BRPI0616848A2 - semente de planta transgênica com maior teor de lisina - Google Patents

Abstract

SEMENTE DE PLANTA TRANSGéNICA COM MAIOR TEOR DE USINA. A presente invenção refere-se a plantas transgénicas que possuem um novo constructo de DNA exógena que expressa uma ácido dihidrodipicolínico sintase e uma molécula de supressão gênica para a usina cetoglutarato redutase, cuja atividade resulta em um maior teor de usina em uma semente de planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEMENTEDE PLANTA TRANSGÊNICA COM MAIOR TEOR DE USINA".

REIVINDICAÇÃO PRIORITÁRIA

Este pedido de patente reivindica a prioridade do Pedido de PatenteProvisório U.S. N9 de Ser. 60/723.178, depositado em 3 de outubro de 2005,cujo pedido é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. Campo da Invenção

São descritos aqui os constructos de DNA úteis para a produçãode plantas transgênicas com partes possuindo maior teor de Iisina e méto-dos de utilização de tais constructos de DNA para a produção de plantas esementes transgênicas, materiais coletados das plantas e farinha grossa eprodutos alimentícios preparados partindo dos mesmos. Tais constructos deDNA são úteis para a produção de plantas transgênicas com maior benefícionutricional através do maior acúmulo de Iisina na semente. São tambémdescritas as moléculas de polinucleotídeos e os métodos úteis para a produ-ção de plantas transgênicas com maior teor de Iisina em suas sementes.

2. Descrição da técnica Relacionada

Zea mays, comumente conhecido como milho ou milho, é umgrão amplamente utilizado como alimentação para animais e alimento paraseres humanos. O grão, aqui referido como um grão ou uma semente, éuma fonte de proteína, amido e óleo para muitos animais inferiores incluindosuínos, gado de corte e de leite, peixes e aves. Em alguns países, tal comoo México, mais de 70% do milho colhido é utilizado para consumo humano eo milho e os produtos derivados do milho tais como angu de milho e tortilhassão elementos principais da dieta. No grão, o volume da composição de a-minoácidos é determinada pela quantidade e o tipo de aminoácidos contidosnos polipeptídeos. Apenas uma parte relativamente pequena, até 10%, dosaminoácidos disponíveis no grão existe na forma de grupos de aminoácidoslivres; o resto está contido em várias proteínas. No milho, a maior parte dospolipeptídeos encontrados no grão são proteínas de armazenamento da se-mente ou zeínas. Estas proteínas de armazenamento da semente são sinte-tizadas à medida que o grão se desenvolve e são utilizadas como uma fontede energia à medida que o grão germina e começa a crescer. As proteínasde armazenamento da semente, entretanto, contêm pouca ou nenhuma Iisi-na. Dos dez aminoácidos considerados essenciais em um produto alímentí-cio de grãos misturados (arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metio-nina ou cisteína, fenilalanina ou tirosina, treonina, triptofano é valina), nãoestá ausente no milho particularmente apenas a lisina, mas também a treo-nina e a metionina. A ausência destes aminoácidos essenciais, especialmen-te a lisina, requer que o milho para alimentos seja suplementado com estesnutrientes, freqüentemente fornecidos através da adição de farinha de sojaou lisina sintética. Seria benéfico para a técnica aumentar o nível de lisina nasemente de milho como um meio de tornar a semente mais nutritiva comoum alimento ou grão alimentício. O benefício adicional é realizado se o grãorequerer pouca ou nenhuma suplementação de lisina adicional.

Na nutrição humana, os pobres tendem a consumir dietas con-têm relativamente altas quantidades de alimentos com amido baratos e rela-tivamente baixos teores de proteínas de qualidade. Kwashiorkor é uma for-ma de subnutrição causada pela ingestão inadequada de proteínas de quali-dade na presença de ingestão de energia satisfatória a boa (calorias totais).

Os sintomas iniciais são muito gerais e incluem fadiga, irritabilidade e letar-gia. Uma vez que a deficiência de proteínas continua, ocorrem falha no cres-cimento, perda de massa muscular, inchaço generalizado (edema) e imuni-dade diminuída. É comum uma barriga protuberante grande. Estados de sa-úde da pele (tais como dermatite, alterações na pigmentação, diminuição depelos e vitiligo) são observados freqüentemente. Choque e coma precedema morte. Uma estimativa do governo sugere que tanto quanto 50% das pes-soas idosas em asilos nos EUA sofrem de subnutrição de proteína-caloria.

Assim, os produtos de milho com maior qualidade de proteínas devido a ní-veis maiores de lisina melhorariam não apenas a qualidade nutricional dadieta, mas o nível geral global da saúde.

Uma abordagem de biologia molecular de plantas para aumentaros níveis de lisina envolve a identificação e a introdução de genes no milhopara afetar os níveis de Iisina no grão sem afetar negativamente as proprie-dades agronômicas. A Iisina é derivada do aspartato, cujo metabolismo estáinterconectado com vias que envolvem a treonina, a metionina e a isoleuci-na. A própria Iisina serve como um produto final para a modificação e para aregulação de enzimas na via para sua própria produção. As enzimas chavesenvolvidas no metabolismo da Iisina são a aspartato quinase (AK) e a ácidodihidrodipicolínico sintase (DHDPS), enquanto que a lisina-cetoglutarato re-dutase (LKR, uma enzima bifuncional também conhecida como sacaropinadesidrogenase, SDH) parece desempenhar uma função principal no catabo-lismo da lisina. AK e DHDPS são respostas reguladas pela lisina; à medidaque os níveis de lisina aumentam, o aminoácido regula para menos a ativi-dade destas enzimas.

Assim, com a finalidade de aumentar os níveis de lisina, seriabenéfico ter uma versão insensível ao "feedback" de AK ou DHDPS. As vari-ações insensíveis à lisina de um gene AK bacteriano foram descritas assimcomo inúmeras variedades de plantas (vide Falco e outros, Patente U.S. Nq5.773.691, incorporada aqui como referência). As formas insensíveis à lisinade AK foram identificadas partindo da cevada, do milho e do tabaco. Foimostrado que um gene DHDPS bacteriano, isolado de E. coli, é pelo menos 20 vezes menos sensível aos aumentos nos níveis de lisina (Glassman eoutros, Patente U.S. Ne 5.258.300; Galili e outros, Patente U.S. Ns5.367.110).

Falco e outros (Patentes U.S. Ne5 5.773.691 e 6.459.019, Publi-cação de Pedido de Patente U.S. N9 2003/0056242) e Dizigan e outros (Pu- blicação de Pedido de Patente U.S. N9 2005/0132437), cada uma das quaisé incorporada aqui como referência em sua totalidade, descrevem o isola-mento e o uso de aspartato quinase insensível ao "feedback" de lisina (AK, ogene conhecido como IysC) de E. coli, DHDPS de E. coíie DHDPS de Cory-nebacterium (conhecido aqui como CORgLdapA) para gerar plantas de se-mente de colza, tabaco, milho e soja transgênicas com maiores níveis delisina na semente.

A presente invenção fornece constructos de DNA que quandoexpressas em células vegetais fornecem um maior componente nutricionalde um produto vegetal, em particular, maior teor de Iisina em uma sementede planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São fornecidas aqui constructos de DNA que quando operacio-nais no genoma de uma planta transgênica conferem maiores níveis de Iisi-na na semente da planta. As sementes com maior teor de Iisina colhidas sãoúteis para a produção de alimento e de produtos alimentícios, tais como fari-nha de milho (também conhecida como "masa harina" (mistura culinária defarinha)), farinha grossa de milho e produtos farináceos que requerem poucaou nenhuma suplementação de lisina. Preferencialmente, a planta e a se-mente transgênicas são uma planta e uma semente de planta de cultivo, pre-ferencialmente uma planta e uma semente de monocotiledônea e mais pre-ferencialmente, uma planta e uma semente de milho.

A invenção fornece plantas e sementes transgênicas que com-preendem os constructos de DNA e possuem maiores níveis de lisina nasemente. Os constructos de DNA da presente invenção compreendem umamolécula que quando expressa nas células do milho inibe a produção de umpolipeptídeo de degradação de lisina e uma molécula que quando expressanas células do milho fornece a produção de um polipeptídeo da ácido dihi-drodipicolínico sintase insensível à lisina ou uma aspartato quinase insensí-vel à lisina.

O grão colhido, mesmo quando não viável e, portanto, não podeser utilizado como semente, oferece, contudo, os maiores níveis de lisina euma maior qualidade de proteína através desta invenção. Tal grão colhido écapaz de ser processado da mesma maneira que o grão convencional. Con-seqüentemente, em uma outra modalidade, a invenção fornece um produtopara alimentação animal com alto teor de lisina através do cultivo de umaplanta transgênica da invenção e da colheita da semente com alto teor delisina ou através do processamento de uma semente da invenção ou de umaparte da mesma. Ainda em uma outra modalidade, a invenção fornece umafarinha ou um produto farináceo preparado através do cultivo de uma plantatransgênica da invenção e através da colheita da semente contendo alto teorde Iisina ou através do processamento de uma semente da invenção ou deuma parte da mesma.

Em uma modalidade da invenção, um constructo de DNA com-preende novas composições de polinucleotídeos que são melhoradas emrelação à expressão em células vegetais, especialmente em células de mi-lho. Um dos novos polinucleotídeos (SEQ ID NO: 5) que codifica um polipep-tídeo da ácido dihidrodipicolínico sintase e um outro novo polinucleotídeo(SEQ ID NO: 9) que é homólogo e complementar a uma parte de uma se-qüência codificadora do polinucleotídeo da Iisina cetoglutarato redutase. umconstructo de DNA quando expressa em uma célula vegetal, especialmenteuma célula vegetal de milho e preferencialmente uma célula de semente demilho causa um aumento na Iisina na semente de milho, um constructo deDNA compreende polinucleotídeos, por exemplo, uma seqüência tal como aSEQ ID NO: 1 que codifica uma ácido dihidrodipicolínico sintase insensível àIisina e uma seqüência tal como a SEQ ID NO: 2 que codifica uma Iisina ce-toglutarato redutase que é utilizada como um molde para o planejamento deRNAs inibidores ou uma seqüência tal como a SEQ ID NO: 3 que codificauma aspartato quinase. O constructo de DNA compreende preferencialmen-te uma molécula promotora que é melhorada para direcionar a transcriçãode um polinucleotídeo ligado de forma operacional em uma semente de mi-lho. Adicionalmente, uma nova molécula de DNA (SEQ ID NO: 10) que com-preende uma molécula de supressão gênica com um alvo do gene da Iisinacetoglutarato redutase em que a molécula de supressão gênica está inseridadentro de um íntron do constructo de DNA.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método deprodução de uma semente de milho com alto teor de Iisina através do cru-zamento de parentais intracruzados para fornecer uma semente híbrida, emque cada parental contém um ou mais cassetes de expressão em planta dosconstructos de DNA da presente invenção em seu genoma e os cassetes deexpressão são diferentes um do outro em cada parental e nenhum parentalcontém todos os três e através da colheita da semente que possui um teorde Iisina maior que qualquer um dos parentais.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método deprodução de um produto para alimentação de seres humanos ou de um pro-duto alimentício para animais com alto teor de Iisina que compreende a eta-pa de processamento de uma semente ou de uma parte da mesma proveni-ente de uma planta transgênica que possui um genoma compreendendo umconstructo de DNA exógena ou uma coleção de constructos de acordo coma presente invenção. Adicionalmente, a invenção fornece um método de pro-dução de um produto para alimentação de seres humanos ou de um produtoalimentício para animais com alto teor de Iisina que compreende as etapasde cultivo de uma planta transgênica para a produção de semente, a semen-te possuindo um genoma que compreende um constructo de DNA exógenada presente invenção e de colheita da semente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Mapa de plasmídeo que ilustra pMON66649

Figura 2. Mapa de plasmídeo que ilustra pMON80003

Figura 3. Mapa de plasmídeo que ilustra pMON79465

Figura 4. Mapa de plasmídeo que ilustra pMON93092

Figura 5 Mapa de plasmídeo que ilustra pMON93093

Figura 6. Mapa de plasmídeo que ilustra pMON80378

Figura 7. Teor de Iisina livre dos grãos R2 provenientes dos e-ventos que compreendem pMON93092.

Figura 8. Teor de Iisina livre de grãos R2 provenientes dos even-tos que compreendem pMON93093.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Uma planta ou uma semente transgênica que exibe uma carac-terística desejada, por exemplo, maior teor de Iisina da presente invenção,compreende um DNA exógeno particular inserido dentro do genoma da plan-ta transgênica que confere a característica desejada. A característica é ex-pressa na forma de uma alteração que pode ser medida partindo da caracte-rística que ocorre naturalmente em uma planta de controle, por exemplo, umplanta ou uma semente com substancialmente o mesmo genótipo que nãopossui tal DNA exógeno particular. Preferencialmente, a alteração é medidaatravés da comparação da expressão da caracterísitica em uma planta ouem uma semente transgênica que possui o DNA exógeno particular associa-do com a característica desejada com a expressão da mesma característicaem uma planta ou em uma semente de controle. "Milho com alto teor de Iisi-na" é, portanto, uma planta de milho com maior teor de Iisina em qualquerparte da planta, preferencialmente em uma semente, que também pode serreferida aqui como um grão ou no agregado como grão. A presente invençãofornece constructos de DNA e sementes que contêm pelo menos um dos cassetes de expressão vegetal dos constructos de DNA das presentes in-venções em seu genoma, em que a semente possui um maior teor de Iisinaque as sementes que não contêm o constructo.

O maior teor de Iisina pode ser exibido pela planta através doacúmulo de maiores quantidades do aminoácido no grão e pode ser medido através de qualquer método adequado, tal como espectrofotometria de mas-sa ou cromatografia líquida de alto desempenho de um tecido extraído deforma apropriada. Um grão de milho transgênico da presente invenção commaior teor de Iisina é especialmente útil como um alimento ou um produtoalimentício, uma farinha ou um produto farináceo, uma fonte de produtosprotéicos de milho purificados ou uma fonte de outros produtos processadospartindo do grão que contêm um maior teor de Iisina que os grãos não trans-gênicos de uma variedade similar.

O grão de milho com o um nível de aproximadamente 4000 par-tes por milhão (ppm) de Iisina total possui uma quantidade suficiente de Iisi-na de forma que o produto alimentício ou para alimentação de gado feitopartindo do grão não requer suplementação partindo de fontes de Iisina adi-cionais. O milho com alto teor de Iisina da presente invenção atinge este ní-vel de produção e de acúmulo de Iisina em um grão de milho. A presenteinvenção é uma melhora substancial em relação aos métodos e às composi- ções descritos previamente para o aumento de Iisina em um grão de milho(por exemplo, Patente U.S. Ne 5.773.691).

Os esforços para aumentar os níveis de aminoácidos em plantastransgênicas incluem a expressão de moléculas de DNA recombinantes quecodificam proteínas em uma via de síntese de aminoácidos em níveis maio-res que os genes nativos. Um método para a produção de maiores níveis delisina no milho é através da expressão de uma ácido dihidrodipicolínico sin-tase (DHDPS) bacteriana que é descrita nas Patentes U.S. Nes 5.288.300,6.459.019 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nq 2003/0056242 A1e da supressão de LKR endógena (Publicação de Pedido de Patente U.S. N92005/0193444), das quais cada uma é incorporada aqui como referência emsua totalidade.

Qualquer uma das plantas ou das partes das mesmas da pre-sente invenção pode ser processada para a produção de uma preparaçãoalimentícia, de farinha, de farinha grossa, de proteína ou de óleo. Uma parteda planta particularmente preferida para esta finalidade é a semente. Emuma modalidade preferida a preparação alimentícia, de farinha, de farinhagrossa, de proteína ou de óleo é planejada para uso na alimentação de ani-mais de fazenda (gado). Os métodos para a produção de preparações ali-mentícias, de farinha, de farinha grossa, de proteína e de óleo são conheci-dos na técnica, por exemplo, Patentes U.S. Nss 4.957.748; 5.100.679;5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227, incorporadas aquicomo referência em sua totalidade. Em uma modalidade preferida, a prepa-ração de proteína é uma preparação de alto teor de proteína, tal como umconcentrado ou um isolado. A preparação com alto teor de proteína possuipreferencialmente um teor de proteína maior que 5% p/v, mais preferencial-mente 10% p/v e ainda mais preferencialmente 15% p/v.

Em uma modalidade adicional, a farinha grossa da presente in-venção pode ser mesclada com outras farinhas grossas. Em uma modalida-de preferida, a farinha grossa produzida partindo de plantas ou de sementesda presente invenção ou geradas através de um método da presente inven-ção constitui mais que aproximadamente 0,5%, aproximadamente 1 %, apro-ximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 25%, aproxi-madamente 50%, aproximadamente 75% ou aproximadamente 90% em vo-lume ou em peso do componente de farinha grossa de qualquer produto. Emuma outra modalidade, a preparação de farinha grossa pode ser mesclada epode constituir mais que aproximadamente 10%, aproximadamente 25%,aproximadamente 35%, aproximadamente 50% ou aproximadamente 75%da mescla em volume. A presente invenção fornece ainda um método demelhoramento do crescimento de um ser humano ou de um animal inferiorque compreende a alimentação do ser humano ou do animal inferior comuma dieta em que pelo menos uma parte da dieta é um milho com alto teorde Iisina que compreende um ou mais dos cassetes de expressão vegetal dapresente invenção. Como utilizado aqui, é pretendido que o termo "animalinferior" abranja a alimentação de aves e de peixes assim como de mamífe-ros.

Constructos de DNA Recombinante

A presente invenção fornece constructos de DNA que compre-endem polinucleotídeos ligados de forma operacional que são eficientes pa-ra conferir maior teor de Iisina em grãos de milho. O termo "constructo deDNA" inclui, mas não está limitado às moléculas de polinucleotídeos quedirecionam a transcrição de moléculas de polinucleotídeos ligadas em umacélula vegetal. Pelo menos uma parte de um constructo de DNA da presenteinvenção é utilizada em um método para a transformação de uma célula ve-getal, que é, a parte que está inserida de forma estável no genoma da célu-la. A parte é responsável pelo fenótipo de alto teor de Iisina nos grãos demilho ou na farinha grossa produzida partindo de tais grãos e é um aspectoda presente invenção. Um depósito pela Monsanto Technology LLC dosconstructos de DNA pMON93092 e pMON09093 foi feito sob o Tratado deBudapeste junto a American Type Culture Collection (ATCC) como os núme-ros de acesso PTA-6733 e PTA-6734, respectivamente. Estes depósitosconstituem uma parte da descrição desta invenção embora seja acreditadoque as seqüências fornecidas aqui na descrição escrita sejam acuradas, aseqüência de polinucleotídeo das moléculas de DNA que compreendem e-lementos reguladores, moléculas codificadoras e moléculas não codificado-res pode ser determinada partindo do depósito se necessário e utilizada paracorrigir as seqüências descritas aqui.As moléculas de polinucleotídeos são ligadas às constructos deDNA recombinantes utilizando métodos conhecidos pelos peritos comuns natécnica. Um exemplo de uma tecnologia útil para o desenvolvimento dosconstructos de DNA é a tecnologia de clonagem GATEWAY® (Invitrogen LifeTechnologies, Carlsbad1 Califórnia) que utiliza a reação de clonagem com arecombinase LR específica ao sítio do sistema Integrase/aff dõ bacteriófatoIambda para o constructo de vetores ao invés de endonucleases de restriçãoe ligases. O GATEWAY® Cloning Technology Instruction Manual fornecidopela Invitrogen fornece ainda diretrizes resumidas para a clonagem de rotinade qualquer polinucleotídeo desejado em um vetor que compreende elemen-tos de expressão vegetal operacionais. Métodos adicionais são descritos emMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3? edição Volumes 1, 2 e 3. J. F.Sambrook, D.W. Russell e N. Irwin1 Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000 (referido aqui como Sambrook e outros).

Como utilizado aqui "DNA exógeno ou DNA isolado" refere-se àmolécula de DNA que não é normalmente encontrada no genoma de umacélula hospedeira ou a um DNA não normalmente encontrado no genomahospedeiro em um contexto idêntico ou quaisquer duas seqüências adjacen-tes uma a cada outra que não estão normalmente ou naturalmente adjacen-tes uma a cada outra. O DNA exógeno pode incluir uma molécula de polinu-cleotídeo de DNA ou de RNA nativa ao genoma hospedeiro ou pode com-preender o polinucleotídeo nativo alterado através da adição ou da deleçãode um ou mais polinucleotídeos ou modificações nos elementos reguladoresdos polinucleotídeos associados ou outras seqüências de polinucleotídeoscomo discutido aqui. Em adição aos elementos reguladores, um DNA exó-geno pode conter uma seqüência codificadora que codifica uma proteína ouum polipeptídeo ou uma seqüência não codificadora que produz um produtosem ser protéico, tal como uma molécula de RNA que afeta a transcrição oua tradução de uma outra seqüência de DNA. Um constructo de DNA da pre-sente invenção que compreende uma seqüência codificadora e uma se-qüência não codificadora.

Os constructos de DNA exógeno utilizados para a transformaçãode células vegetais compreenderão a seqüência codificadora de interesse egeralmente outros elementos reguladores como discutido aqui tais como,mas não limitados a promotores, íntrons, regiões não traduzidas a 5' e a 3',seqüências líderes, seqüências de localização e de trânsito e intensificado-res, a ligação operacional destes elementos reguladores para a expressãode um RNA em uma célula vegetal sendo preferida aqui como um cassetede expressão vegetal heterólogo. Os constructos de DNA que estão listadosna Tabela 1 ilustram a ligação de elementos reguladores em cassetes deexpressão que expressam seqüências codificadoras e seqüências não codi-ficadoras e os níveis médios de Iisina medidos na semente de milho trans-gênico compreendendo cada constructo. Uma molécula de DNA promotorade um constructo de DNA exógeno da presente invenção é exemplificadapor um promotor intensificado na semente ou específico à semente que in-clui, por exemplo, aqueles para uso em uma planta de cultivo monocotiledô-nea, tal como, um promotor L3 de milho (Patente U.S. Ns 6.433.252 ou ho-mólogos do mesmo, incorporada aqui como referência ao P-Zm.L3 na pre-sente invenção), um promotor B32 de milho (SEQ ID NO: 4 ou homólogos domesmo, referido aqui como P-Zm.B32), um promotor da gama coixina domilho (Patente U.S. N9 6.635.806 incorporada aqui como referência ou ho-mólogos do mesmo, referido ao P-Zm.Gcx) ou qualquer um dos quais é utili-zado em um constructo de DNA da presente invenção ou outros promotoresconhecidos que são responsáveis pela maior transcrição em uma sementede milho são referidos aqui como P-Zm.semente. Os exemplos de promoto-res adicionais que funcionam nas sementes, incluem, mas não estão Iimita-dos aos promotores que controlam a expressão de proteínas de armazena-mento de semente, tais como a glutelina do arroz e as proteínas pró-laminade espécies de Triticeae e promotores que controlam a expressão de enzi-mas envolvidas na síntese de amido na semente, tais como, os promotoresque controlam a expressão da ADP glicose amido glicosil transferase demonocotiledôneas. O promotor de semente selecionado está ligado de formaoperacional a uma região codificadora de DHDPS (por exemplo, SEQ ID NO:1, referida aqui como CORgl.dapA) ou uma região codificadora da aspartatoquinase (por exemplo, SEQ ID NO: 3). Os promotores intensificados na se-mente e específicos à semente adicionais são conhecidos na técnica e po-dem ser selecionados e testados em ligação operacional com as moléculascodificadoras e as moléculas não codificadoras de DNA da presente inven-ção através dos métodos descritos na presente invenção ou de métodos si-milares conhecidos pelos versados na técnica da biologia molecular de plan-tas. Um promotor intensificado na semente é expresso primariamente emtoda ou em uma parte de uma semente, embora possa ser secundariamenteexpresso em outras células vegetais, tecidos ou órgãos da planta. Uma partede uma semente inclui, mas não está limitada a um embrião, um endosper-ma, um revestimento de semente, um coleóptilo, um cotilédone, um hipocoti-lédone, uma calada de aleurona, um pericarpo ou um escutelo. As regiõesreguladoras adicionais fornecidas nos constructos de DNA podem incluir,mas não estão limitadas a um íntron (I-), um sinal de trânsito (TS-), um lídernão traduzido a 5' (L-), uma região de poliadenilação a 3' (T-) ou uma regiãoanti-sentido não codificadora. Um cassete de expressão com marcador quepode ser selecionado ou quantificado também pode ser incluído para auxiliarna seleção ou na identificação de células e tecidos vegetais transformados.

O constructo da presente invenção contém opcionalmente um cassete deexpressão que fornece tolerância ao glifosato à planta de milho e pode serutilizado como um marcador que pode ser selecionado. Como utilizado aqui"transgene" significa um DNA exógeno que é incorporado em um genomahospedeiro ou que é capaz de se replicar de forma autônoma em uma célulahospedeira e que é capaz de causar a expressão de um ou mais produtoscelulares. Os exemplos de transgenes fornecerão à célula hospedeira, àsplantas regeneradas da mesma ou às partes de tais plantas, um novo fenóti-po em relação à célula ou à planta não transformada correspondente, porexemplo, maior teor de Iisina em um grão de milho. Os transgenes podemser introduzidos diretamente em uma planta através de transformação gené-tica e são preferencialmente estáveis e podem ser herdados de forma quepodem ser herdados de um aplanta de qualquer geração anterior que foitransformada com o DNA exógeno.Como utilizado aqui, "gene" ou "seqüência codificadora" significauma molécula de DNA partindo da qual uma molécula de RNA é transcrita. Amolécula de DNA fornece uma região codificadora (CR-) para um mRNA quecodifica um produto protéico ou um RNA que funciona como uma moléculade supressão gênica ou uma molécula de RNA estrutural tal como um tRNA,um rRNA, um snRNA ou outro RNA. Como utilizado aqui "expressão" se re-fere à combinação de processos intracelulares, incluindo a transcrição e atradução, através dos quais uma molécula de DNA, tal como um gene, pro-duz um polipeptídeo ou uma molécula de RNA. Um exemplo de seqüênciacodificadora é um gene da dihidrodipicolinato sintase de Corynebacterium(DHDPS; Bonnassie e outros, 1990; Richaud e outros, 1986) útil para a pro-dução de grãos de milho com maior teor de lisina. Uma planta de milho,transformada para conter e expressar um gene DHDPS de Corynebacteriumou qualquer outro gene que resulte em um maior teor de lisina no tecido dogrão, é também referida como uma planta de milho com alto teor de lisina. Aregião codificadora da DHDPS de Corynebacterium da presente invenção éadicionalmente modificada para fornecer maior expressão em uma célulavegetal, preferencialmente em uma célula de monocotiledônea e mais prefe-rencialmente em uma célula de milho. A região codificadora da DHDPS deCorynebaeterium modificada utilizada na presente invenção é descrita comoa SEQ ID NO: 5, referida aqui como CORgl.dapA.nno.

Como utilizado aqui "promotor" significa uma região da seqüên-cia de DNA que inicia a transcrição do RNA partindo do DNA. Os promotoresficam localizados a montante do DNA que será transcrito e possuem regiões que atuam como sítios de ligação para a RNA polimerase e possuem regi-ões que atuam com outros fatores para promover a transcrição do RNA.Mais especificamente, os promotores basais nas plantas compreendem re-giões canônicas associadas com o início da transcrição, tais como as caixasCAAT e TATA. Na presente invenção, as moléculas promotoras preferidas eas moléculas de UTR a 5' são responsáveis pela transcrição nas células ounos tecidos da semente em uma taxa ou um nível maior que em outras célu-las e tecidos da planta. As moléculas promotoras podem ser selecionadasdas conhecidas na técnica, por exemplo, os promotores são descritos naPatente U.S. N9 6.437.217 (promotor RS81 do milho), na Patente U.S. Ns5.641.876 (promotor da actina do arroz), na Patente U.S. N9 6.426.446(promotor RS324 do milho), na Patente U.S. Ns 6.429.362 (promotor PR-1do milho), na Patente U.S. Ns 6.232.526 (promotor A3 do milho), na PatenteU.S. Nq 6.177.611 (promotores constitutivos do milho), nas Patentes U.S. Ne55.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), na PatenteU.S. Ns 6.433.252 (promotor da oleosina L3 do milho, P-Zm.L3), na PatenteU.S. N9 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz assim como um íntron daactina 2 do arroz), na Patente U.S. N9 5.837.848 (promotor específico à raiz),na Patente U.S. N9 6.294.714 (promotores que podem ser induzidos pelaluz), na Patente U.S. N9 6.140.078 (promotores que podem ser induzidos porsais), na Patente U.S. N9 6.252.138 (promotores que podem ser induzidospor agentes patogênicos), na Patente U.S. N9 6.175.060 (promotores quepodem ser induzidos pela deficiência de fósforo), na Patente U.S. N96.635.806 (promotor da gama-coixina, P-CI.Gcx) e no Pedido de PatenteU.S. Ns de Série 09/757.089 (promotor da aldolase de cloroplasto de milho),das quais todas são incorporadas aqui como referência. Adicionalmente,podem ser construídas moléculas promotoras quiméricas que possuem ele-mentos em eis derivados de fontes heterólogas que fornecem aumento adi-cional do perfil de expressão do promotor úteis na presente invenção. Porexemplo, foi mostrado que elementos promotores de vírus de plantas forne-cem aumentos aos elementos promotores de plantas quando ligados deforma operacional (Patente U.S. N9 6.660.911, incorporada aqui como refe-rência em sua totalidade).

Os constructos de DNA para uso na transformação de plantascompreendem tipicamente ainda outros elementos reguladores em adição aum promotor, tais como, mas não limitados às regiões não traduzidas a 3'(contendo sítios de poliadenilação), aos peptídeos de trânsito ou de sinalpara o direcionamento de uma proteína para uma organela celular da planta,particularmente para um cloroplasto, um Ieucoplasto ou outra organela deplastídeo.Um versado na técnica conhecerá vários íntrons, intensificado-res, peptídeos de trânsito, seqüências de sinal de direcionamento, regiõesnão traduzidas a 5' e a 3' (UTRs) úteis no planejamento de vetores de ex-pressão vegetal eficientes, tais como os descritos, por exemplo, na Publica-ção de Patente U.S. N9 2003/01403641 (incorporada aqui como referência).

Uma UTR a 5' que funciona como uma seqüência líder de tradu-ção é um elemento genético de DNA localizado entre a seqüência promotorade um gene e a seqüência codificadora. A seqüência líder de tradução estápresente no mRNA completamente processado a montante da seqüência deinício da tradução. A seqüência líder de tradução pode afetar o processa-mento do produto de transcrição primário no mRNA ou pode afetar a estabi-lidade ou a eficiência de tradução do mRNA. Os exemplos de seqüênciaslíderes de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico do milhoe da petúnia (Patente U.S. N9 5.362.865), líderes de proteína de revestimen-to de vírus vegetais, líderes da Rubisco vegetal, entre outros (Turner e Fos-ter, 1995). As moléculas líderes associadas no contexto nativo com as molé-culas promotoras descritas na presente invenção incluem, por exemplo, olíder B32 do milho (L-Zm.B32), o líder da actina 1 do arroz (L-Os.Act1), olíder da gama coixina (L-CI.Gcx).

A região não traduzida a 3' (UTR a 3') ou a região de poliadeni-lação a 3' significa uma molécula de DNA ligada a e localizada a jusante deuma molécula de polinucleotídeo estrutural e inclui polinucleotídeos que for-necem um sinal de poliadenilação e outros sinais reguladores capazes deafetar a transcrição, o processamento do mRNA ou a expressão gênica. Osinal de poliadenilação funciona nas plantas para causar a adição de nucleo-tídeos poliadenilatos na extremidade a 3' do precursor do mRNA. A seqüên-cia de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, partindo de umavariedade de genes vegetais ou de genes de T-DNA de Agrobacterium. Osexemplos de regiões UTR a 3' são a região a 3' da nopalina sintase (nos 3';Fraley e outros, 1983), hsp17 do trigo (T-Ta.Hsp17) e T-Ps.RbcS2:E9 (subu-nidade pequena da rubisco da ervilha), as descritas na W00011200A2 eoutras UTRs a 3' conhecidas na técnica podem ser testadas e utilizadas emcombinação com uma região codificadora de DHDPS ou de AK, referida aquicomo T-3'UTR.

Os sinais de trânsito se referem de forma geral a moléculas pep-tídicas que quando ligadas a uma proteína de interesse direcionam a proteí-na para um tecido, uma célula, uma localização subcelular ou organela celu-lar particular. Os exemplos incluem, mas não estão limitados á peptídeos detrânsito para cloroplastos, sinais de direcionamento nuclear e sinais vacuola-res. O peptídeo de trânsito para plastídeos tem utilidade particular na pre-sente invenção para direcionar a expressão da enzima DHDPS para os plas-tídeos em uma semente. Um peptídeo de trânsito para cloroplastos (CTP)pode ser engenheirado para ser fundido com o terminal N de proteínas quedevem ser direcionadas para dentro do cloroplasto vegetal. Muitas proteínaslocalizadas no cloroplasto são expressas partindo de genes nucleares comoprecursores e são direcionadas para o cloroplasto por um CTP que é remo-vido durante as etapas de importação. Os exemplos de proteínas de cloro-plasto incluem a subunidade pequena da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase(RbcS2), a ferredoxina, a ferredoxina oxidorredutase, a proteína I e a proteí-na Il do complexo de coleta de luz e a tiorredoxina F. Foi demonstrado invivo e in vitro que as proteínas sem ser de cloroplasto podem ser direciona-das para o cloroplasto através do uso de fusões de proteínas com um CTP eque um CTP é suficiente para direcionar uma proteína para o cloroplasto. Aincorporação de um peptídeo de trânsito para cloroplasto adequado, tal co-mo, o CTP de EPSPS de Arabidopsis thaiiana (Klee e outros, 1987) e foimostrado que o CTP de EPSPS de Petunia hybrida (della-Cioppa e outros,1986) direciona a proteína heteróloga para os cloroplastos em plantas trans-gênicas. O CTP de DapA de Zea mays (SEQ ID NO: 6, referido aqui comoTS-Zm.DapA) da presente invenção tem a utilidade de fornecer direção dopolipeptídeo de DHDPS ligado para dentro dos plastídeos da semente. Osversados na técnica reconhecerão que podem ser feitas vários constructosquiméricos que utilizam a funcionalidade de um CTP particular para a impor-tação de um polipeptídeo de DHDPS heterólogo para dentro do plastídeo dacélula vegetal. Para uma descrição do uso de um peptídeo de trânsito paracloroplasto vide a Patente U.S. Ne 5.188.642, incorporada aqui como refe-rência.

A Tabela 1 ilustra as combinações de promotores e outros ele-mentos reguladores ligados de forma operacional às moléculas de supres-são do gene LKR e às moléculas que codificam DHDPS e seu efeito resul-tante sobre os níveis de Iisina nas plantas e nos grãos de milho. Um versadona técnica saberia que as moléculas de DNA exógeno possuindo função si-milar poderiam ser substituídas pelas ilustradas na Tabela 1 e testadas nosmétodos descritos aqui ou em métodos relacionados que são úteis para aavaliação dos níveis de Iisina nos tecidos vegetais, grãos ou produtos pro-cessados.

Os constructos de DNA da presente invenção podem conter op-cionalmente uma molécula marcadora que pode ser selecionada ou que po-de ser quantificada. São de importância particular as moléculas marcadorasque podem ser selecionadas que fornecem ainda uma característica agro-nômica valiosa, por exemplo, tolerância a herbicidas. Os herbicidas para osquais a tolerância da planta transgênica foi demonstrada e o método da pre-sente invenção que podem ser aplicados, incluem, mas não estão limitadosa: glifosato, glufosinato, sulfoniluréias, imidazolinonas, bromoxinil, dalapon,ciclohexanodiona, inibidores da protoporfirinogênio oxidase e herbicidas deisoxaflutol. As moléculas de polinucleotídeos que codificam proteínas envol-vidas na tolerância a herbicidas são conhecidas na técnica e incluem, masnão estão limitadas a uma molécula de polinucleotídeo que codifica a 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS, descrita nas Patentes U.S.Ne5 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497. Padgette e outros, 1996; e Penaloza-Vazquez e outros, 1995; e aroA (Patente U.S. N9 5.094.945) para tolerânciaao glifosato; bromoxinil nitrilase (Bxn) para tolerância a Bromoxinil (PatenteU.S. Ns 4.810.648); fitoeno dessaturase (crtl, Misawa e outros, 1993 e 1994);para tolerância a norflurazon, acetohidroxiácido sintase (AHAS, aka ALS,Sathasiivan e outros, 1990); e o gene bar para tolerância a glufosinato e abialafos (DeBIock e outros, 1987).

A tolerância a herbicidas é um fenótipo desejável para plantasde cultivo. Os constructos de DNA da presente invenção contêm preferenci-almente um cassete de expressão que fornece tolerância ao glifosato naplanta de milho transformada. O cassete de expressão permite adicional-mente a seleção de células de milho transformadas em um meio contendoglifosato. O cassete de expressão contém preferencialmente um promotorque direciona a transcrição de um gene que codifica uma EPSPS resistenteao glifosato em todas as células da planta transformada. Em particular, ocassete de expressão tolerante ao glifosato da prèsente invenção compre-ende o promotor e o íntron da actina 1 do arroz (P-Os.Act1, l-0s.Act1, Pa-tente U.S. N9 5.641.876, incorporada aqui como referência) ligados de formaoperacional a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito paracloroplasto e um polinucleotídeo que codifica uma EPSPS resistente ao gli-fosato isolada da cepa CP4 de Agrobacterium (referida aqui como aroA:CP4EPSPS, Patente U.S. Ns 5.633.435, incorporada aqui como referência). A N-fosfonometilglicina, também conhecida como glifosato, é um herbicida bem-conhecido que possui atividade sobre um amplo espectro de espécies vege-tais. O glifosato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto Co.,St. Louis, MO), um herbicida seguro que possui, de forma desejável, umameia-vida curta desejável no ambiente. Quando aplicado a uma superfícievegetal, o glifosato se move de forma sistêmica ao longo da planta. O glifo-sato é tóxido para as plantas bloqueando a via do ácido shikímico que forne-ce um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. Especificamen-te, o glifosato afeta a conversão do fosfoenolpiruvato e do ácido 3-fosfoshikímico em 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato através da inibição da en-zima 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase (referida posteriormente aquicomo EPSP sintase ou EPSPS). Para as finalidades da presente invenção,deve ser considerado que o termo "glifosato" incluam qualquer forma eficien-te como herbicida da N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal da mes-ma) e outras formas que resultam na produção do ânion de glifosato in plan-ta. O glifosato na forma de N-fosfonometilglicina e seus sais são utilizadoscomo componentes de meios de cultura sintéticos para a seleção de tolerân-cia bacteriana e vegetal ao glifosato ou utilizados para determinar a resistên-cia à enzima em ensaios bioquímicos in vitro. Os exemplos de formulaçõescomerciais de glifosato incluem, sem restrição, as vendidas pela MonsantoCompany sob os nomes comerciais de herbicidas ROUNDUP®,ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAX, ROUNDUP® CT,ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE,RODEO®, POLARIS®, SPARK® e ACCORD®, dos quais todos contêmglifosato na forma de seu sal de isopropilamônio; as vendidas pela MonsantoCompany na forma dos herbicidas ROUNDUP® DRY e RIVAL®, que contêmo glifosato na forma de seu sal de amônio; a vendidas pela MonsantoCompany na forma de ROUNDUP® GEOFORCE, que contém o glifosato naforma de seu sal de sódio; a vendida pela Monsanto Company na forma deROUNDUP® WEATHERMAX, que contém o glifosato na forma de seu salde potássio; e a vendida pela Zeneca Limited na forma do herbicidaTOUCHDOWN®, que contém o glifosato na forma de seu sal de trimetil- sulfônio. As formulações do herbicida glifosato podem ser utilizadas deforma segura sobre a superfície de plantas de cultivo tolerantes ao glifosatopara controlar ervas daninhas em um campo em proporções tão baixasquanto 5,6 gramas/acre (8 onças/acre) e até 44,8 gramas/are (64onças/accre). Experimentalmente, o glifosato foi aplicado em plantas de cultivo tolerantes ao glifosato em proporções tão baixas quanto 2,8gramas/are (4 onças/acre) e de até ou excedendo 89,6 gramas/are (128onças/acre) sem danos substanciais às plantas de cultivo. A seleção dasproporções de aplicação para uma formulação de glifosato que constituemuma dose biologicamente eficiente está dentro da perícia do técnico agrícolacomum. Para ilustrar que a produção de plantas transgênicas com resistên-cia a herbicida é uma capacidade dos versados na técnica, é feita referênciaàs Publicações de Pedidos de Patentes U.S. 2003/0106096A1 e2002/0112260A1 e às Patentes U.S. N92 5.034.322; 6.107.549 e 6.376.754,das quais todas são incorporadas aqui como referência. A presente invençãofornece uma planta de milho com maior teor de Iisina e é opcionalmente tole-rante ao glifosato.

Durante a transformação, o DNA exógeno pode ser introduzidode forma aleatória, isto é, em uma localização não específica, no genoma daplanta. Em alguns casos, pode ser útil direcionar uma inserção de DNA exó-geno com a finalidade de se conseguir uma integração específica ao sítio,por exemplo, para substituir uma seqüência ou uma região gênica existenteno genoma. Em alguns outros casos pode ser útil direcionar a integração deum DNA exógeno no genoma em um sítio pré-determinado partindo do qualé sabido que a expressão gênica ocorre. Há vários sistemas de recombina-ção específicos ao sítio conhecidos por funcionarem em plantas que incluemCre/lox como descrito na Patente U.S. Ne 4.959.317 e FLP/FRT como des-crito na Patente U.S. N9 5.527.695, ambas incorporadas aqui como referência.

Os genes marcadores que podem ser selecionados úteis inclu-em aqueles que conferem resistência a antibióticos tais como ampicilina,canamicina (nptll), higromicina B (aph IV) e gentamicina (aac3e aacCA) ge-nes marcadores que podem ser selecionados que são descritos nas Paten-tes U.S. Ngs 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047, das quais todassão incorporadas aqui como referência. Os marcadores que podem ser de-tectados que fornecem uma capacidade de identificação visual de transfor-mantes também podem ser empregados, por exemplo, um gene que expres-sa uma proteína colorida ou fluorescente tal como uma Iuciferase ou umaproteína fluorescente verde (GFP) ou um gene que expressa uma beta-glucuronidase ou o gene uidA (GUS) para os quais são conhecidos váriossubstratos cromogênicos.

Supressão gênica

Os constructos de DNA da presente invenção fornecem a ex-pressão de uma molécula de supressão gênica de RNA anti-sentido especí-fica ao gene LKR endógeno (lisina-cetoglutarato redutase (LKR, uma enzimabifuncional em plantas, também conhecida como sacaropina desidrogenase,SDH) e uma célula vegetal transgênica. Tal constructo de DNA compreendeum promotor ativo no tecido direcionado para a supressão enzimática e umelemento de DNA que pode ser transcrito que possui uma seqüência que écomplementar à seqüência de polinucleotídeo de um gene LKR direcionadopara a supressão. O elemento gênico direcionado copiado para uso no DNAque pode ser transcrito no constructo de supressão gênica pode ser um e-lemento promotor, um elemento de íntron, um elemento de éxon, um ele-mento de UTR a 5' ou um elemento de UTR a 3'. Embora seja acreditadoque o tamanho mínimo do DNA copiado partindo da seqüência de um genedirecionado para a supressão tenha aproximadamente 21 ou 23 nucleotí-deos; são preferidos segmentos de nucleotídeos maiores, por exemplo, até ocomprimento total de um gene direcionado. O elemento de DNA pode com-preender várias partes de um gene, por exemplo, nucleotídeos que sãocomplementares a elementos gênicos contíguos ou separados de UTR1 éxone íntron. Tais constructos podem ainda compreender outros elementos regu-ladores, DNA que codifica peptídeos de sinal, peptídeos de sinal, marcado-res seletivos e marcadores que podem ser detectados quando desejado.Para formar uma alça de RNA com orientação anti-sentido o elemento deDNA complementar tem, de forma conveniente, não mais que aproximada-mente a metade do comprimento do elemento de DNA com orientação anti-sentido, freqüentemente não mais que um terço do comprimento do dito e-lemento de DNA com orientação anti-sentido, por exemplo, não mais que umquarto do comprimento do dito elemento de DNA com orientação anti-sentido. Os comprimentos totais dos elementos de DNA combinados podemvariar. Por exemplo, o elemento de DNA com orientação anti-sentido podeconsistir em 500 até 5000 nucleotídeos e o elemento de DNA complementarpode consistir em 50 até 500 nucleotídeos.

A unidade de transcrição anti-sentido pode ser planejada parasuprimir vários genes ou membros de uma família de genes em que o DNAestá combinado com dois ou mais elementos com orientação anti-sentidopartindo de genes diferentes direcionados para a supressão seguidos porum elemento com orientação senso complementar, por exemplo, comple-mentar a pelo menos uma parte do elemento anti-sentido mais a 5'.

A supressão gênica inclui qualquer um dos métodos bem-conhecidos para a supressão da transcrição de um gene ou para o acúmulodo mRNA que corresponde a tal gene prevenindo assim a tradução do pro-duto da transcrição na proteína. A supressão gênica pós-transcrição é medi-ada pela transcrição do DNA recombinante integrado para formar o RNA defilamento duplo (dsRNA) que possui homologia a um gene direcionado paraa supressão. Esta formação do dsRNA resulta mais comumente da transcri-ção de uma repetição invertida integrada do gene alvo e é uma característicacomum dos métodos de supressão gênica conhecidos como supressão anti-sentido, co-supressão e interferência de RNA (RNAi). A supressão da trans-crição pode ser mediada por um dsRNA transcrito que possui homologiacom uma seqüência de DNA promotora para realizar o que é chamada desupressão em trans do promotor.

Mais particularmente, a supressão gênica pós-transcrição atra-vés de inserção de um constructo de DNA recombinante com o DNA comorientação anti-sentido para regular a expressão gênica em células vegetaisé descrita na Patente U.S. Ng 5.107.065 (Shewmaker e outros) e na PatenteU.S. Ns 5.759.829 (Shewmaker e outros). As plantas transgênicas transfor-madas utilizando tais constructos de DNA com orientação anti-sentido para asupressão gênica podem compreender o DNA integrado disposto na formade uma repetição invertida que resulta da inserção de um constructo de DNAnas plantas por transformação mediada por Agrobacterium, que é descritapor Redenbaugh e outros (1992). As inserções repetidas invertidas podemcompreender uma parte ou toda o constructo do T-DNA, por exemplo, umarepetição invertida de uma unidade de transcrição completa ou uma repeti-ção invertida de uma seqüência de término da transcrição. A seleção doDNA inserido que compreende os elementos de repetição invertidos podeaumentar a eficiência de identificação de eventos de transcrição eficientespara o silenciamento gênico seja o constructo de transformação um cons-tructo de DNA anti-sentido simples que tem que ser inserida em várias có-pias ou um constructo de DNA com repetições invertidas complexa (por e-xemplo, um constructo de RNAi) que pode ser inserida na forma de uma úni-ca cópia. Um constructo de DNA da presente invenção pode conter uma re-petição invertida inserida dentro de um elemento regulador, por exemplo, umíntron. A repetição invertida compreendendo uma molécula de DNA que éhomóloga e complementar a um gene LKR endógeno da célula vegetal hos-pedeira. Na presente invenção, uma molécula de DNA (SEQ ID NO: 9, dsS-DH bfx, também referida como LKR dsRNA bfx) é homóloga a uma parte doDNA que codifica um LKR/SDH de Zea mays (SEQ ID NO: 2) e é utilizada para suprimir a expressão dos genes LKR/SDH nativos do milho. A anotaçãobfx se refere a uma seqüência de molécula de dsRNA utilizada para a su-pressão gênica que foi especificamente selecionada através de uma análiseda molécula alvo e da exclusão de seqüências alvos relacionadas encontra-das em alguns outros organismos. Em alguns constructos descritas aqui, ofragmento LKR dsRNA bfx é inserido em um íntron (Zm.LKR dsRNA bfx in-serido em I-Zm.DnaK1 SEQ ID NO: 10). Os polinucleotídeos adicionais ho-mólogos e complementares à seqüência gênica de LKR de Zea mays podemser selecionados para uso na presente invenção.

A supressão conseguida através das mutações de inserção cria-das por elementos de transposição pode também impedir a função gênica.Por exemplo, em muitas plantas dicotiledôneas, a transformação com o T-DNA de Agrobacterium pode ser facilmente conseguida e grandes númerosde plantas transformadas podem ser rapidamente obtidos. Ainda, algumasespécies tal como Zea mays possuem linhagens com elementos de transpo-sição ativos que podem ser eficientemente utilizados para a produção degrandes números de mutações de inserção, enquanto que algumas outrasespécies não possuem tais opções. As plantas mutantes produzidas por mu·tagênese com Agrobacterium ou com transposon e que possuem expressãoalterada de um polipeptídeo de interesse podem ser identificadas utilizandoos polinucleotídeos da presente invenção. Por exemplo, uma grande popula-ção de plantas mutadas pode ser selecionada com os polinucleotídeos quecodificam o polipeptídeo de interesse para detectar plantas mutadas quepossuem uma inserção no gene que codifica o polipeptídeo de interesse.

Moléculas de Proteína

Proteínas da presente invenção que representam proteínas intei-ras ou pelo menos uma parte suficiente da proteína inteira para conferir aatividade biológica relevante da proteína, por exemplo, maior teor de Iisinaem um grão de milho transgênico. O termo "proteína" inclui ainda moléculasque consistem de uma ou mais cadeias polipeptídicas. Assim, uma proteínaútil na presente invenção pode constituir um produto gênico inteiro ou umaou mais partes funcionais de uma proteína natural que fornece a caracterís-tica agronômica desta invenção, isto é, maior teor de lisina.

Os homólogos das proteínas da presente invenção podem seridentificados através da comparação da seqüência de aminoácidos das pro-teínas DHDPS (SEQ ID NO: 7) ou aspartato quinase (SEQ ID NO: 8) com asseqüências de aminoácidos da mesma ou de uma planta diferente ou defontes bacterianas, por exemplo, de forma manual ou através da utilizaçãode algoritmos de busca conhecidos baseados na homologia tais como oscomumente conhecidos e referidos como BLAST, FASTA e Smith-Waterman.

Um aspecto adicional da invenção fornece seqüências codifica-doras que codificam proteínas homólogas funcionais que diferem em um oumais aminoácidos daqueles das proteínas DHDPS ou aspartato quinase for-necidas aqui como o resultado de uma ou mais das substituições de amino-ácidos conservativas bem-conhecidas, por exemplo, a valina é um substitutoconservativo da alanina e a treonina é um substituto conservativo para a se-rina. Quando uma proteína homóloga é expressa em uma planta transgêni-ca, a proteína homóloga afetará a planta transgênica de uma maneira subs-tancialmente equivalente à das proteínas DHDPS ou aspartato quinase.

As substituições conservativas de um aminoácido dentro da se-qüência de proteína nativa podem ser selecionadas de outros membros deuma classe à qual o aminoácido que ocorre naturalmente pertence. Os ami-noácidos representativos dentro destas várias classes incluem, mas não es-tão limitados a: (1) aminoácidos ácidos (carregados negativamente) tais co-mo ácido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (carregadospositivamente) tais como arginina, histidina e lisina; (3) aminoácidos polaresneutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina eglutamina; e (4) aminoácidos não polares neutros (hidrofóbicos) tais comoalanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metioni-na. Os substitutos conservados para um aminoácido dentro de uma seqüên-cia de aminoácidos nativa podem ser selecionados de outros membros dogrupo ao qual o aminoácido que ocorre naturalmente pertence. Por exemplo,um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais alifáticas é constituídode glicina, alanina, valina, Ieucina e isoleucina; um grupo de aminoácidosque possui cadeias laterais de hidroxila alifáticas é constituído de serina etreonina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais contendoamida é constituído de asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidosque possui cadeias laterais aromáticas é constituído de fenilalanina, tirosinae triptofano; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais básicas éconstituído de lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos quepossui cadeias laterais que contêm enxofre é constituído de cisteína e meti-onina. Os grupos de substituição de aminoácidos naturalmente conservativasão: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina,alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutâmico e asparagina-glutamina.

Um aspecto adicional da invenção compreende proteínas quediferem em um ou mais aminoácidos daqueles de seqüências de proteínasDHDPS ou aspartato quinase como o resultado da deleção ou da inserçãode um ou mais aminoácidos em uma seqüência nativa. Quanto tal proteínahomóloga é expressa em uma planta transgênica, a proteína homóloga afe-tará a planta transgênica de uma maneira substancialmente equivalente, porexemplo, resultará em um maior teor de lisina no grão de milho.

As proteínas da presente invenção que são variações das prote-ínas fornecidas aqui geralmente demonstrarão identidade significativa comas proteínas fornecidas aqui, tal como pelo menos 50% ou mais, por exem-plo, pelo menos 60% ou 70% de identidade com as proteínas DHDPS ouaspartato quinase. As proteínas úteis incluem ainda aquelas com porcenta-gem de identidade maior com os aminoácidos em um segmento de proteínadas proteínas DHDPS ou aspartato quinase, por exemplo, 80%, 90%, 95%,98% ou até 99% de identidade.Métodos de Transformação e Plantas

Como utilizado aqui, o termo "milho" significa Zea mays, tambémconhecido como milho e inclui todas as variedades de plantas que podemser cruzadas com o milho, incluindo espécies selvagens de milho.

Os métodos e as composições para a transformação de plantasatravés da introdução de um DNA exógeno no gênoma de uma planta naprática desta invenção podem incluir qualquer um dos métodos bem-conhecidos e demonstrados. Os métodos preferidos de transformação deplantas são o bombardeio de microprojéteis como ilustrado nas PatentesU.S. Nes 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 e 6.403.865e a transformação mediada por Agrobacterium como ilustrado nas PatentesU.S. N95 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840 e 6.384.301 e na Publi-cação de Patente U.S. 20030196219, das quais todas são incorporadas aquicomo referência. A transformação mediada por micropartículas se refere aofornecimento do DNA revestido sobre micropartículas que são propelidaspara dentro dos tecidos alvos através de vários métodos. A transformaçãomediada por Agrobacterium é conseguida através do uso de uma bactéria dosolo engenheirada geneticamente que pertence ao gênero Agrobacterium.

Várias espécies de Agrobacterium medeiam a transferência de um plasmí-deo de DNA específico conhecido como "T-DNA", que pode ser engenheira-do geneticamente para carregar qualquer pedaço desejado de DNA paradentro de muitas espécies vegetais.

Como utilizado aqui um organismo "transgênico" é um cujo ge-noma compreende um DNA exógeno ou um DNA isolado. O organismotransgênico pode ser uma planta, um animal, um inseto, um fungo, uma bac-téria ou um vírus. Como utilizado aqui "planta transgênica" significa umaplanta transformada de forma estável ou uma progênie de planta de qual-quer geração subseqüente que descende da mesma, em que o DNA daplanta ou a progênie da mesma contém um DNA exógeno. A planta transgê-nica pode conter adicionalmente seqüências que são nativas à planta queserá transformada, mas em que o DNA exógeno foi alterado com a finalida-de de alterar o nível ou o padrão de expressão do gene.

Como utilizado aqui, uma planta transformada "de forma estável"é uma planta em que o DNA exógeno pode ser herdado. O DNA exógenopode ser herado na forma de um fragmento de DNA mantido na célula vege-tal e não inserido dentro do genoma do hospedeiro. Preferencialmente, aplanta transformada de forma estável compreende o DNA exógeno inseridodentro do DNA cromossômico no núcleo, nas mitocôndrias ou no cloroplasto,mais preferencialmente no DNA cromossômico nuclear.

Como utilizado aqui uma "planta transgênica R0" é um aplantaque foi transformada diretamente com um DNA exógeno ou foi regeneradapartindo de uma célula, um calo ou um aglomerado de células que foi trans-formado com um DNA exógeno. Como utilizado aqui "progênie" significaqualquer geração subseqüente, incluindo as sementes e as plantas proveni-entes das mesmas, que é derivada de uma planta parental particular ou deum conjunto de plantas parentais; a progênie resultante pode ser altamentehibridizada ou substancialmente homozigota, dependendo do pedigree. Aprogênie de uma planta transgênica desta presente invenção pode ser, porexemplo, autopolinizada, cruzada com outra planta transgênica, cruzadacom uma planta não transgênica e/ou retrocruzada com um ancestral.

As sementes das plantas desta invenção podem ser colhidaspartindo de plantas transgênicas férteis e podem ser utilizadas para o cultivode gerações de progênie de plantas desta invenção, incluindo uma linhagemde planta híbrida que compreende em seu genoma um constructo de DNAexógeno como listado na Tabela 1 da presente invenção, que fornece o be-nefício de maior teor de Iisina no grão de milho e opcionalmente tolerânciaao herbicida glifosato.

Um "evento" transgênico é produzido através da transformaçãode uma célula vegetal com um constructo de DNA exógeno, a regeneraçãode uma planta resultando da inserção específica do DNA exógeno no geno-ma da planta e da seleção de uma planta particular caracterizada pelo DNAdo evento. Cada evento é, portanto, um indivíduo exclusivo que pode serdistinguido de outros eventos pela localização específica da inserção genô-mica do constructo de DNA exógeno da presente invenção. A detecção doDNA do evento é realizada através de um número de métodos de detecçãode DNA conhecidos na técnica e podem ser realizados em tecidos vegetais,sementes e produtos processados do evento que contém o DNA. Tipicamen-te, um número de células vegetais é transformado, cada uma representandopotencialmente um evento de integração diferente, produzindo uma popula-ção de plantas das quais uma planta particular é selecionada. Uma vez queo lócus de integração é geralmente estável ao longo de ciclos repetidos dereprodução vegetal, o termo "evento" se refere ao transformante R0 originale à progênie do transformante que incluem o DNA exógeno inserido em umalocalização particular e exclusiva no genoma, isto é, o DNA do evento. Aprogênie produzida através de um cruzamento sexual, um autocruzamentoou um retrocruzamento repetido, em que pelo menos uma das plantas utili-zadas no cruzamento é descedente em qualquer geração do transformanteR0 original, contém o mesmo DNA do evento.

No processamento das sementes e do grão desta invenção paraa produção de produtos alimentícios e para alimentação, as estruturas dotecido vegetal normal serão destruídas, as células vegetais podem ser rom-pidas e o DNA nativo e os cassetes de expressão vegetal exógenos podemnão permanecer totalmente intactos, particularmente quando são utilizadasaltas temperaturas, solventes de extração e similares. Entretanto, os produ-tos processados exclusivos possíveis através da prática desta invenção po- dem ser rapidamente identificados como compreendendo fragmentos doDNA nativo e fragmentos dos cassetes de expressão vegetal exógenos. Por"fragmentos" entendem-se segmentos de DNA que podem ser isolados ouamplificados com pelo menos 20 pares de bases de comprimento. Taisfragmentos podem ser seqüenciados ou mapeados com enzimas de restri-ção para confirmar a identidade de seqüência com o DNA nativo ou os cas-setes de expressão exógenos do material de partida.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar os exem-plos de certas modalidades preferidas da presente invenção. Deve ser con-siderado pelos versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplosa seguir representam as abordagens que os inventores descobriram quefuncionavam bem na prática da presente invenção e assim podem ser con-sideradas como constituindo os exemplos dos meios preferidos para a práti-ca da mesma. Entretanto, os versados na técnica devem, à luz da presentedescrição, considerar que muitas alterações podem ser feitas nas modalida-des específicas que são descritas e ainda se obter um resultado igual ousimilar sem sair do espírito e do âmbito da invenção.

Exemplo 1

Constructos de DNA e transformação de plantas

Os constructos de DNA da presente invenção compreendemmoléculas reguladoras ligadas ao DNA de interesse. Em particular, um cons-tructo de DNA compreende um promotor, um íntron, um líder a 5', uma mo-lécula codificadora ou não codificadora e uma região não traduzida a 3'. Osconstructos de DNA da presente invenção foram preparadas utilizando vá-rios métodos e ferramentas moleculares, por exemplo, os descritos emSambrook e outros e variações destes métodos que são conhecidos pelosversados na técnica de manipulação de DNA podem ser realizadas para aprodução de constructos substancialmente similares. Os métodos tais comométodos de amplificação pela PCR, clonagem e subclonagem foram utiliza-dos para ligar de forma operacional promotores, líderes, íntrons, peptídeosde trânsito, moléculas codificadoras, moléculas não codificadoras e regiõesnão traduzidas a 3' que são listados na Tabela 1 em configurações opera-cionais e adicionalmente ilustrados nas Figuras 1 -6. Os constructos de DNAforam clonadas em uma ou mais estruturas de plasmídeo apropriadas parauso na transformação mediada por Agrobacterium de células de milho, em-bora outras estruturas de plasmídeo possam ser selecionadas, por exemplo,plasmídeos com alto número de cópias para o isolamento de fragmentos deDNA para a transformação mediada por pistola de partículas ou plasmídeosque são compatíveis com outros hospedeiros bacterianos. Trinta e cincoconstructos listados na Tabela 1 foram feitas para testar as combinações deestratégias de expressão do polipeptídeo DHDPS resistente ao "feedback"de lisina (SEQ ID NO: 7) e a repressão do catabolismo da Iisina através dasupressão gênica do gene LKR/SDH endógeno do milho (SEQ ID NO: 2) oua expressão de uma aspartato quinase (SEQ ID NO: 8). Por exemplo, estasestratégias incluíam: 1) a expressão do LKR-dsRNA no embrião; 2) a ex-pressão tanto do polipeptídeo de DHDPS quanto do LKR-dsRNA no embri-ão; 3) a expressão tanto do polipeptídeo de DHDPS quanto do LKR-dsRNAno endosperma; 4) a expressão do polipeptídeo de DHDPS no endospermae do LKR-dsRNA no embrião; 5) a expressão do polipeptídeo de DHDPS eda aspartato quinase e a expressão do LKR-dsRNA.Preparação de plantas transgênicas

Tecidos de milho (linhagens LH198 ou LH244 intracruzadas) quecompreendem embriões imaturos ou calos são isolados para a transforma-ção e os constructos de DNA da presente invenção são inseridas no genomado milho utilizando os métodos de transformação mediada por Agrobacteri-um (por exemplo, Patentes U.S. Na5 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616;5.981.840 e 6.384.301, das quais todas são incorporadas aqui como refe-rência). Agrobacterium transformada para compreender os constructos deDNA listados na Tabela 1 é inoculada no tecido de milho. Após a exposiçãoàs bactérias transformadas, são utilizados protocolos de transformação pa-dronizados para a propagação e para a seleção de células de milho trans-formadas utilizando meios suplementados com o herbicida glifosato. Após aseleção de células que sobrevivem à exposição ao herbicida glifosato, asplantas transgênicas R0 foram regeneradas até a maturidade. As sementessão coletadas de plantas transgênicas férteis após o autocruzamento ou ocruzamento com uma segunda planta de milho. As análises moleculares sãorealizadas para a caracterização das inserções transgênicas. A PCR, o Sou-thern blotting, o ensaio Taqman® ou outras metodologias conhecidas pelosversados na técnica da biologia molecular são utilizadas para a identificaçãode eventos que compreendem inserções intactas isoladas dos constructosde DNA ou análise de zigosidade. A semente da progênie é plantada e asplantas da progênie cultivadas para a análise de Iisina dos tecidos e da se-mente da progênie.

Exemplo 2

Determinação do teor de Iisina dos tecidos e da semente de milho

Vários métodos são úteis para a determinação do teor de Iisinade tecidos vegetais, sementes e produtos processados, por exemplo, napresente invenção a cromatografia líquida-espectrofotometria de mas-sa/espectrofotometria de massa (LC-MS-MS) foi utilizada para analisar aIisina livre (partes por milhão, ppm) nos grãos de milho dos vários eventosidentificados como transformados com um constructo de DNA como listadona Tabela 1 e os resultados desta análise são descritos na Tabela 2. As a-mostras de grãos de milho maduros individuais de cada evento foram primei-ramente pesadas, moídas até um pó homogêneo fino e extraídas com umsolvente de extração compreendendo metanol, água e ácido fórmico. Nassituações em que os grãos estavam a granel, foram utilizados aproximada-mente 30 mg de pó moído. Ambas as técnicas de cromatografia líquida eespectrométrica de massa com monitoramento de várias reações (MRM)foram utilizadas para separar a Iisina no extrato de amostra. Após a separa-ção, a Iisina foi quantificada utilizando sua área de pico na espectrometria demassa contra sua curva de calibração padrão correspondente que foi prepa-rada utilizando um padrão interno (IS) de d4-lisina com adição de deutério.

Em um outro método, o teor de Iisina dos grãos de milho se ba-seava na avaliação dos aminoácidos livres através da cromatografia líquidade alto desempenho (HPLC). Os grãos individuais ou os conjuntos de grãosde cada evento foram moídos até um pó homogêneo fino como descrito eneste caso, foram utilizados aproximadamente 30 mg do pó para a análise.

Os aminoácidos foram extraídos com ácido tricloroacético a 5% e a detecçãode aminoácido foi conseguida através de uma derivatização da amina primá-ria pré-coluna com o-ftalaldeído (OPA). Utilizando a cromatografia em faseinversa, a separação é conseguida através da hidrofobicidade dos grupos Rlocalizados em cada aminoácido. Para ajudar a estabilizar o fluoróforo, éadicionado um tiol tal como 2-mercaptoetanol (SHCH2CH2OH) ou ácido 3-mercaptopropiônico (SHCH2CH2COOH).

Foi calculada a média dos níveis de Iisina livre (ppm) medidosnos eventos transgênicos produzidos através da transformação com cadauma dos constructos e estão resumidos na Tabela 1. É também identificadaa geração da semente (F1, F2, F3 e F4) analisada. As medidas do nível delisina livre na semente R1 de eventos transgênicos de milho contendopMON80378 são apresentadas na Tabela 2. Os níveis de lisina eram sur-preendentemente altos em 5 dos 6 eventos analisados. Os níveis de lisinapodem ser adicionalmente ajustados através do cruzamento de eventos demilho que contêm várias combinações dos cassetes de expressão vegetaldescritas na tabela 1 de forma que a semente híbrida do cruzamento dosparentais contendo um ou mais dos cassetes de expressão possui o nível delisina desejado. Os parentais intracruzados que contêm, por exemplo, oscassetes de expressão de CordapA e de lysC de E. coli (do tipo selvagem ouEc.lysC.mut, SEQ ID NO: 11, uma molécula de DNA que codifica uma prote-ína modificada em quatro posições, S2A, C58G, T352I e A401G) podem sercruzados com o cassete de expressão de LKR dsRNA para a produção deuma semente de progênie híbrida com níveis de Iisina que são mais que adi-tivos do que os níveis de Iisina da semente de qualquer um dos parentais.

Outras combinações, tal como um parental CordapA e aquele contendo LKRdsRNA, podem ser cruzadas com um parental LysC ou um parental LysC eLKR pode ser cruzado com um parental CordapA para fornecer níveis delisina altos inesperados na semente híbrida.

Tabela 1. Média de Iisina (ppm) por geração analisada partindo de estu-fas e vários testes de campo.

<table>table see original document page 33</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 34</column></row><table>Continuação

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Tabela 2. Níveis de Iisina medidos nos eventos R1 transformados compMON80378

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O teor de lisina dos grãos dos eventos compreendendopMON93092 foi também determinado por espectrofotometria de massa emtandem (LC MS-MS) em amostras moídas e extraídas de aproximadamente20 grãos por espiga. A quantidade de Iisina livre em partes por milhão (ppm)nos grãos R2 partindo de um número de eventos de transformação é mos-trada nas figura 7 e figura 8. Para os eventos compreendendo pMON93092como mostrado, os níveis de Iisina livre variavam entre aproximadamente3500-5500 ppm, enquanto que para os eventos compreendendopMON93093 como mostrado, os níveis variavam entre aproximadamente1700-6500 ppm. Na maior parte dos casos, duas ou mais espigas por eventoforam independentemente medidas e é mostrado o desvio padrão. Em com-paração, a média dos níveis de Iisina para o milho do tipo selvagem estavaentre 50 e 100 ppm.

Um depósito pela Monsanto Technology LLC, de pMON93092 epMON93093 descritos anteriormente e citados nas reivindicações, foi feitosob o Tratado de Budapeste junto à American Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. Os números deacesso da ATCC são PTA-6733 e PTA-6734, respectivamente. O depósitoserá mantido no depositário durante um período de 30 anos ou 5 anos apóso último requerimento ou durante a vida efetiva da patente, seja o que formais longo e será substituído quando necessário durante tal período.

Todas as publicações, as patentes e os pedidos de patentes sãoincorporados aqui como referência até a mesma extensão como se cadapublicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individu-almente indicado como sendo incorporado como referência.REFERÊNCIAS

As referências listadas abaixo são incorporadas aqui como refe-rência até a extensão em que suplementam, explicam, fornecem um funda-mento para ou ensinam uma metodologia, as técnicas e/ou as composiçõesempregadas aqui.

Patente U.S. N9 4.810.648; Patente U.S. Ne 4.957.748; PatenteU.S. N- 4.959.317; Patente U.S. N9 5.015.580; Patente U.S. N9 5.034.322;Patente U.S. N9 5.094.945; Patente U.S. N9 5.100.679; Patente U.S. N95.107.065; Patente U.S. N9 5.188.642; Patente U.S. N9 5.219.596; PatenteU.S. N9 5.258.300; Patente U.S. N9 5.288.300; Patente U.S. N9 5.322.938;Patente U.S. N9 5.352.605; Patente U.S. N9 5.359.142; Patente U.S. N95.362.865; Patente U.S. N9 5.367.110; Patente U.S. N9 5.527.695; PatenteU.S. N9 5.530.196; Patente U.S. N9 5.538.880; Patente U.S. N9 5.550.318;Patente U.S. N9 5.591.616; Patente U.S. N9 5.627.061; Patente U.S. N95.633.435; Patente U.S. N9 5.635.055; Patente U.S. N9 5.641.876; PatenteU.S. N9 5.759.829; Patente U.S. N9 5.773.691; Patente U.S. N9 5.780.708;Patente U.S. N9 5.824.877; Patente U.S. Ns 5.837.848; Patente U.S. N95.936.069; Patente U.S. N9 5.981.840; Patente U.S. N9 6.005.076; PatenteU.S. N9 6.040.497; Patente U.S. N9 6.107.549; Patente U.S. N9 6.118.047;Patente U.S. N9 6.140.078; Patente U.S. N9 6.146.669; Patente U.S. N96.156.227; Patente U.S. N9 6.160.208; Patente U.S. N9 6.175.060; PatenteU.S. N9 6.177.611; Patente U.S. N9 6.232.526; Patente U.S. N9 6.252.138;Patente U.S. N9 6.294.714; Patente U.S. N9 6.376.754; Patente U.S. N96.384.301; Patente U.S. N9 6.399.861; Patente U.S. N9 6.403.865; PatenteU.S. N9 6.426.446; Patente U.S. N9 6.429.357; Patente U.S. N9 6.429.362;Patente U.S. N9 6.433.252; Patente U.S. N9 6.437.217; Patente U.S. N96.459.019; Patente U.S. N9 6.635.806; Patente U.S. N9 6.660.911; Pedido dePatente U.S. N9 2002/0112260;

Pedido de Patente U.S. N9 2003/0056242; Pedido de Patente U.S. N9 2003/0106096; Pedido de Patente U.S. N9 2003/0140364; Pedido dePatente U.S. N9 20030196219; Pedido de Patente U.S. N9 2005/0132437;Pedido de Patente U.S. N9 2005/0193444;Patente U.S. Nq de Série 09/757.089

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<120>

SEMENTE DE PLANTA TRANSGENICA COM MAIOR TEOR DE LISINA

<130>

MONS:094US

<140><141>

DESCONHECIDO2006-09-22

<150><151>

60/723,1782005-10-03

<160>

11

<210><211><212><213>

1

903DNA

Corynebacterium glutamicum

<400>

1

agtacaggtt taacagctaa gaccggagta gagcacttcg gcaccgttgg agtagcaatg 60

gttactccat tcacggaatc cggagacatc gatatcgctg ctggccgcga agtcgcggct 120

tatttggttg ataagggctt ggattctttg gttctcgcgg gcaccactgg tgaatcccca 180

acgacaaccg ccgctgaaaa actagaactg ctcaaggccg ttcgtgagga agttggggat 240

cgggcgaagc tcatcgccgg tgtcggaacc aacaacacgc ggacatctgt ggaacttgcg 300

gaagctgctg cttctgctgg cgcagacggc cttttagttg taactcctta ttactccaag 360

ccgagccaag agggattgct ggcgcacttc ggtgcaattg ctgcagcaac agaggttcca 420

atttgtctct atgacattcc tggtcggtca ggtattccaa ttgagtctga taccatgaga 480

cgcctgagtg aattacctac gattttggcg gtcaaggacg ccaagggtga cctcgttgca 540

gccacgtcat tgatcaaaga aacgggactt gcctggtatt caggcgatga cccactaaac 600

cttgtttggc ttgctttggg cggatcaggt ttcatttccg taattggaca tgcagccccc 660

acagcattac gtgagttgta cacaagcttc gaggaaggcg acctcgtccg tgcgcgggaa 720

atcaacgcca aactatcacc gctggtagct gcccaaggtc gcttgggtgg agtcagcttg 780

gcaaaagctg cttcgcgtct gcagggcatc aacgtaggag atcctcgact tccaattatg 840

gctccaaatg agcaggaact tgaggctctc cgagaagaca tgaaaaaagc tggagttcta 900

taa 903

<210> 2<211> 3183

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2atgggttctg ctgctactga gggcaatgac accttgctgg gcaatggagt tgttgggatt 60cttgctgaga cttgtaatat gtgggaaaga agggcgccgt taactccttc ccattgtgcc 120cgccttctgc taggaggagg caagaacgga cctcgagtaa accggattat tgtgcagcca 180agcacaagga ggatccatca tgacgctcag tatgaggatg caggatgcga gatttcagaa 240gacctgtcag aatgcggcct tatcataggc atcaaacaac ccaagctgca gatgattctt 300tcagatagag cgtacgcttt cttttcacac acacacaaag cccaaaaaga gaatatgcca 360ctgttagaca agatccttga agaaagggtg tccttgtttg attatgagct aattgttgga 420gatgatggga aaagatcact agcatttggg aaatttgctg gtagagctgg actgatagat 480ttcttacatg gtctcggaca gcgatatttg agccttggat actcgactcc atttctctct 540ctgggacaat ctcatatgta tccttcgctc gctgcagcca aggctgcagt cattgtcgtt 600gcagaagaga tagcaacatt tggacttcca tccggaattt gtccgatagt gtttgtgttc 660actggagttg gaaacgtctc tcagggtgcg caggagatat tcaagttatt gccccatacc 720tttgttgatg ctgagaagct tcccgaaatt tttcaggcca ggaatctgtc taagcaatct 780cagtcgacca agagagtatt tcaactttat ggttgtgttg tgacctctag agacatggtt 840tctcacaagg atcccaccag acaatttgac aaaggtgact attatgctca tccagaacac 900tacacccctg tttttcatga aagaattgct ccatatgcat ctgtcatcgt aaactgtatg 960tattgggaga agaggtttcc accattacta aatatggatc agttacagca attgatggag 1020actggttgtc ctttagtcgg cgtttgtgac ataacttgtg atattggagg ttccattgaa 1080tttatcaaca agagtacatc aatagagagg cctttctttc ggtatgatcc ttctaagaat 1140tcataccatg atgatatgga aggtgccgga gtggtctgct tggctgttga cattctccct 1200acagaattct ctaaagaggc ctcccaacat tttggaaaca tactatctag acttgttgct 1260agtttggcct cagtgaagca accggcagaa cttccttcct acttgagaag agcttgcatt 1320gcacatgctg gcagattaac tcctttgtat gaatatatcc ctaggatgag aaatactatg 1380atagatttgg cacccgcaaa aacaaatcca ttgcctgaca agaagtatag caccctggta 1440tctctcagtg ggcacctatt tgataagttc cttataaatg aagctttgga catcattgag 1500acagctggag gttcatttca cttggttaga tgtgaagttg gacaaagcac ggatgatatg 1560tcatactcag agcttgaagt aggagcagat gatactgcca cattggataa aattattgat 1620tccttgactt ctttagctaa tgaacatggt ggagatcacg atgccgggca agaaattgaa 1680ttagctctga agataggaaa agtcaatgag tatgaaactg acgtcacaat tgataaagga 1740gggccaaaga ttttaattct tggagctgga agagtctgtc ggccagctgc tgagtttctg 1800gcatcttacc cagacatatg tacctatggt gttgatgacc atgatgcaga tcaaattcat 1860gttatcgtgg catctttgtá tcaaaaagat gcagaagaga cagttgatgg tattgaaaat 1920acaactgcta cccagcttga tgttgctgat attggaagcc tttcagatct tgtttctcag 1980gttgaggttg taattagctt gctgcctgct agttttcatg ctgccattgc aggagtatgc 2040atagagttga agaagcacat ggtaacggca agctatgttg atgaatccat gtcaaacttg 2100agccaagctg ccaaagatgc aggtgtaact atactttgtg aaatgggcct agatcctggc 2160atagatcact tgatgtcaat gaagatgatt gatgaagctc atgcacgaaa gggaaaaata 2220aaggcattta catcttactg tggtggattg ccatctccag ctgcagcaaa caatccgctt 2280gcctataaat tcagttggaa cccagctggt gcactccggt cagggaaaaa tcctgcagtc 2340tacaaatttc ttggtgagac gatccatgta gatggtcata acttgtatga atcagcaaag 2400aggctcagac tacgagagct tccagctttt gctctggaac acttgccaaa tcggaattcc 2460ttgatatatg gtgaccttta tggtatctcc aaagaagcat ccaccatata tagggctact 2520cttcgttacg aaggttttag tgagattatg gtaacccttt ccaaaactgg gttctttgat 2580gctgcaaatc atccactgct gcaagatact agtcgtccaa catataaggg tttccttgat 2640gaactactga ataatatctc cacaattaac acggacttag atattgaagc ctctggtgga 2700tacgatgatg acctgattgc cagactgttg aagctcgggt gttgcaaaaa taaggaaata 2760gctgttaaga cagtcaaaac catcaagttc ttgggactac atgaagagac tcaaatacct 2820aagggttgtt cgagcccatt tgatgtgatt tgccagcgaa tggaacagag gatggcctat 2880ggccacaatg agcaagacat ggtactgctc caccacgaag tcgaggtgga atacccggac 2940gggcaacccg ccgaaaagca ccaagcgacg ctactggagt tcgggaaggt tgaaaatggc 3000aggtccacca ctgccatggc gctgaccgtc ggcattccag cagcaatagg ggccctgcta 3060ttgctaaaga ataaggtcca gacgaaagga gtgatcaggc ctctgcaacc ggaaatctac 3120gttccagcat tggagatctt ggagtcgtcg ggcatcaagc tggttgagaa agtggagact 3180tga 3183<210> <211> <212> <213> 3 1350 DNA Escherichia coli <400> 3 atggcagaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat 960tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaatccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc 1200ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat 1260ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg 1320caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350

<210> 4

<211> 392

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 4

gatctcgtca atttttccct tttgtaattt tgtaatttat aatttacttt cctgtatgct 60

tctaactctg tcgttttaaa attttaataa aatttcagta ggggcttgcc cctcctgtcc 120

tataaaaaaa agttgacgtg aatagatttc attaagaggt tggatgttag tgggatgaca 180

tgactattag taggacgaga tgatgtggaa agttagtggg agatgatatg gatagttttt 240

gctttcatcg aaaggttgga agttagtatg atgacatggc taatatagat acatagatat 300

agactaccaa catggctgca tgcccccaag ctctcccact atatatatct ctggtagcac 3 60

atcatcccaa ttcacaatgc ttacaaaaac cc 392

<210> 5

<211> 903

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 5

ttatagaact ccagcttttt tcatgtcttc tcgcagagcc tcaagttcct gctcatttgg 60

agccattatt ggaagcctag gatctcctac gttgatgcct tgcagacgca gagcagcttt 120

tgccaagctg actccaccca agcgaccctg ggcagctacc agcggtgata gtttggcgtt 180

gatctccctc gcacggacca ggtcgccttc ctcgaaactt gtgtacaact cccttaatgc 240

tgtgggggct gcatgtccaa ttacggatat aaaacctgat ccgcccaaag caagccaaac 300aagg.tttagt gggtcatcgc ctgaatacca ggcaagtccc gtttctttga tcaatgacgt 3 60ggctgcaacc aggtcccctt tggcgtcttt gaccgccaaa atcgtaggta attcactcag 420

gcgtctcatg gtatcagact caattggaat acctgaccta ccaggaatgt cgtagaggca 480

aattggcacc tctgttgctg ctgcgattgc cccgaagtgc gccagcaatc cctcctggct 540

cggcttactg taataaggag ttacgactaa aaggccgtct gcgccagcag aagcagcagc 600

ctccgcaagt tccacagatg tccgcgtgtt attggttccg acaccggcga ttagtttcgc 660

cctatcccct acttcctcac gcacggcctt gagcagttct agtttctcag cggcggttgt 720

cgttggggat tcaccagtgg tgcccgcgag caccaaagaa tccaagcctt tatcgactag 780

ataagccgcg acctcgcggc cagcagctat atcgatgtct ccactttccg tgaatggagt 840

taccattgct actcccacgg tgccaaagtg ctctactccg gtcttagctg ttaaacctgt 900

gct 903

<210> 6<211> 171

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 6

atggtttcgc cgacgaatct cctcccggcg cggaagatca cccctgtctc aaatggcggc 60

gcagcgacgg cgagcccctc ttctccctcg gtggccgcac ggccacggcg actcccttca 120

ggcctccaat ctgtgactgg tagagggaag gtttccttgg cagccatcac t 171

<210> 7

<211> 300

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 7

Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr Val1 5 10 15 Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp Ile20 25 30

Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu Asp35 40 45

Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr Ala50 55 60

Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly Asp65 70 75 80

Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr Ser85 90 95

Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu Leu100 105 110

Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu Ala115 120 125His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu Tyr130 135 140

Asp 145 Ile Pro Gly Arg Ser 150 Gly Ile Pro Ile Glu 155 Ser Asp Thr Met Arg 160Arg Leu Ser Glu Leu 165 Pro Thr Ile Leu Ala 170 Val Lys Asp Ala Lys 175 GlyAsp Leu Val Ala 180 Ala Thr Ser Leu Ile 185 Lys Glu Thr Gly Leu 190 Ala TrpTyr Ser Gly Asp 195 Asp Pro Leu Asn 200 Leu Val Trp Leu Ala 205 Leu Gly Gly Ser Gly 210 Phe Ile Ser Val Ile Gly His 215 Ala Ala Pro 220 Thr Ala Leu ArgGlu 225 Leu Tyr Thr Ser Phe 230 Glu Glu Gly Asp Leu 235 Val Arg Ala Arg Glu 240Ile Asn Ala Lys Leu 245 Ser Pro Leu Val Ala 250 Ala Gln Gly Arg Leu 255 GlyGly Val Ser Leu 260 Ala Lys Ala Ala Ser 265 Arg Leu Gln Gly Ile 270 Asn ValGly Asp Pro Arg 275 Leu Pro Ile Met 280 Ala Pro Asn Glu Gln 285 Glu Leu GluAla Leu 290 Arg Glu Asp Met Lys 295 Lys Ala Gly Val Leu 300 <210> <211> <212> <213> 8 449 PRT Escherichia coli <400> 8 Met 1 Ala Glu Ile Val 5 Val Ser Lys Phe Gly Gly 10 Thr Ser Val Ala 15 AspPhe Asp Ala Met 20 Asn Arg Ser Ala Asp 25 Ile Val Leu Ser Asp 30 Ala AsnVal Arg Leu Val 35 Val Leu Ser Ala 40 Ser Ala Gly Ile Thr 45 Asn Leu LeuVal Ala 50 Leu Ala Glu Gly Leu 55 Glu Pro Gly Glu Arg 60 Phe Glu Lys LeuAsp 65 Ala Ile Arg Asn Ile 70 Gln Phe Ala Ile Leu 75 Glu Arg Leu Arg Tyr 80Pro Asn Val Ile Arg 85 Glu Glu Ile Glu Arg 90 Leu Leu Glu Asn Ile 95 ThrVal Leu Ala Glu 100 Ala Ala Ala Leu Ala 105 Thr Ser Pro Ala Leu 110 Thr AspGlu Leu Val Ser 115 His Gly Glu Leu 120 Met Ser Thr Leu Leu 125 Phe Val Glu

Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys130 135 140Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala145 150 155 160

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu165 170 175

Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg180 185 190

Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu195 200 205

Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro210 215 220

Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile225 230 235 240

Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala245 250 255

Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile260 265 270

Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu275 280 285

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu290 295 300

Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His305 310 315 320

Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn325 330 335

Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr340 345 350

Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln355 360 365

Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu370 375 380

Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys385 390 395 400

Ala Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg405 410 415

Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro420 425 430

Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe435 440 445

Glu

<210> 9

<211> 1155

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 9ccgatttggc aagtgttcca gagcaaaagc tggaagctct cgtagtctga gcctçtttgc 60tgattcatac aagttatgac catctacatg gatcgtctca ccaagaaatt tgtagactgc 120aggatttttc cctgaccgga gtgcaccagc tgggttccaa ctgaatttat aggcaagcgg 180

attgtttgct gcagctggag atggcaatcc accacagtaa gatgtaaatg cctttatttt 240

tccctttcgt gcatgagctt catcaatcat cttcattgac atcaagtgat ctatgccagg 300

atctaggccc atttcacaaa gtatagttac acctgcatct ttggcagctt ggctcaagtt 360

tgacatggat tcatcaacat agcttgccgt taccatgtgc ttcttcaact ctatgcatac 420

tcctgcaatg gcagcatgaa aactagcagg cagcaagcta attacaacct caacctgaga 480

aacaagatct gaaaggcttc caatatcagc aacatcaagc tgggtagcag ttgtattttc 540

aataccatca actgtctctt ctgcatcttt ttgatacaaa gatgccacga taacatgaat 600

ttgatctgca tcatggtcat caacaccata ggtacatatg tctgggtaag atgccagaaa 660

ctcagcagct ggccgacaga ctcttccagc tccaaaccgg tgctgcctgc tagttttcat 72 0

gctgccattg caggagtatg catagagttg aagaagcaca tggtaacggc aagctatgtt 780

gatgaatcca tgtcaaactt gagccaagct gccaaagatg caggtgtaac tatactttgt 840

gaaatgggcc tagatcctgg catagatcac ttgatgtcaa tgaagatgat tgatgaagct 900

catgcacgaa agggaaaaat aaaggcattt acatcttact gtggtggatt gccatctcca 960

gctgcagcaa acaatccgct tgcctataaa ttcagttgga acccagctgg tgcactccgg 1020

tcagggaaaa atcctgcagt ctacaaattt cttggtgaga cgatccatgt agatggtcat 1080

aacttgtatg aatcagcaaa gaggctcaga ctacgagagç ttccagcttt tgctctggaa 1140

cacttgccaa atcgg 1155

<210> 10<211> 1967

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Molécula de DNA quimérico de um intro de hsp70 de milho e umamolécula de supressão gênica de LKR/SDH

<400> 10

accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa 60

tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa 120

atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat atagggacat 180

ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240

tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300

gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 3 60

gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420

tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttgatccc gatttggcaa gtgttccaga 480gcaaaagctg gaagctctcg tagtctgagc ctctttgctg attcatacaa gttatgacca 540tctacatgga tcgtctcacc aagaaatttg tagactgcag gatttttccc tgaccggagt 600gcaccagctg ggttccaact gaatttatag gcaagcggat tgtttgctgc agctggagat 660ggcaatccac cacagtaaga tgtaaatgcc tttatttttc cctttcgtgc atgagcttca 720tcaatcatct tcattgacat caagtgatct atgccaggat ctaggcccat ttcacaaagt 780atagttacac ctgcatcttt ggcagcttgg ctcaagtttg acatggattc atcaacatag 840cttgccgtta ccatgtgctt cttcaactct atgcatactc ctgcaatggc agcatgaaaa 900ctagcaggca gcaagctaat tacaacctca acctgagaaa caagatctga aaggcttcca 960atatcagcaa catcaagctg ggtagcagtt gtattttcaa taccatcaac tgtctcttct 1020gcatcttttt gatacaaaga tgccacgata acatgaattt gatctgcatc atggtcatca 1080acaccatagg tacatatgtc tgggtaagat gccagaaact cagcagctgg ccgacagact 1140cttccagctc caaaccggtg ctgcctgcta gttttcatgc tgccattgca ggaijtatgca 1200tagagttgaa gaagcacatg gtaacggcaa gctatgttga tgaatccatg tcaaacttga 1260gccaagctgc caaagatgca ggtgtaacta tactttgtga aatgggccta gatcctggca 1320tagatcactt gatgtcaatg aagatgattg atgaagctca tgcacgaaag ggaaaaataa 13 80aggcatttac atcttactgt ggtggattgc catctccagc tgcagcaaac aatccgcttg 1440cctataaatt cagttggaac ccagctggtg cactccggtc agggaaaaat cctgcagtct 1500acaaatttct tggtgagacg atccatgtag atggtcataa cttgtatgaa tcagcaaaga 1560ggctcagact acgagagctt ccagcttttg ctctggaaca cttgccaaat cggaattaac 1620gcctgaagga ataaatataa atgacgaaat tttgatgttt atctctgctc ctttattgtg 1680accataagtc aagatcagat gcacttgttt taaatattgt tgtctgaaga aataagtact 1740gacagtattt tgatgcattg atctgcttgt ttgttgtaac aaaatttaaa aataaagagt 1800ttcctttttg ttgctctcct tacctcctga tggtatctag tatctaccaa ctgacactat 1860attgcttctc tttacatacg tatcttgctc gatgccttct ccctagtgtt gaccagtgtt 1920actcacatag tctttgctca tttcattgta atgcagatac caagcgg 1967

<210> 11

<211> 1350

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 11

atggcagaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60

aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120

tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180

ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240

ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttcçgc 900gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat 960tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaatccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc 1200ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat 1260ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg 132 0caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 13 50

Claims (36)

1. Constructo de DNA que compreende um cassete de expres-são vegetal heterólogo que codifica uma ácido dihidrodipicolínico sintase queé substancialmente resistente à inibição do "feedback" pela L-Iisina livre; eque compreende ainda uma molécula de DNA que é transcrita para produziruma molécula de RNA que suprime uma Iisina cetoglutarato reduta-se/sacaropina desidrogenase; em que cada uma das moléculas de DNA estáligada de forma operacional a um promotor intensificado nas sementes, emque o promotor promove a transcrição das moléculas de DNA substancial-mente no endosperma de uma semente.

2. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, quecompreende um cassete de expressão adicional que compreende uma mo-lécula de DNA que codifica uma aspartato quinase que é substancialmenteresistente ao "feedback" pela L-Iisina livre.

3. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em queuma molécula de DNA que codifica um peptídeo sinal de trânsito para oplastídeo está ligada de forma operacional à molécula de DNA que codifica aácido dihidrodipicolínico sintase.

4. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 2, em queuma molécula de DNA que codifica um peptídeo sinal de trânsito para oplastídeo está ligada de forma operacional à molécula de DNA que codifica aaspartato quinase.

5. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em quea molécula de DNA que codifica uma ácido dihidrodipicolínico sintase é aSEQ ID NO: 1.

6. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em quea molécula de DNA que é transcrita para produzir uma molécula de RNA quesuprime a Iisina cetoglutarato redutase/sacaropina desidrogenase é homólo-ga ou complementar à SEQ ID NO: 2 ou a uma parte da mesma suficientepara a supressão da desidrogenase.

7. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 2, em quea molécula de DNA que codifica uma aspartato quinase é a SEQ ID NO: 3.

8. Semente de milho que compreende o DNA nativo e um oumais cassetes de expressão vegetal exógenos que compreendem uma mo-lécula de DNA que codifica uma ácido dihidrodipicolínico sintase que é subs-tancialmente resistente à inibição do "feedback" pela L-Iisina livre, uma mo-lécula de DNA que é transcrita para produzir uma molécula de RNA que su-prime uma Iisina cetoglutarato redutase/sacaropina desidrogenase e umamolécula de DNA que codifica uma aspartato quinase resistente ao "feed-back" da lisina, as moléculas de DNA estando ligadas de forma operacionala uma ou mais moléculas" de promotores que causam a transcrição de umaou mais moléculas de RNA substancialmente no endosperma da semente demilho.

9. Semente de acordo com a reivindicação 8, em que o construc-to compreende ainda uma molécula de DNA que codifica uma 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase.

10. Semente de acordo com a reivindicação 8, em que a molécu-la de DNA que codifica uma seqüência de DNA estrutural da ácido dihidrodi-picolínico sintase é a SEQ ID NO: 1.

11. Semente de acordo com a reivindicação 8, em que a molécu-la de DNA que codifica uma aspartato quinase é a SEQ ID NO: 3.

12. Semente de acordo com a reivindicação 8, em que a molécu-la de DNA que é transcrita para produzir uma molécula de RNA que suprimeuma lisina cetoglutarato redutase/sacaropina desidrogenase é a SEQ ID NO: 9.

13. Semente de acordo com a reivindicação 9, em que a dita 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase é uma aroA:CP4 EPSPS.

14. Semente de acordo com a reivindicação 8, em que a molécu-la de DNA compreende ainda uma seqüência de DNA que codifica um pep-tídeo sinal de trânsito para o cloroplasto ligado de forma operacional à se-qüência de DNA que codifica a ácido dihidrodipicolínico sintase ou a asparta-to quinase.

15. Semente de acordo com a reivindicação 8, em que o promo-tor é selecionado do grupo que consiste do promotor B32 de Zea mays, dagama coixina de Zea mays e L3 de Zea mays.

16. Semente de acordo com a reivindicação 8, que possui umteor de Iisina maior que a semente de milho que não contém os cassetes deexpressão vegetal exógenos.

17. Constructo de DNA que consiste do plasmídeo pMON93092que compreende os cassetes de expressão vegetal que sãõ depositadosjunto à ATCC como PTA-6733 ou o plasmídeo pMON93093 que compreen-de os cassetes de expressão vegetal que são depositados junto à ATCCcomo-PTA-6734.

18. Semente de planta que compreende dentro de seu genomapelo menos um cassete de expressão vegetal do plasmídeo pMON93092 oudo plasmídeo pMON93093.

19. Produto processado da semente como definido na reivindi-cação 18, em que o dito produto é um produto alimentício, uma farinha, umafarinha grossa ou uma composição de proteína parcialmente purificada.

20. Produto processado da semente como definida na reivindi-cação 18, que compreende fragmentos do DNA nativo e fragmentos doscassetes de expressão vegetal exógenos.

21. Célula de milho que compreende um ou mais cassetes deexpressão vegetal exógenos que compreendem uma molécula de DNA quecodifica uma ácido dihidrodipicolínico sintase que é substancialmente resis-tente à inibição do "feedback" pela L-Iisina livre, uma molécula de DNA que étranscrita para produzir uma molécula de RNA que suprime uma Iisina ceto-glutarato redutase/sacaropina desidrogenase e uma molécula de DNA quecodifica uma aspartato quinase resistente ao "feedback" da lisina, as molé-culas de DNA estando ligadas de forma operacional a uma ou mais molécu-las promotoras que causam a transcrição de uma ou mais moléculas deRNA substancialmente no endosperma de uma semente de milho.

22. Célula de acordo com a reivindicação 21, em que o construc-to compreende ainda uma molécula de DNA que codifica uma 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase.

23. Célula de acordo com a reivindicação 21, em que a moléculade DNA que codifica uma seqüência de DNA estrutural da ácido dihidrodipi-colínico sintase é a SEQ ID NO: 1.

24. Célula de acordo com a reivindicação 21, em que a moléculade DNA que codifica uma aspartato quinase é a SEQ ID NO: 3.

25. Célula de acordo com a reivindicação 21, em que a moléculade DNA que é transcrita para produzir uma molécula de RNA que suprimeuma Iisina cetoglutarato redutase/sacaropina desidrogenase é a SEQ ID NO:-9 (a seqüência bfx).

26. Célula de acordo com a reivindicação 22, em que a dita 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase é uma aroA:CP4 EPSPS.

27. Célula de acordo com a reivindicação 21, em que a moléculade DNA compreende ainda uma seqüência de DNA que codifica um peptí-deo sinal de trânsito para cloroplasto ligado de forma operacional à seqüên-cia de DNA que codifica a ácido dihidrodipicolínico sintase ou a aspartatoquinase.

28. Célula de acordo com a reivindicação 21, em que o promotoré um promotor B32 de Zea mays ou da gama coixina de Zea mays ou L3 deZea mays.

29. Célula de acordo com a reivindicação 21, que possui um teorde Iisina maior que o da semente de milho que não contém os cassetes deexpressão vegetal exógenos.

30. Célula vegetal que compreende dentro de seu genoma oscassetes de expressão vegetal do plasmídeo pMON93092 ou do plasmídeopMOM93093.

31. Produto processado que contém células intactas ou rompi-das como definidas na reivindicação 21, em que o produto é um produto ali-mentício, uma farinha grossa ou uma farinha.

32. Processo para a produção de grão que compreende as eta-pas de:a) transformação de uma célula de uma variedade de plantacom os cassetes de expressão vegetal plasmídeopMON93092 ou pMON93093;b) regeneração da dita célula em uma planta fértil que possuios cassetes de expressão em seu genoma; ec) coleta da semente da dita planta,em que a semente possui um teor de Iisina maior que o da se-mente da mesma variedade não transformada com o dito constructo.

33. Processo para a obtenção de semente que compreende asetapas de:a) seleção de uma primeira e uma segunda plantas parentaiscada uma compreendendo um ou cfois cassetes de expres-são vegetal heterólogos selecionados do grupo que consis-te de (i) um cassete que compreende uma molécula deDNA que codifica uma ácido dihidrodipicolínico sintase queé substancialmente resistente à inibição do "feedback" pelaL-lisina livre, (ii) um cassete que compreende uma molécu-la de DNA que é transcrita para produzir uma molécula deRNA que suprime uma Iisina cetoglutarato reduta-se/sacaropina desidrogenase e (iii) um cassete que com-preende uma molécula de DNA que codifica uma aspartatoquinase que é resistente à inibição do "feedback" pela Iisi-na; as moléculas de DNA em cada um dos cassetes estan-do ligadas de forma operacional com uma molécula promo-tora que causa a transcrição de uma molécula de RNAsubstancialmente no endosperma de uma semente de mi-lho, de forma que cada uma das parentais possui pelo me-nos um dos cassetes de expressão, nenhuma das paren-tais possui todos os três cassetes de expressão e as pa-rentais sejam diferentes uma da outra em relação aos cas-setes de expressão;b) cruzamento das plantas parentais selecionadas; ec) coleta da semente da progênie do dito cruzamento.

34. Processo de fornecimento de nutrição a um ser humano ou aum animal inferior que compreende a alimentação do ser humano ou do a-nimal inferior com uma dieta que compreende uma semente de milho comalto teor de Iisina ou um produto processado partindo da mesma, que com-preende os cassetes de expressão vegetal de pMON93092 ou pMC)N93093.

35. Processo de fornecimento de nutrição a um ser humano ou aum animal inferior que compreende a alimentação do ser humano ou do a-nimal inferior com uma dieta que compreende uma semente de milho comalto teor de Iisina ou um produto processado partindo da mesma, que com-preende fragmentos do DNA nativo provenientes da semente e fragmentosdos cassetes de expressão vegetah de pMON93ü92 ou pMC)N93093.

36. Produto processado da semente que compreende as etapas de:a) transformação de uma célula de uma variedade de plantacom os cassetes de expressão vegetal plasmídeopMON93092 ou pMON93093;b) regeneração da dita célula em uma planta fértil que possuios cassetes de expressão em seu genoma;c) coleta da semente da dita planta, ed) processamento da dita semente em um produto alimentíciopara animais ou uma farinha grossa ou uma farinha ou umóleo;em que a semente possui um teor maior de Iisina que a sementeda mesma variedade não transformada com o dito constructo.