BRPI0616721A2 - métodos para degradar ou converter um material celulósico e para produzir uma substáncia, e, composição detergente - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULóSICO E PARA PRODUZIR UMA SUBSTáNCIA, E, COMPOSIçãO DETERGENTE. A presente invenção diz respeito a métodos para degradar ou converter um material celulósico e para produzir uma substância a partir de um material celulósico.

Description

"MÉTODOS PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIALCELULÓSICO E PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA, E,COMPOSIÇÃO DETERGENTE"

Declaração dos Direitos da Invenções Feitas sob Pesquisa e DesenvolvimentoFederalmente Patrocinado

Esta invenção foi feita com o suporte do Governo sob oSubcontrato NREL N0 ZCO-30017-02, Contrato Principal DE-AC36-98G010337 concedidos pelo Department of Energy. O governo tem certosdireitos nesta invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a métodos para degradar ouconverter um material celulósico e para produzir uma substância a partir deum material celulósico.

Descrição da Técnica Relacionada

A celulose é um polímero da glicose do açúcar simplescovalentemente ligada por beta-l,4-ligações. Muitos microorganismosproduzem enzimas que hidrolisam glicanos ligados por beta. Estas enzimasincluem endoglicanases, celobioidrolases e beta-glicosidases. Asendoglicanases digerem os polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-os ao ataque pelas celobioidrolases. As celobioidrolases seqüencialmenteliberam moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose. Acelobiose é um dímero beta-l,4-ligado solúvel em água de glicose. As beta-glicosidases hidrolisam celobiose à glicose.

A conversão de cargas de alimentação celulósicas em etanoltem as vantagens da biodisponibilidade pronta de quantidades grandes decarga de alimentação, a desejabilidade de evitar a queima ou o enchimentocom terra dos materiais e a limpeza do combustível de etanol. Madeira,resíduos agrícolas, lavouras herbáceas e resíduos sólidos municipais foramconsiderados como cargas de alimentação para a produção de etanol. Estesmateriais primariamente consistem de celulose, hemi-celulose e lignina. Umavez que a celulose é convertida à glicose, a glicose é facilmente fermentadapela levedura em etanol.

Deve ser vantajoso na técnica melhorar a capacidade paraconverter cargas de alimentação celulósicas. O Pedido de Patente PublicadoU. S. Série N0 2003/0113734 divulga uma proteína de celulase isolada,identificada como EGVII e ácidos nucleicos que codificam EGVII.

É um objeto da presente invenção fornecer polipeptídeosisolados tendo atividade realçadora celulolítica e seqüências de ácido nucleicoisolado que codificam os polipeptídeos para melhorar a conversão de cargasde alimentação celulósicas.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a métodos para degradar ouconverter um material celulósico, que compreende: tratar o materialcelulósico com uma quantidade eficaz de um ou mais proteínas celulolíticasna presença de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica, em que a presença do polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica aumenta a degradação de material celulósicocomparada com a ausência do polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica e em que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica éselecionado do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácido x(4,5) équalquer aminoácido em 4 ou 5 posições contíguas e x(3) é qualqueraminoácido em 3 posições contíguas;

(b) um polipeptídeo que compreende um seqüência deaminoácido que tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 2;(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (i) a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência deDNA genômico que compreende a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 1 ou (iii) um filamento complementar of (i) ou (ii); e

(d) uma variante que compreende uma substituição, deleção,e/ou inserção conservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 2.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir uma substância, que compreende:

(A) sacarificação de um material celulósico com umaquantidade eficaz de um ou mais proteínas celulolíticas na presença de umaquantidade eficaz de um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica,em que a presença do polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticaaumenta a degradação de material celulósico comparada com a ausência dopolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica e em que o polipeptídeotendo atividade realçadora celulolítica é selecionado do grupo que consiste de:

(i) um polipeptídeo que compreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácido x(4,5) équalquer aminoácido em 4 ou 5 posições contíguas e x(3) é qualqueraminoácido em 3 posições contíguas; e

(ii) um polipeptídeo que compreende um seqüência deaminoácido que tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 2;

(iii) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (a) aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1, (b) aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1 ou (c) um filamento complementar de(i) ou (ii); e

(iv) uma variante que compreende uma substituição, deleção,e/ou inserção conservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 2;

(B) fermentação do material celulósico sacarificado da etapa(um) com um ou mais microorganismos de fermentação; e

(C) recuperação de uma substância da fermentação.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro são osaminoácidos de 20 a 249 da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro são os nucleotídeos de 77 a766 da SEQ ID N°: 1. A presente invenção ainda diz respeito a composiçõesdetergentes que compreendem, tais polipeptídeos tendo atividade realçadoracelulolítica.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a seqüência de cDNA e a seqüência deaminoácido deduzida de um polipeptídeo de Trichoderma reesei RutC30(ATCC 56765) GH61B tendo atividade realçadora celulolítica (SEQ ID N°: 1e 2, respectivamente). Os íntrons preditos são grifados. O peptídeo de sinalpredito é sublinhado.

A Figura 2 mostra um mapa de restrição de pTr3337.

A Figura 3 mostra um mapa de restrição de pTr61B.

A Figura 4 mostra a hidrólise de PCS (P020502CS, 100 MFsubmetido à autoclave, 10 g/L) pelo caldo de Trichoderma reesei que expressaa beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (CLF) com ou sem suplementaçãopor Trichoderma reesei GH61B. A hidrólise foi realizada a 50° C, pH 5,0 parao períodos indicados. O carregamento de Celluclast foi de 2,5 ou 3,125 mgpor grama de PCS e a mistura continha 2,5 mg de CLF e 0,625 mg de GH61Bpor grama de PCS.

A Figura 5 a hidrólise de PCS (P020502CS, 100 MFsubmetido à autoclave, 10 g/L) por Celluclast Plus suplementado comproteína com GH61B. O caldo de Aspergillus oryzae que não contém proteínarecombinante (Jal250) foi adicionado como um controle. A incubação foi por115 horas a 50° C.

Definições

Atividade realçadora celulolítica: O termo "atividaderealçadora celulolítica" é definida aqui como uma atividade biológica queintensifica a hidrólise de um material celulósico pelas proteínas tendoatividade celulolítica. Para os propósitos da presente invenção, a atividaderealçadora celulolítica é determinada pela medição do aumento na redução deaçúcares a partir da hidrólise de um material celulósico pela proteínacelulolítica sob as seguintes condições: 5,0 mg de proteína celulolítica/g decelulose em PCS por 5 a 7 dias a 50° C na presença e ausência de 0,01 a 2,5mg de atividade realçadora celulolítica por g de celulose em PCS comparada auma hidrólise de controle com carregamento de proteína total igual sematividade realçadora celulolítica (5,01 a 7,5 mg de proteína celulolítica/g decelulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de Celluclast®1,5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) na presença de 3 % de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzidos emAspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 3 % de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzidos emAspergillus oryzae de acordo com o Exemplo 22 do WO 02/095014) docarregamento de proteína de celulase são usados como a fonte da atividadecelulolítica.

Os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica têmpelo menos 20 %, preferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmentepelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, maispreferivelmente pelo menos 70 %, mais preferivelmente pelo menos 80 %,ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelomenos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 % da atividaderealçadora celulolítica do polipeptídeo do polipeptídeo maduro da SEQ IDN°: 2.

Atividade celulolítica: O termo "atividade celulolítica" édefinida neste como uma atividade biológica que hidrolisa um materialcelulósico. Para os propósitos da presente invenção, a atividade celulolítica édeterminada pela medição do aumento na hidrólise de um material celulósicopor uma mistura celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 10 mg deproteína celulolítica/g de celulose em PCS por 5 a 7 dias em 50° C emcomparação com uma hidrólise de controle sem a adição de proteínacelulolítica. Em um aspecto preferido, uma mistura de Celluclast® 1,5L(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) na presença de 3 % de Beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzidos emAspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 3 % beta glicosidase deAspergillus fumigatus (recombinantemente produzidos em Aspergillus oryzaede acordo com Exemplo 22 do WO 02/095014) do carregamento de proteínade celulase como a fonte da atividade celulolítica.

Forragem de milho pré-tratada: O termo "PCS" ou "forragemde milho pré-tratada" é definida neste como um material celulósico derivadode forragem de milho pelo tratamento com calor e ácido diluído. Para ospropósitos da presente invenção, o PCS é feito pelo método descrito noExemplo 1 ou variações destes em tempo, temperatura e quantidade de ácido.

Glicosídeo hidrolase da família 61: O termo "glicosídeohidrolase da família 61" ou "Família GH61" é definido neste como umpolipeptídeo que está na família 62 de glicosídeo hidrolase de acordo comHenrissat B., 1991, A classification of glycosil hidrolases based on amino-acid seqüência similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B. eBairoch A., 1996, Updating the sequência-based classification of glycosilhidrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Presentemente, Henrissat lista aFamília GH61 como não classificada indicando que as propriedades, taiscomo mecanismo, nucleófilo catalítico/base, doadores de próton catalíticos eestrutura 3-D não são conhecidos pelos polipeptídeos que pertencem a estafamília.

Material celulósico: O material celulósico pode ser qualquermaterial contendo celulose. Celulose é, no geral, encontrada, por exemplo,nos caules, folhas, cascas, e espigas de plantas ou folhas, galhos e madeira deárvores. O material celulósico também podem ser, mas não limitado a,material herbáceo, resíduo agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidosmunicipais, papel usado e resíduo de polpa e moagem de papéis. É entendidoneste que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, uma material deparede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemi-celulose em umamatriz misturada. Em um aspecto preferido, o material celulósico é forragemde milho. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é fibra demilho. Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é palha de arroz.

Em um outro aspecto preferido, o material celulósico é papel e resíduo deprocessamento de polpa. Em um outro aspecto preferido, o material celulósicoé madeira ou plantas herbáceas. Em um outro aspecto preferido, o materialcelulósico é bagaço. O material celulósico pode ser usado como é ou pode sersubmetido ao pré tratamento, usar métodos convencionais conhecidos natécnica. Por exemplo, técnicas de pré tratamento físico pode incluir váriostipos de trituração, irradiação, vaporização/explosão de vapor ehidrotermólise; técnicas de pré tratamento químico pode incluir ácido diluído,alcalino, solvente orgânico, amônia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono ehidrotermólise de pH controlado; e técnicas de pré tratamento biológicos podeenvolver aplicação de microorganismos de solubilização-lignina (ver, porexemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomassa, in Handbook onBioethanol: Production e Utilizatio, Wyman, C. E., ed., Tailor & Francis,Washington, DC, 179-212; Ghosh, P. e Singh, A., 1993, Physicochemical ebiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosicbiomassa, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994,Pretratar lignocellulosic biomassa: um review, in Enzymatic Conversion ofBiomassa for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O. e Overend, R. P.,eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington,DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, Etanolproduction firam renewable resources, em Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag BerlinHeidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L. e Hahn-Hagerdal, B., 1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for etanol production, Enz.Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander, L. e Eriksson, K.-E. L, 1990,Production of etanol firam lignocellulosic materiais: State of the art, Adv.Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" comoaqui usado refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20 % puro,preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, maispreferivelmente pelo menos 90 % puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95 % puro, como determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeo puro substancialmente: O termo "polipeptídeopuro substancilamente" indica aqui, uma preparação de polipeptídeo quecontém, na maioria 10 %, preferivelmente na maioria 8 %, maispreferivelmente na maioria 6 %, mais preferivelmente na maioria 5 %, maispreferivelmente na maioria 4 %, mais preferivelmente na maioria 3 %, aindamais preferivelmente na maioria 2 %, mais preferivelmente na maioria 1 % eainda mais preferivelmente na maioria 0,5 % em peso de outro material de

polipeptídeo com que é naturalmente associado. E, portanto, preferido que opolipeptídeo puro substancilamente é pelo menos 92 % puro, preferivelmentepelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, maispreferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, mais preferivelmentepelo menos 98 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99 %, maispreferivelmente pelo menos 99,5 % puro e ainda mais preferivelmente 100 %puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação.

O polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica sãopreferivelmente em uma forma pura substancialmente. Em particular, épreferido que os polipeptídeos são em "forma pura essencialmente", isto é,que a preparação de polipeptídeo é essencialmente livre de outro material depolipeptídeo com que é naturalmente associado. Este pode ser realizado, porexemplo, por preparar o polipeptídeo por meios de métodos recombinantesbem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

Aqui, o termo "polipeptídeo puro substancilamente" ésinônimo dos termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na formaisolada."

Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" édefinido neste como um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticaque é na sua forma final seguindo tradução e quaisquer modificações pós-tradução, tal como processamento de terminal N, truncação de terminal C,glicosilação, fosforilação, etc.

Seqüência codificadora de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência codificadora de polipeptídeo maduro" é definida neste como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade realçadora celulolítica.

Identidade: A relação em entre duas seqüência de aminoácidosou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro"identidade".

Para o propósito da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de aminoácidos é determinada usar o algoritmoNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453)como implementado no programa Needle de EMBOSS com fissura depenalidade aberta de 10, fissura de penalidade de extensão de 0,5 e a matrizEBLOSUM62. A produção de Needle rotulado "identidade mais longa" éusado como a identidade percentual e é calculado como seguinte:

(Resíduos idênticos χ 100)/(Comprimento de alinhamento -Número de fissuras no alinhamento)

Para o propósito da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de nucleotídeo é determinada usar o algoritmoNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453)como implementado no programa Needle de EMBOSS com fissura depenalidade aberta de 10, fissura de penalidade de extensão de 0,5 e a matrizEDNAFULL. A produção de Needle rotulado "identidade mais longa" éusado como a identidade percentual e é calculado como seguinte: (Resíduosidênticos χ 100)/(Comprimento de alinhamento - Número de fissuras noalinhamento)

Seqüências homólogas: O termo "seqüências homólogas" édefinida neste como seqüências com um valor E (ou contagem deprobabilidade) de menos do que 0,001 usar o blastp (para bases de dados deproteínas) ou tblastn (para bases de dados de ácido nucleico) algoritmos coma matriz BLOSUM62, tamanho de palavra 3, custo de existência de fissura11, custo de extensão fissura 1, nenhuma filtração de complexidade inferior ea seqüência de proteína GH61 B madura como dúvida". Ver Altschul et ai.,1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Fragmento de polipeptídeo: O termo "fragmento depolipeptídeo" é definido neste como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos apagados a partir de finais de amino e/ou carboxil dopolipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 ou uma seqüência homóloga deste, emque o fragmento tem atividade realçadora celulolítica. Preferivelmente, umfragmento do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 contém pelo menos 200resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 210 resíduos deaminoácido e mais preferivelmente pelo menos 220 resíduos de aminoácido.

Subseqüência: O termo "subseqüência" é definida neste comoum seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos apagados a partirda extremidade 5' e/ou 3' da seqüência codificadora do polipeptídeo maduroda SEQ ID N°: 1 ou uma seqüência homóloga deste, em que a subseqüênciacodifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica.Preferivelmente, uma subseqüência da seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 1 contém pelo menos 600 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 630 nucleotídeos e mais preferivelmente pelomenos 660 nucleotídeos.

Variante alélica: O termo "variante alélica" indica aquiqualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmolocal cromossômico. A variação alélica origina-se naturalmente através demutação e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. Asmutações do gene pode ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeocodificado) ou pode codificar polipeptídeos tendo a seqüência alterada deaminoácidos. Um variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeocodificado por um variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo isolado: O termo "polinucleotídeo isolado"como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é pelo menos 20 % puro,preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, maispreferivelmente pelo menos 90 % puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95 % puro, como determinado por eletroforese de agarose.

Polinucleotídeo puro substancialmente: O termo"polinucleotídeo puro substancialmente" como aqui usado refere-se a umapreparação de polipeptídeo livre de outros nucleotídeos estranhos e nãodesejados e em uma forma adequada para o uso dentro de sistemas deprodução de proteína geneticamente projetados. Deste modo, umpolinucleotídeo puro substancialmente contém, na maioria 10 %,preferivelmente na maioria 8 %, mais preferivelmente na maioria 6 %, maispreferivelmente na maioria 5 %, mais preferivelmente na maioria 4 %, maispreferivelmente na maioria 3 %, ainda mais preferivelmente na maioria 2 %,mais preferivelmente na maioria 1 % e ainda mais preferivelmente na maioria0,5 % em peso de outro material de polinucleotídeo com que é naturalmenteassociado. Um polinucleotídeo puro substancialmente pode, entretanto, incluirnaturalmente regiões não traduzidas de 5' e 3' ocorrência natural, tal comopromotores e terminadores. E preferido que o polinucleotídeo purosubstancialmente é pelo menos 90 % puro, preferivelmente pelo menos 92 %puro, mais preferivelmente pelo menos 94 % puro, mais preferivelmente pelomenos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, maispreferivelmente pelo menos 97 % puro, ainda mais preferivelmente pelomenos 98 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99 % e ainda maispreferivelmente pelo menos 99,5 % puro em peso. Os polinucleotídeos sãopreferivelmente em um forma pura substancialmente. Em particular, épreferido que os polinucleotídeos divulgados aqui são em "forma puraessencialmente", isto é, que a preparação de polinucleotídeo é essencialmentelivre de outro material de polinucleotídeo com que é naturalmente associado.

Aqui, o termo "polinucleotídeo puro substancialmente" é sinônimo dostermos "polinucleotídeo isolado" e "polinucleotídeo na forma isolada." Ospolinucleotídeos podem ser genômico, cDNA, RNA, semi-sintético, deorigem sintética ou qualquer combinações destes.

cDNA: O termo "cDNA" é definida neste como uma moléculade DNA que pode ser preparada por transcrição reversa a partir de umamolécula de mRNA madura,unida, obtida a partir de uma célula eucariótica.

O cDNA precisa da seqüência de íntron que está usualmente presentes noDNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário é umprecursor para mRNA que é processado através de uma série de etapas antesde aparecer como mRNA unido maduro. Estas etapas incluem a remoção deseqüência de íntron por um processo denominado união. O cDNA derivado demRNA precisa, portanto, de quaisquer seqüências de íntron.

Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácidonucleico" como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucleico, defilamento simples ou duplo, que é isolado a partir de um gene de ocorrêncianatural ou que é modificado por conter segmentos de ácidos nucleicos emuma maneira que, de outra maneira, não existiria na natureza. O termoconstrução de ácido nucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão"quando a construção de ácido nucleico contém as seqüências de controlerequerida para expressão da seqüência codificadora.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" édefinida neste por incluir componentes totais, que são necessários ouvantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo. Cada seqüência de controle pode ser natural ou estranha àseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou natural ou estranhapara cada outro. Tais seqüências de controle incluem, mas não limitam-se a,um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, promotor,seqüência de sinal de peptídeo e terminador de transcrição. Em um mínimo,as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de interrupção detranscripcionais e de tradução. As seqüências de controle podem serfornecidas com ligadores para o propósito de introdução dos locais derestrição específicos que facilitam a ligação das seqüências de controle com aregião codificadora da seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo.

Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado"indica aqui em uma configuração em que uma seqüência de controle écolocada em uma posição apropriada em relação à seqüência codificadora depolisequências de nucleotídeo tal como a seqüência de controle direciona aexpressão da seqüência codificadora de um polipeptídeo.

Seqüência codificadora: Quando aqui usado o termo"seqüência codificadora" significa uma seqüência de nucleotídeo, quediretamente especifica a seqüência de aminoácido deste produto de proteína.Os limites da seqüência codificadora são no geral determinadas por umaestrutura de leitura aberta, que usualmente inicia-se com o códon de partidaATG ou códons de partida alternativos tais como GTG e TTG e finais comum códon de interrupção tal como TAA, TAG e TGA. A seqüênciacodificadora pode ser um DNA, cDNA ou seqüência recombinante denucleotídeo.

Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapaenvolvida na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não limitando a,transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional e secreção.

Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é definidoneste como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção e que éoperacionalmente ligado a nucleotídeos adicionais que fornecem suaexpressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como aquiusado, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível a transformação,transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucleico ouvetor de expressão que compreende um polinucleotídeo.

Modificação: O termo "modificação" significa aqui qualquermodificação química do polipeptídeo que consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID N°: 2 ou uma seqüência homóloga deste; assim como manipulaçãogenética de DNA que codifica uma tal polipeptídeo. A modificação pode sersubstituições, deleções e/ou inserções de um ou mais aminoácidos assimcomo substituição de uma ou mais cadeias colaterais de aminoácidos.Variante artificial: Quando aqui usado, o termo "variante artificial" significaum polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica produzido por umorganismo que expressa uma seqüência modificada de nucleotídeo daseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1 ou umaseqüência homóloga deste. A seqüência modificada de nucleotídeo é obtidoatravés da intervenção humana pela modificação da seqüência de nucleotídeodivulgados em SEQ ID N°: 1 ou uma seqüência homóloga deste.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção diz respeito a métodos para degradar ouconverter um material celulósico, que compreende: tratar o materialcelulósico com uma quantidade eficaz de uma proteína celulolítica napresença de uma quantidade eficaz do polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica, em que a presença do polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica aumenta a degradação de material celulósico comparado com aausência do polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica e em que opolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica é selecionado do grupoque consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende [ILMN/]-P-x(4,5)-G-x-Y- [ILMV] -x-R-x- [EQ] -x(3)- UM-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácidox(4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5 posições contíguas e x(3) é qualqueraminoácido em 3 posições contíguas;

(b) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 2;

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (i) a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência deDNA genômico que compreende a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e

(d) uma variante que compreende uma substituição, deleção,e/ou inserção conservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 2.

A presente invenção ainda compreende a recuperação domaterial celulósico degradado ou convertido. Produtos solúveis de degradaçãoou conversão do material celulósico podem ser separados a partir do materialcelulósico insolúvel usando tecnologias bem conhecidas na técnica tal comocentrifugação, filtração e sedimentação por gravidade.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir uma substância, que compreende: (A) sacarificação de um materialcelulósico com uma quantidade eficaz de um ou mais proteínas celulolíticasna presença de uma quantidade eficaz do polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica, em que a presença do polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica aumenta a degradação de material celulósicocomparado com a ausência do polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica e em que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica éselecionado do grupo que consiste de: (i) um polipeptídeo que compreende[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-UM-[HNQ], em que χ équalquer aminoácido x(4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5 posiçõescontíguas e x(3) é qualquer aminoácido em 3 posições contíguas; (ii) umpolipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido que tem pelomenos 70 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2; (iii)um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sobcondições de estringência pelo menos média com (a) uma seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1, (b) uma seqüência deDNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro da seqüênciacodificadora da SEQ ID N°: 1 ou (c) um filamento complementar de (a) ou(b); e (iv) uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ouinserção conservativa de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro daSEQ ID N°: 2; (B) fermentação do material celulósico sacarificado da etapa(a) com um ou mais microorganismos de fermentação; e (C) recuperação deum substância da fermentação.

Os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica ecélulas hospedeiras descritas aqui podem ser usados na produção demonossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos como cargas de alimentaçãoquímica ou de fermentação de biomassa para a produção de etanol, plásticos,outros produtos ou intermediários. Em particular, os polipeptídeos e célulashospedeiras podem ser usados para aumentar o valor E de resíduos deprocessamento (grãos destiladores secos, grãos consumidos de fermentação,bagaço de cana de açúcar, etc.) por solubilização completa ou parcial decelulose ou hemi-celulose. Na intensificação do processamento pelasproteínas celulolíticas do material celulósico para glicose, xilose, manose,galactose e arabinose, seus polímeros ou produtos derivados como descritaabaixo, os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica pode ser naforma de um caldo de fermentação bruto com ou sem as células ou na formade uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada. A proteína deintensificação celulolítica pode ser uma preparação monocomponente, porexemplo, uma proteína da família 61, uma preparação de proteínamulticomponente, por exemplo, várias proteínas da família 61 ou umacombinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

As proteínas de intensificação celulolítica podem intensificar a atividade deproteínas celulolíticas, na faixa de pH ácido, neutro ou alcalino.

Alternativamente, uma célula hospedeira pode ser usada como uma fonte deum tal polipeptídeo em um processo de fermentação com a biomassa. Acélula hospedeira também podem conter genes naturais ou heterólogos quecodificam a proteína celulolítica assim como outra enzima útil noprocessamento de biomassa.

A biomassa pode incluir, mas não limitar a, recursos demadeira, resíduo sólido municipal, papel residual, lavoura e resíduos delavoura (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook onBioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp, 105-118, Tailor & Francis,Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd,1990, Applied Biochemistry e Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al.,1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor,Volume 65, pp,23-40, Springer-Verlag, New York).

O polissacarídeo predominante na parede celular primária debiomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemi-celulose e o terceiro épectina. A parede celular secundária, produzida após as células tereminterrompido o desenvolvimento, também contém polissacarídeos e éfortalecida por lignina polimérica covalentemente reticulada à hemi-celulose.A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e deste modo um beta-(l-4)-D-glucano linear, enquanto hemi-celuloses incluem uma variedade decompostos, tais como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos e mananos nasestruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Emborano geral polimorfos, a celulose é observada no tecido vegetal principalmentecomo uma matriz cristalina insolúvel de cadeia de glucano paralelos. Ashemi-celuloses usualmente liga-se hidrogênio a celulose, assim como osoutros hemi-celuloses, ajudam a estabilizar a matriz da parede celular.

Polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica epolinucleotídeos destes

Em um primeiro aspecto, o polipeptídeo isolado tendoatividade realçadora celulolítica, compreende o seguinte motivo:

[ILMV] -P-x(4,5 )-G-x-Y- [ILMV] -x-R-x- [EQ] -x(3 )-A- [HNQ],em que χ é qualquer aminoácido x(4,5) é qualquer aminoácido em 4 ou 5posições contíguas e x(3) é qualquer aminoácido em 3 posições contíguas. Nomotivo acima, a abreviação de letra única da IUPAC aceita é utilizada.

Em um segundo aspecto, o polipeptídeo isolado tendoatividade realçadora celulolítica teve uma seqüência de aminoácido que temum grau de identidade para o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 (isto é, opolipeptídeo maduro) de pelo menos 75 %, preferivelmente pelo menos 80 %,mais preferivelmente pelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelomenos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda maispreferivelmente pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %, que teve atividaderealçadora celulolítica (em seguida "polipeptídeos homólogos "). Em umaspecto preferido, os polipeptídeos homólogos tiveram uma seqüência deaminoácido que diferem-se por dez aminoácidos, preferivelmente por cincoaminoácidos, mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda maispreferivelmente por três aminoácidos, mais preferivelmente por doisaminoácidos e ainda mais preferivelmente por um aminoácido dopolipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2.

Um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica dapresente invenção preferivelmente compreende a seqüência de aminoácido daSEQ ID N°: 2 ou um variante alélica deste; ou um fragmento deste que tematividade realçadora celulolítica. Em um aspecto preferido, um polipeptídeocompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro daSEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreendeaminoácidos 20 a 249 da SEQ ID N°: 2 ou um variante alélica deste; ou umfragmento deste que tem atividade intensificadora celulolítica. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 20 a 249 daSEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste daseqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou uma variante alélica deste; ouum fragmento deste que tem atividade realçadora celulolítica. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido daSEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dopolipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste do aminoácidos 20 a 249 da SEQ ID N°: 2 ou umavariante alélica deste; ou um fragmento deste que tem atividade realçadoracelulolítica. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste deaminoácidos 20 a 249 da SEQ ID N°: 2. Em um terceiro aspecto, a presenteinvenção diz respeito a polipeptídeo isolado tendo atividade realçadoracelulolítica que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam sobcondições de estringência pelo menos muito baixas, preferivelmentecondições de estringência pelo menos baixas, mais preferivelmente condiçõesde estringência pelo menos média, mais preferivelmente condições deestringência pelo menos média-alta, ainda mais preferivelmente condições deestringência pelo menos alta e mais preferivelmente condições de estringênciapelo menos muito alta com (i) a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreendea seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1, (iii) umasubseqüência de (i) ou (ii) ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou(iii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, UMLaboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, New York). Umasubseqüência da seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ IDN°: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmente pelomenos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência pode codificarum fragmento de polipeptídeo que tem atividade realçadora celulolítica. Emum aspecto preferido, a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro énucleotídeos 77 a 766 da SEQ ID N°: 1.

A seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1 ou umasubseqüência deste; assim como a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2ou um fragmento deste, pode ser usado para projetar uma sonda de ácidonucleico para identificar e clonar o DNA que codifica os polipeptídeos tendoatividade realçadora celulolítica a partir de cepas de gêneros ou espéciesdiferentes de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular,tais sondas podem ser usadas para hibridização com o genômico ou cDNA degêneros ou espécies de interesse, seguindo os procedimentos de Southernpadrão, de módo a identificar e isolar o gente correspondente destes. Taissondas podem ser consideravelmente mais curtas do que seqüências inteiras,mas devem ser pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, maispreferivelmente pelo menos 35 e mais preferivelmente pelo menos 70nucleotídeos em comprimento. E, entretanto, preferido que a sonda de ácidonucleico seja de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo,a sonda de ácido nucleico pode ser pelo menos 200 nucleotídeos,preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelomenos 400 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelo menos 500nucleotídeos em comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas,por exemplo, sondas de ácido nucleico que são pelo menos 600 nucleotídeos,pelo menos preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 800 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelomenos 900 nucleotídeos em comprimento. Ambas sondas de DNA e RNApodem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o genecorrespondente (por exemplo, com Ρ, H, S, biotina ou avidina). Taissondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA ou cDNA genômica preparada de taisoutros organismos podem, portanto, ser avaliadas por DNA que hibridiza comas sondas descritas acima e que codificam um polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica. O DNA genômico ou outros de tais outros organismospodem ser separados por agarose ou eletroforese em gel de poliacrilamida ououtras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separadopode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material decarregador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogocom a SEQ ID N°: 1 ou uma subseqüência deste, o material de carregador épreferivelmente usado em um Southern blot.

Para o propósito da presente invenção, a hibridização indicaque a seqüência de nucleotídeo hibridiza uma sonda de ácido nucleicorotulado correspondente à seqüência codificadora do polipeptídeo maduro daSEQ ID N°: 1, a seqüência de DNA genômico que compreende a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ED N°: 1, o filamentocomplementar ou uma subseqüência deste, sob condições de estringênciasmuito altas ou muito baixas. As moléculas que a sonda de ácido nucleicohibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo,película de raio X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é nucleotídeos 73 a 1259da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico éum seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID N°: 2ou uma subseqüência deste. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é a seqüência de polinucleotídeo contido em plasmídio pTr3337 queé contido em Escherichia coli NRRL B- 30878, em que a seqüência depolinucleotídeo deste codifica um polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é opolipeptídeo maduro que codifica a região contida em plasmídio pTr3337 queé contido em Escherichia coli NRRL B-30878.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos emcomprimento, condições de estringência muito altas ou muito baixas sãodefinidas como pré-hibridização e hibridização a 42° C em 5X SSPE, 0,3 %SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cortado ou desnaturado e 25% de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35 % deformamida para estringências médias e médias altas ou 50 % de formamidapara estringências altas e muito altas, seguindo procedimentos de Southernblotting padrão para 12 a 24 horas otimamente.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos emcomprimento, o material de carregador é finalmente lavado três vezes cadapor 15 minutos usando 2X SSC, 0,2 % SDS preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50° C(estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55° C (estringênciamédia), mais preferivelmente pelo menos a 60° C (estringência média-alta),ainda mais preferivelmente pelo menos a 65° C (estringência alta) e maispreferivelmente pelo menos a 70° C (estringência muito alta).

Para sondas curtas que são cerca de 15 nucleotídeos a cerca de70 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência são definidascomo pré-hibridização, hibridização e lavagem pós-hibridização a cerca de 5oC a cerca de 10° C abaixo do Tm calculado usando a calculação de acordocom Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the Nation Academy ofSciences USA 48:1390) em 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mMEDTA, 0,5 % NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio,1 mM de fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM ATP e 0,2 mg de RNA delevedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blotting padrão por12 a 24 horas otimamente.

Para sondas curtas que são cerca de 15 nucleotídeos a cerca de70 nucleotídeos em comprimento, o material de carregador é lavado uma vezem 6X SCC plus 0,1 % SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutosusando 6X SSC de 5o C a 10° C abaixo do Tm calculado.

Em um quarto aspecto, os polipeptídeos tendo atividaderealçadora celulolítica podem ser variantes artificiais que compreendem umasubstituição, deleção, e/ou inserção conservativas de um ou mais aminoácidosdo polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 ou uma seqüência homóloga deste;ou o polipeptídeo maduro deste. Preferivelmente, as mudanças de aminoácidosão de uma natureza menor, que são substituições de aminoácido ou inserçõesconservativas que não significantemente afetam a dobra e/ou atividade daproteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos;extensões terminais de amino ou carboxil pequenas, tais como um resíduometionina de terminal amino; um peptídeo ligador pequeno de cerca de 20 aresíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação mudando-sea carga da rede ou um outro função, tal como um trato de poli-histidina, um10 epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas são dentro do grupode aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos(ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina easparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina),aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidospequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições deaminoácidos que no geral não alteram atividades específicas são conhecidosna técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In,The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças que ocorrem maiscomumentes são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle,Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além disso os aminoácidos padrão 20, e aminoácidos nãopadrão (tal como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, 2-aminoisobutírico, ácidoisovalina e alfa-metil serina) pode ser substituído por resíduos de aminoácidosde um polipeptídeo de tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidosnão-conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genéticoe aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos deaminoácido. "Aminoácidos não naturais" foram modificados após as síntesesde proteínas, e/ou tiveram uma estrutura química em suas cadeias secundáriasdiferentes do que dos aminoácidos padrão. Os aminoácidos não naturaispodem ser quimicamente sintetizados e preferivelmente, são comercialmentedisponíveis e incluem pipecólico, ácido tiazolidino carboxílico, ácidodesidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de uma talnatureza que as propriedades física-química dos polipeptídeos são alteradas.Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidadetérmica do polipeptídeo, a mudança de pH ótima e outros.

Aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor pode seridentificado de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, tal comomutagênese direcionado ao local ou mutagênese de varredura de alanina(Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica posterior,mutações alanina simples são introduzidos em cada resíduo na molécula e asmoléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica (isto é,atividade realçadora celulolítica) para identificar resíduos de aminoácido quesão críticos à atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol.Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológicatambém pode ser determinada por análises físicas de estrutura, comodeterminado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear,cristalografia, difração de elétron ou rotulação por fotoafinidade, emconjunção com a mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver,por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J.MoI. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Asidentidades de aminoácidos essenciais também podem ser inferidos a partir deanálises de identidades com polipeptídeos que são relacionados a umpolipeptídeo de acordo com a invenção.

Substituições de aminoácidos simples ou múltiplas podem serfabricadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese,recombinação, e/ou mistura, seguido por um procedimento de avaliaçãorelevante, tal como aquele divulgado por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988,Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem serusados incluem PCR propenso a erro, apresentação de fago (por exemplo,Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patent U.S. N0. 5.223.409;WO 92/06204) e mutagênese direcionada para a região (Derbyshire et al.,1986, Gene 46: 145; tier et al., 1988, DNA 7: 127).

Os Métodos de mutagênese/mistura podem ser combinadoscom produtividade alta, métodos de avaliação automatizado para detectar aatividade dos polipeptídeos mutageneizados clonados expressados pela célulahospedeira (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculasde DNA mutageneizadas que codificam os polipeptídeos ativos podem serrecuperadas a partir de células hospedeiras e rapidamente seqüenciadasusando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinaçãorápida da importância de resíduos individuais de aminoácidos em umpolipeptídeo de interesse e podem ser aplicados aos polipeptídeos de estruturanão conhecida. O número total de substituições de aminoácidos, deleções e/ouinserções do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 é 10, preferivelmente 9,mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente namaioria 6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda maispreferivelmente 3, mais preferivelmente 2 e ainda mais preferivelmente 1.

Um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica dapresente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquergênero. Para o propósito da presente invenção, o termo "obtido a partir de"como aqui usado em conexão com uma fonte dada deve significar que opolipeptídeo codificado por uma seqüência de nucleotídeo é produzido pelafonte ou por uma cepa em que a seqüência de nucleotídeo a partir da fonte foiinserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido a partir de uma fontedada é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser umpolipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser umpolipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus,Streptococcus, Streptomyces, Staphilococcus, Enterococcus, Lactobacillus,Lactococcus, Clostridium, Geobacillus ou Oceanobacillus tendo atividaderealçadora celulolítica ou um polipeptídeo bacteriano gram negativo tal comoum polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campilobacter,Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, llyobacter, Neisseria ouUréiaplasma tendo atividade realçadora celulolítica.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deBacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacilluscirculans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacilluslautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacilluspumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillusthuringiensis tendo atividade realçadora celulolítica.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes,Streptococcus uberis ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendoatividade realçadora celulolítica.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis,Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus ou Streptomyces lividanstendo atividade realçadora celulolítica. O polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica também podem ser um polipeptídeo fungico e maispreferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo deCandida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ouYarrowia tendo atividade realçadora celulolítica; ou mais preferivelmente umpolipeptídeo fungico filamentoso tal como um polipeptídeo de Acremonium,Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium,Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix,Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophillum,Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium ou Trichoderma tendoatividade realçadora celulolítica.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deSaccharomyces carlsbergensis, Saccharomyees cerevisiae, Saccharomyeesdiastaticus, Saccharomyees douglasii, Saccharomyees kluyveri,Saccharomyees norbensis ou Saccharomyees oviformis tendo atividaderealçadora celulolítica.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Coprinus cinereus, Diplodiagossyppina, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusariumcrookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusariumgraminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum,Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcoehroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusariumtorulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicolainsolens, Humicola lanuginosa, Magnaporthe grisea, Mucor miehei,Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum,Phanerochaete chrysosporium, Pseudoplectania nigrella, Thermoascusaurantiacus, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichodermakoningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichodermaviride ou Trichophaea saccata tendo atividade realçadora celulolítica.

Em um mais aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Trichoderma reesei.

Em mais um aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Trichoderma reesei RutC30 (ATCC56765), por exemplo, opolipeptídeo com a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou fragmentosdeste, por exemplo, o polipeptídeo maduro.

Será entedido que para as espécies anteriormente mencionadasa invenção abrange tanto os estados perfeitos quanto os imperfeitos e outrosequivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem considerar o nomedas espécies pelos quais são conhecidas. Aqueles habilitados na técnicafacilmente reconhecerão a identidade dos equivalentes apropriados. As Cepasdestas espécies são facilmente acessíveis ao público em uma variedade decoleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC),Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM),Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural ResearchService Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center(NRRL). Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados e obtidos apartir de outras fontes incluindo microorganismos isolados de natureza (porexemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas mencionadas acima.As técnicas para isolamento de microorganismos de habitat natural são bemconhecidos na técnica. O polinucleotídeo pode ser obtido por avaliaçãosimilar de uma biblioteca genômica ou cDNA de um tal microorganismo.Uma vez que uma de seqüência de polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo foi detectado com as sondas, o polinucleotídeo pode ser isoladoou clonado por técnicas de utilização que são bem conhecidos por aquelapessoa com habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al.,1989, supra).

Os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolíticatambém incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveisem que um outro polipeptídeo é fundido no polipeptídeo de terminal N outerminal C ou fragmento deste tendo atividade realçadora celulolítica. Umpolipeptídeo fundido é produzido por fundir uma seqüência de nucleotídeo(ou uma porção deste) que codifica um outro polipeptídeo a uma seqüência denucleotídeo (ou uma porção deste) que codifica um polipeptídeo h tendoatividade realçadora celulolítica. As técnicas para produzir os polipeptídeosde fusão são conhecidos na técnica e incluem ligação das seqüênciascodificadoras que codificam os polipeptídeos de modo que estes estejam naestrutura e cuja a expressão do polipeptídeo fundido está sob controle domesmo promotor e terminador.

Os polinucleotídeos tendo seqüências de nucleotídeo quecodificam os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica podem serisolados e utilizados para praticar os métodos da presente invenção, comodescrito aqui.

Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo éapresentado na SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto mais preferido, aseqüência de nucleotídeo é a seqüência contida em plasmídio pTr3337 que écontido em E. coli NRRL B-30878. Em um outro aspecto preferido, aseqüência de nucleotídeo é o polipeptídeo maduro que codifica a região daSEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo énucleotídeos 77 a 766 da SEQ ID N°: 1. Em um outro aspecto mais preferido,a seqüência de nucleotídeo é o polipeptídeo maduro que codifica a regiãocontida em plasmídio pTr3337 que é contido em E. coli NRRL B-30878. Apresente invenção também abrange seqüências de nucleotídeo que codificamum polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 ou opolipeptídeo maduro deste, que diferem-se da SEQ ID N°: 1 ou a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro deste por virtude da degeneração docódigo genético. A presente invenção também diz respeito as subseqüênciasda SEQ ID N°: 1 que codifica os fragmentos da SEQ ID N°: 2 que tiveramatividade realçadora celulolítica.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosmutantes que compreendem pelo menos uma mutação na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1, em que a seqüência denucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQID N°: 2. Em umaspecto preferido, o polipeptídeo maduro é aminoácidos 20 a 249 da SEQ ID N°: 2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeoque codifica um polipeptídeo são conhecidos na técnica e incluem isolação deuma preparação de DNA genômico a partir de cDNA ou uma combinaçãodeste. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de um tal DNA genômicopode ser realizada, por exemplo, usando-se a reação de cadeia de polímero(PCR) bem conhecida ou avaliação de anticorpo de bibliotecas de expressãopara detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturaiscortadas. Ver, por exemplo, lnnis et al., 1990, PCR: UM Guide to Metods eApplication, Academic Press, New York. Outros procedimentos deamplicação do ácido nucleico tal como reação de cadeia de ligase (LCR),transcrição ativada ligada (LAT) e seqüência de amplificação baseada emnucleotídeo (NASBA) pode ser usada, os polinucleotídeos podem serclonados a partir de uma cepa de Trichoderma ou um outro ou organismorelacionado e deste modo, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou deespécie do polipeptídeo que codifica a região da seqüência de nucleotídeo.

Nos métodos da presente invenção, os polinucleotídeos tendo seqüências denucleotídeo que tiveram um grau de identidade para a seqüência codificadorado polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1 (isto é, nucleotídeos 388 a 1332) depelo menos 75 %, preferivelmente pelo menos 80 %, mais preferivelmentepelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %, maispreferivelmente pelo menos 95 % e ainda mais preferivelmente pelo menos96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade, que codifica um polipeptídeo ativo.

A modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica pode ser necessáriapara a síntese de polipeptídeos substancialmente similar ao polipeptídeo. Otermo "substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se as formas deocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir emalguma maneira projetada a partir do polipeptídeo isolado da sua fontenatural, por exemplo, variantes artificiais que diferem-se em atividadeespecífica, termoestabilidade, pH ótimo ou coisa parecida. A seqüênciavariante pode ser construída na base da seqüência de nucleotídeo apresentadacomo o polipeptídeo que codifica a região da SEQ ID N°: 1, por exemplo,uma subseqüência deste, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeoque não produzem uma outra seqüência de aminoácido do polipeptídeocodificado pela seqüência de nucleotídeo, mas que correspondem ao uso decódon do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima ou porintrodução de substituições de nucleotídeo que podem produzir umaseqüência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituiçãode nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression ePurification 2: 95-107.

Será evidente à aqueles habilitados na técnica que taissubstituições pode ser feitas fora das regiões críticas à função da molécula eainda resultando em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácidoessenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeoisolado da invenção e portanto preferivelmente não submetido a substituição,pode ser identificado de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica,tal como mutagênese direcionado ao local ou mutagênese de varredura dealanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica posterior, as mutações são introduzidas em cada resíduocarregado possivelmente na molécula e as moléculas mutantes resultantes sãotestadas para atividade realçadora celulolítica para identificar resíduos deaminoácido que são críticos à atividade da molécula. Locais de interaçãoenzima-substrato também podem ser determinados pela análise de estruturastri-dimensionais como determinado por tais técnicas como análise deressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação por fotoafinidade(ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al.,1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992,FEBS Letters 309: 59-64).

O polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo que codificaum polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica que hibridiza sobmuitas condições de estringência pelo menos baixas, preferivelmentecondições de estringência pelo menos baixas, mais preferivelmente condiçõesde estringência pelo menos média, mais preferivelmente condições deestringência pelo menos média-alta, ainda mais preferivelmente condições deestringência pelo menos alta e mais preferivelmente condições de estringênciapelo menos muito alta com (i) a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID N°: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreendea seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 1 ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii); ou variante alélica e subseqüênciasdeste (Sambrook et al., 1989, supra), como definidas aqui. Em um aspectopreferido, a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro é nucleotídeos 77a 766 da SEQIDN0: 1.

Construção de ácido nucleicos

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeotendo atividade realçadora celulolítica pode ser manipulado em umavariedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptídeo pelaconstrução de uma construção de ácido nucleico que compreende umpolinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica operacionalmente ligado a um ou mais seqüências decontrole que direciona a expressão da seqüência codificadora em uma célulahospedeira adequada sob condições compatíveis com as seqüências decontrole. A manipulação da seqüência de polinucleotídeo antes da suainserção em um vetor pode ser desejável ou necessário dependendo do vetorde expressão. As técnicas para modificar as polisequências de nucleotídeoutilizando métodos de DNA recombinantes são bem conhecidos na técnica.

A seqüência de controle pode ser uma seqüência de promotorapropriado, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecido por uma célulahospedeira para expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica. A seqüência de promotorcontém seqüências de controle transcripcional que media a expressão dopolipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo quemostram atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha incluindopromotores mutantes, truncados, híbridos e podem ser obtidos a partir degenes que codificam polipeptídeos extracelular ou intracelular homólogos ouheterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição da construção de ácido nucleico, especialmente em uma célulahospedeira bacteriana, são os promotores obtido a partir de óperon de E. colilac, gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), gene de levansucraseBacillus subtilis (sacB), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amil),gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene dealfa-amilase de Bacillus amiloliquefaciens (amyQ), gene da penicilinase deBacillus licheniformis (penP), genes de xilA e xilB de Bacillus subtilis e genede beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et ai, 1978, Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75: 3727-3731 ), assim como o promotortac (DeBoer et al, 1983, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em " Useful proteinsfrom recombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e emSambrook et al, 1989, supra.

Exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição da construção de ácido nucleico em uma célula hospedeira fungicafilamentosa são promotores obtidos a partir dos genes por Aspergillus oryzaeTAKA amilase, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilaseneutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável ácida de Aspergillus nigeramilase, glicoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA),lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, fosfatoisomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans,Fusarium venenatum amiloglicosidase (WO 00/56900), Fusarium venenatumDaria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), proteasesemelhante à tripsina de Fusarium oxisporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei,celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichodermareesei, endoglicanase II de Trichoderma reesei, endoglicanase III deTrichoderma reesei, endoglicanase IV de Trichoderma reesei, endoglicanaseV de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II deTrichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, assim como opromotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores de genes para a alfa-amilaseneutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae);e promotores mutantes, truncados, híbridos deste.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis sãoobtidos de genes por Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1),Saccharomyces cerevisiae galactokinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiaeálcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase(ADH1,ADH2/FISSURA), Saccharomyces cerevisiae triose fosfato isomerase(TPI), Saccharomyces cerevisiae metalotioneina (CUPl) e Saccharomycescerevisiae 3-fosfoglicerato quinase. Outros promotores utéis para célulashospedeiras de levedura são descritas por Romanos et al, 1992, Yeast 8: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser um terminadoradequado de seqüência de transcrição, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência de terminador éoperacionalmente ligada à terminal 3' de seqüência de nucleotídeo quecodifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célulahospedeira de escolha pode ser usadas na presente invenção.

Os terminadores preferidos por células hospedeiras fungicasfilamentosas são obtidos de genes por Aspergillus oryzae TAKA amilase,Aspergillus niger glucoamilase, Aspergillus nidulans antranilato sintase,Aspergillus niger alfa-glicosidase e Fusarium oxisporum protease semelhanteà tripsina.

Os terminadores preferidos por células hospedeiras delevedura são obtidos de genes por Saccharomyces cerevisiae enolase,Saccharomyces cerevisiae citocromo C (CYCl) e Saccharomyces cerevisiaegliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Outros terminadores utéis por célulashospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante paratradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é operacionalmente ligadaè terminal 5' da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo.Qualquer seqüência líder que é funcional na célula hospedeira de escolhapode ser usada na presente invenção. Os líderes preferidos por célulashospedeiras fungicas filamentosas são obtidos de genes por Aspergillusoryzae TAKA amilase e Aspergillus nidulans triose fosfato isomerase.

Os líderes adequados por células hospedeiras de levedura sãoobtidos de genes por Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1),Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato quinase, fator alfa deSaccharomyces cerevisiae e Saccharomyces cerevisiae álcooldesidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/FISSURA).

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência operacionalmente ligado à terminal 3' daseqüência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célulahospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina pormRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional nacélula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas por célulashospedeiras fungicas filamentosas são obtidas de genes por Aspergillusoryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glucoamilase, Aspergillus nidulansantranilato sintase, Fusarium oxisporum protease semelhante à tripsina eAspergillus niger alfa-glicosidase.

As seqüências de poliadenilação utéis por células hospedeirasde levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular CellularBiology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidoligado ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona ao polipeptídeocodificado no caminho de secreção celular. A extremidade de 5' da seqüênciacodificadora da seqüência de nucleotídeo pode inerentemente conter umregião codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligado na estrutura deleitura de tradução com o segmento da região codificadora que codifica opolipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade de 5' da seqüênciacodificadora pode conter um região codificadora de peptídeo de sinal que éestranho à seqüência codificadora. A região codificadora de peptídeo de sinalestranho pode ser requerido onde a seqüência codificadora não naturalmentecontém uma região codificadora de peptídeo de sinal. Alternativamente, aregião codificadora de peptídeo de sinal estranho pode substituirsimplesmente a região codificadora de peptídeo de sinal natural de modo aintensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer regiãocodificadora de peptídeo de sinal que direciona ao polipeptídeo expressado nocaminho de secreção de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretadoem um meio de cultura, pode ser usado na presente invenção.As regiões codificadoras de peptídeo de sinais efetivos porcélulas hospedeiras bacterianas são a região codificadora de peptídeo de sinaisobtidos de genes por amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, Bacillusstearothermophilus alfa-amilase, Bacillus licheniformis subtilisin, Bacilluslicheniformis beta-lactamase, Bacillus stearothermophilus neutro proteases(nprT, nprS, nprM) e Bacillus subtilis prsA. Os peptídeos de sinais adicionaissão descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões codificadoras de peptídeo de sinais efetivos porcélulas hospedeiras fungicas filamentosas são as regiões codificadoras depeptídeo de sinais obtidos de genes por Aspergillus oryzae TAKA amilase,Aspergillus niger neutro amilase, Aspergillus niger glucoamilase,Rhizomucor miehei aspártico proteinase, Humicola insolens celulase,Humicola insolens endoglicanase V e Humicola lanuginosa lipase.

Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal compreende ouconsiste de aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID N°: 2. Em um outro aspectopreferido, a região codificadora de peptídeo de sinal compreende ou consistede nucleotídeos 20 a 76 da SEQ ID N°: 1.

Os peptídeos de sinais utéis por células hospedeiras delevedura são obtidos de genes por fator alfa de Saccharomyces cerevisiae eSaccharomyces cerevisiae invertase. Outras regiões codificadoras de peptídeode sinais utéis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de propeptídeo que codifica uma seqüência de aminoácidoposicionado no amino terminal de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou uma zimogene emalguns casos). Um propolipeptídeo é no geral inativo e pode ser convertido aum polipeptídeo ativo maduro por clivagem catalítica ou autocatalítica dopropeptídeo do propolipeptídeo. A região codificadora de propeptídeo podeser obtido de genes por protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteaseneutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfa de Saccharomyces cerevisiae,proteinase aspártiea de Rhizomucor miehei aspártico proteinase eMyceliophthora thermophila laease (WO 95/33836).

Onde tanto peptídeo de sinal quanto regiões de propeptídeosestão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a região depropeptídeo é posicionada próxima ao terminal amino de um polipeptídeo e aregião de peptídeo de sinal é posicionada próxima ao terminal amino daregião de propeptídeo.

Também pode ser desejável por adicionar seqüênciasreguladoras que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo emrelação ao desenvolvimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemasreguladores são aqueles que causam a expressão do gene a ser ligada oudesligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presençade um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemasprocarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, osistema ADH2 ou sistema GALl podem ser usados. Em fungos filamentosos,o promotor de TAKA alfa-amilase, promotor de glicoamilase de Aspergillusniger e promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usadoscomo seqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüências reguladoras sãoaquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estesincluem o gene de reductase de diidrofolato que é amplificado na presença demetotrexato e o gene de metalotioneina que são amplificados com metaispesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeoseria operacionalmente ligada com a seqüência reguladora.

Vetores de expressão

Os vários ácidos nucleicos e seqüências de controle descritasaqui podem ser unidos entre si para produzir um vetor de expressãorecombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica, um promotor e sinais deinterrupção transcripcional ou de tradução. Os vetores de expressão podemincluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserçãoou substituição da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo emtais locais. Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica pode ser expressado pelainserção da seqüência de nucleotídeo ou uma construção de ácido nucleicoque compreende a seqüência em um vetor apropriado para a expressão. Aprodução do vetor de expressão, a seqüência codificadora é localizada novetor de modo que a seqüência codificadora é operacionalmente ligada comas seqüências apropriadas de controle para a expressão. O vetor de expressãorecombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídio ou vírus)que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNArecombinante e pode levar quase a expressão da seqüência de nucleotídeo. Aescolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com acélula hospedeira em que o vetor será introduzido. Os vetores podem serplasmídios circulares lineares ou fechados. O vetor pode ser um vetor dereplicação autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidadeextracromossômica, a replicação que é independente da replicaçãocromossômica, por exemplo, um plasmídio, um elemento extracromossômico,um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conterqualquer significado para garantir sua auto-replicação. Alternativamente, ovetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integradono genoma e replicado entre si com os cromossomos em que foramintegrados. Além disso, um vetor simples ou plasmídio ou dois ou maisvetores ou plasmídios que entre si contém o DNA total a ser introduzido nogenoma da célula hospedeira ou um transposon pode ser usado.

Os vetores preferivelmente contém um ou mais marcadoresselecionáveis que permitem a seleção fácil de células transformadas,transferidas, submetidas a transdução ou coisa parecida. Um marcadorselecionável é um produto de gene que fornece a resistência biocida ou viral,resistência a metais pesados, prototrofia à auxotrofia e outros.

Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são osgenes dal a partir de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadoresque conferem resistência a antibiótico tal como resistência a ampicilina,canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores adequados porcélulas hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3,TRPl e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célulahospedeira fungica filamentosa incluem, mas não limitam-se a, amdS(acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricinaacetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase),pirG (orotidino-5'-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) etrpC (antranilato sintase), assim como equivalentes destes. O preferido para ouso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pirG de Aspergillusnidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores preferivelmente contém um elemento que permite aintegração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônomado vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetorpode confiar na seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ouqualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma porrecombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração porrecombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma locaçãoprecisa no cromossomo. Para aumentar a probabilidade da integração em umalocação precisa, os elementos integracionais devem preferivelmente conterum número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares debase, preferivelmente 400 a 10.000 pares de base e mais preferivelmente 800a 10.000 pares de base, que tem um alto grau de identidade com a seqüênciaalvo correspondente para intensificar a probabilidade da recombinaçãohomóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer seqüência queseja homóloga com a seqüência alvo no genoma da célula hospedeira. Alémdisso, os elementos integracionais podem ser que não codificam ou quecodificam as seqüências de nucleotídeo. Por outro lado, o vetor pode serintegrado no genoma da célula hospedeira pela recombinação não homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor ainda pode compreenderuma origem da replicação que permite ao vetor replicar-se autonomamente nacélula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquerreplicador de plasmídio mediando a replicação autônoma com funções nascélulas. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídio" édefinido neste como uma seqüência de nucleotídeo que permite um plasmídioou vetor para replicar in vivo.

Exemplos de origens bacterianas de replicação são as origensde replicação dos plasmídios pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184permitindo a replicação em in E. coli e pUBl 10, pE194, pTA1060 e ρΑΜβΙpermitindo a replicação em Bacillus.

Exemplos de origens de replicação para o uso em uma célulahospedeira de levedura são a origem de 2 mícron da replicação, ARS1, ARS4,a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

Exemplos de origens da replicação utéis nas células fungicasfilamentosas são AMAI e ANSl (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullenet al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Aisolamento do gene AMAI e construção de plasmídios ou vetores quecompreende o gene pode ser realizado de acordo com os métodos divulgadosem WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica pode ser inserida na célulahospedeira para aumentar a produção do polipeptídeo. Um aumento nonúmero de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido pela integração de pelomenos uma cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira oupela inclusão de um gene de marcador selecionável amplificável com opolinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene demarcador selecionável e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo,pode ser selecionado pelo cultivo das células na presença do agenteselecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosacima para construir os vetores de expressão recombinantes são bemconhecidos para uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo,Sambrook et al., 1989, supra).Células hospedeiras

As células hospedeiras recombinantes, que compreendem umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica, podem ser vantajosamente usadas na produção recombinante dopolipeptídeo. Um vetor que compreende uma tal polinucleotídeo é introduzidaem uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido como um integrantecromossômico ou como um vetor extracromossômico auto-replicante comodescrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" abrange qualquerprogênie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursoradevido as mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de umacélula hospedeira dependerá, de grande parte do gene que codifica opolipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular,por exemplo, um procariótico ou um microorganismo não unicelular, porexemplo, um eucariótico.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer bactériagram positiva ou uma Bactéria gram negativa. A bactéria gram positiva inclui,mas não limita-se a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphilococcus,Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus eOceanobacillus. A Bactéria gram negativa inclui, mas não limita-se a, E. coli,Pseudomonas, Salmonella, Campilobacter, Helicobacter, Flavobacterium,Fusobacterium, llyobacter, Neisseria e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer células deBacillus. As células de Bacillus utéis na prática da presente invenção incluem,mas não limitam-se a células de Bacillus alkalophilus, Bacillusamiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii,Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacilluslicheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillusstearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis,Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um mais um aspectopreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillusamiloliquefaciens. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus clausii. Em um outro aspecto maispreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacilluslicheniformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus subtilis. A célula hospedeira bacterianatambém pode ser qualquer célula de Streptococcus. As células deStreptococcus utéis na prática da presente invenção incluem, mas nãolimitam-se a, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes,Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Streptococcus equisimilis. Em um outro aspecto preferido, a célulahospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus pyogenes. Em um outroaspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula deStreptococcus uberis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também podem ser qualquercélula de Streptomyces. As células de Streptomyces utéis na prática dapresente invenção incluem, mas não limitam-se a, Streptomycesachromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor,Streptomyces griseus e Streptomyces lividans.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Streptomyces achromogenes. Em um outro aspecto preferido, acélula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces avermitilis. Emum outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula deStreptomyces coelicolor. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em um outro aspectopreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyceslividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, porexemplo, ser realizada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo,Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando-secélulas competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journal ofBacteriology 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal ofMolecular Biology 56: 209-221 ), por eletroporação (ver, por exemplo,Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ou por conjugação(ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169:5271-5278). A introdução de DNA na célula de E coli pode, por exemplo, serrealizada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan,1983, J. MoI. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Doweret al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA nacélula Streptomyces pode, por exemplo, ser realizada pela transformação deprotoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, FoliaMicrobiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodieret al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) ou por transdução (ver, porexemplo, Burke et al., 2001, Proc. NaTl. Acad. Sei. USA 98:6289-6294). Aintrodução de DNA na célula de Pseudomonas pode, por exemplo, serrealizada pela eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol.Metods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets,2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA na célulade Streptococcus pode, por exemplo, ser realizada pela competência natural(ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297),pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991,Microbios. 68: 189-2070, por eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al.,1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, porexemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquermétodo conhecido para a introdução de DNA na célula hospedeira pode serusado.

A célula hospedeira também podem ser uma eucariótica, talcomo uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungica.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célulafungica. O "Fungo" como aqui usado inclui o filo Ascomycota,Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definidos porHawksworth et al., In, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8aedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assimcomo o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página171 ) e todo o fungo mitospórico (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um mais aspecto preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula de levedura. A "levedura" como aqui usada inclui leveduraascosporogenous (Endomycetales), levedura basidiosporogenous e leveduraque pertence ao Fungi lmperfecti (Blastomycetes). Visto que a classificaçãoda levedura pode mudar no futuro, para o propósito desta invenção, a leveduradeve ser definida como descrita em Biology e Activities of Yeast (Skinner,F.A., Passmore, S.M. e Davenport, R.R., eds, Soe. App. Bacteriol.Symposium Series N°. 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia,Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de leveduraé uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyceskluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em umoutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula deKluyveromyces lactis. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica é uma célula fungica filamentosa. 0 "Fungo filamentoso" inclui todasas formas filamentosas da subdivisão de Eumycota e Oomycota (comodefinidos por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são nogeral caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose,glucano, quitosano, manano e outros polissacarídeos complexos. Odesenvolvimento vegetativo é por alongamento de hyphal e catabolismo docarbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o desenvolvimentovegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae ocorre peloenxerto de um talo unicelular e catabolismo do carbono pode serfermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus,Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor,Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium,Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophillum, Talaromyces,Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungicafilamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ouFusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta,Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa,Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus,Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei,Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum,Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielaviaterrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum,Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei ouTrichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processoenvolvendo formação de protoplasto, a transformação de protoplastos eregeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Osprocedimentos adequados para transformação de células hospedeirasAspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et al, 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Osmétodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritospor Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedurapode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker eGuarente, In Abelson, J.N. e Simon, Μ. I., editors, Guide to Yeast Genetics eMolecular Biology, Metods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187,Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75: 1920.Métodos de Produção

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica, quecompreende (a) cultivação de uma célula, que nesta forma tipo selvagem écapaz de produzir o polipeptídeo, sob condições condutoras para produção dopolipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo. Preferivelmente, a célula é dogênero Trichoderma, mais preferivelmente Trichoderma reesei e maispreferivelmente Trichoderma reesei RutC30.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica, quecompreende (a) cultivação uma célula hospedeira recombinante sob condiçõescondutoras para produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica, quecompreende (a) cultivação de uma célula hospedeira sob condiçõescondutoras para produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeiracompreende uma seqüência de nucleotídeo mutante tendo pelo menos umamutação no polipeptídeo maduro que codifica a região da SEQ ID N°: 1, emque a seqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consistedo polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 e (b) recuperação do polipeptídeo.Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro da SEQ ID N°: 2 éaminoácidos 20 a 249 da SEQ ID N°: 2.

No método de produção, as células são cultivadas em umnutriente médio adequado para produção do polipeptídeo usando métodosbem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada porcultivo em frasco de agitação e fermentação em pequena escala e em grandeescala (incluindo fermentações contínua, batelada, batelada de alimentação ouestado) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizados em um meioadequado e sob condições permitindo o polipeptídeo a ser expressado e/ouisolado. O cultivo acontece em um nutriente médio adequado que compreendefontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentosconhecidos na técnica. As médias adequadas são disponíveis a partir defornecedores comerciais ou podem ser preparadas de acordo com ascomposições publicadas (por exemplo, no catálogo da American Type CultureCollection). Se o polipeptídeo é secretado no nutriente médio, o polipeptídeopode ser recuperadas diretamente do meio. Se o polipeptídeo não é secretadono meio, pode ser recuperado a partir dos lisados de células.

Os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica sãodetectados usando métodos descritos aqui.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodosconhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado apartir do nutriente médio por procedimentos convencionais incluindo, masnão limitando-se a, centrifiigação, filtração, extração, secagem porpulverização, evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos podem ser purificados por uma variedade deprocedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitando a,cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, hidrofóbico,cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos(por exemplo, focalização isoelétrico preparativo), solubilidade diferencial(por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS- PAGE ou extração(ver, por exemplo, Protein Purification, J. -C. Janson e Lars Ryden, editors,VCH Publishers, New York, 1989) para obter o polipeptídeo purosubstancialmente.

Proteínas celulolíticas

Nos métodos da presente invenção, a proteína celulolítica podeser qualquer proteína envolvida no processamento do material celulósico porglicose ou hemi-celulose por xilose, manose, galactose e arabinose, seuspolímeros ou produtos derivados destes como descrito abaixo. A proteínacelulolítica pode ser uma preparação monocomponente, por exemplo, umacelulase, uma preparação multicomponente, por exemplo, endoglicanase,celobioidrolase, glicoidrolase, beta-glicosidase, como definidas abaixo ouuma combinação de preparações de proteína multicomponente emonocomponente. As proteínas celulolíticas podem ter atividade, isto é,hidrolisam a celulose, na, faixa de pH ácida, neutra ou alcalina.

A proteína celulolítica pode ser de origem fungica oubacteriana, que pode ser obtenível ou isolada e purificada a partir demicroorganismos que são conhecidos por ser capazes de produzir enzimascelulolíticas, por exemplo, espécies de Bacillus, Pseudomonas, Humicola,Coprinus, Thielavia, Fusarium, Myceliophthora, Acremonium,Cephalosporium, Scytalidium, Penicillium ou Aspergillus (ver, por exemplo,EP 458162), especialmente aqueles produzidos por uma cepa selecionada deHumicola insolens (reclassificado como Scytalidium thermophilum, ver porexemplo, Patent U.S. N°. 4.435.307), Coprinus cinereus, Fusariumoxisporum, Myceliophthora thermophila, Meripilus giganteus, Thielaviaterrestris, Acremonium sp., Acremonium persicinum, Acremoniumacremonium, Acremonium brachypenium, Acremonium dichromosporum,Acremonium obclavatum, Acremonium pinkertoniae, Acremoniumroseogriseum, Acremonium incoloratum e Acremonium furatum;preferivelmente de Humicola insolens DSM 1800, Fusarium oxisporum DSM2672, Myceliophthora thermophila CBS 117.65, Cephalosporium sp. RYM-202, Aeremonium sp. CBS 478.94, Acremonium sp. CBS 265,95,Aeremonium persicinum CBS 169.65, Aeremonium acremonium AHU 9519,Cephalosporium sp. CBS 535.71, Acremonium brachypenium CBS 866.73,Acremonium dichromosporum CBS 683.73, Acremonium obclavatum CBS311.74, Acremonium pinkertoniae CBS 157.70, Acremonium roseogriseumCBS 134.56, Acremonium incoloratum CBS 146.62 e Acremonium furatumCBS 299.70H. As proteínas celulolíticas também podem ser obtidas deTrichoderma (particularmente Trichoderma viride, Trichoderma reesei eTrichoderma koningii), alkalophilic Bacillus (ver, por exemplo, Patent U.S.N°. 3.844.890 e EP 458162) e Streptomyces (ver, por exemplo, EP 458162).Mutantes projetados quimicamente modificados ou de proteínas de proteínascelulolíticas também podem ser usados.

As proteínas celulolíticas adequadas especialmente são ascelulases alcalinas ou neutras. Exemplos de tais celulases são celulasesdescritas em EP 495.257, EP 531,372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO98/08940. Outros exemplos são variantes de celulases tais como aquelasdescritas em WO 94/07998, EP 531,315, Patent U.S. N°. 4.435.307, PatentU.S. N0. 5.457.046, Patent U.S. N°. 5.648.263, Patent U.S. N°. 5.686.593,Patent U.S. N°. 5.691.178, Patent U.S. N0. 5.763.254, Patent U.S. N0.5.776.757, WO 89/09259, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

As proteínas celulolíticas usadas nos métodos da presenteinvenção pode ser produzidas pela fermentação das cepas microbianasobservadas acima em um nutriente médio contendo fontes adequadas decarbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos natécnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), Mais GeneManipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991 ). Os meios adequadossão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparadasde acordo com composições publicadas (por exemplo, no catálogo daAmerican Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outrascondições adequadas para desenvolvimento e produção da proteínacelulolítica são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J. E. e Ollis,D.F., Biochemical Engineering Fundamentais, McGraw-Hill Book Company,NY, 1986).

A fermentação pode ser qualquer método de cultivação de umacélula resultante na expressão ou isolamento de uma proteína celulolítica. Afermentação pode, portanto, ser entendida como que compreende cultivo emfrasco de agitação ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindofermentações contínuas, de batelada, batelada de alimentação ou estadosólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizada em um meioadequado e sob condições permitindo a proteína celulolítica ou proteína deintensificação celulolítica a ser expressada ou isolada.

As proteínas celulolíticas resultantes produzidas pelos métodosdescritos acima podem ser recuperadas do meio de fermentação e purificadaspor procedimentos convencionais como descritos aqui.

A proteína celulolítica pode hidrolisar ou hidrolisa acarboximetil celulose (CMC), desde modo diminuindo a viscosidade damistura de incubação. A redução resultante em viscosidade pode serdeterminada por um viscosímetro de vibração (por exemplo, MIVI 3000 deSofraser, France). A determinação da atividade de celulase, medido emtermos de Unidade de Viscosidade de Celulase (CEVU), quantifica aquantidade da atividade catalítica presente em uma amostra por medição dacapacidade da amostra por reduzir a viscosidade de uma solução decarboximetil celulose (CMC). O ensaio é realizado na temperatura e pHadequados para a proteína celulolítica e substrato. Para Celluclast™(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) o ensaio é realizado a 40° C em 0,1M de tampão de fosfato pH 9,0 por 30 minutos com CMC como substrato(33,3 g/L de carboximetil celulose Hercules 7 LFD) e uma enzimaconcentração de aproximadamente 3,3-4,2 CEVU/ml. A atividade CEVU écalculada em relação à uma enzima padrão declarada, tal comoCELLUZYME™ padrão 17-1194 (obtido de Novozymes A/S, Bagsvaerd,Denmark).

Exemplos de preparações celulolíticas adequadas para o uso napresente invenção incluem, por exemplo, CELLUCLAST™ (disponível porNovozymes A/S) e NOVOZYM ™ 188 (disponível por Novozymes A/S).Outras preparações comercialmente disponíveis que compreendem celulaseque podem ser usadas incluem CELLUZYME™, CEREFLO™ eULTRAFLO™ (Novozymes A/S), LAMINEX™ e SPEZYME™ CP(Genencor Int.) e ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH). As enzimas decelulase são adicionadas em quantidades efetivas de cerca de 0,001 % a cercade 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 % acerca de 4,0 % em peso de sólidos e mais preferivelmente de cerca de 0,005% a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

Como o mencionado acima, as proteínas celulolíticas ouproteínas de intensificação celulolíticas usadas nos métodos da presenteinvenção podem ser preparações monocomponente, isto é, um componenteessencialmente livre de outros componentes celulolíticos. Os componentesimples podem ser um componente recombinante, isto é, produzidos porclonagem de uma seqüência de DNA que codifica o componente simples ecélulas subseqüentes transformadas com a seqüência de DNA e expressadasem um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). Outrosexemplos de proteínas celulolíticas monocomponente incluem, mas nãolimitam-se a, aqueles divulgados em JP-07203960-A e WO-9206209. Ohospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (enzima é estranha aohospedeiro), mas o hospedeiro pode sob certas condições também ser umhospedeiro homólogo (enzima é natural ao hospedeiro). As proteínascelulolíticas monocomponente também podem ser preparadas pela purificaçãouma tal proteína a partir de um caldo de fermentação.

Exemplos de proteínas celulolíticas monocomponente utéis naprática dos métodos da presente invenção incluem, mas não limitam-se a,endoglicanase, celobioidrolase, glicoidrolase e beta-glicosidase.

O termo "endoglicanase" é definido neste como um endo-1,4-(l,3;l,4)-beta-D-glucano 4-glicanoidrolase (E. C. N0 3,2,1.4), que catalisa aendoidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados decelulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina,ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanos misturados tal como cereal beta-D-glucanos ou xiloglucanos e outros materiais vegetais contendo componentescelulósicos. Para o propósito da presente invenção, a atividade deendoglicanase é determinada usando hidrólise de carboximetil celulose(CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Puro and Appl.Chem. 59: 257-268.

O exo-l,4-beta-D-glucanases inclui tanto celobioidrolases equanto glicoidrolases. Para o propósito da presente invenção, a atividade deexoglucanase é determinada de acordo com o procedimento descrito porHimmel et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 12948-12955.

O termo "celobioidrolase" é definido neste como um 1,4-beta-D-glucano celobioidrolase (E. C. 3,2,1,91), que catalisa a hidrólise de ligações1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, celooligossacarídeos ou qualquerglicose beta-1,4-ligada glicose contendo polímero, liberação de celobiose apartir das extremidades de redução ou não redução da cadeia. Para o propósitoda presente invenção, a atividade celobioidrolase é determinada de acordocom os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47:273- 279 e by van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; vanTilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288. Na presenteinvenção, o método Lever et al. foi utilizado por estimar a hidrólise decelulose em forragem de milho, enquanto o método de van Tilbeurgh et al. foiusado para determinar a atividade celobioidrolase em um dissacarídeofluorescente derivado. O termo "glicoidrolase" é definido neste como um 1,4-beta-D-glucano glucoidrolase (E. C. 3,2,1.74), que catalisa a hidrólise de 1,4-ligações (ligações de O-glicosila) em 1,4-beta-D-glucanos a fim de removeras unidades de glicose sucessivas.

O termo "beta-glicosidase" é definido neste como um beta-D-glucoside glucoidrolase (E.C. 3,2,1,21), que catalisa a hidrólise de resíduos debeta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D-glicose.

Para o propósito da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase édeterminada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al.,2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66, exceto que condições diferentes foramutilizadas como descrito aqui. Uma unidade de atividade de beta-glicosidase édefinida como 1,0 μπιοί de p-nitrofenol produzida por minuto a 5o C, pH 5 de4 mM de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosida como substrato em 100 mM decitrato de sódio, 0,01 % de Tween-20.

Processamento de material celulósico

Os métodos da presente invenção podem ser usados paraprocessar um material celulósico para muitas substâncias utéis, por exemplo,químicas e combustíveis. Além disso para etanol, algumas conveniências eespecialidades químicas que podem ser produzidas de celulose incluemxilose, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (por exemplo, ácidoláctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol, furfural,poliidroxialcanoatos e ácido cis.cis-mucônico (Lynd, L. R., Wyman, C. E. eGemgross, T. U., 1999, Biocommodity Engineering, Biotechnol. Prog., 15:777-793; Philippidis, G. P., 1996, Celulose bioconversion technology, inHandbook on Bioethanol: Production e Utilization, Wyman, C. E., ed., Tailor& Francis, Washington, DC, 179-212; e Ryu, D. D. Y. e Mandeis, M., 1980,Celulases: biosynthesis e applications, Enz. Microb. Technol., 2: 91-102). Umbenefício da co-produção potencial estende-se além da síntese de orgânicoprodutos múltiplos de carboidrato fermentável. Os resíduos ricos em ligninaremanescentes depois do processamento biológico podem ser convertidospara químicas derivadas de lignina ou usadas para produção de energia.

Os métodos convencionais usados para processar o materialcelulósico de acordo com os métodos da presente invenção são bementendidos aqueles habilitados na técnica. Os métodos da presente invençãopode ser implementados usando qualquer mecanismo de processamento debiomassa convencional configurado a operar de acordo com a invenção.

Um tal mecanismo podem incluir um reator agitado porbatelada, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, um reator decoluna de tampão-fluxo (Gusakov, A.V. e Sinitsyn, A.P., 1985, Kinetics ofthe enzymatic hydrolyses of celulose: 1. A mathematical model for um batchreactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu,S. K. e Lee, J. M., 1983, Bioconvertion of waste cellulose using an attrictionbioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65) ou um reactor com agitaçãointensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, Α. V., Sinitsyn,A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement ofenzymatic cellulose hidrolysis using a novel type of bioreactor with intensiveagitação induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56:141-153).

Os métodos convencionais incluem, mas não limitam-se a,sacarificação, fermentação, hidrólise e fermentação (SHF) separadas,sacarificação e fermentação (SSF) simultâneas, sacarificação e co-fermentação (SSCF) simultâneas, hidrólise e fermentação (HHF) híbridas econversão microbiana direta (DMC).

O SHF usa etapas de processos separados para primeirohidrolisar enzimaticamente a celulose a glicose e então fermentar a glicose aoetanol. Em SSF, a hidrólise enzimática da celulose e a fermentação de glicoseao etanol é combinado em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Celulosebioconvertion technology, in Handbook on Bioethanol: Production eUtilization, Wyman, C. E., ed., Tailor & Francis, Washington, DC5 179-212).O SSCF inclui a co-fermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J. eHimmel, M., 1999, Enzymes, energy e the environment: A strategicperspective on the U.S. Department of Energy1S research e developmentactivities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). O HHF inclui duasestapas separadas realizadas no mesmo reator mas em temperaturasdiferentes, isto é, sacarificação enzimática em alta temperatura seguido porSSF em um temperatura inferior que a cepa de fermentação pode tolerar. ODMC combina todos os três processos (produção de celulase, hidrólise decelulose e fermentação) em uma etapa (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van ZyI,W. H. e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentais ebiotechnology, Microbiol. MoI. Biol. Reviews 66: 506-577).

"Fermentação" ou "processo de fermentação" refere-se aqualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende umaetapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, sem limitação,processos de fermentação usados para produzir fermentação produtosincluindo álcoois (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol,1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, acético,ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácidoglucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico,ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico,ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (por exemplo,acetona); aminoácidos (por exemplo, aspártico, ácido glutâmico, ácidoglicina, lisina, serina e treonina); gases (por exemplo, metano, hidrogênio(H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)). Os processosde fermentação também incluem processos de fermentação usados naindústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria delaticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), indústria de couro eindústria de tabaco.

O polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica pode serna forma de um caldo de fermentação bruta com ou sem as células ou naforma de uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada. A proteínacelulolítica intensificada pode ser uma preparação monocomponente, porexemplo, uma proteína da família 61, uma preparação de proteínamulticomponente, por exemplo, um número de proteínas da família 61 ouuma combinação de preparações de proteína multicomponente emonocomponente.

A substância pode ser qualquer substância derivada dafermentação. Em um aspecto preferido, a substância é um álcool. Seráentendido que o termo "álcool" abranja uma substância que contém um oumais porções de hidroxila. Em um mais aspecto preferido, o álcool éarabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em umoutro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto maispreferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool émetanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Emum outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em um outro aspectomais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J.,Du, J. e Tsao, G. T., 1999, Etanol production from renewable resources, emAdvances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed.,Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, Μ. M. eJonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol.Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P. e Singh, D., 1995, Processos forfermentative production of xilitol - um sugar substitute, Process Biochemistry30 (2): 117-124; Ezeji, T. C, Qureshi, N. e Blaschek, H. P., 2003, Productionof acetone, butanol e ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOl e in siturecuperação by gas stripping, World Journal of Microbiology e Biotechnology19(6): 595-603.

Em um outro aspecto preferido, a substância é um ácidoorgânico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoacético. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoacetônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoadípico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoascórbico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidocítrico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5-diceto-D-glucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico éácido fórmico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidofumárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoglucárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoglucônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoglucurônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidoglutárico. Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3-hidroxipropiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico éácido itacônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico éácido láctico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidomálico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidomalônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidooxálico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidopropiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácidosuccínico. Em um outro mais aspecto preferido, o ácido orgânico é ácidoxilônico. Ver, por exemplo, Chen, R. e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediatedextractive fermentation for lactic acid production firam cellulosic biomassa,Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.

Em um outro aspecto preferido, a substância é uma cetona.Será entendido que o termo "cetona" abranja uma substância que contém umaou mais porções de cetona. Em um outro aspecto mais preferido, a cetona éacetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

Em um outro aspecto preferido, a substância é um aminoácido.Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Emum outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em umoutro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em um outro aspectomais preferido, o aminoácido é lisina. Em um outro aspecto mais preferido, oaminoácido é serina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido étreonina. Ver, por exemplo, Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) producyionand other microbial biopolimers, Biotechnology e Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em um outro aspecto preferido, a substância é um gás. Em umoutro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em um outro aspecto maispreferido, o gás é H2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Emum outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N.,A. Miya e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuousculture system of hydrogen-producing anaerobic bactéria, Water Science eTechnology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. in Biomassa e Bioenergy,Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomassa for methaneproduction: A review.

A produção de uma substância de material celulósicotipicamente requer quatro etapas principais. Estas quatro etapas são pré-tratamento, hidrólise enzimática, fermentação e recuperação. Exemplificadoabaixo está um processo para produzir etanol, mas será entendido queprocessos similares podem ser usados para produzir outras substâncias, porexemplo, a substâncias descrita acima.

Pré-tratamento. Na etapa de pré-tratamento ou pré-hidrólise, omaterial celulósico é aquecido para quebrar a lignina e estrutura decarboidrato, solubilizando mais a hemi-celulose e tornam a fração de celuloseacessível a enzimas celulolíticas. O aquecimento é realizado diretamente comvapor ou em pasta onde um catalisador também pode ser adicionado aomaterial para acelerar as reações. Os catalisadores incluem ácidos fortes, taiscomo ácido sulfürico e SO2 ou álcali, tal como hidróxido de sódio. Opropósito do estágio de pré-tratamento é para facilitar a penetração da enzimae microorganismos. A biomassa celulósica também pode ser submetida a umpré-tratamento de explosão de vapor hidrotérmico (ver Pedido de Patente U.SN°. 20020164730).

Sacarificação. Na hidrólise de etapa enzimática, tambémconhecida como sacarificação, as enzimas como descrita aqui são adicionadasao material de pré-tratamento para converter a fração de celulose a glicosee/ou outros açúcares. A sacarificação é no geral realizada nos reatores oufermentadores de tanque agitado sob pH controlado, temperatura e condiçõese mistura. Uma etapa de sacarificação pode demorar até 200 horas. Asacarificação pode ser realizada na temperatura de cerca de 30° C a cerca de65° C, em particular em cerca de 50° C e em um pH na faixa entre cerca de 4e cerca de 5, especialmente em cerca de pH 4,5. Para produzir glicose quepode ser metabolizada por levedura, a hidrólise é tipicamente realizada napresença de uma beta-glicosidase.

Fermentação. Na etapa de fermentação, açúcares, liberação domaterial celulósico como um resulte do pré tratamento e hidrólise de etapaenzimática, são fermentados por etanol por um organismo de fermentação, talcomo levedura. A fermentação também pode ser realizada simultaneamentecom a hidrólise enzimática no mesmo recipiente, novamente sob pHcontrolado, temperatura e condições de mistura. Quando a sacarificação efermentação são realizadas simultaneamente no mesmo recipiente, o processoé no geral denominado sacarificação e fermentação ou SSF simultâneos.

Qualquer substrato celulósico adequado ou material bruto podeser usado em um processo de fermentação na prática da presente invenção. Osubstrato é no geral selecionado com base no produto de fermentaçãodesejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação e o processoutilizado, como é bem conhecido na técnica. Exemplos de substratosadequados para o uso nos métodos da presente invenção, incluem materiaiscontendo celulose, tais como madeira ou resíduos vegetais ou açúcaresmoleculares inferiores DP1-3 obtidos de material celulósico processado quepode ser metabolizado pelo microorganismo de fermentação e que pode serfornecido pela adição direta ao meio de fermentação.

O termo "meio de fermentação" será entendido por referir-se aum meio antes do microorganismo de fermentação ser adicionado, tal como,um meio resultante a partir de um processo de sacarificação, assim como ummeio usado em uma sacarificação e processo de fermentação (SSF)simultâneos.

O "microorganismo de fermentação" refere-se a qualquermicroorganismo adequado para o uso em um processo de fermentaçãodesejado. Os microorganismos de fermentação adequados de acordo com ainvenção são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, tal comoglicose, xilose, arabinose, manose, galactose ou oligossacarídeos diretamenteou indiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos demicroorganismos de fermentação incluem organismos füngicos, tais comolevedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Saccharomyces spp. e emparticular, Saccharomyces cerevisiae. As leveduras comercialmentedisponíveis incluem, por exemplo, Red Star®/™/Lesaffre Ethanol Red(disponível de Red Star/Lesaffre, USA) FALI (disponível de Fleischmann'sYeast, a division of Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponívelde Alltech), GERT STRAND (disponível de Gert Strand AB, Sweden) eFERMIOL (disponível de DSM Specialties).

Em um aspecto preferido, a levedura é um Saccharomyces spp.Em um mais aspecto preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Emum outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Emum outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Emum outro aspecto preferido, a levedura é um Kluyveromyces. Em um outroaspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em um outroaspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em um outroaspecto preferido, a levedura é um Candida. Em um outro aspecto maispreferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em um outro aspecto maispreferido, a levedura é Candida brassicae. Em um outro aspecto preferido, alevedura é um Clavispora. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura éClavispora lusitaniae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura éClavispora opuntiae. Em um outro aspecto preferido, a levedura é umPachysolen. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolentannophilus. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Bretannomyces.Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii(Philippidis, G. P., 1996, Celulose bioconversion technology, in Handbook onBioethanol: Production e Utilization, Wyman, C. E., ed., Tailor & Francis,Washington, DC, 179-212).

A bactéria que pode fermentar eficientemente glicose ao etanolinclui, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum(Philippidis, 1996, supra).

E bem conhecido na técnica que o organismo descrito acimatambém pode ser usado para produzir outras substâncias, como descrito aqui.

A clonagem dos genes heterólogos em Saccharomycescerevisiae (Chen, Z., Ho, N.W.Y., 1993, Cloning e improving the expressionof Pichia stipitis xilose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl.Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho, N. W. Y., Chen, Z, Brainard, A.P.,1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectivelycofermenting glicose e xilose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859) ouem bactéria tal como Escherichia coli (Beall, D. S., Ohta, K., Ingram, L. 0.,1991, Parametric studies of ethanol production from xilose e other sugar byrecombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303), Klebsiellaoxitoca (Ingram, L. O., Gomes, P. F., Lai, X., Moniruzzaman, M., Wood, B.E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998, Metabolie engineering of bactéria forethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214) e Zymomonas mobilis(Zhang, M., Eddy, C, Deanda, K., Finkelstein, M. e Picataggio, S., 1995,Metabolic engineering de um pentose metabolism pathway in ethanologenicZymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, Ce Picataggio, S., 1996, Development de um arabinose-fermenting Zymomonasmobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol.62: 4465-4470) tendo levado à construção de organismos capazes deconverter hexoses e pentoses ao etanol (cofermentação).

Levedura ou um outro microorganismo tipicamente éadicionado à celulose degradada ou hidrolisada e a fermentação é realizadapor cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal como cerca de 35 a cerca de 60 horas.A temperatura é tipicamente entre cerca de 26° C a cerca de 40° C, emparticular a cerca de 32° C e a cerca de pH 3 a cerca de pH 6, em particularem cerca de pH 4-5.

Em um aspecto preferido, a levedura ou um outromicroorganismo é aplicado à celulose degradada ou hidrolisada e afermentação é realizada por cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal comotipicamente 35 a 60 horas. Em um aspecto preferido, a temperatura é no geralentre cerca de 26 a cerca de 40° C, em particular cerca de 32° Ceo pH é nogeral de cerca de pH 3 a cerca de pH 6, preferivelmente em cerca de pH 4 a 5.

A levedura ou um outro microorganismo é preferivelmente aplicado naquantidades de aproximadamente IO5 a IO12, preferivelmente deaproximadamente IO7 a IO10, especialmente aproximadamente 5x107 decontagem viável por ml de caldo de fermentação. Durante uma fase deprodução de etanol a contagem da célula de levedura deve preferivelmente serna faixa de aproximadamente IO7 a IO10, especialmente em cerca deaproximadamente 2 χ 10 . Orientação adicional com relação ao uso de

levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, "Thealcohol Textbook" (Editors K. Jacques, T.P. Lyons e D. R. Kelsall,Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que é incorporadoneste por referência.

O processo mais amplamente usado na técnica é o processo desacarificação e fermentação (SSF) simultâneos onde não existe estágio deretenção para a sacarificação, significando que a levedura e enzima sãoadicionado entre si.

Para produção de etanol, seguindo a fermentação, a mistura édestilado a extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com o processo dainvenção pode ser usado como, por exemplo, etanol de combustível, etanol debebidas, isto é, álcoois neutros potáveis ou etanol industrial. Um estimuladorde fermentação pode ser usado na combinação com qualquer dos processosenzimáticos descritos aqui para ainda melhorar o processo de fermentação eem particular, o desempenho do microorganismo de fermentação, tal como,taxa de intensificação e rendimento de etanol. Um "estimulador defermentação" refere-se aos estimuladores para desenvolvimento demicroorganismos de fermentação, em particular, levedura. Os estimuladoresde fermentação preferidos para desenvolvimento incluem vitaminas eminerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina,pantotenato, nicotínico, ácido meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, ácido riboflavina e Vitaminas A, B, C, D e E.Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viabilityof Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batchprocess, Springer-Verlag (2002), que é incorporado neste por referência.Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprirnutrientes que compreendem Ρ, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.Recuperação. O álcool é separado do material celulósicofermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O Etanolcom uma pureza de até cerca de 96 vol. % pode ser obtido, e pode ser usadocomo, por exemplo, etanol de combustível, etanol de bebidas, isto é, álcooisneutros potáveis ou etanol industrial.

Para outras substâncias, qualquer método conhecido na técnicapode ser usado incluindo, mas não limitando-se a, cromatografia (porexemplo, troca de íon, afinidade, hidrofóbico, cromatofocalização e exclusãode tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalizaçãoisoelétrico preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação desulfato de amônio), SDS- PAGE, destilação ou extração.

Nos métodos da presente invenção, a proteína celulolítica epolipeptídeos de intensificação celulolíticas podem ser suplementados poruma ou mais atividades de enzima adicional para melhorar a degradação domaterial celulósico. As Enzimas adicionais preferidas são hemi-celulases,esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases, e/ou cutinases), proteases,lacases, peroxidases ou misturas destas.

Nos métodos da presente invenção, as enzimas adicionaispodem ser adicionadas antes ou durante a fermentação, incluindo durante ouapós a propagação do microorganismo de fermentação.

As enzimas referidas aqui podem ser derivadas ou obtidas dequalquer origem adequada, incluindo origem bacteriana, fungica, levedura oumamífera. O termo "obtido" aqui significa que a enzima foi isolado a partir deum organismo que naturalmente produz a enzima como uma enzima natural.O termo "obtido" também significa aqui que a enzima foi produzidarecombinantemente em um organismo hospedeiro, em que a enzimaproduzida recombinantemente é natural ou estranha ao organismo hospedeiroou tem uma seqüência modificada de aminoácido, por exemplo, tendo um oumais aminoácidos que são anulados, inseridos e/ou substituídos, isto é, umaenzima produzida recombinantemente que é um mutante e/ou um fragmentode uma seqüência de aminoácido natural ou uma enzima produzida porprocessos de mistura de ácido nucleico conhecido na técnica. Abrangidosdentro do significado de uma enzima natural são variantes naturais e dentrodo significado de uma enzima estranha são variantes obtidasrecombinantemente, tal como por mutagênese direcionado ao local oumistura.

As enzimas também podem ser purificadas. O termo"purificado" como aqui usado cobre as enzimas livres a partir de outroscomponentes do organismo de que é derivado. O termo "purificado" tambémcobre enzimas livres a partir de componentes de organismo natural de que éobtido. As enzimas podem ser purificadas, com apenas quantidades menoresde outras proteína estando presentes. A expressão "outras proteínas" dizrespeito em particular a outras enzimas. O termo "purificado" como aquiusado também refere-se a remoção de outros componentes, particularmenteoutras proteínas e mais particularmente outras enzimas presente na célula deorigem da enzima da invenção. A enzima pode ser "polipeptídeo purosubstancialmente," que é, livre de outros componentes do organismo em que éproduzido, que é, por exemplo, um organismo hospedeiro por enzimasproduzidas recombinantemente.

As enzimas usadas na presente invenção podem ser emqualquer forma adequada para o uso nos processos descritos aqui, tal como,por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células, um pó secoou granulado, um granulado que não em pó, um líquido, um líquidoestabilizado ou uma enzima protegida. Os granulados podem ser produzidos,por exemplo, como divulgados na Patent U.S. N0. 4.106.991 e 4.661.452 epode opcionalmente ser revestido pelos conhecidos na técnica. Aspreparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas poradicionar estabilizadores tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou umoutro poliol, e/ou ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo comprocessos estabilizados. As enzima protegidas podem ser preparadas deacordo com o processo divulgado em EP 238.216.

Hemi-celulases

As hidrólises enzimáticas de hemi-celuloses podem serrealizadas por uma ampla variedade de fungos e bactérias. Similar adegradação de celulose, a hidrólise de hemi-celulose requer ação coordenadade muitas enzimas. As hemi-celulases podem ser colocadas em três categoriasgerais: as enzimas de endo-atuação que atacam as ligações internas dentro dacadeia de polissacarídeo, as enzimas de exo-atuação que atuamprocessivelmente na redução ou não redução final da cadeia de polissacarídeoe as enzimas suplementares, acetilesterases e esterases que hidrolisam asligações de glicosida lignina, tal como esterase de ácido coumárico e esterasede ácido ferúlico (Wong, K.K.Y., Tan, L. U. L. e Saddler, J. N., 1988,Multiplicity of β-1,4-xylanase in microorganisms: Functions e applications,Microbiol. Rev. 52: 305-317; Tenkanen, M. e Poutanen, K., 1992,Significance of esterases in a degradation of xylans, in Xylans e Xylanases,Visser, J., Beldman, G., Kuster-van Someren, M. A. e Voragen, A. G. J., eds.,Elsevier, New York, NY, 203-212; Coughlan, Μ. P. e Hazlewood, G. P.,1993, Hemicellulose e hemicellulases, Portland, London, UK; Brigham, J. S.,Adney, W. S. e Himmel, M. E., 1996, Hemi-celulases: Diversity eapplications, in Handbook on Bioethanol: Production e Utilization, Wyman,C. E., ed., Tailor & Francis, Washington, DC, 119-141).

As hemi-celulases incluem xilanases, arabinofuranosidases,acetil xilan esterase, glucuronidases, endo-galactanase, mananoases, endo ouexo arabinases, exo-galactanases e misturas deste. Os exemplos de hemi-celulases de enzimas de endo-atuação e ancilares incluem endoarabinanase,endoarabinogalactanase, endoglicanase, endomananoase, endoxilanase eferaxan endoxilanase. Os exemplos de hemi-celulases de exo-atuação eenzimas ancilares incluem a-L-arabinosidase, β-L-arabinosidase, a-l,2-L-fucosidase, a-D-galactosidase, β-D-galactosidase, β-D-glicosidase, β-D-glucuronidase, β-D-mannosidase, β-D-xilosidase, exoglicosidase,exocelobioidrolase, exomannobioidrolase, exomananoase, exoxilanase, xilanα-glucuronidase e coniferin β-glicosidase. Os exemplos de esterases incluemacetil esterases (acetilgalactan esterase, acetilmanano esterase e acetilxilanesterase) e aril esterases (esterase de ácido coumárico e ácido furílicoesterase).

Preferivelmente, a hemi-celulase é uma hemi-celulase de exo-atuação e mais preferivelmente, uma hemi-celulase de exo-atuação que tem acapacidade para hidrolisar hemi-celulose sob condições ácidas de pH abaixode 7. Um exemplo de uma hemi-celulase adequada para o uso na presenteinvenção inclui VISCOZYME™ (disponível de Novozymes A/S, Denmark).A hemi-celulase é adicionada em uma quantidade efetiva de cerca de 0,001 %a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025% a cerca de 4,0 % em peso de sólidos e mais preferivelmente de cerca de0,005 % a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

Uma xilanase (E.C. 3.2.1.8) pode ser obtida de qualquer fonteadequada, incluindo organismos fungicos ou bacterianos, tal comoAspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium,Trichoderma, Humicola, Thermomyces e Bacillus. As preparaçõescomercialmente disponíveis preferidas que compreende xilanase incluemSHEARZYME®, BIOFEED WHEAT®, BIO-FEED Plus® L,CELLUCLAST®, ULTRAFLO®, VISCOZYME®, PENTOPAN MONO®BG e PULPZYME® HC (Novozymes A/S); e LAMINEX® e SPEZYME®CP (Genencor Int.).Esterases

As esterases que podem ser usadas para bioconversão decelulose incluem acetil esterases, tais como acetilgalactan esterase,acetilmanano esterase e acetilxilan esterase e esterases que hidrolisam asligações de glicosídeo lignina, tal como esterase de ácido coumárico eestearase de ácido ferúlico.

Como aqui usado, uma "esterase" também conhecida comouma hidrolase de éster carboxílico, refere-se a enzimas e atuação nas ligaçõesde éster e incluem enzimas classificadas em EC 3.1.1 Carboxylic EsterHidrolases according to Enzyme Nomenclature (Enzyme Nomenclature,1992, Academic Press, San Diego, Califórnia, com Suplemento 1 (1993),Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) eSuplemento 5, em Eur. J. Biochem. 223: 1-5, 1994; Eur. J. Biochem. 232: 1-6,1995; Eur. J. Biochem. 237: 1-5, 1996; Eur. J. Biochem. 250: 1-6, 1997 e Eur.J. Biochem. 264: 610-650, 1999; respectivamente). Exemplos não limitantesde esterases incluem arilesterase, triacilglicerol lipase, acetilesterase,acetilcolinesterase, colinesterase, tropinesterase, pectinesterase, esterolesterase, clorofilase, L-arabinonolactonase, gluconolactonase, uronolactonase,tanase, retinil-palmitato esterase, hidroxibutirato-dímero hidrolase,acilglicerol lipase, 3-oxoadipato enol-lactonase, 1,4-lactonase, galactolipase,4-piridoxolactonase, acilcamitino hidrolase, aminoacil-tRNA hidrolase, D-arabinonolactonase, 6-fosfogluconolactonase, fosfolipase Al, 6-acetilglucosedeacetilase, lipoproteína lipase, diidrocoumarina lipase, limonin-D-anel-lactonase, esteróide-lactonase, triacetato-lactonase, actinomicin lactonase,orselinate-depsídeo hidrolase, cefalosporin-C deacetilase, clorogenatehidrolase, alfa-amino-ácido esterase, 4-metiloxaloacetato esterase,carboximetilenobutenolidase, desoxilimonato A-anel-lactonase, 2-acetil-l-alquilglicerofosfocolina esterase, fusarinina-C ornitinesterase, sinapinaesterase, cera-éster hidrolase, forbol-diéster hidrolase, fosfatidilinositoldesacilase, sialata O-acetilesterase, acetoxibutinilbitiofeno desacetilase,acetilsalicilato desacetilase, metilumbeliferil-acetato desacetilase, 2-pirono-4,6-dicarboxilato lactonase, N-acetilgalactosaminoglicano desacetilase,estearase de hormônio juvenil, bis(2-etilexil)ftalato esterase, proteína-glutamato metilesterase, 11-cis-retinil-palmitato hidrolase, all-trans-retinil-palmitato hidrolase, L-ramnono-l,4-lactonase, 5-(3,4-diacetoxibut-l-inil)-2,2'-bitiofeno desacetilase, éster acil etílico graxo sintase, xilono-1,4-lactonase, N-acetilglucosaminilfosfatidilinositol desacetilase, cetraxatobenzilesterase, acetilalquilglicerol acetilidrolase e acetilxilan esterase.

As esterases preferidas para o uso na presente invenção sãoenzimas lipolíticas, tais como, lipases (classificada como EC 3.1.1.3, EC3.1.1.23, e/ou EC 3.1.1.26) e fosfolipases (classificada como EC 3.1.1.4 e/ouEC 3.1.1.32, incluindo lisofosfolipases classificadas como EC 3.1.1.5). Outrasesterases preferidas são cutinases (classificada como EC 3.1.1.74).

A esterase pode ser adicionada em uma quantidade efetivapara obter benefício desejado para melhorar o desempenho domicroorganismo de fermentação, por exemplo, para mudar acomposição/concentração do lipídio dentro e/ou fora do microorganismo defermentação ou na membrana celular do microorganismo de fermentação,para resultar na melhora no movimento de solutos dentro e/ou fora dosmicroorganismos de fermentação durante a fermentação e/ou para fornecermais fontes de energia metabolizáveis (tal como, por exemplo, para convertercomponentes, tal como, óleo a partir de um substrato de milho, acomponentes utéis de microorganismo de fermentação, por exemplo, ácidosgraxos insaturados e glicerol), para aumentar o rendimento de etanol.Exemplos de quantidades efetivas de esterase são de cerca de 0,01 a cerca de400 LU/g DS (Sólidos secos). Preferivelmente, a esterase é usada em umaquantidade de cerca de 0,1 a cerca de 100 LU/g DS, mais preferivelmentecerca de 0,5 a cerca de 50 LU/g DS e ainda mais preferivelmente cerca de 1 acerca de 20 LU/g DS. A otimização adicional da quantidade de esterase podeser a seguir obtida usando procedimentos padrão conhecidos na técnica.

Uma unidade de Lipase (LU) é a quantidade da enzima quelibera 1,0 μπιοί de ácido graxo tratável por minuto com tributirina comosubstrato e goma arábica como um emulsificador a 30(C, pH 7.0 (tampão defosfato).

Em um aspecto preferido, a esterase é uma enzima lipolítica,mais preferivelmente, um lipase. Como aqui usado, uma "enzima lipolítica"refere-se a lipases e fosfolipases (incluindo liso-fosfolipases). A enzimalipolítica é preferivelmente de origem microbiana, em particular de origembacteriana, fungica ou de levedura. A enzima lipolítica usada pode serderivada de qualquer fonte, incluindo, por exemplo, uma cepa de Absidia, emparticular Absidia blakesleena e Absidia corymbifera, uma cepa deAchromobacter, em particular Achromobacter iophagus, uma cepa deAeromonas, uma cepa de Alternaria, em particular Alternaria brassiciola, umacepa de Aspergillus, em particular Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,Aspergillus fumigatus e Aspergillus flavus, uma cepa de Achromobacter, emparticular Achromobacter iophagus, uma cepa de Aureobasidium, emparticular Aureobasidium pullulans, uma cepa de Bacillus, em particularBacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus e Bacillus subtilis, uma cepa deBeauveria, uma cepa de Brochothrix, em particular Brochothrixthermosohata, uma cepa de Candida, em particular Candida cilindracea{Candida rugosa), Candida paralipolitica e Candida antarctica, uma cepa deChromobacter, em particular Chromobacter viscosum, uma cepa de Coprinus,em particular Coprinus cinereus, uma cepa de Fusarium, em particularFusarium graminearum, Fusarium oxisporum, Fusarium solani, Fusariumsolani pisi, Fusarium roseum culmorum e Fusarium venenatum, uma cepa deGeotricum, em particular Geotricum penicillatum, uma cepa de Hansenula,em particular Hansenula anômala, uma cepa de Humicola, em particularHumicola brevispora, Humicola brevis var. thermoidea e Humicola insolens,uma cepa de Hyphozyma, uma cepa de Lactobacillus, em particularLactobacillus curvatus, uma cepa de Metarhizium, uma cepa de Mucor, umacepa de Paecilomyces, uma cepa de Penicillium, em particular Penicilliumcyclopium, Penicillium crustosum e Penicillium expansum, uma cepa dePseudomonas em particular Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonasalcaligenes, Pseudomonas cepacia (syn. Burkholderia cepacia), Pseudomonasfluorescens, Pseudomonas tragi, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonasmendocina, Pseudomonas mephitica lipolitica, Pseudomonas alcaligenes,Pseudomonas plantari, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putida,Pseudomonas stutzeri e Pseudomonas wisconsinensis, uma cepa deRhizooctonia, em particular Rhizooctonia solani, uma cepa de Rhizomucor,em particular Rhizomucor miehei, uma cepa de Rhizopus, em particularRhizopus japonicus, Rhizopus microsporus e Rhizopus nodosus, uma cepa deRhodospohdium, em particular Rhodosporidium toruloides, uma cepa deRhodotorula, em particular Rhodotorula glutinis, uma cepa deSporobolomyces, em particular Sporobolomyces shibatanus, uma cepa deThermomyces, em particular Thermomyces lanuginosus (anteriormenteHumicola lanuginosa), uma cepa de Thiarosporella, em particularThiarosporella phaseolina, uma cepa de Trichoderma, em particular,Trichoderma harzianum e Trichoderma reesei, e/ou uma cepa de Verticillium.

Em um aspecto preferido, a enzima lipolitica é derivada deuma cepa de Aspergillus, Achromobacter, Bacillus, Candida, Chromobacter,Fusarium, Humicola, Hyphozyma, Pseudomonas, Rhizomucor, Rhizopus ouThermomyces.

Em um aspecto mais preferido, a enzima lipolitica é um lipase.As lipases podem ser aplicadas aqui por sua capacidade de modificar aestrutura e composição de óleos triglicerídeo e gorduras no meio defermentação (incluindo fermentação de levedura), por exemplo, resultando apartir de um substrato de milho. As lipases catalisam diferentes tipos deconversão de triglicerídeo, tal como hidrólise, esterificação etransesterificação. As lipases adequadas incluem lipases ácidas, neutras ebásicas, como são bem conhecidas na técnica, embora as lipases ácidas (talcomo, por exemplo, a lipase G AMANO 50, disponível de Amano) parecemser mais efetiva em concentrações inferiores de lipase como comparada aslipases neutras ou básicas. As lipases preferidas para o uso na presenteinvenção incluem lipase de Candida antarcitca e lipase de Candidacilindracea. As lipases mais preferidas são lipases purificadas tais como lipasede Candida antarcitca (lipase A), lipase de Candida antarcitca (lipase B),lipase de Candida cilindracea e lipase de Penicillium camembertii.

A lipase pode ser uma divulgada em EP 258.068-A ou podeser uma variante de lipase tal como uma variante divulgada em WO 00/60063ou WO 00/32758, incorporado neste por referência.

As lipases são preferivelmente adicionadas em quantidades decerca de 1 a cerca de 400 LU/g DS, preferivelmente cerca de 1 a cerca de 10LU/g DS e mais preferivelmente cerca de 1 a cerca de 5 LU/g DS.

Em um outro aspecto preferido, a esterase é um cutinase. Ascutinases são enzimas que são capazes de degradar a cutina. A cutinase podeser derivada de qualquer fonte. Em um aspecto preferido, a cutinase éderivada de uma cepa de Aspergillus, em particular Aspergillus oryzae, umacepa de Alternaria, em particular Alternaria brassiciola, uma cepa deFusarium, em particular Fusarium solani, Fusarium solani pisi, Fusariumroseum culmorum ou Fusarium roseum sambucium, uma cepa deHelminthosporum, em particular Helminthosporum sativum, uma cepa deHumicola, em particular Humicola insolens, uma cepa de Pseudomonas, emparticular Pseudomonas mendocina ou Pseudomonas putida, uma cepa deRhizooctonia, em particular Rhizooctonia solani, uma cepa de Streptomyces,em particular Streptomyces scabies ou uma cepa de Ulocladium, emparticular Ulocladium consortiale. Em um aspecto mais preferido a cutinase éderivada de uma cepa de Humicola insolens, em particular a cepa deHumicola insolens DSM 1800. A cutinase de Humicola insolens é descrita emWO 96/13580, que é incorporado neste por referência. A cutinase pode seruma variante tal como uma das variantes divulgadas em WO 00/34450 e WO01/92502, que são incorporado neste por referência. As variantes de cutinasepreferidas incluem variantes listadas no Exemplo 2 de WO 01/92502 que sãoneste especificamente incorporado por referência. Uma quantidade eficaz decutinase é de cerca de 0,01 a cerca de 400 LU/g DS, preferivelmente de cercade 0,1 a cerca de 100 LU/g DS e mais preferivelmente de cerca de 1 a cercade 50 LU/g DS. A otimização adicional da quantidade de cutinase pode ser aseguir obtida usando procedimentos padrão conhecidos na técnica.

Em um outro aspecto preferido, a esterase é uma fosfolipase.Como aqui usado, o termo "fosfolipase" é uma enzima que tem atividade comrelação aos fosfolípideos, por exemplo, atividade hidrolítica. Os fosfolípideos,tais como lecitina ou fosfatidilcolina, consistem de glicerol esterificado comdois ácidos graxos em um posição externa (sn-1) e a mediana (sn-2) eesterificados com ácido fosfórico na terceira posição. O ácido fosfórico podeser esterificado a um amino-álcool. Diversos tipos de atividade de fosfolipasepode ser distinguida, incluindo fosfolipases Al e A2 que hidrolisam um grupode acila graxa (na posição sn-1 e sn-2, respectivamente) para formarlisofosfolípideos; e lisofosfolipase (ou fosfolipase B) que hidrolisam o grupoacila graxa remanescente nos lisofosfolípideos. A fosfolipase C e fosfolipaseD (fosfodiesterases) liberam diacil glicerol ou ácido fosfatídicorespectivamente.

O termo "fosfolipase" inclui enzimas com atividadefosfolipase, por exemplo, atividade de fosfolipase A (Al ou A2), atividade defosfolipase B, atividade de fosfolipase C ou atividade de fosfolipase D. Otermo "fosfolipase A" como aqui usado é entendido a cobrir uma enzima comatividade de fosfolipase Al e/ou fosfolipase A2. A atividade de fosfolipasepode ser fornecida por enzimas tendo outras atividades também, tal como, porexemplo, uma lipase com atividade de fosfolipase. A atividade de fosfolipasepode, por exemplo, ser a partir de uma lipase com atividade secundária defosfolipase. Em outro aspecto, a atividade enzimática da fosfolipase éfornecida por uma enzima tendo essencilamente apenas atividade defosfolipase e em que a atividade enzimática da fosfolipase não é umaatividade secundária.

A fosfolipase pode ser de qualquer origem, por exemplo, deorigem animal (por exemplo, mamífero, por exemplo, pâncreas bovino ouporcino) ou veneno de cobra ou veneno de abelha. Alternativamente, afosfolipase pode ser de origem microbiana, por exemplo, de fungosfilamentosos, levedura ou bacteriana, tal como Aspergillus, por exemplo, A.awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. niger ou A. oryzae, Dictyostelium, porexemplo, D. discoideum; Fusarium, por exemplo, F. culmorum, F.graminearum, F. heterosporum, F. solani, F. oxisporum ou F. venenatum;Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo ou M. subtilissimus;Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus;Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus ou R. stolonifer; Sclerotinia,por exemplo, S. libertiana; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum;Whetzelinia, por exemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B.megaterium ou S. subtilis; Citrobacter, por exemplo, C. freundii;Enterobacter, por exemplo, E. aerogenes ou E. cloacae; Edwardsiella, E.tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli;Klebsiella, por exemplo, K. pneumoniae; Proteus, por exemplo, P. vulgaris;Providencia, por exemplo, P. stuartii; Salmonella, por exemplo, S.typhimurium; Serratia, por exemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella,por exemplo, S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. violeceoruber; ouYersinia, por exemplo, Y. enterocolitica.

As fosfolipases comerciais preferidas incluem LECITASE™ eLECITASE™ ULTRA (disponível de Novozymes A/S, Denmark).

Uma quantidade eficaz de fosfolipase é de cerca de 0,01 acerca de 400 LU/g DS, preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 100 LU/gDS e mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 50 LU/g DS. Aotimização adicional da quantidade de fosfolipase pode ser a seguir obtidausando procedimentos padrão conhecidos na técnica.

Proteases

Em um outro aspecto preferido da invenção, pelo menos umtensoativo e pelo menos uma enzima feradora de carboidrato é usado nacombinação com pelo menos uma protease. A protease pode ser usada, porexemplo, para digerir a proteína para produzir amino nitrogênio livre (FAN).Tal função de aminoácidos livres como nutrientes para a levedura, destemodo, intensificando o desenvolvimento da levedura e, conseqüentemente, aprodução de etanol.

O microorganismo de fermentação para o uso em um processode fermentação pode ser produzido pela propagação de microorganismo defermentação na presença de pelo menos uma protease. Embora não limitado aqualquer teoria de operação, acredita-se que a propagação do microorganismode fermentação com uma quantidade eficaz de pelo menos uma proteasereduza a defasagem de tempo do microorganismo de fermentação quando omicroorganismo de fermentação é subseqüentemente usado em um processode fermentação como em comparação com um microorganismo defermentação que foi propagado sob as mesmas condições sem a adição deprotease. Acredita-se que a ação da protease no processo de propagaçãoresulte direta ou indiretamente na supressão ou expressão de genes que sãonocivos ou benéficos, respectivamente, à microorganismo de fermentaçãodurante a fermentação, deste modo, diminuindo a defasagem de tempo eresultando em um ciclo de fermentação mais rápido.

As proteases são bem conhecidas na técnica e referem-se aenzimas que catalisam a clivagem de ligação de peptídeo. As proteasesadequadas incluem proteases füngicas e bacterinas. As proteases preferidassão proteases ácidas, isto é, proteases caracterizada pela capacidade parahidrolisar proteínas sob condições ácidas de pH abaixo de 7. As proteasesfungicas ácidas adequadas incluem proteases fungicas derivadas deAspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra,Irpex, Penicillium, Sclerotium e Torulopsis. São especialmente consideradasas proteases derivadas de Aspergillus niger (ver, por exemplo, Koaze et ai.,1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus saitoi (ver, por exemplo,Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soe. Japan 28: 66), Aspergillus awamori(Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42: 927-933, Aspergillusaculeatus (WO 95/02044) ou Aspergillus oryzae; e proteases ácidas a partir deMucor pusillus ou Mucor miehei. As proteases bacterinas, que não sãoproteases ácidas, incluem os produtos comercialmente disponíveis deALCALASE™ e NEUTRASE™ (disponível de Novozymes A/S). Outrasproteases incluem GC106 de Genencor International, Inc., USA eNOVOZYM™ 50006 de Novozymes A/S.

Preferivelmente, a protease é uma protease de ácido aspártico,como descrito, por exemplo, em Handbook of Proteolytic Enzymes, Editedpor A.J. Barrett, N. D. Rawlings e J. F. Woessner, Academic Press, SanDiego, 1998, Capítulo 270). Os exemplos adequados de protease de ácidoaspártico incluem, por exemplo, aqueles divulgados por Berka et al., 1990,Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene 125: 195-198; e Gomi et al., 1993,Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1095-1100.Peroxidases

Outros compostos que possuem atividade de peroxidase podeser qualquer peroxidase (EC 1,11,1.7) ou qualquer fragmento tendo atividadede peroxidase derivada deste, que apresenta atividade de peroxidase.

Preferivelmente, a peroxidase é produzida pelas plantas (porexemplo, peroxidase de rábano silvestre ou soja) ou microorganismos, taiscomo fungos ou bactérias.Alguns fungos preferidos incluem cepas que pertencem àsubdivisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, por exemplo, Fusarium,Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces,Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium ou Dreschlera, emparticular, Fusarium oxisporum (DSM 2672), Humicola insolens,Trichoderma reesei, Myrothecium verrucaria (IFO 6113), Verticillumalboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754),Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia alii ou Dreschlerahalodes.

Outros fungos preferidos incluem cepas que pertencem àsubdivisão Basidiomycotina, classe Basidiomycetes, por exemplo, Coprinus,Phanerochaete, Coriolus ou Trametes, em particular Coprinus cinereus f.microsporus (IFO 8371 ), Coprinus macrorhizus, Phanerochaetechrysosporium (por exemplo NA-12) ou Trametes (previamente denominadoPoliporus), por exemplo, T. versicolor (por exemplo, PR4 28-A).

Outros fungos preferidos incluem cepas que pertencem àsubdivisão Zygomycotina, classe Mycoraceae, por exemplo, Rhizopus ouMucor, em particular Mucor hiemalis.

Algumas bactérias preferidas incluem cepas da ordemActinomycetales, por exemplo, Streptomyces spheroides (ATTC 23965),Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12382) ou Streptoverticillum verticilliumssp. verticillium.

Outras bactérias preferidas incluem Rhodobacter sphaeroides,Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC15958), Pseudomonas fluorescens (NRRL B-Il ) e Bacillus strains, porexemplo, Bacillus pumilus (ATCC 12905) e Bacillus stearothermophilus.

Outras bactérias preferidas incluem cepas que pertencem aoMyxococcus, por exemplo, M. virescens.

A peroxidase também podem ser uma que é produzida por ummétodo que compreende cultivar uma célula hospedeira transformada com umvetor de DNA recombinante que carrega uma seqüência de DNA que codificaa peroxidase assim como as seqüências de DNA para a expressão daseqüência de DNA que codifica the peroxidase, em um meio de cultura sobcondições que permitem a expressão da peroxidase e a recuperação daperoxidase da cultura.

Em um aspecto preferido, uma peroxidase recombinantementeproduzida peroxidase é uma peroxidase derivada de um Coprinus sp., emparticular C. macrorhizus ou C. cinereus de acordo com WO 92/16634.

Na presente invenção, os compostos que possuem atividade deperoxidase compreendem enzimas de peroxidase e fragmentos ativos deperoxidase derivados de citocromos, hemoglobina ou enzimas de peroxidase.

Uma unidade de peroxidase (POXU) é a quantidade de enzimaque sob as seguintes condições catalisa a conversão de 1 μιηοΐ de peróxido dehidrogênio por minuto a 30° C em 0,1 M de tampão de fosfato pH 7,0, 0,88mM de peróxido de hidrogênio e 1,67 mM de 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfonato) (ABTS). A reação é seguida por 60 segundos(15 segundos após a mistura pela mudança na absorbância de 418 nm, quedeve estar em uma faixa de 0,15 a 0,30. Para o cálculo da atividade, umcoeficiente de absorção de ABTS oxidado de 36 mM-1 cm-1 e umaestequiometria de um μπιοί de H2O2 convertido por dois μηιοί de ABTSoxidado são usados.

Lacases

Na presente invenção, as lacases e as enzimas relacionadascom lacase compreendem qualquer enzima de lacase classificada como EC1,10,3,2, qualquer enzima de catecol oxidase classificada como EC 1,10,3,1,qualquer enzima de bilirubina oxidase classificada como EC 1,3,3,5 ouqualquer enzima de monofenol monooxigenase classificada como EC1,14,18,1.As enzimas mencionadas acima podem ser microbianas, isto é,obtidas de bactérias ou fungos (incluindo fungos filamentosos ou leveduras)ou estes podem ser derivados de plantas.

Os exemplos adequados de fungos incluem uma lacase obtidaa partir de uma cepa de Aspergillus, Neurospora, por exemplo, N. crassa,Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, porexemplo, T. villosa e T. versicolor, Rhizooctonia, por exemplo, R. solani,Coprinus, por exemplo, C. cinereus, C. comatus, C. Jfriesii e C. plicatilis,Psathyrella, por exemplo, P. condelleana, Panaeolus, por exemplo, P.papilionaceus, Myceliophthora, por exemplo, M. thermophila, Schytalidium,por exemplo, S. thermophilum, Poliporus, por exemplo, P. pinsitus,Pycnoporus, por exemplo, P. cinnabarinus, Phlebia, por exemplo, P. radita(WO 92/01046) ou Coriolus, por exemplo, C. hirsutus (JP 2-238885).

Os exemplos adequados de bactérias incluem uma lacaseobtida a partir de uma cepa de Bacillus.

Uma lacase obtida de Coprinus, Myceliophthora, Poliporus,Pycnoporus, Scytalidium ou Rhizoctonia é preferida; em particular um lacaseobtida de Coprinus cinereus, Myceliophthora thermophila, Poliporus pinsitus,Pycnoporus cinnabarinus, Scytalidium thermophilum ou Rhizoctonia solani.

As lacases comercialmente disponíveis são NS51001 (umPoliporus pinsitius laccase, disponível da Novozymes A/S, Denmark) eNS51002 (um Myceliopthora thermophila laccase, disponível da NovozymesA/S, Denmark).

A lacase ou a enzima relacionada com a lacase também podeser uma que é produzida por um método que compreende cultivar uma célulahospedeira transformada com um vetor de DNA recombinante que carregauma seqüência de DNA que codifica a lacase assim como seqüências de DNApara a expressão da seqüência de DNA que codifica a lacase, em um meio decultura sob condições que permitem a expressão da enzima lacase enzima e arecuperação da lacase da cultura.

A atividade de lacase (LACU) é determinada a partir daoxidação de siringaldazina sob condições aeróbicas em pH 5,5. A cor violetaproduzida é medida em 530 nm. As condições analíticas são 19 mM desiringaldazina, 23 mM de tampão de acetato, pH 5,5, 30° C, tempo de reaçãode 1 minuto. Uma unidade de lacase (LACU) é a quantidade de enzima quecatalisa a conversão de 1,0 μιηοΐ de siringaldazina por minuto sob ascondições acima.

A atividade de lacase (LAMU) é determinada a partir daoxidação de siringaldazina sob condições aeróbicas em pH 7,5. A cor violetaproduzida é submetida à fotometria em 530 nm. As condições analíticas são19 mM de siringaldazina, 23 mM de Tris/maleato pH 7,5, 30° C, tempo dereação de 1 minuto. Uma unidade de lacase (LAMU) é a quantidade deenzima que catalisa a conversão de 1,0 [imole de siringaldazina por minutosob as condições acima.

Os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica podemser usados em conjunção com as enzimas e/ou proteínas celulolíticasobservadas acima para ainda degradar o componente de celulose do substratode biomassa, (ver, por exemplo, Brigham et al., 1995, in Handbook onBioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp, 119-141, Tailor & Francis,Washington D. C; Lee, 1997, Journal of Biotechnology 56: 1-24).

As quantidades ótimas de um polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica e de proteínas celulolíticas depende de diversos fatoresque inclui mas não limita-se à mistura de componentes de proteínascelulolíticas, o substrato celulósico, a concentração de substrato celulósico, ospré tratamentos do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH e inclusão deorganismo de fermentação (por exemplo, levedura para a sacarificação efermentação simultâneas).

Em um aspecto preferido, uma quantidade eficaz depolipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica ao material celulósico éde cerca de 0,01 a cerca de 2,0 mg, preferivelmente de cerca de 0,025 a cercade 1,5 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, maispreferivelmente de cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmentede cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de0,15 a cerca de 1,25 mg e mais preferivelmente de cerca de 0,25 a cerca de1,0 mg por g de material celulósico.

Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficaz deproteínas celulolíticas para o material celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente decerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 15 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e maispreferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

Em um aspecto preferido, uma quantidade eficaz depolipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica para as proteínascelulolíticas é de cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente de cerca de0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente de cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g,mais preferivelmente de cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmentede cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,1 acerca de 0,5 g e mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por gde proteínas celulolíticas.

Composições Detergentes

Os polipeptídeos tendo atividade realçadora celulolítica podemser adicionados a e deste modo tornar-se um componente de uma composiçãodetergente.

A composição detergente da presente invenção pode serformulada, por exemplo, como um composição detergente manual ou demáquina de lavar incluindo um composição aditiva de lavanderia para o pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecidoadicionada ao enxágüe ou ser formulada como uma composição detergentepara o uso em operações de limpeza de superfícies duras domésticas no geralou ser formulada para operações manuais ou em máquina de lavar pratos.

Em um aspecto específico, a presente invenção fornece umaditivo detergente que compreende um polipeptídeo tendo atividaderealçadora celulolítica como descrita aqui. O aditivo detergente assim como acomposição detergente podem compreender uma ou mais enzimas, tal comouma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carboidrase, celulase, pectinase,mananoase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, umalacase e/ou peroxidase.

No geral, as propriedades das enzimas selecionadas devem sercompatíveis com o detergente selecionado, (isto é, compatibilidade de pHótima com outros ingredientes enzimáticos ou não enzimáticos, etc.) e asenzimas devem estar presentes em quantidade eficazes.

Celulases: As celulases adequadas incluem aquelas de origembacteriana ou fungica. Os mutantes projetados quimicamente modificados oude proteína estão incluídos. As celulases adequadas incluem celulases dogênero Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium,por exemplo, as celulases fungicas produzidas a partir de Humicola insolens,Myceliophthora thermophila e Fusarium oxisporum divulgados na Patente U.S. N0 4.435.307, Patente U. S. N0 5.648.263, Patente U. S. N0 5,691,178,Patente U. S. N0 5.776.757 e WO 89/09259.

As celulases especialmente adequadas são as celulasesalcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidado com a cor. Os exemplos detais celulases são celulases descritas em EP O 495 257, EP O 531 372, WO96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outro exemplos são celulasevariantes, tais como aquelas descrita em WO 94/07998, EP 0 531 315, PatenteU. S. N0 5.457.046, Patente U. S. N0 5.686.593, Patente U. S. N0 5.763.254,WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

As celulases comercialmente disponíveis incluemCelluzyme™ e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ e Puradax HA™(Genencor International Inc.) e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Proteases: As proteases adequadas incluem aquelas de origemanimal, vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferida. Mutantesprojetados quimicamente modificados ou de proteína estão incluídos. Aprotease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease,preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma proteasesemelhante à tripsina. Os exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas,especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo,subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168(descrita mo WO 89/06279). Os exemplos de proteases semelhantes à tripsinasão atripsin (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e a protease deFusarium descrita no WO 89/06270 e WO 94/25583.

Os exemplos de proteases útil são as variantes descritas noWO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946, especialmenteas variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27,36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235e 274.

As enzimas de protease comercialmente disponíveis preferidasincluem Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™ eKannase™ (Novozymes A/S), Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™,Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™ e FN3™ (GenencorInternational Inc.).

Lipases: As lipases adequadas incluem aquelas de origembacteriana ou fungica. Os mutantes projetados quimicamente modificados oude proteína estão incluídos. Os exemplos de lipases úteis incluem lipases deHumicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. Ianuginosa (T.lanuginosus) como descrito no EP 258 068 e EP 305 216 ou de H. insolenscomo descrito em WO 96/13580, uma Pseudomonas lipase, por exemplo, deP. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376),P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705(WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), umBacillus lipase, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et ai., 1993, Biochemicaet Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ouS. pumilus (WO 91/16422).

Outro exemplos são lipase variantes, tais como aquelesdescritos em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

As enzimas de lipase comercialmente disponíveis preferidasincluem Lipolase™, Lipex™ e Lipolase Ultra™ (Novozymes A/S).

Amilases: As amilases adequadas (alfa e/ou beta) incluemaquelas de origem bacteriana ou fungica. Os mutantes projetadosquimicamente modificados ou de proteína estão incluídos. As amilasesincluem, por exemplo, α-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepaespecial de Bacillus licheniformis, descritos em mais detalhes no GB1.296.839. os exemplos de amilases úteis são as variantes descritas no WO94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 e WO 97/43424, especialmente asvariantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23,105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243,264, 304, 305, 391, 408 e 444.

As amilases comercialmente disponíveis são Duramil™,Termamil™, Fungamil™ e ΒΑΝ™ (Novozymes A/S) e Rapidase™ ePurastar™ (da Genencor International Inc.).

Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases adequadasincluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fungica. Os mutantesprojetados quimicamente modificados ou de proteína estão incluídos. Osexemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, porexemplo, de C. cinereus e variantes destes como aqueles descritos em WO93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

As peroxidases comercialmente disponíveis incluemGuardzyme™ (Novozymes A/S).

As enzimas detergentes podem estar incluídas em umcomposição detergente pela adição de aditivos separados contendo uma oumais enzimas ou pela adição de um aditivo combinado que compreende todasestas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é, um aditivo separadoou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como umgranulado, líquido, pasta, etc. As formulações aditivas detergentes preferidassão granulados, em particular, granulados que não em pó, líquidos, emparticular líquidos ou pastas estabilizados.

Os granulados que não em pó podem ser produzidos, porexemplo, como divulgado na Patente U. S. N0 4.106.991 e 4.661.452 e podemser opcionalmente revestidos pelos métodos conhecidos na técnica. Osexemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido deetileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos moleculares médios de 1000 a20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno;álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos decarbono e em que existem de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcooisgraxos; ácidos graxos e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Osexemplos de materiais de revestimento que formam película adequados para aaplicação de técnicas de leito de fluido são dados no GB 1483591. Aspreparações de enzimas líquidas podem ser, por exemplo, estabilizadas paraadicionar um poliol tal como, propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar,ácido láctico ou ácido bórico de acordo com os métodos estabelecidos. Asenzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgadono EP 238.216.

Uma composição detergente da presente invenção pode estarem qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó,um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode seraquoso, tipicamente contendo até 70 % de água e de 0 a 30 % de solventeorgânico ou não aquoso.

A composição detergente compreende um ou mais tensoativos,que podem ser não iônicos, incluindo semi-polar e/ou aniônico e/ou catiônicoe/ou zwitteriônico. Os tensoativos estão tipicamente presentes em um nível de0,1 % a 60 % em peso.

Quando incluídos neste o detergente usualmente conterá decerca de 1 % a cerca de 40 % de um tensoativo aniônico, tal comoalquilbenzenosulfonato linear, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquila (sulfatode álcool graxo), álcool etoxisulfato, alcanossulfonato secundário, éstermetílico do ácido graxo alfa-sulfo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico ousabão.

Quando incluído neste, o detergente conterá usualmente decerca de 0,2 % a cerca de 40 % de um tensoativo não ônico, tal comoetoxilado alcoólico, etoxilado de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo,alquildimetilaminoóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado,monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo de poliidróxi alquilaou derivados de N-acil N-alquila de glucosamina ("glucamidas").

O detergente pode conter de 0 a 65 % de um formadordetergente ou agente de complexação, tal como zeólito, difosfato, trifosfato,fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácidoetilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminapentaacético, ácido alquil-ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis em ácido ou silicatos em camadas (porexemplo, SKS-6 da Hoechst).

O detergente podem compreender um ou mais polímeros. Osexemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli (etilenoglicol), poli(álcool polivinílico), poli(vinilpiridino-N-óxido),poli(vinilimidazol), policarboxilatos, tais como poliacrilatos, copolímeros deácido maleico/acrílico e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema um sistema alvejante quepodem compreender uma fonte de H2O2, tal como perborato ou percarbonatoque podem ser combinados com um ativador de branqueamento formador deperácido, tal como tetraacetiletilenodiamina ounonanoiloxibenzenossulfonato. Alternativamente, o sistema alvejante podemcompreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona.

As enzimas da composição detergente da invenção podem serestabilizadas usando-se agentes estabilizadores convencionais, por exemplo,um poliol, tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool deaçúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, porexemplo, um borato éster aromático ou um derivado de ácido fenil borônico,tal como ácido 4-formilfenil borônico e a composição pode ser formuladacomo descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientes dedetergente convencionais, tais como, por exemplo, condicionadores de tecidoincluindo argilas, intensificadores de espuma, supressores de espuma, agentesanti-corrosão, agentes de suspensão de manchas, agentes anti-redeposição demancha, pigmentos, bactericidas, abrilhantadores óticos, hidrotropos,inibidores de mancha ou perfumes.

Nas composições detergentes, qualquer enzima pode seradicionada em uma quantidade correspondente à 0,01 a 100 mg de proteína deenzima por litro de licor de lavagem, preferivelmente 0,05 a 5 mg de proteínade enzima por litro de licor de lavagem, em particular de 0,1 a 1 mg deproteína de enzima por litro de licor de lavagem.

Nas composições de detergente, um polipeptídeo tendoatividade realçadora celulolítica pode ser adicionado em uma quantidadecorrespondente de 0,001 a 100 mg de proteína, preferivelmente de 0,005 a 50mg de proteína, mais preferivelmente 0,01 a 25 mg de proteína, ainda maispreferivelmente de 0,05 a 10 mg de proteína, mais preferivelmente de 0,05 a 5mg de proteína e ainda mais preferivelmente 0,01 a 1 mg de proteína por litrode licor de lavagem.

Um polipeptídeo da invenção tendo atividade realçadoracelulolítica também podem ser incorporada nas formulações de detergentedivulgadas no WO 97/07202, que é incorporado neste por referência.

A presente invenção ainda é descrita pelos seguintes exemplosque não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos

Materiais

Produtos químicos usados como tampões e substratos foramprodutos comerciais pelo menos do grau de reagente.

Cepas

Trichoderma reesei RutC30 (ATCC 56765; Montenecourt eEveleigh, 1979, Adv. Chem. Ser. 181: 289-301 ) foi usada como a fonte degene de Trichoderma reesei que codifica um polipeptídeo da Família 61 tendoatividade realçadora celulolítica. A cepa Aspergillus oryzae JaL250 (WO99/61651) foi usada para a expressão do polipeptídeo da Família 61 deTrichoderm reesei tendo atividade realçadora celulolítica.

Meio

As placas de PDA foram compostas por litro, de 39 gramas deágar de dextrose de batata. O meio MDU2BP foi composto, por litro, de 45 gde maltose, 1 g de

MgS04.7H20, 1 g de NaCl, 2 g de K2SO4, 12 g de KH2PO4, 7g de extrato de levedura, 2 g de uréia e 0,5 ml de solução de metais de traçoAMG, pH a 5,0.A solução de metais de traço AMG foi composta por litro de14,3 g de ZnS04.7H20, 2,5 g de CuS04.5H20, 0,5 g de NiCl2-6H20, 13,8 gde FeS04.7H20, 8,5 g de MnSO4 H2O e 3 g de ácido cítrico.

As placas LB foram compostas, por litro, de 10 g de triptona, 5g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio e 15 g de Bacto Agar.

O meio SOC foi composto de 2 % de triptona, 0,5 % de extratode levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2 e 10 mM deMgSO4 e glicose esterilizada no filtro a 20 mM adicionado depois desubmeter à autoclave.

Exemplo 1: Fermentação e tecido micelial

A cepa Trichoderma reesei RutC30 foi cultivada em umtanque de fermentação der escala piloto no meio de desenvolvimentocontendo uma fonte de carbono complexa. As fontes de carbono incluíramglicose, celulose ou forragem de milho pré-tratada e lavada. O micéliofungico foi coletado a partir de uma amostra de um litro e imediatamentecongelada em N2 líquido e armazenada a -80° C.

A forragem de milho pré-tratada (PCS) foi obtida do U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL). Ossólidos insolúveis em água EM PCS são 56,5 % de celulose, 4,6 % de hemi-celulose e 28,4 % de lignina. As condições de pré tratamento condições foramforragem de milho, 1,4 % (peso/vol) de ácido sulfurico 165° C, 107 psi (0,74MPa), por 8 minutos. Antes do ensaio, o PCS foi lavado com um volumegrande de água destilada deionizada em um filtro de vidro. O PCS foi entãotriturado usando-se um triturador de café para reduzir o tamanho de partículae ainda lavado com água em um filtro de 22 μηι Millipore (6P ExpressMembrane, Stericup, Millipore, Billerica, MA). O PCS lavado foi recolocadoem suspensão em água deionizada para a fabricação de uma suspensão de 20mg/ml e armazenado a 4o C.

Exemplo 2: Construção de biblioteca de cDNA direcional de Trichodermareesei

O RNA total foi preparado a partir das amostras miceliais deTrichoderma reesei mycelial descritas no Exemplo 1 pela extração comtiocianato de guanidínio seguido pela ultracentrifugação através de umaalmofada de 5,7 M de CsCl (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294-5299) usando-se as seguintes modificações. Os micélios congelados foramtriturados em N2 líquido a um pó fino com um mortar e um pilão, seguidopela trituração com um triturador de café pré-esfriado e imediatamentecolocado em suspensão em 5 volumes de tampão de extração de RNA (4 Mde tiocianato de guanidínio, 0,5 % de laurilsarcosina sódica, 25 mM de citratode sódio pH 7,0, 0,1 M β-mercaptoetanol). A mistura foi agitada por 30minutos em temperatura ambiente e centrifugado (20 minutos a 12.000 χ g)para granular os escombros celulares. O sobrenadante foi coletado,cuidadosamente estratificado em uma almofada de 5,7 M de CsCl (5,7 M deCsCl, 10 mM de EDTA, pH 7,5, 0,1 % de dietilpirocarbonato (DEPC);submetido à autoclave antes do uso) usar 26,5 ml de sobrenadante por 12,0 mlde almofada de CsCl e centrifugada para obter o RNA total RNA (rotorBeckman SW 28, 25,000 rpm, temperatura ambiente, 24 horas). Depois dacentrifugação, o sobrenadante foi cuidadosamente removido e a parte inferiordo tubo contendo o grânulo de RNA foi cortado e enxaguado com 70 % deetanol. O grânulo de RNA total foi transferido a um tubo de Eppendorf,colocado em suspensão em 500 μΐ de TE (10 mM de Tris-0,1 mM de EDTA),pH 7,6 (se difícil, aquecido ocasionalmente por 5 minutos a 65° C), fenolextraído e precipitado com etanol por 12 horas a -20° C (2,5 volumes deetanol, 0,1 volume de 3M de acetato de sódio pH 5,2). O RNA foi coletadopor centrifugação (30 minutos a 12.000 χ g), lavado em 70 % de etanol erecolocado em suspensão em um volume mínimo de água tratada com DEPC.A concentração de RNA total foi determinada medindo-se a absorbância em260 nm.O Poli(A)+ RNA foi isolado pela cromatografia de afinidadede oligo(dT)-celulose (Aviv & Leder, 1972, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 69: 1408-1412). Um total de 0,2 g de oligo(dT)celulose (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) foi pré- dilatado em 10 mlde 1 X de tampão de carregamento de coluna (20 mM de Tris-Cl, pH 7,6, 0,5M de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1 % de SDS), carregado em uma coluna deplástico tamponada tratada com DEPC (Poli Prep Chromatography Column,BioRad, Hercules, CA) e equilibrada com 20 ml de IX de tampão decarregamento. O RNA total (1 a 2 mg) foi aquecido a 65° C por 8 minutos,resfriado bruscamente em gelo por 5 minutos e depois adição de 1 volume de2X de tampão de carregamento de coluna carregado na coluna. O eluato foicoletado e recarregado de 2 a 3 vezes pelo aquecimento da amostra comoacima e resfriamento brusco em gelo antes de atingir o carregamento. Acoluna de oligo(dT) foi lavada com 10 volumes de IX de tampão decarregamento, depois com 3 volumes de tampão de tampão de sal de meio (20mM de Tris-Cl, pH 7,6, 0,1 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1 % de SDS),seguido pela eluição do poli(A)+ RNA com 3 volumes de tampão de eluição(10 mM de Tris-Cl pH 7,6, 1 mM de EDTA, 0,05 % de SDS) pré-aquecida a65° C, pela coleta de 500 μΐ de frações. Absorbância em 260 nm foi lida paracada fração coletada e as frações contendo mRNA foram unidas e etanolprecipitado a -20° C por 12 horas. O poli(A)+ RNA foi coletado porcentrifiigação, recolocado em suspensçao em água tratada com DEPC earmazenado em alíquotas de 5 a 10 μg a -80° C.

O cDNA Eco RI-Not 1-direcional de filamento duplo foisintetizado a partir de 5 μg de Trichoderma reesei RutC30 poli(A)+ RNA bypelo método de RNase H (Gubler e Hoffinan 1983, Gene 25: 263-270;Sambrook et ai., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) usando-se umamodificação de grampo de cabelo. O poli(A)+ RNA (5 μg em 5 μΐ de águatratada com DEPC) foi aquecida a 70° C por 8 minutos em um tubo deEppendorf isento de RNase pré-siliconizado, resfriado bruscamente em gelo ecombinado em um volume final de 50 μΐ com o tampão de transcriptasereversa (50 mM de Tris-Cl pH 8,3, 75 mM de KCl5 3 mM de MgCl2, 10 mMde DTT) contendo 1 mM de dATP, dGTP e dTTP, 0,5 mM de 5-metil-dCTP,40 unidades de inibidor da ribonulease de placenta humana (Promega,Madison, Wl), 4,81 μg de iniciador oligo(dT)I8-TVoi 1 e 1000 unidades detranscriptase reversa Superscript II RNase H (Life Technologies, Inc.,Rockville, MD). O cDNA do primeiro filamento foi sintetizado pelaincubação da mistura de reação a 45° C por 1 hora. Após a síntese, a misturahíbrida de mRNAicDNA foi gel filtrada em gel através de uma coluna derotação MicroSpin S-400 HR (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) deacordo com as instruções do fabricante.

Após a filtração em gel, os híbridos foram diluídos em 250 μΐde tampão do segundo filamento (20 mM de Tris-Cl pH 7.4, 90 mM de KCl,4,6 mM MgCl2, 10 mM de (NH4)2SO4, 0,16 mM de NAD+) contendo 200 μΜde cada dNTP, 60 unidades de polimerase I de DNA de E. coli (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ), 5,25 unidades de RNase H e 15 unidades deligase de DNA de E. coli (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Asíntese de cDNA do segundo filamento foi realizada pela incubação do tubode reação a 16° C por 2 horas e um adicional de 15 minutos a 25° C. A reaçãofoi interrompida pela adição de EDTA à concentração final de 20 mMseguido por extrações de clorofórmio e fenol.

O cDNA de filamento duplo foi precipitado em etanol a -20° Cpor 12 horas pela adição de 2 volumes de 96 % de etanol e 0,2 volume de 10M de acetato de amônio, recuperado por centrifugação, lavado em 70 % deetanol, secado (SpeedVac) e recolocado em suspensão em 30 μΐ de tampão denuclease de feijão de Mung (30 mM de acetato de sódio pH 4,6, 300 mM deNaCl, 1 mM de ZnSO4, 0,35 mM de ditiotreitol, 2 % de glicerol) contendo 25unidades de nuclease de feijão de Mung. O DNA grampo de cabelo defilamento simples foi preso pela incubação da reação a 30° C por 30 minutos,seguido pela adição de 70 μΐ de 10 mM de Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM de EDTA,extração de fenol e precipitação de etanol com 2 volumes de 96 % de etanol e0,1 volume de 3 M de acetato de sódio pH 5,2 em gelo por 30 minutos.

Os cDNAs de filamento duplo foram recuperados porcentrifugação (30.000 χ g por 30 minutos) e finalizado abruptamente com T4DNA polimerase em 30 μΐ de tampão de T4 DNA polimerase (20 mM deTris-acetato, pH 7,9, 10 mM de acetato de magnésio, 50 mM de acetato depotássio, 1 mM de ditiotreitol) contendo 0,5 mM de cada dNTP e 5 unidadesde T4 DNA polimerase pela incubação da mistura de reação a 16° C por 1hora. A reação foi interrompida pela adição de EDTA a 20 mM deconcentração final, seguido por extrações de fenol e clorofórmio e etanolprecipitação por 12 horas a -20° C pela adição de 2 volumes de 96 % deetanol e 0,1 volume de 3 M de acetato de sódio pH 5,2.

Depois da reação de substituta, o cDNA foi recuperado porcentrifugação como acima, lavado em 70 % etanol e o grânulo de DNA foisecado em um SpeedVac. O grânulo de cDNA foi recolocado em suspensãoem 25 μl de tampão de ligação (30 mM de Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2,10 mM de ditiotreitol, 0,5 mM ATP) contendo 2 μg de adaptadores Eco Rl(0,2 μg/μl, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e 20 unidades de T4ligase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) pela incubação damistura de reação a 16° C por 12 horas. A reação foi interrompida peloaquecimento a 65° C por 20 minutos e depois colocada em gelo por 5minutos. O cDNA adaptado foi digerido com Not I pela adição de 20 μΐ deágua submetida à autoclave, 5 μΐ de 10X de tampão de enzima de restriçãoNot I e 50 unidades de Not I, seguido pela incubação por 3 horas a 37° C. Areação foi interrompida pelo aquecimento da amostra a 65° C por 15 minutos.Os cDNAs foram fracionados por tamanho pela eletroforese em gel deagarose em uma 0,8 % de gel de agarose de baixo ponto de fusão SeaPlaqueGTG (FMC, Rockland, ME) em 44 mM de Tris Base, 44 mM de ácido bórico,0,5 mM de tampão de EDTA (TBE) (em água submetida à autoclave) para aseparação de adaptadores não ligados e cDNAs pequenos. O gel foi utilizadopor 12 horas em 15 V e o cDNA foi selecionado por tamanho com um corteem 0.7 kb cortando-se a parte inferior do gel de agarose gel. Depois, um gelde agarose a 1,5 % foi vertido no gel contendo cDNA e os cDNAs defilamento duplo foram concentrados utilizando-se o gel de modo inverso atéeste aparecer como uma banda comprimida no gel. O pedaço de gel contendocDNA foi cortado a partir do gel e o cDNA foi extraído do gel usando-se umKit de Purificação de Faixa de Gel GFX (Amersham, Arlington Heights, IL)como segue. A fatia de gel adaptada foi pesada em um tubo demicrocentrífuga isento de nuclease de 2 ml (ISC BioExpress, Kaysville, UT).

Depois 10 ml de Tampão de captura (Amersham, Arlington Heights, IL) foiadicionado para cada 10 ml de fatia de gel. A fatia de gel foi dissolvida porincubação a 60° C por 10 minutos, até a agarose ser completamentesolubilizada e a amostra foi então granulada pela centrifugação breve (2minutos a 8.000 χ g). a amostra fundida foi transferida a uma coluna derotação GFX colocada em um tubo de coleta, incubado a 25° C por 1 minutoe depois centrifugado em velocidade total (15.000 χ g) em umamicrocentrífuga por 30 segundos. O fluxo todo foi descartado e a coluna foilavada com 500 μΐ de tampão de lavagem (GFX Kit de Purificação de Faixade Gel, Amersham, Arlington Heights, EL) seguido pela centrifugação emvelocidade total centrifugação por 30 segundos. O tubo de coleta foidescartado e a coluna foi colocada em um tubo de Eppendorf de 1,5 ml,seguido pela eluição do cDNA pela adição de 50 μΐ de TE pH 7,5 ao centro dacoluna, incubação a 25° C por 1 minuto e finalmente pela centrifugação por 1minuto em velocidade máxima (15.000 xg).0 cDNA eluído foi armazenado -20° C até a construção da biblioteca.Uma preparação de DNA de plasmídeo para um clone depYES2.0 cDNA contendo a inserção de Eco RI-Not I oi purificado usando-seum QIAGEN Tip-IOO de acordo com as instruções do fabricante (QIAGEN,Valencia, CA). Um total de 10 μg de DNA de plasmídeo purificado foidigerido até a finalização com Not I e Eco Rl em um volume total de 60 μΐpela adição de 6 μΐ de IOX NEBuffer para Eco Rl (New England Biolabs,Beverly, MA), 40 unidades de Not I e 20 unidades de Eco Rl seguido pelaincubação por 6 horas a 37° C. A reação foi interrompida pelo aquecimentoda amostra a 65° C por 20 minutos. O DNA de plasmídeo digerido foiextraído uma vez com fenol-clorofórmio, depois com clorofórmio, seguidopela precipitação de etanol por 12 horas a -20° C pela adição de 2 volumes de96 % etanol e 0,1 volume de 3 M de acetato de sódio pH 5,2. O DNAprecipitado foi colocado em suspensão foi em 25 μΐ de TE pH 7,5, carregadoem um gel de agarose SeaKem a 0,8 % em tampão de TBE e usado por 3horas a 60 V. O vetor diferido foi cortado do gel e o DNA foi extraído do gelusando-se um Kit de Purificação de Faixa de Gel GFX de acordo com asinstruções do fabricante. Depois de medir a concentração de DNA pelaabsorbância a 260 nm, o vetor eluído foi armazenado a -20° C até aconstrução da biblioteca.

Para estabelecer as condições de ligação ótimas para abiblioteca de cDNA, quatro ligações de teste foram realizadas em 10 μΐ detampão de ligação (30 mM de Tris-Cl pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM deDTT, 0,5 mM de ATP) contendo 7 μΐ de cDNA de filamento duplo (quecorresponde à aproximadamente 1/10 do volume total na amostra de cDNA),2 unidades de T4 ligase e 25 ng, 50 ng e 75 ng de vetor pYES2,0 clivado porEco RI-Not I (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectivamente. A reação deligação do controle fundamental do vetor continha 75 ng de vetor pYES2,0clivado por Eco RI-Not I sem cDNA. As reações de ligação foram realizadaspela incubação a 16° C por 12 horas, aquecido a 65° C por 20 minutos edepois 10 μl de água submetida à autoclave foi adicionado a cada tubo. Um μΐdas misturas de ligação foi submetido à eletroporação (200 W, 2,5 kV, 25 mF)a 40 μΐ de células de E. coli DH IOB eletrocompetentes (Life Technologies,Gaithersburg, MD). Após a adição de 1 ml de meio SOC (Birren et ai, 1998.Genoma Analysis, Vol. 2. Detecting Genes. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY) a cada mistura de transformação, as célulasforam desenvolvidas a 37° C por 1 hora. Após 50 μΐ e 5 μΐ de cadaeletroporação serem colocadas em placas LB suplementadas com ampicilina a100 μg por ml e desenvolvido a 37° C por 12 horas. Usando-se as condiçõesótimas, uma biblioteca de cDNA de Trichoderma reesei RutC30 contendo 1-2,5 χ 10 unidades formadoras de colônias independentes foi estabelecida noE. coli, com um fundamento de vetor de ca. 1 %. A biblioteca de cDNA foiarmazenada como (1) grupos individuais (25.000 c.f.u./grupo) em 20 % deglicerol a -80° C; (2) grânulos celulares do mesmo grupo a -20° C; (3) DNAde plasmídeo purificado por QIAGEN Tip 100 dos grupos individuais a -20°C e (4) cDNA de filamento duplo direcional a -20° C.

Exemplo 3: Preparação de padrão EST de Trichoderma reesei

Os DNAs de plasmídeo de colônias de E. coli individuais apartir de bibliotecas de cDNA descritas no Exemplo 2 foram purificadasusando-se um sistema de preparação de plasmídeo de multiplicação de 96reservatórios (QLAGEN, Valencia, CA) de acordo com instruções fornecidaspelo fabricante.

Exemplo 4: Análise dos dados da seqüência de DNA de clones de cDNA

Denominação da base, determinação do valor de qualidade e aadaptação do vetor foram realizadas com o auxílio do softwarePHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA). A análise dahomologia da seqüência das seqüências EST montadas contra o banco dedados PER. foi realizada com o programa Blastx (Altschul et. al., 1990, J. MoI.Biol. 215:403-410) on um cluster Linux de 32 nodos (Paracel, Inc., Pasadena,CA) usando-se a matriz BLOSUM 62 (Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89: 10915-10919).

Exemplo 5: Identificação de um clone de cDNA clone que codifica umpolipeptídeo da Família 61 tendo atividade realçadora celulolítica (GH61B)

Um clone de cDNA que codifica um polipeptídeo da Família61 tendo atividade realçadora celulolítica (GH61B) foi inicialmenteidentificado pela similaridade de seu produto traduzido com outrospolipeptídeos da Família 61 conhecidos presentes nos bancos de dadospúblicos. Especificamente, esta análise indicou que o polipeptídeo predito foi50 % idêntico ao nível de proteína ao domínio do núcleo de endoglicanase IVde Trichoderma reesei, um membro conhecido da Família 61 (Saloheimo etal., 1997, Eur. J. Biochem. 249: 584-591). Após esta identificação inicial, oclone de EST foi recuperado de sua placa de estoque congelada original elistado nas placas de LB suplementadas com 100 μg de ampicilina por ml. Asplacas foram incubadas durante a noite a 37° C e no dia seguinte, uma colôniasimples foi usada para a inoculação de 3 ml de LB suplementado com 100 μgde ampicilina per ml. As culturas de líquido foram incubadas durante a noite a37° C e o DNA de plasmídeo foi preparado com um BioRobot 9600(QIAGEN Inc., Valencia, CA). O DNA de plasmídeo de cada clone EST foisubmetido ao sequenciamento novamente com a química de terminador Big-Dye™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), usando-se o Ml3 anteriore um iniciador Poly-T mostrado abaixo para sequenciar seqüência aextremidade 3' do clone. 5 '-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' (SEQID N°: 3) onde V = G, A ou C e N = G, A, C ou T

Um clone, Trichoderma reesei EST Tr3337 denominadopTr3337, foi selecionado para a análise de seqüência de nucleotídeo.Exemplo 6: Caracterização de um clone de cDNA de Trichoderma reesei quecodifica um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica

Três novos iniciadores mostrados abaixo foram projetadospara estender a informação de seqüência de EST pTr3337 (Figura 2).

5'-TGTCCATGGCCGAGA-3' (SEQ ID N°: 4)

5'-ATACTGGTCACTTCCCCAA-3' (SEQ ID N°: 5)

5'-GCGCTGGGTCAAGATT-3 (SEQ ID N0: 6)

O sequenciamento de DNA foi realizado em um seqüenciadorde DNA automatizado Perkin-Elmer Biosystems Modelo 377 XL usando-se aquímica de terminador de pigmento (Giesecke et al., 1992, Journal ofVirology Methods 38: 47-60). O fragmento de cDNA de 1,17 kb foiseqüenciado em um valor de qualidade de 36. A seqüência de nucleotídeo(SEQ ID N°: 1 ) e a seqüência de aminoácido deduzida (SEQ ID N°: 2) daregião que codifica o clone de cDNA de Trichoderma reesei GH61B sãomostradas na Figura 1. A seqüência codificadora é de 750 bp incluindo ocódon de interrupção. A proteína predita codificada é de 249 aminoácidos. Aregião codificadora é de 56,8 % G+C. usando-se o programa SignalP program(Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinalizador de19 resíduos foi predito. A proteína madura predita contém 230 aminoácidoscom uma massa molecular de 25,1 kDa e ponto isoelétrico (pi) de 7,36.

A análise do peptídeo maduro com o programa lnterproscan(Zdobnov e Apweiler, 2001, Bioinformatics 17: 847-8) mostrou que o genecodificado pelo clone Tr3337 continha a assinatura da seqüência das proteínasda Família 61 de glicosil hidrolase. Esta assinatura da seqüência conhecidacomo o padrão Pfam PF03443 (Bateman et. al., 2004, Nucleic Acids Research32: 138-141) está localizado do resíduo 20 ao 241 confirmando que o cloneTr3337 codifica um gene da Família 61 de Trichoderma reseei.

Um alinhamento global em pares comparativo da seqüência deaminoácidos foi determinada usando-se o Algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no ProgramaNeedle de EMBOSS com fissura de penalidade aberta de 10, fissura depenalidade de extensão de 0,5 e a matriz EBLOSUM62. O alinhamentomostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene Trichoderma reeseique codifica o polipeptídeo maduro GH61B tendo atividade realçadoracelulolítica dividida 100 % e 62 % de identidade (excluindo-se fissuras) paraa seqüência de aminoácidos deduzida de duas proteínas de glicosil hidrolaseda família 61 de Trichoderma reesei (GeneSeP ADH34517) e Chaetomiumglobosum (UniProt Q2GPR1), respectivamente.

Uma cepa de E. coli contendo plasmídeo pTr3337 foidepositada com o Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois,61604, como NRRL B-30878, com uma data de depósito de 20 de setembrode 2005.

Exemplo 7: Construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae dogene da Família GH61B de Trichoderma reesei

Os dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos mostradosabaixo foram projetados amplificar o PCR do gene da família GH61B deTrichoderma reesei do clone de cDNA. Um Kit de clonagem InFusion (BDBiosciences, Palo Alto, CA) foi usado para clonar o fragmento diretamente novetor de expressão, pAILo2 (WO 2005/074647), sem a necessidade dedigestões de restrição e ligação.

Iniciador direto:

5'-ACTGGATTTACCATGAAGTCCTGCGCCATTCTTGC-3 (SEQID N°: 7)Iniciador reverso:

5'-AGTCACCTCTAGTTAGCCTTGCCACAGGGCTGG-3' (SEQ ID N°: 8)

Ambas as letras representam a seqüência codificadora. Aseqüência remanescente é homóloga aos locais de inserção de pAILo2.cinqüenta picomoles de cada um dos iniciadores foram usados em uma reaçãode PCR contendo 100 ng de clone de cDNA de Trichoderma reesei(preparado como descrita no Exemplo 5), IX de tampão de amplificação Pfic(Invitrogen, Carlsbad, CA), 6 μΐ de 10 mM de combinação de dATP, dTTP,dGTP e dCTP, 2,5 unidades de Platinum Pfx DNA Polimerase (Invitrogen,Carlsbad, CA), 1 μΐ de 50 mM de MgSO4 e 5 μΐ de IOX de soluçãointensificadora de pCRx (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um volume final de50 μΐ. As condições de amplificação foram um ciclo a 94° C por 2 minutos e30 ciclos cada a 94° C por 15 segundos, 55° C por 30 segundos e 68° C por 3minutos. O bloco de aquecimento foi então para um ciclo de encharcamento a4 °C.

Os produtos de reação foram isolados em um gel de agarose a1,0 % usando-se 40 mM de base de Tris-20 mM de acetato de sódio-1 mM detampão de dissódio EDTA (TAE) onde uma faixa de produto de 3 kb foiexcisado do gel e purificado usando-se um Kit de Extração de Gel QIAquick(QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento foi então clonado em pAILo2 usando-se um Kitde Clongam InFusion. O vetor foi digerido com Nco I e Pac I (usando-se ascondições especificadas pelo fabricante). O fragmento foi purificado pelaeletroforese em gel e purificação em gel QIAquick. O fragmento de gene e ovetor digerido foram combinados entre si em um reação resultante noplasmídeo de expressão pTról B (Figura 3) em que a transcrição do gene daFamília GH61B ocorreu sob o controle do promotor de NA2-tpi (um híbridodos promotores de genes para Aspergillus niger neutro alfa-amilase eAspergillus oryzae triose fosfato isomerase). A reação de recombinação (20μΐ) foi composta de IX de Tampão InFusion (BD Biosciences, Palo Alto,CA), IX de BSA (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 1 μΐ de infusão InFusion(diluído 1:10) (BD Biosciences, Palo Alto, CA), 100 ng de pAILo2 digeridocom Nco I e Pac Ie 100 ng do produto de PCR purificado de Trichodermareesei GH61B. A reação foi incubada em temperatura ambiente por 30minutos. Um μΐ da reação foi usado para transformar as células E. coli XLlOSolopac Gold (Stratagene, La JoIIa, CA). Um transformante de E. colicontendo pTrólB (gene GH61B) foi identificado pela digestão da enzima derestrição e DNA de plasmídeo foi preparado usando-se um QIAGENBioRobot 9600.

Exemplo 8: Expressão do cDNA de Trichoderma reesei que codifica ospolipeptídeos da Family GH61B tendo atividade realçadora celulolítica emAspergillus oryzae JaL250

Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 forampreparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988,Bio/Technology 6: 1419-1422. Cinco μg de pTrólB (assim como pAILo2como um controle de vetor) foi usado para a transformação de Aspergillusoryzae JaL250.

A transformação de Aspergillus oryzae JaL250 com pTrólB(gene GH61B) produziu cerca de 70 transformantes. Dez transformantesforam isolados a placas de PDA individuais.

As placas de PDA confluentes de todos os transformantesforam lavadas com 5 ml de 0,01 % de Tween 80 e inoculadas separadamenteem 25 ml de meio MDU2BP em frascos de agitação de vidro de 125 ml eincubado a 34° C, 200 rpm. Cinco dias após a incubação, 5 μΐ desobrenadante de cada cultura foram analisados usando-se 8 a 16 % de géis deTris-Glicina SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com asinstruções do fabricante. Os perfis de SDS-PAGE das culturas mostraram quediversos transformantes tiveram uma nova banda principal deaproximadamente 25 kDa.

Uma placa confluente de um transformante (desenvolvido emPDA) foi lavado com 10 ml de 0,01 % de Tween 20 e inoculado em umFembach de 2 litros contendo 500 ml de meio MDU2BP para a geração docaldo para a caracterização da enzima. O frasco foi coletado no dia 5 efiltrado usando-se 0,22 μιη de GP Express plus Membrane (Millipore,Bedford, MA).

Exemplo 9: Efeito de Trichoderma reesei GH61B na hidrólise de forragem demilho pré-tratada pelo caldo de fermentação de Trichoderma reesei queexpressa beta-glicosidase de Aspergillus oryzae

Trichoderma reesei GH61B (recombinantemente produzidoem Aspergillus oryzae como descrito no Exemplo 8) foi dessalinizado etrocado por 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 usando-se um filtro decentrífuga Centricon Plus-20 com uma membrana Biomax-5 (5000 NMWL;Millipore, Bedford, MA) antes dos experimentos de hidrólise. O cal defermentação de Trichoderma reesei isento de célula que expressa beta-glicosidase de Aspergillus oryzae, preparado como descrito no WO2005/074647, foi usado em experimentos de hidrólise sem dessalinizar outrocar o tampão.

As diluições de enzima foram preparadas antes de cadaexperimento a partir das soluções de enzima de estoque, que foramarmazenadas a -20° C.

Os açúcares de redução (RS) foram determinados usando-seum ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) (Lever, M.,1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal.Biochem. 47: 273-279), que foi modificado e adaptado a um formato demicroplaca de 96 reservatórios.

Uma alíquota de 90 μΐ da amostra diluída foi colocada em cadareservatório de uma microplaca de fundo cônico de 96 reservatórios (CorningInc., Acton, MA, Costar, policarbonato claro).

O ensaio foi iniciado pela adição de 60 μΐ de 1,25 % PHBAHem hidróxido de sódio a 2 % a cada reservatório. A placa não coberta foiaquecida em um bloco de aquecimento feito como de costume por 10 minutosa 95° C. Após a microplaca ser esfriada até a temperatura, 35 μΐ de águadeionizada foram adicionados a cada reservatório. Uma alíquota de 100 μΐ foiremovida de cada reservatório e transferido a uma placa de 96 reservatóriosde fundo plano (Corning Inc., Acton, MA, Costar, poliestireno de ligação demeio). A absorbância em 410 nm (A4j0) foi medido usando-se um SpectraMAXMicroplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O valor A4I0 foitraduzido em equivalentes de glicose usando-se uma curva padrão.

A curva padrão foi obtida com seis padrões de glicose (0,005,0,010, 0,025, 0,050, 0,075 e 0,100 mg/ml), que foram tratadas similarmente àsamostras. Os padrões de glicose foram preparados pela diluição de solução deglicose de estoque de 10 mg/ml com água deionizada.

O grau de conversão de celulose para a redução do açúcar(conversão, %) foi calculado usando-se a seguinte equação:

Conversão (o/o) = RS (mg/mi) * 100 * 162 / (Celulose (mg/m]) * 180) == RS (mg/ml) * 100 / (Celulose (mg/ml) * 1,111).

Nesta equação, RS é a concentração de açúcar de redução emsolução medida em equivalentes de glicose (mg/ml) e o fator 1,111 reflete opeso ganho na conversão de celulose à glicose.

A hidrólise de PCS triturado (1 % p/v em uma base de pesoseco) pelo caldo de fermentação de Trichoderma reesei isento de célula queexpressa Beta-glicosidase de Aspergillus oryzae foi realizada em umDeepwell Plates 96 (1,2 ml, Brinkmann, Westbury, NY) coberto comDeepwell Mats 96 (Brinkmann, Westbury, NY). Todas as reações comvolume inicial de 1 ml foram realizadas em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0com agitação intermitente a 50° C.

As reações de curso de tempo contendo o caldo defermentação de Trichoderma reesei em 2,5 mg per g de PCS foramsuplementados com Trichoderma reesei GH61B (recombinantementeproduzidos em Aspergillus oryzae como descrito aqui) em 0,625 mg por g dePCS (25 % do carregamento de proteína de celulase) e os resultados foramcomparados como caldo de Trichoderma reesei não suplementado em 2,5 e3,125 mg por g de PCS ou comparado com a proteína de Trichoderma reeseiGH61B sozinha em 2,5 mg por g de PCS.As reações de carregamento de proteína contendo o caldo defermentação de Trichoderma reesei em 2,5 mg por g de PCS foramsuplementados com proteína de Trichoderma reesei GH61B(recombinantemente expressados em Aspergillus oryzae como descrito aqui)em 0,2, 0,4, 0,6 ou 1,2 mg por g de PCS e incubado por 115 horas, osresultados foram comparados com caldo de Trichoderma reesei nãosuplementado em 2,5 e 3,5 mg por g de PCS.

As alíquotas de 20 μΐ foram removidas a partir das reações dehidrólise de PCS em pontos de tempo especificados usando-se um pipetadorde 8 canais e adicionado a 180 μΐ de uma mistura alcalina (102 mM deNa2CO3 e 58 mM de NaHCO3) em placa de filtração de 96 reservatóriosMultiscreen HV (Millipore, Bedford, MA) para terminar a reação. Asamostras foram filtradas a vácuo em uma outra microplaca de fundo redondopara a remoção do resíduo de PCS. Após a diluição apropriada, os filtradosforam analisados ao RS usando-se o ensaio de PHBAH descritos abaixo.

Os resultados abaixo como mostrados na Figura 4 indicaramque a suplementação do caldo de fermentação de Trichoderma reesei queexpressa Beta-glicosidase de Aspergillus oryzae com a proteína deTrichoderma reesei GH61B melhorou o rendimento da hidrólise em todos ospontos de tempo amostrados. A melhora foi maior do que a vista com umcarregamento de proteína igual do caldo de Trichoderma reesei sozinho. Amelhora não pode ser explicada pela hidrólise pelo polipeptídeo GH61Bsozinho com este quantificado a apenas 1,2 % em 115 horas em umcarregamento de proteína muito mais alto de 2,5 mg per g de PCS.

Os resultados mostrados na Figura 5 indicaram que aintensificação foi vista em uma faixa de carregamentos de proteína dopolipeptídeo, com intensificação máxima em um carregamento de proteína deaproximadamente 16 % do carregamento de proteína do caldo deTrichoderma reesei.Depósito de Material Biológico

O seguinte material biológico foi depositado sob os termos doBudapest Treaty with the Agricultural Research Service Patent CultureCollection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street,Peoria, Illinois, 61604 e dando-se os seguintes números de acessão:Depósito Número de Acesso Data de DepósitoCepa de E.coli NRRL B-30878 20 de setembro de 2005 pTr3337

A cepa foi depositada sob as condições que garantem que oacesso da cultura estará disponível durante a pendência deste pedido depatente a um determinado pelo Commissioner of Patents and Trademarks aser intitulado a este sob 37 C. F. R. §1,14 e 35 U. S. C. §122. O depósitorepresenta uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósitoestá disponível como requerido pelas leis de patente estrangeiras em paísesem que as contrapartes do pedido de objetivo ou sua progênie sãodepositados. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de umdepósito não constitui uma licença para praticar os objetivos da invenção emdesacreditamento dos direitos de patente garantidos por ação governamental.

A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitadaem escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, visto que estesaspectos são pretendidos como ilustrações de diversos aspectos da invenção.Quaisquer aspectos equivalentes são pretendidos estarem dentro do escopodesta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelasmostradas e descritas aqui estarão evidentes para aqueles habilitados natécnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também sãopretendidas estarem dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso deconflito, a presente divulgação incluindo controlarão.

Várias referências são citadas neste, cujas divulgações sãoincorporada por referência em sua totalidade.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes, Inc.

<120> Métodos para aumentar a degradação ou conversão de materialcelulósico

<130> 10825.204-W0

<150> 60/722,579

<151> 2006-09-30

<160> 8

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1172

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<4 00> 1 ggatctaagc cccatcgata tgaagtcctg cgccattctt gcagcccttg gctgtcttgc 60cgggagcgtt ctcggccatg gacaagtcca aaacttcacg atcaatggac aatacaatca 120gggtttcatt ctcgattact actatcagaa gcagaatact ggtcacttcc ccaacgttgc 180tggctggtac gccgaggacc tagacctggg cttcatctcc cctgaccaat acaccacgcc 240cgacattgtc tgtcacaaga acgcggcccc aggtgccatt tctgccactg cagcggccgg 300cagcaacatc gtcttccaat ggggccctgg cgtctggcct cacccctacg gtcccatcgt 360tacctacgtg gctgagtgca gcggatcgtg cacgaccgtg aacaagaaca acctgcgctg 420ggtcaagatt caggaggccg gcatcaacta taacacccaa gtctgggcgc agcaggatct 480gatcaaccag ggcaacaagt ggactgtgaa gatcccgtcg agcctcaggc ccggaaacta 540tgtcttccgc catgaacttc ttgctgccca tggtgcctct agtgcgaacg gcatgcagaa 600ctatcctcag tgcgtgaaca tcgccgtcac aggctcgggc acgaaagcgc tccctgccgg 660aactcctgca actcagctct acaagcccac tgaccctggc atcttgttca acccttacac 720aacaatcacg agctacacca tccctggccc agccctgtgg caaggctaga tccaggggta 780cggtgttggc gttcgtgaag tcggagctgt tgacaaggat atctgatgat gaacggagag 840gactgatggg cgtgactgag tgtatatatt tttgatgacc aaattgtata cgaaatccga 900acgcatggtg atcattgttt atccctgtag tatattgtct ccaggctgct aagagcccac 960cgggtgtatt acggcaacaa agtcaggaat ttgggtggca atgaacgcag gtctccatga 1020atgtatatgt gaagaggcat cggctggcat gggcattacc agatataggc cctgtgaaac 1080atatagtact tgaacgtgct actggaacgg atcataagca agtcatcaac atgtgaaaaa 1140acactacatg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1172<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

Met Lys Ser Cys Ala Ile Leu Ala Ala Leu Gly Cys Leu Ala Gly Ser15 10 15

Val Leu Gly His Gly Gln Val Gln Asn Phe Thr Ile Asn Gly Gln Tyr20 25 30

Asn Gln Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr Tyr Gln Lys Gln Asn Thr Gly35 40 45

His Phe Pro Asn Val Ala Gly Trp Tyr Ala Glu Asp Leu Asp Leu Gly50 55 60

Phe Ile Ser Pro Asp Gln Tyr Thr Thr Pro Asp Ile Val Cys His Lys65 70 75 80

Asn Ala Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ser Asn85 90 95

Ile Val Phe Gln Trp Gly Pro Gly Val Trp Pro His Pro Tyr Gly Pro100 105 110

Ile Val Thr Tyr Val Val Glu Cys Ser Gly Ser Cys Thr Thr Val Asn115 120 125

Lys Asn Asn Leu Arg Trp Val Lys Ile Gln Glu Ala Gly Ile Asn Tyr130 135 140

Asn Thr Gln Val Trp Ala Gln Gln Asp Leu Ile Asn Gln Gly Asn Lys145 150 155 160

Trp Thr Val Lys Ile Pro Ser Ser Leu Arg Pro Gly Asn Tyr Val Phe165 170 175

Arg His Glu Leu Leu Ala Ala His Gly Ala Ser Ser Ala Asn Gly Met180 185 190

Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Val Asn Ile Ala Val Thr Gly Ser Gly Thr195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Pro Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Pro Thr210 215 220Asp Pro Gly Ile Leu225

230

Phe Asn Pro Tyr Thr Thr Ile Thr Ser Tyr Thr

235

240

Ile Pro Gly Pro Ala Leu Trp Gln Gly245

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<220>

<221> misc_feature

<222> (24) . . (24)

<223> V= G, A, OR C

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> N= A, C, G, OR T

<4 00> 3

tttttttttt tttttttttt tttvn 25

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<4 00> 5

atactggtca cttccccaa 19

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Triehoderma reesei

<4 00> 4

tgtccatgge cgaga

15

<4 00> 6

gcgctgggtc aagatt

16

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<4 00> 7

actggattta ccatgaagtc ctgcgccatt cttgc

35<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 8

agtcacctct agttagcctt gccacagggc tgg

33

Claims (40)

1. Método para degradar ou converter um material celulósico,caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico comuma quantidade eficaz de uma ou mais proteínas celulolíticas na presença deuma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica, em que a presença do polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica aumenta a degradação de material celulósico comparada com aausência do polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica e em que opolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica é selecionado do grupoque consiste de:(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2;(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (i) a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência deDNA genômico que compreende a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);(c) um polipeptídeo que compreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácido, x(4,5)é qualquer aminoácido nas posições contíguas 4 ou 5 e x(3) é qualqueraminoácido nas posições contíguas 3; e(d) uma variante que compreende uma substituição, deleção,e/ou inserção conservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o material celulósico é selecionado do grupo que consiste dematerial herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólidomunicipal, papel usado e resíduo de polpa e moagem de papel.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas celulolíticas sãoselecionadas do grupo que consiste de uma celulase, endoglicanase,celobioidrolase e beta-glicosidase.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que ainda compreende tratar o materialcelulósico com uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadasdo grupo que consiste de um hemi-celulase, esterase, protease, lacase,peroxidase ou uma mistura destes.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método é um processo de pré-tratamento, uma etapa em um processo de sacarificação e fermentaçãosimultâneas (SSF) ou uma etapa em um processo de hidrólise e fermentaçãohíbrido (HHF).

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que ainda compreende recuperar o materialcelulósico degradado.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o material celulósico degradado é um açúcar.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a proteína celulolítica e/ou o polipeptídeotendo atividade realçadora celulolítica estão na forma de um caldo defermentação com ou sem células.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica compreendeuma seqüência de aminoácido que tem preferivelmente pelo menos 70 % deidentidade, mais preferivelmente pelo menos 75 % de identidade, ainda maispreferivelmente pelo menos 80 % de identidade, ainda mais preferivelmentepelo menos 85 % de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 %de identidade, o mais preferivelmente pelo menos 95 % de identidade e aindamais preferivelmente pelo menos 97 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticacompreende ou consiste da SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro desta; ouum fragmento desta tendo atividade realçadora celulolítica.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica écodificado por um polinucleotídeo que hibridiza preferivelmente sobcondições de estringência pelo menos média, mais preferivelmente condiçõesde estringência pelo menos média-alta e o mais preferivelmente condições deestringência pelo menos alta com (i) a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico quecompreende a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii).

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica é umavariante que compreende uma substituição, deleção e/ou inserçãoconservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica écodificada pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pTr3337 que estácontido na E. coli NRRL B-30878.

14. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 11,caracterizado pelo fato de que a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 é dos nucleotídeos de 77 a 766 da SEQ ID NO: 1.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de- 1,9, 10 e 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2 é dos aminoácidos de 20 a 249 da SEQ ID NO: 2.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticacompreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ],em que χ é qualquer aminoácido, x(4,5) é qualquer aminoácido nas posiçõescontíguas 4 ou 5 e x(3) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 3.

17. Método para produzir uma substância, caracterizado pelofato de que compreende:(A) sacarificar um material celulósico com uma quantidadeeficaz de uma ou mais proteínas celulolíticas na presença de uma quantidadeeficaz do polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica, em que apresença do polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica aumenta adegradação do material celulósico comparada com a ausência do polipeptídeotendo atividade realçadora celulolítica e em que o polipeptídeo tendoatividade realçadora celulolítica é selecionado do grupo que consiste de:(i) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2;(ii) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (a) aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ LD NO: 1, (b) aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (c) um filamento complementar de(a) ou (b);(iii) um polipeptídeo que compreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ELMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácido,x(4,5) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 4 ou 5 e x(3) é qualqueraminoácido nas posições contígua 3; e(iv) uma variante que compreende uma substituição, deleção,e/ou inserção conservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2;(B) fermentar o material celulósico sacarificado da etapa (a)com um ou mais microorganismos de fermentação; e(C) recuperar a substância da fermentação.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o material celulósico é selecionado do grupo que consiste dematerial herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólidomunicipal, papel usado e resíduo de polpa e moagem de papel.

19. Método de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas celulolíticas sãoselecionadas do grupo que consiste de uma celulase, endoglicanase,celobioidrolase e beta-glicosidase.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-17 a 19, caracterizado pelo fato de que ainda compreende tratar o materialcelulósico com uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadasdo grupo que consiste de uma hemi-celulase, esterase, protease, lacase,peroxidase ou uma mistura destes.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-17 a 20, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadassimultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-17 a 21, caracterizado pelo fato de que a substância é um álcool, ácidoorgânico, cetona, aminoácido ou gás.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-17 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína celulolítica e/ou opolipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica estão na forma de umcaldo de fermentação com ou sem células.

24. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticacompreende uma seqüência de aminoácido que tem preferivelmente pelomenos 70 % de identidade, mais preferivelmente pelo menos 75 % deidentidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % de identidade, aindamais preferivelmente pelo menos 85 % de identidade, ainda maispreferivelmente pelo menos 90 % de identidade, o mais preferivelmente pelomenos 95 % de identidade e ainda o mais preferivelmente pelo menos 97 %de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

25. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticacompreende ou consiste da SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro deste; ouum fragmento deste tendo atividade realçadora celulolítica.

26. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica écodificado por um polinucleotídeo que hibridiza preferivelmente sobcondições de estringência pelo menos média, mais preferivelmente condiçõesde estringência pelo menos média-alta e o mais preferivelmente condições deestringência pelo menos alta com (i) a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico quecompreende a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii).

27. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica é umavariante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserçãoconservativas de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2.

28. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica écodificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pTr3337 que é contidona E. coli NRRL B-30878.

29. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 26,caracterizado pelo fato de que a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 é dos nucleotídeos de 77 a 766 da SEQ ID NO: 1.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-17, 24, 25 e 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro da SEQID NO: 2 é dos aminoácidos de 20 a 249 da SEQ ID NO: 2.

31. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolíticacompreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ],em que χ é qualquer aminoácido, x(4,5) é qualquer aminoácido nas posiçõescontíguas 4 ou 5 e x(3) é qualquer aminoácido nas posições contíguas 3.

32. Composição detergente, caracterizada pelo fato de quecompreende um polipeptídeo tendo atividade realçadora celulolítica éselecionado do grupo que consiste de:(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2;(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob condições de estringência pelo menos média com (i) a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 , (ii) a seqüência deDNA genômico que compreende a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);(c) um polipeptídeo que compreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácido, x(4,5)é qualquer aminoácido nas posições contíguas 4 ou 5 e x(3) é qualqueraminoácido nas posições contíguas 3; e(d) uma variante que compreende uma substituição, deleção,e/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2.

33. Composição detergente de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma seqüência deaminoácido que tem preferivelmente pelo menos 70 % de identidade, maispreferivelmente pelo menos 75 % de identidade, ainda mais preferivelmentepelo menos 80 % de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 85 %de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade, omais preferivelmente pelo menos 95 % de identidade e ainda maispreferivelmente pelo menos 97 % de identidade com o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 2.

34. Composição detergente de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica compreende ou consiste da SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeomaduro deste; ou um fragmento deste tendo atividade realçadora celulolítica.

35. Composição detergente de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sobpreferivelmente condições de estringência pelo menos média, maispreferivelmente condições de estringência pelo menos média-alta e o maispreferivelmente condições de estringência pelo menos alta com (i) aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii).

36. Composição detergente de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica é uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ouinserção conservativa de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 2.

37. Composição detergente de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica é codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pTr3337que está contido na E. coli NRRL B-30878.

38. Composição detergente de acordo com as reivindicações 32 ou 35, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 é dos nucleotídeos de 77 a 766 daSEQ ID NO: 1.

39. Composição detergente de acordo com qualquer uma dasreivindicações 32, 33, 34 e 36, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2 é dos aminoácidos de 20 a 249 da SEQ ID NO: 2.

40. Composição detergente de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade realçadoracelulolítica compreende [ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ], em que χ é qualquer aminoácido, x(4,5) é qualquer aminoácido nasposições contíguas 4 ou 5 e x(3) é qualquer aminoácido nas posiçõescontíguas 3.