos na presente invenção SVMsconstituem um tipo relativamente novo de algoritmo de aprendizagem. Vide,por exemplo, Cristiani and Shawe -Taylor, 2000, An Introduction to SupportVector Machines, Cambridge University Press, Cambridge; Boser et al. 1992,"A training algorithm for optimal margin classifiers ", em Proceedings of the5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory, ACM Press,Pittsburgh, PA, págs. 142-152; Vapnik, 1998, Statistical Learning Theory,Wiley, Nova Iorque; Mount, 2002, Bionformatics: sequenee and genomeanalysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NovaIorque, Duda, Pattern Classification, Second Edtion, 2002, John Wiley &Sons, Inc.; e Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer,Nova Iorque; e Furey et al., 2000, Bioinformatics, 16, 906-914, cada um dosquais é incorporado a este, a título referencial, em sua totalidade. Quandousados para a classificação, os SVMs separam um determinado conjunto dedados de treinamento de dados rotulados binários com um hiperplano, queestá em uma distância máxima a partir dos mesmos. Para casos, nos quais nãoé possível separação linear, os SVMs podem operar em combinação com umatécnica de "Kernels", que produz automaticamente um mapeamento não-linear em um espaço de característica. O hiperplano encontrado pelo SVM noespaço de característica corresponde a um limite de decisão não-linear noespaço de entrada.

Em uma abordagem, quando é usado um SVM, os dados decaracterística são padronizados de modo a ter uma média de zero e variânciaunitária e os membros de uma população de treinamento são divididos, d umemodo aleatório, em um conjunto de treinamento e um conjunto de teste. Porexemplo, em uma modalidade, dois terços dos membros da população detreinamento são colocados no conjunto de treinamento e um terço dosmembros da população de treinamento são colocados no conjunto de teste. Osvalores de expressão para uma combinação de genes descrita na presenteinvenção são usados para treinar o SVM. Então, a capacidade para que oSVM treinado classifique corretamente membros no conjunto de teste édeterminada. Em algumas modalidades, a computação é executada, váriasvezes, para uma determinada combinação de marcadores moleculares. Emcada iteração da computação, os membros da população de treinamento sãoatribuídos, de modo aleatório, ao conjunto de treinamento e ao conjunto deteste. Deste modo, a qualidade da combinação de biomarcadores é assumidacomo a média de cada tal iteração da computação de SVM.

5.10.13. Métodos Evolucionários

Inspirados pelo processo de evolução biológica, os métodosevolucionários do projeto de regra de decisão empregam uma pesquisaestocástica quanto a uma regra de decisão. Em uma revisão ampla, taismétodos criam várias regras de decisão - uma populaçãO-a partir de umacombinação de biomarcadores descrita na presente invenção. Cada regra dedecisão vária um pouco em relação à outra. A seguir, as regras de decisão sãoclassificadas com base em dados de característica através da população detreinamento. Mantendo a analogia com a evolução biológica, a graduaçãoresultante (escalar) é, algumas vezes, denominada o ajuste. As regras dedecisão são classificadas de acordo com a sua graduação e as melhores regrasde decisão são retidas (alguma porção da população total de regras dedecisão). De novo, mantendo a terminologia biológica, isto é denominado asobrevivência do mais apto. As regras de decisão são alteradas de um modoestocástico na próxima geração - os filhos ou descendentes. Algumas regrasde decisão de descendentes estão graduadas mais altas do que os seus pais nageração prévia, algumas terão graduações mais baixas. O processo total éentão repetido para a geração subseqüente: as regras de decisão sãoclassificadas e as melhores são retidas, alteradas de um modo aleatório parafornecer ainda uma outra geração, e assim por diante. Em parte, devido àclassificação, cada geração possui, em média, uma graduação ligeiramentemais alta do que a prévia. O processo é interrompido quando a regra dedecisão mais simples em uma geração possui uma graduação que excede aum valor de critério desejado. Mais informação sobre os métodosrevolucionários é encontrada, por exemplo, em Duda, Pattern Classification,Segunda edição, 2001, John Wiley & Sons, Inc.

5.10.14. Outros algoritmos de Análise de Dados

Os algoritmos de análise de dados acima descritos sãomeramente exemplos dos tipos de métodos, que podem ser usados paraconstruir uma regra de decisão para discriminar conversores a partir de não-conversores. Além disso, combinações das técnicas acima descritas podem serusadas. Algumas combinações, tais que o uso da combinação de árvores dedecisão e reforço, foram descritas. No entanto, muitas outras combinações sãopossíveis. Em adição, outras técnicas na arte, tais que a Busca de Projeção e aVotação Ponderada são usadas para a construção de regras de decisão.

5.11. Dispositivos para o Diagnóstico ou Prognóstico, ou aMonitoração, de uma Condição Inflamatória Sistêmica

A presente invenção provê dispositivos úteis para odiagnóstico, o prognóstico ou a monitoração de uma condição inflamatóriasistêmica. Alguns dispositivos da presente invenção compreendem umcomputador tendo uma unidade de processamento central e uma memóriaacoplada à unidade de processamento central. A memória armazenainstruções para avaliar se uma ou mais quantidades de um ou maisbiomarcadores de um paciente de teste, em risco de desenvolver umacondição inflamatória sistêmica satisfaz a um primeiro conjunto de valores.Satisfazer ao primeiro conjunto de valores prevê que o paciente de teste tenhaa probabilidade de desenvolver a condição inflamatória sistêmica.

A Figura 1 detalha um sistema exemplar, que suporta afuncionalidade acima descrita. O sistema é, de modo preferido, um sistema decomputador 10, tendo:

• uma unidade de processamento central 22;

· uma unidade de armazenamento não - volátil principal 14,por exemplo, um acionador de disco rígido, para o armazenamento desoftware e dados, a unidade de armazenamento 14 sendo controlada pelocontrolador de armazenamento 12;

• um sistema de memória 36, de modo preferido uma memóriade acesso aleatório de alta velocidade RAM) para armazenar programas decontrole de sistema, dados, e programas aplicativos, que compreendeprogramas e dados carregados a partir de uma unidade de armazenamentonão-volátil 14; a memória do sistema 36 pode também inclui memória apenaspara a leitura (ROM);• uma interface de usuário 32, que compreende um ou maisdispositivos de entrada (por exemplo, o teclado 28) e um visor 26 ou outrodispositivo de saída;

• um cartão de interface de rede 20 para a conexão a uma redede comunicação com fio ou sem fio 34 (por exemplo, uma rede de área ampla,tal que a Internet);

• um condutor interno 30 para interconectar os elementosantes mencionados do sistema; e

• uma fonte de potência 24 para acionar os elementos antesmencionados.

A operação do computador 10 é controlada primariamenteatravés de um sistema operacional 40, que é executada através de umaunidade de processamento central 22. O sistema operacional 40 pode serarmazenado em uma memória de sistema 36. Em adição ao sistemaoperacional 40, em uma memória de sistema de implementação típica 36,estão incluídos:

• um sistema de arquivo 42 para controlar o acesso aos váriosarquivos e estruturas de dados usados pela presente invenção;

• um conjunto de dados de treinamento 44 para o uso naconstrução de uma ou mais regras de decisão de acordo com a presenteinvenção;

• um módulo e algoritmo de análise de dados 54 para oprocessamento de dados de treinamento e a construção de regras de decisão;

• uma ou mais regras de decisão 56;

um módulo de avaliação de perfil de biomarcador 60 paradeterminar se uma pluralidade de quantidades em um perfil de biomarcadorde pelo menos um paciente de teste satisfaz a um primeiro conjunto devalores;

• uma base de dados 68 de biomarcadores selecionados dapresente invenção.

Como ilustrado na Figura 1, um computador 10 compreendemódulos de programa de software e estruturas de dados. As estruturas dedados armazenadas no computador 10 podem incluir o conjunto de dados detreinamento 44, as regras de decisão 56,o perfil de biomarcador de paciente deteste 62, e/ou a base de dados de biomarcador 68. Cada uma destas estruturasde dados podem compreender qualquer forma de sistema de armazenamentode dados, incluindo, mas não limitados a, um arquivo binário ou ASCII plano,uma planilha Excel, uma base de dados relacionai (SQL), ou uma base dedados de processamento analítico em linha (OLAP) (MDX e/ou variantes domesmo). Em algumas modalidades específicas, tais estruturas de dados estão,cada qual, sob a forma de uma ou mais bases de dados, que incluem umaestrutura hierárquica (por exemplo, um esquema em estrela). Em algumasmodalidades, tais estruturas de dados estão, cada qual, sob a forma de basesde dados que não possuem uma hierarquia explícita (por exemplo, tabela dedimensão que não estão dispostas de um modo hierárquico)

Em algumas modalidades, cada uma das estruturas e dadosarmazenada ou acessível ao sistema 10 são estruturas de dados únicas. Emoutras modalidades, tais estruturas de dados compreendem, de fato, umapluralidade de estruturas de dados (por exemplo, bases de dados, arquivos)que podem, ou não, todos estar hospedados pelo menos computador 10. Porexemplo, em algumas modalidades, o conjunto de treinamento de dados 44compreende uma pluralidade de planilhas Excel, que são armazenadas ou nocomputador 10 e/ou em computadores, que sejam acessáveis pelo computador10, através de uma rede de área ampla 34. Em um outro exemplo, o conjuntode dados de treinamento 44 compreende uma base de dados, que ou éarmazenada no computador 10 ou é distribuída através de um ou maiscomputadores, que são acessáveis pelo computador 10, através de uma redede área ampla 34.Será apreciado que muitos dos módulos e estruturas de dadosilustrados na Figura 1 podem estar localizados em um ou mais computadoresremotos. Por exemplo, algumas modalidades do presente pedido sãoimplementações do tipo de serviço de rede. Em tais modalidades, o módulo deavaliação de perfil de biomarcador 60 e/ou outros módulos pode residir emum computador de cliente, que está em comunicação com o computador 10através da rede 34. Em algumas modalidades, por exemplo, o módulo deavaliação do perfil de biomarcador 60 pode ser uma página de rede interativa.

Em algumas modalidades, o conjunto de dados de treinamento44, as regras de decisão 56 e/ou a base de dados do biomarcador 68 ilustradasna Figura 1 estão em um computador único (computador 10) e em outrasmodalidades, uma ou mais de tais estruturas de dados e módulos sãohospedados por um ou mais computadores remotos (não mostrado). Qualquerarranjo das estruturas de dados e módulos de software em um ou maiscomputadores está dentro do escopo da presente invenção, desde que estasestruturas de dados e estes módulos de software possam ser abordados, umcom relação ao outro, através de uma rede ou através de outros meioseletrônicos. Deste modo, a presente invenção abrange ainda um amploconjunto de sistemas de computador.

6. EXEMPLOS

6.1. Exemplo 1: Análise de Metabólitos do Soro dePacientes com Sepse e Pacientes com SIRS

Os Exemplos 1 e 2 demonstram a utilidade dos biomarcadoresda invenção para o diagnóstico e o prognóstico de sepse e SIRS. Os perfis debiomarcador de referência foram estabelecidos para duas populações devoluntários para paciente.

Populações de Pacientes

Os pacientes foram divididos em duas populações. Aprimeira população ("o grupo de SIRS") representa pacientes quedesenvolveram SIRS e que entraram no presente estudo no "Dia 1", masque não progrediram para a sepse durante a sua estada no hospital. Asegunda população ("o grupo de sepse") representa pacientes quedesenvolveram igualmente SIRS e que entraram no presente estudo noDia 1, mas que progrediram para a sepse, de modo típico, pelo menosvários dias antes de entrarem para o estudo.

Coleta de Amostra

Foram tiradas amostras de sangue a cada 24 horas a partir decada grupo de estudo. A suspeita clínica de sepse no grupo de sepse ocorreuno "tempo 0". As amostras foram tomadas no "tempo - 12 horas ", "tempo -36 horas" e "tempo - 60 horas" precedente ao dia de suspeita clínica de iníciode sepse no grupo de sepse. Ou seja, as amostras a partir do grupo de sepseincluíram aquelas tomadas no dia de entrada no estudo (Dia 1), 60 horas antesda suspeita clínica de sepse (tempo - 60 horas), 36 horas antes da suspeitaclínica de sepse (tempo - 36 horas), e no dia da suspeita clínica do início dasepse (tempo - 12 horas).

Preparação da Amostra

A 200 μΐ de metanol gelado (armazenado a - 20°C) foramadicionados 20 μΐ de plasma humano. A mistura foi então turbilhonadadurante 60 segundos, antes que ela fosse incubada a 4°C durante 20 minutos,de modo a auxiliar à precipitação de proteínas do plasma. A mistura foi entãocentrifugada a 13 k rpm durante 10 minutos e a 4o para que as proteínasfossem transformadas em pelotas. O sobrenadante (100 μΐ) contendo osmetabólitos foi então transferido para um tubo Eppendorf e evacuado a secoatravés de Speed - Vac.

Para a análise de espectrometria de massa (MS), osmetabólitos foram preparados com a diluição final de 1:50 com relaçãoao plasma original, em 50% de metanol e 0,5% de ácido fórmico, emágua deionizada, com 200 nM de reserpina como um controle interno.Espectrometria de Massa de Metabólitos

A análise de MS dos extratos de metabólito do soro foiexecutada em um sistema Qstar XL MS/MS (Applied Biosystems). A amostrafoi infundida em MS através do Nanomate (Advion Bioscience), um sistemade nanoeletropulverização automatizado. A eletropulverização foi efetuadaem uma voltagem de pulverização de 1,5 kV e sob uma pressão depulverização de O, 15 psi (1,035 kPa). O espectro MS foi acumulado durante 3minutos com massa com carga (M/Z), na faixa de 100 a 1200 Daltons.

6.2. Exemplo 2: Diagnóstico e Prognóstico de Sepse e SIRScom o Biomarcador 496. 3 ou o Biomarcador 518.3 da Invenção

Este exemplo provê estudos de curso de tempo dosbiomarcadores 496.3 e 518.3 e demonstra a sua utilidade para o diagnóstico, oprognóstico e a monitoração de sepse e SIRS. O biomarcador 496.3 é 1-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina, e o biomarcador 518. 3 é o sal desódio de l-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina.

O sangue foi extraído diariamente a partir de pacientescadastrados neste estudo até 13 dias a partir do dia de entrada no ICU, talcomo descrito no Exemplo 1. As concentrações relativas dos biomarcadoresde metabólito expostos na patente foram medidas com ESI-MS após aextração com metanol frio, também como descrito no Exemplo 1.

As Figuras 2 e 3 fornecem alterações de concentração relativados biomarcadores 496.1 3 e 518. 3 ao longo de um período de 13 dias para opaciente de sepse M 113 e para o paciente de SIRS M 245.

Como pode ser observado na Figura 2, a concentração dobiomarcador 496. 3 do paciente com SIRS M 245 aumenta, de modo gradual,a partir do dia 1 até o dia 13, indicando uma recuperação gradual do pacientecom SIRS a partir de um trauma de choque inicial.

Por outro lado, a concentração do mesmo biomarcador dopaciente de sepse diminui gradualmente até dois dias após o diagnósticoclínico de sepse no dia 12. Como mostrado na Figura 2, ocorre uma queda deconcentração repentina do biomarcador 518. 3 entre o dia 5 e o dia 7 para opaciente de sepse Ml 13, indicando um início ou piora da infecção sistêmica.

Como pode ser observado na Figura 3, a concentração dobiomarcador 518.3 do paciente de SIRS M245 aumenta, de modo gradual, apartir do dia 1 até o dia 13, indiciando uma recuperação gradual do pacientede SIRS a partir de um trauma de choque inicial.

Por outro lado, a concentração do mesmo biomarcador dopaciente de sepse diminui, de modo gradual, até dois dias após o diagnósticoclínico de sepse no dia 12. Como é também mostrado na Figura 3, existe umaqueda de concentração repentina do biomarcador 518. 3 entre o dia 6 e o dia 7para o paciente de sepse M 113, indicando um início ou uma piora dainfecção sistêmica.

Deste modo, é possível diagnosticar o início da sepse para opaciente M 113 entre o dia 6 e o dia 7, que é cerca de quatro dias antes que ossintomas clínicos ocorressem. O paciente com sepse M 113 sofreu um choqueséptico no dia 12, antes da eventual recuperação do dia 13, conforme indicadopela recuperação dos biomarcadores 496.3 e 518.3 (vide Figuras 2 e 3).

Um diagnóstico precoce de sepse entre o dia 6 e o dia 7,acompanhado por uma intervenção terapêutica ou profilática precoce poderiater salvado o paciente do choque séptico, junto com todo o custo associadocom o tratamento do choque séptico.

Como acima demonstrado, a quantidade de biomarcadores496.3 e 518.3 foi útil para o diagnóstico e a monitoração de SIRS nospacientes M245 (vide dias 1-13) e M 113 (vide dias 1-6). Em adição, osbiomarcadores 496. 3 e 518.3 foram também úteis para o diagnóstico ou oprognóstico de conversão para sepse e choque séptico no paciente M 113(vide dias 6-12) e para monitorar a recuperação do mesmo (vide dias 12- 13).

6.3. Exemplo 3: Identificação de Biomarcadores porMS/MS

Os biomarcadores foram geralmente identificados pelaexecução, em série, de MS nos sinais de pico de MS a partir das amostras deplasma. Os sinais e pico e MS/MS foram então atribuídos aos fragmentoscorrespondentes a partir do biomarcador proposto. Os biomarcadores foramfinalmente confirmados através de espectros de MS/MS de compostosadquiridos comercialmente.

Tabela 1. MS/MS de 496. 3 (l-O-palmitoil-2-liso-sn-gIicero-3-fosfocolina)

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Tabela 2. MS/MS de 524. 3 (l-O-estearoil-2-liso-sn-glicero-

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6.4. Exemplo 4: Desempenho de Quadrados Mínimos de 1-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina como um Diagnóstico paraSepse Usando Análise de Quadrados Mínimos

Este exemplo demonstra quão bom é o desempenho dosensaios baseados no marcador l-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolinapara o diagnóstico de sepse. Nestes ensaios exemplares, os ajustes de curva dequadrados mínimos são usados para modelar os dados e diagnosticar aiminência de sepse. O desempenho dos modelos demonstra a utilidade dosmétodos da invenção, para o diagnóstico, prognóstico e monitoração decondições inflamatórias sistêmicas em pacientes.

Os ensaios avaliaram duas características nos pacientes, I-O-palmitoil-2-liso-sn-glciero-3- fosfocolina com um peso molecular aparente de496,3 e o sal de sódio correspondente com um peso molecular de 518,3.

Havia um total de 55 pacientes totais, dos quais 23 erampacientes de SIRS e 32 eram pacientes de sepse. As Tabelas 4-1 e 4-2 abaixofornecem as distribuições de raça, gênero, idade e estado séptico para estasamostras.

Tabela 4-1

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Tabela 4-2

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Os pacientes foram classificados em pontos do tempo combase na iminência de sepse. Pacientes com SERS obtiveram a classificação 0.Na data de entrada, os pacientes com sepse obtiveram a classificação 1. Doisdias antes do início da sepse, os pacientes obtiveram a classificação 2. Um diaantes do início da sepse, os pacientes obtiveram a classificação 3.

Imediatamente antes do início da sepse, os pacientes obtiveram a classificação 4.

Características "retardadas" foram construídas a partir decaracterísticas para cada paciente ao longo do curso do tempo. Os dados deretardo 0 para um determinado paciente, em um período de tempodeterminado, são os dados daquele paciente apenas naquele período de tempo.Os dados de retardo 1 para aquele paciente naquele período de tempo são osdados de retardo O, assim como os dados a partir do período de tempo préviopara aquele paciente. De modo similar, os dados de retardo 2 para aquelepaciente naquele período de tempo são os dados disponíveis a partir daquelepaciente, naquele período de tempo, assim como nos dois períodos de tempoprévios.

Uma conseqüência quando à construção de retardamentossuperiores a 0 é a de que os dados para os pacientes em pontos de período detempo precoce estão incompletos, pois os dados retardados estãoindisponíveis. Estes casos são descartados da análise. Portanto, se os dados deretardo 0 estiverem completos, os dados de retardo 1 não possuem casos apartir do primeiro período de ponto no tempo disponível, e os dados deretardo 2 não possuem casos a partir do primeiro ou do segundo período deponto de tempo disponível. Retardamentos superiores fornecem maiorinformação por paciente em um período de tempo determinado, mas menoscasos para serem treinados. Naturalmente, quando maior o retardo, maislongo o período de tempo antes que uma previsão possa ser efetuada, emboraaquela previsão possa finalmente ser mais precisa.

Muitos modelos de regressão linear múltiplos foram ajustados,variando as características incluídas, assim como parâmetros de complexidadede modelo, usando a rotina de otimização SPSA (aproximação estocástica deperturbação simultânea). Para modelos de regressão múltiplos, não existeparâmetro de complexidade disponível. Os modelos foram selecionados demodo a otimizar a perda de erro ao quadrado média.

Uma formulação modelo, com uma perda esperada pequena,irá, de modo geral, fornecer melhores resultados para o paciente (intervençõesmais precisas, intervenções mais precoces, etc.) do que uma formulação demodelo com uma alta perda esperada. No entanto, a perda em si mesma nãonos ensina que pacientes deverão ser chamados, ou quando. De modo aavaliar isso, uma validação cruzada é executada com a formulação modeloidentificada. Os pacientes são divididos em grupos k (tipicamente 10), cadaqual de tamanho similar e tendo um número de pacientes de SIRS e depacientes sépticos. (Todos os dados de um determinado paciente sãodistribuídos a um mesmo grupo). Um modelo é ajustado de acordo com aformulação, deixando fora cada grupo a cada vez. O modelo ajustado é entãoaplicado aos dados do paciente descartados em cada ponto no tempo, e osvalores de SI previstos são calculados. A seguir, uma seqüência de limites éaplicada a cada valor de SI previsto. Para cada limite, podemos entãodeterminar se um valor de SI previsto do paciente alguma vez excedeu olimite, e se o fez, quando. Os valores previstos para todos os pacientes sãoentão reunidos para formar estimativas de especificidade e de sensibilidadeagregadas para todos os limites.

6.4.1. Resultados de Retardo 0

As características selecionadas pelo melhor modelo estimadoincluem características com pesos moleculares evidentes de 496,3 e 518,3.Como mostrado no Exemplo 3 acima, estas características correspondem aomarcador l-0-palmitol-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina e ao sal de sódiocorrespondente.

A iteração 1000 é estimada como tendo o melhor desempenho.As características selecionadas e a complexidade do modelo nesta iteração sãoestimados como fornecendo uma perda de 1,4482. Esta formulação modelofoi avaliada com uma validação cruzada de 10 vezes. A Figura 4 ilustra asensibilidade e a especificidade que seriam alcançadas com relação apacientes durante todo o curso de seus períodos de tempo. A Tabela 4-3apresenta os dados a partir dos pontos selecionados. A Tabela 4-4 sumaria astaxas de tempo estimadas da primeira intervenção de sepse iminente, para oslimites selecionados quando a alta sensibilidade, alta concordância total, e altaespecificidade, respectivamente.

A Tabela 4-3 provê uma sensibilidade e especificidadeestimada para os limites selecionados quanto à alta sensibilidade (limite maisbaixo), alta especificidade (limite mais alto), e concordância total elevada.

Tabela 4-3

<table>table see original document page 132</column></row><table>

A Tabela 4-4 provê uma distribuição estimada dos primeirosperíodos de intervenção de iminência de sepse para limites selecionados,fornecendo alta sensibilidade, alta concordância e alta especificidade,respectivamente. O dia 1 é o dia de entrada, o Dia 2 é o próximo dia testado,etc. "I" indica sem intervenção quanto a iminência de sepse durante o cursodo estudo.

Tabela 4-4

<table>table see original document page 132</column></row><table>

A Figura 4-2 ilustra a evolução de parâmetros de inclusão decaracterística durante a otimização. Embora a última iteração seja, de modotípico, a melhor, o processo é aleatório e a melhor iteração é estimada; nestecaso, a iteração 1000 é estimada como sendo a melhor.6.4.2. Resultados do Retardo 1

As características selecionadas pelo melhor modelo estimadoincluem características com pesos moleculares aparentes de 496.3 e 518.3.Como mostrado no Exemplo 3 acima, estas características correspondem aomarcador l-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina e ao sal de sódiocorrespondente.

A iteração 1000 é estimada como tendo o melhor desempenho.

As características selecionadas e a complexidade de modelo nesta iteração sãoestimadas como fornecendo uma perda de 1,4638. Esta formulação modelofoi avaliada com validação cruzada de 10 vezes. A Figura 4-3 ilustra asensibilidade e a especificidade que seriam alcançadas com relação apacientes durante todo os seus cursos de tempo. A Tabela 4-4 apresenta osdados a partir de pontos selecionados. A Tabela 4-6 sumaria as taxas detempo estimadas da primeira intervenção de sepse iminente, para os limitesselecionados quanto a alta sensibilidade, alta concordância geral, e altaespecificidade, respectivamente.

A Tabela 4-5 fornece a sensibilidade e a especificidadeestimadas para limites selecionados quanto a alta sensibilidade (limite maisbaixo), alta especificidade (limite mais alto), e alta concordância total.

Tabela 4-5

<table>table see original document page 133</column></row><table>

A Tabela 4-6 provê a distribuição estimada de períodos de tempode primeira intervenção de sepse para os limites selecionados, fornecendosensibilidade, alta concordância, e alta especificidade, respectivamente. O Dia 1 éo dia de entrada, o Dia 2 é o próximo dia testado, etc. "I" indica sem intervençãode iminência de sepse durante o curso do estudo.

Tabela 4-6

<table>table see original document page 133</column></row><table>

As Figuras 4-4 e 4-5 ilustram a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização. Embora a última iteração seja,de modo típico, a melhor, o processo e aleatório e, deste modo, estima amelhor iteração; neste caso, a iteração 1000 é estimada como sendo a melhor.

6.4.3 Resultados do Retardo 2

As características selecionadas pelo melhor modelo estimadoincluem as características com pesos moleculares evidentes de 496.3 e 518.3.Como mostrado no Exemplo 3 acima, estas características correspondem aomarcador l-0-palmitol-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina e ao sal de sódiocorrespondente.

A iteração 1000 é estimada como tendo o melhor desempenho.As características selecionadas e a complexidade do modelo nesta iteração sãoestimados como fornecendo perda de 1,6208. Esta formulação modelo foiavaliada com validação cruzada de 10 vezes. A Figura 4-6 ilustra asensibilidade e a especificidade que seriam alcançadas com relação apacientes durante os seus cursos de tempo totais. A Tabela 4-7 apresenta osdados a partir de pontos selecionados. A Tabela 4-8 sumaria as taxas detempo estimadas da primeira intervenção de sepse iminente, para os limitesselecionados quanto a alta sensibilidade, alta concordância total, e altaespecificidade, respectivamente.

A Tabela 4-7 fornece a especificidade e a sensibilidadeestimadas para os limites selecionados quanto a alta sensibilidade (limite maisbaixo), alta especificidade (limite mais alto), e alta concordância total.

Tabela 4-7

<table>table see original document page 134</column></row><table>

A Tabela 4-8 provê a distribuição estimada de períodos detempo de primeira intervenção de iminência de sepse para limitesselecionados fornecendo alta sensibilidade, alta concordância e altaespecificidade, respectivamente: o Dia 1 é o dia de entrada, o Dia 2 é opróximo dia testado, etc., "I" indica sem intervenção de iminência de sepsedurante o curso do estudo.

Tabela 4-8

<table>table see original document page 135</column></row><table>

As Figuras 4- 7 a 4-9 ilustram a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização. Embora a última iteração seja,de modo típico, a melhor, o processo é aleatório e, deste modo, estimamos amelhor iteração; neste caso, a iteração 1000 é estimada como sendo a melhor.

6.5. Exemplo 5: Desempenho de l-O-palmitoil-2-liso-sn-glciero-3-fosfocolina como um Diagnóstico para a Sepse Usando a Análisede Rede Neural

Este exemplo demonstra quão bom é o desempenho dosensaios baseados no marcador l-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolinapara o diagnóstico de sepse. Nestes ensaios exemplares, os ajustes da curvaneural são usados para modelar os dados e diagnosticar a iminência de sepse.

O desempenho dos modelos demonstra a utilidade dosmétodos da invenção para o diagnóstico, o prognóstico e a monitoração decondições inflamatórias nos pacientes.

Os ensaios avaliaram duas características nos pacientes, I-O-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3- fosfocolina com um peso molecular aparente de496,3 e o sal de sódio correspondente com um peso molecular aparente de 518,3.

Haviam 55 pacientes no total, dos quais 23 eram pacientes deSIRS e 32 eram pacientes de sepse. As Tabelas 5-1 e 5-2 abaixo fornecemdistribuições de raça, gênero, idade, e estado séptico para estas amostras.

Tabela 5-1

<table>table see original document page 136</column></row><table>

Tabela 5-2

<table>table see original document page 136</column></row><table>

Os pacientes foram classificados em pontos de tempo combase na iminência de sepse ("SI"). Os pacientes receberam a classificação 0.Na data de entrada, os pacientes de sepse receberam a classificação 1. Doisdias antes do início da sepse, os pacientes receberam a classificação 2. Um diaantes do início da sepse, os pacientes receberam a classificação 3.Imediatamente antes do início da sepse, os pacientes receberam aclassificação 4.

Características "retardadas" foram construídas a partir decaracterísticas para cada paciente a longo do curso do tempo. Os dados deretardo O para um determinado paciente em um determinado período detempo são os dados a partir daquele paciente apenas naquele momento detempo. Os dados de retardo 1 para aquele paciente naquele momento são osdados de retardo O, assim como os dados a partir do ponto de tempo préviopara aquele paciente. De um modo similar, os dados de retardo 2 para aquelepaciente naquele momento são os dados disponíveis a partir daquele pacientenaquele momento, assim como nos dois pontos de tempo precedentes.

Uma conseqüência da construção de retardos superiores a O é ade que os dados para pacientes em pontos de tempo antecedentes estãoincompletos, pois os dados em retardo estão indisponíveis. Estes casos sãodescartados a partir da análise. Portanto, os dados de retardo 0 estãocompletos, os dados de retardo 1 não possuem casos a partir do primeiroponto de tempo disponível, e os dados de retardo 2 não possuem casos a partirdo primeiro ou segundo ponto de tempo disponível. Retardos mais altosfornecem maior informação por paciente em um determinado período detempo, mas menos casos para o treinamento. De fato, quando maior o retardo,mais longo o tempo antes que possa ser efetuada uma previsão, emboraaquela previsão possa ser, no final, mais precisa.

Muitos modelos de rede neural foram ajustados, variando ascaracterísticas incluídas, assim como os parâmetros de complexidade demodelo, usando a rotina de otimização SPSA (aproximação estocástica deperturbação simultânea). Para os modelos de rede neural, a complexidade égovernada pelo número de nodos ocultos de queda de peso. Os modelosforam selecionados, de modo a otimizar a perda de erro ao quadrado média.

Uma formulação de modelo, com uma pequena perdaesperada, irá fornecer, de modo geral, melhores resultados para o paciente(intervenções mais precisas, intervenções mais precoces, etc.) do que umaformulação de modelo com uma alta perda esperada. No entanto, a perda emsi mesma não ensina que pacientes deverão sofrer intervenção, ou quando. Demodo a avaliar isto, a validação cruzada é executada com a formulação demodelo identificada. Os pacientes são divididos em grupos K (de modo típico10), cada qual de tamanho similar e tendo um número similar de pacientes deSIRS e sépticos. (Todos os dados de um determinado paciente sãodistribuídos para o mesmo grupo). Um modelo é ajustado de acordo com aformulação, descartando cada grupo, a cada vez. O modelo ajustado é entãoaplicado ao paciente descartado em cada ponto do tempo e os valores de SIprevistos são calculados. A seguir, uma seqüência de limites é aplicada acada valor de SI previsto. Para cada limite, podemos então determinar se umvalor de SI previsto do paciente alguma vez excedeu o limite, e se o fez,quando. Os resultados previstos a partir de todos os pacientes foram entãoreunidos, de modo a formar estimativas de sensibilidade e especificidadeagregadas para todos os limites.

6.5.1. Resultados de Retardo 0

As características selecionadas pelo melhor modelo estimadoincluem as características com pesos moleculares aparente de 496.3 e 518. 3.Como mostrado no Exemplo 3 acima, estas características

correspondem ao marcador l-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina e ao sal de sódio correspondente. Os parâmetros de complexidadede modelo identificados são 5 nodos ocultos e o peso diminui em 0,3003.

A iteração 1000 é estimada como tendo o melhor desempenho.A características selecionadas e a complexidade do modelo nesta iteração sãoestimados como fornecendo a perda de 1,3537. Esta formulação modelo foiavaliada com validação cruzada de 10 vezes. A Figura 5- 1 ilustra asensibilidade e a especificidade que seriam alcançadas com relação apacientes durante os seus curtos de tempo totais. A Tabela 5-3 apresenta osdados a partir de pontos selecionados. A Tabela 5-4 sumaria as taxas detempo estimadas da primeira intervenção de sepse iminente, para os limitesselecionados quanto a alta sensibilidade, alta concordância total, e altaespecificidade, respectivamente.

A Tabela 5-3 provê sensibilidade e especificidade estimadaspara os limites selecionados quanto a alta sensibilidade (limite mais baixo),alta especificidade (limite mais alto), e alta concordância total.

Tabela 5-3

<table>table see original document page 138</column></row><table>

A Tabela 5-4 provê a distribuição estimada de períodos detempo de intervenção de iminência de sepse para os limites selecionados,fornecendo alta sensibilidade, alta concordância, e alta especificidade,respectivamente. O Dia 1 é o dia de entrada, o Dia 2 é o dia seguinte testado,etc. "I" indica sem intervenção de iminência de sepse durante o curso doestudo.

Tabela 5-4

<table>table see original document page 139</column></row><table> A Figura 5-2 ilustra a evolução de parâmetros de inclusão decaracterística durante a otimização. Embora a última iteração seja, de modotípico, a melhor, o processo é aleatório e a melhor iteração é estimada; nestecaso, a iteração 1000 é estimada como sendo a melhor.

6.5.1. Resultados de Retardo 1

As características selecionadas pelo melhor modelo estimadosão caracterizadas por pesos moleculares de 496. 3 e 518.3. Como mostradono Exemplo 3 acima, estas características correspondem ao marcador I-O-palmitoil-2- lisO-sn-glicero-3-fosfocolina e ao sal de sódio correspondente.

Os parâmetros de complexidade do modelo identificados são 4 nodos ocultose o peso diminui em 1, 0563.

A iteração 847 é estimada como tendo o melhor desempenho.As características selecionadas e a complexidade do modelo nesta iteração sãoestimadas como fornecendo uma perda de 1,3603. Esta formulação modelofoi avaliada com validação cruzada 10 vezes. A Figura 5-3 ilustra asensibilidade e a especificidade que seriam alcançadas com relação apacientes ao longo de seus curtos de tempo totais. A Tabela 5-5 apresentadados a partir de pontos selecionados. A Tabela 5-6 sumaria as taxas detempo estimadas da primeira intervenção de sepse iminente, para os limitesselecionados quanto a alta sensibilidade, alta concordância total, e altaespecificidade, respectivamente.

A Tabela 5-5 fornece a especificidade e a sensibilidadeestimadas para limites selecionados quanto a alta sensibilidade (limite maisbaixo), alta especificidade (limite mais alto), e alta concordância total.

Tabela 5-5

<table>table see original document page 140</column></row><table>

A Tabela 5-6 provê a distribuição estimada de períodos de tempode intervenção de iminência de sepse para limites selecionados, fornecendo altasensibilidade, alta concordância e alta especificidade, respectivamente. O dia 1 é odia de entrada, o dia 2 é o dia seguinte testado, etc. "I "indica sem intervenção deiminência de sepse durante o curso do estudo.

Tabela 5-6

<table>table see original document page 140</column></row><table>

As Figuras 5-4 a 5-5 ilustram a evolução de parâmetros deinclusão de característica durante a otimização. Embora a última iteração seja,de modo típico, a melhor, o processo é aleatório e, deste modo, estimamos amelhor iteração; neste caso, a iteração 847 é estimada como sendo a melhor.

6.5.1. Resultados do Retardo 2

As características selecionadas pelo melhor modelo estimadoincluem características com pesos moleculares aparentes de 496.3 e 518.3.Como mostrado no Exemplo 3 acima, estas características correspondem aomarcador l-0-palmitoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina e ao sal de sódiocorrespondente. Os parâmetros de complexidade de modelo identificados são3 nodos ocultos e o peso decai em 1,6457.

A iteração 1000 é estimada como tendo o melhor desempenho.As características selecionadas e a complexidade do modelo nesta iteração sãoestimados como fornecendo uma perda de 1, 5287. Esta formulação de modelofoi avaliada com uma validação cruzada de 10 vezes. A Figura 5-6 ilustra asensibilidade e a especificidade, que seriam alcançadas com relação a pacientesdurante os seus cursos de tempo totais. A Tabela 5-7 apresenta dados a partir depontos selecionados. A Tabela 5-8 sumaria as taxas estimadas de tempo daprimeira intervenção de sepse iminente para os limites selecionados quanto a altasensibilidade, concordância geral, e alta especificidade, respectivamente.

A Tabela 5-7 provê a especificidade e a sensibilidadeestimadas para limites selecionados quanto a alta sensibilidade (limite maisbaixo), alta especificidade (limite mais alto), e alta concordância total.

Tabela 5-7

<table>table see original document page 141</column></row><table>

A Tabela 5-8 provê a distribuição estimada de períodos detempo de primeira intervenção de iminência de sepse para limitesselecionados, que fornecem alta sensibilidade, alta concordância, e altaespecificidade, respectivamente. O dia 1 é o dia de entrada, o dia 2 é o diaseguinte testado, etc. ("I) indica sem intervenção de iminência de sepsedurante o curso do estudo.

Tabela 5- 8

<table>table see original document page 141</column></row><table>

As Figuras 5-7 a 5-9 ilustram os parâmetros de inclusão decaracterística durante a otimização. Embora a ultima iteração seja, de modotípico, a melhor, o processo é aleatório, e, deste modo, estimamos a melhoriteração; neste caso, a iteração 1000 é estimada como sendo a melhor.

6.6. Exemplo 6: Ensaio Enzimático Colorimétrico para aDeterminação de Lisofosfatidilcolina Total

Populações de Pacientes

As populações de pacientes foram divididas em duaspopulações. A primeira população ("o grupo SIRS") representa pacientes, quedesenvolveram SIRS e que entraram no presente estudo no "Dia 1", mas quenão progrediram para a sepse durante a sua estadia no hospital. A segundapopulação ("o grupo de sepse") representa pacientes, que igualmentedesenvolveram SIRS e que entraram no presente estudo no Dia 1, mas queprogrediram para a sepse, de modo típico, pelo menos várias dias após terementrado no estudo.

Coleta de Amostras

As amostras de sangue foram extraídas a cerca de cada 24horas a partir de cada grupo de estudo. A suspeita clínica de sepse no grupode sepse ocorreu no "tempo 0". As amostras foram tomadas no "tempo 12horas", "tempo 36 horas" e tempo 60 horas" precedendo ao dia de suspeitaclínica do início de sepse no grupo de sepse. Ou seja, as amostras a partir dogrupo de sepse incluíram aquelas tomadas no dia de entrada no estudo (Dia1), 60 horas antes da suspeita clínica de sepse (tempo 60 horas), 36 horasantes da suspeita clínica de sepse (tempo 36 horas), e no dia da suspeitaclínica do início de sepse (tempo 12 horas).

Fontes de Reagentes

Lisofosfolipase (EC 3.1. 1.5) foi obtida de Asachi ChemicalCo. (Tóquio, Japão), Glicerofosforilcolina fosfodiesterase (GPCP; EC3.1.4.2), colina oxidase (COD; EC 1.1.3.17), peroxidase (EC 1. 11. 1. 7), N-etil-N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina desidrato de sódio (TOOS) e 4-aminoantipirina foram adquiridos de Aldrich (Milwakee, WI). l-Palmitoil-2-hidróxi-fosfatidilcolina foi obtido a partir de Avanti Polar-Lipids Inc.(Alabaster, AL), 10- acetil-3,7-diidroxifenoxazina foi obtido a partir deInvitrogen (Carlsbad, CA).

Mecanismo

No mecanismo de ensaio apresentado no Esquema 1 (FIG. 6),uma molécula de lisofosfatidilcolina (LPC) pode ser submetida a uma série dereações enzimáticas, de modo a fornecer duas moléculas de peróxido dehidrogênio. O peróxido de hidrogênio resultante pode oxidar 4-aminoantipirina, na presença de um sal de sódio de desidrato de N-etil-N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3- metilanilina (TOOS) de modo a produzir um corantequinoneimina. A intensidade de absorbância de quinoneimina pode sermedida em um comprimento de ondas de 590 nm.

Reagentes

O reagente A compreende Tris- HCl 100 mM (pH 8,0), 0,01 %de Triton X-100, cloreto de cálcio 1 mM, TOOS 3 mM (N-Etil-N-(2-hidróxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina, sal de sódio, diidrato),10 K Unidades/Lperoxidase, 0,1 K Unidades/L GPCP (glicerofosforilcolina fosfodiesterase) eIOK Unidades/L COD (colina oxidase). O reagente B compreende Tris- HCl100 mM (pH 8,0), 0,01% de Triton X- 100, 4-aminoantipirina 5mM e 30 KUnidades/L lisofosfolipase.

Ensaio enzimático colorimétrico por LPCUma amostra de plasma de 8 μΐ foi previamente incubada com240 μl de reagente A, durante 5 minutos a 37°C, e a absorbância entre 570 nm(comprimento de onda primário) e 700 nm (comprimento de onda secundário)foi medida em uma leitora de placa (Perkin-Elmer Victor 3). A reação foiiniciada com a adição de 80 μΐ de reagente B. Após 5 minutos, a absorbânciaentre 570 nm e 700 nm foi medida. A concentração de LPC total foideterminada com o auxílio de uma curva de calibração a partir da diluiçãoseqüencial de 500 μηιοΙ/L de l-palmitoil-2-hidróxi-fosfatidilcolina.

Resultados

<table>table see original document page 144</column></row><table>

Como mostrado na Tabela acima, um paciente com sepse e umpaciente com SIRS apresentam concentrações de LPC mais baixas,comparados a um paciente saudável normal. A concentração de LPC nopaciente com sepse é adicionalmente diminuída, comparada ao paciente comSIRS. Ambas as diferenças foram observadas em um conjunto maior deamostras.

6.7. Exemplo 7: Ensaio Enzimático Fluorescente para aDeterminação de LPC Total

Populações de Pacientes

Os pacientes foram divididos em duas populações. A primeirapopulação ("o grupo SIRS") representa pacientes que desenvolveram SIRS eque entraram no presente estudo no "Dia 1", mas que não progrediram para asepse durante a sua estadia no hospital. A segunda população ("o grupo desepse") representa pacientes que igualmente desenvolveram SIRS e queentraram no presente estudo no Dia 1, mas que progrediram para a sepse, demodo típico, pelo menos vários dias após entrarem no estudo.

Coleta de Amostras

Amostras de sangue foram tomadas a cada 24 horas a partir decada grupo de estudo. A suspeita clínica de sepse no grupo de sepse ocorreuno "tempo 0". As amostras foram tomadas no "tempo 12 horas", "tempo 36horas" e "tempo 60 horas" precedente ao dia de suspeita clínica do início desepse no grupo de sepse. Ou seja, as amostras a partir do grupo de sepseincluíram aquelas tomadas no dia de entrada no estudo (Dia 1), 60 horas antesda suspeita clínica de sepse (tempo 60 horas), 36 horas antes da suspeitaclínica de sepse (tempo 36 horas), e no dia da suspeita clínica do início desepse (tempo 12 horas).

Fontes de Reagentes

Lipofosfolipase (EC 3. 1. 1. 5) foi obtida a partir de AsachiChemical Co. (Tóquio, Japão). Glicerofosforilcolina fosfodiesterase (GPCP;EC 3. 1. 4. 2), colina oxidase (COD; EC 1.1.3.17), peroxidase (EC 1. 11. 1.7), desidrato de N-etil-N-(2-hidróxi-3-sulfofopropil)-3-metilanilina sódico(TOOS) e 4- aminoantipirina foram adquiridos de Aldrich (Milwaukee, WI).l-Palmitoil-2-hidróxi- fosfatidilcolina foi obtido a partir de Avanti Polar-Lipids Inc., (Alabaster, AL). 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina foi obtido apartir de Invitrogen (Carlsbd, CA).

Mecanismo

De modo similar ao ensaio enzimático colorimétrico, umamolécula de LPC pode fornecer, através de uma série de reações enzimáticas,duas moléculas de peróxido de hidrogênio (Esquema 1; vide Figura 6). Operóxido de hidrogênio resultante pode ser então oxidado para 10-acetil- 3,7-diidroxifenoxazina a um produto fluorescente, 7-hidróxi-3H-fenoxazina- 3-ona. A intensidade fluorescente de 7-hidróxi-3H- fenoxazina-3-ona pode serentão medida a 590 nm com um comprimento de onda de excitação de 530 nm.

Reagentes

O reagente A compreende Tris- HCl 100 mM (pH 8,0), 0,01%de Triton X- 100, cloreto de magnésio 10 mM, 0,1 K unidades/L de GPCP(glicerofosforilcolina fosfodiesterase), 10 K unidades/L de peroxidase, 10 Kunidades/L de COD (colina oxidase), e 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina 20mM. O reagente B compreende Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), 0,01% de TritonX-100 e 30 K unidades/L de lisofosfolipase.

240 μl de Reagente A são adicionados, a cada reservatório deuma microplaca 96 preta, para a fluorescência. 8 μΐ de cada amostra e/oupadrões são adicionados ao interior de cada reservatório contendo o ReagenteA, 80 μl do Reagente B são adicionados ao interior de cada reservatório. Amistura resultante é incubada durante 60 minutos, ou mais, a 37°C, protegidacontra a luz. A fluorescência é lida na leitora de placa Elmer Victor 3, comum comprimento de onda de excitação de 530 nm, um comprimento e onda deemissão de 590 nm, uma energia de lâmpada de "10000", e uma abertura deemissão "Small". O LPC total é determinado com o auxílio de uma curva decalibração a partir de 500 μηιοΙ/L de l-palmitoil-2-hidróxi-fosfatidilcolinadiluído de modo seqüencial, e uma solução de tampão compreendendo Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), 0,01% de Triton X- 100 e cloreto de magnésio 10 mM.

Resultados

As concentrações de LPC totais para 29 pacientes de sepse e22 pacientes de SIRS no dia da entrada, e nos intervalos T-60, T- 36 e T-12 (odia da suspeita clínica do início da sepse) são apresentadas na Figura 7. Comopode ser observado a partir da Figura 7, a concentração de LPC total para amaioria dos pacientes de SIRS é aumentada, de modo gradual, a partir do diade entrada, indicando uma recuperação gradual de cada paciente de SIRS apartir de um trauma de choque inicial. Por outro lado, a concentração de LPCtotal para a maioria dos pacientes de sepse começa a cair ou é nivelada doisdias antes do dia da suspeita clínica do início da sepse (T-12).

Neste conjunto de dados, o prognóstico clínico de sepse podeser efetuado de acordo com os métodos da invenção, um ou dois dias antes doinício da sepse, com 90% de especificidade e 60 % de sensibilidade, usandoos critérios que se seguem:- concentração de LPC (Dn) < 60 μΜ no dia da intervenção (dia n); e-Dn- Dn.! < 0 μΜ (a concentração de LPC foi reduzida ou nivelada).

Um diagnóstico precoce de sepse, acompanhado por umaintervenção terapêutica ou profilática precoce, poderia ter salvado o pacientedo choque séptico, além de ter poupado todo o custo associado com otratamento de choque séptico.

Todas as publicações e pedidos de patente citados nesterelatório são incorporados a este, a título referencial, como se cada publicaçãoindividual ou pedido de patente fosse, de modo específico e individual,indicado para ser incorporado a título referencial. Embora a invençãoprecedente tenha sido descrita de modo detalhado a título de ilustração eexemplo para propósitos de clareza ou de compreensão, será prontamenteevidente para aqueles de habilidade ordinária na arte, à luz dos ensinamentosdesta invenção, que algumas alterações e modificações podem serintroduzidas na mesma, sem que haja afastamento do espírito ou do escopodas reivindicações apensas.

Claims

1. Método para o diagnóstico ou prognóstico de sepse em umpaciente, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de monitorar ouavaliar a quantidade de lisofosfatidilcolina total em uma amostra de fluido outecido do paciente, em que o diagnóstico ou prognóstico é feito antes do inícioda sepse.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a lisofosfatidilcolina é um composto de acordo com a fórmula (I)<formula>formula see original document page 148</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila C10-22.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que R é acila C14-22, preferivelmente acila C1-20, mais preferivelmenteacila C16-18.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a etapa de medir durante o tempo uma pluralidade dequantidades de lisofosfatidilcolina total em uma amostra de fluido ou tecidodo paciente.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de dita lisofosfatidilcolina compreende l-0-palmitoil-2-liso-s«-glicero-3-fosfocolina e l-0-estearoil-2-liso-s«-glicero-3-fosfocolina.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a lisofosfatidilcolina total livre e/ou lisofosfatidilcolina totalligada indicam a quantidade de lisofosfatidilcolina total.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a lisofosfatidilcolina é um composto de acordo com a fórmula (I)<formula>formula see original document page 149</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila C10-22 ·

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que R é acila C14-22, preferivelmente acila C16-20 mais preferivelmenteacila C16-18.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que R é acila saturada, preferivelmente acila C16 saturada ou acila C18saturada.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que R é acila C16-18 não-ramificada, preferivelmente palmitoíla ouestearoíla.

11. Método de acordo com as reivindicações 4 a 7,caracterizado pelo fato de que uma quantidade decrescente indica riscocrescente para sepse ou uma quantidade crescente indica risco decrescentepara sepse, ou em que uma quantidade decrescente indica diagnóstico desepse ou uma quantidade crescente indica contra diagnóstico de sepse.

12. Método de acordo com as reivindicações 4 a 7,caracterizado pelo fato de que o paciente é positivo para SIRS.

13. Método de acordo com as reivindicações 4 a 7,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a medição de um oumais biomarcadores, em que dito biomarcador é outro que nãolisofosfatidilcolina.

14. Método de acordo com as reivindicações 4 a 7,caracterizado pelo fato de que a quantidade é medida por espectrometria,cromatografia, imunoensaio, eletroforese ou ensaio enzimático.

15. Método de acordo com as reivindicações 4 a 7,caracterizado pelo fato de que o fluido ou tecido é sangue, plasma, saliva,soro, saliva, urina, células, extrato celular ou biópsia de tecido.

16. Método de acordo com as reivindicações 4 a 7,caracterizado pelo fato de que o fluido ou tecido é sangue.

17. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de monitorar ou avaliaruma ou mais medições clínicas.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a medição clínica é de acordo com um modelo de severidadeclínica para sepse, em que o modelo clínico é selecionado a partir do grupoque consiste em Avaliação de Saúde Crônica e de Fisiologia Aguda,Avaliação de Saúde Crônica e de Fisiologia Aguda II, Avaliação de SaúdeCrônica e de Fisiologia Aguda III, Modelo de Previsão de Mortalidade,Classificação de Fisiologia Aguda Simplificada, Classificação de DisfunçãoOrgânica Múltipla, Classificação de Determinação de Falha OrgânicaSeqüencial, Classificação de Disfunção Orgânica Logística, e conceito depredisposição, infecção, resposta e disfunção orgânica.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa de comparar a quantidade delisofosfatidilcolina total na amostra de tecido ou fluido do paciente com umaquantidade referencial, indicativa da quantidade de lisofosfatidilcolina total naamostra de tecido ou fluido de um indivíduo que apresenta sepse.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a lisofosfatidilcolina é um composto de acordo com afórmula (I)<formula>formula see original document page 151</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila C10-22·

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que R é acila C 14.22, preferivelmente acila C10-20, maispreferivelmente acila Ci6-i8.

22. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que a diferença entre as quantidades estáinversamente correlacionada com o risco de sepse.

23. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que a quantidade referencial é uma quantidadereferencial de corte.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que uma quantidade inferior a quantidade referencial de corteindica diagnóstico de sepse.

25. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que a quantidade é medida 12, 24, 36 ou 48 horasantes do início da sepse.

26. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que o paciente é positivo para SIRS.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é positivo para SIRS.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que o indivíduo é positivo para sepse.

29. Método para o diagnóstico ou prognóstico de sepse em umpaciente, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de detectarlisofosfatidilcolina no paciente por meio do contato de uma amostra de fluidoou tecido do paciente com:uma enzima ou reagente capaz de reagir lisofosfatidilcolinapara formar glicerofosfatidilcolina;uma enzima ou reagente capaz de reagir glicerofosfatidilcolinapara formar colina;uma enzima ou reagente capaz de reagir colina, água eoxigênio para formar peróxido;uma peroxidase, eum substrato fluorogênico da dita peroxidase,sob condições adequadas para a formação de um produtofluorescente, em que o produto fluorescente indica lisofosfatidilcolina; eem que o diagnóstico ou prognóstico é feito antes do início dasepse.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita enzima ou reagente, capaz de reagir lisofosfatidilcolinapara formar glicerofosfatidilcolina, é lisofosfolipase.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita enzima ou reagente, capaz de converterlisofosfatidilcolina a glicerofosfatidilcolina é EC 3.1.1.5.

32. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita enzima ou reagente, capaz de reagirglicerofosfatidilcolina para formar colina, é uma glicerofosfatidilcolinadiesterase.

33. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita enzima ou reagente, capaz de reagirglicerofosfatidilcolina para formar colina, é EC 3.1.4.2.

34. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita enzima ou reagente, capaz de reagir colina para formarperóxido, é uma colina oxidase.

35. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita enzima ou reagente, capaz de reagir colina paraperóxido, é EC 1.1.3.17.

36. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a dita peroxidase é peroxidase de rábano silvestre.

37. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o dito substrato fluorogênico é 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina e o dito produto fluorescente é 7-hidróxi-3H-fenoxazin-3-ona.

38. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o dito produto fluorescente é detectado através de detecçãode fluorescência.

39. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a amostra é colocada em contato com uma lisofosfolipase,uma glicerofosfatidilcolina diesterase, uma colina oxidase, uma peroxidase, e10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina, sob condições adequadas para a formaçãode 7-hidróxi-3H-fenoxazin-3-ona, em que 7-hidróxi-3H-fenoxazin-3-onaindica lisofosfatidilcolina.

40. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a amostra é colocada em contato com EC 3.1.1.5, EC 3.1.4.2,EC 1.1.3.17, peroxidase de rábano silvestre e 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina, sob condições adequadas para a formação de 7-hidróxi-- 3H-fenoxazin-3-ona, em que 7-hidróxi-3H-fenoxazin-3-ona indicalisofosfatidilcolina.

41. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a quantidade de produto fluorescente indica a quantidade delisofosfatidilcolina.

42. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a quantidade de lisofosfatidilcolina total na amostra de fluidoou tecido do paciente é comparada com a quantidade referencial indicativa daquantidade de lisofosfatidilcolina total nas amostras de fluido ou tecido deuma pluralidade de indivíduos que apresentam sepse.

43. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa de comparar a quantidade delisofosfatidilcolina total na amostra de fluido ou tecido do paciente com umpadrão interno na amostra de fluido ou tecido.

44. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a(s) medição(ões) clínica(s) é(são) selecionada(s) a partir dogrupo que consiste em freqüência respiratória, temperatura, freqüênciacardíaca, contagem de células brancas sangüíneas, contagem de monócitos,contagem de linfócitos, contagem de granulócitos, contagem de neutrófilos,razão de neutrófilos imaturos para neutrófilos totais, contagem de plaquetas,concentração de creatinina no soro, concentração de uréia, concentração delactato, excesso de base e concentração de pC>2 e HCO3".

45. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que uma medição clínica é monitorada ou avaliada.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que a freqüência respiratória é monitorada ou avaliada.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que a temperatura é monitorada ou avaliada.

48. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que mais de uma medição clínica é monitorada ou avaliada.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que a freqüência respiratória e temperatura são monitoradas ouavaliadas.

50. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente monitorar ou avaliar um ou maisbiomarcadores na amostra de fluido ou tecido do paciente, em que osbiomarcadores são selecionados a partir do grupo que consiste em endotoxina,DNA bacteriano, proteína C, procalcitonina, proteína de ligação de LBP -LPS, produtos de degradação de fibrina, antitrombina III, dímero D, HLA-DR, CD-64, E- selectina, cortisol, ACTH, CD-14, sTNFRI, sTNF-RII, TNF,IL-6, IL-8, e IL-10, dímero D, tempo de protrombina, tempo detromboplastina parcial ativado, inibidor-1 de ativador de plasminogênio,trombomodulina solúvel, inibidor de fibrinólise ativável por trombina,proteína S, antitrombina e TNF-a.

51. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa de:medir uma pluralidade de quantidades de um composto deacordo com a fórmula (I)<formula>formula see original document page 155</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila C10-22, naamostra de fluido ou tecido do paciente; emedir um ou mais medições clínicas do paciente.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que a(s) medição(ões) clínica(s) é(são) selecionada(s) a partir dogrupo que consiste em freqüência respiratória, temperatura, freqüênciacardíaca, contagem de células brancas sangüíneas, contagem de monócitos,contagem de linfócitos, contagem de granulócitos, contagem de neutrófilos,razão de neutrófllos imaturos para neutrófilos totais, contagem de plaquetas,concentração de creatinina no soro, concentração de uréia, concentração delactato, excesso de base e concentração de pO2 e HCO3".

53. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que uma medição clínica é medida.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que a freqüência respiratória é medida.

55. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que a temperatura é medida.

56. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que mais de uma medição clínica é medida.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que a freqüência respiratória e temperatura são medidas.

58. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 51,caracterizado pelo fato de que o paciente é negativo para SIRS.

59. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 51,caracterizado pelo fato de que o paciente é positivo para SIRS.

60. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 51,caracterizado pelo fato de que a quantidade é medida por espectrometria,cromatografia, imunoensaio, eletroforese ou ensaio enzimático.

61. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 51,caracterizado pelo fato de que o fluido ou tecido é sangue, plasma, saliva,soro, saliva, urina, células, extrato celular ou biópsia de tecido.

62. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente medir um ou maisbiomarcadores na amostra de fluido ou tecido do paciente, em que osbiomarcadores são selecionados a partir do grupo que consiste em endotoxina,DNA bacteriano, proteína C, procalcitonina, proteína de ligação de LBP -LPS, produtos de degradação de fibrina, antitrombina III, dímero D, HLA-DR, CD-64, E- selectina, cortisol, ACTH, CD-14, sTNFRI, sTNF-RII, TNF,IL-6, IL-8, e IL-10, dímero D, tempo de protrombina, tempo detromboplastina parcial ativado, inibidor-1 de ativador de plasminogênio,trombomodulina solúvel, inibidor de fibrinólise ativável por trombina,proteína S, antitrombina e TNF-a.

63. Kit para diagnóstico ou prognóstico, ou monitoração, desepse em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende umalisofosfolipase, uma glicerofosfatidilcolina diesterase, uma colina oxidase,uma peroxidase e um substrato fluorogênico da dita peroxidase, em que odiagnóstico ou prognóstico é para ser feito antes do início da sepse.

64. Kit de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelofato de compreender um EC 3.1.1.5, EC 3. 1. 4. 2, EC 1.1. 3. 17, peroxidasede rábano e 10-acetil-3,7-diidroxifenoxazina.

65. Kit de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelofato de que a lisofosfatidilcolina é um composto de acordo com a fórmula (I)<formula>formula see original document page 157</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila C10-22·

66. Kit de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelofato de que a dita composição compreende um anticorpo capaz de se ligarseletivamente ao composto de fórmula (I).

67. Dispositivo para o diagnóstico ou prognóstico de sepse,caracterizado pelo fato de que dito dispositivo é capaz de medir a quantidadede um composto de acordo com a fórmula (I):<formula>formula see original document page 158</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila Cio-22, naamostra de fluido ou tecido do paciente, em que dito dispositivo é capaz decomparar a quantidade com uma quantidade referencial, indicativa daquantidade do composto na amostra de fluido ou tecido de um indivíduo queapresenta sepse; em que dito dispositivo compreende uma lisofosfolipase,uma glicerofosfatidilcolina diesterase, uma colina oxidase, uma peroxidase eum substrato fluorogênico da dita peroxidase, e em que o diagnóstico ouprognóstico é para ser feito antes do início da sepse.

68. Sistema para o diagnóstico ou prognóstico de sepse,caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro dispositivo, capaz demedir a quantidade de um composto de acordo com a fórmula (I)<formula>formula see original document page 158</formula>ou um sal ou solvato do mesmo, em que R é acila C10-22, naamostra de fluido ou tecido do paciente, e um segundo dispositivo, capaz decomparar a quantidade com uma quantidade referencial, indicativa daquantidade do composto na amostra de fluido ou tecido de um indivíduo queapresenta sepse; em que dito primeiro dispositivo compreende umalisofosfolipase, uma glicerofosfatidilcolina diesterase, uma colina oxidase,uma peroxidase e um substrato fluorogênico da dita peroxidase, e em que odiagnóstico ou prognóstico é para ser feito antes do início da sepse.