BRPI0617006A2 - gene quimérico, vetor designado para transformação de plastìdeos vegetais, célula vegetal transplastÈmica, planta transplastÈmica, partes colhìveis de planta, método de produção de proteìna de interesse em célula vegetal e métodos de produção de peptìdeo - Google Patents
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Abstract
GENE QUIMéRICO, VETOR DESIGNADO PARA TRANSFORMAçãO DE PLASTìDEOS VEGETAIS, CéLULA VEGETAL TRANSPLASTÈMICA, PLANTA TRANSPLASTÈMICA, PARTES COLHìVEIS DE PLANTA, MéTODO DE PRODUçãO DE PROTEìNA DE INTERESSE EM CéLULA VEGETAL E MéTODOS DE PRODUçãO DE PEPTìDEO. A presente invenção refere-se a construções e métodos de expressão de proteínas recombinantes no lúmen tilacóide de células vegetais transplastómicas. Além disso, a presente invenção refere-se a células vegetais transpiastómicas e plantas que expressam gene de interesse no lúmen tilacóide.
Description
"GENE QUIMÉRICO, VETOR DESIGNADO PARA TRANSFORMAÇÃO DEPLASTÍDEOS VEGETAIS, CÉLULA VEGETAL TRANSPLASTÔMICA,PLANTA TRANSPLASTÔMICA, PARTES COLHÍVEIS DE PLANTA,MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA DE INTERESSE EM CÉLULAVEGETAL E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PEPTÍDEO"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a construções e métodos deexpressão de proteínas recombinantes no lúmen tilacóide de células vegetaistransplastômicas.
Antecedentes da Invenção
Plastídeos vegetais (cloroplastas, amiloplastas, etioplastas,cromoplastas etc.) são derivados de precursor comum conhecido como proplastídeoe são responsáveis pela produção de compostos importantes tais como aminoácidos,carboidratos complexos, ácidos graxos e pigmentos. Geralmente, células vegetaiscontêm 500 a 10.000 cópias de genoma de plastídeo circular de 120 a 160quilobases pequeno que contém segmentos de DNA duplicados e de cópia única.Desta forma, é possível elaborar células vegetais que contêm até vinte mil cópias degene específico de interesse, o que potencialmente pode resultar em níveis muitoaltos de expressão de genes exógenos e um acúmulo de proteínas recombinantesque variam até 40% do total de proteínas celulares solúveis (De Cosa etal, 2001, NatBiotechnol. 19, 71-74). Além disso, nenhum silenciamento genético foi relatado emlinhagens transgênicas de cloroplastas, apesar do acúmulo de transcritos em umnível 169 vezes mais alto que plantas transgênicas nucleares (Lee et al, 2003, Mo/.Breeding, 11,1-13). Além disso, plastídeos da maior parte das plantas são herdadosmatemalmente. Conseqüentemente, ao contrário dos genes heterólogos expressosno núcleo, genes heterólogos expressos em plastídeos não são disseminados pelopólen. Esta particularidade limita muito, portanto, o risco de dispersão do transgeneno ambiente e a sua propagação para plantas vizinhas.Cloroplastas são organelos complexos em termos estruturais, quecompreendem três fases solúveis distintas. O cloroplasta é envolto por umenvelope de membrana dupla, que inclui um espaço intermembrana. A fasesolúvel principal é o estroma, que é o local de fixação de carbono, síntese deaminoácidos e muitos outros processos. A membrana dominante é a redetilacóide de interconexão extensa, onde a luz é capturada e sintetizada porATP. A membrana tilacóide inclui a terceira fase solúvel, o lúmen tilacóide, queabriga uma série de proteínas fotossintéticas extrínsecas, bem como muitasoutras (C. Robinson etal, 2001, Traffic 2: 245-251).
Apenas algumas proteínas de cloroplastas são codificadas esintetizadas no interior do organelo. A maior parte é codificada no núcleo,sintetizada na forma de precursores no citosol e importada após a traduçãopara um dos subcompartimentos do cloroplasta. Isso requer sinais deordenamento celular específicos, que podem ser particularmente sofisticados, devido à presença dos diferentes sistemas de membranas que necessitam sercruzados.
Dois processos de secreção diferentes para o direcionamento deproteínas para o lúmen tilacóide de cloroplasta foram caracterizados. Oprimeiro é processo dependente de Sec relativo ao mecanismo de exportaçãode SecYEG em bactérias. O segundo é mecanismo dependente de pH,caracterizado por duas argininas sucessivas conservadas no peptídeo detrânsito, o processo de Tat (translocase de arginina dupla). Proteínas dirigidasao lúmen por meio do processo de Sec são geralmente translocadas emestado desdobrado, enquanto proteínas importadas por meio do processo deTat podem ser translocadas em estado dobrado. Proteínas importadas nolúmen por meio de qualquer processo são processadas por protease deprocessamento de tilacóide que remove a parte próxima de carboxila dopeptídeo de trânsito (C. Robinson et aí, Traffic 2001, 2: 245-251).O lúmen tilacóide de cloroplastas é um compartimento celularvegetal que poderá ser ideal para o acúmulo de certas proteínasrecombinantes devido à sua crescente estabilidade oxidativa e ao seu teorespecífico em proteases (Z. Adams et al, TRENDS in Plant Science, vol. 7, n°10, 2002). Apesar disso, foi raramente considerado para direcionamento eacúmulo de proteínas recombinantes.
Na Patente Norte-Americana n- US 6.512.162, a seqüência decodificação de aprotinina é fundida com o gene petA a fim de dirigir a proteínapetA::aprotinina fundida à membrana tilacóide de células vegetais. PetA é genedo genoma de cloroplasta que codifica a proteína citocromo f (petA), que foirelatada como polipeptídeo com disposição transmembrana na membranatilacóide de cloroplasta, com a região N-terminal no espaço intratilacóide eseqüência C-terminal de quinze aminoácidos no estroma (S. J. Rothstein et al,Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., vol. 82, págs. 7955-7959, 1985). Portanto, aproteína petA::aprotinina fundida em que a seqüência de codificação deaprotinina é ligada ao terminal 3' da seqüência de codificação de citocromo f(petA) deverá abordar a aprotinina no estroma.
Existe ainda, portanto, necessidade de métodos e meios queabordem de forma clara e não ambígua, um peptídeo de interesse no lúmentilacóide de cloroplasta.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção fornece, pela primeira vez, seqüências deácido nucléico úteis no direcionamento de proteína recombinante codificada portransgene integrado ao genoma de cloroplasta para o lúmen tilacóide decloroplasta, utilizando seqüência de sinal direcionadora de lúmen de proteínascodificadas nucleares.
Esta estratégia utiliza-se da expressão em alto nível paratransgenes integrados ao genoma de cloroplasta, a fim de acumular altaquantidade de proteína recombinante em compartimento celular que possuicaracterísticas específicas, especialmente em termos de propriedades redox,teor de proteases e atividades de dobra.
Além disso, é possível, com esta estratégia, produzir proteínasrecombinantes que contêm N-terminais que não de metionina em cloroplastasvegetais.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1: mapa do plasmídeo pAPR20.
Descrição Detalhada da Invenção
O objeto da presente invenção é gene quimérico quecompreende, ligados entre si de forma funcional na direção de transcrição:
a. promotor funcional em plastídeo vegetal;
b. seqüência de ácidos nucléicos que codificam peptídeo desinal direcionador de lúmen N-terminal de metionina de proteína codificadanuclear fundida em tradução com:
c. seqüência de ácidos nucléicos heterólogos que codificampeptídeo; e
d. opcionalmente, um terminador que é ativo nos plastídeosde células vegetais.
Proteínas codificadas nucleares dirigidas ao compartimento delúmen tilacóide de cloroplastas possuem peptídeo de trânsito bipartidocaracterístico, composto de peptídeo de sinal direcionador estromal e peptídeode sinal direcionador de lúmen. As informações de direcionamento estromaisencontram-se na parte amino-proximal do peptídeo de trânsito. O peptídeo desinal direcionador de lúmen encontra-se na parte carboxila-proximal dopeptídeo de trânsito e contêm todas as informações para direcionamento aolúmen. Os peptídeos de sinal direcionadores de lúmen exibem fortessimilaridades a peptídeos de sinal de bactérias e podem ser divididos emdomínio N-terminal carregado, núcleo hidrofóbico e domínio C-terminal maispolar que termina com resíduos de cadeias curtas na posição 3 e 1 comrelação ao local de clivagem de terminais (von Heijne etal, Eur. J. Biochem. 80,535-545, 1989).
A previsão de peptídeo de sinal direcionador de lúmen de proteínacodificada nuclear com base na seqüência de aminoácidos da proteína ou naseqüência de ácidos nucléicos do gene correspondente é bem conhecida dostécnicos no assunto.
Como exemplo não limitador, SignaIP (Nielsen et al, Int. J. NeuralSyst. 8: 581-599, 1997) é ferramenta apropriada para prever os peptídeos detrânsito bipartidos e peptídeos de sinal direcionadores de lúmen de proteínasdo lúmen. Outra forma de proceder é o uso do software TargetP (Emanuelssonet al, J. Moi Biol. 300: 1005-1016, 2000), que permite a previsão em largaescala da localização subcelular de proteínas codificadas nucleares e apesquisa por meio de seleção manual das proteínas de cloroplastas previstaspor TargetP para motivos de arginina dupla (Kieselbach et al, Photosynthesis
Research, 78: 249-264, 2003).
Pesquisas recentes em proteômicos do cloroplasta das plantassuperiores foram atingidas na identificação de numerosas proteínas do lúmencodificadas nucleares (Kieselbach et al, FEBS Lett. 480: 271-276, 2000; Peltieret al, Plant Cell 12: 319-314, 2000; Bricker et al, Biochim. Biophys. Acta 1503:350-356, 2001), cujo peptídeo de sinal de direcionamento de lúmen pode serpotencialmente utilizado de acordo com a presente invenção. Cerca de oitentaproteínas de Arabidopsis, bem como proteínas homólogas de espinafre eervilhas domésticas, são relatadas por Kieselbach et al, PhotosynthesisResearch, 78: 249-264, 2003. Particularmente, a Tabela 2 dessa publicação,que é incorporada ao presente relatório descritivo como referência, descreveproteínas do lúmen de cloroplasta, identificadas pelo seu número de acesso.Além disso, a versão preliminar recentemente publicada do genoma de arroz(Goff et al, Science 296: 92-100, 2002), é fonte apropriada de peptídeo de sinaldirecionador de lúmen que pode ser utilizado de acordo com a presenteinvenção.
Os técnicos no assunto sabem bem que a tradução normal emplastídeos inicia-se na metionina. Peptídeo de sinal direcionador de lúmen deproteína codificada nuclear pode conter metionina como aminoácido N-terminalou não. Segundo a presente invenção, códon de inicialização de tradução(ATG), que codifica metionina, é fundido em quadro na extremidade 5' damolécula de ácido nucléico que codifica peptídeo de sinal direcionador delúmen ou substituído para o aminoácido N-terminal quando esse peptídeo desinal direcionador de lúmen não for iniciado por metionina.
Moléculas de ácido nucléico que codificam peptídeo de sinaldirecionador de lúmen podem ser isoladas, por exemplo, a partir de bibliotecas deDNA ou DNA genômico produzidas a partir de origem vegetal. Alternativamente,elas podem haver sido produzidas por meio de métodos de DNA recombinantes(tais como PCR) ou por meio de síntese química. A identificação e o isolamentodessas moléculas de ácido nucléico podem ter lugar utilizando as moléculas deacordo com a presente invenção ou partes dessas moléculas ou, conforme venhaa ser o caso, as linhagens de complemento reverso dessas moléculas, tal comopor meio de hibridização de acordo com métodos padrão (vide, por exemplo,Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY). Peptídeo de sinalde direcionamento de lúmen N-terminal de metionina de acordo com a presenteinvenção pode ser obtido a partir de proteína codificada nuclear utilizandométodos que são familiares dos técnicos no assunto, notadamente métodos taiscomo os descritos em Sambrook et al (1989, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Nolan C., ed„ Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press).Proteínas codificadas nucleares podem ser dirigidas para ocompartimento de lúmen tilacóide de cloroplastas através da membranatilacóide por meio de dois processos diferentes de secreção. O primeiro é oprocesso dependente de Sec1 o segundo é o processo de Tat (Robinson et ai,Plant Moi Biol. 38, 209-221, 1998; Cline et al, Annu. Rev. Cell dev. Biol. 12, 1-26, 1996). Os inventores demonstraram que peptídeos de sinal dedirecionamento de lúmen provenientes de proteína codificada nuclear utilizandoo processo dependente de Sec ou proteína codificada nuclear utilizando oprocesso de Tat são apropriadas de acordo com a presente invenção.
Desta forma, a presente invenção refere-se a gene quiméricoconforme definido acima, em que a seqüência de ácidos nucléicos que codificapeptídeo de sinal direcionador de lúmen é de proteína codificada nuclearutilizando o processo dependente de Sec, ou utilizando o processo de Tat, paraa translocação através da membrana tilacóide.
Em realização da presente invenção, a seqüência de ácidosnucléicos que codifica peptídeo de sinal que direciona lúmen N-terminal demetionina é selecionada a partir do grupo que consiste de:
a. molécula de ácido nucléico que codifica peptídeo quecompreende a seqüência de aminoácidos fornecida em SEQ ID N0 2 ou 4;
b. molécula de ácido nucléico que codifica peptídeo, cujaseqüência de aminoácidos possui identidade de pelo menos 70%, pelo menos80%, pelo menos 90%, 95% ou 99% com a seqüência de aminoácidosfornecida sob SEQ ID N0 2 ou 4;
c. molécula de ácido nucléico que compreende a seqüênciade nucleotídeos exibida em SEQ ID N0 1 ou 3;
d. molécula de ácido nucléico, cuja seqüência de ácidos
nucléicos possui identidade de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos70%, 80% ou 90% com as seqüências de ácidos nucléicos descritas em a ou c;e. moléculas de ácido nucléico, cuja seqüência denucleotídeos desvia-se da seqüência das moléculas de ácido nucléicoidentificadas em a, b, c ou d devido à degeneração do código genético; e
f. moléculas de ácido nucléico que representam fragmentos,variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico identificadasem a, b, c, d ou e.
Segundo a presente invenção, o termo "identidade" deve sercompreendido como indicando a quantidade de aminoácidos e nucleotídeoscorrespondente aos aminoácidos/nucleotídeos de outra proteína/ácido nucléico,expressa na forma de percentual. A identidade é preferencialmente determinadapor meio de comparação de SEQ ID N0 1, SEQ ID N0 2, SEQ ID N0 3 ou SEQ IDN0 4 com outra proteína/ácido nucléico com o auxílio de programas decomputador. Caso seqüências que são comparadas entre si possuamcomprimentos diferentes, a identidade deve ser determinada de tal forma que aquantidade de aminoácidos que contêm seqüência mais curta em comum com aseqüência mais longa determine o quociente percentual da identidade.Preferencialmente, a identidade é determinada por meio do programa decomputador ClustalW, que é bem conhecido e disponível ao público (Thompsonet ai, Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). ClustalW é disponível aopúblico por meio de Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) e TobyGibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), Laboratório Europeu de BiologiaMolecular, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemanha. ClustalW podetambém ser descarregado de diferentes sites na Internet, que incluem o IGBMC(Instituto de Genética e Biologia Molecular e Celular, Β. P. 163, 67404 IllkirchCedex, França; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/), bem como de todos os sites na internetespelhados do EBI (Instituto Europeu de Bioinformática, Wellcome TrustGenome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, Reino Unido).Preferencialmente, é utilizada a Versão 1.8 do programa decomputador CIustaIW para determinar a identidade entre proteínas de acordocom a presente invenção e outras proteínas. Ao fazê-lo, devem serconfigurados os parâmetros a seguir: KTUPLE = 1, TOPDIAG = 5, WINDOW =5, PAIRGAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0,05, GAPDIST = 8,MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET1 ENDGAPS (OFF)1 NOPGAP, NOHGAP.
Preferencialmente, é utilizada a Versão 1.8 do programa decomputador CIustaIW para determinar a identidade entre a seqüência denucleotídeos das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presenteinvenção, por exemplo, e a seqüência de nucleotídeos de outras moléculas deácido nucléico. Ao fazê-lo, devem ser configurados os parâmetros a seguir:KTUPLE = 2, TOPDIAGS = 4, PAIRGAP = 5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN =10, GAPEXT = 5, MAXDIV = 40, TRANSITIONS: não ponderadas.
Segundo a presente invenção, as expressões "ligados entre si emforma funcional" ou "ligados operativamente" indicam que os elementosespecificados do gene quimérico componente são ligados entre si de forma quefuncionem como unidade para permitir a expressão da seqüência decodificação. Como forma de exemplo, afirma-se que o promotor é ligado àseqüência de codificação de forma funcional, caso seja capaz de promover aexpressão da mencionada seqüência de codificação.
Segundo a presente invenção, as expressões "ligados entre si deforma funcional" cobrem o caso de disposição policistrônica em que o promotornão é ligado diretamente à seqüência de codificação.
Um gene quimérico, de acordo com a presente invenção, podeser elaborado a partir dos diversos componentes utilizando métodos que sãofamiliares para os técnicos no assunto, notadamente métodos tais como osdescritos em Sambrook et ai (1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual,Nolan C., ed., Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Exatamentequais elementos reguladores devem ser incluídos no gene quiméricodependerão da planta e do tipo de plastídeo no qual devem trabalhar; ostécnicos no assunto são capazes de selecionar quais elementos reguladoresdevem funcionar e podem aumentar a produção de proteína em uma dadaplanta. A seqüência de consenso de Shine-Dalgarno (SD) GGAGG, porexemplo, pode ser colocada acima no fluxo do gene. Alternativa ouadicionalmente, a região não traduzida 5' (UTR) pode ser inserida entre opromotor e o gene (Staub, J. M. e Maliga, P., 1993, EMBO J. 12, 601-606). Ostécnicos no assunto sabem que o uso de sinais reguladores da região nãotraduzida 5' (5' UTR) e a região não traduzida 3' (3' UTR) geralmente énecessário para níveis mais altos de expressão de transgenes em plastídeos(De Cosa, B., Moar, W., Lee, S. B., Miller1 M. e Daniell1 H., 2001, Nat.Biotechnol. 19, 71-74). 5' UTR e 3' UTR possíveis são bem conhecidas dostécnicos no assunto. O promotor do gene psbA, nucleotídeo 1596 a 1819 deGenbank Z00044, por exemplo, inclui a 5' UTR endógena. O promotor dooperador ribossômico 16S Prrn pode ser associado à região do local de uniãode ribossomos do gene rbcL (5' UTR rbcL).
Dentre os promotores funcionais em plastídeos de célulasvegetais, como forma de exemplo, pode-se fazer menção especial do gene"20 psbA que codifica o polipeptídeo D1 de PSII (Staub et aí, 1993, EMBO Journal12 (2): 601-606) e o promotor Prrn constitutivo que regula o operador de RNAribossômico (Staub etal, 1992, Plant Cell 4: 39-45). Como regra geral, qualquerpromotor resultante de gene vegetal plastômico ou gene bacteriano poderáfuncionar e os técnicos no assunto saberão quais dos promotores disponíveisdevem ser selecionados a fim de obter o modo de expressão desejável(constitutivo ou indutível).
Um promotor apropriado para a presente invenção é o promotorPrrn de fumo, que é associado à parte da seqüência não traduzida 5' do generbcL que fornece local de união de ribossomos (Svab et al, 1993, Proc. Natl.
Acad. Sei. 90: 913-917).
Outro promotor apropriado é o promotor dependente de luz dogene psbA que codifica o polipeptídeo D1 de PSII (Staub, J. M. e Maliga1 P.,1993, EMBO J. 12, 601-606).
Dentre os terminais que são ativos em plastídeos de célulasvegetais, como forma de exemplo, poder-se-á fazer menção especial dosterminais do gene psbA, gene rbcL (que codifica a subunidade grande deRuBisCO) e o gene rps16 (que codifica proteína ribossômica de fumo(Shinozaki et al, 1986, EMBO J. 5: 2043-2049; Staub, J. M. e Maliga, P., 1993,EMBO J. 12, 601-606).
Segundo a presente invenção, a expressão "fundido por traduçãocom" deverá indicar fusão de seqüências de ácido nucléico de forma querepresentem um único quadro de leitura aberta que, mediante transcrição, geraa produção de um único RNA mensageiro que codifica um polipeptídeo isolado,quando traduzido.
Segundo a presente invenção, a seqüência de ácidos nucléicosque codifica peptídeo de sinal que direciona lúmen N-terminal de metionina deproteína codificada nuclear é fundida por tradução com seqüência de ácidosnucléicos heterólogos, o que indica que esta segunda seqüência de ácidosnucléicos não é fundida naturalmente com a primeira seqüência de ácidosnucléicos que codifica peptídeo de sinal direcionador de lúmen.
Em realização da presente invenção, a seqüência de ácidosnucléicos heterólogos que codifica um peptídeo que é fundido à seqüência deácidos nucléicos que codifica peptídeo de sinal direcionador de lúmen éderivada de organismo eucariótico.
Em outra realização da presente invenção, a seqüência de ácidosnucléicos que codifica peptídeo de sinal direcionador de lúmen N-terminal demetionina e/ou a molécula de ácido nucléico heterólogo são projetadas a fim deotimizar a expressão de cloroplastas, com base no uso de códons decloroplasta de Nicotiana tabacum. O uso de códons de cloroplasta de Nicotianatabacum é disponível em www.Kazusa.or.jp/codon e a distribuição dos códonsé atribuída aleatoriamente a cada resíduo de aminoácido ao longo de toda aseqüência de codificação, de acordo com a freqüência na tabela de uso decódons de cloroplasta (Nakamura etal, 2000, Nuci Acids Res., 28, 292).
Em ainda outra realização da presente invenção, a seqüência deácidos nucléicos heterólogos que codifica peptídeo codifica um peptídeo quecontém N-terminal que não de metionina.
Molécula de ácido nucléico heterólogo que codifica peptídeo pode serisolada, por exemplo, a partir de bibliotecas de DNA ou DNA genômico produzidas apartir de origem eucariótica ou outra. Alternativamente, elas podem haver sidoproduzidas por meio de métodos de DNA recombinante (tais como PCR) ou pormeio de síntese química. A identificação e o isolamento dessas moléculas de ácidonucléico podem ter lugar utilizando as moléculas de acordo com a presenteinvenção ou partes dessas moléculas ou, conforme venha a ser o caso, aslinhagens d e complemento reverso dessas moléculas, tais como por meio dehibridização de acordo com métodos padrão (vide, por exemplo, Sambrook et al,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).
Em ainda outra realização da presente invenção, a seqüência deácidos nucléicos heterólogos que codifica peptídeo codifica a proteínaaprotinina. Aprotinina é uma inibidora da protease que pode ser extraída deórgãos ou tecidos bovinos, tais como pâncreas, pulmões ou fígado. Aprotininaconhecidamente inibe várias proteases de serina, que incluem tripsina,quimotripsina, plasmina e calicreína, e é utilizada terapeuticamente notratamento de enfarte do miocárdio, síndrome de choque, pancreatite aguda ehiperfibrinolítica e para reduzir a perda de sangue relativa a cirurgia cardíaca(Bidstrup et al, 1989, Cardiovasc. Surg. 44: 640-645). As seqüências deaminoácidos e ácidos nucléicos de aprotinina podem ser encontradas no bancode dados Swiss-Prot/TrEMBL (colaboração entre o Instituto Suíço deBioinformática e a estação EMBL - o Instituto Europeu de Bioinformática;httoJ/us.expasv.org/sprot) com o Número de Acesso P00974.
Segundo a presente invenção, a proteína aprotinina é identificadacomo SEQ ID N0 6. Gene quimérico de acordo com a presente invenção emque a seqüência de ácido nucléico heteróloga codifica peptídeo que contémfragmentos da proteína aprotinina que exibem atividade biológica comparável àproteína aprotinina, ou codifica peptídeo, cuja seqüência de aminoácidospossui identidade para pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%,95% ou 99% para SEQ ID N0 6 é realização adicional da presente invenção.
Em outra realização da presente invenção, a seqüência de ácidosnucléicos heterólogos possui seqüência de ácidos nucléicos com identidade depelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% paraa seqüência SEQ ID N0 5.
As moléculas de ácido nucléico ou os polipeptídeos, que sãohomólogos a outra molécula ou derivados constitutivos dessas moléculas, são"20 geralmente variações dessas moléculas, que constituem modificações, queexecutam a mesma função biológica. Com este propósito, podem ocorrermodificações sobre resíduos de aminoácidos não envolvidos na atividadeenzimática.
No contexto da presente invenção, a função biológica dasmoléculas de ácido nucléico ou dos polipeptídeos por elas codificados pode serdeterminada pela capacidade dos polipeptídeos ou dos polipeptídeoscodificados pelas moléculas de ácido nucléico de inibirem protease de serina,utilizando, por exemplo, teste in vitro tal como o teste de cloridrato de Na-benzoil-D, L-arginino-p-nitroanilida (Lavens et aí, 1993, J. Immunol. Methods,166 (1), 93-102; Sigma-AIdrich, produto n0 B 4875, teste de acordo com omanual do fabricante). As variações, tais como mutações, podem haverocorrido de maneira natural ou haver sido introduzidas por meio de mutagênese. As variações podem também ser seqüências fabricadassinteticamente. As variantes alélicas podem ser variantes de ocorrência naturale também variantes fabricadas sinteticamente ou variantes produzidas pormeio de métodos de DNA recombinante. Moléculas de ácido nucléico, que sedesviam das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção devido à degeneração do código genético, constituem forma especial dederivados.
Genes quiméricos que incluem molécula de ácido nucléicoheterólogo que codifica aprotinina e cuja seqüência difere da seqüência denucleotídeos da molécula nativa devido à degeneração do código genético também são objeto da presente invenção.
Genes quiméricos que incluem molécula de ácido nucléicoheterólogo que codifica aprotinina variante com alteração da atividadeenzimática também são objeto da presente invenção.
A presente invenção também se refere a vetor designado para a transformação de plastídeos vegetais, caracterizado pelo fato de que contémpelo menos duas seqüências que são homólogas a seqüências no plastoma daplanta a ser transformada, em que as mencionadas seqüências homólogasladeiam pelo menos um gene quimérico de acordo com a presente invenção.
Estas seqüências (uma acima no fluxo (LHRR) e a outra abaixo no fluxo (RHRR) do(s) gene(s) quimérico(s) componente(s)) permitemrecombinação homóloga dupla em região intergênica do plastoma, quecompreende a LHRR e RHRR de região contígua.
As duas seqüências de recombinação homólogas de acordo coma presente invenção podem ser contíguas, de tal forma que o gene quiméricoseja inserido em seqüência não codificadora (intergênica) do plastoma. Emrealização específica, esta seqüência é parte do operador do RNA ribossômicode plastídeo. Em outra realização específica, esta seqüência é parte dooperador do RNA ribossômico de plastídeo. Em outra realização específica, aseqüência não codificadora inclui a extremidade 3' do gene rbcl (que codifica asubunidade grande de ruBisCO), em que a outra seqüência homóloga inclui aextremidade 5' do gene accD (que codifica uma das subunidades de acetil-CoAcarboxilase). E, ainda mais especificamente, o fragmento de LHRRcorresponde aos nucleotídeos 57764 a 59291 do plastoma de fumo (Shinozakiet al, 1986 - Genbank Z00044). O fragmento de RHRR corresponde aosnucleotídeos 59299 a 60536 do plastoma de fumo.
Para obter a transformação de plastídeos, o DNA transformadordeve cruzar a parede celular, a membrana de plasma e a membrana dupla do organelo antes de atingir o estroma. Neste particular, o método maiscomumente utilizado para transformação do genoma de plastídeo é o debombardeamento de partículas (Svab e Maliga, 1993, Proc. Nati Acad. Sei. U.S. A, primeiro de fevereiro, 90 (3): 913-917).
Transfecção de plastídeos utilizando microprojéteis em altavelocidade foi realizada em primeiro lugar na alga unicelular Chlamydomonasreinhardtii (Boynton et al, 1988). Atualmente, em plantas superiores,transformação estável de plastídeos é comumente conduzida em fumo,Nicotiana tabacum (Svab e Maliga, 1990, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 87,8526-8530; Svab e Maliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., primeiro de fevereiro, 90 (3): 913-917). A transformação de plastídeos a partir de arroz(Khan, M. S. e Maliga, 1999, Nat. Biotechnoi 17, 910-915), de Arabidopsisthaliana (Sikdar et al, 1998, Plant Cell Reports 18: 20-24), de batata (Sidorov etal, 1999, Plant J. 19 (2): 209-216), de Brassica napus (Chaudhuri et al, 1999,WO 00/39313) e de tomate (Ruf et al, 2001, Nat. Biotechnol. 19, 870-875)foram relatados. Plantas transplastômicas férteis foram obtidas para fumo,tomate, batata e soja (WO 04/053133). Recentemente, foi relatada atransformação de plastídeos de lentilha d'água (WO 05/005643).
Pode-se utilizar marcador seletivo para selecionar plastídeostransformados e células, ou seja, aqueles que incorporaram o(s) gene(s)quimérico(s) ao seu plastoma (ou seja, células transplastômicas) e issotambém possibilita a obtenção de plantas transplastômicas homoplasmáticasférteis. O termo "homoplasmático" indica que todas as células contêm o mesmo tipo de plastoma e somente aquele plastoma. Plantas transplastômicas sãohomoplasmáticas quando todas as suas células contiverem apenas cópia doplastoma transformado.
Dentre os genes que podem ser utilizados como marcadoresseletivos, como forma de exemplo, pode-se fazer menção especial de dois genes quiméricos, nomeadamente o gene aadA que codifica aminoglicosídeo3"-adeniltransferase que confere resistência a espectinomicina e estreptomicina(Svab et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 913-917) e o gene neo que codificaneomicina fosfotransferase (Carrer et al, 1993, Moi Gen. Genet. 241: 49-56)que confere resistência a canamicina. Outros possíveis marcadores seletivos apropriados incluem genes que conferem resistência a betaína aldeído, taiscomo o gene que codifica betaína aldeído desidrogenase (Daniell et al, 2001,Curr. Genet. 39: 109-116) e também genes que conferem tolerância aherbicidas, tais como o gene bar (White et al, 1990, Nucleic Acid Res. 18 (4):1062) que confere resistência a bialafós, e o gene EPSPS (US 5.188.642) queconfere resistência a glifosato. Alternativamente, podem ser utilizados genesrelatores, ou seja, genes que codificam enzimas prontamente identificadas, taiscomo GUS (β-glucuronidase) (Staub, J. M. e Maliga, P., 1993, EMBO J. 12,601-606) ou a proteína fluorescente verde (GFP1 Sidorov et al, 1999, Plant J.19 (2): 209-216), genes que codificam pigmentos ou enzimas que regulam aprodução de pigmentos. Esses genes são descritos nos Pedidos de PatenteWO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, WO 97/04130 e WO 01/64023.
O gene que codifica o marcador seletivo pode ser o gene aadAque codifica aminoglicosídeo 3"-adeniltransferase que confere resistência aespectinomicina e estreptomicina (Svab et al, 1993, Proc. Nati Acad. Sei.90: 913-917).
A presente invenção também se refere, portanto, a célulasvegetais transplastômicas ou plantas transplastômicas e/ou sua progênie, quecontêm integradas ao seu plastoma, molécula de ácido nucléico quecompreende, ligadas entre si de forma funcional na direção de transcrição,seqüência promotora que é ativa em plastídeos, seqüência de ácidos nucléicosque codifica peptídeo de sinal que se direciona a lúmen N-terminal demetionina de proteína codificada nuclear fundida por tradução com seqüênciade ácidos nucléicos heterólogos que codifica peptídeo e, opcionalmente, umterminador que é ativo nos plastídeos de células vegetais.
Em realização da presente invenção, a seqüência de ácidos nucléicosheterólogos que codifica peptídeo que é fundido à seqüência de ácidos nucléicos quecodifica peptídeo de sinal direcionador a lúmen é derivada de organismo eucariótico.
A presente invenção também se refere a planta transplastômicae/ou progênie que é Lemnaceae1 planta do gênero Nicotiana, planta de batata,planta de tomate, planta de soja ou alga.
Em realização específica, a planta transplastômica de acordo coma presente invenção é planta de fumo.
Em realização adicional, a presente invenção refere-se a partesde plantas colhíveis de plantas de acordo com a presente invenção, tais comofolhas, em que estas partes colhíveis contêm células vegetais de acordo com apresente invenção.A presente invenção também se refere a método de fabricação deplantas transplastômicas de acordo com a presente invenção, em que:
a. célula vegetal é transformada com pelo menos um genequimérico que compreende, ligada entre si de forma funcional na direção detranscrição, seqüência promotora que é ativa em plastídeos, seqüência deácidos nucléicos que codifica peptídeo de sinal direcionador de lúmen N-terminal de metionina de proteína codificada nuclear fundida por tradução comseqüência de ácidos nucléicos heterólogos que codifica peptídeo e,opcionalmente, um terminador que é ativo nos plastídeos de células vegetais;
b. planta é regenerada de célula vegetal obtida na etapa a; e
c. se necessário, plantas adicionais são produzidas a partir
das plantas obtidas na etapa b.
A célula vegetal obtida na etapa a pode ser regenerada emplantas inteiras de acordo com métodos conhecidos dos técnicos no assunto,utilizando, por exemplo, os métodos descritos em Plant Cell Culture Protocols,1999, editado por R. D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2.
A produção de plantas adicionais de acordo com a etapa c dométodo de acordo com a presente invenção pode ser conduzida, por exemplo,por meio de propagação vegetativa (utilizando, por exemplo, cortes, tubérculosou por meio de cultivo de calos e regeneração de plantas inteiras) ou porpropagação sexual. Aqui, a propagação sexual tem lugar preferencialmentesob condições controladas, ou seja, plantas selecionadas com característicasespecíficas são cruzadas e propagadas entre si.
A presente invenção refere-se ainda a método de produção deproteína de interesse em célula vegetal que compreende a etapa detransformação de plastídeo com gene quimérico de acordo com a presenteinvenção e cultivo de célula vegetal que compreende o mencionado plastídeotransformado sob condições apropriadas para a expressão do gene quiméricoe para a clivagem subseqüente do peptídeo de sinal.
A presente invenção refere-se ainda a método de produção depeptídeo N-terminal não de metionina em plastídeo vegetal que compreende asetapas de:
a. transformação de plastídeo com gene quimérico quecompreende, ligadas entre si de forma funcional na direção de transcrição,seqüência promotora que é ativa em plastídeos, seqüência de ácidos nucléicosque codifica peptídeo de sinal direcionador de lúmen N-terminal de metioninade proteína codificada nuclear fundida por tradução com seqüência de ácidosnucléicos heterólogos que codifica peptídeo e, opcionalmente, um terminadorque é ativo nos plastídeos de células vegetais, em que a seqüência de ácidosnucléicos heterólogos codifica peptídeo N-terminal não de metionina; e
b. cultivo de célula vegetal que compreende o mencionadoplastídeo transformado sob condições apropriadas para a expressão do genequimérico e para a subseqüente clivagem do peptídeo de sinal.
A presente invenção refere-se ainda ao método descrito acima deprodução de peptídeo N-terminal que não de metionina em plastídeo vegetal,em que a proteína N-terminal que não de metionina é aprotinina.
A presente invenção refere-se ainda a método de produção depeptídeo de interesse que compreende a etapa de extração do peptídeo deinteresse de célula vegetal transplastômica de acordo com a presente invençãoou de planta transplastômica e/ou sua progênie de acordo com a presenteinvenção, ou de partes colhíveis de planta transplastômica de acordo com apresente invenção.
Preferencialmente, esse método também compreende a etapa decolheita das plantas cultivadas e/ou partes dessas plantas tais como folhas antes daextração do peptídeo de interesse. De maior preferência, ele compreende ainda aetapa de cultivo das plantas de acordo com a presente invenção antes da colheita.A presente invenção refere-se ainda ao método descrito acima deprodução de peptídeo de interesse, em que o peptídeo de interesse é a aprotinina.
Métodos de extração da aprotinina são conhecidos dos técnicosno assunto. Uma série de métodos é disponível para isolar aprotinina, incluindométodos gerais de precipitação e/ou etapas cromatográficas utilizando DEAE-celulose ou métodos de afinidade. Exemplos desses métodos são descritos naPatente Norte-Americana US 5.164.482 e em J. D. Altman et al, 1991, ProteinEng., 4 (5): 593-600.
A presente invenção é ilustrada especificamente pelos exemplosa seguir que não são limitadores de nenhuma forma.
Exemplo 1
Seqüência de Ácidos Nücléicos que Codifica Peptídeo de Sinal Dirigido aLúmen N-Terminal de Metionina Utilizando o Processo Dependente de Secpara a Translocacão Através da Membrana Tilacóide
O gene AT5g52970 de Arabidopsis thaliana com funçãodesconhecida que codifica proteína secretada para o lúmen por meio doprocesso dependente de Sec foi selecionado dentre proteínas do lúmenidentificadas por Kieselbach et al, 2003, Photosynthesis Research, 78: 249-264. Este gene foi selecionado dentre as proteínas do lúmen que possuemcarga positiva (arginina ou lisina) no terminal amino após a clivagem dopeptídeo de sinal. Essa seleção prévia foi realizada para aumentar aprobabilidade de processamento exato adicional da proteína de fusão e aremoção da aprotinina, cuja seqüência de aminoácidos inicia-se com arginina.Nenhuma seleção prévia ou seleção prévia com base em outros critérios podeser realizada dependendo da seqüência de ácidos nücléicos heterólogos queserá fundida por tradução à seqüência de ácidos nücléicos que codificapeptídeo de sinal direcionador do lúmen N-terminal de metionina.
O peptídeo de trânsito bipartido da proteína codificada porAT5g52970 foi previsto utilizando software SignaIP (Nielsen et al, Int. J. NeuralSyst. 8: 581-599, 1997). A seqüência amino-terminal prevista deste peptídeo detrânsito bipartido que permite a importação para o cloroplasta foi excluída eadicionou-se metionina na forma de local de início de tradução, gerando aseqüência de LSP1 identificada sob SEQ ID N0 2.
Exemplo 2
Seqüência de Ácidos Nucléicos que Codifica Peptídeo de Sinal Direcionadoa Lúmen N-Terminal de Metionina Utilizando o Processo Tat para a
Translocacão Através da Membrana Tilacóide
O gene AT1g20810 de Arabidopsis thaliana que codificaproteína similar a imunofilina secretada para o lúmen por meio do processode Tat foi selecionado dentre proteínas do lúmen identificadas porKieselbach et al, 2003, Photosynthesis Research, 78: 249-264. Este gene foiselecionado dentre as proteínas do lúmen que possuem carga positiva(arginina ou lisina) no terminal amino após a clivagem do peptídeo de sinal.Essa seleção prévia foi realizada para aumentar a probabilidade deprocessamento exato adicional da proteína de fusão e remoção daaprotinina, cuja seqüência de aminoácidos inicia-se com arginina. Nenhumaseleção prévia ou seleção prévia com base em outros critérios pode serrealizada dependendo da seqüência de ácidos nucléicos heterólogos queserá fundida por tradução com a seqüência de ácidos nucléicos que codificapeptídeo de sinal direcionado a lúmen N-terminal de metionina.
O peptídeo em trânsito bipartido da proteína codificada porAT1g20810 foi previsto utilizando software SignaIP (Nielsen et al, Int. J. Neural Syst. 8: 581-599, 1997). A seqüência amino-terminal deste peptídeo emtrânsito bipartido prevista que permite a importação no cloroplasta foi excluídae adicionou-se metionina na forma de local de início de tradução, gerando aseqüência de LSP2 identificada em SEQ ID N0 4.Exemplo 3
Seqüências de Codificação de LSPs/Proteínas de Fusão de Aprotinina
Seqüências sintéticas que codificam LSP1 ou LSP2 fundidas noterminal amino de aprotinina (denominadas LSP1::aprotinina eLSP2::aprotinina, respectivamente) foram projetadas a fim de otimizar aexpressão de cloroplastas, com base no uso de códons de plastídeos de fumo(www.kazusa.or.jp/códon). A distribuição dos códons foi atribuídaaleatoriamente a cada resíduo de aminoácido de acordo com a sua freqüênciana tabela de uso de códons de cloroplasta.
Exemplo 4
Vetores de Transformação de Cloroplastas pAPR20 ε pAPR21
As seqüências de codificação de LSP1::aprotinina eLSP2::aprotinina foram introduzidas em vetor de transformação de cloroplastasderivado de plasmídeo pBluescript (Stratagene)1 gerando os vetores pAPR20 epAPR21, respectivamente. pAPR20 é exibido na Figura 1. pAPR21 é idêntico apAPR20, exceto pelo fato de que LSP2 toma o lugar de LSP1.
Estes vetores contêm regiões do plastoma de fumo, LHRR-Nt (1) eRHRR-Nt (1), que permitem a integração dirigida dos transgenes entre os genesrbcL e accD. O fragmento de LHRR corresponde aos nucleotídeos 57764 a 59291do plastoma de fumo (Shinozaki et al, 1986 - Genbank Z00044). O fragmento deRHRR corresponde aos nucleotídeos 59299 a 60536 do plastoma de fumo.
O gene marcador selecionável quimérico aadA codifica a resistênciaa espectinomicina conforme descrito por Svab e Maliga (1993). A sua expressão écolocada sob o controle do promotor do operador ribossômico 16S (Prrn (p)-Nt:nucleotídeos 102561 a 102677 do Genbank Z00044), seguida pelo local de uniãode ribossomos do gene rbcL (5'UTRrbcL-Nt: nucleotídeos 57569 a 57584 doGenbank Z00044). O terminador de transcrição, 3'psbA-Nt (2), vem do gene psbA(nucleotídeos 146 a 533 do Genbank Z00044 em orientação reversa).As seqüências de codificação de fusão de LSPs::aprotinina sãocolocadas sob o controle do promotor do gene psbA (PpsbA-Nt (2):nucleotídeos 1596 a 1819 do Genbank Z00044 em orientação reversa). Oterminador de transcrição, 3'rbcL-Nt (2), vem do gene rbcL (nucleotídeos 59036a 59246 do Genbank Z00044).
Os elementos restantes do vetor derivam do vetor pBluescript.
Exemplo 5
Transformação de Cloroplastas
Plantas de Nicotiana tabacum (var. PBD6) foram cultivadas emcondições estéreis sobre meio MS (Murashige e Skoog, 1962) suplementadocom sacarose (3%) e fitagar (7 g/l). Os lados abaxiais de folhas que medem detrês a cinco centímetros foram bombardeados utilizando disparador departículas construído no laboratório de acordo com o modelo descrito por Fineret al (1992). O DNA do vetor pAPR23 (cinco microgramas por15 bombardeamento) foi adsorvido sobre partículas de ouro na presença de CaCI2(0,8 a 1,0 M) e espermidina (14 a 16 mM). As folhas tratadas foram colocadaspor dois dias sobre o mesmo meio MS suplementado com ácido naftalenoacético (ANA 0,05 mg/l) e 6-benzilaminopurina (BAP 2 mg/l). As folhas foramcortadas em seguida em quadrados com comprimento médio de 5 mm e cultivadas para seleção de eventos transplastômicos sobre o meio que contémhormônios anterior suplementado com 500 mg/l de cloridrato deespectinomicina. Pedaços de folhas foram subcultivados sobre meio deseleção novo a cada dez dias. Após quatro a seis semanas, calos verdes ouplantículas que aparecem sobre os explantes Iixiviados foram isolados etransferidos para meio MS (3% sacarose e 7 g/l de fitagar) suplementado com500 mg/l de cloridrato de espectinomicina, sem hormônios. Os brotosregenerados, uma vez enraizados, foram transferidos em seguida para aestufa.Exemplo 6
Análise PCR de Linhagens Selecionadas
Os primeiros eventos gerados com pAPR20 e pAPR21,selecionados sobre espectinomicina, foram analisados por meio de PCR a fim5 de verificar a presença dos transgenes no local esperado no genoma decloroplasta de fumo. Dois pares diferentes de primers (1) e (2) foram utilizados
para esta análise.
O primeiro par (1) permite a confirmação da integração no
local esperado com um primer repousando no gene rbcL antes do10 fragmento de LHRR presente no vetor de transformação pAPR20 oupAPR21 (orbcL52F: 5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3') e o segundoprimer que repousa no início da região de codificação de AADA, emorientação reversa (aadAIOR: 5'-gttgatacttcggcgatcaccgcttc-3'). Aobservação de produto de amplificação de cerca de 1,8 kb confirmará a15 integração.
O segundo par (2) permite a amplificação de fragmento queengloba a fusão LSPs::aprotinina com um primer repousando na extremidadedo promotor psbA (psbA230F: 5'-tttgtagaaaactagtgtgcttggg-3') e o segundoprimer repousando no terminador 3'rbcL em orientação reversa (5-20 atgtcaccacaaacagagactaaagc-3'). A observação de produto de amplificação decerca de 550 bp confirmará a presença dos conjuntos de expressão deLSPs::aprotinina no genoma de cloroplasta de fumo. A amplificação consistiuem trinta ciclos (94 0C por 45 segundos - 54 0C por 60 segundos - 72 0C por120 segundos).
25 As reações de PCR para os três eventos selecionados (APR20-1-
2, APR-21-19-1 e APR21-19-2) são positivas para cada um dos dois pares deprimers, o que demonstra que eles são transplastômicos e integraram osconjuntos de expressão de pAPR20 e pAPR21 conforme o esperado.Exemplo 7Análise Western Blot de Aprotinina
A expressão de aprotinina foi analisada por meio de SDS-PAGEsob condições de desnaturação seguidas por Western Blot. O total deproteínas solúveis foi extraído de material de folha triturada em nitrogêniolíquido de eventos transgênicos utilizando como tampão de extração Tris-HCI25 mM, NaCI 100 mM, Triton X100 0,5%, glicerol 10%, pH 8. Vintemicrogramas de proteínas solúveis de cada extrato, quantificados por meio deteste Bradford, foram separados em seguida por meio de SDS-PAGE (12%acrilamida) e transferidos sobre membrana de PVDF. Quantidade padrão deaprotinina (200 ng; Sigma), bem como extrato de fumo do tipo selvagem,também foi incluída no experimento. Após a transferência, a membrana foibloqueada com reagente de bloqueio de acordo com as instruções dofabricante (Roche) e incubada em seguida por uma noite a 4 0C com anticorpomonoclonal de camundongo dirigido contra aprotinina. Após a lavagem, amembrana foi incubada com segundo anticorpo monoclonal dirigido contraimunoglobulinas de camundongos e acoplada a fosfatase alcalina (SigmaA3562). A revelação do complexo imunológico foi realizada utilizando kit daBiorad (Immun-Star) e a quimioluminescência gerada registrada sobre filme.
O resultado deste experimento demonstra claramente que, paraos dois tipos de construções (pAPR20 e pAPR21), a proteína de fusão deLSP::aprotinina é processada e dividida, pois uma única faixa é visível sobre oWestern Blot, que migra exatamente na mesma posição de aprotinina padrãogenuína. Os peptídeos de sinais selecionados que direcionam aprotinina aolúmen por meio do processo de Sec (linhagens pAPR20) ou Tat (linhagenspAPR221) são, portanto, clivados com alta eficiência.
O nível de expressão é estimado em cerca de 0,1 a 0,2% de proteínassolúveis totais para linhagens pAPR21 e em cerca de 0,5% para linhagens pAPR20.Exemplo 8
Análise de LC/MS por Eletropulverizacão de Aprotinina Recombinante
Aprotinina recombinante foi extraída em tampão PBS de folhastransgênicas de eventos gerados com vetores pAPR20 e pAPR21 e imunopurificadautilizando anticorpos monoclonais. As proteínas isoladas foram fechadas pararemoção dos sais e analisadas em instrumento LC/MS/MS Ionics EP-10+.
O cromatograma de eletropulverização LC/MS das amostrascorrespondentes a pAPR20 e pAPR21, respectivamente, foi comparado aocromatograma de eletropulverização de LC/MS do padrão de aprotinina.
O cromatograma de eletropulverização de LC/MS das amostrascorrespondentes a pAPR20 exibe pico em tempo de retenção de 3,31 minutos. Opeso molecular médio obtido a partir dos íons carregados de forma múltipla é de6532 ± 2 daltons. A diferença de massa em comparação com a aprotinina padrão éde 16 daltons ou a massa de oxigênio. A aprotinina isolada aparentemente éoxidada. O cromatograma de eletropulverização de LC/MS da amostracorrespondente a pAPR21 exibe pico em tempo de retenção de 3,36 minutos. Opeso molecular médio obtido a partir dos íons carregados de forma múltipla é de6516 ± 1 Dalton. O espectro de massa é exatamente igual à aprotinina padrão.
Estes experimentos demonstram claramente que ocorre uma clivagemin planta no local esperado entre o peptídeo de sinal e a aprotinina madura, a partir dearginina no terminal amino e que corresponde a aprotinina genuína no nível deaminoácido. A massa suplementar de 16 na amostra pAPR20 poderá corresponder àoxidação de um resíduo, possivelmente a metionina codificada exclusiva.
Exemplo 9
Aprotinina Recombinante Une-se a Tripsina
A fim de verificar se a aprotinina recombinante produzida emcloroplastas transgênicos encontra-se em conformação ativa, extratos dematerial de folha de linhagens geradas com vetores pAPR20 e pAPR21 forampreparados em tampão PBS e amostras correspondentes a vinte microgramasde proteína solúvel total foram incubadas por trinta minutos a 37 0C com váriasquantidades de tripsina (0, 28, 112, 450 ou 1800 nanogramas). Em seguida,amostras foram separadas por meio de SDS-PAGE sob condições nãoredutoras e análise Western realizada utilizando anticorpos monoclonaisdirigidos contra aprotinina. Esta análise demonstra para os dois tipos deextratos o surgimento de faixa com peso molecular mais alto assim que seadiciona tripsina às amostras. Esta nova faixa corresponde à formação decomplexo de aprotinina em tripsina. Ao adicionar-se tripsina suficiente, nenhuma aprotinina livre permanece, somente o complexo é detectado.
Este experimento demonstra que a totalidade de aprotininarecombinante produzida em transformadores de plastídeos com vetorespAPR20 e pAPR21 encontra-se em conformação ativa capaz de unir-se àprotease de tripsina.Listagem de Seqüência
<110> Bayer CropScience SA
Plantas transformadas com plastídeos que expressam proteínas-alvono esoaco celular<130> BCS 05-4032
<120>
<160> 10
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<2I1> 13S
<212> DWA
<213> Artifitial
<223> Seqüência otimizada de Nucleotideos LSPl<220>
<221> CDS
<222> (1)..(138)
<400> 1
atg tca aga ctt tct tta aaa act teu ggt gat gaa gaa aat tgg gttMet ser Arg Leu Ser Leu Lys Thr Ser Gly Asp Glu Glu Asn Trp Val
1 * " 5 10 15
tca cga ttc aga tca aaa tct tta tca ttg gta ttt tct gga gtt ttaSer Arci Phe Arq Ser Lys Ser Leu Ser Leu Val Phe Ser Gly Val Leu20" 25 30
gct ctt gat tta tct: ctt tca qeja qtt ggt t:tt gea gat geaAla Leu Gly Leu Ser Leu Ser Gly Val Gly Phe Ala Asp Ala35 40 45
48
96
138
<210> 2
<211> 46
<212> PRT
<213> Artilicial
<220> _ 0. . .<223> Construção Sintética
<400> 2
Het ser Arq Leu ser Leu Lys i hr ser Gly Asp blu Glu Asn ι rp vai1 5 10
Ser Arq Phe Aro ser Lys Ser Leu ser Leu vai Phe Ser Gly Val Leu20"" 25 30
Ala Leu Gly Leu ser Leu ser Gly vai Gly Phe Ala Asp Ala35 Ί0 Is
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial
<223> Seqüência otimizada de Nucleotideos LSP2<220>
<221> CDS<222> (1)..(126)
<400> 3
ata cga cca att aat caa ott gta gct ttt tct gtt cct ata tca aga 46
Met Ara Pro Ile Asn Gln vai vai Ala Phe Ser vai Pro Ile Ser Arg1 5 10 15
aga qat act agt ata att tta ctt tca tct att cca tta act tca ttt 96
Aru Asp Ala Ser Ile Ile Leu Leu Ser Ser Ile Pro Leu Thr Ser Phe" 20 25 30
ttc gta ctt act cct tca tct tca gaa gct 126
Phe vai Leu Thr Pro Ser Ser Ser Glu Ala35 40
<2.10> 4
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<212> PRT
<213> Artificial
<220> . , .<223> Construção Sintética
<400> 4
Met Ara Pro Ile Asri Gln Val Val Ala Phe Ser Val Pro Ile Ser Arg1 5 10 15
Aro Asp Ala Ser Ile Ile Leu Leu Ser Ser Ile Pro Leu Thr Ser Phe" 20 25 30
Phe Val Leu Thr Pro Ser Ser Ser Glu Ala35 40
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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48
96
cgg cct gac ttc tgc. cta oag cct cca tal: acg ggt ccc tgc aag gccAra Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala1 "" 5 10 15
aga att ate aga tac ttc tac aac gcc aag gct ggg ctc tgc cag accAra Ile lie Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr20 25 30
ttt gta tat ggc age tgc aga gct aaa aga aac aat ttc aag age gea 144
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala35 40 45
gag gac tgc atg agg acc tgt ggt ggt gct 174
Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala50 55<210> 6
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<213> Bos taurus
<400> 6
Arq Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala1 5 10 15
Ara Ile Ile Arq Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr20 25 30
Phe Val Tyr Gly Glv Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala35 40 45
Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala50 55
<210> 7
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<212> DNJA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 7
atgtcaccac aaacagagac taaagc
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<220>
<223> primer
<400> 8
gttgatactt cggcgatcac cgcttc
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<22 3> primer<400> 9
tttgtagaaa actagtgtgc ttggg
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<223> primer
<400> 10
atgtcaccac aaacagagac taaagc
Claims (13)
1. GENE QUIMÉRICO, caracterizado pelo fato de quecompreende, ligados entre si de forma funcional na direção de transcrição:a) um promotor funcional em plastídeo vegetal;b) uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica peptídeode sinal direcionador de lúmen N-terminal de metionina de proteína codificadanuclear fundida em tradução com:c) uma seqüência de ácidos nucléicos heterólogos quecodifica peptídeo; ed) opcionalmente, um terminador que é ativo nos plastídeosde células vegetais.
2. GENE QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácidos nucléicos que codificapeptídeo de sinal direcionador de lúmen é de proteína codificada nuclearutilizando o processo dependente de Sec ou o processo de Tat paratranslocação através da membrana tilacóide.
3. GENE QUIMÉRICO, de acordo com uma dasreivindicações de 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a seqüência de ácidosnucléicos heterólogos que codifica peptídeo codifica a proteína aprotinina.
4. VETOR DESIGNADO PARA TRANSFORMAÇÃO DEPLASTÍDEOS VEGETAIS, caracterizado pelo fato de que contém pelo menosduas seqüências que são homólogas a seqüências no plastoma da planta a sertransformada, em que as mencionadas seqüências homólogas ladeiam pelomenos um gene quimérico conforme definido em uma das reivindicações de 1a 3.
5. CÉLULA VEGETAL TRANSPLASTÔMICA, caracterizadapelo fato de que contém pelo menos um gene quimérico conforme definido emuma das reivindicações de 1 a 3.
6. PLANTA TRANSPLASTÔMICA e/ou sua progênie,caracterizada pelo fato de que compreende célula vegetal transplastômicaconforme definida na reivindicação 5.
7. PLANTA TRANSPLASTÔMICA e/ou sua progênie, deacordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é uma alga, umaLemnaceae, uma planta do gênero Nicotiana1 batata, tomate ou soja.
8. PARTES COLHÍVEIS DE PLANTA, conforme definida emuma das reivindicações de 6 a 7, caracterizadas pelo fato de quecompreendem células vegetais conforme definidas na reivindicação 5.
9. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA DEINTERESSE EM CÉLULA VEGETAL, caracterizado pelo fato de quecompreende as etapas a seguir:a) transformação de um plastídeo com um gene quiméricoconforme definido em uma das reivindicações de 1 a 2; eb) cultivo de uma célula vegetal que compreende omencionado plastídeo transformado sob condições apropriadas para aexpressão do gene quimérico e para a clivagem subseqüente do peptídeo desinal.
10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PEPTÍDEO, N-terminal quenão de metionina em plastídeo vegetal, caracterizado pelo fato de que omencionado método compreende:a) transformação de um plastídeo com um gene quiméricoconforme definido em uma das reivindicações de 1 a 2, em que a seqüência deácidos nucléicos heterólogos codifica um peptídeo N-terminal que não demetionina; eb) cultivo de uma célula vegetal que compreende o mencionadoplastídeo transformado sob condições apropriadas para a expressão do genequimérico e para a clivagem subseqüente do peptídeo de sinal.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a proteína N-terminal não de metionina é aprotinina.
12. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PEPTÍDEO, de interesse,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de extração do peptídeo deinteresse de célula vegetal transplastômica conforme definida na reivindicação-5, ou de planta transplastômica e/ou sua progênie conforme definida em umadas reivindicações de 6 a 7, ou de partes colhíveis de planta transplastômicaconforme definidas na reivindicação 8.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o peptídeo de interesse é a aprotinina.
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