BRPI0100752B1 - moléculas e pares de moléculas de dna, processos para detectar molécula de dna e para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, bem como kit de detecção de dna - Google Patents
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Abstract
patente de invenção: "evento de milho pv-zmgt32 (nk603) e composições e processos para detecção do mesmo". a presente invenção refere-se a uma construção de dna que confere tolerância à planta de milho transgênica. são providos também ensaios para detectar a presença do evento de milho pv-zmgt32 (nk603) baseado na seqüência de dna do construto recombinante inserida no genoma de milho e de sequências genômicas flanqueando o sítio de inserção.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS E PARES DE MOLÉCULAS DE DNA, PROCESSOS PARA DETECTAR MOLÉCULA DE DNA E PARA CRIAR UM TRAÇO TOLERANTE A GLIFOSATO EM PLANTAS DE MILHO, BEM COMO KIT DE DETECÇÃO DE DNA".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, especificamente a uma construção de DNA para conferir tolerância a glifosato a uma planta. A invenção, mais especifica mente, refere-se a uma planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) e a ensaios para detectar a presença de um DNA de planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) em uma amostra e composições do mesmo.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se à planta PV-ZMGT32 (nk603) de milho (Zea mays) tolerante ao herbicida glifosato e à construção da expressão de DNA da planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) e à detecção da região de inserção genô-mica/transgenes em milho PV-ZMGT32 {nk.603) e progênie da mesma.
Milho é uma cultura importante e é uma fonte de alimento primária em muitas áreas do mundo. Os processos de biotecnologia são aplicados a milho para melhora dos traços agronômicos e da qualidade do produto. Um destes traços agronômicos é tolerância a herbicida, em particular tolerância ao herbicida glifosato. Este traço é conferido pela expressão de um transgene nas plantas de milho (patente US nQ 6.040.497). Sabe-se que a expressão de genes estranhos em plantas é influenciada por sua posição cromossômica, talvez devido à estrutura de cromatina (por exemplo, hetero-cromatina) ou a proximidade de elementos de regulação transcripcionais (por exemplo, melhoradores) próximos ao sítio de integração (Weising e outros, Ann. Rev. Genet 22: 421- 477, 1988). Por esta razão, é frequentemente necessário triar um grande número de eventos a fim de identificar um evento caracterizado por expressão ótima de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, observa-se em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação em níveis de expressão de um gene introduzido entre eventos. Também podem haver diferenças em padrões espaciais ou tempo- rais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de planta, que podem não corresponder aos padrões esperados de elementos regulatórios transcripcionais presentes na construção de genes introduzidos. Por esta razão, é comum produzir centenas a milhares de eventos diferentes e triar estes eventos para um evento único que visa níveis de expressão e padrões para fins comerciais. Um evento que visa níveis ou padrões de expressão de transgenes é utilizável para introgredir transgene em outras experiências genéticas por acasalamento sexual usando processos de criação convencionais. Progênie destes cruzamentos mantém as características de expressão de transgenes do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar expressão de genes confiável em um número de variedades que são bem adaptadas às condições de crescimento locais.
Pode ser vantajoso ser capaz de detectar a presença de um evento particular a fim de determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene de interesse. Além disso, um processo para detectar um evento particular pode ser proveitoso para agir de acordo com regulações requerendo a rotulação e aprovação de pré- comercialização e rotu-lação de alimentos derivados de plantas de culturas recombinantes, por exemplo. É possível detectar a presença de um transgene por qualquer processo de detecção de ácido nucléico bem conhecido como a reação de cadeia de polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas de ácido nucléico. Estes processos de detecção focalizam, geralmente, elementos genéticos frequentemente usados como promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como um resultado, estes processos não podem ser utilizáveis para discriminar entre eventos diferentes, particularmente os produzidos usando a mesma construção de DNA, a menos que a sequência de DNA do DNA cromossômico adjacente ao DNA inserido ("DNA de flanco") seja conhecida. Um ensaio PCR específico de evento é discutido, por exemplo, por Windels e outros, (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/ 5b: 459-462,1999), que identificaram evento 40-3-2 de soja tolerante a glifosato por PCR usando um conjunto de ínicíadores no espaço entre a junção do inserto e do DNA de flanco, especificamente um iniciador que incluiu a seqüência do inserto e um segundo iniciador que incluiu seqüência de DNA de flanco. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com uma aspecto da invenção, provê-se uma construção de DNA que quando expressada em células de plantas e plantas confere tolerância ao herbicida glifosato. Esta invenção refere-se preferivelmente aos processos para produzir e selecionar uma planta de milho tolerante a glifosato. A construção de DNA consiste em dois cassetes de expressão transgênicos. O primeiro cassete de expressão consiste em um promotor actina 1 de arroz (Oryzae sativa) e íntron ligado de modo operativo a uma seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto EPSPS de Arabidop-sis, conectada de modo operativo a um 5- enol - piruvilshiquimato -3- fosfato sintase (EPSPS) resistente a glifosato isolada da cepa CP4 de Agrobacte-rium tumefaciens sp., conectada de modo operativo a um terminador trans-cripcional de nopalina sintase. O segundo cassete de expressão transgênico consiste no promotor 35S do vírus mosaico de couve- flor (CaMV) contendo uma duplicação em tandem da região melhoradora, conectado de modo operativo a um íntron Hsp70 de Zea mays, conectado de modo operativo a uma seqüência de ácido nucléico codificando uma seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto EPSPS de Arabidopsis thaliana, conectada de modo operativo a uma 5- enol- piruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) isolada da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens sp., conectada de modo operativo a um terminador transcripcional de nopalina sintase.
De acordo com outro aspecto da invenção, são providas composições e processos para detectar a presença da região de inserção genômi-ca/ transgenes de uma nova planta de milho designada PV-ZMGT32 (nk603). Moléculas de DNA são providas, as quais compreendem pelo menos uma seqüência de junção de PV-ZMGT32 (nk603) selecionada dentre o grupo consistindo em 5’ TGTAGCGGCCCACGCGTGGT 3’ (SEQ ID NOS: 9), 5’ TACCACGCGACACACTTC 3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’ TGCTGTTCTGCTGACTTT 3’ (SEQ ID NO: 11) e complementos dos mesmos; em que uma seqüência de junção transpõe a junção entre DNA heteró- logo inserido no genoma e o DNA da célula de milho flanqueando o sítio de inserção e é diagnosticada para o evento. A semente e planta de milho compreendendo estas moléculas são um aspecto desta invenção.
Uma nova molécula de DNA 5’ ACCAAGCTTTTATAATAG 3’ (SEQ ID NO: 12) e o complemento da mesma, em que esta molécula de DNA é nova em PV-ZMGT32 (nk603) e sua progênie. A semente e planta de milho compreendendo esta molécula são um aspecto desta invenção.
De acordo com outro aspecto da invenção, moléculas de DNA que compreendem a nova região de inserção genômica/ transgene, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 são um aspecto desta invenção.
Moléculas de DNA que compreendem um comprimento suficiente de uma porção de transgenes da seqüência de DNA da SEQ ID NO: 7 e um comprimento suficiente similar de uma seqüência de DNA 5’ de milho de flanco da SEQ ID NO: 7 ou um comprimento suficiente similar de uma porção de transgenes 3’ da seqüência de DNA da SEQ ID NO: 8 e um comprimento suficiente similar de uma seqüência de DNA 3’ flanqueando o transgene, em que estas moléculas de DNA são utilizáveis como iniciadores de DNA em processos de amplificação de DNA de modo a prover um produto amplicon de DNA especificamente produzido de DNA de PV-ZMGT32 (nk603) e sua progênie são outro aspecto da invenção. Iniciadores de DNA homólogos ou complementares a uma comprimento da SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 são um aspecto da invenção. Os amplicons produzidos usando estes iniciadores são um agente diagnóstico para evento de milho PV-ZMGT32 (nk603) e sua progênie são um objeto desta invenção.
De acordo com outro aspecto da invenção, são providos processos para detectar a presença de DNA correspondendo ao evento de milho PV-ZMGT32 (nk603) evento em uma amostra. Estes processos compreendem: (a) contactar o DNA compreendendo a amostra com o conjunto de iniciadores de DNA, que, quando usados em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico de evento de milho PV-ZMGT32 (nk603), produzem um amplicon que é diagnóstico para evento de milho PV-ZMGT32 (nk603); (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, produ- zindo assim o amplicon; e (c) detectar o amplicon. Um par de moléculas de DNA compreendendo um conjunto de iniciadores de DNA, em que as moléculas de DNA são identificadas como SEQ ID NO: 13 ou complementos da mesma e SEQ ID NO: 14 ou complementos da mesma; SEQ ID NO: 15 ou complementos da mesma e SEQ ID NO: 16 ou complementos da mesma. O amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14. O amplicon compreendendo as moléculas de DNA das SEQ ID NO: 15 e SEQ IDNO:16.
De acordo com outro aspecto da invenção, processos para detectar a presença de um DNA correspondendo ao evento PV-ZMGT32 (nk603) em uma amostra, estes processos compreendendo: (a) contactar a amostra compreendendo DNA com uma sonda que hibridiza em condições de hibridização estringentes com DNA genômico de evento de milho PV-ZMGT32 (nk603) e não hibridiza em condições de hibridização estringentes com uma planta de milho de controle; (b) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização estringentes; e (c) detectar hibridização da sonda no DNA.
De acordo com outro aspecto da invenção, processos para produzir uma planta de milho que tolera aplicação de glifosato são providos, os quais compreendem as etapas de: (a) cruzar sexualmente uma primeira linhagem de milho parental compreendendo os cassetes de expressão da presente invenção, que confere tolerância à aplicação de glifosato, e uma segunda linhagem de milho parental que é desprovida de tolerância a glifosato, desse modo produzindo uma pluralidade de plantas de progênie; e (b) selecionar uma planta de progênie que tolera aplicação de glifosato. Estes processos podem, opcionalmente, compreender uma outra etapa de retro-cruzar a planta de progênie na segunda linhagem de milho parental para produzir uma planta de milho de criação verdadeira que tolera aplicação de glifosato.
Esta invenção refere-se ainda às plantas e sementes de milho PV-ZMGT32 (nk603) (Zea mays) tolerantes a glifosato tendo o número de acesso ATCC PTA- 2478 e a progênie derivada das mesmas. A planta de milho ou suas partes produzidas cultivando a planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) tolerante a glifosato, o pólen e óvulos da planta de milho PV-ZMGT32 (nk603). Os núcleos das células vegetativas, os núcleos das células de pólen e os núcleos de células de ovos da planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) e a progênie derivada dos mesmos. A semente e planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) das quais as moléculas de iniciadores de DNA da presente invenção provêem um produto amplicon específico são um aspecto da invenção.
Os aspectos acima e outros da invenção se tornarão mais evidentes da descrição detalhada e desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Mapa de plasmídeo de pMON25496.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADES PREFERIDAS
Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. u-60/ 213.567, depositado em 22/06/00; pedido provisório U.S. if 60/ 241.215, depositado em 13/10/00; e pedido provisório n- 60/ 240.014, depositado em 13/10/00. Os seguintes processos e definições são providos para melhor definir a presente invenção e para guiar os versados na técnica na prática da presente invenção. Salvo de outro modo indicado, os termos devem ser compreendidos de acordo com o emprego convencional pelos versados na técnica relevante. Definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontrados em Rieger e outros Glossary of Genetics: Clas-sical and Molecular, 5a edição, Springer-Verlag, New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Usa-se a nomenclatura para bases de DNA como descrito em 37 CFR parágrafo 1.822.
Como usado aqui, o termo "milho" significa Zea mays ou tipo de milho e inclui todas as variedades de plantas que podem ser criadas com milho, incluindo espécie de tipo de milho selvagem.
Como usado aqui, o termo "compreendendo" significa "incluindo mas não limitado a". "Glifosato" refere-se a N- fosfonometilglicina e seus sais. Glifosato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Tratamen- tos com "herbicida glifosato" refere-se a tratamentos com o herbicida Roun-dup®, Roundup Ultra® ou qualquer outra formulação herbicida contendo glifosato.
Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células de plantas com DNA heterólogo, isto é, construção de ácido nucléico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção em uma localização do genoma particular. O termo "evento" refere-se aqui transformante original e progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" refere-se, também, à progênie produzida por um acasalamento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA heterólogo. Mêsmo após retrocruzamento repetido do parental recorrrente, o DNA inserido e o DNA de flanco do parental transformado está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" refe-re-se, também, ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e sequência genômica de flanco imediatamente adjacente ao DNA inserido que se pode esperar ser transferida a uma progênie que recebe DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultantes de autofertiIização) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido. Uma planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) tolerante a glifosato pode ser criada primeiro cruzando sexualmente uma primeira planta de milho parental consistindo em uma cultura de planta de milho da planta de milho PV-ZMGT32 (nk603) transgênica tendo número de acesso ATCC PTA-2478 e progênie da mesma derivada de transformação com os cassetes de expressão da presente invenção, que tolera aplicação do herbicida glifosato, e uma segunda planta de milho parental que é desprovida de tolerância ao herbicida glifosato, desse modo produzindo uma pluralidade de primeiras plantas de progênie; e então selecionando primeira planta de progênie que é tolerante à aplicação do herbicida glifosato; e autafertilização a primeira planta de progênie, desse modo produzindo uma pluralidade de segundas plantas de progênie; e então selecionando dentre as segundas plantas de progênie uma planta tolerante ao herbicida glifosato. Estas etapas ainda podem incluir o retrocruzamento da primeira planta de progênie tolerante a glifosato ou a segunda planta progênie tolerante a glifosato na segunda planta de milho parental ou uma terceira planta de milho parental, desse modo produzindo uma planta de milho que tolera a aplicação do herbicida glifosato.
Também deve ser compreendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser casadas para produzir descendência que contém dois genes exógenos adicionados segregando independentemente. Auto- fertilização da progênie apropriada pode produzir plantas que são homo-zigóticas para ambos os genes exógenos adicionados. Retrocruzamento em uma planta parental e acasalamento com uma planta não transgênica também são contemplados, uma vez que é propagação vegetativa. Descrições de outros processos de criação que são usados comumente para diferentes traços e culturas podem ser encontrados em uma das várias referências, por exemplo, Fehr, em Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox, J. ed., American Society of Agronomy, Madison, Wl (1987).
Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual é fixado um rótulo detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isóto-po radioativo, ligando, agente quimioluminescente, ou enzima. A sonda é complementar a um filamento de um ácido nucléico de marcação, no caso da presente invenção, em um DNA genômico do evento de milho PV-ZMGT32 (nk603) se de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui DNA do evento. Sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos deoxirribonucléico ou ribonucléico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que ligam-se especificamente a uma seqüência de DNA de marcação e podem ser usados para detectar a presença da seqüência de DNA de marcação. "Iniciadores" são ácidos nucleicos isolados que são recombina-dos em um filamento de DNA de marcação complementar por hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA de marcação, então estendidos junto com o filamento de DNA de marcação por uma polimerase, por exemplo, polimerase de DNA. Pares de inici-adores da presente invenção referem-se a seu uso para amplificação de uma sequência de ácido nucléico de marcação, por exemplo, pela reação de cadeia de polimerase (PCR) ou outros processos de amplificação de ácido nucléico convencionais.
Sondas e iniciadores são de comprimento de nucleotídeo suficiente para ligarem-se à seqüência de DNA de marcação especificamente nas condições de hibridização ou condições de reação determinadas pelo operador.
Este comprimento pode ser de qualquer comprimento que é utilizável no processo de detecção de escolha. Geralmente, 11 nucleotídeos ou mais de comprimento, preferivelmente 18 nucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 24 nucleotídeos ou mais, e mais preferivelmente 30 nucleotídeos ou mais são usados. Estas sondas e iniciadores hibridizam especificamente em uma seqüência de marcação em condições de hibridização de alta es-tringência. Preferivelmente, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de seqüência de DNA completa com a seqüência de marcação, apesar de sondas diferindo da seqüência de DNA de marcação e que retêm a capacidade de hibridizar em sequências de DNA de marcação poderem ser designadas por processos convencionais.
Processos para preparar e usar sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (a seguir, "Sambrook e outros, 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel e outros, Greene Publishing and Wiley- In-terscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (a seguir, "Ausubel e outros, 1992"); e Innis e outros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de iniciadores por PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de computador pretendidos para aquele fim como Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cam- bridge, MA).
Iniciadores e sondas baseados em DNA de flanco e sequências inseridas aqui descritos podem ser usados para confirmar (e, se necessário, para corrigir) as sequências descritas por processos convencionais, por exemplo, reclonando e seqüenciando estas sequências.
As sondas de ácido nucléico e iniciadores da presente invenção hibridizam em condições estringentes em uma sequência de DNA de marcação. Qualquer processo de amplificação ou de hibridização de ácido nu-cléico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das mesmas são capazes de hibridizar especificamente em outras moléculas de ácido nucléico em certas circunstâncias. Como usado aqui, refere-se que duas moléculas de ácido nucléico são capazes de hibridizar especificamente uma com a outra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico antiparalela de filamento duplo. Uma molécula de ácido nucléico é referida ser o "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se elas demonstram complementaridade completa. Como usado aqui, refere-se que moléculas demonstram "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são "minimamente complementares" se elas puderem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir às mesmas permanecerem recombinadas uma com a outra em condições convencionais de "baixa estringência". Similarmente, as moléculas são "complementares" se elas puderem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que as mesmas permaneçam recombinadas uma com a outra em condições de "alta estringên-cia" convencionais. Condições de estringência convencionais são descritas por Sambrook e outros, 1989, e por Haymes e outros, em: Nucleic Acid Hy-bridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Desvios de complementaridade completa são, consequentemente, permissíveis, contanto que os desvios não impeçam completamente a capacidade das moléculas formarem estrutura de filamento duplo. A fim de que uma molécu- Ia de ácido nucléico sirva como um iniciador ou sonda, ela necessita ser somente suficientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável em concentrações de sal e do solvente particular e empregadas.
Como usado aqui, uma seqüência substancialmente homóloga é uma molécula de ácido nucléico que hibridizará especificamente no complemento da molécula de ácido nucléico na qual ela está sendo comparada em condições de alta estringência. Condições de estringência apropriadas que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/-citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50°C, são conhecidas dos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocolos in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma alta estringência de cerca de 2,0 x SSC a 50°C a uma alta estringência de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência em temperatura ambiente, cerca de 22°C, a condições de baixa estringência a cerca de 65°C. Ambos temperatura e sal podem variar, ou tanto a temperatura como a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto em outra variável é mudada. Em uma modalidade preferida, um ácido nucléico da presente invenção hibridizará especificamente em uma ou mais das moléculas de ácido nucléico descritas em SEQ ID NOS: 9, 10, 11 e 12 ou complementos das mesmas ou fragmentos de quaisquer condições moderadamente estringentes, por exemplo, a cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65°C. Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléico da presente invenção hibridizará especificamente em uma ou mais das moléculas de ácido nucléico descritas na SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO: 12 ou complementos ou fragmentos de quaisquer condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção tem a seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO: 12 ou complementos das mesmas ou fragmentos de qualquer uma. Em outro aspecto da presente inven- ção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO: 12 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de seqüência com a seqüência descrita em SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO: 12 ou complemento das mesmas ou fragmentos de qualquer uma. SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO: 12 podem ser usadas como marcadores em processos de criação de planta para identificar a progênie de cruzamentos genéticos similares aos processos descritos para análise do marcador de DNA da seqüência repetida, em "DNA markers: Protocols, applications, and overviews: (1997) 173- 185, Cregan e outros, eds. Wiley- Liss NY; que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. A hibridização da sonda na molécula de DNA pode ser detectada por qualquer número de processos conhecidos dos versados na técnica, estes podem incluir, mas não estão limitados a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas baseadas em anticorpos e etiquetas quimioluminescentes.
Com respeito à amplificação de uma seqüência de ácido nucléico de marcação (por exemplo, por PCR) usando um par de iniciadores de amplificação particular, "condições estringentes" são condições que permitem ao par de iniciadores hibridizar somente na seqüência de ácido nucléico de marcação à qual um iniciador tendo a seqüência do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) pode ligar-se e, preferivelmente, produzir um produto de amplificação único, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA. O termo "específico para (uma seqüência de marcação)" indica que uma sonda ou iniciador hibridiza em condições de hibridização estringentes somente na seqüência de marcação em uma amostra compreendendo a seqüência de marcação.
Como usado aqui, "DNA amplificado" ou "amplicon" refere-se ao produto da amplificação de ácido nucléico de uma seqüência de ácido nu- cléico de marcação que é parte de um gabarito de ácido nucléico. Por exemplo, para determinar se a planta de milho resultante de um cruzamento sexual contém um DNA genômico de evento transgênico da planta de milho da presente invenção, DNA extraído de uma amostra de tecido de planta de milho pode ser submetido a processo de amplificação de ácido nucléico usando um par de iniciadores de DNA que inclui um primeiro iniciador derivado de seqüência de flanco no genoma de planta adjacente no sítio de inserção do DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA hete-rólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA evento. O amplicon é de um comprimento e tem uma sequência que também é diagnóstico para o evento. O amplicon pode estar na faixa de comprimento de comprimento combinado dos pares de iniciadores mais um par de bases de nucleotídeos, preferivelmente mais cerca de cinqüenta pares de bases de nucleotídeos, mais preferivelmente mais cerca de duzentos e cinqüenta pares de bases, e ainda mais preferivelmente mais cerca de quatrocentos e cinqüenta pares de bases de nucleotídeos. Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da seqüência de flanco em ambos os lados do DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui a seqüência de nucleotídeo inserida total (por exemplo, o fragmento de DNA Mlu1 da construção da expressão de pMON25496, figura 1, aproximadamente 6.706 pares de bases de nucleotídeos). Um membro de um par de iniciadores derivado da seqüência genômica da planta pode estar localizado em uma distância da seqüência de DNA inserida, esta distância pode estar na faixa de um par de bases de nucleotídeos até os limites da reação de amplificação, ou cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.
Amplificação de ácido nucléico pode ser realizada por qualquer um de vários processos de amplificação de ácido nucléico conhecidos na técnica, incluindo a reação de cadeia de polimerase (PCR). Uma variedade de processos de amplificação é conhecida na técnica e é descrita, inter alia, nas patentes US n-s 4.683.195 e 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis e outros, Academic Press, San Diego, 1990. Processos de amplificação PCR são desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA bacteriófago (Cheng e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 5695 - 5699,1994). Estes processos bem como outros processos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção. A seqüência do inserto de DNA heterólogo ou seqüência de DNA de flanco do evento de milho PV-ZMGT32 (nk603) pode ser verificada (e corrigida, se necessário) amplificando as sequências de DNA extraídas de plantas ou sementes do depósito ATCC número de acesso PTA- 2478 usando iniciadores de DNA derivados das sequências providas aqui seguido por seqüenciamento de DNA padrão do am-plicon PCR ou do DNA clonado. O amplicon produzido por estes processos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. Um destes processos é Genetic Bit Analy-sis (Nikiforov e outros, Nucleic Acid Res. 22: 4167- 4175, 1994), onde um oligonucleotídeo de DNA é designado, que sobrepõem tanto a seqüência de DNA genômica de flanco adjacente como a seqüência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em reservatórios de uma placa de microreser-vatórios. Realizando PCR da região de interesse (usando um iniciador na seqüência inserida e um na seqüência genômica de flanco adjacente), um produto PCR de filamento único pode ser hibridizado no oligonucleotídeo imobilizado e servir como um gabarito para uma reação de extensão de base usando uma polimerase de DNA e ddNTPs rotulados específicos para a próxima base esperada. Leitura pode ser fluorescente ou baseada em ELISA. Um sinal indica a presença da seqüência de flanco/inserto devido à amplificação, hibridização e extensão de base única bemsucedidas.
Outro processo é a técnica de Pyrosequencing como descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). Neste processo, um oligonucleotídeo é designado, que sobrepõem o DNA genômico adjacente e junção inserida de DNA. O oligonucleotídeo é hibridizado no produto PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador na seqüência inserida e um na seqüência genômica de flanco) e incubado na presença de uma polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’fosfos-sulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal claro que medido, Um sinal claro indica a presença da seqüência transgênica de flanco/inserto devido à amplificação, hibridiza-ção e extensão em base múltipla ou única bemsucedidas.
Polarização fluorescente como descrito por Chen e outros, (Ge-nomic Res., 9:492- 498,1999) é um processo que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando este processo, um oligonu-cleotídeo é designado, que sobrepõem a junção inserida de DNA e de flanco genômica. O oligonucleotídeo é hibridizado em produto PCR de filamento único da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na seqüência de DNA genômica de flanco) e incubado na presença de uma polimerase de DNA e um ddNTP rotulado com fluorescência. Extensão de base única resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma troca na polimerização usando um fluorômetro. Uma troca na polarização indica a presença de seqüência de transgenes de flanco/inserto devido à amplificação, hibridização e extensão de base única bem- sucedidas.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um processo para detectar e quantificar a presença de uma seqüência de DNA e é totalmente compreendido nas instruções providas pelo fabricante. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada que sobrepõem a junção inserida de DNA e de flanco genômica. A sonda FRET e iniciadores PCR (um iniciador na seqüência de DNA inserida e um na seqüência genômica de flanco) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridização da sonda FRET resulta em divagem e liberação da porção fluorescente fora da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência de inserto de transgene/ de flanco devido à amplificação e hibridização bemsucedidas.
Sinais de aviso moleculares foram descritos para uso na detecção da seqüência como descrito em Tyangi e outros (Nature Biotech. 14: 303- 308, (1996). Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é designada, que sobrepõem a junção inserida de DNA e genômica de flanco. A estrutura única da sonda FRET resulta em que ela contém estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em íntima proximidade. A sonda FRET e iniciadores PCR (um iniciador na seqüência de DNA inserida e um na seqüência genômica de flanco) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Seguindo amplificação, hi-bridização bemsucedida da sonda FRET na seqüência de marcação resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções fluorescentes e de extinção. Resulta em um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência transgênica de flanco/in-serto devido à amplificação e hibridização bem- sucedidas.
Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar exemplos de certas modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos versados na área que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam abordagens que os inventores verificaram funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas constituir exemplos de modos preferidos para sua prática. No entanto, os versados na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas trocas podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um resultado igual ou similar sem sair do espírito e escopo da invenção. EXEMPLOS EXEMPLO 1 O evento de milho transgênico PV-ZMGT32 (nk603) (aqui referido como nk603) foi gerado por bombardeio de microprojétil de embriões de milho tipo maize (Songstad e outros, In Vitro Cell Plant 32: 179- 183, 1996) usando um fragmento de DNA Mlu I linear derivado de pMON25496 (figura 1). Este fragmento de DNA contém dois cassetes de expressão de transge-ne que conferem coletivamente tolerância de planta de milho a glifosato. O primeiro cassete é composto do promotor actina 1 de arroz e íntron (P-Os. Actl e l-Os. Act1. patente US n5 5.641.876), conectados de modo operativo a um peptídeo de trânsito de cloroplasto EPSPS de Arabdopisis (TS- At. EPSPS: CTP2, Klee e outros, Mol. Gen. Genet. 210: 47- 442,1987), conectado de modo operativo a uma 5- enol - piruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente US n2 5.633.435) e conectado de modo operativo a um terminador transcripcio-nal de nopalina sintase (T-AGRTU.nos, Fraley e outros, Proc. natl. Acad. Sei. USA 80:4803- 4807,1983). O segundo cassete de expressão de trans-gene consiste do promotor 35S do vírus mosáico de couve- flor contendo uma duplicação em tandem da região melhoradora (P-CaMV.35S, Kay e outros, Science 236: 1299- 1302, 1987; patente US n2 5.164.316), conectado de modo operativo a um íntron Hsp70 de Zea Mays (l-Zm.Hsp70, patente US n2 5.362.865), conectado de modo operativo a um peptídeo de trânsito de cloroplasto EPSPS de Arabidopis (TS.At. EPSPS:CTP2, Kee e outros, Mol. Gen. Genet/ 210: 47- 442, 1987), conectado de modo operativo a uma 5- enol- piruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA: CP4, patente US no 5.633.435) e conectado de modo operativo a um terminador transcripcional de nopalina sintase (T-AGRTU.nos, Fraley e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4803- 4807, 1983). Calos transgênicos tolerantes a glifosato pós- bombardeio foram selecionados em meio contendo glifosato 3 mM e as plantas foram subseqüen-temente regeneradas. Trezentas e quatro plantas de 91 eventos transgênicos foram produzidas, nk603 foi selecionado desta população baseado em uma combinação superior de características, incluindo tolerância a glifosato, desempenho agronômico e inserção transgênica única. Avaliações em estufa e no campo do evento nk603 e sua progênie derivada indicam que esta inserção transgênica confere tolerância que excede especificações comerciais para tolerância reprodutiva e vegetativa total a 340 g de glifosato/acre (840 g de glifosato/hectare; 9,0 kg Roundup Ultra/acre) quando aplicado nos estágios de folhas V4 e V8. EXEMPLO 2 O evento de milho nk603 tolerante a glifosato foi comparado ao padrão comercial atual, GA21 (patente US n° 6.040.497), para tolerância a glifosato de dano vegetativo e efeito sobre rendimento. Plantas de nk603 e GA21 foram plantadas em fileiras em lotes no campo em replicada. Os tratamentos foram 1) não pulverizado, 2) pulverizado em uma taxa de 1,8 Kg (64 onças/acre) de Roundup Ultra® no estágio de folha V4 e novamente com 1,8 Kg (64 onças/acre) de Roundup Ultra® no estágio de folha V8, 3) pulverizado em uma taxa de 2,7 Kg (96 onças/acre) de Roundup Ultra® no estágio de folha V4 e novamente com 2,7 (96 onças/acre) de Roundup Ultra® no estágio de folha V8. Tolerância vegetativa foi medida como porcentagem de dano vegetativo determinado pela quantidade de mal - formação de folhas observado 10 dias após o tratamento com herbicida no estágio de folha V8. O rendimento de cada lote foi medido em alqueires/acre e a redução percentual no rendimento determinada para cada tratamento com herbicida com relação ao tratamento não pulverizado. Os resultados mostrados na tabela 1 ilustram que nk603 mostra um nível de dano vegetativo percentual mais baixo do que as plantas GA21 e a redução no rendimento percentual observada também é menos para o evento nk603. Uma incidência baixa de dano vegetativo foi observada nos lotes não pulverizados, esta observação é atribuível a vários fatores ambientais diferentes da exposição ao herbicida glifo-sato. O cassete de expressão duplo de pMON25496 em nk603 foi comparado a dano vegetativo e taxa de fertilidade de 3 eventos de milho independentes obtidos somente do promotor CaMV.35S conduzindo a expressão do gene de tolerância a glifosato (AGRTU.aroA.CP4). Observou-se que o cassete de expressão duplo conferiu um nível mais alto de tolerância vegetativa e tolerância reprodutiva do que três eventos de milho independentes (ev 1, ev 2 e ev 3) contendo somente o cassete de expressão onde a expressão do gene tolerante a glifosato foi conduzida pelo promotor CaMV.35S. Um nível mais alto de tolerância vegetativa a dano com herbicida glifosato foi observado para nk603 mais 3 eventos de milho adicionais de pMON25496 quando comparado ao dano médio de 6 eventos de milho de uma construção onde a expressão do gene de tolerância a glifosato foi conduzida somente pelo promotor actina de arroz e íntron (P.Os. Act1/l-Os/Actl). As plantas transformadas com o cassete de expressão duplo possuíam um nível mais alto de tolerância a glifosato em dano vegetativo e fertilidade do que plantas derivadas da transformação com os cassetes de expressão únicos isto resultou na resistência melhorada a perda de rendimento devido à apli- cação do herbicida glifosato.
Tabela 1. Tolerância de nk6Q3 a qlifosato - Classificação de dano veaetati-vo, rendimento e fertilidade Evento Tratamento % dano Rendim. % red. ren- veqetativo ala ./acre dimento GA21 Não pulverizado 0,3 142,2 1.8 kg (64 onças) Roundup 5,3 134,1 5,7 Ultra® em V4 seguido por 1.8 kg (64 onças) emV8 2.7 (96 onças) kg Roundup 8,3 129,1 9,2 Ultra em V4 seguido por 2.7 kg (96 onças) em V8 Nk603 Não pulverizado 0,9 145,6 1.8 kg (64 onças) Roundup 2,9 138,5 4,9 Ultra® em V4 seguido por 1.8 kg (64 onças) em V8 2.7 kg (96 onças) Roundup 4,7 140,1 3,8 Ultra® em V4 seguido por 2.7 kg (96 onças) em V8 Tratamento Classificação de fertilidade ** Nk603 1,8 kg Roundup Ultra® em V8 4,5 CaMV.35S ev 1 1,8 kg Roundup Ultra® em V8 2,0 CaMV.35S ev 2 1,8 kg Roundup Ultra® em V8 2,2 CaMV.35S ev 3 1,8 kg Roundup Ultra® em V8 2,4 Tratamento % média de dano veaetativo* nk603 mais 3 eventos 3,6 kg (128 onças) Roundup 22,9 pMON25496 dicionais Ultra® em V4 seguido por 3,6 kg (128 onças) em V8 Seis eventos de cas- 3,6 kg (128 onças) Roundup 28,9 sete único P-Os-Actl Ultra® em V4 seguido por 3,6 kg (128 onças) em V8 * Dano vegetativo é observado 10 dias após tratamento de V8 é uma medida tomada para avaliar dano vegetativo em resposta a tratamento com glifo- sato. ** Classificação de fertilidade em fêmeas: 4-5 = totalmente fértil; 3 = emissão de pólen significativamente reduzida; 0-2 = completamente estéril -altamente estéril, não apropriado para uso comercial. EXEMPLO 3 A molécula de DNA de flanco correspondente de nk603 foi clo-nada usando adaptadores ligados e abrigados em PCR como descrito no kit Genome Walker® (catálogo # K1807-1, Clone Tech Laboratories, Inc, Paio Alto, CA). Primeiramente, DNA genômico do evento nk603 foi purificado pelo processo de purificação CTAB (Rogers e outros, Plant Mol. Biol. 5: 69-76, 1985). As bibliotecas de DNA genômicas para amplificação foram preparadas de acordo com instruções do fabricante (Genome Walker®, Clone Tech Laboratories, Inc, Paio Alto, CA). Em reações separadas, DNA genômico foi digerido durante a noite a 37°C com as seguintes endonucleases de restrição de extremidade cega: EcoRV, Seal, Dral, PvuW e Stu\ (Clone Tech Laboratories, Inc, Paio Alto, CA). As misturas de reação foram extraídas com fenol: clorofórmio, o DNA foi precipitado pela adição de etanol à fase aquo-sa, peletizado por centrifugação, depois recolocado em suspensão em tampão Tris- EDTA (Tris- HC110 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Os fragmentos de DNA genômicos de extremidade cega foram ligados aos adaptadores de Genome Walker® de acordo com protocolo de instruções do fabricante. Após ligação, cada reação foi tratada a quente (70°C durante 5 min) para concluir a reação e então diluída 10 vezes em tampão Tris- EDTA. Um μΙ de cada ligação positiva foi então amplificado em uma reação de 50 μΙ que incluía 1 μΙ da respectiva biblioteca ligada ao adaptador, 1 μΙ de 10 μΜ do iniciador adaptador AP1 de Genome Walker® (5’ GTATATCGACTCACTATAGGGC 3’, SEQ ID NO: 1), 1 μΙ de oligonucleotídeo específico de transgene de nk603 10 μΜ (5’ TGACGTATCAAAGTACCGACAAAAACATCC 3’ (SEQ ID NO: 2), 1 μΙ de deoxirribonucleotídeos 10 mM, 2,5 μΙ de sulfóxido de dimeti-la, 5 μΙ de 10X tampão PCR contendo MgCI2, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de poli-merase de DNA termoestável Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) e H20 a 50 μΙ. As reações foram realizadas em um termociclador usando controle de temperatura calculado e as seguintes condições de ciclagem: 1 ciclo a 95°C durante 9 min; 7 ciclos de 94°C durante 2 s, 70°C durante 3 min; 36 ciclos de 94°C durante 2 s, 65°C durante 3 min; 1 ciclo de 65°C durante 4 min. Um μΙ de cada reação primária foi diluído 50 vezes com água e amplificada em uma reação secundária (1 μΙ da respectiva reação primária diluída, 1 μΙ de iniciador adaptador AP2 abrigado em Genome Walker® 10 μΜ (5’ ACTATAGGGCACGCGTGGT 3’, SEQ ID NO: 3, suprido pelo fabricante), 1 μΙ de oligonucleotídeo abrigado específico de transgene de nk603 10 μΜ (5’ CTTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC 3’, SEQ ID NO: 4), 1 μ! de deoxirribonucleotídeos 10 mM, 2,5 μΙ de sulfóxido de dimetila, 5 μΙ de 10X tampão PCR contendo MgCI2, 0,5 μΙ (2,5 unidades) de polimerase de DNA termoestável Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), e H20 a 50 μΙ] usando as seguintes condições de ciclização: 1 ciclo de 95°C durante 9 min; 5 ciclos de 94°C durante 2 s, 70°C durante 3 min; 24 ciclos de 94°C durante 2 s; 65°C durante 3 min; 1 ciclo de 65°C durante 4 min.
Produtos PCR, representando regiões 5’ que transpõem a junção entre a inserção transgênica de nk603 e o DNA de milho de flanco limítrofe, foram purificados por eletroforese de gel agarose por purificação da matriz de agarose usando o kit de extração de gel QIAquick (catálogo # 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) e clonagem direta no vetor pGEM-T Easy (catálogo # A1360, Promega, Madison, Wl). A relação e identidade dos produtos PCR clonados no fragmento Mlu I de pMON25496 foram confirmadas por análise de seqüência de DNA (ABI Prism® 377, PE Biosystems, Foster City, CA e software de análise de seqüência DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, Wl).
Similarmente, a seqüência 3’ de DNA de milho nk603 de flanco foi amplificada e clonada usando iniciadores específicos de gene abrigados, SEQ ID NO: 5 (5’ AGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC 3’) e SEQ ID NO: 6 (5’ GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG 3’), que recombinam no terminador transcripcional T-GRTU.nos. Dois terminadores transcripcionais T-AGRTU.nos estão presentes na inserção transgênica/ genômica de nk603, um interno na construção e um na extremidade 3’ da construção adjacente a DNA genômico de milho. Os produtos PCR produzidos nesta rea- ção foram seqüenciados e a seqüência de DNA que sobrepõem a junção entre seqüência de flanco e transgênica foi distinguida de produtos de T-AGRTU.nos interno por comparação às sequências de elementos genéticos conhecidos da construção pMON25496 como anteriormente descrito.
Seqüência de DNA de milho flanqueando ambos os lados da inserção transgênica foi determinada para nk603 seqüenciando os produtos de amplificação derivados de Genome Walker® e alinhamento na seqüência transgênica conhecida. Na extremidade 5’ da inserção transgênica, a seqüência de um segmento de 498 pb próximo à junção de inserção foi determinada (SEQ ID NO: 7). Esta consistiu de 304 pares de bases (pb) da seqüência de DNA genômico de milho de flanco (nucleotídeos 1-304 da SEQ ID NO: 7), 45 pb da seqüência de DNA da construção pMON25496 (nucleotídeos 305-349 da SEQ ID NO: 7) e 149 pb da seqüência de DNA da extremidade 5’ de P-Os.Act1 (nucleotídeos 350-498 da SEQ ID NO: 7). A seqüência de DNA foi determinada para um segmento de 1183 pb próximo à junção da inserção 3’ (SEQ ID NO: 8), que começa com 164 pb do terminador transcripcional U-AGRTU.nos (nucleotídeos 1-164 da SEQ ID NO: 8), 217 pb da seqüência de DNA da construção pMON25496 (nucleotídeos 165-381 da SEQ ID NO: 8), 305 pb de genes de plastídeos de milho, rps 11 e rpoA (segmentos parciais de cada gene correspondendo a 63-363 bases do GenBank número de acesso X07810, correspondendo a 382-686 bases da SEQ ID NO: 8), e a seqüência de DNA restante consistindo de seqüência de DNA genômica de milho flanqueando o sítio de integração (correspondendo a 687- 1183 bases da SEQ ID NO: 8).
As moléculas de DNA de junção, SEQ ID NOS: 9, 10, 11 e 12 são moléculas de DNA novas em nk603 e são diagnóstico para planta de milho nk603 e sua progênie. As moléculas de junção em SEQ ID NOS: 9,10 e 11 representam cerca de 9 nucleotídeos em cada lado de um sítio de inserção de um fragmento de DNA transgênico e DNA genômico de milho. SEQ ID NO: 9 é encontrada nas posições de nucleotídeos 295- 314 da SEQ ID NO: 7. As sequências de junção SEQ ID NOS: 10 e 11 estão localizadas nas posições de nucleotídeos 678- 695, respectivamente, da SEQ ID NO: 8, representando uma molécula de DNA de junção da seqüência de DNA da construção com seqüência de DNA de plastídeos de milho (SEQ ID NO: 10) e seqüência de construção com seqüência de DNA genômica de milho (SEQ ID NO: 11). SEQ ID NO: 12 está localizada na posição de nucleotídeos 156-173 da SEQ ID NO: 8 e representa uma molécula de DNA nova em nk603 devido ser ela uma fusão da seqüência terminadora T-AGRTU.nos com um fragmento invertido da seqüência de DNA do promotor actina de arroz. EXEMPLO 4 Pares de iniciadores de evento de DNA são usados para produzir um diagnóstico amplicon para nk603. Estes pares de iniciadores de evento incluem mas não estão limitados às SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 para a molécula de DNA de amplicon 5’ e SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 para a molécula de DNA de amplicon 3'. Além destes pares de iniciadores, qualquer par de iniciadores derivado de SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 que, quando usado em uma reação de amplificação de DNA, produz um diagnóstico amplicon de DNA para nk603 é um aspecto da presente invenção. As condições de amplificação para esta análise são ilustradas na tabela 2 e tabela 3 para a região de junção genômica/ transgênica inserida 5’. O mesmo processo é aplicado para amplificação da molécula de DNA de amplicon 3’ usando moléculas de DNA de iniciadores SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16, no entanto, qualquer modificação destes processos que usam moléculas de DNA ou complementos das mesmas para produzir um diagnóstico amplicon de molécula de DNA para nk603 está dentro do entendimento dos versados na técnica. Além disso, um par de iniciadores de controle (SEQ ID NOS: 17 e 18) para amplificação de um gene de milho endógeno está incluído como um padrão interno para as condições de reação. A análise da amostra de extrato de DNA de tecido de planta nk603 deve incluir um controle de extrato de DNA de tecido positivo de nk603, um controle de extrato de DNA negativo de uma planta de milho que não é nk603, e um controle negativo que contém nenhum extrato de DNA de milho gabarito. Moléculas de iniciadores de DNA adicionais de comprimento suficiente podem ser selecionadas da SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 pelos versados na técnica dos processos de amplificação de DNA, e condições otimizadas para a produção de um ampli-con que pode diferir dos processos mostrados na tabela 2 e tabela 3, mas resultam em um diagnóstico amplicon para nk603. O uso destas sequências de iniciadores de DNA com modificações nos processos da tabela 2 e tabela 3 está dentro do escopo da invenção. O amplicon em que pelo menos uma molécula de iniciadores de DNA de comprimento suficiente derivado das SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 que é diagnóstico para nk603 é um aspecto da invenção. O amplicon, em que pelo menos um iniciador de DNA de comprimento suficiente derivado de qualquer um dos elementos genéticos de pMON 15496 que é diagnóstico para nk603, é um aspecto da invenção. O ensaio para o amplicon de nk603 pode ser realizado usando um termocicla-dor Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin- Elmer 9700 ou Mastercylcer Gradient Eppendorf como mostrado na tabela 3, ou por processos e aparelhos conhecidos dos versados na técnica.
Tabela 2. Procedimento PCR e mistura de ração para a confirmação da região de junção genômica/ transqênica inserida.
Tabela 2 (continuação) Tabela 3. Parâmetros de PCR sugeridos para diferentes termocicladores Misturar suavemente e, se necessário (nenhum topo de calor no termociclador), adicionar 1-2 gotas de óleo mineral no topo de cada reação. Prosseguir com o PCR em um termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin- Elmer 9700 ou Mastercylcer Gradient Eppendorf usando os seguintes parâmetros.
Nota: O termociclador de motor MJ ou Mastercycler Gradiente Eppendorf deve ser testado no modo calculado. Testar o termociclador Perkin- Elmer 9700 com a velocidade de subida fixada no máximo.
Um depósito da Monsanto Company, semente de milho do evento PV-ZMGT32 (nk603) acima descrito foi feito sob o Tratado de Budapeste com o American Type Culture Collection (ATCC), 1081 University Bou-levard, Manassas, Va. 20110. O número de acesso ATCC é PTA-2478. O depósito será mantido no depositário durante um período de 30 anos, ou 5 anos após a última solicitação, ou durante ao prazo de vigência efetivo da patente, o que for mais longo, e será substituído conforme necessário durante esse período.
Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente aos versados na técnica que a invenção pode ser modificada no escopo e detalhes sem sair destes princípios. As requerentes reivindicam todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações anexas.
Todas as publicações e documentos de patente publicados citados neste relatório são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
Claims (16)
1. Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequencía de nucleotideos identificada como SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8,
2. Par de moléculas de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA que compreende nucleotideos contíguos selecionados de nucleotideos 1 a 304 de SEQ ID NO:7 ou seu complemento completo e uma segunda molécula de DNA que compreende nucleotideos contíguos selecionados de nucleotideos 305 a 498 de SEQ ID NO:7 ou seu complemento completo, em que as moléculas funcionam como diagnóstico de sondas ou iniciadores de DNA para a presença de SEQ ID NO:9.
3. Par de moléculas de DNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a primeira molécula de DNA reside na molécula de DNA de inserto de transgene da SEQ ID NO: 7, e a segunda molécula de DNA reside na molécula de DNA genômica de milho da SEQ ID NO: 7, e o par de moléculas de DNA é utilizável como diagnóstico de sondas ou iniciadores de DNA para a presença de SEQ ID NO: 9.
4. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende; uma sequencía de nucleotideos de pelo menos 11 nucleotideos contíguos da SEQ ID NO: 7 ou seu complemento utilizável como um diagnóstico de sonda ou iniciador de DNA para a presença de SEQ ID NO:9,
5. Par de moléculas de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA que compreende nucleotideos contíguos selecionados de nucleotideos 1 a 686 de SEQ ID NO S ou seu complemento completo e uma segunda molécula de DNA que compreende nucleotideos contíguos selecionados de nucleotideos 687 a 1183 de SEQ ID NO:8 ou seu complemento completo, em que as moléculas de DNA funcionam como diagnóstico de sondas e iniciadores de DNA para a presença de SEQ ID NO:11.
6. Par de moléculas de DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a primeira molécula de DNA reside na molécula de DNA de ínserto de transgene da SEQ ID NO; 8, e a segunda molécula de DNA reside na molécula de DNA genômica de milho da SEQ ID NO; 8, e o par de moléculas de DNA é utilizável como diagnóstico de sondas ou iniciadores de DNA para a presença de SEQ ID NO:11.
7. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende; uma sequencia de nucleotídeos de pelo menos 11 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO; 8 ou seu complemento utilizável como um diagnóstico de sonda ou iniciador de DNA para a presença de SEQ ID NO:11.
8. Processo para detectar a presença de uma molécula de DNA identificada como SEQ ID NO; 7 em uma amostra de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair uma amostra de DNA de uma planta de milho; (b) contratar a amostra de DNA com um conjunto de iniciadores de DNA compreendendo o par de molécula de DNA, como definido na reivindicação 3; (c) prover condições de reação de amplificação de ácido nu- cléico; (d) realizar a referida reação de amplificação de ácido nu-cléico, desse modo produzindo uma molécula de amplicon de DNA; e (e) detectar a molécula de amplicon de DNA.
9. Processo para detectar a presença de uma molécula de DNA identificada como SEQ ID NO; 8 em uma amostra de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende; (a) extrair uma amostra de DNA de uma planta de milho; (b) contatar a amostra de DNA com um conjunto de iniciadores de DNA compreendendo o par de moléculas de DNA, como definido na reivindicação 6; (c) prover condições de reação de amplificação de ácido nu- cléico; (d) realizar referida reação de amplificação de ácido nucléi- co, desse modo produzindo uma molécula de amplcon de DNA; e (e) detectar a molécula de amplicon de DNA,
10, Processo para detectar a presença de uma molécula de DNA identificada como SEG ID NO: 7 em uma amostra de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair uma amostra de DNA de uma planta de milho; (b) contatar a amostra de DNA com uma molécula de DNA identificada como SEQ ID NO: 9, em que referida molécula de DNA é uma sonda de DNA que hibrídiza em condições de hibridização estringente com a molécula de DNA identificada como SEQ ID NO: 7, e não hibrídiza nas condições de hibridização estríngentes com uma amostra de DNA não contendo a molécula de DNA identificada como SEQ ID NO: 7; e (c) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização estríngentes; e detectar hibridização da sonda no DNA,
11. Processo para detectar a presença de uma molécula de DNA identificada como SEQ ID NO; 8 em uma amostra de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair uma amostra de DNA de uma planta de milho; (b) contatar a amostra de DNA com uma molécula de DNA selecionada dentre o grupo consistindo das SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEG ID NO: 12, em que referida molécula de DNA é uma sonda de DNA que hibrídiza em condições de hibridização estríngentes com a molécula de DNA identificada como SEQ ID NO: 8, e não hibrídiza nas condições de hibridização estríngentes com uma amostra de DNA não contendo a molécula de DNA identificada como SEG ID NO: 8; e (c) submeter a amostra e sonda a condições de hibridização estríngentes; e detectar hibridização da sonda no DNA.
12, Molécula de DNA, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequencia de nucleotídeos identificada como SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, ou SEG ID NO: 12,
13. Processo para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair uma amostra de DNA de plantas de milho de pro- gêníe; (b) contatar a amostra de DNA com uma molécula de ácido nucléico marcadora selecionada dentre o grupo consistindo das SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 e complementos das mesmas; e (c) realizar um processo de criação assistido pelo marcador para o traço tolerante a glifosato, em que o traço tolerante a glifosato é ligado geneticamente a um complemento de uma molécula de ácido nucléico marcadora.
14. Kit de detecção de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos uma molécula de DNA de comprimento suficiente dos nucleotídeos contíguos homólogos ou complementares à SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 que funciona como uma sonda ou iniciador de DNA especifico para a presença de SEQ ID NO:9 ou 11, respectiva mente.
15. Kit de detecção de DNA de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o kit contêm um processo de detecção de hi-bridização de DNA selecionado dentre o grupo consistindo de etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas baseadas em anticorpos e etiquetas quimioluminescentes.
16. Kit de detecção de DNA de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o kit contém um processo de detecção de amplificação de DNA selecionado dentre o grupo consistindo de coloração, análise genética de bits, pirossequenciamento, polarização de fluorescência, Taqman e sinais de aviso moleculares,
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