ES2896153T3 - Procedimientos para producir etanol y organismos de fermentación - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para producir etanol, que comprende: (a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima celulolítica; (b) fermentar el material celulósico sacarificado con un microorganismo fermentador para producir el producto de fermentación; en el que el organismo fermentador es Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EE.UU.).

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para producir etanol y organismos de fermentación
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para producir etanol a partir de material celulósico, y a organismos fermentadores mejorados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El etanol es un combustible de transporte que comúnmente se mezcla con la gasolina. El material celulósico se utiliza como materia prima en los procedimientos de producción de etanol. Existen varios procedimientos en la técnica para preparar hidrolizados de celulosa y hemicelulosas que contienen glucosa, manosa, xilosa y arabinosa. La glucosa y la manosa se convierten eficazmente en etanol durante el metabolismo anaeróbico natural. Con mucho, el microorganismo productor de etanol más eficiente es la levadura Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo, Saccharomyces cerevisiae carece de las enzimas necesarias para convertir el azúcar dominante xilosa en xilulosa, y por lo tanto es incapaz de utilizar la xilosa como fuente de carbono. Hacerlo requiere la manipulación genética de Saccharomyces cerevisiae para que exprese enzimas que puedan convertir la xilosa en xilulosa. Una de las enzimas necesarias es la xilosa isomerasa (E.C. 5.3.1.5), que convierte la xilosa en xilulosa, que entonces se puede convertir en etanol durante la fermentación mediante Saccharomyces cerevisiae.
El documento WO 2003/062430 describe que la introducción de una Piromyces xilosa isomerasa (XI) funcional en Saccharomyces cerevisiae permite el metabolismo lento de la xilosa a través de la xiluloquinasa endógena (EC 2.7.1.17) codificada por XKS1 y las enzimas de la parte no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato, y confiere a los transformantes de levadura la capacidad para crecer en xilosa.
La patente US no. 8.586.336-B2 describió una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae que expresa una xilosa isomerasa obtenida del fluido del rumen bovino. La cepa de levadura se puede utilizar para producir etanol mediante el cultivo en condiciones de fermentación anaeróbica.
Diao et al., 2013, BMC Biotechnology 13, p 1-9, describen la construcción de levadura de fermentación rápida de xilosa, CIBTS0735, basada en xilosa isomerasa y S. cerevisiae diploide industrial por diseño racional y evolución adaptativa.
A pesar de la mejora significativa de los procedimientos de producción de etanol a partir de material celulósico durante la última década, todavía existe el deseo y la necesidad de proporcionar procedimientos mejorados. Para producir etanol económicamente, se requiere un organismo de fermentación que sea biológicamente eficiente.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir etanol, que comprende:
(a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima celulolítica;
(b) fermentar el material celulósico sacarificado con un microorganismo fermentador para producir etanol; en el que el organismo fermentador es Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 U.S.A.). En otro aspecto, la invención se refiere a un organismo recombinante de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260, depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 U.S.A.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 muestra un mapa plasmídico del plásmido pYIE2-mgXI-GXF1-delta que alberga los casetes de expresión mgXI y GXF.
La Fig. 2 muestra un mapa plasmídico del plásmido usado pSH47-hyg.
La Fig. 3 muestra un mapa del plásmido resultante pYIE2-XKS1 -PPP-5.
La Fig. 4 muestra una comparación de fermentación de CIBTS1260 frente a BSGX001 en hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con ácido NREL a 1 g de DCW/l de incorporación de levadura, 35°C, pH 5,5, en 72 horas.
La Fig. 5 muestra una comparación de Saccharomyces cerevisiae frente a BSGX001 en medio modelo: 2/l de incorporación de levadura, 32°C, pH 5,5, 72 horas.
La Fig. 6 muestra una comparación de la fermentación de hidrolizado de bagazo generado con Composición de Enzima Celulolítica CA y Composición de Enzima Celulolítica CB con CIBTS1260 a 1 g/l de incorporación de levadura en 72 horas.
La Fig. 7 muestra la reducción porcentual de la concentración de DP2 durante la fermentación de hidrolizados generados con celulasa CA o CB a 1 g/l de incorporación de levadura, 35°C, pH 5,5, 72 horas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona procedimientos mejorados para producir etanol a partir de material lignocelulósico utilizando un organismo fermentador.
Definiciones
Actividad auxiliar 9: La expresión “Actividad auxiliar 9” o “AA9” significa un polipéptido clasificado como polisacárido monooxigenasa lítica (Quinlan et al, 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 208: 15079-15084; Phillips et al, 2011, ACS Chem. Biol. 6: 1399-1406; Lin et al, 2012, Structure 20: 1051-1061). Los polipéptidos AA9 se clasificaron anteriormente en la familia de glucósido hidrolasa 61 (GH61) según Henrissat, 1991, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Biochem. J. 316: 695-696.
Los polipéptidos AA9 potencian la hidrólisis de un material celulósico por una enzima que tiene actividad celulolítica. La actividad potenciadora celulolítica se puede determinar midiendo el aumento de azúcares reductores o el aumento del total de celobiosa y glucosa a partir de la hidrólisis de un material celulósico por enzima celulolítica en las siguientes condiciones: 1 -50 mg de proteína total/g de celulosa en rastrojo de maíz pretratado (PCS), en la que la proteína total está compuesta de 50-99,5% p/p de proteína de enzima celulolítica y 0,5-50% p/p de proteína de un polipéptido AA9 durante 1 -7 días a una temperatura adecuada, tal como 40°C-80°C, por ejemplo 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, o 70°C, y un pH adecuado, tal como 4-9, por ejemplo 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, u 8,5, en comparación con una hidrólisis de control con igual carga de proteína total sin actividad potenciadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS).
La actividad potenciadora del polipéptido AA9 se puede determinar usando una mezcla de CELLUCLAST™ 1.5L (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) y beta-glucosidasa como fuente de la actividad celulolítica, en la que la betaglucosidasa está presente en un peso de al menos 2-5% de proteína de la carga de proteína celulasa. En un aspecto, la beta-glucosidasa es una beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (por ejemplo, producida de forma recombinante en Aspergillus oryzae de acuerdo al documento WO 02/095014). En otro aspecto, la beta-glucosidasa es una betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, producida de forma recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en el documento WO 02/095014).
La actividad potenciadora del polipéptido AA9 también se puede determinar incubando un polipéptido AA9 con celulosa hinchada con ácido fosfórico al 0,5% (PASC), acetato de sodio 100 mM pH 5, MnSO4 1 mM, ácido gálico al 0,1%, 0,025 mg/ml de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, y TRITON® X-100 al 0,01% (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenilpolietilenglicol) durante 24-96 horas a 40°C, seguido de la determinación de la glucosa liberada de la PASC.
La actividad potenciadora del polipéptido AA9 también se puede determinar según el documento WO 2013/028928 para composiciones de alta temperatura.
Los polipéptidos AA9 mejoran la hidrólisis de un material celulósico catalizada por una enzima que tiene actividad celulolítica al reducir la cantidad de enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis, preferiblemente al menos 1,01 veces, por ejemplo al menos 1,05 veces, al menos 1,10 veces, al menos 1,25 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, o al menos 20 veces.
Beta-glucosidasa: El término “beta-glucosidasa” significa una beta-D-glucósido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de restos terminales de beta-D-glucosa no reductores con la liberación de beta-D-glucosa. La actividad de la beta-glucosidasa se puede determinar usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido como sustrato según el procedimiento de Venturi et al., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa se define como 1,0 gmol de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 25°C, pH 4,8, a partir de p-nitrofenil-beta-D-glucopiranósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 50 mM que contiene TWEEN® 20 al 0,01%.
Beta-xilosidasa: El término “beta-xilosidasa” significa una beta-D-xilósido xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exohidrólisis de beta (1^ 4)-xilooligosacáridos cortos para eliminar sucesivos restos de D-xilosa de los extremos no reductores. La actividad de la beta-xilosidasa se puede determinar usando p-nitrofenil-beta-D-xilósido 1 mM como sustrato en citrato de sodio 100 mM que contiene TWEEN® 20 al 0,01% a pH 5, 40°C. Una unidad de beta-xilosidasa se define como 1,0 pmol de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 40°C, pH 5, a partir de p-nitrofenil-beta-D-xilósido 1 mM en citrato de sodio 100 mM que contiene TWe En® 20 al 0,01%.
Catalasa: El término “catalasa” significa un peróxido de hidrógeno:peróxido de hidrógeno oxidorreductasa (EC 1.11.1.6) que cataliza la conversión de 2 H2O2 a O2 2 H2O. Para los fines de la presente invención, la actividad de catalasa se determina según la Patente U.S. No. 5.646.025. Una unidad de actividad de catalasa equivale a la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 pmol de peróxido de hidrógeno en las condiciones del ensayo.
Celobiohidrolasa: El término “celobiohidrolasa” significa una 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91 y E.C. 3.2.1.176) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en celulosa, celooligosacáridos, o cualquier polímero que contiene glucosa con enlaces beta-1,4, liberando celobiosa del extremo reductor (celobiohidrolasa I) o del extremo no reductor (celobiohidrolasa II) de la cadena (Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). La actividad de celobiohidrolasa se puede determinar según los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur. Biochem. 170: 575-581.
Composición de enzima celulolítica o celulasa: La expresión “composición de enzima celulolítica” o “celulasa” significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Tales enzimas incluyen endoglucanasa(s), celobiohidrolasa(s), beta-glucosidasa(s), o combinaciones de las mismas. Los dos enfoques básicos para medir la actividad de la enzima celulolítica incluyen: (1) medir la actividad de la enzima celulolítica total, y (2) medir las actividades de las enzimas celulolíticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas, y betaglucosidasas), como se revisa en Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad de la enzima celulolítica total se puede medir utilizando sustratos insolubles, incluyendo papel de filtro Whatman N°1, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo de papel de filtro con papel de filtro Whatman N°1 como sustrato. El ensayo fue establecido por la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem.
59: 257-68).
La actividad de la enzima celulolítica se puede determinar midiendo el aumento en la producción/liberación de azúcares durante la hidrólisis de un material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) en las siguientes condiciones: 1­ 50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulosa en rastrojo de maíz pretratado (PCS) (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada, tal como 402C-802C, por ejemplo 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, o 70°C, y un pH adecuado tal como 4-9, por ejemplo 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína de enzima celulolítica. Las condiciones típicas son reacciones de 1 ml, PCS lavado o sin lavar, 5% de sólidos insolubles (peso seco), acetato de sodio 50 mM pH 5, MnSO4 1 mM, 50°C, 55°C o 60°C, 72 horas, análisis de azúcar mediante cromatografía en columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).
Material celulósico: La expresión “material celulósico” significa cualquier material que contenga celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa, y el tercero es la pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos, y está reforzada por lignina polimérica reticulada covalentemente a hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa, y de este modo es un beta-(1 -4)-D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes. Aunque generalmente es polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas de glucanos paralelas. Las hemicelulosas suelen unirse por enlaces de hidrógeno a la celulosa, así como a otras hemicelulosas, que ayudan a estabilizar la matriz de la pared celular.
La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras, y mazorcas de plantas, u hojas, ramas, y madera de árboles. El material celulósico puede ser, pero no se limita a, restos agrícolas, material herbáceo (incluyendo cultivos energéticos), restos sólidos urbanos, restos de fábricas de pulpa y papel, papel de desecho, y madera (incluyendo restos forestales) (véanse, por ejemplo, Wiselogel et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), p. 105-118, Taylor y Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volumen 65, p. 23-40, Springer-Verlag, Nueva York). Se entiende aquí que la celulosa puede estar en forma de lignocelulosa, un material de la pared celular vegetal que contiene lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mixta. En un aspecto, el material celulósico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto, el material celulósico es lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosas y lignina.
El material celulósico puede ser restos agrícolas, material herbáceo (incluyendo los cultivos energéticos), restos sólidos urbanos, restos de fábricas de pulpa y papel, papel de desecho, o madera (incluyendo los restos forestales).
El material celulósico puede ser arundo, bagazo, bambú, mazorca de maíz, fibra de maíz, rastrojo de maíz, miscanthus, paja de arroz, pasto varilla, o paja de trigo.
El material celulósico puede ser álamo temblón, eucalipto, abeto, pino, álamo, pícea, o sauce.
El material celulósico puede ser celulosa de algas, celulosa bacteriana, línter de algodón, papel de filtro, celulosa microcristalina (por ejemplo, AVICEL®), o celulosa tratada con ácido fosfórico.
El material celulósico puede ser una biomasa acuática. Como se usa aquí, la expresión “biomasa acuática” significa biomasa producida en un ambiente acuático mediante un proceso de fotosíntesis. La biomasa acuática puede ser algas, plantas emergentes, plantas de hojas flotantes, o plantas sumergidas.
El material celulósico puede usarse tal cual, o puede someterse a un pretratamiento, usando métodos convencionales conocidos en la técnica, como se describe en el presente documento. En un aspecto preferido, el material celulósico se trata previamente.
Endoglucanasa: El término “endoglucanasa” significa una 4-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa (E.C.
3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3-1,4 glucanos mixtos, tales como beta-D-glucanos o xiloglucanos de cereales, y otro material vegetal que contenga componentes celulósicos. La actividad de endoglucanasa se puede determinar midiendo la reducción en la viscosidad del sustrato o el aumento en los extremos reductores determinados por un ensayo de azúcar reductor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). La actividad de endoglucanasa también se puede determinar usando carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato según el procedimiento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.
Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa: La expresión “enzima hemicelulolítica” o “hemicelulasa” significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico. Véase, por ejemplo, Shallom y Shoham, 2003, Current Opinion In Microbiology 6(3): 219-228). Las hemicelulasas son componentes clave en la degradación de la biomasa vegetal. Los ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero no se limitan a, una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. Los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas, son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que se unen mediante enlaces de hidrógeno a las microfibrillas de celulosa en la pared celular de la planta, reticulándolas en una red robusta. Las hemicelulosas también se unen covalentemente a la lignina, formando junto con la celulosa una estructura muy compleja. La estructura y organización variables de las hemicelulosas requieren la acción concertada de muchas enzimas para su completa degradación. Los módulos catalíticos de las hemicelulasas son glucósido hidrolasas (GH) que hidrolizan enlaces glucosídicos, o carbohidrato esterasas (CE), que hidrolizan enlaces de éster de acetato o de grupos laterales de ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, basados en la homología de su secuencia primaria, pueden asignarse a las familias GH y CE. Algunas familias, con un pliegue general similar, pueden agruparse en clanes, marcados alfabéticamente (por ejemplo, GH-A). Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas de carbohidratos está disponible en la base de datos de enzimas activas de carbohidratos (CAZy). Las actividades de las enzimas hemicelulolíticas se pueden medir según Ghose y Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752, a una temperatura adecuada tal como 402C-802C, por ejemplo 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, o 70°C, y un pH adecuado tal como 4-9, por ejemplo 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, o 7,0.
Rastrojo de maíz pretratado: La expresión “rastrojo de maíz pretratado” o “PCS” significa un material celulósico derivado de rastrojo de maíz por tratamiento con calor y ácido sulfúrico diluido, pretratamiento alcalino, pretratamiento neutro, o cualquier pretratamiento conocido en la técnica.
Material que contiene xilano: La expresión “material que contiene xilano” significa cualquier material que comprende un polisacárido de la pared celular vegetal que contiene una cadena principal de restos de xilosa enlazados en beta (1-4). Los xilanos de las plantas terrestres son heteropolímeros que poseen una cadena principal de beta-(1-4)-D-xilopiranosa, que está ramificada por cadenas cortas de hidratos de carbono. Comprenden ácido D-glucurónico o su 4-O-metiléter, L-arabinosa, y/o diversos oligosacáridos, compuestos de D-xilosa, L-arabinosa, D- o L-galactosa, y D-glucosa. Los polisacáridos de tipo xilano se pueden dividir en homoxilanos y heteroxilanos, que incluyen glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos, y heteroxilanos complejos. Véase, por ejemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.
En los procedimientos de la presente invención, puede usarse cualquier material que contenga xilano. En un aspecto preferido, el material que contiene xilano es material celulósico.
Actividad degradante de xilano o actividad xilanolítica: La expresión “actividad degradante de xilano” o “actividad xilanolítica” significa una actividad biológica que hidroliza material que contiene xilano. Los dos enfoques básicos para medir la actividad xilanolítica incluyen: (1) medir la actividad xilanolítica total, y (2) medir las actividades xilanolíticas individuales (por ejemplo, endoxilanasas, beta-xilosidasas, arabinofuranosidasas, alfa-glucuronidasas, acetilxilano esterasas, feruloil esterasas, y alfa-glucuronil esterasas). El progreso reciente en los ensayos de enzimas xilanolíticas se resumió en varias publicaciones, que incluyen Biely y Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova y Biely, 2006, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrimann et al., 1997, Biochemical Journal 321: 375-381.
La actividad degradante de xilano total puede medirse determinando los azúcares reductores formados a partir de diversos tipos de xilano, incluyendo, por ejemplo, xilanos de avena espelta, madera de haya y madera de alerce, o mediante determinación fotométrica de fragmentos de xilano teñidos liberados de diversos xilanos teñidos covalentemente. Un ensayo común de actividad xilanolítica total se basa en la producción de azúcares reductores a partir de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico, como se describe en Bailey et al., 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. La actividad de xilanasa también se puede determinar con AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en TRITON® X-100 al 0,01% y fosfato de sodio 200 mM pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1,0 gmol de azurina producida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en fosfato sódico 200 mM pH 6.
La actividad degradante de xilano se puede determinar midiendo el aumento en la hidrólisis del xilano de madera de abedul (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por la(s) enzima(s) degradante(s) de xilano en las siguientes condiciones típicas: reacciones de 1 ml, 5 mg/ml de sustrato (sólidos totales), 5 mg de proteína xilanolítica/g de sustrato, acetato de sodio 50 mM pH 5, 50°C, 24 horas, análisis de azúcar usando el ensayo de hidrazida de ácido phidroxibenzoico (PHBAH) como se describe por Lever, 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279.
Xilanasa: El término “xilanasa” significa una 1,4-beta-D-xilano-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos. La actividad de xilanasa se puede determinar con AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en TRITON® X-100 al 0,01% y fosfato de sodio 200 mM pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1,0 gmol de azurina producida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en fosfato sódico 200 mM pH 6.
Xilosa isomerasa: La expresión “xilosa isomerasa” o “XI” significa una enzima que puede catalizar D-xilosa en D-xilulosa in vivo, y convertir D-glucosa en D-fructosa in vitro. La xilosa isomerasa también se conoce como “glucosa isomerasa”, y se clasifica como E.C. 5.3.1.5. Como la estructura de la enzima es muy estable, la xilosa isomerasa es uno de los buenos modelos para estudiar las relaciones entre la estructura y las funciones de las proteínas (Karimaki et al., Protein Eng Des Sel, 12004, 17 (12):861 -869). Además, el valor de aplicación industrial extremadamente importante hace que la xilosa isomerasa se considere una enzima industrial tan importante como la proteasa y la amilasa (Tian Shen et al. , Microbiology Bulletin, 2007, 34 (2): 355-358; Bhosale et al. , Microbiol Rev, 1996, 60 (2): 280-300). Los científicos mantienen una gran preocupación, y llevaron a cabo una extensa investigación sobre la xilosa isomerasa. Desde la década de 1970, las aplicaciones de la xilosa isomerasa se han centrado en la producción de jarabe con alto contenido en fructosa y etanol combustible. En los últimos años, los científicos han descubierto que, en determinadas condiciones, la xilosa isomerasa se puede utilizar para producir muchos azúcares raros importantes, que son los materiales de producción en la industria farmacéutica, tales como ribosa, manosa, arabinosa, y lixosa (Karlmaki et al., Protein Eng Des Se, 12004, 17 (12): 861-869). Estos hallazgos aportan nueva vitalidad a la investigación sobre la xilosa isomerasa.
Procedimientos de la invención
La presente invención también se refiere a procedimientos para producir etanol, que comprenden:
(a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima celulolítica;
(b) fermentar el material celulósico sacarificado con un microorganismo fermentador para producir etanol; en el que el organismo fermentador es Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 USA.).
En una realización preferida, el procedimiento comprende recuperar el etanol del medio de fermentación.
El procesamiento del material celulósico según la presente invención se puede lograr usando métodos convencionales en la técnica. Además, los procedimientos de la presente invención pueden implementarse usando cualquier aparato de procesamiento de biomasa convencional configurado para operar según la invención.
La sacarificación (es decir, hidrólisis) y fermentación, separadas o simultáneas, incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis y fermentación separadas (SHF); sacarificación y fermentación simultáneas (SSF); sacarificación y co-fermentación simultáneas (SSCF); hidrólisis y fermentación híbridas (HHF); hidrólisis y co-fermentación separadas (SHCF); hidrólisis y co-fermentación híbridas (HHCF).
SHF utiliza etapas de procedimiento separadas para hidrolizar primero enzimáticamente el material celulósico a azúcares fermentables, por ejemplo monómeros de glucosa, celobiosa y pentosa, y después fermentar los azúcares fermentables a etanol. En SSF, la hidrólisis enzimática del material celulósico y la fermentación de azúcares a etanol se combinan en una sola etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, en Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF implica la co-fermentación de múltiples azúcares (Sheehan y Himmel, 1999, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). HHF implica una etapa de hidrólisis separada, y además, una etapa de sacarificación e hidrólisis simultáneas, que se pueden llevar a cabo en el mismo reactor. Las etapas en un procedimiento de HHF se pueden llevar a cabo a diferentes temperaturas, es decir, sacarificación enzimática a alta temperatura, seguida de SSF a una temperatura más baja que el organismo de fermentación puede tolerar. Se entiende aquí que cualquier método conocido en la técnica que comprenda pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación), fermentación, o una combinación de los mismos, puede usarse en la práctica de los procedimientos de la presente invención.
Un aparato convencional puede incluir un reactor agitado alimentado discontinuo, un reactor agitado discontinuo, un reactor agitado de flujo continuo con ultrafiltración, y/o un reactor de columna de flujo pistón continuo (de Castilhos Corazza et al., 2003, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov y Sinitsyn, 1985, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), un reactor de atrición (Ryu y Lee, 1983, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65). Los tipos de reactores adicionales incluyen reactores para hidrólisis y/o fermentación de tipo lecho fluidizado, de manto de flujo ascendente, inmovilizados, y extrusora.
Pretratamiento
En una realización, el material celulósico se trata previamente antes de la sacarificación en la etapa (a).
Al poner en práctica los procedimientos de la presente invención, se puede utilizar cualquier procedimiento de pretratamiento conocido en la técnica para romper los componentes de la pared celular vegetal del material celulósico (Chandra et al., 2007, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe y Zacchi, 2007, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks y Zeeman, 2009, Bioresource Technology 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686; Taherzadeh y Karimi, 2008, Int. J. Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang y Wyman, 2008, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).
El material celulósico también puede someterse a reducción del tamaño de partícula, tamizado, remojo previo, humectación, lavado, y/o acondicionamiento antes del pretratamiento, usando métodos conocidos en la técnica.
Los pretratamientos convencionales incluyen, pero no se limitan a, pretratamiento con vapor (con o sin explosión), pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con agua caliente, pretratamiento alcalino, pretratamiento con cal, oxidación húmeda, explosión húmeda, explosión de fibra con amoníaco, pretratamiento de organosolv, y pretratamiento biológico. Los pretratamientos adicionales incluyen pretratamientos de percolación de amoníaco, ultrasonido, electroporación, microondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítico, ozono, líquido iónico, e irradiación gamma.
En una realización preferida, el material celulósico se trata previamente antes de la sacarificación (es decir, la hidrólisis) y/o la fermentación. El pretratamiento se realiza preferiblemente antes de la hidrólisis. Alternativamente, el pretratamiento se puede llevar a cabo simultáneamente con la hidrólisis enzimática para liberar azúcares fermentables, tales como glucosa, xilosa y/o celobiosa. En la mayoría de los casos, la propia etapa de pretratamiento da como resultado cierta conversión de biomasa en azúcares fermentables (incluso en ausencia de enzimas).
Pretratamiento con vapor. En el pretratamiento con vapor, el material celulósico se calienta para romper los componentes de la pared celular de la planta, incluyendo la lignina, la hemicelulosa, y la celulosa, para hacer que la celulosa y otras fracciones, por ejemplo hemicelulosa, sean accesibles a las enzimas. El material celulósico se hace pasar a o a través de una vasija de reacción en la que se inyecta vapor de agua para aumentar la temperatura hasta la temperatura y presión requeridas, y se retiene allí durante el tiempo de reacción deseado. El pretratamiento con vapor se realiza preferiblemente a Í40-2502C, por ejemplo 160-200°C o 170-190°C, en el que el intervalo de temperatura óptimo depende de la adición opcional de un catalizador químico. El tiempo de residencia para el pretratamiento con vapor es preferiblemente 1-60 minutos, por ejemplo 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos, o 4-10 minutos, en el que el tiempo de residencia óptimo depende de la temperatura y la adición opcional de un catalizador químico. El pretratamiento con vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, de modo que el material celulósico generalmente solo está húmedo durante el pretratamiento. El pretratamiento con vapor a menudo se combina con una descarga explosiva del material después del pretratamiento, lo que se conoce como explosión de vapor, es decir, vaporización rápida a presión atmosférica y flujo turbulento del material para aumentar la superficie accesible por fragmentación (Duff y Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe y Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Solicitud de Patente U.S. No. 2002/0164730). Durante el pretratamiento con vapor, los grupos acetilo de hemicelulosa se escinden, y el ácido resultante autocataliza la hidrólisis parcial de la hemicelulosa a monosacáridos y oligosacáridos. La lignina se elimina solo de forma limitada.
Pretratamiento químico. La expresión “tratamiento químico” se refiere a cualquier pretratamiento químico que promueva la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa, y/o lignina. Tal pretratamiento puede convertir la celulosa cristalina en celulosa amorfa. Ejemplos de procedimientos de pretratamiento químico adecuados incluyen, por ejemplo, pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con cal, oxidación húmeda, expansión de fibra con amoníaco/congelación (AFEX), percolación con amoníaco (APR), líquido iónico, y pretratamientos de organosolv.
Algunas veces se añade un catalizador químico, tal como H2SO4 o SO2 (típicamente 0,3 a 5% p/p), antes del pretratamiento con vapor, lo que disminuye el tiempo y la temperatura, aumenta la recuperación, y mejora la hidrólisis enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). En el pretratamiento con ácido diluido, el material celulósico se mezcla con ácido diluido, típicamente H2SO4, y agua para formar una suspensión, se calienta con vapor hasta la temperatura deseada, y después de un tiempo de residencia, se evapora a presión atmosférica. El pretratamiento con ácido diluido se puede realizar con varios diseños de reactores, por ejemplo reactores de flujo pistón, reactores en contracorriente, o reactores de lecho retráctil en contracorriente continuo (Duff y Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Schell et al., 2004, Bioresource Technology 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115). En una realización específica, el pretratamiento con ácido diluido del material celulósico se lleva a cabo usando ácido sulfúrico al 4% p/p a 180°C durante 5 minutos.
También se pueden utilizar varios métodos de pretratamiento en condiciones alcalinas. Estos pretratamientos alcalinos incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de sodio, cal, oxidación húmeda, percolación con amoníaco (APR), y pretratamiento expansión de fibra con amoníaco/congelación (AFEX).
El pretratamiento con cal se realiza con óxido de calcio o hidróxido de calcio a temperaturas de 85-150°C y tiempos de residencia de 1 hora a varios días (Wyman et al., 2005, Bioresource Technology 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686). Los documentos WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, y WO 2006/110901 describen métodos de pretratamiento que utilizan amoníaco.
La oxidación húmeda es un pretratamiento térmico que se realiza típicamente a 180-200°C durante 5-15 minutos con la adición de un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno o sobrepresión de oxígeno (Schmidt y Thomsen, 1998, Bioresource Technology 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). El pretratamiento se realiza preferiblemente a 1-40% de materia seca, por ejemplo 2-30% de materia seca, o 5-20% de materia seca, y con frecuencia el pH inicial se incrementa mediante la adición de álcali tal como carbonato de sodio.
Una modificación del método de pretratamiento de oxidación húmeda, conocida como explosión húmeda (combinación de oxidación húmeda y explosión de vapor) puede manipular materia seca hasta en un 30%. En explosión húmeda, el agente oxidante se introduce durante el pretratamiento después de un cierto tiempo de residencia. El pretratamiento se finaliza entonces evaporando de forma instantánea a presión atmosférica (documento WO 2006/032282).
La expansión de fibra con amoníaco (AFEX) implica tratar el material celulósico con amoníaco líquido o gaseoso a temperaturas moderadas tales como 90-150°C y alta presión tal como 17-20 bares durante 5-10 minutos, en la que el contenido de materia seca puede ser tan alto como 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23­ 35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technology 96: 2014-2018). Durante el pretratamiento con AFEX, la celulosa y las hemicelulosas permanecen relativamente intactas. Se escinden los complejos de lignina-hidrato de carbono.
El pretratamiento de organosolv deslignifica el material celulósico mediante extracción con etanol acuoso (etanol al 40-60%) a 160-200°C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851 -861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Normalmente se añade ácido sulfúrico como catalizador. En el pretratamiento de organosolv, se elimina la mayor parte de la hemicelulosa y la lignina.
Otros ejemplos de métodos de pretratamiento adecuados se describen en Schell et al., 2003, Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108: 69-85, y Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, y Solicitud Publicada 2002/0164730.
En un aspecto, el pretratamiento químico se lleva a cabo preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido, y más preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido continuo. El ácido es típicamente ácido sulfúrico, pero también se pueden usar otros ácidos, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloruro de hidrógeno, o mezclas de los mismos. El tratamiento con ácido suave se realiza en el intervalo de pH de preferiblemente 1-5, por ejemplo 1-4 o 1-2,5. En un aspecto, la concentración de ácido está en el intervalo de preferiblemente 0,01 a 10% en peso de ácido, por ejemplo 0,05 a 5% en peso de ácido, o 0,1 a 2% en peso de ácido. El ácido se pone en contacto con el material celulósico y se mantiene a una temperatura en el intervalo de preferiblemente 140-200°C, por ejemplo 165-190°C, durante períodos que oscilan de 1 a 60 minutos.
En otro aspecto, el pretratamiento tiene lugar en una suspensión acuosa. En aspectos preferidos, el material celulósico está presente durante el pretratamiento en cantidades preferiblemente entre 10-80% en peso, por ejemplo 20-70% en peso, o 30-60% en peso, tal como alrededor de 40% en peso. El material celulósico pretratado puede no lavarse o lavarse usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo lavarse con agua.
Pretratamiento mecánico o pretratamiento físico: La expresión “pretratamiento mecánico” o “pretratamiento físico” se refiere a cualquier pretratamiento que promueva la reducción del tamaño de las partículas. Por ejemplo, dicho pretratamiento puede implicar diversos tipos de trituración o molienda (por ejemplo, molienda en seco, molienda en húmedo, o molienda con bolas vibratorias).
El material celulósico se puede pretratar tanto física (mecánicamente) como químicamente. El pretratamiento mecánico o físico se puede combinar con aplicación de vapor/explosión de vapor, hidrotermólisis, tratamiento con ácido diluido o suave, alta temperatura, tratamiento de alta presión, irradiación (por ejemplo, irradiación de microondas), o combinaciones de los mismos. En un aspecto, alta presión significa presión en el intervalo de preferiblemente alrededor de 100 a alrededor de 400 psi, por ejemplo alrededor de 150 a alrededor de 250 psi. En otro aspecto, temperatura alta significa temperatura en el intervalo de alrededor de 100 a alrededor de 300°C, por ejemplo alrededor de 140 a alrededor de 200°C. En un aspecto preferido, el pretratamiento mecánico o físico se realiza en un procedimiento por lotes usando un sistema hidrolizador de pistola de vapor que usa alta presión y alta temperatura como se define anteriormente, por ejemplo, un hidrolizador Sunds disponible de Sunds Defibrator AB, Suecia. Los pretratamientos físicos y químicos se pueden realizar de forma secuencial o simultánea, según se desee.
Por consiguiente, en un aspecto preferido, el material celulósico se somete a un pretratamiento físico (mecánico) o químico, o cualquier combinación de los mismos, para promover la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa, y/o lignina.
Pretratamiento biológico. La expresión “pretratamiento biológico” se refiere a cualquier pretratamiento biológico que promueva la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa, y/o lignina del material celulósico. Las técnicas de pretratamiento biológico pueden implicar la aplicación de microorganismos y/o enzimas solubilizantes de la lignina (véanse, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, en Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh y Singh, 1993, Adv. Appl. Microbiol.
39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, en Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., y Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; y Vallander y Eriksson, 1990, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).
Sacarificación
En la etapa de sacarificación (es decir, la etapa de hidrólisis), el material celulósico, por ejemplo pretratado, se hidroliza para romper la celulosa y/o hemicelulosa en azúcares fermentables, tales como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, manosa, galactosa, y/u oligosacáridos solubles. La hidrólisis se realiza enzimáticamente mediante una composición de enzima celulolítica. Las enzimas de las composiciones se pueden añadir de forma simultánea o secuencial.
La hidrólisis enzimática se lleva a cabo preferiblemente en un entorno acuoso adecuado en condiciones que pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica. En un aspecto, la hidrólisis se realiza en condiciones adecuadas para la actividad de la(s) enzima(s), es decir, óptimas para la(s) enzima(s). La hidrólisis se puede llevar a cabo como un procedimiento alimentado por lotes o continuo, en el que el material celulósico se alimenta gradualmente a, por ejemplo, una disolución de hidrólisis que contiene enzima.
La sacarificación se realiza generalmente en reactores de tanque agitado o fermentadores bajo condiciones controladas de pH, temperatura, y mezclamiento. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente el tiempo de procedimiento, la temperatura, y las condiciones de pH adecuados. Por ejemplo, la sacarificación puede durar hasta 200 horas, pero típicamente se realiza durante preferiblemente alrededor de 12 a alrededor de 120 horas, por ejemplo alrededor de 16 a alrededor de 72 horas, o alrededor de 24 a alrededor de 48 horas. La temperatura está en el intervalo de preferiblemente alrededor de 25°C a alrededor de 70°C, por ejemplo alrededor de 30°C a alrededor de 65°C, alrededor de 40°C a alrededor de 60°C, o alrededor de 50°C a alrededor de 55°C. El pH está en el intervalo de preferiblemente alrededor de 3 a alrededor de 8, por ejemplo alrededor de 3,5 a alrededor de 7, alrededor de 4 a alrededor de 6, o alrededor de 4,5 a alrededor de 5,5. El contenido de sólidos secos está en el intervalo de preferiblemente alrededor de 5 a alrededor de 50% en peso, por ejemplo alrededor de 10 a alrededor de 40% en peso, o alrededor de 20 a alrededor de 30% en peso.
La sacarificación en la etapa (a) se lleva a cabo usando una composición de enzima celulolítica. Tales composiciones enzimáticas se describen a continuación en la sección “Composición de enzima celulolítica” más abajo. Las composiciones de enzima celulolítica pueden comprender cualquier proteína útil para degradar el material celulósico. En un aspecto, la composición de enzima celulolítica comprende o comprende además una o más (por ejemplo, varias) proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido AA9 (GH61), una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una enzima ligninolítica, una oxidorreductasa, una pectinasa, una proteasa, y una swollenina.
En otro aspecto, la celulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa.
En otro aspecto, la hemicelulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. En otro aspecto, la oxidorreductasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una catalasa, una lacasa, y una peroxidasa.
Las enzimas o composiciones enzimáticas utilizadas en los procedimientos de la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para uso, tal como, por ejemplo, una formulación de caldo de fermentación o una composición celular, un lisado celular con o sin detritos celulares, una preparación enzimática semipurificada o purificada, o una célula hospedante como fuente de las enzimas. La composición enzimática puede ser un polvo o granulado seco, un granulado que no espolvorea, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida estabilizada. Las preparaciones enzimáticas líquidas se pueden estabilizar, por ejemplo, mediante la adición de estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico, según procedimientos establecidos.
En un aspecto, una cantidad eficaz de composición de enzima celulolítica o hemicelulolítica para el material celulósico es alrededor de 0,5 a alrededor de 50 mg, por ejemplo alrededor de 0,5 a alrededor de 40 mg, alrededor de 0,5 a alrededor de 25 mg, alrededor de 0,75 a alrededor de 20 mg, alrededor de 0,75 a alrededor de 15 mg, alrededor de 0,5 a alrededor de 10 mg, o alrededor de 2,5 a alrededor de 10 mg por g del material celulósico.
En un aspecto, dicho compuesto se añade en una relación molar del compuesto a unidades glucosílicas de celulosa de alrededor de 10-6 a alrededor de 10, por ejemplo alrededor de 10-6 a alrededor de 7,5, alrededor de 10-6 a alrededor de 5, alrededor de 10-6 a alrededor de 2,5, alrededor de 10-6 a alrededor de 1, alrededor de 10-5 a alrededor de 1, alrededor de 10-5 a alrededor de 10-1, alrededor de 10-4 a alrededor de 10-1, alrededor de 10-3 a alrededor de 10-1, o alrededor de 10-3 a alrededor de 10-2. En otro aspecto, una cantidad eficaz de dicho compuesto es alrededor de 0,1 pM a alrededor de 1 M, por ejemplo alrededor de 0,5 pM a alrededor de 0,75 M, alrededor de 0,75 pM a alrededor de 0,5 M, alrededor de 1 pM a alrededor de 0,25 M, alrededor de 1 pM a alrededor de alrededor de 0,1 M, alrededor de 5 pM a alrededor de 50 mM, alrededor de 10 pM a alrededor de 25 mM, alrededor de 50 pM a alrededor de 25 mM, alrededor de 10 pM a alrededor de 10 mM, alrededor de 5 pM a alrededor de 5 mM, o alrededor de 0,1 mM a alrededor de 1 mM.
El término “licor” significa la fase de disolución, ya sea acuosa, orgánica, o una combinación de las mismas, que surge del tratamiento de un material de lignocelulosa y/o hemicelulosa en una suspensión, o sus monosacáridos, por ejemplo xilosa, arabinosa, manosa, etc., en condiciones como se describen en el documento WO 2012/021401, y sus contenidos solubles. Un licor para la mejora celulolítica de un polipéptido AA9 (polipéptido GH61) se puede producir tratando un material (o materia prima) de lignocelulosa o hemicelulosa aplicando calor y/o presión, opcionalmente en presencia de un catalizador, por ejemplo ácido, opcionalmente en presencia de un disolvente orgánico, y opcionalmente en combinación con la rotura física del material, y después separando la disolución de los sólidos residuales. Dichas condiciones determinan el grado de mejora celulolítica que se puede obtener mediante la combinación de licor y un polipéptido AA9 durante la hidrólisis de un sustrato celulósico mediante una preparación de enzima celulolítica. El licor se puede separar del material tratado usando un método estándar en la técnica, tal como filtración, sedimentación, o centrifugación.
En un aspecto, una cantidad eficaz del licor a celulosa es alrededor de 10-6 a 10 g por g de celulosa, por ejemplo alrededor de 10-6 a alrededor de 7,5 g, alrededor de 10-6 a alrededor de 5 g, alrededor de 10-6 a alrededor de 2,5 g, alrededor de 10-6 a alrededor de 1 g, alrededor de 10-5 a alrededor de 1 g, alrededor de 10-5 a alrededor de 10-1 g, alrededor de 10-4 a alrededor de 10-1 g, alrededor de 10-3 a alrededor de 10-1 g, o alrededor de 10-3 a alrededor de 10­ 2 g por g de celulosa.
Fermentación
Los azúcares fermentables obtenidos del material celulósico hidrolizado se pueden fermentar por uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos fermentadores capaces de fermentar los azúcares directa o indirectamente en un producto de fermentación deseado. “Fermentación” o “procedimiento de fermentación” se refiere a cualquier procedimiento de fermentación o cualquier procedimiento que comprenda una etapa de fermentación. Los procedimientos de fermentación también incluyen los procedimientos de fermentación utilizados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria del cuero, y la industria del tabaco. Las condiciones de fermentación dependen del producto de fermentación deseado y del organismo de fermentación, y un experto en la técnica puede determinarlas fácilmente.
En la etapa de fermentación, los azúcares, liberados del material celulósico como resultado de las etapas de pretratamiento e hidrólisis enzimática, se fermentan a un producto, por ejemplo etanol, por un organismo fermentador, tal como la levadura. La hidrólisis (sacarificación) y la fermentación pueden ser separadas o simultáneas.
Al poner en práctica la presente invención, en la etapa de fermentación se puede usar cualquier material celulósico hidrolizado adecuado. El material se selecciona generalmente en base a la economía, es decir, los costes por potencial de azúcar equivalente, y la resistencia a la conversión enzimática.
La expresión “medio de fermentación” se entiende en el presente documento que se refiere a un medio antes de que se añada(n) microorganismo(s) fermentador(es), tal como un medio resultante de un procedimiento de sacarificación, así como un medio utilizado en un procedimiento de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).
Organismo fermentador de la invención
En este aspecto, la invención se refiere a organismos fermentadores recombinantes capaces de convertir hexosas y pentosas en etanol, y en la que el organismo fermentador recombinante es Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 U.S.A.).
Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 tiene una o más, tal como todas, de las siguientes propiedades:
• mayor consumo de xilosa en comparación con BSGX001 después de 48 horas de fermentación a 1 g de DWC/l, 35°C, pH 5,5, en particular como se describe en el Ejemplo 3;
• mayor consumo de glucosa en comparación con BSGX001 después de 48 horas de fermentación a 1 g de DWC/l, 35°C, pH 5,5, en particular como se describe en el Ejemplo 3;
• mayor producción de etanol en comparación con BSGX001 después de 48 horas de fermentación a 1 g de DWC/l, 35°C, pH 5,5, en particular como se describe en el Ejemplo 3.
Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 proporciona un consumo total de xilosa a las 48 horas de fermentación en las condiciones del procedimiento en el Ejemplo 3, es decir, 1 g de DCW/l, 35°C, pH 5,5.
Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 proporciona un consumo total de glucosa a las 24 horas de fermentación en las condiciones del procedimiento en el Ejemplo 3, es decir, 1 g de DCW/l, 35°C, pH 5,5.
Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 proporciona más de 30 g/l de etanol, tal como más de 40 g/l de etanol, tal como más de 45 g/l de etanol, tal como aproximadamente 47 g/l de etanol después de 48 horas de fermentación en las condiciones del procedimiento en el Ejemplo 3, es decir, 1 g de DCW/l, 35°C, pH 5,5.
El organismo fermentador de la invención comprende un gen que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de xilosa isomerasa mostrada en SEQ ID NO: 2 en el documento US 8586336B2 o SEQ ID NO: 13 aquí. El organismo fermentador de la invención comprende un gen transportador de pentosa, GFX1 de Candida intermedia, la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 18.
El organismo fermentador de la invención sobreexpresa un gen de xiluloquinasa (XKS) de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae.
El organismo fermentador de la invención sobreexpresa un gen de ribulosa 5 fosfato 3-epimerasa (RPE1) de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae.
El organismo fermentador de la invención sobreexpresa un gen de ribulosa 5 fosfato isomerasa (RKI1) de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae.
El organismo fermentador de la invención sobreexpresa un gen de transcetolasa (TKL1) y sobreexpresa un gen de transaldolasa (TAL1) de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae.
El organismo fermentador de la invención tiene todas las siguientes modificaciones genéticas:
• gen de xilosa isomerasa (Ru-XI) obtenido a partir del fluido del rumen bovino, mostrado en SEC ID NO: 20 aquí, que codifica la xilosa isomerasa mostrada en SEC ID NO: 13 aquí;
• un gen transportador de pentosa (GXF1) de Candida intermedia, mostrado en SEQ ID NO: 18;
• gen de la xiluloquinasa (XKS), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae;
• gen de la ribulosa 5 fosfato 3-epimerasa (RPE1), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae;
• gen de la ribulosa 5 fosfato isomerasa (RKI1), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae;
• gen de transcetolasa (TKL1) y gen de transaldolasa (TAL1), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae.
El organismo fermentador de la invención tiene las siguientes modificaciones genéticas:
• gen de xilosa isomerasa (Ru-XI) obtenido a partir del fluido del rumen bovino, mostrado en SEC ID NO: 20 aquí, que codifica la xilosa isomerasa mostrada en SEC ID NO: 13 aquí;
• gen de la xiluloquinasa (XKS), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae;
• gen de la ribulosa 5 fosfato 3-epimerasa (RPE1), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae;
• gen de la ribulosa 5 fosfato isomerasa (RKI1), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae;
• gen de transcetolasa (TKL1) y gen de transaldolasa (TAL1), de una cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae.
Estimuladores de la fermentación
Un estimulador de la fermentación se puede usar en un procedimiento de la invención descrito aquí para mejorar aún más la fermentación, y en particular, el rendimiento del organismo fermentador, tal como la mejora de la velocidad y el rendimiento del producto (por ejemplo, rendimiento de etanol). Un “estimulador de la fermentación” se refiere a estimuladores para el crecimiento de los organismos fermentadores, en particular, levadura. Los estimuladores de la fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Ejemplos de vitaminas incluyen multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, mesoinositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina, y vitaminas A, B, C, D, y E. Véase, por ejemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002). Los ejemplos de minerales incluyen minerales y sales minerales que pueden suministrar nutrientes, que comprenden P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, y Cu.
Productos de fermentación
El producto de fermentación de la invención es etanol.
Recuperación
El producto de fermentación, es decir, etanol, puede recuperarse opcionalmente del medio de fermentación usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía, procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación, o extracción. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulósico fermentado y se purifica mediante métodos convencionales de destilación. Se puede obtener etanol con una pureza de hasta alrededor de 96% en volumen, que se puede usar como, por ejemplo, etanol de combustible, etanol para bebida, es decir, alcoholes neutros potables, o etanol industrial.
ENZIMAS
Las siguientes secciones describen polipéptidos, enzimas y composición de enzimas que pueden usarse en los procedimientos de la invención.
Composición de enzima celulolítica
Según la invención, una composición de enzima celulolítica está presente o se añade durante la sacarificación en la etapa (a). Una composición de enzima celulolítica es una preparación de enzima que contiene una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan el material celulósico. Tales enzimas incluyen endoglucanasa, celobiohidrolasa, betaglucosidasa, y/o combinaciones de las mismas.
La composición de enzima celulolítica puede ser de cualquier origen. En una realización, la composición de enzima celulolítica deriva de una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei; una cepa de Humicola, tal como una cepa de Humicola insolens, y/o una cepa de Chrysosporium, tal como una cepa de Chrysosporium lucknowense. En una realización preferida, la preparación de enzima celulolítica deriva de una cepa de Trichoderma reesei.
La composición de enzima celulolítica puede comprender además uno o más de los siguientes polipéptidos, tales como enzimas: polipéptido AA9 (polipéptido GH61) que tiene actividad potenciadora celulolítica, beta-glucosidasa, xilanasa, beta-xilosidasa, CBH I, CBH II, o una mezcla de dos, tres, cuatro, cinco o seis de ellos.
El o los polipéptidos (por ejemplo, polipéptido AA9) y/o la o las enzimas (por ejemplo, beta-glucosidasa, xilanasa, betaxilosidasa, CBH I y/o CBH II) adicionales pueden ser extraños al organismo productor de la composición de enzima celulolítica (por ejemplo, Trichoderma reesei).
En una realización, la preparación de enzima celulolítica comprende un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-glucosidasa.
En otra realización, la preparación de enzima celulolítica comprende un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, y una CBH I.
En otra realización, la preparación de enzima celulolítica comprende un polipéptido AA9 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una CBH I y una CBH II.
Otras enzimas, tales como endoglucanasas, también pueden estar incluidas en la composición de enzima celulolítica.
Como se mencionó anteriormente, la composición de enzima celulolítica puede comprender varios polipéptidos diferentes, que incluyen enzimas.
En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (por ejemplo, documento WO 2005/074656), y proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (por ejemplo, la descrita en el documento WO 2008/057637, en particular mostrada como SEQ ID NOs: 59 and 60).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/074656 o SeQ ID NO: 4 aquí), y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o s Eq iD NO: 5 aquí).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el descrito en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí, y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el descrito en el documento WO 2011/041397, y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí) o una variante descrita en el documento WO 2012/044915, en particular aquella que comprende una o más, tales como todas, de las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y.
En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido AA9 (GH61A) que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el derivado de una cepa de Penicillium emersonii (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí), beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí) o una variante con una o más, en particular todas, de las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y, y descrita en el documento WO 2012/044915; CBH1 Cel7A de Aspergillus fumigatus, por ejemplo la descrita como SEQ ID NO: 6 en el documento WO2011/057140 y SEQ ID NO: 10 aquí, y CBH II de Aspergillus fumigatus, por ejemplo la descrita como SEQ ID NO: 18 en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 11 aquí.
En una realización preferida, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además una hemicelulasa, o una composición de enzima hemicelulolítica, tal como una xilanasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 8 aquí) y beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 aquí).
En una realización, la composición de enzima celulolítica también comprende una xilanasa (por ejemplo, derivada de una cepa del género Aspergillus, en particular Aspergillus aculeatus o Aspergillus fumigatus; o una cepa del género Talaromyces, en particular Talaromyces leycettanus) y/o una beta-xilosidasa (por ejemplo, derivada de Aspergillus, en particular Aspergillus fumigatus, o una cepa de Talaromyces, en particular Talaromyces emersonii).
En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (por ejemplo, documento WO 2005/074656 o SEQ ID NO: 4 aquí), proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (por ejemplo, la descrita en el documento WO 2008/057637, en particular como SEQ ID NOs: 59 y 60), y xilanasa de Aspergillus aculeatus (por ejemplo, Xyl II en el documento WO 94/21785 o SEQ ID NO: 6 aquí).
En otra realización, la preparación de enzima celulolítica comprende una preparación celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/074656 o SEQ ID NO: 4 aquí), beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí) y xilanasa de Aspergillus aculeatus (Xyl II descrita en el documento WO 94/21785 o SEQ ID NO: 6 aquí).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica comprende una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/074656 o SEQ ID NO: 4 aquí), beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí) y xilanasa de Aspergillus aculeatus (por ejemplo, Xyl II descrita en el documento WO 94/21785 o SEQ ID NO: 6 aquí).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el descrito en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí, beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ iD No : 5 aquí) y xilanasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, Xyl III en el documento WO 2006/078256 o SEQ ID NO: 8 aquí).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica comprende una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el descrito en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí, betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí), xilanasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, Xyl III en el documento WO 2006/078256 o SEQ ID NO: 8 aquí), y CBH I de Aspergillus fumigatus, en particular CBH1 Cel7A descrita como SEQ ID NO: 2 en WO2011/057140 o SeQ ID NO: 10 aquí.
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el descrito en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí, beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí), xilanasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, Xyl III en el documento WO 2006/078256 o SEQ ID NO: 8 aquí), CBH I de Aspergillus fumigatus, en particular CBH1 Cel7A descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 10 aquí, y c Bh II derivada de Aspergillus fumigatus, en particular la descrita como SEQ ID NO: 4 en el documento WO 2013/028928 o SEQ ID NO: 11 aquí.
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además polipéptido AA9 (GH61A) de Penicillium emersonii que tiene actividad potenciadora celulolítica, en particular el descrito en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí, beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/047499 o SeQ ID NO: 5 aquí), o una variante de la misma con una o más, en particular todas, de las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y; xilanasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, Xyl III en el documento WO 2006/078256 o SEQ ID NO: 8 aquí), CBH I de Aspergillus fumigatus, en particular CBH I Cel7A descrita como SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 10 aquí, y CBH II derivada de Aspergillus fumigatus, en particular la descrita en el documento WO 2013/028928 o SeQ iD NO: 11 aquí.
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende la CBH I de SEQ ID NO: 14 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49536 (documento WO2012/103293); una CBH II de SEQ ID NO:15 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288); una variante de beta-glucosidasa de SEQ ID NO: 5 aquí (No. de acceso GENSEQP AZU67153 (documento WO 2012/44915)), en particular con una o más, en particular todas, de las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y; y AA9 (polipéptido GH61) de SEQ ID NO: 7 aquí (No. de acceso GENSEQP BAL61510 (documento WO 2013/028912)).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende la CBH I de SEQ ID NO: 14 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49536 (documento WO2012/103293)); la CBH II de SEQ ID NO: 15 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288); la xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 16 aquí (No. de acceso GENSEQP BAK46118 (documento WO 2013/019827)); y la beta-xilosidasa de SEQ ID NO: 17 aquí (No. de acceso GENSEQP AZI04896 (documento WO 2011/057140)).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende la CBH I de SEQ ID NO: 14 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49536 (documento WO2012/103293)); la CBH II de SEQ ID NO: 15 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288)); y el AA9 (polipéptido GH61) de SEQ ID NO: 7 aquí (No. de acceso GENSEQP BAL61510 (documento WO 2013/028912)).
En otra realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende la CBH I de SEQ ID NO: 14 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49536 (documento WO2012/103293)); la CBH II de SEQ ID NO: 15 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288)), el AA9 (polipéptido GH61) de SEQ ID NO: 7 aquí (No. de acceso GENSEQP BAL61510 (documento WO 2013/028912)), y la catalasa de SEQ ID NO: 19 aquí (No. de acceso GENSEQP BAC11005 (documento WO 2012/130120)).
En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende la CBH I de SEQ ID NO: 14 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288); la CBH II de SEQ ID NO: 15 aquí (No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288)), la variante de beta-glucosidasa de sEq ID NO: 5 aquí (No. de acceso GENSEQP AZU67153 (documento WO 2012/44915)), con una o más, en particular todas, de las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y; el AA9 (polipéptido GH61) de SEQ ID NO: 7 aquí (No. de acceso GENSEQP BAL61510 (documento WO 2013/028912)), la xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 16 aquí (No. de acceso GENSEQP BAK46118 (documento WO 2013/019827)), y la beta-xilosidasa de SEQ ID NO: 17 aquí (No. de acceso GENSEQP AZI04896 (documento WO 2011/057140)).
En una realización, la composición celulolítica es una preparación de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende EG I de SEQ iD NO: 21 aquí (No. de acceso Swissprot P07981), EG II de SEQ ID NO: 22 aquí (No. de acceso EMBL M19373), CBH I de SEQ ID No: 14 aquí; CBH II de SEQ ID nO: 15 aquí; variante de beta-glucosidasa de SEQ ID NO: 5 aquí, con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, f512Y; el AA9 (polipéptido GH61) de SEQ ID NO: 7 aquí, xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 16 aquí; y beta-xilosidasa de SEQ ID NO: 17 aquí.
La composición de enzima celulolítica comprende o puede comprender además una o más (varias) proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido AA9 (es decir, GH61) que tiene actividad potenciadora celulolítica, una hemicelulasa, una expansina, una esterasa, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa, y una swollenina.
En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica comercial. Ejemplos de composiciones de enzima celulolítica comerciales adecuadas para uso en un procedimiento de la invención incluyen: CELLIC® CTec (Novozymes A/S), CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S), CELLIC® CTec3 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), ACCELLERASE™ 1000, ACCELLERASE 1500, ACCELLERASE™ TRIO (DuPont), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), or ALTERNAFUEL® CMAX3™ (Dyadic International, Inc.). La composición de enzima celulolítica se puede añadir en una cantidad eficaz de alrededor de 0,001 a alrededor de 5,0% en peso de sólidos, por ejemplo alrededor de 0,025 a alrededor de 4,0% en peso de sólidos, o alrededor de 0,005 a alrededor de 2,0% en peso de sólidos.
Endoglucanasa
La composición de enzima celulolítica usada en un procedimiento de la invención puede comprender una endoglucanasa de cualquier origen.
Los ejemplos de endoglucanasas bacterianas que pueden usarse en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (documentos WO 91/05039; WO 93/15186; Patente U.S. No. 5.275.944; WO 96/02551; Patente U.S. No. 5.536.655; WO 00/70031; WO 05/093050), endoglucanasa de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanasa III de Thermobifida fusca (documento WO 05/093050), y endoglucanasa V de Thermobifida fusca (documento WO 05/093050).
Los ejemplos de endoglucanasas fúngicas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, endoglucanasa I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglucanasa I Cel7B de Trichoderma reesei (GenBank: M15665), endoglucanasa II de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanasa II Cel5A de Trichoderma reesei (GenBank: M19373), endoglucanasa III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, GenBank:AB003694), endoglucanasa V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, GenBank:Z33381), endoglucanasa de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanasa de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanasa de Fusarium oxysporum (GenBank: L29381), endoglucanasa de Humicola grísea var. termoidea (GenBank: AB003107), endoglucanasa de Melanocarpus albomyces (GenBank: MAL515703), endoglucanasa de Neurospora crassa (GenBank: XM_324477), endoglucanasa V de Humicola insolens, endoglucanasa de Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanasa I de Thermoascus aurantiacus (GenBank: AF487830), endoglucanasa de Trichoderma reesei cepa No. VTT-D-80133 (GenBank: M15665), endoglucanasa de Penicillium pinophilum (documento WO 2012/062220); y (documento WO 2013/019780).
En una realización, la endoglucanasa, tal como la derivada de Trichoderma reesei u homólogo de la misma, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una endoglucanasa (EG) que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21 aquí;
(ii) una endoglucanasa (EG) que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, tal como al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 21 aquí.
En una realización, la endoglucanasa, tal como la derivada de Trichoderma reesei u homólogo de la misma, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una endoglucanasa (EG) que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 22 aquí;
(ii) una endoglucanasa (EG) que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, tal como al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 22 aquí.
Polipéptido AA9 (es decir, GH61) que tiene actividad potenciadora celulolítica
La composición de enzima celulolítica utilizada según la invención puede comprender en una realización uno o más polipéptidos AA9 (GH61) que tienen actividad potenciadora celulolítica. La composición de enzima celulolítica usada en un procedimiento de la invención puede comprender un polipéptido AA9 (GH61) de cualquier origen.
Ejemplos de polipéptidos AA9 útiles en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos Aa 9 de Thielavia terrestris (documentos WO 2005/074647, WO 2008/148131, y WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (documentos WO 2005/074656 y WO 2010/065830), Trichoderma reesei (documentos w O 2007/089290 y WO 2012/149344), Myceliophthora thermophila (documentos WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868, y WO 2009/033071), Aspergillus fumigatus (documento WO 2010/138754), Penicillium pinophilum (documento WO 2011/005867), Thermoascus sp. (documento WO 2011/039319), Penicillium sp. (emersoni0 (documentos WO 2011/041397 y WO 2012/000892), Thermoascus crustaceous (documento WO 2011/041504), Aspergillus aculeatus (documento WO 2012/125925), Thermomyces lanuginosus (documentos WO 2012/113340, WO 2012/129699, WO 2012/130964, y WO 2012/129699), Aurantiporus alborubescens (documento WO 2012/122477), Trichophaea saccata (documento WO 2012/122477), Penicillium thomii (documento WO 2012/122477), Talaromyces stipitatus (documento WO 2012/135659), Humicola insolens (documento WO 2012/146171), Malbranchea cinnamomea (documento WO 2012/101206), Talaromyces leycettanus (documento WO 2012/101206), and Chaetomium thermophilum (documento WO 2012/101206), y Talaromyces thermophilus (documentos WO 2012/129697 y WO 2012/130950).
En un aspecto, el polipéptido AA9 se usa en presencia de un catión de metal divalente activante soluble según el documento WO 2008/151043, por ejemplo manganeso o cobre.
En otro aspecto, el polipéptido AA9 se usa en presencia de un compuesto dioxi, un compuesto bicíclico, un compuesto heterocíclico, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto de quinona, un compuesto que contiene azufre, o un licor obtenido a partir de un material celulósico pretratado, tal como el rastrojo de maíz pretratado (documentos WO 2012/021394, WO 2012/021395, WO 2012/021396, WO 2012/021399, WO 2012/021400, WO 2012/021401, WO 2012/021408, y WO 2012/021410).
En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido AA9 (GH61) que tiene actividad potenciadora celulolítica, tal como el derivado del género Termoascus, tal como una cepa de Thermoascus aurantiacus, tal como el descrito en el documento WO 2005/074656 como SEQ iD NO: 2 o SEQ ID NO: 4 aquí; o el derivado del género Thielavia, tal como una cepa de Thielavia terrestris, tal como el descrito en el documento WO 2005/074647 como SEQ ID n O: 7 y SEQ ID n O: 8 y SEQ ID NO: 2 aquí; o el derivado de una cepa de Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como el descrito en el documento WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2; o el derivado de una cepa derivada de Penicillium, tal como una cepa de Penicillium emersonii, tal como el descrito en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí.
En una realización, el polipéptido AA9 (GH61) de Thermoascus aurantiacus que tiene actividad potenciadora celulolítica, u homólogo del mismo, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende el polipéptido maduro de SEQ iD NO: 4 aquí;
(ii) un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 aquí.
En otra realización el polipéptido AA9 (GH61) de Penicillium sp. que tiene actividad potenciadora celulolítica, u homólogo del mismo, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 7 aquí;
(ii) un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 7 aquí.
Beta-glucosidasa
Según la invención, puede estar presente y/o añadirse una beta-glucosidasa en la etapa de sacarificación (a). La composición de enzima celulolítica usada en un procedimiento de la invención puede comprender una betaglucosidasa de cualquier origen.
Los ejemplos de beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, beta-glucosidasas de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (documento WO 2005/047499), Aspergillus n iger(Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (documento WO 02/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (documentos WO 2007/019442 y WO 2010/088387), Thielavia terrestris (documento WO 2011/035029), y Trichophaea saccata (documento WO 2007/019442).
En una realización, la beta-glucosidasa puede ser la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger o Aspergillus oryzae, tal como la descrita en el documento WO 2002/095014 o la proteína de fusión que tiene actividad de beta-glucosidasa descrita en el documento WO 2008/057637 como SEQ ID NOs: 59 y 60, o Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí, o una variante de betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2012/044915, tal como una con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando, para la numeración, SEQ ID NO: 5 aquí).
En otra realización, la beta-glucosidasa deriva de una cepa del género Penicillium, tal como una cepa de Penicillium brasilianum descrita en el documento WO 2007/019442, o una cepa del género Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei.
En una realización, la beta-glucosidasa es una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, u homólogo de la misma, seleccionada del grupo que consiste en:
(i) una beta-glucosidasa que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí;
(ii) una beta-glucosidasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí.
En una realización, la beta-glucosidasa es una variante que comprende una sustitución en una o más (varias) posiciones correspondientes a las posiciones 100, 283, 456 y 512 del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí, en la que la variante tiene actividad de beta-glucosidasa.
En una realización, la beta-glucosidasa es una variante de (a) un polipéptido que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí; (b) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí; o (c) un fragmento del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí, que tiene actividad de betaglucosidasa.
En una realización, la variante de beta-glucosidasa tiene al menos 80%, por ejemplo al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 aquí.
En una realización, la beta-glucosidasa es de una cepa de Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, mostrada en SEQ ID NO: 5 aquí), que comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E y F512Y; tal como una variante de la misma con las siguientes sustituciones:
• F100D S283G N456E F512Y;
• L89M G91L I186V I140V;
• I186V L89M G91L I140V F100D S283G N456E F512Y.
En una realización, el número de sustituciones está entre 1 y 10, tal como 1 y 8, tal como 1 y 6, tal como 1 y 4, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones.
En una realización, la variante comprende una sustitución en una posición correspondiente a la posición 100, una sustitución en una posición correspondiente a la posición 283, una sustitución en una posición correspondiente a la posición 456, y/o una sustitución en una posición correspondiente a la posición 512.
En una realización preferida, la variante de beta-glucosidasa comprende las siguientes sustituciones: Phe100Asp, Ser283Gly, Asn456Glu, Phe512Tyr en la SEQ ID NO: 5 aquí.
Celobiohidrolasa
La composición de enzima celulolítica usada en un procedimiento de la invención puede comprender una celobiohidrolasa, tal como CBH I y/o CBH II, de cualquier origen.
Los ejemplos de celobiohidrolasas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus aculeatus cellobiohydrolase II (documento WO 2011/059740), Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase I (documento WO 2013/028928), Aspergillus fumigatus cellobiohydrolase II (documento WO 2013/028928), Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase I, Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase II, Humicola insolens cellobiohydrolase I, Myceliophthora thermophila cellobiohydrolase II (documento WO 2009/042871), Penicillium occitanis cellobiohydrolase I (GenBank:AY690482), Talaromyces emersoniicellobiohydrolase I (GenBank:AF439936), Thielavia hyrcanie cellobiohydrolase II (documento WO 2010/141325), Thielavia terrestris cellobiohydrolase II (CEL6A, WO 2006/074435), Trichoderma reesei cellobiohydrolase I, Trichoderma reesei cellobiohydrolase II, and Trichophaea saccata cellobiohydrolase II (documento WO 2010/057086). Celobiohidrolasa I.
Celobiohidrolasa I
La composición de enzima celulolítica usada en un procedimiento de la invención puede comprender en una realización una o más CBH I (celobiohidrolasa I). En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa I (CBH I), tal como la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la CBH I Cel7A descrita en SEQ iD NO: 6 en el documento W o 2011/057140 o SEQ ID NO: 10 aquí; una cepa del género Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei; o una cepa del género Talaromyces, tal como una cepa de Talaromyces leycettanus, preferiblemente la mostrada en SEQ ID NO: 14 aquí o No. de acceso GENSEQP AZY49536 (documento WO2012/103293).
En una realización, la celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus, u homólogo de la misma, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una celobiohidrolasa I que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 aquí;
(ii) una celobiohidrolasa I que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 aquí.
En otra realización, la celobiohidrolasa I, por ejemplo la derivada de una cepa de Talaromyces leycettanus, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una celobiohidrolasa I que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 14 aquí;
(ii) una celobiohidrolasa I que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 14 aquí.
Celobiohidrolasa II
La composición de enzima celulolítica usada según la invención puede comprender en una realización una o más CBH II (celobiohidrolasa II). En una realización, la celobiohidrolasa II (CBHII), tal como la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la de SEQ ID NO: 11 aquí, o una cepa del género Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, o una cepa del género Thielavia, tal como una cepa de Thielavia terrestris, tal como la celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris; o una cepa del género Talaromyces, tal como una cepa de Talaromyces leycettanus, preferiblemente la mostrada en SEQ ID NO: 15 aquí o No. de acceso GENSEQP AZY49446 (documento WO2012/103288).
En una realización, la celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus, u homólogo de la misma, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una celobiohidrolasa II que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 11 aquí;
(ii) una celobiohidrolasa II que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 11 aquí.
En otra realización, la celobiohidrolasa II, por ejemplo la derivada de una cepa de Talaromyces leycettanus, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una celobiohidrolasa II que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 15 aquí;
(ii) una celobiohidrolasa II que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 15 aquí.
Hemicelulasas
Según la invención, puede estar presente y/o añadirse una hemicelulasa durante la sacarificación en la etapa (a). La hemicelulasa puede estar en forma de una composición de enzima hemicelulolítica. La hemicelulasa puede ser de cualquier origen, pero preferiblemente de origen fúngico o bacteriano.
El término “hemicelulasa” o “enzima hemicelulolítica” significa una o más (varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico. Véase, por ejemplo, Shallom y Shoham, 2003, Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 6(3): 219-228. Las hemicelulasas son componentes clave en la degradación de la biomasa vegetal. Ejemplos de hemicelulasas incluyen, pero no se limitan a, una acetilmanano esterasa, una acetilxilano esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido cumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa, y una xilosidasa. Los módulos catalíticos de las hemicelulasas son glucósido hidrolasas (GH) que hidrolizan enlaces glucosídicos, o carbohidrato esterasas (CE), que hidrolizan enlaces de éster de acetato o de grupos laterales de ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, basados en la homología de su secuencia primaria, pueden asignarse a familias de GH y CE marcadas con números. Algunas familias, con un pliegue general similar, se pueden agrupar además en clanes, marcados alfabéticamente (por ejemplo, GH-A). Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas de hidratos de carbono está disponible en la base de datos de enzimas activas de hidratos de carbono (CAZy). Las actividades de las enzimas hemicelulolíticas se pueden medir según Ghose y Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752.
En una realización, la hemicelulasa presente y/o añadida en la sacarificación es una composición de enzima hemicelulolítica. En una realización, la composición de enzima hemicelulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además una xilanasa y/o una beta-xilosidasa. En una realización preferida, la composición de enzima hemicelulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además xilanasa de Aspergillus fumigatus (XYL III mostrada en SEQ ID NO: 8 aquí) y beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 9 aquí).
La hemicelulasa o preparación de enzima hemicelulolítica se puede añadir preferiblemente en concentraciones entre 0,01 y 20 mg de EP/g de celulosa, tal como 0,1-1 mg de EP/g de celulosa.
Xilanasas
En una realización preferida, la hemicelulasa es una xilanasa, o la composición de enzima hemicelulolítica comprende una xilanasa. El término “xilanasa” significa una 1,4-beta-D-xilano-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos. Para los fines de la presente invención, la actividad de xilanasa se determina con AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en TRITON® X-100 al 0,01% y amortiguador de fosfato sódico 200 mM pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1,0 pmol de azurina producida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano al 0,2% como sustrato en amortiguador de fosfato sódico 200 mM pH 6.
Los ejemplos de xilanasas útiles en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, xilanasas de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; documento WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (documento WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (documento WO 2011/041405), Penicillium sp. (Documento WO 2010/126772), Thermomyces lanuginosus (GeneSeqP:BAA22485), Talaromyces thermophilus (GeneSeqP:BAA22834), Thielavia terrestris NRRL 8126 (documento WO 2009/079210), y Trichophaea saccata (documento WO 2011/057083).
Los ejemplos de xilanasas contempladas específicamente incluyen xilanasas GH10, tal como la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita como Xyl III en el documento WO 2006/078256, o Aspergillus aculeatus, tal como la descrita en el documento WO 94/21785 como SEQ ID NO: 5 (Xyl II).
La xilanasa puede estar comprendida en una preparación de enzima celulolítica que además incluye una xilanasa. En una realización, la hemicelulasa es una preparación de enzima celulolítica que además comprende una xilanasa, preferiblemente una xilanasa GH10, tal como la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita como Xyl III en el documento WO 2006/078256, o Aspergillus aculeatus, tal como la descrita en el documento WO 94/21785 como SEQ ID NO: 5 (Xyl II) o SEQ ID NO: 6 aquí.
En una realización, la xilanasa deriva de Aspergillus aculeatus, tal como la mostrada en SEQ ID NO: 6 aquí. En una realización preferida, la xilanasa deriva de Aspergillus fumigatus, tal como la mostrada en SEQ ID NO: 8 aquí.
Las xilanasas contempladas también incluyen aquellas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad con la xilanasa de Aspergillus fumigatus en el documento WO 2006/078256 mostrado como SEQ ID NO: 8 aquí, o la xilanasa de Aspergillus aculeatus descrita en el documento WO 94/21785 como SEQ ID NO: 5 (Xyl II) o SEQ ID NO: 6 aquí.
En una realización, la xilanasa, por ejemplo derivada de una cepa de Talaromyces leycettanus, comprendida en la composición de enzima celulolítica, tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad, al menos 97%, al menos al menos 98%, al menos 99% de identidad con SEQ ID NO: 16 aquí.
Beta-xilosidasas
En una realización preferida, la hemicelulasa usada en un procedimiento de la invención es una beta-xilosidasa, o la composición de enzima hemicelulolítica comprende una beta-xilosidasa. El término “beta-xilosidasa” significa una beta-D-xilósido xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exohidrólisis de beta (1^4)-xilooligosacáridos cortos, para eliminar sucesivos restos de D-xilosa de los extremos no reductores. Para los fines de la presente invención, una unidad de beta-xilosidasa se define como 1,0 pmol de anión p-nitrofenolato producido por minuto a 40°C, pH 5, a partir de p-nitrofenil-beta-D-xilósido 1 mM como sustrato en 100 mM de citrato de sodio que contiene TWEEN® 20 al 0,01%.
Ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los procedimientos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, betaxilosidasas de Neurospora crassa (SwissProt:Q7SOW4), Trichoderma reesei (UniProtKB/TrEMBL:Q92458), Talaromyces emersonii (SwissProt:Q8X212), and Talaromyces thermophilus (GeneSeqP:BAA22816).
Los ejemplos de beta-xilosidasa contemplada específicamente incluyen la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus, tal como la descrita en el documento WO 2013/028928 (Ejemplo 16 y 17) o SEQ ID NO: 9 aquí, o derivada de una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei, tal como el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 58 en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 1 aquí.
La beta-xilosidasa usada en un procedimiento de la invención puede estar comprendida en una composición de enzima celulolítica. En una realización, la hemicelulasa es una composición de enzima celulolítica; tal como composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei; que comprende además una beta-xilosidasa, tal como la derivada de una cepa del género Aspergillus, tal como una cepa de Aspergillus fumigatus (por ejemplo, la descrita en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 9 aquí), tal como la descrita en el documento WO 2013/028928 (Ejemplos 16 y 17), o derivada de una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de Trichoderma reesei, tal como el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 58 en el documento WO 2011/057140.
Las beta-xilosidasas contempladas también incluyen aquellas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad con la beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus descrita como SEQ ID NO: 206 en el documento WO 2011/057140 o SEQ ID NO: 9 aquí, o cualquiera de las beta-xilosidasas mencionadas aquí.
En una realización, la beta-xilosidasa, por ejemplo derivada de una cepa de Talaromyces emersonii, comprendida en la composición de enzima celulolítica, tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad con SEQ ID NO: 17 aquí.
La hemicelulasa utilizada en un procedimiento de la invención puede comprender un producto de hemicelulasa comercial. Ejemplos de productos comerciales de hemicelulasa incluyen, por ejemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec2 (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec3 (Novozymes), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xylanase (Genencor), Ec OPUl P® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xylanase (DSM), De Po L™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), y DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, Uk ).
Catalasas
Las composiciones de enzima celulolítica pueden comprender una catalasa. La catalasa puede ser cualquier catalasa. La catalasa puede incluir, pero no se limita a, una catalasa E.C. 1.11.1.6 o E.C. 1.11.1.21.
Los ejemplos de catalasas útiles incluyen, pero no se limitan a, catalasas de Alcaligenes aquamarinus (documento WO 98/00526), Aspergillus lentilus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger (Patente U.S. No. 5,360,901), Aspergillus oryzae (documento JP 2002223772A; Patente U.S. No. 6,022,721), Bacillus thermoglucosidasius (documento JP 1 1243961a ), Humicola insolens (documentos WO 2009/104622, WO 2012/130120), Malbranchea cinnamomea, Microscilla furvescens (documento WO 98/00526), Neurospora crassa, Penicillium emersonii (documento WO 2012/130120), Penicillium pinophilum, Rhizomucor pusillus, Saccharomyces pastorianus (documento WO 2007/105350), Scytalidium thermophilum, Talaromyces stipitatus (documento w O 2012/130120), Thermoascus aurantiacus (documento WO 2012/130120), Thermus brockianus (documento WO 2005/044994), y Thielavia terrestris (documento WO 2010/074972).
Las catalasas útiles son las catalasas de Bacillus pseudofirmus (UNIPROT:P30266), Bacillus subtilis (UNIPROT:P42234), Humicola grisea (GeneSeqP: AXQ55105), Neosartorya fischeri (UNIPROT:A1 DJU9), Penicillium emersonii (GeneSeqP:BAC10987), Penicillium pinophilum (GeneSeqP:BAC10995), Scytalidium thermophilum (GeneSeqP:AAW06109 o ADT89624), Talaromyces stipitatus (GeneSeqP:BAC10983 o BAC11039; UNIPROT:B8MT74), y Thermoascus aurantiacus (GeneSeqP:BAC11005). Los números de acceso se incorporan aquí en su totalidad.
En una realización preferida, las composiciones de enzima celulolítica pueden comprender una catalasa, por ejemplo la derivada de Termoascus, en particular Thermoascus aurantiacus, en particular la mostrada en el documento WO 2012/130120 o SEQ ID NO: 19 aquí.
En una realización, la catalasa, por ejemplo la derivada de una cepa de Thermoascus auranticus, se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una catalasa que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 19 aquí;
(ii) una catalasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60%, al menos 70%, por ejemplo al menos 75%, al menos el 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 19 aquí.
El contenido de proteína de la catalasa está en el intervalo de alrededor de 0,5% a alrededor de 10%, por ejemplo alrededor de 0,5% a alrededor de 7%, alrededor de 0,5% a alrededor de 5%, alrededor de 0,5% a alrededor de 4%, alrededor de 0,5% a alrededor de 3%, alrededor de 0,5% a alrededor de 2%, y alrededor de 0,5% a alrededor de 1% de proteína enzimática total en la reacción de sacarificación/hidrólisis.
En una realización, la relación de proteína de catalasa a composición de enzima celulolítica está en el intervalo de alrededor de 1:200 a alrededor de 1:10, por ejemplo alrededor de 1:100 a alrededor de 1:15, o alrededor de 1:50 a alrededor de 1:25.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Materiales:
Composición de Enzima Celulolítica CA (“CA”): Preparación de enzima celulolítica derivada de Trichoderma reesei que además comprende polipéptido GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica derivado de una cepa de Penicillium emersonii (SEQ iD No : 2 en el documento WO 2011/041397 o SEQ ID NO: 7 aquí), beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/047499 o SEQ ID NO: 5 aquí) variante F100D, S283G, N456E, F512Y) descrita en el documento WO 2012/044915; CBH1 Cel7A de Aspergillus fumigatus descrita como SEQ ID No : 6 en el documento WO2011/057140 y SEQ ID NO: 10 aquí, y CBH II de Aspergillus fumigatus descrita como SEQ ID NO: 18 en el documento WO 2011/057140 y SEQ ID n O: 11 aquí. Además, la Preparación de Enzima Celulolítica CA comprende además 10% de una preparación de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además xilanasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 8 aquí) y beta-xilosidasa de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 9 aquí).
Composición de Enzima Celulolítica CB (“CB”): Preparación de enzima celulolítica de Trichoderma reesei que comprende EG I de SEQ ID NO: 21 aquí, EG II de SEQ ID NO: 22 aquí, CBH I de SEQ ID NO: 14 aquí; CBH II de SEQ ID NO: 15 aquí; variante de beta-glucosidasa de SEQ ID NO: 5 aquí, con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, f512Y; el AA9 (polipéptido GH61) de SEQ ID NO: 7 aquí, xilanasa GH10 de SEQ ID NO: 16 aquí; y beta-xilosidasa de SEQ ID NO: 17 aquí.
CIBTS1260: Levadura de Saccharomyces cerevisiaedepositada por Novozymes A/S bajo los términos del Tratado de Budapest con la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE.UU.) y a la que se le otorgó el siguiente número de acceso:
Depósito Número de acceso Fecha de deposito
CIBTS1260 NRRL Y-50973 5 de septiembre de 2014
BSGX001 se describe en la patente US No. 8.586.336-B2, y se construyó de la siguiente manera: La cepa hospedante BSPX042 de Saccharomyces cerevisiae (fenotipo: ura3-251, sobreexpresión de XKS1; sobreexpresión de RPE1, RKI1, TAL1, y TKL1, los cuales son genes en PPP; sin el gen de aldosa reductasa GRE3; y daño de la cadena respiratoria de transporte de electrones al suprimir el gen COX4 después de la evolución adaptativa) se transformó con el vector pJFE3-RuXI insertado con el gen de xilosa isomerasa (SEQ ID NO: 1 en la patente US No. 8.586.336-B2 o SEQ ID NO: 20 aquí) que codifica RuXI mostrada en SEQ ID NO: 2 en la patente US No. 8.586.336-B2 o SEQ ID NO: 13 aquí.
Métodos:
Identidad
La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias polinucleotídicas se describe mediante el parámetro “identidad”.
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) utilizando el software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: penalización de espacio de 10 y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación por pares son Ktuple=1, penalización de espacio=3, ventanas=5, y diagonales=5.
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias polinucleotídicas se determina mediante el método de Wilbur-Lipman (Wilbur y Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) utilizando el software LASERGENE™ m Eg ALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: penalización de espacio de 10 y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación por pares son Ktuple=3, penalización de espacio=3, y ventanas = 20.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Construcción de la cepa CIBTS1000.
Se identificó una cepa de Saccharomyces cerevisiae diploide que se sabe que es un productor eficiente de etanol a partir de glucosa. Se utilizó la cepa CCTCC M94055 de S. cerevisiae Chinese Center for Type Culture Collection (CCTCC).
Se clonó una xilosa isomerasa, denominada mgXI, a partir de un proyecto de metagenómico, lo que significa que se desconoce el organismo donante. El aislamiento y las características de esta xilosa isomerasa se describen en la solicitud de patente CN No. 102174549A o la publicación de patente US No. 2012/0225452.
Se clonó un transportador de pentosa, denominado GXF, de Candida intermedia utilizando métodos estándar. Este transportador de xilosa se describió por D. Runquist et. al. (Runquist D, Fonseca C, Radstrom P, Spencer-Martins I, Hahn-Hagerdal B: ''Expression of the Gxf1 transporter from Candida intermedia improves fermentation performance in recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae". Appl Microbiol Biotechnol 2009, 82:123-130).
El gen de la xilosa isomerasa se fusionó con el promotor de Triosa Fosfato Isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae y el terminador de TPI usando métodos estándar, de manera que la expresión de la xilosa isomerasa en S. cerevisiae se controlara por las señales de expresión de TPI.
El gen GXF se fusionó con las señales de expresión de TPI de la misma manera.
Estos dos casetes de expresión se insertaron en un vector de clonación de Escherichia co lique contiene:
• El origen de replicación de E. co licolE1 que asegura que el plásmido se pudiera propagar en E. coli.
• Un fragmento de la secuencia delta (5) de Saccharomyces cerevisiae.
• Un marcador de resistencia a la zeocina de Streptoalloteichus hindustanus para la selección de transformantes de E. coli o S. cerevisiae resistentes a zeocina. Se fusionó un doble promotor al extremo 5’ del gen de zeocina que consiste en un promotor del Factor de Alargamiento de la T raducción (TEF1) de S. cerevisiae y un promotor EM7 de E. coli. El terminador CYC1 de S. cerevisiae se añadió al extremo 3’ del gen de zeocina. Todo el casete de expresión de zeocina estaba flanqueado por sitios loxP para permitir la eliminación de este casete de expresión mediante recombinación Cre-lox (B. Sauer: "Functional expression of the Cre-Lox site specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Mol. Cell. Biol.
1987, 7: 2087-2096).
El plásmido de expresión de xilosa isomerasa/transportador de pentosa se denominó pYIE2-mgXI-GXF1-5, y se muestra en la Fig. 1.
El plásmido pYIE2-mgXI-GXF1 -delta se linealizó primero mediante digestión con XhoI, y después se transformó en la cepa parental Saccharomyces cerevisiae CCTCC M94055 tras la selección de transformantes resistentes a zeocina. Se aisló una cepa denominada CIBTS0912 que tiene el plásmido integrado en una secuencia delta. El casete de resistencia a zeocina ubicado entre los dos sitios loxP se eliminó entonces mediante expresión transitoria de recombinasa CRE, dando como resultado la cepa CIBTS0914.
La expresión transitoria de recombinasa CRE se logró de forma similar al método estándar de levadura descrito por Prein et. al. (Prein B, Natter K, Kohlwein SD. "A novel strategy for constructing N-terminal chromosomal fusions to green fluorescent protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae". FEBS Lett. 2000: 485, 29-34.), transformando con un plásmido inestable que expresa la recombinasa CRE, seguido del curado para ese plásmido nuevamente. En este trabajo, el gen de kanamicina del vector estándar de levadura pSH47 se reemplazó por un marcador de resistencia a higromicina de modo que en lugar de seleccionar la resistencia a kanamicina, se utilizó la selección para higromicina. En la Fig. 2 se muestra un mapa plasmídico del plásmido pSH47-hyg usado.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
La cepa CIBTS0914 se transformó de nuevo con pYIE2-mgXI-GXF1-5 digerido con Xhol para aumentar el número de copias de los dos casetes de expresión, y se seleccionó una cepa resistente a zeocina, CIBTS0916.
Para sobreexpresar los genes de la ruta de pentosa fosfato, se ensambló un plásmido de expresión que albergaba los genes seleccionados de la ruta de pentosa fosfato.
Los genes seleccionados para la sobreexpresión fueron:
1. Xiluloquinasa (XKS1).
2. Trans-aldolasa (TAL1).
3. Ribulosa 5 fosfato epimerasa (RPE1).
4. Transcetolasa (TKL1).
5. Ribosa 5 fosfato isomerasa (RKI1)
Además de estos genes, el casete de selección KanMX, rodeado por sitios loxP, se incluyó como parte del vector lanzadera pUG6 de E. co li- S. cerevisiae (Güldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. "A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast." NAR 1996, 24:2519-24).
En la Fig. 3 se muestra un mapa del plásmido pYIE2-XKS1-PPP-5 resultante. A continuación, se muestra una tabla que enumera los elementos genéticos utilizados:
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0001
El plásmido pYIE2-XKS1-PPP-5 se digirió con Notl, y los elementos del vector se eliminaron mediante electroforesis en gel de agarosa. A continuación, el fragmento lineal que contenía todos los casetes de expresión se transformó en CIBTS0916 para la recombinación homóloga doble seguida de la selección para la resistencia a kanamicina (G418). Se seleccionó una colonia resistente a la kanamicina, y se denominó CIBTS0931.
CIBTS0931 contiene tanto el marcador de selección de zeocina como el marcador de selección de kanamicina. Ambos están flanqueados por sitios de recombinación loxP.
Para eliminar los marcadores de resistencia a zeocina y kanamicina, la cepa se transformó de nuevo con el plásmido episomal pSH47-hyg, y los transformantes se seleccionaron en placas que contenían higromicina. Posteriormente, se realizó el cribado de transformantes que habían perdido resistencia a zeocina y kanamicina, y después de eso, se realizó el cribado de una cepa que también perdió el marcador de resistencia a higromicina. Se seleccionó una cepa CIBTS1000, y se demostró que había perdido el plásmido pSH47-hyg.
Ejemplo 2
Adaptación de la cepa CIBTS1000 a una alta absorción de xilosa y resistencia al acetato.
La cepa CIBTS1000 se modificó para que pudiera utilizar xilosa como fuente de carbono y fermentarla a etanol. Sin embargo, la utilización de xilosa fue muy ineficaz. Una forma bien conocida de mejorar eso, en el campo de la ingeniería metabólica, es utilizar la adaptación. Esto también se hizo en este caso. La cepa CIBTS1000 se transfirió en serie de matraz de agitación a matraz de agitación en un medio que contenía xilosa como única fuente de carbono e inhibidores del crecimiento de levaduras que se sabe que están presentes en los hidrolizados de biomasa celulósica. Durante estas transferencias en serie, se acumulan mutaciones que permiten que la cepa crezca mejor en las condiciones proporcionadas - y de ese modo utilice mejor la xilosa.
En una primera ronda de adaptación, CIBTS1000 se transfirió en serie en un sistema de matraz de agitación utilizando medio YPX (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, y 20 g/l de xilosa) e YPDX (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 10 g/l de glucosa, y 10 g/l de xilosa).
En una segunda ronda de adaptación, la transferencia en serie se realizó en YPXI (YPX suplementado con formiato de sodio 43 mM, acetato de sodio 50 mM, y sulfato de sodio 100 mM) e YPDXI (YPDX suplementado con formiato de sodio 43 mM, acetato de sodio 50 mM, y sulfato de sodio 100 mM).
En una ronda final de adaptación, la transferencia en serie se realizó usando hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con ácido diluido NREL (véase el Ejemplo 3) suplementado con 10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 10 g/l de glucosa, y 10 g/l de xilosa.
Se seleccionó una cepa denominada CIBTS1260-J132-F3 como cepa adaptada.
Ejemplo 3
Comparación de fermentación de CIBTS1260 y BSGX001 en hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con ácido diluido NREL
Las dos cepas de Saccharomyces cerevisiae, CIBTS1260 y BSGX001, se ensayaron en hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con ácido diluido NREL (ácido sulfúrico al 4% p/p a 180°C durante 5 minutos). El hidrolizado se produjo después de 3 días de hidrólisis en un reactor de 20 kg a 50°C con 20 mg de proteína enzimática/g de glucano de la Composición de Enzima Celulolítica CA. El hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con ácido diluido tenía una composición final de 63,2 g/l de glucosa, 44,9 g/l de xilosa, 0,8 g/l de glicerol, y 9,5 g/l de acetato. Antes de la fermentación, cada cepa se propagó en un agitador de aire a 30°C a 150 rpm en medio YPD (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, y 20 g/l de glucosa). Después de 24 horas de crecimiento, estas dos cepas de levadura se evaluaron en 50 ml de hidrolizado en matraces Erlenmeyer con deflectores de 125 ml a una incorporación de levadura de 1 g de peso celular seco (DCW)/l. Para sellar cada matraz, se usaron tapones de goma equipados con agujas de relleno romas de calibre 18, y los matraces se colocaron en un agitador de aire a 35°C a una velocidad de 150 rpm. Se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 horas, para la determinación de las concentraciones de glucosa, xilosa y etanol mediante análisis por HPLC. Los resultados se promediaron para cada conjunto de 3 réplicas, y se dan en la Figura 1, que muestra una comparación de CIBTS1260 frente a BSGX001 en hidrolizado de rastrojo de maíz pretratado con ácido NREL a 1 g/l de incorporación de levadura en 72 horas. Como se muestra en la Fig. 4, a las 48 horas, la cepa CIBTS1260 completó el consumo total de xilosa y produjo aproximadamente 47 g/l de etanol. Sin embargo, la cepa BSGX001 fue lenta para absorber glucosa para la conversión a etanol, y de este modo consumió solo 3 g/l de xilosa. Estos resultados indican que CIBTS1260 da como resultado una mejor absorción y utilización de xilosa para la conversión en etanol en comparación con BSGX001.
Ejemplo 4
Comparación de CIBTS1260 y BSGX001 para el rendimiento de fermentación en medios modelo
Se comparó el rendimiento de fermentación de CIBTS1260 y su precursor BSGX001. Antes de la fermentación, cada cepa se propagó en un agitador de aire a 30°C a 150 rpm en medio YPD (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, y 20 g/l de glucosa). Después de 24 horas de crecimiento, estas dos cepas de levadura se evaluaron en medio YPX (5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de peptona, y 50 g/l de xilosa). Para evaluar el rendimiento de la fermentación, cada cepa se inoculó en 50 ml de medio YPX en matraces Erlenmeyer con deflectores de 125 ml, a una incorporación de levadura de 2 g de DCW/l. Para sellar cada matraz, se usaron tapones de goma equipados con agujas de relleno romas de calibre 18, y los matraces se colocaron en un agitador de aire a 32°C a una velocidad de 150 rpm. Se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 horas, para la determinación de las concentraciones de glucosa, xilosa y etanol mediante análisis por HPLC. Los resultados se promediaron para cada conjunto de 3 repeticiones y se muestran en la Figura 5.
Como se muestra en la Fig. 5, CIBTS1260 (líneas de puntos) ha utilizado completamente toda la xilosa disponible en 24 horas, y produjo 21,3 g/l de etanol. En el tiempo de fermentación de 72 horas, BSGX001 (líneas continuas) consumió 1,5 g/l de xilosa, y la concentración de etanol resultante fue 1,3 g/l.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir etanol, que comprende:
(a) sacarificar un material celulósico con una composición de enzima celulolítica;
(b) fermentar el material celulósico sacarificado con un microorganismo fermentador para producir el producto de fermentación; en el que el organismo fermentador es Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260 (depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EE.UU.).
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende recuperar el producto de fermentación de la fermentación.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el material celulósico se pretrata.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la composición de enzima celulolítica comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido AA9, una hemicelulasa, una CIP, una esterasa, una expansina, una enzima ligninolítica, una oxidorreductasa, una pectinasa, una proteasa, y una swollenina.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, y una beta-glucosidasa.
6. El procedimiento de la reivindicación 4 o 5, en el que la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una xilanasa, una acetilxilano esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa, y una glucuronidasa.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que las etapas (a) y (b) se realizan simultáneamente en una sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el que las etapas (a) y (b) se realizan secuencialmente (SHF).
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el material celulósico se pretrata antes de la sacarificación.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el pretratamiento es un pretratamiento con ácido diluido.
11. Un organismo recombinante de Saccharomyces cerevisiae CIBTS1260, depositado con el número de acceso NRRL Y-50973 en la Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), Illinois 61604 EE.UU.
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